WO1993006222A1

WO1993006222A1 - Lignees de cellules endotheliales cerebrales immortalisees avec un oncogene

Info

Publication number: WO1993006222A1
Application number: PCT/FR1992/000879
Authority: WO
Inventors: Michel Claire; Pierre-Olivier Couraud; Odile Durieu-Trautmann; Nathalie Foignant-Chaverot; Françoise ROUX; Arthur Donny Strosberg
Original assignee: Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Priority date: 1991-09-24
Filing date: 1992-09-22
Publication date: 1993-04-01
Also published as: FR2681609B1; FR2681609A1

Abstract

Lignées de cellules endothéliales cérébrales immortalisées, leur procédé de préparation et leurs applications en tant que modèle d'étude de la physiopathologie cérébrale et plus particulièrement en tant que modèle cellulaire de la barrière hémato-encéphalique. Lesdites lignées sont obtenues par transfection de cellules endothéliales cérébrales par un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire, éventuellement associé à au moins un gène marqueur et les lignées ainsi transfectées sont immortalisées et présentent le phénotype non transformé de cellules endothéliales cérébrales différenciées.

Description

LIGNEES DE CELLULES ENDOTHELIALES CEREBRALES IMMORTALISEES, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEURS APPLICATIONS EN TANT QUE MODELE D'ETUDE DE LA PHYSIOPATHOLOGIE CEREBRALE.

La présente invention est relative à des lignées de cellules endothéliales cérébrales immortalisées, à leur procédé de préparation et à leurs applications en tant que modèle d'étude de la physiopathologie cérébrale et plus particulièrement en tant que modèle cellulaire de la barrière hémato-encéphalique.

La barrière hématoencéphalique contrôle les échanges entre le sang et le parenchyme cérébral. Elle est essentiellement constituée des cellules endothéliales des microvaisseaux cérébraux, associées aux astrocytes perivasculaires. Ces cellules endothéliales présentent un phenotype unique, caractérisé essentiellement par la présence de nombreuses jonctions serrées intercellulaires et l'expression d'enzymes spécifiques, telles que la γ- glutamyltranspeptidase (γ-GT) et la phosphatase alcaline.

II est connu que l'induction de ce phenotype endothelial est contrôlé, in vivo, par les astrocytes perivasculaires. L'étude in vi tro des mécanismes moléculaires de cette induction présente l'inconvénient d'être dépendante de la disponibilité en cultures cellulaires primaires de cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux ; de plus, outre la difficulté, à l'heure actuelle, de disposer de systèmes permettant l'analyse des cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique, la durée de vie limitée de ces cellules en culture (de l'ordre de douze passages) conduisant, de plus, à des changements phénotypiques considérables concomitamment au vieillissement cellulaire (DURIEU-TRAUTMANN et al., J. Neurochem., 1991) est un autre inconvénient majeur lié à cette étude.

Les Inventeurs se sont, en conséquence, donné pour but de pourvoir à un modèle d'étude des cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique, ne pré sentant pas les inconvénients des cultures de ces cellules et permettant l'étude des processus neuro- et immuno- chimiques impliqués dans le contrôle de l'activité de la barrière hémato-encéphalique.

La présente invention a pour objet des lignées de cellules endothéliales cérébrales de mammifère, caractérisées :

en ce qu'elles sont immortalisées et présentent au moins l'une des caractéristiques suivantes des cellules endothéliales cérébrales différenciées, de manière stable :

- l'expression de marqueurs endothéliaux tels que l'antigène apparenté au facteur VIII, l'enzyme de conversion de l'angiotensine et des enzymes spécifiques (γ-GT, phosphatase alcaline),

- la sécrétion de substances vasoactives (endothéline, NO, prostaglandines),

- l'expression de molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH),

- l'expression de récepteurs hormonaux

(récepteurs de neurotransmetteurs tels que les récepteurs β-adrénergiques), et

- l'existence de jonctions serrées et

. en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues par transfection de cellules endothéliales cérébrales par un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogene viral ou cellulaire, éventuellement associé à au moins un gène marqueur.

De telles lignées cellulaires présentent, de manière surprenante, au moins l'une des propriétés précitées des cellules endothéliales cérébrales différenciées, et ce, de manière stable.

Conformément à l'invention, ledit gène marqueur est avantageusement un gène codant pour la résistance à un antibiotique.

Selon un mode de réalisation avantageux de la dite lignée, elle est obtenue par transfection de cellules endothéliales de capillaires cérébraux bovins par le plasmide pSV3 néo contenant le gène néo de la résistance à la néomycine et un fragment de l'oncogene T de SV40.

Le plasmide pSV3 néo est plus particulièrement décrit dans l'article au nom de Southern et Berg, (J. Mol. Appl. Genêt., 1982, 1, 327-341).

Cette lignée cellulaire a été dénommée SV-BEC par les Inventeurs.

Conformément à l'invention, ladite lignée a été déposée sous le nº I-1143 en date du 19 septembre 1991 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite lignée, elle est obtenue par transfection de cellules endothéliales de capillaires cérébraux de rat par un plasmide contenant la région. précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine.

Cette lignée cellulaire a été dénommée RBE-4 par les Inventeurs.

Conformément à l'invention, ladite lignée a été déposée sous le nº I-1142 en date du 19 septembre 1991 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.

Ledit fragment oncogene viral ou cellulaire et/ou le gène marqueur sont sous le contrôle soit d'un promoteur homologue, soit d'un promoteur hétérologue, aptes à permettre l'expression dudit fragment immortalisant.

De manière inattendue, lesdites lignées sont immortelles, présentent un phenotype stable et non transformé de cellules endothéliales cérébrales différenciées, possèdent une activité de prolifération illimitée et présentent certaines des propriétés des cellules endothé liales cérébrales de la barrière hémato-encéphalique, permettant notamment leur utilisation comme modèle cellulaire in vitro de la barrière hémato-encéphalique.

La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une lignée cellulaire conforme à l'invention par une méthode de transfection, lequel procédé est caractérisé en ce que :

. on cultive des cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux dans un milieu de culture convenable, supplémenté en sérum et en facteur de croissance,

. on les transfecte entre le 2ème et le 6ème passage avec un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogene viral ou cellulaire et éventuellement au moins un gène marqueur, notamment un gène codant pour la résistance à un antibiotique et

. on sélectionne les cellules transfectées sur un milieu de sélection adapté audit gène marqueur, si nécessaire.

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du- dit procédé, ledit fragment nucléique comprend un gène codant pour la résistance à la néomycine et un fragment d'un oncogene viral, tels qu'un fragment de I'oncogene T de SV40 et un fragment contenant la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 ou d'un oncogene cellulaire.

La présente invention a également pour objet un modèle d'étude et d'identification des systèmes biochimiques et cellulaires de la barrière hémato-encéphalique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une lignée cellulaire selon l'invention.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention, avec référence aux dessins annexés dans lesquels les figures 1 à 7 illustrent les propriétés des cellules SV-BEC et les figures 8 à 14 illustrent les propriétés des cellules RBE-4.

De manière plus précise :

- les figures 1A et 1B illustrent l'effet du FGFb sur la prolifération des cellules SV-BEC (figure 1A) et des cellules CECB (figure 1B),

- les figures 2A et 2B illustrent l'effet de quantités croissantes de FGFb sur les cellules SV-BEC (figure 2A) et des cellules CECB (figure 2B),

- les figures 3 montrent que les cellules SV-

BEC sont des cellules endothéliales différenciées (figure 3A : présence d'enzyme de conversion de I'angiotensine ; figure 3B : présence d'antigène apparenté au facteur VIII ; figure 3C : immunocoloration avec I'agglutinine Griffonia simplicifolia,

- la figure 4 montre que les cellules SV-BEC sécrètent de I'endothéline-1,

- la figure 5 illustre une coupe verticale d'une monocouche confluente de cellules SV-BEC, en microscopie électronique,

- la figure 6 montre le nombre de sites de liaison β-adrénergiques présents à la surface des cellules SV-BEC,

- les figures 7A et 7B illustrent l'effet de l'isoproterenol et d'un antagoniste sur la quantité d'AMPc dans les cellules SV-BEC,

- la figure 8 montre la structure du plasmide servant à la transfection des cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux de rat, pour l'obtention de la lignée immortalisée RBE-4,

- les figures 9A et 9B illustrent certaines des caractéristiques du phenotype endothelial différencié des cellules RBE-4 immortalisées : expression d'un antigène apparenté au facteur apparenté au facteur VIII (figure 9A) et coloration par la lectine Bandeiraea simplicifolia (figure 9B), - Les figures 9C à 9F montrent la localisation histochimique de γ-GT, en présence de FGFb dans des cellules RBE-4 immortalisées,

- Les figures 10A-F montrent la localisation histochimique de la phosphatase alcaline, en l'absence

(figures 10A-B) ou en présence (figures 10C-F) de FGFb,

- Les figures 11 et 12 illustrent la synthèse d'AMPc (figure 11) et de GMPc (figure 12) par les cellules RBE-4,

- la figure 13 illustre la sécrétion d'ET-1 par les cellules RBE-4, et

- la figure 14 illustre l'expression des molécules de classe I et de classe II du CMH dans les cellules RBE-4.

II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : Préparation d'une lignée cellulaire conforme à l'invention : cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux bovins (lignée SV-BEC).

Des cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux bovins sont isolées à partir du cortex cérébral traité à la collagénase (DURIEU-TRAUTMANN et al., J. Neurochem., 1991, 56, 3, 775-781) ; ces cellules ne sont pas contaminées par des cellules vasculaires de muscle lisse ou des péricytes. Elles sont mises en culture dans des boîtes recouvertes de gélatine à 0,2 % (p/v) contenant un milieu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's Médium) supplémenté en sérum bovin fétal à 10 % (v/v), en glu- tamine 2 mM et en FGFb à 1 ng/ml et du glucose a 1 g/l.

Elles sont soumises à un passage hebdomadaire réalisé par resuspension dans de la trypsine-EDTA [0,05 %-0,02 % (p/v)] à 1 à 10 dilutions ; le milieu est changé tous les 3 jours.

La technique de coprécipitation au phosphate de calcium est utilisée pour la transfection desdites cellules, au Sème passage, avec le plasmide pSV3 néo (10 μg), contenant un fragment de l'oncogene SV40 et le gène de résistance néo au médicament dénommé G418 (WHITLEY et al., Mol. Cell. Endocrinol., 1987, 52, 279- 284).

Après sélection dans un milieu contenant 800 μg/ml de G418, les cellules présentes sont clonées par dilution limite.

On obtient ainsi le clone SV-BEC.

EXEMPLE 2 : Caractéristiques de la lignée SV-BEC.

La lignée cellulaire obtenue à l'exemple 1 possède un certain nombre des caractéristiques des cellules endothéliales cérébrales.

A. Phénotype __en dothélial différencié :

a) Besoins en FGFb et en gélatine des cellules SV-BEC immortalisées :

. Lorsque les cellules sont ensemencées à faible densité (5.10³ cellules/cm²) dans des boîtes de culture de tissus et cultivées sur un milieu supplémenté en sérum, [DMEM supplémenté en sérum bovin fétal (10 %) et glutamine (2 mM) ] , les cellules endothéliales cérébrales bovines (CECB) prolifèrent à faible taux, tandis que les SV-BEC arrêtent de proliférer après 3-4 jours en culture.

Les figures 1A et 1B, qui comportent en abscisse le nombre de jours et en ordonnées le nombre de cellules/cm² (x 10^-3), illustrent l'effet du FGFb sur la prolifération des cellules SV-BEC (figure 1A) et des celIules CECB (figure 1B). L'addition de FGFb (1 ng/ml) (figure 1A, courbe -■- et figure 1B, courbe -▲-), améliore de manière importante le taux de croissance des deux types cellulaires.

La confluence est atteinte après 5 jours, après addition de FGFb chaque jour.

. La densité cellulaire maximale obtenue avec les cellules SV-BEC, dans ces conditions, est seulement de 65 à 70 % de la densité obtenue avec les cellules CECB. Les taux de croissance des deux types cellulaires sont similaires, avec un temps de doublement de la population d'environ 12 heures, pendant la phase logarithmique.

. Les figures 2A et 2B, qui comportent en abscisses les concentrations en FGFb et en ordonnées le nombre de cellules/cm² (x 10^-3) illustrent l'effet de quantités croissantes de FGFb sur les cellules SV-BEC (figure 2A) et sur les cellules CECB (figure 2B) en présence ou en l'absence de gélatine. La concentration de FGFb nécessaire pour une prolifération cellulaire optimale, est de 0,25 ng/ml pour les cellules SV-BEC (figure 2A : boîtes de culture recouvertes de gélatine : courbe ; boîtes sans gélatine : courbe ❑) et de 0,5 ng/ml pour les cellules CECB (figure 2B : boîtes de culture recouvertes de gélatine : courbe ▲ ; boîtes sans gélatine : courbe ❑) . Dans l'essai illustré aux figures 2A et 2B, le FGFb est ajouté au jour 0 et au jour 3.

Les réponses prolifératives des deux types cellulaires sont significativement améliorées lorsque les cellules sont ensemencées sur des boîtes de culture recouvertes de gélatine. A confluence, les cellules SV-BEC forment une monocouche de cellules, inhibées par contact.

b) Immunochimie :

Par analyse irnmunocytochimique, il apparaît que les cellules SV-BEC expriment un antigène apparenté au facteur VIII ainsi que l'enzyme de conversion de l'angiotensine, deux marqueurs spécifiques des cellules endothéliales.

De plus, ces cellules sont colorées par l'agglutinine Griffonia simplicifolia (Sigma) fluorescente, qui est également un marqueur spécifique des celIules endothéliales cérébrales.

Pour ces trois tests, les cellules ont été cultivées sur des lamelles de couverture recouvertes de gélatine. Elles sont fixées avec un mélange méthanol : éthanol (1:1) à 22ºC pendant 20 min, ces cellules sont d'abord incubées avec des anticorps dirigés contre l'antigène apparenté au facteur VIII ou l'enzyme de conversion de l'angiotensine, puis avec des anticorps biotynilés et finalement elles sont colorées à la strep- tavidine fluorescente. Ces résultats sont observés à l'aide d'un microscope standard (Nikon) équipé avec une illumination en épifluorescence.

L'agglutinine Griffonia simplicifolia, marquée à la fluorescéine est utilisée au 1/400 dans un tampon PBS.

Toutes les incubations sont de 60 minutes à température ambiante.

Les cellules SV-BEC sont donc de vraies cellules endothéliales différenciées, comme le montrent la présence d'antigène apparenté au facteur VIII (figure 3B), d'enzyme de conversion de l'angiotensine (figure 3A) et l'immunocoloration avec l'agglutinine Griffonia simplicifolia (figure 3C).

c) Sécrétion de substances vasoactives :

Les cellules SV-BEC sont également testées pour la synthèse et la sécrétion de substances vasoactives, en comparaison avec les cellules CECB. En utilisant un radioimmunoessai, on détecte une immunoréactivité apparentée à celle de l'endothéline-1 dans un milieu conditionné (figure 4). Les courbes de dilution générées par ces milieux conditionnés sont parallèles à la courbe standard obtenue avec l'endothéline-1 (ET-1). De plus, la sécrétion observée est linéaire en fonction du temps et atteint un plateau au bout de 24 heures. Le protocole du RIA est le suivant :

un antisérum de lapin spécifique de l'endothéline (dilution finale de 1/300) est incubé dans du DMEM supplémenté en sérum bovin fétal (10 %), en présence de différentes concentrations d' endothéline non marquée synthétique ou de milieu conditionné, pendant 2 heures à 37ºC (volume final : 80 μl).

De l'[¹²⁵I]ET-1 (10 000 cpm dans 40 μl) est alors ajoutée et l'incubation est de 16 heures à 4ºC. L'[¹²⁵I]ET-1 libre et liée sont séparées par addition de Protéine A-Sépharose^® .

Après 1 heure à température ambiante, les tubes sont centrifugés, les culots lavés avec un tampon et la radioactivité liée est comptée.

La figure 4 illustre les résultats d'un tel essai et comporte en abscisse la concentration en endothéline-1 (log fmol/tube) et en ordonnées le rapport lié/libre (%). Les milieux conditionnés obtenus à partir de SV-BEC (courbe -

-) et à partir de CEBC (courbe -▲-) sont comparées avec la courbe standard (courbe -O-).

B. Absence de tumoriqénicité :

Les cellules SV-BEC ne sont pas transformées : en effet, comme précisé ci-dessus, elles présentent une inhibition de contact et leur prolifération est dépendante du FGFb exogène.

C. Expression des marqueurs de la barrière hémato-encéphalique :

- Le protocole utilisé est le suivant :

Les cellules sont rincées avec un tampon PBS froid, pH 7,4, puis fixées dans du glutaraldehyde 2 % (v/v) dans un tampon cacodylate 0,1 M, pendant 60 min à 4ºC. Après un rinçage rapide dans le même tampon, les cellules sont à nouveau fixées, soit dans du ferro-osmium [OsO4 1%,K₄Fe(CN)₆0,8 %] dans un tampon cacodylate pendant 30 min, soit dans de IOSO₄ aqueux 1 % et de l'acétate d'uranyle 1 % dans de l'éthanol 50 %. Ces cellules sont ensuite déshydratées dans de l'éthanol puis retirées des boîtes de culture à l'aide d'un traitement court avec du butyl-2-3-époxy-propyl- éther.

Les monocouches sont soigneusement récupérées et transférées sur de petites capsules de polyéthylène et incluses dans un mélange EPON^®, en utilisant de l'époxy- 1-2 -propane comme solvant intermédiaire.

De fines sections sont colorées de manière conventionnelle avec du citrate de plomb et de l'acétate d'uranyle et observées dans un appareil Philipps CM12 à 80 kv.

- Résultats:

La morphologie ultrastructurale des cellules SV-BEC est observée au microscope électronique.

La figure 5 illustre une coupe verticale d'une monocouche confluente ; de nombreuses jonctions serrées intercellulaires sont visibles (voir les flèches), caractéristiques de la barrière hémato-encéphalique.

De plus, une activité γ-glutamyl transférase significative est mesurée dans les cellules confluentes SV-BEC (11,2 nmol.mg prot^-1.min ^-1), également spécifique de la barrière hémato-encéphalique, selon le protocole de mesure de l'activité γ-glutamyl transpeptidase décrit dans ORLOWSKI et MEISTER (Proc. Natl. Acad. Sci., 1970, 67, 1248-1255).

D. Coexpression des récepteurs β1 et β2 adrénergiques :

* Liaison aux récepteurs.

- Protocole :

. Pour la mesure de la liaison des ligands β- adrénergiques, les cellules sont détachées après un court traitement à la trypsine-EDTA, lavées et remises en suspension (environ 10⁷ cellules/ml) dans une solution salée de Hank supplementee avec de l'HEPES 20 mM, pH 7,4 et de la sérumalbumine bovine (1 mg/ml) .

Les cellules (10⁶) sont incubées dans le tam pon avec des quantités croissantes de [³H] CGP 12177, dans un volume final de 300 μl à 37ºC pendant 60 min.

La liaison non spécifique est mesurée en présence de (±) alprénolol 3.10^-5 M. La réaction est arrêtée par addition d'1 ml de tampon froid, et les échantillons sont immédiatement filtrés sur des filtres en fibre de verre GF/C (Whatman). Après lavages, la radioactivité retenue sur les filtres est comptée par scintillation liquide.

- Résultats :

La liaison du [³H] CGP 12177, un antagoniste β-adrénergique hydrophile, est utilisée pour évaluer le nombre de sites de liaison β-adrénergiques présents à la surface des cellules SV-BEC. Une analyse Scatchard des données de liaison à saturation indiquent 3819 ± 229 sites/cellule et une constante de dissociation (K_D) de 899 ± 113 pM (figure 6).

La figure 6 comporte en abscisse la concentration en [³H] CGP 12177, en nM et en ordonnée la quantité liée en fpmol/10⁶ cellules.

* Couplage des récepteurs à l'activité adénylate cyclase : accumulation d'AMPc cellulaire.

- Protocole :

Des aliquots de 10⁶ cellules sont incubés dans un tampon (solution salée de Hank, HEPES 20 mM, pH 7,4,

IBMX (3-isobutyl-1-méthyl-xanthine) 0,5 mM) avec des quantités croissantes de (-)isoproterenol dans un volume final de 200 μl à 37 º C pendant 10 min .

L'inhibition de l'accumulation d'AMPc cellu- laire est testée avec de l'(-)isoproterenol 3.10^-8, en présence de différentes concentrations de ligand CGP 2071A adrénergique β1-sélectif. Le contenu en AMPc esc mesuré comme décrit dans CHAPOT et al. (Hybridoma, 1989, 8, 535-543), en utilisant le kit Amersham [³H] cAMP. - Resultats :

La figure 7A montre que l'(-)isoproterenol induit une augmentation du taux d'AMPc d'un facteur 6.

Ces données indiquent une valeur de IΕC₅₀ de 5 nM pour l'(-) isoproterenol. Une inhibition biphasique de l'effet de l'(-) isoproterenol est observée en présence de CGP 20712A, suggérant l'existence de deux populations de récepteurs β-adrénergiques comme dans les cellules endothéliales d'origine (figure 7B).

Une analyse informatique de ces données révèle que 36 % des récepteurs ont une affinité importante pour le CGP 20712A (IC₅₀ ≈ 29 pM) et que 65 % ont une faible affinité (IC₅₀ ≈ 1 nM). Ces valeurs sont en accord avec les affinités connues du CGP 20712A pour les récepteurs β1 et β2 adrénergiques (MARULLO et al., Bio/Technology, 1989, 7, 923-927).

La figure 7A, qui comporte en abscisse la concentration en (-) isoproterenol (log M) et en ordonnées la quantité de pmol d'AMPc/10⁶ cellules, illustre l'effet de l'isoproterenol sur la quantité d'AMPc dans les cellules SV-BEC et la figure 7B, qui comporte en abscisse la concentration en CGP 20712A (log M) et en ordonnée le pourcentage d'AMPc accumulé, illustre l'inhibition de cet effet par le CGP 20712A.

EXEMPLE 3 : Préparation d'une lignée cellulaire conforme à l'invention : cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux de rat Lewis (lignée RBE-4).

- Des cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux de rat Lewis sont immortalisées par transfection avec un plasmide contenant la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine sous contrôle du promoteur SV40 (figure 8), selon la même technique que celle de l'exemple 1, après mise en culture de ces cellules dans des boîtes recouvertes de collagène, contenant un milieu α-MEM/F10 (2/3 ; 1/3), supplémenté en sérum de veau foetal à 10 %, en FGFb 1 ng/ml, en glutamine et en pénicilline/streptomycine. EXEMPLE 4 : Caractéristiques de la lignée RBE-4.

La lignée cellulaire obtenue à l'exemple 3 possède certaines des caractéristiques des cellules endothéliales cérébrales, étudiées selon les mêmes protocoles que ceux de l'exemple 2 ; elle possède notamment un phenotype non-transformé : inhibition de contact, prolifération dépendant des facteurs de croissance et d'adhérence, expression de marqueurs de différentiation endo- théliale et non-tumorigénicité.

A. Phenotype endothélial différencié :

Les cellules RBE-4 expriment un antigène apparenté au facteur apparenté au facteur VIII (figure 9A) ; de plus, ces cellules sont colorées par la lectine Bandeiraea simplicifolia (figure 9B) ; le protocole utilisé est le même que celui de l'exemple 2 et les résultats montrent bien que les cellules RBE-4 sont des cellules endothéliales différenciées.

B. Expression de marqueurs de la barrière hémato-encéphaligue :

Les activités de deux enzymes, qui sont considérées comme des marqueurs des cellules endothéliales différenciées des microvaisseaux cérébraux, la γ-glutamyl- transférase (γ-GT) et la phosphatase alcaline, sont mises en évidence dans les cellules RBE-4, à l'aide de méthodes histochimiques.

Des cellules RBE-4 sont ensemencées dans des boîtes de culture de tissus et cultivées dans un milieu contenant du FGFb [α Medium/Ham's F10 (1:1 Seromed, France), supplémenté avec de la glutamine 2 mM, du sérum de veau fétal inactivé par la chaleur à 10 % et du FGFb 1 ng/ml ; puis elles sont étalées à une densité de 10⁴ cellules/cm² sur des boîtes recouvertes de collagène]. Les cultures confluentes développent, après plusieurs jours, des ramifications qui s'étendent au delà de la monocouche et forment un réseau de structures tubulaires, rappelant des capillaires (figure 9C). Des activités γ-GT (figure 9C) et phosphatase alcaline peuvent être détectées dans quelques unes de ces structures tubulaires, mais ne sont pas observées dans les cellules de la mono- couche environnante.

Les cellules RBE-4 sont cocultivées avec un milieu conditionné ou des membranes plasmatiques soit de cellules astrogliales primaires de rat (figure 9D), soit de cellules gliomales C6 (figure 9E). Dans des mono- couches traitées avec des membranes plasmatiques des deux types précités, en présence ou non de FGFb, les structures tubulaires se développent rapidement et forment des agrégats informes importants ; une telle prolifération apparaît moins évidente en milieu conditionné. Les activités γ-GT (figure 9F) et phosphatase alcaline (figure 10A-F) se rencontrent dans de nombreuses cellules de ces structures tri-dimensionnelles, entraînant une augmentation globale de ces deux marqueurs de la BHE dans les cocultures. L'addition d'un analogue de l'AMPc, le 8- bromo-AMPc, réduit ce processus angiogénique et induit l'expression d'une activité phosphatase alcaline dans chacune des cellules formant les structures tubulaires résiduelles ou les agrégats et dans quelques cellules de la monocouche. Les effets de cette substance sur la γ-GT sont moins prononcés.

Les figures 9C à 9F montrent la localisation histochimique de γ-GT, en présence de FGFb (un trait correspond à 60 μm) : 9C : cellules RBE-4 à confluence, avec une structure de type capillaire et la présence de quelques cellules γ-GT + ; 9D : cellules RBE-4 traitées pendant 6 jours avec des membranes plasmatiques d'astrocytes primaires ; 9E cellules RBE-4 traitées pendant 6 jours avec des membranes plasmatiques de cellules gliomales C6 ; 9F : cellules RBE-4 traitées pendant 6 jours avec des membranes plasmatiques de cellules gliomales C6 et du 8-bromo-AMPc 0, 1 mM : la plupart des cellules pré sentent une activité γ-GT.

Les figures 10A-F montrent la localisation histochimique de la phosphatase alcaline, en l'absence (figures 10A-B) ou en présence (figures 10C-F) de FGFb : figures 10A et C : cellules RBE-4 à confluence ; figures 10B et D : cellules RBE-4 traitées pendant 6 jours avec des membranes plasmatiques de cellules gliomales C6 ; figure 10E : cellules RBE-4 traitées pendant 10 jours avec un milieu conditionné pour cellules gliomales C6 : figure 10F : cellules en outre traitées avec du 8-bromo-AMPc 0,1 mM. Ces différentes figures montrent que l'expression de l'activité phosphatase alcaline présente la même évolution en coculture ec en présence de 8-bromo-AMPc que la γ-GT.

Ces différents résultats montrent que dans les monocouches de cellules endothéliales du clone RBE-4, comme dans les cultures primaires de cellules endothéliales microvasculaires, la formation de tubes capillaires peut se produire, en présence d'un mitogène angio- génique soluble ; de plus, la formation d'une telle structure tubulaire peut être stimulée par des facteurs astrogliaux (membranaires ou solubles).

C - Expression de récepteurs hormonaux.

. production d'AMPc :

Des aliquots de 4.10⁶ cellules sont incubées dans un tampon A [solution saline de Hank, Hepes 20 mM pH 7,4, IBMX 0,5 mM} en présence de quantités croissantes de (-) isoproterenol, dans un volume final de 250 μl, à 37ºC et pendant 10 minutes ; l'AMPc est mesuré comme décrit dans DURIEU-TRAUTMANN O. et al. (J. Neurochem., 1991, 56, 775-781), en utilisant un kit AMPc Amersham [³H].

Les cellules RBE-4 ont été testées pour leur capacité à produire l'AMPc sous l'influence d'un signal de régulation extracellulaire ; la figure 11, qui comporte en abscisse la concentration en isoproterenol et en ordonnée la concentration en AMPc (pmol/10⁵ cellules), montre que l'isoproterenol, un agoniste β-adrénergique, stimule l'accumulation d'AMPc dans les cellules RBE-4, cette stimulation étant bloquée par le propranolol.

. production de GMPc :

Des aliquots de 2.10⁵ cellules sont incubées dans le même tampon A que précédemment, en présence de quantités croissantes de peptides natriurétiques (ANP) dans un volume final de 500 μl à 37ºC, pendant 10 minutes.

Lorsqu'on teste l'activité guanylyl cyclase soluble, des aliquots de 10⁶ cellules sont incubées dans le tampon A contenant du nitroprusside à 37ºC, pendant 5 minutes.

La production de GMPc, à partir de GTP, est catalysée par différentes enzymes : la figure 12, qui comporte en abscisse la concentration en ANP et en ordonnée la concentration en GMPc (pmol/10⁵ cellules), montre que le facteur atrial natriurétique (FAN ou ANP pour atrial natriuretic peptide) stimule l'accumulation de GMPc dans les cellules RBE-4.

Ceci montre que les cellules immortalisées conformes à l'invention, RBE-4 possèdent des récepteurs β-adrénergiques et des récepteurs FAN.

D - Sécrétion de substances vasoactives.

. sécrétion d'endothéline-1 (ET-1) :

Les cellules RBE-4 sont cultivées dans des boîtes contenant 24 puits, pendant 3 jours.

Le milieu est alors changé et remplacé par 500 μl de milieu dépourvu de sérum contenant de la SAB 0,15 % et différents effecteurs aux concentrations indiquées ci-après.

L'incubation dure de 30 min à 6 h. Les taux d'ET-1 dans les surnageants de culture sont déterminés par EIA, basé sur l'utilisation d'un tandem d'anticorps monoclonaux dirigés contre deux épitopes différents de l'ET-1 (sensibilité de l'essai, de l'ordre du pg/ml) ; l'accumulation d'ET-1 dans le milieu extracellulaire est linéaire sur une période de 6-8 heures (110±4 pg/10⁶ cellules/h, à confluence) (figure 13), puis atteint un plateau vers la 16ème heure. Cette sécrétion est stimulée par le sérum et la thrombine ; de plus, le 8-bromo-AMPc (0,5mM) induit un forte libération d'ET-1, tandis que le 8-bromo-GMPc (0,5mM) et le FAN (100 nM) inhibent cette sécrétion.

La figure 13 met en valeur ces résultats, obtenus dans les conditions précitées :

en présence de : 1 : rien ; 2 : 8-bromo-AMPc 0,5 mM ; 3 : IBMX 0,5 mM et 8-bromo-AMPc 0,5 mM ; 4 : isoproterenol 100 μM ; 5 : 8-bromo-GMPc 0,5 mM ; 6 : FAN 100 nM et 7 : IBMX 0,5 mM. Après ces traitements, on mesure l'immunoréactivité ET-1 dans les surnageants. Les résultats sont exprimés comme la moyenne ± SEM de 8 à 16 déterminations (p<0,01 pour les colonnes 2 à 6).

. sécrétion de NO :

Le NO, identifié comme facteur relaxant de l'endothelium, est synthétisé à partir de L-arginine par au moins deux NO synthases différentes (la première : dépendante du calcium et de la calmoduline et exprimée, de manière constitutive, seulement dans un petit nombre de types cellulaires, incluant quelques neurones ; la deuxième : inductible par les cytokines).

Des cellules RBE-4 sont cultivées dans des boîtes à 24 puits, pendant 3 jours.

Elles sont ensuite stimulées par l'addition de 100 U/ml d'IFN-γ de rat et/ou de 50 U/ml de TFNα humain, en présence ou en l'absence des différents effecteurs mentionnés ci-après : N-méthylarginine (NMA) , nitroarginine(NOA), cycloheximide (CHX) , 8-bromo-AMPc (BrAMPc) ou isoproterenol (ISO).

Le tableau I ci-après montre la régulation de l'activité NO synthase inductible dans les cellules RBE-

La libération de NO par les cellules RBE-4 est détectée par détermination colorimétrique des nitrites accumulées, après 48 h, en ajoutant 500 μl de surnageant cellulaire à 500 μl de réactif de Greiss (sulfanilamide 0,5 % et dihydrochlorure de naphtyléthylènediamine 0,05 %, dans de l'acide phosphorique 5 %), puis en incubant 10 min à température ambiante. La DO540 est mesurée avec un spectrophotomètre. Comme le montre le tableau I, seule la NO synthase inductible est détectable dans les cellules RBE-4. La production de nitrites par les cellules RBE-4 est induite par un traitement avec l'IFN-γ et le TNFα potentialise cet effet. Cette activité est bloquée par la N-méthyl-arginine et d'une moindre manière par la nitro-arginine. Ceci montre l'absence d'expression de la NO synthase constitutive par ces cellules, ce qui constituerait une caractéristique particulière des cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique.

Le tableau I montre également que le BrAMPc, quoique n'ayant aucun effet seul, potentialise l'effet inducteur des cytokines. L'isoproterenol stimule l'effet inducteur de l'IFN-γ et du TNFα, bien que sans effet seul.

L'activité de l'isoproterenol est dépendante de la dose et simule celle du 8-Br-AMPc.

L'activation de la synthèse de NO est précédée d'une lag-phase de 7-8 h.

. sécrétion de prostaglandines :

Les cellules RBE-4 sécrètent de manière constitutive des quantités importantes de PGE2 (> 1000 pg/ml), mais pratiquement pas de 6-céto-PGF-_1α, le dérivé stable de la PGI₂ (< 50 pg/ml).

E - Expression de molécules du complexe majeur d'histo- compatibilité.

L'expression de molécules de classe I et de classe II, dans les cellules RBE-4, a été étudiée.

Par analyse en cytométrie de flux dans des conditions standard, les cellules RBE-4 expriment de manière constitutive, des molécules de classe I uniquement. Une analyse après un traitement avec de l'IFN-γ, révèle que l'expression des molécules de classe I est augmentée ; elle révèle également une induction importante de l'expression des molécules de classe II (figure 14 : intensité de fluorescence en abscisse, nombre de cellules, en ordonnée) : l'expression maximale des molé- cules de classe I est observée après 16 heures et reste stable pendant plusieurs heures, tandis que 24 heures de traitement sont nécessaires pour obtenir une expression optimale des molécules de classe II.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS

1º) Lignées de cellules endothéliales cérébrales de mammifère, caractérisées :

- l'expression de marqueurs endothéliaux,

- la sécrétion de substances vasoactives, - l'expression de molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH),

- l'expression de récepteurs hormonaux, et

- l'existence de jonctions serrées et

2º) Lignée cellulaire selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par transfection de cellules endothéliales de capillaires cérébraux bovins par le plasmide pSV3 néo contenant le gène néo de la résistance à la néomycine et un fragment de l'oncogene T de SV40.

3º) Lignée cellulaire selon la revendication

2, caractérisée en ce qu'elle a été déposée sous le n' I- 1143 en date du 19 septembre 1991 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.

4º) Lignée cellulaire selon la revendication

1, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par transfection de cellules endothéliales de capillaires cérébraux de rat par un plasmide contenant la région précoce ElA du génome de l'adénovirus 2 et le gène de résistance à la néomycine.

5º) Lignée cellulaire selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle a été déposée sous le nº I- 1142 en date du 19 septembre 1991 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganisit.es tenue par l'Institut Pasteur.

6º) Procédé d'obtention d'une lignée cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, par une méthode de transfection, lequel procédé est caractérisé en ce que :

7º) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit fragment nucléique comprend un gène codant pour la résistance à la néomycine et un fragment d'un oncogene viral ou cellulaire.

8º) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le fragment d 'oncogene virai est choisi dans le groupe qui comprend des fragments dOncogene T de SV40 et des fragments contenant la région précoce ElA du génome de l'adénovirus 2.

9º) Modèle d'étude et d'identification des systèmes biochimiques et cellulaires de la barrière hémato-encéphalique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une lignée cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.