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WO1993014125A1 - Nouvel antigene lymphocytaire, anticorps correspondant et leurs applications - Google Patents

Nouvel antigene lymphocytaire, anticorps correspondant et leurs applications Download PDF

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Publication number
WO1993014125A1
WO1993014125A1 PCT/FR1993/000025 FR9300025W WO9314125A1 WO 1993014125 A1 WO1993014125 A1 WO 1993014125A1 FR 9300025 W FR9300025 W FR 9300025W WO 9314125 A1 WO9314125 A1 WO 9314125A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
antibody
cells
cell
mab
Prior art date
Application number
PCT/FR1993/000025
Other languages
English (en)
Inventor
Laurence Boumsell
Armand Bensussan
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) filed Critical Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Publication of WO1993014125A1 publication Critical patent/WO1993014125A1/fr

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a new lymphocyte antigen as well as antibodies corresponding to this antigen and their applications.
  • Lymphocyte activation induces or increases the expression of several surface structures, some of which, such as the IL2 and transferrin receptors, are directly involved in cell growth.
  • the activation of human lymphocytes leads to phenotypic modifications appearing either immediately or at variable times after the disturbance of the antigen recognition structures. Phenotypic changes can be attributed to the expression on the cell surface of inducible molecules such as CD25 (1, 2) and CD71 (3), or to the increased expression of surface antigens such as CD26 (4, 5), CD 29 (6.7), CD45RO (8.9), or to an epitopic modulation as in the case of CD2 (10.11), or to changes in affinity as reported for the molecules CD 1 1a / CD18 (12) and LAMK13).
  • these inducible molecules include receptor subunits of high affinity for various cytokines (2). Most often, they are detected using a monoclonal antibody (mAb) recognizing a putative receptor for an unknown ligand.
  • mAb monoclonal antibody
  • the hgands of CD5 (14,15), CD43 (16) and CD69 (17,18) were very recently identified, whereas the use of mAb as agonists against these structures had made it possible to identify their crucial role in the activation of the T cell (15, 17, 18, 19).
  • mAbs have been shown to increase the cytoplasmic concentration of free calcium, if they are "cross linked" on the surface of T cells (19).
  • monoclonal antibodies have been defined according to the invention against functionally defined clones of human T cells.
  • BB 18 a monoclonal antibody called BB 18 was first isolated, recognizing, on the cell surface, a new lymphocyte antigen composed of subunits of 150 ⁇ 10 kDa, the expression of which on T lymphocytes increases rapidly. after their activation by various stimuli including iectins.
  • PMA phorbol 12-myristate 13-acetate
  • the expression on the cell surface of this structure of 150 ⁇ 10 kDa undergoes an even earlier negative modulation than the molecules of CD3.
  • Biochemical studies as well as phenotypic analysis have revealed that this structure is different from all the molecules previously identified on the cell surface of lymphocytes.
  • BD 16, BM4, BM71 and BM63 monoclonal antibodies
  • BD 16, BM4, BM71 and BM63 monoclonal antibodies
  • IgG1 which were obtained after immunization of Balb / c mice with a human thymic clone and fusion with the NSI cell line. They immunoprecipitate from the surface of human peripheral blood lymphocytes or radio-labeled iodine T clones, the same molecular structure. These antibodies react with different epitopes of this structure. Thus, there is no inhibition of the binding of the antibody BB18 in the presence of an excess of the antibody BD 1 6 and vice versa.
  • the present invention therefore firstly relates to an antigenic protein consisting of a phosphorylated glycoprotein with a molecular weight of 150 ⁇ 10 kDa determined by electrophoresis of SDS PAGE type under reducing conditions, protein expressed on the surface of human T lymphocytes preferably activated.
  • the present invention also relates to an antigenic protein consisting of the same phosphorylated glycoprotein but in the form of a disulfide-linked dimer with a molecular weight of 300 ⁇ 20kDa determined by SDS PAGE electrophoresis under non-reducing conditions, protein expressed at surface of preferably activated human T lymphocytes, composed of subunits of 150 ⁇ 10 kDa as defined above.
  • a subject of the invention is also derivatives of the protein in monomer or dimer form, characterized in that the protein is in non-glycosylated and / or non-phosphorylated form or in that it comprises non-natural glycosilations or phosphorylations or consisting of a fragment of this protein comprising the essential antigenic sites of the protein or non-glycosylated and / or non-phosphorylated derivatives and / or comprising non-natural glycosylations and / or phosphorylation.
  • the present invention also relates to the monoclonal antibodies recognizing an epitope of a protein according to the invention, in particular the monoclonal antibodies BD 16, BB18, BM4, BM71 and BM63, as well as hybridoma cell lines producing these antibodies, in particular the lines deposited at ECACC under the numbers 92010801 for the antibody BD16, 92010802 for the antibody BB18, 93 01 1201 for the antibody BM4, 93 01 1202 for BM71 and 93 011203 for BM63.
  • the protein, its fragments or derivatives according to the invention can be obtained from the natural protein itself obtained by purification from producer cells by immunoprecipitation techniques, in particular with the antibodies BB18, BD 16, BM4, BM71 and BM63 or other techniques.
  • the protein according to the invention, its fragments and derivatives according to the invention can however also be obtained by recombinant DNA techniques of genetic engineering from the DNA coding for the said protein incorporated in expression vectors of that this in eukaryotic or prokaryotic cells, in which case the glycosilation of the recombinant protein obtained can differ from the natural protein as is known to those skilled in the art.
  • a protein or an antibody according to the invention can be labeled with a detectable label with a view to their assay in vitro or their localization in vivo or ex-vivo.
  • the invention indeed also relates to the use of proteins and antibodies according to the invention for the diagnosis of pathological states or the monitoring of the treatment of ailment or as a warning lamp for the appearance of these ailments.
  • the present invention relates to the use of these proteins and antibodies for the rapid diagnosis of a state of early activation of lymphocyte T cells.
  • the present invention relates to the use of a protein, antibody or antibody fragment according to the invention as a medicament in particular for the treatment of diseases with signs of immune deficiency or of inflammatory or autoimmune pathology and in in vivo or ex vivo treatment of malignant lymphoid proliferation.
  • FIG. 1 shows the kinetics of expression on the cell surface of the structure recognized by BB18 after activation of PBMC (mononuclear cells of peripheral blood) using PHA.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells of peripheral blood
  • the peripheral blood mononuclear cells were labeled before (DO), 3 days (D3), or 9 days (D9) after coculture with PHA 1 ⁇ g / ml, for indirect immunofluorescence with BB18, CD25 "BC96" or an antibody monoclonal negative IgGl.
  • the fluorescence profiles are shown as histograms.
  • FIG. 2 shows the PMA inducing an early decrease in reactivity with BB18.
  • Peripheral blood T cells were incubated with PMA 1 ⁇ g / ml for 6, 10, 24 or 144 h. The cells were washed and treated for indirect immunofluorescence with various monoclonal antibodies. At each measurement time, a negative control made of cells incubated under the same conditions but without PMA was carried out. As no modification of the control cells was observed, the control tested after 6 h of culture is presented. The fluorescence profiles are shown as histograms.
  • FIG. 3 shows the SDS-PAGE profile of an immunopreopity BB 18 obtained from a lysate of cloned T cells.
  • the human thymus T cell immunizing clone B12 was surface labeled and lysed in NP40 1%.
  • the immunoprecipitates obtained with BB 18, CD 18 "M232" or an irrelevant IgGI monoclonal antibody were analyzed on a 7.5% SDS-PAGE gel under non-reducing conditions. The positions of the molecular weight markers have been indicated on the left in kDa.
  • - Figure 4 shows the two-dimensional gel analysis (non-reducing / reducing) of a BB18 immunoprecipitate obtained from lysates of cloned T cells.
  • the immunoprecipitates obtained with the monoclonal antibody BB18 were first separated under non-reducing conditions (N. Red.) On a 7.5% gel using a PHAST system. Then the gel strip containing the immunoprecipitate was cut and subjected to electrophoresis in the second dimension, as recommended by the manufacturer, after reduction (Reduction) on a 7.5% SDS-PAGE gel. The positions of the molecular weight markers have been indicated on the right in kDa.
  • FIG. 5 shows the kinetics of PBMC proliferation induced by the BB18 monoclonal antibody.
  • Mononuclear peripheral blood cells were incubated with the purified CD3 "X3" 5 ⁇ g / ml (white triangles), the purified monoclonal antibody BB18 5 ⁇ g / ml (empty squares) or 10 ⁇ g / ml (white circles) in the presence 0.2 ng / ml PMA for 2 to 8 days.
  • the incorporation of (H) TdR was measured by "drawing" the culture for the last 16 hours. The results are expressed as the average of triplicate samples and the SEM has always been less than 10% of the average. Under these conditions, PMA alone did not induce significant proliferation at any of the measurement times.
  • FIG. 6 represents the autoradiography of SDS-PAGE at 8.5% immunoprecipitates of BB18 and BD 16 under reducing conditions, and treated or having undergone a simulated treatment with endo-F.
  • the positions of the molecular weight markers are indicated on the right in kilodaltons.
  • FIG. 7 shows the autoradiography of SDS-PAGE at 12% of BB18 and BD 16 immunoprecipitates under reducing conditions, and treated or having undergone a simulated treatment with V8 protease directly in the gel.
  • the positions of the molecular weight markers are indicated on the right in kilodaltons.
  • FIG. 8 shows the co-modulation of the PBL cell surface structure at 37 ° C for 8 hours, with an excess of Acm BB 1 8 or 24 hours with mAb BD 16. Next, the cells were carefully washed and labeled with a biotiny mAb or an FITC-labeled goat anti-mouse Ig, as a control.
  • FIG. 9 represents a competitive binding experiment between mAbs BB18 and BD 16.
  • the second antibody (2nd mAb) was biotinyié, as indicated in the section "Materials and methods", and its binding was revealed by streptavidune- phycoerythrin.
  • FIG. 10 shows the SDS-PAGE analysis of BB18 and BD16 immunoprecipitates obtained from 32 P metabolic labeling of cloned T cells.
  • the immunoprecipitates were analyzed under non-reducing conditions (left-hand part) and under reducing conditions
  • FIG. 11 represents the SDS-PAGE analysis of BB18 and BD 16 immunoprecipitates obtained from metabolic labeling with 32 P (left part) or surface labeling with 125 1 (right part) cloned T cells. Immunoprecipitates were analyzed under non-reducing conditions on both sides. The positions of the molecular weight markers are indicated on the right in kilodaltons. In addition, a CD 18 mAb was used as a control.
  • FIG. 12 represents the effect of mAbs BB18 (curve a) and BD16 (curve b) on the intracellular Ca 2+ concentration of Jurkat cells.
  • the arrows indicate the nature and time in addition to the MCA.
  • Each trace is representative of at least three experiences.
  • the Y axis represents the intracellular Ca 2+ concentration in nM, while the X axis corresponds to time in seconds.
  • FIG. 13 represents the kinetics of the proliferative responses of PBL to a CD2 pair of mAb (CD2X11 + D66) in the presence or absence of mAb BB18 or BD 16.
  • mAb BB18 or BD16 Acm BB18 or BD16, soluble and purified, with a final concentration of 5 ⁇ g / ml.
  • incubation of PBMC with PMA induces rapid negative modulation followed by complete re-expression within 24 hours.
  • This molecule is not specific for the T cell because it is also expressed in EBV-transformed B cell lines.
  • cells proliferate when this dimer has been stimulated in the presence of submitogenic concentrations of PMA.
  • the monoclonal antibodies used such as CD 1 "L404",
  • CD8 "OKT8”, CD 18 "M232” and CD25 “BC96” were either locally produced (23) or purchased commercially.
  • BD16 were prepared by immunization of Balb / c mice with the thymic clone B12, CD4 + CD8 + (22) (three intravenous injections with 20x10 6 cells). Spleen cells from immunized mice were fused to the NS I cell line five days after the last injection. The initial screening by indirect immunofluorescence and flow cytometry using a Facstar (Becton Dickinson, Mountain View, CA) retained all the supernatants of hybridomas reacting with the immunizing cells but not or weakly with the mononuclear cells of the peripheral blood at rest. Cultures containing the above-mentioned monoclonal antibodies were cloned twice by limiting dilution.
  • Human PBMCs were prepared by Ficoll-Isopaque density gradient centrifugation. The unfractionated population was separated into E rosette-less (E-) and E rosette-plus (E-) populations by interaction with 5% sheep red blood cell (SRBC). The mixture was deposited on Ficoll-Isopaque and the E- cells were recovered from the interface while the E + cells were obtained from the pellet after hypotonic lysis of the SRBC.
  • E- E rosette-less
  • E- E rosette-plus
  • the monocytes were obtained from E- cells by adhering to the glass overnight.
  • the peripheral blood mononuclear cells CD2 + CD3 were obtained by complement-dependent lysis with a CD3 mAb in the E + cell fraction.
  • Normal and leukemic samples were obtained from the Saint-Louis Hospital Blood Bank and cryopreserved as previously described (23).
  • Human T cell clones were obtained as described elsewhere (22) and cultured in RPMI-1640 medium (GIBCO, Paisley, Scotland) containing 2mmol / liter of L-glutamine, penicillin (100 U / ml) , streptomycin (100 ⁇ g / ml), 10% heat-inactivated human serum and recombinant interleukin 2, kindly provided by Roussel-Uclaf (Romainvilie, France) (30 U / ml.) The cloned cells have been restimulated every 7 days with feeder cells in the presence of purified PHA (Wellcome, Beckenham, UK) at 1 ⁇ g / ml and of recombinant interleukin 2.
  • the feeder cells were a mixture of irradiated aliogenic LSPs from three donors (the same donors being used for several months). Cultures of EBV-transformed leukemia or B cell lines and hybridoma cell lines were mycoplasma free and maintained logarithmic in RPMI containing 10% selected heat-inactivated fetal calf serum and antibiotics.
  • the cells were first incubated with an excess of a first mAb for 30 min., Then they were centrifuged and incubated with the appropriate dilution of a biotinylated mAb. Controls included an incubation during the first stage with the same unconjugated mAb or with an inadequate mAb. After the final washes, the cells were resuspended in 0.3 ml of a 1% formalin solution in PBS. The purified antibodies were labeled with biotin using a standard protocol. Briefly, after dialysis in carbonate buffer (pH 8.8), the antibody was incubated (1 mg / ml) for 15 min.
  • the bands separated by autoradiography of the dried gel were visualized, they were excised, digested with protease V8 in a buffer sample (at 1 mg / ml) , and the fragments were analyzed in a second SDS-PAGE experiment.
  • the nitrogen-bridged sugars were eliminated by treatment of the specific immunoprecipitates with endo-beta-N-acetylglucosaminidase-F (endo-F) (Boehringer Mannheim, Meylan France).
  • the digestion was carried out by bringing the BB18 and BD 16 immunoprecipitates to the boil for 4 minutes in 50 ⁇ l of 100 mM potassium phosphate buffer, pH 6.5 containing 50 mM EDTA, 0.5% SDS and 1% beta-mercaptoethanol.
  • 100 ⁇ l of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) containing 50 mM EDTA, 1% NP40 and 1% beta-mercaptoethanol was added before the addition of 12 ⁇ l (0.6 IU) of endo-F. After 24 h of incubation at 37 ° C, the reaction was stopped by adding a buffer sample.
  • 50,000 PBMC were cultured in triplicate in 96-well rounded bottom plates (Costar, Cambridge, MA) in a total volume of 0.2 ml RPMI 1640, supplemented with 10% fetal calf serum in one volume 0.15 ml total of RPMI 1640, supplemented with 10% heat-inactivated human serum.
  • Various concentrations of purified antibodies were added with 0.2 ng / ml PMA.
  • the phosphorus labeling was carried out as follows. Cloned T cells were washed twice in phosphate-free medium containing 5% dialyzed human AB serum and then incubated in the same medium at 50 x 10 6 cells in 1 ml for 30 minutes at 37 ° C.
  • the cells were washed twice in PBS before their lysis in 2-3 ml of buffer containing 10 mM Tris, pH 8.2, containing 1% NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mg / ml of BSA,
  • the intracellular Ca 2+ concentration was measured as previously described (26). Briefly, Jurkat cells were washed twice in medium containing 25 mM HEPES (pH 7.2), 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM Na 2 HPO 4 , 1 mM Ca Cl 2 , 0.5 mM MgCl 2 , and 1% glucose (all subsequent incubations and washes were performed in the same medium) and they were resuspended at 30x106 cells / ml in the presence of 3 ⁇ M of Fura 2-AM (Calbiochem, letdon,
  • mAbs obtained by repeated immunizations with highly functional human T cell clones 21).
  • an mAb was initially identified on the clone called B12 (22) of human thymus T cells. called BB18, recognizing a new disulfide-linked dimer composed of subunits of 150 ⁇ 10kDa. This structure, which is weakly expressed in normal peripheral blood lymphocytes, is quickly found to be strongly expressed during activation.
  • BB18 mAbs react strongly with cloned T cells and weakly with resting human T cells by flow cytofluorometry.
  • mice In order to obtain monoclonal antibodies defining the stages of T cell activation, six-week-old Balb / c mice were immunized with cloned human thymic cells (22). An mAb of the IgG1 isotype, named BB18, was thus isolated.
  • Table 1 summarizes the reactivity of the aforementioned mAb with many normal human and hematopoietic malignant cells. The molecule recognized by this mAb is weakly expressed on resting T cells but not at all on B cells from peripheral blood or lympoid organs. Among the leukemic lymphoid cell lines tested, all T cells were strongly labeled, while the Burkitt lymphoma cell lines were not reactive.
  • BB 18 strongly marked the YT cell line of activated NK, CD3 negative tumor cells and its CD 25 mutant, YT2C2. The structure recognized by BB18 appears to be strongly expressed immediately after cellular activation as shown by the representative kinetic experiment carried out with mononuclear cells from the peripheral blood of a normal individual stimulated with PHA (FIG. 1).
  • the modulation of the CD3 molecule reaches its maximum after 24 hours while the modulation of CD4 is completed after 10 hours. However, as previously reported after 24 hours of culture in the presence of PMA, CD25 is induced and the expression of CD8 is not modified by this treatment. A.3. Biochemical analysis of the immunoprecipitated molecule by mAb BB18 after labeling the cell surface.
  • mAb BB18 In order to define the molecule identified by mAb BB18, clones of human T cells were labeled with Iodine 125 on their external face, according to the lactoperoxidase method, and iysed. The BB 18 immunoprecipitates obtained from these lysates of labeled cells were then analyzed by SDS-PAGE. The autoradiography shown in Figure 3 indicates that mAb BB18 immunoprecipitates from a representative T cell clone. A predominant band migrating under non-reducing conditions with a molecular mass of approximately 300 kDa.
  • CD18 "M232" mAbs used as immunoprecipitate control of three protein bands from the same lysate characteristic of CD 18 molecules and two different CD 11 molecules, while no protein band is obtained with an inappropriate IgG1 type mAb .
  • the immunoprecipitate obtained with the BB18 Antibody consists mainly of homodimers linked by disulfide bridges of approximately 300 kDa in the first non-reducing dimension, which resolves in a second reducing dimension into a predominant protein band of approximately 150 kDa below the diagonal of the two-dimensional gel.
  • Stimulation with soluble BB18 mAbs induces proliferation of LSPs in the presence of a submitogenic concentration of PMA.
  • BB18 a new surface structure of a human lymphocyte cell with the mAb called BB 18.
  • the immunoprecipitated molecule using BB18 from lysates of cloned T lymphocytes marked on the surface, appeared to be a homodimer linked by bridges. disulfides comprising subunits of approximately 150kDa. This structure is poorly detectable on resting peripheral blood T cells, while its expression increases rapidly after activation of the T cell and remains at this high level for some time after initial triggering.
  • the BB18 Antibody reacts strongly with all the cloned T cells tested regardless of their CD4 / CD8 phenotype and their TcR (data not shown).
  • mAb BB18 does not react with resting B cells, while long-standing EBV-transformed B cells are weakly labeled.
  • Burkit's lymphoma cell lines (Daudi and Namalva) clearly lack responsiveness.
  • leukemic but not myelomonocytic lymphoid cell lines are reactive to BB18.
  • the CD28 molecule a 44 kDa disulfide-bridged homodimer, preferentially expressed on a T cell subpopulation, was the first structure described to induce costimulatory signals (25, 26). The effect has been shown to regulate the stability of the mRNA encoding lymphokines (27).
  • costimulatory signal mediator molecules include the molecule CD26 (4, 5), identifying dipeptidylpeptidase IV, which is a 120 kDa structure; CD69, a very early activation heterodimer with disulfide bridges, of 28.32 kDa (17, 18); the specific T cell molecule identified by mAb 10D 1, which is a 90 kDa disulfide bridge homodimer (28); CD60 "UM4D4" recognizing a hydrocarbon structure expressed on various gangliosides (29).
  • the CD43 mAbs are particularly interesting, identifying a highly sialylated glycoprotein of 95 kDa, which similarly to the CD3 and CD2 mAbs can directly trigger the activation of T cells in the presence of monocytes. It has been recently reported that a monoclonal antibody reactive with CD5, unlike the previously described CD5 mAb, is capable of inducing T cell proliferation in the presence of monocytes (15). This raised the possibility that only certain epitopes of the CD5 molecule, as in the case of CD2, are involved in the activation of T cells. Finally, it should be mentioned that, unlike the epitope recognized by the Antibody BB18, the surface expression of the majority of signal transduction structures is not increased during activation of the cell.
  • T cells can be activated through several distinct surface molecules, these activation pathways appear to share common signal transduction mechanisms. It is well known that activation of the T cell via CD2 or CD5, but not via CD43 (16) is dependent on the expression of CD3-TcR. Although no physical link of the BB18 molecule with CD3-TcR has been demonstrated according to the invention, (the AMC has labeled YT2C2 CD3-TcR negative lymphocytes), links are possible with components such as CD3 chain.
  • BD16 a second mAb, named BD16, presenting a similar reactivity motif in immunofluorescence studies and immunoprecipitating a dimeric structure with disulfide bridges of 300 kDa originating from the surface of the T cell.
  • BB18 and BD 16 identified the same structure
  • an additional biochemical analysis of the molecule immunoprecipitated by the two mAbs was performed after labeling the cell surface. Human T cell clones were labeled on their outer surface, according to the lactoperoxidase method, and lysed.
  • FIG. 6 represents an autoradiography revealing an identical band of approximately 120 kDa in the two immunoprecipitates treated with endo-F, while the characteristic band of 150 kDa was obtained with the samples having received a simulated treatment.
  • the 150 kDa cell surface molecule reactive to mAbs BB18 and BD16 is a phosphoprotein and the mAb BD16 co-precipitates a phosphorylated structure of 100 kDa.
  • CD2-induced PBL proliferation is greatly increased by mAb BD 16 but not by mAb BB18.
  • Freshly isolated PBLs were incubated for various durations with or without mAb, as described in the "Materials and Methods" section.
  • the soluble and purified BB18, BD 16 and CD3 mAbs were used at final concentrations of 5 ⁇ g / ml.
  • MAb BD 16 enhances the proliferative response of PBL to various pairs of
  • the PBLs were cultivated for 5 days in the medium, CD2 mAbs alone with or without BB18 or BD16 as a control (results not exposed) or a combination of CD2 mAbs with or without BB18 or BD16 mAbs. Significant proliferation was observed only in wells containing pairs of CD2 mAbs. CD2 mAbs were used in the form of diluted ascites fluid, while BB18 and BD16 were purified mAbs used at final concentrations of 5 ⁇ g / ml.
  • Sialophorin a sialoglycoprotein surface defective in the wiskott-aldrich synchrome, is involved in human T lymphocyte proliferation. 3. Exp. Med. 165: 1383.
  • CD 28 activation pathway regulates the production of multiple T-cell derived lymphokmes / cytokmes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 1333.

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Abstract

La présente invention concerne une protéine antigénique consistant en une glycoprotéine de 150 ± 10 kDa déterminé par électrophorèse de type SDS-PAGE dans des conditions réductrices, exprimée à la surface des lymphocytes T de sang humain. La présente invention concerne également la protéine sous forme dimèrique à liason disulfure de poids moleculaire 300 ± 20 kDa. La présente invention concerne enfin des anticorps dirigés contre une protéine selon l'invention, ainsi que des lignées d'hybridomes, ainsi que l'application des protéines et anticorps selon l'invention dans le domaine du diagnostic et thérapeutique.

Description

NOUVEL ANTIGENE LYMPHOCYTAIRE , ANTICORPS
CORRESPONDANT ET LEURS APPL ICATIONS
La présente invention concerne un nouvel antigène lymphocy- taire ainsi que des anticorps correspondant à cet antigène et leurs applications.
L'activation lymphocytaire induit ou augmente l'expression de plusieurs structures de surface, dont certaines, telles que les récepteurs à l'IL2 et a la transferrine, sont directement impliquées dans la croissance cellulaire. En particulier, l'activation de lymphocytes humains conduit à des modifications phénotypiques apparaissant soit immédiatement soit à des temps variables après la perturbation des structures de reconnaissance de l'antigène. Des changements phénotypiques peuvent être attribués à l'expression à la surface de la cellule de molécules inductibles telles que CD25(1 ,2) et CD71 (3), ou à l'expression accrue d'antigènes de surface tels que CD26(4,5), CD 29(6,7), CD45RO(8,9), ou à une modulation épitopique comme dans le cas de CD2(10,11), ou à des changements de l'affinité comme on l'a rapporté pour les molécules CD 1 1a/CD18(12) et LAMK13). Il n'est pas surprenant que ces molécules inductibles incluent des sous-unités de récepteurs de grande affinité pour diverses cytokines (2). Le plus souvent, elles sont détectées en utilisant un anticorps monoclonal (Acm) reconnaissant un récepteur putatif d'un ligand inconnu. Par exemple, les hgands de CD5(14,15), CD43(16) et CD69( 17,18) ont été très récemment identifiés, alors que l'utilisation d'Acm en tant qu'agonistes contre ces structures avait permis d'identifier leur rôle crucial dans l'activation de la cellule T (15, 17, 18, 19). On a montré que ces Acm augmentent la concentration cytoplasmique en calcium libre, si on en fait un "cross linkage" à la surface des cellules T ( 19). Comme une augmentation du calcium cytosolique et une activation de la Protéine Kinase C (PKC) simultanées sont des événements précoces et essentiels de la prolifération des lymphocytes T, on a mené des investigations sur les effets de ces divers Acm sur l'activation des lymphocytes T humains en présence de PMA (Phorbol 12-myristate 13-acétate), quu est un activateur de la PKC(20). En outre, l'utilisation d'Acm a confirmé qu'un grand nombre d'antigènes de surface des leucocytes et en particulier ceux induits pendant l'activation sont communs aux lignées cellulaires B et T(2,3,14).
Afin d'identifier de nouvelles structures caractéristiques des lymphocytes activés, on a, selon l'invention, défini des anticorps monoclonaux contre des clones de cellules T humaines fonctionnellement définies.
Selon la présente invention, on a tout d'abord isolé un anticorps monoclonal dénommé BB 18 reconnaissant, sur la surface cellulaire, un nouvel antigène lymphocytaire composé de sous-unités de 150 ±10 kDa, dont l'expression sur les lymphocytes T augmente rapidement après leur activation par divers stimuli notamment des iectines. En revanche, en présence de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), l'expression à la surface de la cellule de cette structure de 150 ±10 kDa subit une modulation négative encore plus précoce que les molécules du CD3. Des études biochimiques ainsi qu'une analyse phenotypique ont révélé que cette structure est différente de toutes les molécules identifiées précédemment sur la surface cellulaire des lymphocytes.
D'autres anticorps monoclonaux (BD 16, BM4, BM71 et BM63), obtenus selon l'invention, reconnaissent la même structure de surface que i'Acm BB18. Ces anticorps sont des IgGl qui ont été obtenues après immunisation de souris Balb/c avec un clone thymique humain et fusion avec la lignée cellulaire NSI. Ils immunoprécipitent de la surface de lymphocytes du sang périphérique humain ou de clones T radio-marqués à l'iode, la même structure moléculaire. Ces anticorps réagissent avec des épitopes différents de cette structure. Ainsi, il n'y pas d'inhibition de la fixation de l'anticorps BB18 en présence d'un excès de l'anticorps BD 1 6 et vice-versa.
La présente invention a donc tout d'abord pour objet une protéine antigénique consistant en une glycoprotéine phosphorylée de poids moléculaire de 150 ± 10 kDa déterminé par electrophorese de type SDS PAGE dans des conditions réductrices, protéine exprimée à la surface des lymphocytes T humains de préférence activés. La présente invention a aussi pour objet une protéine antigénique consistant en la même glycoprotéine phosphorylée mais sous forme d'un dimère à liaison disulfure de poids moléculaire de 300 ±20kDa déterminé par electrophorese de type SDS PAGE dans des conditions non réductrices, protéine exprimée à la surface de lymphocytes T humains de préférence activés, composée de sous-unités de 150 ± 10kDa telles que définies ci-dessus.
L'invention a également pour objet des dérivés de la protéine sous forme monomère ou dimère caractérisés en ce que la protéine se présente sous forme non glycosylée et/ou non phosphorylée ou en ce qu'elle comporte des glycosilations ou phosphorylations non naturelles ou consistant en un fragment de cette protéine comportant les sites antigéniques essentiels de la protéine ou des dérivés non glycosylés et/ou non phosphorylés et/ou comportant des glycosylations et/ou phosphory- lations non naturelles.
La présente invention concerne également les anticorps monoclonaux reconnaissant un épitope d'une protéine selon l'invention, notamment les anticorps monoclonaux BD 16, BB18, BM4, BM71 et BM63, ainsi que des lignées de cellules d'hybridomes produisant ces anticorps, notamment les lignées déposées à l'ECACC sous les numéros 92010801 pour l'anticorps BD16, 92010802 pour l'anticorps BB18, 93 01 1201 pour l'anticorps BM4, 93 01 1202 pour BM71 et 93 011203 pour BM63.
La protéine, ses fragments ou dérivés selon l'invention peuvent être obtenus à partir de la protéine naturelle elle-même obtenue par purification à partir de cellules productrices par des techniques d'immunoprécipitation, notamment avec les anticorps BB18, BD 16, BM4, BM71 et BM63 ou d'autres techniques. La protéine selon l'invention, ses fragments et dérivés selon l'invention peuvent cependant également être obtenus par des techniques d'ADN recombinant de génie génétique à partir de l'ADN codant pour la dite protéine incorporé dans des vecteurs d'expression de celle-ci dans des cellules eukaryotes ou prokaryotes, auquel cas la glycosilation de la protéine recombinante obtenue peut différer de la protéine naturelle comme il est connu de l'homme de l'art. Une protéine ou un anticorps selon l'invention peuvent être marqués par un marqueur détectable en vue de leur dosage in vitro ou leur localisation in vivo ou ex-vivo.
L'invention concerne en effet également l'utilisation des protéines et anticorps selon l'invention pour le diagnostic d'états pathologiques ou le suivi du traitement d'affection ou comme voyant d'apparition de ces affections. En particulier, la présente invention concerne l'utilisation de ces protéines et anticorps pour le diagnostic rapide d'un état d'activation précoce des cellules T lymphocytaires.
Enfin, la présente invention concerne l'emploi d'une protéine, anticorps ou fragment d'anticorps selon l'invention à titre de médicament notamment pour le traitement de maladies avec des signes de déficit immunitaire ou de pathologie inflammatoire ou auto-immunes et dans le traitement in vivo ou ex vivo de proliférations lymphoïdes malignes.
D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description qui va suivre.
Sur les figures annexées,
- la Figure 1 représente la cinétique d'expression à la surface cellulaire de la structure reconnue par BB18 après activation des PBMC (cellules mononuclées de sang périphérique) à l'aide de PHA. Les cellules mononuclétaires du sang périphérique ont été marquées avant (DO), 3 jours (D3), ou 9 jours (D9) après la coculture avec le PHA 1 μg/ml, pour immunofiuorescence indirecte avec BB18, CD25"BC96" ou un anticorps monoclonal négatif IgGl. Les profils de fluorescence sont figurés comme des histogrammes.
- La Figure 2 représente le PMA induisant une décroissance précoce de la réactivité avec BB18. Des cellules T du sang périphérique ont été incubées avec du PMA 1 μg/ml pendant 6, 10, 24 ou 144 h. Les cellules ont été lavées et traitées pour l'immunofluorescence indirecte avec des anticorps monoclonaux variés. A chaque temps de mesure, un contrôle négatif fait de cellules incubées dans les mêmes conditions mais sans PMA a été réalisé. Comme on n'a pas observé de modifications des cellules-contrôles, le contrôle testé après 6h de culture est présenté. Les profils de fluorescence sont figurés comme des histogrammes.
- La Figure 3 représente le profil de SDS-PAGE d'un îmmunopréopité BB 18 obtenu à partir d'un lysat de cellules T clonées. Le clone immunisant B12 de cellules T de thymus humain a été marqué en surface et lysé dans du NP40 1 %. Les immunoprécipités obtenus avec BB 18, CD 18"M232" ou un anticorps monoclonal IgGI irrelevant ont été analysés sur un gel de SDS-PAGE à 7,5% dans des conditions non réductrices. Les positions des marqueurs de masse moléculaire ont été indiquées à gauche en kDa. - La Figure 4 représente l'analyse sur gel à deux dimensions (non réducteur/réducteur) d'un immunoprécipité BB18 obtenu à partir de lysats de cellules T clonées. Les immunoprécipités obtenus avec l'anticorps monoclonal BB18 ont été d'abord séparés dans des conditions non réductrices (N. Réd.) sur un gel à 7,5% à l'aide d'un système PHAST. Ensuite la bande de gel contenant l'immunoprécipité a été coupée et soumise à l'électrophorèse dans la seconde dimension, comme recommandé par le fabricant, après réduction (Réd.) sur un gel de SDS-PAGE à 7,5%. Les positions des marqueurs de masse moléculaire ont été indiquées à droite en kDa.
- La Figure 5 représente la cinétique de la prolifération des PBMC induite par l'anticorps monoclonal BB18. Des cellules mononucléaires du sang périphérique ont été incubées avec le CD3"X3" purifié 5 μg/ml (triangles blancs), l'anticorps monoclonal BB18 purifié 5 μg/ml (carrés vides) ou 10 μg/ml (cercles blancs) en présence de PMA 0,2 ng/ml pendant 2 à 8 jours. L'incorporation de ( H)TdR a été mesurée en "puisant" la culture pendant les 16 dernières heures. Les résultats sont exprimés comme la moyenne d'échantillons tripliqués et le SEM a toujours été inférieur à 10% de la moyenne. Dans ces conditions, le PMA seul n'a induit de prolifération significative a aucun des temps de mesure.
- La Figure 6 représente l'autoradiographie de SDS-PAGE à 8,5% d'immunoprécipités de BB18 et BD 16 en conditions réductrices, et traités ou ayant subi un traitement simulé à l'endo-F. Les positions des marqueurs de masse moléculaire sont indiquées à droite en kilodaltons.
- La Figure 7 représente l'autoradiographie de SDS-PAGE à 1 2% d'immunoprécipités de BB18 et de BD 16 en conditions réductrices, et traités ou ayant subi un traitement simulé avec la protéase V8 directement dans le gel. Les positions des marqueurs de masse moléculaire sont indiquées à droite en kilodaltons.
- La Figure 8 représente la comodulation de la structure de surface cellulaire PBL à 37°C pendant 8 heures, avec un excès d'Acm BB 1 8 ou 24 heures avec l'Acm BD 16. Ensuite, on a soigneusement lavé et marqué les cellules avec un Acm biotinyié ou une Ig anti-souris de chèvre marquée au FITC, comme témoin.
- La Figure 9 représente une expérience de liaison compétitive entre les Acm BB18 et BD 16. Le second anticorps (2nd mAb) était biotinyié, comme cela est indiqué dans la section "Matériel et méthodes", et sa liaison a été révélée par streptavidune-phycoérythrine.
- La Figure 10 représente l'analyse par SDS-PAGE d'immunoprécipités de BB18 et BD16 obtenus à partir d'un marquage métabolique au 32P de cellules T clonées. On a analysé les immunoprécipités dans des conditions non-réductrices (partie de gauche) et dans des conditions réductrices
(partie de droite). Les positions des marqueurs de masse moléculaire sont indiquées à gauche en kilodaltons.
- La Figure 11 représente l'analyse par SDS-PAGE d'immunoprécipités de BB18 et BD 16 obtenus à partir d'un marquage métabolique au 32P (partie degauche) ou de marquage en surface à l' 1251 (partie de droite) de cellules T clonées. On a analysé les immunoprécipités dans des conditions non-réductrices des deux côtés. Les positions des marqueurs de masse moléculaire sont indiquées à droite en kilodaltons. De plus, on a utilisé un Acm CD 18 comme témoin.
- La Figure 12 représente l'effet des Acm BB18 (courbe a) et BD16 (courbe b) sur la concentration intracellulaire en Ca2+ des cellules de Jurkat. Les flèches indiquent la nature et le temps en plus de l'Acm. Chaque trace est représentative d'au moins trois expériences. L'axe des Y représente la concentration intracellulaire en Ca2+ en nM, ntandis que l'axe des X correspond au temps en secondes.
- La Figure 13 représente la cinétique des réponse proliferatives des PBL à une paire CD2 d'Acm (CD2X11 + D66) en présence ou en l'absence d'Acm BB18 ou BD 16. On a utilisé des Acm BB18 ou BD16, solubles et purifiés, avec une concentration finale de 5 μg/ml. En revanche, l'incubation de PBMC avec du PMA induit une modulation négative rapide suivie d'une réexpression complète dans les 24 heures. Cette molécule n'est pas spécifique de la cellule T car elle est aussi exprimée dans des lignées cellulaires B EBV-transformées. De plus, les cellules prolifèrent quand ce dimère a été stimulé en présence de concentrations submitogéniques de PMA.
I. MATERIEL ET METHODES
1. Anticorps monoclonaux.
Les anticorps monoclonaux utilisés tels que CD 1"L404",
CD2"X1 1", CD2"D66", CD2"GT2", CD3"OKT3", CD4"0516", CD8"L533",
CD8"OKT8", CD 18"M232" et CD25"BC96" ont été soit produits localement (23) soit achetés dans le commerce. Les anticorps monoclonaux BB18 et
BD16 ont été préparés par immunisation de souris Balb/c avec le clone thymique B12, CD4+CD8 +(22) (trois injections intraveineuses avec 20x106 cellules). On a fusionné des cellules de rate de souris immunisées à la lignée cellulaire NS I cinq jours après la dernière injection. Le criblage initial par immunofluorescence indirecte et cytométrie de flux en utilisant un Facstar (Becton Dickinson, Mountain View, CA) a retenu tous les surnageants d'hybridomes réagissants avec les cellules immunisantes mais pas ou faiblement avec les cellules mononucléaires du sang périphérique au repos. Les cultures contenant les anticorps monoclonaux susmentionnés ont été clonées deux fois par dilution limitante. On a effectué des passages en série de l'hybridome clone par injection i.p. dans des souris Balb/c sensibilisées avec du pristane. Les fluides des ascites ont été collectés, ultracentrifugés et purifiés par affinité, au besoin, sur une colonne de protéine A-Sépharose. 2. Isolation de populations cellulaires.
Des PBMC humaines ont été préparées par centnfugation par gradient de densité Ficoll-Isopaque. La population non-fractionnée a été séparée en populations E rosette-moins (E-) et E rosette-plus (E-) par interaction avec 5% de globule rouge de mouton (SRBC). Le mélange a été déposé sur du Ficoll-Isopaque et les cellules E- ont été récupérées à partir de l'interface tandis que les cellules E+ ont été obtenues à partir du culot après lyse hypotonique du SRBC.
Les monocytes ont été obtenus à partir des cellules E- par adhérence au verre pendant une nuit. Les cellules mononucléaires du sang périphérique CD2 + CD3 ont été obtenues par lyse sous dépendance du complément avec un Acm CD3 dans la fraction cellulaire E+. Des échantillons normaux et leucémiques ont été obtenus à partir de la Banque du Sang de l'Hôpital Saint-Louis et cryopréservés comme décrit précédemment (23).
3. Cultures cellulaires.
Des clones de cellules T humaines ont été obtenues comme décrit ailleurs (22) et mises en culture dans du milieu RPMI-1640 (GIBCO, Paisley, Ecosse) contenant 2mmol/litre de L-glutamine, de la pénicilline (100 U/ml), de la streptomycine (100 μg/ml), 10% de sérum humain inactivé par la chaleur et de l'interleukine 2 recombinante, gracieusement fournie par Roussel-Uclaf (Romainvilie, France) (30 U/ml.) Les cellules clonées ont été restimulées tous les 7 jours avec des cellules nourricières en présence de PHA purifé (Wellcome, Beckenham, UK) à 1 μg/ml et d'interleukine 2 recombinante. Les cellules nourricières étaient un mélange de LSP aliogéniques irradiées provenant de trois donneurs (les mêmes donneurs étant utilisés pendant plusieurs mois). Les cultures de lignées cellulaires humaines leucémiques ou B EBV-transformées et de lignées cellulaires d'hybridome étaient libres de mycoplasme et maintenues en croissance logarithmiques dans du RPMI contenant 10% de sérum de veau foetal sélectionné inactivé à la chaleur et des antibiotiques.
4. Etudes par immunofluorescence.
Des études par immunofluorescence indirecte ont été pratiqués en utilisant une Ig antisouris conjuguée à de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou de la phycoérymthrine (PE) des Laboratoires Meloy (Springfield, VA) comme décrit précédemment (22). La fluorescence a été lue en utilisant un microfluoromètre Facstar (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
Pour des expériences de biocage croisé, on a d'abord incubé les cellules avec un excès d'un premier Acm pendant 30 min., puis on les a centrifugées et incubées avec la dilution appropriée d'un Acm biotinyié. Des témoins comprenaient une incubation pendant la première étape avec le même Acm non-conjugué ou avec un Acm inadéquat. Après les lavages finaux, on a remis en suspension les cellules dans 0,3 ml d'une solution de formaline à 1 % dans du PBS. Les anticorps purifiés ont été marqués à la biotine en utilisant un protocole standard. En bref, après dialyse dans un tampon carbonate (pH 8,8), on a incubé l'anticorps (1 mg/ml) pendant 15 min. à température ambiante avec de l'act-biotine (IBF, Villeneuve-La- Garenne, France). On a arrêté la réaction par addition de NH4Cl IM, et on a éliminé la biotine libre par filtration sur gel. On a conservé congelés les Acm conjugués à -70°C jusqu'à leur utilisation. Les émissions par fluorescence du FITC et du PE ont été discriminées en utilisant des filtres passe-bandes à 530±15 et 575±12,5.
5. Modulation induite par le PMA de l'expression à la surface de la cellule.
Des PBMC ont été incubées avec du PMA (Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO) à 1 μg/ml dans un milieu de culture contenant 10% de
FCS pendant les temps indiqués. Après un lavage complet, les cellules ont été marquées en immunofluorescence indirecte en utilisant une batterie d'anticorps monoclonaux contre diverses molécules de surface.
6. Marquage et immunoprécipitations de protéines de surface cellulaire.
Des cellules T humaines clonées ont été marquées en surface avec de la lactopéroxydase et quatre additions de H 2O2 comme décrit précédemment. Les cellules ont alors été lysées dans un tampon de lyse standard 10 mM Tris-HCI (pH 7,4), contenant 1 % (PV) de Nonidet P40, 0,15M de NaCl, 1 mg/ml de BSA et 2 mM de PMSF (Phényl Méthyl Sulfonyl fluoride), 20 mM d'iodoacétamide, et de l'aprotinine à 1 lU/ml comme inhibiteurs des protéases. Les immunoprécipitations et l'analyse par SDS-PAGE ont été pratiquées comme décrit (22). Des analyses par electrophorese sur gel bidimensionnelle non réductrice/réductrice en diagonale ont été pratiquées en utilisant des gels PHAST (Pharmacia) d'acrylamide à 7,5% pour la première et la seconde dimension selon les recomandations du fabricant (Pharmacia, Uppsala, Suède). L'autoradiographie de plaques de gel séchées a été pratiquée à -70°C. Les poids moléculaires ont été calculés par référence à la mobilité de protéines standard.
Dans certaines expériences, à la suite de SDS-PAGE dans des conditions réductrices, on a visualisé les bandes séparées par autoradiographie du gel séché, on les a excisées, digérées avec la protéase V8 dans un échantillon de tampon (à 1 mg/ml), et on a analysé les fragments dans une seconde expérience de SDS-PAGE. Les sucres à ponts azotés ont été éliminés par traitement des immunoprécipités spécifiques avec de l'endo-bêta-N-acétylglucosaminidase-F (endo-F) (Boehringer Mannheim, Meylan France). On a effectué la digestion en portant à ébullition les immunoprécipités au BB18 et au BD 16 pendant 4 minutes dans 50 μl de tampon au phosphate de potassium 100 mM, pH 6,5 contenant 50 mM d'EDTA, 0,5% de SDS et 1% de bêta-mercaptoéthanol. On a ajouté 100 μl de tampon au phosphate de potassium 100 mM (pH 6,5) contenant 50 mM d'EDTA, 1% de NP40 et 1% de bêta-mercaptoéthanol avant l'addition de 12 μl (0,6 IU) d'endo-F. Après 24 h d'incubation à 37°C, on a arrêté la réaction par addition d'un échantillon de tampon.
7. Tests de prolifération.
50.000 PBMC ont été mises en culture en triple dans des plaques de 96 puits à fond arrondi (Costar, Cambridge, MA) dans un volume total de 0,2 ml de RPMI 1640, supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal dans un volume total de 0,15 ml de RPMI 1640, supplémenté avec 10% de sérum humain inactivé par la chaleur. Diverses concentrations d'anticorps purifiés ont été ajoutées avec 0,2 ng/ml de PMA. Après diverses périodes de temps, les puits furent radiomarqués individuellement avec 1 μCl (1 Cl = 37 Gbq) de ( 3H)Tdr et récoltés 16 heures plus tard. L'incorporation du (3H)Tdr a été mesurée en utilisant un compteur à scintillation liquide (Rac Beta 121 1/1212 LKB, Finlande). 8. Marquage au phosphate et îmmunomprécipitations
On a effectué le marquage au phosphore de la manière suivante. On a lavé deux fois des cellules T clonées dans un milieu dépourvu de phosphate contenant 5% de sérum AB humain dialyse et on les a ensuite incubées dans le même milieu à 50x106 cellules dans 1 ml pendant 30 minutes, à 37°C.
Ensuite, on a ajouté 1 mCi d'acide [ 32P]-orthophosphorique.
Après 3 heures de marquage, on a lavé les cellules deux fois dans du PBS avant leur lyse dans 2-3 ml de tampon contenant 10 mM de Tris, pH 8,2, contenant 1 % de NP-40, 150 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA, 1 mg/ml de BSA,
10 mM de NaF, 1 mM de PMSF et 10 mM d'iodoacétamide. Les immunoprécipitations et l'anaiyse par SDS-PAGE ont été pratiqués comme décrits (25).
9. Mesures de Ca2+ .
On a mesuré la concentration intracellulaire du Ca2+ comme décrit précédemment (26). En bref, on a lavé deux fois des cellules de Jurkat dans un milieu contenant 25 mM d'HEPES (pH 7,2), 125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de Na2HPO4, 1 mM de Ca Cl2, 0,5 mM de MgCl2, et 1 % de glucose (toutesles incubations et les lavages ultérieurs ont été pratiqués dans le même milieu) et on les a remises en suspension à 30x106 cellules/ml en présence de 3 μM de Fura 2-AM (Calbiochem, meudon,
France) pendant 30 minutes à 37°C dans l'obscurité. Après cette période d'incubation, on a dilué vingt fois la suspension cellulaire et on l'a incubée pendant 30 minutes supplémentaires dans les mêmes conditions. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois et remises en suspension à 2x 106 cellules/ml dans une cuvette à 37°C pour les mesures de Ca2+ .
II. RESULTATS A) ETUDE DE L'Acm BB18
Dans une tentative pour définir les glycoprotéines de surface cellulaire spécifiques de l'activation, on a, selon l'invention, utilisé des Acm obtenus par immunisations répétées avec des clones de cellules T humaines hautement fonctionnelles (21 ). En particulier, on a initialement identifié sur le clone dénommé B12(22) de cellules T de thymus humain un Acm. dénommé BB18, reconnaissant un nouveau dimère à liaison disulfure composé de sous-unités de 150 ±10kDa. Cette structure qui est faiblement exprimée sur des lymphocytes normaux de sang périphérique, se retrouve rapidement fortement exprimée pendant l'activation.
A.1. Les Acm BB18 réagissent fortement avec les cellules T clonées et faiblement avec les cellules T humaines au repos par cytofluorométrie de flux.
Afin d'obtenir des anticorps monoclonaux définissant les étapes de l'activation du lymphocyte T, on a immunisé des souris Balb/c âgées de six semaines avec des cellules thymiques clonées humaines (22). Un Acm de l'isotype IgGl, nommé BB18, a été ainsi isolé. Le Tableau 1 résume la réactivité de l'Acm susmentionné avec de nombreuses cellules humaines normales et hématopoïétiques malignes. La molécule reconnue par cet Acm est faiblement exprimée sur des cellules T au repos mais pas du tout sur des cellules B provenant du sang périphérique ou d'organes lympoïdes. Parmi les lignées cellulaires lymphoïdes leucémiques testées, toutes les cellules T étaient vivement marquées, tandis que les lignées cellulaires du lymphome de Burkitt n'étaient pas réactives. D'autres lignées cellulaires malignes telles que K562 (érythroleucémie), U937 (monocytique), HL60 (promeylocytique) ou SKNSH (neurobiastome) n'étaient pas réactives. En revanche, des cellules T activées de longue date (clones de cellules T IL2-dépendants) ou B (lignées cellulaires B EBV- transformées) se sont révélées positives avec cet Acm. De plus, le BB 18 marquait fortement la lignée YT de cellules tumorales NK, CD3 négatives activées et son mutant CD 25 négatif, YT2C2. La structure reconnue par BB18 apparaît comme fortement exprimée immédiatement après l'activation cellulaire comme le montre l'expérience cinétique représentative pratiquée avec des cellules mononucléaires du sang périphérique d'un individu normal stimulé avec de la PHA (Figure 1). L'accroissement précoce dans son expression s'est effectué en parallèle à celle du C25 pendant les premiers jours de l'activation de la cellule T, mais elle est restée persistante. Un accroissement similaire de la réactivité au BB18 a été aussi observé quand les lymphocytes du sang périphérique (PBL) étaient stimulés soit avec des cellules allogeniques, un Acm CD3, ou l'IL2 (données non présentées). Par conséquent, l'accroissement de la réactivité avec l'Anticorps BB18 définit clairement l'état d'activation chez les lymphocytes T. TABLEAU 1
Réactivité de l'Anticorps BB 18 avec des populations de celiules hématopoïétiques
Figure imgf000015_0001
a Réactivité déterminée par microfluorometrie de flux
b Toutes les cellules ont été faiblement marquées par de l'Acm BB 18 A.2. L'intensité de la réactivité avec l'Anticorps BB18 se trouve diminuée peu de temps après l'incubation avec du PMA.
Comme l'expression de plusieurs structures inductibles par activation est régulée positivement par le PMA, on a voulu déterminer si le PMA était capable d'augmenter rapidement la réactivité avec l'Anticorps BB18. De manière surprenante, après une incubation de 6 heures avec du PMA à 1 μg/ml, le marquage avec l'Anticorps BB18 n'était plus détectable. Comme on le montre dans l'expérience représentative présentée à la Figure 2, la réactivité des celuiles T au CD3, au CD4 et à l'Anticorps BB18 diminue lorsqu'on ajoute du PMA aux cultures. Plus précisément, après 6 heures avec du PMA, la régulation négative de la molécule réagissant avec l'Anticorps BB 18 est maximale tandis qu'une fraction importante des cellules avait perdu l'expression du CD4. La modulation de la molécule CD3 atteint son maximum après 24 heures tandis que la modulation du CD4 est achevée dès après 10 heures. En revanche, comme on l'a rapporté précédemment après 24 heures de culture en présence de PMA, le CD25 est induit et l'expression de CD8 n'est pas modifiée par ce traitement. A.3. Analyse biochimique de la molécule immunoprécipitée par l'Acm BB18 après marquage de la surface cellulaire.
Afin de définir la molécule identifiée par l'Acm BB18, des clones de cellules T humaines ont été marqués avec de l'Iode 125 sur leur face externe, selon la méthode à la lactopéroxydase, et iysés. Les immunoprécipités au BB 18 obtenus à partir de ces lysats de cellules marquées ont été ensuite analysés par SDS-PAGE. L'autoradiographie montrée à la Figure 3 indique que l'Acm BB18 immunoprécipite, à partir d'un clone de cellules T représentatif. Une bande prédominante migrant sous des conditions non-réductrices avec une Masse moléculaire d'approximativement 300 kDa. Des Acm CD18"M232" utilisés comme contrôle immunoprécipitent trois bandes de protéines à partir du même lysat caractéristiques des molécules CD 18 et de deux différentes molécules CD 11, tandis qu'aucune bande de protéine n'est obtenue avec un Acm inapproprié de type IgGl. De plus, comme on le montre à la Figure 4, l'immunoprécipité obtenu avec l'Anticorps BB18 consiste principalement en homodimères liés par des ponts disulfures d'environ 300 kDa dans la première dimension non-réductrice, qui se résoud dans une seconde dimension réductrice en une bande protéique prédominante d'environ 150 kDa en dessous de la diagonale du gel à deux dimensions.
4. Une stimulation avec des Acm BB18 solubles induit une prolifération des LSP en présence d'une concentration submitogénique de PMA.
Il a été montré précédemment que la stimulation de certaines molécules de surface, avec leur anticorps agoniste, en conjonction avec du PMA, induit une prolifération des lymphocytes T (24, 25, 26). Par conséquent, on a testé la possibilité que la prolifération cellulaire puisse être induite par des doses submitogéniques de PMA et des Acm BB18 purifiés. Les résultats d'une expérience représentative de cinétique, montrés à la Figure 5, indiquent que des Acm BB18, utilisés soit à 5 soit à 10 μg/ml avec 0,2 ng/ml de PMA, induisent une forte réponse proliférative sur des PBMC fraîchement isolées atteignant un pic au jour 4. Dans des conditions expérimentales similaires, un Acm CD 1"L404" d'isotype identique s'est avéré incapable de déclencher une prolifération de lymphocytes, tandis qu'ainsi qu'on l'a rapporté précédemment, un Acm CD3 stimule vigoureusement la prolifération cellulaire.
On a donc identifié une nouvelle structure de surface de cellule Jymphocytaire humaine avec l'Acm dénommé BB 18. La molécule îmmunoprécipitée en utilisant le BB18, à partir de lysats de lymphocytes T clones marqués en surface est apparue comme étant un homodimère lié par des ponts disulfures comprenant des sous-unités d'environ 150kDa. Cette structure est faiblement détectable sur des lymphocytes T de sang périphérique au repos, tandis que son expression augmente rapidement après l'activation de la cellule T et se maintient à ce niveau élevé pendant un certain temps après le déclenchement initial. Au surplus, l'Anticorps BB18 réagit vivement avec toutes les cellules T clonées testées quel que soit leur phénotype CD4/CD8 et leur TcR (données non présentées). La distribution cellulaire indique que l'Acm BB18 ne réagit pas avec des cellules B au repos, tandis que des cellules B EBV-transformées de longue date sont faiblement marquées. En revanche, des lignées cellulaires de lymphome de Burkit (Daudi et Namalva) manquent clairement de réactivité. Qui plus est, des lignées cellulaires lymphoïdes leucémiques mais pas myélomonocytiques sont réactives au BB18. La distributnon cellulaire, ainsi que l'analyse biochimique de la structure reconnue par BB18, ont établi que cette molécule est différente de toutes les structures de surface de leucocytes précédemment connues.
Les fonctions d'autres molécules de surface, telles que LFA-1, CD4 et CD8 ont été démontrées par la faculté de certains Acm spécifiques d'inhiber les activités tueuses naturelles ou cytotoxiques des lymphocytes T. Les tentatives pour inhiber, avec un Acm BBI8 purifié, la fonction cytotoxique de lymphocytes allosensibilisées in vitro 6d., de lymphocytes T clones cytotoxiques ou de cellules NK. n'ont pas été couronnées de succès. Les résultats suggèrent que l'épitope reconnu par l'Acm BB18 n'est pas impliqué dans les fonctions cytotoxiques, pas plus que dans l'adhésion de l'effecteur à la cellule cible.
Le fait que des cocultures de PBMC avec des concentrations submitogéniques de PMA et de l'Acm BBI8 purifié aient eu pour résultat une réponse proliférative vigoureuse, atteignant un maximum au jour 4 est particulièrement intéressant. Néanmoins, la réponse comitogénique mesurée dans ces conditions expérimentales n'atteint pas la magnitude de la réponse observée avec un déclenchement au CD3. Il est à noter que les réactivités au CD3 et au BB18 diminuent toutes deux après incubation des LSP avec du PMA. Néanmoins, la cinétique de la diminution de réactivité est différente pour les deux structures.
Plusieurs molécules ont été décrites, lesquelles, une fois mises en réaction avec un Acm agoniste dans des conditions appropriées, sont capables de transduction de signaux comitogéniques avec du PMA. La molécule CD28, un homodimère de 44 kDa à ponts disulfure, exprimé de manière préférentielle sur une sous-population de cellule T, a été la première structure décrite induisant des signaux costimulateurs (25, 26). Il a été montré que l'effet s'exerce par régulation de la stabilité de l'ARNm codant pour les lymphokines (27). D'autres exemples de molécules médiatrices de signaux costimulateurs incluent la molécule CD26 (4, 5), identifiant la dipeptidylpeptidase IV, qui est une structure de 120 kDa ; CD69, un hétérodimère d'activation très précoce à ponts disulfure, de 28, 32 kDa ( 17, 18) ; la molécule spécifique de la cellule T identifiée par l'Acm 10D 1, qui est un homodimère à ponts disulfure de 90 kDa (28) ; CD60"UM4D4" reconnaissant une structure hydrocarbonée exprimée sur divers gangliosides (29). Les Acm CD43 sont particulièrement intéressants, identifiant une glycoprotéine fortement sialylée de 95 kDa, laquelle de manière similaire aux Acm CD3 et CD2 peut directement déclencher l'activation des cellules T en présence de monocytes. Il a été rapporté récemment qu'un anticorps monoclonal réagissant avec CD5, à la différence de l'Acm du CD5 précédemment décrit, était capable d'induire une prolifération de cellules T en présence de monocytes (15). Cela a évoqué la possibilité que seuls certains épitopes de la molécule CD5, comme dans le cas de la CD2, soient impliqués dans l'activation des cellules T. Finalement, il convient de mentionner que, contrairement à l'épitope reconnu par l'Anticorps BB18, l'expression de surface de la majorité des structures de transduction du signal n'est pas augmentée durant l'activation de la cellule.
Bien que des cellules T humaines puissent être activées par le biais de plusieurs molécules de surface distinctes, ces voies d'activation semblent partager des mécanismes de transduction de signal communs. Il est bien connu que l'activation de la cellule T via CD2 ou CD5, mais non pas via CD43 ( 16) est dépendante de l'expression de CD3-TcR. Bien qu'aucun lien physique de la molécule BB18 avec le CD3-TcR n'ait été démontré selon l'invention, (l'Acm a marqué les lymphocytes YT2C2 CD3-TcR négatifs), des liens sont possibles avec des composants tels que la chaîne du CD3.
Figure imgf000019_0001
B) ETUDE DE L'ANTICORPS BD16
B.1. Les Acm BD 16 et BB 18 reconnaissent une structure identique sur les cellules T humaines
Afin d'obtenir des anticorps monoclonaux définissant les étapes de l'activation du lymphocyte T, on a immunisé de manière répétée des souris Balb/c âgées de 6 semaines avec des cellules thymiques clonées humaines (22). On a rapporté ci-dessus qu'un Acm de l'isotype IgGl, nommé BB18, reconnaissait une molécule exprimée à un niveau faible sur des cellules T au repos, mais pas du tout sur des cellules B ou des monocytes du sang périphérique ou des organes lymphoïdes. De plus, la structure identifiée par BB18 est apparue comme fortement exprimée immédiatement après l'activation cellulaire. Ensuite, dans une fusion différente, on a isolé un second Acm, nommé BD16, présentant un motif de réactivité similaire dans des études d'immunofluorescence et immunoprécipitant une structure dimérique à ponts disulfure de 300 kDa provenant de la surface de la cellule T. Afin de déterminer si BB18 et BD 16 identifiaient la même structure, on a pratiqué une analyse biochimique supplémentaire de la molécule immunoprécipitée par les deux Acm après le marquage de la surface cellulaire. Des clones de cellules T humaines ont été marqués sur leur surface externe, selon la méthode à la lactopéroxydase, et lysés. Les immunoprécipités de BB18 et BD16 obtenus à partir de ces lysats de cellules marqués ont reçu un traitement ou un traitement simulé avec de l'endo-F avant d'être analysés dans des conditions réductrices par SDS-PAGE. La Figure 6 représente une autoradiographie révélant une bande identique d'approximativement 120 kDa dans les deux immunoprécipités traités à l'endo-F, tandis que la bande caractéristique de 150 kDa a été obtenue avec les échantillons ayant reçu un traitement simulé. Ces résultats ont fortement indiqué que les deux Acm réagissaient avec une structure identique de la surface cellulaire. Une preuve supplémentaire a été obtenue après digestion par la protease V8 de la bande de 150 kDa imunoprécipité au BB18 et au BD16, isolée à partir d'un gel one-D. Les résultats, présentés à la Figure 7, ont révélé que BB18 et BD 16 étaient scindés en trois polypeptides principaux, ce qui a résulté en un motif de bandes identiques après la digestion à la protease V8.
B.2. La structure de surface identifiée par les Acm BD 16 et BB18 subit une régulation négative sur des PBL lors d'une préincubation avec BB18
Afin de déterminer si l'expression de la structure réactive avec les Acm BB18 BD 16 était modifiée par une interaction avec ces Acm, on a incubé des PBL pendant des périodes variables avec des concenrations saturantes soit de l'Acm, soit d'un IgGl non pertinent comme témoin. La Figure 8 montre qu'après 8 heures d'incubation avec un Acm BB18, la structure réactive avec BB18 ou BD16 n'était plus détectée par un Acm biotinyié BB18 ou BD 16. L'utilisation d'une Ig anti-souris de chèvre marquée au FITC a révélé que l'Acm BB18 n'était pas présent à la surface cellulaire des cellules préincubées avec l'Acm BB18 et ne pouvait pas être responsable du manque de réactivité du BB18 biotinyié. On notera que la modulation de la molécule réactive pour ieBB18 n'a pas modifié la réactivité d'un Acm CD 18"M232" vis-à-vis des cellules traitées. La même figure indique qu'une préincubation des PBL avec des concentrations saturantes de BD16 n'a produit qu'une modulation partielle de la molécule réactive au BD 16/BD 18, même après 24 heures de préincubation. De plus, les résultats présentés à la Figure 8 ont suggéré que 3B18 et BD16 pouvaient identifier des épitopes distincts d'une structure de surface identique. L'Acm BB18 biotinyié a marqué un nombre de cellules comparable à celui des cellules marquées par l'immunoglobuline anti-souris de chèvre (GAM) marquée au FITC après 24 heures de pré-incubation des cellules avec l'Acm BD16, tandis que la fixation de l'Acm BD16 était complètement inhibée. Pour confirmer le fait que les deux Acm identifiaient des épitopes distincts, nous avons pratiqué une expérience supplémentaire, dans des conditions qui empêchaient une régulation négative de la structure de surfacecellulaire réactive au BB18 (Figure 9). Alors qu'une quantité saturante de BB18 a inhibé la fixation du BB 18 biotinyié et pas celle du BD16 biotinyié, sur les PBL, une quantité saturante de BD16 n'a pas empêché la fixation de BB18 biotinyié. Pris ensemble, ces résultats indiquent que BB18 et BD16 identifient deux épitopes distincts de la même structure de la surface lymphocitaire.
B.3. La molécule de surface cellulaire de 150 kDa réactive aux Acm BB18 et BD16 est une phosphoprotéine et l'Acm BD16 coprécipite une structure phosphorylée de 100 kDa.
On a pratiqué une caractérisation biochimique supplémentaire de la structure réactive au BB 18 et au BD16 après marquage métabolique au 32 P de cellules T clonées. Dans des conditions non réductrices, on a obtenu une bande unique de 300 kDa pour les deux immunoprécipités (Figure 10), et dans des conditions réductrices, on a détecté une bande principale phosphoprotéique de 150 kDa (Figure 10 et Figure 1 1 , partie gauche). Cette protéine a migré à exactement la même masse moléculaire apparente que les bandes protéiques de 150 kDa observées après le marquage de la surface cellulaire (Figure 1 1, partie droite). On notera qu'on a observé régulièrement une bande phosphorylée supplémentaire de 100 kDa seulement dans les immunoprécipités au BD16 en conditions réductrices (Figure 10, partie droite et Figure 11, partie gauche). On n'a jamais observé cette bande supplémentaire dans les immunoprécipités de BD 16 provenant de lysats de cellules marquées à seule face externe. Au surplus, la découverte du fait que cette bande phosphorylée de 100 kDa n'était pas visible dans les immunoprécipités de BD16 analysés dans des conditions non-réductrices (Figure 10, partie gauche), suggère que cette bande supplémentaire formait des multimères de masse moléculaire plus élevée n'entrant pas dans le gel.
B.4. L'Acm BB 18, à la différence de l'Acm BD 16, induit une mobilisation du calcium intracytoplasmique faible mais significative dans les cellules de Jurkat
On a précédemment rapporté que l'Acm BB18 déclenchait une prolifération des PBL lorsqu'on utilisait en conjonction avec des doses submitogéniques de PMA (30). Dans des conditions expérimentales similaires, l'Acm BD 16 n'est pas parvenu à activer les PBL (données non présentées). Afin d'explorer les différences possibles de signalisation biochimique responsables de ces résultats contrastés, on a mesuré les concentrations intracellulaires en Ca2+ après incubation de la lignée cellulaire T Jurkat avec un Acm purifié BB18 ou BD 16. Les résultats d'une expérience représentative sont présentés à la Figure 13 et indiquent qu'on a obtenu une augmentation faible mais reproductible de la concentration en Ca2+ intracellulaire seulement avec l'Acm BB18. De plus, une addition ultérieure d'Acm CD3 purifié après l'Acm BB18 a résulté en la mobilisation rapide attendue de Ca2+ (Figure 12, courbe a). Il est à noter que la mobilisation de Ca induite par l'Acm CD3 après l'incubation au BD 16 (Figure 12, courbe b) avait régulièrement une magnitude inférieure à celle obtenue après le déclenchement au BB18. La réticulation de l'Acm avec un antisérum anti-souris de lapin n'a pas modifié le résultat. B.5. La prolifération des PBL induite par le CD3 est inhibée par l'Acm BD 16 mais pas par l'Acm BB18.
Afin d'étudier plus avant la différence entre les rôles joués par l'intermédiaire des deux épitopes reconnus par les Acm BB18 et BD 16, on a étudié leur effet sur la réponse proliférative des PBL à un Acm CD3 "OKT3" soluble ou immobilisé. Comme on l'indique au Tableau 2, on a obtenu une réponse proliférative très forte des PBL avec l'Acm CD3 immobilisé sur du plastique, avec un pic de réponse le jour 4, tandis que la réponse des LSP à l'Acm soluble CD3 "OKT3" était d'une magnitude plus faible. Dans cette expérience cinétique représentative, l'Acm BB18 n'a pas modifié la réponse proliférative des PBL à l'AcmCD3, qu'il soit sous forme soluble ou immobilisé. Par contre, la présence d'Acm BD 16 purifié dans la culture a induit une forte inhibition des réponses proliferatives induites par le CD3. On a observé cette inhibition à tous les points de mesure aussi bien dans le cas d'une prolifération induite par un CD3 soluble qu'immobilisé, et elle représentait approximativement une inhibition de 50%.
B.6. La prolifération des PBL induite par le CD2 est fortement accrue par l'Acm BD 16 mais pas par l'Acm BB18.
En plus de l'Acm CD3, on a montré que certaines paires d'Acm CD2 étaient fortement comitogènes pour les LSP. Cet effet se manifeste en présence de nombres variables de cellules accessoires (31). On a testé les effets fonctionnels des Acm BB18 et BD 16 sur une prolifération de LSP induite par le CD2. La Figure 13 montre qu'après le pic de prolifération attendu en réponse à DC2X1 1 et D66 au jour 4, la réponse a décru très vite aux jours 5 et 6 (31). Dans cette expérience cinétique représentative, l'Acm BB 18 n'a pas modifié la cinétique de la réponse proliférative des PBL. De façon surprenante, en présence d'Acm BD 16 purifié dans la culture, la réponse proliférative maximale a été prolongée jusqu'au jour 5, et a diminué ensuite. Cela a résulté en un doublement de la cpm au jour 5. Enfin, cette réponse proliférative au CD2 prolongée, induite par l'Acm BD 16, a été observée indépendamment de la paire d'Acm CD2 utilisée. Comme on l'indique au Tableau 3, au jour 5 de la culture, quand les réponses proliferatives à diverses paires de CD2 déclinaient, l'Acm BD 16 a induit une prolifération accrue avec chacune des combinaisons de CD2. A nouveau, on notera que cet effet d'amplification a été limité à l'Acm BD16 et n'a pas été observé avec l'Acm BB18 ou avec des Acm CD2 solitaires (données non présentées).
TABLEAU 2
L'Acm BD 16 inhibe la prolifération de PBL induite par le CD3
Figure imgf000024_0001
On a incubé des PBL fraîchement isolés pendant diverses durées avec ou sans Acm, ainsi que cela a été décrit dans la section "Matériel et Méthodes". Les Acm BB18, BD 16 et CD3 solubles et purifiés ont été utilisés à des concentrations finales de 5 μg/ml.
* cpm incorporé par PBL. Les résultats sont exprimés comme la moyenne d'échantillons triplés pour lesquels le ESM a toujours été inférieur à 10% de la moyenne. TABLEAU 3
L'Acm BD 16 accroît la réponse proliférative des PBL à diverses paires de
CD2
Figure imgf000025_0001
Les PBL ont été cultivées 5 jours dans le milieu, des Acm CD2 seuls avec ou sans BB18 ou BD16 comme témoin (résultats non exposés) ou une combinaison des Acm CD2 avec ou sans Acm BB18 ou BD16. Une prolifération significative n'a été observée que dans les puits contenant des paires d'Acm CD2. Les Acm CD2 ont été utilisées sous forme de fluide d'ascites dilués, alors que BB18 et BD16 étaient des Acm purifiés utilisés à des concentrations finales de 5 μg/ml.
* cpm incorporé par PBL. Les résultats sont exprimés comme la moyenne d'échantillons triplés pour lesquels le ESM a toujours été inférieur à 10% de la moyenne.
DEPOT DES ANTICORPS
Les lignées de cellules d'hybridomes produisant les anticorps
BD16 et BB18 ont été déposées à l'European Collection of Animal Cell
Cultures (Porton Down, Salisbury, Wiltstrive SP4 03G, England), le 7 janvier
1992 et ont reçu les numéros 92010801 pour l'anticorps BD16 et 92010802 pour l'anticorps BB18.
Les lignées de cellules d'hybridomes produisant les anticorps
BM4, BM 71 et BM63 ont été déposées à 1" European Collection of Animal
Cell Cultures (Porton Down, Salisbury, Wiltstrive SP4 03G, England) le 12 janvier 1993 et ont reçu les numéros 93 01 1201 pour BM4, 93 01 1202 pour BM71 et 93 01 1203 pour BM 63.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Protéine antigénique consistant en une glycoprotéine phosphorylée de poids moléculaire de 150 ± 10kDa déterminé par electrophorese de type SDS PAGE dans des conditions réductrices, exprimée à la surface des lymphocytes T de sang humain de préférence activés.
2. Protéine antigénique sous forme d'un homo-dimère à liaison disulfure de poids moléculaire de 300 ± 20kDa déterminé par electrophorese de type SDS PAGE dans des conditions non réductrices, exprimée à la surface de lymphocytes T de sang humain de préférence activés, composée de sous-unités selon la revendication 1.
3. Dérivé d'une protéine selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il s'agit de la protéine ou un fragment comportant les sites antigéniques essentiels de la protéine, sous forme glycosylée ou non glycosylée ou comportant des glycosylations non naturelles.
4. Dérivé d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'il s'agit de ia protéine ou un fragment de celle-ci comportant les sites antigéniques essentiels, sous forme phosphorylée ou non phosphorylée ou comportant des phosphorylations non naturelles.
5. Protéine ou dérivé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce qu'elle comporte un marquage permettant son dosage in vitro ou sa localisation in vivo ou ex-vivo.
6. Anticorps dirigé contre la protéine selon l'une des revendications I à 5.
7. Anticorps monoclonal reconnaissant un épitope d'une protéine selon l'une des revendications 1 à 5.
8. Anticorps selon la revendication 6 ou 7 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une immunoglobuline de sous-classe IgG1.
9. Anticorps selon l'une des revendications 6 à 8 caractérisé en ce qu'il est produit par une lignée de cellules d'hybridome déposée à l'ECACC sous le numéro 92010801 pour l'anticorps BD 16.
10. Anticorps selon l'une des revendications 6 à 8 caractérisé en ce qu'il est produit par une lignée de cellules d'hybridome déposée à l'ECACC sous le numéro 92010802 pour l'anticorps BB18.
1 1. Anticorps selon l'une des revendications 6 à 8 caractérisé en ce qu'il est produit par une lignée de cellules d'hybridome déposée à l'ECACC sous le numéro 93 01 1201 pour l'anticorps BM4.
12. Anticorps selon l'une des revendications 6 à 8 caractérisé en ce qu'il est produit par une lignée de cellules d'hybridome déposée à l'ECACC sous le numéro 93 01 1202 pour l'anticorps BM71.
13. Anticorps selon l'une des revendications 6 à 8 caractérisé en ce qu'il est produit par une lignée de cellules d'hybridome déposée à l'ECACC sous le numéro 93 01 1203 pour l'anticorps BM63.
14. Anticorps selon l'une des revendications 5 à 13 caractérisé en ce qu'il comporte un marquage permettant son dosage in vitro ou sa localisation in vivo ou ex-vivo.
15. Lignée de cellules d'hybridome, caractérisée en ce qu'elle est capable de produire l'anticorps monoclonal selon l'une des revendications 6 à 14.
16. Utilisation d'un anticorps monoclonal selon les revendications 9 à 13 pour immunoprécipiter des protéines selon les revendications 1 ou 2.
17. Kit de diagnostic comportant une protéine ou un des anticorps selon l'une des revendications 1 à 14.
18. Utilisation d'une protéine ou d'un anticorps selon l'une des revendications 1 à 14 pour le diagnostic rapide d'un état d'activation précoce des cellules T lymphocytaires.
19. Médicament comportant, à titre de principe actif, une protéine ou un anticorps ou leurs fragments selon l'une des revendications 1 à 14.
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