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WO1993023549A2 - Acide nucleique correspondant a un gene du chromosome 22 implique dans les translocations chromosomiques recurrentes associees au developpement de tumeurs cancereuses - Google Patents

Acide nucleique correspondant a un gene du chromosome 22 implique dans les translocations chromosomiques recurrentes associees au developpement de tumeurs cancereuses Download PDF

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WO1993023549A2
WO1993023549A2 PCT/FR1993/000494 FR9300494W WO9323549A2 WO 1993023549 A2 WO1993023549 A2 WO 1993023549A2 FR 9300494 W FR9300494 W FR 9300494W WO 9323549 A2 WO9323549 A2 WO 9323549A2
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gene
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ews
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Alain Aurias
Olivier Delattre
Chantal Desmaze
Thomas Melot
Martine Peter
Béatrice PLOUGASTEL
Gilles Thomas
Jessica Zucman
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid comprising all or part of the nucleic sequence of a gene from chromosome 22 involved in the
  • the invention also relates to hybrid nucleic acids corresponding to the fusion products resulting from the chromosomal translocations in which is engaged
  • the invention relates more particularly to a nucleic acid comprising all or part of the nucleic sequence of the gene for chromosome 22 involved in recurrent chromosomal translocations
  • the invention also relates to mRNAs.
  • the invention also relates to the detection of the gene for chromosome 22 involved in
  • the invention also relates to the detection, for the same purposes, of the products for which these genes encode as well as the products and reagents for the implementation of these methods.
  • Chromosomal recurrent trans locations constitute a mechanism for activating oncogenes and are therefore involved in the appearance of numerous pathogenic tumors (Solomon E, Borrow J, Goddard A D, Science 254, 1153-1160; (1991)).
  • the so-called "small round cell" tumors constitute a group of heterogeneous cancers.
  • An accurate diagnosis of these tumors is essential to correctly choose the therapeutic protocol to be used to treat them.
  • a subset of these tumors carries a chromosomal translocation t (ll; 22) (q24; 12) and is sensitive to the same therapeutic protocol.
  • Ewing's sarcoma is the second most common bone tumor in children. Despite the absence of a morphological marker, Ewing's Sarcoma cells occasionally express antigens or can cause the expression of morphological figures characteristic of neural differentiation (Lipins y M, Braham K, Philip I et al, Cancer Res. 47, 183-187 (1987); Cavazzana AO, Miser JS, Jefferson J, Triche TJ, Am. J. Pathol. 127, 507-518 (1987)).
  • the techniques for diagnosing tumors with small round cells use conventional methods of pathology and cytology, and therefore constitute an exclusion diagnosis which is not completely reliable.
  • Ewing's Sarcoma has been linked to a subtype of Peripheral Primary Neuroectodermal Tumors (PNET) called Peripheral Neuroepithelioma (PN).
  • PNET Peripheral Primary Neuroectodermal Tumors
  • Ewing's sarcoma and Peripheral Neuroepithelioma share a chromosomal translocation t (11; 22) (q24; ql2) very specific and cytogenetically identical (Aurias A, Rimbaut C, Buffe C, Dubousset J, Mazabraud A, N. Engl. J. Med. 309, 496-497 (1983); Turc-Carel C, Philip I, Berger MP, Philip T, Lenoir GM, N. Engl. J. Med. 309, 497-498, (1983); hang Peng J, Triche TJ, Knutsen T, Miser J, Douglass EC, Israel MA, N. Engl. J. Med.
  • the gene for chromosome 22 involved in the translocation t (ll; 22), named Ews, has been isolated and its cDNA sequenced; the protein sequence for which it codes has been deduced from the cDNA sequence; the Ews gene comprises a region called EWSR1 of approximately 7 Kb at the level of which the break point of chromosome 22 is located.
  • the gene for chromosome 11 involved in the translocation t (ll; 22), called Hum-Fli-1, has been isolated and its cDNA sequence; the protein sequence for which it codes has been deduced from the cDNA sequence; the Hum-Fli-1 gene comprises a region called EWSR2 of approximately 40 Kb at which the break point of chromosome 11 is located.
  • the inventors confirmed the strong homology of the Hum-Fli-1 gene with the genes of the Ets family and more particularly with the murine gene Fli-1 (Baud V et al., Genomics vol. 11, 223-224, 1991; Ben-David Y et al., Genes & Development vol. 5, no. 6, 1991).
  • the inventors have also shown that in approximately 12% of cases of Ewing's sarcoma, the Ews gene of chromosome 22 fuses with the Erg gene carried by chromosome 21. Which Erg gene is also part of the family of transcription factors Ets .
  • Malignant soft tissue melanoma is a serious tumor most often developing in the tendons and aponeuroses in subjects aged 15 to 35 years (Chung EB, Enzinger FM, Am. J. Surg. Pathol. 7, 405- 413, 1983; Epstein L, Martin AO, Kempson R, Cancer Res. 44, 1265-1274, 1984).
  • the MMSP presents several common phenotypic figures with malignant skin melanomas, the translocation t (12; 22) (ql3; 12) is specific for this type of tumor (Mitelman F, Catalog of Chromosom Aberrations in Cancer, New York: Alan R. Liss, 1988).
  • the invention therefore relates to a nucleic acid comprising all or part of the nucleic sequence of the Ews gene of chromosomes 22, located at the breakpoint of this chromosome in various recurrent chromosomal translocations associated with the development of cancerous tumors.
  • the invention also relates to the hybrid DNAs resulting from the fusion of the Ews gene with other genes during recurrent chromosomal translocations involving chromosome 22, consisting essentially of part of the nucleotide sequence of the Ews gene and part of the nucleotide sequence of the gene located at the break point of the other chromosome involved in translocation.
  • the invention relates to hybrid DNAs essentially comprising the part of the nucleotide sequence of the Ews gene up to the region of 7 Kb at the level of which the breakpoint of chromosome 22 is located.
  • the invention relates more particularly to those resulting from chromosomal translocation following: - t (ll; 22) (q24; ql2), associated with at least 80% of cases of Ewing's sarcoma or related tumors;
  • the invention also relates to mRNAs derived from DNA of the chromosome 22 gene and fusion DNAs, as well as cDNAs which may be derived therefrom.
  • the subject of the invention is therefore the hybrid DNAs, resulting from the translocation t (11; 22) (q24; ql2), constituted essentially by the fusion of part of the nucleotide sequence of the gene
  • the invention relates to hybrid DNAs comprising the part of the nucleotide sequence of the Hum-Fli-1 gene located at the break point of chromosome 11 in said translocation. More specifically, the invention relates to hybrid DNAs comprising the part of the nucleotide sequence of the
  • the hybrid DNAs according to the invention corresponding to the fusion products resulting from the recurrent chromosomal translocation t consist essentially of a part of the nucleotide sequence of the cDNA of the Ews gene, and more precisely the nucleotide sequence of a cDNA resulting from the fusion of the Ews and Hum-Fli-1 genes.
  • Nucleotide probes or their counterparts capable of hybridizing with all or part of the nucleotide sequence of the Ews or Hum-Fli-1 genes or with the cDNA of one of these genes have been prepared. Among these, probes capable of specifically hybridizing with part of the Ews gene or part of the Hum-Fli-1 gene were selected.
  • Complementary probes of all or part of the hybrid DNAs corresponding in particular to the part of the Ews and Hum-Fli-1 genes altered by the translocation t (ll; 22), or also with the mRNA or cDNA of the fusion genes , were also obtained with a view to detecting, by hybridization, in the tumor cells of a subject, the possible presence of a translocation t (ll; 22).
  • Synthetic oligonucleotides were prepared from the nucleotide sequences of the Ews, Hum-Fli-1 genes and products resulting from the fusion of these two genes, in order to prepare by transcription reverse mRNA from a sample to be analyzed, the cDNA corresponding to the fusion zone.
  • the in vitro gene amplification of this cDNA by PCR, using priming oligonucleotides, allows the analysis of the products amplified by simple radioactive or colorimetric methods of the gel electrophoresis type and staining with ethidium bromide, or immunological or fluorographic revelation.
  • the invention therefore relates to the nucleotide sequences, or their analogs, constituting genetic probes capable of hybridizing with the nucleotide sequence of the Ews gene or the hybrid DNAs resulting from the fusion of the Ews and Humfli-1 genes, or their MRNA and cDNA, as well as oligonucleotides derived from these sequences and constituting primers for the production of reverse transcription of RNA or the implementation of a gene amplification process by PCR.
  • the chromosomal translocation t (ll; 22) observed in neurectodermal tumors gives rise to hybrid fusion genes capable of coding for chimeric proteins which have conserved the N-terminal part of the EWS protein coded by the Ews gene and the C part terminal of the HUM-FLI-1 protein encoded by the Hum-Fli-1 gene.
  • NTD-EWS N-terminal part of the EWS protein
  • the amino acid sequence of the chimeric proteins can be deduced from the fusion cDNAs resulting from the translocation t (ll; 22); several of these proteins have been produced in vitro in particular in order to prepare polyclonal and monoclonal antibodies capable of binding with the cells producing these proteins and, consequently, having the translocation t (ll; 22).
  • the invention therefore also relates to the chimeric proteins resulting from the chromosomal translocation t (ll; 22), as well as the antibodies for the immunological detection of the presence of these proteins and more particularly of a chimeric protein in a biological sample originating from a subject likely to carry a chromosomal translocation t (ll; 22).
  • the invention also relates to methods of detecting a fusion gene resulting from the chromosomal translocation t (ll; 22).
  • a method for detecting such a gene comprises the following steps:
  • - the treatment of a biological sample coming from tumor cells of a patient likely to present a chromosomal translocation t (II; 22), so as to render the nucleic acids which it contains capable of hybridizing with a probe; - contacting at least one probe according to the specific invention, either of a part of the nucleotide sequence of the Ews gene, or of the nucleotide sequence of a fusion gene corresponding to the translocation t (ll; 22 ), with the biological sample, under conditions allowing the formation of complexes hybridization between the probe (s) and the target DNA or RNA contained in the sample;
  • a second embodiment of such a method aims to detect the transcript of a fusion gene resulting from the translocation t (ll; 22); this method consists, starting from the mRNA extracted from a biological sample originating from tumor cells of a patient likely to present a chromosomal translocation t (ll; 22), to effect a reverse transcription using an oligonucleotide adequate synthesis to obtain a corresponding cDNA; then amplifying said cDNA according to an enzymatic amplification process using DNA polymerase and suitable primers, known as PCR, consisting of repeating cycles of DNA denaturation, hybridization of primers and extension from the primers, a number of times sufficient to increase the amount of the starting sequence in an exponential proportion relative to the number of cycles used.
  • PCR suitable primers
  • the amplification products are analyzed for example by electrophoresis to detect the presence of a product corresponding to one or other of the genes involved in the translocation t (ll; 22) or to a fusion gene. Detection methods for products amplified by adsorption on microplates are also possible.
  • the invention also relates to the detection of a chimeric protein encoded by a fusion gene resulting from the translocation t (ll; 22).
  • a method comprises the following steps: - the treatment of a biological sample from r a patient whose tumor cells may enter near a trans chromosomal t rent (ll; 22), so as to make the proteins it contains accessible to antibodies;
  • DNA or fusion RNA or of a chimeric protein allows the diagnosis of Ewing's sarcoma and related tumors in subjects with tumors with small round cells.
  • the subject of the invention is therefore a method for diagnosing Ewing's sarcoma and related tumors, consisting of a biological sample from tumor cells of a patient capable of having a t (ll; 22 ), to be treated so as to make the nucleic acids that it contains r capable of hybridizing with a probe, to detect the presence of a translocation t (ll; 22) in the tumor cells.
  • Such a method comprises the following steps:
  • At least one probe of the invention optionally labeled, specific either for part of the nucleotide sequence of the Ews gene, or for the nucleotide sequence of a fusion gene corresponding to the translocation t ( ll; 22), with the biological sample treated in such a way that the cells it contains are lysed and possibly the nucleic acids contained in said cells are fragmented using restriction enzyme, under conditions allowing the formation of complexes hybridization between the probe (s) and the target DNA or RNA contained in the sample;
  • this process can be implemented in tests on a membrane or on a plate or on any other suitable support, according to dot blot or Southern blot methods or even filtration.
  • a method of diagnosing Ewing's sarcoma and related tumors consists of starting from the mRNA extracted from a biological sample originating from tumor cells of a patient capable of having a chromosomal translocation t (ll; 22), performing reverse transcription using a synthetic oligonucleotide suitable for obtaining a corresponding cDNA; then amplifying said cDNA according to an enzymatic amplification process using DNA polymerase and suitable primers, known as PCR, consisting of repeating cycles of DNA denaturation, hybridization of primers and extension from the primers, a number of times sufficient to increase the amount of the starting sequence in an exponential proportion relative to the number of cycles used.
  • the amplification products are analyzed for example by electrophoresis to detect the presence of a product corresponding to a fusion gene of the translocation t (ll; 22).
  • Product detection methods amplified by adsorption on microplates are also possible.
  • a method for diagnosing Ewing's sarcoma and related tumors consists, starting from a cell sample brought into contact with one or more antibodies of the invention specific for fusion proteins corresponding to the tranlocation t (ll; 22), to detect immun ⁇ logically the presence of at least one protein encoded by one or more fusion genes resulting from the translocation t (ll; 22).
  • Such a method comprises the following steps:
  • kits for implementing these methods can be prepared.
  • kits or kits contain, in the case of a hybridization process, probes according to the invention as well as samples of DNA or control RNA; in the case of a reverse transcription and PCR process, the oligonucleotides suitable for the implementation of each of these techniques, as well as control DNA or RNA samples; in the case of an immunological method, the monoclonal antibodies as well as control samples of known reactivity.
  • the invention also relates to the use of the DNA sequences of the invention for preparing antisense nucleotides, or the like, having anti-tumor activity; which by hybridization with all or part of the fusion gene inhibit its transcription and thus prevent the production of mRNA and chimeric proteins, and / or, in another embodiment, hybridizes with the transcribed mRNA and then inhibits the production of chimeric proteins.
  • the invention therefore relates to the use of a nucleic acid or an analogue of this nucleic acid capable of hybridizing with the nucleotide sequence of a hybrid DNA according to the invention for preparing a therapeutic agent inhibiting the expression of a fusion gene resulting from a chromosomal translocation t (ll; 22) (q24; ql2), in tumor cells of patients with Ewing's sarcoma or related tumors.
  • the invention therefore also relates to a therapeutic agent for inhibiting the expression of a fusion gene resulting from the chromosomal translocation t (ll; 22) (q24; ql2) in the tumor cells of patients with Ewing's sarcoma. or related tumors, characterized in that it is essentially constituted by a hybrid DNA according to the invention, or an analog of this DNA, capable of hybridizing with the nucleotide sequence of a fusion gene resulting from chromosomal translocation t (ll; 22) - (q24; ql2).
  • the invention relates to the use of a nucleic acid or an analog of this nucleic acid, capable of hybridizing with the nucleotide sequence of a hybrid RNA according to the invention to prepare a therapeutic agent inhibiting the translation of chimeric proteins resulting from a chromosomal translocation t (ll; 22 ) (q24; ql2), in the tumor cells of patients with Ewing's sarcoma or related tumors.
  • a nucleic acid or an analog of this nucleic acid capable of hybridizing with the nucleotide sequence of a hybrid RNA according to the invention to prepare a therapeutic agent inhibiting the translation of chimeric proteins resulting from a chromosomal translocation t (ll; 22 ) (q24; ql2), in the tumor cells of patients with Ewing's sarcoma or related tumors.
  • the invention therefore also relates to a therapeutic agent for inhibiting the translation of chimeric proteins resulting from the chromosomal trans location t (ll; 22) (q24; ql2) in the tumor cells of patients with Ewing's sarcoma or of tumors related, characterized in that it essentially consists of a hybrid RNA according to the invention, or an analog of this RNA, capable of hybridizing with the nucleotide sequence of RNA derived from a fusion gene resulting from the chromosomal translocation t (ll; 22) (q24; ql2).
  • the subject of the invention is also the hybrid DNAs resulting from the translocation t (21; 22) associated with approximately 10% of cases of Ewing's sarcoma or of related tumors, constituted essentially by the fusion of part of the nucleotide sequence of the Ews gene, and of the part of the nucleotide sequence of the Erg gene located at the breakpoint of chromosome 21 in this trans location. More specifically, the invention relates to hybrid DNAs comprising the part of the nucleotide sequence of the Erg gene from the region at which the break point of chromosome 21 is located up to its 3 ′ end.
  • the hybrid DNAs according to the invention corresponding to the fusion products resulting from the recurrent chromosomal translocation t (21; 22) consist essentially of a part of the nucleotide sequence of the cDNA of the Ews gene, and more precisely of the nucleotide sequence of a cDNA resulting from the fusion of the Ews and Erg genes.
  • Nucleotide probes or their counterparts capable of hybridizing with all or part of the nucleotide sequence of the Ews or Erg genes or with the cDNA of one of these genes have been prepared. Among these, probes capable of specifically hybridizing with part of the Ews gene or part of the Erg gene were selected. Complementary probes of all or part of the hybrid DNAs, corresponding in particular to the part of the Ews and Erg genes altered by the translocation t (21; 22), or also with the mRNA or cDNA of the fusion genes, have also been obtained in order to detect by hybridization, in the tumor cells of a subject, the possible presence of a translocation t (21; 22).
  • Synthetic oligonucleotides were prepared from the nucleotide sequences of the Ews, Erg genes and products resulting from the fusion of these two genes, in order to prepare, by reverse transcription of mRNA from a sample to be analyzed, the corresponding cDNA to the fusion zone.
  • the in vitro gene amplification of this cDNA by PCR, using priming oligonucleotides, allows the analysis of the products amplified by simple radioactive or colorimetric methods of the gel electrophoresis type and staining with ethidium bromide, or immunological or fluorographic revelation.
  • the invention therefore relates to nucleotide sequences, or their analogs, constituting genetic probes capable of hybridizing with the nucleotide sequence of the Ews gene or the hybrid DNAs resulting from the fusion of the Ews and Erg genes, or their mRNAs and cDNAs, as well as oligonucleotides derived from these sequences and constituting primers for the performing reverse RNA transcription or implementing a gene amplification process by PCR.
  • the chromosomal translocation t (21; 22) observed in neurectodermal tumors gives rise to hybrid fusion genes capable of coding for chimeric proteins which have conserved the N-terminal part of the EWS protein coded by the Ews gene and the C part terminal of the ERG protein encoded by the Erg gene.
  • the chimeric proteins resulting from the translocation t conserves the NTD-EWS domain, which is in phase with the binding domain of the ERG protein DNA.
  • the amino acid sequence of the chimeric proteins can be deduced from the fusion cDNAs resulting from the translocation t (21; 22); some of these proteins have been produced in vitro in particular in order to prepare polyclonal and monoclonal antibodies capable of binding with the cells producing these proteins and, consequently, having the translocation t (21; 22).
  • the invention therefore also relates to the chimeric proteins resulting from the chromosomal translocation t (21; 22), as well as the antibodies for the immunological detection of the presence of these proteins and more particularly of a chimeric protein in a biological sample originating from a subject likely to carry a chromosomal translocation t (21; 22).
  • the invention also relates to methods of detecting a fusion gene resulting from the chromosomal translocation t (21; 22).
  • a method for detecting such a gene comprises the following steps:
  • This process can be implemented in tests on a membrane or on a plate or on any other suitable support, according to dot blot or Southern blot or filtration methods.
  • a second embodiment of such a method aims to detect the transcript of a fusion gene resulting from the translocation t (21; 22); this method consists, starting from the mRNA extracted from a biological sample originating from tumor cells of a patient likely to present a chromosomal translocation t (21; 22), to effect a reverse transcription using an oligonucleotide adequate synthesis to obtain a corresponding cDNA; then to amplifying said cDNA according to an enzymatic amplification process using DNA polymerase and suitable primers, known as PCR, consisting in repeating cycles of DNA denaturation, hybridization of primers and extension from primers, a number of times sufficient to increase the amount of the starting sequence in an exponential proportion relative to the number of cycles used.
  • PCR DNA polymerase and suitable primers
  • the amplification products are analyzed for example by electrophoresis to detect the presence of a product corresponding to one or other of the genes involved in the translocation t (21; 22) or to a fusion gene. Detection methods for products amplified by adsorption on microplates are also possible.
  • the invention also relates to the detection of a chimeric protein encoded by a fusion gene resulting from the translocation t (21; 22). Such a method comprises the following steps:
  • the subject of the invention is therefore a method for diagnosing Ewing's sarcoma and related tumors, consisting in using a biological sample from tumor cells of a patient capable of exhibiting a chromosomal translocation t (21; 22 ), to be treated so as to render the nucleic acids which it contains capable of hybridizing with a probe, to detect the presence of a translocation t (21; 22) in the tumor cells.
  • Such a method comprises the following stages: contacting at least one probe of the invention, optionally labeled, specific either for part of the nucleotide sequence of the Ews gene, or for the nucleotide sequence of a gene resulting from the translocation t (21; 22), with the biological sample treated so that the cells it contains are lysed and possibly the nucleic acids contained in said cells are fragmented using restriction enzyme, under conditions allowing the formation of hybridization complexes between the probe (s) and the target DNA or RNA contained in the sample; the detection by any appropriate means of the hybrids possibly formed, in order to detect the presence of a product corresponding to the fusion gene resulting from the translocation t (21; 22).
  • a method of diagnosing Ewing's sarcoma and related tumors consists of starting from the mRNA extracted from a biological sample originating from tumor cells of a patient capable of having a chromosomal translocation t (21; 22), performing reverse transcription using a synthetic oligonucleotide suitable for obtaining a corresponding cDNA; then amplifying said cDNA according to an enzymatic amplification process using DNA polymerase and suitable primers, known as PCR, consisting of repeating cycles of DNA denaturation, hybridization of primers and extension from the primers, a number of times sufficient to increase the amount of the starting sequence in an exponential proportion relative to the number of cycles used.
  • the amplification products are analyzed for example by electrophoresis to detect the presence of a product corresponding to a fusion gene of the trans location t (21; 22). Detection methods for products amplified by adsorption on microplates are also possible.
  • a method for diagnosing Ewing's sarcoma and related tumors consists in detecting from a cellular sample brought into contact with one or more antibodies of the invention specific for fusion proteins immunologically the presence of at least one protein encoded by one or more fusion genes resulting from the translocation t (21; 22).
  • Such a method comprises the following steps:
  • translocation t (21; 22) being associated with approximately 10% of cases of Ewing's sarcoma and the translocation t (II; 22) being associated with at least 80% of cases of Ewing's sarcoma, it is advantageous, to make a diagnosis of Ewing's sarcoma to implement
  • kits or kits contain, in the case of a hybridization process, probes according to the invention as well as samples of DNA or control RNA; in the case of a reverse transcription and PCR process, the
  • the invention also relates to the use of the DNA sequences of the invention for preparing antisense nucleotides, or the like, having anti-tumor activity; which by hybridization with all or part of the fusion gene inhibits its transcription and thus prevents the production of mRNA and of chimeric proteins, and / or, in another embodiment, hybridizes with the transcribed mRNA and then inhibits the production of chimeric proteins.
  • the invention therefore relates to the use of a nucleic acid or an analogue of this nucleic acid capable of hybridizing with the nucleotide sequence of a hybrid DNA corresponding to the translocation t (21; 22) according to the invention for preparing a therapeutic agent inhibiting the expression of a fusion gene resulting from said translocation, in the tumor cells of patients suffering from Ewing's sarcoma or related tumors.
  • a subject of the invention is therefore also a therapeutic agent for inhibiting the expression of a fusion gene resulting from the chromosomal translocation t (21; 22) in the tumor cells of patients suffering from Ewing's sarcoma or related tumors, characterized in that it essentially consists of a hybrid DNA according to the invention corresponding to said translocation, or an analog of this DNA, capable of hybridizing with the nucleotide sequence of a fusion gene resulting from the chromosomal translocation t (21; 22).
  • the invention relates to the use of a nucleic acid or an analogue of this nucleic acid, capable of hybridizing with the nucleotide sequence of a hybrid RNA according to the invention corresponding to the translocation t (21; 22) to prepare an agent therapeutic inhibiting the translation of chimeric proteins resulting from such chromosomal translocation, in the tumor cells of patients suffering from Ewing's Sarcoma or related tumors.
  • a subject of the invention is therefore also a therapeutic agent for inhibiting the translation of chimeric proteins resulting from the chromosomal translocation t (21; 22) in the tumor cells of patients with Ewing's sarcoma or related tumors, characterized in that '' It essentially consists of a hybrid RNA according to the invention corresponding to the translocation t (21; 22), or an analogue of this RNA, capable of hybridizing with the nucleotide sequence of the RNA derived from a gene for fusion resulting from this chromosomal translocation.
  • the translocation t (21; 22) being associated with approximately 10% of cases of Ewing's sarcoma and the translocation t (ll; 22) being associated with at least 80% of cases of Ewing's sarcoma
  • the invention relates, advantageously, a therapeutic agent essentially consisting either of therapeutic agents inhibiting the expression of the fusion genes resulting from these two chromosomal translocations, or therapeutic agents inhibiting the translation of the fusion genes resulting from these two chromosomal translocations.
  • the subject of the invention is finally hybrid DNAs, resulting from the trans locat ion t (12; 22) (ql3; ql2), constituted essentially by the fusion of part of the nucleotide sequence of the gene
  • the invention relates to hybrid DNAs comprising the part of the nucleotide sequence of the Atf-1 gene from the region at which the breakpoint of chromosome 12 is located in this translocation to its 3 'end.
  • the inventors have studied in detail the mechanisms giving rise to the various fusion genes of the translocation t (ll; 22).
  • the hybrid DNAs according to the invention corresponding to the fusion products resulting from the recurrent chromosomal translocation t (12; 22), consist essentially of a part of the nucleotide sequence of the cDNA of the Ews gene, and more precisely the nucleotide sequence of a cDNA resulting from the fusion of the Ews and Atf-1 genes.
  • Nucleotide probes or their counterparts capable of hybridizing with all or part of the nucleotide sequence of the Ews or Hum-Fli-1 genes or with the cDNA of one of these genes have been prepared. Among these, probes capable of specifically hybridizing with part of the Ews gene or part of the Hum-Fli-1 gene were selected.
  • Complementary probes of all or part of the hybrid DNAs corresponding in particular to the part of the Ews and Atf-1 genes altered by the translocation t (12; 22), or also with the mRNA or cDNA of the fusion genes, have also obtained in order to detect by hybridization, in the tumor cells of a subject, the possible presence of a translocation t (12; 22).
  • Synthetic oligonucleotides were prepared from the nucleotide sequences of the Ews, Atf-1 genes and products resulting from the fusion of these two genes, in order to prepare by reverse transcription of mRNA from a sample to be analyzed, the CDNA corresponding to the fusion zone.
  • the in vitro gene amplification of this cDNA by PCR, using priming oligonucleotides, allows the analysis of products amplified by simple radioactive or colorimetric methods such as gel electrophoresis and staining with ethidium bromide, or immunological or fluorographic revealing.
  • the invention therefore relates to the nucleotide sequences, or their analogs, constituting genetic probes capable of hybridizing with the nucleotide sequence of the Ews gene or the hybrid DNAs resulting from the fusion of the Ews and Atf-1 genes, or their mRNAs and CDNA, as well as oligonucleotides derived from these sequences and constituting primers for carrying out reverse transcription of RNA or implementing a gene amplification process by PCR.
  • MMSP malignant melanoma of the soft parts
  • the amino acid sequence of the chimeric proteins can be deduced from the fusion cDNAs resulting from the translocation t (12; 22); one of these proteins was produced in vitro in particular in order to prepare polyclonal and monoclonal antibodies capable of binding with the cells producing this protein and, consequently, having the translocation t (12; 22).
  • the invention therefore also relates to the chimeric proteins resulting from the chromosomal translocation t (12; 22), as well as the antibodies for the immunological detection of the presence of these proteins and more particularly of a chimeric protein in a biological sample originating from a subject likely to carry a chromosomal translocation t (12; 22).
  • the invention also relates to methods of detecting a fusion gene resulting from the chromosomal translocation t (12; 22).
  • a method for detecting such a gene comprises the following steps:
  • a probe according to the specific invention either of a part of the nucleotide sequence of the Ews gene, or of the nucleotide sequence of a fusion gene corresponding to the translocation t (12; 22), or a mixture of these probes, with the biological sample, under conditions allowing the formation of hybridization complexes between the probe (s) and the target DNA or RNA contained in the sample ;
  • This process can be implemented in tests on a membrane or on a plate or on any other suitable support, according to dot blot or Southern blot or filtration methods.
  • a second embodiment of such a method aims to detect the transcript of a fusion gene resulting from the translocation t (12; 22); this method consists, starting from the mRNA extracted from a biological sample originating from tumor cells of a patient likely to present a chromosomal translocation t (12; 22), to effect a reverse transcription using an oligonucleotide of synthesis adequate to obtain a corresponding cDNA; then amplifying said cDNA according to an enzymatic amplification process using DNA polymerase and suitable primers, known as PCR, consisting of repeating cycles of DNA denaturation, hybridization of primers and extension from the primers, a number of times sufficient to increase the amount of the starting sequence in an exponential proportion relative to the number of cycles used.
  • PCR DNA polymerase and suitable primers
  • the amplification products are analyzed for example by electrophoresis to detect the presence of a product corresponding to one or other of the genes involved in the translocation t (12; 22) or to a fusion gene. Detection methods for products amplified by adsorption on microplates are also possible.
  • the invention also relates to the detection of a chimeric protein encoded by a fusion gene resulting from the translocation t (12; 22).
  • a method comprises the following stages: - the treatment of a biological sample originating from a patient whose tumor cells are capable of exhibiting a chromosomal translocation t (12; 22), so as to make the proteins which it contains accessible antibodies; - bringing the biological sample into contact with at least one antibody specific for the chimeric protein according to the invention corresponding to the translocation t (12,22), under conditions allowing the formation of immunological complexes between the (or) antibodies and proteins present in the sample cells;
  • the detection by any appropriate means of any immunological complexes formed Specifically, the detection of fusion DNA or RNA or of a chimeric protein allows the diagnosis of MMSP.
  • the subject of the invention is therefore a method for diagnosing MMSP, consisting of starting from a biological sample originating from tumor cells of a patient capable of having a chromosomal translocation t (12; 22), to be treated so as to make the nucleic acids it contains capable of hybridizing with a probe, detecting the presence of a translocation t (12; 22) in tumor cells.
  • Such a method comprises the following steps:
  • At least one probe of the invention optionally labeled, specific either for part of the nucleotide sequence of the Ews gene, or for the nucleotide sequence of a fusion gene corresponding to the translocation t ( 12; 22), with the biological sample treated so that the cells which it contains are lysed and optionally so that the nucleic acids contained in said cells are fragmented using restriction enzyme, in conditions allowing the formation of hybridization complexes between the probe (s) and the target DNA or RNA contained in the sample; - the detection by any appropriate means of the hybrids possibly formed, to detect the presence of a product corresponding to the fusion gene resulting from the translocation t (12; 22).
  • this process can be implemented in tests on a membrane or on a plate or on any other suitable support, according to dot blot or Southern blot methods or even filtration.
  • a method of diagnosing MMSP consists, from the mRNA extracted from a biological sample originating from tumor cells of a patient capable of having a t (12; 22) chromosomal translocation, performing reverse transcription using an adequate synthetic oligonucleotide to obtain a corresponding cDNA; then amplifying said cDNA according to an enzymatic amplification process using DNA polymerase and suitable primers, known as PCR, consisting of repeating cycles of DNA denaturation, hybridization of primers and extension from the primers, a number of times sufficient to increase the amount of the starting sequence in an exponential proportion relative to the number of cycles used.
  • PCR suitable primers
  • the amplification products are analyzed for example by electrophoresis to detect the presence of a product corresponding to a fusion gene of the translocation t (ll; 22). Detection methods for products amplified by adsorption on microplates are also possible.
  • a method for diagnosing MMSP consists, from a cell sample contacted with one or more antibodies of the invention specific for fusion proteins, to immunologically detect the presence of a protein encoded by a fusion gene resulting from the translocation t (12; 22).
  • Such a method comprises the following steps:
  • kits for implementing these methods can be prepared.
  • These kits or kits contain, in the case of a hybridization process, probes according to the invention as well as samples of DNA or control RNA; in the case of a reverse transcription and PCR method, the oligonucleotides suitable for the implementation of each of these techniques, as well as control DNA or RNA samples; in the case of an immunological method, the monoclonal antibodies as well as control samples of known reactivity.
  • the invention also relates to the use of the DNA sequences of the invention corresponding to a translocation t (12; 22), for preparing antisense nucleotides, or the like, having anti-tumor activity; which by hybridization with all or part of the fusion gene inhibit its transcription and thus prevent the production of mRNA and chimeric proteins, and / or, in another embodiment, hybridizes with the transcribed mRNA and then inhibits the production of chimeric proteins.
  • the invention therefore relates to the use of a nucleic acid or an analogue of this nucleic acid capable of hybridizing with the nucleotide sequence of a hybrid DNA according to the invention corresponding to a translocation t (12 ; 22), to prepare an inhibiting therapeutic agent expression of a fusion gene resulting from a chromosomal translocation t (12; 22) (ql3; ql2), in the tumor cells of patients suffering from MMSP.
  • a subject of the invention is therefore also a therapeutic agent for inhibiting the expression of a fusion gene resulting from the chromosomal translocation t (12; 22) (ql3; ql2) in the tumor cells of patients suffering from MMSP, characterized in which is essentially constituted by a hybrid DNA according to the invention corresponding to the translocation t (12; 22), or an analog of this DNA, capable of hybridizing with the nucleotide sequence of a fusion gene resulting from the chromosomal translocation t (12; 22) (ql3; ql2).
  • the invention relates to the use of a nucleic acid or of an analogue of this nucleic acid, capable of hybridizing with the nucleotide sequence of a hybrid RNA according to the invention corresponding to a t (12; 22) translocation, to prepare a therapeutic agent inhibiting the translation of chimeric proteins resulting from a t (12; 22) (ql3; ql2) chromosomal translocation, in tumor cells of patients with MMSP.
  • the invention therefore also relates to a therapeutic agent for inhibiting the translation of chimeric proteins resulting from the chromosomal translocation t (12; 22) (ql3; ql2) in the tumor cells of patients suffering from MMSP, characterized in that it essentially consists of a hybrid RNA according to the invention corresponding to a translocation t (12; 22), or an analog of this RNA, capable of hybridizing with the nucleotide sequence of the RNA derived from a resulting fusion gene chromosomal translocation t (12; 22) (ql3; ql2).
  • the invention also relates to the nucleic acid corresponding to the Ews gene, as well as the mRNA which results therefrom and the cDNA which derives therefrom, as well as the protein for which it codes.
  • the preparation of probes and primers constitute tools allowing the detection of the normal Ews gene; this detection of the normal Ews gene can be advantageously combined with the methods for detecting fusion genes resulting from the various translocations in which this gene is involved, in order to serve as a positive control.
  • the DNAs of the invention can be introduced into expression vectors derived from plasmids or from viruses, with the aim, in particular, of producing the proteins corresponding to these DNA sequences, in order to prepare antibodies specific for these proteins, or in order to have pharmacological study models.
  • the third locus identified thanks to the cosmids overlapping Cos5 and Cos6 (Zucman J, Delattre O, Desmaze C et al, Genomics, in press), was located between loci VIIIF2 and LIF .
  • the Cos5 / Cos6 locus was gradually extended by recurrent isolation of overlapping clones using a library of cosmids specific to chromosome 22.
  • B6 and G9 overlap the breakpoint of chromosome 22 on derivative 11 of the translocation t (ll; 22), of A3EW2-3B and Alu6, two hybrid cells derived respectively from ES and PN tumors and containing the der (11) (Geurts van Kessel AHM, Turc-Carel C, Klein A de et al, Mol. Cel. Biol. 5, 427-429 (1985); Zhang F, Delattre O, Rouleau G et al, Genomics 6, 174-177 (1990)).
  • the FISH technique on metaphasic chromosomes of a PN cell line used with one of these two cosmids confirms that the breakpoint has been crossed because a fluorescent signal is then observed on derivative 22 of the translocation.
  • DNA fragments, in single copies in the human genome, close to the breakpoint of chromosome 22 were selected to analyze the DNA of a group of 20 ES and PN tumors. In all cases, a breakpoint is observed in the same region of approximately 7 Kb, which has been designated EWSR1 for Region 1 of Ewing's sarcoma.
  • a cosmid library made from the ICB104 cell line derived from a PN tumor was screened with probes from EWSR1.
  • Three groups of overlapping cosmids were isolated, one corresponding to the normal chromosome 22 and the other two to each of the two translocation derivatives. Subsequently, fragments not originating from chromosome 22 but originating from these cosmids were used to identify a clone, from which it was demonstrated by the FISH technique that it derived from the q2 region of chromosome 11.
  • the comparison of Restriction maps of the intact and rearranged regions of chromosomes 11 and 22 indicate, at the level of resolution authorized by the study, that the translocation is simple and reciprocal.
  • the locus of chromosome 11 has been extended to 100 Kb by recurrent isolation of overlapping cosmids. Screening of the same group of 20 tumors with probes from this region made it possible to identify 17 breakpoints on chromosome 11. They are distributed, without obvious aggregation, over a region of more than 40 Kb called EWSR2. Interestingly, the two tumors with a variant translocation and both having a cytogenetically intact chromosome 11 are altered in the EWSR2 region; which highlights a sub-microscopic rearrangement in these tumors.
  • the EWSR1 region is flanked by three groups of sites for a rare restriction site endonuclease. It appears in human cells that these sites are at least partially unmethylated, which suggests that they are part of HTF islets (Lindsay S, Bird A P, Nature 327, 336-338, (1987)).
  • the EWSR1 region is included in a phylogenetically conserved region. Fragments were selected to screen northern blots prepared from RNA extracted from 7 PNET tumors with a t translocation (ll; 22), 3 non-karyotyped ES tumors and several normal tissues (lung, heart, liver, pancreas, placenta , kidney, skeletal muscle) and 4 control tumors or cell lines (neuroblastoma, pheochromocytoma, colon adenocarcinoma, HeLa).
  • Probes named 22RR3 and 22RR12 were used to screen a human cDNA library, and the overlapping clones hy ridant with the two probes were characterized.
  • the largest clone contains 1968 bp, the open reading phase of which comprises a first ATG codon occurring in the context of a Kozak consensus sequence, it codes for a protein of 656 amino acids called EWS.
  • a search in databases revealed that the sequence of the first 285 amino acids has a homology with proteins such as glutene, gliadin, chorionic protein S36, annexin VII, the ordins Bl and C. However, the greatest homologies were observed with the C-terminal domain of the large Eukaryotic RNA polymerase II subunit (CTD-polII).
  • These different molecules contain a domain comprising the repetition of a peptide of seven amino acid residues including tyrosine and a rate important proline and serine. This domain can adopt a specific secondary structure called pro- ⁇
  • the C-terminal portion of the EWS protein contains three regions (300-340, 454-513, 559-640) rich in glycine (46%), arginine (19%) and proline (13%) which has homologies with the proteins rich in glycines such as collagen, keratin and proteins binding single stranded nucleic acids.
  • a sequence of 85 amino acids arranged between the first and the second region is homologous to a sequence found in several RNA-binding proteins.
  • This domain contains the RNP-1 and RNP-2 consensus sequences (Bandziulis RJ, Swanson MS, Dreyfuss G, Genes Dev. 3, 431-437 (1989)) and has been shown as the RNA recognition motif for 70 Kd snRNP Ul protein (Query CC, Bentley RC, Keene JD, Cell 57, 89-101 (1989)). In this region, other marks of similar homologies have been found with several RNA-binding proteins and functionally characterized.
  • the probe named 11RR1 was used to find 11 overlapping clones from a human marrow cDNA library.
  • amino acid identity reaches 97% (Ben-David Y, Giddens E B, Letwin K, Bernstein A, Genes Dev. 5, 908-
  • Hybridization of the 5 ′ ends of the two cDNAs on the contigs of chromosomes 11 and 22 has shown that the two genes are transcribed in the direction of the center towards the telomer.
  • the fusion transcript seen in northern blots is initialized on chromosome 22 and terminated on chromosome 11.
  • genomic fragments designated 22HP.5 and 11RR1 which hybridize respectively with the cDNAs coding for the proteins EWS and Hum-Fli-1 were sequenced and revealed in each case the presence of an exon. Oligonucleotides homologous to these exons were used to perform reverse transcription and amplified by PCR the RNAs from different sources.
  • RNA from breast tissue Unlike RNA from breast tissue, neuroblastoma (IMR32), pheochromocytoma, lymphoma, ovarian carcinoma, all RNA from 7 PNET tumors with a t translocation (ll; 22) and those from 3 non-karyotyped ES tumors allow the amplification of a specific product. Depending on the tumor, three different sizes of amplification products were first observed. Their sequences reveal three types of fusion transcripts.
  • the first type contains exonic sequences present in the 22HP.5 and 11RR1 fragments and a 174 bp sequence derived from the most centromeric adjacent exon of the Hum-Fli-1 gene.
  • the second and third types differ from the first because of the presence at the junction site of additional sequences originating respectively from the coding region of the Ews and Hum-Fli-1 genes.
  • the fusion is in phase, and the resulting chimeric proteins differ from the EWS protein by the substitution of the RNA binding domain, by the DNA binding domain of the HUM-FLI-1 protein. homologous to the ETS protein domain.
  • a similar study carried out on approximately 40 ES and PN tumors has made it possible to highlight other types of fusion genes resulting from the chromosomal translocation t (ll; 22).
  • the EWS protein shares, through its total sequence, homologies with proteins known to interact with single-stranded nucleic acids and more particularly with RNA.
  • the C-terminal region contains an RNA recognition motif which is also encountered in a group of participating proteins. to the post-transcriptional process of RNA (Frankel AD, Mattaj IW, Rio DC, Cell 67, 1041-1046 (1991)). In addition, in the Ews protein this motif is flanked by amino acid sequences rich in glycine. Such sequences, observed in several RNA binding proteins, also interact with RNA (Kumar A, Casas-Finet JR, Luneau Cj et al, J. Biol. Chem. 265, 17094-17100 (1990); Munroe SH, Dong X, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 895-899 (1992)).
  • the N-terminal region of the EWS protein exhibits homology to the CTD-polII region. It has been suggested that this domain interacts with transcription factors at the initiation complex (Corden JL, TIBS 15, 383-387 (1990)). These homologies of the EWS protein suggest that it has two different functional domains which together participate in the mechanism of genetic expression.
  • the Ets family of genes is involved through various mechanisms in erythroleukaemias induced in mice and hens by retroviruses.
  • the first member of this family was discovered to be a co-transduced genetic element giving rise to hybrid proteins containing the sequences MYB and ETS-1 (Watson DK, Ascione R, Papas T s, Crit. Rev. Oncogenesis 1, 409 -436 (1990)).
  • Spi-1 (PU1) and Fli-1 are activated by the retroviral integration of different strains of the Friend's leukemia virus (Ben-David Y, Bernstein A, Cell 66, 831 -834 (1991)).
  • ETS domain Kerman A, Wasylyk C, Trends Genêt. 7, 49-54 (1991); Lim F, Kraut N, Frampton J, Graf T, EMBO J. 11, 643-652 (1992); Hipskind RA, Rao VN, Mueller CGF et al, Nature 354, 531-534, (1991)).
  • the proteins ETS-1 and ETS-2 contain a region which promotes transcription when this is linked to the DNA binding domain of LexA (Wasylyk B, Gutman A, Flores P , Bègue A, Leprince D, Stehelin D, Nature 346, 191-193 (1990)) or Gal4 (Seneca S, Punyammalee B, Bailly M et al, Oncogene 6, 357-360 (1991)).
  • the retroviral insertion site activating the murine Fli-1 gene has been shown to be located near the Ets-1 gene on mouse chromosome 9.
  • the insertion site is phylogenetically conserved and is homologous to a region of human chromosome 11 close to the Ets-1 gene (Baud V, Lipinski M, Rassart E, Poliquin L, Bergeron D, Genomics 11, 223-224 (1991)) .
  • Hum-Fli-1 represents the cDNA of the human gene homologous to the murine Fli-1 gene.
  • the translocation described in the description of the invention clearly results from the fusion of two genes which belong to families hitherto not involved in human carcinogenesis: the ETS family of proteins which bind to DNA and the family of proteins. binding to RNA. Because the translocation is reciprocal without apparent loss of genetic material, on each of the two derived chromosomes, the 5 'end of the gene is juxtaposed at the 3' end of the other gene.
  • the chimeric gene generated on der (11) is not expressed at a level sufficient to be measured in northern blots and does not seem to be involved in the tumor phenotype since der (11) can occasionally be lost in ES tumors ( Turc- Carel C, Philip I, Berger MP, Philip T, Lenoir GM, Cancer Genêt. Cytogenet. 12, 1-19 (1984); Douglass EC, Valentine M, Green AA, Hayes FA, Thompson E i, JNCI 77, 1211-1213 (1986)).
  • the transcribed hybrid generated by der (22) is visible in northern blots although its intracellular level seems to decrease in comparison with the normal transcript of the Ews gene coded by chromosome 22.
  • the translocation replaces the DNA binding domain, HUM-FLI-1, with an RNA binding domain and links it by the same polypeptide chain to a domain which has homology with CTD-polII .
  • the chimeric protein can functionally interfere with the negative regulatory elements controlling transcription.
  • a possible example of such an alteration could be the MIC2 antigen, which is specifically overexpressed in PNET tumors exhibiting a t (ll; 22) translocation (Ambros IM, Ambros PF, Strehl S et al, Cancer 67, 1886-1893 (1991); Garin-Chesa P, Fellinger EJ, Huvos AG et al, Am. J. Pathol. 139, 275-286 (1991)).
  • Ets-type gene The involvement in a solid tumor of an Ets-type gene indicates that the role of the ETS family of proteins in the cancerization process is not limited to hematological cancers.
  • erythroleukemia in which this family is involved, a highly transformed phenotype is associated with other alterations, intervening either by cotransduction of the Myb sequences, or by a alteration of the TP53 gene (Ben-David Y, Bernstein A, Cell
  • the first is based on the fact that the small size of the EWSRl region allows simple detection of genomic rearrangements by the Southern technique;
  • the second is based on reverse transcription and gene amplification by PCR and provides a sensitive method for showing the presence of fusion transcripts in tumors and in their potential metastatic sites.
  • FIGURE 1 A first figure.
  • Figure 1 shows the map of the EWSR1 region on chromosome 22.
  • A3EW2-3B and ALU 6 two hybrid somatic cells which contain the der (11) of ES tumors and
  • CpGl contains 3 SacII sites, 3 BssHII sites and 1 MluI site
  • CpG2A contains 3 SacII sites, 3 BssHII sites
  • CpG2B contains 3 BssH2 sites, 3 SacII sites and 1 Notl site.
  • the preincubated probe was then used to screen the library according to standard procedures and the overlapping cosmids were identified. b) The tumor samples were collected immediately after surgery.
  • a fragment was used for the karyotype analysis: - T2 to T11 tumors have a typical t (11; 22) (q2; ql2) translocation;
  • the T12 tumor has a complex translocation t (10; 11; 22; 12) (q22; q24; ql2; q24);
  • the T13 tumor has a variant translocation t (14; 22) (q32; ql2);
  • - T14 tumor has a variant of translocation t (7; 22) (q35; ql2);
  • tumor has a complex translocation t (ll; ll; 22) (ql3; q24; ql2). Analysis of tumor carayotypes 16 to
  • Bi-color FISH analysis on interphasic nuclei of T17 and T19 tumors shows the appearance of a breakpoint in the 22ql2 band (Desmaze C, Zucman J, Delattre O, Thomas G, Aurias A, Genes Chr. Cancer , in press) .
  • the Tl tumor corresponds to the hybrid cell line A3EW2.
  • the Alu6 hybrid cell line is derived from the T8 tumor.
  • T7 to T13 tumors are PN tumors; all other tumors were diagnosed with Ewing's sarcoma.
  • the DNA of the blood samples (N) and tumor samples (T) was digested with the enzyme PstI and analyzed according to the Southern method with the 5.5-sac probe.
  • This figure represents the detection of rearranged bands in tumors; more particularly, the detection of abnormal genomic fragments in 6 tumors.
  • the tumor number is listed at the top of the bands.
  • DNA samples from the blood of patients with T16 and T18 tumors are indicated by (N).
  • the fragment corresponding to the rearranged junction is indicated by a horizontal arrow.
  • FIG. 3 represents the restriction map of the regions involved in the chromosomal translocation t (11; 22) (q24; ql2); the normal regions (22N) and (UN) and the two derivatives 11 and 22 of the translocation t (1; 22), der (11) and der (22) are represented for the tumor T11.
  • the double line represents chromosome 11
  • the thick line represents chromosome 22.
  • EWSRl and EWSR2 represents the smallest region which contains all the breakpoints identified on chromosome 22 and chromosome 11, respectively.
  • the vertical arrows indicate the position of the EcoRl rearranged fragments identified in 17 tumors.
  • An Xhol linker was inserted at the BamHI site of a SuperCos vector marketed by the Stratagene Company.
  • the 3 'end of DNA partially digested by Mbol of an ICB 104 cell line derived from the Tll tumor (Zhang F, Delattre O, Rouleau G et al, Genomics 6, 174-177 (1990)), was partially filled with dGTP and dATP.
  • the high molecular weight fragments were gel purified and linked to the Xhol site of the modified SuperCos vector and partially filled with dTTP and dCTP.
  • the virions were used to infect the strain of E. coli DH5 alpha MCR.
  • the library obtained from 4.10 5 independent cosmids was screened with probes 22RR3 and 22RR12. Groups of overlapping clones containing either an unaltered EWSR1 region (22N) or the junction fragment of the translocation derivative 22, der (22), or of the translocation derivative 11, der (11), have been identified.
  • the 11RR1 probe made it possible to find a cosmid, which by fluorescent hybridization in situ on chromosome is shown to come from the band llq24. This cosmid was used to extend the locus on normal chromosome 11.
  • This figure shows the detection in Northern blots of abnormal transcripts in Ewing's sarcoma or cell lines.
  • N represents the normal transcript of the Ews gene
  • R represents the fusion transcripts.
  • the sizes of the abnormal transcripts are significantly different.
  • the same abnormal transcripts are detected with both the 22RR3 probe and the 11RR1 probe, which indicates that the translocation gives rise to the synthesis of a chimeric transcript.
  • This figure represents the detection by reverse transcription and PCR of three types of chimeric transcripts.
  • M is a size marker.
  • Breast corresponds to a breast tissue;
  • OVARY corresponds to an ovarian carcinoma;
  • IMR32 corresponds to a cell line of neuroblastomas.
  • the abbreviations designating the patients are identical to those in FIG. 1.
  • Results This figure represents the nucleotide sequence of the cDNA containing the entire coding region and the 3 'non-transcribed end of the Ews gene; As well as the amino acid sequence deduced from this cDNA codon by codon. These sequences are numbered on the left.
  • the first methionine codon is located with a purine (A) at position -3 and a guanosine (G) at position +4 in agreement with the Kozak consensus sequence.
  • Method Probes 22RR3 and 22RR12 were used to screen a human fetal brain cDNA library
  • the 2372 bp and 2939 bp cDNA sequences of the clones BF1AC5 and BM025 were determined on the strands of the overlapping subclones, using either the M13 primer or commercial primers. They have been shown to contain the entire coding sequence of the Ews and Hum-Fli-1 genes.
  • the direct sequencing of the PCR amplification products was carried out with a Sequenase marketed by the Company USB after 30 cycles of asymmetric amplification with either primer 11.3 or primer 22.3, then purification through a Centricon 100 membrane marketed by the Amicon Company.
  • This figure represents the cDNA of the Hum-Fli-1 gene.
  • FIG. 8 represents the nucleotide sequence of the fusion cDNA -obtained by reverse transcription and PCR amplification of the type 1 fusion transcript.
  • the sequence homologous (at the 5 'end) or complementary (at the 3' end) to the primers used for the PCR amplification are underlined.
  • the vertical line indicates the junction between the two genes which occur between the first and second position of codon 265 of the Ews gene and between the same positions of codon 219 of the Hum-Fli-1 gene.
  • This figure represents the different domains of the EWS protein encoded by the Ews gene.
  • the different peptide domains are represented.
  • the hatched region represents the first 270 amino acids containing a high proportion of tyrosine, glutamine, serine, threonine, glycine, alanine and proline, which together represent about 90% of all residues.
  • most tyrosines are present every 5 to 9 residues and define a degenerate motif repeated 31 times. After tyrosine, the most recurrent residues in the repetition are a serine in position -1 (50%), a glycine in position +1 (50%), and two glutamines in positions +2 and +3 (respectively 70% and 40 %).
  • This part of the molecule has homology with CTD-polII.
  • the three shaded areas correspond to regions rich in glycine, arginine and proline.
  • RNA BD represents a supposed RNA binding domain, which is exposed in B.
  • the arrows indicate the position of the Hum-Fli-1 junction point for the three different types of chimeric proteins as deduced by reverse transcription and PCR amplification described above.
  • Dpen pi9 for the Drosophila pen pi9 clone Haynes SR, Rebbert ML, Mozert BA, Forquignon F, Dawid IB, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1819-1823 (1987)
  • H nucl for human nucleolin Srivastava M, McBride 0 W, Flemming PJ, Pollard HB, Burns AL, J. Biol. Chem. 265, 14922-14931 (1990)
  • HsnRNP Ul for 70 Kd human snRNP Ul Spritz RA
  • # 2 relate to different domains of RNA binding to within the same protein.
  • the invariable positions among these proteins are shaded and the minimum substitutions between EWS and at least 4 of the 6 proteins are indicated in bold.
  • EWS Ews gene
  • Hum-Fli-1 Hum-Fli-1
  • EWS / Hum-Fli-1 type 1, 2 and 3 Ews gene
  • RNA BD the C terminal portion of EWS containing the domain supposed RNA binding
  • ETS D the C-terminal part of the Hum-Fli-1 gene containing the ETS domain
  • FIG. 11 represents the restriction map of the Ews and Hum-Fli-1 genes at the level of their EWSR1 and EWSR2 break region. The position of the exons is indicated relative to the restriction sites.
  • the open reading frames are divided by the different exons; each intron between two coding exons interrupts the open reading frame according to one of the three phases: A, B or C.
  • FIG. 12 represents the exonic structure of the Ews gene.
  • FIG. 13 represents the exonic structure of the Hum-Fli-1 gene.
  • FIG. 14 represents the juxtapositions of exons of the Ews and Hum-Fli-1 genes and the junction sequences of the resulting fusion transcripts.
  • FIG. 15 represents, according to a nomenclature identical to that of FIG. 14, an observed case of juxtaposition concerning exon 8 of Ews and exon 7 of .Hum-Fli-1, between which a sequence d unknown origin (Alien sequence).
  • FIG. 16 represents, according to a nomenclature identical to that of FIGS. 14 and 15, four cases in which two different fusion transcripts have been observed juxtaposing a series of exons of Ews with a series of exons of Hum-Fli-1 ; this is probably the result of alternative splices.
  • the (*) indicates in the sequence of the translation product a stop codon.
  • FIG. 18 represents, according to a nomenclature identical to that of FIGS. 14, 15 and 16, the junction sequences of four fusion transcripts corresponding to 5 observed cases, juxtaposing exon 7 of the Ews gene with the supposed exons 6, 8 and 9 of the Erg gene, and exon 10 of Ews with the supposed exon 6 of Erg.
  • Figures 19 and 20 show the rearrangement of the Ews gene in the SU-CCS-1 cell line of MMSP.
  • FIG. 19 represents the restriction map of the EWSR1 region and indicates the position of the probes used and the positions deduced from the breakpoint of chromosome 22 in the Sten-1 tumor and in the SU-CCS-1 cell line.
  • Part (a) of FIG. 20 represents the analysis by the Southern blot technique of the DNA of Control and that of the line SU-CCS-1 doubly digested with EcoRl and PstI and hybridized with the RR2 probe derived from EWSRl; in this figure, N indicates the normal band and R the band corresponding to the rearrangement.
  • Part (b) of FIG. 20 represents the detection in a northern blot of an abnormal transcript with the EWS-5 'EB probe defined by the 5' EcoRl / BamHI fragment of the cDNA of the Ews gene; extracted RNAs a Hela cell line and a glioma cell line were used as controls; N indicates the normal EWS transcript and R indicates an additional transcript.
  • Part (c) of FIG. 20 represents the analysis of the amplified products obtained in the last step of the RACE procedure; compared to the control RNA, which was used to promote amplification from the normal EWS transcript (EWS), the RNA extracted from SU-CCS-1 has an additional amplified fragment which has been shown to defend the transcript of fusion (Fusion).
  • Figures 21 and 22 relate to the identification of the EWS / ATF-1 fusion transcript in MMSP tumors and cell lines.
  • FIG. 21 represents the detection by PCR-reverse transcriptase of the chimeric transcript.
  • the PCR was carried out the primers 22.1 and ATF-1.1, corresponding respectively to exon 7 of the Ews gene, and to the 3 ′ region translated from ATF-1.
  • the analysis of the amplified products was carried out on a 1% agarose gel (control: no RNA).
  • FIG. 22 represents the sequence of the 954 bp cDNA fragment obtained by PCR-reverse transcriptase of the transcript resulting from the fusion of the Ews and Atf-1 genes.
  • the sequences identical (to the 5 'region) or complementary (to the 3' region) to the primers used for the amplification are underlined in the figure.
  • the vertical line indicates the junction between the two genes, which occurs between the second and third position of codon 325 and between the same positions of codon 65 of the Atf-1 gene.
  • the contribution of the Ews gene sequence is indicated in bold characters.
  • the position of the specific oligonucleotide of the Ews gene used in the RACE procedure is indicated and underlined.
  • Figures 23 and 24 represent the junction of the chimeric transcripts and gives a schematic representation of the proteins which are deduced therefrom.
  • FIG. 23 represents the partial sequence of the cDNA of the genes Ews and Atf-1, and of their hybrid transcripts in the junction regions, highlighting the open and closed junction frames respectively for the hybrid transcript Ews / Atf-1 from the der (22), and for the transcript Atf- 1 / Ews from the der (12).
  • FIG. 24 represents the translation products corresponding to the 4 cDNAs indicated in FIG. 22.
  • the reciprocal product is indicated by ATF-1 / EWS and is coded by chromosome der (12).
  • the consensus recognition site for phosphorylation by priteine kinase A is indicated by PKA; NTD-EWS indicates the N-terminal domain of EWS.
  • the SU-CCS cell line was prepared from a pluval effusion of MMSP (Epstein L, Martin AO, Kempson R, Cancer Res. 44, 1265-1274, 1984). Cytogenetic analysis revealed a complex karyotype with a single normal copy of chromosomes 12 and 22. The cell line was cultured as originally described. The frozen fragments of primary tumors of MMSP, Sten-1 (Stenman G, Kindblom LG, Angervall L, Genes Chrorr Cancer 4, 122-127, 1992), W9150 (Speleman F, Colpaert C, Goovaerts G, Leroy JG, Van Marck E, Cancer Genêt. Cytogenet.
  • cDNA probes have the following:
  • EWS 5 'EB is the 0.8 Kb coding region of the EWS cDNA ending at a BamHI site
  • the 3 ′ ATF-1 probe was prepared by PCR and extends from nucleotide 754 to nucleotide 955 in FIG. 17. 3) Gene amplification procedure by PCR
  • the amplified products were analyzed on 1% TBE agarose gels.
  • ATF-1.1 5'AAAACTCCACTAGGAAATCCATTT 3 'ATF-1.3 5' CTGGGAGGGGGGAGTGGAAG 3 '
  • a microgram of polyA and polyA RNA of the SU-CCS-1 cell line was denatured for 10 minutes at 80 ° C. and transcribed using the Gen AmpRNA PCR kit sold by the company Cetus.
  • the initial reverse transcription was carried out in 2 to microliters using the primer A3'NV. Incubation at 42 ° Celsius for 45 minutes was followed by 5 minutes at 94 ° Celsius.
  • a 2 microliters aliquot of the resulting cDNA was amplified by PCR using a 3-step procedure involving overlapping oligonucleotides.
  • the first step implemented primers 22.1 and A3 '-4 in 20 cycles (association temperature 64 ° C). Twenty microliters were analyzed on a 1% agarose gel with low melting point. The portion of the gel containing the amplified products of approximately 1.5 to 2.5 Kb was collected, melted at 68 ° Celsius, and diluted in an equal volume of TE buffer.
  • One microliter was subjected to PCR amplification
  • association temperature 66 ° C association temperature 66 ° C
  • primers 22.3 and A3 '-5 Association temperature 66 ° C
  • RNA was reverse transcribed using as an primer an oligo-dT and the PCR Gen Amp RNA kit from the company Cetus, according to the conditions described by the manufacturer.
  • the cDNA obtained was subjected to three different PCR amplifications:
  • the amplified products corresponding to the Ews / Atf-1 transcripts were obtained with the primers 22.1 and ATF-1.1 (association temperature 60 ° C),
  • the amplified products corresponding to the normal Atf-1 transcript were obtained with the primers ATF-1.3 and ATF-1.1 (association temperature 60 ° C),
  • PCR products were subcloned into phages M13mpl8 and M13mpl9. In each case, three independent clones were entirely sequenced with Kit Taq polymerase from the company Applied Biosystems, using dideoxynucleotides and fluorescent primers. The reaction sequences were analyzed on an automatic sequencer from the company Applied Biosystems.
  • the DNA was extracted from a primary MMSP tumor, called Sten-1, having a characteristic t (ll; 22) translocation (Stenman G, Kindblom LG, Angervall L, Genes Chrom. Cancer 4, 122-127, 1992 ), and a cell line called SU-CCS-1 having a complex karyotype containing an abnormal chromosome 12 (Epstein L, Martin AO, Kempson R, Cancer Res. 44, 1265-1274, 1984).
  • the DNAs were screened with probes from EWSR1. Abnormal fragments were detected with the PR.8 probes for Sten-1 and RR2 for SU-CCS-1 (as shown in Figure 19).
  • RNA derived from Sten-1, SU-CCS-1, and from primary MMSP tumor 5852/88 were characterized by northern blots with the 3 'and 5' ends of the cDNA of the Ews gene. The normal 2.5 Kb transcript of the Ews gene was highlighted with the two probes.
  • each probe specifically revealed an additional band (the 5 ′ probe, a clearly expressed transcript of 3 Kb, probe 3 'a diffuse transcript of 1.5 Kb) suggesting that these abnormal transcripts could correspond to the fusion genes generated by the translocation t (12; 22) as shown in Figure 20 (b).
  • the cDNA sequences located between this labeling and exon 7 of the Ews gene were amplified by PCR using a three-step procedure. Agarose gel electrophoresis revealed that the Helac RNAs lead to the amplification of a single 1.4 Kb fragment, which has been identified by hybridization as corresponding to the normal cDNA of the Ews gene. In addition to this fragment, the SU-CCS-1 RNA leads to the amplification of a fragment of higher molecular weight as indicated in FIG. 20 c.
  • the sequencing revealed a foreign open reading phase fused to codon 325 on the 3 'side of the eighth exon of the Ews gene.
  • a search in the NBRF database revealed that this sequence dodes for the C-terminal part of the Atf-1 gene, a cAMP-dependent transcription factor.
  • this sequence is identical to the 3 'end of the cDNA sequence of the Atf-1 gene (Hai T, Liu F, Coukos WJ, Green MR, Genes Dev. 3, 2083-2090, 1989; Yoshimura T, Fijisawa JL, Yoshida M, EMBA J. 9, 2537-2542, 1990).
  • a probe from this end called ATF-1 3 ', hybridizes with the abnormal transcript of 3 Kb observed in northern blot.
  • a more direct procedure for testing for the presence of an Ews / Atf-1 fusion transcript in tumor RNA was developed from a specific oligonucleotide derived from the 3 'untranslated region of the Atf-1 gene.
  • This primer was used, in combination with an oligonucleotide homologous to exon 7 of the Ews gene, to amplify, by PCR, cDNAs primed with an oligo- dT synthesized from three known primary MMSP tumors, of the cell line SU- CCS-1 and Hela control cells.
  • the four RNAs of the MMSP cases lead to a major fragment of 1 Kb (as shown in FIG. 21).
  • the sequencing revealed the same phase junction, occurring in codon 325 of the Ews gene and codon 65 of the Atf-1 gene (as shown in FIG. 21).
  • the deduced fusion protein encoded by this transcript conserved the entire N-terminal domain of the EWS protein and most of the ATF-1 protein (as shown in Figure 23).
  • the portion of the fusion transcript corresponding to the Atf-1 gene was used to find a cosmid of a human genomic bank. It has been shown by fluorescence in situ hybridization (FISH) on metaphase chromosomes, that this cosmid exclusively covers the 12ql3 band, thus demonstrating that the Atf-1 gene is located in this region of the genome.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • the complexity of the SU-CCS-1 cell karyotype precludes a simple formal cytogenetic demonstration of the appearance of a translocation involving chromosomes 12 and 22.
  • the transcription of the normal Atf-1 gene on chromosome 12 and that of the reciprocal fusion gene generated on cromosome der (12) were studied by PCR reverse transcriptase. In all cases of MMSP, the two transcripts were expressed, this result is compatible with the broad spectrum of expression of the Atf-1 gene (Yoshimura T, Fijisawa JI, Yoshida M, EMBO J. 9, 2537-2542, 1990 ). In all cases, the amplified products isss of the reciprocal fusion transcript are of identical sizes but shorter than expected. Sequencing of the Sten-1 tumor cDNA junction region revealed an out-of-phase fusion caused by the deletion or splicing of the ninth exon of the Ews gene. The deduced translation product is a truncated protein composed of the first 65 amino acids of the ATF-1 protein followed by 3 aberrant amino acids (as shown in FIG. 23).
  • the present study demonstrates that the t (12; 22) translocation associated with MMSP generates hybrid genes associating part of the Ews gene and part of the Atf-1 gene, whose structural and functional characteristics resemble those of the fusion of the Ews genes. and Hum-Fli-1 in the translocation t (ll; 22) which it associated with Ewing's sarcoma.
  • the chimeric gene generated on chromosome der (22) codes for a protein in which the same portion of the N-terminal part of the EWS protein is linked to a DNA binding domain of a transcription factor.
  • the hybrid protein deduced from the DNA sequence of fusion of the Ews and Atf-1 genes contains the major part of the ATF-1 protein, including an important functional domain bZIP. This area is known to mediate protein dimerization and DNA binding. Consequently, it is possible to consider that these two properties are preserved in the hybrid protein, which must therefore be capable of forming homodimers and heterodimers with the transcription factor CREB known to interact with the normal ATF-1 protein ( Turc-carel C, Aurias A, Mugneret F, Lizard Sidaner I, Volk C, Thiery JP, Olschwang S, Philip T, Lenoir GM, Mazabraud A, Cancer Genêt. Cytogenet.
  • the chimeric protein comprising part of the EWS protein and part of the ATF-1 protein, which potentially has the EWS transactivating domain linked to the bZIP domain, which is no longer regulated by the cAMP, of ATF-1, can alter the regulation of transcription of genes normally controlled by ATF-1.
  • the two transcribed hybrids are generated, in most MMSPs, by a cytogenetically simple translocation, suggesting that the transcription of the ATF-1 gene is identical to that of the EWS gene, ie from the centromere to the telomer. Both are expressed. This situation had already been observed in several hematological malignant tumors.
  • the chromosomes of the translocation t (15; 17) associated with promyelotic leukemia (Tkachuk DC, Kohler S, Cleary ML, Cell 71, 691-700, 1992), those of the translocation t ( 14; ll) associated with acute leukemia of lymphocytes in children (Gu Y, Nakamura T, Aider H, Prasad R, Canaani O, Cimino G, Groce CM, Canaani R, Cell 71, 701-708, 1992), express , in each case, aberrant fusion transcripts.
  • the expression of a reciprocal fusion gene on the der (12) chromosome is compatible with the generally known expression of ATF-1.
  • the N-terminal transactivating domain of E2A can be linked either to the PBX1 domain or to the bZIP domain of HLF (Inaba T, Roberts WM, Shapiro LH, Jolly KW, Raimondi SC, Smiht SD, Look AT, Science 257, 521-534, 1992; Hunger SP, Ohyashiki K, Toyama K, Cleary ML, Genes Develop. 6, 1608-1620, 1992).
  • HLF Inaba T, Roberts WM, Shapiro LH, Jolly KW, Raimondi SC, Smiht SD, Look AT, Science 257, 521-534, 1992; Hunger SP, Ohyashiki K, Toyama K, Cleary ML, Genes Develop. 6, 1608-1620, 1992).
  • HLF Inaba T, Roberts WM, Shapiro LH, Jolly KW, Raimondi SC, Smiht SD, Look AT, Science 257, 521-534, 1992
  • Hunger SP Ohyashiki K, Toyama K
  • the N-terminal transactivating domain of EWS can be fused to the DNA binding domain of different families of transcription factors: the ETS domain in the case of Ewing's sarcoma, the bZIP domain in the case of MMPS .
  • ETS domain in the case of Ewing's sarcoma
  • bZIP domain in the case of MMPS .

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Abstract

L'invention concerne un acide nucléique comprenant tout ou partie de la séquence nucléique d'un gène du chromosome 22 impliqué dans les translocations chromosomiques récurrentes associées au développement de tumeurs cancéreuses. L'invention a aussi pour objet des acides nucléiques hybrides correspondant aux produits de fusion résultant des translocations chromosomiques dans lesquelles est engagé ledit gène du chromosome 22, et plus particulièrement les translocations chromosomiques récurrentes t(11;22), t(21;22) associées au sarcome d'Ewing, et t(12;22) associée au mélanome malin des parties molles.

Description

ACIDE NUCLEIQUE CORRESPONDANT A UN GENE DU
CHROMOSOME 22 IMPLIQUE DANS LES TRANSLOCATIONS
CHROMOSOMIQUES RECURRENTES ASSOCIEES AU DEVELOPPEMENT DE
TUMEURS CANCEREUSES ET ACIDES NUCLEIQUES DE FUSION
5 RESULTANT DESDITES TRANSLOCATIONS.
La présente invention concerne un acide nucléique comprenant tout ou partie de la séquence nucléique d'un gène du chromosome 22 impliqué dans les
10 translocations chromosomiques récurrentes associées au développement de tumeurs cancéreuses. L'invention a aussi pour objet des acides nucléiques hybrides correspondant aux produits de fusion résultant des translocations chromosomiques dans lesquelles est engagé
15 ledit gène du chromosome 22.
L'invention concerne plus particulièrement un acide nucléique comprenant tout ou partie de la séquence nucléique du gène du chromosome 22 impliqué dans les translocations chromosomiques récurrentes
20 t(ll;22), t(21;22) et t(12;22), ainsi que les acides nucléiques hybrides résultant de la fusion de ce gène du chromosome 22 avec respectivement les gènes des chromosomes 11, 21 et 12 qui sont impliqués dans ces translocations. L'invention concerne également les ARNm
25 issus de l 'ADN du gène du chromosome 22 et des ADN de fusion, ainsi que les ADNc qui peuvent en dériver, de même que les protéines pour lesquelles ils codent.
L'invention concerne également la détection du gène du chromosome 22 impliqué dans des
30 translocations chromosomiques ainsi que des gènes de fusion résultant desdites translocations, à l'aide de
•~ sondes préparées à partir des acides nucléiques .% précédents, en vue du diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentés chez des sujets atteints de
35 tumeurs dites "à petites cellules rondes" ou de tumeurs neuroectodermiques primitives périphériques ou encore du mélanome malin des parties molles; l'invention concerne aussi la détection, aux mêmes fins, des produits pour lesquels codent ces gènes ainsi que les produits et réacti s pour la mise en oeuvre de ces procédés .
Les trans locations récurrentes chromosomiques constituent un mécanisme d'activation d'oncogènes et sont donc impliquées dans l'apparition de nombreuses tumeurs pathogènes (Solomon E, Borrow J, Goddard A D, Science 254, 1153-1160; (1991)) . Parmi celles-ci les tumeurs dites "à petites cellules rondes" constituent un groupe de cancers hétérogènes. Un diagnostic précis de ces tumeurs est essentiel pour choisir correctement le protocole thérapeutique à utiliser pour les traiter. Un sous-ensemble de ces tumeurs porte une translocation chromosomique t(ll;22) (q24;12) et est sensible au même protocole thérapeutique.
Le sarcome d'Ewing constitue la seconde tumeur des os la plus fréquente chez l'enfant. Malgré l'absence de marqueur morphologique, les cellules du Sarcome d'Ewing expriment occasionnellement des antigènes ou peuvent causer l'expression de figures morphologiques caractéristiques d'une differentiation neurale (Lipins y M, Braham K, Philip I et al, Cancer Res. 47, 183-187 (1987) ; Cavazzana A O, Miser J S, Jefferson J, Triche T J, Am. J. Pathol. 127, 507-518 (1987)) . Ainsi les techniques de diagnostic des tumeurs à petites cellules rondes utilisent des méthodes classiques de 1'anatomopathologie et de la cytologie, et constituent donc un diagnostic d'exclusion qui n'est pas totalement fiable. La démonstration de la présence d'une translocation chromosomique t(ll;22) dans une tumeurs à petites cellules rondes peut être réalisée par une étude du caryot pe; cette étude nécessite que les cellules parviennent vivantes au laboratoire, ce qui est souvent difficilement réalisable et entraîne un taux élevé d'échec; en outre, il existe des difficultés d'interprétation. Le Sarcome d'Ewing (ES) a été rattaché à un sous-type de Tumeurs Neuroectodermiques Primitives Périphériques (PNET) dénommées Neuroépithéliome Périphérique (PN) . Cette relation est en outre supportée par l'expression hautement spécifique de l'antigène MIC2 à la fois dans le Sarcome d'Ewing (ES) et le Neuroépithéliome Périphérique (PN) , alors que cet antigène n'est pas exprimé dans la plupart des autres tumeurs humaines (A bros I M, A bros P F, Strehl S et al, Cancer 67, 1886-1893 (1991) ; Garin-Chesa P, Fellinger E J, Huvos A G et al, Am. J. Pathol. 139, 275- 286 (1991)) . Avec d'autres sous-types rares de Tumeurs Neuroectodermiques Primitives (Whang-Peng J, Fréter C E, Knutsen T, Nanfro J J, Gazdar a, Cancer Genêt. Cytogenet. 29, 155-157 (1987) ; De Chadarevian J P, Vekemans M, Seemayer T A, N. Engl . J. Med. 311, 1702- 1703, (1984) ; Cavazzana A 0, Navarro S, Noguera R et al, Adv. Neuroblastoma Res. 2,463-473 (1988) ; Vigfusson N V, Allen L J, Philip J H, Alschibaja T, Riches W G, Cancer Genêt. Cytogenet. 22, 211-218 (1986)), le Sarcome d'Ewing et le Neuroépithéliome Périphérique partagent une translocation chromosomique t (11;22) (q24;ql2) très spécifique et cytogénétiquement identique (Aurias A, Rimbaut C, Buffe C, Dubousset J, Mazabraud A, N. Engl. J. Med. 309, 496-497 (1983) ; Turc-Carel C, Philip I, Berger M P, Philip T, Lenoir G M, N. Engl. J. Med. 309, 497-498, (1983) ; hang Peng J, Triche T J, Knutsen T, Miser J, Douglass E C, Israël M A, N. Engl. J. Med. 311, 584-585 (1984)) . Cette translocation a été observée dans 83 % des cas de Sarcome d'Ewing. Des variantes de cette translocation ou des translocations plus complexes ont été observées dans 9 % des autres cas et impliquent de manière constante la bande 22ql2 (Turc-Carel C, Aurias A, Mugneret F et al, Cancer Genêt. Cytogenet. 32, 229- 238 (1988)) . La région 22ql2 apparaît donc comme l'un des principaux sites d'apparition d'altérations chromosomiques récurrentes rencontrées dans un groupe défini de tumeurs humaines.
Les travaux de recherches menés sur la cartographie physique du bras long du chromosome 22 (Zhang F, Delattre 0, Rouleau G, Couturier J, Lefrançois D, Thomas G, Aurias A, Genomics 6, 174-177 (1990) ; Zhang F R, Aurias A, Delattre O, Stern M H, Benitez J, Rouleau G, Thomas G, Genomics 7, 319-324 (1990) ; Delattre O, Azairibuja C J, Aurias A, Zucman J, Peter M, Zhang F, Hors-Cayla M C, Rouleau G, Thomas G, Genomics 9, 721-727 (1991)), et l'isolement de sondes à proximité du point de cassure chromosomique (Zucman J, Delattre 0, Desmaze C, Azambuja C, Rouleau G, De Jong P, Aurias A, Thomas G, Genomics, sous presse) ont conduit les Inventeurs à mettre en évidence que la translocation t(ll;22) (q24;ql2) fusionne un gène porté par le chromosome 22 et un gène porté par le chromosome 11; cette fusion conduisant à la formation d'un gène hybride associé à la pathologie. Ces deux gènes ont été caractérisés et les produits de leur fusion ont pu être définis.
Le gène du chromosome 22 impliqué dans la translocation t(ll;22), dénommé Ews, a été isolé et son ADNc séquence; la séquence de la protéine pour laquelle il code a été déduite de la séquence de l'ADNc; le gène Ews comporte une région dénommée EWSRl d'environ 7 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 22.
Le gène du chromosome 11 impliqué dans la translocation t(ll;22), dénommé Hum-Fli-1, a été isolé et son ADNc séquence; la séquence de la protéine pour laquelle il code a été déduite de la séquence de l'ADNc; le gène Hum-Fli-1 comporte une région dénommée EWSR2 d'environ 40 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 11. En outre, les Inventeurs ont confirmé la forte homologie du gène Hum-Fli-1 avec les gènes de la famille Ets et plus particulièrement avec le gène murin Fli-1 (Baud V et al., Genomics vol. 11, 223-224, 1991; Ben-David Y et al., Gènes & Development vol. 5, no. 6, 1991) .
Les Inventeurs ont par ailleurs montré que dans environ 12 % des cas de Sarcome d'Ewing, le gène Ews du chromosome 22 fusionne avec le gène Erg porté par le chromosome 21. Lequel gène Erg fait également partie de la famille des facteurs de transcription Ets.
En outre, les travaux de recherche menés par les Inventeurs sur les translocations chromosomiques récurrentes dans lesquelles est impliqué le gène Ews, les ont conduits à mettre en évidence que la translocation chromosomique récurrente t(12;22) (ql3;12) associée au mélénome malin des parties molles (MMSP) fusionne le gène Ews avec le gène Atf-1 porté par le chromosome 12. Le lien entre la translocation t(12;22) et le mélénome malin des parties molles a été décrit notamment par Bridge J A et al. (Bridge J A, Borek D A, Neff J R, Huntrakoon M, Am. J. Cin. Pathol. 93, 26-31, 1986) et Stenman G et al. (Stenman G, Kindblom L-G, Angervall L, Gènes Chrom. Cancer 4, 122-127, 1992) .
Le mélanome malin des parties molles est une tumeur grave se développant le plus souvent au niveau des tendons et des aponeuroses chez des sujets âgés de 15 à 35 ans (Chung E B, Enzinger F M, Am. J. Surg. Pathol. 7, 405-413, 1983; Epstein L, Martin A O, Kempson R, Cancer Res . 44, 1265-1274, 1984) . Bien que le MMSP présente plusieurs figures phenotypiques communes avec les mélanomes malins cutanés, la translocation t (12;22) (ql3;12) est spécifique de ce type de tumeur (Mitelman F, Catalog of Chromosom Aberrations in Cancer, New York : Alan R. Liss, 1988) . Du fait que le point de cassure du chromosome 22 dans la translocation t (12; 22) (ql3; 12) ne peut être distingué cytogénétiquement de celui de la translocation t(ll;22), les inventeurs ont étudié les réarrangement du gène Ews dans la translocation t(12;22) . L'invention concerne en conséquence un acide nucléique comprenant tout ou partie de la séquence nucléique du gène Ews du chromosomes 22, localisé au niveau du point de cassure de ce chromosome dans diverses translocations chromosomiques récurrentes associées au développement de tumeurs cancéreuses.
L'invention concerne aussi les ADN hybrides résultant de la fusion du gène Ews avec d'autres gènes lors de translocations chromosomiques récurrentes impliquant le chromosome 22, constitués essentiellement d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews et d'une partie de la séquence nucleotidique du gène localisé au niveau du point de cassure de l'autre chromosome impliqué dans la translocation.
Plus particulièrement, l'invention concerne les ADN hybrides comprenant essentiellement la partie de la séquence nucleotidique du gène Ews jusqu'à la région de 7 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 22.
Parmi ces ADN hybrides comprenant la partie de la séquence nucleotidique du gène Ews depuis son origine jusqu'à la région de 7 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 22, l'invention concerne plus particulièrement ceux résultant des translocation chromosomiques suivantes : - t(ll;22) (q24;ql2), associée à au moins 80% des cas de sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées;
- t(21;22), associée à au moins 10% des cas de sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées;
5 - t(12;22), associée au mélanome malin des parties molles.
L'invention concerne également les ARNm issus de l'ADN du gène du chromosome 22 et des ADN de fusion, ainsi que les ADNc qui peuvent en dériver, de
10 même que les protéines pour lesquelles ils codent.
L'invention a donc pour objet les ADN hybrides, résultant de la translocation t (11;22) (q24;ql2) , constitués essentiellement par la fusion d'une partie de la séquence nucleotidique du gène
15 Ews, et de la partie de la séquence nucleotidique du gène Hum-Fli-1 localisée au niveau du point de cassure du chromosome 11 dans ladite translocation. Plus précisément, l'invention concerne les ADN hybrides comprenant la partie de la séquence nucleotidique du
20 gène Hum-Fli-1 depuis la région EWSR2 de 40 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 11 dans cette translocation jusqu'à son extrémité 3'.
Les Inventeurs ont étudié en détail les mécanismes donnant naissance aux différents gènes de
25 fusion de la translocation t(ll;22) .
Les structures exoniques des gènes Ews et Hum-Fli-1 ont été déterminées. Il apparait que les positions précises des points de cassures situés au niveau des régions EWSRl et EWSR2 se trouvent le plus
30 souvent, et peut être exclusivement dans les introns des deux gènes afin que, par le jeu des epissages ayant lieu au cours de la maturation du transcrit primaire, un cadre ouvert de lecture puisse être restauré. La
<_v position des exons par rapport aux sites de restriction
35 a été définie pour les gènes Ews et Hum-Fli-1. Les cadres ouverts de lectures sont divisés et chaque intron entre deux exons codant interrompt les cadres de lectures; la détermination de la majorité des jonctions introns-exons a été réalisée pour les deux gènes Ews et Hum-Fli—1.
A partir de ces travaux, il a été possible de déduire la taille approximative des introns, sites des points de cassures chromosomiques, et de prévoir la multiplicité des produits de fusion possibles. En outre, la séquence promotrice du gène EWS a été déterminée.
De manière avantageuse, les ADN hybrides selon l'invention correspondant aux produits de fusion résultant de la translocation chromosomique récurrente t(ll;22), sont constitués essentiellement d'une partie de la séquence nucleotidique de l'ADNc du gène Ews, et plus précisément de la séquence nucleotidique d'un ADNc résultant de la fusion des gène Ews et Hum-Fli-1.
Des sondes nucléotidiques ou leurs homologues, capables de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence nucleotidique des gènes Ews ou Hum-Fli-1 ou encore avec l'ADNc de l'un de ces gènes ont été préparées. Parmi celles-ci des sondes capables de s'hybrider spécifiquement avec une partie du gène Ews ou une partie du gène Hum-Fli-1 ont été sélectionnées. Des sondes complémentaires de tout ou partie des ADN hybrides, correspondant notamment à la partie des gènes Ews et Hum-Fli-1 altérées par la translocation t(ll;22), ou encore avec l'ARNm ou l'ADNc des gènes de fusion, ont également été obtenues en vue de détecter par hybridation, dans les cellules tumorales d'un sujet, la présence éventuelle d'une translocation t(ll;22) .
Des oligonucléotides de synthèses ont été préparés à partir des séquences nucléotidiques des gènes Ews, Hum-Fli-1 et des produits résultant de la fusion de ces deux gènes, afin de préparer par transcription réverse d'ARNm issu d'un échantillon à analyser, l'ADNc correspondant à la zone de fusion. L'amplification génique in vi tro de cet ADNc par PCR, à l'aide d'oligonucléotides amorces, permet l'analyse des produits amplifiés par des méthodes radioactives ou colorimétriques simples du type électrophorèse sur gel et coloration au bromure d'éthidium, ou révélation immunologique ou fluorographique.
L'invention concerne en conséquence les séquences nucléotidiques, ou leurs analogues, constituant des sondes génétiques capables de s'hybrider avec la séquence nucleotidique des gène Ews ou les ADN hybrides résultant de la fusion des gènes Ews et Hum- fli-1, ou leurs ARNm et ADNc, ainsi que des oligonucléotides issus de ces séquences et constituant des amorces pour la réalisation d'une transcription réverse d'ARN ou la mise en oeuvre d'un processus d'amplification génique par PCR.
La translocation chromosomique t(ll;22) observée dans les tumeurs neurectodermiques donne naissance à des gènes de fusion hybrides capables de coder pour des protéines chimères ayant conservées la partie N-terminale de la protéine EWS codée par le gène Ews et la partie C-terminale de la protéine HUM-FLI-1 codée par le gène Hum-Fli-1.
L'étude approfondie du gène Ews, montre que celui-ci code pour une protéine de 656 acides aminés présentant deux domaines de structure différents. La partie C-terminale est caractérisée par trois régions riches en résidus glycine et arginine et une région de 85 acides aminés homologue au domaine consensus de fixation de l'ARN; ceci suggère fortement que la partie C-terminale de la protéine EWS pourrait interagir avec les acides nucléiques simples brins et plus particulièrement avec l'ARN. La partie N-terminale de la protéine EWS (NTD-EWS) comporte un polypeptide répété et dégénéré possédant une séquence consensus SYGQQS qui présente une faible "homologie avec la CTD-PolII.
La séquence en acides aminées des protéines chimères peut être déduite des ADNc de fusion résultant de la translocation t(ll;22); plusieurs de ces protéines ont été produites in vitro afin notamment de préparer des anticorps polyclonaux et monoclonaux capables de se lier avec les cellules produisant ces protéines et, en conséquence, présentant la translocation t(ll;22) . L'invention concerne donc aussi les protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t(ll;22), ainsi que les anticorps pour la détection immunologique de la présence de ces protéines et plus particulièrement d'une protéine chimère dans un échantillon biologique provenant d'un sujet susceptible de porter une translocation chromosomique t(ll;22) .
L'invention concerne aussi les procédés de détection d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(ll;22) .
Dans une première forme de réalisation, un procédé de détection d'un tel gène comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(ll;22), de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient aptes à s'hybrider avec une sonde; - la mise en contact d'au moins une sonde selon l'invention spécifique, soit d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, soit de la séquence nucleotidique d'un gène de fusion correspondant à la translocation t(ll;22), avec l'échantillon biologique, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde (s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillon;
- la mise en évidence par tous moyens appropriés des hybrides éventuellement formés. Ce procédé peut être mis en oeuvre dans des tests sur membrane ou sur plaque ou sur tout autre support adapté, selon des méthodes de dot blot ou de Southern blot ou encore de filtration.
Une seconde forme de réalisation d'un tel procédé, vise à détecter le transrit d'un gène de fusion résultant de la translocation t(ll;22); ce procédé consiste, à partir de l'ARNm extrait d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(ll;22), à effectuer une transcription réverse à l'aide d'un oligonucléotide de synthèse adéquat pour obtenir un ADNc correspondant; puis à amplifier ledit ADNc selon un processus d'amplification enzymatique à l'aide d'ADN polymérase et d'amorces adéquats, connu sous le nom de PCR, consistant à répéter des cycles de dénaturation de l'ADN, hybridation des amorces et extension à partir des amorces, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. Les produits d'amplification sont analysés par exemple par électrophorèse pour détecter la présence d'un produit correspondant à l'un ou l'autre des gènes impliqués dans la translocation t(ll;22) ou à un gène de fusion. Des méthodes de détection des produits amplifiés par adsorption sur microplaques sont aussi possibles.
L'invention concerne aussi la détection d'une protéine chimère codée par un gène de fusion résultant de la translocation t(ll;22) . Un tel procédé comprend les étapes suivantes : - le traitement d'un échantillon biologique provenant drun patient dont les cellules tumorales sont susceptibles de prés enter une trans location chromosomique t (ll;22) , de façon à rendre les protéines qu ' il contient accessibles à des anticorps;
- la mise en contact de l ' échantillon biologique avec au moins un anticorps spécifique de la protéine chimère selon l ' invention correspondant à la translocation t (ll; 22) , dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps et les protéines présentes dans les cellules de l ' échantillon;
- la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés .
De manière spécifique la détection d'ADN ou d'ARN de fusion ou encore d'une protéine chimère permet le diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées chez les sujets présentant des tumeurs à petites cellules rondes.
L'invention a en conséquence pour objet un procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, consistant, à partir d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(ll;22), à traiter de façon à rendre les acides nucléiques quril contient apte à s'hybrider avec une sonde, à détecter la présence d'une translocation t(ll;22) dans les cellules tumorales. Un tel procédé comprend les étapes suivantes :
- la mise en contact d'au moins une sonde de l'invention, éventuellement marquée, spécifique soit d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, soit de la séquence nucleotidique d'un gène de fusion correspondant à la translocation t(ll;22) , avec l'échantillon biologique traité de façon à ce que les cellules qu'il contient soient lysées et éventuellement à ce que les acides nucléiques contenus dans lesdites cellules soient fragmentés à l'aide d'enzyme de restriction, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde (s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillon;
- la mise en évidence par tout moyen approprié des hybrides éventuellement formés, pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(ll;22) .
Comme précédemment, ce procédé peut être mis en oeuvre dans des tests sur membrane ou sur plaque ou sur tout autre support adapté, selon des méthodes de dot blot ou de Southern blot ou encore de filtration.
Dans une autre forme de réalisation, un procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, consiste, à partir de l'ARNm extrait d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(ll;22), à effectuer une transcription réverse à l'aide d'un oligonucléotide de synthèse adéquat pour obtenir un ADNc correspondant; puis à amplifier ledit ADNc selon un processus d'amplification enzymatique à l'aide d'ADN polymérase et d'amorces adéquats, connu sous le nom de PCR, consistant à répéter des cycles de dénaturation de l'ADN, hybridation des amorces et extension à partir des amorces, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. Les produits d'amplification sont analysés par exemple par électrophorèse pour détecter la présence d'un produit correspondant à un gène de fusion de la translocation t(ll;22) . Des méthodes de détection des produits amplifiés par adsorption sur microplaques sont aussi possibles .
Dans une autre forme de réalisation, un procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentés, consiste, à partir d'un échantillon cellulaire mis en contact avec un ou plusieurs anticorps de l'invention spécifiques de protéines de fusion correspondant à la tranlocation t(ll;22), à détecter immunσlogiquement la présence d'au moins une protéine codée par un ou plusieurs gènes de fusion résultant de la translocation t(ll;22) . Un tel procédé comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(ll;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps monoclonaux;
- la mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un anticorps den l'invention dirigé contre au moins une protéine chimère correspondant à la tranlocation t(ll;22), dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps (s) et les protéines présentes dans les cellules de l'échantillon; - la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés, pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(ll;22) . Des trousses pour la mise en oeuvre de ces procédés peuvent avantageusement être préparées . Ces trousses ou kits contiennent, dans le cas d'un procédé par hybridation, des sondes selon l'invention ainsi que des échantillons d'ADN ou d'ARN témoins; dans le cas d'un procédé par transcription réverse et PCR, les oligonucléotides adéquats pour la mise en oeuvre en oeuvre de chacune de ces techniques ainsi des échantillons d'ADN ou d'ARN témoins; dans le cas d'un procédé immunologique, les anticorps monoclonaux ainsi que des échantillons témoins de réactivité connue.
L'invention concerne également l'utilisation des séquences d'ADN de l'invention pour préparer des nucléotides anti-sens, ou analogues, ayant une activité anti-tumorale; lesquels par hybridation avec tout ou partie du gène de fusion inhibent sa transcription et ainsi empêchent la production d'ARNm et de protéines chimères, et/ou, dans une autre de forme de mise en oeuvre, s 'hybride avec l'ARNm transcrit et inhibe alors la production de protéines chimères . L'invention concerne en conséquence, l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un analogue de cet acide nucléique, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un ADN hybride selon l'invention pour préparer un agent thérapeutique inhibant l'expression d'un gène de fusion résultant d'une translocation chromosomique t(ll; 22) (q24; ql2) , dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées.
L'invention a donc aussi pour objet un agent thérapeutique pour inhiber l'expression d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(ll; 22) (q24; ql2) dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un ADN hybride selon l'invention, ou un analogue de cet ADN, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(ll; 22)- (q24; ql2) .
Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un analogue de cet acide nucléique, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un ARN hybride selon 1 ' invention pour préparer un agent thérapeutique inhibant la traduction de protéines chimères résultant d'une translocation chromosomique t(ll; 22) (q24; ql2) , dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées .
L'invention a donc aussi pour objet un agent thérapeutique pour inhiber la traduction de protéines chimères résultant de la trans location chromosomique t(ll; 22) (q24; ql2) dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un ARN hybride selon l'invention, ou un analogue de cet ARN, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique de l'ARN issu d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(ll; 22) (q24; ql2) . L'invention a aussi pour objet les ADN hybrides résultant de la translocation t(21;22) associée à environ 10% des cas de sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, constitués essentiellement par la fusion d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, et de la partie de la séquence nucleotidique du gène Erg localisée au niveau du point de cassure du chromosome 21 dans cette trans location. Plus précisément, l'invention concerne les ADN hybrides comprenant la partie de la séquence nucleotidique du gène Erg depuis la région au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 21 jusqu'à son extrémité 3'.
Les Inventeurs ont étudié en détail les mécanismes donnant naissance aux différents gènes de fusion de la translocation t(21;22) . De manière avantageuse, les ADN hybrides selon l'invention correspondant aux produits de fusion résultant de la translocation chromosomique récurrente t(21;22) sont constitués essentiellement d'une partie de la séquence nucleotidique de l'ADNc du gène Ews, et plus précisément de la séquence nucleotidique d'un ADNc résultant de la fusion des gène Ews et Erg.
Des sondes nucléotidiques ou leurs homologues, capables de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence nucleotidique des gènes Ews ou Erg ou encore avec l'ADNc de l'un de ces gènes ont été préparées. Parmi celles-ci des sondes capables de s'hybrider spécifiquement avec une partie du gène Ews ou une partie du gène Erg ont été sélectionnées . Des sondes complémentaires de tout ou partie des ADN hybrides, correspondant notamment à la partie des gènes Ews et Erg altérées par la translocation t(21;22), ou encore avec l'ARNm ou l'ADNc des gènes de fusion, ont également été obtenues en vue de détecter par hybridation, dans les cellules tumorales d'un sujet, la présence éventuelle d'une translocation t(21;22) .
Des oligonucléotides de synthèses ont été préparés à partir des séquences nucléotidiques des gènes Ews, Erg et des produits résultant de la fusion de ces deux gènes, afin de préparer par transcription réverse d'ARNm issu d'un échantillon à analyser, l'ADNc correspondant à la zone de fusion. L'amplification génique in vi tro de cet ADNc par PCR, à l'aide d'oligonucléotides amorces, permet l'analyse des produits amplifiés par des méthodes radioactives ou colorimétriques simples du type électrophorèse sur gel et coloration au bromure d'éthidium, ou révélation immunologique ou fluorographique.
L'invention concerne en conséquence les séquences nucléotidiques, ou leurs analogues, constituant des sondes génétiques capables de s'hybrider avec la séquence nucleotidique des gène Ews ou les ADN hybrides résultant de la fusion des gènes Ews et Erg, ou leurs ARNm et ADNc, ainsi que des oligonucléotides issus de ces séquences et constituant des amorces pour la réalisation d'une transcription réverse d'ARN ou la mise en oeuvre d'un processus d'amplification génique par PCR.
La translocation chromosomique t(21;22) observée dans les tumeurs neurectodermiques donne naissance à des gènes de fusion hybrides capables de coder pour des protéines chimères ayant conservées la partie N-terminale de la protéine EWS codée par le gène Ews et la partie C-terminale de la protéine ERG codée par le gène Erg.
Comme dans le cas des protéines chimères résultant de la fusion des gènes Ews et Hum-Fli-1, les protéine chimères résultant de la translocation t(21,22) conserve le domaine NTD-EWS, lequel est en phase avec le domaine de fixation de l'ADN de la protéine ERG.
La séquence en acides aminées des protéines chimères peut être déduite des ADNc de fusion résultant de la translocation t(21;22); certaines de ces protéines ont été produites in vitro afin notamment de préparer des anticorps polyclonaux et monoclonaux capables de se lier avec les cellules produisant ces protéines et, en conséquence, présentant la translocation t(21;22) . L'invention concerne donc aussi les protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t(21;22), ainsi que les anticorps pour la détection immunologique de la présence de ces protéines et plus particulièrement d'une protéine chimère dans un échantillon biologique provenant d'un sujet susceptible de porter une translocation chromosomique t(21;22) . L'invention concerne aussi les procédés de détection d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(21;22) .
Dans une première forme de réalisation, un procédé de détection d'un tel gène comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(21;22), de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient aptes à s'hybrider avec une sonde;
- la mise en contact d'au moins une sonde selon l'invention spécifique, soit d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, soit de la séquence nucleotidique d'un gène de fusion correspondant à la translocation t(21;22), avec l'échantillon biologique, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde (s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillon;
- la mise en évidence par tous moyens appropriés des hybrides éventuellement formés.
Ce procédé peut être mis en oeuvre dans des tests sur membrane ou sur plaque ou sur tout autre support adapté, selon des méthodes de dot blot ou de Southern blot ou encore de filtration.
Une seconde forme de réalisation d'un tel procédé, vise à détecter le transrit d'un gène de fusion résultant de la translocation t(21;22) ; ce procédé consiste, à partir de l'ARNm extrait d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(21;22), à effectuer une transcription réverse à l'aide d'un oligonucléotide de synthèse adéquat pour obtenir un ADNc correspondant; puis à amplifier ledit ADNc selon un processus d'amplification enzymatique à l'aide d'ADN polymérase et d'amorces adéquats, connu sous le nom de PCR, consistant à répéter des cycles de dénaturation de l'ADN, hybridation des amorces et extension à partir des amorces, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. Les produits d'amplification sont analysés par exemple par électrophorèse pour détecter la présence d'un produit correspondant à l'un ou l'autre des gènes impliqués dans la translocation t(21;22) ou à un gène de fusion. Des méthodes de détection des produits amplifiés par adsorption sur microplaques sont aussi possibles. L'invention concerne aussi la détection d'une protéine chimère codée par un gène de fusion résultant de la translocation t(21;22) . Un tel procédé comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique provenant d'un patient dont les cellules tumorales sont susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(21;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps;
- la mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un anticorps spécifique d'au moins une protéine chimère selon l'invention correspondant à la translocation t(21;22), dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps et les protéines présentes dans les cellules de l'échantillon;
- la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés .
De manière spécifique la détection d'ADN ou d'ARN de fusion résultant de la translocation t(21;22) ou encore d'une protéine chimère correspondante, permet le diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées chez les sujets présentant des tumeurs à petites cellules rondes. L'invention a en conséquence pour objet un procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, consistant, à partir d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(21;22), à traiter de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient apte à s'hybrider avec une sonde, à détecter la présence d'une translocation t(21;22) dans les cellules tumorales. Un tel procédé comprend les étapes suivantes : - la mise en contact d'au moins une sonde de l'invention, éventuellement marquée, spécifique soit d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, soit de la séquence nucleotidique d'un gène de fusion résultant de la translocation t(21;22) , avec l'échantillon biologique traité de façon à ce que les cellules qu'il contient soient lysées et éventuellement à ce que les acides nucléiques contenus dans lesdites cellules soient fragmentés à l'aide d'enzyme de restriction, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde (s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillon; la mise en évidence par tout moyen approprié des hybrides éventuellement formés, pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(21;22) .
Comme précédemment, ce procédé peut être mis en oeuvre dans des tests sur membrane ou sur plaque ou sur tout autre support adapté, selon des méthodes de dot blot ou de Southern blot ou encore de filtration. Dans une autre forme de réalisation, un procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, consiste, à partir de l'ARNm extrait d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(21;22), à effectuer une transcription réverse à l'aide d'un oligonucléotide de synthèse adéquat pour obtenir un ADNc correspondant; puis à amplifier ledit ADNc selon un processus d'amplification enzymatique à l'aide d'ADN polymérase et d'amorces adéquats, connu sous le nom de PCR, consistant à répéter des cycles de dénaturation de l'ADN, hybridation des amorces et extension à partir des amorces, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. Les produits d'amplification sont analysés par exemple par électrophorèse pour détecter la présence d'un produit correspondant à un gène de fusion de la trans location t(21;22) . Des méthodes de détection des produits amplifiés par adsorption sur microplaques sont aussi possibles.
Dans une autre forme de réalisation, un procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentés, consiste, à partir d'un échantillon cellulaire mis en contact avec un ou plusieurs anticorps de l'invention spécifiques de protéines de fusion, à détecter immunologiquement la présence d'au moins une protéine codée par un ou plusieurs gènes de fusion résultant de la translocation t(21;22) . Un tel procédé comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(21;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps monoclonaux;
* - la mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un anticorps dirigé contre au
1 5 moins une protéine chimère correspondant à la translocation t(21;22), dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps (s) et les protéines présentes dans les cellules de l'échantillon;
10 - la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés, pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(21;22) .
15 La translocation t(21;22) étant associée à environ 10% des cas de sarcome d'Ewing et la translocation t(ll;22) étant associée à au moins 80% des cas de sarcome d'Ewing, il est avantageux, pour réaliser un diagnostic du sarcome d'Ewing de mettre en oeuvre
20 simultanément les procédés visant à détecter dans les cellules tumorales de patients susceptibles de présenter ces translocations chromosomiques, les produits résultant de ces deux translocations.
Des trousses pour la mise en oeuvre de ces
25 procédés peuvent avantageusement . être préparées. Ces trousses ou kits contiennent, dans le cas d'un procédé par hybridation, des sondes selon l'invention ainsi que des échantillons d'ADN ou d'ARN témoins; dans le cas d'un procédé par transcription réverse et PCR, les
30 oligonucléotides adéquats pour la mise en oeuvre en oeuvre de chacune de ces techniques ainsi des échantillons d'ADN ou d'ARN témoins; dans le cas d'un
•4 procédé immunologique, les anticorps monoclonaux ainsi que des échantillons témoins de réactivité connue. L'invention concerne également l'utilisation des séquences d'ADN de l'invention pour préparer des nucléotides anti-sens, ou analogues, ayant une activité anti-tumorale; lesquels par hybridation avec tout ou partie du gène de fusion inhibent sa transcription et ainsi empêchent la production d'ARNm et de protéines chimères, et/ou, dans une autre de forme de mise en oeuvre, s'hybride avec l'ARNm transcrit et inhibe alors la production de protéines chimères. L'invention concerne en conséquence, l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un analogue de cet acide nucléique, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un ADN hybride correspondant à la translocation t(21;22) selon l'invention pour préparer un agent thérapeutique inhibant l'expression d'un gène de fusion résultant de ladite translocation , dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées .
L'invention a donc aussi pour objet un agent thérapeutique pour inhiber l'expression d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(21; 22) dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un ADN hybride selon l'invention correspondant à ladite translocation, ou un analogue de cet ADN, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(21;22) . Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un analogue de cet acide nucléique, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un ARN hybride selon l'invention correspondant à la translocation t(21;22) pour préparer un agent thérapeutique inhibant la traduction de protéines chimères résultant d'une telle translocation chromosomique, dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées. L'invention a donc aussi pour objet un agent thérapeutique pour inhiber la traduction de protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t(21; 22) dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un ARN hybride selon l'invention correspondant à la translocation t(21;22) , ou un analogue de cet ARN, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique de l'ARN issu d'un gène de fusion résultant de cette translocation chromosomique.
La translocation t(21;22) étant associée à environ 10% des cas de sarcome d'Ewing et la translocation t(ll;22) étant associée à au moins 80% des cas de sarcome d'Ewing, l'invention concerne, de façon avantageuse, un agent thérapeutique constitué essentiellement, soit des agents thérapeutiques inhibant l'expression des gènes de fusion résultant de ces deux translocations chromosomiques, soit des agents thérapeutiques inhibant la traduction des gènes de fusion résultant de ces deux translocations chromosomiques .
L'invention a enfin pour objet les ADN hybrides, résultant de la trans locat ion t (12;22) (ql3;ql2) , constitués essentiellement par la fusion d'une partie de la séquence nucleotidique du gène
Ews, et de la partie de la séquence nucleotidique du gène Atf-1 localisée au niveau du point de cassure du chromosome 12 dans ladite translocation. Plus précisément, l'invention concerne les ADN hybrides comprenant la partie de la séquence nucleotidique du gène Atf-1 depuis la région au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 12 dans cette translocation jusqu'à son extrémité 3'.
Les Inventeurs ont étudié en détail les mécanismes donnant naissance aux différents gènes de fusion de la translocation t(ll;22) .
De manière avantageuse, les ADN hybrides selon l'invention correspondant aux produits de fusion résultant de la translocation chromosomique récurrente t(12;22), sont constitués essentiellement d'une partie de la séquence nucleotidique de l'ADNc du gène Ews, et plus précisément de la séquence nucleotidique d'un ADNc résultant de la fusion des gène Ews et Atf-1.
Des sondes nucléotidiques ou leurs homologues, capables de s'hybrider avec tout ou partie de la séquence nucleotidique des gènes Ews ou Hum-Fli-1 ou encore avec l'ADNc de l'un de ces gènes ont été préparées. Parmi celles-ci des sondes capables de s'hybrider spécifiquement avec une partie du gène Ews ou une partie du gène Hum-Fli-1 ont été sélectionnées.
Des sondes complémentaires de tout ou partie des ADN hybrides, correspondant notamment à la partie des gènes Ews et Atf-1 altérées par la translocation t(12;22), ou encore avec l'ARNm ou l'ADNc des gènes de fusion, ont également été obtenues en vue de détecter par hybridation, dans les cellules tumorales d'un sujet, la présence éventuelle d'une translocation t(12;22) .
Des oligonucléotides de synthèses ont été préparés à partir des séquences nucléotidiques des gènes Ews, Atf-1 et des produits résultant de la fusion de ces deux gènes, afin de préparer par transcription réverse d'ARNm issu d'un échantillon à analyser, l'ADNc correspondant à la zone de fusion. L'amplification génique in vitro de cet ADNc par PCR, à l'aide d'oligonucléotides amorces, permet l'analyse des produits amplifiés par des méthodes radioactives ou colorimétriques simples du type électrophorèse sur gel et coloration au bromure d'éthidium, ou révélation immunologique ou fluorographique. L'invention concerne en conséquence les séquences nucléotidiques, ou leurs analogues, constituant des sondes génétiques capables de s'hybrider avec la séquence nucleotidique des gène Ews ou les ADN hybrides résultant de la fusion des gènes Ews et Atf-1, ou leurs ARNm et ADNc, ainsi que des oligonucléotides issus de ces séquences et constituant des amorces pour la réalisation d'une transcription réverse d'ARN ou la mise en oeuvre d'un processus d'amplification génique par PCR. La translocation chromosomique t(12;22) observée dans les tumeurs du mélanome malin des parties molles (MMSP) donne naissance à des gènes de fusion hybrides capables de coder pour des protéines chimères ayant conservées la partie N-terminale de la protéine EWS codée par le gène Ews et la partie C-terminale de la protéine ATF-1 codée par le gène Atf-1.
La séquence en acides aminées des protéines chimères peut être déduite des ADNc de fusion résultant de la translocation t(12;22) ; l'une de ces protéines a été produite in vitro afin notamment de préparer des anticorps polyclonaux et monoclonaux capables de se lier avec les cellules produisant cette protéine et, en conséquence, présentant la translocation t(12;22) . L'invention concerne donc aussi les protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t(12;22), ainsi que les anticorps pour la détection immunologique de la présence de ces protéines et plus particulièrement d'une protéine chimère dans un échantillon biologique provenant d'un sujet susceptible de porter une translocation chromosomique t(12;22) . L'invention concerne aussi les procédés de détection d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(12;22) .
Dans une première forme de réalisation, un procédé de détection d'un tel gène comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(12;22), de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient aptes à s'hybrider avec une sonde;
- la mise en contact d'une sonde selon l'invention spécifique, soit d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, soit de la séquence nucleotidique d'un gène de fusion correspondant à la translocation t(12;22), ou d'un mélange de ces sondes, avec l'échantillon biologique, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde(s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillo ;
- la mise en évidence par tous moyens appropriés des hybrides éventuellement formés .
Ce procédé peut être mis en oeuvre dans des tests sur membrane ou sur plaque ou sur tout autre support adapté, selon des méthodes de dot blot ou de Southern blot ou encore de filtration.
Une seconde forme de réalisation d'un tel procédé, vise à détecter le transrit d'un gène de fusion résultant de la translocation t(12;22); ce procédé consiste, à partir de l'ARNm extrait d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(12;22), à effectuer une transcription réverse à l'aide d'un oligonucléotide de synthèse adéquat pour obtenir un ADNc correspondant; puis à amplifier ledit ADNc selon un processus d'amplification enzymatique à l'aide d'ADN polymérase et d'amorces adéquats, connu sous le nom de PCR, consistant à répéter des cycles de dénaturation de l'ADN, hybridation des amorces et extension à partir des amorces, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. Les produits d'amplification sont analysés par exemple par électrophorèse pour détecter la présence d'un produit correspondant à l'un ou l'autre des gènes impliqués dans la translocation t(12;22) ou à un gène de fusion. Des méthodes de détection des produits amplifiés par adsorption sur microplaques sont aussi possibles.
L'invention concerne aussi la détection d'une protéine chimère codée par un gène de fusion résultant de la translocation t(12;22) . Un tel procédé comprend les étapes suivantes : - le traitement d'un échantillon biologique provenant d'un patient dont les cellules tumorales sont susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(12;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps; - la mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un anticorps spécifique de la protéine chimère selon l'invention correspondant à la translocation t (12,22), dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps et les protéines présentes dans les cellules de l'échantillon;
- la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés. De manière spécifique la détection d'ADN ou d'ARN de fusion ou encore d'une protéine chimère permet le diagnostic du MMSP .
L'invention a en conséquence pour objet un procédé de diagnostic du MMSP, consistant, à partir d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(12;22), à traiter de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient apte à s'hybrider avec une sonde, à détecter la présence d'une translocation t(12;22) dans les cellules tumorales. Un tel procédé comprend les étapes suivantes :
- la mise en contact d'au moins une sonde de l'invention, éventuellement marquée, spécifique soit d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, soit de la séquence nucleotidique d'un gène de fusion correspondant à la translocation t(12;22), avec l'échantillon biologique traité de façon à ce que les cellules qu'il contient soient lysées et éventuellement à ce que les acides nucléiques contenus dans lesdites cellules soient fragmentés à l'aide d'enzyme de restriction, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde(s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillon; - la mise en évidence par tout moyen approprié des hybrides éventuellement formés, pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(12;22) .
Comme précédemment, ce procédé peut être mis en oeuvre dans des tests sur membrane ou sur plaque ou sur tout autre support adapté, selon des méthodes de dot blot ou de Southern blot ou encore de filtration.
Dans une autre forme de réalisation, un procédé de diagnostic du MMSP, consiste, à partir de l'ARNm extrait d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(12;22), à effectuer une transcription réverse à l'aide d'un oligonucléotide de synthèse adéquat pour obtenir un ADNc correspondant; puis à amplifier ledit ADNc selon un processus d'amplification enzymatique à l'aide d'ADN polymérase et d'amorces adéquats, connu sous le nom de PCR, consistant à répéter des cycles de dénaturation de l'ADN, hybridation des amorces et extension à partir des amorces, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. Les produits d'amplification sont analysés par exemple par électrophorèse pour détecter la présence d'un produit correspondant à un gène de fusion de la translocation t(ll;22) . Des méthodes de détection des produits amplifiés par adsorption sur microplaques sont aussi possibles.
Dans une autre forme de réalisation, un procédé de diagnostic du MMSP, consiste, à partir d'un échantillon cellulaire mis en contact avec un ou plusieurs anticorps de l'invention spécifiques de protéines de fusion, à détecter immunologiquement la présence d'une protéine codée par un gène de fusion résultant de la translocation t(12;22) . Un tel procédé comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(12;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps monoclonaux; la mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un anticorps dirigé contre au moins une protéine chimère correspondant à la translocation t(12;22), dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps (s) et les protéines présentes dans les cellules de l'échantillon;
- la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés, pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(12;22) .
Des trousses pour la mise en oeuvre de ces procédés peuvent avantageusement être préparées . Ces trousses ou kits contiennent, dans le cas d'un procédé par hybridation, des sondes selon l'invention ainsi que des échantillons d'ADN ou d'ARN témoins; dans le cas d'un procédé par transcription réverse et PCR, les oligonucléotides adéquats pour la mise en oeuvre en oeuvre de chacune de ces techniques ainsi des échantillons d'ADN ou d'ARN témoins; dans le cas d'un procédé immunologique, les anticorps monoclonaux ainsi que des échantillons témoins de réactivité connue. L'invention concerne également l'utilisation des séquences d'ADN de l'invention correspondant à une translocation t(12;22), pour préparer des nucléotides anti-sens, ou analogues, ayant une activité anti¬ tumorale; lesquels par hybridation avec tout ou partie du gène de fusion inhibent sa transcription et ainsi empêchent la production d'ARNm et de protéines chimères, et/ou, dans une autre de forme de mise en oeuvre, s 'hybride avec l'ARNm transcrit et inhibe alors la production de protéines chimères. L'invention concerne en conséquence, l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un analogue de cet acide nucléique, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un ADN hybride selon l'invention correspondant à une translocation t(12;22), pour préparer un agent thérapeutique inhibant l'expression d'un gène de fusion résultant d'une translocation chromosomique t (12;22) (ql3;ql2) , dans les cellules tumorales de patients atteints de MMSP.
L'invention a donc aussi pour objet un agent thérapeutique pour inhiber l'expression d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t (12; 22) (ql3;ql2) dans les cellules tumorales de patients atteints de MMSP, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un ADN hybride selon l'invention correspondant à la translocation t(12;22), ou un analogue de cet ADN, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(12;22) (ql3;ql2) .
Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique ou d'un analogue de cet acide nucléique, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un ARN hybride selon l'invention correspondant à une translocation t(12;22) , pour préparer un agent thérapeutique inhibant la traduction de protéines chimères résultant d'une translocation chromosomique t (12;22) (ql3;ql2) , dans les cellules tumorales de patients atteints MMSP .
L'invention a donc aussi pour objet un agent thérapeutique pour inhiber la traduction de protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t(12; 22) (ql3; ql2) dans les cellules tumorales de patients atteints de MMSP, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un ARN hybride selon l'invention correspondant à une translocation t(12;22), ou un analogue de cet ARN, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique de l'ARN issu d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(12; 22) (ql3; ql2) . L ' invention concerne aussi l ' acide nucléique correspondant au gène Ews , ainsi que l ' ARNm qui en est issu et l 'ADNc qui en dérive, de même que la protéine pour laquelle il code . En effet, la préparation de sondes et d' amorces constituent des outils permettant la détection du gène Ews normal; cette détection du gène Ews normal pouvant être avantageusement conjuguée aux procédés de détection des gènes de fusion résultant des diverses translocations dans lesquelles ce gène est impliqué, afin de servir de témoin positif .
Les ADN de l ' invention peuvent être introduites dans des vecteurs d' expression dérivés de plasmides ou de virus , dans le but , notamment , de produire les protéines correspondant à ces séquences d'ADN, afin de préparer des anticorps spécifiques de ces protéines, ou encore afin de disposer de modèles d' étude pharmacologique .
D ' autres caractéristiques de l ' invention apparaîtront au cours de la description qui suit et qui se réfèrent à des exemples , étant entendu que ces exemples ne sauraient constituer une quelconque limitation à la portée des revendications .
EXEMPLE 1 : ETUDE DE LA TRANS LOCATION CHROMOSOMIQUE RECURRENTE t ( 11 : 22 ) ASSOCIEE A U
SARCOME D ' EWING
X ~ Clonage _\s≤ points de cassures
En utilisant un panel de cellules somatiques hybrides, il a été montré que le locus identifié avec la sonde VTIIF2 et celui codant pour le Facteur d' Inhibition de la Leucémie (LIF) sont de chaque coté et à proximité du point de cassure du chromosome 22 (Delattre O, Azambuja C J, Aurias A et al, Genomics 9, 721-727, (1991)) . Selon l'échelle définie par Trask et al. (Trask B, Pinkel D, Van Den Engh G, Genomics 5, 710- 717 (1989)), la distance entre ces deux loci a été estimée par Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur noyaux interphasiques entre 1,5 et 2 Mégabases.
Le criblage différentiel d'une banque de cosmides spécifiques du chromosome 22 avec plusieurs produits Alu-PCR (Nelson D L, Ledbetter S A, Corbo L, Victoria M F, Ramirez-Solis R, Webster T D, Ledbetter D H, Caskey C T, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6686-6690 (1989) ) générés à partir de quatre cellules hybrides, a conduit à l'identification de trois loci indépendants qui sont télomériques au point de cassure et à proximité du locus LIF (Zucman J, Delattre O, Desmaze C et al, Genomics, sous presse) . Deux d'entre-eux sont disposés sur un large contig de 450 Kilobases préalablement construit par expansion du locus LIF. Par la technique FISH bi-couleur sur noyaux interphasiques, le troisième locus, identifié grâce aux cosmides chevauchant Cos5 et Cos6 (Zucman J, Delattre O, Desmaze C et al, Genomics, sous presse) , a été localisé entre les loci VIIIF2 et LIF. Le locus Cos5/Cos6 a été progressivement étendu par isolement récurrent de clones chevauchant en utilisant une banque de cosmides spécifiques du chromosome 22.
Au cours de cette procédure, il a été mis en évidence que deux cosmides, dénommés B6 et G9, chevauchent le point de cassure du chromosome 22 sur le dérivé 11 de la translocation t(ll;22), de A3EW2-3B et Alu6, deux cellules hybrides dérivant respectivement des tumeurs ES et PN et contenant le der (11) (Geurts van Kessel A H M, Turc-Carel C, Klein A de et al, Mol. Cel. Biol. 5, 427-429 (1985) ; Zhang F, Delattre O, Rouleau G et al, Genomics 6, 174-177 (1990)) . La technique FISH sur chromosomes métaphasiques d'une lignée cellulaire PN mise en oeuvre avec l'un de ces deux cosmides confirme que le point de cassure a été franchi car un signal fluorescent est alors observé sur le dérivé 22 de la translocation.
Des fragments d'ADN, en copies uniques dans le génome humain, proches du point de cassure du chromosome 22 ont été sélectionnés pour analyser l'ADN d'un groupe de 20 tumeurs ES et PN. Dans tous les cas, un point de cassure est observé dans la même région de environ 7 Kb, laquelle a été dénommée EWSRl pour Région 1 du Sarcome d'Ewing.
Une banque de cosmides fabriquée à partir de la lignée cellulaire ICB104 dérivant d'une tumeur PN (Zhang F, Delattre O, Rouleau G et al, Genomics 6, 174- 177 (1990) ) a été criblée avec des sondes issues de EWSRl . Trois groupes de cosmides chevauchant ont été isolés, l'un correspondant au chromosome 22 normal et les deux autres à chacun des deux dérivés de la translocation. Par la suite, des fragments non issus du chromosome 22 mais provenant de ces cosmides ont été utilisés pour identifier un clone, dont il a été mis en évidence par la technique FISH qu'il dérivait de la région q2 du chromosome 11. La comparaison des cartes de restriction des régions intactes et réarrangées des chromosomes 11 et 22 indique, au niveau de résolution autorisée par l'étude, que la translocation est simple et réciproque.
Le locus du chromosome 11 a été étendu sur 100 Kb par isolement récurrent de cosmides chevauchants . Le criblage du même groupe de 20 tumeurs avec des sondes de cette région a permis d'identifier 17 points de cassures sur le chromosome 11. Ils sont répartis, sans agrégation évidente, sur une région de plus de 40 Kb dénommée EWSR2. De manière intéressante, les deux tumeurs avec une translocation variante et présentant toutes les deux un chromosome 11 cytogénétiquement intact sont altérées dans la région EWSR2; ce qui met en évidence un réarrangement sub-microscopique dans ces tumeurs .
Au niveau moléculaire, les positions des points de cassure dans les tumeurs ES et PN ne démontrent pas une spécificité évidente, suggérant qu'ils ne permettent pas de différencier ces deux cancers très proches .
II - Caraetérisation des σ è n e s impliqués dans la translocation
La région EWSRl est flanquée de trois groupes de sites pour une endonucléase à site de restriction rare. Il apparaît dans les cellules humaines que ces sites sont au moins partiellement non méthylés, ce qui suggère qu'ils font partie d'îlots HTF (Lindsay S, Bird A P, Nature 327, 336-338, (1987)) .
Comme cela a été mis en évidence par hybridation croisée sur de l'ADN de souris et de hamster, la région EWSRl est inclue dans une région phylogénétiquement conservée. Des fragments ont été sélectionnés pour cribler des northern blots préparés à partir d'ARN extrait de 7 tumeurs PNET présentant une translocation t(ll;22), 3 tumeurs ES non caryotypées et plusieurs tissus normaux (poumon, coeur, foie, pancréas, placenta, rein, muscle squelettique) et 4 tumeurs de contrôle ou lignées cellulaires (neuroblastome, phéochromocytome, adenocarcinome du colon, HeLa) .
Un fragment de restriction EcoRl de 3 Kb dénommé 22RR3, centromérique de la région EWSRl, détecte dans tous les échantillons un transcrit de 2,5 Kb et dans les 10 PNET testés un autre transcrit spécifique de taille variable.
Le même transcrit de 2,5 Kb et non les transcrits spécifiques des tumeurs PNET, est observé avec une sonde télomérique de la région EWSRl (sonde 22RR12) . A l'inverse, une sonde distale de la région EWSR2 du chromosome 11 (sonde 11RR1) donne le résultat opposé en détectant le transcrit spécifique des tumeurs PNET et pas le transcrit de 2,5 Kb. Ces résultats suggèrent fortement la présence dans les tumeurs PNET testées d'un ARN chimère liant ensemble les séquences codées par le chromosome 22 et le chromosome 11. En outre, la sonde 11RR1 montre à l'évidence un transcrit dans les ARN messagers des tissus du poumon, du coeur et du foie, lequel n'est pas observé dans les autres tissus normaux testés.
Des sondes dénommées 22RR3 et 22RR12 ont été utilisées pour cribler une banque d'ADNc humain, et les clones chevauchants hy ridant avec les deux sondes ont été caractérisés . Le clone le plus grand contient 1968 pb dont la phase de lecture ouverte comporte un premier codon ATG se présentant dans le contexte d'une séquence consensus Kozak, il code une protéine de 656 acides aminés dénommée EWS. Une recherche dans des bases de données (NBRF et Swissprot) a révélé que la séquence des 285 premiers acides aminés présente une homologie avec des protéines telles que le glutène, la gliadine, la protéine chorionique S36, 1'annexine VII, les ordéines Bl et C. Toutefois, les plus grandes homologies ont été observées avec le domaine C-terminal de la grosse sous-unité des ARN polymérases II Eucaryote (CTD-polII) .
Ces différentes molécules contiennent un domaine comprenant la répétition d'un peptide de sept résidus d'acides aminés dont la tyrosine et un taux important de proline et serine. Ce domaine peut adopter une structure secondaire particulière dénommée pro-β
(Matsushima N, Creutz C E, Kretsinger R H, Proteins 7, 125-155, (1990)) . La portion C-terminale de la protéine EWS contient trois régions (300-340, 454-513, 559-640) riches en glycine (46%) , arginine (19%) et proline (13%) qui présente des homologies avec les protéines riches en glycines telles que le collagène, la kératine et les protéines liant les acides nucléiques simples brins.
Une séquence de 85 acides aminés disposée entre la première et la deuxième région est homologue à une séquence rencontrée dans plusieurs protéines liant l'ARN. Ce domaine contient les séquences consensus RNP-1 et RNP-2 (Bandziulis R J, Swanson M S, Dreyfuss G, Gènes Dev. 3, 431-437 (1989)) et a été montré comme le motif de reconnaissance de l'ARN pour la protéine snRNP Ul de 70 Kd (Query C C, Bentley R C, Keene J D, Cell 57, 89- 101 (1989)) . Dans cette région, d'autres marques d'homologies similaires ont été trouvées avec plusieurs protéines liant l'ARN et fonctionnellement caractérisées. Toutefois, le taux le plus élevé d'homologie a été obtenu avec le produit de traduction de l'ADNc du clone pen pl9 de Drosophile, lequel n'a pas de fonction connue et contient des- éléments du type pen répétés (Haynes S R, Rebbert M L, Mozer B A, Forquignon F, Dawid I B, Proc. Natl. Acad. Sci . USA 84, 1819-1823 (1987) ) .
La sonde dénommée 11RR1 a été utilisée pour retrouver 11 clones se chevauchant issus d'une banque d'ADNc de moelle humaine. Le clone le plus long, dénommé BM025, avec un insert de 2939 pb, contient une phase ouverte de lecture de 1356 pb.
L'analyse de la séquence en acides aminés déduite, révèle une homologie avec des membres de la famille des gènes Ets. Pour le gène humain Ets-1, cette homologie est proche de 33 % dans le domaine d'activation de la transcription (Gutman A, Wasylyk C, Trends Genêt. 7, 49-54 (1991)) et atteint 70 % pour le domaine de fixation de l'ADN (Karim F D, Urness L D, Thummel C S et al. Gènes Dev. 4, 1451-1453 (1990)) .
L'homologie la plus frappante a été mise en évidence avec le gène Fli-1 de souris pour lequel
1'identité en acides aminés atteint 97 % (Ben-David Y, Giddens E B, Letwin K, Bernstein A, Gènes Dev. 5, 908-
918 (1991) ) .
III - Caractérisât-ion des ARNm chimères codant pour L≤_≤ protéines hybrides
L'hybridation des extrémités 5' des deux ADNc sur les contigs des chromosomes 11 et 22 a montré que les deux gènes sont transcrits dans le sens du centro ère vers le télomère. Le transcrit de fusion vu en northern blots est initialisé sur le chromosome 22 et terminé sur le chromosome 11. Afin d'étudier la jonction des deux gènes, les Inventeurs ont recherché les exons flanquants de manière centromérique la région EWSRl et de manière télomérique la région EWRS2. Deux. fragments génomiques dénommés 22HP.5 et 11RR1 qui s'hybrident respectivement avec les ADNc codant pour les protéines EWS et Hum-Fli- 1 ont été séquences et ont révélé dans chaque cas la présence d'un exon. Des oligonucléotides homologues à ces exons ont été utilisés pour réaliser une transcription réverse et amplifié par PCR les ARN issus de différentes sources .
A la différence des ARN issus de tissus de sein, de neuroblastome (IMR32) , de phéochromocytome, de lymphome, de carcinome ovarien, tous les ARN issus de 7 tumeurs PNET avec une translocation t(ll;22) et ceux issus de 3 tumeurs ES non-caryotypées permettent l'amplification d'un produit spécifique. Selon la tumeur, trois tailles différentes de produits d'amplification ont été observées dans un premier temps. Leurs séquences révèlent trois types de transcrits de fusion.
Le premier type contient des séquences exoniques présentes dans les fragments 22HP.5 et 11RR1 et une séquence de 174 pb issue de l'exon adjacent le plus centromérque du gène Hum-Fli-1.
Les deuxième et troisième types diffèrent du premier du fait de la présence au niveau du site de jonction de séquences supplémentaires provenant respectivement de la région codante des gènes Ews et Hum-Fli-1. Dans tous les cas, la fusion est en phase, et les protéines chimères résultantes diffèrent de la protéine EWS par la substitution du domaine de fixation de l'ARN, par le domaine de fixation de l'ADN de la protéine HUM-FLI-1 homologue au domaine de la protéine ETS. Une étude similaire réalisée sur environ 40 tumeurs ES et PN a permis de mettre en évidence d'autres types de gènes de fusion résultant de la translocation chromosomique t(ll;22) .
IV - Discussion
La protéine EWS partage à travers sa séquence totale des homologies avec des protéines connues pour interagir avec des acides nucléiques simples brins et plus particulièrement avec l'ARN.
Premièrement, la région C-terminale contient un motif de reconnaissance de l'ARN qui est aussi rencontré dans un groupes de protéines qui participent au processus post-transcriptionnel de l'ARN (Frankel A D, Mattaj I W, Rio D C, Cell 67, 1041-1046 (1991)) . En outre, dans la protéine Ews ce motif est flanqué par des séquences d'acides aminés riches en glycine. De telles séquences, observées dans plusieurs protéines de fixation de l'ARN, interagissent également avec l'ARN (Kumar A, Casas-Finet J R, Luneau Cj et al, J. Biol. Chem. 265, 17094-17100 (1990) ; Munroe S H, Dong X, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 895-899 (1992)) . Deuxièmement, la région N-terminale de la protéine EWS présente une homologie avec la région CTD-polII. Il a été suggéré que ce domaine interagit avec les facteurs de transcription au niveau du complexe d'initiation (Corden J L, TIBS 15, 383-387 (1990)) . Ces homologies de la protéine EWS suggèrent qu'elle possède deux domaines fonctionnels différents qui participent ensemble au mécanisme d'expression génétique.
La famille des gènes Ets est impliqus à travers différents mécanismes dans les erythroleucémies induites chez la souris et la poule par des rétrovirus . Le premier membre de cette famille a été découvert comme étant un élément génétique co-transduit donnant jour à des protéines hybrides contenant les séquences MYB et ETS-1 (Watson D K, Ascione R, Papas T s, Crit. Rev. Oncogenesis 1, 409-436 (1990)) . Indépendamment, deux autres membres de cette famille, Spi-1 (PU1) et Fli-1, sont activés par 1'intégration rétrovirale de différents souches du virus de la leucémie de Friend (Ben-David Y, Bernstein A, Cell 66, 831-834 (1991)) . Tous les membres de cette famille de protéines ont une région hautement conservée, dénommée domaine ETS (Karim F D, Urness L D, Thummel C S et al; Gènes Dev. 4, 1451-1453 (1990)), dont on a montré dans la plupart des cas qu'il se fixe spécifiquement à des éléments de la région promotrice riches en purine, et favorise l'activation transcriptionnelle de différents gènes viraux ou cellulaires d'eucaryotes (Gutman A, Wasylyk C, Trends Genêt. 7, 49-54 (1991) ; Lim F, Kraut N, Frampton J, Graf T, EMBO J. 11, 643-652 (1992) ; Hipskind R A, Rao V N, Mueller C G F et al, Nature 354, 531-534, (1991)) . En outre, du côté N-terminal, les protéines ETS-1 et ETS-2 contiennent une région qui favorise la transcription lorsque celle-ci est liée au domaine de fixation de l'ADN de LexA (Wasylyk B, Gutman A, Flores P, Bègue A, Leprince D, Stehelin D, Nature 346, 191-193 (1990)) ou Gal4 (Seneca S, Punyammalee B, Bailly M et al, Oncogene 6, 357-360 (1991) ) .
La plus forte homologie concernant le produit de traduction de Hum-Fli-1 apparaît avec la protéine murine FLI-1 (Ben-David Y, Giddens E B, Letwin K, Bernstein A, Gènes Dev. 5, 908-918 (1991)), une protéine pour laquelle les homologies avec les domaines de fixation de l'ADN et d'activation de la transcription de ETS-1 peuvent être clairement identifiées.
Il a été montré que le site d'insertion rétroviral activant le gène murin Fli-1 est situé à proximité du gène Ets-1 sur le chromosome 9 de la souris. Le site d'insertion est phylogénétiquement conservé et est homologue à une région du chromosome 11 humain proche du gène Ets-1 (Baud V, Lipinski M, Rassart E, Poliquin L, Bergeron D, Genomics 11, 223-224 (1991)) . Sur- la base à la fois de cette homologie et de cette conservation synténique, il est proposé que Hum-Fli-1 représente l'ADNc du gène humain homologue au gène murin Fli-1.
Le clonage des points de cassure des translocations chromosomiques récurrentes somatiquement acquises a éclairé deux mécanismes majeurs de cancérisation : la dérégulation de l'expression d'un gène et la génération de protéines de fusion (Solomon E, Borrow J, Goddard A D, Science 254, 1153-1160; (1991) ) .
La translocation décrite dans 1'exposé de l'Invention résulte clairement de la fusion de deux gènes qui appartiennent à des familles jusqu'alors non impliquées dans la carcinogénèse humaine : la famille ETS des protéines se fixant à l'ADN et la famille des protéines se fixant à l'ARN. Du fait que la translocation est réciproque sans perte apparente de matériel génétique, sur chacun des deux chromosomes dérivés, l'extrémité 5' du gène est juxtaposée à l'extrémité 3' de l'autre gène.
Le gène chimère généré sur le der (11) n'est pas exprimé à un niveau suffisant pour être mesuré en northern blots et ne semble pas être impliqué dans le phénotype tumoral puisque le der (11) peut occasionnellement être perdu dans les tumeurs ES (Turc- Carel C, Philip I, Berger M P, Philip T, Lenoir G M, Cancer Genêt. Cytogenet. 12, 1-19 (1984) ; Douglass E C, Valentine M, Green A A, Hayes F A, Thompson E i, J. N. C. I. 77, 1211-1213 (1986)) . Au contraire, l'hybride transcrit généré par le der(22) est visible en northern blots bien que son niveau intracellulaire semble diminuer en comparaison avec le transcrit normal du gène Ews codé par le chromosome 22. Cette différence pourrait être due à une instabilité conférée par une longue séquence 3' non codante riche en AT (Brawerman G, Cell 57, 9-10 (1989) ) , telle que celle rencontrée dans le transcrit Hum-Fli-1. La translocation t (11,-22) a deux conséquences directes :
- Premièrement, elle place l'expression du domaine de fixation de l'ADN, HUM-FL-1, sous le contrôle d'un promoteur ectopique, le promoteur Ews, dont il a été montré par hybridation en northern blot, qu'il ne partage pas la spécificité de tissus du promoteur Hum- Fli-1.
- Deuxièmement, la translocation substitue le domaine de fixation de l'ADN, HUM-FLI-1, par un domaine de fixation de l'ARN et le relie par la même chaîne polypeptidique à un domaine qui présente une homologie avec la CTD-polII .
L'implication constante de la bande 22ql2 et plus précisément de la région EWSRl dans les tumeurs ES et PN. indique que ce dernier domaine joue un rôle essentiel dans le processus de cancerisation. La structure de la protéine chimère indique que ce rôle est probablement mis en oeuvre via l'altération de la régulation de transcription des gènes cibles de Hum- Fli-1.
Par analogie avec le mode d'action de la CTD-polII (Peterson C L, Krugen W, Herskowitz I, Cell 64, 1135-1143 (1991)), la protéine chimère peut gêner fonctionnellement les éléments de régulation négatifs contrôlant la transcription. Un exemple possible d'une telle altération pourrait être l'antigène MIC2, lequel est spécifiquement surexprimé dans les tumeurs PNET présentant une translocation t(ll;22) (Ambros I M, Ambros P F, Strehl S et al, Cancer 67, 1886-1893 (1991) ; Garin-Chesa P, Fellinger E J, Huvos A G et al, Am. J. Pathol. 139, 275-286 (1991)) .
L'implication dans une tumeur solide d'un gène du type Ets indique que le rôle de la famille des protéines ETS dans le processus de cancerisation n'est pas limité aux cancers hématologiques . Dans le cas des érythroleucémies, dans lesquelles cette famille est impliquée, un phénotype hautement transformé est associé à d'autres altérations, intervenant soit par cotransduction des séquences Myb, soit par une altération du gène TP53 (Ben-David Y, Bernstein A, Cell
66, 831-834 (1991)) .
Dans le cas du Sarcome d'Ewing, outre la translocation t(ll;22) , d'autres d'aberrations chromosomiques récurrentes incluant une translocation t(lql6p) non compensée ont été décrites (Douglass E C,
Valentine M, Green A A, Hayes F A, Thompson E i, J. N.
C. I. 77, 1211-1213 (1986) ; Mugneret F, Lizard S,
Aurias A, Turc-Carel C, Cancer Genêt. Cytogenet. 30, 239-245 (1988) ) . Leur contribution au phénotype tumoral reste à évaluer.
Les analyses de caryotypes démontrant la présence d'une translocation t(ll;22) dans les tumeurs à petites cellules rondes ont été utilisées pendant plusieurs années comme un critère de diagnostic des tumeurs ES et PN. Deux nouvelles approches pour un diagnostic sont maintenant disponibles :
- la première repose sur le fait que la petite taille de la région EWSRl autorise une détection simple des réarrangements génomiques par la technique de Southern;
- la seconde repose sur une transcription réverse et une amplification génique par PCR et fourni une méthode sensible pour montrer la présence de transcrits de fusion dans les tumeurs et dans leurs sites métastasiques potentiels.
Il est à présent possible d'obtenir des indications sur la fréquence et la spécificité des altérations Ews et Hum-Fli-1 dans les tumeurs humaines, et plus particulièrement dans celles présentant des aberrations cytogénétiques 22ql2 et/ou llq24 (Whang-Peng J, Fréter C E, Knutsen T, Nanfro J J, Gazdar a, Cancer Genêt. Cytogenet. 29, 155-157 (1987) ; De Chadarevian J P, Vekemans M, Seemayer T A, N. Engl. J. Med. 311, 1702- 1703, (1984) ; Cavazzana A O, Navarro S, Noguera R et al, Adv. Neuroblastoma Res . 2,463-473 (1988) ; Vigfusson N V, Allen L J, Philip J H, Alschibaja T, Riches W G, Cancer Genêt. Cytogenet. 22, 211-218 (1986) ; Aurias A, Rimbaut C, Buffe C, Dubousset J, Mazabraud A, N. Engl. J. Med. 309, 496-497 (1983) ; Turc-Carel C, Philip I, Berger M P, Philip T, Lenoir G M, N. Engl. J. Med. 309, 497-498, (1983) ; Whang Peng J, Triche T J, Knutsen T, Miser J, Douglass E C, Israël M A, N. Engl. J. Med. 311, 584-585 (1984) ; Turc-Carel C, Aurias A, Mugneret F et al, Cancer Genêt. Cytogenet. 32, 229-238 (1988)) ; Turc- Carel C, Dal Cin P, Rao U, Karakousis C, Sandberg A, Cancer Genêt. Cytogenet. 30, 145-150 (1988) ; Shen W P V, Young R F, Walter B N, Choi B H, Smith M J, Katz J, Cancer Genêt. Cytogenet. 45, 207-217 (1990) ; Trent J M, Kaneko Y, Mitelman F, Cytogenet. Cell Genêt. 51, 533-562 (1989) ) .
L'hypothèse d'une relation entre Ews et un défaut génétique héréditaire responsable de la Neurofibromatose de type II, qui a été localisé dans la même région 22ql2 (Rouleau G A, Seizinger B R, Wertelecki W et al., Am. J. Hum. Genêt. 46, 323-328 (1990)) peut également être examinée.
V - Description des fiςrures
FIGURE 1
1) Résultats
La figure 1 représente la carte de la région EWSRl sur le chromosome 22 .
- En A est représentée de manière schématique une partie du contig résultant de l'expansion du locus Cos5/Cos6 identifié par hybridation différentielle Alu-PCR (Zucman J, Delattre O, Desmaze C, Aza buja C, Rouleau G, De Jong P, Aurias A, Thomas G, Genomics, sous presse) .
La position du contig est indiquée en rapport avec différents autres loci proches . Les cosmides B6 et G9 recouvrent les points de cassure de
A3EW2-3B et ALU 6, deux cellules somatiques hybrides qui contiennent le der (11) respectivement des tumeurs ES et
PN (Geurts van Kessel A H M, Turc-Carel C, Klein A de et al, Mol . Cel . Biol . 5 , 427-429 ( 1985 ) ; Zhang F, Delattre O, Rouleau G et al, Genomics 6 , 174-177
(1990) ) .
- En B est représentée la carte de restriction EcoRl d'un fragment de 100 Kb centré autour de la région EWSRl. La position de trois régions de dinucléotides CpG est indiquée : CpGl contient 3 sites SacII, 3 sites BssHII et 1 site MluI; CpG2A contient 3 sites SacII, 3 sites BssHII; CpG2B contient 3 sites BssH2, 3 sites SacII et 1 site Notl.
- En C est représentée une carte de restriction détaillée de la région EWSRl sur laquelle les sites PstI sont marqués (P) , les sites BamHI sont marqués (B) , les sites Xbal sont marqués (X) et les sites EcoRI sont marqués (R) . Les flèches verticales indiquent les fragments de restriction réarrangés dans chacune des 20 tumeurs testées.
2) Méthode a) Une banque spécifique du chromosome 22, LL22NC01 construite à partir de vecteur cosmidique Lawrist 5 a été utilisée pour mener les expériences sur le chromosome 22. Les fragments terminaux où l'insert entier ont été marqués par random priming en utilisant un dCTP marqué en alpha par le 32P. Les séquences humaines répétitives et les vecteurs contaminant résiduels ont été inhibés avec un large excès d'ADN humain total et de vecteurs d'ADN.
La sonde préincubée a été alors utilisée pour cribler la banque selon les procédures standards et les cosmides chevauchants ont été identifiés. b) Les échantillons de tumeurs ont été récupérés immédiatement après opération.
Un fragment a été utilisé pour l'analyse de caryotype : - les tumeurs T2 à Tll présentent une translocation t (11;22) (q2 ;ql2) typique;
- la tumeur T12 présente une translocation complexe t (10; 11;22;12) (q22;q24;ql2;q24) ;
- la tumeur T13 présente une variante de translocation t (14;22) (q32;ql2) ;
- la tumeur T14 présente une variante de translocation t(7;22) (q35;ql2);
- la tumeur T15 présente une translocation complexe t(ll;ll;22) (ql3;q24;ql2) . L'analyse des carayotypes des tumeurs 16 à
19 n'a pas été réalisée et la tumeur T20 présente uniquement des metaphases normales. L'analyse en FISH bi-couleur sur noyaux interphasiques des tumeurs T17 et T19 montre l'apparition d'un point de cassure dans la bande 22ql2 (Desmaze C, Zucman J, Delattre O, Thomas G, Aurias A, Gènes Chr. Cancer, sous presse) .
La tumeur Tl correspond à la lignée cellulaire hybride A3EW2. La lignée cellulaire hybride Alu6 est issue de la tumeur T8. Les tumeurs T7 à T13 sont des tumeurs PN; toutes les autres tumeurs ont été diagnostiquées Sarcome d'Ewing. L'ADN des échantillons de sang (N) et d'échantillons de tumeurs (T) a été digéré avec l'enzyme PstI et analysé selon la méthode de Southern avec la sonde 5.5-sac. FIGURE 2
Cette figure représente la détection de bandes réarrangées dans des tumeurs; plus particulièrement, la détection de fragments genomiques anormaux dans 6 tumeurs. Le numéro de la tumeur est indiqué en haut des bandes. Les échantillons d'ADN provenant de sang des patients porteurs des tumeurs T16 et T18 sont indiqués par (N) . Dans chaque cas, le fragment correspondant à la jonction réarrangée est indiqué par une flèche horizontale.
f GURE g
1) Résultats
La figure 3 représente la carte de restriction des régions impliquées dans la translocation chromosomique t (11;22) (q24;ql2) ; les régions normales (22N) et (UN) et les deux dérivés 11 et 22 de la translocation t(l;22) , der (11) et der (22) sont représentées pour la tumeur Tll.
La double ligne représente le chromosome 11, la ligne épaisse représente le chromosome 22.
Dans les dérivés der(ll) et der (22), la simple ligne entre les parties des- chromosome 11 et 22 représente le fragment de fusion EcoRl. EWSRl et EWSR2 représente la région la plus petite qui contient tous les points de cassures identifiés respectivement sur le chromosome 22 et le chromosome 11. Les flèches verticales indiquent la position des fragments réarrangés EcoRl identifiés dans 17 tumeurs .
Les abréviations désignant les tumeurs sont identiques à celles utilisées à la Figure 1.
Enfin, les positions des sondes 22RR3, 22RR12, 22HP.5 et 11RR1 sont indiquées. 2 ) Méthodes
Un linker Xhol a été inséré au niveau du site BamHI d'un vecteur SuperCos commercialisé par la Société Stratagene. L'extrémité 3' de l'ADN partiellement digéré par Mbol d'une lignée cellulaire ICB 104 dérivée de la tumeur Tll (Zhang F, Delattre O, Rouleau G et al, Genomics 6, 174-177 (1990) ), a été partiellement comblé avec des dGTP et dATP . Les fragments de haut poids moléculaire ont été purifiés sur gel et lié au site Xhol du vecteur SuperCos modifié et comblé partiellement avec des dTTP et dCTP . Après conditionnement avec le kit Gigapack Gold de la Société Stratagene, les virions ont été utilisés pour infecter la souche d'E. coli DH5 alpha MCR.
La banque obtenue de 4.105 cosmides indépendants a été criblée avec les sondes 22RR3 et 22RR12. Les groupes de clones chevauchants contenant soit une région EWSRl non altérée (22N) ou le fragment de jonction du dérivé 22 de la translocation, der(22), ou du dérivé 11 de la translocation, der (11), ont été identifiés. La sonde 11RR1 a permis de retrouver un cosmide, lequel par hybridation fluorescente in situ sur chromosome est montré comme provenant de la bande llq24. Ce cosmide a été utilisé pour étendre la locus sur le chromosome 11 normal.
Fiςrure 4
Cette Figure montre la détection en Northern blots de transcrits anormaux dans le Sarcome d'Ewing ou des lignées cellulaires.
Le même northern blot contenant 1 μg d'ARNm polyadénylé provenant des tumeurs T19, Tll, T8 et T18 ou de la lignée de neuroblastome IMR32 a été successivement hybride avec les sondes 22RR3 , 22RR12 et 11RR1 . N représente le transcrit normal du gène Ews , R représente les transcrits de fusion .
Selon la tumeur, les tailles des transcrits anormaux sont sensiblement différentes . Les mêmes transcrits anormaux sont détectés à la fois avec la sonde 22RR3 et la sonde 11RR1 , ce qui indique que la translocation donne lieu à la synthèse d' un transcrit chimère .
FIGURE 5
1) Résultats
Cette figure représente la détection par transcription réverse et PCR de trois types de transcrits chimères .
M est un marqueur de taille . Breast correspond à un tissu de sein; OVARY correspond à un carcinome ovarien; IMR32 correspond à une lignée cellulaire de neuroblastomes . Les abréviations désignant les patients sont identiques à ceux de la figure 1.
Les trois types de transcrits décrits à la figure 9 ci-après sont indiqués 1, 2, 3 par une flèche .
2) Méthode
L'oligonucléotide 11A de formule suivante : 5' AGAAGGGTACTTGTACATGG 3' a été utilisé comme amorce pour la transcription réverse de 1 μg d'ARN total en utilisant un kit de PCR Gen Amp RNA de la Société Cetus. L'ADNc résultant a été soumis à 30 cycles d'amplification par PCR avec les amorces 11.3 et 22.3 respectivement de formules suivantes :
5* ACTCCCCGTTGGTCCCCTCC 3' 5' TCCTACAGCCAAGCTCCAAGTC 3' Chaque cycle comprenant une étape de dénaturation à 90°C pendant 30 secondes, puis à 65°C pendant 1 minute, une étape d'extension à 72°C pendant 2 minutes. Le fragment amplifié a été identifié par électrophorèse sur gel et révélé au bromure d'éthidium.
FIGURE 6
1) Résultats Cette figure représente la séquence nucleotidique de l'ADNc contenant la région codante entière et l'extrémité 3' non transcrite du gène Ews; Ainsi que la séquence en acides aminés déduites de cet ADNc codon par codon. Ces séquences sont numérotées sur la gauche.
Deux signaux de polyadénylation, l'un commençant au nucléotide 2143 et l'autre au nucléotide 2332 sont soulignés .
Le premier codon de la méthionine est localisé avec une purine (A) en position -3 et une guanosine (G) en position +4 en accord avec la séquence consensus Kozak.
2) Méthode Les sondes 22RR3 et 22RR12 ont été utilisées pour cribler une banque d'ADNc de cerveau foetal humain
(Stratagene cat . n° 936206) et ont permis d'identifier un clone qui a été dénommé BF1AC5. La sonde 11RR1 a été utilisée pour cribler une banque d'ADNc de moelle humaine (Clontech cat. n° HL1058) et a permis d'identifier un clone qui a été dénommé BM025. Un million de clones ont été mis sur plaques et criblés dans chaque banque. Les fragments d'ADN sous-clonés dans les phages Ml3mpl8 ou M13mpl9 ont été utilisés comme matrices pour déterminer les séquences nucléotidiques en utilisant la méthode de terminaison de chaîne didéoxy et soit une polymérase T7 modifiée, soit la taq polymérase commercialisée par la Société Amersham. Les séquences d'ADNc de 2372 pb et 2939 pb des clones BF1AC5 et BM025 ont été déterminées sur les brins des sous-clones chevauchant, en utilisant soit l'amorce M13, soit des amorces du commerce. Il a été montré qu'ils contiennent la séquence codante entière des gènes Ews et Hum-Fli-1. Le séquençage direct des produits d'amplification PCR a été effectué avec un Sequenase commercialisé par la Société USB après 30 cycles d'amplification asymétrique avec soit l'amorce 11.3, soit l'amorce 22.3, puis purification à travers une membrane Centricon 100 commercialisé par la Société Amicon.
FIGURE 7
Cette figure représente l'ADNc du gène Hum-Fli-1.
FIgϋRE 8
La figure 8 représente la séquence nucleotidique de l'ADNc de fusion -obtenue par réverse transcription et amplification par PCR du transcrit de fusion de type 1.
La séquence homologue (à l'extrémité 5') ou complémentaire (à l'extrémité 3') aux amorces utilisées pour l'amplification par PCR sont soulignées. La ligne verticale indique la jonction entre les deux gènes qui se présentent entre la première et la seconde position du codon 265 du gène Ews et entre les mêmes positions du codon 219 du gène Hum-Fli-1. FTSUfiE 9
Cette figure représente les différentes domaines de la protéine EWS codée par le gène Ews . - en A, sont représentés les différents domaines peptidiques . La région hachurée représente les 270 premiers acides aminés contenant une forte proportion de tyrosine, glutamine, serine, thréonine, glycine, alanine et proline, lesquels représentent ensemble environ 90% de tous les résidus . Dans cette région, la plupart des tyrosines sont présentes tous les 5 à 9 résidus et définissent un motif dégénéré répété 31 fois. Après la tyrosine, les résidus les plus récurrents dans la répétition sont une serine en position -1 (50%) , une glycine en position +1 (50%) , et deux glutamines enpositions +2 et +3 (respectivement 70% et 40%) . Cette partie de la molécule présente une homologie avec la CTD-polII.
Les trois zones ombrées correspondent à des régions riches en glycine, arginine et proline.
La zone marquée "RNA BD" représente un domaine supposé de fixation de l'ARN, lequel est exposé en B .
Les flèches indiquent la position du point de jonction Hum-Fli-1 pour les trois types différents de protéines chimères telles que déduites par transcription réverse et amplification par PCR exposées précédemment .
- en B, on montre les alignements les plus significatifs de la protéine EWS dans la région supposée de fixation de l'ARN. Dpen pi9 pou le clone pen pi9 de Drosophile (Haynes S R, Rebbert M L, Mozert B A, Forquignon F, Dawid I B, Proc. Natl . Acad. Sci. USA 84, 1819-1823 (1987)) ; H nucl pour nucléoline humaine (Srivastava M, McBride 0 W, Flemming P J, Pollard H B, Burns A L, J. Biol . Chem. 265, 14922-14931 (1990)); HsnRNP Ul pour snRNP Ul humaine de 70 Kd (Spritz R A,
Strunk K, Surowy C S, Hoch S O, Barton D E, Francke U,
Nuclei. Acid. Res. 15, 10173-10391 (1987)); HhnRNP Al et
Bl pour hnRNP humaine Al (Biiamonti G, Buvoli M, Bassi M T, Morandi C, Cobianchi F, Riva S, J. Mol. Biol. 207,
491-503 (1988)) et Bl (Burd C G, Swanson M S, Goerlach
M, Dreyfuss G, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 9788-9792
(1989)); HPABP pour protéine de fixation poly(A) humaine
(Grange T, Martin de sa C, Oddos J, Pictet R, Nue. Acids Res. 15, 4771-4787 (1987)) .#2, #3 and #4 se rapportent à différents domaine de fixation de l'ARN au sein de la même protéine. Les positions invariables parmi ces protéines sont ombrées et les substitutions minimums entre EWS et au moins 4 des 6 protéines sont indiquées en caractères gras.
Les domaines I à IV ont été décrits par Query C C, Bentley R C, Keene J D, Cell 57, 89-101 (1989) . RNP-1 et RNP-2 se rapportent aux motifs consensus commentés par Brandzilius R J, Swanson M S, Dreyfuss G, Gènes Dev. 3, 431-437 (1989) . A la droite de la Figure 8 B, il est indiqué par "Identities" le pourcentage de résidus identiques entre EWS et chacun des domaines de fixation d'ARN considérés. Il est en outre indiqué du côté C-terminal la présence d'une région riche en résidu glycine (GR) et d'un domaine basique (Basic D) .
FIGURE 10
Cette figure représente de manière schématique les protéines codées par le gène Ews normal (EWS) , le gène Hum-Fli-1 normal (Hum-Fli-1) , et leurs gènes de fusion (EWS/Hum-Fli-1 type 1, 2 et 3) .
Dans les trois types de protéines chimères, la portion C terminale de EWS contenant le domaine supposé de fixation de l'ARN (désigné RNA BD) est remplacée par la partie C-terminale du gène Hum-Fli-1 contenant le domaine ETS (désigné ETS D) . La protéine chimère de type 1 est entièrement représentée sur la figure; les protéines de type 2 ou 3 peuvent être déduites de celle de type 1 par l'insertion de 84 ou 22 acides aminés supplémentaires provenant respectivement de EWS ou Hum-Fli-1. Les positions des codons interrompus sont indiqués dans tous les cas .
FIGURES 11. 12. JL 1A. IS «fc 16
La figure 11 représente la carte de restriction des gènes Ews et Hum-Fli-1 au niveau de leur région de cassure EWSRl et EWSR2. La position des exons est indiquée par rapport aux sites de restrictions. Les cadres ouverts de lecture sont divisés par les différents exons; chaque intron entre deux exons codant interrompt le cadre ouvert de lecture suivant une des trois phases : A, B ou C.
La figure 12 représente la structure exonique du gène Ews .
Il a été en outre possible de séquencer la totalité des jonctions introns-exons pour ce gène, comme représenté figure 12.
La figure 13 représente la structure exonique du gène Hum-Fli-1.
Il a été en outre possible de séquencer la majorité des jonctions introns-exons pour ce gène, comme représenté figure 13.
Il est donc possible à partir de ces informations de prévoir la multiplicité des produits de fusions possibles des deux gènes . Un nombre important de produits de fusion juxtaposant ces exons ont été observés par transcription reverse puis amplification génique par PCR.
La figure 14 représente les juxtapositions d'exons des gènes Ews et Hum-Fli-1 et les séquences de jonction des transcrits de fusion en résultant. A gauche de la figure 14, il est indiqué schématiquement les exons de Ews (cases hachurés) et les exons de Hum-Flli-1 (case pleine) impliqués dans la juxtaposition, à droite de la figure 14 sont indiqués les séquences de jonction des transcrits de fusion correspondant aux juxtapositions symbolisées à gauche de ladite figure, avec le nombre de cas observés.
La figure 15 représente, selon une nomenclature identique à celle de la figure 14, un cas observé de juxtaposition concernant l'exon 8 de Ews et l'exon 7 de .Hum-Fli-1, entre lesquels s'est intercalé une séquence d'origine inconnue (Alien séquence) .
La figure 16 représente, selon une nomenclature identique à celle des figures 14 et 15, quatre cas chez lesquels il a été observé deux transcrits de fusion différents juxtaposant une série d'exons de Ews à une série d'exons de Hum-Fli-1; ceci étant vraissemblablement le résultat d'epissages alternatifs. Dans les séquences de fusion à doite de la figure, les (*) indique dans la séquence du produit de traduction un codon stop.
Fiςrure 17
Cette figure représente la séquence de la région promotrice du gène Ews . EXEMPLE 2 : ETUDE DE LA TRANS LOCA ION
CHROMOSOMIOUE RECURRENTE t (21:22) ASSOCIEE AU
SARCOME D ' E ING
La figure 18 représente, selon une nomenclature identique à celle des figures 14, 15 et 16, les séquences de jonction de quatre transcrits de fusion correspondants à 5 cas observés, juxtaposant l'exon 7 du gène Ews avec les exons supposés 6, 8 et 9 du gène Erg, et l'exon 10 de Ews avec l'exon supposé 6 de Erg.
EXEMPLE 3 : ETUDE DE LA TRANSLOCATION
CHROMOSOMIOUE RECURRENTE t(12:22) ASSOCIEE AU
MELANOME MALIN DES PARTIES MOLLES (MMSP.
I - Description des figures
Les figures 19 et 20 représentent le réarrangement du gène Ews dans la lignéee cellulaire SU- CCS-1 de MMSP.
La figure 19 représente la carte de restriction de la région EWSRl et indique la position des sondes utilisées et les positions déduites du point de cassure du chromosome 22 dans la tumeur Sten-1 et dans la lignée cellulaire SU-CCS-1.
La partie (a) de la figure 20 représente l'analyse par la technique de Southern blot de l'ADN de Control et de celui de la lignée SU-CCS-1 doublement digérés par EcoRl et PstI et hybrides avec la sonde RR2 issue de EWSRl; dans cette figure, N indique la bande normale et R la bande correspondant au réarrangement .
La partie (b) de la figure 20 représente la détection en northern blot d'un transcrit anormal avec la sonde EWS-5 ' EB définie par le fragment 5' EcoRl/BamHl de l'ADNc du gène Ews; les ARN extraits d'une lignée cellulaire Hela et d'une lignée cellulaire de gliome ont été utilisés comme témoins; N indique le Transcrit normal du gène EWS et R indique un transcrit additionnel. La partie (c) de la figure 20 représente l'analyse des produits amplifiés obtenus à la dernière étape de la procédure RACE; comparé à l'ARN de contrôle, lequel a été utilisé pour promouvoir l'amplification à partir du transcrit EWS normal (EWS), l'ARN extrait de SU-CCS-1 présente un fragment amplifié supplémentaire qui a été montré comme défivant du transcrit de fusion (Fusion) .
Les figures 21 et 22 se rapporte à l'identification du transcrit de fusion EWS/ATF-1 dans les tumeurs et lignées cellulaires MMSP.
La figure 21 représente la détection par PCR-reverse transcriptase du transcrit chimère. Après reverse transcription de l'ARN total, de la lignée SU- CCS-1, des tumeurs MMSP Sten-1 et 5852/88 et d'une lignée cellulaire Hela, la PCR a été réalisée les amorces 22.1 et ATF—1.1, correspondant respectivement à l'exon 7 du gène Ews, et à la région 3' on traduite de ATF-1. L'analyse des produits amplifiés a été réalisée sur un gel d'agarose 1% (contrôle : aucun ARN) . La figure 22 représente la séquence du fragment d'ADNc de 954 pb obtenu par PCR-reverse transcriptase du transrit résultant de la fusion des gènes Ews et Atf-1. Les séquences .identiques (à la région 5 ' ) ou complémentaires (à la région 3 ' ) aux amorces utilisées pour l'amplification sont soulignées dans la figure. La ligne vertical indique la jonction entre les deux gènes, laquelle intervient entre la seconde et la troisième position du codon 325 et entre les mêmes positions du codon 65 du gène Atf-1. La contribution de la séquence du gène Ews est indiquée en caractères gras. La position de 1 'oligonucléotide spécifique du gène Ews utilisé dans la procédure RACE est indiquée et soulignée.
Les figures 23 et 24 représentent la jonction des transcrits chimères et donne une représentation schématique des protéines qui en sont déduites .
La figure 23 représente la séquence partielle de l'ADNc des gènes Ews et Atf-1, et de leurs transcrits hybrides dans les régions de jonction, mettant en évidence les cadres ouvert et fermé de jonction respectivement pour le transcrit hybride Ews/Atf-1 depuis le der (22), et pour le transcrit Atf- 1/Ews depuis le der (12) . La figure 24 représente les produits de traduction correspondant aux 4 ADNc indiqués à la figure 22. Dans la protéine chimère EWS/ATF-1, la portion C- Terminal de EWS contenant deux des trois régions riches en glycine (régions ombrées) et le domaine homologue de fixation de l'ARN (RNA-BD) sont remplacés par la partie C-terminale de ATF-1 contenant le domaine de base de fixation de l'ADN et les quatre heptamères leucine définissant ensemble le domaine bZIP.
Le produit réciproque est indiqué par ATF- 1/EWS et est codé par le chromosome der (12) . Le site de reconnaissance consensus pour la phosphorylation par la pritéine kinase A (acides aminés 60 à 63) est indiqué par PKA; NTD-EWS indique le domaine N-terminal de EWS .
il - Méthode
1) Tumeurs et lignées cellulaires La lignée cellulaire SU-CCS a été préparée à partir d'une effusion pluerale de MMSP (Epstein L, Martin A O, Kempson R, Cancer Res. 44, 1265-1274, 1984) . L'analyse cytogénétique a révélé un caryotype complexe prészentant une unique copie normal des chromosomes 12 et 22. La lignée cellulaire a été cultivée comme initialement décrit . Les fragments congelés des tumeurs primaires de MMSP, Sten-1 (Stenman G, Kindblom L-G, Angervall L, Gènes Chrorr Cancer 4, 122-127, 1992), W9150 (Speleman F, Colpaert C, Goovaerts G, Leroy J G, Van Marck E, Cancer Genêt. Cytogenet. 58, 176-179, 1992) et 5852/88 (Fletcher A A, Gènes Chrom. Cancer 5, 184, 1992), ont été collectés et gardés au maitenus congelés à -80° Celsius jusqu'à leur utilisation. Toutes les tumeurs primitives ont été préalablement caractérisées cytogenetiquement et possèdent toutes une translocation t(12;22) (ql3;ql2) . L'extraction de l'ADN et de l'ARN ainsi que les Southern et nothern blot ont été réalisés conformément aux procédures standards (Maniatis T, Fritsh E F, Sambrook J, J. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) .
2) Sondes
Les sondes genomiques sont représentées à la f igure 19 , Les sondes d ' ADNc s ont les suivantes :
- EWS 5 ' EB est la région codante de 0, 8 Kb de l 'ADNc de EWS se finissant en un site BamHl ;
- EWS 3 ' XE est la dernière région codante de 0, 85 Kb commençant au site Xbal;
- La sonde ATF-1 3 ' a été préparé par PCR et s ' étend du nucléotide 754 au nucléotide 955 de la figure 17 . 3) Procédure d'amplification génique par PCR
L'ensemble des réactions PCR ont été réalisées dans 30 micolitres avec le kit AmpTAQ commercialisé par la Société Cetus, et en utilisant un cycleur commercialisé par la Société Perkin Elmer. Sauf indication contraire, 30 cycles ont été réalisés avec les paramètres suivants : - étape de dénaturation : 94° Celsius pendant 30 secondes;
- température de chauffage : comme indiqué spécifiquement pour chaque cas pendant 60 secondes
- élongation : à 72° Celsisus pendant 120 secondes.
Les produits amplifiés ont été analysés sur gels d'agarose TBE 1%.
Les séquences des différentes amorces utilisées dans les procédures RACE et RT sont rapportés ci-dessous :
A3'NV 5 'ATCGTTGAGACTCGTACCAGCAGAGTCACGAGAGAGACTACACGGT ACTGGTTTTTTTTTTTTTT 3 '
22.1 5 'CCCACTAGTTACCCACCCCA 3*
A 3 '-4 5 'CGTTGAGACTCGTACCAGCAG 3 ' 22.3 5 'TCCTACAGCCAAGCTCCAAGTC 3•' '3'-5 5 'TACCAGCAGAGTCACGAGAGAG 3'
22.7 5'AACAGAGCAGCAGCTACGGGCA 3'
A 3'-6 5 'CGAGAGAGACTACACGGTACTGG 3'
ATF-1.1 5'AAAACTCCACTAGGAAATCCATTT 3' ATF-1.3 5 'CTGGGAGGGGGGAGTGGAAG 3'
22.4 5*GGGCCGATCTCTGCGCTCCT 3' 4) Procédure RACE
Un microgramme de polyA et d'ARN polyA de la lignée cellulaire SU-CCS-1 a été dénaturé pendant 10 minutes à 80° Celsius et transcrit en utilisant le kit PCR Gen AmpRNA commercialisé par la Société Cetus. La transcription reverse initial a été effectuée dans 2à microlitres en utilisant l'amorce A3'NV. L'incubation à 42° Celsius pendant 45 minutes a été suivie par 5 minutes à 94° Celsius . Un aliquot de 2 microlitres de l'ADNc résultant a été amplifié par PCR en utilisant une procédure à 3 étapes impliquant des oligonucléotides chevauchant. La première étape a mis en oeuvre les amorces 22.1 et A3 '-4 dans 20 cycles (température d'association 64°C) . Vingt microlitres ont été analysés sur un gel d'agarose 1% à faible point de fusion. La portion du gel contenant les produits amplifiés d'environ 1,5 à 2,5 Kb a été collecté, fondue à 68° Celsius, et diluée dans un volume égal de tampon TE. Un microlitre a été soumis à une amplification par PCR
(température d'association 66°C) en utilisant les amorces 22.3 et A3 '-5. L'analyse des 20 microlitres sur un gel d'agarose 1% à faible point de fusion a révélé deux bandes. En vue d'une caractéristion ultérieure, chaque bande a été dcoupée du gel,- diluée au 1/1000 dans un tampon TE, et un microlitre a été amplifié par PCR (température d'association 67°C) en utilisant les amorces 22.7 et A3'-6.
5) Analyse RT-PCR des transcrits du MMSP
Un microgramme de l'ARN total a été reverse transcrit en utilisant comme amorce un oligo-dT et le kit PCR Gen Amp RNA de la Société Cetus, selon les conditions décrites par le fabriquant. L'ADNc obtenu a été soumis à trois amplification PCR différentes :
- les produits amplifiés correspondant aux transcrits Ews/Atf-1 ont été obtenus avec les amorces 22.1 et ATF-1.1 (température d'association 60°C) ,
-les produits amplifiés correspondant au transcrit Atf-1 normal ont été obtenus avec les amorces ATF-1.3 et ATF-1.1 (température d'association 60°C) ,
- les produits amplifiés correspondant aux transcrits Atf-1/Ews ont été obtenus avec les amorces
ATF-1.3 et 22.4 (température d'association 65°C) .
6) Séquencaαe
Les produits de la PCR ont été sous-clonés dans les phages M13mpl8 et M13mpl9. Dans chaque cas, trois clones indépendants ont été entirement séquences avec Kit Taq polymérase de la Société Applied Biosystems, en utilisant des didéoxynucléotides et des amorces fluorescentes .Les séquences de réaction ont été analysées sur un séquenceur automatique de la Société Applied Biosystems .
7) Etude de l'hybridation in situ par fluorescence (FISH)
La librairie de cosmides genomiques construite à partir de la lignée cellulaire ICB 104 et décrite par Zucman et al. (Zucman J, Delattre O, Desmaze C, Plougastel B, Joubert I, Melot T, Peter M, De Jong P, Rouleau G, Aurias A, Thomas G, Gènes Chrom. Cancer 5, 271-277, 1992) a été criblée avec la partie Atf-1 du transcrit de fusion Ews/Atf-1, et les cosmides CCS2.2, F7 et G9 correspondant respectivement à la région 3 ' et à la région 5' de Ews. Des analyses FISH monocouleur et bicouleur ont été réalisées comme décrit par Desmaze et al. (Desmaze C, Zucman J, Delattre O, Thomas G, Aurias A, Gènes Chrom. Cancer 5, 30-34, 1992) .
III - Résultats
1) Altération de la protéine EWS dans le MMSP
L'ADN a été extrait d'une tumeur primaire de MMSP, dénommée Sten-1, présentant une translocation t(ll;22) caractéristique (Stenman G, Kindblom L-G, Angervall L, Gènes Chrom. Cancer 4, 122-127, 1992), et d'une lignée cellulaire dénommée SU-CCS-1 présentant un caryotype complexe contenant un chromosome 12 anormal (Epstein L, Martin A O, Kempson R, Cancer Res. 44, 1265- 1274, 1984) . Les ADN ont été criblés avec des sondes issues de EWSRl. Des fragments anormaux ont été mis mis en évidence avec les sondes PR.8 pour Sten-1 et RR2 pour SU-CCS-1 (comme montré figure 19) . Cependant des ADN apparis normaux de tissus normaux n'ont pas été accessible, ces bandes anormales, qui n'ont jamais été observées avec l'ADN extrait de tissus normaux, suggère fortement des réarrangement somatiquement acquis (comme montré figure 16°. Les ARN issus de Sten-1, SU-CCS-1, et de la tumeur MMSP primaire 5852/88 (Fletcher J A, Gènes Chrom. Cancer 5, 184, 1192) ont été caractérisés par northern blots avec les extrémités 3' et 5' de l'ADNc du gène Ews. Le transcrit normal de 2,5 Kb du gène Ews a été mis en évidence avec les deux sondes. Cependant, dans les trois cas, chaque sonde a révélé spécifiquement une bande supplémentaire (la sonde 5', un transcrit clairement exprimé de 3 Kb, la sonde 3 'un transcrit difus de 1,5 Kb) suggérant que ces transcrits anormaux pouvaient correspondre aux gènes de fusion générés par la translocation t(12;22) comme montré figure 20 (b) .
2) Clonage du transcrit hvbride
Afin de cloner ces transcrits, méthode dérivée de l'amplification rapide des extrémités d'ADNc a été mise en oeuvre (Frohman AF, Dush MK, Martin GR, Proc. Natl. Acad. Sci . USA 85, 8998-9002, 1988; Dumas Miline Edwards JB, Delort J, Mallet J, Methods in Molecular Biology, vol. 16, chap. 35, 1992) . Des ARN polyA de SU-CCS-1 et de cellules Hela ont été reverse transcrits en utilisant un oligonucléotide (dT) marqué à son extrémité 5' avec une séquence artificielle de 51 nucléotides (comme indiqué précédemment) . Les séquences d'ADNc localisées entre ce marquage et l'exon 7 du gène Ews ont été amplifiées par PCR en utilisant une procédure à trois étapes . Une électrophorèse sur gel d'agarose a révélé que les ARN Helaconduisent à l'amplification d'un unique fragment de 1,4 Kb, lequel a été identifié par hybridation comme correspondant à l'ADNc normal du gène Ews. Outre ce fragment , l'ARN SU- CCS-1 conduit à l'amplification d'un fragment de plus haut poids miléculaire comme indiqué à la figure 20 c. Le séquençage a mis en évidence une phase de lecture ouverte étrangère fusionné au codon 325 du côté 3' du huitième exon du gène Ews . Une recherche dans la banque de données NBRF a révélé que cette séquence dode pour la partie C-terminale du gène Atf-1, un facteur de transcription dépendant de l'AMPc. Au niveau de la séquence nucléique, cette séquence est identique à l'extrémité 3' de la séquence d'ADNc du gène Atf-1 (Hai T, Liu F, Coukos WJ, Green MR, Gènes Dev. 3, 2083-2090, 1989; Yoshimura T, Fijisawa J-L, Yoshida M, EMBA J. 9, 2537-2542, 1990) . Une sonde issue de cette extrémité, dénommée ATF-1 3', s 'hybride avec le transcrit anormal de 3 Kb observé en northern blot.
Une procédure plus directe pour tester la présence d'un transcrit de fusion Ews/Atf-1 dans l'ARN de tumeur a été développé à partir d'un oligonucléotide spécifique dérivant de la région 3' non traduite du gène Atf-1. Cette amorce a été utilisée, en combinaison avec un oligonucléotide homologue à l'exon 7 du gène Ews, pour amplifier par PCR, des ADNc amorcés avec un oligo- dT synthétisés à partir de trois tumeurs primaires MMSP connues, de la lignée cellulaire SU-CCS-1 et de cellules de contrôle Hela. A la différence de l'ARN de Hela, qui ne conduit à aucune amplification, les quatre ARN des cas de MMSP conduisent à un fragment majeur de 1 Kb (comme montré figure 21) . pour chaque cas, le séquençage a révélé la même jonction en phase, intervenant dans le codon 325 du gène Ews et le codon 65 du gène Atf-1 (comme montré figure 21) . La protéine de fusion déduite codée par ce transcrit a conservé la totalité du domaine N-terminal de la protéine EWS et la majeure partie de la protéine ATF-1 (comme montré figure 23) .
3) Cartographie du σène Atf-1 sur le chromosome 12
La portion du transcrit de fusion correspondant au gène Atf-1 a été utilisée pour retrouver un cosmide d 'ne banque génomique humaine. Il a été montré par hybridation in situ en fluorescence (FISH) sur des chromosomes en mêtaphase, que ce cosmide couvre exclusivement la bande 12ql3, démontrant ainsi que le gène Atf-1 est localisé dans cette région du génome. La complexité du caryotype des cellule SU-CCS-1 exclu une simple démonstration cytogénétique formelle de l'apparition d'une translocation impliquant les chromosomes 12 et 22. Toutefois, l'analyse FISH bicouleur sur des noyaux de cellules SU-CCS-1 en interphase ont montré que le locus du gène Ews était divisé et que la partie proximal du gène Ews était juxtaposée au locus du gène Atf-1.
4) Gène de fusion réciproque
La transcription du gène Atf-1 normal sur le chromosome 12 et celle du gène de fusion réciproque généré sur le cromosome der (12) ont été étudiées par PCR reverse transcriptase. Dans tous les cas de MMSP, les deux transcrits ont été exprimés, ce résultat est compatible avec le large spectre d'expression du gène Atf-1 (Yoshimura T, Fijisawa J-I, Yoshida M, EMBO J. 9, 2537-2542, 1990) . Dans tous les cas, les produits amplifiés isss du transcrit de fusion réciproque sont de tailles identiques mais plus courtes qu'escompté. Le séquençage de la région de jonction de l'ADNc de tumeur Sten-1 a révélé une fusion hors phase causée par la déletion ou l'épissage du neuvième exon du gène Ews. Le produit traduction déduit est une protéine tronquée composée des 65 premier acides aminés de la protéine ATF-1 suivis de 3 acides aminés aberrants (comme montré figure 23) .
IV - Discussion
La présente étude démontre que la translocation t(12;22) associée au MMSP génère des gènes hybrides associant une partie du gène Ews et une partie du gène Atf-1, dont les caractéristiques structurales et fonctionnelles ressemblent à celles de la fusion des gènes Ews et Hum-Fli-1 dans la translocation t(ll;22) qui elle associée au Sarcome d'Ewing. Dans les deux cas, le gène chimère générée sur le chromosome der(22) code pour une protéine dans laquelle la même portion de la partie N-terminale de la protéine EWS est liée à un domaine de fixation d'ADN d'un facteur de transcription. II a ainsi été montré sur des modèles que la portion préservée de la partie N-terminale de la protéine EWS, lorsqu'elle est liée au domaine de fixation d'ADN des protéines HUM_FLI-1, ETS-1 ou GAL-4, conduisait à la transcription de gènes reporters spécifiques contenant dans leur région promotrice les éléments de réponse correspondant.
La protéine hybride déduite de la séquence d'ADN de fusion des gènes Ews et Atf-1, contient la majeure partie de la protéine ATF-1, dont un domaine fonctionnel important bZIP . Ce domaine est connu pour médier la dimérisation de la protéine et la fixation de l'ADN. En conséquence, il est possible de considérer que ces deux propriétés sont préservées dans la protéine hybride.Celui-ci doit donc être capable de former des homodimères et des hétérodimères avec le facteur de transcription CREB connu pour interagir avec la protéine ATF-1 normal (Turc-carel C, Aurias A, Mugneret F, Lizard Sidaner I, Volk C, Thiery J-P, Olschwang S, Philip T, Lenoir GM, Mazabraud A, Cancer Genêt. Cytogenet. 32, 229-238, 1988; Douglass EC, Valentine M? Green AA, Hayes FA, Thompson El, J. Nat. Cancer Inst . 77, 1211-1213, 1988) .Il est également possible de fixer à l'ADN des motifs reconnus par la protéine ATF-l.La protéine chimère a cependant perdu un site consensus de phosphorylation de la protéine kinase A, lequel peut contribuer à la régulation de l'activité de transcription du gène Atf-1 par l'AMPc (Yoshimura T, Fijisawa J-I, Yoshida M, EMBO J. 9, 2537-2542, 1990; Flink K J, Jones N C, Oncogene 6, 2019-2026, 1991) . La protéine chimère comprenant une partie de la protéine EWS et une partie de la protéine ATF-1, qui possède potentiellement le domaine transactivateur de EWS lié au domaine bZIP, qui n'est plus régulé par l'AMPc, de ATF-1, peut altérer la régulation de la transcription des gènes normalement contrôlés par ATF-1. Les deux hybrides transcrits sont générés, dans la plupart des MMSP, par une translocation cytogenetiquement simple, suggérant que la transcription du gène ATF-1 est identique à celle du gène EWS, soit depuis le centromère vers le télomère.Les deux étant exprimés. Cette situation avait déjà été observée dans plusieurs tumeurs malignes hematologiques . En effet, il a été montré que les chromosomes de la translocation t(15;17) associée à la leucémie promyelotique (Tkachuk D C, Kohler S, Cleary ML, Cell 71, 691-700, 1992), ceux de la translocation t(14;ll) associée aux leucémies aiguës des lymphocytes chez l'enfant (Gu Y, Nakamura T, Aider H, Prasad R, Canaani O, Cimino G, Groce CM, Canaani R, Cell 71, 701-708, 1992), expriment, dans chaque cas, des transcrits de fusion aberrants. Dans le MMSP, l'expression d'un gène de fusion réciproque sur le chromosome der (12) est compatible avec l'expression généralement connue de ATF-1. Toutefois en raison du cadre extérieur de fusion des deux séquences codantes, son produit d'expression déduit est presque entièrement composé des 65 premiers acides aminés de la région N- terminale de la protéine ATF-1. La protéine ATF-1 tronquée ne devrait donc pas former de dimères ou lier l'ADN. La contribution de cette protéine tronquée au phénotype de la tumeur demeure obscur. Toutefois, cela ne devrait pas être essentiel à la prolifération de la tumeur puisque, à une occasion, le' chromosome der(12) présentait une deletion dans 30% des cellules tumorales (Stenma G, Kindblom L-G, Angervall L, Gènes Chrom. Cancer 4, 122-127, 1992) . Dans le cas du sarcome d'Ewing, la fusion réciproque n'est pas exprimée à un niveau mesurable et le chromosome der(11) n'est déleté que dans quelques cas (Turc-carel C, Aurias A, Mugneret F, Lizard Sidaner I, Volk C, Thiery JP, Olschwang S, Philip T, Lenoir GM, Cancer Genêt. Cytogenet. 32, 229- 238, 1988; Douglass AC, Valentine M, Green AA, Hayes FA, Thompson El, J. Nat. Cancer Inst. , 1211-1213, 1986) .
Dans le cas de la leucémie des lymphocytes aiguë, le domaine transactivateur N-terminal de E2A peut être lié soit au domaine de PBX1, soit au domaine bZIP de HLF (Inaba T, Roberts WM, Shapiro LH, Jolly KW, Raimondi SC, Smiht SD, Look AT, Science 257, 521-534, 1992; Hunger SP, Ohyashiki K, Toyama K, Cleary ML, Gènes Develop. 6, 1608-1620, 1992) . La présente étude démontre mode similaire de conversion oncogénétique des tumeurs solides. En effet, le domaine transactivateur N-terminal de EWS peut être fusionné au domaine de fixation de l'ADN de différentes familles de facteurs de transcription : le domaine ETS dans le cas du sarcome d'Ewing, le domaine bZIP dans le cas du MMPS. Ceci suggère un mécanisme oncogénétique commun médié par le domaine N-terminal de EWS contenu à la fois dans les protéine chimères EWS/HUM-FLI-1 et EWS/AF-1.

Claims

REVENDICATIONS
1) Acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence nucleotidique du gène Ews porté par le chromosome 22.
2) Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence nucleotidique de l'ADNc du gène Ews de la figure 6.
3) ADN hybride caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué, d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews selon l'une des revendications 1 à 2, et d'une partie de la séquence nucleotidique d'un gène localisé au niveau du point de cassure d'un chromosome impliqué dans une translocation chromosomique réccurente avec le chromosome 22.
4) ADN hybride selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend la partie de la séquence nucleotidique du gène Ews jusqu'à la région EWSRl de 7 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 22.
5) ARNm hybride issu d'un ADN selon l'une des revendications 3 à 4.
6) ADN hybride selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews et de la partie de la séquence nucleotidique du gène Hu - Fli-1 localisée au niveau du point de cassure du chromosome 11 dans la translocation t(ll;22) (q24;ql2) . 7) ADN hybride selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué de la partie de la séquence nucleotidique du gène Ews jusqu'à la région EWSRl de 7 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 22 et, de la partie de la séquence nucleotidique du gène Hum-Fli-1 depuis la région EWSR2 de 40 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 11 dans cette translocation jusqu'à son extrémité 3'.
8) ADN hybride selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué d'une partie de la séquence nucleotidique de l'ADNc du gène Ews de la figure 6 et, d'une partie de la séquence nucleotidique de l'ADNc du gène Hum-Fli—1 de la figure 7.
9) ADN hybride selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'il est constituée par ou comprend la séquence représentée à la figure 8.
10) ADN hybride selon la revendication 8, caractérisé en ce que sa séquence de jonction entre les gènes Ews et Hum-Fli-1 est représentée à l'une des figures 14, 15 ou 16.
11) ARNm hybride caractérisé en ce qu'il est issu d'un ADN selon l'une des revendications 6 à 10.
12) Sonde nucleotidique caractérisée en ce qu'elle est capable de s'hybrider avec tout ou partie d'au moins un des acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 11. 13) Oligonucléotide comprenant environ 20 bases caractérisé en ce qu'il est issu d'une sonde selon la revendication 12.
14) Oligonucléotide selon la revendication 13 pour la transcription réverse d'ARNm de fusion, caractérisé en ce qu'il est constitué de la séquence de formule suivante :
51 AGAAGGGTACTTGTACATGG 3*
15) Oligonucléotides selon la revendication 13 constituant des amorces pour l'amplification génique par PCR d'un ADNc de fusion, caractérisés en ce qu'ils sont constitués des séquences de formules suivantes : 5' ACTCCCCGTTGGTCCCCTCC 3'
5' TCCTACAGCCAAGCTCCAAGTC 3'
16) Protéine de fusion, résultant d'une translocation chromosomique t(ll;22), présente dans des cellules tumorales, caractérisée en ce qu'elle est constituée de la séquence en acides aminées codée par un ADN hybride selon l'une des revendications 6 à 10.
17) Protéine selon la revendication 16, caractérisée en qu'elle a conservé la partie N-terminale de la protéine EWS et la partie C-terminale de la protéine Hum-Fli-1.
18) Protéine selon l'une des revendications 16 à 17, caractérisée en ce que sa séquence en acides aminés est constituée par ou comprend la séquence représentée à la figure 8. 19) Anticorps spécifique d'une protéine de fusion résultant d'une translocation t(ll;22) selon l'une des revendication 16 à 18.
20) Procédé de détection d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(ll;22), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(ll;22), de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient aptes à s'hybrider avec une sonde;
- la mise en contact d'au moins une sonde selon la revendication 12, éventuellement marquée, spécifique, soit d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, soit de la séquence nucleotidique d'un gène de fusion résultant de la translocation t(ll;22), avec l'échantillon biologique, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde (s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillon;
- la mise en évidence par tous moyens appropriés des hybrides éventuellement formés .
21) -Procédé de détection du transcrit d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(ll;22), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : — l'extraction d'ARNm d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(ll;22); - la synthèse, par transcription réverse de cet ARNm à l'aide d'un oligonucléotide selon l'une des revendications 13 et 14, d'un ADNc correspondant;
- L'amplification génique à l'aide d'ADN polymérase et de deux oligonucléotides amorces selon l'une des revendications 13 et 15, de cet ADNc;
- l'analyse des produits amplifiés.
22) Procédé de détection d'une protéine chimère codée par un gène de fusion résultant de la translocation t(ll;22), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique provenant d'un patient dont les cellules tumorales sont susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(ll;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps; la mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un anticorps selon la revendication 19, spécifique d'au moins une protéine chimère résultant de la translocation t(ll;22), dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps et les protéines présentes dans les cellules de l'échantillon; - la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés .
23) Procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(ll;22), de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient aptes à s'hybrider avec une sonde;
- la mise en contact d'au moins une sonde selon la revendication 12, éventuellement marquée, spécifique, soit d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, soit de la séquence nucleotidique d'au moins un gène de fusion résultant de la translocation t(ll;22) , avec l'échantillon biologique, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde (s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillon;
- la mise en évidence par tous moyens appropriés des hybrides éventuellement formés pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(ll;22) .
24) Procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - l'extraction d'ARNm d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t (11;22) ;
- la synthèse, par transcription réverse de cet ARNm à l'aide d'un oligonucléotide selon l'une des revendications 13 et 14, d'un ADNc correspondant;
- L'amplification génique à l'aide d'ADN polymérase et de deux oligonucléotides amorces selon l'une des revendications 13 et 15, de cet ADNc; - l'analyse des produits amplifiés pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(ll;22) . 79
25) Procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique 5 provenant d'un patient dont les cellules tumorales sont susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(ll;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps;
- la mise en contact de l'échantillon 10 biologique avec au moins un anticorps selon la revendication 19, spécifique d'au moins une protéine chimère résultant d'une translocation t(ll;22), dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps et les 15 protéines présentes dans les cellules de l'échantillon;
- la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la
20 translocation t(ll;22).
26) Utilisation d'un acide nucléique ou d'un analogue de cet acide nucléique, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un ADN hybride selon
25 l'une des revendications 6 à 10, pour préparer un agent thérapeutique inhibant l'expression d'un gène de fusion résultant d'une translocation chromosomique t(ll;22) (q24;ql2), dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs
30 apparentées.
27) Agent thérapeutique pour inhiber -* l'expression d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t (11;22) (q24;ql2) dans les 35 cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un ADN hybride selon l'une des revendications 6 à 10, ou un analogue de cet ADN, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(ll; 22) (q24; ql2) .
28) Utilisation d'un acide nucléique ou d'un analogue de cet acide nucléique, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un ARN hybride selon la revendication 117 pour préparer un agent thérapeutique inhibant la traduction de protéines chimères résultant d'une translocation chromosomique t (11;22) (q24;ql2) , dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées.
29) Agent thérapeutique pour inhiber la traduction de protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t(11;22) (q24;ql2) dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un ARN hybride selon la revendication 11, ou un analogue de cet ARN, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique de l'ARN issu d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(ll;22) (q24;ql2) .
30) ADN hybride selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews et de la partie de la séquence nucleotidique du gène Erg localisée au niveau du point de cassure du chromosome 21 dans la translocation t(21;22) . 31) ADN hybride selon la revendication 30, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué de la partie de la séquence nucleotidique du gène Ews jusqu'à la région EWSRl de 7 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 22 et, de la partie de la séquence nucleotidique du gène Erg depuis la région au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 21 dans cette translocation jusqu'à son extrémité 3'.
32) ADN hybride selon la revendication 31, caractérisé en ce que sa séquence de jonction entre les gènes Ews et Erg est représentée à la figure 18.
33) ARNm hybride caractérisé en ce qu'il est issu d'un ADN selon l'une des revendications 30 à 32.
34) Sonde nucleotidique caractérisée en ce qu'elle est capable de s'hybrider avec tout ou partie d'au moins un des acides nucléiques selon l'une des revendications 30 à 33.
35) Oligonucléotide comprenant environ 20 bases caractérisé en ce qu'il est issu d'une sonde selon la revendication 34.
36) Protéine de fusion, résultant d'une translocation chromosomique t(21;22), présente dans des cellules tumorales, caractérisée en ce qu'elle est constituée de la séquence en acides aminées codée par un ADN hybride selon l'une des revendications 30 à 32.
37) Protéine selon la revendication 36, caractérisée en qu'elle a conservé la partie N-terminale de la protéine EWS et la partie C-terminale de la protéine ERG.
38) Anticorps spécifique d'une protéine de fusion résultant d'une translocation t(21;22) selon l'une des revendication 36 à 37.
39) Procédé de détection d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(21;22), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(21;22), de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient aptes à s'hybrider avec une sonde;
- la mise en contact d'au moins une sonde selon la revendication 34, éventuellement marquée, spécifique, soit d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, soit de la séquence nucleotidique d'au moins un gène de fusion résultant de la translocation t(21;22), avec l'échantillon biologique, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde (s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans 1 '.échantillon;
- la mise en évidence par tous moyens appropriés des hybrides éventuellement formés .
40) Procédé de détection du transcrit d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(21;22), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- l'extraction d'ARNm d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t (21; 22) ;
- la synthèse, par transcription réverse de cet ARNm à l'aide d'un oligonucléotide adéquat selon la revendication 35, d'un ADNc correspondant;
- L'amplification génique à l'aide d'ADN polymérase et de deux oligonucléotides amorces adéquat selon la revendications 35, de cet ADNc;
- l'analyse des produits amplifiés.
41) Procédé de détection d'une protéine chimère codée par un gène de fusion résultant de la translocation t(21;22), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - le traitement d'un échantillon biologique provenant d'un patient dont les cellules tumorales sont susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(21;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps; - la mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un anticorps selon la revendication 38, spécifique de la protéine chimère, dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps et les protéines présentes dans les cellules de l'échantillon;
- la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés .
42) Procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(21;22), de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient aptes à s'hybrider avec une sonde;
- la mise en contact d'au moins une sonde selon la revendication 34, éventuellement marquée, spécifique, soit d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, soit de la séquence nucleotidique d'au moins un gène de fusion résultant de la translocation t(21;22) , avec l'échantillon biologique, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde(s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillon;
- la mise en évidence par tous moyens appropriés des hybrides éventuellement formés pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(21;22) .
43) Procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- l'extraction d'ARNm d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t (21;22) ; - la synthèse, par transcription réverse de cet ARNm à l'aide d'un oligonucléotide adéquat selon la revendication 35, d'un ADNc correspondant;
- L'amplification génique à l'aide d'ADN polymérase et de deux oligonucléotides amorces adéquat selon la revendication 35, de cet ADNc;
- l'analyse des produits amplifiés pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(21;22) . 44) Procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique provenant d'un patient dont les cellules tumorales sont susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(21;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps;
- la mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un anticorps selon la revendication 38, spécifique d'au moins une protéine chimère résultant d'une translocation t(21;22), dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps et les protéines présentes dans les cellules de l'échantillon;
- la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(21;22) .
45) Procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer simultanément les procédés selon les revendications 23 et 42
46) Procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer simultanément les procédés selon les revendications 24 et 43
47) Procédé de diagnostic du Sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer simultanément les procédés selon les revendications 25 et 44 48) Utilisation d'un acide nucléique ou d'un analogue de cet acide nucléique, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un ADN hybride selon l'une des revendications 30 à 32, pour préparer un agent thérapeutique inhibant l'expression d'un gène de fusion résultant d'une translocation chromosomique t(21;22), dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées.
49) Agent thérapeutique pour inhiber l'expression d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(21;22) dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un ADN hybride selon l'une des revendications 30 à 32, ou un analogue de cet ADN, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(21;22) .
50) Utilisation d'un acide nucléique ou d'un analogue de cet acide nucléique, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un ARN hybride selon la revendication 33, pour préparer un- agent thérapeutique inhibant la traduction de protéines chimères résultant d'une translocation chromosomique t(21;22), dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées.
51) Agent thérapeutique pour inhiber la traduction de protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t (21; 22) dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d' Ewing ou de tumeurs apparentées , caractérisé en ce qu ' il est essentiellement constitué par un ARN hybride selon la revendication 33, ou un analogue de cet ARN, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique de l'ARN issu d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(21;22) .
52) Agent thérapeutique pour inhiber l'expression d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t (11;22) (q24;ql2) ou de la translocation chromosomique t(21;22) dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué des agents thérapeutiques selon les revendications 27 et 49.
53) Agent thérapeutique pour inhiber la traduction de protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t (11;22) (q24;ql2) ou de la translocation chromosomique t(21;22) dans les cellules tumorales de patients atteints du Sarcome d'Ewing ou de tumeurs apparentées, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué des agents thérapeutiques selon les revendications 29 et 51.
54) ADN hybride selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews et de la partie de la séquence nucleotidique du gène Atf-1 localisée au niveau du point de cassure du chromosome 12 dans la translocation t(12;22) (ql3;ql2) .
55) ADN hybride selon la revendication 54, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué de la partie de la séquence nucleotidique du gène Ews jusqu'à la région EWSRl de 7 Kb au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 22 et, de la partie de la séquence nucleotidique du gène Atf-1 depuis la région au niveau de laquelle se situe le point de cassure du chromosome 12 dans cette translocation jusqu'à son extrémité 3'.
56) ADN hybride selon la revendication 55, caractérisée en ce qu'il est constituée par ou comprend la séquence représentée à la figure 22.
57) ADN hybride selon la revendication 8, caractérisé en ce que sa séquence de jonction entre les gènes Ews et Atf-1 est représentée à la figure 23.
58) ARNm hybride caractérisé en ce qu'il est issu d'un ADN selon l'une des revendications 54 à 57.
59) Sonde nucleotidique caractérisée en ce qu'elle est capable de s'hybrider avec tout ou partie d'au moins un des acides nucléiques selon l'une des revendications 54 à 58.
60) Oligonucléotide comprenant environ 20 bases caractérisé en ce qu'il est issu d'une sonde selon la revendication 59.
61) Protéine de fusion, résultant d'une translocation chromosomique t(12;22), présente dans des cellules tumorales, caractérisée en ce qu'elle est constituée de la séquence en acides aminées codée par un ADN hybride selon l'une des revendications 54 à 57.
62) Protéine selon la revendication 61, caractérisée en qu'elle a conservé la partie N-terminale de la protéine EWS et la partie C-terminale de la protéine Atf-1. 63) Protéine selon l'une des revendications 61 à 62, caractérisée en ce que sa séquence en acides aminés est constituée par ou comprend la séquence représentée à la figure 22.
64) Anticorps spécifique d'une protéine de fusion résultant d'une translocation t(12;22) selon l'une des revendication 61 à 63.
65) Procédé de détection d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(12;22), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(ll;22), de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient aptes à s'hybrider avec une sonde; - la mise en contact d'au moins une sonde selon la revendication 59, éventuellement marquée, spécifique, soit d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, soit de la séquence nucleotidique d'un gène de fusion résultant de la translocation t(12;22), avec l'échantillon biologique, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde (s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillon;
- la mise en évidence par tous moyens appropriés des hybrides éventuellement formés.
66) Procédé de détection du transcrit d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(12;22), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : l'extraction d'ARNm d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(12;22); - la synthèse, par transcription réverse de cet ARNm à l'aide d'un oligonucléotide adéquat selon la revendication 60, d'un ADNc correspondant;
- L'amplification génique à l'aide d'ADN polymérase et de deux oligonucléotides amorces adéquat selon la revendication 60, de cet ADNc;
- l'analyse des produits amplifiés.
67) Procédé de détection d'une protéine chimère codée par un gène de fusion résultant de la translocation t(12;22), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique provenant d'un patient dont les cellules tumorales sont susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(12;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps;
- la mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un anticorps selon la revendication 64, spécifique d'au moins une protéine chimère résultant de la translocation t(12;22), dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps et les protéines présentes dans les cellules de l'échantillon;
- la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés".
68) Procédé de diagnostic du mélanome malin des parties molles, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - le traitement d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(12;22), de façon à rendre les acides nucléiques qu'il contient aptes à s'hybrider avec une sonde;
- la mise en contact d'au moins une sonde selon la revendication 59, éventuellement marquée, spécifique, soit d'une partie de la séquence nucleotidique du gène Ews, soit de la séquence nucleotidique d'au moins un gène de fusion résultant de la translocation t(12;22) , avec l'échantillon biologique, dans des conditions permettant la formation de complexes d'hybridation entre la (ou les) sonde(s) et l'ADN ou l'ARN cible contenu dans l'échantillon;
- la mise en évidence par tous moyens appropriés des hybrides éventuellement formés pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(12;22) .
69) Procédé de diagnostic du mélanome malin des parties molles, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- l'extraction d'ARNm d'un échantillon biologique provenant de cellules tumorales d'un patient susceptibles de présenter une translocation chromosomique t (12;22) ;
- la synthèse, par transcription réverse de cet ARNm à l'aide d'un oligonucléotide adéquat selon la revendication 60, d'un ADNc correspondant;
- L'amplification génique à l'aide d'ADN polymérase et de deux oligonucléotides amorces adéquat selon la revendication 60, de cet ADNc; - l'analyse des produits amplifiés pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(12;22).
70) Procédé de diagnostic du mélanome malin des parties molles, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique provenant d'un patient dont les cellules tumorales sont susceptibles de présenter une translocation chromosomique t(12;22), de façon à rendre les protéines qu'il contient accessibles à des anticorps;
- la mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un anticorps selon la revendication 64, spécifique d'au moins une protéine chimère résultant d'une translocation t(12;22), dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques entre le (ou les) anticorps et les protéines présentes dans les cellules de l'échantillon; - la mise en évidence par tout moyen approprié des complexes immunologiques éventuellement formés pour détecter la présence d'un produit correspondant au gène de fusion résultant de la translocation t(12;22) .
71) Utilisation d'un acide nucléique ou d'un analogue de cet acide nucléique, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un ADN hybride selon l'une des revendications 54 à 57, pour préparer un agent thérapeutique inhibant l'expression d'un gène de fusion résultant d'une translocation chromosomique t(12;22) (ql3;ql2), dans les cellules tumorales de patients atteints du mélanome malin des parties molles. 72) Agent thérapeutique pour inhiber l'expression d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t (12;22) (ql3;ql2) dans les cellules tumorales de patients atteints du mélanome malin des parties molles, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un ADN hybride selon l'une des revendications 54 à 57, ou un analogue de cet ADN, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t(12;22) (ql3;ql2) .
73) Utilisation d'un acide nucléique ou d'un analogue de cet acide nucléique, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique d'un ARN hybride selon la revendication 58, pour préparer un agent thérapeutique inhibant la traduction de protéines chimères résultant d'une translocation chromosomique t (12;22) (ql3;ql2) , dans les cellules tumorales de patients atteints du mélanome malin des parties molles .
74) Agent thérapeutique pour inhiber la traduction de protéines chimères résultant de la translocation chromosomique t (12;22) (ql3;ql2) dans les cellules tumorales de patients atteints du mélanome malin des parties molles, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par un ARN hybride selon la revendication 58, ou un analogue de cet ARN, capable de s'hybrider avec la séquence nucleotidique de l'ARN issu d'un gène de fusion résultant de la translocation chromosomique t (12;22) (ql3;ql2) .
75) Procédé de détection d'un gène de fusion résultant d'une translocation chromosomique t(ll;22) selon l'une des revendications 20 à 22, ou d'une translocation chromosomique t(21;22) selon l'une des revendications 39 à 41, ou d'une translocation chromosomique t(12;22) selon l'une des revendications 65 à 67, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la détection, selon les mêmes moyens, du gène Ews ou de l'ARNm qui en est issu ou de l'ADNc qui en dérive ou encore de la protéine EWS, à titre de témoin.
76) Procédé de diagnostic du sarcome d'Ewing et des tumeurs apparentés selon l'une des revendications 23 à 25, ou 42 à 44, ou 45 à 47, ou du mélanome malin des parties molles selon l'une des revendications 68 à 70, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la détection, selon les mêmes moyens, du gène Ews ou de l'ARNm qui en est issu ou de l'ADNc qui en dérive ou
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