WO1992001052A1

WO1992001052A1 - Dna coding for human fk506-binding protein and expression thereof

Info

Publication number: WO1992001052A1
Application number: PCT/JP1991/000931
Authority: WO
Inventors: Noboru Maki; Nobuhiro Takahashi; Masanori Suzuki
Original assignee: Tonen Corporation
Priority date: 1990-07-11
Filing date: 1991-07-11
Publication date: 1992-01-23
Also published as: DE69130684T2; JPH0471492A; DE69130684D1; EP0594847A1; EP0594847B1; JP2982908B2; EP0594847A4

Description

明細書

ヒ卜 F K 5 0 6桔台蛋白質をコードする D N Aおよびその発現本発明は、ヒト FK506 結合蛋白質をコードする D N A及びその発現に係る。

発明の背景

プロリンぺプチド '結合の異性化を触媒し、蛋白質の高次構造形成を促進する酵素としてべプチジルプロリルシストランスィソメラ一ゼ（以下、 PPIaseと略称する）が知られており、この酵素は免疫抑制剤サイクロスポリン Aと特異的に結合するサイクロフィリンと同一物質であることが判明している（Takahasi, Ν· ら、 Nature 337, 473- Π 5, 1989； La n g, K. ら、 Nature 329 ， 268 -270, 1987)。また、この酵素は、変性させた蛋白質、例えばリボヌクレア一ゼ A、リボヌクレア一ゼ T i 、免疫グロプリン、シトクローム（、タイプ mコラーゲンなどの高次構造の再構成を促進することができる（Fi scher, G. と Ba n g, H. , B i o c h i m i. Biophys. Acta 828, 39 - 42, 1985 ； Lin, L. -N. ら、 Biochimi. Bi ophys. Acta 956, 256 - 266, 1989 ； Bachinger, H. P. , ]. Biol. Cheni. 262, Π144-Π 148, 198 T ) 。

免疫抑制剤サイクロスポリン Aによって、サイクロフィリンの PPlase活性が阻害されることから、サイクロスポリン Aの効果は、 PPlase活性を阻害することによって、その基質となる蛋白質の活性発現が抑制されるために起こると推定されている。しかし、以下に述べるように、その効果は多岐に及んでおり、サイクロフイリンが作用する蛋白質は多数存在するものと考えられている。例えば、免疫系細胞において、サイクロスポリン Aはヘルパー T細胞を活性化するが、サイクロフィリンは PPIa seとして、インターロイキン 2遺伝子や他のリンフォカイン遣伝子の発現を活性化するある種の転写制御因子、例えば NFAT、 AP- 3の活性発現に働いている（高橋信弘ら、現代化学^ ， 0 - 47, 1989； Eimel, E. A. ら、 Science 246, 16 Π- 1620, 1989) 。また、サイクロスポリン Aの免疫細胞における 7—インタ一フヱロン、インターロイキン 4、マクロファージ活性化因子、腫瘍懐死因子などの産生、分泌の阻害に対しては、これらの蛋白質合成のための転写、訳あるいは高次構造形成のいずれかの過程にサイグロフィリンは PPlase として作用している（高橋信弘、医学のあゆみ、 _111， 13 -416, 1989 ) ものと考えられ哺乳類において、サイクロフィリンは、一つの生物種に対して一種類の蛋白質が同定されているのみである。しかし、その染色体上にはサイクロフィリン様遄伝子をコードする数十コピ一の D N A配列の存在が確認されており（Haendler, B. ら、 EMBO. J. _6, 947 - 950, 1987) 、また、酵母および大腸菌において 2種類のサイクロフィリン様蛋白質が確認されている（特願平 1一 184738および特願平 1一 344705) ことから、哺乳類においても、サイクロフィリン様蛋白質が多数存在するものと考えられる。この多様性が、作用する基質蛋白質の多様性に対応しており、サイクロスポリン Aのもつ薬剤としての副作用が生じる原因であると推察される。

ところで、免疫抑制剤サイクロスポリン Aと非常に類似の効果をもつが、その化学構造が全く異なる免疫抑制剤として FK

506 が知られている（Thomson, A. W. , Ioimuno 1 ogy Today, 10,

6 - 9, 1989 ) 。また、生体内において、 FK 506 と特異的に結合する蛋白質が存在しており、この FK506 結合蛋白質は PPIase活性を有し、 FK 506 の結合によってその活性が阻害されることも知られている（Siekierka, J. J, ら、 Nature 341, 755 - 757, 1989 Harding, M. W. ら、 Nature 34L 758 -760, 1989 ) ₀

化学構造が全く異なる免疫抑制剤が、共に、 PPIase活性の阻害効果を有す^という結果は、免疫抑制作用が PPlase 活性の阻害を介して行われていることを強く示唆しており、従って、 PPI a se活性の阻害効果をもつ物質は免疫抑制効果をもっと考えりれる。

FK 506 結合蛋白質とサイクロフィリンとの PPlase活性に対する基質特異佳の比较研究から、サイクロフィリンは相対的に広い基質特異性をもつのに対し、 FK 506 結合蛋白質はより狭い基質特異性を有する、即ち、 M 506 結合蛋白質の基質となる蛋白質はサイグロフィリンのそれとは異なり、かつ、サイクロフィリンよりもより特異的に働いていることが示唆されている (Harrison, R. K. と S t e i n, R. L. , B i o ch em i s t r y 29, 3813 - 3816, 1990) 。

免疫抑制剤としては、免疫系細胞に選択性をもつ、特にヘルパー T細胞で働く PPlase活性を特異的に阻害できる物質が副作用の少ない薬剤として有効であると期待でき、サイクロフィリンより狭い基質特異性を有する FK5 結合蛋白質の酵素活性阻害効果を目安として、かかる副作用の少ない薬剤をスクリー二ングすることができると考えられる。

FK 506 結合蛋白質は、 2つのグループによって天然から直接単離されているが、報告されている分子量は、 11, 000ダルトン (Siekierka, J. J. ら， Nature 34—1, 755 - 757, 1989 ) 及び 14, 000ダルトン（Harding, M. W. ら， Nature 341, 758 - 760, 1989 ) とくい違っている。また、後者の文献の中で、 Harding らは、ゥシ胸腺から単離した蛋白質のァミノ末端側 40残基までの部分アミノ酸配列を決定し、サイクロフィリンと異なる蛋白質であるとしているが、 PPlaseとしての酵素活性部位等においてサイクロフィリンと何らかの共通性があるかどうかについては不明である。

上述のように、 FK506 結合蛋白質はサイクロフィリンと異なる PPIase活性を有しており、その生理学的機能も多用であろうと考えられている。該蛋白質はその PPIase活性の阻害を目安とした免疫抑制剤のスクリ一ユングの手段として使用し得るだけでなく、 vitro での特定蛋白質の高次構造形成を促進する手段として、また該蛋白質の基質特異性を調べるための研究用試薬として重要視されている。しかしながら、これまで、該蛋白質は直接臓器から単離する以外には入手方法が確立されていなかった。

本発明の目的は、 FK506 結合蛋白質に対応する遺伝子を単離することによって、該蛋白質をコードする D N A配列を決定し. またこの D N A配列から推定されるァミノ酸配列を決定することである。

本発明の別の目的は、該蛋白質を遺伝子工学技術を用いて多量に製造するための手段を提供することである。

発明の概要

本発明は、配列番号 1によって示される第 1番目〜第 108 番目のアミノ酸 S列によって表わされるヒト FK506 結合蛋白質をコードする塩基配列を含む D N Aを提供する。

ヒト FK506 桔合蛋白質をコードする遗伝子は、米国 CL0NTECH 社のス gtllをベクターとして作製されたヒ卜 T細胞 c D N Aライブラリーからプローブを用いるハイブリダィゼーション法により得られる。推定ァミノ酸配列から計算されたヒト FK506 結合蛋白質の分子量は 11， 951ダルトンであり、またその等電点は 8. Πである。該遺伝子のヌクレオチド配列は、データベース検索上全く新規の配列であり、また PPIase活性をもつサイクロフィリンの配列との間にも全く栢同性はない。

本発明はまた、該 D N Aを含む発現べシター及び該べクタ一を宿主細胞内に導入して得られる形質転換体を提供する。本発明はさらに、該形質転換体の培養下で該ベクターを発現させることによる組換えヒト FK506 結合蛋白質の製造方法、及びこの方法により得られる組換えヒト FK506 結合蛋白質を提供する。

図面の簡単な説明

第 1図は、ヒト FK506 結合蛋白質をコードする D NA断片を組み込んだプラスミド pUC- X-FKBP- Aの構築方法を示す。

第 2図は、発現プラミド p】DB-GAP-FKBP- A の作製方法を示す < 発明の詳細な説明

本発明は、 15列番号 1によって示される第 1番目〜第 108'番目のアミノ酸配列によって表わされるヒ卜 FK506 結合蛋白質をコ一ドする塩基配列を包含する D N Aを提供する。

以下に、本発明に係る c D NAの単離、配列決定、及び発現について詳細に説明する。

c D N Aの単離及び配列決定

米国 CL0NTECH社のス gt 11をベクターとして作製されたヒト T 細胞 cDNAライブラリーから、 Harding ら [Nature 341, 758 - 760

により報告されたゥシ FK506 桔合蛋白質（以下、 FKBP と略称する）のァミノ酸配列（31番目の Gli！〜 37番目の Asp ) に基づいて合成した D N A配列をプローブとして用いるハイブリダィゼーションによるスクリーニングを実施することによつて、大腸菌株に感染させたヒ卜 FKBPcMAを含む陽性クローンを単離することができる。

該クローンを溶菌し、得られたファージからフヱノ一ル/クロロホルム抽出及びエタノール沈殿の慣用手法によりファージ D N Aを回収し、これを RNaseAを含有する緩衝液中で EcoR I と反応させた後、ァガロースゲル電気泳動、サザンプロッティング [Sauthern, E. J. , J. Hoi. Biol. 98, 503 - 517 (1975)] を行ない. 再度ハイプリダイゼーションを実施する。その結果得られるクローンは約 1. 5kbの EcoR I断片を有しており、この D N A断片をグラスパウダー法（Gene C 1 e a n^TM, B i。- 101社）等の慣用技術により該ァガロースから分離、精製する。

次に、上記 1. 5kb EcoR I断片を、 T4 DNAリガ一ゼを用いて. EcoR I 消化 pffCU ベクタ—内に組み込み組換えプラスミドを作製する。該プ^スミドを、塩化カルシウム法 [Mandel. M. と Higa, A. , J. Mol. Biol. , 159 - 162 ( 19 T9) ] によって作製された感受性大腸.菌 JM107 株に移入し、アンピシリン耐性株を分離し、形質転換体 pUC- h- MBPを得る。プラスミド D N Aのミニプレ？レ一ションを常法 (Maniatisら， Molecular Clonin ： A Laboratory Manual, 1982) に従って実施し、得られたプラスミド D N Aを EcoR I で切断し、ァガロースゲル電気泳動を行なうことにより、 1.5kbの EcoR I 断片が pUC ベクターに挿入されていることを確認した。また、サザンブロッテイングにより、この断片が前記プローブと桔合することも確認された。

挿入 D N A中に存在する Hi ικ II制限酵素認識部位を利用して、前記プラスミド D N Aを EcoR I と Hi ικ 11で二重消化し、生成した 2つの約 750 bp D N A断片の夫々を MUrop 系ファージ D N A に再度組み込み、ジデォキシ法 [Sanger, F. , Nicklen, S.および Corlson, A. R. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 - 5467 ( 1977) ] によりヌクレオチド配列を決定し、目的とするヒト FKBPをコードする cDNAを同定した。

配列表中 £列番号 1に、上記のようにして得られた完全長のヒト FKBPcDNAのヌクレオチド配列及びそれから推定されるヒト FKBPのアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列から、この遺伝子は、配列番号 1によって示される 108個のアミノ酸残基から成る蛋白質（ ½et G!y Leu ¹ 1 ιι)をコードしていると考えられる。このアミノ酸配列と Harding ら [Nature 341, 758 - 760 ( 1989)] が報告しているゥシ FKBPの N 末端 40ァミノ酸残基の配列部分とが完全に一致することから判断して、得られた遣伝子は、ヒト FKBPをコ一ドする遺伝子であることが明らかとなつた < 従って、本発明の実施態様により、ヒト FK5D6 結合蛋白質をコードする塩基配列として配列番号 1によって示される第 79番目〜第 402 番目のヌクレオチド配列（'⁹ATG GGA "· CTG

GAA⁴⁰² ) を挙げることができる。もちろん、各アミノ酸に対応する他のコドンから成る他のいかなる塩基配列も本発明に包含される。

ヒト F K B Pの特性

推定されたアミノ酸配列から、ヒト FKBPの分子量、等電点を計算すると、分子量 11, 951ダルトン、等電点 8.71 であり、これらの値は前記 Harding ら（前掲）の報告した分子量及び S i e k ierka ら [Nature 341, 755 -757, 1989]の報告した等電点とよい一致が見られ、得られた遺伝子が FKBPをコ一ドしていることを更に強く支持している。得られた塩基配列、全アミノ酸配列をデータベース（Gen Bank, E BL, DDBJ) に登録されている配列と夫々比較したが、相同性のある遺伝子及び蛋白質を見い出すことはできなかった。更に、同じ PP 1 a s e活性をもつサイクロフィリンの配列 [実施例 2及び Haendl erら、 ENBO J. _6, M7〜 950 ( 1987)] とも比較したが、何ら相同性は存在しなかった。従って、サイクロフィリンと FK8Pは、互いに全く関連性のない構造を持っていることが明らかとなった。このことは、これら 2つの PPIaseが独立に異なった基質に働いている可能性を示唆している。

単離した遗伝子をプローブとして、ノーザン（Northern) ブロット法により各種臓器での FKBPの niRNAの存在を調べたところ. 用いた臓器、即ち肺，胎整，肝膝，脳，白血球の全てにおいて. 量的な差はあったが、該 fflRMが存在していた。それ故、 FKBPは組織特異的に存在しているとは考えにくい。サザンプロット法により、ヒト染色体上に存在する遺伝子の数を調べると、サイクロフィリン遗伝子の場合 20コピー以上の DNA 配列が存在していると考えられるのに対し、 FKBPの遣伝子の場合 1〜2 コピーの D N A 85列が検出されただけであった。このことから、サイクロフィリンの場合には分子種として多様性があるが、 FKBP の場合にはほとんど多様性はなく、機能的にも FKBPの方が極めて限定的な機能を有していると考えられる。更に、 FKBP の場合、分子種としての数が少ないと推定されることに加え、その PPIaseとしての基質特異性が非常に狭い（ H a r r i s o n, L K. と Stein, R. L. , Biochemistry 21, 3813 - 3816, 1990) と考えられことから、この蛋白質の作用する基質蛋白質の種類は比較的限定されていると推定される。この作用する基質が組織特異的に働く蛋白質である場合には、 FKBPの酵素活性を阻害する物質は薬剤として比較的組織特異的な作用をもつ可能性が高く、一方それが各組織に共通で普遍的な蛋白質である場合には、酵素活性阻害物質剤として副作用が多いと考えられる。それ故、 FKBPを容易に入手できるならば、該蛋白質はこれらのことを明らかにする基; Sを探る強力な手段となり得るだけでなく、副作用のない又は少ない免疫抑制剤等の FKBP阻害物質をスクリー二ングする上で重要な役割を果し得るといえる。

ヒト F K 506 結合蛋白質の発現

本発明はまた、プロモーターの下流であって且つターミネ一ターの上流に存在するべクター内のクロ一ニング部位に導入された、配列番号 1によって示される第 1番目〜第 108 番目のァミノ酸配列によつて表されるヒト FK506 結合蛋白質をコードする塩基配列から成る D N Aを含む発現べクターを提供する。 - l 3 - 発現べクターの構築：

ベクターとしては、プラスミド及びファージ等の慣用べクタ一を挙げることができる。また、プロモーターとして、大腸菌ファージ、酵母菌のような真核生物由来のもの等が挙げられ、例えばトリブトファン合成酵素オペロン（卩 ) 、ラクトースオペロン（lac ) 、ラムダファージ P _L , P _R 、ダリセルアルデヒドー 3 — リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH), アルコールデヒドロゲナ一ゼ（ADHI)のプロモータ一等がある。さらにまた、ターミネータ一としては、例えば GAPDH 遺伝子、 ADHI遺伝子の夕一ミネーターが挙げられる。

上述のようにして得られたヒト FKBPクローンは、 3 ' 側部分にポリ A 配列を含んでいなかつたため、先ず FKBP構造遺伝子とヒトサイクロフィリン cDNA由来のポリ A 配列を連結したプラスミドを第 1図に示す手順に従って構築することができる。

FKBPcDNAを含むプラスミド pUC- h-FKBP DNAを Nco l消化し、次いで K I en (^処理することにより Nco I部位が平滑末端となつた 340bp DNA 断片を得、 Gene C I e a n^TMにより精製する。一方、 PUC18 の EcoR I部位に I部位を導入した pUC- 18- Xクロ一二ングベクターを EcoR I と Sma I で二重消化し、更に、 Kl enow処理を行って平滑末端をもつベクタ一を作製する。このベクターと前記の Obp DNA 断片を T4 MAリガーゼの存在下に連結して- 組換えプラス :ミド pUC-X- FKBPを得る。

次に、ヒト PPlaseを含むプラスミド pUC- h - PPI D NAを EcoR I と Pst Iで二重消化して、約 O bpのヒト PPlaseポリ A 配列を含有する D N A断片を得、また、 pUC- X- FKBP DNAを EcoR I と Xho Iで二重消化することにより 2. bのベクター断片として得る。これら 3つの D N A断片を連結して三者が連結したブラスミド pDC- X- FKBP-Aを構築する。

更に、天然の GAPDH 遺伝子のプロモーター領域を含むプラスミド (pGXN13.-NeoC-ATE ；特願平 1— Π 8264号参照）を X" I と BamH Iで二重消化し、得られた大フラグメントをヒ卜血清ァルブミン cDNAを含む発現プラスミド p】DB- ADH- HSA-A (特開平 2 - 117384号参照）の Xho I ZBamH I二重消化物の小さい方のフラグメント（HSAcD NAを含む）と連結させて作製した pJDB- GAP -HSA- A DNAを Sn I と Xho Iで二重消化して、 HS A 遣伝子の除かれた発現ベクターを得る。一方、 pUC- X-FKBP- Aを順次 Hindffi 消化、 Kl enow処理及び Xho I消化して、 ίΚΒΡとポリ A 配列を含む 570bp の D NA断片を得る。夫々の D N A断片を連結してヒト FKBPを発現産生させるための発現プラスミド pJDB- GAP-FKBP- A を作製することができる（第 2図参照）。第 2図の発現ブラスミドの構造から分かるように、ヒト FKBPをコードする D NA 断片は GAPDH プロモーターの下流側であって且つ ADHIターミネ一夕一の上流側に導入される。該発現プラスミド pJDB- GAP- FK BP- Aは、これを大腸菌 HB101 株に移入して得られた形質転換株 HB101/pIDB-GAP-h-FKBP として微生物工業技術研究所に寄託され（平成 2年 6月 27日付寄託，微ェ研菌寄第11558 号； £1^ 1⁾ - 11558) 、次いで、この寄託物はブタペスト条約に基づく国際寄託に平成 3年 7月 4日付で移管され、微生物工業技術研究所に受託番号微ェ研条寄第 3Π1号（FERM BP- 3471) で寄託されている。

形質転換体の作製：

本発明は更に、宿主を、上記の本発明発現プラスミドで形質転換して得られる形質転換体を提供する。

本発明の形質転換体の作製は、橋本英明と木村光の法 [発酵と工業， 43, 630 - 637 ( 1985)] の改良法により、前記発現プラスミド p】DB- GAP- FKBP- A を宿主内に移入することによって実施される。宿主としては、大腸菌，枯草菌，酵母等のこの業界で慣用の微生物が挙げられる。動物細胞の使用も可能であることは当業者に自明であろう。

組換えヒト F K 506 結合蛋白質の製造：

該形質転換体を任意の培地中で培養し、目的とする組換え蛋白質を産生蓄積せしめることにより、組換えヒト 506 結合蛋白質を得ることができる。具体的には、この方法は、

配列番号によって示される第 1番目〜第 108 番目のァミノ酸配列をコードする塩基配列を含む D N Aを適当な宿主細胞内で発現させ得る複製可能な発現べクターを構築する工程、該発現べクダーを宿主細胞内に移入して形質転換体を得るェ程、

該 D N Aを発現させ得る条件下で該形質転換体を培養して該組換えヒト FK506 結合蛋白質を産生させる工程、及び

該組換えヒト FK506 結合蛋白質を回収する工程、

を包含する。

このような組換えヒト FK506 結合蛋白質の製造方法も本発明の範囲内である。

発現生成物の検出は、培養菌体を集菌し、加熱溶菌させた試料を SDS ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動分析することによって行い、ゲル上約 Hキ口ダルトン付近にヒ卜 FKBPによる有意なバンドが確認された。発現生成物は、菌体を破砕後、慣用の精製手段、例えばゲルろ過，ィォン交換ク口マトグラフィー, ァフィ二ティクロマトグラフィ一などの種々のクロマトグラフィ一法の組み合わせ等により実質的に精製された形で単離回収することができる。従って、本発明は、上記方法により得られる組換えヒト FK506 結合蛋白質にも係わる。

本発明により、遣伝子工学的にヒト FKBPを製造供給することが可能となる。またこれにより、免疫抑制剤のスクリ一二ングのための PPlase酵素活性をもつ結合蛋白質の安定供給が可能となる。さらに、サイクロフィリンの基質蛋白質とは異なつた基質蛋白質の高次構造形成に対する促進効果が期待できるため、この効果を利用した不活性型蛋白質の活性化への利用等が考えられる。

以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を変えない限り以下の実施例によって限定されるものではない。

実験例 1 ヒト FKBP遺伝子のクローニング

ヒト FKBPcDNAを含むクローンを得るために、米国 CL0NTECH社の I g t ilをべクタ一として作製されたヒ卜 T 細胞 cDNAライブラリーを用いた。

λ g t 11組換え体ファージ ix lO^q pfu を大腸菌 Y109G 株の一晩培養液 [LB培地（i¾!トリプトン， 0. 5% 酵母エキス， 0. 5 % NaCl) + 0: 2% マルトース] の細胞 50/ 1 に加え、 37°Cで 20 分間反応させた後、 3mlのい Top-ァガロース（LB培地 + 0. 1% ァガロース）と共に直径 90πππのいプレート（LB培地； 1. 5!¾ 寒天） 4枚にまいた。これらのプレートを 3 Cで一晩培養しブラークを形成させた後、 4でで 1時間保存した。組換え体ファージをメンブランフィルター（Amersham社， Hybond- N) に移し、 0. 5N NaOH, 1M NaClを浸した 3MM 口紙（Whatman 社）上に 5分間置き、さらに 0. 5M Tris-HCl (pH7. 2), 1. 5M NaCl を浸した口紙上に 5分間静置した。 2X SSC (20x SSC は 3M NaCl, 0. 3Mクェン酸三ナトリウムから成る）溶液でフィルターを洗い、風乾させた後、サランラップで包み、 UV照射することによりファージ D N Aをフィルタ一に固定した。そのフィルターを³² P 放射性同位元素で標識した合成ォリゴヌクレオチド（比活性≥ 10⁷ cpm/ i g DNA)をプローブとして用いてス ^ リーニングした [Be ntonと Davis, Science 196, 180 - 182 (1977) ] 。ー丄 g — プローブとして、ゥシ FKBP [Hardingら， Nature 341, 758 -760 ( 1989)] のアミノ酸配列の 31番目グルタミン酸から 37番目ァスパラギン酸に対応するプローブ D N A 5' - GA (A/G) GA (T/C) GG (G/A/T/C) AA (A/G) AA (A/G) TT (T/C) GA-3' を Caruthersら [Matt eucci, M. D. と Caruthers, M. H. , Tetrahedron Letters 21, 719 (1980)] により開発されたホスホアミダイト法を応用した自動 D N A合成機（Applied B i o s y s t emsモデル 380 B) を用いて合成し、合成 D N A鎖（21pmol) を 50mM Tri s-HCI (pH7, 6), lOm MgCl₂ , oiM ジチオスレィトール， 100 Ci [ 7 - ³²P] ATP UOOOCi/mmol, Amersl m社）及び 12単位の T 4 ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）を含有する溶液 50 1 中で 37で 60分間処理することにより、 5' 端をリン酸化標識した。 6X SSC , 5 Xデンハルト溶液（100Xデンハルト溶液は 2¾ゥシ血清アルプミン， 2¾フイコール， 2%ポリビニルピロリドン）， 0.5¾SDS, 50 mlの超音波処理したサケ精子 D N A及び ID⁶ cpra/ralプロ —ブ D N Aを含む溶液を用い、 Π で 16時間フィルターのハイブリダィゼ一シヨンを行った。そのフィルターを 2X SSC , 37 °Cで洗浄し、 X 線フィルム（Kodak 社， XAR- 5) に一 70°Cで 10 時間露光させた。現像後、陽性のシグナルを与えたプラ一ク 2個をパスツールピぺットの先端で搔き取り， 100 1 の ΤΜ液 [10mM Tri s-HCl (pH7.5), lOmM MgCl₂ ] に懸濁し、室温に 20分間静置させた。懸濁液 0. 5^ 1を 1 mlの TM液で希釈し、そのうち 5// 〗を前述の方法で大鵃菌 Π 090 株に感染させ、いプレート上にまき、プラークを形成させた。形成されたプラークは再度上記のようにプラークハイブリダィゼーシヨンを行い単一プラークからなる陽性ク口ーンを得た。陽性ク口一ンをパスツールピぺットの先で搔き取り、 50μ 1 の Y109G 細胞に加えて Πでで 20分間静置した後、 ΙΟπΜ MgS0₄ を含む 2mlの L B培地に加え、 37°Cで 6 時間振逢培養した。クロ口ホルムを 100/z l 加え、ボルテックスミキサーにかけて完全に溶菌させ、 5000 rpm で 5分間遠心し, 上清を得た。この上清中に 10^1Qオーダーのファージが含まれていた。この上清 800/z l に lOOju l の 5M NaClを加えてよく混ぜ、一 20でで 20分間静置した。 15Krpmで 5分間遠心し、得られた沈澱を 500ju 1 の 70% エタノールで洗い、 200 ίί 1 の TE溶液

[ 10mM Tri s-HCl (pH8. 0) , lm EDTA] に溶解させた。 Ιμ ΐ ( 60 u n i t / 1 ) の Mase I (宝酒造）と 2 1 の 1M MgCl₂ を加え、 37°Cにて 30分間反応させ、 100// 1 の TE飽和フエノールを加え、ボルテックスミキサーで処理した。 12Krpmで 5分間遠心し、水層をさらにフヱノール/クロ口ホルム U： 1) で 1回抽出し、得られた水雇に 20〃 1 の 3M 酢酸ナトリウム（pH 5.2) 及び 500JK 1 のエタノールを加え、遠心して D N Aを沈澱させた。その沈截を 70%エタノールで洗浄した後、減圧乾燥させ、 50 1 の TEに溶解した。この操作で i jK g相当のファージ D N Aが得られた。得られた溶液 20/^ 1 に 2.5/z l の 10倍濃度の EcoR I緩衝液 [0.5M NaCl, 1M Tris-HCI (pH7.5), 70nH gClg ] を加え、 1〃 1 (20単位）の EcoR I (二ツボンジーン）と lju 1 の lOmgZmlの ase A (Sigma 社）を加え、 37でで 1時間反応させた。反応後、 0.7%ァガロースゲル電気泳動を行い、サザンプロット法 [Sathern, E.， J. Mol. Biol. 98, 503 - 517 (1975) ] に従って、 D N Aノくンドを Hy b o n dフィルタ一にブロッティングさせた。 D N Aの結合したフィルターを用いてプラークハイブリゼーションと同一の条件でハイブリゼーションを行った。こうして得られたクローンは各々約 1.5kb の EcoR I断片を有し、グラスパウダー法（Gene C 1 e a n^TM， B i o- 101社）により D N Aをァガロースから分離精製し、 pUCU ベクターにサブクローニングした。 EcoR I で消化した pUC19 ベクター（30ng) と回収された 1. 5 kbの ScoR I 断片（20ng) とを 2. 8単位の Π DNAリガーゼ（宝酒造）を含む総量 30 « 1 の反応溶液 [ mM Tris-HCl (pHT. 6)， 6. 6 mM MgCl₂ , 10mMジチオスレィトール， ImM ATP] 中で、 16°C、時間処理レ、両者が連結した組換えプラスミドを得た。この反応液の 10 1 を宿主菌の大腸菌】M 107 株を形質転換するのに用いた。形質転換に用いる感受性大腸菌は、塩化カルシウム法 [Mandel, M. と H i g a, A. , J. Mo 1. B i o 1. 51, 159 - 162 (1970) 3 により作製される。具体的には、大腸菌 jMl 株の一晚培養液 (L B培地）を同じ培地で希釈し、 O D _{6Q (|} が 0. 6になるまで 37でで振通培養し、 1. 5ml を 5Krpm で 5分間逮心して集菌した。これを 750^ 1 の 50mM CaCl₂ に懸濁し、氷上に 20分間放置した後、遠心により集菌した。得られた菌体 1 1 の 50raM CaCl₂ に再懸濁し、前記の D N A リガーゼ反応液を加え、氷上に 40分間放置した。 4 Cで 1分間保温した後、 1101の 1^ 8培地を加え、で 30分間保温した。このうち 0. imlを X-Galプレ — ト（155 β- g 5—プロモー 4 —クロ口一 3 —インドリル — β — Ό—ガラクトビラノシド、 80// g / mlィソプロピル一 β — D—チォガラクトビラノシド、 25 g /m 1アンピシンを含む L一プレート）上に塗布し、 37°Cに一晩保温した。プレート上に生じたコロニーのうち白色を呈するコロニーを選抜し、菌体を一白金耳とり、 ja gZralアンピシリンを含む L B培地に移し、一晩培養液を調製した。 1.5mlの一晩培養液を遠心して集菌し、プラスミド D N Aのミニプレパレーションを常法（Mani a t i s , Molecular C 1 o n i n ; A Labor tory Manual, 1982)により行った。得られたプラスミド D N Aを、 EcoRl で切断し、ァガロースゲル電気泳動を行い、 1.5Kbの EcoRl 断片が pUCべクターに挿入されていることを確めた（pUC- h- FKBP) 。さらに、サザンブロット法により、この断片がプローブと結合することも確認した。この挿入 D N A中に存在する Hi ncil制限酵素認識部位を利用し、 1 gプラスミド D N Aを溶液 25〃 1 [50mM NaCl, ΙΟΟπΜ T r i c - HC 1 (ρΗ7.5)、 7mM MgCl₂ , 20単位の EcoRI (二ツボンジーン）、 10単位の Hincll (二ツボンジーン） ] 中で分二重消化し、生ずる約 750 bp DNA 断片 2つをそれぞれ M13rap系ファージ D N Aに再度組込み、ジデォキシ法 [Sang e r, F. Ni ckl en, S 及び Cor 1 son, A. R. Proc. Na 11. Acad. Sc i. USA, U, 63〜5467 (1977)] によって、ヌクレオチド配列を決定し、目的とするヒト FKBPをコードする c DMAを同定した。 1.5kb EcoR I 断片の決定されたヌクレオチド配列を配列表中の配列番号 1 に示した。この断片は 1532 b からなり、さらに、この塩基配列から推定されるァミノ酸配列と Harding ら [Nature 341, 758 -760 (1989)]により報告されたゥシ FK506 結合蛋白質の部分ァミノ酸配列との比較から、この遺伝子は、配列番号 1によって示される 1番目〜 108 番目の 108 個のアミノ酸残基からなるヒ卜 FKBP結合蛋白質をコ一ドしてことが判明した。

実験例 2 ヒトサイク—口？ィ—リン cD NAのクローニング

ヒトサイグロフィリン cDNAを含むクローンを得るため、米国 CL0NTECH社 φス g tilをベクターとして作製されたヒト T細胞 cDNAライブラリーを用いた。 λ gt 11組換え体ファ一ジを大腸菌 Y 1090株を宿主として感染させ、形質転換ブラーク 1 X 10⁴ 個を L—プレート上に形成させ、組換え D N Aをメンブランフィル夕一（Anersham社、 Hybond- N) に移した後、 ³²P放射性同位元素で標識したブタ PPlase cDNA 遺伝子（比活性≥ 10⁸ cpm / β g ) をプローブとして用いスクリーニングした [ B e n 10 nと Davis, Science 196, 180 〜182 (1977) ] 。

プローブは、特願平 1一 1 738 (平成元年 7月 19日出願）に示したブタ PPIase遺伝子の EcoRl ' Pst I断片を、ランダム ' プライムド D N Aラベリングキット（Boehringer社）を用い、メ一力一マニュアルに従い D N A標識を行つて調製した。ハイブリダィゼ一シヨン反応は、 4 x S S C、 5 xデンハルト溶液、 0, 5 % S D S、 5( g /mlの超音波処理したサケ精子 D N A及び 1G⁶ cpra/mlのプローブ D N Aを含む溶液中で、 65でにて 16時間行い、洗浄は 0. lx S S Cを用いて 65でで行い、 X線フィルム（Kodak 社、 XAR-5) に一 70でにて 10時間露光させた。現像後、陽性のシグナルを与えたプラークについて、ハイプリダイゼーシヨンを繰り返すことにより単一プラークからなる陽性クローンを得た。

そのクローンからファージ D N Aを調製 [Blattnerら、 Scie nce 202, 1279 〜 1284 (1978)] し、 l 〃 gファージ D N Aを溶液 25 1 [50mM NaCI, IOOBIM Tris-HCl (pH7.5), 7mM MgCl₂ , 20単位の EcoRl (二ツボンジーン） ] 中で 37で 60分間処理することにより消化し、消化物のサザンブロットをプローブとハイブリダィズさせた [Southern, E. J. Mol. Biol. 98, 503〜5Π ( 1975)] 。ハイブリダィズした EcoRI 断片は約 750 bp であり、グラスパウダー法（Gene C 1 e a n^TM, B i。- 101社）により D N Aをァガロースから回収し、 pUC 19ベクターにサブクロ一ニングした。

EcoRI で消-化した pUCUベクター（30ng) と回収された 800 bp EcoRI断片（20ng) とを、 2. 8単位の T 4 D N A リガーゼ

(宝酒造）を含む合計 1 の反応液 [66mM Tris-HCl (pH7.6), 6.6πιΜ MgCl₂ , mMジチオスレィトール， 1 mM ATP] 中で U°C にて 4時間処理し、両者が連結した組換えプラスミドを得た。この反応液 10 μ 1 を用いて大腸菌 J Μ 7 株を形質転換させ、

X- Galプレート上にまき、コロニーを形成させた。白色を呈するコロニ一を選択し、 25 g /mlァンピシリンを含む 5 mlの L B培地に接種し、 37でで一晩培養した。 1.5B1 の一晩培養液から逮心により細胞を集め、それらの細胞からミニプレパレーシヨン法により D N Aを調製し、 EcoRI による切断の後、ァガロースゲル電気泳動を行い、適切な挿入 D N Aを含む組換えブラスミド pUC- b- PPI を得た。

この挿入 D N A中に存在する P st I制限酵素認識部位を利用し、 1 gプラスミド D N Aを溶液 2 1 [50mM NaCl, ΙΟΟπιΜ

Tris-HCl (pH7.5).7mM MgCl, , 20単位の EcoRI (二ツボンジ一ン）、 20単位の？ 5 1 (二ツボンジー） ] 中で、 37でにて 60分間二重消化し、生ずる約 600bp と 150bp の D N A断片を M 13rap系ファージ D N Aにそれぞれ組込み、ジデォキシ法 [Sang er, F. Nicklen, S.及び Corlson, A. R. Proc. Nat I. Acad. Sci. USA, U, 5463〜54Π (1Π7Π によってヌクレオチド配列を決定した。ヒトサイクロフィリンの cDNA配列は、すでに決定されており

[Haendler, Bら、 ENBO J. J, 947 〜950 (1987)] 、今回得られたクローンのヌクレオチド配列とも完全に一致した。

実験例 3 酵母菌でのヒト FKBP発現プラスミドの構築

FKBP cDNA を含むプラスミド pUC- h- FKBP 1 g D N Aを、反応液 20AI I C150mM NaCl. 6m Tris-HCI (pH7.5), 6nM MgC!₂ , 6単位の Ncol (二ツボンジーン） ] 中で 37で、 1時間消化し、その反応液に T E 80ju l を加え、 70でで 5分間熱処理した後、 1 1 の ImM dXTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP を各々 1 mM含む）と 2単位の D N Aポリメラーゼの Klenowフラグメン卜（宝酒造）を加え、 37°Cで 30分間保温した。ァガロースゲル電気泳動を行い、 Ncoi 部位が平滑末端となった Qbp DNA 断片を Gene

Clean^TMにより、精製した。また、 pUCU の EcoRI 部位に Xhol 部位を導入した PUC18X クローニングベクターを 20〃 1 反応液 [20mM KC1, 10mM Tris- HC1 (pH8. 0), 7mM MgCI₂ , 20単位の EcoRi (二ツボンジーン）， 10単位の Sroal (宝酒造） ] 中で 37で、 1時間二重消化し、 40mM Tris-HCl (pH7.5) を 1 加えて、 70でで 5分間熱処理した後、上記と同様に Klenoff処理を行い、平滑末端をもつベクターを作製した。このベクター (30ng)と先に述べた FKBPを含む D N A断片（20ng)を 2.8単位の T 4 D N Aリガ一ゼ（宝酒造）を含む合計 30 1 の連結反応溶液 [66mM Tris- HC1 (pH7.6), 6.6mM MgCl ₂ , lOraM ジチオスレィトール， l niM ATP] 中で 16°C、 10時間処理し、両者が連結した組換えブラ;スミド pUC- X- FKBPを得た。

そして、ヒトサイクロフィリン cD N Aを含むブラスミド ρϋ C-h-PPI l u g MAを用い、 EcoRI 反応液 20ju 1 [50mM NaCl, IOOIDM Tris-HCl (pH7.5), 7mM MgClg ， 20単位の EcoRI ] に 20 単位の P st I (二ツボンジーン） 1 1 を加え、 37°C 1時間反応し、約 150bp のヒトサイクロフィリンポリ A配列を含む D N A断片を得、 pUC- X-FKBPからは、 1 /z g D NAを用い、 20/z l の EcoRI 反応液に 12単位の Xhol (宝酒造）と 20単位の P si lをそれぞれ 1 gずつ加え、 3 C 1時間二重消化し、 370 bp の FKBP遺伝子を含む D N A断片を得た。クローニングベクターは pUCinの 200 ng DNA を EcoRI 反応液 1 に 12単位の Xhol 1 と加え、 Πで 1時間反応し、 2.6kb のべクタ一断片を得た。これら 3つの D N A断片を、上記の連結反応を行い、三者が連結したプラスミド pUC- X- FKBP-Aを構築した（第 1図参照）。天然の GAPDH のプロモーター領域を含むプラスミド（pGXN13- Neo C-ATE ；特願平 1 - 328624参照）を Xholと BamHi で二重消化し、得られた大きいフラグメントをヒ卜血清アルブミン cDNAを含む発現プラスミド p】DB- ADH- HSA- A (特願平 2-1173 M参照）の Xhol /BamHl 二重消化物の小さい方のフラグメント（HSAcDNA を含む）と連結させて作製した pJDB-GAP-HSA- A の D N A l /z gを反応液 20ju 1 [20mM 1、 ΙΟπΜ Tris-HCl (ρΗ8. 0), H MgCI₂ , 10単位の Snial, 12単位の Xhcl] 中で、 37で 1時間かけて二重消化し、 H S A遣伝子の除かれた発現ベクターを得た。 pUC- X-FK BP-Aからは、 1 # g D N Aを用い反応液 20ju 1 [50nM NaCl. lOOtnM Tris-HCI (pH7. 5), 7m MgClg , 10単位の H i n d m (宝酒造） ] 中で、 Πΐ ΐ時間反応し、水 30ju 1 を加えて 70でで 5分間熱処理をした。その反応液に Klenw処理を行い、再度熱処理し、 l M NaClを 5 ju l と 12単位の Xhol 1〃 1 を加えて、 37°C 1 時間反応させ、 FKBPとポリ A配列を含む 570 bp の D N A断片を得た。それぞれの D N A断片を上述したように連結反応を行い、酵母菌での発現プラスミド p】DB- GAP- FKBP- A を作製した（第 2 図参照）

実験例 4 発現プラスミドによる酵母宿主の形質転換

ヒト FKBP発現プラスミド pjDB-GAP- FKBP- A による酵母菌の形質転換は、橋本英明、木村光の KU R法 [発酵と工業、、 6 3(！〜 637 (1985) ] を改変した方法により行った。まず Y P D培地 [1%酵母エキス（Difco)、 2%バクトペプトン（Difco)、 2 %グルコース] 50mlに A H22株（MATa、 leu 2-3、 leu 2-112, his 4-519 、 canl) の Y P D培地によるー晚培養液 1 m 1を加え, 30でで Onm での吸光度が 0.5に達するまで培養した。これを 4でで 2000 r rn, 5分間の遠心で集菌し、菌体を 5 mlの 0.1M LiSCN に懸濁した。次にそのうちの 1.5mlを分取して 2000 rpm, 5分間の逮心で集菌し、菌体を 1の 2M LiSCN、 46 1 の 50 %ポリエチレングリコール 4000に再懸濁し、そこに 10// 1の D N A溶液（5- lOitz gの D NAを含む）を加えて、 30°Cで一晩保温した。この懸濁液に 50 1の滅菌蒸留水を加えて、ボルテツクスミキサにてゆるく振盪した後、 2000 rpm. 5分間遠心して集菌し、菌体を 100 β 1 の滅菌蒸留水に再懸濁し、選択用の寒天培地 [S D培地： 20ju g Ζπιΐヒスチ > ン塩酸塩、 0.67%ァミノ酸非含有イーストニトロゲンベース（D if co) 、 2%グルコースに 2%の寒天を加えたもの] にまいた。 30 で数日培養した後、生じたコロニーを 5 ralの S D培地に接種し 3 (TCで 48時間培養して、ヒト FKBPの発現について S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS- PAGE) により調べた。

実験例 5 形質転換体によるヒト FKBPの発現

S D培地での形質転換体 48時間培養液 1 mlを 5G rpm, 5分間遠心して集菌し、菌体を 30jw 1 の S D S— P A G E試料用緩衝液、（2¾ SDS, 5¾ 2—メルカプトエタノール、 7%グリセ口ール、 0.00625 %ブロムフヱノ一ルブルー、 0.0625M Tris- HC I 緩衝液 PH6.8) に懸濁し、 100 ^で 10分間煮沸した。この試料 lOju 1 を分離ゲル濃度 15%の S D S—ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動 [Laemrali の方法： Nature 277, 680 (1970)] した後、クマシ一ブリリアントブルー（ C B B ) により染色し、約 14キロダルトン付近にヒト FKBPと考えられる有意なバンドを検出した。

配列表配列番号： 1

配列の長さ： 1532

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の： cDNA to mRNA

直接の起源

ヒト T細胞 cDNAライブラリー（CL0NTECH社、米国）

配列の特徵

特徵を表す記号： mat peptide

¾ES : 79…"- 02

特徵を決定した方法： S 配列

EcoRI

GAATTCGGGC TCGCTGTTGG TCCACGCCGC CCGTCGCGCC GCCCGCCCGC 60 TCAGCGTCCG CCGCCGCC ATG GGA GTG CAG GTG GAA ACC ATC TCC CCA GGA 111

Met Gly Val Gin Val Glu Thr lie Ser Pro Gly

1 5 10

GAC GGG CGC ACC TTC CCC AAG CGC GGC CAG ACC TGC GTG GTG CAC TAC 159 Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gin Thr Cys Val Val His Tyr

15 20 25

ACC GGG ATG CTT GAA GAT GGA AAG AAA TTT GAT TCC TCC CGG GAC AGA 207 Thr Gly Met leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg

30 35 40

AAC AAG CCC TTT AAG TTT ATG CTA GGC AAG CAG GAG GTG ATC CGA GGC 255 Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gin Glu Val lie Arg Gly

45 50 55

TGG GAA GAA GGG GTT GCC CAG ATG AGT GTG GGT CAG AGA GCC AAA CTG 303 Trp Glu Glu Gly Val Ala Gin Met Ser Val Gly Glu Arg Ala Lys Leu

60 65 70 75 Ώ

tr> YS

謹

9一

V39U 9yE v3Yii

Claims

' WO 92/01052 PCT/JP91/00931 34 請求の範囲

1. 下記に示すァミノ酸配列によつて表わされるヒト FK506 結合蛋白質をコ一ドする塩基配列を含む D N A。

1 5 10

Me t Gly Va 1 Gin Val Glu Th r lie Se r Pro

15 20

Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly

25 30

Gin Thr Cys Va I Val His Tyr Thr Gly Met

35 40

Leu Glu Asp Gly Lys Lys Ph e As Ser S e r

45 50

Ar As Arg As n Lys Pro Phe Lys Phe Met

55 60

Leu Gly Lys Gin Glu Val lie Arg Gly Trp

65 70

Glu Glu Gly Val Ala GU Met Ser Val Gly

75 80

Glu Arg A 1 a Lys Leu T r lie Ser Pro As ⁸⁵ 90

Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly

95 100

lie lie Pro Pro His Ala Thr Leu Va 1 Phe

105

As Va I Glu Leu Leu Ly s Leu G 1 u

2. 前記塩基配列が下記に示す配列から成ることを特徴とする請求項 1記載の D N A。

ATG GGA GTG CAG GTG GAA ACC ATC TCC CCA 30

GGA GAC GGG CGC ACC TTC CCC AAG CGC GGC 60

CAG ACC TGC GTG GTG CAC TAC ACC GGG ATG 90

CTT GAA GAT GGA AAG AAA TTT GAT TCC TCC 120

CGG GAC AGA AAC AAG CCC TTT AAG TTT ATG 150

CTA GGC AAG CAG GAG GTG ATC CGA GGC TGG 180

GAA GAA GGG GTT GCC CAG ATG AGT GTG GGT 210

CAG AGA GCC AAA CTG ACT ATA TCT CCA GAT 240

TAT GCC TAT GGT GCC ACT GGG CAC CCA GGC 270

ATC ATC CCA CCA CAT GCC ACT CTC GTC TTC 300

GAT GTG GAG CTT CTA AAA CTG GAA 324

3. プロモーターの下流であって且つ夕一ミネ一ターの上流に存在するべク夕一内のクローニング部位に導入された、請求項 1又は 2に記載の D N Aを含む発現べクター。

4. ベクターがプラスミドである請求項 3に記載の発現べクタ一。

5. ベクターが p】DB- GAP-FKBP- Aである請求項 4に記載の発現べクター。

6. 宿主を、請求項 3〜 5のいずれか一項に記載の発現べクターで形質転換して得られる形質転換体。

7. 宿主が酵母又は大腸菌である請求項 6に記載の形質転換体。

8. 請求項 1又は 2記載の塩基配列によってコ一ドされるァミノ酸配列を含む組換えヒト FK506 結合蛋白質の製造方法であつて、

該塩基配列を含む D N Aを適当な宿主内で発現させ得る複製可能な発現べクターを構築する工程、

該発現べクタ一を宿主細胞内に移入して形質転換体を得るェ程、

該 D N Aを発現させ得る条件下で該形質転換体を培養して該組換えヒト FK506 結合蛋白質を産生させる工程、及び該組換えヒト結合蛋白質を回収する工程、

を含む方法。

9. 請求項 1又は 2記載の塩基配列によってコードされるァミノ酸配列を含む組換えヒト FK506 結合蛋白質。