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WO1996017865A2 - Gene und genprodukte zur diagnostik von degenerativer nervenschädigung - Google Patents

Gene und genprodukte zur diagnostik von degenerativer nervenschädigung Download PDF

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WO1996017865A2
WO1996017865A2 PCT/EP1995/004777 EP9504777W WO9617865A2 WO 1996017865 A2 WO1996017865 A2 WO 1996017865A2 EP 9504777 W EP9504777 W EP 9504777W WO 9617865 A2 WO9617865 A2 WO 9617865A2
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PCT/EP1995/004777
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WO1996017865A3 (de
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Hans-Werner Müller
Clemens Gillen
Marc Gleichmann
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Boehringer Mannheim Gmbh
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Publication of WO1996017865A3 publication Critical patent/WO1996017865A3/de

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor

Definitions

  • the invention relates to new genes and gene products which are suitable for the diagnosis of nerve damage and degenerative diseases of the peripheral nerve tissue, and the use of these genes or gene products for the therapy of degenerative nerve diseases and for regeneration after traumatic nerve lesions.
  • the group of diseases that lead to nerve damage include congenital axonal and demyelinating neuropathies, toxic neuropathies (e.g. cytostatic-induced N.), motoneuropathies, ALS and inflammatory and diabetic neuropathies.
  • toxic neuropathies e.g. cytostatic-induced N.
  • the object of the invention is to provide new genes and gene products with the aid of which a diagnosis of nerve lesions and inherited neurodegenerative diseases is possible and which are suitable for the therapy of peripheral nerve damage.
  • the genes and gene products can be used to stimulate regeneration, to inhibit degenerative progression processes and / or for — in particular genetic — therapy of neurodegenerative hereditary diseases.
  • the invention relates to nucleic acids of the sequences SEQ ID NO: 1 to 30 and the amino acids of the sequences SEQ ID NO: 31-33.
  • the invention further relates to protein-coding nucleic acids which hybridize with one of the nucleic acids of the sequences SEQ ID NO: 1 to 30 in the coding region or in the 3'- or 5'-untranslated regions (standard conditions according to Sambrook et al. (8)) and code for proteins expressed in damaged and / or regenerating nerves.
  • the protein-coding nucleic acids preferably contain one of the sequences SEQ ID NO: 1-4, 7-24 in the untranslated regions.
  • SEQ ID NO 5: describes the complete cDNA of the protein encoded by clone CR 11-9 (DSM 9518).
  • SEQ ID NO: 25 the cDNA from clone NT I-2B (DSM 9515)
  • SEQ ID NO: 26 the cDNA from clone NT 1-11 (DSM 9522)
  • SEQ ID NO: 27 the cDNA from clone NT 1-12 ( DSM 9520)
  • SEQ ID NO: 28 the cDNA from clone NT 1-17 (DSM 9516).
  • a nucleic acid is preferably used which hybridizes under stringent conditions with one of the nucleic acids mentioned under standard conditions.
  • standard conditions and methods for hybridization are known to the person skilled in the art and are described, for example, by J. Sambrook et al. (1989) (8) and B.D. Harnes and S.G. Higgins (1985) (37). The standard protocols described there are usually used for this. Particular reference is made to Sambrook, Section IX, both publications being the subject of the disclosure of this invention. Standardized stringent conditions are also described in Höltke and Kessler (1990) (50).
  • Preferred stringent conditions are given for hybridization in the presence of 1 mol / 1 NaCl, 1% SDS and 10% dextran sulfate and subsequent washing of the filter twice at room temperature for 5 minutes in 2 ⁇ SSC and a further washing step for 30 minutes.
  • This further washing step can be carried out at 0.5 x SSC, 0.1% SDS, preferably at 0.2 x SSC, 0.1% SDS and particularly preferably at 0.1 x SSC, 0.1% SDS at 65 ° C become.
  • the proteins expressed in damaged and / or regenerating nerves are expediently produced recombinantly using the methods familiar to the person skilled in the art.
  • a DNA is first produced, which is able to produce such a protein.
  • DNAs are contained in the plasmids DSM 9514 - DSM 9523 and DSM 9561, which were deposited on October 25, 1994 and on November 25, 1994 (DSM 9561) with the German Collection of Microorganisms for patent purposes.
  • the sequence coding for the protein can be determined with the aid of SEQ ID NO: 1 to 30 by determining the reading frame of the cDNA clones.
  • a cDNA library preferably the cDNA library cloned into ⁇ ZAPII phages, Stratagene, US
  • nucleic acid samples in accordance with the sequences SEQ ID NO: 1 to 30 mentioned according to the invention.
  • the RNA on which the library is based preferably originates from nerve tissue (in particular from the sciatic nerve of mammals, such as rats or humans). CDNA fragments which are as close as possible to the 5 'end of the sequences should preferably be used as probes. It is also possible to use the RACE method (FINDERACE Kit, Clontech Laboratories, Darmstadt, DE) to amplify longer cDNA fragments from an RNA using a polymerase chain reaction, which can then be cloned.
  • nerve tissue in particular from the sciatic nerve of mammals, such as rats or humans.
  • CDNA fragments which are as close as possible to the 5 'end of the sequences should preferably be used as probes. It is also possible to use the RACE method (FINDERACE Kit, Clontech Laboratories, Darmstadt, DE) to amplify longer cDNA fragments from an RNA using a polymerase chain reaction, which can then be cloned.
  • the desired DNA is cloned into a vector that can be transferred to a host cell and replicable there.
  • a vector contains operator elements which are required for the expression of the DNA.
  • This vector is transferred to a host cell that is capable of expressing the DNA.
  • the host cell is cultured under conditions suitable for the amplification of the vector and the recombinant protein is obtained from the cells or the supernatant. Suitable measures familiar to the person skilled in the art ensure that the protein can assume a tertiary structure in which it is active.
  • the expressed protein it is not necessary for the expressed protein to contain precisely the sequence in the coding or in the untranslated regions which is coded by SEQ ID NO: 1 to 30. Proteins which contain essentially (preferably more than 90%) the same sequence and show similar properties are also suitable.
  • nucleic acid sequence of the gene can also be modified. Such modifications are, for example:
  • Another object of the invention is a method for producing a polypeptide, which is expressed in damaged and or regenerating nerves, by expression of an exogenous DNA in prokaryotic or eukaryotic host cells and isolation of the desired polypeptide, the DNA in the coding or untranslated characteristic of the protein Range SEQ H> NO: 1 to 30 or a DNA which codes for the same amino acid as part of the degeneration of the genetic code.
  • the protein is preferably expressed in microorganisms, in particular in prokaryotes, and there in E. coli.
  • the expression vectors must contain a promoter which allows expression of the protein in the host organism.
  • promoters are known to the person skilled in the art and are, for example, lac promoter (Chang et al. (1977) (I)), trp promoter (Goeddel et al. (1980) (2)), ⁇ p promoter (Shi atake et al. ( 1981) (3)) and T5 promoter (U.S. Patent No. 4,689,406 (4)).
  • Synthetic promoters such as tac promoter (US Pat. No. 4,551,433 (5)) are also suitable. Coupled promoter systems such as, for example, T7 RNA polymerase / promoter system (Studier et al., J. Mol. Biol.
  • Hybrid promoters comprising a bacteriophage promoter and the operator region of the microorganism are also suitable (EP-A 0267 851 (7)).
  • an effective ribosome binding site is required.
  • this ribosome binding site is referred to as the Shine-Dalgarno (SD) sequence (Sambrook et al. (1989) (8)).
  • the protein As a fusion protein.
  • a DNA which codes for the N-terminal part of an endogenous bacterial protein or another stable protein is usually attached to the 5 'end of the fused for the protein coding sequence of the invention. Examples include lacZ (Phillips and Silhavy (1990) (9)), trpE (Yansura (1990) (10)).
  • the fusion proteins are preferably cleaved with enzymes (e.g. factor Xa) (Nagai et al. (1984) (11)).
  • enzymes e.g. factor Xa
  • Further examples of the cleavage sites are the IgA protease cleavage site (WO 91/11520 (12), EP-A 0495 398 (13)) and the ubiquitin cleavage site (Miller et al. (1989) (14)).
  • the proteins expressed in this way in bacteria are obtained in a conventional manner by digesting the bacteria and isolating the proteins.
  • a fusion product is preferably used, which consists of the signal sequence which is suitable for the secretion of proteins in the host organisms used and the nucleic acid which codes for the protein.
  • the protein is either secreted into the medium (for gram-positive bacteria) or into the periplasmic space (for gram-negative bacteria).
  • a cleavage site which allows the protein to be split off either during processing or in an additional step.
  • signal sequences originate, for example, from ompA (Ghrayeb et al. (1984) (15)), phoA (Oka et al. (1985) (16)).
  • Terminators are DNA sequences that signal the end of a transcription process. They are usually characterized by two structural peculiarities: an inverted repetitive G / C-rich region that can intramolecularly form a double helix, and a number of U (or T) residues. Examples are the main terminator in the DNA of phage fd (Beck and Zink (1981) (43) and rmB (Brosius et al. (1981) (17)).
  • the expression vectors usually contain a selectable marker to select transformed cells.
  • selectable markers are, for example, the resistance genes for ampicillin, chloramphenicol, erythromycin, kanamycin, neomycin and tetracycline (Davies et al. (1978) (18)).
  • suitable selectable markers are the genes for essential substances of the biosynthesis of substances necessary for the cell, e.g. Histidine, tryptophan and leucine.
  • Suitable bacterial vectors are known. For example, vectors have been described for the following bacteria: Bacillus subtilis (Palva et al. (1982) (19)), E. coli (Aman et al. (1985) (20), Studier et al. (1986) (21)) , Streptococcus cremoris (Powell et al. (1988) (22)), Streptococcus lividans and Streptomyces lividans (U.S. Patent No. 4,747,056 (23)).
  • yeast in addition to prokaryotic microorganisms, expression of the recombinant proteins according to the invention is also possible in eukaryotes (such as CHO cells, yeast or insect cells).
  • the yeast system or insect cells is preferred as the eukaryotic expression system.
  • Expression in yeast can be via three types of yeast vectors (integrating YIp (yeast integrating plasmids) vectors, replicating YRp (yeast replicon plasmids) vectors and episomal YEp (yeast episomal plasmids) vectors.
  • integrating YIp yeast integrating plasmids
  • YRp yeast replicon plasmids
  • episomal YEp yeast episomal plasmids
  • nucleic acids On the basis of the nucleic acids provided by the invention, it is possible to provide a test with which nucleic acids which encode proteins which are expressed in damaged and regenerating nerves can be detected. Such detection can take place, for example, in cells or cell lysates. Such detection can be carried out using nucleic acid diagnostics.
  • the sample to be examined is brought into contact with a probe which is selected from the group
  • nucleic acids shown in SEQ ID NO: 1 to 30 or the complementary nucleic acids are shown in SEQ ID NO: 1 to 30 or the complementary nucleic acids
  • nucleic acids which hybridize with one of the nucleic acids of a), wherein
  • the nucleic acid probe is incubated with the nucleic acid of the sample and the hybridization is optionally detected via a further binding partner of the nucleic acid of the sample and or nucleic acid probe.
  • Hybridization between the probe and nucleic acids from the sample shows the presence of the RNA of such proteins.
  • Such processes are known to the person skilled in the art and are described, for example, in WO 89/06698 (25), EP-A 0200 362 (26), USP 2915082 (27), EP-A 0 063 879 (28), EP-A 0 173 251 ( 29), EP-A 0 128 018 (30).
  • the coding nucleic acid of the sample is amplified before the test, for example using the known PCR technique.
  • a derivatized (labeled) nucleic acid probe is usually used in the context of nucleic acid diagnostics. This probe is brought into contact with a denatured DNA or RNA from the sample bound to a carrier and the temperature, ionic strength, pH value and other buffer conditions - depending on the length of the nucleic acid sample and the resulting melting temperature of the hybrid to be expected - see above chosen that the labeled DNA or RNA can bind to homologous DNA or RNA (hybridization, see also J. Mol. Biol. (1975) (31), Proc. Natl. Acad. Sei.
  • Suitable carriers are membranes or carrier materials based on nitrocellulose (eg Schleicher and Schuell, BA 85, Amersham Hybond, C), reinforced or bound powdery nitrocellulose or nylon membranes derivatized with various functional groups (eg nitro group) (eg Schleicher and Schüll, Nytran) ; NEN, Gene Screen; Amersham Hybond M .; Pall Biodyne).
  • Hybridizing DNA or RNA is then detected by incubating the support with an antibody or antibody fragment after thorough washing and saturation to prevent non-specific binding.
  • the antibody or the antibody fragment is directed against the substance incorporated in the nucleic acid probe during derivatization.
  • the antibody is marked.
  • a directly labeled DNA can also be used. After incubation with the antibodies, washing is carried out again in order to detect only specifically bound antibody conjugates. The determination is then carried out via the labeling of the antibody or antibody fragment according to methods known per se.
  • - after amplification e.g. PCR technique
  • the invention therefore comprises a method for the detection of nucleic acids which code for a protein which is expressed in damaged and / or regenerating nerves, characterized in that the sample to be examined is incubated with a nucleic acid probe which is selected from the group
  • nucleic acids shown in SEQ ID NO: 1 to 30 or the complementary nucleic acids b) nucleic acids which hybridize with one of the nucleic acids of a), wherein
  • the nucleic acid probe is incubated with the nucleic acid of the sample and the hybridization is optionally detected via a further binding partner of nucleic acid of the sample and / or nucleic acid probe.
  • nucleic acids according to the invention are therefore valuable prognostic markers in the diagnosis of nerve damage.
  • the nucleic acid of the sequence SEQ ID NO: 6 is used.
  • SEQ ID NO: 6 describes the complete sequence of NT 11-11.
  • the coding area lies between bases 362-907.
  • the corresponding protein is listed in SEQ ID NO: 31.
  • NT 13-11 is a plasmolipin cDNA extended by 234 base pairs N-terminally (Fischer and Sapirstein (1994) (44)).
  • the nucleic acid encodes a protein with a molecular weight of 19.4 kDa with four transmembrane domains.
  • NT II-11 is expressed in myelinating glial cells of the CNS (oligodendrocytes) and PNS (Schwann cells) and, like a number of other myelin proteins (PLP, PMP22, Connexin 32), is characterized by four hydrophobic transmembrane domains. Like these proteins, NT II-11 can have the property of a potential disease gene for neurodegenerative diseases. Such diseases are, for example, in the CNS and PNS, Paelizaeus-Märzbacher disease, Charcot-Marie-Tooth neuropathy type la, Pressure-Neuropathy HNPP and Dejerine-Sottas disease. NT 11-11 is a valuable marker for the detection of neurodegenerative hereditary diseases.
  • This property can be tested in an in vitro test for the growth of Schwann cells and their myelinating capacity in neuron-Schwann cell cocultures. Such a test can be carried out analogously to the test for determining the protein function of PMP22 (Zoidl et al. (1995) (45)).
  • NT II-1 SEQ ID NO: 29
  • CRII-7 SEQ ID NO: 30
  • NT II-1 shows in three domains up to 79% similarity (including conservative amino acid exchanges) to CDC4L in humans (Feuchter et al. (1992) (46)).
  • NT II-1 can be involved in regulating the cell growth of Schwann cells during nerve regeneration in order to induce the dedifferentiation of Schwann cells and to stimulate the entry of these cells into the cell division cycle.
  • the proliferation of Schwann cells is an important sub-step of nerve regeneration. Only when the division phase has ended can Schwann cells begin myelinating regenerating axons. A cell in division does not form a medullary sheath.
  • NT II-1 as a nucleic acid or protein can be a valuable therapeutic agent for the regeneration of nerve cells.
  • SEQ ID NO: 29 shows the nucleic acid sequence from NT II-l.
  • the coding region of a polypeptide with NT II-1 activity is preferably between nucleotides 1-2661 or can be extended at the N-terminal.
  • the corresponding amino acid sequence shows SEQ ID NO: 32. Partial sequences of NT II-1 are described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • CRII-7 shows as nucleic acid and protein clear similarities with a macrophage-specific cysteine-rich mouse protein (MS2) and a metalloproteinase (Blobel and White (1992) (47); Weskamp and Blobel (1994) (48); Katagiri et al. (1995) (49)).
  • the glycoprotein according to the invention occurs in soluble form in the nervous system since it contains no transmembrane domain.
  • the protein also has a modulatory function in cell-cell interactions as a disintegrin. Disintegrins can change integrin-mediated interactions between cells and the extracellular matrix (ECM). Because of the two protein functions (disintegrin, metalloproteinase), a mobilizing effect on cell-cell and cell-matrix contacts can be assumed for the protein according to the invention (antithrombolytic effect, sperm-egg cell contact inhibition).
  • CRII-7 can loosen the Schwann cell ECM contacts and thus facilitate the regeneration of injured axons. It can be assumed that CRII-7 fulfills this function in particular in the early phase of the regeneration process. As a nucleic acid and protein, CRII-7 thus represents a valuable therapeutic substance for the treatment of nerve damage.
  • SEQ ID NO: 30 shows the nucleic acid sequence of CRII-7.
  • the coding region of a polypeptide with CRII-7 activity lies between nucleotides 244-2370.
  • the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 33. Partial sequences of the nucleic acid sequence of CRII-7 are described in SEQ LD NO: 3 and 4.
  • CRII-7 The effect of CRII-7 can be confirmed in an in vitro test.
  • the binding of cells and matrix (fibronectin or vitronectin) in the cell culture is checked.
  • An analog test can be set up using Schwann cells and fibronectin or laminin substrates.
  • the effectiveness of NT II-1 can be tested in an in vitro model with primary Schwann cell cultures.
  • Cell proliferation can be checked by incorporating 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU).
  • sequence listing either shows the complete cDNA with 5 * and 3 'untranslated region of the nucleic acids according to the invention (SEQ ID NO: 5, 6 and 25-30) or partial areas thereof.
  • Table I shows an overview. The sequences are contained in the assigned plasmids and can be determined and isolated therefrom with the aid of the sequences SEQ ID NO: 1 to 30 according to methods familiar to the person skilled in the art. In the event of deviations, the sequences contained in the plasmids are to be regarded as correct.
  • sequence is in the range consisting of 5'-, 3 * UT (untranslated
  • NT I-2B shows in a partial sequence sequence similarity to NICER elements (Cho et al.,
  • the sciatic nerve in Wistar rats is damaged by crushing (crush lesion) or cutting (transection).
  • 3 cDNA libraries were produced, starting from polyA + RNA of the undamaged sciatic nerve or the distal nerve section one week after the crush lesion (see Table II).
  • the size selection of double-stranded cDNA by Sepharose gel filtration led to the separation of small cDNA fragments ( ⁇ 400 bp).
  • the ⁇ ZAP ⁇ phage (from Stratagene) was used as the vector and can be converted into a Bluescript SK ⁇ phagemid (from Stratagene) by coinfection with an Ml 3 helper phage ("Exassist", from Stratagene).
  • the type and quantity ratio of the cDNA clones obtained after transformation represent the messenger RNAs present in the cells at that time.
  • a total of 5000 cDNA clones were transferred to replica filters in a multi-stage process.
  • a filter was hybridized with radiolabeled control nerve cDNA; the other with radioactively labeled cDNA of the regenerating nerve section one week after the crush lesion. After washing and exposure, signals appeared on the autoradiogram whose intensity was proportional to the amount of RNA of the corresponding cDNA sequence in the two tissues.
  • the clones that showed a different hybridization signal were regarded as differentially regulated, isolated and subjected to renewed hybridization (so-called "rescreen”).
  • Cross hybridization experiments in the Southern blot yielded groups of homologous clones.
  • the largest cDNA clones were sequenced and identified by computer-aided comparison (FASTA, GCG software) with previously published sequences (eg GenBankTM EMBL database).
  • the cDNA library cloned into the ⁇ ZAPII phages was plated out on agar plates (diameter: 150 mm) according to the manufacturer (Stratagene, La Jolla, CA). In order to screen the entire cDNA library with a few plates, very high phage densities of 1 - 2 x 10 5 phages / plate were chosen. The plates were incubated overnight at 37 ° C.
  • Hybond N filters After removing the Plaques of Hybond N filters (Amersham International), they are processed according to the manufacturer's instructions. The filters were prehybridized and hybridized in 7% sodium dodecyl sulfate (SDS) / 0.5 M Na phosphate pH 7.0 at 60 ° C (Church and Gilbert (1984) (33)). The hybridization is carried out with [ 32 P] dCTP-labeled samples which were produced by unidirectional PCR reaction (Sezl et al. (1991) (34)) or by random-primed labeling. The filters were washed in 2 x SSC / 0.1% SDS at 60 ° C for 15 minutes and then in 0.1 x SSC / 1% SDS at 60 ° C for 15 minutes. The exposure was at -70 ° C on a Kodak X-OMAT X-ray film.
  • the conversion into the Bluescript SK H phagemid takes place by co-infection of E.coli XLlBlue cells with an M13 exassist phage according to the manufacturer (Stratagene, La Jolla, CA).
  • the single-stranded phagemid particles contained in the supernatant are used in various dilutions for the infection of E. coli SOLR cells; the disruptive exassist phage cannot replicate in these cells.
  • Hybond N filters are applied, incubated for two hours at 37 ° C. and after being removed by microwave treatment in the bacteria are lysed in a single step, the DNA is denatured and fixed (Buluwela et al. (1989) (36)).
  • the subsequent hybridization is carried out according to the above-mentioned method.
  • the plasmid DNA was obtained using the Qiagen spin plasmid kit (Qiagen GmbH, Hilden BRD).
  • DSM 9514-DSM 9523 and DSM 9561 are available under DSM (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig ) on October 25, 1994 or November 25, 1994 (DSM 9561).
  • DSM 9561 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig ) on October 25, 1994 or November 25, 1994 (DSM 9561).
  • DNA fragments containing genes according to the invention or parts thereof are sequenced and appropriately modified at the ends (e.g. via PCR) and used as a whole or in combination in an expression vector for E. coli.
  • the tac promoter is used as the promoter. However, it is also possible to use other, preferably well-regulated promoters.
  • An E. coli strain that has been transformed with an expression plasmid is grown either in minimal medium or LB medium with antibiotic selection overnight at 30 or 37 ° C (e.g. in 5 ml culture).
  • the overnight culture is inoculated into a larger volume (e.g. 1 1) and allowed to continue growing. If this volume is already used for obtaining biomass, it can be induced with IPTG at an OD ⁇ O of 0.2 to 2 and the cells can continue to grow until the OD and / or the enzyme activity formed does not increase any further. At this point, centrifugation is carried out and the biomass is used to purify the proteins.
  • RNA was isolated from nerve tissue according to the method of Chomczynski and Sacchi (1987) (40)). 20 ⁇ g of total RNA were separated on a 1.2% agarose-formaldehyde gel and on nylon membranes (Amersham, Braunschweig) according to standard methods transferred (Sambrook et al. (1989) (8)). The DNA sequences SEQ ID NO: 1 to 30 were radioactively labeled as a sample (Feinberg and Vogelstein (1984), Anal. Biochem. 137, 266-267 (41)). The hybridization was carried out at 68 ° C.
  • N ⁇ I-11 complete sequence of plasmolipin
  • the proliferation rate can be determined by methods known to those skilled in the art for measuring the incorporation of e.g. 3H-thymidine or bromodeoxyuridine (BrDU) can be determined in the DNA as well as by generating and evaluating cell growth curves.
  • 3H-thymidine or bromodeoxyuridine (BrDU) can be determined in the DNA as well as by generating and evaluating cell growth curves.
  • the myelinating capacity of NTII-11 can be checked in vitro using a coculture test system.
  • the coculture system consists on the one hand of the above-mentioned transduced Schwann cells (NTII-11 overexpressing cells, NTII-1 1 underexpressing cells or control cells which carry the retroviral vector without N ⁇ I-11 cDNA sequences) and out sensory neurons that are prepared from posterior root ganglia of the embryonic rat according to the methods known to the person skilled in the art.
  • Control Schwann cells form myelin sheaths around the nerve axons within 2 weeks on collagen substrate and in culture medium containing serum, to which ascorbate and nerve growth factor are added.
  • the extent of myelin formation in the test culture can be checked by conventional light microscopic and immunocytochemical methods. In this way it can be determined whether the abnormal expression of NTÜ-11 affects the capacity of the Schwann cell for myelin formation or possibly promotes it.
  • Cell culture system primary Schwann cell culture from the rat sciatic nerve
  • Schwann cells are prepared from the sciatic nerve of 1 to 3 day old Wistar rats and immunoselected according to Brockes et al. (1979). The cultures thus obtained usually have a purity of ⁇ 99%. The almost confluent cultures are driven into growth arrest for 24 hours by adding a modified DMEM medium with the addition of 0.5% fetal calf serum (FCS) (Zoidl et al., 1995). By adding a DMEM medium with 10% FCS and 2 ⁇ M forskolin, the synchronized entry into the cell cycle is made possible. At various times after stimulation, part of the cells are subjected to the FACS analysis in order to determine the distribution in the various stages of the cell cycle. The remainder can be used to analyze NTH-1 expression and phosphorylation. The following experiments are possible.
  • FCS fetal calf serum
  • RNA is isolated according to Chomczynski and Sacchi (1987). This can be subjected to Northern blot analysis using an NTII-1-specific, radioactively labeled cDNA probe or, if the NTII-1 transcript is not very abundant, analyzed by semi-quantitative RT-PCR (Myers and Gelfand, 1991).
  • a change in the NTII-1 protein concentration can be detected by Western blot analysis using an NTH-1 specific antibody.
  • the NT ⁇ -1 protein is isolated and subjected to acidic hydrolysis.
  • the amino acid mixture obtained is analyzed by two-dimensional electrophoresis with subsequent autoradiography (Contor et al., 1987).
  • Phosphorylated tyrosine residues can be detected in a Western blot analysis with a specific antibody (Frackelton et al., 1983). After incubation of these commercially available antibodies ("py20”, ICN Biochemicals; “4G10", UBI), the antibody can be detected by means of chemiluminescence (e.g. ECL system, from Amersham).
  • phosphatases of different substrate specificity can be used. Bacterial alkaline phosphatase (Pharmacia) or acidic phosphatase from potatoes (Sigma) act on phosphorylated tyrosine, serine and threonine residues. The protein phosphatase 2A (Calbiochem) only reacts with phosphorylated serine or threonine residues, the phosphatase PTP-1B (UBI) only with phosphotyrosine residues (Anderson et al., 1990).
  • Cell culture system primary Schwann cell culture from the rat sciatic nerve
  • the specificity and effectiveness of the cell-matrix interaction could be determined by varying various parameters.
  • the extent of cell adhesion can be determined by a centrifugation experiment * after different exposure times.
  • the Schwann cells are cultivated in round bottom microtiter plates. After determining the diameter of the cell pellets and incubation with the CRII-7 protein, they are subjected to centrifugation, in which the cells are pressed together on the round bottom, so that there is a proportional relationship between the diameter of the cell pellet and the extent of the adhesion.
  • the active epitope can be determined by using CRII-7 protein fragments.
  • the tripeptide RGD (Arg-Gly-Asp) interacts with a large number of ECM molecules and is part of many disintegrin amino acid sequences.
  • Snake venom proteins such as kistrin, bitistatin or barbourin with known disintegrin activity could also be used.
  • GCCCTCCCTA CCGACAGCTC AGAGTCTGTG TCTGGGCAGA GACCGAACAC CAGTGTGGAA 120
  • MOLECULE TYPE cDNA
  • xi SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:
  • GAGCCTCCAG CTTGCTTTGA TCCTGATTTA GAAAGTGTGA CTTTCCAACT TGAACTCAGC 660
  • CTACTCTTAA GCCAGCTATG CTGTGACCTA AGCCACGGCT GGGTCTTAGC ACAGGGCCAC 960
  • MOLECULE TYPE cDNA
  • SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO: 13: ⁇ TTTTKTGTCG VGAGCTMGAG GACCGAACCC AGGGCCTTGT KCTTGCTAGG 60
  • GAAAGGCTCA GACCGGGTCT TCGAATGGTT TGTGTAGGCG TTTTTATGAA GAAAATGTAA 180
  • ATCTGAGCAA CATGTTAGTG GTCCGTTACT GTAATGTCAT ACCTGAAGAA ATCGATTTAC 240
  • TCACAGCTTC TCCCTGAATG CTGCTATGGC AAGTGACCTA CTATGTAACT CTCGAGCTTG 60
  • AAAGAACATA CAACGAAAGG CTCAGACCGG GTCTTCGAAT GGTTTGTGTA GGCGTTTTTA 180

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue Gene und Genprodukte, die in degenerierenden und/oder regenerierenden peripheren Nerven exprimiert werden, sowie deren Anwendung zur Diagnose und/oder Therapie. Die in SEQ ID NO:1 bis 30 genannten Nukleinsäuren hybridisieren mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.

Description

Neue Gene und Genprodukte zur Diagnostik und Regeneration degenerativer Nervenschädigungen
Gegenstand der Erfindung sind neue Gene und Genprodukte, die zur Diagnose von Nerven¬ schädigungen und degenerativen Erkrankungen des peripheren Nervengewebes geeignet sind, sowie die Anwendung dieser Gene bzw. Genprodukte zur Therapie von degenerativen Ner¬ venkrankheiten und zur Regeneration nach traumatischen Nervenläsionen.
Zur Gruppe von Krankheiten, die zu Nervenschädigungen fuhren, zählen u.a. angeborene axonale und demyelinisierende Neuropathien, toxische Neuropathien (z.B. zytostatika-indu- zierte N.), Motoneuropathien, ALS sowie entzündliche und diabetische Neuropathien. Häufig ist die klinische Diagnose besonders bei der umfangreichen Gruppe hereditärer axonaler und demyelinisierender Neuropathien nicht eindeutig und bedarf zur eindeutigen Feststellung molekulargenetischer Verfahren, wozu die neuen Gene und daraus abgeleitete Gensonden bei¬ tragen sollen.
Aufgabe der Erfindung ist es, neue Gene und Genprodukte bereitzustellen, mit deren Hilfe eine Diagnose von Nervenläsionen und erblicher neurodegenerativer Erkrankungen möglich ist, und die zur Therapie von peripheren Nervenschädigungen geeignet sind. Die Gene und Genprodukte können zur Stimulierung der Regeneration, zur Hemmung degenerativer Ver¬ laufsprozesse und/oder zur -insbesondere genetischen- Therapie neurodegenerativer Erb¬ krankheiten eingesetzt werden.
Gegenstand der Erfindung sind Nukleinsäuren der Sequenzen SEQ ID NO: l bis 30 und die Aminosäuren der Sequenzen SEQ ID NO:31-33.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind proteincodierende Nukleinsäuren, welche mit einer der Nukleinsäuren der Sequenzen SEQ ID NO:l bis 30 im codierenden Bereich oder in den 3'- oder 5'-untranslatierten Bereichen hybridisieren (Standardbedingungen nach Sambrook et al. (8)) und für Proteine codieren, die in lädierten und/oder regenerierenden Nerven expri- miert werden. Vorzugsweise enthalten die proteincodierenden Nukleinsäuren eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1-4, 7-24 in den untranslatierten Bereichen. SEQ ID NO 5: beschreibt die komplette cDNA des von Klon CR 11-9 (DSM 9518) codierten Proteins. SEQ ID NO:25 die cDNA von Klon NT I - 2B (DSM 9515), SEQ ID NO: 26 die cDNA von Klon NT 1-11 (DSM 9522), SEQ ID NO: 27 die cDNA von Klon NT 1-12 (DSM 9520) und SEQ ID NO: 28 die cDNA von Klon NT 1-17 (DSM 9516).
Vorzugsweise wird eine Nukleinsäure verwendet, welche unter stringenten Bedingungen mit einer der genannten Nukleinsäuren unter Standardbedingungen hybridisiert. Solche Standardbedingungen und Verfahren zur Hybridisierung sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise von J. Sambrook et al. (1989) (8) und B.D. Harnes und S.G. Higgins (1985) (37) beschrieben. Die dort beschriebenen Standardprotokolle werden üblicherweise hierfür verwendet. Insbesondere wird hingewiesen auf Sambrook, Section IX, wobei beide Publikationen Gegenstand der Offenbarung dieser Erfindung sind. Standardisierte stringente Bedingungen sind ebenso beschrieben in Höltke und Kessler (1990) (50).
Bevorzugte stringente Bedingungen sind gegeben bei einer Hybridisierung in Gegenwart von 1 mol/1 NaCl, 1% SDS und 10% Dextransulfat bei anschließendem zweifachen Waschen des Filters bei Raumtemperatur für 5 Minuten in 2 x SSC und einem weiteren Waschschritt für 30 Minuten. Dieser weitere Waschschritt kann bei 0,5 x SSC, 0,1% SDS, vorzugsweise bei 0,2 x SSC, 0,1% SDS und besonders bevorzugt bei 0,1 x SSC, 0,1% SDS bei 65°C durchgeführt werden.
Die Herstellung der in lädierten und/oder regenerierenden Nerven exprimierten Proteine erfolgt zweckmäßig rekombinant nach den dem Fachmann geläufigen Methoden.
Dazu wird zunächst eine DNA hergestellt, welche in der Lage ist, ein derartiges Protein zu produzieren. Solche DNAs sind in den Plasmiden DSM 9514 - DSM 9523 und DSM 9561 enthalten, die am 25. Okt. 1994 bzw. am 25.11.94 (DSM 9561) bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen für Patentzwecke hinterlegt wurden. Die das Protein codierende Sequenz kann mit Hilfe von SEQ ID NO: l bis 30 ermittelt werden, indem man den Leserahmen der cDNA-Klone ermittelt. Hierzu wird eine cDNA-Bibüothek (vorzugsweise die in λZAPII Phagen klonierte cDNA-Bibliothek, Stratagene, US) mit Nukleinsäureproben ent¬ sprechend den erfindungsgemäß genannten Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis 30 durchgemustert. Die der Bibliothek zugrundeliegende RNA stammt vorzugsweise aus Nervengewebe (insbesondere aus dem Ischiasnerv von Säugern, wie Ratte oder Mensch). Als Sonden sollten vorzugsweise cDNA-Fragmente verwendet werden, welche möglichst nahe am 5'-Ende der Sequenzen liegen. Ebenso möglich ist es, durch das RACE- Verfahren (FINDERACE Kit, Clontech Laboratories, Darmstadt, DE) ausgehend von einer RNA mittels Polymerase-Kettenreaktion längere cDNA- Fragmente zu amplifizieren, die dann kloniert werden können.
Die gewünschte DNA wird in einen Vektor kloniert, der in eine Wirtszelle transferiert werden kann und dort replizierbar ist. Ein derartiger Vektor enthält zusätzlich zur erfindungsgemäßen Sequenz Operatorelemente, die zur Expression der DNA erforderlich sind. Dieser Vektor wird in eine Wirtszelle transferiert, die in der Lage ist, die DNA zu exprimieren. Die Wirtszelle wird unter Bedingungen, die zur Amplifikation des Vektors geeignet sind, kultiviert und das rekombinante Protein aus den Zellen oder dem Überstand gewonnen. Dabei wird durch geeignete, dem Fachmann geläufige Maßnahmen sichergestellt, daß das Protein eine tertiäre Struktur einnehmen kann, in der es aktiv ist.
Dabei ist es nicht erforderlich, daß das exprimierte Protein genau die Sequenz im codierenden oder in den untranslatierten Bereichen enthält, welche von SEQ ID NO: l bis 30 codiert wird. Ebenso geeignet sind Proteine, welche im wesentlichen (vorzugsweise zu mehr als 90%) die gleiche Sequenz enthalten und analoge Eigenschaften zeigen.
Auch die Nukleinsäuresequenz des Gens kann modifiziert sein. Derartige Modifikationen sind beispielsweise:
- Veränderungen der Nukleinsäure, um verschiedene Erkennungssequenzen von Restriktionsenzymen zur Erleichterung der Schritte der Ligation, Klonierung und Mutagenese einzuführen;
- Veränderungen der Nukleinsäure zum Einbau von bevorzugten Codons für die Wirtszelle;
- Ergänzung der Nukleinsäure um zusätzliche Operatorelemente, um die Expres¬ sion in den Wirtszellen zu optimieren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, welches in lädierten und oder regenerierenden Nerven exprimiert wird, durch Expression einer exogenen DNA in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen und Isolierung des gewünschten Polypeptids, wobei die DNA im für das Protein charakteristischen codierenden oder untranslatierten Bereich SEQ H> NO:l bis 30 oder eine DNA, welche im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes für die gleiche Aminosäure codiert, enthält. Die Expression des Proteins erfolgt vorzugsweise in Mikroorganismen, insbesondere in Pro- karyonten, und dort in E. coli.
Die Expressionsvektoren müssen einen Promotor enthalten, der die Expression des Proteins im Wirtsorganismus erlaubt. Derartige Promotoren sind dem Fachmann bekannt und sind bei¬ spielsweise lac Promotor (Chang et al. (1977) (I)), trp Promotor (Goeddel et al. (1980) (2)), λp Promotor (Shi atake et al. (1981) (3)) und T5 Promotor (US-Patent Nr. 4,689,406 (4)). Ebenfalls geeignet sind synthetische Promotoren wie beispielsweise tac Promotor (US-Patent Nr. 4,551,433 (5)). Ebenso geeignet sind gekoppelte Promotorsysteme wie beispielsweise T7- RNA-Polymerase/Promotorsystem (Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113 (6)). Ebenso geeignet sind hybride Promotoren aus einem Bacteriophagen-Promotor und der Operator- Region des Mikroorganismus (EP-A 0267 851 (7)). Zusätzlich zum Promotor ist eine effek¬ tive Ribosomenbindungsstelle erforderlich. Für E. coli wird diese Ribosomenbindungsstelle als Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz bezeichnet (Sambrook et al. (1989) (8)).
Zur Verbesserung der Expression ist es möglich, das Protein als Fusionsprotein zu exprimie- ren. In diesem Fall wird üblicherweise eine DNA, welche für den N-terminalen Teil eines endogenen bakteriellen Proteins oder ein anderes stabiles Protein codiert, an das 5'-Ende der für die erfindungsgemäßen Proteine codierenden Sequenz fusioniert. Beispiele hierfür sind beispielsweise lacZ (Phillips and Silhavy (1990) (9)), trpE (Yansura (1990) (10)).
Nach Expression des Vektors, vorzugsweise eines biologisch fünktionellen Plasmids oder eines viralen Vektors, werden die Fusionsproteine vorzugsweise mit Enzymen (z.B. Faktor Xa) gespalten (Nagai et al. (1984) (11)). Weitere Beispiele für die Spaltstellen sind die IgA- Protease-Spaltstelle (WO 91/11520 (12), EP-A 0495 398 (13)) und die Ubiquitin-Spaltstelle (Miller et al. (1989) (14)).
Die auf diese Weise in Bakterien exprimierten Proteine werden durch Aufschluß der Bakterien und Proteinisolierung in üblicher Weise gewonnen.
In einer weiteren Ausführungsform ist es möglich, die Proteine als aktive Proteine aus den Mikroorganismen zu sezernieren. Hierzu wird vorzugsweise ein Fusionsprodukt verwendet, welches aus der Signalsequenz, die für die Sekretion von Proteinen in den verwendeten Wirts¬ organismen geeignet ist, und der Nukleinsäure, welche für das Protein codiert, besteht. Das Protein wird dabei entweder in das Medium (bei grampositiven Bakterien) oder in den peri- plasmatischen Raum (bei gramnegativen Bakterien) sezerniert. Zwischen der Signalsequenz und der für die erfindungsgemäßen Proteine codierenden Sequenz ist zweckmäßig eine Spalt¬ stelle angebracht, die entweder bei der Prozessierung oder in einem zusätzlichen Schritt die Abspaltung des Proteins erlaubt. Derartige Signalsequenzen stammen beispielsweise von ompA (Ghrayeb et al. (1984) (15)), phoA (Oka et al.(1985) (16)).
Zusätzlich enthalten die Vektoren noch Terminatoren. Terminatoren sind DNA-Sequenzen, die das Ende eines Transkriptionsvorganges signalisieren. Sie zeichnen sich meist durch zwei strukturelle Eigenarten aus: eine umgekehrt repetitive G/C-reiche Region, die intramolekular eine Doppelhelix bilden kann, sowie eine Anzahl von U(bzw. T)-Resten. Beispiele sind der Hauptterminator in der DNA des Phagen fd (Beck und Zink (1981) (43) sowie rmB (Brosius et al. (1981) (17)).
Zusätzlich enthalten die Expressionsvektoren üblicherweise einen selektierbaren Marker, um transformierte Zellen zu selektieren. Derartige selektierbare Marker sind beispielsweise die Resistenzgene für Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin, Neomycin und Tetracyclin (Davies et al. (1978) (18)). Ebenso geeignete selektierbare Marker sind die Gene für essentielle Substanzen der Biosynthese von für die Zelle notwendigen Stoffen wie z.B. Histidin, Tryptophan und Leucin.
Es sind eine Vielzahl von geeigneten bakteriellen Vektoren bekannt. Beispielsweise sind für die folgenden Bakterien Vektoren beschrieben: Bacillus subtilis (Palva et al. (1982) (19)), E. coli (Aman et al. (1985) (20), Studier et al. (1986) (21)), Streptococcus cremoris (Powell et al. (1988) (22)), Streptococcus lividans und Streptomyces lividans (US-Patent Nr. 4,747,056 (23)).
Weitere gentechnologische Verfahren zur Herstellung und Expression von geeigneten Vekto¬ ren sind in J. Sambrook et al. (1989) (8) beschrieben.
Eine Expression der rekombinanten erfindungsgemäßen Proteine ist außer in prokaryontischen Mikroorganismen auch in Eukaryonten (wie beispielsweise CHO-Zellen, Hefe oder Insekten¬ zellen) möglich. Als eukaryontisches Expressionssystem wird das Hefesystem oder Insekten¬ zellen bevorzugt. Die Expression in Hefe kann über drei Arten von Hefevektoren (integrierende YIp (yeast integrating plasmids)- Vektoren, replizierende YRp (yeast replicon plasmids)-Vektoren und episomale YEp (yeast episomal plasmids)-Vektoren erfolgen. Näheres hierzu ist beispielsweise in S.M. Kingsman et al (1987) (24) beschrieben. Auf Basis der durch die Erfindung bereitgestellten Nukleinsäuren ist es möglich, einen Test bereitzustellen, mit dem Nukleinsäuren, welche Proteine codieren, die in lädierten und regenerierenden Nerven exprimiert werden, nachgewiesen werden können. Ein derartiger Nachweis kann beispielsweise in Zellen oder Zell-Lysaten erfolgen. Ein solcher Nachweis kann mittels der Nukleinsäuren-Diagnostik geführt werden. Hierbei wird die zu untersuchende Probe (sample) mit einer Sonde in Kontakt gebracht, welche ausgewählt ist aus der Gruppe
a) der in SEQ ID NO:l bis 30 gezeigten Nukleinsäuren oder der dazu komplemen¬ tären Nukleinsäuren,
b) Nukleinsäuren, die mit einer der Nukleinsäuren von a) hybridisieren, wobei
die Nukleinsäuresonde mit der Nukleinsäure der Probe inkubiert wird und die Hybridisierung gegebenenfalls über einen weiteren Bindepartner von Nukleinsäure der Probe und oder Nukleinsäuresonde nachgewiesen wird.
Eine Hybridisierung zwischen der Sonde und Nukleinsäuren aus der Probe zeigt das Vorhan¬ densein der RNA von derartigen Proteinen. Derartige Verfahren sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in der WO 89/06698 (25), EP-A 0200 362 (26), USP 2915082 (27), EP-A 0 063 879 (28), EP-A 0 173 251 (29), EP-A 0 128 018 (30) beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die codierende Nukleinsäure der Probe vor dem Test amplifiziert, beispielsweise mittels der bekannten PCR-Technik. Übli¬ cherweise wird im Rahmen der Nukleinsäurediagnostik eine derivatisierte (markierte) Nuklein¬ säuresonde verwendet. Diese Sonde wird mit einer an einen Träger gebundenen denaturierten DNA oder RNA aus der Probe in Kontakt gebracht und hierbei die Temperatur, Ionenstärke, pH- Wert und sonstige Pufferbedingungen - abhängig von der Länge der Nukleinsäureprobe und der daraus resultierenden Schmelztemperatur des zu erwartenden Hybrids - so gewählt, daß die markierte DNA oder RNA an homologe DNA oder RNA binden kann (Hybridisierung, siehe auch J. Mol. Biol. (1975) (31), Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1979) (32)). Als Träger geeignet sind Membranen oder Trägermaterialien auf Basis Nitrocellulose (z.B. Schleicher und Schüll, BA 85, Amersham Hybond, C), verstärkte oder gebundene pul- verfbrmige Nitrocellulose oder mit verschiedenen funktionellen Gruppen (z.B. Nitrogruppe) derivatisierte Nylonmembranen (z.B. Schleicher und Schüll, Nytran; NEN, Gene Screen; Amersham Hybond M.; Pall Biodyne). Die Detektion von hybridisierenden DNA oder RNA erfolgt dann dadurch, daß der Träger nach gründlichem Waschen und Absättigen zur Verhinderung unspezifischer Bindung mit einem Antikörper oder Antikörperfragment inkubiert wird. Der Antikörper oder das Antikör¬ perfragment ist gegen die in der Nukleinsäuresonde bei der Derivatisierung inkorporierte Sub¬ stanz gerichtet. Der Antikörper wiederum ist markiert. Es kann jedoch auch eine direkt mar¬ kierte DNA verwendet werden. Nach der Inkubation mit den Antikörpern wird nochmals gewaschen, um nur spezifisch gebundene Antikörperkonjugate nachzuweisen. Die Bestim¬ mung erfolgt dann über die Markierung des Antikörpers oder Antikörperfragments nach an sich bekannten Methoden.
Der Nachweis der Expression kann durchgeführt werden beispielsweise als:
— in situ-Hybridisierung mit fixierten ganzen Zellen mit fixierten Gewebsabstrichen und iso¬ lierten Metaphasen-Chromosomen,
— colony-Hybridisierung (Zellen) und plaque-Hybridisierung (Phagen und Viren)
— Southern-Hybridisierung (DNA-Nachweis)
— Northern-Hybridisierung (RNA-Nachweis),
— Serum-Analytik (z.B. Zelltypanalyse von Zellen in Serum, durch slot-blot-Analyse),
— nach Amplifikation (z.B. PCR-Technik).
Die Erfindung umfaßt daher ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, welche für ein Protein codieren, das in lädierten und/oder regenerierenden Nerven exprimiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Probe mit einer Nukleinsäurensonde inkubiert wird, welche ausgewählt ist aus der Gruppe
a) der in SEQ ID NO: 1 bis 30 gezeigten Nukleinsäuren oder der dazu komplementären Nukleinsäuren, b) Nukleinsäuren, die mit einer der Nukleinsäuren von a) hybridisieren, wobei
die Nukleinsäuresonde mit der Nukleinsäure der Probe inkubiert wird und die Hybridisierung ggf. über einen weiteren Bindepartner von Nukleinsäure der Probe und/oder Nukleinsäure¬ sonde nachgewiesen wird.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind damit wertvolle prognostische Marker in der Diagnostik von Nervenschädigungen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Nukleinsäure der Sequenz SEQ ID NO:6 verwendet. SEQ ID NO:6 beschreibt die vollständige Sequenz von NT 11-11. Der codierende Bereich liegt zwischen den Basen 362-907. In SEQ ID NO:31 ist das entspre¬ chende Protein aufgeführt. NT 13-11 ist eine um 234 Basenpaare N-terminal verlängerte cDNA von Plasmolipin (Fischer und Sapirstein (1994) (44)). Die Nukleinsäure codiert ein Protein mit einem Molekulargewicht von 19,4 kDa mit vier Transmembrandomänen.
NT II-11 wird in myelinisierenden Gliazellen des ZNS (Oligodendrocyten) und PNS (Schwannzellen) exprimiert und zeichnet sich wie eine Reihe anderer Myelinproteine (PLP, PMP22, Connexin 32) durch vier hydrophobe Transmembrandomänen aus. Ebenso wie diese Proteine kann NT II- 11 die Eigenschaft eines potentiellen Krankheitsgens für neurodegenera- tive Erkrankungen besitzen. Solche Erkrankungen sind beispielsweise im ZNS und PNS, Paelizaeus-Märzbacher Krankheit, Charcot-Marie-Tooth-Neuropathie Typ la, Pressure- Neuropathy HNPP und Dejerine-Sottas-Erkrankung. Damit stellt NT 11-11 einen wertvollen Marker zur Erkennung von neurodegenerativen Erbkrankheiten dar.
Diese Eigenschaft kann in einem in vitro Test auf Wachstum von Schwannzellen und ihrer Myelinisierungskapazität in Neuron-Schwannzell-Cokulturen geprüft werden. Ein derartiger Test kann analog dem Test zur Bestimmung der Proteinfunktion von PMP22 durchgeführt werden (Zoidl et al. (1995) (45)).
Weitere Gegenstände der Erfindung sind NT II-l (SEQ ID NO:29) und CRII-7 (SEQ ID NO:30) als Nukleinsäure und Protein.
Die Aminosäuresequenz von NT II-l zeigt in drei Domänen bis zu 79% Ähnlichkeit (einschließlich konservativer Aminosäureaustausche) mit CDC4L des Menschen (Feuchter et al. (1992) (46)). Ebenso wie CDC4L kann NT II-l an der Regulation des Zellwachstums von Schwannzellen während der Nervenregeneration beteiligt sein, um die Dedifferenzierung von Schwannzellen zu induzieren und den Eintritt dieser Zellen in den Zellteilungszyklus zu stimu¬ lieren. Die Proliferation von Schwannzellen ist ein wichtiger Teilschritt der Nervenregenera¬ tion. Erst wenn die Teilungsphase beendet ist, können Schwannzellen mit der Myelinisierung regenerierender Axone beginnen. Eine in Teilung befindliche Zelle bildet keine Markscheide aus. Die erfolgreiche Regeneration und Myelinisierung von Nervenfasern setzt eine streng koordinierte Regulation der Dedifferenzierung, Proliferation und RedifFerenzierung voraus. Aus diesem Grund kann NT II-l als Nukleinsäure oder Protein ein wertvolles Therapeutikum zur Regeneration von Nervenzellen darstellen. SEQ ID NO: 29 zeigt die Nukleinsäuresequenz von NT II-l. Der codierende Bereich eines Polypeptids mit NT II-l Aktivität liegt dabei vorzugsweise zwischen den Nukleotiden 1-2661 oder kann N-terminal verlängert sein. Die entsprechende Aminosäuresequenz zeigt SEQ ID NO: 32. Teilsequenzen von NT II-l sind in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO:2 beschrieben.
CRII-7 zeigt als Nukleinsäure und Protein deutliche Ähnlichkeiten mit einem Makrophagen- spezifischen cysteinreichen Protein der Maus (MS2) und einer Metalloproteinase (Blobel und White (1992) (47); Weskamp und Blobel (1994) (48); Katagiri et al. (1995) (49)). Das erfin¬ dungsgemäße Glycoprotein tritt im Nervensystem in löslicher Form auf, da es keine Trans¬ membrandomäne enthält. Neben einer Proteasefunktion besitzt das Protein auch eine modula¬ torische Funktion bei Zell-Zell-Interaktionen als Disintegrin. Disintegrine können Integrin- vermittelte Wechselwirkungen zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM) verän¬ dern. Aufgrund der beiden Proteinfünktionen (Disintegrin, Metalloproteinase) kann für das erfindungsgemäße Protein eine mobilisierende Wirkung auf Zeil-Zeil- und Zell-Matrix- Kontakte angenommen werden (antithrombolytische Wirkung, Sperma-Eizell-Kontakt- hemmung).
Schwannzellen sind wesentlich am Aufbau der ECM beteiligt. Auf ihrer Oberfläche bilden diese Zellen eine Basalmembran aus, die besondere wachstumsstimulierende Eigenschaften für regenerierende Nervenfasern besitzt. Regenerierende Nervenfasern wachsen deshalb bevor¬ zugt im Zwischenraum zwischen der Schwannzelloberfläche und der Basalmembran. CRII-7 kann aufgrund seiner Disintegrin- und Protease-Eigenschaften die Schwannzell-ECM-Kon- takte auflockern und damit die Regeneration verletzter Axone erleichtern. Dabei ist anzuneh¬ men, daß CRII-7 diese Funktion insbesondere in der Frühphase des Regenerationsprozesses erfüllt. Damit stellt CRII-7 als Nukleinsäure und Protein eine wertvolle therapeutische Sub¬ stanz zur Behandlung von Nervenschädigungen dar.
SEQ ID NO:30 zeigt die Nukleinsäuresequenz von CRII-7. Der codierende Bereich eines Polypeptids mit CRII-7 Aktivität liegt dabei zwischen den Nukleotiden 244-2370. Die ent¬ sprechende Aminosäuresequenz zeigt SEQ ID NO:33. Teilsequenzen der Nukleisäuresequenz von CRII-7 sind in SEQ LD NO:3 und 4 beschrieben.
Die Wirkung von CRII-7 kann in einem in vitro Test bestätigt werden. Dabei wird die Bindung von Zellen und Matrix (Fibronectin oder Vitronectin) in der Zellkultur geprüft. Ein analoger Test kann mit Schwannzellen und Fibronectin- oder Lamininsubstraten aufgebaut werden. Die Wirksamkeit von NT II-l kann in einem in vitro Modell mit primären Schwannzellkultu- ren geprüft werden. Die Zellproliferation kann über den Einbau von 5-Brom-2'-Deoxyuridin (BrdU) geprüft werden.
Die Hinterlegungen sowie die folgenden Beispiele, Publikationen und das Sequenzprotokoll erläutern die Erfindung, deren Schutzumfang sich aus den Patentansprüchen ergibt, weiter. Die beschriebenen Verfahren sind als Beispiele zu verstehen, die auch noch nach Modifikationen den Gegenstand der Erfindung beschreiben.
Im Sequenzprotokoll ist entweder die vollständige cDNA mit 5* und 3' untranslatiertem Bereich der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren (SEQ ID NO: 5, 6 und 25-30) oder Teilberei¬ che davon dargestellt. Tabelle I zeigt einen Überblick. Die Sequenzen sind in den zugeordne¬ ten hinterlegten Plasmiden enthalten und lassen sich daraus mit Hilfe der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis 30 nach dem Fachmann geläufigen Verfahren bestimmen und isolieren. Im Falle von Abweichungen sind die in den Plasmiden enthaltenen Sequenzen als richtig anzusehen.
Tabelle I
Figure imgf000013_0001
!) wenn keine Angabe: Sequenz ist im Bereich, bestehend aus 5'-, 3* UT (untranslatierte
Region) und codierendem Bereich, enthalten. 2) NT I-2B zeigt in einer Teilsequenz Sequenzähnlichkeit zu NICER-Elementen (Cho et al.,
(1990)) (42) Beispiel 1
Identifizierung der DNA-Sequenzen
A) Verwendete cDNA-Banken
In einem Tiermodell wird bei Wistar-Ratten der Ischiasnerv durch Quetschen (Crushläsion) oder Durchtrennen (Transection) lädiert.
In einem weiteren Schritt wurden 3 cDNA-Banken hergestellt, ausgehend von polyA+-RNA des nicht lädierten Ischiasnervs bzw. des distalen Nervenabschnitts eine Woche nach Crush¬ läsion (siehe Tabelle II).
Die Größenselektion doppelsträngiger cDNA durch Sepharosegelfiltration (S400-LKB, Fa. Pharmacia) führte zur Abtrennung kleiner cDNA-Fragmente (< 400 bp). Als Vektor wurde der λ ZAP π-Phage (Fa. Stratagene) verwendet, der sich durch Coinfektion mit einem Ml 3 Helferphagen ("Exassist", Fa. Stratagene) in ein Bluescript SKπ-Phagemid (Fa. Stratagene) überführen läßt.
Die nach Transformation erhaltenen cDNA-Klone repräsentieren in Art und Mengenverhältnis die zu diesem Zeitpunkt in den Zellen vorhandenen messenger RNAs.
Tabelle U
poly(A)+RNA Gewebe Primer Komplexität mittl. cDNA μg Länge (bp)
4.4 Kontrollnerv oligo dT 0.5 x 106 - 2300
5 Crush distal oligo dT 1.6 x lO6 > 400 1 Woche n.L.
5 random hex. 0.4 x 106 > 400
B) Diflerentielle Hybridisierung
Es wurden insgesamt 5000 cDNA-Klone in einem mehrstufigen Verfahren auf Replica-Filter überführt. Ein Filter wurde mit radioaktiv markierter cDNA des Kontrollnervs hybridisiert; der andere mit radioaktiv markierter cDNA des regenerierenden Nervenabschnittes eine Woche nach Crushläsion. Nach Waschen und Exposition traten auf dem Autoradiogramm Signale auf, deren Intensität proportional der RNA-Menge der entsprechenden cDNA-Sequenz in den beiden Geweben war. Die Klone, die ein unterschiedlich starkes Hybridisierungssignal zeigten, wurden als differentiell reguliert betrachtet, isoliert und einer erneuten Hybridisierung unter¬ worfen (sogenanntes "Rescreen"). Durch Kreuzhybridisierungsexperimente im Southern Blot erhielt man Gruppen homologer Klone. Die jeweils größten cDNA-Klone wurden ansequen¬ ziert und durch Computer-unterstützten Vergleich (FASTA, GCG-Software) mit bereits publizierten Sequenzen (z.B. GenBankTM EMBL databank) identifiziert.
Beispiel 2
Durchmustern der cDNA-Bibliothek nach vollständigen Klonen ("Full-Length-Screen")
Ausstreichen der cDNA Bibliothek
Die in den λZAPII Phagen klonierte cDNA-Bibliothek wurde nach Angaben des Herstellers (Stratagene, La Jolla, CA) auf Agar-Platten (Durchmesser: 150 mm) ausplattiert. Um die gesamte cDNA-Bibliothek mit wenigen Platten zu durchmustern, wurden sehr hohe Phagen- dichten von 1 - 2 x 105 Phagen/Platte gewählt. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.
Plaque-Filterhybridisierung
Nach Abziehen der Plaques of Hybond N-Filter (Amersham International) werden diese nach Angaben des Herstellers weiterbehandelt. Die Filter wurden prähybridisiert und hybridisiert in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS)/0,5 M Na-Phosphat pH 7,0 bei 60°C (Church und Gilbert (1984) (33)). Die Hybridisierung erfolgt mit [32P]dCTP-markierten Proben, die durch uni- direktionale PCR-Reaktion (Stürzl et al. (1991) (34)) oder durch Random-primed Markierung hergestellt wurden. Die Filter wurden in 2 x SSC/0,1% SDS bei 60°C für 15 Minuten und an¬ schließend in 0,1 x SSC/1% SDS bei 60°C für 15 Minuten gewaschen. Die Exposition erfolgte bei -70°C auf einen Kodak X-OMAT Röntgenfilm.
Charakterisierung der gefundenen cDNA-Klone
Diese erfolgte durch Analyse der Phagengemische mittels Polymerase-Ketten-Reaktion in Anlehnung an Hamilton et al. (1991) (35). Hierbei wurden die signalgebenden Bereiche der Platten großzügig ausgeschnitten und die Phagen durch Inkubation in SM-Puffer nach Anga¬ ben des Herstellers eluiert (Stratagene, La Jolla, CA). Jedes Lysat enthält einige hundert Phagenklone, von denen einer zur Probe korrespondierende Sequenzen enthält. Jedes Lysat wurde einer dreifachen PCR-Amplifikation unterzogen. 1. Durch Verwendung zweier interner cDNA-spezifischer Primer wurde die Spezifität des Hybridisierungssignales verifiziert.
273. Durch Verwendung eines cDNA-spezifischen Primers, der "antisense" im äußersten 5'- Bereich der bekannten Sequenz gelegen ist, und jeweils eines vektorspezifischen Primers, der in der T7- bzw. T3-Promotor-Region bindet, erfolgte die Amplifikation neuer stromaufwärts gelegener Sequenzen. Die Größe des Amplifikationsproduktes zeigte, wieviel an neuer Sequenz zu erwarten war. Nur Phagen-Eluate, die Klone ausreichender Länge enthielten, wurden weiter charakterisiert.
In vivo Exzision
Die Umwandlung in das Bluescript SK H Phagemid geschieht durch Coinfektion von E.coli XLlBlue-Zellen mit einem M13-Exassist-Phagen nach Angaben des Herstellers (Stratagene, La Jolla, CA). Die im Überstand enthaltenen einzelsträngigen Phagemidpartikel werden in ver¬ schiedenen Verdünnungen zur Infektion von E.coli SOLR-Zellen benutzt, in diesen Zellen kann sich der störende Exassist-Phage nicht replizieren. Nach Ausstreichen der infizierten E.coli-Zellen auf Ampicillin-haltige Agar-Platten und 8- bis 10-stündiger Inkubation bei 37°C werden Hybond N Filter aufgelegt, zwei Stunden bei 37°C inkubiert und nach dem Abziehen durch Mikrowellen-Behandlung in einem einzigen Schritt die Bakterien lysiert, die DNA dena¬ turiert und fixiert (Buluwela et al. (1989) (36)). Die anschließende Hybridisierung erfolgt nach dem oben aufgeführten Verfahren.
Plasmid-DNA-Präparation
Die Gewinnung von Plasmid-DNA wurde mit dem Qiagen Spin-Plasmid-Kit (Qiagen GmbH, Hilden BRD) durchgeführt.
Sequenzierung
Es wurden jeweils 3 bis 5 μg Plasmid-DNA mittels Vektor- oder cDNA-spezifischen Primern unter Verwendung des Sequenase Version 2.0 DNA-Sequenzierungskits (USB, Cleveland, Ohio) sequenziert.
Vektoren, die die genannten Fragmente, und damit die SEQ ID NO: 1 bis 30, enthalten, sind unter DSM 9514 - DSM 9523 und DSM 9561 bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig) am 25.10.94 bzw. am 25.11.94 (DSM 9561) hinterlegt worden. Beispiel 3 Expression
DNA-Fragmente, die erfindungsgemäße Gene oder Teile davon enthalten, werden sequenziert und in geeigneter Weise an den Enden modifiziert (z.B. via PCR) und als Ganzes oder in Kombination in einen Expressionsvektor für E. coli eingesetzt. Als Promotor wird der tac Promotor verwendet. Die Verwendung anderer, vorzugsweise gut regulierbarer Promotoren ist jedoch auch möglich.
Ein E. coli Stamm, der mit einem Expressionsplasmid transformiert worden ist, wird entweder in Minimalmedium oder LB Medium unter Antibiotika-Selektion über Nacht bei 30 oder 37°C angezogen (z.B. in 5 ml Kultur). Die Übernachtkultur wird in ein größeres Volumen (z.B. 1 1) überimpft und weiterwachsen gelassen. Verwendet man dieses Volumen bereits zur Biomas¬ sengewinnung kann man bei einer OD^O von 0.2 bis 2 mit IPTG induzieren und die Zellen weiterwachsen lassen, bis die OD und/oder die gebildete Enzymaktivität nicht weiter zunimmt. Zu diesem Zeitpunkt wird abzentrifugiert und die Biomasse zur Aufreinigung der Proteine verwendet.
Beispiel 4
Nachweis von mRNA in Nervengewebe
Ein Nachweis, daß in Nervengewebe Proteine exprimiert werden, die von Nukleinsäuren codiert werden, welche mit SEQ ID NO. l bis 30 hybridisieren, und demzufolge mRNA vor¬ handen ist, kann einerseits mit den etablierten Methoden der Nukleinsäure-Hybridisierung er¬ folgen, wie etwa Northern-Hybridisierung, in-situ-Hybridisierung, Dot- oder Slot-Hybridisie¬ rung und daraus abgeleiteten diagnostischen Techniken (Sambrook et al. (1989) (8); Nucleic Acid Hybridisation - A Practical Approach, Hrsg. BD Harnes und SJ Higgins (1985), IRL Press (37); WO 89/06698 (25), EP-A 0200362 (26), USP 2915082 (27), EP-A 0 063 879 (28), EP-A 0 173 251 (29), EP-A 0 128 018 (30)). Andererseits können Methoden aus dem vielfältigen Repertoire der Amplifikationstechniken unter Verwendung von spezifischen Primem angewandt werden (PCR Protocols - A Guide to Methods and Applications; Hrsg. MA Innis, DH Gelfand, JJ Sninsky, TJ White (1990), Academic Press Inc. (38); PCR - A Practical Approach; Hrsg. MJ McPherson, P Quirke, GR Taylor (1991), IRL Press (39)). Die RNA wurde hierfür aus Nervengewebe nach der Methode von Chomczynski und Sacchi (1987) (40)) isoliert. 20 μg Gesamt-RNA wurden auf einem 1,2% Agarose-Formaldehyd-Gel aufgetrennt und auf Nylon-Membranen (Amersham, Braunschweig) nach Standard-Methoden übertragen (Sambrook et al. (1989) (8)). Als Probe wurden die DNA-Sequenzen SEQ ID NO:l bis 30 radioaktiv markiert (Feinberg und Vogelstein (1984), Anal. Biochem. 137, 266- 267 (41)). Die Hybridisierung erfolgte bei 68°C in 5 x SSC, 5 x Denhardt, 7 % SDS/0,5 M Phosphat-Puffer pH 7,0, 10% Dextransulfat und 100 μg ml Lachssperma-DNA. Anschließend wurden die Membranen zweimal je eine Stunde in 1 x SSC bei 68°C gewaschen und dann auf Röntgenfilm exponiert.
Beispiel 5
In vitro Test NTDI-11
Die biologische Funktion von NΗI-11 (vollständige Sequenz von Plasmolipin) auf die Prolife¬ ration von Schwannzellen und ihre Myelinisierungskapazität kann an Testsystemen in der Zell¬ kultur überprüft werden.
Einfluß von NTIJ-11 (Plasmolipin) auf das Proliferationsverhalten:
Primäre Schwannzellkulturen werden nach dem in Beispiel 6 genannten Verfahren hergestellt. Anschließend werden in die Multiklonierungsstelle des retroviralen Vektors pSLX-CMV NΗI-1 1-CDNA Sequenzen in "sense" bzw. "antisense" Orientierung hineinkloniert. Mit den Vektorkonstrukten werden Ψ2- Verpackungszellen transfiziert, aus dem Kulturüberstand infektiöse Virusvektor-partikel gewonnen und diese zur Infektion von Schwannzellkulturen eingesetzt. Auf diese Weise werden Schwannzellen erhalten, die entweder das "sense" oder das "antisense"-NTπ-l 1-Konstrukt tragen. Zellen mit dem "sense"-Konstrukt in ihrem Genom werden NTHl l (Plasmolipin) überexprimieren. Andererseits werden Zellen, die das "antisense"-Konstrukt tragen NTII-11 in geringerer Menge exprimieren. Das Ausmaß der NTπ-11 Expression kann mit Hilfe der RT-PCR-, Northern-Blot und Western-Blot-Methoden überprüft werden.
Die Proliferationsrate kann durch dem Fachmann bekannte Methoden zur Messung des Einbaus von z.B. 3H-Thymidin oder Bromdesoxyuridin (BrDU) in die DNA sowie durch die Erstellung und Auswertung von Zeilwachstumskurven bestimmt werden.
Weitergehende Tests unter Verwendung synchronisierter Schwannzellkulturen (zur Synchro¬ nisation siehe Beispiel 6) in der Durchflußzytometrie erlaubt eine quantitative Aussage über die zeitabhängige Verteilung der Zellpopulation in verschiedenen Phasen des Zellzyklus.
Einfluß von NTü-ll auf die Myelinisierungskapazität von Schwannzellen:
Die Myelinisierungskapazität von NTII-11 kann durch ein Cokultur-Testsystem in vitro über¬ prüft werden. Das Cokultursystem besteht einerseits aus den oben genannten transduzierten Schwannzellen (NTII-11 überexprimierende Zellen, NTII-1 1 unterexprimierende Zellen bzw. Kontrollzellen, die den retroviralen Vektor ohne NΗI-11 cDNA-Sequenzen tragen) und aus sensorischen Neuronen, die aus Hinterwurzelganglien der embryonalen Ratte nach den dem Fachmann bekannten Verfahren präpariert werden. Auf Collagen-Substrat und in Serum- haltigen Kulturmedium, dem Ascorbat und Nervenwachstumsfaktor zugesetzt wird, bilden Kontroll-Schwannzellen innerhalb von 2 Wochen Myelinscheiden um die Nervenaxone. Durch gängige lichtmikroskopische und immuncytochemische Verfahren kann das Ausmaß der Myelinbildung in der Testkultur überprüft werden. Auf diese Weise läßt sich festgestellen, ob die abnorme Expression von NTÜ-11 die Kapazität der Schwannzelle zur Myelinbildung be¬ einträchtigt oder eventuell fördert.
Beispiel 6
In vz'tro-Modell NTTI-1:
Zellkultursystem: Primäre Schwannzellkultur aus dem Ischiasnerv der Ratte
Aus dem Ischiasnerv 1 bis 3 Tage alter Wistar-Ratten werden Schwannzellen präpariert und durch Immunoselektion nach Brockes et al. (1979) aufgereinigt. Die so erhaltenen Kulturen bestitzen üblicherweise eine Reinheit von ~99%. Die nahezu konfluenten Kulturen werden durch Zugabe eines modifizierten DMEM-Mediums unter Zusatz von 0,5% fetalem Kälberserum (FCS) für 24 Stunden in den Wachstumsarrest getrieben (Zoidl et al., 1995). Durch Zugabe eines DMEM-Mediums mit 10% FCS und 2 μM Forskolin wird der synchronisierte Eintritt in den Zellzyklus ermöglicht. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stimulierung wird ein Teil der Zellen der FACS-Analyse unterworfen, um die Verteilung in den verschiedenen Stadien des Zellzyklus zu bestimmen. Der restliche Teil kann zur Analyse der NTH-1 -Expression und Phosphorylierung verwendet werden. Hierbei sind folgende Experimente denkbar.
Untersuchung der NTQ-1 mRNA-Expression
Nach Lyse der Zellen wird die Gesamt-RNA nach Chomczynski und Sacchi (1987) isoliert. Diese kann unter Verwendung einer NTII-1 spezifischen, radioaktiv markierten cDNA-Sonde der Northernblotanalyse unterworfen werden, oder bei geringer Abundanz des NTII-1 Transkriptes durch semiquantitative RT-PCR (Myers und Gelfand, 1991) analysiert werden.
Untersuchung der NTII-1 Proteinexpression
Eine Veränderung der NTII-1 Proteinkonzentration kann durch Westernblotanalyse unter Verwendung eines NTH-1 spezifischen Antikörpers detektiert werden.
Untersuchung derNTII-1 Phosphorylierung Eine Änderung im Phosphorylierungsstatus eines Proteins geht mit einer Veränderung des Molekulargewichtes einher, die durch Mobilitätsänderung in der SDS-PAGE sichtbar wird. Zum Nachweis einer Proteinphosphorylierung bieten sich mehrere Methoden an:
a) Nach radioaktiver Markierung der Zellen mittels anorganischem 32phosphats, wird das NTπ-1 -Protein isoliert und einer sauren Hydrolyse unterzogen. Das erhaltene Aminosäuregemisch wird durch zweidimensionale Elektrophorese mit anschließender Autoradiographie analysiert (Contor et al., 1987).
b) Phosphorylierte Tyrosinreste können in einer Westernblotanalyse mit einem spezifischen Antikörper detektiert werden (Frackelton et al., 1983). Nach Inkubation dieser kommerziell erhältlichen Antikörper („py20", ICN Biochemicals; „4G10", UBI) kann der Antikörper mittels Chemoluminiszenz detektiert werden (z.B. ECL-System, Fa. Amersham).
c) Zur enzymatischen Dephosphorylierung können Phosphatasen verschiedener Substratspezifität verwendet werden. Die bakterielle alkalische Phosphatase (Pharmacia) oder die saure Phosphatase aus Kartoffeln (Sigma) wirken auf phosphorylierte Tyrosin-, Serin- und Threonin-Reste. Die Protein Phosphatase 2A (Calbiochem) reagiert nur mit phosphorylierten Serin- oder Threonin-Resten, die Phosphatase PTP-1B (UBI) nur mit Phosphotyrosin-Resten (Anderson et al., 1990).
Literatur
Anderson, N.G., Maller, J.G., Tonks, N.K. Sturgill, T.W. (1990) Nature, 343: 651-653. Brockes, J.P., Fields, K.L. and Raff, M.C. (1979) BrainRes., 165: 105-118. Contor, L., Lamy F. und Lecoq, RE. (1987) Anal. Biochem., 160: 414-420. Frackelton, A.R., Ross, A.H. und Eisen H.N. (1983) Mol. Cell. Biol., 3: 1343-1352. Myers, T.W., Gelfand, D.H. (1991) Biochemistry, 30: 7661-7666. Zoidl, G, Blass-Kampmann, S., DT rso, D.D., Schmalenbach, C. and H.W. Müller (1995) EMBOJ, 14: 1122-1128. Beispiel 7
In fw-Modell CRH-7:
Zellkultursystem: Primäre Schwannzellkultur aus dem Ischiasnerv der Ratte
Zur Untersuchung der CRH-7 Funktion könnten die oben bereits beschriebenen primären Schwannzellkulturen verwendet werden.
Durch Variation verschiedener Parameter ließe sich die Spezifität und Effektivität der Zell- Matrix-Interaktion bestimmen.
1.) Variation der Substratbedingungen
Durch Beschichten der Zellkulturschalen mit verschiedenen Komponenten der Extrazellulärmatrix wie Kollagen I, Kollagen IV, Laminin, Fibronektin oder Vitronektin kann untersucht werden, welche dieser Komponenten durch Interaktion mit dem CRII-7-Protein zu einer Modulation der Zell-Matrix-Interaktion führen.
2.) Variation der CRII-7-Konzentration und Inkubationsdauer
Nach Zugabe verschidener Menge an CRII-7 kann nach verschieden langen Einwirkungszeiten das Ausmaß der Zelladhäsion durch ein Zentrifugationsexperiment* bestimmt werden. Hierzu werden die Schwannzellen in Mikrotiterplatten mit Rundboden kultiviert. Nach Bestimmung des Durchmessers der Zellpellets und Inkubation mit dem CRII-7-Protein werden sie einer Zentrifugation unterzogen, bei der die Zellen auf dem Rundboden zusammengedrängt werden, so daß sich ein proportionaler Zusammenhang zwischen Durchmesser des Zellpellets und dem Ausmaß der Adhäsion ergibt.
3.) Variation des verwendeten CRII-7 Proteins
Durch Verwendung von CRII-7-Proteinfragmenten kann das aktive Epitop ermittelt werden.
4.) Verwendung spezifischer Inhibitoren
Zur Kontrolle und zur genaueren Definition der Interaktion bieten sich verschiedene Inhibitoren an. Das Tripeptid RGD (Arg-Gly-Asp) interagiert mit einer Vielzahl von ECM- Molekülen und ist Bestandteil vieler Disintegrin-Aminosäuresequenzen. Ebenso könnten Schlangengiftproteine wie Kistrin, Bitistatin oder Barbourin mit bekannter Disintegrin- Wirkung Verwendung finden.
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(50) Höltke und Kessler, The Dig System User's Guide For Further Hybridisation (1990), Boehringer Mannheim GmbH, DE
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
(B) STRASSE: Sandhofer Str. 116
(C) ORT: Mannheim
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: D-69305
(G) TELEFON: 08856/60-3446 (H) TELEFAX: 08856/60-3451
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Neue Gene und Genprodukte zur Diagnostik und Regeneration degenerativer Nervenschaedigungen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 33
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30B (EPA)
(vi) DATEN DER URANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: DE P 44 43 159.7
(B) ANMELDETAG: 05-DEC-1994
(vi) DATEN DER URANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: DE 195 02 525.3
(B) ANMELDETAG: 27-JAN-1995
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 152 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
AGAAAAACCC CATATTTATA ATTGAGAGAC GTTAGACAGA CCTTAAATGG TTCATTGAGT 60
TAGTGGCTTA GTTTGAAGTC TCATGGTACA GGCAATTAGG TCCTTATTTA GAAAAAAAAA 120
AAGGCCTTTA TACCTATTTA CAATATACAC AG 152 -- D
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 171 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
TACTCTGGCT TTTCAAAAGG GAATTCGGAA TAAAGTCTAC CAAAGGTTCC TGGCAGTTGT 60
GCCCTCCCTA CCGACAGCTC AGAGTCTGTG TCTGGGCAGA GACCGAACAC CAGTGTGGAA 120
CAAGGGTCTG GCTTACTCAG CACCTGGTTG GAGAGAGTCT GTGACTCAGA G 171
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 224 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
TCCAAGACCT CACATTTATT ACAACAGAGC AGAGACAGAC CACATTCCCG TCCTTCCACC 60
ACCTACTCCA GCCCCAGCCC CTTBCCAACA CTCAGCTGCA GGTAATTCAG TGGGTCCCMG 120
GTACTACTGA ACAGCGCCTG KGTGGTTCTT TAGGGCTGGA TGCCATATTG TCTAAGCTTC 180
TGCTTCTCTA GTGTTTTGTG RGAGATTCAG ACAGAGGTTC ACWT 224
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 110 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
GAGGTACTGA GGAAGAGCAG CAAGCCAGCC CAGAGAGGAC CCAGAGTAGA TCCTTGGAGA 60
ACCAGGTTGT TCAGGACAGC CCCCCAATTA ACCTAACAGA AGTGCTTAGA 110
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 882 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
TGACTTCTGC TAGTGCTTCC GGCGAGGTCC CTTCCTGGGG AGTTCTGGCC TCTGCGGTCC 60
AAGCTTCTGC AGAAGATGTT TTATCATATT TCCCTGGAGC ACGAGATCCT ACTGCACCCA 120
CGCTACTTTG GTCCCAACTT GCTCAACACG GTGAAGCAGA AGCTGTTCAC CGAGGTGGAG 180
GGGACCTGCA CTGGGAAATA TGGCTTTGTG ATTGCTGTCA CTACCATCGA CAATATTGGT 240
GCTGGTGTGA TCCAGCCGGG CCGAGGTTTT GTTCTTTATC CAGTGAAATA CAAAGCTATT 300
GTTTTCCGGC CCTTTAAAGG GGAAGTGGTG GATGCTGTGG TCACTCAGGT CAACAAGGTT 360
GGACTTTTCA CAGAAATTGG GCCCATGTCC TGCTTCATCT CTCGACACTC CATCCCTTCA 420
GAGATGGAGT TTGATCCAAA TTCGAACCCC CCTTGTTACA AGACCATGGA TGAGGACATT 480
GTAATTCAGC AGGACGATGA GATACGCTTG AAGATTGTAG GGACACGTGT AGACAAGAAT 540
GACATTTTTG CTATTGGCTC TCTGATGGAT GACTACTTGG GACTTGTGAG CTGAGTGAGG 600
GAGCCTCCAG CTTGCTTTGA TCCTGATTTA GAAAGTGTGA CTTTCCAACT TGAACTCAGC 660
ACCAACTTGA CTGTCGTACC AAGAGGTTCA ATCTGGCCAC TGTTATGGGG GCAGGGAAGA 720
AGGCTCCTTG TCCCCAGAAC ACTTTGTTTC TTCCAGCTGA GCTGTGCTCT TATTCTCTTC 780
TGTGTTCTAA CCATAAACAT GTTGTCCTTA GTTCTCAAGG AAATGTGTCT TCTCTTGGTA 840
GGAATAAAAG TTGTTTATTT ATTTTAAAAA AAAAAAAAAA AA 882 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1622 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_peptide
(B) LAGE:362..907
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
AACACCACCC CATACCTAGT GGGCACTTTT TCAAAGACAT AGAGCGTGAC CTGAGACGTC 60
TTGCCCACTA TGTCCGGTGG GTTTTTGACA TCACATGTGA AAGTGCCGTT GTCACTGTAG 120
TCTAGGTTGT GTATGACAAT GGAGCCTGCC CAAACACCAG CACACTAGGG GTTCTTCACG 180
ATCTCTATCC AGAGCAAACA GGCGAACCGA GGGTTAAGGG GCGGGGCCTC TTCGAGGGGC 240
GGGGCCTCGG GCGGAGCGGG GTCGGGCTTC GCGCACCTGT AGGTTCTGTC TAGGGATCCG 300
CTGTCGCAGC CCCGGAGCAG CGCCGGGAGC GCGTCCCGAG CGTCGTAGGC TCGCGATCGC 360
TATGGCGGAG TTCCCGTCGA AAGTGAGCAC CAGGACCAGC AGCCCCGCGC AGGGCGTGGG 420
AGCATCTGTG TCTGCGATGC GACCGGACCT GGGCTTTGTG CGCTCCGCCC TTGGGGTGCT 480
CGCGCTTCTG CAGCTGGTGC TGGGGCTGCT GGTGTGGGCC TTGATTGCTG ACACCCCATA 540
CCACCTGTAT CCTGCCTACG GCTGGGTTAT GTTTGTAGCT GTCTTCCTCT GGCTGGTAAC 600
AATTGTCTTC TTCATCATCT ACCTGTTTCA ACTGCACATG AAGTTGTATA TGGTGCCCTG 660
GCCGTTGGTG TTACTGGTCT TCTTTGTTGC TGCCACCGTC CTCTATATCA CCGCCTTTGT 720
CGCCTGTGCG GCGGCGGTCG ATCTGACATC CCTGAGGGGC TCCCGACCGT ACAACCAGCG 780
CTCGGCTGCC TCTTTCTTTG CTTGTCTGGT GATGATTGCC TACGGACTGA GTGCTTTCTT 840
CAGCTTCCAG GCCTGGCGAG GAGTGGGCAG CAACGCGGCC ACGAGTCAGA TGGCTGGGGG 900
CTACTCTTAA GCCAGCTATG CTGTGACCTA AGCCACGGCT GGGTCTTAGC ACAGGGCCAC 960
CCCCAACCTT ACCAGGCTTA AGCTCTCCAA GCACTCCTGA GGAACAGGCC CAAGCTGGCA 1020 CAGATGGACA GCCAAGAGCC AGGAGCGGGG ACATCCTCCT CACCTCCCTT ATTCAGCAGA 1080 AGATGATGGG GTTGGGGGGC TCTTGTGGCT TTGCCTTGTC ATCAGAGAAC TTCAGTGTCC 1140 CAGGCTGGGC CACCCTGCTC ACCAGCACTA AATGCACTAA CAGACCTTCA GCCTCTGATC 1200 TGCCTAGTGT AAACCTAACA AGACAACACA TGATCTACGT TCCAGAAGCT AAGCCCACCC 1260 CCAGGCTCTT CTGGACCCAC CTCCCCCTCC CCTACCGCAC GCCAACCCAT TGTCACCTGT 1320 AGAGAGACTT TTATAGAAGA GTTGGGATTT CGAGGACTGG ACTATTTCAG TTGGTTTCAA 1380 TAGTTTCCAA GACAGCAAGC CTCACCATGT CCCCTCCCTC ACGTGGAACT CTTTCTCTCC 1440 TTTGGGAGAG AGCATCCGTG CAGGGTGCTC CCCCCAGGCT GCTGATTAGA CACAGGGGAC 1500 TTCCAAGGAG GGAGAGAGGG AAGCAGGGCC TTGCCTGGTG AGTTGTCAGG AGGTTAATGG 1560 CGACTCTTAT TTGGAATTAT TATTTTTTAC AATTTAAATA AAAATGGATG TGTCTGTTTG 1620 GA 1622
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 184 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
TAATACGCAC TCACTAWAGG GMMVAAATTG GGMTACGGCG CCCCCCCCTC GAGGNYCGMA 60
CGGSTATCGC AATAAGCCTT GAATAATCGA AATCCCCCCC CCGCTACCMG CCCTTYGCCT 120
TYCCTTTCAA GATGCTGATT TGCGCCSCCC CGMCAGAAGA AAATARGGGW TCTGCGAGAA 180
MGCC 184
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 133 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
ACCAGCCTTT GCTTTCCTTT CAAGTGTGTT TGGTCGCCCG CAGAGAAATA GGGTCTGGAG 60
AAGCTGCCTA TGAAGCCAGA TGGAGGGATA CATAAGAAAG GAAGATCCCA CCTGTCCTTC 120
TTATGGACTC TGG 133
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 141 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAACA GAGCTGGGGA 60
CAGAACCCAG GGCCTTGTGC TTGCTAGGCA AGTGCTCTAC CACTGAGCTA AATTTCCCCA 120
ACCCCTGAAT TTCTTTTATA G 141
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 70 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10: AGGTCACCGA GATGCGTTCC AGGTCGGTGG CGGCCATSGA SCTGCGCACC GGGCGGGCGG 60 GTTGCGGGGA 70
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 239 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
TCCCTGAGCG CCGCAGCRTC ACCGAGATGC GTTCCAGGTC GGTGGCCGCC ATGGCGAGCT 60
GCGCACCGGG CGCSGCGGGT TGCGGGGAGC GCCGGGGCCG CGGGAGGGAC GAGCCGGCTG 120
CGGRACGCGC TCCGCCGGGG CGCNYGCGGM WGAATGGAWC CAATATGGCC ACTTCCTGGA 180
AACTCCCCTT GGCGGCGGCG GCGGGAGAAG CCGCGAGASC GGCCCCGCCC CCGCBCGAG 239
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 296 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12: ττττττττττ TTTTGTCGGA GCTGAGGACC GAACCCAGGG CCTTGTGCCT TGCTAGGCCA 60
AGCTCTCTAC CACTGACCTA AATCCCCAAT TCCCCCCCCC CCTTTTTTTT AAAGCGCAGA 120
AATATTATGG GAATGTGTTT TTGTTTTAAT CCTGGTGCGG GGACGTGGGG CTGCTTTCCC 180
GCAGTGACTG TGATTTGCCT CGTGCTCTAG CAAGAGCGTG GTCTTACCAG CTGTACAGAG 240
TTGTTGCAAT TGTATGTTAT TTTGGAACTC TGGGGACTTT TCAGAGGATA TATAAA 296
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 427 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13: ττττττττττ TTTTKTGTCG VGAGCTMGAG GACCGAACCC AGGGCCTTGT KCTTGCTAGG 60
CAAGCTCTCT ACCACTGACC TAAATCCCCA ATTCCCCCCC CCCTTTTTTT TTAAAGCGCA 120
GAAATATTAT GGGAATGTGT TTTTGTTTTA ATCCCTGGTG CGGGGACGTG GGGCTGCTTT 180
CCCGCAGTGA CTGTGATTTG CTCGTGCTCT AGCAAGAGCG TGGTCTTGCC AGCTGTACAG 240
AGTTGTTGCA TTGTATGCCA TTTTGGACTC TGGGGACTTT TCAGAGGATA TATAAATGCT 300
CGAGCCCGAT GGAAAGGACA GGTTGGCAAC TGGGTGCTGT TGGGCTGTGC TTTGTCAAGT 360
AGTCCTGTGT GAAGAGACAG AAAAAAGAAA TCCAATATCC TGACACAAAG ATCAAACTTG 420
CCCAAGG 427
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 156 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
TCTTGAACTT CTTATTTAGC TGAGTCCTAT TTAGCTCAAG CACCTCTTGG GTATTAACAG 60
CTTGGGCTGC AGGACGGGCT GCACATAGAT AGTTTGTGGA AGGAGAGTAG AGTCCATTCG 120
GTGGAAGGAA GGACGGATCC ACAGATGATG TATCTA 156
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 342 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15: TCTTTGAACT TCTTATTTAG CTGAGTCCTA TTTAGCTCAA GCACCTCTTG GGTATTAACA 60 GCTTGGGCTG CAGGACGGGC TGCACATAGA TAGTTTGTGG AAGGAGAGTA GAGTCCATTC 120 GGTGGAAGGA AGGACGGATC CACAGATGAT GTATCTAGAA CCTGAGTTCA TCAAATGTCC 180
TTTGACTCCA CTCACACTGA CGGAGCTGAA AGACCTCCGG AGAGGACCTT TCCCTCAGGA 240
GGAATYCCAA GCGCCAATGA CCGAGCCGAG TCTACTCGGA TGCAATCAGC AAGAGGGKTT 300
ATTTGGAAAC ACAGGTACCT GCSGGCACAC AGTCTCTTCA GA 342
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 608 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16: ττττττττττ TTGTTTTTCT ττττcτττττ TTT GGAGCT GGGGACCAAA CCCAGGGCCT 60
TGCGCTTGCT AGGCAAGCGT TCTTACCACT GAGCTAAATC CCCAACCCCA ACTCCTAAGT 120
TTTAAAAATT TAAAAGACCA AATCATCTTA CACGTCATAT TAGTCTTAGC ACATTTGAAA 180
TTTGTGCAGT TCCATAACAC CAAAGCCTAA ATATGCTACA ACTCAGCCCT GCTCAACTGC 240
TACAGCCTTT CATCTCTGAC CTGAGGGGCA CGGAGGCGTC AGAGCCACAA TACCTAAGTT 300
TCAGGCCCAT CTCTGTCATA AACCAGTGCT TCAGCTTTCT CTCTCCAGAA ACCTGTTTGA 360
ATTTAAACTC CCACAGTGGA ACCTCTTGGC TCCTCATCTC CGCCCCACTC TCCTGTCCAG 420
ATCCATTCTT GACTCCCGCT CCTTAGAACA CAGCGCTCCT TAGAGCACAG CTTGAAGAGC 480
TTTGTGAAGA CTGAGTGCTG GTGCTTGGTC TTCTAGAAAC AGAGAGGAAC CGAGGAAAGA 540
ACAGTGCACT AGAGTTCCAG ATGAACTGTG GGGAGCATGG CCAAGGGCAT CTGGGCGGAG 600
ACAGAGGG 608
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 358 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
TCTTTGAACT TTCTCATCGA AAGGAAAGAA GACTACGCGT GAGTATTCTA TATGTACAGG 60
CTGCGTGTTG AGTATACATA ACTGAGAAGC ACGGTCAGGA ATATATAAAG AACATACAAC 120
GAAAGGCTCA GACCGGGTCT TCGAATGGTT TGTGTAGGCG TTTTTATGAA GAAAATGTAA 180
ATCTGAGCAA CATGTTAGTG GTCCGTTACT GTAATGTCAT ACCTGAAGAA ATCGATTTAC 240
AAATAAAAAG CTTTATTCCT GCTCACSGTT TGGGGGGTTC TAGTACGTGG TGGCCCTGTT 300
GCTTTGGGCC TGTKGTAAGG CAGCAAAGGG TCATGGGAGT GCATGAAAGA GCMAAACC 358
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 409 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
TGTGTCTCCA ACAAGCTGCT GAACTGAGAA TTTCTCTGAG AGCATAGTGT GGTTTTACTG 60
GTGACTAAAG ATGAGAGGCC CTATATTTGC TTGTGACGTT TTATAAACCC CTCACCAAAA 120
TAACCTCACT TTTAATCTAA GCATCTGAGG ACTAGAATTT GGGCCCAGCC ACTATTCCAG 180
AATTTACAGA AATGGAAAAV VMATTCTATT ACCATGCTAA GTCACTTTGT CCTATTGTGT 240
GGTATGTCGT GTGTGTCCTC GTGTCATCTG AATCCATACA CTTACGTGTA GCACACGTCA 300
CTACTCTCCT CTCAGTGTCG GTCACAGCAC ATCTGAAAGC CTCCGCCATC AAGGACTAGT 360
AAACATTTGT TGACAGGCCT ACTTAGCTTG CTGTGTGACA GCCATCTAA 409
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 292 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
TCACAGCTTC TCCCTGAATG CTGCTATGGC AAGTGACCTA CTATGTAACT CTCGAGCTTG 60
TCTGTTACGG GGGCTTCATT CAAGTCTCCC AAGCAGTGCA GACATTTCTG ACATCTCAAC 120
CACTGGACAT CCCTCCAGAT GCTGGGTCCT CCTATGAGCC TGCTTGGCTC CCTCAGTTGT 180
TGCATTTATC AGATGGTGTA GTTATGATCT TCCTTAGATA AGCTCCAAGT GTGGTACCCA 240
GAGCAGTCTG TTGACAGCAC CCSAGGAAGC CTGTTCTGYT GGSTTGCTCA GA 292
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 307 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
TTTTTTTTTT TVGTTCTTTT TTTTTGGAGC TGGGGACTGA ACCCAGAGCC TTGCACTTGG 60
TAGGCAAGCG CTCTACCACT GAGCTAAATC CCAACCCCCA AAGGAGAATT TAAAGTGGCC 120
TTCAAGGGGA AGAGGGGAGG ACTCACTTTG GTGACAGGAA CTCAGCCATC CTAGATGAGT 180
CCTGTGGGAG TTAAGGGACA TGCGTAAAGC CACAGCGCCA GAGTCCTCCA TGCTGCAAGT 240
GTTTCACAGT GCACTGGGCT CTTCTGCCAT GTGGAAATCT CTGCTTTDGC CATCACTTTA 300
GGGGACA 307
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 135 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
GGATCCCAGC CAGGACCAGA GCAGAAACCC TGACCTCCAC TTCTTCATTC AGACAGGACT 60
CATGGCAGCC ATGGGTTACA TCAAAGAGTC CTGCCCCATG CTGCTGATAG AGCCTGGGAT 120
TGAGAAAGCC TAGAG 135
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 182 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
TGCAGCCCGA CTATATCAGT GGTGGAGGCT TCAGCAATGT TTTCCCACAG GCCTTCATAC 60
CAGGAGGAAG CAGTAGCCCA GTTCTTGAAG TCCAGCTCTC ATCTACCTCC ATCTAGTTAC 120
TTCAATGCTA GTGGCCGTGC TTACCCAGCT GTTGCCGCGC TTTCTGATGG CTACTGGGTG 180
GT 182
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 214 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:
CTGATATAGT CAACTCATCA TTTGTGACAA GGAAAGGATT CTTGAAGGAG GTTCCTCCTA 60
CTGTAGTGAC ATAGGGGCTA GAAGCAGGGA AGCTAGGACG GACGGAACTT GTGTCTTCCG 120
GAGTTTTTTT TTTTTTTAAT GTTTGAAGAC CATTTATTAG AAAGAAACCA GTGAGACATT 180
GTGGCAGCAG ACAGGAAGGG GGTTAGGGCC TGTG 214 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 165 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:
TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAGAGA GAGAGCAACT GGTAATCATC TAACCTTTGT 60
TCAGTTAGTC AGAGTGGTTG ATCACATTTT CATGTTTTTC TGGAAAAGTT CAAAAAAAAA 120
ATTTTACATG TCACTCGAGG CAGCTAATAT CTCATTGGAG GCTTT 165
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1678 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:
GAATTCGCGG CCGCTCTTGA ACTTCTTATT TAGCTGAGTC CTATTTAGCT CAAGCACCTC 60
TTGGGTATTA ACAGCTTGGG CTGCAGGACG GGCTGCACAT AGATAGTTTG TGGAAGGAGA 120
GTAGAGTCCA TTCGGTGGAA GGAAGGACGG ATCCACAGAT GATGTATCTA GAACCTGAGT 180
TCATCAAATG TCCTTTGACT CCACTCACAC TGACGGAGCT GAAAGACCTC CGGAGAGGAC 240
CTTTCCCTCA GGAGGAATCC CAAGCGCCCA ATGACCGAGC CGAGTCTACT CGGATGCAAT 300
CAGCAAGAGG GTTTATTGGA AAACACAGGT ACCTGCGGGC ACACAGTCTC TTCAGAGGAC 360
TTGTGCGCCC AGCAGCTCCA GCATGGGGCT TTTATAGGGT TTGGGGAAGC AGAAGCGGGC 420
GTACAGAAGC AGATGCATAG TTACGGGGAT TGGTGGATTC AAACGAGGCA CATAGACATG 480
TTCACATATG ATTGGCTATT TCACATGATG AGGTAATAAG GTATAGCTAC ACACATTGGC 540
AGGTTTGGGG CGTCCTGAAT GTCGGGGGCT GGGGACTTAT CTCTTCCTGC CAGGTGGCCT 600
GTGAGTCAGA TCTGGTACTC CTGGTCTGTT CTACATTCCT TTTCTTTTAT GGTCTGTTAG 660 TTCTAGCGGC AGGGAGGGGC TGCCTGGACT TGCTTTTCAC AGTGTTTAGT CCTGAGGTTG 720 TGAATTTTGA AACATACTCT TTTAACTTCA TATTTTTAAA CCTTAAATCT GTATAAATTT 780 CCTTTCAGGG GCAACCTAAC TTGAACTCAT CAGATCTGGC TTAGGCGTGG GGTTTGGGAG 840 AGAGACAGTG AGTTCCGCAT CTGGGAATCC CAGGTCGGGG GTGGTGGGCC TCTGAGGGTT 900 TGGCACAGAA AAGAAAGACM CGTTGAGCTG CTGGGAGACA TAGTGGCTGA ATGGGACAAT 960 TGTTCTGGCA AGAGCTATGT TGAGCTGAGA ACTGAGAAAA AGGTGGTCTG TAGCTCTGGG 1020 GTATACACAA GCCACCCAGT CCGGTCAGAA GAAGCCATCT GTAAACGGAC TTTGGCTACT 1080 TTTCAGGTCC TTTTTCTTTT GCCCTTCTCC ACCCCTCTTC TTCCACCCTT TCAACCCCCT 1140 AACGCTAGGT AGGAGGGAAC AAAAGGATTG AGGGGGAAGA GAGGAACTAC GAACCATTAG 1200 CCTACTTCCT GCTGACTAAG AGGTGTTGAG TTCCTTGGGG CAAGTTTGAT CTTTGGTGTC 1260 AGGATATTGG ATTTCTTTTT TTCTGTCTCT TCACACAGGA CTACTTGACA AAGCACAGCC 1320 CAACAGCACC CAGTTGCCAA CCTGTCCTTT CCATCGGGGC TCGAGCATTT ATATATCCTC 1380 TGAAAAGTCC CCAGAGTTCC AAAATGGCAT ACAATTGCAA CAACTCTGTA CAGCTGGCAA 1440 GACCACGCTC TTGCTAGAGC ACGAGGCAAA TCACAGTCAC TGCGGGAAAG CAGCCCCACG 1500 TCCCCGCACC AGGGATTAAA ACAAAAACAC ATTCCCATAA TATTTCTGCG CTTTAAAAAA 1560 AAGGGGGGGG GGGAATTGGG GATTTAGGTC AGTGGTAGAG AGCTTGCCTA GCAAGCACAA 1620 GGCCCTGGGT TCGGTCCTCA GCTCCGACAA AAAAAAAAAA AAAGCGGCCG CGAATTCC 1678
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2214 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:
GAATTCGCGG CCGCTCTTTG AACTTTCTCA TCGAAAGGAA AGAAGACTAC GCGTGAGTAT 60
TCTATATGTA CAGGCTGCGT GTTGAGTATA CATAACTGAG AAGCACGGTC AGGAATATAT 120
AAAGAACATA CAACGAAAGG CTCAGACCGG GTCTTCGAAT GGTTTGTGTA GGCGTTTTTA 180
TGAAGAAAAT GTAAATCTGA GCAACATGTT AGTGGTCCGT TACTGTAATG TCATACCTGA 240 AGAAATCGAT TTACAAATAA AAAGCTTTAT TCCTGCTCAC GGTTTGGGGG GTTCTAGTAC 300 GTGGTGGCCC TGTTGCTTTG GGCCTGTGGT AAGGCAGCAA AGGGTCATGG GAGTGCATGA 360 AAGAGCAAAA CCGTTTACAT GGAAACCAGG GGCCGGACAG TAATGAAATG GGCGTGGTTC 420 CCAGTTCTAG TTGAGGGCAC GCCCCACTGA CCCTACTTCT TAAAGGTTCT GCTTCCTCCC 480 GGTACTGCCG TCCTGCGGCC AAGCCTTTAA CCCATGATCC TTTAAAGCAT CGGACCCACA 540 AACTTGTCAA CCAATAAGCA TATAAAAGTA TCATTAGTAA TCAGTAGAGA GATACAAGTG 600 AAGAGCCCAG GGAACTACCA ATTTTCCCCA TGTGTATGGT TAAAAGGGGG TGGAGGATGG 660 GGAGGTGACT CAGTTAGCAA AGTGACTGCT GTACAAGTAG GAACTTAGGA GTTTAGATGC 720 CTAGAACCAA AACAGGCACA ACATGCATCT GTAAGCACAG CTCGGGGAGA GAGGGGCCTA 780 GGAGGAGCCC TGGTCATCCA GCCTAGCAGA TGCAGGAGCT CTAGGTACAT CAAAAACAAC 840 AACAAAAACC GAGAGAGTGC TGTAATCCCA GTAGAAGTAG AGGCAGGTGA ATCTCTGTGA 900 GTTCGAGGCC AACCTGGCCT TCATAGTGAG CTCCAGGCTA ATAGAGAGGA TATGGAGAAG 960 CTAGAGCCCT TGCACATTGC TAATGTCCCA CTGTGGACAC AGAATTACCA TTTGATCCAG 1020 TTAACCTTAC TGGGCACGCA CTCAAGAGAA CTGGAGGTAA GAACCTGGAT ACTCAGCGTG 1080 AATGGCACTT ATTCAGAGTA GCTAGAAGCC ATATCCTTCA TTCCAGAACA GTGTAATTTC 1140 AAAGCACACT AAGTGAAATC TTACTTAGCT TTACAGAGGA GTGAGAAGAG TGCATACGTC 1200 TATGCGGATG AGTCTTGGGG ATGTGCTACC CCCAGTGCGC CAGACATTGT GTGATTCCGC 1260 TTATGTTAGC CACAGACGAA ATATGTGTCC CAGATATTCA GGGACAGAAA TGGTCTTTAC 1320 CAGGGTTGGG AACTGGGAGA TTACTGTTCA GTCCAGAGTT TTCCACATGC AAGTGTCGAG 1380 AATGCCATGG AGAGGAAAGT GGTGATTAGC GATTGGCAGC ACTGGGAACG CCCTTGATGC 1440 TACCCCACTG CCTACCTCAT GGTCCAGACA GTGACTTCTG TGCTGTGTAT CTTAGGCTGC 1500 AGAAGTTAAA CACCTGCAAG CTGTTTCGCT CCACTTCCGT TGTTTCATTC TGATAGTCAG 1560 CCCCATCGTC CATGGTTTGG GTCTTCCTTC TCCCTCTTGT CTCCGCCCAG GATGCCCTTG 1620 GCCATGCTCC CCACAGGTTC ATCTGGAACT CTAGTGCACT GTTCTTTCCT CGGTTCCTCT 1680 CTGTTCTAGA AGACCAAGCA CCAGCACTCA GTCTTCACAA AGCTCTTCAA GCTGTGCTCT 1740 AAGGAGCGCT GTGTTCTAAG GTGCGGAGTC AAGAATGGAT CTGGACAGGA GAGTGGGGCG 1800 GAGATGAGGA GCCAAGAGGT TCCACTGTGG GAGTTTAAAT TCAAACAAGG TTTCTGGCGA 1860 GAGAAAGCTG AAGCACTGGT TTATGACAGA GATGGGCCTG AAACTTAGGT ATTGTGGCTC 1920 TGACGCCTCC GTGCCCCTTC AGGTCAGAGA TGAAAGGCTG TAGCAGTTGA GCAGGGCTTA 1980 GATGTAGCAT ATTTAGGCTT TGGTGTTATG GAACTGCACA AATTTCAAAT GTGCTAAGAC 2040 TAATATGACG TGTAAGATGA TTTGGTCTTT TAAATTTTTA AAACTTAGGA GTTGGGGTTG 2100 GGGATTTAGC TCAGTGGTAG ACGCTTGCCT AGCAAGCGCA AGGCCCTGGG TTTGGTCCCC 2160 AGCTCCGAAA AAAAAGAAAA AGAAAAACAA AAAAAAAAAA GCGGCCGCGA ATTC 2214
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1220 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:
GAATTCGCGG CCGCTAATTT TTATTATAAA GCAATCTACT AAAAAAATAC AACTGTATTT 60
GAACCTTCCG ATCTCTGTGA GCTATGATGA TCAGAAGTCG GGAGTCCTTT GTGTTTAAAC 120
AACCACATGC TCACTCTTTA ACATAATTCC TGCTTATATA CGGGAAGCGA TTCACAACCG 180
CCATCCACCT GCACCTTTTG CCCAGGCGGC AATGTGGTTT AGACCTCAGG TCTGTAATTG 240
CAATACTTTT TGATGGGAGA TGTTGCACAA GTGCTATTTG TTAGCTATGA AATCAGGTTT 300
TCTGCTTGTT CTTAATGCAT GGTCAAATCA TAGCACAAAA TCATTAAAAA TAATCAGTGA 360
TAAATGATCT GTTCCCTGGG GTTGTTTGTT CACTTCTCAT AGTCAACAAA TAGAAGACTG 420
ATGTATGTGT ATGACCAGTC TTGGAAAATA CCTGTTGTTT GTGGTGCTGG AGGGAGAGCT 480
CTTGGCTACA CACCAACCCA AAGGATACTG CTGATCCGTC CCTAGTTACT GACTTTAAAA 540
TATTTGTCAT GTGTCACAGC TCATGTGTGG TGAGGACAAC CTGCTCCTGT CATGTCTCTC 600
TGACTACTAC GTGAGTTCCA AGAGCATTCT TGGCAGTGAA TGCCTTTAGT CCCTTTCTTA 660
CTGGTCTGTC ACTGATTTTT TTAAAAAAGG ACTTTCTAGT GTGTTAGAAA CCCGGATAGA 720
TCACAGGTTC TCAATCGAGA GTTCTAACAT AGGACATTCA GAATTGGTTC CTGAGAACAT 780
CGACCCCATA GGGGCTTTAG ATGGCTGTCA CACAGCAAGC TAAGTAGGCC TGCTAACAAA 840 TGTTTACTAG TCCTTGATGG CGGAGGCTTT CAGATGTGCT GTGACCGACA CTTGAGAGGA 900 GAGTAGTGAC GTGTGCTACA CGTAAGTGTA TGGATTCAGA TGACACGAGG ACACACACGA 960 CATTCCACAC AATAGGACAA AGTGTCTTAG CATGGTAATA GAATGCCTTT TCCATTTCTG 1020 TAAATTCTGG AATAGTGGCT GGGCCCAAAT TCTAGTCCTC AGATGCTTAG ATTAAAAGTG 1080 AGGTTATTTT GGTGAGGGGT TTATAAAACG TCACAAGCAA ATATAGGGCC TCTCATCTTT 1140 AGTCACCAGT AAAACCACAC TATGCTCTCA GAGAAATTCT CAGTTCAGCA GCTTGTTGGA 1200 GACACAGCGG CCGCGAATTC 1220
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1232 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:
GAATTCGCGG CCGCTCACAG CTTCTCCCTG AATGCTGCTA TGGCAAGTGA CCTACTATGT 60
AACTCTCGAG CTTGTCTGTT ACGGGGGCTT CATTCAAGTC TCCCAAGCAG TGCAGACATT 120
TCTGACATCT CAACCACTGG ACATCCCTCC AGATGCTGGG TCCTCCTATG AGCCTGCTTG 180
GCTCCCTCAG TTGTTGCATT TATCAGATGG TGTAGTTATG ATCTTCCTTA GATAAGCTCC 240
AAGTGTGGTA CCCAGAGCAG TCTGTTGACA GCACCCGAGG AAGCCTGTTC TGCTGGCTTG 300
CTCAGACATG GCAGTACCGC TGGGCCCAGC ATTAACAGCC AACCCTAGAG AAACCAGCTG 360
TGCCTCTGGA AMCGGCCTGG TGCTGAGCTT CGTTCAGGCA GCATCTGTCC ACCCTCTCTG 420
CATTTCGCTC TTTGGTAAGG TGACCTGGGG GAGATGGGAG CCCTGGATGT CAGGACCTGG 480
TGCCCATGTG DGAATCTTTC TTTCTCTTCT GAAATGTGGA ACCATCCAGT TAACTAATGA 540
AAATCCGGGA CCCCAAATCA CCTGTGTTCT CACGGCCCCC ACATTGTGTT CTACCGTCTG 600
TCCCTGTAAG GGGCCTCCAG TGGCCTTTGT CCCTCCCCTG TTCTGCCTAA TTGCCCTGAA 660
CTTTGCTGGG CCTGTGAGCC CTTTGCACAG TTACTTAAGA GCAGATTTGA ACTCTGAACT 720
CCCTGGGCTT TGTAAGTCAG TTGATTGGTT GACCAGTTAG TTGGGGTTGG GTTAGATTTT 780
AGCATTTTCT TTCTTTTTTT TTTTTTAATA ATTTCATTGC TAGATATCCA AAGCTTTGAA 840 AATACGTTTC TTAGTTCTTC AATAGAGTAC AGGAAAGCAT CGATACTCCT GGCCCTGTTT 900
CCCACATTGT CCCCTAAAGG TGATGGCTAA AGCAGAGAAT TTCCACATGG GCAGAAGAGC 960
CCAGTGCACT GTGAAACACT TGCAGCATGG AGGACTCTGG CGCTGTGGCT TTACGCATGT 1020
CCCTTAACTC CCACAGGACT CATCTAGGAT GGCTGAGTTC CTGTCACCAA AGTGAGTCCT 1080
CCCCTCTTCC CCTTGAAGGC CACTTTAAAT TCTCCTTTGG GGGTTGGGGA TTTAGCTCAG 1140
TGGTAGAGCG CTTGCCTACC AAGTGCAAGG CTCTGGGTTC AGTCCCCAGC TCCAAAAAAA 1200
AAGAACCAAA AAAAAAAAGC GGCCGCGAAT TC 1232
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 3231 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_peptide
(B) LAGE:1..2661
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:
TATTACCTCC TGGCTTTTCA AAAGGGAATT CGGAATAAAG TCTACCAAAG GTTCCTGGCA 60
GTTGTGCCCT CCCTCACCGA CAGCTCAGAG TCTGTGTCTG GGCAGAGACC GAACACCAGT 120
GTGGAACAAG GGTCTGGCTT ACTCAGCACC CTGGTTGGAG AGAAGTCTGT GACTCAGAGG 180
TGGGAGAGAG GTGAAATCAG CAACTTCCAG TATCTGATGC ACTTGAACAC CCTGGCCGGC 240
AGGTCCTACA ACGACCTTAT GCAGTACCCT GTCTTCCCCT GGATCCTCGC AGATTACGAC 300
TCCGAGGAAG TTGACCTCAC TAACCCTAAG ACATTCAGAA ACCTGGCTAA GCCAATGGGC 360
GCGCAGACGG ATGAGCGACT GGCCCAGTAC AAGAAGCGCT ACAAGGACTG GGAGGATCCC 420
AATGGGGAGA CCCCAGCCTA CCACTACGGC ACCCACTACT CCTCCGCCAT GATTGTGGCC 480
TCGTACCTCG TGAGGATGGA GCCCTTCACA CAGATATTCC TACGGCTTCA GGGTGGTCAC 540
TTTGACCTGG CAGACCGGAT GTTCCACAGT GTCCGTGAGG CCTGGTACTC AGCATCAAAG 600
CACAACATGG CGGATGTGAA AGAACTCATC CCAGAATTTT TCTACCTGCC GGAATTCCTG 660 TTCAATTCTA ACAACTTTGA CCTAGGCTGC AAACAGAATG GCACCAAGCT TGGAGATGTT 720 ATCCTTCCAC CCTGGGCAAA GGGGGACCCG AGAGAGTTCA TCCGCGTCCA CCGTGAGGCT 780 CTGGAGTGCG ACTACGTGAG TGCCCACCTG CACGAGTGGA TCGACCTCAT CTTCGGCTAT 840 AAGCAGCAGG GCCCCGCGGC AGTGGAGGCT GTGAACGTCT TCCATCACCT TTTCTACGAG 900 GGCCAAGTGG ATATCTACAA CATAAACGAC CCGCTAAAGG AGACGGCCAC CATCGGCTTC 960 ATTAACAACT TCGGTCAGAT CCCTAAGCAG TTGTTTAAAA AGCCTCATCC ACCAAAGCGA 1020 GTACGGAGTC GGCTGAACGG AGAGAATGCA GGCCTCTCTG TCCCACCAGG AGCCACCAGC 1080 GACAAGATCT TTTTCCATCA CCTAGACAAC CTGAGGCCTT CCCTAACACC CGTGAAAGAA 1140 CTCAAAGAGC CCGTGGGGCA GATCGTGTGC ACAGATAAAG GCATTCTCGC CGTAGAGCAG 1200 AACAAGGTGC TCATCCCCCC TGCTTGGAAC AAGACCTTCG CCTGGGGCTA TGCAGACCTC 1260 AGCTGCCGCC TGGGGACCTA CGAGTCAGAC AAGGCAGTGG CTGTGTATGA ATGTCTGTCC 1320 GAATGGGGCC AGATTCTCTG TGCAGTTTGC CCCAGCCCCA AGCTCGTCAT CACGGGTGGA 1380 ACAAGTACAG TGGTGTGCGT CTGGGAGATG GGCACCTCCA AAGAAAAGGC CAAGCCCCTG 1440 ACGCTCAAGC AGGCTCTACT TGGCCACACT GATACTGTCA CCTGTGCCAC AGCCTACGTA 1500 GCCTACCACA TCATTGTCAG CGGGTCCCGA GACCGAACCT GCATCATCTG GGACCTGAAC 1560 AAACTGTCGT TTCTCACCCA GCTCCGTGGC CACCGAGCGC CCGTCTCCGC CCTTTGCATT 1620 AATGAGTTAA CAGGGGACAT CGTGTCCTGT GCTGGCACAT ACGTCCACGT GTGGAGCATC 1680 AACGGGAACC CCATTGTGAG CGTCAACACC TTCACAGGCC GGAGCCAGCA GATCGTCTGC 1740 TGCTGCATGT CCGAGATGAA TGAATGGGAC ACGCAGAATG TCATCGTGAC AGGGCACTCA 1800 GATGGGGTGG TCCGGTTCTG GAGAATGGAA TTCCTGCAGG TTCCGGAAAC ACCAGCTCCT 1860 GAGCCTGTCG AAGACCTGGA GATGCAGGAA GGCTGCCCGG AAGCACAGAT AGGGCAGCAA 1920 GCCCAAGATG AAGACAGCAG TGATTCTGAG GCAGAAGAGC CCAGTGTCAG CCAGGATCCT 1980 AAGGACACGC CCAGCCAGCC CAGCAGCACC AGCCACAGGC CTCGGGCAGC CTCCTGCAGA 2040 GCCACCGCCA CATGGTGCAC TGACAGCGGC TCTGATGACT CCCGGCGCTG GTCCGACCAG 2100 CTCAGTCTTG ATGAGAAAGA TGGCTTCATA TTTGTGAACT ATTCAGAGGG CCAGGCCAGA 2160 GCACATCCTC AGGGCTCCCA CTCCCACCCC AACCCCACTG AAGCACGAAG TTACAGCAGA 2220 TTGAAACCTG GGTACCGGTG GGAGCGGCAG CTGGTGTTCA GAAGCAAACT GACTATGCAC 2280 ACGGCCTTTG ATCGGAAGGA CAACACTCAT CCAGCTGAGG TCACCGCACT GGGTGTCTCC 2340 AAGGATCACA GCAGGATCCT CGTGGGTGAC AGCCGAGGCC GAGTGTTCAG CTGGTCTGTG 2400 AGTGACCAGC CTGGCCGTTC TGCGGCCGAC CACTGGGTGA AGGACGAAGG TGGTGACAGC 2460 TGTTCAGGAT GCTCTGTACG CTTCTCCCTC ACAGAGAGAA GGCACCATTG CAGGAACTGC 2520 GGGCAGCTCT TCTGTCAGAA GTGCAGTCGA TTTCAGTCAG AAATAAAGCG ACTGAAAATC 2580 TCGTCCCCAG TGCGTGTCTG CCAGAACTGC TACTATAGCT TACAGCACGA GAGGGGGGCA 2640 GACGATGGGC CTCGGAACTG CTGAGACAGA CGGCGGGACT GACGAGAGGC CACAGCCTGA 2700 AGGAGCTCTT CCTGCCCCGT CATGGCTCCA AAGGCACTGA AGCAGACTCC GTTTACACAG 2760 ATCTGCACAC TGAGTGTCTG AAGTGTTGAG TTCAAAGGGA TCATTGGATC GGGTTCCGAG 2820 GCCAGTGACC GGCACGGGCA CTAAACCGTT AGCAGCACAA GAACGCAAGG TGGTCCCGGA 2880 GCATCTCAGA ACCCGAGTCT CCCATAGCGT AGCTGTCTCC GAGAGCAAAC TCCTGCTCCC 2940 CAACTGTCTT TCTTGTATCT CATTTTTATA GAGCTATTCA TCCTTATTTG GAAAAATCAA 3000 CAAAAACTTT AAAAAAAAGG CTTCTAGAAA ATGGTTGTAA ATCTGACTTC TTTGCAAGCA 3060 GCTGTGTATA TTGTAAATAG GTATAAAGGC CTTTTTTTTT TTCTAAATAA GGACCTAATT 3120 GCCTGTAACA TGAGACTTCA AACTAAGCCA CTAACTCAAT GAACCATTTA AGGTCTGTCT 3180 AACGTCTCTC AATTATAAAT ATGGGGTTTT TCTAAAAAAA AAAAAAAAAA A 3231
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2653 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_peptide
(B) LAGE:244..2370
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30: TGAGGTACTG AGGAAGAGCA GCAAGCCAGC CCAGAGAGGA CCCAGAGTAG ATCCTTGGAG 60 AACCAGGTTG TTCAGGACAG CCCCCCAATT AACCTAACAG AAGTGCTTCA GACTGGTTTA 120 CCTGAGACCC TGAGGATTGG ATTGGAGCTG GACGGTGAGA ATCATATCCT GGAGCTTCAA 180 CAGAATAGAG ATCTGGTCCC TGGCCGCCCG ACTCTGGTGT GGTATCAGCC TGACGGCACC 240 CGAATGGTCA GCGAGGGGCA CAGTCTGGAA AACTGCTGCT ATCGAGGACG AGTTCAGGGC 300 CGCCCCAGCT CTTGGGTCTC CCTCTGTGCC TGCTCTGGGA TCAGGGGGCT GGTAGTCCTG 360 TCCCCTGAGA GAAGCTATAC ACTGGAGCTG GGACCTGGAG ACCTTCAGCG TCCTCTCATT 420 GTTTCTCGGA TCCAAGACCT CCTCTTGCCA GGCCACACCT GTGCCCCAAG CTGGCATGCA 480 TTTGTGCCCA CCGAGGCAGC ACCAGACCTC CTTTTGGAAC AGCACCACCT TCGCAGGCTT 540 AAGCGGGATG TAGTAACAGA GACGAAAATT GTCGAACTGG TGATTGTGGC TGATAATTCA 600 GAGGTCAGGA AGTACCCTGA CTTCCAACAA CTGCTGAACC GAACACTAGA AGTGGCCCTT 660 CTGCTAGACA CATTCTTCCA GCCCCTGAAT GTCCGGG AG CACTTGTGGG CCTAGAGGCA 720 TGGACCCAGC GCGACCTGAT AGAGATGAGC TCCAACCCAG CTGTCCTGCT AGACAACTTC 780 CTCCGCTGGC GCCGGACAGA CTTGCTGCCT CGACTGCCCC ATGATAGTGC CCAGCTTGTG 840 ACTGTTACTT CCTTCTCTGG GCCCATGGTG GGCATGGCCA TTCAGAATTC CATCTGTTCT 900 CCTGACTTCT CGGGAGGTGT GAATATGGAC CACTCGACAA GCATCTTAGG AGTTGCCTCC 960 TCCATTGCCC ACGAGTTGGG TCACAGCCTG GGCCTAGACC ACGATTCACC TGGGAACAGT 1020 TGTCCCTGTC CAGGTCCAGC CCCAGCCAAG AGCTGCATCA TGGAGGCCTC CACAGATTTC 1080 CTACCAGGTC TGAACTTCAG CAACTGCAGC CGATGGGCCC TGGAAAAAGC CCTCCTAGAT 1140 GGGATGGGCA GCTGCCTCTT TGAATGGCCA CCCAGCCGGG CCCCTATGTC CTCTTTGTGT 1200 GGAAATATGT TTGTGGACCC TGGAGAGCAG TGTGACTGTG GCTTCCCAGA TGAGTGCACT 1260 GATCCTTGCT GTGACTATTT TACCTGCCAG CTGAGGCCGG GAGCACAGTG TGCATCTGAC 1320 GGACCCTGTT GTCAAAACTG CAAGTTACAG CCAGCTGGCT GGCAGTGCCG CCTTCCCACA 1380 GACGATTGCG ATTTGCCTGA GTTCTGCCTA GGAGATAGCT CTCAGTGCCC CCCTGACATC 1440 AGGCTTGGGG ACGGTGAGCC TTGTGCTAGT GGAGAGGCTG TGTGTATGCA TGGGCGCTGT 1500 GCCTCCTACA CCCGGCAGTG CCAGTCGCTT TGGGGACCTG GGGCCCAGCC TGCTGCACCA 1560 CTTTGCCTCC AAACAGCCAA CACTCGGGGT AATGCCTTTG GGAGCTGTGG GCGCAGCCCC 1620 AGTGGTAGCT ACATGCCTTG CAACCTTAGA GATGCCATTT GTGGGCAACT ACAGTGCCAG 1680 TGGGGTAGGA ATCAGCCTCT GCTGGGCTCA GTCCAAGATC AGCTCTCGGA GGTCCTGGAA 17 0 GCCAATGGGA CACAATTAAA CTGCAGCTGG GTAGATCTGG ACTTGGGCAA TGATGTGGCC 1800 CAGCCTCTCC TGGCTCTACC TGGCACTGCC TGTGGCCCTG GCCTGGTGTG CATCGGCCAT 1860 CGATGCCAGC CTGTGGATCT CCTGGGAGCA CAGGAATGCC GCAGCAAATG CCATGGCCAT 1920 GGGGTCTGCG ACAGCAGCAG GCACTGCCAC TGTGACGAGG GCTGGGCACC TCCTGATTGC 1980 ATGACCCAGC TCAGAGCAAC CAGCTCCCTG ACCACAGGCC TGCTCCTCAG CCTCCTGTTG 2040 TTATTGGTCC TCGTACTACT TGGTGCCAGC TACTGGTACC GTGCCCGCCT GCATCAGCGG 2100 CTCTGCCAGC TCAAGGGATC CAGCTGCCAA TATAGGGCAG CCCAATCCGG TCCTCCTGAG 2160 CGACCAGGAC CTCCACAGAG GGCACAGCAG ATGCCAGGCA CTAAGCCTCA GGGGCCTACC 2220 AAACCCCCAC CCCCAAGAAA GCCACTGCCC GCCAACCCAC AGGGCCGGCC CCCGCTGGGT 2280 GACCTGCCTG GCCCAGGAGA TGGAAGCTTG CAGCTGGTAG TGCCTTCCAG GCCTGCCCCA 2340 CCACCCCCAG CAGCATCTTC GCTCTACCTC TGACCCCTCG AGATTCGGCT GTCTCCTGCT 2400 CAGTTCTAGG ACTTAAAGTG GAACCTCTGT CTGAATCTCC CACAAAACAC TAGAGAAGCA 2460 GAAGCTTAGA CAATATGGCA TCCAGCCCTA AAGAACCACC AGGCGCTGTT CAGTAGTACC 2520 TGGGACCCAC TGAATTACCT GCAGCTGAGT GTTGGGAAGG GGCTGGGGCT GGAGTAGGTG 2580 GTGGAAGGAC GGGAATGTGG TCTGTCTCTG CTCTGTTGTA ATAAATGTGA GGTCTTGGAA 2640 AAAAAAAAAA AAA 2653
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 182 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:
Met Ala Glu Phe Pro Ser Lys Val Ser Thr Arg Thr Ser Ser Pro Ala 1 5 10 15
Gin Gly Val Gly Ala Ser Val Ser Ala Met Arg Pro Asp Leu Gly Phe 20 25 30
Val Arg Ser Ala Leu Gly Val Leu Ala Leu Leu Gin Leu Val Leu Gly 35 40 45 Leu Leu Val Trp Ala Leu Ile Ala Asp Thr Pro Tyr His Leu Tyr Pro 50 55 60
Ala Tyr Gly Trp Val Met Phe Val Ala Val Phe Leu Trp Leu Val Thr 65 70 75 80
Ile Val Phe Phe Ile Ile Tyr Leu Phe Gin Leu His Met Lys Leu Tyr
85 90 95
Met Val Pro Trp Pro Leu Val Leu Leu Val Phe Phe Val Ala Ala Thr 100 105 110
Val Leu Tyr Ile Thr Ala Phe Val Ala Cys Ala Ala Ala Val Asp Leu 115 120 125
Thr Ser Leu Arg Gly Ser Arg Pro Tyr Asn Gin Arg Ser Ala Ala Ser 130 135 140
Phe Phe Ala Cys Leu Val Met Ile Ala Tyr Gly Leu Ser Ala Phe Phe 145 150 155 160
Ser Phe Gin Ala Trp Arg Gly Val Gly Ser Asn Ala Ala Thr Ser Gin
165 170 175
Met Ala Gly Gly Tyr Ser 180
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 887 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:
Tyr Tyr Leu Leu Ala Phe Gin Lys Gly Ile Arg Asn Lys Val Tyr Gin 1 5 10 15
Arg Phe Leu Ala Val Val Pro Ser Leu Thr Asp Ser Ser Glu Ser Val 20 25 30
Ser Gly Gin Arg Pro Asn Thr Ser Val Glu Gin Gly Ser Gly Leu Leu 35 40 45
Ser Thr Leu Val Gly Glu Lys Ser Val Thr Gin Arg Trp Glu Arg Gly 50 55 60 Glu Ile Ser Asn Phe Gin Tyr Leu Met His Leu Asn Thr Leu Ala Gly 65 70 75 80
Arg Ser Tyr Asn Asp Leu Met Gin Tyr Pro Val Phe Pro Trp Ile Leu
85 90 95
Ala Asp Tyr Asp Ser Glu Glu Val Asp Leu Thr Asn Pro Lys Thr Phe 100 105 110
Arg Asn Leu Ala Lys Pro Met Gly Ala Gin Thr Asp Glu Arg Leu Ala 115 120 125
Gin Tyr Lys Lys Arg Tyr Lys Asp Trp Glu Asp Pro Asn Gly Glu Thr 130 135 140
Pro Ala Tyr His Tyr Gly Thr His Tyr Ser Ser Ala Met Ile Val Ala 145 150 155 160
Ser Tyr Leu Val Arg Met Glu Pro Phe Thr Gin Ile Phe Leu Arg Leu
165 170 175
Gin Gly Gly His Phe Asp Leu Ala Asp Arg Met Phe His Ser Val Arg 180 185 190
Glu Ala Trp Tyr Ser Ala Ser Lys His Asn Met Ala Asp Val Lys Glu 195 200 205
Leu Ile Pro Glu Phe Phe Tyr Leu Pro Glu Phe Leu Phe Asn Ser Asn 210 215 220
Asn Phe Asp Leu Gly Cys Lys Gin Asn Gly Thr Lys Leu Gly Asp Val 225 230 235 240
Ile Leu Pro Pro Trp Ala Lys Gly Asp Pro Arg Glu Phe Ile Arg Val 245 250 255
His Arg Glu Ala Leu Glu Cys Asp Tyr Val Ser Ala His Leu His Glu 260 265 270
Trp Ile Asp Leu Ile Phe Gly Tyr Lys Gin Gin Gly Pro Ala Ala Val 275 280 285
Glu Ala Val Asn Val Phe His His Leu Phe Tyr Glu Gly Gin Val Asp 290 295 300
Ile Tyr Asn Ile Asn Asp Pro Leu Lys Glu Thr Ala Thr Ile Gly Phe 305 310 315 320
Ile Asn Asn Phe Gly Gin Ile Pro Lys Gin Leu Phe Lys Lys Pro His 325 330 335
Pro Pro Lys Arg Val Arg Ser Arg Leu Asn Gly Glu Asn Ala Gly Leu 340 345 350 Ser Val Pro Pro Gly Ala Thr Ser Asp Lys Ile Phe Phe His His Leu 355 360 365
Asp Asn Leu Arg Pro Ser Leu Thr Pro Val Lys Glu Leu Lys Glu Pro 370 375 380
Val Gly Gin Ile Val Cys Thr Asp Lys Gly Ile Leu Ala Val Glu Gin 385 390 395 400
Asn Lys Val Leu Ile Pro Pro Ala Trp Asn Lys Thr Phe Ala Trp Gly
405 410 415
Tyr Ala Asp Leu Ser Cys Arg Leu Gly Thr Tyr Glu Ser Asp Lys Ala 420 425 430
Val Ala Val Tyr Glu Cys Leu Ser Glu Trp Gly Gin Ile Leu Cys Ala 435 440 445
Val Cys Pro Ser Pro Lys Leu Val Ile Thr Gly Gly Thr Ser Thr Val 450 455 460
Val Cys Val Trp Glu Met Gly Thr Ser Lys Glu Lys Ala Lys Pro Leu 465 470 475 480
Thr Leu Lys Gin Ala Leu Leu Gly His Thr Asp Thr Val Thr Cys Ala
485 490 495
Thr Ala Tyr Val Ala Tyr His Ile Ile Val Ser Gly Ser Arg Asp Arg 500 505 510
Thr Cys Ile Ile Trp Asp Leu Asn Lys Leu Ser Phe Leu Thr Gin Leu 515 520 525
Arg Gly His Arg Ala Pro Val Ser Ala Leu Cys Ile Asn Glu Leu Thr 530 535 540
Gly Asp Ile Val Ser Cys Ala Gly Thr Tyr Val His Val Trp Ser Ile 545 550 555 560
Asn Gly Asn Pro Ile Val Ser Val Asn Thr Phe Thr Gly Arg Ser Gin
565 570 575
Gin Ile Val Cys Cys Cys Met Ser Glu Met Asn Glu Trp Asp Thr Gin 580 585 590
Asn Val Ile Val Thr Gly His Ser Asp Gly Val Val Arg Phe Trp Arg 595 600 605
Met Glu Phe Leu Gin Val Pro Glu Thr Pro Ala Pro Glu Pro Val Glu 610 615 620
Asp Leu Glu Met Gin Glu Gly Cys Pro Glu Ala Gin Ile Gly Gin Gin 625 630 635 640 Ala Gin Asp Glu Asp Ser Ser Asp Ser Glu Ala Glu Glu Pro Ser Val
645 650 655
Ser Gin Asp Pro Lys Asp Thr Pro Ser Gin Pro Ser Ser Thr Ser His 660 665 670
Arg Pro Arg Ala Ala Ser Cys Arg Ala Thr Ala Thr Trp Cys Thr Asp 675 680 685
Ser Gly Ser Asp Asp Ser Arg Arg Trp Ser Asp Gin Leu Ser Leu Asp 690 695 700
Glu Lys Asp Gly Phe Ile Phe Val Asn Tyr Ser Glu Gly Gin Ala Arg 705 710 715 720
Ala His Pro Gin Gly Ser His Ser His Pro Asn Pro Thr Glu Ala Arg
725 730 735
Ser Tyr Ser Arg Leu Lys Pro Gly Tyr Arg Trp Glu Arg Gin Leu Val 740 745 750
Phe Arg Ser Lys Leu Thr Met His Thr Ala Phe Asp Arg Lys Asp Asn 755 760 765
Thr His Pro Ala Glu Val Thr Ala Leu Gly Val Ser Lys Asp His Ser 770 775 780
Arg Ile Leu Val Gly Asp Ser Arg Gly Arg Val Phe Ser Trp Ser Val 785 790 795 800
Ser Asp Gin Pro Gly Arg Ser Ala Ala Asp His Trp Val Lys Asp Glu 805 810 815
Gly Gly Asp Ser Cys Ser Gly Cys Ser Val Arg Phe Ser Leu Thr Glu 820 825 830
Arg Arg His His Cys Arg Asn Cys Gly Gin Leu Phe Cys Gin Lys Cys 835 840 845
Ser Arg Phe Gin Ser Glu Ile Lys Arg Leu Lys Ile Ser Ser Pro Val 850 855 860
Arg Val Cys Gin Asn Cys Tyr Tyr Ser Leu Gin His Glu Arg Gly Ala 865 870 875 880
Asp Asp Gly Pro Arg Asn Cys
885
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 709 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:
Met Val Ser Glu Gly His Ser Leu Glu Asn Cys Cys Tyr Arg Gly Arg 1 5 10 15
Val Gin Gly Arg Pro Ser Ser Trp Val Ser Leu Cys Ala Cys Ser Gly 20 25 30
Ile Arg Gly Leu Val Val Leu Ser Pro Glu Arg Ser Tyr Thr Leu Glu 35 40 45
Leu Gly Pro Gly Asp Leu Gin Arg Pro Leu Ile Val Ser Arg Ile Gin 50 55 60
Asp Leu Leu Leu Pro Gly His Thr Cys Ala Pro Ser Trp His Ala Phe 65 70 75 80
Val Pro Thr Glu Ala Ala Pro Asp Leu Leu Leu Glu Gin His His Leu
85 90 95
Arg Arg Leu Lys Arg Asp Val Val Thr Glu Thr Lys Ile Val Glu Leu 100 105 110
Val Ile Val Ala Asp Asn Ser Glu Val Arg Lys Tyr Pro Asp Phe Gin 115 120 125
Gin Leu Leu Asn Arg Thr Leu Glu Val Ala Leu Leu Leu Asp Thr Phe 130 135 140
Phe Gin Pro Leu Asn Val Arg Val Ala Leu Val Gly Leu Glu Ala Trp 145 150 155 160
Thr Gin Arg Asp Leu Ile Glu Met Ser Ser Asn Pro Ala Val Leu Leu
165 170 175
Asp Asn Phe Leu Arg Trp Arg Arg Thr Asp Leu Leu Pro Arg Leu Pro 180 185 190
His Asp Ser Ala Gin Leu Val Thr Val Thr Ser Phe Ser Gly Pro Met 195 200 205
Val Gly Met Ala Ile Gin Asn Ser Ile Cys Ser Pro Asp Phe Ser Gly 210 215 220
Gly Val Asn Met Asp His Ser Thr Ser Ile Leu Gly Val Ala Ser Ser 225 230 235 240
Ile Ala His Glu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Asp His Asp Ser Pro 245 250 255 Gly Asn Ser Cys Pro Cys Pro Gly Pro Ala Pro Ala Lys Ser Cys Ile 260 265 270
Met Glu Ala Ser Thr Asp Phe Leu Pro Gly Leu Asn Phe Ser Asn Cys 275 280 285
Ser Arg Trp Ala Leu Glu Lys Ala Leu Leu Asp Gly Met Gly Ser Cys 290 295 300
Leu Phe Glu Trp Pro Pro Ser Arg Ala Pro Met Ser Ser Leu Cys Gly 305 310 315 320
Asn Met Phe Val Asp Pro Gly Glu Gin Cys Asp Cys Gly Phe Pro Asp
325 330 335
Glu Cys Thr Asp Pro Cys Cys Asp Tyr Phe Thr Cys Gin Leu Arg Pro 340 345 350
Gly Ala Gin Cys Ala Ser Asp Gly Pro Cys Cys Gin Asn Cys Lys Leu 355 360 365
Gin Pro Ala Gly Trp Gin Cys Arg Leu Pro Thr Asp Asp Cys Asp Leu 370 375 380
Pro Glu Phe Cys Leu Gly Asp Ser Ser Gin Cys Pro Pro Asp Ile Arg 385 390 395 400
Leu Gly Asp Gly Glu Pro Cys Ala Ser Gly Glu Ala Val Cys Met His
405 410 415
Gly Arg Cys Ala Ser Tyr Thr Arg Gin Cys Gin Ser Leu Trp Gly Pro 420 425 430
Gly Ala Gin Pro Ala Ala Pro Leu Cys Leu Gin Thr Ala Asn Thr Arg 435 440 445
Gly Asn Ala Phe Gly Ser Cys Gly Arg Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Met 450 455 460
Pro Cys Asn Leu Arg Asp Ala Ile Cys Gly Gin Leu Gin Cys Gin Trp 465 470 475 480
Gly Arg Asn Gin Pro Leu Leu Gly Ser Val Gin Asp Gin Leu Ser Glu
485 490 495
Val Leu Glu Ala Asn Gly Thr Gin Leu Asn Cys Ser Trp Val Asp Leu 500 505 510
Asp Leu Gly Asn Asp Val Ala Gin Pro Leu Leu Ala Leu Pro Gly Thr 515 520 525
Ala Cys Gly Pro Gly Leu Val Cys Ile Gly His Arg Cys Gin Pro Val 530 535 540 Asp Leu Leu Gly Ala Gin Glu Cys Arg Ser Lys Cys His Gly His Gly 545 550 555 560
Val Cys Asp Ser Ser Arg His Cys His Cys Asp Glu Gly Trp Ala Pro
565 570 575
Pro Asp Cys Met Thr Gin Leu Arg Ala Thr Ser Ser Leu Thr Thr Gly 580 585 590
Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Val Leu Val Leu Leu Gly Ala 595 600 605
Ser Tyr Trp Tyr Arg Ala Arg Leu His Gin Arg Leu Cys Gin Leu Lys 610 615 620
Gly Ser Ser Cys Gin Tyr Arg Ala Ala Gin Ser Gly Pro Pro Glu Arg 625 630 635 640
Pro Gly Pro Pro Gin Arg Ala Gin Gin Met Pro Gly Thr Lys Pro Gin
645 650 655
Gly Pro Thr Lys Pro Pro Pro Pro Arg Lys Pro Leu Pro Ala Asn Pro 660 665 670
Gin Gly Arg Pro Pro Leu Gly Asp Leu Pro Gly Pro Gly Asp Gly Ser 675 680 685
Leu Gin Leu Val Val Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala 690 695 700
Ser Ser Leu Tyr Leu 705

Claims

Patentansprüche
1. Nukleinsäuren der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis 30.
2. Nukleinsäure, welche mit einer der Nukleinsäuren der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis 30 im codierenden oder 3'- oder 5 '-untranslatierten Bereich hybridisiert und für ein Protein codiert, das in lädierten und/oder regenerierenden Nervenzellen exprimiert wird.
3. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure, welche ein Protein codiert, das in lädierten und/oder regenerierenden Nerven exprimiert wird und welche mit einer der Nukleinsäuren der Sequenzen SEQ ID NO: l bis 30 hybridisiert, dadurch gekennzeichnet, daß eine cDNA-Bibliothek aus dem Ischiasnerv mit einer Hybridisierungssonde ausgewählt aus den Nukleinsäuren SEQ ID NO:l bis 30 durchgemustert wird.
4. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, welches von einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 2 codiert wird, durch Transfektion einer geeigneten Wirtszelle mit der genannten Nukleinsäure, Expression und Gewinnung des Proteins aus den Zellen oder dem Überstand.
5. Verfahren zum Nachweis von traumatischen und pathologischen Veränderungen des peripheren Nervensystems, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure enthaltende Probe von Gewebe und/oder Zellen mit einer Nukleinsäuresonde inkubiert wird, welche ausgewählt ist aus der Gruppe
a) der in SEQ ID NO:l bis 30 gezeigten Nukleinsäuren oder der dazu komplemen¬ tären Nukleinsäuren,
b) Nukleinsäuren, die mit einer der Nukleinsäuren von a) hybridisieren, wobei
die Nukleinsäuresonde mit der Nukleinsäure der Probe inkubiert wird und die Hybridi¬ sierung gegebenenfalls über einen weiteren Bindepartner von Nukleinsäure der Probe und/oder Nukleinsäuresonde nachgewiesen wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende Nuklein¬ säure vor dem Nachweis amplifiziert wird.
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