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JP7630176B2 - 操作されたカプシドを有するアデノ随伴ウイルス - Google Patents

操作されたカプシドを有するアデノ随伴ウイルス Download PDF

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Description

発明の分野
本開示は、一般的にアデノ随伴ウイルスベクターによる遺伝子治療に関する。特に本開示は、操作されたカプシドタンパク質を有する組換えアデノ随伴ウイルスビリオンに関する。
関連出願の相互参照
本出願は、その開示が全ての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年３月２日に出願された米国仮特許出願第６２／９８４，１９７号および２０１９年４月１日に出願された米国仮特許出願第６２／８２７，５７６号の優先権の利益を主張する。
配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子出願されており、．ｔｘｔフォーマットで電子提出された配列表を含む。テキストファイルは、２０２０年３月３１日に作製され、サイズ約２，５９０キロバイトの「ＴＥＮＡ＿０１２＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題する配列表を含有する。このテキストファイルに含有される配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
背景
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子治療および他の生物医学応用にとって有望である。特に、ＡＡＶを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で様々な組織および細胞に遺伝子産物を送達することができる。ＡＡＶのカプシドタンパク質は、主にＡＡＶベクターの免疫原性および指向性を決定する。
一部の組織に関して、ＡＡＶサブタイプ５（ＡＡＶ５）は、ヒト集団におけるＡＡＶ５に対する中和抗体の発生率が低いことから好ましいＡＡＶベクターである。しかしＡＡＶ５は、他のＡＡＶサブタイプより心組織を形質導入する効率が低い。加えて、異なる細胞タイプの選択的形質導入が望ましいが、達成することは難しい。例えば一部の応用では、心臓の筋細胞ではなくて心臓線維芽細胞の形質導入が望ましい場合もあれば、その逆が望ましい場合もあり得る。本開示は、野生型ＡＡＶ５カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンより効率的および／または選択的に心組織および／または細胞タイプを形質導入することが可能なｒＡＡＶビリオンを形成するＡＡＶ５カプチドのバリアントを提供する。
開示の概要
一態様では、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、親ＡＡＶ５カプシドと比較して、Ｓ６５１Ａ、Ｓ６５１Ｇ、Ｓ６５１Ｖ、Ｓ６５１Ｌ、Ｓ６５１Ｉ、Ｔ５７８Ａ、Ｔ５７８Ｇ、Ｔ５７８Ｖ、Ｔ５７８Ｌ、Ｔ５７８Ｉ、Ｔ５８２Ａ、Ｔ５８２Ｇ、Ｔ５８２Ｖ、Ｔ５８２Ｌ、またはＴ５８２Ｉから選択される１つまたは複数の置換を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質と、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、ｒＡＡＶビリオンを提供する。
別の態様では、本開示は、親ＡＡＶ５カプシドと比較してＳ６５１ＡまたはＳ６５１Ｖ；Ｔ５７８ＡまたはＴ５７８Ｖ；またはＴ５８２ＡもしくはＴ５８２Ｖから選択される１つまたは複数の置換を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、親配列のＧＨループにおける挿入部位に親配列に対して５～１１アミノ酸の挿入を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質と、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む（com/prising）異種核酸とを含む、ｒＡＡＶビリオンを提供する、
別の態様では、本開示は、親配列のＧＨループにおける挿入部位に親配列に対して５～１１アミノ酸の挿入を含む、ＡＡＶ５カプシドタンパク質を提供する。
さらなる態様では、本開示は、ＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、カプシドタンパク質が親配列のＧＨループにおける挿入部位に親配列に対して５～１１アミノ酸の挿入を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
さらなる態様では、本開示は、親配列のＧＨループにおける挿入部位に親配列に対して５～１１アミノ酸の挿入を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質と、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含むｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物を提供する。
さらなる態様では、本開示は、心臓細胞を形質導入する方法であって、心臓細胞に、本開示のｒＡＡＶビリオンを接触させるステップを含み、ｒＡＡＶビリオンが心臓細胞を形質導入する、方法を提供する。
さらなる態様では、本開示は、心臓細胞に１つまたは複数の遺伝子産物を送達する方法であって、心臓細胞に本開示のｒＡＡＶビリオンを接触させるステップを含み、心臓細胞が遺伝子産物を発現する、方法を提供する。
さらなる態様では、本開示は、それを必要とする対象における心病態を処置する方法であって、本開示のｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含み、ｒＡＡＶビリオンが心組織を形質導入する、方法を提供する。
さらなる態様では、本開示は、ｒＡＡＶビリオンに、標的細胞において形質導入効率の増加をもたらすＡＡＶカプシドタンパク質を同定する方法であって、ｒＡＡＶビリオンの集団を提供するステップであって、そのｒＡＡＶゲノムがバリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードするｃａｐポリヌクレオチドのライブラリーを含む、ステップ；ｒＡＡＶビリオンによる標的細胞へのｃａｐポリヌクレオチドの形質導入を可能にするために十分な期間、集団に標的細胞を接触させるステップ；および標的細胞からｃａｐポリヌクレオチドをシーケンシングし、それによって標的細胞において形質導入効率の増加をもたらすＡＡＶカプシドタンパク質を同定するステップを含む、方法を提供する。
図１は、人工多能性幹細胞由来心筋細胞（ｉＰＳＣ－ＣＭ）に関する初回の負の選択ステップの後に、ヒト心臓線維芽細胞（ｈＣＦ）に関する正の選択ステップを組み入れるライブラリースクリーニング戦略の実施形態を示す。
図２Ａ～２Ｂは、ＡＡＶ５ランダムペプチドディスプレイライブラリーの生成およびＡＡＶ５の結晶構造上へのマッピングを示す。図２Ａは、３’および５’末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に挟まれたＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子（「Ｒｅｐ２」）およびＡＡＶのｃａｐ遺伝子（「Ｃａｐ５」）を含むＡＡＶゲノムの概略図を示す。本実施形態では、アラニン残基に挟まれたランダム７量体ポリペプチドライブラリー（ＡＸＸＸＸＸＸＸＡ；配列番号１００）が表示のように５７５位に挿入される。図２Ｂは、ＡＡＶ５カプシドの構造を示す。ポリペプチドライブラリーのおおよその挿入部位（示されるカプシドタンパク質の６０コピーのうちの１つにおける）を黒色矢印によって示す。
図３Ａ～３Ｄは、各スクリーニングラウンド後のライブラリー複雑度を可視化し、読み取りデータの総数およびユニークペプチドである読み取りデータのパーセンテージを報告する。各バリアントを、ペプチド配列の疎水性に基づいて異なる濃淡の灰色によって表し、画像における各ピクセルは、ライブラリーにおける単一の読み取りデータを表し、同じ配列の他の読み取りデータとクラスターを形成する。富化の増加は、親ライブラリー（図３Ａ）と比較して、ラウンド１後（図３Ｂ）、ラウンド２後（図３Ｃ）、またはラウンド３後（図３Ｄ）での読み取りデータの過剰（すなわち、ユニークペプチドである読み取りデータのパーセンテージの減少）に基づいて明白である。
図４Ａ～４Ｄは、ライブラリースクリーニング戦略を使用して同定された様々なｒＡＡＶビリオンのｈＣＦ細胞に関する形質導入効率を示す。図４Ａは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポータートランスジーンをパッケージングした非改変ＡＡＶ５（一番右側の棒グラフ）に対して基準とする１５個のＡＡＶ５バリアントの形質導入効率を示す。ｈＣＦを、ゲノム感染多重度（ＭＯＩ）１００，０００で感染させ、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（商標）細胞イメージングマルチモードリーダーを使用して定量した。代表的な蛍光画像を、非改変ＡＡＶ５（図４Ｂ）またはＡＡＶ５．ＣＲ１７（図４Ｃ）のいずれかで形質導入したｈＣＦに関して示す。図４Ｄは、ＭＯＩ １，０００での非改変ＡＡＶ５対ＡＡＶ．ＣＲ１７の形質導入効率を示す。
図５Ａ～５Ｄは、ライブラリースクリーニング戦略を使用して同定された様々なｒＡＡＶビリオンのｉＰＳ－ＣＭ細胞に関する形質導入効率を示す。図５Ａは、ＧＦＰレポータートランスジーンをパッケージングした非改変ＡＡＶ５（最も右側の棒グラフ）に対して基準とする１５個のＡＡＶ５バリアントの形質導入効率を示す。ｈＣＦを、ゲノム感染多重度（ＭＯＩ）１００，０００で感染させ、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５（商標）細胞イメージングマルチモードリーダーを使用して定量した。代表的な蛍光画像を、非改変ＡＡＶ５（図５Ｂ）またはＡＡＶ５．ＣＲ２３（図５Ｃ）のいずれかで形質導入したｈＣＦに関して示す。図５Ｄは、ＭＯＩ １００，０００での非改変ＡＡＶ５対ＡＡＶ．ＣＲ２３の形質導入効率を示す。
図６Ａ～６Ｅは、ＡＡＶ５．ＣＲ１７が、初代マウス心臓線維芽細胞（ｍＣＦ）において改善された形質導入効率を有することを実証する。ｍＣＦに、ＡＡＶ５．ＣＡＧ－ＧＦＰまたはＡＡＶ５．ＣＲ１７．ＣＡＧ－ＧＦＰのいずれかを高い（１００，０００）、中等度（１０，０００）、または低い（１，０００）ＭＯＩで感染させた。感染の７２時間後、形質導入をフローサイトメトリーを使用して評価した。図６Ａは、「総ＧＦＰ」および「高ＧＦＰ」集団のヒストグラムおよびゲーティングを示す。非改変ＡＡＶ５と比較してＡＡＶ５．ＣＲ１７をＭＯＩ １０３、１０４、または１０５で細胞に形質導入した場合、増加したパーセントＧＦＰ＋（図６Ｂ）およびＧＦＰ強度（図６Ｃ）が「総ＧＦＰ」集団において観察された。非改変ＡＡＶ５と比較してＡＡＶ５．ＣＦ１７をＭＯＩ １０３、１０４、または１０５で細胞に形質導入した場合、増加したパーセントＧＦＰ＋（図６Ｄ）およびＧＦＰ強度（図６Ｅ）が、「高ＧＦＰ」集団において観察された。 図６Ａ～６Ｅは、ＡＡＶ５．ＣＲ１７が、初代マウス心臓線維芽細胞（ｍＣＦ）において改善された形質導入効率を有することを実証する。ｍＣＦに、ＡＡＶ５．ＣＡＧ－ＧＦＰまたはＡＡＶ５．ＣＲ１７．ＣＡＧ－ＧＦＰのいずれかを高い（１００，０００）、中等度（１０，０００）、または低い（１，０００）ＭＯＩで感染させた。感染の７２時間後、形質導入をフローサイトメトリーを使用して評価した。図６Ａは、「総ＧＦＰ」および「高ＧＦＰ」集団のヒストグラムおよびゲーティングを示す。非改変ＡＡＶ５と比較してＡＡＶ５．ＣＲ１７をＭＯＩ １０３、１０４、または１０５で細胞に形質導入した場合、増加したパーセントＧＦＰ＋（図６Ｂ）およびＧＦＰ強度（図６Ｃ）が「総ＧＦＰ」集団において観察された。非改変ＡＡＶ５と比較してＡＡＶ５．ＣＦ１７をＭＯＩ １０３、１０４、または１０５で細胞に形質導入した場合、増加したパーセントＧＦＰ＋（図６Ｄ）およびＧＦＰ強度（図６Ｅ）が、「高ＧＦＰ」集団において観察された。
図７Ａ～７Ｈは、心筋梗塞（ＭＩ）を有するおよび有しないＣＤ１マウスにおけるＡＡＶ５およびＡＡＶ５．ＣＲ１７の形質導入プロファイルを示す。非改変ＡＡＶ５は、対照マウス（ＧＦＰ－図７Ａ；ＤＡＰＩ－図７Ｂ）または誘発ＭＩマウス（ＧＦＰ－図７Ｃ；ＤＡＰＩ－図７Ｄ）において心組織の限定的な形質導入を示した。ＡＡＶ５．ＣＲ１７は、対照マウス（ＧＦＰ－図７Ｅ；ＤＡＰＩ－図７Ｆ）および誘発ＭＩマウス（ＧＦＰ－図７Ｇ；ＤＡＰＩ－図７Ｈ）の両方において心組織をより有効に形質導入した。１．２×１０１１ｖｇのＡＡＶ５．ＣＡＧ－ＧＦＰまたはＡＡＶ５．ＣＲ１７．ＣＡＧ－ＧＦＰのいずれかを、心筋内注射を介して６週齢のＣＤ１マウスに注射した。ＧＦＰの強度および分布を、注射後７日に評価した。心筋細胞および線維芽細胞の形質導入の増加が非ＭＩおよびＭＩ動物の両方においてＡＡＶ５．ＣＲ１７によって観察される。全ての心組織切片を２０倍の対物レンズを使用して等しいゲインおよび露光時間でイメージングした。抗ＧＦＰ免疫染色を緑色で示し、ＤＡＰＩブルーによる核の対比染色を青色で示す。 図７Ａ～７Ｈは、心筋梗塞（ＭＩ）を有するおよび有しないＣＤ１マウスにおけるＡＡＶ５およびＡＡＶ５．ＣＲ１７の形質導入プロファイルを示す。非改変ＡＡＶ５は、対照マウス（ＧＦＰ－図７Ａ；ＤＡＰＩ－図７Ｂ）または誘発ＭＩマウス（ＧＦＰ－図７Ｃ；ＤＡＰＩ－図７Ｄ）において心組織の限定的な形質導入を示した。ＡＡＶ５．ＣＲ１７は、対照マウス（ＧＦＰ－図７Ｅ；ＤＡＰＩ－図７Ｆ）および誘発ＭＩマウス（ＧＦＰ－図７Ｇ；ＤＡＰＩ－図７Ｈ）の両方において心組織をより有効に形質導入した。１．２×１０１１ｖｇのＡＡＶ５．ＣＡＧ－ＧＦＰまたはＡＡＶ５．ＣＲ１７．ＣＡＧ－ＧＦＰのいずれかを、心筋内注射を介して６週齢のＣＤ１マウスに注射した。ＧＦＰの強度および分布を、注射後７日に評価した。心筋細胞および線維芽細胞の形質導入の増加が非ＭＩおよびＭＩ動物の両方においてＡＡＶ５．ＣＲ１７によって観察される。全ての心組織切片を２０倍の対物レンズを使用して等しいゲインおよび露光時間でイメージングした。抗ＧＦＰ免疫染色を緑色で示し、ＤＡＰＩブルーによる核の対比染色を青色で示す。
図８Ａ～８Ｅは、表２（配列番号１０１～６００）における上位１００（図８Ａ）の配列、上位５０（図８Ｂ）、上位２０（図８Ｃ）の配列、または表１（図８Ｄ）（配列番号１０１～１１５）に報告されるデータを有する配列に基づく配列モチーフを示す。図８Ｅは、ラウンド３後のライブラリー（配列番号１０１～６００）における配列読み取りデータの数によって重みをつけた、ライブラリーにおける全ての配列読み取りデータに関する配列モチーフを示す。 図８Ａ～８Ｅは、表２（配列番号１０１～６００）における上位１００（図８Ａ）の配列、上位５０（図８Ｂ）、上位２０（図８Ｃ）の配列、または表１（図８Ｄ）（配列番号１０１～１１５）に報告されるデータを有する配列に基づく配列モチーフを示す。図８Ｅは、ラウンド３後のライブラリー（配列番号１０１～６００）における配列読み取りデータの数によって重みをつけた、ライブラリーにおける全ての配列読み取りデータに関する配列モチーフを示す。
図９は、ＡＡＶ５表面露出セリン／スレオニン／リシン／チロシン変異体ベクターが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｈＣＦの形質導入効率の増加を実証することを示す。ｈＣＦ細胞に、遍在的に発現するＧＦＰレポーターをパッケージングするＡＡＶ５－野生型またはＡＡＶ５－変異体ベクターのいずれかを感染させた。ＡＡＶ５カプシドにおける置換Ｓ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、またはＴ５８２Ａは、感染多重度１００，０００ｖｇ／細胞で感染の７２時間後にヒト心臓線維芽細胞形質導入の改善をもたらした。
図１０Ａ～１０Ｃは、ＡＡＶｘ１ベクター（上の線）またはＡＡＶ５ベクター（下の線）のいずれかによるヒト心臓線維芽細胞（ｈＣＦ）の形質導入を示す。図１０Ａは、形質導入された細胞のパーセンテージを示す。図１０Ｂは、ＧＦＰトランスジーンの発現を示す。図１０Ｃは、相対的形質導入を示す（相対的形質導入＝形質導入された細胞（％）×細胞強度）。
図１１は、心臓線維芽細胞（ＣＦ）の細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの相対的形質導入を示す。
図１２は、ＭｙＡ発現カセットを有するＡＡＶｘ１ベクターが％駆出率の動的心エコー検査データ（kinetic echocardiography data）により心筋梗塞に対して有効であることを示す。
図１３は、虚血性損傷を有する処置および無処置ブタの注射後９週間までのパーセント駆出率の変化のグラフを示す。
詳細な説明
本開示は、一般的に（１）選択された表面露出アミノ酸残基での置換；（２）ＧＨループでの挿入；または（３）その両方を有するカプシドタンパク質を有するウイルスベクターとして使用するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンに関する。ｒＡＡＶビリオンは、これらの置換および／または挿入を有しない親カプシドタンパク質を有するｒＡＡＶビリオンと少なくとも同様にまたはそれより良好に心組織、例えば心臓線維芽細胞を形質導入し得る。
本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する。特に、本開示は、新規カプシドタンパク質、それらを同定する方法、およびそれらを使用する方法を提供する。本明細書に開示される新規カプシドタンパク質を同定する方法は、ハイブリッドカプシドタンパク質を含む任意の血清型のＡＡＶに関して広い適用性を有する。加えて、それらは、この方法および他の方法からの変異を有するカプシドタンパク質を繰り返し改善するために適用することができる。一般的に、本開示の方法は、ｃａｐ遺伝子ポリヌクレオチドの形態でのＡＡＶカプシドの無作為化または半無作為化ライブラリーの調製、そのようなカプシドを含むＡＡＶビリオンの調製（ｃａｐ遺伝子ライブラリーをＡＡＶゲノムに組み込むことによって、またはパッケージング系にトランスフェクトしたプラスミド上などのｉｎ ｔｒａｎｓでそれを提供することのいずれかによって）、ＡＡＶビリオンを正にまたは負に選択すること、およびシーケンシングのためにｃａｐ遺伝子を回収することに関する。一部の実施形態では、回収およびシーケンシングは、ナノポアシーケンシングを含む。他のハイスループットまたは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）法を使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶビリオンは、親配列のＧＨループにおける挿入部位に親配列に対して５～１１アミノ酸の挿入を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質を含む。ｒＡＡＶビリオンは一般的に、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。挿入にとって適した挿入部位は、ＡＡＶ５カプシドの結晶構造に基づくＧＨループのモデリング；フレキシブルな残基の選択；または様々な挿入部位のスクリーニングを含むがこれらに限定されない様々な方法によって決定することができる。挿入は、２つの隣接するアミノ酸残基の間であり得るか、または非隣接残基を選択してもよく、この場合、挿入は１つまたは複数の介在する残基の欠失を引き起こす。
一部の実施形態では、ＡＡＶ５カプシドタンパク質は、合理的に設計された；変異誘発によって導入された；または１つもしくは複数の部位でランダムコドン使用頻度を有する配列のライブラリーを生成することによって無作為化された残基の置換を含む。トランスフェクション効率を調節する例示的な非制限的な置換としては、Ｓ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、またはＴ５８２Ａが挙げられるがこれらに限定されない。置換された残基は、１つまたは複数の挿入部位、例えばＧＨループまたは他のループでの挿入をさらに含むＡＡＶ５カプシドタンパク質に組み込まれ得る。
本開示のカプシドタンパク質は、指向性進化法によって富化されていると同定される任意の挿入を含み、実施例に示されるがこれらに限定されない配列がその後に続く。いかなる特定の挿入部位にも限定されないが、一部の実施形態では、挿入は、ＡＡＶ５カプシドタンパク質（配列番号１）における残基約５７４と５７５との間である。一部の実施形態では、挿入部位は、配列番号１の５６０～５９４に対応する親配列における位置で任意の２つの、必要に応じて隣接するアミノ酸の間である。一部の実施形態では、挿入部位は、配列番号１の５７４および５７５に対応する親配列における隣接するアミノ酸の間である。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３のＮ末端残基を全長のＶＰ１の配列の上に示す。
Figure 0007630176000001
この挿入部位での挿入は、ＶＰ３カプシドタンパク質をＮ末端セグメント（配列番号２）とＣ末端セグメント（配列番号３）とに分割し、これを本明細書において明確にするために別個の配列として開示し、これらは本開示の挿入のいずれかによって連結され得る。一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号１（明確にするために、挿入部位でアライメントにギャップを有する）と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である配列を含む。一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を共有する配列、および配列番号３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を共有する配列を含み、配列番号２および配列番号３は、５～１１アミノ酸の挿入によって連結される。一部の実施形態では、挿入は、配列番号１０１～６００から選択される。一部の実施形態では、配列番号１０１～６００の隣接するアラニン（Ａ）残基は、フレキシブルな残基であるセリン（Ｓ）またはグリシン（Ｇ）などの他の残基によって置換され、隣接するＡ残基は存在しない。
MGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQ
（配列番号２）
SSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL
（配列番号３）
一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号４と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である配列を含み、Ｘは任意のアミノ酸を表す。一部の実施形態では、カプシドタンパク質は配列番号５と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である配列を含み、Ｘは任意のアミノ酸を表す。
Figure 0007630176000002
Figure 0007630176000003
一部の実施形態では、挿入は以下の式：
－Ｘ０－（Ｘ）ｎ－Ｘ１０－
（式中、ｎは５～９であり、Ｘ０およびＸ１０は、各々独立してＡ、Ｓ、Ｇであるか、または存在しない）（配列番号１１０１）
のペプチドである。
一部の実施形態では、挿入は以下の式：
－Ｘ０－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－
（式中、Ｘ０およびＸ８は、各々独立してＡ、Ｓ、Ｇであるか、または存在しない）（配列番号１１０２）
のペプチドである。
一部の実施形態では、挿入は以下の式：
－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ａ－
（式中、Ｘ１は、Ｐ、Ｒ、またはＧであり；Ｘ２は、Ｋ、Ｌ、またはＲであり；Ｘ３は、任意のアミノ酸であり；Ｘ４は、Ｎ、Ｈ、Ｋ、またはＱであり；Ｘ５は、任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてＸ５は、Ｇ、Ｋ、もしくはＳであり；Ｘ６は、任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてＸ６は、ＴもしくはＶであり；Ｘ７は、任意のアミノ酸であり、または必要に応じてＸ７は、ＫもしくはＶである）（配列番号１１０３）
のペプチドである。
一部の実施形態では、挿入は以下の式：
－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ａ－
（式中、Ｘ１は、Ｐ、Ｒ、またはＧであり；Ｘ２は、Ｋ、Ｌ、またはＲであり；Ｘ３は、任意のアミノ酸であり；Ｘ４は、Ｎ、Ｈ、Ｋ、またはＱであり；Ｘ５は、任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてＸ５は、Ｇ、Ｋ、もしくはＳであり；Ｘ６は、任意のアミノ酸であり；Ｘ７は、任意のアミノ酸である）（配列番号１１０４）
のペプチドである。
一部の実施形態では、挿入は以下の式：
－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ａ－
（式中、Ｘ１は、Ｐ、Ｒ、またはＧであり；Ｘ２は、Ｋ、Ｌ、またはＲであり；Ｘ３は、任意のアミノ酸であり；Ｘ４は、Ｎ、Ｈ、Ｋ、またはＱであり；Ｘ５は、任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてＸ５は、Ｇ、Ｋ、もしくはＳであり；Ｘ６は、ＴまたはＶであり；Ｘ７は、任意のアミノ酸である）（配列番号１１０５）
のペプチドである。
一部の実施形態では、挿入は以下の式：
－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ａ－
（式中、Ｘ１は、Ｐ、Ｒ、またはＧであり；Ｘ２は、Ｋ、Ｌ、またはＲであり；Ｘ３は、任意のアミノ酸であり；Ｘ４は、Ｎ、Ｈ、Ｋ、またはＱであり；Ｘ５は、任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてＸ５は、Ｇ、Ｋ、もしくはＳであり；Ｘ６は、ＴまたはＶであり；Ｘ７は、ＫまたはＶである）（配列番号１１０６）
のペプチドである。
一部の実施形態では、Ｘ１からＸ７は、任意のアミノ酸であり、挿入は以下の基準の１つまたは複数によって定義される：Ｘ１は、Ｐ、Ｒ、またはＧであり；Ｘ２は、Ｋ、Ｌ、またはＲであり；Ｘ３は、任意のアミノ酸であり；Ｘ４は、Ｎ、Ｈ、Ｋ、またはＱであり；Ｘ５はＸ５は、Ｇ、Ｋ、またはＳであり；Ｘ６は、ＴまたはＶであり；および／またはＸ７はＸ７は、ＫもしくはＶである（配列番号１１０７）。
一部の実施形態では、挿入は配列番号１０１～６００から選択される。
一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端への順番で、配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％および配列番号３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である配列を有する１つのポリペプチド；配列番号１０１～６００から選択される１つのポリペプチド；ならびに配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％および配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である配列を有する１つのポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端への順番で、配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％および配列番号３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である配列を有する１つのポリペプチド；配列番号１０１～２００から選択される１つのポリペプチド；ならびに配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％および配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である配列を有する１つのポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端への順番で、配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％および配列番号３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である配列を有する１つのポリペプチド；配列番号１０１～１５０から選択される１つのポリペプチド；ならびに配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％および配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である配列を有する１つのポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端への順番で、配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％および配列番号３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である配列を有する１つのポリペプチド；配列番号１０１～１２０から選択される１つのポリペプチド；ならびに配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％および配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である配列を有する１つのポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端への順番で、配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％および配列番号３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である配列を有する１つのポリペプチド；配列番号１０１～１１５から選択される１つのポリペプチド；ならびに配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％および配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である配列を有する１つのポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端への順番で、配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％および配列番号３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である配列を有する１つのポリペプチド；配列番号１０３または１１０から選択される１つのポリペプチド；ならびに配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％および配列番号２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である配列を有する１つのポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号６０１～１１００の１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である配列またはその機能的断片を有するポリペプチドを含み、それから本質的になり、またはそれからなる。
一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号６０１～６１５の１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である配列またはその機能的断片を有するポリペプチドを含み、それから本質的になり、またはそれからなる。
一部の実施形態では、挿入は、ＲＫＶＨＩＥＶ（配列番号８１）、ＲＫＹＱＳＤＬ（配列番号８２）、ＰＬＴＮＴＶＫ（配列番号８３）、ＬＫＹＨＧＰＰ（配列番号８４）、ＲＫＹＱＧＤＭ（配列番号８５）、ＲＫＦＨＳＴＤ（配列番号８６）、ＲＫＨＨＧＬＥ（配列番号８７）、ＰＧＴＮＶＴＫ（配列番号８８）、ＲＫＭＨＭＰＤ（配列番号８９）、ＰＬＫＫＩＶＱ（配列番号９０）、ＰＬＧＫＫＴＳ（配列番号９１）、ＰＲＧＶＫＶＴ（配列番号９２）、ＰＬＡＫＳＫＳ（配列番号９３）、ＰＲＴＫＧＡＶ（配列番号９４）、およびＰＳＧＲＫＡＴ（配列番号９５）から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、挿入は、ＡＲＫＶＨＩＥＶＡ（配列番号１０１）、ＡＲＫＹＱＳＤＬＡ（配列番号１０２）、ＡＰＬＴＮＴＶＫＡ（配列番号１０３）、ＡＬＫＹＨＧＰＰＡ（配列番号１０４）、ＡＲＫＹＱＧＤＭＡ（配列番号１０５）、ＡＲＫＦＨＳＴＤＡ（配列番号１０６）、ＡＲＫＨＨＧＬＥＡ（配列番号１０７）、ＡＰＧＴＮＶＴＫＡ（配列番号１０８）、ＡＲＫＭＨＭＰＤＡ（配列番号１０９）、ＡＰＬＫＫＩＶＱＡ（配列番号１１０）、ＡＰＬＧＫＫＴＳＡ（配列番号１１１）、ＡＰＲＧＶＫＶＴＡ（配列番号１１２）、ＡＰＬＡＫＳＫＳＡ（配列番号１１３）、ＡＰＲＴＫＧＡＶＡ（配列番号１１４）、ＡＰＳＧＲＫＡＴＡ（配列番号１１５）から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、挿入は配列番号１０１～６００のいずれか１つを含む。一部の実施形態では、配列は、配列番号１０１～６００のいずれか１つと比較して多くて１、２、３、または４個のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、挿入は、アミノ酸配列ＰＬＴＮＴＶＫ（配列番号８３）｛クローンＣＲ１７｝、またはＰＬＴＮＴＶＫ（配列番号８３）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む。
一部の実施形態では、挿入は、アミノ酸配列ＰＬＫＫＩＶＱ（配列番号９０）｛クローンＣＲ２３｝、またはＰＬＫＫＩＶＱ（配列番号９０）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む。
一部の実施形態では、挿入は、アミノ酸配列ＡＰＬＴＮＴＶＫＡ（配列番号１０３）｛クローンＣＲ１７｝またはＡＰＬＴＮＴＶＫＡ（配列番号１０３）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む。
一部の実施形態では、挿入は、アミノ酸配列ＡＰＬＫＫＩＶＱＡ（配列番号１１０）｛クローンＣＲ２３｝を含み、挿入は１、２、３、または４個の保存的アミノ酸置換をさらに含む。
一部の実施形態では、挿入は、アミノ酸配列ＰＬＴＮＴＶＫ（配列番号８３）｛クローンＣＲ１７｝を含み、挿入は１、２、３、または４個の保存的アミノ酸置換をさらに含む。
一部の実施形態では、挿入は、アミノ酸配列ＰＬＫＫＩＶＱ（配列番号９０）｛クローンＣＲ２３｝を含み、挿入は１、２、３、または４個の保存的アミノ酸置換をさらに含む。
一部の実施形態では、挿入は、アミノ酸配列ＡＰＬＴＮＴＶＫＡ（配列番号１０３）｛クローンＣＲ１７｝を含み、挿入は１、２、３、または４個の保存的アミノ酸置換をさらに含む。
一部の実施形態では、挿入は、少なくともアミノ酸配列ＡＰＬＫＫＩＶＱＡ（配列番号１１０）｛クローンＣＲ２３｝を含み、挿入は、１、２、３、または４個の保存的アミノ酸置換をさらに含む。
保存的置換は、極性残基での極性残基の置換、非極性残基での非極性残基の置換、疎水性残基での疎水性残基の置換、小さい残基での小さい残基の置換、および大きい残基での大きい残基の置換を含む。保存的置換は、以下の群内の置換をさらに含む：｛Ｓ、Ｔ｝、｛Ａ、Ｇ｝、｛Ｆ、Ｙ｝、｛Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｅ｝、｛Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ｝、｛Ｃ、Ｕ、Ｇ、Ｐ；Ａ｝、および｛Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｗ｝。
形質導入効率は、当技術分野で公知の方法または実施例に記載される方法を使用して決定することができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して心臓細胞において形質導入効率の増加を示す。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、親配列を含むＡＡＶビリオンと比較してヒト心臓線維芽細胞（ｈＣＦ）において形質導入効率の増加を示す。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｈＣＦ細胞において感染多重度（ＭＯＩ）１００，０００で少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５倍の形質転換効率の増加を示す。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｈＣＦ細胞において感染多重度（ＭＯＩ）１００，０００で約２～約１６倍、約２～約１４倍、約２～約１２倍、約２～約１０倍、約２～約８倍、約２～約６倍、約２～約４倍、または約２～約３倍の形質転換効率の増加を示す。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｈＣＦ細胞において感染多重度（ＭＯＩ）１００，０００で少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５倍の形質転換効率の増加を示す。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｈＣＦ細胞において感染多重度（ＭＯＩ）１００，０００で約２０％～３０％、約３０％～４０％、約４０％～５０％、約５０％～８０％、約８０％～１００％、約１００％～１２５％、約１２５％～１５０％、約１５０％～１７５％、または約１７５％～２００％の形質転換効率の増加を示す。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｈＣＦ細胞において感染多重度（ＭＯＩ）１，０００で少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５倍の形質転換効率の増加を示す。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｈＣＦ細胞において感染多重度（ＭＯＩ）１，０００で約２～約１６倍、約２～約１４倍、約２～約１２倍、約２～約１０倍、約２～約８倍、約２～約６倍、約２～約４倍、または約２～約３倍の形質転換効率の増加を示す。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｈＣＦ細胞において感染多重度（ＭＯＩ）１，０００で約２０％～３０％、約３０％～４０％、約４０％～５０％、約５０％～８０％、約８０％～１００％、約１００％～１２５％、約１２５％～１５０％、約１５０％～１７５％、または約１７５％～２００％の形質転換効率の増加を示す。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して人工多能性幹細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）において形質転換効率の増加を示す。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において感染多重度（ＭＯＩ）１００，０００で少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５倍の形質転換効率の増加を示す。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において感染多重度（ＭＯＩ）１００，０００で約２～約１６倍、約２～約１４倍、約２～約１２倍、約２～約１０倍、約２～約８倍、約２～約６倍、約２～約４倍、または約２～約３倍の形質転換効率の増加を示す。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において感染多重度（ＭＯＩ）１００，０００で約２０％～３０％、約３０％～４０％、約４０％～５０％、約５０％～８０％、約８０％～１００％、約１００％～１２５％、約１２５％～１５０％、約１５０％～１７５％、または約１７５％～２００％の形質転換効率の増加を示す。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において感染多重度（ＭＯＩ）１，０００で少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５倍の形質転換効率の増加を示す。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において感染多重度（ＭＯＩ）１，０００で約２～約１６倍、約２～約１４倍、約２～約１２倍、約２～約１０倍、約２～約８倍、約２～約６倍、約２～約４倍、または約２～約３倍の形質転換効率の増加を示す。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｉＰＳ－ＣＭ細胞において感染多重度（ＭＯＩ）１，０００で約２０％～３０％、約３０％～４０％、約４０％～５０％、約５０％～８０％、約８０％～１００％、約１００％～１２５％、約１２５％～１５０％、約１５０％～１７５％、または約１７５％～２００％の形質転換効率の増加を示す。
１つの細胞タイプの他方に対する形質導入効率の比率が親配列と比較してカプシドタンパク質によって増加する場合、細胞タイプの選択性は増加する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｉＰＳ－ＣＭ細胞にまさってｈＣＦ細胞に関してｒＡＡＶビリオンの選択性の増加を示す。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｈＣＦ細胞にまさってｉＰＳ－ＣＭ細胞に関してｒＡＡＶビリオンの選択性の増加を示す。
一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、Ｓ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、Ｔ５８２Ａ、Ｋ２５１Ｒ、Ｙ７０９Ｆ、Ｙ６９３Ｆ、またはＳ４８５Ａから選択される変異を含む。一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、Ｋ２５１Ｒ、Ｙ７０９Ｆ、Ｙ６９３Ｆ、またはＳ４８５Ａから選択される変異を含む。
カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、野生型ｃａｐ遺伝子の天然のコドン、または同じタンパク質をコードするように選択された代替コドンのいずれかを含む配列を含み得る。挿入のコドン使用頻度は多様であり得る。本開示のカプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子の代表的なヌクレオチド配列は、配列番号５１～７２として提供される。一部の実施形態では、本開示は、配列番号５１～７２の１つと少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。適切なヌクレオチド配列を選択することおよび本開示の任意のカプシドタンパク質をコードするために代替のヌクレオチド配列を誘導することは当業者の範囲内である。宿主生物のコドン使用頻度表、すなわちヒトに関する真核細胞コドン使用頻度を使用して、タンパク質配列の逆翻訳を実施することができる。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号５１｛ＣＲ２ポリヌクレオチド配列｝と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号１０１またはＡＲＫＶＨＩＥＶＡ（配列番号１０１）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号５２｛ＣＲ５ポリヌクレオチド配列｝と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号１０２またはＡＲＫＹＱＳＤＬＡ（配列番号１０２）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号５３｛ＣＲ８ポリヌクレオチド配列｝と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号１０７またはＡＲＫＨＨＧＬＥＡ（配列番号１０７）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号５４｛ＣＲ１７ポリヌクレオチド配列｝と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号１０３またはＡＰＬＴＮＴＶＫＡ（配列番号１０３）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号５５｛ＣＲ１８ポリヌクレオチド配列｝と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号１０４またはＡＬＫＹＨＧＰＰＡ（配列番号１０４）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号５６｛ＣＲ１９ポリヌクレオチド配列｝と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号１０５またはＡＲＫＹＱＧＤＭＡ（配列番号１０５）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号５７｛ＣＲ２０ポリヌクレオチド配列｝と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号１０６またはＡＲＫＦＨＳＴＤＡ（配列番号１０６）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号５８｛ＣＲ２１ポリヌクレオチド配列｝と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号１０８またはＡＰＧＴＮＶＴＫＡ（配列番号１０８）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号５９｛ＣＲ２２ポリヌクレオチド配列｝と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号１０９またはＡＲＫＭＨＭＰＤＡ（配列番号１０９）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号６０｛ＣＲ２３ポリヌクレオチド配列｝と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号１１０またはＡＰＬＫＫＩＶＱＡ（配列番号１１０）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号６１｛ＣＲ２４ポリヌクレオチド配列｝と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質は、配列番号１１１またはＡＰＬＧＫＫＴＳＡ（配列番号１１１）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号６２｛ＣＲ２５ポリヌクレオチド配列｝と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号１１２またはＡＰＲＧＶＫＶＴＡ（配列番号１１２）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号６３｛ＣＲ２６ポリヌクレオチド配列｝と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号１１３またはＡＰＬＡＫＳＫＳＡ（配列番号１１３）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号６４｛ＣＲ２７ポリヌクレオチド配列｝と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号１１４またはＡＰＲＴＫＧＡＶＡ（配列番号１１４）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号６５｛ＣＲ２８ポリヌクレオチド配列｝と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号１１５またはＡＰＳＧＲＫＡＴＡ（配列番号１１５）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号６６と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が配列番号１に関して置換Ｋ２５１Ｒを含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号６７と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が配列番号１に関して置換Ｓ４８５Ａを含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号６８と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が配列番号１に関して置換Ｓ６５１Ａを含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号６９と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号１に関して置換Ｔ５７８Ａを含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号７０と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号１に関して置換Ｔ５８２Ａを含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号７１と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号１に関して置換Ｙ７０９Ｆを含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号７２と少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号１に関して置換Ｙ６９３Ｆを含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号９～３４から選択される改変カプシドと少なくとも９５％、９９％、または１００％同一である配列を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質であって、参照カプシド配列番号１からの改変カプシドにおいて置換が存在し、指定されたパーセント同一性レベルで他の置換、必要に応じて保存的置換が認容される、ＡＡＶ５カプシドタンパク質を提供する。
一部の実施形態では、挿入部位は、配列番号１の４２０～４６０に対応する親配列における位置で任意の２つ、必要に応じて隣接するアミノ酸の間である。一部の実施形態では、挿入部位は、配列番号１の４４４および４４５に対応する親配列における隣接するアミノ酸の間である。例示的な実施形態は、配列番号３１として開示されるＡＡＶ５カプシドである。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンは、親ＡＡＶ５カプシドと比較してＳ６５１Ｇ、Ｓ６５１Ｖ、Ｓ６５１Ｌ、Ｓ６５１Ｉ、Ｔ５７８Ａ、Ｔ５７８Ｇ、Ｔ５７８Ｖ、Ｔ５７８Ｌ、Ｔ５７８Ｉ、Ｔ５８２Ａ、Ｔ５８２Ｇ、Ｔ５８２Ｖ、Ｔ５８２Ｌ、またはＴ５８２Ｉから選択される１つまたは複数の置換を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質と、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンは、親ＡＡＶ５カプシドと比較してＳ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、またはＴ５８２Ａから選択される１つまたは複数の置換を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質と、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む。
ＡＡＶ５カプシドタンパク質は、Ｓ６５１ＡまたはＳ６５１Ｖ；Ｔ５７８ＡまたはＴ５７８Ｖ；またはＴ５８２ＡもしくはＴ５８２Ｖから選択される任意の２つの置換、またはＳ６５１ＡもしくはＳ６５１Ｖ；Ｔ５７８ＡまたはＴ５７８Ｖ；またはＴ５８２ＡもしくはＴ５８２Ｖの３つ全てを含み得る。変異の以下の組合せは、本開示によって明白に企図される：
ａ） Ｔ５７８Ｇ＋Ｓ６５１Ｇ；
ｂ） Ｔ５７８Ｖ＋Ｓ６５１Ｖ；
ｃ） Ｔ５７８Ｌ＋Ｓ６５１Ｌ；
ｄ） Ｔ５７８Ｉ＋Ｓ６５１Ｉ；
ｅ） Ｔ５８２Ａ＋Ｓ６５１Ａ；
ｆ） Ｔ５８２Ｇ＋Ｓ６５１Ｇ；
ｇ） Ｔ５８２Ｖ＋Ｓ６５１Ｖ；
ｈ） Ｔ５８２Ｌ＋Ｓ６５１Ｌ；
ｉ） Ｔ５８２Ｉ＋Ｓ６５１Ｉ；
ｊ） Ｔ５７８Ａ＋Ｔ５８２Ａ＋Ｓ６５１Ａ；
ｋ） Ｔ５７８Ｇ＋Ｔ５８２Ｇ＋Ｓ６５１Ｇ；
ｌ） Ｔ５７８Ｖ＋Ｔ５８２Ｖ＋Ｓ６５１Ｖ；
ｍ） Ｔ５７８Ｌ＋Ｔ５８２Ｌ＋Ｓ６５１Ｌ；および
ｎ） Ｔ５７８Ｉ＋Ｔ５８２Ｉ＋Ｓ６５１Ｉ。
ＡＡＶ５カプシドタンパク質は、Ｓ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、またはＴ５８２Ａから選択される任意の２つの置換；またはＳ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、もしくはＴ５８２Ａの３つ全てを含み得る。例えば、ＡＡＶ５カプシドタンパク質は、配列番号７４～８０のいずれか１つ、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列であり得る。
Figure 0007630176000004
Figure 0007630176000005
Figure 0007630176000006
Figure 0007630176000007
前述の配列のいずれかにおいて、アラニン置換は、その代わりにバリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、またはイソロイシン（Ｉ）への置換であり得る。
一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基が野生型ＡＡＶ５カプシドに存在する残基に保存される。例えば、一部の実施形態では、Ｔ５８１は、チロシン（Ｔ）として保存されるか、またはセリン（Ｓ）として半保存される。これに対し、米国特許第１０，０４６，０１６号は、肺上皮細胞への感染力が、Ｔ５８１Ａ変異による変異によって増加することを教示している。
定義
文脈がそれ以外であることを示していない限り、本発明の特色（feature）を任意の組合せで使用することができる。記載される任意の特色または特色の組合せを除外または省略することができる。個別の実施形態に記載される本発明のある特定の特色もまた、単一の実施形態と組み合わせて提供され得る。単一の実施形態に記載される本発明の特色もまた、個別にまたは任意の適した部分組合せで提供され得る。実施形態の全ての組合せは、各々のおよびあらゆる組合せが個々に開示されているかのように本明細書に開示される。実施形態および要素の全ての部分組合せは、あらゆるそのような部分組合せが個々に開示されているかのように本明細書に開示される。
特に定義していない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。詳細な説明は、単に読者の利便性のために節に分割され、任意の節において見出される本開示を別の節において見出される開示と組み合わせてもよい。本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実践または試験において使用することができるが、例示的な方法および材料を以下に記載する。本明細書において言及した全ての刊行物は、刊行物が引用されることに関連して方法および／または材料を開示および記載するために参照により本明細書に組み込まれる。刊行物を参照しても、刊行物が先行技術であると認めたことにはならない。
単数形「１つの（ａ）」「１つ（ａｎ）」、および「その」は、本文が明らかにそれ以外であることを示していない限り複数形の指示対象を含む。例えば、「１つの組換えＡＡＶビリオン」という言及は、そのようなビリオンの複数を含み、「その心臓細胞」という言及は１つまたは複数の心臓細胞を含む。
接続詞「および／または」は、「および」と「または」との両方を意味し、「および／または」によって接続された列挙は、列挙された項目の１つまたは複数の全ての可能性がある組合せを包含する。
用語「ベクター」は、細胞に送達されるポリヌクレオチドまたはタンパク質を含む高分子または分子の複合体を指す。
「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの略語である。この用語は、全てのサブタイプのＡＡＶを網羅し、サブタイプが示されている場合を除き、天然に存在する形態および組換え形態の両方を含む。略語「ｒＡＡＶ」は、組換えアデノ随伴ウイルスを指す。「ＡＡＶ」は、ＡＡＶまたは任意のサブタイプを含む。「ＡＡＶ５」は、ＡＡＶサブタイプ５を指す。ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列ならびに天然の末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列は、文献または公共のデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋに見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７（ＡＡＶ１）、ＡＦ０６３４９７（ＡＡＶ１）、ＮＣ＿００１４０１（ＡＡＶ２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ２）、ＮＣ＿００１７２９（ＡＡＶ３）、ＮＣ＿００１８２９（ＡＡＶ４）、Ｕ８９７９０（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２（ＡＡＶ５）、ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ７）、ＡＦ５１３８５２（ＡＡＶ８）、およびＮＣ＿００６２６１（ＡＡＶ８）を参照されたい。ＡＡＶについて記載する刊行物としては、Srivistava et al. (1983) J. Virol. 45:555; Chiorini et al. (1998) J. Virol. 71:6823; Chiorini et al. (1999) J. Virol. 73:1309; Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virol. 73:939; Xiao et al. (1999) J. Virol. 73:3994; Muramatsu et al. (1996) Virol. 221:208; Shade et al. (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854; Moris et al. (2004) Virology 33:375-383；国際特許出願公開番号ＷＯ２０１８／２２２５０３Ａ１、ＷＯ２０１２／１４５６０１Ａ２、ＷＯ２０００／０２８０６１Ａ２、ＷＯ１９９９／６１６０１Ａ２、およびＷＯ１９９８／１１２４４Ａ２；米国特許出願第１５／７８２，９８０号および同第１５／４３３，３２２号；ならびに米国特許第１０，０３６，０１６号、同第９，７９０，４７２号、同第９，７３７，６１８号、同第９，４３４，９２８号、同第９，２３３，１３１号、同第８，９０６，６７５号、同第７，７９０，４４９号、同第７，９０６，１１１号、同第７，７１８，４２４号、同第７，２５９，１５１号、同第７，１９８，９５１号、同第７，１０５，３４５号、同第６，９６２，８１５号、同第６，９８４，５１７号、および同第６，１５６，３０３号が挙げられる。
当技術分野で使用される「ＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶベクター」は、文脈に応じてｒＡＡＶビリオン内にパッケージングされたＤＮＡまたはｒＡＡＶビリオンそのもののいずれかを指す。本明細書で使用される場合、文脈から、そうでないことが明らかでない限り、ｒＡＡＶベクターは、カプシドまたはｒＡＡＶビリオンの他のタンパク質と共に、ｒＡＡＶビリオン内にパッケージングされることが可能なポリヌクレオチド配列を含む核酸（典型的にはプラスミド）を指す。一般的には、ｒＡＡＶベクターは、異種ポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド）と、異種ポリヌクレオチド配列に隣接する１つまたは２つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）とを含む。２つのＩＴＲのうちの１つのみがｒＡＡＶにパッケージングされてもよく、それでもなお得られたｒＡＡＶビリオンの感染力は維持され得る。Wu et al. (2010) Mol Ther. 18:80を参照されたい。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補性（ｓｃＡＡＶ）のいずれかを生成するように設計され得る。McCarty D. (2008) Mo. Ther. 16:1648-1656；ＷＯ２００１／１１０３４；ＷＯ２００１／９２５５１；ＷＯ２０１０／１２９０２１を参照されたい。
「ｒＡＡＶビリオン」は、少なくとも１つのウイルスカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１）およびカプシドタンパク質を含むカプシド形成されたｒＡＡＶベクター（またはその断片）を含む細胞外ウイルス粒子を指す。
簡潔および明確にするために、本開示は、「カプシドタンパク質」または「複数のカプシドタンパク質」を指す。当業者は、そのような言及が、ＶＰ１、ＶＰ２、もしくはＶＰ３、またはＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の組合せを指すことを理解する。野生型ＡＡＶおよびほとんどの組換え発現系の場合と同様に、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、同じオープンリーディングフレームから発現され、ＶＰ３をコードする配列の操作は、必然的にＶＰ１およびＶＰ２のＣ末端ドメインの配列を変更する。同様に異なるオープンリーディングフレームからカプシドタンパク質を発現させてもよく、この場合、得られたｒＡＡＶビリオンのカプシドは野生型と操作されたカプシドタンパク質との混合物、および異なる操作されたカプシドタンパク質の混合物を含有し得る。
用語「末端逆位反復配列」または「ＩＴＲ」は、本明細書で使用される場合、その対称性のためにそのように命名されたＡＡＶウイルスシスエレメントを指す。これらのエレメントは、ＡＡＶゲノムの効率的な複製にとって必須である。理論に拘束されたくはないが、ＩＴＲ機能にとって必須の最小エレメントは、Ｒｅｐ結合部位および末端分解部位（terminal resolution site）プラスヘアピン形成を可能にする可変回文配列であると考えられる。本開示は、ＡＡＶゲノムを生成する代替手段が存在し得ること、または本開示のカプシドタンパク質と適合性となるようにプロスペクティブに開発され得ることを企図する。
「ヘルパーウイルス機能」は、ＡＡＶ複製およびパッケージングを可能にするヘルパーウイルスゲノムにおいてコードされる機能を指す。
「パッケージング」は、ｒＡＡＶベクターのカプシド形成を含むｒＡＡＶビリオンのアセンブリをもたらす一連の細胞内事象を指す。ＡＡＶ「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製およびカプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書においてＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と呼ばれる。パッケージングは、ヘルパーウイルスそのものまたは組換え系においてより一般的な、ヘルパーフリー系によって供給されるヘルパーウイルス機能（すなわち、１つまたは複数のヘルパープラスミド）のいずれかを必要とする。
ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）を哺乳動物細胞によって複製およびパッケージングさせるウイルスを指す。ヘルパーウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはポックスウイルス、例えばワクシニアであり得る。
「感染性」ビリオンまたはウイルス粒子は、コンピテントにアセンブルされたウイルスカプシドを含み、ビリオンが指向性である細胞にポリヌクレオチド構成要素（component）を送達することが可能なビリオンまたはウイルス粒子である。この用語は、ウイルスの複製能を必ずしも意味しない。
「感染力」は、ビリオンが細胞を調節する能力の測定値を指す。感染力は、感染性ウイルス粒子の総ウイルス粒子に対する比として表記することができる。感染力は、一般的に特定の細胞タイプに関して決定される。これは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で測定することができる。感染性ウイルス粒子の総ウイルス粒子に対する比を決定する方法は、当技術分野において公知である。例えば、Grainger et al. (2005) Mol. Ther. 11:S337 （ＴＣＩＤ５０感染力価アッセイについて記載する）；およびZolotukhin et al. (1999) Gene Ther. 6:973を参照されたい。
用語「親カプシド」または「親配列」は、粒子カプシドまたは配列が由来する参照配列を指す。特に明記していない限り、親配列は、操作されたカプシドタンパク質と同じ血清型の野生型カプシドタンパク質の配列を指す。
「複製コンピテント」ウイルス（例えば、複製コンピテントＡＡＶ）は、感染性であり、感染した細胞において複製されることが可能であるウイルス（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下で）を指す。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンは、ｒｅｐ遺伝子、またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の両方を欠如するゲノムを含み、したがって複製インコンピテントである。
本開示の実践は、特に示していない限り、当業者の範囲内である組織培養、免疫学、分子生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの通常の技術を用いる。例えば、Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5thedition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; 米国特許第４，６８３，１９５号; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; IRL Press (1986) Immobilized Cells and Enzymes; Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition (2002) Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sohail (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press);およびSell (2013) Stem Cells Handbookを参照されたい。
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらのアナログの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、直線状および環状核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、およびプライマーが挙げられる。特に明記していない限りまたは必要でない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記載される本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態および二本鎖形態を構成することが公知であるかまたは予想される２つの相補的一本鎖形態の各々の両方を包含する。
用語「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これは遺伝子コードされるおよび遺伝子コードされないアミノ酸、化学または生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸、ならびに改変ペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。用語はまた、改変されている、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、リン酸化、または標識構成要素とのコンジュゲーションを有するアミノ酸ポリマーも包含する。
用語「ペプチド」は、短いポリペプチド、例えば約４～３０アミノ酸残基の間を有するペプチドを指す。
用語「単離された」は、ビリオン、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が通常天然で会合している細胞性のおよびその他の構成成分から分離されていることを意味する。例えば、単離された細胞は、異なる表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離された細胞である。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」または「同一性」は、目的の配列と参照配列との間で同一であるアミノ酸の数のパーセンテージを指す。一般的に、同一性は、目的の配列を参照配列と整列させること、整列させた配列間で同一であるアミノ酸の数を決定すること、その数を参照配列におけるアミノ酸の総数によって除算すること、およびその結果に１００を乗算してパーセンテージを得ることによって決定される。配列は、様々なコンピュータープログラム、例えばｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで入手可能なＢＬＡＳＴを使用して整列させることができる。アライメントのための他の技術は、Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996);およびMeth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997); J. Mol. Biol. 48: 44に記載されている。当業者は、配列の長さ、相違、および参照配列に関する挿入または欠失の存在または非存在（presence of absence）を含む様々な要因に応じて適切なアライメント方法を選択することが可能である。
「組換え」は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限またはライゲーションステップ、および天然で見出されるポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす他の手順の様々な組合せの産物であるか、またはポリヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチドからアセンブルされることを意味する。「組換え」タンパク質は、組換えポリペプチドから産生されたタンパク質である。組換えビリオンは、組換えポリヌクレオチドおよび／または組換えタンパク質、例えば組換えカプシドタンパク質を含むビリオンである。
「遺伝子」は、転写および翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることが可能である少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。「遺伝子産物」は、特定の遺伝子の発現に起因する分子である。遺伝子産物としては、ポリペプチド、タンパク質、アプタマー、干渉ＲＮＡ、またはｍＲＮＡが挙げられ得るがこれらに限定されない。遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）は、系を作製するために必要な１つの遺伝子産物としてまたはいくつかの遺伝子産物（例えば、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ）として記載され得る。
「短鎖ヘアピンＲＮＡ」またはｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを発現するために使用されるポリヌクレオチド構築物である。
「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能的調節に寄与する分子の相互作用に関係するヌクレオチド配列である。調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響を及ぼし得、本質的に増強性または阻害性であり得る。制御エレメントは、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの転写調節配列を含む。
「プロモーター」は、ある特定の条件下でＲＮＡポリメラーゼに結合することが可能で、プロモーターから通常下流に（３’方向に）位置するコード領域の転写を開始することが可能なＤＮＡ配列である。用語「組織特異的プロモーター」は、本明細書で使用される場合、心組織などの特定の臓器または組織の細胞において操作可能であるプロモーターを指す。
「作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結された」または「操作可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結された」は、エレメントがそれらを予想される様式で動作することを可能にする関係にある遺伝子エレメントの並置を指す。例として、プロモーターがコード配列の転写の開始を助ける場合、プロモーターはコード領域作動可能に連結されている。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に介在する残基が存在してもよい。
「発現ベクター」は、標的細胞において遺伝子産物の発現に影響を及ぼすために使用される目的の遺伝子産物をコードするコード配列を含むベクターである。発現ベクターは、遺伝子産物の発現を容易にするためにコード配列に作動可能に連結された制御エレメントを含む。
用語「発現カセット」は、標的細胞における遺伝子産物の発現に影響を及ぼすために使用される目的の遺伝子産物をコードするコード配列を含む異種ポリヌクレオチドを指す。特に指定していない限り、ＡＡＶベクターの発現カセットは、ＩＴＲの間に（かつＩＴＲを含まない）ポリヌクレオチドを含む。
用語「遺伝子送達」または「遺伝子移入」は、本明細書で使用される場合、外来の核酸配列、例えばＤＮＡを宿主細胞に信頼可能に挿入するための方法またはシステムを指す。そのような方法は、組み込まれていない移入されたＤＮＡの一過性の発現、移入されたレプリコンの染色体外複製および発現（例えば、エピソーム）、または移入された遺伝子材料の宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組込みをもたらし得る。
「異種」は、それが比較される実体の残りの遺伝子型とは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子操作技術によって異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。その天然のコード配列から除去され、それが天然で関連が見出されないコード配列に作動可能に連結されているプロモーターは異種プロモーターである。このように例えば、異種核酸を含むｒＡＡＶは、天然に存在するＡＡＶに通常含まれない核酸を含むｒＡＡＶである。
用語「遺伝的変更」および「遺伝子改変」（およびその文法的バリアント）は本明細書で互換的に使用され、遺伝子エレメント（例えば、ポリヌクレオチド）が有糸分裂または減数分裂以外によって細胞に導入されるプロセスを指す。エレメントは、細胞に対して異種であり得るか、または細胞にすでに存在するエレメントの追加のコピーもしくは改善されたバージョンであり得る。遺伝的変更は、例えば、当技術分野において公知の任意のプロセス、例えば電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿を通して細胞に組換えプラスミドもしくは他のポリヌクレオチドをトランスフェクトすることによって、またはポリヌクレオチド－リポソーム複合体を接触させることによって影響を受け得る。遺伝的変更はまた、ベクターの形質導入または感染によっても影響を受け得る。
配列が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の長期培養の間にその機能を実施するために利用できる場合、細胞は、ポリヌクレオチド配列によって「安定に」変更されるか、形質導入されるか、遺伝子改変されるか、または形質転換されていると言われる。一般的に、そのような細胞は、変更された細胞の子孫によって同様に受け継がれ得る遺伝的変更が導入されているという点において「遺伝的に」変更されて（遺伝子改変されて）いる。
用語「トランスフェクション」は、本明細書で使用される場合、細胞による外因性の核酸分子の取込みを指す。細胞は、外因性の核酸が細胞膜の内部に導入されている場合「トランスフェクト」されている。いくつかのトランスフェクション技術が、当技術分野で一般的に公知である。例えば、Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al. (1981) Gene 13:197を参照されたい。そのような技術を使用して、１つまたは複数の外因性の核酸分子を適した宿主細胞に導入することができる。
用語「形質導入」は、本明細書で使用される場合、野生型ビリオンによる「感染」とは対照的に組換えビリオンによる細胞への外因性核酸の移入を指す。感染を組換えビリオンに関して使用する場合、用語「形質導入」および「感染性」は、同義語であり、したがって「感染力」および「形質転換効率」は、等価であり、類似の方法を使用して決定することができる。
特に指定していない限り、全ての医学用語は、例えば全ての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Harrison's Principles of Internal Medicine, 15ed.、特に心臓または心血管の疾患、障害、状態、および機能障害に関する章におけるように、医療従事者によって使用される用語の通常の意味を与えられる。
「処置」、「処置する（treating）」、および「処置する（treat）」は、疾患、障害、もしくは状態、および／またはその症状の有害なまたは他の任意の望ましくない作用を低減または改善する作用剤によって疾患、障害、または状態に作用することとして定義される。
「投与」、「投与する」などは、本発明の組成物に関連して使用する場合、直接投与（医療従事者による対象への投与または対象による自己投与）、および／または間接的投与（組成物を患者に処方すること）の両方を指す。典型的には有効量が投与され、この量は当業者が決定することができる。任意の投与方法を使用してもよい。対象への投与は、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、血管内、または心筋内送達によって達成され得る。
本明細書で使用される場合、組成物の量に関する用語「有効量」などは、所望の生理的アウトカム（例えば、細胞のリプログラミングまたは疾患の処置）を誘導するために十分である量を指す。有効量は、１つまたは複数の投与、適用、または投薬量で投与することができる。そのような送達は、個々の投薬量単位が使用される期間、組成物の生物学的利用率、投与経路などを含む複数の変数に依存する。しかし、任意の特定の対象に関する組成物（例えば、ｒＡＡＶビリオン）の特定の量は、用いられる特定の作用剤の活性、対象の年齢、体重、全身健康、性別、および食事、投与時間、排泄速度、組成物の組合せ、処置される特定の疾患の重症度、および投与形態を含む多様な要因に依存すると理解される。
用語「個体」、「対象」、および「患者」は、本明細書において互換的に使用され、ヒトおよび非ヒト霊長類（例えば、サル）；競技用哺乳動物（例えば、ウマ）；農場哺乳動物（例えば、ヒツジ、ヤギなど）；哺乳動物ペット（例えば、イヌ、ネコなど）；およびげっ歯類（例えば、マウス、ラットなど）を含むがこれらに限定されない哺乳動物を指す。
用語「心病態」または「心機能障害」は、互換的に使用され、心臓のポンプ機能の何らかの欠陥を指す。これには、例えば収縮の欠陥、弛緩能の欠陥（時に拡張機能障害と呼ばれる）、心臓弁の異常なまたは不適切な機能、心筋疾患（時に、心筋症と呼ばれる）、狭心症、心筋虚血、および／または心筋に対する不適切な血液供給によって特徴付けられる梗塞などの疾患、アミロイドーシスおよびヘモクロマトーシスなどの浸潤性疾患、全身または局所肥大（例えば、ある種の心筋症または全身性高血圧症において起こり得る）、および心室間の異常な伝導が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「心筋症」は、心筋に直接影響を及ぼす任意の疾患または機能障害を指す。疾患または障害の病因は、例えば、炎症、代謝、毒性、浸潤性、線維形成性、血液学、遺伝子学、または起源不明であり得る。２つの根本的な形態、（１）原因不明の心筋疾患からなる第１のタイプ、および（２）既知原因の心筋疾患からなるまたは他の臓器系を伴う疾患に関連する第２のタイプが認識されている。「特定の心筋症」は、ある特定の全身障害または心障害に関連する心疾患を指し；例としては、高血圧性および代謝性心筋症が挙げられる。心筋症は、左室および／または右室の収縮ポンプ機能が損なわれ、進行性の心肥大をもたらす障害である拡張型心筋症（ＤＣＭ）；高血圧症または大動脈狭窄などの明白な原因がない左室肥大によって特徴付けられる肥大型心筋症；ならびに異常な拡張機能および心室充満を妨害する過度に強固な心室壁によって特徴付けられる拘束型心筋症を含む。心筋症はまた、左室心筋緻密化障害、不整脈原性の右室心筋症、および不整脈原性右室異形成も含む。
「心不全」は、心機能の異常は、心臓が代謝組織の要件に見合う速度で血液を送り出すことができないことの原因となる、および／または拡張容量が異常に上昇した場合に限って心臓がそうすることができる病的状態を指す。心不全は、収縮期および拡張期不全を含む。心不全患者は、低い心拍出量を有する患者（典型的に、虚血性心疾患、高血圧症、拡張型心筋症、および／または弁膜症もしくは心膜疾患に二次的である）、および上昇した心拍出量を有する患者（典型的に、甲状腺機能亢進症、貧血、妊娠、動静脈痩、脚気、およびページェット病による）に分類される。心不全は、駆出率低下心不全（ＨＦｒＥＦ）および駆出率が保たれた心不全（ＨＦｐＥＦ）を含む。
語句「薬学的に許容される」は、本明細書で用いられる場合、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を引き起こすことなく、妥当な利益／リスク比に釣り合ってヒトおよび動物の組織と接触して使用するために適したそれらの化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
用語「精製された」は、本明細書で使用される場合、無関係な材料、すなわち材料が得られた天然の材料を含む不純物の存在を低減または除去する条件下で単離されている材料を指す。例えば、精製されたｒＡＡＶベクターＤＮＡは、好ましくは組織培養構成要素、夾雑物などを含む細胞や培養構成要素を実質的に含まない。
用語「再生する」、「再生」などは、本明細書で傷害を受けた心組織の文脈において使用される場合、その通常の意味を有し、同様に傷害を受けている、例えば虚血、梗塞、再還流、または他の疾患により傷害を受けている心臓または心組織において新たな心組織を成長および／または発達させるプロセスも指す。一部の実施形態では、心組織再生は、心筋細胞の生成を含む。
用語「治療遺伝子」は、本明細書で使用される場合、発現された場合に、それが存在する細胞もしくは組織、または遺伝子が発現される哺乳動物に対して有益な効果を付与する遺伝子を指す。有益な効果の例としては、状態もしくは疾患の兆候もしくは症状の改善、状態もしくは疾患の防止もしくは阻害、または所望の特徴の付与が挙げられる。治療遺伝子は、細胞または哺乳動物における遺伝子欠損を部分的にまたは全体を修正する遺伝子を含む。
本明細書で使用される場合、用語「機能的な心筋細胞」は、電気シグナルを送るまたは受けることができる分化した心筋細胞を指す。一部の実施形態では、活動電位および／またはＣａ２＋トランジェントなどの電気生理的特性を示す場合、心筋細胞は機能的な心筋細胞であると言われる。
本明細書で使用される場合、「分化した非心臓細胞」は、成体生物の全ての細胞タイプへは分化することができず（すなわち、多能性細胞ではない）、心臓系列以外の細胞系列（例えば、神経系列、または結合組織系列）の細胞系列である細胞を指し得る。分化した細胞としては、複能性細胞、少能性細胞、単能性細胞、前駆細胞、および最終分化細胞が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、分化能が低い細胞は、分化能が高い細胞を参照すると「分化した」と見なされる。
「体細胞」は、生物の体を形成する細胞である。体細胞は、生物における臓器、皮膚、血液、骨、および結合組織を構成する細胞を含むが、胚細胞ではない。
本明細書で使用される場合、用語「全能性」は、細胞が生物の全ての細胞系列を形成する能力を意味する。例えば、哺乳動物では、受精卵および第１分割段階の胚盤胞のみが全能性である。
本明細書で使用される場合、用語「多能性」は、細胞が体または身体の全ての系列を形成する能力を意味する。例えば、胚性幹細胞は、３つの胚葉、すなわち外胚葉、中胚葉、および内胚葉の各々から細胞を形成することができる多能性幹細胞の１タイプである。多能性細胞は、ＮａｎｏｇおよびＲｅｘ１などのそのマーカーの発現によって認識され得る。
本明細書で使用される場合、用語「複能性」は、成体幹細胞が１つの系列の複数の細胞タイプを形成する能力を指す。例えば、造血幹細胞は、血液細胞系列の全ての細胞、例えばリンパ系細胞および骨髄性細胞を形成することが可能である。
本明細書で使用される場合、用語「少能性」は、成体幹細胞がごく少数の異なる細胞タイプに分化する能力を指す。例えば、リンパ系幹細胞または骨髄幹細胞はそれぞれ、リンパ系列または骨髄系列のいずれかの細胞を形成することが可能である。
本明細書で使用される場合、用語「単能性」は、細胞が単一の細胞タイプを形成する能力を意味する。例えば、精原幹細胞は、精子細胞のみを形成することが可能である。
本明細書で使用される場合、用語「リプログラミング」または「分化転換」は、細胞を、多能性幹細胞特徴を示す細胞に再分化させる中間プロセスがなく、異なる細胞タイプの細胞（例えば、線維芽細胞）からある特定の系列の細胞（例えば、心臓細胞）を生成することを指す。
本明細書で使用される場合、用語「心臓細胞」は、心臓の収縮または血液供給などの心機能を提供するか、またはそうでなければ心臓の構造を維持するように作用する、心臓に存在する任意の細胞を指す。心臓細胞は、本明細書で使用される場合、心臓の外膜、筋膜、または内膜に存在する細胞を包含する。心臓細胞はまた、例えば心臓の筋肉細胞または心筋細胞、および心血管系の細胞、例えば冠動脈または冠静脈の細胞も含む。心臓細胞の他の非限定的な例としては、心臓の筋肉、血管、および構造を支持する心臓細胞を構成する、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、心幹細胞または前駆細胞、心臓伝導細胞、および心ペースメーカー細胞が挙げられる。心臓細胞は、例えば胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を含む幹細胞に由来し得る。
用語「心筋細胞（cardiomyocyte）」または「複数の心筋細胞（cardiomyocytes）」は、本明細書で使用される場合、骨格筋細胞と比較して哺乳動物の心臓に天然に見出されるサルコメア含有横紋筋細胞を指す。心筋細胞は、特殊な分子、例えばミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、心α－アクチンのようなタンパク質の発現によって特徴付けられる。用語「心筋細胞」は、本明細書で使用される場合、任意の心筋細胞亜集団または心筋細胞サブタイプ、例えば心房、心室、およびペースメーカー心筋細胞を含む総称である。
用語「心筋細胞様細胞」は、心筋細胞の特色を共有するが、全ての特色を共有しなくてもよい細胞を意味すると意図される。例えば、心筋細胞様細胞は、ある特定の心遺伝子の発現が心筋細胞とは異なり得る。
用語「培養」または「細胞培養」は、人為的なｉｎ ｖｉｔｒｏ環境で細胞を維持することを意味する。「細胞培養系」は本明細書で使用される場合、細胞集団が単層または浮遊状態で成長し得る培養条件を指す。「培養培地」は、本明細書で使用される場合、細胞の培養、成長、または増殖のための栄養溶液を指す。培養培地は、機能的特性、例えば、限定されずに、特定の状態（例えば、多能性状態、休止状態等）で細胞を維持する能力、細胞を成熟させる能力、一部の例では具体的には、特定の系列の細胞（例えば、心筋細胞）への前駆細胞の分化を促進する能力によって特徴付けられ得る。
本明細書で使用される場合、用語「発現」または「発現する」は、それによってポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織試料中のｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することによって決定され得る。
用語「誘導心筋細胞」または略語「ｉＣＭ」は、心筋細胞（および／または心筋細胞様細胞）へと形質転換されている非心筋細胞（およびその子孫）を指す。本開示の方法は、例えば他の技術を増強するため、誘導心筋細胞を生成するために現在公知のまたは後に発見される任意の方法と共に使用することができる。
用語「人工多能性幹細胞由来心筋細胞」は、本明細書で使用される場合、心筋細胞様細胞へと分化しているヒト人工多能性幹細胞を指す。調製されたｉＰＳ－ＣＭ細胞の例示的な方法は、Karakikes et al. Circ Res. 2015 Jun 19; 117(1): 80-88によって提供される。
用語「ヒト心臓線維芽細胞」および「マウス心臓線維芽細胞」はそれぞれ、本明細書で使用される場合、ヒトまたはマウスの成体心室から単離され、ｅｘ ｖｉｖｏでの培養において維持される初代細胞を指す。
用語「非心筋細胞」は、本明細書で使用される場合、本明細書で定義および使用される「心筋細胞」の基準を満たさない細胞調製物中の任意の細胞または細胞集団を指す。非心筋細胞の非限定的な例としては、体細胞、心臓線維芽細胞、非心臓線維芽細胞、心臓前駆細胞、および幹細胞が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「リプログラミング」は、分化転換、脱分化などを含む。
本明細書で使用される場合、用語「リプログラミング効率」は、試料中の細胞の総数と比較して心筋細胞へのリプログラミングが成功した試料中の細胞数を指す。
用語「リプログラミング因子」は、本明細書で使用される場合、１つの細胞タイプから別の細胞タイプへの細胞のリプログラミングを助けるため、細胞に発現させるために導入される因子を含む。例えば、リプログラミング因子は、他の転写因子および／または低分子と組み合わせて、心臓線維芽細胞を誘導心筋細胞へとリプログラミングすることが可能な転写因子を含み得る。本文から明白でない限り、リプログラミング因子は、ＡＡＶが送達するポリヌクレオチドによってコードされ得るポリペプチドを指す。リプログラミング因子はまた低分子も含み得る。
用語「幹細胞」は、自己再生能を有し、分化した子孫を生成する能力を有する細胞を指す。用語「多能性幹細胞」は、３つ全ての胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の細胞を生じることができるが、完全な生物を生じる能力は有しない幹細胞を指す。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドまたは核酸配列を参照する場合の用語「その同等物」は、参照のポリペプチドまたは核酸配列とは異なるが、必須の特性（例えば、生物活性）を保持するポリペプチドまたは核酸を指す。ポリペプチドの典型的なバリアントは、別の参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。バリアントのヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しても、変更しなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、参照配列によってコードされるポリペプチドにおいてアミノ酸置換、欠失、付加、融合、および切断をもたらし得る。一般的に、参照ポリペプチドおよびバリアントの配列が、全体として非常に類似であり、多くの領域において同一であるように、差は限定的である。
本明細書で使用される場合、用語「前駆細胞」は、特定のタイプの細胞へと分化するか、または特定のタイプの組織を形成するように関係づけられた細胞を指す。前駆細胞は、幹細胞と同様に１つまたは複数の種類の細胞へとさらに分化することができるが、それがより限定された／拘束された分化能を有するように幹細胞より成熟している。
用語「遺伝子改変」は、新規核酸（すなわち、細胞に対して外因性の核酸）の導入後に細胞に導入された永続的または一過性の遺伝子変化を指す。遺伝子変化は、新規核酸の心臓細胞のゲノムへの組み入れ、または新規核酸の染色体外エレメントとしての一過性もしくは安定な維持によって達成され得る。細胞が真核細胞である場合、永続的な遺伝子変化は、細胞のゲノムへの核酸の導入によって達成することができる。遺伝子改変の適した方法としては、ウイルス感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、電気穿孔、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどが挙げられる。
用語「幹細胞」は、自己再生能および分化した子孫を生成する能力を有する細胞を指す。用語「多能性幹細胞」は、３つ全ての胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の細胞を生じることができるが、完全な生物を生じる能力を有しない幹細胞を指す。一部の実施形態では、心筋細胞表現型を誘導するための組成物を、リプログラミングを誘導するために細胞集団において使用することができる。他の実施形態では、組成物は心筋細胞表現型を誘導する。
用語「人工多能性幹細胞」は、その通常の意味を有し、多能性の少なくとも１つの特徴を示すようにリプログラムされている分化した哺乳動物体細胞（例えば、成体体細胞、例えば皮膚）も指す。例えば、Takahashi et al. (2007) Cell 131(5):861-872, Kim et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. 108(19): 7838-7843, Sell (2013) Stem Cells Handbookを参照されたい。
用語「形質導入効率」は、少なくとも１つのＡＡＶゲノムによって形質導入された細胞のパーセンテージを指す。例えば、１×１０６個の細胞がウイルスに曝露され、０．５×１０６個の細胞がＡＡＶゲノムの少なくとも１つのコピーを含有すると決定される場合、形質導入効率は５０％である。形質導入効率を決定するための例示的な方法は、フローサイトメトリーである。例えば、ＡＡＶゲノムが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチドを含む場合、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージは形質導入効率の尺度である。
用語「選択性」は、１つの細胞タイプの別のまたは他の全ての細胞タイプに対する形質導入効率の比を指す。
用語「感染力」は、ＡＡＶビリオンが細胞、特にｉｎ ｖｉｖｏの細胞に感染する能力を指す。したがって、感染力は、少なくとも生体内分布および中和抗体逃避の関数である。
特に明記していない限り、本明細書を通して使用した略語は以下の意味を有する：ＡＡＶ、アデノ随伴ウイルス、ｒＡＡＶ、組換えアデノ随伴ウイルス；ＡＨＣＦ、成人ヒト心臓線維芽細胞；ＡＰＣＦ、成体ブタ心臓線維芽細胞；ａ－ＭＨＣ－ＧＦＰ、アルファ－ミオシン重鎖緑色蛍光タンパク質；ＣＦ、心臓線維芽細胞；ｃｍ、センチメートル；ＣＯ、心拍出量；ＥＦ、駆出率；ＦＡＣＳ、蛍光活性化細胞選別；ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質；ＧＭＴ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５；ＧＭＴｃ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、ＴＧＦ－βｉ、ＷＮＴｉ；ＧＯ、遺伝子オントロジー；ｈＣＦ、ヒト心臓線維芽細胞；ｉＣＭ、誘導心筋細胞；ｋｇ、キログラム（killigram）；μｇ、マイクログラム；μｌ、マイクロリットル；ｍｇ、ミリグラム；ｍｌ、ミリリットル；ＭＩ、心筋梗塞；ｍｓｅｃ、ミリ秒；ｍｉｎ、分；ＭｙＡＭＴ、ミオカルジン、Ａｓｃｌ１、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５；ＭｙＡ、ミオカルジン、およびＡｓｃｌ１；ＭｙＭＴ、ミオカルジン、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５；ＭｙＭＴｃ、ミオカルジン、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、ＴＧＦ－βｉ、ＷＮＴｉ；ＭＲＩ、核磁気共鳴イメージング；ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水；ＰＢＳＴ、リン酸緩衝食塩水、ｔｒｉｔｏｎ；ＰＦＡ、パラホルムアルデヒド；ｑＰＣＲ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応；ｑＲＴ－ＰＣＲ、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応；ＲＮＡ、リボ核酸；ＲＮＡ－ｓｅｑ、ＲＮＡシーケンシング；ＲＴ－ＰＣＲ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応；ｓｅｃ、秒；ＳＶ、一回拍出量；ＴＧＦ－β、トランスフォーミング成長因子ベータ；ＴＧＦ－βｉ、トランスフォーミング成長因子ベータ阻害剤；ＷＮＴ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ－Ｉｎｔ；ＷＮＴｉ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ－Ｉｎｔ阻害剤；ＹＦＰ、黄色蛍光タンパク質；４Ｆ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、ＴＢＸ５、およびミオカルジン；４Ｆｃ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、ＴＢＸ５、およびミオカルジン＋ＴＧＦ－βｉおよびＷＮＴｉ；７Ｆ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５、Ｅｓｓｒｇ、ミオカルジン、Ｚｆｐｍ２、およびＭｅｓｐ１；７Ｆｃ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５、Ｅｓｓｒｇ、ミオカルジン、Ｚｆｐｍ２、およびＭｅｓｐ１＋ＴＧＦ－β、およびＷＮＴｉ。
実施形態および変形形態
組成物
遺伝子治療にとって有用な特性を有するカプシドバリアントを同定する努力は、米国特許第９，２３３，１３１号に記載されるＡＡＶ２およびＡＡＶ５ ｃａｐ遺伝子のＤＮＡのシャッフリング、ならびに国際特許出願番号ＷＯ２０１２／１４５６０１Ａ２およびＷＯ２０１８／２２２５０３Ａ１に記載の指向性進化法を含む。これらの文書の開示は、全ての目的に関して、特にＡＡＶビリオンを作製および使用する方法ならびにその中に開示されているポリヌクレオチド配列および遺伝子産物、ならびに心疾患または障害を処置するために有用な転写因子の組合せに関して参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子によってコードされ、これはまた右オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とも呼ばれる（左ＯＲＦ、ｒｅｐに対して）。代表的なＡＡＶカプシドの構造は、Xie et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:10405-1040 （ＡＡＶ２）； Govindasamy et al. (2006) J. Virol. 80:11556-11570 （ＡＡＶ４）； Nam et a. (2007) J. Virol. 81:12260-12271 （ＡＡＶ８）および Govindasamy et al. (2013) J. Virol. 87:11187-11199 （ＡＡＶ５）を含む様々な刊行物に記載されている。
ＡＡＶカプシドは、予想される比１：１：１０でＴ＝１正二十面体対称性で整列した３つのウイルスタンパク質（ＶＰ）、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の６０コピー（全体で）を含有する。３つのＶＰは、同じｍＲＮＡから翻訳され、ＶＰ１はそのＣ末端領域での完全なＶＰ２配列に加えてユニークなＮ末端ドメインを含有する。ＶＰ２は、そのＣ末端でＶＰ３に加えて余分のＮ末端配列を含有する。ほとんどの結晶構造では、全てのカプシドタンパク質に共通するＣ末端ポリペプチド配列（約５３０アミノ酸）のみが観察される。ＶＰ１のユニークなＮ末端領域、ＶＰ１－ＶＰ２重複領域、およびＶＰ３の最初の１４～１６個のＮ末端残基が主に障害を受けると考えられる。クライオ電子顕微鏡および画像再構成データから、インタクトＡＡＶカプシドでは、ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のＮ末端領域はカプシド内に位置し、受容体および抗体結合にとってアクセスできないことが示唆されている。したがって、受容体の結合および形質導入表現型は一般的に、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の共通のＣ末端ドメイン内のアミノ酸配列によって決定される。
一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸挿入、置換、または欠失が、ＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶ、例えばＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶの溶媒アクセス可能部分に存在する。ＡＡＶカプシドのＧＨループ／ループＩＶに関しては、例えば、van Vliet et al. (2006) Mol. Ther. 14:809; Padron et al. (2005) Virol. 79:5047;およびShen et al. (2007) Mol. Ther. 15: 1955を参照されたい。一部の実施形態では、「親」ＡＡＶカプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ５カプシドタンパク質である。一部の実施形態では、「親」ＡＡＶカプシドタンパク質は、キメラＡＡＶカプシドタンパク質である。様々なＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列が当技術分野において公知である。例えば、ＡＡＶ１に関してＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０４９５４２；ＡＡＶ４に関してＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０４４９２７；ＡＡＶ５に関してＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ１３７５６；ＡＡＶ６に関してＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ９５４５０；ＡＡＶ７に関してＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿０７７１７８；ＡＡＶ８に関してＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿０７７１８０；ＡＡＶ９に関してＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＳ９９２６４、およびＡＡＶ１０に関してＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＴ４６３３７を参照されたい。例えば、予想される祖先ＡＡＶカプシドに関しては、Santiago-Ortiz et al. (2015) Gene Ther. 22:934を参照されたい。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損型パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは長さ約４．７ｋｂで、２つの１４５ヌクレオチドの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶには複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は公知である。例えば、ＡＡＶ５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６に提供される。ＡＡＶの生活環および遺伝学は、Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)において論評されている。シュードタイプｒＡＡＶの産生は、例えばＷＯ０１／８３６９２に開示されている。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えばカプシド変異を有するｒＡＡＶもまた企図される。例えば、Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)を参照されたい。例示的なＡＡＶベクターは、その各々が全ての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ７，１０５，３４５；ＵＳ１５／７８２，９８０；ＵＳ７，２５９，１５１；ＵＳ６，９６２，８１５；ＵＳ７，７１８，４２４号；ＵＳ６，９８４，５１７；ＵＳ７，７１８，４２４；ＵＳ６，１５６，３０３；ＵＳ８，５２４，４４６；ＵＳ７，７９０，４４９；ＵＳ７，９０６，１１１；ＵＳ９，７３７，６１８；米国出願１５／４３３，３２２；ＵＳ７，１９８，９５１に提供される。
本開示のｒＡＡＶビリオンは、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。遺伝子産物は、ポリペプチドまたはＲＮＡ、または両方であり得る。遺伝子産物がポリペプチドである場合、ヌクレオチド配列は、必要に応じて１つまたは複数のイントロンと共に遺伝子産物ポリペプチドに翻訳されるメッセンジャーＲＮＡをコードする。ヌクレオチド配列は、１つ、２つ、３つ、またはそれより多くの遺伝子産物をコードし得る（数字は、ｒＡＡＶビリオンのパッケージング能によって限定されるが、典型的には約５．２ｋｂである）。遺伝子産物は、１つのプロモーター（単一の転写単位に関して）または１つより多くのプロモーターに作動可能に連結され得る。配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または自己切断ペプチド（例えば、２Ａペプチド）を使用して、複数の遺伝子産物もまた産生され得る。
一部の実施形態では、遺伝子産物はポリペプチドである。一部の実施形態では、ポリペプチド遺伝子産物は、心臓線維芽細胞のリプログラミングを誘導して、誘導心筋細胞様細胞（ｉＣＭ）を生成するポリペプチドである。一部の実施形態では、ポリペプチド遺伝子産物は、心臓細胞の機能を増強するポリペプチドである。一部の実施形態では、ポリペプチド遺伝子産物は、心臓細胞において欠失しているまたは欠損している機能を提供するポリペプチドである。一部の実施形態では、ポリペプチド遺伝子産物はゲノム編集エンドヌクレアーゼである。
一部の実施形態では、遺伝子産物は、異種ポリペプチドに融合された融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、遺伝子産物は、細胞下局在を提供するアミノ酸配列に融合されたゲノム編集ヌクレアーゼを含み、すなわち、融合パートナーは、細胞下局在配列である（例えば、核を標的化するための１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、２つまたはそれより多くのＮＬＳ、３つまたはそれより多くのＮＬＳなど）。
一般的に、ウイルスベクターは、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を「産生細胞」または「パッケージング細胞」系に導入することによって産生される。パッケージング細胞系は、任意の容易にトランスフェクト可能な細胞系を含むがこれらに限定されない。パッケージング細胞系は、ＨＥＫ２９１、２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、またはＳｆ９細胞系に基づき得る。パッケージング細胞系の例としては、Ｓｆ９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１７１１（商標））が挙げられるがこれらに限定されない。ｒＡＡＶビリオンを生成するための例示的なパッケージング細胞系および方法は、国際特許出願番号ＷＯ２０１７０７５６２７、ＷＯ２０１５／０３１６８６、ＷＯ２０１３／０６３３７９、ＷＯ２０１１／０２０７１０、ＷＯ２００９／１０４９６４、ＷＯ２００８／０２４９９８、ＷＯ２００３／０４２３６１、およびＷＯ１９９５／０１３３９２；米国特許第９４４１２０６Ｂ２号、ＵＳ８６７９８３７、およびＵＳ７０９１０２９Ｂ２に提供される。
一部の実施形態では、遺伝子産物は、機能的な心臓タンパク質である。一部の実施形態では、遺伝子産物は、非機能的心臓タンパク質を機能的心臓タンパク質に交換または修復するゲノム編集エンドヌクレアーゼ（必要に応じて、ガイドＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ、および／または修復鋳型と共に）である。機能的心臓タンパク質としては、心トロポニンＴ；心サルコメアタンパク質；β－ミオシン重鎖；心室ミオシン必須軽鎖１（myosin ventricular essential light chain 1）；心室ミオシン調節軽鎖２（myosin ventricular regulatory light chain 2）；心ａ－アクチン；ａ－トロポミオシン；心トロポニンＩ；心ミオシン結合タンパク質Ｃ；ｆｏｕｒ－ａｎｄ－ａ－ｈａｌｆ ＬＩＭタンパク質１；チチン；５’－ＡＭＰ－活性化タンパク質キナーゼサブユニットガンマ－２；トロポニンＩ ３型、ミオシン軽鎖２、アクチンアルファ心筋１；心ＬＩＭタンパク質；カベオリン３（ＣＡＶ３）；ガラクトシダーゼアルファ（ＧＬＡ）；リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２）；ミトコンドリア転移ＲＮＡグリシン（ＭＴＴＧ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡイソロイシン（ＭＴＴＩ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡリシン（ＭＴＴＫ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡグルタミン（ＭＴＴＱ）；ミオシン軽鎖３（ＭＹＬ３）；トロポニンＣ（ＴＮＮＣ１）；トランスサイレチン（ＴＴＲ）；筋小胞体カルシウム－ＡＴＰアーゼ２ａ（ＳＥＲＣＡ２ａ）；間質由来因子－１（ＳＤＦ－１）；アデニレートシクラーゼ－６（ＡＣ６）；ベータ－ＡＲＫｃｔ（βアドレナリン受容体キナーゼＣ末端）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；肝細胞成長因子；低酸素誘導成長因子；チモシンベータ４（ＴＭＳＢ４Ｘ）；一酸化窒素シンターゼ－３（ＮＯＳ３）；ウノカルチン（unocartin）３（ＵＣＮ３）；メルシン；アポリポタンパク質－Ｅ（ＡｐｏＥ）；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；およびＳ１００Ａ１（低分子カルシウム結合タンパク質；例えば、Ritterhoff and Most (2012) Gene Ther. 19:613; Kraus et al. (2009) Mol. Cell. Cardiol. 47:445を参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、遺伝子産物は、その発現が遺伝子障害の原因である遺伝子における欠損を補う遺伝子産物である。本開示は、例えば限定されないが括弧内に示す障害に使用するためにまたは各々によって引き起こされる他の障害のために、以下：ＴＡＺ（バース症候群）；ＦＸＮ（フリードライヒ運動失調）；ＣＡＳＱ２（ＣＰＶＴ）；ＦＢＮ１（マルファン）；ＲＡＦ１およびＳＯＳ１（ヌーナン）；ＳＣＮ５Ａ（ブルガタ）；ＫＣＮＱ１およびＫＣＮＨ２（ＱＴ延長症候群）；ＤＭＰＫ（筋強直性ジストロフィー１型）；ＬＭＮＡ（肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ型）；ＪＵＰ（ナクソス）；ＴＧＦＢＲ２（ロイスディーツ）；ＥＭＤ（Ｘ連鎖ＥＤＭＤ）；およびＥＬＮ（ＳＶ大動脈弁狭窄）の１つまたは複数をコードするポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶビリオンを提供する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、心トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）；ＢＡＧファミリー分子シャペロン調節因子３（ＢＡＧ３）；ミオシン重鎖（ＭＹＨ７）；トロポミオシン１（ＴＰＭ１）；ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）；５’－ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼサブユニットガンマ－２（ＰＲＫＡＧ２）；トロポニンＩ ３型（ＴＮＮＩ３）；チチン（ＴＴＮ）；ミオシン、軽鎖２（ＭＹＬ２）；アクチン、アルファ心筋１型（ＡＣＴＣ１）；カリウム電位依存性チャネル、ＫＱＴ様サブファミリー、メンバー１（ＫＣＮＱ１）；プラコフィリン２（ＰＫＰ２）；筋細胞エンハンサー因子２ｃ（ＭＥＦ２Ｃ）；および心ＬＩＭタンパク質（ＣＳＲＰ３）のうちの１つまたは複数をコードするポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、本開示の遺伝子産物は、ポリペプチドリプログラミング因子である。リプログラミング因子は、１つの細胞タイプを別の細胞タイプへと変換する手段として望ましい。非心筋細胞を、当業者に利用可能な任意の方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで心筋細胞に分化させることができる。例えば、Ieda et al. (2010) Cell 142:375-386; Christoforou et al. (2013) PLoS ONE 8:e63577; Addis et al. (2013) J. Mol. Cell Cardiol. 60:97-106; Jayawardena et al. (2012) Circ. Res. 110: 1465-1473; Nam Y et al. (2003) PNAS USA 110:5588-5593; Wada R et al. (2013) PNAS USA 110: 12667-12672;およびFu J et al. (2013) Stem Cell Reports 1:235-247に記載される方法を参照されたい。
心臓の文脈において、リプログラミング因子は、直接または中間の細胞タイプを通して心臓線維芽細胞を心筋細胞に変換することが可能であり得る。特に、直接のリプログラミング、または最初に線維芽細胞を多能性もしくは全能性幹細胞に変換することによるリプログラミングが可能である。そのような多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）と呼ばれる。その後心筋（ＣＭ）細胞に変換されるｉＰＳ細胞は、ｉＰＳ－ＣＭ細胞と呼ばれる。この例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで心臓線維芽細胞に由来するｉＰＳ－ＣＭをｉｎ ｖｉｖｏで使用して目的のカプシドタンパク質を選択する。本開示はまた、本開示のカプシドタンパク質を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで順にｉＰＳ－ＣＭ細胞を生成することも想定しているが、特にｉｎ ｖｉｖｏで治療的遺伝子治療レジメンの一部として使用することを想定する。誘導心筋細胞様（ｉＣＭ）細胞は、心筋細胞へと直接リプログラミングされた細胞を指す。
誘導心筋細胞は、１つまたは複数の心筋細胞特異的マーカーを発現し、心筋細胞特異的マーカーとしては、心トロポニンＩ、心トロポニン－Ｃ、トロポミオシン、カベオリン－３、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖－２ａ、ミオシン軽鎖－２ｖ、リアノジン受容体、サルコメアａ－アクチニン、Ｎｋｘ２．５、コネキシン４３、および心房性ナトリウム利尿因子が挙げられるがこれらに限定されない。誘導心筋細胞はまた、サルコメア構造も示すことができる。誘導心筋細胞は、心筋細胞特異的遺伝子ＡＣＴＣ１（心ａ－アクチン）、ＡＣＴＮ２（アクチニンａ２）、ＭＹＨ６（ａ－ミオシン重鎖）、ＲＹＲ２（リアノジン受容体２）、ＭＹＬ２（ミオシン調節軽鎖２、心室アイソフォーム）、ＭＹＬ７（ミオシン調節軽鎖、心房アイソフォーム）、ＴＮＮＴ２（トロポニンＴ ２型、心臓）、およびＮＰＰＡ（ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ａ型）、ＰＬＮ（ホスホランバン）の発現の増加を示す。線維芽細胞マーカー、例えばＣｏｌｌａ２（コラーゲンｌａ２）の発現は、ｉＣＭが誘導される線維芽細胞と比較して誘導心筋細胞において下方調節されている。
ポリペプチドリプログラミング因子を伴うリプログラミング法（一部の例では、ｒＡＡＶと組み合わせて供給される低分子リプログラミング因子によって補充される）は、特に開示されるリプログラミングの方法および因子に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１８／０１１２２８２Ａ１、ＷＯ２０１８／００５５４６、ＷＯ２０１７／１７３１３７、ＵＳ２０１６／０１８６１４１、ＵＳ２０１６／０２５１６２４、米ＵＳ２０１４／０３０１９９１、およびＵＳ２０１３／０２１６５０３Ａ１に記載される方法を含む。
一部の実施形態では、心臓細胞は、Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅホモログ１（ＡＳＣＬ１）、ミオカルジン（ＭＹＯＣＤ）、筋細胞特異的エンハンサー因子２Ｃ（ＭＥＦ２Ｃ）、および／またはＴ－ボックス転写因子５（ＴＢＸ５）などの、目的の１つまたは複数のポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現をモジュレートする１つまたは複数のリプログラミング因子を使用して誘導心筋細胞様（ｉＣＭ）細胞へとリプログラミングされる。一部の実施形態では、１つまたは複数のリプログラミング因子は、目的の１つまたは複数のポリヌクレオチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡポリヌクレオチド）として提供される。一部の実施形態では、１つまたは複数のリプログラミング因子はタンパク質として提供される。
一部の実施形態では、リプログラミング因子は、マイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、または目的の１つもしくは複数のポリヌクレオチドもしくはタンパク質の発現を増加させることが可能な低分子である。一部の実施形態では、目的のポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現は、マイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡアンタゴニストの発現によって増加する。例えば、Ｏｃｔポリペプチドの内因性の発現は、マイクロＲＮＡ－３０２（ｍｉＲ－３０２）の導入によって、またはｍｉＲ－３０２の発現の増加によって増加させることができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Hu et al., Stem Cells 31(2): 259-68 (2013)を参照されたい。したがって、ｍｉＲＮＡ－３０２は、内因性のＯｃｔポリペプチド発現の誘導因子であり得る。ｍｉＲＮＡ－３０２は、単独でまたはＯｃｔポリペプチドをコードする核酸と共に導入することができる。一部の実施形態では、適した核酸遺伝子産物はマイクロＲＮＡである。適したｍｉｃｒＲＮＡとしては、例えばｍｉｒ－１、ｍｉｒ－１３３、ｍｉｒ－２０８、ｍｉｒ－１４３、ｍｉｒ－１４５、およびｍｉｒ－４９９が挙げられる。
一部の実施形態では、本開示の方法は、低分子リプログラミング因子の投与前、間、または後に本開示のｒＡＡＶビリオンを投与することを含む。一部の実施形態では、低分子リプログラミング因子は、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ－１９３１８９、デキサメタゾン、ＬＹ３６４９４７、Ｄ４４７６、ミリセチン、ＩＷＲ１、ＸＡＶ９３９、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、Ｓ－ニトロソ－ＴＶ－アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）、Ｈｈ－Ａｇｌ．５、アルプロスタジル、クロマカリム、ＭＮＩＴＭＴ、Ａ７６９６６２、レチノイン酸ｐ－ヒドロキシアニリド、二臭化デカメトニウム、ニフェジピン、ピロキシカム、バシトラシン、アズトレオナム、ハルマロール塩酸塩、アミド－Ｃ２（Ａ７）、Ｐｈ－Ｃ１２（ＣＩＯ）、ｍＣＦ３－Ｃ－７（Ｊ５）、Ｇ８５６－７２７２（Ａ４７３）、５４７５７０７、またはその任意の組合せからなる群から選択される低分子である。
一部の実施形態では、遺伝子産物は、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５から選択される目的の１つまたは複数のタンパク質の発現をモジュレートするリプログラミング因子を含む。一部の実施形態では、遺伝子産物は、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＡＵＲＫＢ、ＯＣＴ４、ＢＡＦ６０Ｃ、ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ２、ＩＲＸ４、ＩＳＬＬ、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＮＫＸ２．５、ＳＲＦ、ＴＢＸ２０、ＺＦＰＭ２、およびｍｉＲ－１３３から選択される１つまたは複数のリプログラミング因子を含む。
一部の実施形態では、遺伝子産物は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５（すなわち、ＧＭＴ）を含む。一部の実施形態では、遺伝子産物は、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５（すなわち、ＭｙＭＴ）を含む。一部の実施形態では、遺伝子産物は、ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５（すなわち、ＭｙＡＭＴ）を含む。一部の実施形態では、遺伝子産物は、ＭＹＯＣＤおよびＡＳＣＬ１（すなわち、ＭｙＡ）を含む。一部の実施形態では、遺伝子産物は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、およびＭＹＯＣＤ（すなわち、４Ｆ）を含む。他の実施形態では、遺伝子産物は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＥＳＳＲＧ、ＭＹＯＣＤ、ＺＦＰＭ２、およびＭＥＳＰ１（すなわち、７Ｆ）を含む。一部の実施形態では、遺伝子産物は、ＡＳＣＬ１、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５、ＭＹＯＣＤ、ＥＳＲＲＧ、およびＭＥＳＰＬの１つまたは複数を含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで心臓の筋細胞を生成する。心筋細胞または心臓の筋細胞は、心筋を構成する筋肉細胞である。各々の心筋細胞は、筋肉細胞の収縮単位であるサルコメアの長い鎖である筋原線維を含有する。心筋細胞は、骨格筋細胞の線紋（striation）と類似の線紋を示すが、１つの核のみを含有することから多核骨格細胞とは異なる。心筋細胞は、高いミトコンドリア密度を有し、それによってそれらはＡＴＰを迅速に産生することができ、疲労に対して非常に抵抗性となる。成熟心筋細胞は、以下の心マーカー：α－アクチニン、ＭＬＣ２ｖ、ＭＹ２０、ｃＭＨＣ、ＮＫＸ２－５、ＧＡＴＡ４、ｃＴＮＴ、ｃＴＮＩ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＬＣ２ａ、またはそれらの任意の組合せの１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、成熟心筋細胞は、ＮＫＸ２－５、ＭＥＦ２Ｃ、またはそれらの組合せを発現する。一部の実施形態では、心臓前駆細胞は、ＧＡＴＡ４、ＩＳＬ１、またはそれらの組合せなどの初期心臓前駆体マーカーを発現する。
一部の実施形態では、遺伝子産物はポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、以下に記載するように、遺伝子産物は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼに結合することが可能なガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、遺伝子産物は、例えば心臓細胞におけるｍＲＮＡおよび／またはポリペプチド遺伝子産物のレベルを低減することが可能な阻害性核酸である。例えば、一部の実施形態では、ポリヌクレオチド遺伝子産物は、心疾患または障害を引き起こす対立遺伝子によってコードされる転写物を選択的に不活化することが可能な干渉ＲＮＡである。一例として、対立遺伝子は、肥大型心筋症を引き起こす変異を含むミオシン重鎖７、心筋、ベータ（ＭＹＨ７）対立遺伝子である。他の例としては、肥大型心筋症（ＨＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）または左室心筋緻密化障害（ＬＶＮＣ）を引き起こす対立遺伝子によってコードされる転写物を選択的に不活化する干渉ＲＮＡが挙げられ、対立遺伝子はＭＹＬ３（ミオシン軽鎖３、アルカリ、心室、骨格遅筋型）、ＭＹＨ７、ＴＮＮＩ３（トロポニンＩ ３型（心臓））、ＴＮＮＴ２（トロポニンＴ ２型（心臓））、ＴＰＭｌ（トロポミオシン１（アルファ））、またはＨＣＭを引き起こす、ＤＣＭを引き起こす、もしくはＬＶＮＣを引き起こす変異を含むＡＣＴＣ１対立遺伝子である。心疾患を引き起こす変異の例に関しては、例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２３７４３０号を参照されたい。
一部の実施形態では、遺伝子産物はポリペプチドコードＲＮＡである。一部の実施形態では、遺伝子産物は干渉ＲＮＡである。一部の実施形態では、遺伝子産物はアプタマーである。一部の実施形態では、遺伝子産物はポリペプチドである。一部の実施形態では、遺伝子産物は治療ポリペプチド、例えば臨床上の利益を提供するポリペプチドである。一部の実施形態では、遺伝子産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、遺伝子産物は、標的核酸の改変を提供するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、遺伝子産物は：ｉ）標的核酸の改変を提供するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ；およびｉｉ）標的核酸中の標的配列に結合する第１のセグメントおよびＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼに結合する第２のセグメントを含むガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、遺伝子産物は：ｉ）標的核酸の改変を提供するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ；ｉｉ）標的核酸中の第１の標的配列に結合する第１のセグメントおよびＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼに結合する第２のセグメントを含む第１のガイドＲＮＡ；およびｉｉｉ）標的核酸中の第２の標的配列に結合する第１のセグメントおよびＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼに結合する第２のセグメントを含む第１のガイドＲＮＡである。
本開示のｒＡＡＶビリオンにおける異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列をプロモーターに操作可能に連結することができる。例えば、本開示のｒＡＡＶビリオンにおける異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を、構成的プロモーター、調節型プロモーター、または心臓細胞特異的プロモーターに操作可能に連結することができる。適した構成的プロモーターとしては、ヒト伸長因子１αサブユニット（ＥＦｌα）プロモーター、β－アクチンプロモーター、α－アクチンプロモーター、β－グルクロニダーゼプロモーター、ＣＡＧプロモーター、スーパーコアプロモーター、およびユビキチンプロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンにおける異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、心臓特異的転写調節エレメント（cardiac-specific transcriptional regulator element）（ＴＲＥ）に操作可能に連結され、心臓特異的ＴＲＥはプロモーターおよびエンハンサーを含む。適した心臓特異的ＴＲＥとしては、以下の遺伝子：ミオシン軽鎖－２（ＭＬＣ－２）、ａ－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）、デスミン、ＡＥ３、心トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）、および心アクチンに由来するＴＲＥが挙げられるがこれらに限定されない。Franz et al. (1997) Cardiovasc. Res. 35:560-566; Robbins et al. (1995) Ann. NY. Acad. Sci. 752:492-505; Linn et al. (1995) Circ. Res. 76:584-591; Parmacek et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 1870-1885; Hunter et al. (1993) Hypertension 22:608-617;およびSartorelli et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4047-4051。同様にPacak et al. (2008) Genet Vaccines Ther. 6:13も参照されたい。一部の実施形態では、プロモーターはα－ＭＨＣプロモーター、ＭＬＣ－２プロモーター、またはｃＴｎＴプロモーターである。
遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドは、遺伝子産物の発現を容易にするためにプロモーターおよび／またはエンハンサーに操作可能に連結される。利用する宿主／ベクター系に応じて、構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む任意の数の適した転写および翻訳制御エレメントをｒＡＡＶビリオンにおいて使用してもよい（例えば、Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544を参照されたい）。
別個のプロモーターおよび／またはエンハンサーを、ポリヌクレオチドの各々に関して用いることができる。一部の実施形態では、同じプロモーターおよび／またはエンハンサー（enhance）を単一のオープンリーディングフレームにおける２つまたはそれより多くのポリヌクレオチドのために使用する。遺伝子エレメントのこの立体配置を用いるベクターは「多シストロン性」と呼ばれる。多シストロン性ベクターの例示的な例は、２Ａ領域（複数可）によって連結された２つまたはそれより多くのポリヌクレオチドを含む単一のオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたエンハンサーおよびプロモーターを含み、それによってオープンリーディングフレームの発現により、複数のポリペプチドが共翻訳で生成される。２Ａ領域は、コドンスキッピングを通して複数のポリペプチド配列の生成を媒介すると考えられているが、本開示はまた、同じポリヌクレオチドから目的の２つまたはそれより多くのタンパク質を生成するために翻訳後切断を用いる多シストロン性ベクターにも関する。例示的な２Ａ配列、ベクター、および関連する方法は、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００４０２６５９５５Ａ１に提供される。
適した真核細胞プロモーター（真核細胞において機能的なプロモーター）の非限定的な例としては、レトロウイルス由来のＣＭＶ、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長末端反復（ＬＴＲ）、およびマウスメタロチオネイン－Ｉが挙げられる。一部の実施形態では、心臓特異的発現を付与することが可能なプロモーターを使用する。適した心臓特異的プロモーターの非限定的な例としては、デスミン（Ｄｅｓ）、アルファ－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ－２）、心トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、および心トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）が挙げられる。適したニューロン特異的プロモーターの非限定的な例としては、シナプシンＩ（ＳＹＮ）、カルシウム／カルモジュリン依存的タンパク質キナーゼＩＩ、チューブリンアルファＩ、ニューロン特異的エノラーゼおよび血小板由来成長因子ベータ鎖プロモーター、およびサイトメガロウイルスエンハンサー（Ｅ）をそれらのニューロン特異的プロモーターに融合させることによるハイブリッドプロモーターが挙げられる。
リプログラミング因子の発現を駆動するために適したプロモーターの例としては、レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）エレメント；構成的プロモーター、例えばＣＭＶ、ＨＳＶ１－ＴＫ、ＳＶ４０、ＥＦ－ｌａ、β－アクチン、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）；誘導性プロモーター、例えばＴｅｔ－オペレーターエレメントを含有するプロモーター；心臓特異的プロモーター、例えばデスミン（ＤＥＳ）、アルファ－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ－２）、心トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、および心トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）；神経特異的プロモーター、例えばネスチン、ニューロン核（ＮｅｕＮ）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）、ベータＩＩＩチューブリン、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、オリゴデンドロサイト系列（Ｏｌｉｇｌ／２）、およびグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；ならびに膵臓特異的プロモーター、例えばＰａｘ４、Ｎｋｘ２．２、Ｎｇｎ３、インスリン、グルカゴン、およびソマトスタチンが挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞タイプ特異的転写調節エレメント（ＴＲＥ）に操作可能に連結され、ＴＲＥはプロモーターおよびエンハンサーを含む。適したＴＲＥとしては、以下の遺伝子：ミオシン軽鎖－２、ａ－ミオシン重鎖、ＡＥ３、心トロポニンＣ、および心アクチンに由来するＴＲＥが挙げられるがこれらに限定されない。Franz et al. (1997) Cardiovasc. Res. 35:560-566; Robbins et al. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 752:492-505; Linn et al. (1995) Circ. Res. 76:584-591; Parmacek et al. (1994) Cell. Biol. 14:1870-1885; Hunter et al. (1993) Hypertension 22:608-617;およびSartorelli et al. (1992) PNAS USA 89:4047-4051。
プロモーターは、遺伝子または核酸セグメントに天然に会合したプロモーターであり得る。同様に、ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）に関して、プロモーターは、マイクロＲＮＡ遺伝子（例えば、ｍｉＲＮＡ－３０２遺伝子）に天然に会合したプロモーターであり得る。そのような天然に会合したプロモーターは、「天然のプロモーター」と呼ぶことができ、コードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得ることができる。同様に、エンハンサーは、核酸配列に天然に会合したエンハンサーであり得る。しかし、エンハンサーはその配列の下流または上流のいずれかに位置することができる。
あるいは、ある特定の利点は、コード核酸セグメントを、その天然の環境において核酸に通常会合しないプロモーターを指す組換えまたは異種プロモーターの制御下に配置することによって得られる。組換えまたは異種エンハンサーはまた、その天然の環境における核酸配列に通常会合しないエンハンサーも指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および他の任意の原核細胞、ウイルス、または真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に存在しない」、すなわち異なる転写調節領域の異なるエレメントおよび／または発現を変更する変異を含有するプロモーターまたはエンハンサーを含み得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成によって産生することに加えて、本明細書に開示される組成物と共に、組換えクローニングおよび／またはＰＣＲ（商標）を含む核酸増幅技術を使用して、配列を産生してもよい（その各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照されたい）。
使用されるプロモーターは、構成的、誘導性、発達特異的、組織特異的であり得、および／または核酸セグメントの高レベル発現を指示する適切な条件下で有用であり得る。例えば、プロモーターは、構成的プロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶサイトメガロウイルス前初期プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＨＳＶ１－ＴＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、β－アクチンプロモーター、ＰＧＫプロモーター、またはそれらの組合せであり得る。使用することができる真核細胞プロモーターの例としては、構成的プロモーター、例えばウイルスプロモーター、例えばＣＭＶ、ＳＶ４０、およびＲＳＶプロモーター、ならびに調節型プロモーター、例えば誘導性または抑制性プロモータープロモーター、例えばｔｅｔプロモーター、ｈｓｐ７０プロモーター、およびＣＲＥによって調節される合成プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、細胞タイプ特異的プロモーターを使用して特異的細胞タイプにおいてリプログラミング因子の発現を駆動する。本明細書に記載される方法にとって有用な適した細胞タイプ特異的プロモーターの例としては、He et al (2006), Human Gene Therapy 17:949-959に記載される合成マクロファージ特異的プロモーター；顆粒球およびマクロファージ特異的リゾチームＭプロモーター（例えば、Faust et al (2000), Blood 96(2):719-726を参照されたい）；および骨髄系特異的ＣＤ１１ｂプロモーター（例えば、Dziennis et al (1995), Blood 85(2):319-329を参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない。用いることができるプロモーターの他の例としては、ヒトＥＦ１α伸長因子プロモーター、ＣＭＶサイトメガロウイルス前初期プロモーター、ＣＡＧニワトリアルブミンプロモーター、本明細書に記載されるウイルスベクターのいずれかに関連するウイルスプロモーター、または本明細書に記載されるプロモーターのいずれかと相同であるプロモーター（例えば、別の種からの）が挙げられる。使用することができる原核細胞プロモーターの例としては、ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ５、ｔａｃ、ｂｌａ、ｔｒｐ、ｇａｌ、ｌａｃ、またはマルトースプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを使用して、マルチ遺伝子または多シストロン性のメッセージを作り出すことができる。ＩＲＥＳエレメントは、５’－メチル化Ｃａｐ依存的翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回して、内部の部位で翻訳を開始することができる（Pelletier and Sonenberg, Nature 334(6180):320-325 (1988)）。ピコルナウイルス科の２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎ウイルス）からのＩＲＥＳエレメント（Pelletier and Sonenberg, Nature 334(6180):320-325 (1988)）、ならびに哺乳動物メッセージからのＩＲＥＳ（Macejak & Samow, Nature 353:90-94 (1991)）が記載されている。ＩＲＥＳエレメントを、異種オープンリーディングフレームに連結することができる。ＩＲＥＳによって各々が隔てられた複数のオープンリーディングフレームを共に転写し、多シストロン性メッセージを作製することができる。ＩＲＥＳエレメントにより、各々のオープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにアクセス可能である。複数の遺伝子を、単一のプロモーター／エンハンサーを使用して効率よく発現させ、単一のメッセージを転写することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９号を参照されたい）。
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ポリアデニル化配列に操作可能に連結される。適したポリアデニル化配列としては、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル（ｂＧＨｐｏｌｙＡ）および短いポリＡシグナルが挙げられる。必要に応じて、本開示のｒＡＡＶベクターは、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む（compriset）。一部の実施形態では、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドは、いわゆる自己切断ペプチド、例えばＰ２Ａペプチドを含む配列によって結合される。
一部の実施形態では、遺伝子産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的エンドヌクレアーゼを含み、例えばエンドヌクレアーゼは心疾患または障害に関連する対立遺伝子をノックアウトする。例えば、優性対立遺伝子が、野生型の場合、心臓構造タンパク質である、および／または正常な心機能を提供する遺伝子の欠損コピーをコードする場合、部位特異的エンドヌクレアーゼを、欠損対立遺伝子を標的化とし、欠損対立遺伝子をノックアウトすることができる。一部の実施形態では、部位特異的エンドヌクレアーゼはＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。
欠損対立遺伝子のノックアウトに加えて、部位特異的ヌクレアーゼをまた使用して、欠損対立遺伝子によってコードされるタンパク質の機能的コピーをコードするドナーＤＮＡとの相同組換えを刺激することができる。例えば、主題のｒＡＡＶビリオンを使用して、欠損対立遺伝子、欠損対立遺伝子（またはその断片）の機能的コピーをノックアウトする両方の部位特異的エンドヌクレアーゼを送達して、欠損対立遺伝子の修復をもたらすことができ、それによって機能的な心臓タンパク質（例えば、機能的トロポニンなど）の産生を提供することができる。一部の実施形態では、本発明のｒＡＡＶビリオンは、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする異種ヌクレオチド配列、および機能的心臓タンパク質をコードする、欠損対立遺伝子の機能的コピーをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。機能的心臓タンパク質としては、例えば、トロポニン、塩素イオンチャネルなどが挙げられる。
使用するために適した部位特異的エンドヌクレアーゼとしては、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；メガヌクレアーゼ；および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられ、そのような部位特異的エンドヌクレアーゼは天然に存在せず、特定の遺伝子を標的とするように改変される。そのような部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノム内の特定の位置を切断するように操作することができ、次に非相同末端結合がいくつかのヌクレオチドを挿入または欠失させながら切断部を修復することができる。そのような部位特異的ヌクレアーゼ（同様に、「ＩＮＤＥＬ」とも呼ばれる）は、その後にフレームからタンパク質を放出し、遺伝子を有効にノックアウトする。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。適した部位特異的エンドヌクレアーゼとしては、操作されたメガヌクレアーゼ、再操作されたホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。適したエンドヌクレアーゼは、Ｉ－Ｔｅｖｌヌクレアーゼを含む。適したメガヌクレアーゼは、Ｉ－Ｓｃｅｌ（例えば、Bellaiche et al. (1999) Genetics 152: 1037を参照されたい）；およびＩ－Ｃｒｅｌ（例えば、Heath et al. (1997) Nature Sructural Biology 4:468を参照されたい）を含む。使用するために適した部位特異的エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲｉ系およびＣａｓ９に基づくＳＡＭ系を含む。
一部の実施形態では、遺伝子産物は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、遺伝子産物は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡを含む。一部の実施形態では、遺伝子産物は、ガイドＲＮＡ、例えばシングルガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、遺伝子産物は：１）ガイドＲＮＡ；および２）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。ガイドＲＮＡは：ａ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼに結合するタンパク質結合領域；およびｂ）標的核酸に結合する領域を含み得る。ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼはまた、本明細書において「ゲノム編集ヌクレアーゼ」とも呼ばれる。
適したゲノム編集ヌクレアーゼの例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えばＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）である。適したゲノム編集ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えばＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）である。一部の実施形態では、遺伝子産物は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、遺伝子産物は、クラス２ ＩＩ型 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）を含む。一部の実施形態では、遺伝子産物は、クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆｌタンパク質、Ｃ２ｃｌタンパク質、またはＣ２ｃ３タンパク質）を含む。一部の実施形態では、遺伝子産物は、クラス２ ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質；「Ｃａｓｌ３ａ」タンパク質とも呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、遺伝子産物はＣａｓＸタンパク質を含む。一部の実施形態では、遺伝子産物はＣａｓＹタンパク質を含む。
使用方法
一部の実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶビリオンに、標的細胞において形質導入効率の増加をもたらすＡＡＶカプシドタンパク質を同定する方法を提供する。方法は、ｒＡＡＶビリオンの集団を提供するステップであって、そのｒＡＡＶゲノムがバリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードするｃａｐポリヌクレオチドのライブラリーを含む、ステップ；必要に応じて非標的細胞への望ましくないｒＡＡＶビリオンの結合を可能にするために十分な期間、集団に非標的細胞を接触させるステップ；ｒＡＡＶビリオンによる標的細胞へのｃａｐポリヌクレオチドの形質導入を可能にするために十分な期間、集団に標的細胞を接触させるステップ；および標的細胞からのｃａｐポリヌクレオチドをシーケンシングし、それによって標的細胞において形質導入効率の増加をもたらすＡＡＶカプシドタンパク質を同定するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、非標的細胞へのｒＡＡＶビリオンの結合を可能にするために十分な期間、集団に非標的細胞を接触させることによってｒＡＡＶビリオンの集団を枯渇させるステップをさらに含む。そのような同定方法の非制限的な例を実施例に提供する。
本開示は、ｒＡＡＶビリオンを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで心筋細胞および／または心筋細胞様細胞を生成する方法を提供する。選択された開始細胞をｒＡＡＶで形質導入し、必要に応じて、開始細胞を系列および／または分化境界を越えて変換させるために十分な時間および条件で、低分子リプログラミング因子に（形質導入の前、間、または後に）曝露し、心臓前駆細胞および／または心筋細胞を形成させる。一部の実施形態では、開始細胞は線維芽細胞である。一部の実施形態では、開始細胞は分化表現型を示す１つまたは複数のマーカーを発現する。開始細胞を心臓前駆細胞および心筋細胞に変換させるための時間は多様であり得る。例えば、開始細胞を、心臓細胞または心筋細胞マーカーが発現されるまで、目的の１つまたは複数のポリヌクレオチドまたはタンパク質による処置後にインキュベートしてもよい。そのような心臓細胞または心筋細胞マーカーは、以下のマーカー：α－ＧＡＴＡ４、ＴＮＮＴ２、ＭＹＨ６、ＲＹＲ２、ＮＫＸ２－５、ＭＥＦ２Ｃ、ＡＮＰ、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＭＬＣ２ｖ、ＭＹ２０、ｃＭＨＣ、ＩＳＬ１、ｃＴＮＴ、ｃＴＮＩ、およびＭＬＣ２ａ、またはそれらの任意の組合せのいずれかを含み得る。一部の実施形態では、誘導心筋細胞は、１つまたは複数のニューロン細胞マーカーに関して陰性である。そのようなニューロン細胞マーカーは、以下のマーカー：ＤＣＸ、ＴＵＢＢ３、ＭＡＰ２、およびＥＮＯ２のいずれかを含み得る。
心臓前駆体マーカーが開始細胞によって発現されるまで、インキュベーションを進行させることができる。そのような心臓前駆体マーカーとしては、ＧＡＴＡ４、ＴＮＮＴ２、ＭＹＨ６、ＲＹＲ２、またはそれらの組合せが挙げられる。心臓前駆体マーカー、例えばＧＡＴＡ４、ＴＮＮＴ２、ＭＹＨ６、ＲＹＲ２、またはそれらの組合せは、本明細書に記載される組成物中の細胞のインキュベーションの開始後約８日までに、または約９日までに、または約１０日までに、または約１１日までに、または約１２日までに、または約１４日までに、または約１５日までに、または約１６日までに、または約１７日までに、または約１８日までに、または約１９日までに、または約２０日までに発現され得る。細胞のさらなるインキュベーションを、ＮＫＸ２－５、ＭＥＦ２Ｃ、またはそれらの組合せなどの後期心臓前駆体マーカーの発現がおこるまで実施することができる。
リプログラミング効率は、心筋細胞マーカーの関数として測定され得る。そのような多能性マーカーとしては、心筋細胞マーカータンパク質およびｍＲＮＡの発現、心筋細胞の形態、および電気生理学表現型が挙げられるがこれらに限定されない。心筋細胞マーカーの非限定的な例としては、ａ－サルコグリカン、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、コネキシン３７、コネキシン４０、クリプト、デスミン、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＨ６、ミオシン重鎖、ＮＫＸ２．５、ＴＢＸ５、およびトロポニンＴが挙げられる。
心筋細胞に対して特異的な様々なマーカーの発現は、従来の生化学または免疫化学法（例えば、酵素結合免疫吸着検定法、免疫組織化学的アッセイなど）によって検出され得る。あるいは、心筋細胞特異的マーカーをコードする核酸の発現を評価することができる。細胞における心筋細胞特異的マーカーコード核酸の発現は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）またはハイブリダイゼーション分析、任意のマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡを増幅、検出、および分析するためにこれまで一般的に使用されている分子生物学的方法によって確認することができる。心筋細胞に対して特異的なマーカーをコードする核酸配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋなどの公共のデータベースから入手可能である。このように、プライマーまたはプローブとして使用するために必要なマーカー特異的配列は、容易に決定される。
心筋細胞は、何らかの心臓特異的電気生理学的特性を示す。１つの電気的特徴は活動電位であり、これは各心臓細胞の内部と外部との間の電位差が一貫した軌跡に従って上昇および下降する、持続の短い事象である。心筋細胞の別の電気生理学的特徴は、Ｃａ２＋トランジェントと呼ばれる細胞質の遊離のＣａ２＋濃度の周期的変動であり、これは心筋細胞の収縮および弛緩の調節に用いられる。これらの特徴を検出および評価して、細胞の集団が心筋細胞へとリプログラミングされているかどうかを評価することができる。
本開示は、遺伝子産物を心臓細胞、例えば、心臓線維芽細胞に送達する方法を提供する。方法は一般的に、心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）にｒＡＡＶビリオンを感染させることを伴い、ｒＡＡＶビリオンに存在する異種核酸によってコードされる遺伝子産物（複数可）が心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）において産生される。遺伝子産物（複数可）を心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）に送達すると、心疾患または障害の処置を提供することができる。遺伝子産物（複数可）を心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）に送達すると、心臓線維芽細胞からの誘導心筋細胞様（ｉＣＭ）細胞の生成を提供することができる。遺伝子産物（複数可）を心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）に送達すると、心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）のゲノムの編集を提供することができる。
一部の実施形態では、心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）の感染または形質導入はｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。一部の実施形態では、心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）の感染または形質導入はｉｎ ｖｉｔｒｏで行われ；感染／形質導入した心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）は、それを必要とする個体に導入される（例えば、輸注されるまたは植え込まれる）、例えばそれを必要とする個体の心組織に直接導入される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入に関して、細胞に送達されるｒＡＡＶビリオンの有効量は、ｒＡＡＶビリオンの約１０５～約１０１３個である。他の有効な投薬量は、用量応答曲線を確立するルーチンの試験を通して当業者が容易に確立することができる。
一部の実施形態では、心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）の感染はｉｎ ｖｉｖｏで行われる。例えば一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、それを必要とする個体の心組織に直接投与される。「有効量」は、実験および／または臨床試験を通して決定することができる比較的広範囲に入る。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ注射、すなわち心組織への直接注射の場合、治療有効量は、本開示のｒＡＡＶビリオン約１０６～約１０１５程度、例えばｒＡＡＶビリオン約１０５～１０１２程度である。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、心外膜を通しての心筋内注射を介して投与される。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、冠動脈を通しての血管送達を介して投与される。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、上大静脈を通しての全身送達を介して投与される。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、末梢静脈を通しての全身送達を介して投与される。
例えば、約１０４～約１０５、約１０５～約１０６、約１０６～約１０７、約１０６～約１０７、約１０７～約１０８、約１０８～約１０９、約１０９～約１０１０ 、約１０１０～約１０１１、約１０１１まで（to about 1011）、約１０１１～約１０１２、約１０１２～約１０１３、約１０１３～約１０１４、約１０１４～約１０１５ゲノムコピーまたは１０１５ゲノムコピーより多くの本開示のｒＡＡＶビリオンが個体に投与され、例えば個体の心組織に直接投与されるか、または別の経路を介して投与される。個体に投与されるｒＡＡＶビリオンの数は、個体の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのウイルスゲノム（ｖｇ）として表記することができる。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、約１０２ｖｇ／ｋｇ～１０４ｖｇ／ｋｇ、約１０４ｖｇ／ｋｇ～約１０６ｖｇ／ｋｇ、約１０６ｖｇ／ｋｇ～約１０８ｖｇ／ｋｇ、約１０８ｖｇ／ｋｇ～約１０１０ｖｇ／ｋｇ、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１２ｖｇ／ｋｇ、約１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１０１４ｖｇ／ｋｇ、約１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１０１６ｖｇ／ｋｇ、約１０１６ｖｇ／ｋｇ～約１０１８ｖｇ／ｋｇであるか、または１０１８ｖｇ／ｋｇより多い。
一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、心外膜を通しての心筋内注射を介して投与される。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、冠動脈を通しての血管送達を介して投与される。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、上大静脈を通しての全身送達を介して投与される。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、末梢静脈を通しての全身送達を介して投与される。
一部の実施形態では、遺伝子発現の所望のレベルを達成するために、１回より多くの投与（例えば、２回、３回、４回またはそれより多くの投与）を用いてもよい。一部の実施形態では、１回より多くの投与は、様々な間隔で投与され、例えば、毎日、毎週、月に２回、毎月、３ヶ月毎、６ヶ月毎、毎年などの間隔で投与される。一部の実施形態では、複数回の投与は、１ヶ月～２ヶ月、２ヶ月～４ヶ月、４ヶ月～８ヶ月、８ヶ月～１２ヶ月、１年～２年、２年～５年、または５年より長い期間にわたって投与される。
本開示は、心臓線維芽細胞をリプログラムして誘導心筋細胞様細胞（ｉＣＭ）を生成する方法を提供する。方法は一般的に、心臓線維芽細胞に本開示のｒＡＡＶビリオンを感染させることを伴い、ｒＡＡＶビリオンは、１つまたは複数のリプログラミング因子をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。
心筋細胞に特異的な様々なマーカーの発現は、従来の生化学または免疫化学的方法（例えば、酵素結合免疫吸着検定法；免疫組織化学的アッセイなど）によって検出される。あるいは、心筋細胞特異的マーカーをコードする核酸の発現を評価することができる。細胞における心筋細胞特異的マーカーコード核酸の発現は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）またはハイブリダイゼーション分析、任意のマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡを増幅、検出、および分析するためにこれまで一般的に使用されている分子生物学的方法によって確認することができる。心筋細胞に対して特異的なマーカーをコードする核酸配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋなどの公共のデータベースを通して入手可能である；このように、プライマーまたはプローブとして使用するために必要なマーカー特異的配列は容易に決定される。
誘導心筋細胞はまた、自発収縮も示すことができる。誘導心筋細胞が自発収縮を示すかどうかは、標準的な電気生理学的方法（例えば、パッチクランプ）を使用して決定することができる。
一部の実施形態では、誘導心筋細胞は、自発的Ｃａ２＋オシレーションを示すことができる。Ｃａ２＋オシレーションは、標準的な方法を使用して、例えば多様なカルシウム感受性色素のいずれかを使用して検出することができ、細胞内Ｃａ２＋イオン検出色素としては、ｆｕｒａ－２、ｂｉｓ－ｆｕｒａ ２、ｉｎｄｏ－１、Ｑｕｉｎ－２、Ｑｕｉｎ－２ ＡＭ、ベンゾチアザ－１、ベンゾチアザ－２、ｉｎｄｏ－５Ｆ、Ｆｕｒａ－ＦＦ、ＢＴＣ、Ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２、Ｍａｇ－Ｆｕｒａ－５、Ｍａｇ－Ｉｎｄｏ－１、ｆｌｕｏ－３、ｒｈｏｄ－２、ｒｈｏｄ－３、ｆｕｒａ－４Ｆ、ｆｕｒａ－５Ｆ、ｆｕｒａ－６Ｆ、ｆｌｕｏ－４、ｆｌｕｏ－５Ｆ、ｆｌｕｏ－５Ｎ、オレゴングリーン４８８ ＢＡＰＴＡ、カルシウムグリーン、カルセイン、Ｆｕｒａ－Ｃ１８、カルシウムグリーン－Ｃ１８、カルシウムオレンジ、カルシウムクリムゾン、カルシウムグリーン－５Ｎ、マグネシウムグリーン、オレゴングリーン４８８ ＢＡＰＴＡ－１、オレゴングリーン４８８ ＢＡＰＴＡ－２、Ｘ－ｒｈｏｄ－１、Ｆｕｒａ Ｒｅｄ、Ｒｈｏｄ－５Ｆ、Ｒｈｏｄ－５Ｎ、Ｘ－Ｒｈｏｄ－５Ｎ、Ｍａｇ－Ｒｈｏｄ－２、Ｍａｇ－Ｘ－Ｒｈｏｄ－１、Ｆｌｕｏ－５Ｎ、Ｆｌｕｏ－５Ｆ、Ｆｌｕｏ－４ＦＦ、Ｍａｇ－Ｆｌｕｏ－４、エクオリン、デキストランコンジュゲートまたはこれらの色素のいずれかの他の任意の誘導体、およびその他（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅのカタログまたはインターネットサイトを参照されたく、同様にNuccitelli, ed., Methods in Cell Biology, Volume 40: A Practical Guide to the Study of Calcium in Living Cells, Academic Press (1994); Lambert, ed., Calcium Signaling Protocols (Methods in Molecular Biology Volume 114), Humana Press (1999); W. T. Mason, ed., Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. A Practical Guide to Technology for Quantitative Real-Time Analysis, Second Ed, Academic Press (1999); Calcium Signaling Protocols (Methods in Molecular Biology), 2005, D.G. Lamber, ed., Humana Pressも参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、ｉＣＭは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成され；ｉＣＭは、個体に導入され、例えば、ｉＣＭは、それを必要とする個体の心組織に植え込まれる。本開示の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで心臓線維芽細胞集団を感染させて、ｉＣＭ集団を生成することを含み得；ｉＣＭの集団は、それを必要とする個体の心組織に植え込まれる。
一部の実施形態では、ｉＣＭはｉｎ ｖｉｖｏで生成される。例えば、一部の実施形態では、１つまたは複数のリプログラミング因子をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む本開示のｒＡＡＶビリオンが、個体に投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、それを必要とする個体の心組織に直接投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数のリプログラミング因子をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む本開示のｒＡＡＶビリオンの約１０６～約１０５、約１０５～約１０９、約１０９～約１０１０、約１０１０～約１０１１、約１０１１～約１０１２、約１０１２～約１０１３、約１０１３～約１０１４、約１０１４～約１０１５ゲノムコピー、または１０１５ゲノムコピーより多くが個体に投与され、例えば個体の心組織に直接投与されるか、または別の投与経路を介して投与される。個体に投与されるｒＡＡＶビリオンの数は、個体の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのウイルスゲノム（ｖｇ）として表記することができる。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、約１０２ｖｇ／ｋｇ～１０４ｖｇ／ｋｇ、約１０４ｖｇ／ｋｇ～約１０６ｖｇ／ｋｇ、約１０６ｖｇ／ｋｇ～約１０８ｖｇ／ｋｇ、約１０８ｖｇ／ｋｇ～約１０１０ｖｇ／ｋｇ、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１２ｖｇ／ｋｇ、約１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１０１４ｖｇ／ｋｇ、約１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１０１４ｖｇ／ｋｇ、約１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１０１６ｖｇ／ｋｇであるか、または１０１６ｖｇ／ｋｇより多い。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、心外膜を通しての心筋内注射を介して投与される。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、冠動脈を通しての血管送達を介して投与される。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、上大静脈を通しての全身送達を介して投与される。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、末梢静脈を通しての全身送達を介して投与される。
本開示は、心臓細胞のゲノムを改変する（「編集する」）方法を提供する。本開示は、心臓線維芽細胞のゲノムを改変する（「編集する」）方法を提供する。本開示は、心筋細胞のゲノムを改変する（「編集する」）方法を提供する。方法は一般的に、心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞または心筋細胞）に本開示のｒＡＡＶビリオンを感染させることを伴い、ｒＡＡＶビリオンはゲノム編集エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。一部の実施形態では、方法は、心臓線維芽細胞または心筋細胞に本開示のｒＡＡＶビリオンを感染させるステップを含み、ｒＡＡＶビリオンはＲＮＡガイドゲノム編集エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。一部の実施形態では、方法は、心臓線維芽細胞または心筋細胞に本開示のｒＡＡＶビリオンを感染させるステップを含み、ｒＡＡＶビリオンはｉ）ＲＮＡガイドゲノム編集エンドヌクレアーゼ、およびｉｉ）１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。一部の実施形態では、方法は、心臓線維芽細胞または心筋細胞に本開示のｒＡＡＶビリオンを感染させるステップを含み、ｒＡＡＶビリオンはｉ）ＲＮＡガイドゲノム編集エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）ガイドＲＮＡ、およびｉｉｉ）ドナー鋳型ＤＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。適したＲＮＡガイドゲノム編集エンドヌクレアーゼは上記の通りである。
一部の実施形態では、心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞；心筋細胞）を感染させるステップはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。一部の実施形態では、心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞；心筋細胞）を感染させるステップはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われ；感染した心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞）は、それを必要とする個体に導入され（例えば、植え込まれ）、例えばそれを必要とする個体の心組織に直接導入される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入の場合、細胞に送達されるｒＡＡＶビリオンの有効量は、約１０ｓ～約１０１３程度のｒＡＡＶビリオンである。他の有効な投薬量は、用量応答曲線を確立するルーチンの試験を通して当業者によって容易に確立することができる。
一部の実施形態では、心臓細胞（例えば、心臓線維芽細胞；心筋細胞）を感染させるステップはｉｎ ｖｉｖｏで行われる。例えば、一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、それを必要とする個体の心組織に直接投与される。「有効量」は、実験および／または臨床試験を通して決定することができる比較的広い範囲に入る。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ注射の場合、すなわち心組織に直接注射する場合、治療有効用量は、本開示のｒＡＡＶビリオンの約１０６～約１０１５程度、例えばｒＡＡＶビリオン約１０１１～１０１２程度である。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、心外膜を通しての心筋内注射を介して投与される。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、冠動脈を通しての血管送達を介して投与される。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、上大静脈を通しての全身送達を介して投与される。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、末梢静脈を通しての全身送達を介して投与される。
例えば、本開示のｒＡＡＶビリオンの約１０６～約１０７、約１０７～約１０８、約１０８～約１０９、約１０９～約１０１０、約１０１０～約１０１１、約ｌ０１１～約１０１２、約１０１２～約１０１３、約１０１３～約１０１４、約１０１４～約１０１５ゲノムコピー、または１０１５ゲノムコピーより多くが個体に投与され、例えば個体の心組織に直接投与される。個体に投与されるｒＡＡＶビリオンの数は、個体の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのウイルスゲノム（ｖｇ）として表記することができる。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、約１０２ｖｇ／ｋｇ～１０４ｖｇ／ｋｇ、約１０４ｖｇ／ｋｇ～約１０６ｖｇ／ｋｇ、約１０６ｖｇ／ｋｇ～約１０８ｖｇ／ｋｇ、約１０８ｖｇ／ｋｇ～約１０１０ｖｇ／ｋｇ、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１２ｖｇ／ｋｇ、約１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１０１４ｖｇ／ｋｇ、約１０１４ｖｇ／ｋｇ～約１０１６ｖｇ／ｋｇ、約１０１６ｖｇ／ｋｇ～約１０１８ｖｇ／ｋｇであるか、または１０１８ｖｇ／ｋｇより多い。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、心外膜を通しての心筋内注射を介して投与される。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、冠動脈を通しての血管送達を介して投与される。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、上大静脈を通しての全身送達を介して投与される。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶビリオンの有効量は、末梢静脈を通しての全身送達を介して投与される。
一部の実施形態では、ゲノム編集は、相同組換え修復（ＨＤＲ）を含む。一部の実施形態では、ＨＤＲは、心臓線維芽細胞または心筋細胞における内因性の標的核酸の欠損を修正し、欠損は、心臓線維芽細胞もしくは心筋細胞の構造および／もしくは機能の欠損または心臓線維芽細胞もしくは心筋細胞の構成要素の欠損に関連するか、またはそれをもたらす。
一部の実施形態では、ゲノム編集は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含む。一部の実施形態では、ＮＨＥＪは、心臓線維芽細胞または心筋細胞における内因性の標的核酸の欠損を欠失させ、欠損は、心臓線維芽細胞もしくは心筋細胞の構造および／もしくは機能の欠損または心臓線維芽細胞もしくは心筋細胞の構成要素の欠損に関連するか、またはそれをもたらす。
心臓細胞のゲノムを編集するための本開示の方法を使用して、心疾患または障害を生じる任意の多様な遺伝子欠損を修正することができる。目的の変異は、以下の遺伝子：心トロポニンＴ（ＴＮＮＴ２）；ミオシン重鎖（ＭＹＨ７）；トロポミオシン１（ＴＰＭ１）；ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）；５’－ＡＭＰ－活性化タンパク質キナーゼサブユニットガンマ－２（ＰＲＫＡＧ２）；トロポニンＩ ３型（ＴＮＮＩ３）；チチン（ＴＴＮ）；ミオシン、軽鎖２（ＭＹＬ２）；アクチン、アルファ心筋１（ＡＣＴＣ１）；カリウム電位依存チャネル、ＫＱＴ－様サブファミリー、メンバー１（ＫＣＮＱ１）；プラコフィリン２（ＰＫＰ２）；筋細胞エンハンサー因子２ｃ（ＭＥＦ２Ｃ）；および心ＬＩＭタンパク質（ＣＳＲＰ３）のうちの１つまたは複数における変異を含む。目的の特定の変異としては、ＭＹＨ７ Ｒ６６３Ｈ変異；ＴＮＮＴ２ Ｒ１７３Ｗ；ＰＫＰ２ ２０１３ｄｅｌＣ変異；ＰＫＰ２ Ｑ６１７Ｘ変異；およびＫＣＮＱ１ Ｇ２６９Ｓミスセンス変異が挙げられるがこれらに限定されない。目的の変異は、以下の遺伝子：ＭＹＨ６、ＡＣＴＮ２、ＳＥＲＣＡ２、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５、ＭＹＯＣＤ、ＮＫＸ２－５、ＮＯＴＣＨ１、ＭＥＦ２Ｃ、ＨＡＮＤ２、およびＨＡＮＤ１のうちの１つまたは複数における変異を含む。一部の実施形態では、目的の変異は、以下の遺伝子：ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、およびＭＹＯＣＤにおける変異を含む。本開示の方法によって処置することができる心疾患および障害としては、冠動脈心疾患、心筋症、心外膜炎、先天性心血管欠損、およびうっ血性心不全が挙げられる。本開示の方法によって処置することができる心疾患および障害としては、肥大型心筋症；心臓弁膜症；心筋梗塞；うっ血性心不全；ＱＴ延長症候群；心房性不整脈；心室性不整脈；拡張型心不全；収縮型心不全；心臓弁疾患；心臓弁石灰化；左室心筋緻密化障害；心室中隔欠損；および虚血が挙げられる。
処置の方法
本開示は、それを必要とする対象における心病態を処置する方法であって、ｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含み、ｒＡＡＶビリオンが心組織を形質導入する、方法を提供する。
本開示の組成物および方法を使用する処置を必要とする対象は、先天性心欠損を有する個体、筋変性疾患に罹患している個体、虚血性心組織をもたらす状態に罹患している個体（例えば冠動脈疾患を有する個体）などが挙げられるがこれらに限定されない。一部の例では、方法は、筋変性疾患または状態（例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、または虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患）を処置するために有用である。一部の例では、本発明の方法は、心または心血管疾患または障害、例えば心血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管事故（卒中）、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、冠動脈弁疾患（valve disease coronary）、動脈拡張症（artery disease dilated）、収縮機能障害、心内膜炎、高血圧（ｈｉｇｈ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）（高血圧症（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ））、心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患、僧帽弁逸脱、心筋梗塞（心臓発作）、または静脈血栓塞栓症を有する個体を処置するために有用である。
本開示の組成物、細胞、および方法を使用する処置にとって適した対象は、虚血性心組織をもたらす状態を含むがこれらに限定されない心状態を有する（例えば冠動脈疾患を有する個体）個体（例えば哺乳動物対象、例えばヒト、非ヒト霊長類、家庭哺乳動物、実験用の非ヒト哺乳動物対象、例えばマウス、ラットなど）などを含む。
一部の例では、処置にとって適した個体は、心または心血管疾患または状態、例えば心血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管事故（卒中）、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、冠動脈弁疾患、動脈拡張症、拡張機能障害、心内膜炎、高血圧（高血圧症）、心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患、僧帽弁逸脱、心筋梗塞（心臓発作）、または静脈血栓塞栓症に罹患している。一部の例では、本発明の方法による処置にとって適した個体は、筋変性疾患、例えば家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、または虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患を有する個体を含む。
例えば、心病態は、うっ血性心不全、心筋梗塞、心虚血、心筋炎、および不整脈からなる群から選択することができる。一部の実施形態では、対象は糖尿病である。一部の実施形態では、対象は非糖尿病である。一部の実施形態では、対象は糖尿病性心筋症に罹患している。
治療のために、本開示のｒＡＡＶビリオンおよび／またはその医薬組成物を、局所または全身に投与することができる。ｒＡＡＶビリオンは、注射、カテーテル、植え込み可能デバイスなどによって導入することができる。ｒＡＡＶビリオンは、細胞に有害な影響を及ぼさない任意の生理的に許容される賦形剤または担体中で投与することができる。例えば、本開示のｒＡＡＶビリオンおよび／またはその医薬組成物は、静脈内または心臓内経路を通して（例えば、心外膜内または心筋内に）投与することができる。本開示のｒＡＡＶビリオンおよび／またはその医薬組成物を対象、特にヒト対象に投与する方法は、医薬組成物（例えば、ｒＡＡＶビリオンを含む組成物）の注射または注入を含む。注射は直接筋注射を含んでもよく、注入は静脈内注入を含んでもよい。ｒＡＡＶビリオンまたは医薬組成物は、対象への注射による導入を容易にする送達デバイスに挿入することができる。そのような送達デバイスは、細胞または流体をレシピエント対象の体に注射するためのチューブ、例えばカテーテルを含む。チューブはさらに、それを通して本発明の細胞を所望の位置で対象に導入することができる針、例えばシリンジを含み得る。
一部の実施形態（embdoiments）では、ｒＡＡＶビリオンは、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、または心臓内注射または心臓内カテーテル挿入によって投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、直接心筋内注射または経血管投与によって投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、直接心筋内注射、順行性冠動脈内注射、逆行性注射、経心内膜心筋注射、または再循環送達を伴う分子心臓手術（ＭＣＡＲＤ）によって投与される。
ｒＡＡＶビリオンは、異なる形態のそのような送達デバイス、例えばシリンジに挿入することができる。ｒＡＡＶビリオンは、医薬組成物の形態で供給することができる。そのような組成物は、ヒトでの投与のために十分な無菌的条件下で調製された等張の賦形剤を含み得る。医用製剤における一般的原理に関して、読者は、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, by G. Morstyn & W. Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996;およびHematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000を参照されたい。賦形剤および組成物の任意の付随する構成成分の選択は、用いられる経路および／またはデバイスによる投与を最適化するように適合させることができる。
組換えＡＡＶは、局所または全身性に投与され得る。組換えＡＡＶは、本開示の適切なカプシドタンパク質を選択することによって特定の細胞タイプを標的とするように操作され得る。ＡＡＶビリオン組成物の様々な治療投与レジメンおよび投薬量の適格性を決定するために、ｒＡＡＶビリオンを最初に、適した動物モデルにおいて試験することができる。１つのレベルで、組換えＡＡＶを、ｉｎ ｖｉｖｏで標的細胞に感染する能力に関して評価する。組換えＡＡＶはまた、それが標的組織に遊走するかどうか、それらが宿主において免疫応答を誘導するかどうかに関して、または投与されるｒＡＡＶビリオンの適切な数もしくは投薬量の決定を確実にするために評価することができる。組換えＡＡＶが処置される疾患に応じて免疫応答を生成することが望ましいことも望ましくないこともあり得る。一般的に、ビリオンの繰り返し投与が必要である場合、ビリオンは免疫原性でないことが有利である。試験目的の場合、ｒＡＡＶビリオン組成物を、免疫不全動物（例えば、ヌードマウス、または化学的もしくは放射線照射により免疫不全にした動物）に投与することができる。標的組織または細胞を感染期間後に回収し、組織または細胞が感染しているか、および所望の表現型（例えば、誘導心筋細胞）が標的組織または細胞において誘導されているかどうかを決定するために評価する。
組換えＡＡＶビリオンは、心臓への直接注射または心カテーテル挿入を含むがこれらに限定されない様々な経路によって投与することができる。あるいは、ｒＡＡＶビリオンを、静脈内注入などによって全身投与することができる。直接注射を使用する場合、開胸手術または最小侵襲手術のいずれかによって行うことができる。一部の実施形態では、組換えウイルスを、注射または注入によって心膜腔に送達する。注射または注入された組換えウイルスは、多様な方法によって追跡することができる。例えば、検出可能な標識（例えば、緑色蛍光タンパク質またはベータ－ガラクトシダーゼ）によって標識されたまたはそれを発現する組換えＡＡＶを容易に検出することができる。組換えＡＡＶは、標的細胞にマーカータンパク質、例えば表面発現タンパク質または蛍光タンパク質を発現させるように操作され得る。あるいは、組換えＡＡＶによる標的細胞の感染は、試験のために使用した動物によって発現されない細胞マーカー（例えば、実験動物に細胞を注射した場合のヒト特異的抗原）のその発現によって検出することができる。標的細胞の存在および表現型は、蛍光顕微鏡法（例えば、緑色蛍光タンパク質、またはベータ－ガラクトシダーゼに関して）によって、または免疫組織化学（例えば、ヒト抗原に対する抗体を使用して）、ＥＬＩＳＡ（ヒト抗原に対する抗体を使用して）によって、または心表現型を示すＲＮＡに対して増幅を特異的にするプライマーおよびハイブリダイゼーション条件を使用するＲＴ－ＰＣＲ分析によって評価することができる。
医薬組成物
本開示は、本開示のｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、および緩衝剤の１つまたは複数を含み得る。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤は、ヒトにおいて使用するために適している。そのような賦形剤、担体、希釈剤、および緩衝剤は、過度の毒性なく投与することができる任意の剤を含む。薬学的に許容される賦形剤としては、水、食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体が挙げられるがこれらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば無機酸の塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；および有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などがその中に含まれ得る。加えて、補助物質、例えばｐＨ緩衝物質がそのような媒体に存在してもよい。多様な薬学的に許容される賦形剤が当技術分野で公知であり、本明細書において詳細に考察する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えばA. Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins;およびHandbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assocを含む多様な刊行物において十分に記載されている。
組成物を調製するために、ｒＡＡＶビリオンを生成し、必要に応じてまたは望ましければ精製する。ｒＡＡＶを薬学的に許容される担体と混合するかまたはその中に懸濁することができる。これらのｒＡＡＶを、適切な濃度に調整し、必要に応じて他の作用剤と組み合わせることができる。単位用量に含まれるｒＡＡＶビリオンおよび／または他の作用剤の濃度は、広く異なり得る。用量および投与回数は、当業者が最適化することができる。例えば、約１０２～１０１０ベクターゲノム（ｖｇ）が投与され得る。一部の実施形態では、用量は、少なくとも約１０２ｖｇ、約１０３ｖｇ、約１０４ｖｇ、約１０５ｖｇ、約１０６ｖｇ、約１０７ｖｇ、約１０８ｖｇ、約１０９ｖｇ、約１０１０ｖｇ、またはそれより多くのベクターゲノムであり得る。化合物の日用量も同様に多様であり得る。そのような日用量は、例えば少なくとも約１０２ｖｇ／日、約１０３ｖｇ／日、約１０４ｖｇ／日から、約１０５ｖｇ／日、約１０６ｖｇ／日、約１０７ｖｇ／日、約１０８ｖｇ／日、約１０９ｖｇ／日、約１０１０ｖｇ／日、またはそれより多くのベクターゲノム／日までの範囲であり得る。
ある特定の実施形態では、処置の方法は、１つまたは複数の抗炎症剤、例えば抗炎症性ステロイドまたは非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の投与によって増強される。
本発明において使用するための抗炎症性ステロイドは、コルチコステロイド、特にグルココルチコイド活性を有するステロイド、例えばデキサメタゾンおよびプレドニゾンを含む。本発明において使用するための非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、一般的に炎症および疼痛を引き起こすプロスタグランジンの産生、シクロオキシゲナーゼ－１（ＣＯＸ－１）および／またはシクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）を遮断することによって作用する。従来のＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ－１およびＣＯＸ－２の両方を遮断することによって作用する。ＣＯＸ－２選択的阻害剤は、ＣＯＸ－２酵素のみを遮断する。ある特定の実施形態では、ＮＳＡＩＤはＣＯＸ－２選択的阻害剤、例えばセレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標））、ロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ）、およびバルデコキシブ（Ｂ ｅｘｔｒａ）でる。ある特定の実施形態では、抗炎症剤は、ＮＳＡＩＤプロスタグランジン阻害剤、例えばピロキシカムである。
処置に使用されるｒＡＡＶビリオンの量は、選択される特定の担体によって変化するのみならず、投与経路、処置される状態の性質、ならびに患者の年齢および状態によっても変化する。最終的に、主治医の医療提供者が適切な投薬量を決定してもよい。医薬組成物は、細胞を含むまたは細胞を含まない投与のために単一の単位剤形中の各化合物の適切な比率で製剤化され得る。細胞またはベクターは、個別に提供され、化合物組成物の液体液剤と混合され得るか、または個別に投与され得る。
組換えＡＡＶは、非経口投与（例えば、注射、例えばボーラス注射または持続的注入によって）のために製剤化されてもよく、アンプル、充填済みシリンジ、低容量注入容器、または保存剤を添加した複数回投与用容器で単位剤形中に提示され得る。医薬組成物は、懸濁剤、液剤、油性または水性媒体中の乳剤の形態をとることができ、懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤などの製剤化剤を含有し得る。適した担体としては、食塩水溶液、リン酸緩衝食塩水、および当技術分野で一般的に使用される他の材料が挙げられる。
組成物はまた、心疾患、状態、および傷害の処置にとって有用な作用剤などの他の成分（ingredient）、例えば抗凝固剤（例えば、ダルテパリン（ｆｒａｇｍｉｎ）、ダナパロイド（ｏｒｇａｒａｎ）、エノキサパリン（ｌｏｖｅｎｏｘ）、ヘパリン、チンザパリン（ｉｎｎｏｈｅｐ）、および／またはワーファリン（ｃｏｕｍａｄｉｎ））、抗血小板剤（例えば、アスピリン、チクロピジン、クロピドグレル、またはジピリダモール）、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（例えば、ベナゼプリル（Ｌｏｔｅｎｓｉｎ）、カプトプリル（Ｃａｐｏｔｅｎ）、エナラプリル（Ｖａｓｏｔｅｃ）、フォシノプリル（Ｍｏｎｏｐｒｉｌ）、リシノプリル（Ｐｒｉｎｉｖｉｌ、Ｚｅｓｔｒｉｌ）、モエキシプリル（Ｕｎｉｖａｓｃ）、ペリンドプリル（Ａｃｅｏｎ）、キナプリル（Ａｃｃｕｐｒｉｌ）、ラミプリル（Ａｌｔａｃｅ）、および／またはトランドラプリル（Ｍａｖｉｋ））、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断剤（例えば、カンデサルタン（Ａｔａｃａｎｄ）、エプロサルタン（Ｔｅｖｅｔｅｎ）、イルベサルタン（Ａｖａｐｒｏ）、ロサルタン（Ｃｏｚａａｒ）、テルミサルタン（Ｍｉｃａｒｄｉｓ）、および／またはバルサルタン（Ｄｉｏｖａｎ））、ベータ遮断剤（例えば、アセブトロール（Ｓｅｃｔｒａｌ）、アテノロール（Ｔｅｎｏｒｍｉｎ）、ベタキソロール（Ｋｅｒｌｏｎｅ）、ビソプロロール／ヒドロクロロチアジド（Ｚｉａｃ）、ビソプロロール（Ｚｅｂｅｔａ）、カルテオロール（Ｃａｒｔｒｏｌ）、メトプロロール（Ｌｏｐｒｅｓｓｏｒ、Ｔｏｐｒｏｌ ＸＬ）、ナドロール（Ｃｏｒｇａｒｄ）、プロプラノロール（Ｉｎｄｅｒａｌ）、ソタロール（Ｂｅｔａｐａｃｅ）、および／またはチモロール（Ｂｌｏｃａｄｒｅｎ））、カルシウムチャネル遮断剤（例えば、アムロジピン（Ｎｏｒｖａｓｃ、Ｌｏｔｒｅｌ）、ベプリジル（Ｖａｓｃｏｒ）、ジルチアゼム（Ｃａｒｄｉｚｅｍ、Ｔｉａｚａｃ）、フェロジピン（Ｐｌｅｎｄｉｌ）、ニフェジピン（Ａｄａｌａｔ、Ｐｒｏｃａｒｄｉａ）、ニモジピン（Ｎｉｍｏｔｏｐ）、ニソルジピン（Ｓｕｌａｒ）、ベラパミル（Ｃａｌａｎ、Ｉｓｏｐｔｉｎ、Ｖｅｒｅｌａｎ）、利尿剤（例えば、アミロライド（Ｍｉｄａｍｏｒ）、ブメタニド（Ｂｕｍｅｘ）、クロロチアジド（Ｄｉｕｒｉｌ）、クロルタリドン（Ｈｙｇｒｏｔｏｎ）、フロセミド（Ｌａｓｉｘ）、ヒドロクロロチアジド（Ｅｓｉｄｒｉｘ、Ｈｙｄｒｏｄｉｕｒｉｌ）、インダパミド（Ｌｏｚｏｌ）、および／またはスピロノラクトン（Ａｌｄａｃｔｏｎｅ））、血管拡張剤（例えば、二硝酸イソソルビド（Ｉｓｏｒｄｉｌ）、ネシリチド（Ｎａｔｒｅｃｏｒ）、ヒドラジン（Ａｐｒｅｓｏｌｉｎｅ）、硝酸塩および／またはミノキシジル）、スタチン、ニコチン酸、ゲムフィブロジル、クロフィブレート、ジゴキシン、ジギトキシン、ラノキシン、またはそれらの任意の組合せなども含有し得る。
追加の作用剤、例えば抗菌剤、抗微生物剤、抗ウイルス剤、生物応答改変剤、成長因子、免疫モジュレーター、モノクローナル抗体、および／または保存剤を含めることができる。本発明の組成物はまた、他の形態の治療と共に使用され得る。
本明細書に記載されるｒＡＡＶビリオンは、疾患または障害を処置するために対象に投与することができる。そのような組成物は、例えばレシピエントの生理的状態、投与の目的が外傷性傷害に対する応答であるか、またはより持続的な治療目的のためであるか、および熟練の実践者に公知の他の要因に応じて、持続的または間欠的様式での単一用量、複数用量であり得る。化合物および本発明の組成物の投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であり得るか、または一連の間隔を空けた用量であり得る。局所および全身投与の両方が企図される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンの局所送達が達成される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンの局所送達を使用して心臓内の細胞集団を生成する。一部の実施形態では、そのような局所集団は心臓のための「ペースメーカー細胞」として動作する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンを使用して、洞房（ＳＡ）結節、房室（ＡＶ）結節、Ｈｉｓ束（a bindle of His）、および／またはプルキンエ線維のうちの１つまたは複数を生成する、再生する、修復する、置き換える、および／または回復させる（rejunevate）。
等張性を制御するために、水性医薬組成物は、生理的な塩、例えばナトリウム塩を含み得る。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは１～２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、脱水リン酸二ナトリウム（disodium phosphate dehydrate）、塩化マグネシウム、および塩化カルシウムが挙げられる。
組成物は、１つまたは複数の緩衝剤を含み得る。典型的な緩衝剤としては、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、またはクエン酸緩衝剤が挙げられる。緩衝剤は、典型的には、５～２０ｍＭの範囲の濃度で含まれる。組成物のｐＨは一般的に５～８の間であり、より典型的には６～８の間、例えば６．５～７．５の間、または７．０～７．８の間である。
組成物は好ましくは無菌である。組成物は好ましくはグルテンフリーである。組成物は好ましくは非発熱性である。
一部の実施形態では、細胞を含む組成物は、凍結保護剤を含み得る。凍結保護剤の非限定的な例としては、グリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、およびグリセロール）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド、スクロース、トレハロース、デキストロース、およびそれらの任意の組合せが挙げられる。
以下のタイプの化合物の１つまたは複数もまた、ｒＡＡＶビリオンと共に組成物に存在することができる：ＷＮＴアゴニスト、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－ベータシグナル伝達阻害剤、エピジェネティック改変剤、ＬＳＤ１阻害剤、アデニルシクラーゼアゴニスト、またはそれらの任意の組合せ。
キット
本明細書に記載の組成物（例えば、ｒＡＡＶビリオン）のいずれかを含む多様なキットが本明細書に記載される。キットは、共に混合されたか、または個々に包装された、および乾燥型または水和型の本明細書に記載の組成物のいずれかを含み得る。ｒＡＡＶビリオンおよび／または本明細書で記載される他の作用剤は、個別のバイアル、ボトル、または他の容器に個々に包装することができる。あるいは、ｒＡＡＶビリオンおよび／または本明細書に記載の作用剤のいずれかを単一の組成物として一緒に、または一緒にもしくは個別に使用することができる２つもしくはそれより多くの組成物として包装することができる。化合物および／または本明細書に記載される作用剤は、分化境界を超えて選択された細胞の変換を容易にするために適切な比率および／または量で包装され、心臓前駆細胞および／または心筋細胞を形成することができる。
キットは、それらの組成物、化合物、および／または作用剤を投与するための指示を含み得る。そのような指示は、本出願を通して記載される情報を提供することができる。ｒＡＡＶビリオンまたは医薬組成物は、送達デバイスの形態でいずれかのキット内に提供することができる。あるいは、送達デバイスをキットに個別に含めることができ、指示は、対象への投与前に送達デバイスを組み立てる方法を記載することができる。
いずれのキットも、シリンジ、カテーテル、メス、試料または細胞収集のための滅菌容器、希釈剤、薬学的に許容される担体などを含み得る。キットは、本出願の先行する節においてまたは他の部分で組成物に関して本明細書に記載される補助因子または薬物のいずれかなどの他の因子を提供することができる。
番号付き実施形態
実施形態Ｉ－１．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって：
ａ）親配列のＧＨループにおける挿入部位に前記親配列に対して５～１１アミノ酸の挿入を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質；および
ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、ｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－２．親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して心臓細胞において形質導入効率の増加を示す、実施形態Ｉ－１に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－３．親配列を含むＡＡＶビリオンと比較してヒト心臓線維芽細胞（ｈＣＦ）において形質導入効率の増加を示す、実施形態Ｉ－１に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－４．感染多重度（ＭＯＩ）１，０００でｈＣＦ細胞において少なくとも１０倍の形質導入効率の増加を示す、実施形態Ｉ－３に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－５．感染多重度（ＭＯＩ）１００，０００でｈＣＦ細胞において少なくとも２倍の形質導入効率の増加を示す、実施形態Ｉ－３に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－６．親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して人工多能性幹細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）において形質導入効率の増加を示す、実施形態Ｉ－１に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－７．感染多重度（ＭＯＩ）１００，０００でｉＰＳ－ＣＭ細胞において少なくとも２倍の形質導入効率の増加を示す、実施形態Ｉ－６に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－８．感染多重度（ＭＯＩ）１，０００でｉＰＳ－ＣＭ細胞において少なくとも４倍の形質導入効率の増加を示す、実施形態Ｉ－６に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－９．ｉＰＳ－ＣＭ細胞にまさってｈＣＦ細胞に関してｒＡＡＶビリオンの選択性の増加を示す、実施形態Ｉ－１に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－１０．ｈＣＦ細胞にまさってｉＰＳ－ＣＭ細胞に関してｒＡＡＶビリオンの選択性の増加を示す、実施形態Ｉ－１に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－１１．挿入部位が、配列番号１の５６０～５９４に対応する前記親配列における位置での任意の２つの、必要に応じて隣接するアミノ酸の間である、実施形態Ｉ－１に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－１２．挿入部位が、配列番号１の５７４および５７５に対応する前記親配列における隣接するアミノ酸の間である、実施形態Ｉ－１１に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－１３．挿入が以下の式：
－Ｘ０－（Ｘ）ｎ－Ｘ１０－
（式中、ｎは５～９であり、
Ｘ０およびＸ１０は、各々独立してＡ、Ｓ、Ｇであるか、または存在しない）（配列番号１１０１）
のペプチドである、実施形態Ｉ－１２に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－１４．挿入が以下の式：
－Ｘ０－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－
（式中、Ｘ０およびＸ８が、各々独立してＡ、Ｓ、Ｇであるか、または存在しない）（配列番号１１０２）
のペプチドである、実施形態Ｉ－１２に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－１５．挿入が以下の式：
－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ａ－
（式中：
ａ）Ｘ１が、Ｐ、Ｒ、またはＧであり；
ｂ）Ｘ２が、Ｋ、Ｌ、またはＲであり；
ｃ）Ｘ３が、任意のアミノ酸であり；
ｄ）Ｘ４が、Ｎ、Ｈ、Ｋ、またはＱであり；
ｅ）Ｘ５が、任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてＸ５が、Ｇ、Ｋ、もしくはＳであり；
ｆ）Ｘ６が、任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてＸ６が、ＴもしくはＶであり；
ｇ）Ｘ７が、任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてＸ７が、ＫもしくはＶである）（配列番号１１０３）
のペプチドである、実施形態Ｉ－１２に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－実施形態Ｉ－１６．挿入が、配列番号１０１～６００から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－１４に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－１７．挿入が、ＲＫＶＨＩＥＶ（配列番号８１）、ＲＫＹＱＳＤＬ（配列番号８２）、ＰＬＴＮＴＶＫ（配列番号８３）、ＬＫＹＨＧＰＰ（配列番号８４）、ＲＫＹＱＧＤＭ（配列番号８５）、ＲＫＦＨＳＴＤ（配列番号８６）、ＲＫＨＨＧＬＥ（配列番号８７）、ＰＧＴＮＶＴＫ（配列番号８８）、ＲＫＭＨＭＰＤ（配列番号８９）、ＰＬＫＫＩＶＱ（配列番号９０）、ＰＬＧＫＫＴＳ（配列番号９１）、ＰＲＧＶＫＶＴ（配列番号９２）、ＰＬＡＫＳＫＳ（配列番号９３）、ＰＲＴＫＧＡＶ（配列番号９４）、およびＰＳＧＲＫＡＴ（配列番号９５）から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－１４に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－１８．挿入が、ＡＲＫＶＨＩＥＶＡ（配列番号１０１）、ＡＲＫＹＱＳＤＬＡ（配列番号１０２）、ＡＰＬＴＮＴＶＫＡ（配列番号１０３）、ＡＬＫＹＨＧＰＰＡ（配列番号１０４）、ＡＲＫＹＱＧＤＭＡ（配列番号１０５）、ＡＲＫＦＨＳＴＤＡ（配列番号１０６）、ＡＲＫＨＨＧＬＥＡ（配列番号１０７）、ＡＰＧＴＮＶＴＫＡ（配列番号１０８）、ＡＲＫＭＨＭＰＤＡ（配列番号１０９）、ＡＰＬＫＫＩＶＱＡ（配列番号１１０）、ＡＰＬＧＫＫＴＳＡ（配列番号１１１）、ＡＰＲＧＶＫＶＴＡ（配列番号１１２）、ＡＰＬＡＫＳＫＳＡ（配列番号１１３）、ＡＰＲＴＫＧＡＶＡ（配列番号１１４）、ＡＰＳＧＲＫＡＴＡ（配列番号１１５）から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－１４に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－１９．挿入が、アミノ酸配列ＰＬＴＮＴＶＫ（配列番号８３）、またはＰＬＴＮＴＶＫ（配列番号８３）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、実施形態Ｉ－１４に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－２０．挿入が、アミノ酸配列ＰＬＫＫＩＶＱ（配列番号９０）、またはＰＬＫＫＩＶＱ（配列番号９０）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、実施形態Ｉ－１４に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－２１．親配列のＧＨループにおける挿入部位に前記親配列に対して５～１１アミノ酸の挿入を含む、ＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－２２．ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して心臓細胞において形質導入効率の増加を示す、実施形態Ｉ－２１に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－２３．ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、親配列を含むＡＡＶビリオンと比較してヒト心臓線維芽細胞（ｈＣＦ）において形質転換効率の増加を示す、実施形態Ｉ－２１に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－２４．ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、感染多重度（ＭＯＩ）１，０００でｈＣＦ細胞において少なくとも１０倍の形質導入効率の増加を示す、実施形態Ｉ－２３に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－２５．ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、感染多重度（ＭＯＩ）１００，０００でｈＣＦ細胞において少なくとも２倍の形質導入効率の増加を示す、実施形態Ｉ－２３に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－２６．ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して人工多能性幹細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）において形質導入効率の増加を示す、実施形態Ｉ－２１に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－２７．ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、感染多重度（ＭＯＩ）１００，０００でｉＰＳ－ＣＭ細胞において少なくとも２倍の形質導入効率の増加を示す、実施形態Ｉ－２６に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－２８．ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、感染多重度（ＭＯＩ）１，０００でｉＰＳ－ＣＭ細胞において少なくとも４倍の形質導入効率の増加を示す、実施形態Ｉ－２６に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－２９．ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、ｉＰＳ－ＣＭ細胞にまさってｈＣＦ細胞に関してＡＡＶ５カプシドタンパク質の選択性の増加を示す、実施形態Ｉ－２１に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－３０．ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、ｈＣＦ細胞にまさってｉＰＳ－ＣＭ細胞に関してＡＡＶ５カプシドタンパク質の選択性の増加を示す、実施形態Ｉ－２１に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－３１．挿入部位が、配列番号１の５６０～５９４に対応する親配列における位置で任意の２つの、必要に応じて隣接するアミノ酸の間である、実施形態Ｉ－２１に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－３２．挿入部位が、配列番号１の５７４および５７５に対応する前記親配列における隣接するアミノ酸の間である、実施形態Ｉ－２１に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－３３．挿入が以下の式：
－Ｘ０－（Ｘ）ｎ－Ｘ１０－
（式中、ｎが５～９であり、
Ｘ０およびＸ１０が、各々独立してＡ、Ｓ、Ｇであるか、または存在しない）（配列番号１１０１）
のペプチドである、実施形態Ｉ－３２に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－３４．挿入が以下の式：
－Ｘ０－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－
（式中、Ｘ０およびＸ８が、各々独立してＡ、Ｓ、Ｇであるか、または存在しない）（配列番号１１０２）
のペプチドである、実施形態Ｉ－３２に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－３５．挿入が以下の式：
－Ａ－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ａ－
（式中：
ａ）Ｘ１が、Ｐ、Ｒ、またはＧであり；
ｂ）Ｘ２が、Ｋ、Ｌ、またはＲであり；
ｃ）Ｘ３が、任意のアミノ酸であり；
ｄ）Ｘ４が、Ｎ、Ｈ、Ｋ、またはＱであり；
ｅ）Ｘ５が、任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてＸ５が、Ｇ、Ｋ、もしくはＳであり；
ｆ）Ｘ６が、任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてＸ６が、ＴもしくはＶであり；
ｇ）Ｘ７が、任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてＸ７が、ＫもしくはＶである）（配列番号１１０３）
のペプチドである、実施形態Ｉ－３２に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－３６．挿入が、配列番号１０１～６００から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－３４に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－３７．挿入が、ＲＫＶＨＩＥＶ（配列番号８１）、ＲＫＹＱＳＤＬ（配列番号８２）、ＰＬＴＮＴＶＫ（配列番号８３）、ＬＫＹＨＧＰＰ（配列番号８４）、ＲＫＹＱＧＤＭ（配列番号８５）、ＲＫＦＨＳＴＤ（配列番号８６）、ＲＫＨＨＧＬＥ（配列番号８７）、ＰＧＴＮＶＴＫ（配列番号８８）、ＲＫＭＨＭＰＤ（配列番号８９）、ＰＬＫＫＩＶＱ（配列番号９０）、ＰＬＧＫＫＴＳ（配列番号９１）、ＰＲＧＶＫＶＴ（配列番号９２）、ＰＬＡＫＳＫＳ（配列番号９３）、ＰＲＴＫＧＡＶ（配列番号９４）、およびＰＳＧＲＫＡＴ（配列番号９５）から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－３４に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－３８．挿入が、ＡＲＫＶＨＩＥＶＡ（配列番号１０１）、ＡＲＫＹＱＳＤＬＡ（配列番号１０２）、ＡＰＬＴＮＴＶＫＡ（配列番号１０３）、ＡＬＫＹＨＧＰＰＡ（配列番号１０４）、ＡＲＫＹＱＧＤＭＡ（配列番号１０５）、ＡＲＫＦＨＳＴＤＡ（配列番号１０６）、ＡＲＫＨＨＧＬＥＡ（配列番号１０７）、ＡＰＧＴＮＶＴＫＡ（配列番号１０８）、ＡＲＫＭＨＭＰＤＡ（配列番号１０９）、ＡＰＬＫＫＩＶＱＡ（配列番号１１０）、ＡＰＬＧＫＫＴＳＡ（配列番号１１１）、ＡＰＲＧＶＫＶＴＡ（配列番号１１２）、ＡＰＬＡＫＳＫＳＡ（配列番号１１３）、ＡＰＲＴＫＧＡＶＡ（配列番号１１４）、ＡＰＳＧＲＫＡＴＡ（配列番号１１５）から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－３４に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－３９．挿入が、アミノ酸配列ＰＬＴＮＴＶＫ（配列番号８３）、またはＰＬＴＮＴＶＫ（配列番号８３）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、実施形態Ｉ－３４に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－４０．挿入が、アミノ酸配列ＰＬＫＫＩＶＱ（配列番号９０）、またはＰＬＫＫＩＶＱ（配列番号９０）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、実施形態Ｉ－３４に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－４１．実施形態Ｉ－２１からＩ－４０のいずれか１つに記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－４２．実施形態Ｉ－１からＩ－２０のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物。
実施形態Ｉ－４３．心臓細胞を形質導入する方法であって、心臓細胞に、実施形態Ｉ－１からＩ－２０のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオンを接触させるステップを含み、ｒＡＡＶビリオンが心臓細胞を形質導入する、方法。
実施形態Ｉ－４４．心臓細胞に１つまたは複数の遺伝子産物を送達する方法であって、心臓細胞に、実施形態Ｉ－１からＩ－２０のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオンを接触させるステップを含み、心臓細胞が遺伝子産物を発現する、方法。
実施形態Ｉ－４５．１つまたは複数の遺伝子産物が短鎖ヘアピンＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを含む、実施形態Ｉ－４４に記載の方法。
実施形態Ｉ－４６．ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、および必要に応じて修復鋳型を含む１つまたは複数の遺伝子産物であって、該遺伝子産物が機能的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を形成する、実施形態Ｉ－４４に記載の方法。
実施形態Ｉ－４７．１つまたは複数の遺伝子産物がポリペプチドを含む、実施形態Ｉ－４４に記載の方法。
実施形態Ｉ－４８．ポリペプチドが、必要に応じて心トロポニンＴ；心サルコメアタンパク質；β－ミオシン重鎖；心室ミオシン必須軽鎖１；心室ミオシン調節軽鎖２；心α－アクチン；ａ－トロポミオシン；心トロポニンＩ；心ミオシン結合タンパク質Ｃ；ｆｏｕｒ－ａｎｄ－ａ－ｈａｌｆ ＬＩＭタンパク質１；チチン；５’－ＡＭＰ－活性化タンパク質キナーゼサブユニットガンマ－２；トロポニンＩ ３型、ミオシン軽鎖２、アクチンアルファ心筋１；心ＬＩＭタンパク質；カベオリン３（ＣＡＶ３）；ガラクトシダーゼアルファ（ＧＬＡ）；リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２）；ミトコンドリア転移ＲＮＡグリシン（ＭＴＴＧ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡイソロイシン（ＭＴＴＩ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡリシン（ＭＴＴＫ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡグルタミン（ＭＴＴＱ）；ミオシン軽鎖３（ＭＹＬ３）；トロポニンＣ（ＴＮＮＣ１）；トランスサイレチン（ＴＴＲ）；筋小胞体カルシウム－ＡＴＰアーゼ２ａ（ＳＥＲＣＡ２ａ）；間質由来因子－１（ＳＤＦ－１）；アデニレートシクラーゼ－６（ＡＣ６）；β－ＡＲＫｃｔ（βアドレナリン受容体キナーゼＣ末端）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；肝細胞成長因子；低酸素誘導成長因子；チモシンベータ４（ＴＭＳＢ４Ｘ）；一酸化窒素シンターゼ－３（ＮＯＳ３）；アポリポタンパク質－Ｅ（ＡｐｏＥ）；およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；Ｓ１００Ａ１から選択される、実施形態Ｉ－４７に記載の方法。
実施形態Ｉ－４９．１つまたは複数の遺伝子産物が、１つまたは複数のリプログラミング因子を含む、実施形態Ｉ－４４に記載の方法。
実施形態Ｉ－５０．１つまたは複数のリプログラミング因子が、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＡＵＲＫＢ、ＯＣＴ４、ＢＡＦ６０Ｃ、ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ２、ＩＲＸ４、ＩＳＬＬ、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＮＫＸ２．５、ＳＲＦ、ＴＢＸ２０、およびＺＦＰＭ２から選択される１つまたは複数のポリペプチドである、実施形態Ｉ－４９に記載の方法。
実施形態Ｉ－５１．心臓細胞を心臓の心筋細胞へとリプログラムする、実施形態Ｉ－４３からＩ－５０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－５２．それを必要とする対象における心病態を処置する方法であって、実施形態Ｉ－４２に記載の医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含み、ｒＡＡＶビリオンが心組織を形質導入する、方法。
実施形態Ｉ－５３．ｒＡＡＶビリオンが、皮下、静脈内、心外膜、筋肉内、腹腔内もしくは心臓内注射によるか、または心臓内カテーテル挿入によって投与される、実施形態Ｉ－５２に記載の方法。
実施形態Ｉ－５４．ｒＡＡＶビリオンが、直接心筋内注射または経血管投与によって投与される、実施形態Ｉ－５２に記載の方法。
実施形態Ｉ－５５．ｒＡＡＶビリオンが、直接心筋内注射、順行性冠動脈内注射、逆行性注射、経心内膜心筋注射、または再循環送達を伴う分子心臓手術（ＭＣＡＲＤ）によって投与される、実施形態Ｉ－５２に記載の方法。
実施形態Ｉ－５６．標的細胞において形質導入効率の増加をｒＡＡＶビリオンに付与するＡＡＶカプシドタンパク質を同定する方法であって：
ａ）ｒＡＡＶビリオンの集団を提供するステップであって、そのｒＡＡＶゲノムが、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードするｃａｐポリヌクレオチドのライブラリーを含む、ステップ；
ｂ）前記ｒＡＡＶビリオンによる標的細胞への前記ｃａｐポリヌクレオチドの形質導入を可能にするために十分な期間、前記集団に前記標的細胞を接触させるステップ；および
ｃ）前記標的細胞から前記ｃａｐポリヌクレオチドをシーケンシングし、それによって前記標的細胞において形質導入効率の増加をもたらすＡＡＶカプシドタンパク質を同定するステップ
を含む、方法。
実施形態Ｉ－５７．ステップ（ｂ）の前に、ｒＡＡＶビリオンの前記集団に、非標的細胞への前記ｒＡＡＶビリオンの結合を可能にするために十分な期間、前記非標的細胞を接触させることによって、前記集団を枯渇させるステップをさらに含む、実施形態Ｉ－５６に記載の方法。
実施形態Ｉ－５８．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって：
ａ）親ＡＡＶ５カプシドと比較して、Ｓ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、またはＴ５８２Ａから選択される１つまたは複数の置換を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質；および
ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、ｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－５９．ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、Ｓ６５１Ａ、Ｔ５７８ＡまたはＴ５８２Ａから選択される２つまたはそれより多くの置換を含む、実施形態Ｉ－５８に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－６０．ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、Ｔ５８２ＡおよびＳ６５１Ａ置換を含む、実施形態Ｉ－５８に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－６１．ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、Ｔ５７８ＡおよびＴ５８２Ａ置換を含む、実施形態Ｉ－５８に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－６２．ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、Ｔ５７８ＡおよびＳ６５１Ａ置換を含む、実施形態Ｉ－５８に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－６３．ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、Ｓ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、およびＴ５８２Ａ置換を含む、実施形態Ｉ－５８に記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－６４．ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号７３と少なくとも９５％の同一性を共有する、実施形態Ｉ－５８からＩ－６２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－６５．ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号７３と少なくとも９８％の同一性を共有する、実施形態Ｉ－５８～Ｉ－６２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－６６．ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号７３と少なくとも９９％の同一性を共有する、実施形態Ｉ－５８～Ｉ－６２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－６７．ＡＡＶ５カプシドタンパク質が配列番号７３のポリペプチド配列（the polypeptide sequence SEQ ID NO: 73）を含む、実施形態Ｉ－５８～Ｉ－６２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
実施形態Ｉ－６８．親ＡＡＶ５カプシドと比較してＳ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、またはＴ５８２Ａから選択される１つまたは複数の置換を含む、ＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－６９．カプシドタンパク質が、Ｓ６５１Ａ、Ｔ５７８ＡまたはＴ５８２Ａから選択される２つまたはそれより多くの置換を含む、実施形態Ｉ－６７に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－７０．カプシドタンパク質が、Ｔ５８２ＡおよびＳ６５１Ａ置換を含む、実施形態Ｉ－６７に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－７１．カプシドタンパク質が、Ｔ５７８ＡおよびＴ５８２Ａ置換を含む、実施形態Ｉ－６８に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－７２．カプシドタンパク質が、Ｔ５７８ＡおよびＳ６５１Ａ置換を含む、実施形態Ｉ－６８に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－７３．カプシドタンパク質が、Ｓ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、およびＴ５８２Ａ置換を含む、実施形態Ｉ－６８に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－７４．カプシドタンパク質が、配列番号７３と少なくとも９０％の同一性を共有する、実施形態Ｉ－６８からＩ－７３のいずれか１つに記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－７５．カプシドタンパク質が、配列番号７３と少なくとも９５％の同一性を共有する、実施形態Ｉ－６８からＩ－７３のいずれか１つに記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－７６．配列番号７３と少なくとも９８％の同一性を共有する、実施形態Ｉ－６８～Ｉ－７３のいずれか１つに記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－７７．配列番号７３と少なくとも９９％の同一性を共有する、実施形態Ｉ－６８～Ｉ－７３のいずれか１つに記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
実施形態Ｉ－７８．実施形態Ｉ－６８からＩ－７７のいずれか１つに記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
実施形態Ｉ－７９．実施形態Ｉ－５８からＩ－６７のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物。
実施形態Ｉ－８０．心臓細胞を形質導入する方法であって、心臓細胞に、実施形態Ｉ－５８からＩ－６７のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオンを接触させるステップを含み、ｒＡＡＶビリオンが心臓細胞を形質導入する、方法。
実施形態Ｉ－８１．１つまたは複数の遺伝子産物を心臓細胞に送達する方法であって、心臓細胞に、実施形態Ｉ－５８からＩ－６７のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオンを接触させるステップを含み、心臓細胞が遺伝子産物を発現する、方法。
実施形態Ｉ－８２．１つまたは複数の遺伝子産物が短鎖ヘアピンＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを含む、実施形態Ｉ－８１に記載の方法。
実施形態Ｉ－８３．ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、および必要に応じて修復鋳型を含む１つまたは複数の遺伝子産物であって、該遺伝子産物が機能的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を形成する、実施形態Ｉ－８１に記載の方法。
実施形態Ｉ－８４．１つまたは複数の遺伝子産物がポリペプチドを含む、実施形態Ｉ－８１に記載の方法。
実施形態Ｉ－８５．タンパク質が、心トロポニンＴ；心サルコメアタンパク質；β－ミオシン重鎖；心室ミオシン必須軽鎖１；心室ミオシン調節軽鎖２；心α－アクチン；ａ－トロポミオシン；心トロポニンＩ；心ミオシン結合タンパク質Ｃ；ｆｏｕｒ－ａｎｄ－ａ－ｈａｌｆ ＬＩＭタンパク質１；チチン；５’－ＡＭＰ－活性化タンパク質キナーゼサブユニットガンマ－２；トロポニンＩ ３型、ミオシン軽鎖２、アクチンアルファ心筋１；心ＬＩＭタンパク質；カベオリン３（ＣＡＶ３）；ガラクトシダーゼアルファ（ＧＬＡ）；リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２）；ミトコンドリア転移ＲＮＡグリシン（ＭＴＴＧ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡイソロイシン（ＭＴＴＩ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡリシン（ＭＴＴＫ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡグルタミン（ＭＴＴＱ）；ミオシン軽鎖３（ＭＹＬ３）；トロポニンＣ（ＴＮＮＣ１）；トランスサイレチン（ＴＴＲ）；筋小胞体カルシウム－ＡＴＰアーゼ２ａ（ＳＥＲＣＡ２ａ）；間質由来因子－１（ＳＤＦ－１）；アデニレートシクラーゼ－６（ＡＣ６）；β－ＡＲＫｃｔ（βアドレナリン受容体キナーゼＣ末端）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；肝細胞成長因子；低酸素誘導成長因子；チモシンベータ４（ＴＭＳＢ４Ｘ）；一酸化窒素シンターゼ－３（ＮＯＳ３）；アポリポタンパク質－Ｅ（ＡｐｏＥ）；およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；Ｓ１００Ａ１から選択される、実施形態Ｉ－８４に記載の方法。
実施形態Ｉ－８６．１つまたは複数の遺伝子産物が、１つまたは複数のリプログラミング因子を含む、実施形態Ｉ－８１に記載の方法。
実施形態Ｉ－８７．１つまたは複数のリプログラミング因子が、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＡＵＲＫＢ、ＯＣＴ４、ＢＡＦ６０Ｃ、ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ２、ＩＲＸ４、ＩＳＬＬ、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＮＫＸ２．５、ＳＲＦ、ＴＢＸ２０、およびＺＦＰＭ２から選択される１つまたは複数のポリペプチドである、実施形態Ｉ－８６に記載の方法。
実施形態Ｉ－８８．心臓細胞を心臓の心筋細胞へとリプログラムする、実施形態Ｉ－８０からＩ－８７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－８９．それを必要とする対象における心病態を処置する方法であって、実施形態Ｉ－７９に記載の医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶビリオンが心組織を形質導入する、方法。
実施形態Ｉ－８９．ｒＡＡＶビリオンが、皮下、心外膜、静脈内、筋肉内、腹腔内もしくは心臓内注射によるか、または心臓内カテーテル挿入によって投与される、実施形態Ｉ－８９に記載の方法。
実施形態Ｉ－９０．ｒＡＡＶビリオンが、直接心筋内注射または経血管投与によって投与される、実施形態Ｉ－８９に記載の方法。
実施形態Ｉ－９１．ｒＡＡＶビリオンが、直接心筋内注射、順行性冠動脈内注射、逆行性注射、経心内膜心筋注射、または再循環送達を伴う分子心臓手術（ＭＣＡＲＤ）によって投与される、実施形態Ｉ－８９に記載の方法。
以下の非限定的な実施例は、本発明の開発に関係する実験研究の一部を例証する。
（実施例１）
カプシドタンパク質配列の同定
ライブラリーの生成およびＡＡＶ選択
人工多能性幹細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）に関する最初の負の選択ステップの後にヒト心臓線維芽細胞（ｈＣＦ）に関する正の選択ステップを組み入れるライブラリースクリーニング戦略を、図１に示すように実施した。簡単に説明するとｃａｐ遺伝子配列のライブラリーを、プライマーＰ１（ＧＴＣＧＧＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧＧＣＣＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＴＧＣＣＣＣＣＧＣＧＡＣＣＧＧＣＡＣＧ）（配列番号６）およびＰ２（ＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＡＧＣＧＡＴＧＣＡＴＴＴＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＡＴＧＣＧＡＣ）（配列番号７）｛Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ；Ｋ＝ＧまたはＴ｝を使用するＰＣＲによって生成し、ギブソンアセンブリを介してＮｏｔＩおよびＮｈｅＩ線形化ｐＣＲ－ＡＡＶ－ＬＩＢ５７５へとクローニングした（図２Ａ）。ｐＣＲ－ＡＡＶ－ＬＩＢ５７５を、ＨＥＫ２９３Ｔパッケージング細胞系を使用してｒＡＡＶビリオンにパッケージングした。ベクターは、３’および５’末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に挟まれたＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子（「Ｒｅｐ２」）およびＡＡＶのｃａｐ遺伝子（「Ｃａｐ５」）を含有する。アラニン残基に挟まれたランダムな７量体ポリペプチドライブラリー（ＡＸＸＸＸＸＸＡ；配列番号１００）をｃａｐ遺伝子の５７５位に挿入する。図２Ｂは、ＡＡＶ５カプシドの構造を示し、黒色の矢印は、アセンブルしたＡＡＶビリオン上に存在するカプシドタンパク質６０コピーのうちの１つに示される挿入部位を示す。ｃａｐ遺伝子への挿入により、同じポリペプチドが同等の位置で６０コピー全てに挿入される（図には示していない）。
感染多重度が５０，０００（ラウンド１）～１，０００（ラウンド３）の範囲のビリオンを液体培養培地中で混合し、健康な年齢３０歳の男性から単離したｉＰＳ－ＣＭ細胞に適用した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ＤＮＡをｉＰＳ－ＣＭ細胞から単離し、プライマーＰ２（配列番号７）およびＰ３（ＣＣＡＴＣＧＡＣＧＴＣＡＧＡＣＧＣＧＧＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＣＡＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＡＧ）（配列番号８）を使用してＰＣＲによって増幅し、Ｏｘｆｏｒｄ ＮａｎｏＰｏｒｅ ＭｉｎｉＩＯＮを使用して製造業者の指示に従ってシーケンシングした。この負の選択ステップに関するシーケンシング読み取りデータを分析した（データは示していない）。
次いで、ｉＰＳ－ＣＭ細胞に付着していないまたは感染していないｒＡＡＶビリオンを含有する培養培地をｈＣＦ細胞に移し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間後、プレートを培養培地によって洗浄し、接着したｈＣＦ細胞を除去し、ｃａｐ遺伝子のＰＣＲ増幅およびシーケンシングを、上記のようにｒＡＡＶを感染させたｈＣＦ細胞から単離したＤＮＡについて実施した。配列の開始ライブラリーおよび負の選択および正の選択のこの最初のラウンド後の配列に関する代表的なデータをそれぞれ、図３Ａおよび図３Ｂに示す。ライブラリーの複雑度が減少し、これはユニーク読み取りデータのパーセンテージが９７．６％から８７．５％に減少したことから、選択された配列が富化されたことと一致する。
最初のラウンドから得られたｃａｐ遺伝子のライブラリーを、再度ｐＣＲ－ＡＡＶ－ＬＩＢ５７５にサブクローニングし、同じ負の選択および正の選択手順をラウンド２として実施した。これをラウンド３として繰り返した。配列の持続的な富化は、ラウンド２（図３Ｃ）からラウンド３（図３Ｄ）のユニーク読み取りデータが５８．２％から４１．５％に減少することによって観察された。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ系における形質導入効率の増加の確認
各々のユニーク配列の読み取りデータの数は、その挿入配列を含有するｒＡＡＶビリオンの形質導入効率の増加と相関することから、読み取りデータの富化は、形質導入効率の増加の実験的測定である。最高の存在量を有する５００個の配列を以下の表２に示す。
表１に列挙する配列を、ＧＦＰレポーターアッセイを使用して培養ｈＣＦ細胞（図４Ａ～４Ｄ）およびｉＰＳ－ＣＭ細胞（図５Ａ～５Ｄ）において再試験するために選択した。
Figure 0007630176000008
Figure 0007630176000009
簡単に説明すると、表１のペプチドを選択実験と同様にＡＡＶゲノムではなく末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を欠如するＲｅｐ－Ｃａｐプラスミドにおける同じ挿入部位でｃａｐ遺伝子に各々クローニングした。これらのＲｅｐ－Ｃａｐプラスミドを各々使用して、レポーターＡＡＶゲノムをパッケージングするｒＡＡＶを生成するために、Ｒｅｐ２およびそれぞれのＣａｐバリアントを発現させた（ＣＡＧプロモーターによって制御されるＧＦＰトランスジーンに隣接するＡＡＶ２ ＩＴＲ）。カプシドとして操作されたカプシドタンパク質を有するＧＦＰトランスジーンを含有する得られたｒＡＡＶビリオンを、接着性のｈＣＦまたはｉＰＳ－ＣＭ細胞上にＭＯＩ １００，０００で（図４Ａ、図５Ａ、図５Ｄ）または１，０００で（図４Ｄ）プレーディングした。形質導入効率を、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（商標）細胞イメージングマルチモードリーダーを備えた自動デジタル広視野顕微鏡法を使用してＧＦＰ蛍光細胞を計数することによって測定した。代表的な蛍光顕微鏡写真を、（図４Ｂ；親ＡＡＶ５カプシド－配列番号１）および（図４Ｃ；ＡＡＶ５．ＣＲ１７カプシド－配列番号１０３）に示す。ｈＣＦ細胞における１５個のＡＡＶ５バリアントの形質導入効率（図４Ａ）を、非改変ＡＡＶ５（一番右の棒グラフ）に対して基準とした。より暗い棒グラフは、この実験においてｈＣＦ細胞において形質転換効率の増加をもたらした配列を表す。
ｉＰＳ－ＣＭ細胞（図５Ａ～５Ｄ）では、形質導入効率の増加が同様に観察され、実際に親ＡＡＶ５と比較した形質導入の増強倍率は、ｈＣＦ細胞におけるより高かった（図５Ａおよび図５Ｄ）。代表的な蛍光画像を、非改変ＡＡＶ５（図５Ｂ）またはＡＡＶ５．ＣＲ２３（図５Ｃ）のいずれかによって形質導入したｈＣＦに関して示す。
次に、ヒト心臓線維芽細胞による試験を、マウス心臓線維芽細胞（ｍＣＦ）において高い（１００，０００）、中等度（１０，０００）、または低い（１，０００）ＭＯＩでＡＡＶ５．ＣＡＧ－ＧＦＰまたはＡＡＶ５．ＣＲ１７．ＣＡＧ－ＧＦＰのいずれかによって繰り返した。ＡＡＶ５．ＣＲ１７をＡＡＶ５と比較する試験におけるＧＦＰ＋細胞の総数の増加に加えて、高い強度のＧＦＰ集団がＡＡＶ５．ＣＲ１７によって形成されたが、ＡＡＶ５では形成されないことが観察された（図６Ａ）。したがって、図６Ｂ～６Ｅにおける個々の細胞の強度の測定値を、総集団および高いＧＦＰ＋集団の細胞サブセットにゲートした。細胞を、非改変ＡＡＶ５と比較してＡＡＶ５．ＣＲ１７で、高い、中等度、または低いＭＯＩで形質導入した場合、パーセントＧＦＰ＋（図６Ｂ）およびＧＦＰ強度（図６Ｃ）の増加が、「総ＧＦＰ」集団において観察された。パーセントＧＦＰ＋（図６Ｄ）およびＧＦＰ強度（図６Ｅ）の増加はまた、細胞に非改変ＡＡＶ５と比較してＡＡＶ５．ＣＦ１７を形質導入した場合に「高いＧＦＰ」集団においても観察された。図６Ｅの傾向は、単に高ＧＦＰ＋細胞についてのゲーティングにより高強度のＧＦＰ発現を有する細胞集団が選択されたことからあまり顕著ではなかった。
ｉｎ ｖｉｖｏ試験
次に、ＡＡＶ５．ＣＲ１７カプシドを、ｉｎ ｖｉｖｏで健康な動物および疾患動物において試験した。具体的には、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（登録商標）から購入したＣＤ－１（登録商標）ＩＧＳマウス（野生型バックグラウンド）を、健常群と疾患群とに分けた。疾患群をGao et al. Circulation Research (2010) 107:1445-1453の結紮法を使用して誘導心筋梗塞（ＭＩ）に供した。ＡＡＶ５．ＣＡＧ－ＧＦＰまたはＡＡＶ５．ＣＲ１７．ＣＡＧ－ＧＦＰのいずれかの１．２×１０１１ｖｇを、６週齢のＣＤ－１マウスに心筋内注射を介して注射した。ＧＦＰ強度および分布を注射の７日後に評価した。全ての心組織切片を等しいゲインおよび露出で２０倍対物レンズを使用してイメージングした。抗ＧＦＰ免疫染色およびＤＡＰＩによる核の対比染色を示す。心筋細胞および線維芽細胞は形態によって識別された。心筋細胞および線維芽細胞の形質導入の増加が、非ＭＩおよびＭＩ動物の両方においてＡＡＶ５（図７Ａ～７Ｂおよび図７Ｃ～７Ｄ）と比較してＡＡＶ５．ＣＲ１７（図７Ｅ～７Ｆおよび図７Ｇ～７Ｈ）において観察される。
共有される配列モチーフ
選択後の富化を実証する挿入の間において共有される残基を同定するために、全てのシーケンシングデータまたはラウンド３後の上位配列を使用して、配列モチーフを生成した。簡単に説明すると、配列モチーフを、表２における上位１００（図８Ａ）、上位５０（図８Ｂ）、上位２０（図８Ｃ）の配列、ならびに本実施例においてｉｎ ｖｉｔｒｏで再試験した配列（図８Ｄ）に関して生成した。配列モチーフはまた、モチーフにおける各々のアミノ酸の重要性に重みをつけるために各々の配列の読み取りデータ数を使用して全ての配列に関しても生成した（図８Ｅ）。配列モチーフは、ある特定のアミノ酸が挿入部位におけるある特定の位置で好ましいことを示唆している。
ライブラリーからの上位の配列を以下の表２に示す。挿入の開始および終止における隣接する「Ａ」残基は、一部の実施形態では、フレキシブルアミノ酸（ＧまたはＳ）などの別のアミノ酸で置き換えられているか、または存在しない。
Figure 0007630176000010
Figure 0007630176000011
Figure 0007630176000012
Figure 0007630176000013
Figure 0007630176000014
Figure 0007630176000015
Figure 0007630176000016
Figure 0007630176000017
Figure 0007630176000018
Figure 0007630176000019
Figure 0007630176000020
Figure 0007630176000021
Figure 0007630176000022
（実施例２）
形質導入効率の増加を有するＡＡＶ５カプシドタンパク質の合理的設計
実施例１に記載されるライブラリーに基づくアプローチに関連して、合理的設計アプローチを使用して形質導入効率の増加をもたらすＡＡＶ５カプシドタンパク質を同定した。表面露出残基を選択した。これらのアミノ酸の置換を、実施例１に記載されるようにｈＣＦアッセイにおいて試験した。ＡＡＶ５カプシドにおける置換Ｓ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、またはＴ５８２Ａは、感染多重度１００，０００ｖｇ／細胞で、感染後７２時間で改善されたヒト心臓線維芽細胞形質導入をもたらした（図９）。
追跡実験において、この合理的設計実験で同定された置換を互いに組み合わせて、ならびに表１および２に開示する挿入と組み合わせて試験する。
（実施例３）
ＡＡＶｘ１を野生型ＡＡＶ５と比較する比較試験
Ｓ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、および／またはＴ５８２Ａ置換のうち２つまたは３つを有するＡＡＶ５カプシド（ＡＡＶｘ１）を生成した。カプシド配列は以下の通りであった：
Figure 0007630176000023
ヒト心臓線維芽細胞（ｈＣＦ）を形質導入する能力を試験するため、ｈＣＦに、ＡＡＶ５．ＣＡＧ－ＧＦＰまたはＡＡＶｘ１（Ｔ５８２Ａ＋Ｓ６５１Ａ）を、１，０００～１，０００，０００の範囲のＭＯＩで感染させた。感染の４８時間後、細胞を採取し、ＧＦＰ発現を、フローサイトメトリーを使用して定量した。試験した全てのＭＯＩで、パーセント形質導入（図１０Ａ）、ＧＦＰ発現（図１０Ｂ）、および相対的形質導入（図１０Ｃ）が、野生型ＡＡＶ５カプシドと比較して増加した。
ＡＡＶｘ１ベクターが機能的なカーゴを送達する能力を、ミオカルジンおよびＡＳＣＬ１（ＭｙＡ）をコードする発現カセットを含むＡＡＶ５およびＡＡＶｘ１ベクターを生成することによって試験した。その各々が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９１５０および米国仮特許出願第６２／７８８，４７９号に記載されるミオカルジンの内部欠失ＭｙΔ３を使用した。顕著なことに、ＡＡＶｘ１ベクターは、感染後７日目でのトランスジーンおよびマーカー発現に基づいて、ＡＡＶ５ベクターより平均で９倍良好な成績を示した（表３に示す）。
Figure 0007630176000024
（実施例４）
ＡＡＶｘ１による心組織のｉｎ ｖｉｖｏ形質導入
マウスでの試験
ｉｎ ｖｉｖｏ形質導入を評価するために、ＡＡＶ５またはＡＡＶｘ１（Ｔ５８２Ａ＋Ｓ６５１Ａ）カプシドを使用して、ＬＡＤ結紮マウス心筋梗塞（ＭＩ）モデルを使用してＧＦＰレポーターをコードする発現カセットをマウスに送達し、ＡＡＶベクターの注射を傷害の時点で心外膜に行った。単一のベクター用量１．２×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）を心臓内注射によって各対象の心臓に送達した。注射後７日に、動物を屠殺し、その心臓を酵素消化によって解離した。解離した細胞を内皮細胞マーカー（ＣＤ３１）および線維芽細胞マーカー（Ｔｈｙ－１）によって染色し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣ）を使用して選別した。ＧＦＰ＋、Ｔｈｙ－１＋、およびＣＤ３１－細胞を形質導入心臓線維芽細胞として分類し、一方ＧＦＰ－、Ｔｈｙ－１＋、およびＣＤ３１－細胞を非形質導入心臓線維芽細胞として分類した。形質導入細胞の数をＡＡＶ５に対して正規化した。図１１に示すように、心臓線維芽細胞（ＣＦ）のｉｎ ｖｉｖｏ形質導入は、ＡＡＶ５ベクターよりＡＡＶｘ１ベクターを使用すると４倍より高かった。
機能的なｉｎ ｖｉｖｏ試験に関して、ＡＡＶｘ１（Ｔ５８２Ａ＋Ｓ６５１Ａ）カプシドを使用してミオカルジンおよびＡＳＣＬ１（ＭｙＡ）をコードする発現カセットを送達した。ＡＡＶｘ１ベクターを、ＬＡＤ結紮マウス心筋梗塞（ＭＩ）モデルを使用してマウスにおいて試験し、ＡＡＶベクターの注射を傷害の時点で心外膜に行った。単一のベクター用量１．２×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）を心臓内注射によって各対象の心臓に送達した。
有効性を心エコー検査によって注射後２、４、６、および８週に評価した。ＡＡＶｘ１ベクターは、ＧＦＰコード対照と比較して心機能（駆出率）を有意に保存した（図１２）。
ブタでの試験
ＡＡＶｘ１ベクターをブタ心筋梗塞（ＭＩ）モデルにおいてさらに試験した。ＭｙＡをＡＡＶｘ１カプシドにパッケージングして、９０分間バルーン閉塞して虚血性傷害を導入後の２８日にブタ心臓の境界領域に心外膜注射した。これと並行して梗塞を有するブタに、製剤緩衝液も注射し、各々の群は１０匹の動物からなった。心エコー検査を、注射後３週、５週、７週および９週に実施した。ＡＡＶｘ１ベクターを投与したブタは、対照の注射後５週、７週および９週と比較して駆出率の有意な改善を実証した（図１３）。このようにＡＡＶｘ１ベクターによる処置は、投与前のベースラインを超える心成績の平均で１０％改善をもたらした。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって：
ａ）親ＡＡＶ５カプシドと比較して、Ｓ６５１Ａ、Ｓ６５１Ｇ、Ｓ６５１Ｖ、Ｓ６５１Ｌ、Ｓ６５１Ｉ、Ｔ５７８Ａ、Ｔ５７８Ｇ、Ｔ５７８Ｖ、Ｔ５７８Ｌ、Ｔ５７８Ｉ、Ｔ５８２Ａ、Ｔ５８２Ｇ、Ｔ５８２Ｖ、Ｔ５８２Ｌ、またはＴ５８２Ｉから選択される１つまたは複数の置換を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質；および
ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、ｒＡＡＶビリオン。
（項目２）
前記ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、Ｓ６５１ＡまたはＳ６５１Ｖ；Ｔ５７８ＡまたはＴ５７８Ｖ；および／またはＴ５８２ＡもしくはＴ５８２Ｖから選択される２つまたはそれより多くの置換を含む、項目２に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目３）
前記ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、Ｔ５８２ＡおよびＳ６５１Ａ置換を含む、項目２に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目４）
前記ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、Ｔ５７８ＡおよびＴ５８２Ａ置換を含む、項目３に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目５）
前記ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、Ｔ５７８ＡおよびＳ６５１Ａ置換を含む、項目３に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目６）
前記ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、Ｓ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、およびＴ５８２Ａ置換を含む、項目３に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目７）
前記ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号７３と少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を共有する、項目１から６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目８）
親ＡＡＶ５カプシドと比較して、Ｓ６５１Ａ、Ｓ６５１Ｇ、Ｓ６５１Ｖ、Ｓ６５１Ｌ、Ｓ６５１Ｉ、Ｔ５７８Ａ、Ｔ５７８Ｇ、Ｔ５７８Ｖ、Ｔ５７８Ｌ、Ｔ５７８Ｉ、Ｔ５８２Ａ、Ｔ５８２Ｇ、Ｔ５８２Ｖ、Ｔ５８２Ｌ、またはＴ５８２Ｉから選択される１つまたは複数の置換を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目９）
Ｓ６５１ＡまたはＳ６５１Ｖ；Ｔ５７８ＡまたはＴ５７８Ｖ；またはＴ５８２ＡもしくはＴ５８２Ｖから選択される２つまたはそれより多くの置換を含む、項目８に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目１０）
Ｔ５８２ＡおよびＳ６５１Ａ置換を含む、項目９に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目１１）
Ｔ５７８ＡおよびＴ５８２Ａ置換を含む、項目９に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目１２）
Ｔ５７８ＡおよびＳ６５１Ａ置換を含む、項目９に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目１３）
Ｓ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、およびＴ５８２Ａ置換を含む、項目９に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目１４）
配列番号７３と少なくとも９０％の同一性を共有する、項目８から１３のいずれか一項に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目１５）
配列番号７３と少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を共有する、項目８から１３のいずれか一項に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目１６）
項目８から１５のいずれか一項に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目１７）
項目１から７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物。
（項目１８）
心臓細胞を形質導入する方法であって、前記心臓細胞に、項目１から７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオンを接触させるステップを含み、前記ｒＡＡＶビリオンが前記心臓細胞を形質導入する、方法。
（項目１９）
１つまたは複数の遺伝子産物を心臓細胞に送達する方法であって、前記心臓細胞に、項目１から７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオンを接触させるステップを含み、前記心臓細胞が前記遺伝子産物を発現する、方法。
（項目２０）
前記１つまたは複数の遺伝子産物が、必要に応じて心トロポニンＴ；心サルコメアタンパク質；β－ミオシン重鎖；心室ミオシン必須軽鎖１；心室ミオシン調節軽鎖２；心α－アクチン；ａ－トロポミオシン；心トロポニンＩ；心ミオシン結合タンパク質Ｃ；ｆｏｕｒ－ａｎｄ－ａ－ｈａｌｆ ＬＩＭタンパク質１；チチン；５’－ＡＭＰ－活性化タンパク質キナーゼサブユニットガンマ－２；トロポニンＩ ３型、ミオシン軽鎖２、アクチンアルファ心筋１；心ＬＩＭタンパク質；カベオリン３（ＣＡＶ３）；ガラクトシダーゼアルファ（ＧＬＡ）；リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２）；ミトコンドリア転移ＲＮＡグリシン（ＭＴＴＧ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡイソロイシン（ＭＴＴＩ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡリシン（ＭＴＴＫ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡグルタミン（ＭＴＴＱ）；ミオシン軽鎖３（ＭＹＬ３）；トロポニンＣ（ＴＮＮＣ１）；トランスサイレチン（ＴＴＲ）；筋小胞体カルシウム－ＡＴＰアーゼ２ａ（ＳＥＲＣＡ２ａ）；間質由来因子－１（ＳＤＦ－１）；アデニレートシクラーゼ－６（ＡＣ６）；β－ＡＲＫｃｔ（βアドレナリン受容体キナーゼＣ末端）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；肝細胞成長因子；低酸素誘導成長因子；チモシンベータ４（ＴＭＳＢ４Ｘ）；一酸化窒素シンターゼ－３（ＮＯＳ３）；アポリポタンパク質－Ｅ（ＡｐｏＥ）；およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；Ｓ１００Ａ１から選択されるポリペプチドを含む、項目１８または項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記１つまたは複数の遺伝子産物が、必要に応じてＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＡＵＲＫＢ、ＯＣＴ４、ＢＡＦ６０Ｃ、ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ２、ＩＲＸ４、ＩＳＬＬ、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＮＫＸ２．５、ＳＲＦ、ＴＢＸ２０、およびＺＦＰＭ２から選択される１つまたは複数のリプログラミング因子を含む、項目１８または項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記心臓細胞を心臓の心筋細胞へとリプログラムする、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
それを必要とする対象における心病態を処置する方法であって、項目１７に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶビリオンが心組織を形質導入する、方法。
（項目２４）
前記ｒＡＡＶビリオンが心外膜注射によって投与される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記ｒＡＡＶビリオンが、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、心臓内注射、心臓内カテーテル挿入、直接心筋内注射、経血管投与、順行性冠動脈内注射、逆行性注射、経心内膜心筋注射、または再循環送達を伴う分子心臓手術（ＭＣＡＲＤ）によって投与される、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって：
ａ）親配列のＧＨループにおける挿入部位に前記親配列に対して５～１１アミノ酸の挿入を含むＡＡＶ５カプシドタンパク質；および
ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、ｒＡＡＶビリオン。
（項目２７）
前記挿入部位が、配列番号１の５６０～５９４に対応する前記親配列における位置での任意の２つの、必要に応じて隣接するアミノ酸の間である、項目２６に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目２８）
前記挿入部位が、配列番号１の５７４および５７５に対応する前記親配列における隣接するアミノ酸の間である、項目２７に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目２９）
前記挿入が以下の式：
－Ｘ ０ －Ｘ １ －Ｘ ２ －Ｘ ３ －Ｘ ４ －Ｘ ５ －Ｘ ６ －Ｘ ７ －Ｘ ８ －
（式中、Ｘ ０ およびＸ ８ が、各々独立してＡ、Ｓ、Ｇであるか、または存在しない）（配列番号１１０２）
のペプチドである、項目２６から２８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目３０）
前記挿入が以下の式：
－Ａ－Ｘ １ －Ｘ ２ －Ｘ ３ －Ｘ ４ －Ｘ ５ －Ｘ ６ －Ｘ ７ －Ａ－
（式中：
ａ）Ｘ １ が、Ｐ、Ｒ、またはＧであり；
ｂ）Ｘ ２ が、Ｋ、Ｌ、またはＲであり；
ｃ）Ｘ ３ が、任意のアミノ酸であり；
ｄ）Ｘ ４ が、Ｎ、Ｈ、Ｋ、またはＱであり；
ｅ）Ｘ ５ が、任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてＸ ５ が、Ｇ、Ｋ、もしくはＳであり；
ｆ）Ｘ ６ が、任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてＸ ６ が、ＴもしくはＶであり；
ｇ）Ｘ ７ が、任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてＸ ７ が、ＫもしくはＶである）（配列番号１１０３）
のペプチドである、項目２９に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目３１）
前記挿入が、配列番号１０１～６００から選択されるアミノ酸配列を含む、項目３０に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目３２）
前記挿入が、ＲＫＶＨＩＥＶ（配列番号８１）、ＲＫＹＱＳＤＬ（配列番号８２）、ＰＬＴＮＴＶＫ（配列番号８３）、ＬＫＹＨＧＰＰ（配列番号８４）、ＲＫＹＱＧＤＭ（配列番号８５）、ＲＫＦＨＳＴＤ（配列番号８６）、ＲＫＨＨＧＬＥ（配列番号８７）、ＰＧＴＮＶＴＫ（配列番号８８）、ＲＫＭＨＭＰＤ（配列番号８９）、ＰＬＫＫＩＶＱ（配列番号９０）、ＰＬＧＫＫＴＳ（配列番号９１）、ＰＲＧＶＫＶＴ（配列番号９２）、ＰＬＡＫＳＫＳ（配列番号９３）、ＰＲＴＫＧＡＶ（配列番号９４）、およびＰＳＧＲＫＡＴ（配列番号９５）から選択されるアミノ酸配列を含む、項目３０に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目３３）
前記挿入が、ＡＲＫＶＨＩＥＶＡ（配列番号１０１）、ＡＲＫＹＱＳＤＬＡ（配列番号１０２）、ＡＰＬＴＮＴＶＫＡ（配列番号１０３）、ＡＬＫＹＨＧＰＰＡ（配列番号１０４）、ＡＲＫＹＱＧＤＭＡ（配列番号１０５）、ＡＲＫＦＨＳＴＤＡ（配列番号１０６）、ＡＲＫＨＨＧＬＥＡ（配列番号１０７）、ＡＰＧＴＮＶＴＫＡ（配列番号１０８）、ＡＲＫＭＨＭＰＤＡ（配列番号１０９）、ＡＰＬＫＫＩＶＱＡ（配列番号１１０）、ＡＰＬＧＫＫＴＳＡ（配列番号１１１）、ＡＰＲＧＶＫＶＴＡ（配列番号１１２）、ＡＰＬＡＫＳＫＳＡ（配列番号１１３）、ＡＰＲＴＫＧＡＶＡ（配列番号１１４）、ＡＰＳＧＲＫＡＴＡ（配列番号１１５）から選択されるアミノ酸配列を含む、項目３０に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目３４）
前記挿入が、アミノ酸配列ＰＬＴＮＴＶＫ（配列番号８３）、またはＰＬＴＮＴＶＫ（配列番号８３）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、項目３０に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目３５）
前記挿入が、アミノ酸配列ＰＬＫＫＩＶＱ（配列番号９０）、またはＰＬＫＫＩＶＱ（配列番号９０）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、項目３０に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目３６）
前記カプシドタンパク質が親ＡＡＶ５カプシドと比較してＳ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、またはＴ５８２Ａから選択される１つまたは複数の置換を含む、項目２６から３５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目３７）
前記ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、Ｓ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、またはＴ５８２Ａから選択される２つまたはそれより多くの置換を含む、項目３６に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目３８）
前記ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、Ｔ５８２ＡおよびＳ６５１Ａ置換を含む、項目３６に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目３９）
前記ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、Ｔ５７８ＡおよびＴ５８２Ａ置換を含む、項目３６に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目４０）
前記ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、Ｔ５７８ＡおよびＳ６５１Ａ置換を含む、項目３６に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目４１）
前記ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、Ｓ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、およびＴ５８２Ａ置換を含む、項目３６に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目４２）
前記親配列を含むＡＡＶビリオンと比較して心臓細胞において形質導入効率の増加を示す、項目２６から４１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目４３）
前記親配列を含むＡＡＶビリオンと比較してヒト心臓線維芽細胞（ｈＣＦ）において形質導入効率の増加を示す、項目２６から４２に記載のｒＡＡＶビリオン。
（項目４４）
親配列のＧＨループにおける挿入部位に前記親配列に対して５～１１アミノ酸の挿入を含む、ＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目４５）
前記挿入部位が、配列番号１の５７４および５７５に対応する前記親配列における隣接するアミノ酸の間である、項目４４に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目４６）
前記挿入が以下の式：
－Ｘ ０ －（Ｘ） ｎ －Ｘ １０ －
（式中、ｎが５～９であり、
Ｘ ０ およびＸ １０ が、各々独立してＡ、Ｓ、Ｇであるか、または存在しない）（配列番号１１０１）
のペプチドである、項目４４または項目４５に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目４７）
前記挿入が以下の式：
－Ｘ ０ －Ｘ １ －Ｘ ２ －Ｘ ３ －Ｘ ４ －Ｘ ５ －Ｘ ６ －Ｘ ７ －Ｘ ８ －
（式中、Ｘ ０ およびＸ ８ が、各々独立してＡ、Ｓ、Ｇであるか、または存在しない）（配列番号１１０２）
のペプチドである、項目４４または項目４５に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目４８）
前記挿入が以下の式：
－Ａ－Ｘ １ －Ｘ ２ －Ｘ ３ －Ｘ ４ －Ｘ ５ －Ｘ ６ －Ｘ ７ －Ａ－
（式中：
ａ）Ｘ １ が、Ｐ、Ｒ、またはＧであり；
ｂ）Ｘ ２ が、Ｋ、Ｌ、またはＲであり；
ｃ）Ｘ ３ が、任意のアミノ酸であり；
ｄ）Ｘ ４ が、Ｎ、Ｈ、Ｋ、またはＱであり；
ｅ）Ｘ ５ が、任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてＸ ５ が、Ｇ、Ｋ、もしくはＳであり；
ｆ）Ｘ ６ が、任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてＸ ６ が、ＴもしくはＶであり；
ｇ）Ｘ ７ が、任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてＸ ７ が、ＫもしくはＶである）（配列番号１１０３）
のペプチドである、項目４７に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目４９）
前記挿入が、配列番号１０１～６００から選択されるアミノ酸配列を含む、項目４８に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目５０）
前記挿入が、ＲＫＶＨＩＥＶ（配列番号８１）、ＲＫＹＱＳＤＬ（配列番号８２）、ＰＬＴＮＴＶＫ（配列番号８３）、ＬＫＹＨＧＰＰ（配列番号８４）、ＲＫＹＱＧＤＭ（配列番号８５）、ＲＫＦＨＳＴＤ（配列番号８６）、ＲＫＨＨＧＬＥ（配列番号８７）、ＰＧＴＮＶＴＫ（配列番号８８）、ＲＫＭＨＭＰＤ（配列番号８９）、ＰＬＫＫＩＶＱ（配列番号９０）、ＰＬＧＫＫＴＳ（配列番号９１）、ＰＲＧＶＫＶＴ（配列番号９２）、ＰＬＡＫＳＫＳ（配列番号９３）、ＰＲＴＫＧＡＶ（配列番号９４）、およびＰＳＧＲＫＡＴ（配列番号９５）から選択されるアミノ酸配列を含む、項目４８に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目５１）
前記挿入が、ＡＲＫＶＨＩＥＶＡ（配列番号１０１）、ＡＲＫＹＱＳＤＬＡ（配列番号１０２）、ＡＰＬＴＮＴＶＫＡ（配列番号１０３）、ＡＬＫＹＨＧＰＰＡ（配列番号１０４）、ＡＲＫＹＱＧＤＭＡ（配列番号１０５）、ＡＲＫＦＨＳＴＤＡ（配列番号１０６）、ＡＲＫＨＨＧＬＥＡ（配列番号１０７）、ＡＰＧＴＮＶＴＫＡ（配列番号１０８）、ＡＲＫＭＨＭＰＤＡ（配列番号１０９）、ＡＰＬＫＫＩＶＱＡ（配列番号１１０）、ＡＰＬＧＫＫＴＳＡ（配列番号１１１）、ＡＰＲＧＶＫＶＴＡ（配列番号１１２）、ＡＰＬＡＫＳＫＳＡ（配列番号１１３）、ＡＰＲＴＫＧＡＶＡ（配列番号１１４）、ＡＰＳＧＲＫＡＴＡ（配列番号１１５）から選択されるアミノ酸配列を含む、項目４８に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目５２）
前記挿入が、アミノ酸配列ＰＬＴＮＴＶＫ（配列番号８３）、またはＰＬＴＮＴＶＫ（配列番号８３）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、項目４８に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目５３）
前記挿入が、アミノ酸配列ＰＬＫＫＩＶＱ（配列番号９０）、またはＰＬＫＫＩＶＱ（配列番号９０）と比較して多くて１、２、３、もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列を含む、項目４８に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目５４）
親ＡＡＶ５カプシドと比較してＳ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、またはＴ５８２Ａから選択される１つまたは複数の置換を含む、項目４４から５３のいずれか一項に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目５５）
Ｓ６５１Ａ、Ｔ５７８Ａ、またはＴ５８２Ａから選択される２つまたはそれより多くの置換を含む、項目５４に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
（項目５６）
項目４４から５５のいずれか一項に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目５７）
項目２６から４３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物。
（項目５８）
心臓細胞を形質導入する方法であって、前記心臓細胞に、項目２６から４３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオンを接触させるステップを含み、前記ｒＡＡＶビリオンが前記心臓細胞を形質導入する、方法。
（項目５９）
心臓細胞に１つまたは複数の遺伝子産物を送達する方法であって、前記心臓細胞に、項目２６から４３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶビリオンを接触させるステップを含み、前記心臓細胞が前記遺伝子産物を発現する、方法。
（項目６０）
前記１つまたは複数の遺伝子産物が、必要に応じて心トロポニンＴ；心サルコメアタンパク質；β－ミオシン重鎖；心室ミオシン必須軽鎖１；心室ミオシン調節軽鎖２；心α－アクチン；ａ－トロポミオシン；心トロポニンＩ；心ミオシン結合タンパク質Ｃ；ｆｏｕｒ－ａｎｄ－ａ－ｈａｌｆ ＬＩＭタンパク質１；チチン；５’－ＡＭＰ－活性化タンパク質キナーゼサブユニットガンマ－２；トロポニンＩ ３型、ミオシン軽鎖２、アクチンアルファ心筋１；心ＬＩＭタンパク質；カベオリン３（ＣＡＶ３）；ガラクトシダーゼアルファ（ＧＬＡ）；リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２）；ミトコンドリア転移ＲＮＡグリシン（ＭＴＴＧ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡイソロイシン（ＭＴＴＩ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡリシン（ＭＴＴＫ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡグルタミン（ＭＴＴＱ）；ミオシン軽鎖３（ＭＹＬ３）；トロポニンＣ（ＴＮＮＣ１）；トランスサイレチン（ＴＴＲ）；筋小胞体カルシウム－ＡＴＰアーゼ２ａ（ＳＥＲＣＡ２ａ）；間質由来因子－１（ＳＤＦ－１）；アデニレートシクラーゼ－６（ＡＣ６）；β－ＡＲＫｃｔ（βアドレナリン受容体キナーゼＣ末端）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；肝細胞成長因子；低酸素誘導成長因子；チモシンベータ４（ＴＭＳＢ４Ｘ）；一酸化窒素シンターゼ－３（ＮＯＳ３）；アポリポタンパク質－Ｅ（ＡｐｏＥ）；およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；Ｓ１００Ａ１から選択されるポリペプチドを含む、項目５８または項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記１つまたは複数の遺伝子産物が、必要に応じてＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＡＵＲＫＢ、ＯＣＴ４、ＢＡＦ６０Ｃ、ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ２、ＩＲＸ４、ＩＳＬＬ、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＮＫＸ２．５、ＳＲＦ、ＴＢＸ２０、およびＺＦＰＭ２から選択される１つまたは複数のリプログラミング因子を含む、項目５８または項目５９に記載の方法。
（項目６２）
前記心臓細胞を心臓の心筋細胞へとリプログラムする、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
それを必要とする対象における心病態を処置する方法であって、項目５７に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶビリオンが心組織を形質導入する、方法。
（項目６４）
前記ｒＡＡＶビリオンが心外膜注射によって投与される、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記ｒＡＡＶビリオンが、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、心臓内注射、心臓内カテーテル挿入、直接心筋内注射、経血管投与、順行性冠動脈内注射、逆行性注射、経心内膜心筋注射、または再循環送達を伴う分子心臓手術（ＭＣＡＲＤ）によって投与される、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
標的細胞において形質導入効率の増加をｒＡＡＶビリオンに付与するＡＡＶカプシドタンパク質を同定する方法であって：
ａ）ｒＡＡＶビリオンの集団を提供するステップであって、そのｒＡＡＶゲノムが、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードするｃａｐポリヌクレオチドのライブラリーを含む、ステップ；
ｂ）前記ｒＡＡＶビリオンによる標的細胞への前記ｃａｐポリヌクレオチドの形質導入を可能にするために十分な期間、前記集団に前記標的細胞を接触させるステップ；および
ｃ）前記標的細胞から前記ｃａｐポリヌクレオチドをシーケンシングし、それによって前記標的細胞において形質導入効率の増加をもたらすＡＡＶカプシドタンパク質を同定するステップ
を含む、方法。
（項目６７）
ステップ（ｂ）の前に、ｒＡＡＶビリオンの前記集団に、非標的細胞への前記ｒＡＡＶビリオンの結合を可能にするために十分な期間、前記非標的細胞を接触させることによって、前記集団を枯渇させるステップをさらに含む、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記バリアントＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ５カプシドタンパク質である、項目６６または項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記バリアントカプシドタンパク質が各々個々に、親配列のＧＨループにおける挿入部位に前記親配列に対して５～１１アミノ酸の挿入を含む、項目６６から６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記挿入部位が、配列番号１の５６０～５９４に対応する前記親配列における位置での任意の２つの、必要に応じて隣接するアミノ酸の間である、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記挿入部位が配列番号１の５７４および５７５に対応する前記親配列における隣接するアミノ酸の間である、項目６９に記載の方法。
（項目７２）
前記挿入が以下の式：
－Ｘ ０ －Ｘ １ －Ｘ ２ －Ｘ ３ －Ｘ ４ －Ｘ ５ －Ｘ ６ －Ｘ ７ －Ｘ ８ －
（式中、Ｘ ０ およびＸ ８ が各々独立して、Ａ、Ｓ、Ｇであるか、または存在しない）（配列番号１１０２）
のペプチドである、項目６９から７１のいずれか一項に記載の方法。

Claims (15)

  1. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって：
    ａ）配列番号１を含む親ＡＡＶ５カプシドと比較して、（ｉ）Ｔ５８２Ａ、または（ｉｉ）Ｔ５８２ＡおよびＳ６５１Ａから選択される１つまたは複数の置換のみを含むＡＡＶ５カプシドタンパク質；および
    ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸
    を含む、ｒＡＡＶビリオン。
  2. 前記ＡＡＶ５カプシドタンパク質が、配列番号７３を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
  3. 配列番号１を含む親ＡＡＶ５カプシドと比較して、（ｉ）Ｔ５８２Ａ、または（ｉｉ）Ｔ５８２ＡおよびＳ６５１Ａから選択される１つまたは複数の置換のみを含む、ＡＡＶ５カプシドタンパク質。
  4. 配列番号７３を含む、請求項３に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質。
  5. 請求項３または４に記載のＡＡＶ５カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  6. 請求項１または２に記載のｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物。
  7. 心臓細胞に形質導入するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、前記心臓細胞に、請求項１または２に記載のｒＡＡＶビリオンを接触させるステップを含み、前記ｒＡＡＶビリオンが前記心臓細胞に形質導入する、方法。
  8. １つまたは複数の遺伝子産物を心臓細胞に送達するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、前記心臓細胞に、請求項１または２に記載のｒＡＡＶビリオンを接触させるステップを含み、前記心臓細胞が前記遺伝子産物を発現する、方法。
  9. 前記遺伝子産物が、心トロポニンＴ；心サルコメアタンパク質；β－ミオシン重鎖；心室ミオシン必須軽鎖１；心室ミオシン調節軽鎖２；心α－アクチン；ａ－トロポミオシン；心トロポニンＩ；心ミオシン結合タンパク質Ｃ；ｆｏｕｒ－ａｎｄ－ａ－ｈａｌｆ ＬＩＭタンパク質１；チチン；５’－ＡＭＰ－活性化タンパク質キナーゼサブユニットガンマ－２；トロポニンＩ ３型、ミオシン軽鎖２、アクチンアルファ心筋１；心ＬＩＭタンパク質；カベオリン３（ＣＡＶ３）；ガラクトシダーゼアルファ（ＧＬＡ）；リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２）；ミトコンドリア転移ＲＮＡグリシン（ＭＴＴＧ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡイソロイシン（ＭＴＴＩ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡリシン（ＭＴＴＫ）；ミトコンドリア転移ＲＮＡグルタミン（ＭＴＴＱ）；ミオシン軽鎖３（ＭＹＬ３）；トロポニンＣ（ＴＮＮＣ１）；トランスサイレチン（ＴＴＲ）；筋小胞体カルシウム－ＡＴＰアーゼ２ａ（ＳＥＲＣＡ２ａ）；間質由来因子－１（ＳＤＦ－１）；アデニレートシクラーゼ－６（ＡＣ６）；β－ＡＲＫｃｔ（βアドレナリン受容体キナーゼＣ末端）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；肝細胞成長因子；低酸素誘導成長因子；チモシンベータ４（ＴＭＳＢ４Ｘ）；一酸化窒素シンターゼ－３（ＮＯＳ３）；アポリポタンパク質－Ｅ（ＡｐｏＥ）；およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；Ｓ１００Ａ１から選択されるポリペプチドを含む、請求項７または請求項８に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。
  10. 前記遺伝子産物が、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＡＵＲＫＢ、ＯＣＴ４、ＢＡＦ６０Ｃ、ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ２、ＩＲＸ４、ＩＳＬＬ、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＮＫＸ２．５、ＳＲＦ、ＴＢＸ２０、およびＺＦＰＭ２から選択される１つまたは複数のリプログラミング因子を含む、請求項７または請求項８に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。
  11. 前記心臓細胞を心臓の心筋細胞へとリプログラムする、請求項１０に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。
  12. それを必要とする対象における心病態を処置するための医薬の製造における、請求項６に記載の医薬組成物の使用であって、前記処置は、前記医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶビリオンが心組織に形質導入する、使用。
  13. 前記ｒＡＡＶビリオンが心外膜注射によって投与されることを特徴とする、請求項１２に記載の使用。
  14. 前記ｒＡＡＶビリオンが、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、心臓内注射、心臓内カテーテル挿入、直接心筋内注射、経血管投与、順行性冠動脈内注射、逆行性注射、経心内膜心筋注射、または再循環送達を伴う分子心臓手術（ＭＣＡＲＤ）によって投与されることを特徴とする、請求項１２に記載の使用。
  15. それを必要とする対象における心病態を処置するための請求項６に記載の医薬組成物であって、前記ｒＡＡＶビリオンが心組織に形質導入する、医薬組成物。
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