WO1992010563A1 - Lignees de cellules immortalisees et leurs applications, notamment a la production de cellules differenciees - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to immortalized cell lines retaining the same properties as the differentiated cells or primary precursors of the original donor, to their applications as a system for producing large numbers of differentiated cells and as a model for study of the pathophysiology of the differentiated cells obtained.
- the present invention also relates to the application of said differentiated cells and / or precursors as a preventive and / or therapeutic agent, in particular in the treatment of genetic diseases, and more particularly in myopathies.
- the immortalized cell lines of the prior art do not make it possible to obtain differentiated cells having the same properties as cells which normally differentiate in the living organism, in particular to form an organ; moreover, the immortalized cell lines described in the prior art are specific for an organ or a cell type.
- PCT International Application WO 89/09816, in the name of MASSACHUSSETS INSTITUTE OF TECHNOLOGY describes, for example, an immortalized cell line produced by incorporation into appropriate precursor cells, of a multiplication stimulator gene, which is capable of enabling said cells to multiply, which gene is controlled by an external factor. More specifically, this PCT application describes an immortalized cell line produced by incorporation in cells of the embryonic nervous system of a retroviral vector comprising a multiplication gene, which corresponds to the temperature-sensitive domain of the SV40 virus tsA58 strain and a gene resistant to a drug, in particular to an antibiotic.
- the model proposed in this PCT international application is specific for nerve cells; in addition, it comprises a retroviral vector, comprising a viral promoter, which has a certain number of drawbacks, in particular the risks linked to the presence of a fragment of viral origin.
- the inventors have therefore set themselves the goal of providing immortalized cell lines, making it possible to obtain differentiated cells having the characteristics of the differentiated cells normally obtained from primary cells, whatever the cell of origin.
- the subject of the present invention is immortalized cell lines, characterized in that they are obtained by appropriate transformation of suitable primary cells, -issued from an appropriate animal organ, in particular a mammal or a bird, - by a fragment of nucleic acid comprising a suitable immortalizing viral oncogene, at least a fragment of the regulatory regions of the human vimentin gene and optionally a gene devoid of its promoter, but the activity of which is easily detectable either by a simple enzymatic test, or by the that it confers resistance to an antibiotic, which gene allows the selection of transformants.
- the immortalizing viral oncogene is chosen from the group which comprises the T / t SV40 oncogene, the ts T / ⁇ t SV40 oncogene, the T / ⁇ t SV40 oncogene and the region of the immortalizing gene of adenovirus, Eptsein-Barr virus or herpes virus.
- the fragment of the regulatory regions of the human vimentin gene is preferably the vimentin promoter and more particularly the nucleic acid fragment of the promoter vimentin, between the bases -830 and +93 of the vimentin regulatory sequence.
- the nucleic acid fragment of the vimentin promoter comprises the bases -830 to -529 and / or the fragment -540 to -140, located upstream of the cap site.
- the term large T gene is understood to mean the gene which expresses both the T protein and the t protein (symbolized T / t), while the T / ⁇ t gene only expresses the large T protein ( ⁇ t corresponds to the deletion of the petit t gene).
- the inventors have developed a sequence which contains the thermosensitive grand T (ts) ts T / ⁇ t gene and the vimentin promoter, which sequence has the advantage of conditionally expressing only the grand T protein and of being activated. by the vimentin promoter; moreover, this large T gene is modified so as to be thermosensitive.
- This sequence can in particular be inserted into a plasmid, called by the inventors pHuVim830- ts T / ⁇ t.
- the cell lines according to the invention due to the association of DNA fragment coding for the T antigen of the SV40 virus and promoter of vimentin, which constitutes the activator of the associated immortalizing gene, have a certain number advantages, in particular linked to the presence of the vimentin promoter.
- Vimentin is a polypeptide found in cells derived from the mesenchyme. It is a cell structure protein; the vimentin gene plays a role in particular in growth cell, differentiation and cell development.
- the combination of an SV40 T antigen expression gene and a vimentin promoter has the particular advantage of allowing specific control of cell differentiation:
- the activation of the T antigen gene is carried out by the vimentin promoter, in the presence of an appropriate mitogenic agent, optionally associated with proteins which bind to a site of the vimentin promoter; it appears that in the absence of a mitogenic agent, the vimentin promoter is repressed,
- the T antigen itself when produced, activates the vimentin promoter, by action on certain sites of the vimentin promoter on which activator proteins can bind (AP1, c-fos, NK-KB ) and the T antigen itself.
- Such a combination also has the advantage of not being specific with respect to a cell or an organ, but on the contrary of allowing the immortalization of any cell, while retaining the potential for differentiation of the immortalized cell.
- the combination gene for expression of the heat-sensitive T antigen and promoter of vimentin has the additional advantage of allowing double control, both at the level of the T antigen itself (activation temperature, 34oC for example) than the vimentin promoter (repression when the T antigen is no longer functional), this combination having the additional advantage of not containing the st gene, thus avoiding disturbances at the level of the cell membrane .
- the primary cells are advantageously chosen from the group which comprises the mammalian precursor muscle cells and more especially myoblasts, mammalian epithelial cells and mammalian endothelial cells.
- the precursor muscle cells are preferably chosen from the group which comprises normal mouse myoblasts, mouse mutant myoblasts and human mutant myoblasts.
- the mouse mutant myoblasts are advantageously chosen from the group which comprises myoblasts of muscular dysgenesis, in particular called myoblasts mdg and mdx and the human mutant myoblasts are in particular chosen from the group which comprises DMD cells and STEINERT cells.
- the immortalized cell line according to the invention is advantageously obtained by transfection of the appropriate primary cells with a plasmid chosen from the group which comprises the plasmid pHuVim830- ts T / ⁇ t, the plasmid pHuVim830-T / ⁇ t and the plasmid pHuVim830-T / t.
- HVM the line, called HVM, is obtained by transfection of normal mouse myoblasts with a plasmid pHuVim830- ts T / ⁇ t and was deposited under the number I-1019 on December 7, 1990 with the National Collection of Cultures of Microorganisms run by the INSTITUT PASTEUR.
- HVMd the line called HVMd is obtained by transfection of mouse mdg mutant myoblasts with a plasmid pHuVim830- ts T / ⁇ t and was deposited under the no I-1020 on December 7, 1990 with the National Collection of Cultures of Microorganisms by the INSTITUT PASTEUR.
- the cell line is obtained by microinjection of a suitable linear nucleic acid sequence, obtained from a plasmid chosen from the group which comprises the plasmid pHuVim830- ts T / ⁇ t , the plasmid ⁇ HuVim830-T / ⁇ t and plasmid pHuVim830-T / t, in suitable primary cells.
- a suitable linear nucleic acid sequence obtained from a plasmid chosen from the group which comprises the plasmid pHuVim830- ts T / ⁇ t , the plasmid ⁇ HuVim830-T / ⁇ t and plasmid pHuVim830-T / t, in suitable primary cells.
- the line called HVE is obtained by microinjection of a linearized pHuVim830-T / t plasmid in human endothelial cells of the umbilical cord and was deposited under the number I-1016 on December 3, 1990 with the National Collection of Cultures of Microorganisms held by the INSTITUT PASTEUR.
- porcine endothelial cells aorta
- rabbit endothelial cells marginal ear vein
- mammary epithelial cells of rabbit bovine oviduct epithelial cells
- bovine oviduct epithelial cells mouse kidney mesangial cells
- mouse brain endothelial cells normal and dystrophic human muscle cells.
- the present invention also relates to a process for obtaining differentiated muscle cells (myotubes), characterized in that it comprises the following steps:
- step (b) modification of the temperature of the cells in culture at a temperature between 38oC and 40oC, possibly associated with a modification of the culture medium, in particular by reducing the serum concentration of said medium and / or using a serum from an animal different from that of step (a);
- step (c) obtaining cells differentiated in large numbers by culture of said cells under the conditions suitable for the differentiation of step (b).
- the vimentin promoter is repressed and the T protein is not functional.
- the process for obtaining differentiated muscle cells comprises the following steps:
- step (c) obtaining cells differentiated in large numbers by culture of said cells under the conditions suitable for the differentiation of step (b).
- the present invention also relates to a process for obtaining differentiated epithelial or endothelial cells, characterized in that it comprises the following steps:
- the activating agent is chosen in particular from the group which comprises the T antigen itself and appropriate mitogenic agents.
- the mitogenic agent is chosen in particular from the group which comprises sera, growth factors such as PDGF, EGF or FGF, interleukin II, interferons and phytohemaglutinin (PHA).
- the activating agent When the activating agent consists of the T antigen itself, it acts on certain sites of the vimentin promoter and thus activates the promoter; then, the activated promoter then activates the T antigen.
- the activating agent consists of serum
- the latter acts more particularly on the proteins AP1, c-fos and NF-KB, which bind to the nucleic acid of the vimentin promoter at the level in particular of the bases -707 , -693, -197, -195 and -227, allowing the gene coding for the T antigen, to express said antigen.
- the present invention also relates to the differentiated cells obtained by any of the methods for obtaining differentiated cells described above.
- the differentiated cells or precursors in accordance with the invention find application in particular as a preventive agent, vaccine for example, in particular by adding a nucleic acid fragment of an appropriate virus and / or as a therapeutic agent, in particular by adding a nucleic acid fragment known as a "corrector", more specifically in the treatment of genetic diseases, for example myopathies.
- the vimentin promoter is repressed; moreover, they no longer express the T antigen.
- the present invention also relates to an agent for preventive and / or therapeutic purposes, characterized in that it comprises at least one differentiated cell in accordance with the invention, optionally modified by adding an appropriate nucleic acid fragment and optionally associated with at least one suitable pharmaceutical vehicle.
- the present invention also relates to an agent for preventive and / or therapeutic purposes, characterized in that it comprises at least one cell line in accordance with the invention, optionally modified by adding an appropriate nucleic acid fragment and optionally associated with at least one suitable pharmaceutical vehicle.
- the present invention further relates to a model for studying and identifying biochemical systems whose nuclear, cytoplasmic or membrane expression is involved in the proliferation and cell differentiation of muscle, epithelial, endothelial or nerve cells, characterized in that it consists of a cell line according to the invention.
- the present invention further relates to a nucleic acid sequence, characterized in that it successively comprises:
- sequence coding for the large T antigen of SV40 not comprising the fragment coding for the small t antigen, which sequence is thermosensitive, or a fragment thereof;
- a sequence comprising at least one fragment of the regulatory regions of the human vimentin gene and in particular at least one fragment of the promoter of human vimentin, with a length of 830 base pairs from the cap site or a fragment thereof; ci, in particular the fragment -830 to -529 and / or the fragment -540 to -140, upstream of said cap site; and eventually
- Such a sequence can in particular be inserted into an appropriate vector, in particular a plasmid, which vector is capable of immortalizing an appropriate cell line; such a plasmid has been designated, as specified above, pHuVim830- ts T / ⁇ t by the inventors.
- the present invention further relates to a method for producing a non-human transgenic mammal, characterized in that it comprises the introduction of a plasmid chosen from the group which comprises the plasmid pHuVim830-T / t, the plasmid pHuVim830-T / ⁇ t and the plasmid pHuVim830- ts T / ⁇ t in a non-human mammal at an early embryonic stage.
- the present invention also relates to a transgenic non-human mammal, characterized in that it is obtained by the method described above, and in that the cells comprising the plasmid chosen from the group which comprises the plasmid pHuVim830-T / t, the plasmid pHuVim830-T / t and the plasmid pHuVim830- ts T / ⁇ t, can differentiate normally in vivo, while being able to produce immortalized cells in vitro.
- the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows, which is refers to examples of implementation of the method which is the subject of the present invention.
- Example 1 Preparation of the plasmids.
- This plasmid is described in European Patent Application 90402009.6; it expresses the large T antigen and the small t antigen.
- the vimentin promoter fragment -830 - +93 is cloned into a plasmid pUC 18; the clones are obtained by digestion of the 5 ′ sequence of the vimentin gene at the site of the restriction enzyme Pvu II.
- the plasmid pUC 18 containing the DNA fragment of the vimentin promoter is linearized by the restriction enzyme Xba I; a cohesive 3 ′ end is obtained, which is adjusted so as to obtain a blunt end, then the DNA fragment of the vimentin promoter thus obtained is linked with the DNA fragment of the T antigen, by ligation of the 'end 3' Xba I of the promoter with the Sfi I end of the SV40 fragment.
- the BamH I 5 ′ and 3 ′ ends are linked in the presence of T4 ligase.
- the sequences coding for the T antigen are thus under the control of the regulatory region of vimentin of 830 base pairs.
- This plasmid contains the sequence coding for the large T antigen in which nucleotides 4630 to 4900 have been removed. This plasmid no longer expresses the t protein and the expression of the T protein is thermosensitive. This thermosensitivity is obtained using a mutation at nucleotide 3505.
- the plasmid which only expresses the T protein, is activated by the human vimentin gene.
- the sequence coding for the T antigen begins at position 5234 and ends at position 2533; this fragment is generated by digestion of the SV40 DNA with the following restriction enzymes: Sfi I, (position 5234) and BamH I (position 2533).
- FIG. 1 describes more precisely this plasmid, which successively comprises a fragment of 830 base pairs of the human vimentin promoter, the sequence coding for the T antigen and the plasmid pUC18.
- Example 2 Production of precursor muscle cell lines in accordance with the invention and differentiated muscle cells obtained from these lines.
- the immortalized myoblasts were obtained by transfection with the plasmid pHuVim- ts T / .DELTA.t described above, to 34oC in a DMEM medium containing fetal calf serum to 20%. Under these conditions, all the cells express the T antigen (FIGS. 2A and 2B), indicating that they have all integrated the plasmid; indeed, at 34oC the functional large T protein induces the multiplication and immortalization of the cell.
- FIGS. 2A and 2B represent the indirect immunofluorescence obtained, when an immortaused cell line, produced from normal myoblasts - (FIG. 2A) or from mdg myoblasts (FIG. 2B), is brought into contact with anti-protein monoclonal antibodies.
- the synthesis of the large T protein is characterized after electrophoresis of myoblastic extracts after coupling with specific antibodies directed against said T protein.
- the amount of T protein is similar in normal myoblasts and in mdg myoblasts.
- FIGS. 3A and 3B represent the integration of the plasmid pHuVim830- t s T / ⁇ t in muscle cells.
- the DNA of the immortalized cells is treated with the restriction enzyme Hinc II, then is subjected to gel electrophoresis, followed by transfer to a nitrocellulose strip; then an incubation is carried out with a DNA probe labeled with 32 P ( 32 P dCTP), corresponding to the fragment coding for the T antigen (the last 632 nucleotides of the SV40 T gene (Amersham Multiprime kit); if the fragment is effectively integrated, a band of approximately 1 kb is observed (FIG. 3A: normal muscle, wild strain; FIG. 3B: mdg muscle, muscular dysgenesis g).
- the doubling time of these immortalized cells is approximately 24 hours.
- the cell lines obtained above are placed under appropriate differentiation conditions, namely at 39 ° C., in a DMEM medium containing 10% horse serum.
- thermosensitivity of the expression of the T antigen leads to an increase in terminal differentiation, when the T antigen is repressed.
- these differentiation conditions 39oC, DMEM medium containing 10% horse serum
- myoblasts express the T protein while the fused myoblasts (multinucleated myotubes) do not express the T protein, indicating repression of the vimentin promoter at the myotube stage.
- mice with muscular dysgenesis are capable of forming myotubes.
- Two clones were more particularly studied, HMV for normal myoblasts and HMVd for muscular dysgenesis. 2. Characteristics of the differentiated cells obtained:
- the appearance of normal sarcomeres, triads and excitation-contraction coupling are markers of the terminal differentiation of muscle cells in culture.
- the differentiated cells obtained from the immortalized line of normal mice contract spontaneously in culture and their sarcomeric organization can be visualized, while in the immortalized mdg myotubes obtained in accordance with the invention, the sarcomeric organization is poorly developed. Unlike normal immortalized myotubes in accordance with the invention, the type L calcium current is not found in differentiated mdg cells.
- Example 3 Production of endothelial cell lines in accordance with the invention and differentiated cells obtained from these lines.
- the efficiency of cloning is tested on plates containing 50 culture wells 10 mm in diameter, which wells are inoculated with 1-10 cells.
- the growth curves are established from three plates, using COS cells as a reference. Growth in a semi-solid medium is carried out as described by GIMBRONE et al. (Cell, 1976, 9, 685 * 693), with DMEM supplemented with 10% fetal calf serum.
- the intranuclear T antigen is identified using a mouse monoclonal antibody and a rabbit anti-mouse antibody conjugated with one of fluorescein, after fixation with ethanol-acetone (7/3), for 6 minutes. at 20oC; the intermediate filaments are detected by indirect immunofluorescence in the presence of an anti-vimentin mouse monoclonal antibody (Amersham); the demonstration of factor VIII is carried out as described in Little et al. (J. Pathol., 1986, 149, 89-95), using a rabbit anti-factor VIII antibody (Zymed Laboratories)
- FIG. 4 represents the indirect immunofluorescence obtained, when an immortalized cell line, produced from immortalized endothelial cells, is brought into contact with anti-T protein monoclonal antibodies. Analysis of the genomic DNA reveals that the recombinant gene is integrated (FIG. 5). This figure represents the integration of the plasmid pHuVim830T / t into the cells: the DNA of the immortalized cells is treated with the restriction enzyme Hinc II, then is subjected to gel electrophoresis, followed by transfer to a nitrocellulose strip.
- the immortalized cells as prepared above are transferred, onto a medium devoid of serum or containing less than 1% of serum, said cells retain the characteristic properties of endothelial cells, in particular the production of factor VIII.
- Example 4 Production of epithelial cell lines in accordance with the invention and differentiated cells, obtained from these lines.
- rabbit mammary gland epithelial cells are obtained after digestion of these tissues with collagenase;
- bovine oviduct epithelial cells are harvested after washing the oviducts with DMEM medium.
- the cells are microinjected as described in Example 3, above.
- the immortalized cells as prepared above are transferred to a medium lacking in serum or containing less than 1% of serum, said cells retain the characteristic properties of epithelial cells, in particular the detection of intermediate filaments, by immunofluorescence indirect in the presence of a mouse anti-keratin monoclonal antibody.
- Such immortalized cells find application in particular to serve as feeder cells for bovine embryos during the sexing of the embryos.
- mice are microinjected at the cell stage with a linearized fragment of the plasmid pHuVim830- ts T / ⁇ t and then said eggs are transferred to the oviducts of 35 mice.
- DNA analysis of the tail cells by the Southern method shows that 3 young mice are transgenic.
- the transgenic mice obtained express the T gene of SV40 and find particular application in the study in tumorigenicity in vivo and as a source of immortalized cells, insofar as the promoter HuVim830 is inducible in in vitro culture.
Landscapes
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Abstract
Lignées de cellules immortalisées conservant les mêmes propriétés que les cellules différenciées ou précurseurs primaires du donneur d'origine, leurs applications en tant que système de production de cellules différenciées en grand nombre et modèle d'étude de la physiopathologie des cellules différenciées obtenues. Application desdites cellules différenciées et/ou précurseurs comme agent à visée préventive et/ou thérapeutique, notamment dans le traitement des maladies génétiques, et plus particulièrement dans les myopathies. Lesdites lignées cellulaires immortalisées sont obtenues par transformation appropriée de cellules primaires convenables, -issues d'un organe d'animal approprié, notamment un mammifère ou un oiseau, -par un fragment d'acide nucléique comprenant un oncogène viral immortalisant approprié, au moins un fragment des régions régulatrices du gène humain de la vimentine et éventuellement un gène dépourvu de son promoteur, mais dont l'activité est aisément détectable soit par un test enzymatique simple, soit par le fait qu'il confère une résistance à un antibiotique.
Description
LIGNEES DE CELLULES IMMORTALISEES ET LEURS APPLICATIONS. NOTAMMENT A LA PRODUCTION DE CELLULES DIFFERENCIEES.
La présente invention est relative à des lignées de cellules immortalisées conservant les mêmes propriétés que les cellules différenciées ou précurseurs primaires du donneur d'origine, à leurs applications en tant que système de production de cellules différenciées en grand nombre et en tant que modèle d'étude de la physiopathologie des cellules différenciées obtenues.
La présente invention est également relative à l'application desdites cellules différenciées et/ou précurseurs comme agent à visée préventive et/ou thérapeutique, notamment dans le traitement des maladies génétiques, et plus particulièrement dans les myopathies.
Les lignées cellulaires immortalisées de l'Art antérieur ne permettent pas d'obtenir des cellules différenciées ayant les mêmes propriétés que les cellules qui se différencient normalement dans l'organisme vivant, pour former notamment un organe ; de plus, les lignées cellulaires immortalisées décrites dans l'Art antérieur sont spécifiques d'un organe ou d'un type cellulaire.
La Demande Internationale PCT WO 89/09816, au nom de MASSACHUSSETS INSTITUTE OF TECHNOLOGY décrit, par exemple, une lignée cellulaire immortalisée produite par incorporation dans des cellules précurseurs appropriées, d'un gène stimulateur de multiplication, qui est capable de permettre auxdites cellules de se multiplier, lequel gène est contrôlé par un facteur externe. Plus spécifiquement, cette Demande PCT décrit une lignée cellulaire immortalisée produite par incorporation, dans des cellules du système nerveux embryonnaire, d'un vecteur rétroviral comprenant un gène de multiplication, qui correspond au domaine sensible à la température de la souche tsA58 du virus SV40 et un gène résistant à un médicament, notamment à un antibiotique.
Toutefois, le modèle proposé dans cette Demande internationale PCT est spécifique des cellules nerveuses ; de plus, il comprend un vecteur rétroviral, comprenant un promoteur viral, qui comporte un certain nombre d'inconvénients, notamment les risques liés à la présence d'un fragment d'origine virale.
Les Inventeurs se sont, en conséquence, donné pour but de pourvoir à des lignées de cellules immortalisées, permettant l'obtention de cellules différenciées présentant les caractéristiques des cellules différenciées obtenues normalement à partir de cellules primaires, quelle que soit la cellule d'origine.
La présente invention a pour objet des lignées cellulaires immortalisées, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par transformation appropriée de cellules primaires convenables, -issues d'un organe d'animal approprié, notamment un mammifère ou un oiseau, - par un fragment d'acide nucléique comprenant un oncogène viral immortalisant approprié, au moins un fragment des régions régulatrices du gène humain de la vimentine et éventuellement un gène dépourvu de son promoteur, mais dont l'activité est aisément détectable soit par un test enzymatique simple, soit par le fait qu'il confère une résistance à un antibiotique, lequel gène permet la sélection des transformants.
Selon un mode de réalisation avantageux desdites lignées cellulaires, l'oncogène viral immortalisant est choisi dans le groupe qui comprend l'oncogène T/t de SV40, l'oncogène tsT/Δt de SV40, l' oncogène T/Δt de SV40 et la région du gène immortalisant de l'adénovirus, du virus Eptsein-Barr ou du virus herpétique.
Conformément à l'invention, le fragment des régions régulatrices du gène humain de la vimentine est, de préférence, le promoteur de la vimentine et plus particulièrement le fragment d'acide nucléique du promoteur
de la vimentine, compris entre les bases -830 et +93 de la séquence régulatrice de la vimentine.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le fragment d'acide nucléique du promoteur de la vimentine comprend les bases -830 à -529 et/ou le fragment -540 à -140, situés en amont du site cap.
Un tel fragment d'acide nucléique hybride
(oncogène grand T de SV 40 associé au promoteur de la vimentine) a notamment été décrit dans la Demande de Brevet européen nº 90402009.6 et est notamment incorporé dans un plasmide dénommé pHuVim830-T/t.
Dans la présente invention, on entend par gène grand T, le gène qui exprime à la fois la protéine T et la protéine t (symbolisé T/t), alors que le gène T/Δt n'exprime que la protéine grand T (Δt correspond à la délétion du gène petit t).
Les Inventeurs ont mis au point une séquence qui contient le gène grand T thermosensible (ts) tsT/Δt et le promoteur de la vimentine, laquelle séquence a l'avantage de n'exprimer conditionnellement que la protéine grand T et d'être activée par le promoteur de la vimentine ; de plus, ce gène grand T est modifié de manière à être thermosensible. Cette séquence peut notamment être insérée dans un plasmide, dénommé par les Inventeurs pHuVim830-tsT/Δt.
Les lignées cellulaires conformes à l'invention, en raison de l'association fragment d'ADN codant pour l'antigène T du virus SV40 et promoteur de la vimentine, -qui constitue l'activateur du gène immortalisant associé-, présentent un certain nombre d'avantages, notamment liés à la présence du promoteur de la vimentine.
La vimentine est un polypeptide que l'on retrouve dans les cellules dérivées du mésenchyme. Il s'agit d'une protéine de structure des cellules ; le gène de la vimentine joue notamment un rôle dans la croissance
cellulaire, la différenciation et le développement cellulaire.
La combinaison gène d'expression de l'antigène T du SV40 et promoteur de la vimentine a notamment l'avantage de permettre un contrôle spécifique de la différenciation cellulaire :
- l'activation du gène de l'antigène T est réalisée par le promoteur de la vimentine, en présence d'un agent mitogène approprié, éventuellement associé à des protéines qui se fixent sur un site du promoteur de la vimentine ; il en ressort qu'en l'absence d'agent mitogène, le promoteur de la vimentine est réprimé,
- l'antigène T lui-même, lorsqu'il est produit, active le promoteur de la vimentine, par action sur certains sites du promoteur de la vimentine sur lesquels peuvent se fixer des protéines activatrices (AP1, c-fos, NK-KB) et l'antigène T lui-même.
Une telle combinaison a également l'avantage de ne pas être spécifique vis-à-vis d'une cellule ou d'un organe, mais au contraire de permettre l'immortalisâtion de n'importe quelle cellule, tout en gardant les potentialités de différenciation de la cellule immortalisée.
La combinaison gène d'expression de l'antigène T sensible à la chaleur et promoteur de la vimentine, a de plus l'avantage de permettre un double contrôle, tant au niveau de l'antigène T lui-même (température d'activation, 34ºC par exemple) que du promoteur de la vimentine (répression lorsque l'antigène T n'est plus fonctionnel), cette combinaison ayant de plus l'avantage de ne pas contenir le gène st, évitant ainsi des perturbations au niveau de la membrane cellulaire.
Selon un autre mode de réalisation avantageux desdites lignées, les cellules primaires sont avantageusement choisies dans le groupe qui comprend les celIules musculaires précurseurs de mammifère et plus parti
culièrement les myoblastes, les cellules épithéliales de mammifère et les cellules endothéliales de mammifère.
Conformément à l'invention, les cellules musculaires précurseurs sont, de préférence, choisies dans le groupe qui comprend les myoblastes normaux de souris, les myoblastes mutants de souris et les myoblastes mutants humains.
Les myoblastes mutants de souris sont avantageusement choisis dans le groupe qui comprend des myoblastes de dysgénésie musculaire, notamment dénommés myoblastes mdg et mdx et les myoblastes mutants humains sont notamment choisis dans le groupe qui comprend les cellules DMD et les cellules STEINERT.
La lignée de cellules immortalisées conforme à l'invention est avantageusement obtenue par transfection des cellules primaires appropriées par un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-tsT/Δt, le plasmide pHuVim830-T/Δt et le plasmide pHuVim830-T/t.
Conformément à l'invention :
- la lignée, dénommée HVM, est obtenue par transfection de myoblastes normaux de souris par un plasmide pHuVim830-tsT/Δt et a été déposée sous le nº I-1019 en date du 7 décembre 1990 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'INSTITUT PASTEUR.
- la lignée dénommée HVMd est obtenue par transfection de myoblastes mutants mdg de souris par un plasmide pHuVim830-tsT/Δt et a été déposée sous le nº I-1020 en date du 7 décembre 1990 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'INSTITUT PASTEUR.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode dé réalisation, la lignée cellulaire est obtenue par microinjection d'une séquence linéaire d'acide nucléique appropriée, obtenue à partir d'un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-tsT/Δt, le
plasmide ρHuVim830-T/Δt et le plasmide pHuVim830-T/t, dans des cellules primaires convenables.
Conformément à l'invention, la lignée dénommée HVE est obtenue par microinjection d'un plasmide pHuVim830-T/t linéarisé dans des cellules endothéliales humaines du cordon ombilical et a été déposée sous le nº I-1016 en date du 3 décembre 1990 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'INSTITUT PASTEUR.
On obtient ainsi des lignées cellulaires présentant un taux de multiplication élevé.
On peut en outre citer, à titre d'exemples non limitatifs, comme autres lignées conformes à l'invention, des cellules endothéliales porcines (aorte), des cellules endothéliales de lapin (veine marginale de l'oreille), des cellules épithéliales mammaires de lapin, des cellules épithéliales de l'oviducte bovin, des cellules mésangiales du rein de souris, des cellules endothéliales de cerveau de souris, des cellules musculaires humaines normales et dystrophiques.
La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de cellules musculaires (myotubes) différenciées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(a) culture d'une lignée cellulaire musculaire immortalisée, conforme à l'invention, comprenant un plasmide contenant un oncogène viral immortalisant thermosensible, notamment le plasmide pHuVim830-tsT/Δt, sur un milieu approprié, contenant une quantité appropriée de sérum d'un animal convenable, à une température comprise entre 34ºC et 36ºC, permettant l'expression conditionnelle d'une protéine virale, et notamment de l'antigène tsT et une multiplication cellulaire importante ;
(b) modification de la température des cellules en culture à une température comprise entre 38ºC et 40ºC, associée, éventuellement, à une modification du
milieu de culture, notamment par diminution de la concentration en sérum dudit milieu et/ou utilisation d'un sérum d'un animal différent de celui de l'étape (a) ; et
(c) obtention de cellules différenciées en grand nombre par culture desdites cellules dans les conditions appropriées à la différenciation de l'étape (b).
Dans les cellules différenciées ainsi obtenues (stade myotubes), le promoteur de la vimentine est réprimé et la protéine T n'est pas fonctionnelle.
En variante, le procédé d'obtention de cellules musculaires (myotubes) différenciées comprend les étapes suivantes :
(a) culture d'une lignée cellulaire musculaire immortalisée, conforme à l'invention, comprenant un plasmide contenant un oncogène viral immortalisant, notamment un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-T/t et le plasmide pHuVim830-T/Δt, sur un milieu approprié, contenant une quantité convenable de sérum d'un animal convenable, à une température appropriée notamment 37ºC ;
(b) modification du milieu de culture, notamment par diminution de la concentration en sérum dudit milieu ;
(c) obtention de cellules différenciées en grand nombre par culture desdites cellules dans les conditions appropriées à la différenciation de l'étape (b).
La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de cellules épithéliales ou endotheliales différenciées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(a) culture d'une lignée cellulaire épithéliale ou endothéliale, conforme à l'invention en présence d'un agent d'activation approprié, qui conditionne l'expression d'une protéine virale appropriée et
notamment de l'antigène T en présence du promoteur de la vimentine et permet une multiplication cellulaire importante ;
(b) transfert de ladite lignée immortalisée dans un milieu dépourvu en agent d'activation et/ou à une température comprise entre 37ºC et 40ºC ; et
(c) obtention de cellules différenciées en grand nombre.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, l'agent d'activation est notamment choisi dans le groupe qui comprend l'antigène T lui-même et des agents mitogènes appropriés.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'agent mitogène est notamment choisi dans le groupe qui comprend les sérums, les facteurs de croissance tels que le PDGF, l'EGF ou le FGF, l'interleukine II, les interférons et la phytohémaglutinine (PHA).
Lorsque l'agent d'activation consiste en l'antigène T lui-même, il agit sur certains sites du promoteur de la vimentine et active ainsi le promoteur ; puis, le promoteur activé active ensuite l'antigène T.
Lorsque l'agent d'activation consiste en du sérum, ce dernier agit plus particulièrement sur les protéines AP1, c-fos et NF-KB, qui se fixent sur l'acide nucléique du promoteur de la vimentine au niveau notamment des bases -707, -693, -197, -195 et -227, permettant au gène codant pour l'antigène T, d'exprimer ledit antigène.
La présente invention a également pour objet les cellules différenciées obtenues par l'un quelconque des procédés d'obtention de cellules différenciées décrits ci-dessus.
Les cellules différenciées ou précurseurs conformes à l'invention trouvent notamment application comme agent a visée préventive, vaccin par exemple,
notamment par adjonction d'un fragment d'acide nucléique d'un virus approprié et/ou comme agent à visée thérapeutique, notamment par adjonction d'un fragment d'acide nucléique dit "correcteur", plus spécifiquement dans le traitement de maladies génétiques, par exemple les myopathies.
En effet, dans de telles cellules, le promoteur de la vimentine est réprimé ; de plus, elles n'expriment plus l'antigène T.
La présente invention a également pour objet un agent à visée préventive et/ou thérapeutique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cellule différenciée conforme à l'invention, éventuellement modifiée par adjonction d'un fragment d'acide nucléique approprié et éventuellement associée à au moins un véhicule pharmaceutique approprié.
La présente invention a également pour objet un agent à visée préventive et/ou thérapeutique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une lignée cellulaire conforme à l'invention, éventuellement modifiée par adjonction d'un fragment d'acide nucléique approprié et éventuellement associée à au moins un véhicule pharmaceutique approprié.
La présente invention a, de plus, pour objet un modèle d'étude et d'identification des systèmes biochimiques dont l'expression nucléaire, cytoplasmique ou membranaire est impliquée dans la prolifération et la différenciation cellulaire des cellules musculaires, épithéliales, endothéliales ou nerveuses, caractérisé en ce qu'il est constitué par une lignée cellulaire conforme à l'invention.
La présente invention a, en outre, pour objet une séquence d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle comprend successivement :
- une séquence codant pour l'antigène grand T de SV40, ne comportant pas le fragment codant pour
l'antigène petit t, laquelle séquence est thermosensible, ou un fragment de celle-ci ;
- une séquence comprenant au moins un fragment des régions régulatrices du gène humain de la vimentine et notamment au moins un fragment du promoteur de la vimentine humaine, d'une longueur de 830 paires de bases à partir du site cap ou un fragment de celle-ci, notamment le fragment -830 à -529 et/ou le fragment -540 à -140, en amont dudit site cap ; et, éventuellement
- un gène, dépourvu de son promoteur, mais dont l'activité est aisément détectable soit par un test enzymatique simple, soit par le fait qu'il confère une résistance a un antibiotique.
Une telle séquence peut notamment être insérée dans un vecteur approprié, notamment un plasmide, lequel vecteur est apte à immortaliser une lignée cellulaire appropriée ; un tel plasmide a été dénommé, comme précisé plus haut, pHuVim830-tsT/Δt par les Inventeurs.
La présente invention a, de plus, pour objet une méthode de production d'un mammifère transgénique non humain, caractérisée en ce qu'elle comprend l'introduction d'un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-T/t, le plasmide pHuVim830-T/Δt et le plasmide pHuVim830-tsT/Δt dans un mammifère non humain à un stade embryonnaire précoce.
La présente invention a également pour objet un mammifère transgénique non humain, caractérisé en ce qu'il est obtenu par la méthode ci-dessus décrite, et en ce que les cellules comprenant le plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-T/t, le plasmide pHuVim830-T/t et le plasmide pHuVim830-tsT/Δt, peuvent se différencier normalement in vivo, tout en pouvant produire des cellules immortalisées in vitro .
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se
réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemple 1 : Préparation des plasmides.
1) Plasmide pHuVim830-T/t
Ce plasmide est décrit dans la Demande de Brevet européen 90402009.6 ; il exprime l'antigène grand T et l'antigène petit t. Le fragment -830 - +93 du promoteur de la vimentine est clone dans un plasmide pUC 18 ; les clones sont obtenus par digestion de la séquence 5' du gène de la vimentine au niveau du site de l'enzyme de restriction Pvu II. Le plasmide pUC 18 contenant le fragment d'ADN du promoteur de la vimentine est linéarisé par l'enzyme de restriction Xba I ; on obtient une extrémité 3' cohésive, qui est ajustée de manière à obtenir une extrémité franche, puis on lie le fragment d'ADN du promoteur de la vimentine ainsi obtenu avec le fragment d'ADN de l'antigène T, par ligation de l'extrémité 3' Xba I du promoteur avec l'extrémité Sfi I du fragment SV40. Les extrémités BamH I 5' et 3' sont liées en présence de T4 ligase. Les séquences codant pour l'antigène T sont ainsi sous le contrôle de la région régulatrice de la vimentine de 830 paires de bases.
2) Plasmide pHuVim830-tsT/Δt :
Ce plasmide contient la séquence codant pour l'antigène grand T dans laquelle les nucléotides 4630 à 4900 ont été retirés. Ce plasmide n'exprime plus la protéine t et l'expression de la protéine T est thermosensible. Cette thermosensibilité est obtenue à l'aide d'une mutation au niveau du nucléotide 3505.
Le plasmide qui n'exprime que la protéine T, est activé par le gène de la vimentine humaine.
La séquence codant pour l'antigène T commence en position 5234 et s'arrête en position 2533 ; ce fragment est généré par digestion de l'ADN de SV40 par les enzymes de restriction suivantes : Sfi I, (position 5234) et BamH I (position 2533). La figure 1 décrit plus précisément ce plasmide, qui comprend successivement un fragment de 830 paires de bases du promoteur humain de la vimentine, la séquence codant pour l'antigène T et le plasmide pUC18.
Exemple 2 : Production de lignées cellulaires musculaires précurseurs conformes à l'invention et cellules musculaires différenciées, obtenues à partir de ces lignées.
a- Lignées cellulaires musculaires précurseurs :
Les myoblastes immortalisés sont obtenus par transfection avec le plasmide pHuVim-tsT/Δt décrit cidessus, à 34ºC dans un milieu DMEM contenant du sérum de veau foetal à 20 %. Dans ces conditions, toutes les cellules expriment l'antigène T (figures 2A et 2B), indiquant qu'elles ont toutes intégrées le plasmide ; en effet, à 34ºC la protéine grand T fonctionnelle induit la multiplication et l'immortalisation de la cellule. Ces figures 2A et 2B représentent l'immunofluorescence indirecte obtenue, lorsqu'une lignée cellulaire immortausée, réalisée à partir de myoblastes normaux - (figure 2A) ou de myoblastes mdg (figure 2B), est mise en contact avec des anticorps monoclonaux anti-protéine T ; à 34ºC, tous les noyaux cellulaires expriment l'antigène T.
La synthèse de la protéine grand T est caractérisée après électrophorese d'extraits myoblastiques après couplage avec des anticorps spécifiques dirigés contre ladite protéine T. La quantité de protéine T est similaire dans les myoblastes normaux et dans les myoblastes mdg.
L'analyse de l'ADN génomique révèle que le gène recombinant est intégré (figures 3A et 3B). Ces
figures représentent l'intégration du plasmide pHuVim830- tsT/Δt dans les cellules musculaires. L'ADN des cellules immortalisées est traité par l'enzyme de restriction Hinc II, puis est soumis à une électrophorèse sur gel, suivie d'un transfert sur bande de nitrocellulose ; on procède ensuite à une incubation avec une sonde d'ADN marquée au 32P (32P dCTP), correspondant au fragment codant pour l'antigène T (les 632 derniers nucléotides du gène SV40 T (Amersham Multiprime kit) ; si le fragment est effectivement intégré, on observe une bande d'environ 1 kb (figure 3A : muscle normal, souche sauvage ; figure 3B : muscle mdg, dysgénésie musculaire g).
Le temps de doublement de ces cellules immortalisées est d'environ 24 heures.
b- obtention de cellules musculaires différenciées :
Les lignées cellulaires obtenues ci-dessus, sont mises dans des conditions de différenciation appropriées à savoir à 39ºC, dans un milieu DMEM contenant du sérum de cheval à 10 %.
La thermosensibilité de l'expression de l'antigène T conduit à une augmentation de la différenciation terminale, lorsque l'antigène T est réprimé. Dans ces conditions de différenciation (39ºC, milieu DMEM contenant du sérum de cheval à 10 %), les cellules mononucléées (myoblastes) non fusionnées expriment la protéine T alors que les myoblastes fusionnés (myotubes multinucléés) n'expriment pas la protéine T, indiquant la répression du promoteur de la vimentine au stade myotubes.
Les souris normales et les souris présentant une dysgénésie musculaire (souris dites mdg), sont capables de former des myotubes. Deux clones ont plus particulièrement été étudiés HMV pour les myoblastes normaux et HMVd pour la dysgénésie musculaire.
2. Caractéristiques des cellules différenciées obtenues :
L'apparition de sarcomères normaux, de triades et du couplage excitation-contraction sont des marqueurs de la différenciation terminale des cellules musculaires en culture.
Les cellules différenciées obtenues à partir de la lignée immortalisée de souris normales se contractent spontanément en culture et leur organisation sarcomérique peut être visualisée, alors que dans les myotubes mdg immortalisés obtenus conformément à l'invention, l'organisation sarcomérique est peu développée. Contrairement aux myotubes immortalisés normaux conformes à l'invention, le courant calcique de type L n'est pas retrouvé dans les cellules différenciées mdg.
Exemple 3 : Production de lignées cellulaires endothéliales conformes à l'invention et cellules différenciées, obtenues à partir de ces lignées.
a. Immortalisation de cellules endothéliales : Les cellules endotheliales de porc et de lapin sont recueillies, à partir d'échantillons de sang, par ponction veineuse dans des tubes héparinisés suivie d'une centrifugation sur Ficoll (d=1,09). Les cellules endotheliales humaines sont recueillies, après une digestion limitée à la collagenase, des veines du cordon ombilical ou des vaisseaux du cerveau ; ces cellules sont mises en culture dans des récipients de culture recouverts de gélatine, avec un milieu DMEM supplémenté avec du sérum de veau foetal à 10 %, de la glutamine à 2 mM et des antibiotiques, incubées à 37ºC en atmosphère humidifiée contenant 10 % de C02.
Entre 500 et 2000 cellules sont individuellement microinjectées dans leurs noyaux, avec un plasmide pHuVim830-T/t linéarisé (environ 3,5 kb), tel que décrit dans la Demande de Brevet européen nº 90402009.6, à savoir comprenant le gène codant pour l'antigène T
complet de SV40 (grand T et petit t) et la séquence comprise entre les nucléotides -830 et +93 du promoteur de la vimentine, linéarisé par digestion Sph I/BamH I dudit plasmide à une concentration de 2 ng/μl dans un tampon Tris-EDTA. La microinjection de ce plasmide dans le noyau desdites cellules est suivie de l'intégration et de l'expression de l'antigène grand T dans les cellules dérivées. La quantité injectée est d'environ deux fois supérieure a la taille du noyau.
2. Caractéristiques de la multiplication cellulaire :
L'efficacité du clonage est testée sur des plaques contenant 50 puits de culture de 10 mm de diamètre, lesquels puits sont inoculés avec 1-10 cellules. Les courbes de croissance sont établies à partir de trois plaques, en utilisant des cellules COS comme référence. La croissance dans un milieu semi-solide est réalisée comme décrit par GIMBRONE et al. (Cell, 1976, 9, 685*693), avec du DMEM supplémenté en sérum de veau foetal à 10 %.
Trois semaines après la microinjection, des foyers multicouches de cellules apparaissent dans toutes les cultures primaires, envahissant les cellules résiduelles. De tels foyers n'apparaissent jamais dans les cultures contrôle, dans lesquelles la monocouche confluente de cellules subit une dégénération spontanée en 3 à 5 semaines.
Les caractéristiques des lignées cellulaires
L'antigtne T intranucléaire est identifié à l'aide d'un anticorps monoclonal de souris et un anticorps de lapin anti-souris conjugué avec un de la fluorescéine, après fixation à l'éthanol-acétone (7/3), pendant 6 minutes à 20ºC ; les filaments intermédiaires sont détectés par immunofluorescence indirecte en présence d'un anticorps monoclonal de souris anti-vimentine (Amersham) ; la mise en évidence du facteur VIII est réalisée comme décrit dans Little et al. (J. Pathol., 1986, 149, 89-95), en utilisant un anticorps de lapin anti-facteur VIII (Zymed Laboratories)
La figure 4 représente l'immunofluorescence indirecte obtenue, lorsqu'une lignée cellulaire immortalisée, réalisée à partir de cellules endothéliales immortalisées, est mise en contact avec des anticorps monoclonaux anti-protéine T.
L'analyse de l'ADN génomique révèle que le gène recombinant est intégré (figure 5). Cette figure représente l'intégration du plasmide pHuVim830T/t dans les cellules : l'ADN des cellules immortalisées est traité par l'enzyme de restriction Hinc II, puis est soumis à une electrophorese sur gel, suivie d'un transfert sur bande de nitrocellulose ; on procède ensuite à une incubation avec une sonde d'ADN marquée au 32P (32P dCTP), correspondant au fragment codant pour l'antigène T (les 632 derniers nucléotides du gène SV40 T (Amersham Multiprime kit) ; si le fragment est effectivement intégré, on observe une bande d'environ 1 kb.
b. Arrêt de la multiplication desdites lignées immortalisées :
Dès que l'on transfert les cellules immortalisées telles que préparées ci-dessus, sur un milieu dépourvu en sérum ou contenant moins de 1 % de sérum, lesdites cellules gardent les propriétés caractéristiques des cellules endothéliales, notamment la production de facteur VIII.
Exemple 4 : Production de lignées cellulaires épithéliales conformes à l'invention et cellules différenciées, obtenues à partir de ces lignées.
a. Immortalisation de cellules :
. les cellules épithéliales de glande mammaire de lapin sont obtenues après digestion de ces tissus par la collagénase ;
. les cellules épithéliales d'oviductes bovins sont récoltées après lavage des oviductes avec un milieu DMEM.
Les cellules sont microinjectées comme décrit à l'exemple 3, ci-dessus.
Les caractéristiques des lignées cellulaires obtenues sont résumées dans le tableau II ci-après :
b.Arrêt de la multiplication desdites lignées immortalisées :
Dès que l'on transfert les cellules immortalisées telles que préparées ci-dessus, sur un milieu dépourvu en sérum ou contenant moins de 1 % de sérum, lesdites cellules gardent les propriétés caractéristiques des cellules épithéliales, notamment la détection des filaments intermédiaires, par immunofluorescence indirecte en présence d'un anticorps monoclonal de souris anti-kératine.
De telles cellules immortalisées trouvent notamment application pour servir de cellules nourricières aux embryons de bovins lors du sexage des embryons .
Exemple 5 : Souris transgénique.
On microinjecte 70 oeufs au stade une cellule avec un fragment linéarisé du plasmide pHuVim830-tsT/Δt puis on transfert lesdits oeufs dans les oviductes de 35 souris. L'analyse en ADN des cellules de la queue par la
méthode de Southern montre que 3 jeunes souris sont transgéniques. Les souris transgéniques obtenues expriment le gène T de SV40 et trouvent notamment application dans l'étude dans la tumorigénécité in vivo et comme source de cellules immortalisées, dans la mesure où le promoteur HuVim830 est inductible en culture in vi tro .
Le croisement d'une souris transgéniques "VimT" avec un mutant mdg ou un mutant mdx conduit à un animal dont les cellules mises en culture sont à la fois immortelles et portent la mutation précitée.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.
Claims
1. Lignées cellulaires immortalisées, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par transformation appropriée de cellules primaires convenables, -issues d'un organe d'animal approprié, notamment un mammifère ou un oiseau,- par un fragment d'acide nucléique comprenant un oncogène viral immortalisant approprié, au moins un fragment des régions régulatrices du gène humain de la vimentine et éventuellement un gène dépourvu de son promoteur, mais dont l'activité est aisément détectable soit par un test enzymatique simple, soit par le fait qu'il confère une résistance à un antibiotique.
2. Lignées cellulaires selon la revendication 1, caractérisées en ce que l' oncogène viral immortalisant est choisi dans le groupe qui comprend l' oncogène T/t de SV40, l' oncogène tsT/Δt de SV40, l'oncogène T/Δt de SV40 et la région du gène immortalisant de l'adénovirus, du virus Eptsein-Barr ou du virus herpétique.
3. Lignées cellulaires selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisées en ce que le fragment des régions régulatrices du gène humain de la vimentine est, de préférence, le promoteur de la vimentine et plus particulièrement le fragment d'acide nucléique du promoteur de la vimentine, compris entre les bases -830 et +93 de la séquence régulatrice de la vimentine.
4. Lignées cellulaires selon la revendication 3, caractérisées en ce que le fragment d'acide nucléique du promoteur de la vimentine comprend les bases -830 à - 529 et/ou le fragment -540 à -140, situés en amont du site cap.
5. Lignées cellulaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce que les cellules primaires sont avantageusement choisies dans le groupe qui comprend les cellules musculaires précurseurs de mammifère et plus particulièrement les myoblastes, les cellules épithéliales de mammifère et les cellules endotheliales de mammifère.
6. Lignées cellulaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce que les cellules musculaires précurseurs sont choisies dans le groupe qui comprend les myoblastes normaux de souris, les myoblastes mutants de souris et les myoblastes mutants humains.
7. Lignées cellulaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par transfection de cellules primaires appropriées par un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-tsT/Δt, le plasmide pHuVim830-T/Δt et le plasmide pHuVim830-T/t
8. Lignée cellulaire selon la revendication 7, dénommée HVM, caractérisée en ce qu'elle a été obtenue par transfection de myoblastes normaux de souris par un plasmide pHuVim830-tsT/Δt et a été déposée sous le n' I- 1019 en date du 7 décembre 1990 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'INSTITUT PASTEUR.
9. Lignée cellulaire selon la revendication 7, dénommée HVMd, caractérisée en ce qu'elle a été obtenue par transfection de myoblastes mutants mdg de souris par un plasmide pHuVim830-tsT/Δt et a été déposée sous le nº I-1020 en date du 7 décembre 1990 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'INSTITUT PASTEUR.
10. Lignées cellulaires selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par microinjection d'une séquence linéaire d'un acide nucléique appropriée, obtenue à partir d'un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-tsT/Δt, le plasmide pHuVim830-T/Δt et le plasmide pHuVim830-T/t, dans des cellules primaires convenables.
11. Lignée cellulaire selon la revendication 10, dénommée HVE, caractérisée en ce qu'elle a été obtenue par microinjection d'un plasmide pHuVim830-T/t linéarisé dans des cellules endothéliales humaines du cordon ombilical et a été déposée sous le nº 1-1016 en date du 3 décembre 1990 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'INS ITUT PASTEUR.
12. Procédé d'obtention de cellules musculaires (myotubes) différenciées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(a) culture d'une lignée de cellules musculaires selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, comprenant un plasmide contenant un oncogène viral immortalisant thermosensible, sur un milieu approprié contenant une quantité appropriée de sérum d'un animal convenable, à une température comprise entre 34ºC et 36ºC, permettant l'expression conditionnelle d'une protéine virale, et notamment de l'antigène tsT et une multiplication cellulaire importante ;
(b) modification de la température des cellules en culture à une température comprise entre 38ºC et 40ºC, associée, éventuellement, à une modification du milieu de culture, notamment par diminution de la concentration en sérum dudit milieu et/ou utilisation d'un sérum d'un animal différent de celui de l'étape (a) ; et
(c) obtention de cellules différenciées en grand nombre par culture desdites cellules dans les conditions appropriées à la différenciation de l'étape (b).
13. Procédé d'obtention de cellules musculaires (myotubes) différenciées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(a) culture d'une lignée cellulaire musculaire immortalisée selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, comprenant un plasmide contenant un oncogène viral immortalisant, notamment un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-T/t et le plasmide pHuVim830-T/Δt, sur un milieu approprié, contenant une quantité convenable de sérum d'un animal convenable, à une température appropriée notamment 37ºC ;
(b) modification du milieu de culture, notamment par diminution de la concentration en sérum dudit milieu ;
(c) obtention de cellules différenciées en grand nombre par culture desdites cellules dans les conditions appropriées à la différenciation de l'étape (b).
14. Procédé d'obtention de cellules épithéliales ou endothéliales différenciées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(a) culture d'une lignée cellulaire épithéliale ou endothéliale selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, 7, 10 ou 11, en présence d'un agent d'activation approprié qui conditionne l'expression d'une protéine virale appropriée et notamment de l'antigène T en présence du promoteur de la vimentine et permet une multiplication cellulaire importante ;
(b) transfert de ladite lignée immortalisée dans un milieu dépourvu en agent d'activation et/ou à une température comprise entre 37*C et 40ºC ; et
(c) obtention de cellules différenciées en grand nombre.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'agent d'activation est notamment choisi dans le groupe qui comprend l'antigène T lui-même et des agents mitogènes appropriés.
16. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'agent mitogène est notamment choisi dans le groupe qui comprend les sérums, les facteurs de croissance tels que le PDGF, l'EGF ou le FGF, l'interleukine II, les interférons et la phytohémaglutinine (PHA).
17. Cellules différenciées, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par l'un quelconque des procédés d'obtention de cellules différenciées selon l'une quelconque des revendications 12 a 16.
18. Agent à visée préventive et/ou thérapeutique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cellule différenciée selon la revendication 17, éventuellement modifiée par adjonction d'un fragment d'acide nucléique approprié et éventuellement associée à au moins un véhicule pharmaceutique approprié.
19. Agent à visée préventive et/ou thérapeutique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une lignée cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, éventuellement modifiée par adjonction d'un fragment d'acide nucléique approprié et éventuellement associée à au moins un véhicule pharmaceutique approprié.
20. Modèle d'étude et d'identification des systèmes biochimiques dont l'expression nucléaire, cytoplasmique ou membranaire est impliquée dans la prolifération et la différenciation cellulaire des cellules musculaires, épithéliales, endothéliales ou nerveuses, caractérisé en ce qu'il est constitué par une lignée cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
21. Séquence d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle comprend successivement :
- une séquence codant pour l'antigène grand T de SV40, ne comportant pas le fragment codant pour l'antigène petit t, laquelle séquence est thermosensible, ou un fragment de celle-ci ; et
- une séquence comprenant au moins un fragment du promoteur de la vimentine humaine, d'une longueur de 830 paires de bases à partir du site cap ou un fragment de celle-ci, notamment le fragment -830 à -529 et/ou le fragment -540 à -140, en amont du site cap ; et, éventuellement - un gène, dépourvu de son promoteur, mais dont l'activité est aisément détectable soit par un test enzymatique simple, soit par le fait qu'il confère une résistance à un antibiotique.
22. Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique selon la revendication 19, lequel vecteur est apte à immortaliser une lignée cellulaire appropriée.
23. Méthode de production d'un mammifère transgénique non humain, caractérisée en ce qu'elle comprend l'introduction d'un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-T/t, le plasmide pHuVim830-T/Δt et le plasmide pHuVim830-tsT/Δt dans un mammifère non humain à un stade embryonnaire précoce.
24. Mammifère transgénique non humain, caractérisé en ce qu'il est obtenu par la méthode selon la revendication 23, et en ce que les cellules comprenant le plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-T/t, le plasmide pHuVim830-T/Δt et le plasmide pHuVim830-tsT/Δt, peuvent se différencier normalement in vivo, tout en pouvant produire des cellules précurseurs immortalisées in vitro.
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