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WO1995001163A1 - Nouvelles preparations pharmaceutiques a base de peptides pour la voie generale - Google Patents

Nouvelles preparations pharmaceutiques a base de peptides pour la voie generale Download PDF

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WO1995001163A1
WO1995001163A1 PCT/FR1993/000672 FR9300672W WO9501163A1 WO 1995001163 A1 WO1995001163 A1 WO 1995001163A1 FR 9300672 W FR9300672 W FR 9300672W WO 9501163 A1 WO9501163 A1 WO 9501163A1
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WO
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liposomes
insulin
active principle
lipid
peptide
Prior art date
Application number
PCT/FR1993/000672
Other languages
English (en)
Inventor
Jérôme CORBIERE
Original Assignee
Corbiere Jerome
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins

Definitions

  • the present invention relates to the field of pharmacotechnology.
  • compositions allowing administration in a particularly suitable form of peptides, and in particular hormonal peptides. It is known, in fact, that the administration of peptides with therapeutic properties is limited to a few specific routes, taking into account the ease of hydrolysis of these compounds at the gastric level or at the intestinal level.
  • parenteral route by sublingual route or by pernasal route.
  • the parenteral route which is the most used requires frequent and permanent use of injections and tends to become an easement for the patient.
  • the unilamellar liposome technique has also been proposed but it has the drawback of subjecting to an intense sonication, an aqueous solution of phospholipids in water, which involves significant risks of oxidation of this material as well as other alterations. sonication chemicals.
  • the substance which it is desired to incorporate is defined as being a vegetable or mineral oil or any oily substance or else a biologically active substance, a contrast agent, a biological reagent, or even an ink, a lubricant or a surface treatment agent.
  • the solvent of the first phase must be sufficiently volatile to be able to be easily removed and this limits the choice of such a solvent to lower alcohols, lower ketones, certain hydrocarbons.
  • the solvent of the second phase is a liquid which does not dissolve the polymer intended to form the capsule and the substance contained in the core, but which is miscible with the solvent of the first phase.
  • This complex production process leads to the formation of nanoparticles of a size less than 500 nm, the outer wall of which is a polymer formed by nanoprecipitation and whose shape is regularly spherical.
  • the object of the present invention is significantly different by its embodiment and by the technical problem. It aims to achieve a mode of administration of drugs, particularly suitable for the digestive or parenteral route and intended above all to allow the administration by these two routes, in a protected form, of drugs which, without it, would not pass not the intestinal barrier, either due to enzymatic degradation or due to insufficient absorption.
  • a - This problem has therefore been resolved by producing liposomes, that is to say spherical vesicles with a diameter ranging from one tenth to ten micrometers, formed of several walls composed of a double layer of alternating phospholipids with one or more aqueous compartments.
  • vesicles have the property of serving as vehicles for water-soluble or dispersible active principles which are housed in the aqueous compartment, lipophilic active principles which are inserted into the walls of lipids or amphiphilic active principles which are localized in both in the aqueous compartments by the hydrophilic part and in the lipid walls by their lipophilic residue.
  • the process for preparing this new form of administration is characterized in that a mixture of phospholipids and cholesterol is dissolved in a chlorinated organic solvent and then the solvent is evaporated under reduced pressure, which is dispersed the dry residue in an ultrasonic tank in an aqueous solution or dispersion of the active ingredient to be incorporated until the total dispersion of the lipid phase in the aqueous phase is obtained.
  • This suspension can then be diluted by liposomes which do not contain any active principle and whose aqueous phase contains only a solution of a buffering agent. We can therefore adjust the concentration of active ingredient at will.
  • the active principle which is not attached to the liposomes is then separated by filtration, in particular on a polyacrylamide gel or on a dextran gel, eluting with the aid of a buffering agent.
  • the liposomal suspensions obtained after gel filtration are stored at low temperature and protected from light.
  • the method according to the invention therefore comprises two important stages: the formation of multilamellar liposomes from phosphatidyl choline and the separation of the active principle which is not fixed by gel filtration.
  • the process is carried out by lyophilization and thus dry forms are obtained, no longer in suspension.
  • the phospholipids used are phospholipids of natural origin such as egg phosphatidyl choline or soy phosphatidyl choline containing at least 9BX of phosphatidyl choline.
  • lipid vesicles formed are kept in suspension in an aqueous solution of sodium citrate, the pH of which varies according to the concentration from 2.5 to 4.5 and preferably from 2.8 to 3.0.
  • the lipid constituents are dissolved in an inert solvent such as a chlorinated solvent chosen from the group formed by chloroform, methylene chloride, dichlorethane, tetrabromoethane and hexafluoroacetone. Preference is given to the lowest boiling point solvents which thus allow easier and faster evaporation.
  • Methylene chloride constitutes the most effective solvent according to the invention.
  • the lipid solution can also be added with a nonionic surfactant such as a Tween, a Span, a Palmitostearate of sugar or a copolymer of propylene oxide and ethylene oxide.
  • a nonionic surfactant such as a Tween, a Span, a Palmitostearate of sugar or a copolymer of propylene oxide and ethylene oxide.
  • the content of surface active agent it is possible to incorporate in the lipid solution * varies in wide limits and particularly from 1 to 20% by weight of phospholipids. A content ranging from 5 to 15% is particularly envisaged.
  • Filtration on polyacrylamide or dextran gel is carried out on a column packed with such a gel, formed in particular with a polymer sold under the brand SEPHAROSE and in particular SEPHAROSE 6B.
  • the filtration eluent is a mixture of the starting citrate buffer supplemented with sodium chloride.
  • the liposomal populations obtained are not homogeneous and, whatever the method of preparation, there are two different sizes of vesicles, one ranging from 120 to 180 nm and the other ranging from 750 to 1750 nm.
  • the size of the vesicles measured with the Coulter N 4 MD counter shows good reproducibility.
  • the liposomes according to the invention show a plurilamellar structure.
  • the little absorbable or hydrolyzable active principles, of peptide nature which it is possible to incorporate into the liposomes according to the invention, are of very varied nature and can include small peptides, globulins, proteins, macromolecules, such as TRH, lysine vasopressin, desglycinamide lysine vasopressin, ACTH fragments, encephalins as well as longer chain peptides such as CCK, CCK analogs, natural or chemically modified insulins, proinsulin and insulins polymers, somatotropin, EGF, calcitonin, thyrocalcitonin, natriuretic factor, polylysine, FSH, LHRH, gonadorelines such as RH, buserelin, intestinal peptides (VIP, ProVIP, preproVIP ...) and in general, any peptide natural or of synthetic origin or genetic origin having a degree of solubility in water sufficient to ensure its incorporation into l has aque
  • the suspension of neutral liposomes devoid of active principle is prepared under the same conditions by replacing for each of them, the buffered aqueous solution of active principle, by a buffer solution at approximately pH 3.0 and using a phospholipid concentration of 50 ⁇ mol / ml approximately.
  • This suspension is mixed with the buffered aqueous suspension of active principle so that the final concentration of the mixture is reduced in a proportion ranging for example from 1 to 10.
  • Filtration on acrylamide gel has the effect of eliminating the excess of active principle which has remained absorbed on the surface of the liposomes and whose presence would be useless due to the degradation in the digestive tract or possibly harmful when the active principle is a substance. very active.
  • the active ingredient incorporated is a peptide hormone such as insulin and in particular porcine insulin or human insulin, calcitonin, oxytocin.
  • the content of active principle and in particular of insulin makes it possible to observe that the active principle retained by the multilamellar vesicles before filtration, can vary within very large proportions.
  • active principle retained by the multilamellar vesicles before filtration can vary within very large proportions.
  • an insulin it is of the order of 1.5 to 2.5 IU per umol and after filtration of 0.03 to 0.10 U / ⁇ mol.
  • the incorporation rate therefore ranges from 0.25 to 65% of active principle relative to the theoretical quantity introduced.
  • the presence of a negative charge in the wall of the liposomes significantly improves the encapsulation of the peptide active principles inside the liposomes, when these have a basic structure.
  • the raw materials used are soy phosphatidylcholine, with a molecular weight of approximately 800, containing at least 98% of phosphatidylcholine, lanolin cholesterol, with a molecular weight of 387, and diketyl phosphate, with a molecular weight 560. These three components are combined in a 7/2/1 molar ratio and added tocoferol acetate, used as an antioxidant in the proportion of one mole per 100 moles of phosphatidylcholine.
  • the lipid vesicles are suspended in an aqueous solution of citrate buffer at pH 3.0 thus composed: 0.1 M disodium citrate solution containing 2 ° / 0 o of methylparaben: 399 ml, concentrated hydrochloric acid: 3.3 ml and distilled water qsq 1000 ml.
  • the mother insulin solution is a 100 IU / ml solution of porcine insulin, also buffered at pH 3.0, thus prepared: porcine insulin: 192.3 mg, citrate buffer pH 3.0 q.s.p 50 ml.
  • the lipid mixture was prepared with 200 mg of phosphatidylcholine, 28 mg of cholesterol, 20 mg of diketyl phosphate and 1.2 mg of tocoferol acetate.
  • the lipid constituents are dissolved in 20 ml of dichloromethane, then the solvent is eliminated in a rotary evaporator (Buchi), in a liter flask, under reduced pressure (water pump) and at 37 ° C.
  • the residual film is dispersed at room temperature, by stirring in an ultrasonic tank (Bransonic 220V), for 30 min, in 10 ml of the buffered insulin solution at 50 IU / ml. This sonication is followed by a 2 hour rest period at room temperature.
  • the suspension is then cooled and subjected to a new sonication by probe (Branson 450W), 6 minutes in an ice bath (to keep the temperature below 40 ° C), in the open air.
  • the lipid constituents are dissolved in 20 ml of dichloromethane containing an amount of Tween 60 representing 10% by weight of the phospholipids.
  • the buffered aqueous insulin solution is added with constant stirring to Ultraturrax e * in the open air, at a temperature increasing to 60 ° C in 20 minutes. After stopping the heating, stirring is continued for 40 minutes. It allows the total evaporation of the organic solvent and the obtaining of a suspension whose lipid concentration is 25 ⁇ mol / ml (ie 20 mg / ml).
  • the lipid constituents are dissolved in 5 ml of propylene glycol, maintained at 60 ° C (until dissolution).
  • the buffered insulin solution 50 ml is heated to 30 ° C and introduced into an ultrasonic bath (Bransonic 220 V), with gentle agitation with Ultraturrax (0SI).
  • the lipid solution at 60 ° C. is injected at a low rate (5 ml in 1 to 2 minutes) into the insulin solution maintained with stirring and sonication. Agitation with Ultraturrax is continued 2 minutes after the injection and sonication, 30 minutes.
  • the bath of sonication should be cooled with ice to keep the temperature below 40 ° C.
  • the separation of the free insulin is carried out by filtration on Sepharose 6B gel (column 25 cm high and 1.6 cm in section).
  • the eluent for filtration is the sodium citrate buffer supplemented with 0.6% sodium chloride. Its flow rate is 0.5 ml / min.
  • the volume of each fraction collected is 3 ml.
  • the lipid vesicles are filtered between the 5th and the 8th fraction and free insulin, from the 12th.
  • the separation of the free insulin is carried out by tangential ultrafiltration, on acrylic Minitan (Millipore), using a PTMK 300 KD polysulfone filter.
  • the volume of the lipid suspension, concentrated by removing the filtrate, is readjusted to 100 ml, during filtration, with the citrate preparation buffer.
  • the free insulin solution is eliminated in the filtrate each time the lipid suspension passes through the membrane, and its different fractions can be collected using a side tube of the filter circuit.
  • the insulin concentration of the different filtrate fractions is determined by assay (HPLC) and filtration is stopped when this concentration is less than 2 IU / ml, which corresponds to a total volume of filtrate collected of the order of 5 to 600 ml. (i.e. 5 to 6 times the initial volume of lipid suspension).
  • the insulin suspensions obtained by the different methods can be stored at 4 ° C and protected from light, or lyophilized as such, after distribution by 2 ml aliquots in 15 ml bottles, for 24 hours.
  • This assay was carried out by a high performance liquid chromatography (HPLC) method in an isocratic system, with a Kromasil C 4 , 5 ⁇ m, 100 A column, 25 cm in length, associated with a Kromasil C 4 , 5 ⁇ m precolumn, 100 A, 1.8 cm, intended to stop most of the phospholipids.
  • the eluting solution is a mixture of 2 solvents A and B, in respective proportions 590 ml / 410 ml, filtered through Millipore 0.45 ⁇ m and added with 0.2% acetonitrile (v / v).
  • Solvent A is composed of acetonitrile: 100 ml and buffer pH 3.3: qs 1000 ml and solvent B, acetonitrile: 500 ml and buffer pH 3.3: 500 ml.
  • the pH 3.3 buffer is prepared by mixing ammonium sulphate: 39.6 g, 2N sulfuric acid: 0.7 ml (qs pH 3.3) and distilled water: qs 1000 ml.
  • the injection volume of the sample to be assayed is fixed at 100 ⁇ l.
  • the retention time of the insulin on the column is of the order of 11 min.
  • This assay method was developed with the buffered aqueous insulin solution used for the preparation of lipid suspensions. It has good sensitivity (1.9 ⁇ g of detectable insulin, so 0.05 IU), as well as unsatisfactory speci fici ty and reproducibility.
  • the results are expressed in units of hormone / ml of the sample to be analyzed.
  • the phospholipid level of insulin suspensions can be determined by the Takayama enzymatic method, using reactive kits from the company BIOMERIEUX.
  • Insulin concentrations can thus be expressed in IU / ⁇ mol of phospholipids.
  • the insulin concentrations of the formulations obtained by the three preparation methods were calculated. The results are as follows:
  • METHOD I made it possible to fix an amount of insulin of the order of 1 IU / ml of suspension, ie 0.45 IU / ⁇ mol of phospholipid, which corresponds to a yield of the order of 22% of the initial amount of hormone used. Furthermore, the reproducibility of the results from one batch of preparation to another has been found to be satisfactory.
  • METHOD II provided only a tiny insulin fixation and therefore cannot be retained. The hormone was probably degraded by the use of T een at high temperature.
  • METHOD III had two advantages: it provided both a higher insulin fixation rate than the two previous methods, and a quantitative preparation of lipid suspension loaded with insulin, thanks to the rapid filtration mode adopted.
  • the level of fixed insulin was 15 IU / ml, or 0.74 IU / ⁇ mol of phospholipid and a yield of the order of 37%.
  • the rate of hormonal fixation has reached 25 IU / ml, that is to say 0.60 IU / ⁇ mol of phospholipid and a yield of 60% of the initial quantity.
  • soy phosphatidylcholine instead of egg phosphadidylcholine. improve the storage of preparations by freeze-drying the lipid insulin suspensions.
  • liposomes were composed of egg or soy phosphatidylcholine, cholesterol and cholesterol hemisuccinate in the molar ratios 7/2/1, 7/1/1 and 7/0/2.
  • Cholesterol hemisuccinate therefore cannot be used as a loading lipoid.
  • This loading lipoid was introduced at three concentrations, in the following phospholipid / cholesterol / lipoid molar ratios: 7/2 / 0.5, 7/2/1 and 7/2/2.
  • Freeze-drying tests were carried out, for 24 hours, on 2 ml aliquots of suspension, in the presence and in the absence of mannitol. The determination of the fixed insulin level was carried out before and after lyophilization. In addition, the size of the liposomal vesicles was determined under the same conditions.
  • the lipid constituents (soy phosphatidylcholine, cholesterol and diketyl phosphate) are dissolved in 5 ml of propylene glycol maintained at 60 ° C.
  • the insulin solution buffered to pH 3.0 is heated to 30 ° C and introduced into an ultrasonic bath, with gentle stirring with Ultraturrax.
  • the lipid solution at 60 ° C. is injected at low flow rate (5 ml in 1 to 2 minutes) into the insulin solution still under agitation and sonication. Agitation with Ultraturrax is continued 2 min after injection and sonication, 30 min.
  • the sonication bath must be cooled by ice to keep the temperature below 40 ° C. After resting for one hour, a new sonication of 30 minutes is carried out in the tank always cooled by ice.
  • the separation of the free insulin is carried out by tangential ultra-filtration, on acrylic Minitan (Millipore), using a PTMK 300 KD polysulfone filter.
  • This filtration method makes it possible to treat a volume of 100 ml of liposomal suspension. Associated with the preparation method previously described (which itself applies to high volumes of suspensions), it makes it possible to successfully envisage an industrial preparation of liposomal suspensions.
  • the lipid composition is expressed as a molar ratio of phosphatidylcholine, cholesterol and cholesterol hemisuccinate.
  • the yield is expressed in% of the theoretical quantity of insulin fixed, ie 2 IU / ⁇ mol of phospholipid. TABLE II influence of the diketyl phosphate concentration
  • the lipid composition of the 3 formulations was: phospholipid, cholesterol and diketyl phosphate, in a 7/2/1 molar ratio.
  • Liposomes composed of non-lyophilized soy phosphatidylcholine 140+ 60nm 70% 1.83 0.75 37.5% 1600 + 340nm 30%
  • liposomes composed of non-lyophilized soy phosphatidylcholine 200+ 80nm: 70% 1.65 0.60 30% 5000 + 1300nm: 30%
  • Venous blood samples will be taken from all fasting animals, then 30 min, 1 hour, 2, 3, 4, 5, 12 and 24 hours after administration of the various preparations in the treated animals and in the controls used to determine spontaneous changes in blood sugar. These samples are taken while taking care to avoid any stress or anesthesia of the animals, likely to cause a disturbance of their glycemia. The best way is to treat animals with a permanent collection catheter.
  • the preparation doses, in liquid form, are determined by HPLC beforehand.

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Abstract

L'invention se rapporte au domaine de la pharmacotechnie. Elle a plus précisément pour objet, un procédé de préparation de compositions pharmaceutiques permettant l'absorption de principes actifs peu résorbables ou susceptibles d'être hydrolysés caractérisé en ce que l'on forme au préalable des liposomes multilamellaires par dissolution d'un mélange de phospholipides et de cholestérol dans un solvant chloré puis évaporation du solvant, en ce que l'on disperse le résidu sec dans une dispersion aqueuse du principe actif à incorporer, en ce que l'on filtre les vésicules ainsi formées sur gel de polyacrylamide et que l'on les élue à l'aide d'une solution de tampon. Emploi en thérapeutique desdits principes actifs.

Description

NOUVELLES PREPARATIONS PHARMACEUTIQUES A BASE DE PEPTIDES POUR LA VOIE GENERALE
La présente invention se rapporte au domaine de la pharmacotechnie.
Elle concerne en particulier de nouvelles préparations pharmaceutiques renfermant comme principe actif un peptide et destinées à être administrées par voie orale, sublinguale ou parentérale.
Elle a plus spécifiquement pour objet de nouvelles compositions pharmaceutiques permettant l'administration sous une forme particulièrement adaptée de peptides, et notamment de peptides hormonaux. On sait, en effet, que l'administration des peptides à propriétés thérapeutiques se trouve limitée à quelques voies particulières, compte tenu de la facilité d'hydrolyse de ces composés au niveau gastrique ou au niveau intestinal.
C'est pourquoi jusqu'ici, l'administration des peptides se faisait essentiellement par voie parentérale, par voie sublinguale ou par voie pernasale. La voie parentérale qui est celle qui est la plus utilisée nécessite le recours fréquent et permanent à des injections et tend à devenir une servitude pour le malade.
En outre, certains produits injectés ou certains solvants sont sclérosants, et il est nécessaire lorsqu'une veine est endommagée, de trouver une autre veine dans laquelle l'injection est possible et, progressivement, ce problème devient particulièrement aigu.
Par ailleurs, l'administration directe, par voie rectale ou même par voie digestive, de peptides s'avère inefficace et il est apparu nécessaire d'adjoindre des agents tensio-actifs qui facilitent le passage de la muqueuse rectale ou digestive mais qui, en outre, sont la cause d'irritations et de phénomènes inflammatoires.
Le problème de l'administration digestive de molécules fragiles hydrolysables ou digestibles, par les enzymes du tube digestif, est un problème difficile dont la solution est loin d'avoir été obtenue jusqu'ici. C'est pourquoi, il s'est avéré intéressant de les administrer sous forme particulaire ou micellaire. C'est ainsi que le brevet français n° 2.515.960 décrit l'incorporation de molécules sous forme de particules de polymères submicroscopiques, d'un diamètre inférieur à 500 nm. Ces particules sont formées par polymérisation micellaire d'un monomère dérivé de l'acide acrylique. Toutefois, la polymérisation s'effectuant en solution, est donc limitée à l'utilisation d'un nombre restreint de polymères et ne peut convenir à des polymères naturels ou semi-synthétiques, peu solubles dans l'eau. En outre, l'élimination des monomères et oligomères résiduels est difficile car la filtration des nanoparticules ainsi formées et des nanocapsules est souvent difficile à réaliser.
La technique des liposomes unilamellaires a été également proposée mais elle présente l'inconvénient de soumettre à une sonication intense, une solution aqueuse de phospholipides dans l'eau, ce qui entraine des risques importants d'oxydation de ce matériau ainsi que d'autres altérations chimiques liées à la sonication.
Un autre mode de réalisaton a été décrit dans le brevet français 2.608.942 dans lequel on prépare des systèmes colloidaux dispersibles sous forme de particules sphériques vésiculaires d'une taille inférieure à 500 nm dont la paroi est constituée par une substance polymérique comme l'acide polylactique ou un corps gras dans lequel le principe actif que l'on désire encapsuler, est dissout ou dispersé et le noyau est formé d'une seconde phase liquide constituée par une solution aqueuse ou d'un mélange de solvant renfermant de l'eau et additionnée d'un ou plusieurs agents tensio-actifs, ce procédé étant défini par le fait que le mélange de solvants de la première phase est miscible au mélange aqueux de la seconde phase. Le mélange des deux phases conduit presque instantanément à la formation de nanocapsules et la solution devient blanche laiteuse.
Dans ce procédé, la substance que l'on désire incorporer est définie comme étant une huile végétale ou minérale ou toute substance huileuse ou bien encore une substance biologiquement active, un produit de contraste, un réactif biologique, ou bien encore une encre, un lubrifiant ou un agent de traitement de surface.
Dans ce procédé, le solvant de la première phase doit être suffisamment volatil pour pouvoir être aisément éliminé et ceci limite le choix d'un tel solvant aux alcools inférieurs, aux cétones inférieures, à certains hydrocarbures. Au contraire, le solvant de la deuxième phase est un liquide qui ne dissout pas le polymère destiné à former la capsule et la substance renfermée dans le noyau, mais qui est miscible au solvant de la première phase. Cette affirmation laisse planer un doute sérieux sur la réalisabilité d'un tel système car si selon ce brevet, les deux solvants doivent être parfaitement miscibles, ceci ne parait pas être le cas lorsque le solvant de la première phase est un hydrocarbure léger, un hydrocarbure léger chloré ou même une cétone inférieure.
Ce procédé d'une réalisation complexe conduit à la formation de nanoparticules d'une taille inférieure à 500 nmdont la paroi extérieure est un polymère formé par nanoprécipitation et dont la forme est régulièrement sphérique.
La présence d'agents tensioactifs en quantités importantes est nécessaire pour assurer la stabilité de la suspension. Rien dans ce brevet ne laisse penser à un mode d'administration de molécules fragiles par la voie digestive.
L'objet de la présente invention est sensiblement différent par son mode de réalisation et par le problème technique. Il vise à réaliser un mode d'administration de médicaments, particulièrement adapté à la voie digestive ou à la voie parentérale et destiné surtout à permettre l'administration par ces deux voies, sous une forme protégée, de médicaments qui, sans cela, ne passeraient pas la barrière intestinale, soit du fait d'une dégradation enzymatique, soit du fait d'une résorption insuffisante. - A - Ce problème a dont été résolu en réalisant des liposomes, c'est-à-dire des vésicules sphériques d'un diamètre allant du dixième à la dizaine de micromètres, formés de plusieurs parois composée d'une double couche de phospholipides alternant avec un ou plusieurs compartiments aqueux. Ces vésicules ont la propriété de servir de véhicules à des principes actifs solubles ou dispersibles dans l'eau qui se logent dans le compartiment aqueux, des principes actifs lipophiles qui s'insèrent dans les parois des lipides ou des principes actifs amphiphiles qui se localisent à la fois dans les compartiments aqueux par la partie hydrophile et dans les parois lipidiques par leur reste lipophile.
Le procédé de préparation de cette nouvelle forme d'administration est caractérisé en ce que l'on dissout dans un solvant organique chloré, un mélange de phospholipides et de cholestérol puis que l'on évapore sous pression réduite le solvant, que l'on disperse le résidu sec dans un bac à ultra-sons dans une solution ou dispersion aqueuse du principe actif à incorporer jusqu'à obtenir la dispersion totale de la phase lipidique dans la phase aqueuse.
Il est également possible de réaliser ces mêmes liposomes en mettant en contact la solution lipidique et la solution ou suspension aqueuse de principe actif sous agitation constante à une température croissante jusqu'à evaporation totale du solvant et obtention d'une suspension aqueuse de liposomes.
Cette suspension peut ensuite être diluée par des liposomes ne renfermant pas de principe actif et dont la phase aqueuse ne contient qu'une solution d'un agent tampon. On peut donc ajuster à volonté la concentration en principe actif.
Le principe actif non fixé aux liposomes est ensuite séparé par filtration notamment sur un gel de polyacrylamide ou sur un gel de dextranne en éluant à l'aide d'un agent tampon.
Les suspensions liposomiales obtenues après filtration sur gel, sont conservées à basse température et à l'abri de la lumière. Le procédé selon l'invention comporte donc deux étapes importantes : la formation des liposomes multilamellaires à partir de phosphatidyl choline et la séparation du principe actif non fixé par filtration sur gel. Cependant, il peut être avantageux de procéder à une opération intermédiaire qui permet d'obtenir des liposomes secs, c'est-à-dire sans solvant aqueux. On procède par lyophilisation et on obtient ainsi des formes sèches et non plus en suspension.
Il est possible également d'effectuer une opération supplémentaire de protection qui permet la production de liposomes enrobés, évitant leur déstabilisation par les sels biliaires lors du passage dans le duodénum.
Les phospholipides utilisés sont des phospholipides d'origine naturelle comme la phosphatidyl choline d'oeuf ou la phosphatidyl choline de soja contenant au moins 9BX de phosphatidyl choline.
On peut, pour obtenir des liposomes chargés négativement, ajouter aux constituants des liposomes, du phosphate de dicetyle ou un ester acide de cholestérol. Les proportions respectives des trois constituants varient de 5:1=1 à 10:1=1. Les vésicules lipidiques formées sont maintenues en suspension dans une solution aqueuse de citrate de sodium dont le pH varie selon la concentration de 2,5 à 4,5 et de préférence de 2,8 à 3,0.
Les constituants lipidiques sont mis en solution dans un solvant inerte comme un solvant chloré choisi dans le groupe formé du chloroforme, du chlorure de méthylène du dichloréthane, du tétrabromoéthane et de 1' hexafluoroacétone. La préférence est donnée aux solvants à point d'ébullition le plus bas qui permettent ainsi une evaporation plus facile et plus rapide. Le chlorure de méthylène constitue le solvant le plus efficace selon l'invention.
La solution lipidique peut être également additionnée d'un agent tensio-actif non ionique comme un Tween, un Span, un Palmitostéarate de sucre ou un copolymère d'oxyde de propylène et d'oxyde d'éthylène. La teneur en agent tensio-actif qu'il est possible d'incorporer dans la solution lipidique varie dans*de larges proportions et notamment de 1 à 20% du poids des phospholipides. Une teneur allant de 5 à 15% est particulièrement envisagée.
La filtration sur gel de polyacrylamide ou de dextranne s'effectue sur une colonne garnie d'un tel gel, formé notamment avec un polymère vendu sous la marque SEPHAROSE et notamment le SEPHAROSE 6B. L'éluant de filtration est un mélange du tampon citrate de départ additionné de chlorure de sodium.
Les populations liposomiales obtenues ne sont pas homogènes et il existe quel que soit le mode de préparation, deux tailles différentes de vésicules, l'une allant de 120 à 180 nm et l'autre allant de 750 à 1750 nm. Toutefois, pour la même composition lipidique et le même mode de préparation, la taille des vésicules mesurée au compteur Coulter N4MD montre une bonne reproductibilité. Au microscope électronique, les liposomes selon l'invention montrent une structure plurilamellaire.
Les principes actifs peu résorbables ou hydrolysables, de nature peptidique qu'il est possible d'incorporer dans les liposomes selon l'invention, sont de nature très variée et peuvent englober aussi bien des petits peptides, des globulines, des protéines, des macromolécules, comme le TRH, la lysine vasopressine, la desglycinamide lysine vasopressine, les fragments d'ACTH, les encéphalines ainsi que des peptides à chaine plus longue comme le CCK, les analogues de CCK, les insulines naturelles ou modifiées chimiquement, la proinsuline et les insulines polymériques, la somatotrophine, l'EGF, la calcitonine, la thyrocalcitonine, le facteur natriurétique, la polylysine, la FSH, la LHRH, les gonadorelines comme la RH, la buséréline, les peptides intestinaux (VIP, ProVIP, preproVIP... ) et d'une manière générale, tout peptide naturel ou d'origine synthétique ou d'origine génétique présentant un degré de solubilité dans l'eau suffisant pour assurer son incorporation dans la phase aqueuse des liposomes. La lyophilisation des liposomes ainsi chargés s'effectue dans des plaques de polyéthylène percées d'alvéoles sphériques dans lesquelles, la suspension de particules vésiculaires est déposée puis évaporée par cryodessication.
La suspension de liposomes neutres dépourvus de principe actif est préparée dans les mêmes conditions en remplaçant pour chacune d'elles, la solution aqueuse tamponnée de principe actif, par une solution tampon à pH 3,0 environ et en utilisant une concentration en phospholipides de 50 μmol/ml environ. Cette suspension est mélangée avec la suspension aqueuse tamponnée de principe actif de sorte que la concentration finale du mélange est diminuée dans une proportion allant par exemple de 1 à 10.
La filtration sur gel d'acrylamide a pour effet d'éliminer l'excès de principe actif resté absorbé en surface des liposomes et dont la présence serait inutile en raison de la dégradation dans le tube digestif ou éventuellement nocive lorsque le principe actif est une substance très active.
Dans un mode d'exécution préféré du procédé selon l'invention, le principe actif incorporé est une hormone peptidique comme l'insuline et notamment l'insuline de porc ou l'insuline humaine, la calcitonine, l'ocytocine.
La teneur en principe actif et notamment en insuline ,déterminée par une méthode de chromatographie liquide haute performance, permet de constater que le principe actif retenu par les vésicules multilamellaires avant filtration, peut varier dans de très larges proportions. Dans le cas d'une insuline, il est de l'ordre de 1,5 à 2,5 UI par umol et après filtration de 0,03 à 0,10 U/μmol.
Le taux d'incorporation s'échelonne donc de 0,25 à 65% de principe actif par rapport à la quantité théorique introduite. La présence d'une charge négative dans la paroi des liposomes améliore de façon significative l'encapsulation des principes actifs peptidiques à l'intérieur des liposomes, lorsque ceux-ci ont une structure basique.
Les exemples suivants illustrent l'invention, ils ne la limitent en aucune façon :
EXEMPLE I
MISE AU POINT D'UNE FORMULATION D'INSULINE DESTINEE A UNE VOIE NON
PARENTERALE
Composition
Les matières premières utilisées sont la phosphatidylcholine de soja, d'un poids moléculaire d'environ 800, contenant au minimum 98% de phosphatidylcholine, du cholestérol de lanoline, d'un poids moléculaire de 387, et du phosphate de dicétyle, d'un poids moléculaire de 560. Ces trois composants sont associés dans un rapport molaire 7/2/1 et additionnés d'acétate de tocoferol, utilisé comme antioxydant dans la proportion d'une mole pour 100 moles de phosphatidylcholine.
Les vésicules lipidiques sont en suspension dans une solution aqueuse de tampon citrate à pH 3,0 ainsi composée : solution de citrate disodique 0,1 M contenant 2°/0o de méthylparaben : 399 ml, acide chlorhydrique concentré : 3,3 ml et eau distillée q.s.q 1000 ml.
La solution mère d'insuline est une solution à 100 Ul/ml d'insuline porcine, également tamponnée à pH 3,0 ainsi préparée : insuline porcine : 192,3 mg, tampon citrate pH 3,0 q.s.p 50 ml.
Modes de préparation
Trois méthodes de préparation ont été réalisées. Quelle que soit la méthode, le mélange lipidique a été préparé avec 200 mg de phosphatidylcholine, 28 mg de cholestérol, 20 mg de phosphate de dicétyle et 1,2 mg d'acétate de tocoferol. HETHODE I
Les constituants lipidiques sont dissous dans 20 ml de dichlorométhane, puis le solvant est éliminé dans un évaporateur rotatif (Buchi), en ballon d'un litre, sous pression réduite (trompe à eau) et à 37°C. Le film résiduel est dispersé à température ambiante, par agitation dans un bac à ultra-sons (Bransonic 220V), pendant 30 mn, dans 10 ml de la solution tamponnée d'insuline à 50 Ul/ml. Cette sonication est suivie d'une période de repos de 2 heures, à température ambiante. La suspension est ensuite refroidie et soumise à une nouvelle sonication par sonde (Branson 450W), 6 minutes dans un bain de glace (pour maintenir la température inférieure à 40°C), à l'air libre.
METHODE II
Les constituants lipidiques sont dissous dans 20 ml de dichlorométhane contenant une quantité de Tween 60 représentant 10% en poids des phospholipides.
La solution aqueuse tamponnée d'insuline est additionnée sous agitation constante à l'Ultraturrax e* à l'air libre, à une température croissant jusqu'à 60°C en 20 minutes. Après arrêt du chauffage, l'agitation est maintenue 40 minutes. Elle permet l'évaporation totale du solvant organique et l'obtention d'une suspension dont la concentration lipidique est de 25 μmol/ml (soit 20 mg/ml).
METHODE III
Les constituants lipidiques sont dissous dans 5 ml de propylène glycol, maintenus à 60°C (jusqu'à dissolution). La solution tamponnée d'insuline (50 ml) est chauffée à 30°C et introduite dans un bain à ultra-sons (Bransonic 220 V), avec une agitation douce à l'Ultraturrax (0SI). La solution lipidique à 60°C est injectée à faible débit (5 ml en 1 à 2 minutes) au sein de la solution d'insuline maintenue sous agitation et sonication. L'agitation à l'Ultraturrax est poursuivie 2 minutes après l'injetion et la sonication, 30 minutes. Le bain de sonication doit être refroidi par de la glace de façon à maintenir la température inférieure à 40°C.
Après un repos d'une heure, une nouvelle sonication de 30 minutes est effectuée, dans le bac toujours refroidi par de la glace.
Quelle que soit la méthode de préparation, la filtration des suspensions lipidiques est nécessaire pour éliminer la solution d'insuline restée libre.
Cette opération a été réalisée par deux techniques :
TECHNIQUE I :
La séparation de l'insuline libre s'effectue par filtration sur gel de Sépharose 6B (colonne de 25 cm de hauteur et 1,6 cm de section). L'éluant de filtration est le tampon citrate de sodium additionné de 0,6% de chlorure de sodium. Son débit est de 0,5 ml/mn. Le volume de chaque fraction recueillie est de 3 ml. Les vésicules lipidiques sont filtrées entre la 5ème et la 8ème fraction et l'insuline libre, à partir de la 12ème.
TECHNIQUE II :
La séparation de l'insuline libre s'effectue par ultrafiltration tangentielle, sur Minitan acrylique (Millipore), en utilisant un filtre de polysulfone PTMK 300 KD.
Pour cette opération, 100 ml de suspension lipidique sont passés en circuit continu au travers de la cellule Minitan, à un débit de 450 à 500 ml/mn, sous une contre-pression réglée à 40 KPascals, ce qui permet un débit de filtrat de 0,5 à 1,5 ml/mn.
Le volume de la suspension lipidique, concentré par élimination du filtrat, est réajusté à 100 ml, en cours de filtration, avec le tampon citrate de préparation. La solution d'insuline libre est éliminée dans le filtrat à chaque passage de la suspension lipidique au travers de la membrane, et ses différentes fractions peuvent être recueillies à l'aide d'une tubulure latérale du circuit filtrant.
La concentration insulinique des différentes fractions de filtrat est déterminée par dosage (HPLC) et la filtration est arrêtée lorsque cette concentration est inférieure à 2 Ul/ml, ce qui correspond à un volume total de filtrat recueilli de l'ordre de 5 à 600 ml (soit 5 à 6 fois le volume initial de suspension lipidique).
Conservation
Les suspensions d'insuline obtenues par les différentes méthodes peuvent être conservées à 4°C et à l'abri de la lumière, ou lyophilisées telles quelles, après répartition par aliquotes de 2 ml en flacons de 15 ml, pendant 24 heures.
Dosage de la quantité d'insuline fixée
Ce dosage a été effectué par une méthode de chromatographie liquide haute performance (HPLC) en système isocratique, avec une colonne Kromasil C4 , 5 μm, 100 A, de 25 cm de longueur, associée à une précolonne Kromasil C4 , 5 μm, 100 A, de 1,8 cm, destinée à arrêter la majeure partie des phospholipides. La solution éluante est un mélange de 2 solvants A et B, en proportions respectives 590 ml/410 ml, filtré sur Millipore 0,45 μm et additionné de 0,2% d'acetonitrile (v/v). Le solvant A est composé d'acetonitrile : 100 ml et de tampon pH 3,3 : q.s.p 1000 ml et le solvant B, d'acetonitrile : 500 ml et de tampon pH 3,3 : 500 ml. Le tampon pH 3,3 est préparé par élange de sulfate d'ammonium : 39,6 g, acide sulfurique 2N : 0,7 ml (q.s.p pH 3,3) et eau distillée : q.s.p 1000 ml.
Le volume d'injection de l'échantillon à doser est fixé à 100 μl. Le temps de rétention de l'insuline sur la colonne est de l'ordre de 11 mn. Cette méthode de dosage a été mise au point avec la solution aqueuse tamponnée d ' insuline utilisée pour la préparation des suspensions lipidiques . Elle a une bonne sensibili té (1 , 9 μg d' insuline détectable , soi t 0 , 05 UI ) , ainsi qu ' une spéci fici té et une reproductibili té sat isfaisantes .
Les résultats sont exprimés en uni tés d ' hormone/ml de l ' échantillon à analyser .
Le taux de phospholipides des suspensions insuliniques peut être déterminé par la méthode enzymatique de Takayama, à l ' aide de ki ts réactifs de la Société BIOMERIEUX.
Les concentrations en insuline peuvent ainsi être exprimées en Ul/μmol de phospholipides .
Résultats
Les concentrations en insuline des formulations obtenues par les trois méthodes de préparation ont été calculées. Les résultats en sont les suivants :
METHODE I : a permis de fixer une quantité d'insuline de l'ordre d'1 Ul/ml de suspension, soit 0,45 Ul/μmol de phospholipide, ce qui correspond à un rendement de l'ordre de 22% de la quantité initiale d'hormone mise en oeuvre. De plus, la reproductibilité des résultats d'un lot de préparation à un autre s'est avérée être satisfaisante.
METHODE II : n'a fourni qu'une fixation infime d'insuline et ne peut donc être retenue. L'hormone a sans doute été dégradée par l'utilisation de T een à température élevée.
METHODE III : a présenté deux avantages : elle a procuré à la fois un taux de fixation d'insuline plus important que les deux méthodes précédentes, et une préparation quantitative de suspension lipidique chargée en insuline, grâce au mode de filtration rapide adopté. Dans le cas de suspension contenant une concentration lipidique de 25 μmol/ml, le taux d'insuline fixée a été de 15 Ul/ml, soit 0,74 Ul/μmol de phospholipide et un rendement de l'ordre de 37%. Pour des préparations contenant 50 μmoles de phospholipide /ml, le taux de fixation hormonale a ateint 25 Ul/ml, soit 0,60 Ul/μmol de phospholipide et un rendement de 60% de la quantité initiale.
EXEMPLE 2
ETUDE DE L'INCORPORATION D'UNE COMPOSITION PEPTIDIQUE DANS DES LIPOSOMES
Au cours des précédents travaux, il a été montré la possibilité de préparer des suspensions liposomiales d'insuline présentant un rendement d'encapsulation satisfaisant et une bonne reproductibilité des résultats d'un lot de préparation à un autre. La méthode de préparation adoptée a été la méthode de Bangham et la composition lipidique sélectionnée, un mélange de phosphatidylcholine d'oeuf ou de soja et de cholestérol associés à un lipoïde de charge négative, dont la présence s'est avérée indispensable pour l'obtention d'une fixation quantitative d'hormone.
On a poursuivi ces études avec plusieurs objectifs :
- améliorer le rendement d'encapsulation, en utilisant comme lipoïde de charge, l'hémisuccinate de cholestérol au lieu du phosphate de dicétyle.
diminuer les effets secondaires éventuels en évaluant la concentration minimale efficace pour une bonne encapsulation de l'hormone, dans le cas de l'utilisation du phosphate de dicétyle.
limiter le coût de la préparation en utilisant de la phosphatidylcholine de soja au lieu de la phosphadidylcholine d'oeuf. améliorer la conservation des préparations en lyophilisant les suspensions lipidiques d'insuline.
envisager un autre mode de préparation quantitative, en vue d'une application industrielle de la formulation mise au point.
Préparation de liposomes d'insuline chargés négativement par de l'hémisuccinate de cholestérol
Ces liposomes ont été composés de phosphatidylcholine d'oeuf ou de soja, de cholestérol et d'hémisuccinate de cholestérol dans les rapports molaires 7/2/1, 7/1/1 et 7/0/2.
Les résultats sont présentés dans le Tableau I. Ils montrent que les taux de fixation de l'hormone obtenus dans ces conditions sont bien inférieurs à ceux observés en utilisant le phosphate de dicétyle.
L'hémisuccinate de cholestérol ne peut donc pas être utilisé comme lipoïde de charge.
Préparation de liposomes d'insuline chargés négativement par du phosphate de dicétyle à différentes concentrations
Ce lipoïde de charge a été introduit à trois concentrations, dans les rapports molaires phospholipide/cholestérol / lipoïde, suivants : 7/2/0,5, 7/2/1 et 7/2/2.
Les taux d'encapsulation obtenus avec les trois formulations, reportés dans le Tableau II, montrent que le meilleur rapport molaire des trois constituants lipidiques est de 7/2/1.
C'est celui qui sera retenu pour la formulation des liposomes chargés en insuline.
Comparaison des taux d'encapsulation de l'hormone, selon la nature du phospholipide utilisé Trois lots de liposomes d'insuline ont été préparés, en utilisant de la phosphatidylcholine d'oeuf, de la phosphatidylcholine de soja (moins riche en acides gras saturés que celle d'oeuf) et de la phosphatidylcholine de soja partiellement hydrogénée (donc plus riche en acides gras saturés qua la précédente).
Les caractéristiques des liposomes obtenus ainsi que les rendements d'encapsulation, reportés dans le Tableau 3, montrent que la phosphatidylcholine de soja permet des taux de fixation d'hormone du même ordre que la phosphatidylcholine d'oeuf et, présentant l'avantage d'un moindre coût, sera adoptée comme phospholipide, pour la formulation des suspensions liposomiales. En revanche, la forme partiellement hydrogénée ne présente pas d'intérêt dans les conditions de la mise au point.
Lyophilisation des suspensions liposomiales
Des essais de lyophilisation ont été effectués, pendant 24 heures, sur des aliquotes de suspension de 2 ml, en présence et en l'absence de mannitol. Le dosage du taux d'insuline fixé a été pratiqué avant et après lyophilisation. De plus, la tailles des vésicules liposomiales a été déterminée dans les mêmes conditions.
Les résultats, présentés dans le Tableau IV, montrent que la présence de mannitol modifie considérablement la taille des vésicules et n'améliore en rien la stabilité des préparations.
Une lyophilisation réalisée sur la solution d'insuline libre montre que cette opération ne dénature pas l'hormone qui ne présente pas de changement dans ses caractéristiques chromatographiques (mêmes temps de rétention et hauteur du pic pour l'insuline lyophilisée ou non). Les suspensions liposomiales peuvent donc être lyophilisées sans mannitol pour conserver leur stabilité. Préparation quantitative de suspensions liposomiales
Les résultats présentés ci-dessus se rapportent à des suspensions liposomiales préparées selon la méthode de Bangham. Cette méthode ne permet de préparer que de faibles quantités de suspensions, d'un volume de 20 ml maximal. En effet, la préparation de volumes supérieurs (100 ml) a conduit à des suspensions dont la taille des vésicules étaient très homogènes et le taux de fixation de l'hormone beaucoup plus faible. Ces inconvénients sont sans doute liés à la difficulté de soniquer des volumes importants de suspensions liposomiales.
Pour tenter de préparer des volumes plus importants, avec un taux d'encapsulation satisfaisant et une homogénéité des suspensions, on opère selon une autre méthode.
Les constituants lipidiques (phosphatidylcholine de soja, cholestérol et phosphate de dicétyle), sont dissous dans 5 ml de propylène glycol maintenu à 60°C.
La solution d'insuline tamponnée à pH 3,0 est chauffée à 30°C et introduite dans un bain à ultra-sons, sous agitation douce à l'Ultraturrax. La solution lipidique à 60°C est injectée à faible débit (5 ml en 1 à 2mn) au sein de la solution d'insuline encore sous agitation et sonication. L'agitation à l'Ultraturrax est poursuivie 2 mn après l'injection et la sonication, 30 mn. Le bain de sonication doit être refroidi par de la glace de façon à maintenir la température inférieure à 40°C. Après un repos d'une heure, une nouvelle sonication de 30 mn est effectuée dans le bac toujours refroidi par de la glace. La séparation de l'insuline libre s'effectue par ultrafltration tangentielle, sur Minitan acrylique (Millipore), en utilisant un filtre de polysulfone PTMK 300 KD.
Cette méthode de filtration permet de traiter un volume de 100 ml de suspension liposomiale. Associée au mode de préparation précédemment décrit (qui lui-même s'applique à des volumes de suspensions élevés), elle permet d'envisager avec succès une préparation industrielle de suspensions liposomiales.
Les caractéristiques des préparations obtenues par cette méthode sont présentés dans le tableau V. L'un des avantages est notamment l'augmentation significative du rendement d'encapsulation de l'hormone.
TABLEAU I Influence de la nature du lipoïde de charge liposomes chargés négativement par de l'hémisuccinate de cholestérol
Nature du Composition Taux d'insuline fixée Rendement phospholipide lipidique Ul/ml Ul/μmol PL
Phosphatidylcholine d'oeuf 7/2/1 0,15 0,025 1,24%
7/1/1 0,20 0,04 1,80%
7/0/2 0,33 0,051 2,5%0
Phosphatidylcholine de soja 7/2/1 1,80 0,273 13,65%
7/1/1 2,11 0,217 10,85%
7/0/2 2,15 0,233 11,64%
La composition lipidique est exprimée en rapport molaire de phosphatidylcholine, cholestérol et d'hémisuccinate de cholestérol.
le rendement est exprimé en % de la quantité théorique d'insuline fixée, soit 2 Ul/μmol de phospholipide. TABLEAU II influence de la concentration en phosphate de dicétyle
Nature du Composition Taux d'insuline fixée Rendement phospholipide lipidique Ul/ml Ul/μmol PL
Phosphatidylc -.holine d'oeuf 7/2/1 4,34 0,97 48%
7/2/2 1,72 0,60 30%
Phosphatidylcholine de soja 7/2/0,5 4,96 0,34 17%
7/2/1 2,20 0,98 49%
7/2/2 0,80 0,37 18%
Phosphatidylcholine de soja partiellement hydrogénée 7/2/1 0,72 0,18 9%
TABLEAU III Influence de la nature du phospholipide
Nature du Taille des Taux d'insuline fixée Rendement phospholipide vésicules Ul/ml Ul/μmol PL
Phosphatidylcholine d'oeuf 225±160nm : 85% 4,34 0,97 48%
1400+400nm : 15%
Phosphadidylcholine de soja 130± 20nm : 80% 2,20 0,98 49%
1200+200nm : 20%
Phosphatidylcholine de soja partiellement hydrogénée 160± 80nm 50% 0,72 0,18 9%
700+300nm 50%
- la composition lipidique des 3 formulations était : phospholipide, cholestérol et phosphate de dicétyle, dans un rapport molaire 7/2/1. TABLEAU IV
Essai de lyophilisation influence de la charge en mannitol
Nature du Taille des Taux d'insuline fixée Rendement phospholipide vésicules Ul/ml Ul/μmol PL
Solution d'insuline à 50 Ul/ml lyophilisée sans mannitol 54,0 lyophilisée avec mannitol 48,7
Liposomes composés de phosphatidylcholine de soja non lyophilisés 140+ 60nm 70% 1,83 0,75 37,5% 1600+340nm 30%
lyophilisés sans mannitol 200±100nm : 45% 2,31 0,99 50%
2100+650nm : 55%
lyophilisés avec mannitol 600±150nm : 35% 2,29 0,88 44%
6000+lOOOnm: 65% TABLEAU IVB Essai de lyophilisation stabilité des préparations après 2 mois
Nature du Taille des Taux d'insuline fixée Rendement phospholipide vésicules Ul/ml Ul/μmol PL
liposomes composés de phosphatidylcholine de soja non lyophilisés 200+ 80nm : 70% 1,65 0,60 30% 5000+1300nm: 30%
lyophilisés sans mannitol 170± 40nm : 40% 1,70 0,65 32%
3700±900nm : 60%
lyophilisés avec mannitol 200± 30nm : 20% 1,15 0,45 23%
4100+500nm : 80%
TABLEAU V Essai de préparation quantitative de liposomes
Mode de Taille des Taux d'insuline fixée Rendement préparation vésicules Ul/ml Ul/μmol PL
Bangham 270± 70nm : 65% 9000±2000nm: 35% 0,80 0,18 9,2%
Injection de solution glycolique 210± 85nm : 60% 1300+400nm : 40% 2,0 0,68 34% Les deux modes de filtration des suspensions liposomiales (filtration sur gel ou filtration sur Minitan acrylique) ont donné des rendements d'encapsulation sensiblement identiques.
Compte tenu des rendements d'encapsulation satisfaisants obtenus par mise en jeu d'un mode de préparation quantitative des liposomes d'insuline, des essais biologiques ont été effectués sur le rat.
Les résultats obtenus permettent d'envisager la mise au point d'une forme sèche, adhésive, facilitant l'administration des préparations, notamment par voie digestive ou par voie perlinguale.
ETUDE PHARMACOLOGIQUE
EXPERIMENTATION D'UNE PREPARATION Δ ACTIVITE HYPOGLYCEMIANTE
4 lots de rats normoglycémiques, mis à jeun 8 heures avant l'épreuve, sont considérés :
1er lot de 5 rats : témoins non traités, servent à déterminer les variations chronobiologiques de la glycémie
2ème lot de 5 rats : traités par voie intra-péritonéale, servent de témoins d'activité de la préparation
3ème lot de 10 rats : gavés par voie intra-buccale ou perlinguale
4ème lot de 10 rats : gavés par voie intra-gastrique, servent à évaluer l'activité de la préparation, après administration orale.
Des prises de sang veineux seront effectuées sur l'ensemble des animaux à jeun, puis 30 mn, 1 heure, 2, 3, 4, 5, 12 et 24 heures après administration des différentes préparations chez les animaux traités et chez les témoins servant à déterminer les variations spontanées de la glycémie. Ces prélèvements sont effectués en ayant soin d'éviter tout stress ou anesthésie des animaux, susceptible de provoquer une perturbation de leur glycémie. Le meilleur moyen consiste à traiter des animaux porteurs d'un cathéter permanent de prélèvement.
Les doses de préparation, se présentant sous forme liquide, sont déterminées par HPLC au préalable.
Les résultats obtenus avec le 3ème et le 4ème lot de rats sont pratiquement identiques aux variations de glycémie relevées avec les rats du 2ème lot, c'est-à-dire traités par voie intra-péritoneale. L'absorption d'insuline par voie digestive est donc presque complète.

Claims

R E V E N D I C A T I O N S
L'invention a pour objet :
1°- Un procédé de préparation de nouvelles compositions pharmaceutiques permettant l'absorption des principes actifs peu résorbables ou susceptibles d'être hydrolyses, caractérisé en ce que l'on forme, au préalable, des liposomes multilamellaires par dissolution d'un mélange de phospholipides et de cholestérol dans un solvant chlore, qu'on évapore le solvant sous pression réduite, qu'on disperse le résidu sec dans une solution ou suspension aqueuse du principe actif à incorporer, jusqu'à ce que la phase lipidique soit répartie d'une manière homogène dans la phase aqueuse, qu'on filtre les vésicules ainsi formées par fixation sur gel de polyacrylamide ou de cellulose modifiée et que l'on élue à l'aide d'une solution tampon à base de citrates.
2°- Un procédé selon la revendication 1° dans lequel on additionne la phase lipidique avec un ou plusieurs agents acidifiants et on obtient des liposomes multilamellaires chargés négativement.
3e- Un procédé selon la revendication 1° ou la revendication 2° dans lequel l'agent acidifiant est choisi dans le groupe constitué par le phosphate de dicétyle et un ester acide de cholestéryle.
4°- Un procédé selon la revendication 3° dans lequel l'ester acide de cholestéryle est l'hémisuccinate de cholestéryle.
5°- Un procédé selon la revendication 1° dans lequel la phase aqueuse des liposomes est additionnée d'un agent tensio-actif non ionique.
6°- Un procédé selon l'une des revendications 1 à 5° dans lequel les vésicules recueillies après dispersion, sont lyophilisées avant la filtration sur gel. °- Un procédé selon l'une des revendications 1 à 6° dans lequel les liposomes multilamellaires renfermant un principe actif sont ajustés à la teneur désirée par des liposomes neutres ne contenant pas de principe actif.
°- Un procédé selon la revendication 1° dans lequel la filtration des liposomes est effectuée sur colonne de Séphadex.
°- Un procédé selon la revendication 1° ou la revendication 8° dans lequel les liposomes sont élues au moyen d'un tampon acide citrique et citrate de sodium, additionné de chlorure de sodium.
°- Un procédé selon la revendication 1° dans lequel le principe actif incorporé dans les liposomes multilamellaires est une molécule peptidique susceptible d'être hydrolyse dans le tube digestif, d'origine naturelle, synthétique ou génétique.
°- Une composition pharmaceutique formée de liposomes multilamellaires éventuellement chargés négativement contenant à titre de principe actif une ou plusieurs molécules peptidiques dans la phase aqueuse du liposome, additionné éventuellement de liposomes neutres, ces liposomes étant préparés selon le procédé des revendications 1 à 10.
°- Une composition pharmaceutique selon la revendication 11° dans laquelle le principe actif peptidique est une insuline humaine ou animale ou une insuline produite par génie génétique.
°- Une composition pharmaceutique selon la revendication 11° dans laquelle le principe actif peptidique est une calcitonine humaine ou animale, ou une calcitonine produite par génie génétique.
°- Une composition pharmaceutique selon la revendication 11° dans laquelle le principe actif peptidique est l'ocytocine.
PCT/FR1993/000672 1992-01-03 1993-07-01 Nouvelles preparations pharmaceutiques a base de peptides pour la voie generale WO1995001163A1 (fr)

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