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WO1994012648A2 - Production de sous-unites de recepteurs t solubles par co-transfection, utilisations des produits ainsi obtenus - Google Patents

Production de sous-unites de recepteurs t solubles par co-transfection, utilisations des produits ainsi obtenus Download PDF

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WO1994012648A2
WO1994012648A2 PCT/FR1993/001165 FR9301165W WO9412648A2 WO 1994012648 A2 WO1994012648 A2 WO 1994012648A2 FR 9301165 W FR9301165 W FR 9301165W WO 9412648 A2 WO9412648 A2 WO 9412648A2
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soluble
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Marc Bonneville
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Institut National De La Sante Et De La Recherche
Immunotech
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    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Definitions

  • the present invention relates to soluble T receptors and more particularly to secreted forms of soluble T receptors (RTs)
  • T lymphocytes are able to recognize in a highly specific way myriads of antigens (Ag), by means of extremely diversified surface structures belonging to the immunoglobulin (Ig) superfamily, T receptors (RT ).
  • Ag antigens
  • Ig immunoglobulin
  • RT T receptors
  • variable glycoprotein subunits In humans as in mice, most T lymphocytes in adults express RTs made up of 2 variable glycoprotein subunits called ⁇ and ⁇ . Like the heavy and light chains of Ig, these subunits comprise a variable domain (V) aminoterminal and a constant domain (C) carboxyterminal and are furthermore very generally associated with each other covalently, via an interchain disulfide bridge.
  • V variable domain
  • C constant domain
  • the nature of the antigens recognized by the ⁇ receptor is relatively well established: they are complexes formed by an oligopeptide antigen (resulting from the intracellular degradation of endogenous or exogenous proteins) closely associated with the products of polymorphic genes located in the major complex histocompatibility (CMH), known as class I or II.
  • CMH major complex histocompatibility
  • the interaction between the ⁇ receptor and the MHC / Ag complexes is conventionally reinforced by so-called core or accessory molecules (CD4 and CD8), recognizing conserved portions of the MHC class II
  • T lymphocytes More recently, another subpopulation of T lymphocytes has been described which is distinguished by the nature of the genes (7 and ⁇ > encoding these T receptors. Unlike the ⁇ T lymphocytes, the antigenic * specificity of the T y ⁇ cells is still unclear. Based on a relative homology of the primary sequences of the ⁇ and ⁇ chains of the T receptor, some predicted structural similarity of the ligands for these receptors. In agreement with this hypothesis, a fraction of ⁇ T lymphocytes has been found to be directed against molecules structurally close to or identical to MHC products conventionally recognized by ⁇ T lymphocytes. However, there are also several examples of recognition by this T subpopulation of molecules of more distant structure, such as stress proteins or certain activation molecules such as CD48.
  • the present inventors sought to generate “soluole” (secreted) forms of the ⁇ T receptor, which could be used (like Ig) as probes allowing the isolation, localization and possibly the purification of specific ligands. . Furthermore, such soluble T receptors also have a number of clinical applications. Traunecker et al. (1989. Immunol. Today 10:29) reported attempts to produce soluble T receptors which consisted in eliminating the transmembrane (TM) portion of the ⁇ chains or ⁇ chains by introducing a translation termination codon upstream of the sequences coding for the TM region which proved to be unsuccessful, no secretion being able to be detected. Following these initial failures, other strategies were then adopted.
  • TM transmembrane
  • chimeric proteins comprising the V, or V and C regions of the ⁇ and ⁇ subunits, attached to the C 'immunoglobulin regions or to glycosyl phosphatidylinositol anchors. (GPI).
  • RT / Ig fusion proteins the main problem turned out to be the sometimes majority secretion of monomeric or homodimeric forms.
  • heterodimeric forms RTs ⁇ sometimes presented significant structural differences with the membrane forms; in particular the 2 chains ⁇ and ⁇ were very generally associated in a non-covalent manner. This could therefore have repercussions on the overall structure and the fine antigenic specificity of such chimeric molecules.
  • the present inventors have discovered that soluble T receptors can be obtained easily and in high yield regardless of the combination of chains implemented, using a method consisting in producing DNA molecules coding for each of the constituent T-subunits deleted from the branch branch portion, and in co-transferring these DNAs in a host cell.
  • the present invention also relates to a method for producing soluble T receptors, charac ⁇ terized in that a co-transfection is carried out in a host cell of the DNA sequences coding for each of the constituent subunits of the T receptor. deleted from the transmembrane portion of the T receptor.
  • soluble V ⁇ C ⁇ / V ⁇ C ⁇ T receptors are produced by co-transfection into a host cell of the DNA sequences coding for the ⁇ and ⁇ subunits of the T ⁇ receptor deleted from the transmembrane portion of the T ⁇ receptor.
  • V ⁇ C ⁇ / V ⁇ C ⁇ soluble T receptors are also produced by co-transfection into a host cell of the DNA sequences coding for the ⁇ and ⁇ subunits of the T ⁇ receptor deleted from the transmembrane portion of the T ⁇ receptor.
  • soluble heterodimeric T receptors V ⁇ C ⁇ / V ⁇ C ⁇ and V ⁇ C ⁇ / V ⁇ C ⁇ are produced, in which the constituent subunits are associated by a covalent bond, by co-transfection into a host cell of the DNA sequences encoding for the C ⁇ and C ⁇ domains of the ⁇ and ⁇ subunits of the T ⁇ receptor deleted from their transmembrane portion, fused respectively with the DNA sequences coding for the Va and V ⁇ domains of the a and ⁇ subunits of the Ta ⁇ receptor for obtaining VaC ⁇ / V ⁇ C ⁇ receptors, or fused respectively with the DNA sequences coding for the V ⁇ and Va domains of the ⁇ and a subunits of the Ta ⁇ receptor to obtain VaC ⁇ / V ⁇ C ⁇ receptors.
  • T receptors soluble V ⁇ C ⁇ / V ⁇ C ⁇ hybrids by co-transfection into a host cell of DNA sequences coding for the ⁇ subunit of the T ⁇ receptor deleted from its transmem ⁇ bran portion, with the DNA sequences coding for the C ⁇ domain of the ⁇ subunit fused with DNA sequences encoding the Va domain of the ⁇ subunit of the T ⁇ 6 receptor.
  • This construction is particularly advantageous and is based on the fact that certain Va genes can be used either by ⁇ clones, or by ⁇ clones.
  • the DNA sequences of the V ⁇ 2 and V ⁇ 9 genes are used for the constructions of the soluble T receptors of the invention for the variable parts. It may however be advantageous to produce V ⁇ C ⁇ / V ⁇ C ⁇ receptors by using a V ⁇ 9 DNA sequence on the one hand, and by replacing the V ⁇ 2 DNA sequence with other V ⁇ DNA sequences for the same reasons as those mentioned. above for the construction of the hybrid V ⁇ C ⁇ / V ⁇ C ⁇ receptor. This construction makes it possible to obtain anti- ⁇ antibodies, or directed against V ⁇ distinct from V ⁇ 2.
  • the invention also encompasses these embodiments of soluble V ⁇ C ⁇ / V ⁇ C ⁇ T receptors.
  • V ⁇ in particular V ⁇ l
  • V ⁇ can be considered as Va, in the sense that they can be indifferently used by chains ⁇ or ⁇ of the receptor T.
  • the examples of receptors produced under soluble form provided here demonstrate in particular the advantage of the process in the context of the generation of antibodies monoclonals directed not only against the regions, variables ⁇ and ⁇ , but also ⁇ .
  • the deletion of the transmembrane portion of the constituent subunits of the T receptor is carried out by introducing a translation termination codon upstream of the sequences coding for the transmembrane portion of these subunits, in particular by mutagenesis directed by P.C.R. (Polymerase Chain Reaction).
  • DNA sequences are genomic DNA or cDNA sequences.
  • the co-transfection is carried out in eukaryotic cells, in particular hamster ovary (CHO) cells.
  • a subject of the invention is also a fusion protein formed between a soluble T receptor and a peptide sequence, the peptide sequence constituting a peptide or a protein, the fusion protein being obtained by fusion of the sequence DNA coding for the peptide or protein with one or both chains of DNA coding for the T receptor subunits deleted from their transmembrane portion, followed by co-transfection of the sequences d DNA thus fused into a host cell.
  • the peptide sequence is that of interleukin-2 (IL-2).
  • the subject of the invention is also polyclonal or monoclonal antibodies, human or animal, directed against a soluble T receptor obtained by the method of the invention or an RTs-IL2 fusion protein as defined above.
  • the monoclonal antibodies according to the invention can be prepared according to a conventional technique.
  • the soluble T receptors possibly fused with interleukin-2 or another protein, can be coupled if necessary with an immunogenic agent,. such as tetanus toxoid, by a coupling agent such as a diazotized benzidine.
  • the present invention also encompasses the fragments and derivatives of monoclonal antibodies according to the invention.
  • These fragments are in particular the F (ab ') 2 fragments which can be obtained by enzymatic cleavage of the antibody molecules with pepsin, the Fab' fragments which can be obtained by reduction of the disulfide bridges of the F (ab ') 2 fragments and the Fab fragments which can be obtained by enzymatic cleavage of the antibody molecules with papain in the presence of a reducing agent.
  • These fragments, as well as Fc fragments can also be obtained by genetic engineering.
  • the derivatives of monoclonal antibodies are for example antibodies or fragments of these antibodies to which markers such as a radioisotope are linked.
  • Monoclonal antibody derivatives are also antibodies or fragments of these antibodies to which therapeutically active molecules are linked.
  • the subject of the invention is also hybridomas producing monoclonal antibodies specific for the peptide sequence described above.
  • hybridomas can be obtained by conventional techniques of cell fusion between spleen cells activated in vitro by the antigen or originating from an animal immunized against the peptide sequence of the invention, and cells of a myeloma line.
  • a subject of the invention is also a diagnostic composition
  • a diagnostic composition comprising a soluble T receptor obtained by a method according to the invention or an RTs-peptide sequence fusion protein, in particular RTs-IL2 as defined above, or also a monoclonal antibody according to 'invention.
  • the diagnostic composition according to the invention tion can be used for typing cellular specificities linked to the T receptor.
  • a soluble T receptor can be used as such.
  • due to the probably low affinity of the latter for its specific ligand it is advantageous to couple the soluble T receptors to a support, in order to increase their avidity by increasing their valence.
  • the support may consist of any support traditionally used, such as organic or magnetic beads.
  • Such supports are for example plastic plates used for ELISA tests on which the soluble T receptor is fixed in the same way as immunoglobulins, tosyl-activated magnetic beads, for example those sold by Dynal, Oslo, Norway, or activated gels of the AFFIGEL type such as those marketed by BIORAD.
  • the coupling techniques are those conventionally used and indicated by the distributor for commercially available supports.
  • These methods may consist of chemical coupling or by means of monoclonal antibodies directed against the soluble T receptors in question, the latter being themselves coupled to the support by chemical coupling.
  • the diagnostic compositions comprise a fused protein as described above, consisting of a soluble T receptor and an antigenic determinant against which there are specific antibodies.
  • Such diagnostic compositions can be used for typing cell specificities not detected by conventional serological techniques.
  • the diagnostic composition according to the invention tion can also include monoclonal antibodies as defined above, and preferably a panel of monoclonal antibodies directed against the V and C portions of the T receptor chains obtained by immunization of animals against the soluble T receptors obtained according to the invention, previously purified.
  • RTs-IL2 fusion proteins as defined above.
  • Such a diagnostic composition can be used in particular for the detection of mono or oligoclonal proliferations, such as those encountered in T leukemias for example.
  • the diagnostic composition is brought into contact with a biological sample, for example a blood sample containing pathological T lymphocytes, and the complex formed with the specific ligand for the T receptor and the T receptor is highlighted.
  • soluble or the fusion protein comprising the soluble T receptor and an antigenic determinant or the complex formed by the monoclonal antibodies according to the invention and the soluble T receptor or the soluble T receptor-IL2 fusion protein against which they are specifically directed.
  • soluble or the fusion protein comprising the soluble T receptor and an antigenic determinant or the complex formed by the monoclonal antibodies according to the invention and the soluble T receptor or the soluble T receptor-IL2 fusion protein against which they are specifically directed.
  • These methods can be based on a radioimmunological method of RIA, RIPA or IRMA type, or an immunoenzymatic method of WESTERN-BLOT type on strips or of ELISA type.
  • cold molecules are used which are not marked or marked with the aid of a suitable marker which may be biotin or its derivatives, an enzyme such as peroxidization, a fluorescent marker such as fluorescein, a radioactive marker, etc.
  • a suitable marker which may be biotin or its derivatives, an enzyme such as peroxidization, a fluorescent marker such as fluorescein, a radioactive marker, etc.
  • These in vitro diagnostic procedures include The following steps are taken, for example: depositing a determined quantity of a composition containing a soluble T receptor, a soluble receptor fused with an antigenic determinant or a monoclonal antibody according to the invention directed against the soluble T receptor or the protein of soluble T-Interleukin 2 receptor fusion according to the invention, in the wells of a microtitation plate or on another support such as beads or a nitrocellulose membrane, deposit in the wells of the biological sample to be tested, or incubation of the latter with the beads or the membrane, in the presence of saturating agents or after prior saturation of the activated supports, - after incubation and rinsing of the microplates or bilies, deposit in the wells or incubation with the beads a system for revealing the soluble T receptor-ligand complex possibly formed.
  • kits for implementing the diagnostic method of the invention include:
  • a subject of the invention is also a therapeutic composition characterized in that it comprises a soluble T receptor obtained according to the method of the invention or a fusion protein as defined above, in particular an RTs-IL2 according to the invention. ⁇ tion.
  • a therapeutic composition is useful especially in the treatment of pathological processes - in which a pauciclonal proliferation of T lymphocytes is observed, such as leukemias or T lymphomas and certain autoimmune diseases. It is preferably administered by injectable route in an appropriate vehicle.
  • this therapeutic composition has a dual purpose. It allows on the one hand the induction of an anti-idiotypic immune response, then leading to the active and selective elimination of the cells carrying these idiotypes, and on the other hand the blocking by competition of the recognition of autologous antigens in the case of autoimmune proliferations.
  • the therapeutic composition according to the invention comprises a soluble heterodimeric T receptor as defined above, optionally carried by a fusion protein.
  • the therapeutic composition according to the invention can also comprise a monoclonal antibody according to the invention, optionally coupled to a therapeutically active molecule, for example a cytotoxic molecule, or a fragment or derivative of monoclonal antibody as defined above.
  • a monoclonal antibody according to the invention optionally coupled to a therapeutically active molecule, for example a cytotoxic molecule, or a fragment or derivative of monoclonal antibody as defined above.
  • composition allows the direct elimination of mono- or oligoclonal cells encountered in certain types of T leukemia.
  • - Figure 1 represents the assembly products of the ⁇ and ⁇ genes.
  • the sequences of the primers 5 'and 3' used to amplify the cDNAs making it possible to obtain the soluble T ⁇ receptors (cDNAs ⁇ s and ⁇ s) are shown above and below the cDNAs ⁇ and ⁇ respectively.
  • the positions of the termination codons are shown in bold.
  • the 3 • gray parts of the ⁇ and ⁇ cDNAs correspond to the hydrophobic transmembrane (TM) regions.
  • FIG. 2 represents the corresponding nucleotide and peptide sequences of the soluble ⁇ and ⁇ chains of the clone used for the construction of the soluble T receptor described above.
  • FIG. 3 shows the results of RTs ⁇ detection tests by the IRMA technique in conditioned medium from CHO cells transfected with ⁇ s / ⁇ s.
  • SN represents the culture supernatant of CHO cells, transfected with an irrelevant cDNA (C) or with the cDNAs of the soluble ⁇ and ⁇ subunits according to the invention (s ⁇ ).
  • the monoclonal antibodies giving a significant radioimmunological signal are represented in bold rectangles.
  • FIG. 4 represents the titration in activity of soluble RT expressed in ⁇ g / ml, as attested by the IRMA test (sand ich 7B6 / TiV ⁇ 2), fractions eluted from an affinity column coupled with the anti-V ⁇ antibody 7B6 (marketed by Immunotech), to which approximately 500 ml of culture supernatant of ⁇ sF5-CH0 cells have been applied.
  • FIG. 5 represents the analysis by SDS-PAGE of positive fractions for the activity of soluble RT, as attested by the IRMA test (sandwich 7B6 / TiV ⁇ 2), of the fractions eluted from an affinity column coupled with the anti-V ⁇ 9B6 antibody.
  • the clone of human lymphocytes ⁇ s G 115 (whose nucleotide and peptide sequences corresponding to the soluble ⁇ and ⁇ chains are represented in FIG. 2, respectively in A and B) expressing T receptors V9JPCl ⁇ / V2D3JlC ⁇ was used for the construction of ⁇ s genes and expression of soluble T receptors.
  • T ⁇ receptors for human leukocytes in peripheral blood include similar V (D) J regions so that the structural and functional results obtained with the soluble form of the particular RT used can be easily applied to the RT expressed by a large proportion of ⁇ cells, - monoclonal antibodies specific for the C ⁇ , C ⁇ , V ⁇ 9 and V ⁇ 2 regions are readily available and can be used to monitor the production and purification of soluble RT molecules,
  • the ⁇ and ⁇ chains of the T receptors of clone G 115 are covalently linked by a disulfide bridge which strongly stabilizes the molecule after its secretion in the medium ,
  • clone G 115 kills the cells of a Burkitt lymphoma (called Dadi) and also recognizes an antigen present in water-soluble extracts of Mycobacterium tuberculosis.
  • Dadi Burkitt lymphoma
  • Clone G 115 derived from T ⁇ lymphocytes derived from leukocytes from peripheral human blood, was maintained in RPMI 1640 medium containing 8% human serum, 2 mM L-glutamine and 150 BRMP (Biological Response Modifier Program) units of IL2 and stimulated every other week with 0.5 ⁇ g / ml of leucoagglutinin (Pharmacia, France), irradiated peripheral blood leukocytes and B lymphoblasts irradiated and transformed by EBV.
  • RPMI 1640 medium containing 8% human serum, 2 mM L-glutamine and 150 BRMP (Biological Response Modifier Program) units of IL2 and stimulated every other week with 0.5 ⁇ g / ml of leucoagglutinin (Pharmacia, France), irradiated peripheral blood leukocytes and B lymphoblasts irradiated and transformed by EBV.
  • BRMP Bio Response Modifier Program
  • MMTV mouse mammary tumor virus
  • a mixture for PCR comprising Tris-HCl 13 mM (pH 8.2), KC1 66 mM, MgCl 2 2 M, 2 U of Taq polymerase (Boehringer) and 50 ⁇ M of primer 5 'phospha ⁇ ted shown in Figure 1 were added to the material obtained by reverse transcription and 30 amplification cycles (94 ° C - 1 min, 45 ° C - 1 min, 72 ° C - 1 min) were carried out.
  • Amplified DNA was purified after electrophoresis on low melting point agarose gel and cloned into a Bluescript SK + plasmid (Stratagene, La Jolla, California) digested with Sma I.
  • the sequencing was carried out using a double-stranded matrix system according to the protocol supplied by the supplier of the USB sequencing kit.
  • the fragments were cloned into an expression vector pKCR6 (Matrisian et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 83: 9413) digested with EcoRI.
  • the plasmid DNA was then introduced into DUKX-B11 DHFR (dihydro-folate reductase) -negative hamster ovary cells, cultured on RPMI 1640 medium, supplemented with 8% fetal calf serum, of 2 mM L-glutamine, thymidine, adenosine and deoxyadenosine at 10 ⁇ g / ml each, using the calcium phosphate precipitation technique (Wigler et al., 1979 Cell. 16: 777).
  • DUKX-B11 DHFR dihydro-folate reductase
  • the DHFR-positive cells were selected by culture of the transfected cells for three weeks in RPMI medium, supplemented with fetal calf serum and L-glutamine (2 mM) without nucleosides. The stable transfectants were then cloned by the limiting dilution technique.
  • soluble Tyô receptors a) Detection of soluble T receptors The monoclonal antibodies used for the detection of soluble RTs were labeled with 125 I by the Iodogen method (Fraker et al., 1978 Biochem.- Biophys.Res.Commun. 80: 849). The T receptors were detected by an immunoradiometric test (IRMA) sandwiched using pairs of monoclonal antibodies specific for the ⁇ and ⁇ chains.
  • IRMA immunoradiometric test
  • Immulon-1 microtiter plates (Dynatech, Marnes, France) were coated for 90 min. at 37 ° C with 50 ⁇ l of monoclonal antibody Y102 (or 7B6) at 40 ⁇ g / ml in a saline solution of phos ⁇ phate buffer. After elimination of the antibody, the unbound sites were saturated with a saline solution of phosphate buffer containing 0.5% bovine serum albumin for 1 hour at room temperature. The samples to be analyzed were then added in an amount of 40 ⁇ l at the same time as 10 ⁇ l of labeled TiV ⁇ 2 monoclonal antibody. After 90 min. incubation at 37 ° C, the wells were rinsed four times with 100 ⁇ l of a saline solution of phosphate buffer supplemented with bovine serum albumin.
  • the bound radioactivity was measured in a scintillation ⁇ counter.
  • the following set of antibodies was used to measure the secretion of soluble RT ⁇ by the IRMA technique: anti-V ⁇ 9 (Y102, B37, 7B6), anti-C ⁇ (B121) and anti-V ⁇ 2 (TiV ⁇ 2) antibodies (Miossec and al., 1989, J. Exp. Med. 171: 1171).
  • a monoclonal antibody specific for IL2 was also used as a negative control.
  • Soluble RT samples were prepared in gel electrophoresis buffer with or without reducing agent, separated by SDS-PAGE, and transferred to a nitrocellulose membrane according to the supplier's recommendations. After saturation of the unbound sites with a blocking buffer (dehydrated skimmed milk and Tween 20), the fingerprints obtained were incubated in the presence of primary antibody (hybridoma supernatant diluted one third with the blocking buffer) for 2 hours at ambient temperature. After washing, an anti-horseradish Ig-peroxidase conjugate was added, and the incubation continued for another 2 hours. The bound antibodies were revealed by diaminobenzidine (1 mg / ml), H 2 0 2 and CoCl 2 .
  • the reaction was estimated to be complete by determining tests for monitoring digested samples by isoelectric focusing in PhastGel IEF 3-9 medium (Pharmacia). After dilution with 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.3, the sample was concentrated using a centripep column at 30,000 revolutions (Amicon) before proteysis. The ⁇ receptors treated with neuraminidase were digested at 37 ° C for 30 minutes with papain (orthington) at an enzyme / substrate ratio of 1/500 in the presence of 1.5 M 2-mercaptoethanol and 1.25 mM EDTA . The reaction was completed by adding N-ethylmaleimide.
  • reaction medium was then applied to a Zorbax CF-250 size exclusion chromatography column (DuPont - New England Nuclear) which made it possible after elution to obtain the T receptor treated with papain and with neuraminidase in the form of 'a single peak at around 65 kDa compared to 75 kDa for the native protein.
  • the total yield from 3.3 mg of affinity purified T receptor was 1.1 mg or about 34%.
  • the material eluted from the anti-V ⁇ 9 column. consisted essentially of ⁇ heterodimers, insofar as it was precipitated by monoclonal antibodies specific for V ⁇ 2. Furthermore, analysis by SDS-PAGE under reducing and non-reducing conditions showed that these heterodimers were linked by a covalent bond.
  • BALB / c mice were immunized with soluble ⁇ T receptors, in accordance with the following protocol: on day 1, 50 ⁇ g of protein in 500 ⁇ l of complete Freund's adjuvant 50% emulsified in 0.9% NaCl were injected subcutaneously in fours different points. On day 25, the same protocol was. repeated in incomplete Freund's adjuvant. A booster was given by 3 intraperitoneal injections on days 50, 51 and 52, using 15 ⁇ g of protein each in 250 ⁇ l of 0.9% NaCl. Splenocytes collected on day 53 were fused with myeloma X63 Ag 8653.
  • Resistant hypoxanthine / aminopterin / thymidine colonies were screened by a radioimmunoassay (RIA) using a soluble T receptor labeled with iodine, according to the IODOGEN method.
  • RIA radioimmunoassay
  • 96-well microtitration plates coated with avidin were incubated with biotinylated goat anti-mouse immunoglobulins (GAMIG, Immunotech) in PBS, BSA, NaN 3 overnight at 4 ° C. , then washed 3 times in Tween PBS.
  • 100 ⁇ l (10 5 cpm) of radiolabeled soluble T receptors were incubated for 2 hours at room temperature and washed 3 times in PBS-Tween. The bound radiolabelled soluble T receptors were assayed by ⁇ count.
  • the monoclonal antibodies having produced an RIA signal were then tested by immunofluorescence to determine their ability to recognize T receptors linked to the membranes of the G9 clone.
  • the fine specificity of these monoclonal antibodies was finally studied by screening for their reactivity with respect to clones and lines of T lymphocytes whose phenotype of the T receptor was known.
  • Three monoclonal antibodies (52, 106 and 510) were directed against a determinant which was common to all T ⁇ receptors but not to T ⁇ receptors.
  • Two monoclonal antibodies (292 and 360) were specific for T receptors comprising the V ⁇ 9 region and two monoclonal antibodies (1 and 389) for T receptors comprising the ⁇ 2 region. No specific specificity could be attributed to the remaining monoclonal antibodies (49, 60, 103 and 515) which recognized subpopulations of ⁇ lymphocytes but whose reactivity could not be correlated with the presence of a particular V region T receptor (Table I below).
  • T ⁇ clones Circulating cytometric analysis of T ⁇ clones using an anti-RTs monoclonal antibody.
  • the phenotype of the T lymphocyte clones was determined by labeling with antibodies Ti ⁇ a (anti-V ⁇ 9), TiV ⁇ 2) and A13 (anti-V ⁇ l); NR (not carried out).
  • soluble ⁇ receptors were prepared as described below, after modification of the multiple cloning site of the expression vector pKCR6.
  • Digestion of the vector pKCR6 thus modified by the enzymes Xho I and Xba I freed these two sites and allowed oriented cloning, the Xho I site being located between 5 'of the coding sequence and the Xba I site in 3'.
  • b) Generation of a complementary DNA coding for a soluble V ⁇ 8 chain bl) PCR cloning of a soluble V ⁇ 8 chain The RNA used for this cloning comes from a T ⁇ clone.
  • the oligonucleotide primer used for the synthesis of the first strand of complementary DNA is as follows:
  • amplification of this cDNA was carried out using the oligonucleotide described previously used as an antisense primer and a sense primer containing a site for the restriction enzyme Xho I upstream of the translation initiation codon.
  • the sequence of this oligonucleotide is as follows:
  • RNA used for this cloning comes from a T ⁇ clone.
  • the nucleotide primer used for the synthesis of the first strand of complementary DNA is as follows:
  • amplification of this cDNA was carried out using the oligonucleotide described previously used as an antisense primer and a sense primer containing a site for the restriction enzyme Xho I upstream of the initiation codon of the translation.
  • the sequence of this oligonucleotide is as follows:
  • the cDNA fragment encoding a soluble V ⁇ 3 chain was extracted from the pBS-SK vector after digestion by restriction enzymes Xho I and Xba I and integrated into the modified expression vector pKCR ⁇ described in a) digested with the same enzymes.
  • the vector thus obtained was co-transfected in association with the expression vector containing the cDNA coding for the soluble V ⁇ 9 chain.
  • the complementary DNA of a total V ⁇ l C ⁇ chain cloned in the vector pBS-SK was used between the restriction sites Sal I and Bam HI.
  • This DNA fragment was purified and integrated into the expression vector pKCR6 containing the soluble V ⁇ 3 chain after it had been digested with the restriction enzymes Xho I and Eco RI. This strategy therefore made it possible to replace the variable part V ⁇ 3 by the variable part V ⁇ l and thus to construct a cDNA coding for a soluble chain V ⁇ l.
  • the vector thus obtained was co-transfected in association with the expression vector containing the cDNA coding for the soluble V ⁇ 9 chain.
  • the purification described above to isolate the V ⁇ 9V ⁇ 2 receptor consisted of immunopurification with an anti V ⁇ 9 antibody (Y102 or 7B6).
  • a Affinity column of the same type but using the anti-body 510 described above and which recognizes a determinant of the constant delta chain was used.
  • the advantage of this new purification is the possibility of purifying any soluble receptor of the invention whatever the variable chains ⁇ , ⁇ , and even ⁇ , ⁇ which they contain.
  • This method was first tested to purify the soluble receptor containing V ⁇ 9 / V ⁇ 3. 5 mg of antibody 510 have been covalently linked to 1 g of a matrix of sepharose beads 4B activated with cyanogen bromide (PHARMACIA, Upsalla, Sweden) according to the supplier's instructions.
  • the culture supernatant of the ⁇ 9 ⁇ 3 transfectant was applied to the affinity column thus formed at a rate of 10 ml / hour at room temperature.
  • a PBS phosphate buffer saline solution (0.01 M phosphate, 0.14 M NaCl pH 7.2 same flow rate)
  • the bound material was eluted with a 0.05 M citrate solution at pH 3.0.
  • the eluted fractions were immediately neutralized with a 0.2 M Tris buffer pH 9 (100 ⁇ l for 1 ml of eluate).
  • the positive fractions for the soluble RT activity as attested by the IRMA test were pooled, and concentrated with l ⁇ g / ml of proteins on CENTRICON cell (30KD barrier) (AMICON, Beverly, MA, USA) according to the manufacturer's instructions. . This cell also made it possible to change the buffer for PBS.
  • the material eluted from the affinity column consists essentially of ⁇ heterodimers, covalently linked, probably present in the form of several glycosylation isomers.

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Abstract

L'invention a pour objet un procédé de production de récepteurs T solubles, caractérisé en ce que l'on réalise une co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour chacune des sous-unités constitutives du récepteur T délétées de la portiontransmembranaire du récepteur T, les produits ainsi obtenus, ainsi que leurs applications diagnostiques et thérapeutiques.

Description

PRODUCTION DE SOUS-UNITES DE RECEPTEURS T SOLUBLES PAR CO-TRANSFECTION, UTILISATIONS DES PRODUITS AINSI OBTENUS.
La présente invention se rapporte à des récepteurs T solubles et plus particulièrement à des formes sécrétées de récepteurs T solubles (RTs)
VαCα/VβCβ, VγCγ/VδCδ ou VαCδ/VβCγ et à leurs applications diagnostiques et thérapeutiques.
Les lymphocytes T sont capables de reconnaî¬ tre de façon hautement spécifique des myriades d'antigè¬ nes (Ag), ce au moyen de structures de surface extrême¬ ment diversifiées appartenant à la superfamille des immunoglobulines ( Ig) , les récepteurs T (RT).
Chez l'homme comme chez la souris, la plupart des lymphocytes T chez l'adulte expriment des RT consti¬ tués de 2 sous-unités glycoprotéiques variables dénommées α et β. Tout comme les chaînes lourdes et légères des Ig, ces sous-unités comportent un domaine variable (V) aminoterminal et un domaine constant (C) carboxyterminal et sont en outre très généralement associées entre elles de façon covalente, via un pont disulfure interchaine. La nature des antigènes reconnus par le récepteur T αβ est relativement bien établie : il s' agit de complexes formés par un antigène oligopeptidique ( issu de la dégradation intracellulaire de protéines endogènes ou exogènes) étroitement associé aux produits de gènes polymorphes situés dans le complexe majeur d'histocompa- tibilité (CMH) , dits de classe I ou II. L'interaction entre le récepteur T αβ et les complexes CMH/Ag est classiquement renforcée par des molécules dites corécep- trices ou accessoires (CD4 et CD8) , reconnaissant des portions conservées des molécules CMH de classe II et I respectivement.
Plus récemment a été décrit une autre sous- population de lymphocytes T qui se distingue par la nature des gènes ( 7 et δ > codant pour ces récepteurs T. A la différence des lymphocytes T αβ, la spécificité* antigénique des cellules T yδ reste encore peu claire. Se basant sur une relative homologie des séquences primaires des chaînes αβ et γδ du récepteur T, certains ont prédit une similarité structurale des ligands pour ces récepteurs. En accord avec cette hypothèse, une fraction des lymphocytes T γδ s'est avérée être dirigée contre des molécules structuralement proches ou identi¬ ques aux produits du CMH classiquement reconnus par les lymphocytes T αβ. Cependant, il existe également plu¬ sieurs exemples de reconnaissance par cette sous-popula¬ tion T de molécules de structure plus éloignée, telles les protéines de stress ou certaines molécules d'activa- tion comme le CD48. Les présents inventeurs ont cherché à générer des formes "soluoles" (sécrétées) de récepteur T γδ, qui pourraient être utilisées (à l'instar des Ig) en tant que sondes permettant l'isolement, la localisation et éventuellement la purification de ligands spécifiques. Par ailleurs, de tels récepteurs T solubles présentent également un certain nombre d'applications cliniques. Traunecker et coll. (1989. Immunol. Today 10:29) ont rapporté des tentatives de production de récepteurs T solubles ayant consisté à éliminer la portion transmembranaire (TM) des chaînes α ou des chaînes β par introduction d'un codon de terminaison de traduction en amont des séquences codant pour la région TM qui se sont révélées infructueuses, aucune sécrétion n'ayant pu être décelée. A la suite de ces échecs initiaux, d'autres stratégies ont alors été adoptées. Dans la plupart des cas, le principe consistait à construire des protéines chimériques comprenant les régions V, ou V et C des sous- unités α et β, accolées aux régions C 'immunoglobulines ou à des ancres de type glycosyl phosphatidylinositol (GPI). Dans le cas des protéines de fusion RT/Ig, le problème principal s'est avéré être la sécrétion parfois majoritaire de formes monomériques ou homodimériques. En outre, les formes hétérodimériques RTs αβ présentait parfois des différences structurales significatives avec les formes membranaires ; en particulier les 2 chaînes α et β étaient très généralement associées de façon non covalente. Ceci pouvait par conséquent avoir des réper¬ cussions sur la structure globale et la spécificité antigénique fine de telles molécules chimériques. Dans le cas des récepteurs T "lipiés" (ancrés à la membrane par une séquence GPI ) , une proportion parfois assez élevée d'hétérodimères αβ associés de façon covalente pouvait être obtenue. Cependant, 1'inconvénient principal de cette technique était la nécessité d'un traitement enzymatique (par phospholipase C), afin de libérer les récepteurs T dans le milieu, et donc une production coûteuse et de faible rendement. Plus récemment a été proposé un protocole de production de récepteurs T dits monochaîne, consistant à accoler un domaine Va à un domaine Vβ via un pont peptidique. Cependant, cette technique s'est révélée délicate d'utilisation. En particulier, elle supposait l'introduction d'un nombre important de mutations dans certaines zones hydrophobes des régions V normalement masquées sur la protéine native, pour rendre ces récepteurs T monochaîne hydroso- lubles.
Tous les exemples de production de formes solubles de récepteurs T décrits dans la littérature, dans tous les cas sous forme hybride, ont montré une extrême variabilité d'efficacité d'une combinaison de chaîne à l'autre.
Les présents inventeurs ont découvert que 1 'on pouvait obtenir des récepteurs T solubles de façon aisée et avec un rendement élevé quelle que soit la combinaison de chaînes mise en oeuvre, à l'aide d'un procédé consistant à produire des molécules d'ADN codant pour chacune des sous-unités constitutive du récepteur T délétées de la portion trans embranaire, et à co-trans- fecter ces ADN dans une cellule-hôte.
La présente invention à aussi pour objet un procédé de production de récepteurs T solubles, carac¬ térisé en ce que l'on réalise une co-transfection dans une cellule hôte des séquences d'ADN codant pour chacune des sous-unités constitutives du récepteur T délétées de la portion transmembranaire du récepteur T.
Selon l'invention, on produit des récepteurs T solubles VαCα / VβCβ par co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour les sous- unités α et β du récepteur Tαβ délétées de la portion transmembranaire du récepteur Tαβ.
On produit également des récepteurs T solubles VγCγ / VδCδ par co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour les sous- unités γ et δ du récepteur Tγδ délétées de la portion transmembranaire du récepteur Tγδ.
On produit en outre des récepteurs T solubles hétérodimériques VαCγ / VβCδ et VαCδ / VβCγ, dans les¬ quels les sous-unités constitutives sont associées par une liaison covalente, par co-transfection dans une cel¬ lule-hôte des séquences d'ADN codant pour les domaines Cγ et Cδ des sous-unités γ et δ du récepteur Tγδ délétées de leur portion transmembranaire, fusionnées respecti¬ vement avec les séquences d'ADN codant pour les domaines Va et Vβ des sous-unités a et β du récepteur Taβ pour obtenir des récepteurs VaCγ / VβCδ, ou fusionnés respectivement avec les séquences 'ADN codant pour les domaines Vβ et Va des sous-unités β et a du récepteur Taβ pour obtenir des récepteurs VaCδ / VβCγ. On produit également des récepteurs T solubles hybrides VγCγ / VαCδ par co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour la sous- unité γ du récepteur Tγδ délétée de sa portion transmem¬ branaire, avec les séquences d'ADN codant pour le domaine Cδ de la sous-unité δ fusionnées avec les séquences d'ADN codant pour le domaine Va de la sous-unité α du récepteur Tα6. Cette construction est particulièrement avantageuse et est basée sur le fait que certains gènes Va peuvent être utilisés soit par des clones αβ, soit par des clones γδ.
Avantageusement, on utilise pour les constructions des récepteurs T solubles de 1 'invention pour les parties variables les séquences d'ADN des gènes Vδ2 et Vγ9. II peut toutefois être intéressant de produire des récepteurs VγCγ / VδCδ en utilisant une séquence d'ADN Vγ9 d'une part, et en remplaçant la séquence d'ADN Vδ2 par d'autres séquences d'ADN Vδ pour les mêmes raisons que celles évoquées ci-dessus pour la construction du récepteur hybride VγCγ / VαCδ. Cette construction permet d'obtenir des anticorps anti-α, ou dirigés contre des Vδ distincts de Vδ2.
Réciproquement, il est également possible de conserver l'ADN Vδ2 et de remplacer la séquence d'ADN Vγ9 par d'autres séquences d'ADN Vγ, afin d'obtenir des anticorps anti-Vγ .
L' invention englobe également ces modes de réalisation de récepteurs T solubles VγCγ / VδCδ.
Il est à noter que plusieurs segments Vδ (notamment Vδl ) peuvent être considérés comme des Va, dans le sens où ils peuvent êtr indifféremment utilisés par des chaînes α ou δ du récepteur T. Ainsi, on peut considérer que les exemples de récepteurs produits sous forme soluble ici fournis démontrent notamment l'intérêt du procédé dans le cadre de la génération d'anticorps monoclonaux dirigés non seulement contre les régions, variables γ et δ, mais également α.
Avantageusement, la délétion de la portion transmembranaire des sous-unités constitutives du récepteur T est réalisée, par introduction d'un codon de terminaison de traduction en amont des séquences codant pour la portion transmembranaire de ces sous-unités, notamment par mutagénèse dirigée par P.C.R. (Polymerase Chain Reaction) . Les séquences d'ADN sont des séquences d'ADN génomique ou d'ADNc.
De préférence, la co-transfection est réalisée dans des cellules eucaryotes, notamment des cellules d'ovaires de hamster (CHO) . L'invention a également pour objet une protéine de fusion formée entre un récepteur T soluble et une séquence peptidique, la séquence peptidique étant constitutive d'un peptide ou d'une protéine, la protéine de fusion étant obtenue par fusion de la séquence d'ADN codant pour le peptide ou la protéine à l'une des chaînes ou aux deux chaînes d'ADN codant pour les sous-unités d'un récepteur T délétées de leur portion transmembra¬ naire, suivie d'une co-transfection des séquences d'ADN ainsi fusionnées dans une cellule-hôte. Avantageusement dans ce cas, la séquence peptidique est celle de 1'interleukine-2 (IL-2).
L'invention a également pour objet des anticorps polyclonaux ou monoclonaux humains ou animaux dirigés contre un récepteur T soluble obtenu par le procédé de l'invention ou une protéine de fusion RTs-IL2 telle que définie précédemment.
Les anticorps monoclonaux selon 1' invention peuvent être préparés selon une technique classique. A cet effet, les récepteurs T solubles, éventuellement fusionnés avec 1 ' interleukine-2 ou une autre protéine, peuvent être couplés si nécessaire à un agent immunogène, . tel que 1 'anatoxine tétanique, par un agent de couplage tel une benzidine bis diazotée.
La présente invention englobe également les fragments et les dérivés d'anticorps monoclonaux selon l'invention. Ces fragments sont notamment les fragments F(ab' )2 qui peuvent être obtenus par clivage enzymatique des molécules d'anticorps avec la pepsine, les fragments Fab' qui peuvent être obtenus par réduction des ponts disulfure des fragments F(ab' )2 et les fragments Fab qui peuvent être obtenus par clivage enzymatique des molécu¬ les d'anticorps avec la papaïne en présence d'un agent réducteur. Ces fragments, ainsi que des fragments Fc, peuvent être également obtenus par génie génétique. Les dérivés d'anticorps monoclonaux sont par exemple des anticorps ou des fragments de ces anticorps auxquels sont liés des marqueurs tels qu'un radioisotope. Les dérivés d'anticorps monoclonaux sont également des anticorps ou des fragments de ces anticorps auxquels sont liées des molécules thérapeutiquement actives.
L'invention a également pour objet des hybridomes produisant des anticorps monoclonaux spécifi¬ ques de la séquence peptidique décrite ci-dessus. Ces hybridomes peuvent être obtenus par les techniques classiques de fusion cellulaire entre des cellules spléniques activées in vitro par 1'antigène ou provenant d'un animal immunisé contre la séquence peptidique de l'invention, et des cellules d'une lignée myélomateuse.
L'invention a également pour objet une composition de diagnostic comprenant un récepteur T soluble obtenu par un procédé selon 1 'invention ou une protéine de fusion RTs-séquence peptidique, notamment RTs-IL2 telle que définie précédemment, ou encore un anticorps monoclonal selon l'invention. La composition de diagnostic selon 1 ' inven- tion peut être utilisée pour le typage de spécificités cellulaires liées au récepteur T. A cet effet, on peut utiliser un récepteur T soluble en tant que tel. Cepen¬ dant, en raison de l'affinité probablement faible de celui-ci pour son ligand spécifique, il est avantageux de coupler les récepteurs T solubles à un support, afin d'augmenter leur avidité par augmentation de leur valence.
Le support peut consister en tout support traditionnellement utilisé, tel des billes organiques ou magnétiques.
De tels supports sont par exemple des plaques en matière plastique utilisées pour les tests ELISA sur lesquels on fixe le récepteur T soluble de la même manière que les immunoglobulines, des billes magnétiques tosyl-activées, par exemple celles commercialisées par Dynal, Oslo, Norvège, ou encore des gels activés de type AFFIGEL tels ceux commercialisés par BIORAD.
Les techniques de couplage sont celles classiquement utilisées et indiquées par le distributeur pour les supports disponibles dans le commerce.
Ces méthodes peuvent consister en un couplage chimique ou au moyen d'anticorps monoclonaux dirigés contre les récepteurs T solubles en question, ces derniers étant eux-mêmes couplés au support par couplage chimique.
Avantageusement, les compositions de diagnos¬ tic comprennent une protéine fusionnée telle que décrite précédemment, constituée d'un récepteur T soluble et d'un déterminant antigénique contre lequel on dispose d'anti¬ corps spécifiques.
De telles compositions de diagnostic peuvent être utilisées pour le typage de spécificités cellulaires non détectées par les techniques sérologiques classiques. La composition de diagnostic selon 1' inven- tion peut également comprendre des anticorps monoclonaux tels que définis précédemment, et de préférence un panel d'anticorps monoclonaux dirigés contre les portions V et C des chaînes des récepteurs T obtenus par immunisation d'animaux contre les récepteurs T solubles obtenus selon l'invention, préalablement purifiés.
Afin d'améliorer l'efficacité des immunisa¬ tions, il est également possible d'injecter des protéines de fusion RTs-IL2 telles que définies précédemment. Une telle composition de diagnostic peut être utilisée notamment pour la mise en évidence de proliféra¬ tions mono ou oligoclonales, comme celles rencontrées dans les leucémies T par exemple.
Selon l'invention, on met en présence la composition diagnostique avec un prélèvement biologique, par exemple un échantillon de sang contenant des lympho¬ cytes T pathologiques, et on met en évidence le complexe formé avec le ligand spécifique du récepteur T et le récepteur T soluble ou la protéine de fusion comprenant le récepteur T soluble et un déterminant antigénique ou le complexe formé par les anticorps monoclonaux selon 1 'invention et le récepteur T soluble ou la protéine de fusion récepteur T soluble-IL2 contre lesquels ils sont spécifiquement dirigés. Ces procédés peuvent être basés sur une méthode radio-immunologique de type RIA, RIPA ou IRMA, ou une méthode immunoenzymatique de type WESTERN-BLOT sur bandelettes ou de type ELISA.
Pour la mise en oeuvre de ces procédés de détection, on utilise des molécules froides non marquées ou marquées à 1 'aide d'un marqueur adéquat qui peut être la biotine ou ses dérivés, une enzyme comme la peroxyda- se, un marqueur fluorescent comme la fluoresceine, un marqueur radioactif, etc... Ces procédés de diagnostic in vitro compren- nent par exemple les étapes suivantes : dépôt d'une quantité déterminée d'une composition contenant un récepteur T soluble, un récep¬ teur soluble fusionné avec un déterminant antigénique ou un anticorps monoclonal selon 1 'invention dirigé contre le récepteur T soluble ou la protéine de fusion récepteur T soluble-Interleukine 2 selon l'invention, dans les puits d'une plaque de microtitation ou sur un autre support tel que des billes ou une membrane de nitrocellu- lose, dépôt dans les puits du prélèvement biologique à tester, ou incubation de celui-ci avec les billes ou la membrane, en présence d'agents saturants ou après saturation préalable des supports activés, - après incubation et rinçage des micropla¬ ques ou des bilies, dépôt dans les puits ou incubation avec les billes d'un système de révélation du complexe récepteur T soluble-ligand éventuellement formé.
Les kits pour la mise en oeuvre du procédé de diagnostic de 1 'invention comprennent :
- au moins une composition de diagnostic selon l'invention,
- des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réalisation d'un complexe entre le ou les ligands éventuellement présents dans un échantil¬ lon biologique,
- un ou plusieurs réactifs éventuellement marqués aptes à réagir avec le complexe formé.
L'invention a également pour objet une composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend un récepteur T soluble obtenu selon le procédé de 1 ' invention ou une protéine de fusion telle que définie ci-dessus, notamment une RTs-IL2 selon l'inven¬ tion. Une telle composition thérapeutique est utile notamment dans le traitement des processus pathologiques- dans lesquels on observe une prolifération pauciclonale de lymphocytes T, tels les leucémies ou lymphômes T et certaines maladies autoimmunes. Elle est administrée de préférence par voie injectable dans un véhicule approprié.
L'administration de cette composition thérapeutique a un double but. Elle permet d'une part l'induction d'une réponse immunitaire anti-idiotypique, conduisant alors à l'élimination active et sélective des cellules porteuses de ces idiotypes, et d'autre part le blocage par compétition de la reconnaissance d'antigènes autologues dans le cas de proliférations autoimmunes.
Avantageusement, la composition thérapeutique selon l'invention comprend un récepteur T soluble hétérodimérique tel que défini précédemment, porté éventuellement par une protéine de fusion.
La composition thérapeutique selon 1 'inven¬ tion peut également comprendre un anticorps monoclonal selon l'invention, éventuellement couplé à une molécule thérapeutiquement active, par exemple une molécule cytotoxique, ou un fragment ou dérivé d'anticorps monoclonal tels que définis précédemment.
Une telle composition permet l'élimination directe de cellules mono- ou oligoclonales rencontrées dans certains types de leucémies T.
On décrira ci-après en détail l'obtention de récepteurs T solubles dans le cas de RTγδ en se référant aux Figures annexées sur lesquelles : - la Figure 1 représente des produits d'assemblage des gènes γ et δ. Les séquences des amorces 5 ' et 3 ' utilisées pour amplifier les ADNc permettant l'obtention des récepteurs Tγδ solubles (ADNc γs et δs) sont représentées au-dessus et en-dessous des ADNc γ et δ respectivement. Les positions des codons de terminaison sont représentées en caractères gras. Les parties en gris • en 3' des ADNc γ et δ correspondent aux régions transmem- branaires (TM) hydrophobes.
La Figure 2 représente les séquences nucléotidiques et peptidiques correspondantes des chaînes δ et γ solubles du clone utilisé pour la construction du récepteur T soluble décrite ci-dessus.
- la Figure 3 représente les résultats des essais de détection de RTsγδ par la technique IRMA en milieu conditionné à partir des cellules CHO transfectées par γs/δs.
SN représente le surnageant de culture des cellules CHO, transfectées avec un ADNc non pertinent (C) ou avec les ADNc des sous-unités γ et δ solubles selon l'invention (sγδ).
Les anticorps monoclonaux donnant un signal radioimmunologique significatifs sont représentés en rectangles gras.
- la Figure 4 représente la titration en activité de RT soluble exprimée en μg/ml, comme attesté par le test IRMA (sand ich 7B6/TiVδ2), des fractions éluées d'une colonne d'affinité couplée avec l'anticorps anti-Vγ 7B6 (commercialisé par Immunotech), sur laquelle ont été appliquées environ 500 ml de surnageant de culture de cellules γδsF5-CH0.
- la Figure 5 représente 1 'analyse par SDS- PAGE de fractions positives pour 1 'activité de RT soluble, comme attesté par le test IRMA (sandwich 7B6/TiVδ2), des fractions éluées d'une colonne d'affinité couplée avec l'anticorps anti-Vγ9B6.
Deux préparations indépendantes (# 1 et # 2) ont été analysées en conditions non réductrices (à gauche) et réductrices (à droite) . MW : marqueurs de poids moléculaire. EXEMPLE 1
1. Construction et expression des gènes γôs des RTs
Le clone de lymphocytes humains γδs G 115 (dont les séquences nucléotidiques et peptidiques correspondant aux chaînes δ et γ solubles sont repré¬ sentées à la Fig. 2, respectivement en A et B) exprimant des récepteurs T V9JPClγ/V2D3JlCδ a été utilisé pour la construction des gènes γδs et l'expression de récepteurs T solubles.
Ce clone a été utilisé pour plusieurs raisons dont les principales sont :
- la grande majorité des récepteurs T γδ des leucocytes humains du sang périphérique comprennent des régions V(D)J similaires de sorte que les résultats structuraux et fonctionnels obtenus avec la forme soluble du RT particulier utilisé peuvent être appliqués facile¬ ment au RT exprimés par une large proportion de cellules γδ, - des anticorps monoclonaux spécifiques des régions Cγ, Cδ, Vγ9 et Vδ2 sont facilement disponibles et peuvent être utilisés pour suivre la production et la purification des molécules RT solubles,
- à la différence de la plupart des lymphocy- tes T humains γδ Vδl- positifs, les chaînes γ et δ des récepteurs T du clone G 115 sont liées de manière covalente par un pont disulfure qui stabilise fortement la molécule après sa sécrétion dans le milieu,
- la spécificité antigénique du clone G 115 est assez bien connue. En particulier, ce clone tue les cellules d'un lymphome de Burkitt (dénommé Dadi) et reconnaît également un antigène présent dans des extraits hydrosolubles de Mycobacterium tuberculosis.
Le clone G 115, issu de lymphocytes Tγδ déri- vant de leucocytes de sang humain périphérique a été maintenu dans un milieu RPMI 1640 contenant 8% de sérum- humain, 2 mM de L-glutamine et 150 unités BRMP (Biolo- gical Response Modifier Program) d'IL2 et stimulé une semaine sur deux avec 0,5 μg/ml de leucoagglutinine (Pharmacia, France), des leucocytes de sang périphérique irradiés et des lymphoblastes B irradiés et transformés par l'EBV.
Après deux lavages dans une solution saline de tampon phosphate, 5.106 cellules ont été lysées sur de la glace dans un tampon Tris-HCl (80 mM, pH 7,5) conte¬ nant 100 mM de NaCl, 5 mM d'EDTA et 0,5% en poids de Triton X100. Après centrifugation, le surnageant a été récolté et mélangé avec un volume égal de phénol à 65°C. L'ARN a été extrait par un traitement au phénol/CHC13, précipité dans 2,5 volumes d'éthanol et solubilisé dans 40μl de Tris 10 mM/EDTA 1 mM). 5 μl d'ARN total ont été transcrits de manière inverse pendant 1 heure à 37°C à 1'aide d'une amorce 3' phosphatée contenant des codons de terminaison de traduction en amont de la région transmembranaire hydrophobe des gènes γ et δ, après les codons de la Lys247 et de Gin274, comme représenté à la Fig. 1, à une concentration de 50 pM, des quatre dNTP à une concentration 1 mM chacun et 200 unités de transcrip- tase réverse du virus de la tumeur mammaire de souris (MMTV) (Boehringer Mannheim, Allemagne), dans un volume final de 25 μl. 75 μl d'un mélange pour PCR (comprenant Tris-HCl 13 mM (pH 8,2), KC1 66 mM, MgCl2 2 M, 2 U de Taq polymérase (Boehringer) et 50 pM d'amorce 5 ' phospha¬ tée représentée à la Figure 1 ont été ajoutés au matériau obtenu par transcription réverse et 30 cycles d'amplifi¬ cation (94°C - 1 min, 45°C - 1 min, 72°C - 1 min) ont été effectués. L'ADN amplifié a été purifié après électropho- rèse sur gel d'agarose à bas point de fusion et clone dans un plasmide Bluescript SK+ (Stratagène, La Jolla, Californie) digéré par Sma I. Le sequençage a été réalisé en utilisant un système de matrice à double brin selon le protocole fourni par le fournisseur du kit USB Seque- nase. Les fragments ont été clones dans un vecteur d'expression pKCR6 (Matrisian et al. , Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 83 : 9413) digéré par EcoRI.
L'ADN plasmidique a alors été introduit dans des cellules d'ovaire de hamster DUKX-B11 DHFR (dihydro- folate réductase)-négatives, cultivées sur un milieu RPMI 1640, additionné de sérum de veau foetal à 8%, de 2 mM de L-glutamine, de thymidine, d'adénosine et de déoxyadé- nosine à 10 μg/ml chacun, par la technique de précipita¬ tion au phosphate de calcium (Wigler et al., 1979 Cell. 16 : 777). Les cellules DHFR- positives ont été sélec¬ tionnées par culture des cellules transfectées pendant trois semaines en milieu RPMI, additionné de sérum foetal de veau et de L-glutamine (2 mM) sans nucléosides. Les transfectants stables ont alors été clones par la technique de dilution limitante.
2. Détection, purification et caractérisation des récepteurs Tyô solubles a) Détection des récepteurs T solubles Les anticorps monoclonaux utilisés pour la détection des RT solubles ont été marqués à 1'125I par la méthode à 1 ' Iodogène (Fraker et al., 1978 Biochem.- Biophys.Res.Commun. 80 : 849). Les récepteurs T ont été détectés par un essai immunoradiométrique (IRMA) en sandwich à 1 'aide de paires d'anticorps monoclonaux spécifiques des chaînes γ et δ.
Des plaques de microtitration Immulon-1 (Dynatech, Marnes, France) ont été revêtues pendant 90 min. à 37°C avec 50 μl d'anticorps monoclonal Y102 (ou 7B6) à 40 μg/ml dans une solution saline de tampon phos¬ phate. Après élimination de l'anticorps, les sites non liés ont été saturés avec une solution saline de tampon phosphate contenant 0,5% de sérum albumine bovine pendant 1 heure à température ambiante. Les échantillons à analyser ont alors été ajoutés à raison de 40 μl en même temps que 10 μl d'anticorps monoclonal TiVδ2 marqué. Après 90 min. d'incubation à 37°C, les puits ont été rincés à quatre reprises avec 100 μl d'une solution saline de tampon phosphate additionné de sérum albumine bovine.
La radioactivité liée a été mesurée dans un compteur γ à scintillation. L'ensemble d'anticorps suivant a été utilisé pour mesurer la sécrétion de RTγδ soluble par la technique IRMA : anticorps anti-Vγ9 (Y102, B37, 7B6), anti-Cγ (B121) et anti-Vδ2 (TiVδ2) (Miossec et al., 1989, J.Exp.Med. 171 : 1171). Un anticorps monoclonal spécifique de l'IL2 a également été utilisé à titre de témoin négatif.
Avec les différentes combinaisons d'anti¬ corps, on n'a observé aucun signal avec les surnageants de cellules d'ovaires de hamster (CHO) non transfectées, de cellules transfectées avec un ADNc non pertinent ou des cellules transfectées avec soit un ADNc tronqué γs ou un ADNc tronqué δs (Fig. 3). Mais les hétérodimères γδ solubles ont été détectés de façon nette par IRMA (essai radioimmunologique) dans les surnageants de cellules CHO cotransfectées avec des produits d'assem- blage γ solubles et δ solubles (γδsF5-CH0) lorsqu'on utilisait des paires d'anticorps spécifiques de Vδ2/Cγ ou Vδ2/Vγ9 (Fig. 3), ce qui suggère que les molécules de RT solubles sécrétées par les cellules γδF5-CH0 étaient en majorité des hétérodimères.
b) Purification des récepteurs T solubles 10 mg d'anticorps monoclonal Y102 ou 7B6 (an- ti-Vγ9) ont été liés de manière covalente à une matrice de billes d'agarose activé (Affigel, Biorad, Richmond, CA. ) selon les indications de fournisseur. Les surnageants de culture ont été appliqués sur une colonne d'affinité à raison de 30 ml/h à 4°C. Après lavage avec une solution saline de tampon phospha¬ te, le matériau lié a été élue avec un tampon glycine 0,2 M (pH 2,5). Les fractions éluées ont été neutralisées en une seule fois par Na2HP04 1M.
Les fractions positives pour 1 'activité de RT soluble comme attesté par le test IRMA ont été rassem¬ blées, dialysées pendant une nuit contre de l'eau distillée et concentrées par évaporation.
Des échantillons de RT solubles ont été préparés dans un tampon pour électrophorèse en gel avec ou sans agent réducteur, séparés par SDS-PAGE, et transferrés sur une membrane de nitrocellulose conformé- ment aux recommandations du fournisseur. Après saturation des sites non liés avec un tampon de blocage (lait écrémé déshydraté et Tween 20), les empreintes obtenues ont été incubées en présence d'anticorps primaire (surnageant d'hybridome dilué au tiers avec le tampon de blocage) pendant 2 heures à température ambiante. Après lavage, un conjugué anti-Ig-peroxydase de raifort a été ajouté, et l'incubation poursuivie pendant 2 autres heures. Les anticorps liés ont été révélés par la diaminobenzidine (1 mg/ml), de H202 et du CoCl2. Dans une préparation type, 3,3 mg (calculés en utilisant un coefficient pour 1% d'extinction de 1,5, comme calculé pour les immunoglobulines) de RT γδ purifiés par affinité ont été traités avec la neuramini- dase de Vibrio cholerae (Boehringer Mannheim) dans 1 ml de tampon contenant 50 mM d'acétate de sodium, 150 mM NaCl et 4 mM CaCl2 à pH 5,5 pendant 1 heure à 37°C.
Dans ces conditions, la réaction a été estimée complète par détermination d'essais de contrôle d'échantillons digérés par focalisation isoélectrique en milieu PhastGel IEF 3-9 (Pharmacia). Après une dilution par un tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,3, l'échantillon a été concentré au moyen d'une colonne centripep à 30 000 tours (Amicon) avant protélyse. Les récepteurs γδ traités à la neuraminidase ont été digérés à 37°C pendant 30 minutes avec de la papaïne ( orthington) à un rapport enzyme/substrat de 1/500 en présence de 1,5 M 2-mercaptoéthanol et 1,25 mM EDTA. La réaction a été complétée par addition de N- éthylmaléimide.
Ces conditions étaient suffisantes pour éliminer complètement le pont dissulfure intercaténaire, comme attesté par analyse en SDS-PAGE en conditions non réductrices. Des rapports enzyme/substrat plus élevés et/ou des durées d'incubation plus longues n'ont apporté aucune preuve d'un clivage protéique supplémentaire. Le milieu réactionnel a alors été appliqué sur une colonne de chromatographie d'exclusion de taille Zorbax CF-250 (DuPont - New England Nuclear) qui a permis d'obtenir après élution le récepteur T traité à la papaïne et à la neuraminidase sous forme d'un pic simple à environ 65 kDa par comparaison avec 75 kDa pour la protéine native.
Aucun signe de dissociation de chaîne n'était apparent.
Après concentration sur centripep, le matériau décrit ci-dessus a été incubé pendant une nuit à 37°C en présence d'endoglycosidase F et N-glycosidase F (Boehringer Mannheim) en conditions non-dénaturantes (0,1 M tampon phosphate de sodium, pH 7,3), comme préconisé par le fabricant. Une purification finale a été effectuée au moyen d'une colonne de chromatographie d'échange d'anions à haute performance, Mono Q (Pharma¬ cia) .
Le rendement total à partir de 3,3 mg de récepteur T purifié par affinité était de 1,1 mg ou environ 34%. Le matériau élue de la colonne anti-Vγ9. consistait essentiellement en hétérodimères γδ, dans la mesure où il était précipité par des anticorps monoclo¬ naux spécifiques de Vδ2. En outre, une analyse par SDS- PAGE en conditions réductrices et non réductrices a montré que ces hétérodimères étaient liés par une liaison covalente.
En effet, en conditions non réductrices, une bande principale diffuse ayant un poids moléculaire apparent de 75-80 kD était observé, qui se résolvait en conditions réductrices en deux composants majoritaires de 42 et 44 kD et deux composants minoritaires de 50 et 39 kD. Des motifs identiques ont été obtenus avec du matériel précipité par étapes avec des anticorps mono- clonaux anti-Vγ9 et anti-Vδ2. Au moyen d'anticorps monoclonaux générés contre ce récepteur soluble (anti¬ corps monoclonaux 360 et 389, cf. ci-après), il a pu être montré par la technique de Western-Blot que les bandes de 50 kD et 44 kD correspondaient à la chaîne γ, et que la bande de 42 et 39 kD correspondait à la chaîne δ. Les différences de tailles des espèces γ et δ solubles étaient dues aux différents degrés de N-glycosylation, comme cela a été précisé par la suite.
3. Obtention et propriétés des anticorps monoclonaux dirigés contre les récepteurs T solubles de 1'invention a) Génération d'anticorps monoclonaux dirigés contre des formes solubles de RT γδ après immunisation de souris contre des RT solubles γδ :
Des souris BALB/c ont été immunisées avec des récepteurs T solubles γδ, conformément au protocole suivant : au jour 1, 50 μg de protéine dans 500 μl d'adjuvant de Freund complet émulsifie à 50% dans NaCl à 0,9% ont été injectés par voie sous-cutanée en quatre points différents. Au jour 25, le même protocole a été. répété dans de l'adjuvant de Freund incomplet. Un rappel a été effectué par 3 injections intrapéritonéales aux jours 50, 51 et 52, à l'aide de 15 μg de protéine chacun dans 250 μl de NaCl à 0,9%. Des splénocytes récoltés au jour 53 ont été fusionnés avec le myélome X63 Ag 8653. Des colonnies hypoxanthine/aminoptérine/thymidine résis¬ tantes ont été criblées par un essai radio-immunologique (RIA) à l'aide d'un récepteur T soluble marqué à l'iode, conformément à la méthode à l'IODOGEN.
A cet effet, des plaques de microtitration à 96 puits revêtus d'avidine (Immunotech) ont été incubées avec des immunoglobulines de chèvre-anti-souris biotinylées (GAMIG, Immunotech) dans PBS, BSA, NaN3 pendant une nuit à 4°C, puis lavées à 3 reprises dans du Tween PBS.100 μl (105 cpm) de récepteurs T solubles radiomarqués ont été incubés pendant 2 heures à tempéra¬ ture ambiante et lavés à 3 reprises dans du PBS-Tween. Les récepteurs T solubles radiomarqués liés ont été dosés par comptage γ.
Neuf anticorps monoclonaux reconnaissant tout ou partie des lymphocytes T γδ humains ont été obtenus à partir d'une rate de souris immunisée, 2 anticorps anti-Vγ9 (292 et 360), 2 anticorps anti-Vδ2 (1 et 389), 1 anticorps pan γδ (510) et 4 anticorps dirigés contre des sous-populations γδ (49, 60, 103 et 515).
b) Réactivité des anticorps monoclonaux anti- RT solubles vis-à-vis de lignées lymphoïdes humaines mono et polyclonales :
Les anticorps monoclonaux ayant produit un signal RIA ont été ensuite testés par immunofluorescence pour déterminer leur aptitude à reconnaître des récep¬ teurs T liés aux membranes du clone G9. La spécificité fine de ces anticorps monoclonaux a finalement été étudiée par criblage de leur réactivité vis-à-vis de clones et de lignées de lymphocytes T dont le phénotype du récepteur T était connu.
A partir d'une seule expérience de fusion, les surnageants de 16 colonnies (3% des puits ensemencés) ont donné un signal RIA positif et parmi eux, onze contenaient des anticorps monoclonaux reconnaissant le clone G9 dans un essai d'immunofluorescence indirect. La spécificité de 7 anticorps monoclonaux a été mesurée par analyse de flux cytométrique.
Trois anticorps monoclonaux (52, 106 et 510) étaient dirigés contre un déterminant qui était commun à tous les récepteurs Tγδ mais non aux récepteurs Tαβ. Deux anticorps monoclonaux (292 et 360) étaient spéci- fiques de récepteurs T comprenant la région Vγ9 et deux anticorps monoclonaux ( 1 et 389 ) de récepteurs T com¬ prenant la région γδ2. Aucune spécificité précise n'a pu être attribuée aux anticorps monoclonaux restants (49, 60, 103 et 515) qui reconnaissaient des sous-populations de lymphocytes γδ mais dont la réactivité n'a pu être corrélée à la présence d'une région V particulière de récepteur T (Tableau I ci-dessous).
Il est à noter que tous les anticorps monoclonaux étaient capables de reconnaître des ré- cepteurs T solubles non réduits dans des analyses de Western-Blott, et plusieurs réagissaient également avec des espèces γ ou δ isolées après réduction (Tableau II), à la différence de la plupart des anticorps monoclonaux V spécifiques générés contre des récepteurs T natifs (liés aux membranes) . En accord avec des attributions de spécificité déduites d'expériences de flux cytométriques, les anticorps monoclonaux 389 et 360 reconnaissaient différentes espèces (de masse moléculaire 39-42 kDa et 44-50 kDa, respectivement), qui pouvaient correspondre aux chaînes δet γ respectivement. En outre, dans la mesure où les anticorps monoclonaux pan γδ52 et 510, et l'anticorps 389 spécifique de Vδ2 réagissant avec les mêmes espèces de 39-42 kDa, cela indiquant que les anticorps monoclonaux 52 et 510 étaient dirigés contre la région Cδ (Tableau I ) .
TABLEAU I
Analyse cytométrique en circulation de clones de Tγδ au moyen d'un anticorps monoclonal anti-RTs. Le phénotype des clones de lymphocytes T a été déterminé par marquage avec des anticorps Tiγa(anti-Vγ9) , TiVδ2) et A13 (anti-Vδl) ; NR (non réalisé).
Figure imgf000025_0001
TABLEAU II
Résultats des analyses en Western-Blot de récepteurs T solubles à l ' aide d 'anticorps anti-RTs.
La masse moléculaire apparente (en kDa) des espèces reconnues par chaque anticorps est rapportée.
( * NR = pas de réactivité ; R = réactivité)
Figure imgf000026_0001
EXEMPLE 2
1. Construction d'autres récepteurs T solubles γδ
D'autres récepteurs solubles γδ ont été préparés comme décrits ci-après, après modification du site multiple de clonage du vecteur d'expression pKCR6.
a) Modification du site multiple de clonage du vecteur d'expression pKCR6 Afin de faciliter et de permettre l'intégra¬ tion orientée des ADN complémentaires codant pour les chaînes gamma et delta solubles dans le vecteur d'expres¬ sion en système eucaryote pKCR6, un fragment d'ADN préalablement clone entre les sites Xba I et Sal I du vecteur pKCSRα a été introduit entre les sites Kpn I de ce vecteur.
La digestion du vecteur pKCR6 ainsi modifié par les enzymes Xho I et Xba I a libéré ces deux sites et permis un clonage orienté, le site Xho I se situant entre 5 ' de la séquence codante et le site Xba I en 3' . b) Génération d'un ADN complémentaire codant pour une chaîne Vγ8 soluble bl ) Clonage par PCR d'une chaîne Vγ8 soluble L'ARN utilisé pour ce clonage est issu d'un clone Tγδ.
L'amorce oligonucléotidique utilisée pour la synthèse du premier brin d'ADN complémentaire est la suivante :
5' GGG TTA CTG CAG CAG TAG TGT ATC 3'
L'amplification de cet ADNc a été effectuée à l'aide de 1 'oligonucleotide décrit précédemment utilisé comme amorce anti sens et d'une amorce sens contenant un site pour l'enzyme de restriction Xho I en amont du codon d'initiation de la traduction. La séquence de cet oligonucleotide est la suivante :
5' CCC TCG AGA TGC TGT TGG CTC TAG CTC 3'
Le fragment d'ADN obtenu à l'issue de cette amplification a été clone dans le vecteur pBS-SK ouvert par l'enzyme de restriction Sma I puis séquence. La séquence obtenue est conforme à celle décrite dans la littérature (Cell. (1986) 45:237-246) à l'exception de la séquence jonctionnelle impliquant le segment Jγl :
Vγ8 N Jγl
TGT GCC ACC TC-G GAC AGT CAT TAT TAT AAG AAA CTC TTT
b2) Intégration dans le vecteur d'expression et transfection dans les cellules eucaryotes Le fragment d'ADNc codant pour une chaîne Vγ8 soluble a été extrait du vecteur pBS-SK après digestion par les enzymes de restriction Xho I et Xba I et intégré dans le vecteur d'expression pKCRô modifié décrit en a) digéré par les mêmes enzymes. Le vecteur ainsi obtenu a été co-transfecté en association avec le vecteur d'expression contenant l'ADNc codant pour la chaîne Vδ2 soluble.
La procédure de transfection, de criblage des clones producteur et de purification des TCR solubles produits est analogue à celle décrite ci-dessus pour la production de TCR Vγ9 Vδ2 soluble.
c) Génération d'un ADN complémentaire codant pour un chaîne Vδ3 soluble cl) Clonage par PCR d'une chaîne Vδ3 soluble L'ARN utilisé pour ce clonage est issu d'un clone Tγδ.
L'amorce nucléotidique utilisée pour la synthèse du premier brin d'ADN complémentaire est la suivante :
5' GGG TTA CTT CTC GGT ATG AAC TAT GGC 3'
L'amplification de cet ADNc a été effectuée à l'aide de l'oligonucleotide décrit précédemment utilisé comme amorce anti sens et d'une amorce sens contenant un site pour 1 'enzyme de restriction Xho I en amont du codon d'initiation de la traduction. La séquence de cet oligonucleotide est la suivante :
5' GAC TCG AGA AAA GAT GAT TCT TAC TGT GGG 3
Le fragment d'ADN obtenu à 1'issue de cette amplification a été clone dans le vecteur pBS-SK ouvert par l'enzyme de restriction Sma I puis séquence. La séquence obtenue est conforme à celle décrite dans la littérature (J. Exp. Med. (1989) 169:393-405) à l'excep¬ tion de la séquence jonctionnelle impliquant les segments Dδ2, Dδ3 et Jδl :
N Dδ3 CGG CTC T TG GGG G AC ACC
Figure imgf000029_0001
c2) Intégration dans le vecteur d'expression et transfection dans les cellules eucaryotes
Le fragment d'ADNc codant pour une chaîne Vδ3 soluble a été extrait du vecteur pBS-SK après digestion par les enzymes de restriction Xho I et Xba I et intégré dans le vecteur d'expression pKCRδ modifié décrit en a) digéré par les mêmes enzymes.
Le vecteur ainsi obtenu a été co-transfecté en association avec le vecteur d'expression contenant l'ADNc codant pour la chaîne Vγ9 soluble.
La procédure de transfection, de criblage des clones producteurs et de purification des TCR solubles produits est analogue à celle décrite ci-dessus pour la production de TCR Vγ9 Vγ2 soluble.
d) Génération d'un ADN complémentaire codant pour un chaîne Vδl soluble
On a utilisé l'ADN complémentaire d'une chaîne Vδl Cδ total clone dans le vecteur pBS-SK entre les sites de restriction Sal I et Bam HI.
Ce fragment a été séquence dans sa totalité et ne présente pas de variation par rapport à la séquence décrite dans la littérature (Eur. J. Immunol. (1989) 19:1545-1549) à l'exception de la séquence jonctionnelle impliquant les segments Dδ2 et Jδl :
Vδl Dδ2 N TGT GCT CTT GGG GAC TTC CTA AAG GGT TCA GGT ACC ACC TAT
Jδl CCA TGG GAA CTC ATC TTT
e) Intégration dans le vecteur d'expression et transfection dans les cellules eucaryotes
La digestion par les enzymes de restriction
Xho I et Eco RI du vecteur pBS-SK contenant l'ADNc Vδl
Cδ libère un fragment d'ADN codant pour la totalité de la partie variable Vδl Dδ2 Jδl et la portion du premier exon de la partie constante Cδ comprise entre la région jonctionelle et le site unique Eco RI.
Ce fragment d'ADN a été purifié et intégré dans le vecteur d'expression pKCR6 contenant la chaîne Vδ3 soluble après qu'il ait été digéré par les enzymes de restriction Xho I et Eco RI. Cette stratégie a donc permis de remplacer la partie variable Vδ3 par la partie variable Vδl et ainsi de construire un ADNc codant pour une chaîne Vδl soluble. Le vecteur ainsi obtenu a été co-transfecté en association avec le vecteur d'expression contenant l'ADNc codant pour la chaîne Vγ9 soluble.
La procédure de transfection, de criblage des clones producteurs et de purification des TCR solubles produits est analogue à celle décrite pour la production de TCR Vγ9 Vδ2 soluble.
2. Détection et purification d'autres récepteurs Tyδ solubles a) Détection des différents récepteurs solubles, contrôle de spécificité
De la même manière que décrit précédemment, 2 IRMA ont été mis au point avec l'anticorps 510 comme anticorps de phase et avec les anticorps 360 et 389 comme traceurs. Ces 2 IRMA ont été testés sur les surnageants de CHO transfectés avec les gènes Vγ9/Vδ2, Vγ9/Vδ3, Vγ8/Vδ2. Seuls les traceurs correspondants au V trans- fecté donnent un signal, fournissant ainsi un bon contrôle de spécificité.
b) Mise au point d'une méthode générale de purification
La purification précédemment décrite pour isoler le récepteur Vγ9Vδ2 consistait en une immunopuri- fication avec un anticorps anti Vγ9 (Y102 ou 7B6 ) . Une colonne d'affinité de même type mais utilisant l'anti¬ corps 510 décrit ci-dessus et qui reconnaît un détermi¬ nant de la chaîne constante delta a été utilisée. L'avantage de cette nouvelle purification est la possibi- lité de purifier n'importe quel récepteur soluble de l'invention quelles que soient les chaînes variables γ, δ, et même α, β qu'elles contiennent. Cette méthode a d'abord été testée pour purifier le récepteur soluble contenant Vγ9/Vδ3. 5 mg d'anticorps 510 ont été liés de manière covalente à lg d'une matrice de billes de sépharose 4B activées au bromure de cyanogène (PHARMACIA, Upsalla, Suède) selon les indications du fournisseur.
Le surnageant de culture du transfectant γ9δ3 a été appliqué sur la colonne d'affinité ainsi formée à raison de 10 ml/heure à température ambiante. Après lavage par une solution saline de tampon phosphate PBS (phosphate 0.01 M, NaCl 0.14 M pH 7,2 même débit), le matériau lié a été élue avec une solution de citrate 0.05 M à pH 3.0. Les fractions éluées ont été neutrali¬ sées immédiatement par un tampon Tris 0.2 M pH 9 (100 μl pour 1ml d'éluat) .
Les fractions positives pour 1 'activité RT soluble comme attesté par le test IRMA ont été rassem- blées, et concentrées à lμg/ml de protéines sur cellule CENTRICON (barrière 30KD) (AMICON, Beverly, MA, USA) suivant les instructions du fabricant. Cette cellule a permis également de changer le tampon pour du PBS.
L'analyse des protéines éluées a été effec- tuée en SDS-PAGE et par Western-Blot. L'analyse a donné des résultats légèrement différents par rapport au γ9δ2. En effet, en conditions non réductrices, trois bandes fortement majoritaires de poids moléculaires 65, 68, 70kD qui se résolvaient en quatre bandes majoritaires 32.5, 34, 36 et 40kD. L'analyse en Western-Blot avec les anticorps 510 (anti Cδ) et 360 (anti Vγ9) ont montré que toutes les bandes majoritaires observées précédemment en conditions non réductrices réagissaient avec les deux anticorps. En conditions réductrices, les bandes réagis- saient soit avec l'anticorps 360 soit avec l'anticorps 510.
De cette analyse, on peut conclure que le métériel élue de la colonne d'affinité consiste essen¬ tiellement en hétérodimères γδ, liés de manière covalen- te, vraisemblablement présents sous forme de plusieurs isomères de glycosylation.

Claims

REVENDICATIONS 1. Procédé de production de récepteurs T solubles, caractérisé en ce que l'on réalise une co-tran¬ sfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour chacune des sous-unités constitutives du récepteur T délétées de la portion transmembranaire du récepteur T.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 1'on produit des récepteurs T solubles VαCα / VβCβ par co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour les sous-unités α et β du récepteur Tαβ délétées de la portion transmembranaire du récepteur Tαβ.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 1'on produit des récepteurs T solubles VγCγ / VδCδ par co-transfection dans une cellule- hôte des séquences d'ADN codant pour les sous-unités γ et δ du récepteur Tγδ délétées de la portion transmembranaire du récepteur Tγδ.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 1'on produit des récepteurs T solubles hétérodimé- riques VαCγ / VβCδ, dans lesquels les sous-unités constitutives sont associées par une liaison covalente, par co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour les domaines Cγ et Cδ des sous-unités γ et δ du récepteur Tγδ délétées de leur portion trans¬ membranaire, fusionnées respectivement avec les séquences d'ADN codant pour les domaines Va et Vβ des sous-unités a et β du récepteur Taβ.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on produit des récepteurs T solubles hétérodimé- riques VαCδ / VβCγ, dans lesquels les sous-unités constitutives sont associées par une liaison covalente, par co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour les domaines Cγ et Cδ des sous-unités γ et δ du récepteur Tγδ délétées de leur portion trans¬ membranaire, fusionnées respectivement avec les séquences d'ADN codant pour les domaines Vβ et Va des sous-unités β et α du récepteur Tαβ.
6. Procédé selon la revendication 1, caracté¬ risé en ce que 1 'on produit des récepteurs T solubles hybrides VγCγ / VαCδ par co-transfection dans une cellule-hôte des séquences d'ADN codant pour la sous- unité γ du récepteur Tγδ délétée de sa portion trans¬ membranaire avec les séquences d'ADN codant pour le domaine Cδ de la sous-unité δ fusionnées avec les séquences d'ADN codant pour le domaine Va de la sous- unité α du récepteur Tαβ.
7. Procédé selon 1'une quelconque des reven¬ dications précédentes, caractérisé en ce que l'on réalise la délétion de la portion transmembranaire des sous- unités constitutives du récepteur T par introduction d'un codon de terminaison de traduction en amont des séquences codant pour la portion transmembranaire de ces sous- unités, notamment par mutagénèse dirigée par P.C.R.
8. Procédé selon 1 'une quelconque des reven¬ dications précédentes, caractérisé en ce que l'on réalise la co-transfection dans des cellules eucaryotes, notam¬ ment dans des cellules d'ovaires de hamster.
9. Protéines de fusion formées d'un récepteur T soluble et d'une séquence peptidique, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par fusion de la séquence d'ADN codant pour ladite séquence peptidique à l'une des chaînes ou aux deux chaînes d'ADN codant pour les sous- unités d'un récepteur T délétées de leur portion trans¬ membranaire, suivie d'une co-transfection des séquences d'ADN ainsi fusionnées dans une cellule-hôte.
10. Protéines de fusion selon la revendica¬ tion 9, caractérisées en ce que la séquence peptidique est celle de 1 'interleukine-2.
11. Anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un récepteur T soluble obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ou une protéine de fusion selon la revendication 9.
12. Fragments Fab, Fab', F(ab' )2 ou Fc d'an¬ ticorps monoclonaux selon la revendication 11.
13. Dérivés d'anticorps monoclonaux compre- nant des anticorps monoclonaux selon la revendication 11 ou des fragments d'anticorps monoclonaux selon la revendication 12, auxquels sont liés des marqueurs ou des molécules thérapeutiquement actives.
14. Hybridomes produisant des anticorps monoclonaux selon la revendication 11.
15. Composition de diagnostic comprenant un récepteur T soluble obtenu par un procédé selon 1 'une quelconque des revendications 1 à 8, ou une protéine de fusion selon la revendication 9 ou 10, ou un anticorps monoclonal selon la revendication 11, ou un fragment d'anticorps monoclonal selon la revendication 12, ou un dérivé d'anticorps monoclonal selon la revendication 13.
16. Procédé de typage de spécificités cellu¬ laires liées au récepteur T dans un prélèvement biolo- gique, caractérisé en ce que l'on met en présence le prélèvement biologique avec un récepteur T soluble obtenu par le procédé selon 1 'une quelconque des revendications 1 à 8, éventuellement couplé à un support, ou une protéine de fusion selon la revendication 9 ou 10, et on met en évidence le complexe éventuellement formé avec le ligand et le récepteur T soluble ou la protéine de fusion.
17. Procédé de détection de prolifération mono ou oligoclonales des lymphocytes T pathologiques, caractérisé en ce que 1'on met en présence un prélèvement biologique contenant lesdits lymphocytes T pathologiques avec des anticorps monoclonaux selon la revendication 11 dirigés contre les portions V et C des chaînes constitu¬ tives des récepteurs T portés par lesdits lymphocytes T pathologiques et on met en évidence la réaction immunolo- gique éventuelle.
18. Kit pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 16 ou la revendication 17, en ce qu'il comprend : - au moins une composition de diagnostic selon l'invention,
- des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réalisation d'un complexe entre le ou les ligands éventuellement présents dans un échantil- Ion biologique,
- un ou plusieurs réactifs éventuellement marqués aptes à réagir avec le complexe formé.
19. Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend un récepteur T soluble obtenu selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, une protéine de fusion selon la revendication 9 ou la revendication 10, ou un anticorps selon la revendication 11, ou un fragment d'anticorps monoclonal selon la revendication 12, ou un dérivé d'anticorps monoclonal selon la revendi- cation 13.
20. Composition thérapeutique selon la reven¬ dication 19, caractérisée en ce qu'elle comprend un récepteur T soluble hétérodimérique ou hybride obtenu selon le procédé de l'une des revendications 4 à 6, ou une protéine de fusion selon la revendication 9, dans laquelle le récepteur T soluble est un récepteur T soluble hétérodimérique ou hybride.
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