WO1987005703A1 - Antiparatypical antibodies, their use for detecting and treating auto-immune diseases - Google Patents

Description

Antiparatypische Antikörper, seine Verwendung zum Nachweis und Behandlung von Autoimmunerkrankungen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Reagenz zum Nachweis von Autoimmunerkrankungen sowie ein Arzneimittel mit Wirkung gegen Autoimmunerkrankungen und ein Verfahren zu dessen Herstellung, worin jeweils antiparatypische Antikörper verwendet werden.

Die Immunregulation durch antiidiotypische Antikörper wurde zum erstenmal von Oudin und weiterführend von Jerne in seiner Netzwerktheorie beschrieben. Im Gegensatz zum Burnett-Selektionsmodell stellt sie eine in vielen Punkten noch hypothetische Grundlage für das Verständnis einer spezifischen Immunsuppression dar und bietet eine realistische Erklärungsmöglichkeit für die Genese und den Pathomechanismus von Autoaggressionserkrankungen.

Es sind dabei zwei Arten von Antikörpern, die zu einer Antigenbindungsblockierung führen können, zu unterscheiden:

1. Antikörper, die antigenunspezifisch am Idiotyp eines anderen Antikörpers binden, und damit möglicherweise durch diasterische Interaktion die Antigenbindung jenes Antikörpers verhindern. Man nennt sie antiidiotypische Antikörper.

2. Antikörper, die am sogenannten Paratop angreifen, d. h. an der muldenförmigen Umschlagstelle der leichten und schweren Kette, und dadurch befähigt sind, durch van der Waalschen'sche Kräfte die antigenen Epitope physikalisch mit unterschiedlicher Affinität anzuziehen. Gegen diese Antigenbindungsstelle gerichtete Antikörper werden als antiparatypische Antikörper bezeichnet. Antiidiotypische Antikörper sind definitionsgemäß Antikörper, die gegen den Idiotyp eines anderen Antikörpers gerichtet sind, d. h. gegen den sogenannten hypervariablen Teil eines Immunglobulins, auf dem sich auch der spezifische Teil der Antigenbindungsstelle, Paratyp, befindet. Diese Definition erscheint deswegen wichtig, weil der gegen den idiotypischen Anteil gerichtete Antikörper - antiidiotypischer Antikörper - der den Paratyp mit einschließt, die Antigenbindung bzw. den antiparatypischen Antikörper durch sterische Behinderung von seinem paratypischen Bindungsort zu verdrängen vermag. Der Wirkmechanismus des antiidiotypischen Antikörpers beruht also auf einer unspezifischen sterischen Blockierung mehr oder weniger aller Antigene, während der antiparatypische Antikörper hohe Selektivität aufweist. Der Paratop erkennt das entsprechende Epitop durch die spezifische sterische Anordnung seiner Aminosäuren, von ihm nur dann erfaßt werden können, wenn Epitopstruktur und Paratopstruktur sich spiegelbildlich verhalten. Dieser Mechanismus ist vergleichbar mit einem hochdifferenzierten Schloß (Paratop)-Schlüssel (Epitop)-Prinzip. Wenn ein antiparatypischer Antikörper mit dem entsprechenden Paratyp eine Reaktion eingehen soll, müssen also spiegelbildliche Strukturen beider Reaktionspartner vorliegen. Daraus folgt, daß der antiparatypische Antikörper eine identische Formation mit dem entsprechenden Epitop, das durch den Paratop gebunden wird, aufweist.

Durch Immunisierung mit antigenspezifisch an Säulen gereinigten und isolierten Antikörpern ist im Tierversuch eine Induzierung vonanti idiotypischen Antikörpern möglich. Üblicherweise wird in der Litera tur die antigenspezifische Selektivität dieses antiidiotypischen Antikörpers durch zwei Methoden nachgewiesen.

1. durch die Präzipitation des antiidiotypischen Antikörpers nach Reaktion mit dem isolierten Jod-markierten Antikörper.

2. in Form eines Radio-Liganden Tests durch die Verdrängung der Antigenbindung an den Antikörper durch die spezifische idiotypische-antiidiotypische Reaktion. Da antiidiotypische Antikörper generell in der Lage sind, sowohl die Antigenbindung als auch die Bindung des antiparatypischen Antikörpers zu blockieren, ist dieses Nachweisverfahren für die Erkennung paratypischer Antikörper ungeeignet. Die Reaktion beider Antikörper miteinander sowie die dadurch bedingte Antigenblockierung rechtfertigen in keinem Fall den Beweisschluß für eine Antikörper/antigenspezifische antiidiotypische Antwort, wie vermeintlich auf Grund der Literatur angenommen wird. Dieses Reaktionsprodukt kann ohne Beteiligung antiparatypischer Antikörper allein durch idiotypische-antiidiotypische Verbindungen oder auch aus der Kombination aniidiotypische idiotypische und antiparatypische Bindungen hervorgerufen werden. Die Identität mit einer reinen paratypischen-antiparatypischen Reaktion ist damit nicht gewährt. Weil die Nachweisverfahren, die auf dieser Basis beruhen, somit nicht ausreichend spezifisch sind, entbehrt auch der nach diesen Methoden isolierte vermeintlich antigenspezifische-antiidiotypische Antikörper für die weitere diagnostische und therapeutische Verwendung den Anspruch auf Selektivität und Spezifität im Hinblick auf die daraus resultierenden Ergebnisse.

Die physiologische Bedeutung idiotypischer-antiidiotypischer bzw. paratypischer-antiparatypischer Antikörper liegt in ihrer funktionellen Eigenschaft der Aufrechterhaltung der Immunbalance. Die Beendigung einer Antikörperantwort bzw. zellulärer Reaktionen mit spezifischen Rezeptoren gegenüber einem Antigen wird durch die Antiantwort antiidiotypischer Antikörper, die sich gegen die antigenspezifischen Antikörper oder die antigenspezifischen Rezeptoren dieser Lymphozyten richten, vermittelt. Um dieser antigenspezifischen Immunsuppression keine generelle Unterdrückung des Immunsystems nach jeder Sensibilisierung mit einem Antigen zu bewirken, ist das Vorhandensein einer Antiantwort mit hoch-selektiven Eigenschaften gegenüber dem antigeninduzierten Antikörper erforderlich. Somit schützt die ausgewogene Interaktion verschiedener Antikörper unseren Organismus möglicherweise vor der Entstehung von Autoagressionserkrankungen. Nicht nur beim Patienten mit Autoimmunleiden, sondern auch im gesunden Organismus wurden autoreaktive Zellen, d. h. Lymphozyten, die gegen körpereigene Substanzen gerichtet sind, entdeckt. Diese autoreaktive Zellpopulation wird wahrscheinlich durch die Blockierung ihrer spezifischen Antigenrezeptoren durch bestimmte Antikörper oder auch durch Lymphozyten mit Antikörper-Rezeptoren an der Zerstörung körpereigenen Gewebes gehindert. Durch einen angeborenen oder erworbenen antigenspezifischen Defekt entfällt die selektive Supprimierung der entsprechenden Lymphozyten, worauf dann eine umgehemmte Autoagressionserkrankung resultiert. Im wesentlichen handelt es sich bei diesen Autoimmunerkrankungen um folgende Formen: Autoimmune Schilddrüsenerkrankungen, Diabetes mellitus Typ I, Myasthenia gravis, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, autoimmune Hepatitis, Autoimmunerkrankungen des hämopoetischen Systems, Uveitis, Immunvaskulitiden, autoimmune Nephropathien, generalisierte Autoaggressionserkrankungen wie Kollagenosen und andere Bindegewebserkrankungen.

Bei den autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen handelt es sich insbesondere um folgende zwei Formen:

1. die chronische Thyreoiditis Hashimoto, die auf einer chronischen autoagressiven Entzündung basiert, wobei der Selbstzerstörungsprozeß der Schilddrüse in einer deutlichen Schilddrüsenunterfunktion endet.

2. Autoimmun bedingte Funktionsstörungen der Schilddrüse, bei der entweder die Schilddrüse zum Wachstum oder hormoneller Überproduktion stimuliert wird. Dafür werden endogene Antikörper, die gegen einen Rezeptor auf der Schilddrüsenmembran gerichtet sind, als ursächlich diskutiert. Sie ahmen unkontrolliert und nicht supprimierbar die Wirkung von TSH, das sowohl Wachstums- als auch hormonstiraulierende Eigenschaften an diesem TSH-Rezeptor besitzt, nach.

Diese beiden Erkrankungen imponieren serologisch beispielsweise durch das Auftreten hochtitriger Antikörper entweder gegenüber Thyreoglobulin und/oder Schilddrüsenmikrosomen oder gegen den TSH-Rezeptor. Die bisherigen Nachweismethoden für Schilddrüsenerkrankungen bedienen sich des Antigens als Detektor. Ein immunologisches Nachweisverfahren, welches die Detektion mit Hilfe von Anti-antikörpern durchführt, ist nicht bekannt.

Die bekannten Nachweismethoden, insbesondere der immunbedingten Funktionsstörungen der Schilddrüse, sind äußerst aufwendig. Ihre diagnostische Treffsicherheit und prognostische Bedeutung ist teilweise von unsicherer Relevanz. Diese Diskrepanz ist im wesentlichen durch die Schwächen der bekannten Nachweisverfahren verursacht. Zwar werden zahlreiche Methoden propagiert, die mehr oder weniger mit der Schilddrüsenwachstumsstimulation oder mit der Schilddrüsenüberfunktion korrelieren, in vielen Fällen kommen aber positive Ergebnisse vor, die keine klinische Korrespondenz besitzen oder auch laborchemisch negative Befunde, bei denen klinisch das Vollbild einer Struma oder Autoimmunhyperthyreose imponiert. Diese Phänomonologie ist durch die Unspezifität des zum Autoantikörpernachweis verwendeten Antigens zu erklären. Eine Reinisolierung von TSH-Rezeptoren ist schwierig. Die Antikörperbindung an unterschiedlichen Rezeptorstellen bewirkt einen differenzierten funktioneilen Effekt in vivo, der sich durch den in vitro-Bindungsnachweis nicht diskriminieren läßt. Gerade für die Differentialdiagnose der Hyperthyreosen oder des Strumenwachstums, die für die Entscheidung einer differentialtherapeutischen Strategie unabdingbare Voraussetzung ist, muβ ein sicherer Diagnostikparameter gefordert werden. Der Autoantikörper muß nicht nur qualitativ spezifisch erfaßt werden können, sondern muß insbesondere auch quantitativ meßbar und damit zum Ausmaβ der in vivo Funktionsstörung relativierbar sein.

Die therapeutische Beeinflussung von Schilddrüsenerkrankungen erfolgt bisher durch Behandlung mit Thyreostatika. Eine Therapie auf immunologischer Basis ist bisher nicht bekannt. Die bisher üblichen Behandlungsmethoden sind mit Nachteilen behaftet, insofern, als erhebliche Nebenwirkungen, wie Schädigung des Blutbilds und schwere allergische Reaktionen nicht selten vorkommen. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, diese Nachteile zu beseitigen und Verfahren und Reagentien zu schaffen, welche einen raschen und einfachen Nachweis von Autoimmunerkrankungen ermöglicht und Arzneimittel zur Verfügung zu stellen zur wirksamen Behandlung der Autoimmunerkrankungen.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zum Nachweis sowie ein Verfahren zur Therapie von Autoimmunerkrankungen, welche dadurch gekennzeichnet sind, daß man mindestens einen paratypischen Antikörper verwendet. Bei den Autoimmunerkrankungen handelt es sich dabei im wesentlichen um die vorstehend genannten Formen. Es handelt sich dabei um antiparatypische Antikörper, die gegen autoreaktive Zellen und Autoantikörper gerichtet sind.

Im Fall der Schilddrüsenerkrankungen handelt es sich insbesondere um antiparatypische Antikörper, die gegen die klinisch relevanten Epitope von Antikörpern gegen Thyreoglobulin, der Schilddrüsenmikrosomen oder des TSH-Rezeptors gerichtet sind.

Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren beruht auf der überraschenden Feststellung, daß man Antikörper gewinnen kann, die eine so hohe Selektivität aufweisen, daß damit eine Nachweismethode zur Verfügung gestellt werden kann, durch welche die Prognose der Behandlung bezüglich der Therapiedauer und -dosis und Remissionserwartung bei Schilddrüsenerkrankungen auch bei Verwendung von Thyreostatika, kalkulierbar wird.

Die neuen, für den Nachweis und die therapeutische Behandlung der Schilddrüsenerkrankungen verwendeten Antikörper lassen sich erfindungsgemäß erhalten, dadurch, daß man Autoantikörper entweder an Schilddrüsenzellmembranen oder an TSH-Rezeptoren, die in der herkömmlichen Weise durch Membranfraktionierung gewonnen werden, adsorbiert und anschließend diese Antigen-Antikörperkomplexe sprengt. Die Reinigung der Antikörper erfolgt nach Methoden wie Ultrazentrifugation über Dichtegradienten, Elektrophorese und HPLC. Die selektionierten Antikörperfraktionen werden zur Immunisierung eingesetzt. Aus den Milzzellen der sensibilisierten Tiere wird durch Fusionierung mit Mäusemyelomzellen ein monoklonaler antiparatypischer Antikörper gewonnen, dessen Spezifität in der paratypischen-antiparatypischen Reaktion im wesentlichen durch TSH-Verdrängung an seinen spezifischen Rezeptor und/oder den Rezeptorantikörper an seine funktioneile Bindungsstelle nachgewiesen wird. Ein weiterer Spezifitätstest ist ein Verdrängungsassay, in dem monoklonale zum Sensibilisieren verwendete Ausgangsantikörper an eine feste Phase gekoppelt worden.

In einem anderen Verfahren werden Antigensensibilisierte Lymphozyten über eine Rosettentechnik (Hammelerythrozyten mit fixiertem TSH) isoliert und zur Fusionierung mit menschlichen Myelomzellen eingesetzt. Nach Hybridisierung werden die dadurch gewonnenen einzelnen monoklonalen Antikörper bezüglich ihrer funktioneilen Eigenschaften an Thyreozyten-Monolayerkulturen für den weiteren Gebrauch getestet.

Bei den oben erwähnten Immunisierungen wird das Immunogen beispielsweise in Kombination mit einem Adjuvans in üblicher Weise verabreicht. Bevorzugt wird als Adjuvans Aluminiumhydroxid zusammenmit Bordatella pertussis oder Freund'schem Adjuvans eingesetzt. Die Immunisierung erfolgt vorzugsweise über mehrere Wochen mit mindestens vier Immunisierungen in 2-3wöchigem Abstand (Injektion intraperitoneal). Aus so immunisierten Tieren werden B-Lymphozyten gewonnen, die mit einer permanenten Myelomzellinie fusioniert werden. Die Fusionierung erfolgt nach dem bekannten Verfahren von Köhler und Milstein. Die hierbei gebildeten Primärkulturen von Hybridzellen werden in üblicher Weise, z. B. unter Verwendung eines handelsüblichen Zellsorters oder durch "limiting dilution" kloniert.

Für diese Bestimmungsverfahren können die monoklonalen Antikörper als solche oder Fragmente hiervon, welche die entsprechenden immunologischen Eigenschaften aufweisen, beispielsweise Fab-Fragmente, verwendet werden. Unter dem Begriff "monoklonale Antikörper" werden daher sowohl die vollständigen Antikörper als auch die Fragmente verstanden. Die erfindungsgemäßen Antikörper eignen sich hervorragend dazu, in Form eines Reagenzes in einer Probe, beispielsweise Serum oder Plasma, Schilddrüsenerkrankungen nachzuweisen. Die Testdurchführung erfolgt nach der ELISA- oder RIA-Technik. Im Rahmen dieses Reagenzes kann der monoklonale Antikörper, sowohl in kompletter als auch in Form der Fragmente, auch auf einem festen Träger fixiert vorliegen, beispielsweise auf immunosorptivem Papier oder der Oberfläche von Kunststoffröhrchen bzw. -schlauchen.

Zur Herstellung von Arzneimitteln werden die Antikörper in an sich bekannter Weise mit geeigneten pharmazeutischen Trägersubstanzen, Aroma-, Geschmacks- und Farbstoffen gemischt und beispielsweise als Tabletten oder Dragees ausgeformt oder unter Zugabe entsprechender Hilfsstoffe in Wasser oder Öl, wie z. B. Olivenöl, suspendiert oder gelöst.

Die Antikörper können in flüssiger oder fester Form oral und parenteral appliziert werden. Als Injektionsmedium kommt vorzugsweise Wasser zur Anwendung, welches die bei Injektionslösungen üblichen Stabilisierungsmittel, Lösungsvermittler und/oder Puffer enthält. Derartige Zusätze sind z. B. Tartrat- oder Borat-Puffer, Ethanol, Dimethylsulfoxid, Komplexbildner (wie Ethylendiamintetraessigsäure), hochmolekulare Polymere (wie flüssiges Polyethylenoxid) zur Viskositätsregulierung oder Polyethylen-Derivate von Sorbitanhydriden.

Feste Trägerstoffe sind z. B. Stärke, Lactose, Mannit, Methylcellulose, Talkum, hochdisperse Kieselsäure, höhermolekulare Fettsäuren (wie Stearinsäure), Gelatine, Agar-Agar, Calciumphosphat, Magnesiumstearat, tierische und pflanzliche Fette oder feste hochmolekulare Polymere (wie Polyethylenglykole). Für die orale Applikation geeignete Zubereitungen können gewünschtenfalls Geschmacks- und Süßstoffe enthalten.

Als Tracer der antiparatypischen Antikörper kommen Zytostatika, Komplement und Isotopen in Frage. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel sind nach Applikation zielsicher in der Lage, die entsprechenden autoreaktiven Lymphozyten zu erkennen und spezifisch diese Klone zu blockieren.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

A) Nachweis der Immunregulation am Thyreoglobulinantikörper und TSH-Rezeptorantikörper-Mode11

a) Es wurde festgestellt, daß Patientenseren mit hohen Schilddrüsenantikörper-Titern nach 1:1-Mischung mit einem Serum desselben Patienten mit einem niedrigen Antikörperspiegel, die mit der Haemagglutinationstechnik ermittelt werden, nach erneuter Bestimmung mit dieser Methode weit unter dem zu erwartenden arithmetischen Mittel liegen. Daraus ergibt sich, daß die Seren mit niedrigen Antikörper-Titer im Krankheitsverlauf antiidiotypische Antikörper gebildet haben, die nach Mischen des Serums zu einem Zeitpunkt mit einem hohen Thyreoglobulinantikörperspiegel eine idiotypische-antiidiotypische Bindung mit diesem Thyreoglobulinantikörper eingehen. Dadurch wird der freie Antikörpergehalt aus dem Serum mit den hohen Thyreoglobulinantikörperkonzentrationen reduziert und steht für die nachfolgende Reaktion in der Haemagglutinationstechnik nicht mehr zur Verfügung.

b) Zum Ausschluß einer Interferenz mit Thyreoglobulin-Antigen in dem Serum mit niedrigen Thyreoglobulin-Antikörper-Titern, das ebenfalls zu einer Reduktion freier Thyreoglobulin-Antikörper im Serum mit den hohen Thyreoglobulin-Antikörpertitern führen kann, wurden Agargel-Diffusionsmethoden durchgeführt. Zunächst wurde mittels einer Ouchterlonytechnik Thyreoglobulin in verschiedenen Konzentrationen dem Agargel beigesetzt. In die gestanzten Löcher wurden Thyreoglobulin-Antikörperhaltige Seren der Patienten und Thyreoglobulin-Antikörper-negative Seren eingefüllt. Gegenüber Thyreoglobulinantikörper-positiven Seren fanden sich Präzipitationsringe. In einem weiteren Ansatz wurde dem Agargel über Säulen gereinigtes humanes Thyreoglobulin-Antikörper-haltiges Serum zugefügt. Als Reaktionsproben wurden diesmal Thyreoglobulin-haltiges Humanserum, Thyreoglobulin und Thyreoglobulinantikörper-negative Kontrollseren sowie Thyreoglobulinantikörper-positive Seren in die Vorlagen eingefüllt. Präzipitationsringe erschienen in diesem Versuch bei den mit Thyreoglobulin versetzten Humanseren sowie bei einigen Patienten mit Thyreoglobulinantikörper-haltigen Seren in niedriger Konzentration, die durch irhohe Anti-Tg gendeinen Zeitpunkt der Erkrankung vorher autoimmunologische

Aktivität aufgewiesen hatten. Dieses Resultat weist auf die

Bildung entweder einer Thyreoglobulinantikörper-Thyreoglobulinverbindung bzw. Thyreoglobulinantikörper-antiidiotypische

Verbindung hin.

In einem dritten Experiment wurden sowohl eine Antikörperfällung und säulenchromatographische Reinigung der mit

Thyreoglobulin versetzten Seren als auch mit Tg-AK positiven Seren durchgeführt. Die so präparierten Proben wurden erneut in ein Thyreoglobulin-Antikörper-haltiges Agargel-Gemisch eingesetzt. Diesmal trat lediglich ein Präzipitationsring bei den Seren auf, denen Thyreoglobulin zugesetzt wurde. Das Verschwinden der zunächst positiven Reaktion im zweiten Ansatz einiger Patientenseren, die einen niedrigen Thyreoglobulinantikörperspiegel aufweisen, nach Immunglobulinextrakt ion weist auf eine idiotypische-antiidiotypische Thyreoglobulinantikörperreaktion hin.

Um diese idiotypische-antiidiotypische Bindung näher zu charakterisieren, wurden zahlreiche Lymphozytenkulturen von den Patienten, die offensichtlich antiidiotypische Thyreoglobulinantikörper entwickelt hatten, angesetzt. Die Lymphozyten wurden in einen sterilen Brutschrank mit Pokeweedmitogen und LPS über 14 Tage zur Antikörperproduktion angeregt. In einem anderen Ansatz wurden Lymphozyten nach Rosettenbildung an tannierten Schafserythrozyten, die mit Thyreoglobulinantikörpern behaftet wurden, durch Dichtezentrifugation isoliert und ebenfalls mit B-Zell-Stimulatoren zur Antikörperproduktion über 14 Tage kultiviert. Bei drei Patienten aus der nicht-selektionierten Lymphozytenkultur sowie in sechs Ansätzen bei Patienten-Lymphozyten, die über die Rosettenbildung isoliert werden konnten, wurde im Medium mit der RIA- und ELISA-Technik Thyreoglobulin nachgewiesen, das nach erneuter Immungglobulinextraktioaegativ war. Ein mit Thyreoglobulin versetztes Kontrollmedium aus dem ebenfalls eine Immunglobulinelimination durchgeführt wurde, blieb Thyreoglobulin-positiv. Diese Untersuchungen weisen auf das Auftreten und die Produktion antiparatypischer Thyreoglobulinantikörper der Patientenlymphozyten im Humansystem hin.

TSH-Rezeptorautoantikörper wurden zunächst üblicherweise mit dem Radio-Ligandentest ermittelt. Um Auskunft über ihre funktionelle Bedeutung zu erlangen, wurde im nu/nu Maus-System nach Transplantation von Schilddrüsen-Operationspräparaten die Wachstumsstimulation über den ³H-Thymidin-Einbau im Thyreozytenkern und die hormoneile Aktivität über den Jod-up-take sowohl morphologisch anhand von autoradiographischen Untersuchungen als auch quantitativ durch die Szintillation im Bohrloch ermittelt. Diese Untersuchungen weisen auf die überwiegend heterogene Antigenbindung der polyklonalen Antikörper am TSH-Rezeptor hin, die in keinem Falle eine Korrelation zur Höhe des Meßwertes im Radio-Ligandentest stand.

Wurden die Basedow- Immunglobuline analog zu den Thyreoglobulinantikörper-Untersuchungen im Individuum 1:1 vermischt und zwar mit Proben, die zu einem Zeitpunkt hoher autoimmunologischer Aktivität und im späteren Krankheitsverlauf deutlich niedriger Aktivität gewonnen wurden, so ließ sich diesmal im Radio-Ligandentest ein Antikörpertiter ermitteln, der im wesentlichen dem arithmetischen Mittel dieses Gemischs entsprach. Im Stimulationsversuch im nu/nu Maus-assay jedoch lagen nach den Kriterien der Beurteilung der Kernvolumengröβe die vermischten Basedow-Immunglobulinpräparationen innerhalb der Werte der negativen Kontrollseren, während die Verwendung der orginären Antikörperpräarationen einzeln eine de Klinik entsprechenden Funktionskorrelation aufwiesen. Diese Ergebnisse beweisen ebenfalls das Auftreten antiidiotypischer Antikörper in der Remission, die eine idiotypische Blockierung der freien TSH-Rezeptorantikörper in dem hochaktiven Serum bedingen. Diese Reaktion besitzt offensichtlich eine diagnostische Bedeutung, ohne daß die Komplexbildung im Radio-Ligandentest nachweisbar ist.

Die weiterführenden Versuchsansätze dienten zur Charakterisierung und Reinigung der idiotypischen-antiidiotypischen bzw. paratypischen-antiparatypischen Antikörper. Sie erfolgte sowohl über Meerschweinchenfettzellmembran-Präparationen entsprechend der Methode nach Endo und humanen Membranthyreozytenpräparationen entsprechend der Methode nach Smith and Hall durch Säulenabsorption. Die Waschlösung wurde auf eine konstante Immunglobulinkonzentration, die laser-nephelometrisch ermittelt wurde, eingestellt, und in einem Verdrängungsassay wurde die Bindungsabnahme an Rezeptoren von Jod-markiertem TSH gegenüber einer autoantikörpernegativen Probe (Normalassay) als Ausdruck der Verdrängungspotenz antiparatypischer Antikörper verglichen. Die Abweichungen zum Normalassay (= 100 %) betrugen zwischen 15 und 27 %.

Anschließend wurde durch Titration dieser konstanten Antikörperfraktion mit zu den Autorezeptorantikörpern, die diesmal mit Chloramin-T-Jod markiert wurden, auf ähnliche Weise die Bindungsabnahme entsprechend titrierten antiparatypischen Antikörper TSH-Produkten nachgewiesen. Durch die Zugabe dieser antiparatypischen Immunglobuline zu einer konstanten Rezeptorantikörpermenge war sowohl im Bioassay als auch durch die Adenylcyclase-Aktivierung oder T3-Release an Schilddrüsenschnitten und Schilddrüsenzellkulturen konzentrationsabhängig eine Aktivitätsminderung dieser Rezeptorantikörper, teils mehr auf den wachstumsstimulierenden Einfluß bezogen, teils mit Hinblick auf die Hormonstimulation, festzustellen. B) Erzeugung antiparatypischer Antikörperklone

Hierzu wurden zwei Tierexperimente etabliert:

1. je eine Balb-C-Maus-Gruppe wurde mit Freud'schein Adjuvans aufbereiteten humanen TSH-Rezeptorpräparationen und gereinigten TSH-Rezeptorantikörper-Fraktionen sensibilisiert.

a) nach ausreichendem TSH-Rezeptorantikörperanstieg nach 12 Wochen durch mehrmalige Immunisierung wurden die Milz zel len kloniert und hybridis iert nach dem Verfahren von Köhler und Milstein (Nature 256, 1975, S. 495-497). Die Klone wurden verworfen, die positiv gegenüber verschiedenem humanem Gewebe (nicht Schilddrüse) reagierten. Durch zahlreiche Umsetzungen konnten Klone gezüchtet werden, die monoklonale Bindungsaffinität sowohl im Radio-Ligandentest als auch in den für Hormonstimulierung und cüfferent für Thyreozytenwachstun bei beschriebenen Test- systemen in Thyreozytenkulturen und Funktionsassay hervorbracht

b) Immunisierung mit Rezeptorantikörpern führte auf ähnliche

Weise zur Klonierung von monoklonalen. Antikörpern, die aufwiesen eine Bindung an jodmarkiertem TSH aas nach Präzipitation mit Antimaus-Serum im Pellet gecountet werden konnte.

Zur Absicherung, daß hier antiparatypische Antikörper generiert wurden, wurden die monoklonalen Antikörper an Maus-IgG-beschichteten Säulen von möglichen antiidiotypischen Antikörpern befreit.

Durch Zugabe dieser antiparatypischen monoklonalen Antikörper zu den bereits funktionell charakterisierten monoklonalen TSH-Rezeptorantikörpern konnte je nach antiparatypischen Klonen entweder die Hormonstimulierung oder das Thyreozytenwachstum gehemmt werden. Der damit verbundene Nachweis funktioncll unterschiedlicher Antiparatop-Strukturen wurde dazu verwendet, aus polyklonalen Antirezeptor-haltigen Humanseren ihre spezifischen funktionsstimulierenden Antikörpereigenschaften zu. charakterisieren. Dazu wurden die jeweiligen antiparatypischen Antikörper an Mikrotiterplatten "gecoated". mit den Serumproben des Patienten inkubiert, gewaschen und in Form eines ELISA-Systems mit einem konjugierten Antihumanantikörper, im Assay spezifische Bindung nachgewiesen. Zur quantitativen Ermittlung des Autoantikörpergehaltes wurden vergleichende Untersuchungen mit einem monoklonalen TSH-ELISA-Test durchgeführt, wobei die Bindungsaktivität dieses monoklonalen Antikörpers in Äquivalenz zur Bindung des antiparatypischen Antikörpers mit dem Paratyp des Rezeptorantikörpers gesetzt wurde.

Eine andere direkte quantifizierbare Meßvariante stellte die Bindungsfähigkeit von bekannten b-TSH-Konzentrationen an die antiparatypischen Antiörper dar, auf die dann die Bindung der Auto-Antikörper bezogen werden konnte(Maßeinheit: TSH-Bindungsaequivalente).

Die gefundenen Autoantikörper in diesem RIA-System korrelier sehr gut mit dem klinischen Erscheinungsbild und der Aktivität der jeweiligen Erkrankung. Damit liegt ein Assay-System vor, das sowohl eine Möglichkeit zur qualitativen Differenzierung von TSH-Rezeptorantikörpern erlaubt, als auch Krankheitsspezifität und Korrelationen zur Krankheitsaktivität aufweist.

Die Gewinnung dieser antiparatypischen Antikörper, die einen hohen funktioneilen Differenzierungsgrad besitzen, können nach entsprechender Markierung zu spezifischen Eliminationen der aetiologisch relevanten durch den antiparatypischen ELISA-Assay aufgedeckten Lymphozytenklone verwendet werden, wie entsprechende tierexperimentelle Untersuchungen zeigen.

2. Die paratypischen Antikörper wurden in einem modifizierten System gewonnen. Meerschweinchen wurden mit TSH-Rezeptoren, welche mit Freud'schem Adjuvans aufbereitet wurden, immunisiert. Die TSH-Rezeptorantikörperaktivität wurde wiederum im Radio-Ligandentest und funktionell nachgewiesen. Nach Erreichen eines angemessenen Antikörperspiegels nach ca. 12 Wochen wurden die Tiere entblutet und die Antikörp er fr akti on und Meerschweinchen gegenüber Humangewebe nicht Schilddrüse) adsorbiert. Die von humanen Thyreozyten getrennten Rezeptorantikörper wurden für die weitere Immunisierung im Balb-C-Modell verwendet. Nach wiederholter Boosterung wurde die Bindungsfähigkeit der Maus-Immunglobuline an TSH geprüft. Analoge Studien folgten im Bioassay und im Radio-Ligandentest durch die Fähigkeit dieses Antikörpers, TSH von seinen Funktionseinheiten zu inhibieren.

Nach ca. 8 Wochen wurden die Milzzellen erneut mit Mäusemyelomzellen hybridisiert und bis zur Entlimitierung kloniert. Die dadurch ermittelten monoklonalen Antikörper, diekeine Bindung gegenüber Kaninchenimmunglobulin aufwiesen, wurden auf ihre antigenspezifische Reaktion untersucht. Dabei kam erneut der Verdrängungsversuch von markierten TSH an TSH-Rezeptor zum Einsatz. Weiterhin wurde die funktioneile Aktivität dieser Antikörper durch ihre Fähigkeit, TSH in den Funktions- und Bioassays zu verdrängen, geprüft. In diesem Zusammenhang konnte durch die Inhibierung der minimalen TSH-Konzentration bei einer konstanten Immunglobulinmenge eine der TSH-Verdrängung entsprechende Einheit festgelegt werden (Verdrängung % TSH). Damit war eine Quantifizierung dieses Meß-systems möglich.

Auch hier konnte der polyklonale Patientenrezeptorantikörper durch unterschiedliche antiparatypische AK auf den Monoclones quantifizierbar in TSH-Verdrängungseinheiten im Hinblick auf seinen funktioneilen Angriffspunkt gemessen werden.

Die auf diese Weise provozierten monoklonalen Antikörper wurden in gleicher Weise zu einem ELISA-System ausgebaut, das eine sichere Erkennung unterschiedlicher TSH-Rezeptorautoantikörper-Spezifitäten sowohl qualitativ als auch quantitativ erkennen läßt. Durch Antikörperabsorption an Augenmuskelgewebe oder Retroorbitalgewebe und anschließender Immunglobulinseparierungkann durch eine Sensibilisierung tierexperimentell ein Antikörper hergestellt werden, der analog zu den Vorexperimenten zum TSH-Rezeptorantikörper und antiparatypischen Antikörper durch antiparatypische-paratypische Bindung Ophthalmopathie-Antigenspezifität aufweist.

Dieser in Analogieschritten erzeugte antiparatypische Antikörper kann in gleicher Weise therapeutisch und diagnostisch angewendet werden.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Nachweis von Autoimmunerkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein antiparatypischer Antikörper verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die antiparatypischen Antikörper gegen autoreaktive Zellen gerichtet sind.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die antiparatypischen Antikörper gegen Lymphozyten mit Antikörper-Rezeptoren gerichtet sind.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Autoimmunerkrankungen um die Formen autoimmune Schilddrüsenerkrankungen, Diabetes mellitus Typ I, Myasthenia gravis, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, autoimmune Hepatitis, Autoimmunerkrankungen des hämopoetischen Systems, Uveitis, Immunvaskulitiden, autoimmune Nephropathien, generalisierte Autoaggressionserkrankungen wie Kollagenosen und andere Bindegewebserkrankungen handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Schilddrüsenerkrankungen um Autoimmunhyperthyreosen oder um Autoimmunorbithopathien handelt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die antiparatypischen Antikörper gegen die klinisch-relevanten Epitope von Antikörpern des Thyreoglobulins, der Schilddrüsenmikrosomen oder des TSH-Rezeptors gerichtet sind.

7. Reagenz zum Nachweis von Autoimmunerkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens einen antiparatypischen Antikörper enthält.

8. Reagenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die antiparatypischen Antikörper gegen autoreaktive Zellen gerichtet sind.

9. Reagenz nach einem der Ansprüche 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß die antiparatypischen Antikörper gegen Lymphozyten mit Antikörper-Rezeptoren gerichtet sind.

10. Reagenz nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Autoimmunerkrankungen um die Formen autoimmune Schilddrüsenerkrankungen, Diabetes mellitus Typ I, Myasthenia gravis, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, autoimmune Hepatitis, Autoimmunerkrankungen des hämopoetischen Systems, Uveitis, Immunvaskulitiden, autoimmune Nephropathien, generalisierte Autoaggressionserkrankungen wie Kollagenosen und andere Bindegewebserkrankungen handelt.

11. Reagenz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Schilddrüsenerkrankungen um Autoimmunhyperthyreosen oder um Autoimmunorbitopathien handelt.

12. Reagenz nach einem der Ansprüche IQ und 11, dadurch gekennzeichnet, daß die antiparatypischen Antikörper gegen die klinisch-relevanten Epitope von Antikörpern des Thyreoglobulins, der Schilddrüsenmikrosomen oder des TSH-Rezeptors gerichtet sind.

13. Arzneimittel mit Wirkung gegen Autoimmunerkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens einen antiparatypischen Antikörper enthält.

14. Arzneimittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die paratypischen Antikörper gegen autoreaktive Zellen gerichtet sind.

15. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 13 und 14, dadurch gekenn zeichnet, daß die antiparatypischen Antikörper gegen Lymphozyte mit Antikörperrezeptor gerichtet sind.

16. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Autoimmunerkrankungen um die Formen autoimmune Schilddrüsenerkrankungen, Diabetes mellitus

Typ I, Myasthenia gravis, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, autoimmune Hepatitis, Autoimmunerkrankungen des hämopoetischen Systems, Uveitis, Immunvaskulitiden, autoimmune Nephropathien, generalisiedrte Autoaggressionserkrankungen wie Kollagenosen und andere Bindegewebserkrankungen handelt.

17. Arzneimittel nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Schilddrüsenerkrankungen um Autoimmunhyperthyreosen oder um Autoimmunorbitopathien handelt.

18. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 16 und 17, dadurch gekenn zeichnet, daß daß die antiparatypischen Antikörper gegen die klinisch-relevanten Epitope von Antikörpern des Thyreoglobulins, der Schilddrüsenmikrosomen oder des TSH-Rezeptors gerichtet sind.

19. Verwendung der von einem oder mehreren antiparatypischen Antikörpern zur Herstellung von Arzneimitteln gemäß einem der Ansprüche 13 bis 18

20. Antiparatypische Antikörper, die gegen autoreaktive Zellen gerichtet sind.

21. Antiparatypische Antikörper nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie gegen Lymphozyten mit Antikörper-Rezeptoren gerichtet sind.

22. Antiparatypische Antikörper, die gegen die klinisch-relevanten Epitope von Antikörpern des Thyreoglobulins, der Schilddrüsenmikrosomen oder des TSH-Rezeptors gerichtet sind.

23. Antiparatypische Antikörper, erhältlich durch folgende Verfahrensschritte

a) Sensibilisierung je einer Balb-C-Maus-Gruppe mit einer durch Freundsches Adjuvans aufbereiteten humanen TSH-Rezeptorpräparation und gereinigten TSH-Rezeptorantikörper-Fraktionen,

b) mehrmalige Immunisierung nach ausreichendem TSH-Rezeptorantikörper- und Arcti-TSH Rezeptor-antikörperanstieg, Klonierung und Hybridisierung nach Köhler und Milstein,

c) Verwerfung der Klone, die positiv gegenüber humanen Nicht-Schilddrüse-Geweben reagieren,

d) Züchtung der Klone, die monoklonale Bindungsaffinität sowohl im Radio-Ligandentest als auch in den für Hormonstimulierung und Differenz für Thyreozytenwachstum umschriebenen Testsystemen in Thyrerozytenkulturen hervorbringen,

e) Befreiung der erhaltenen monoklonalen Antikörper von antiidiotypischen Antikörpern an Maus-IgG-beschichteten Säulen.