ES2366950T3 - Sistemas de expresión de péptidos nell y actividad de formación ósea de péptidos nell. - Google Patents

Abstract

Un método para expresar in vitro un péptido funcional en una célula de insecto, comprendiendo dicho método: a. proporcionar una construcción de ácido nucleico que incluya al menos un ácido nucleico que codifique al menos un péptido NELL1 en fase de lectura con un ácido nucleico que codifique un péptido de señal de secreción de insecto que sea un péptido de señal de secreción procedente de una proteína de abeja secretada, que sea una secuencia de señal de melitina; b. transfectar una célula de insecto con dicha construcción de ácido nucleico y c. cultivar dicha célula de insecto en condiciones que permitan la expresión del péptido NELL1.

Description

Campo de la invención

La invención se refiere en líneas generales a un factor de crecimiento óseo y más particularmente a composiciones que incluyen NELL1, a productos de preparación que incluyen NELL1 y a métodos del uso de NELL1 para inducir la formación ósea. La presente invención también proporciona métodos para la expresión y purificación de péptidos NELL1 y NELL2.

Antecededentes de la invención

Los factores de crecimiento son sustancias, tales como péptidos, que influyen en el crecimiento y diferenciación de poblaciones de células definidas in vivo o in vitro. El documento WO 03/006483 describe la identificación de secuencias de aminoácidos de una forma de empalme de una proteína humana secretada que está relacionada con la subfamilia del factor de crecimiento epidérmico, así como variantes alélicas y otros ortólogos mamíferos de las mismas.

La formación ósea se produce durante el desarrollo de los huesos largos (formación ósea endocondral) y de los huesos planos (formación ósea intramembranosa). Adicionalmente, la formación ósea se produce durante la remodelación ósea que se produce de manera continua en la vida del adulto para mantener la integridad del esqueleto. Finalmente, la formación ósea se produce durante la reparación ósea, tal como cuando se producen lesiones óseas, por ejemplo, en una fractura o situación quirúrgica. Por otro lado, se piensa que los mecanismos de formación ósea individuales están implicados en el desarrollo embriológico de los huesos largos y planos y se piensa que la reparación está implicada en la formación ósea intramembranosa.

La formación ósea mediante cualquier mecanismo implica la actividad de osteoblastos, regulados por factores de crecimiento. Los osteoblastos derivan de un conjunto de células estromales medulares (conocidas también como células madre mesenquimales; MSC). Estas células están presentes en diversos tejidos y son frecuentes en el estroma medular. Las MSC son pluripotentes y pueden diferenciarse en una diversidad de tipos celulares que incluyen osteoblastos, condrocitos, fibroblastos, miocitos y adipocitos. Se piensa que los factores de crecimiento influyen en la proliferación celular osteogénica, diferenciación y mineralización de osteoblastos, cada una de las cuales influye en la formación ósea.

El hueso autógeno se ha usado, por ejemplo, tal como para la reparación ósea en pacientes con craneosinostosis e injerto leporino. La craneosinostosis (CS), el cierre prematuro de las suturas craneales, afecta a 1 de cada 3.000 recién nacidos y por lo tanto es una de las deformidades craneofaciales congénitas humana más comunes. El cierre prematuro de suturas produce dimorfismo craneal, lo que puede precisar corrección quirúrgica. El cierre prematuro de suturas en seres humanos con CS puede producirse mediante dos procesos posiblemente diferenciados: crecimiento excesivo de la calota craneal y fusión ósea. Recientemente, el FGF2 y el FGFR1 se han implicado en la fusión prematura de suturas craneales mediante rutas mediadas por el CBFA1 (8). La mutación de sentido erróneo del CBFA1 está asociada a displasia cleidocraneal, manifestada como cierre de sutura tardío.

Los procedimientos de injerto óseo autólogo se han realizado usando hueso autógeno, tal como procedente de la cresta iliaca o de la calota. Estos sitios donantes no están exentos de morbilidad asociada, que incluye dolor, molestias al caminar y parestesia en muslo, en caso de sitios donantes de cresta ilíaca e infección, déficits neurológicos y hematomas en caso de injertos de calota. Además, los sitios donantes pueden tener un volumen limitado y pueden contribuir a aumentar el tiempo de cirugía y la hospitalización.

También se han usado materiales de injerto aloplástico y se han ensayado factores de crecimiento en modelos animales. Por ejemplo, el bFGF ha mostrado potencial para su uso en regeneración y reparación ósea. Otra familia de factores de crecimiento osteogénico se ha descrito como proteína morfogénica ósea (BMP). Específicamente, se ha demostrado que la proteína BMP-2 recombinante regenera defectos de continuidad mandibular y defectos de paladar leporino con similares resultados o mejores a los del hueso autógeno particulado y médula ósea. Las BMP y otros factores osteogénicos se han estudiado para su uso en aplicaciones clínicas. Sin embargo, el coste del uso de dosificaciones mínimamente eficaces de las BMP ha sido un factor limitante en el uso clínico.

La fusión vertebral es una técnica quirúrgica en la que una o más de las vértebras de la médula espinal se unen entre sí de manera que entre ellas ya no se produce movimiento. Las recomendaciones incluyen: tratamiento de una vértebra fracturada (rota), corrección de deformidad, eliminación de dolor procedente del movimiento, tratamiento de inestabilidad y tratamiento de determinadas hernias discales cervicales. La cirugía puede implicar la colocación de un injerto óseo entre las vértebras para obtener una unión sólida entre ellas. El procedimiento también puede implicar tratamientos complementarios que incluyan la colocación de placas, tornillos, armaduras y recientemente la proteína morfogénica ósea 2 y 7 para ayudar a la estabilización y cicatrización del injerto óseo. El método clínicamente preferido ha sido el injerto óseo autógeno y sin embargo tiene aproximadamente una tasa de fracaso del 30-50%. El injerto óseo autógeno es una cirugía individual que también conduce a morbilidad significativa.

En el documento WO 03/006483 se ilustra un sistema de expresión de un péptido NELL. En Tessier D. C., y col., Gene, 98 (2): 177-183 (1991); LI, Y. y col., Virology, 204 (1): 266-278 (1994 ); y Sarkar M. y col., Glycoconjugate J, 15 (2): 193-197 (1998), se ilustra un sistema de producción de la proteína NELL no relevante usando una célula de insecto y un péptido de señal de secreción de insecto. Otra información relevante se documenta en WO 01/24821, Elkins, D.A., Rosi, J. Base de datos EMBL acceso Nº Q61220 (1997), Watanabe, T.K., y col., Genomics Academic Press, San Diego, 38 (3): 273-276 (1996), y Kuroda, S. y col., Biochemical and Biophysical Research Communications, 265 (3): 752-757 (1999).

Por lo tanto, se desean composiciones y métodos inocuos, eficaces y asequibles para inducir la formación ósea en el desarrollo óseo, trastornos o traumatismos óseos.

Sumario de la invención

La presente invención puede proporcionar métodos para la expresión y purificación de péptidos NELL1 y NELL2. En una realización, el método incluye péptidos NELL, construcciones de ácido nucleico que expresan péptidos NELL y células que expresan péptidos NELL que pueden ser útiles en la producción de cantidades de péptidos NELL. En una realización, las construcciones de ácido nucleico que expresan péptidos NELL pueden incluir adicionalmente secuencias de ácido nucleico que codifican péptidos de señal que pueden facilitar el tránsito de proteínas y la modificación post producción de los péptidos NELL en la célula hospedadora. En una realización, el péptido de señal puede facilitar la secreción del péptido a partir de la célula hospedadora. Por lo tanto, la presente invención es ventajosa al menos proporcionando cantidades de péptidos NELL funcionales que pueden purificarse para uso clínico o en investigación.

La invención puede incluir composiciones y sustratos que incluyan péptidos NELL. En algunas realizaciones, una composición puede incluir NELL1 y puede incluir agentes adicionales que pueden efectuar la aplicación, estabilidad, actividad, difusión y/o concentración del péptido con respecto al sitio de aplicación, por ejemplo. En algunas realizaciones, un sustrato puede incluir células y/o péptidos NELL1 que puede facilitar la reparación ósea en las proximidades del implante.

La invención puede incluir métodos para inducir diferenciación osteogénica, mineralización osteoblástica y/o formación ósea en una diversidad de aplicaciones clínicas.

La presente invención es ventajosa al menos en que los péptidos NELL pueden proporcionar un mayor efecto al de los factores de crecimiento conocidos o pueden potenciar la actividad de otros factores de crecimiento. Por lo tanto, pueden usarse dosis inferiores de cada factor de crecimiento para aplicaciones clínicas. Esto es significativo al menos ya que los tratamientos clínicos pueden ser más asequibles. Adicionalmente la presente invención es ventajosa al menos ya que NELL1 potencia la diferenciación osteogénica, la mineralización osteoblástica y la formación ósea, lo que puede mejorar la tasa clínica y la eficacia del tratamiento solo con la BMP.

Definiciones

En este documento, los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” pueden usarse indistintamente para referirse a un polímero de restos aminoacídicos. Los términos pueden aplicarse a polímeros aminoacídicos, en los que uno o más restos aminoacídicos es un análogo químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros aminoacídicos de origen natural.

Las expresiones “ADNc de NELL1” puede referirse a las SEC ID Nº: 1, 3 y 5 (Figs. 1, 3 y 5 respectivamente), y “ADNc de NELL2” puede referirse a las SEC ID Nº: 7, 9, 11 y 13 (Figs. 7, 9, 11 y 13).

Un péptido NELL1 es una proteína que puede expresar el gen o el ADNc de NELL1 e incluye las SEC ID Nº: 2, 4 y 6 (Figs. 2, 4 y 16, respectivamente). El péptido NELL1 puede incluir un fragmento peptídico NELL1 que conserva la capacidad de inducir la diferenciación celular osteogénica, la diferenciación de osteoblastos o la formación ósea. El péptido NELL2 es una proteína que puede expresar el gen o el ADNc de NELL2 e incluye las SEC ID Nº: 8, 10, 12 y 14 (Figs. 8, 10, 12 y 14, respectivamente). El péptido NELL2 puede incluir fragmentos peptídicos NELL2 que conservan actividad similar a la de la secuencia peptídica NELL2 completa.

El término “anticuerpo” pueden incluir diversas formas de anticuerpos modificados o cambiados, tal como una inmunoglobulina intacta, un fragmento Fv que solo contiene las regiones variables de cadena ligera y pesada, un fragmento Fv unido por un enlace disulfuro, un fragmento Fab o (Fab)’2 que contiene las regiones y partes variables de las regiones constantes, un anticuerpo monocatenario y similar. Un anticuerpo puede incluir moléculas intactas así como fragmentos de las mismas, tales como, Fab y F(ab’)2' y/o anticuerpos monocatenarios (por ejemplo scFv) que pueden unirse a un determinante epitópico. Un anticuerpo puede ser de origen animal (tal como de ratón o de rata) o humano o puede ser quimérico o humanizado. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales (“mAb”), tales como anticuerpos monoclonales con especificidad por un polipéptido codificado por una proteína NELL1 o NELL2.

La expresión “agente de captura” puede referirse a moléculas que se unen específicamente a otras moléculas para formar un complejo de unión tal como anticuerpo-antígeno, lecitincarbohidrato, ácido nucleico-ácido nucleico, biotina- avidina y similares.

La expresión “se une específicamente” puede referirse a una biomolécula (por ejemplo, una proteína, ácido nucleico, anticuerpo, etc.), que hace referencia a una reacción de unión que es determinativa de la biomolécula de presencia en la población de moléculas heterogénea (por ejemplo, proteínas y otros componentes biológicos). Por tanto, en condiciones específicas (por ejemplo, condiciones de inmunoensayo, en el caso de un anticuerpo o condiciones de hibridación rigurosa, en el caso de un ácido nucleico), el ligando o anticuerpo especificado puede unirse a su molécula “diana” particular y puede no unirse en una cantidad significativa a otras moléculas presentes en la muestra.

Las expresiones “ácido nucleico” u “oligonucleótido” pueden referirse al menos a dos nucleótidos unidos covalentemente entre sí. Un ácido nucleico de la presente invención puede ser monocatenario o bicatenario y puede contener enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos, pueden incluirse análogos de ácidos nucleicos que pueden tener estructuras alternativas, que comprenden, por ejemplo, enlaces fosforamida, fosforotioato, fosforoditioato, ometilfosforoamidita y/o estructuras y enlaces de ácido nucleico peptídicos. Los ácidos nucleicos análogos pueden tener estructuras positivas y/o estructuras sin ribosa. Los ácidos nucleicos también pueden incluir uno o más azúcares carbocíclicos. Pueden realizarse modificaciones de las estructuras ribosa-fosfato para facilitar, por ejemplo, la adicción de otros restos tales como etiquetas o para aumentar la estabilidad y la semivida de dichas moléculas en entornos fisiológicos.

La expresión “hibridación específica” puede referirse a la unión, formación de dúplex o hibridación de una molécula de ácido nucleico preferencialmente con una secuencia de nucleótidos particular en condiciones rigurosas, incluyendo condiciones en las que una sonda puede hibridarse preferencialmente con su subsecuencia diana y puede hibridarse en un menor grado con otras secuencias.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el ADNc de NELL1 humano (SEC ID Nº: 1).

La Figura 2 es una secuencia de aminoácidos que codifica NELL1 humano (SEC ID Nº: 2).

La Figura 3 es una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el ADNc de NELL1 de rata (SEC ID Nº: 3).

La Figura 4 es una secuencia de aminoácidos que codifica NELL1 de rata (SEC ID Nº: 4).

La Figura 5 es una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el ADNc de NELL1 de ratón (SEC ID Nº: 5).

La Figura 6 es una secuencia de aminoácidos que codifica NELL1 de ratón (SEC ID Nº: 6).

La Figura 7 es una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el ADNc de NELL2 humano (SEC ID Nº: 7).

La Figura 8 es una secuencia de aminoácidos que codifica NELL2 humano (SEC ID Nº: 8).

La Figura 9 es una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el ADNc de NELL2 de rata (SEC ID Nº: 9).

La Figura 10 es una secuencia de aminoácidos que codifica NELL2 de rata (SEC ID Nº: 10).

La Figura 11 es una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el ADNc de NELL2 de ratón (SEC ID Nº: 11).

La Figura 12 es una secuencia de aminoácidos que codifica NELL2 de ratón (SEC ID Nº: 12).

La Figura 13 es una secuencia de ácidos nucleicos que codifica NELL2 de pollo (SEC ID Nº: 13).

La Figura 14 es una secuencia de aminoácidos que codifica NELL2 de pollo (SEC ID Nº: 14).

La Figura 15 es un diagrama de flujo de un método de producción del péptido NELL funcional.

La Figura 16 ilustra una construcción de ácido nucleico FLAG-péptido de señal NELL1. Las secuencias de aminoácidos subrayadas derivan del péptido de señal de melitina. El enlace entre Alanina y Prolina es un supuesto sitio de escisión para la secreción por células High Five. Los restos de RTVLGFG---- derivan de la proteína madura de la proteína NELL1 de rata/ser humano.

La Figura 17 ilustra los productos de expresión extracelular de NELL1-FLAG. La Fig. 17A es un gel SDS-PAGE teñido con CBB de eluado UnoQ que contiene el péptido NELL1 purificado producido procedente de células High Five en medio asérico (Productividad: aprox. medio 3 mg/l); la Figura 19B es una transferencia de Western que usa el anticuerpo anti-FLAG. La Figura 17C es un gel SDS-PAGE teñido con CBB de eluado UnoQ que contiene el péptido NELL1 purificado producido procedente de células COS7 en medio asérico (Productividad: medio < 0,1 mg/l); La Figura 17D es una transferencia de Western que usa el anticuerpo anti-FLAG.

La Figura 18 es una transferencia de Western que ilustra la expresión extracelular del péptido NELL2-FLAG por células de insecto en medio asérico.

La Figura 19 es una transferencia de Western que ilustra la expresión extracelular de los péptidos NELL1 y NELL2FLAG por células High Five en dos tipos de medio asérico (SFM Express Five y ESF921).

La Figura 20 es un gráfico de barras que representa la inducción con fosfatasa alcalina en células fetales de calota de rata expuestas al péptido NELL1 (1ng, 10 ng, 100 ng/ml) y a BMP4 (100 ng/ml).

Las Figuras 21 A-D son fotomicrografías de osteoblastos tratados con NELL1 (A y B 5 ng/ml y C y D 50 ng/ml).

Las Figuras 22 A y B son fotomicrografías de micronódulos MC3T3 NELL1 que forman micromódulos en ausencia de ácido ascórbico; la Figura 22B está teñida para fosfatasa alcalina.

Las Figuras 23 A-C son fotomicrografías que representan mineralización en construcciones adenovirales A) antiNELL1, B) -GAL y C) NELL; las Figuras 23 D y E son gráficos de barras que representan niveles de osteocalcina y osteoponina en cada grupo de células a lo largo del tiempo.

La Figura 24 es una fotomicrografía de un ratón transgénico que sobreexpresa NELL1 teñido para representar la mineralización que demuestra el sobrecrecimiento de la calota.

Las Figuras 25 A y B son fotomicrografías de calota teñida para representar la mineralización en A) ratones transgénicos que sobreexpresan NELL1 y B) crías normales de la misma camada, respectivamente.

La Figura 26 es una transferencia de reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa que representa la expresión del gen NELL1 en células fetales de calota de rata tratadas con A) Cbfa1 o B) control.

Las Figuras 27 A-C son fotografías de tinción de esqueleto del cráneo (superior), clavícula (central) y micro-CT del cráneo de ratones A) de tipo silvestre, B) Cbfa1+/- y C) Cbfa1+/-+ NELL1sobreexpres., respectivamente.

Las Figuras 28 A y B son fotografías de defectos de calota tratados con micro-CT (derecha) y control (izquierda); A) tratados con BMP2 y B) tratados con NELL1.

La Figura 29 es una fotografía de defectos de calota de NELL1 tratados con micro-CT (derecha) y BMP (izquierda).

Las Figuras 30 A y B son fotografías de defectos de paladar de NELL1 tratados con micro-CT (derecha) y control (izquierda).

Las Figuras 31 A y B son fotomicrografías de cartílago teñido con TUNEL en ratones A) NELL1sobreexpres. y B) de tipo silvestre.

La Figura 32 es un diagrama de flujo de un método de tratamiento de un paciente para formar hueso en un sitio seleccionado.

La Figura 33 A es una representación esquemática de una realización de un implante; la Figura 33 B es una representación esquemática de una realización del tratamiento de un paciente para formar hueso en un lugar seleccionado.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a agentes y a métodos para inducir la formación ósea usando NELL1. La presente invención también se refiere a métodos para la expresión y purificación de las proteínas NELL1 y NELL2, de acuerdo con el argumento de las reivindicaciones 1 y 8.

Ting y Watanabe identificaron de manera simultánea NELL1. NELL1 es un péptido de 810 aa, distribuido principalmente en el hueso. En adultos, NELL2 se expresa a niveles elevados en huesos craneofaciales y a niveles inferiores en huesos largos. Se ha examinado su función en la diferenciación de osteoblastos, en la formación y regeneración ósea. Watanabe identificó NELL2 en 1996 y es un péptido de 816 aa, distribuido en las células neuronales y en el cerebro.

El gen NELL1 humano incluye al menos 3 elementos de respuesta Cbfa1 en la región promotora. Cbfa1 se une específicamente a estos elementos de respuesta en el promotor NELL1. La expresión de NELL1 puede estar bajo el control de sus factores de transcripción expresados de forma endógena al menos en preosteoblastos, osteblastos y condrocitos hipertróficos en el desarrollo y en un ser humano adulto. La disostosis cleidocraneal es un defecto en el desarrollo craneal que se piensa que se produce al menos en parte por la alteración del Cbfa.

Para estudiar la función de los péptidos NELL1 y NELL2, se han realizado intentos para producir y purificar el péptido. Desgraciadamente, los péptidos NELL1 y NELL2 no pudieron expresarse en diversos sistemas de expresión. Específicamente, no se detectó expresión en sistemas de expresión en E. coli directo ni en S. cerevisiae, en sistemas de expresión de E. coli fusionados y CHO-dhfr, se produjeron niveles de expresión muy bajos. En el sistema baculovirus, los péptidos se expresaron. La caracterización bioquímica y el análisis de expresión de las proteínas neuronales similares a trombospondina-1 NELL1 y NELL2 se han descrito en el documento S. Kuroda et al. BBRC 265,79-86, 1999.

Sorprendentemente se descubrió en esta invención que los péptidos NELL1 y NELL2 podían expresarse a niveles altos en células de insectos y que los péptidos NELL1 y NELL2 expresados en un sistema de insecto eran formas funcionales de la proteína.

Las células COS7 pueden usarse para producir las proteínas NELL1 y NELL2 a niveles bajos, tal como aproximadamente 10 microgramos por litro de medio, pero necesitan medio que contenga suero para la expresión. Desgraciadamente, este medio no es adecuado para la producción de las proteínas. Así como para los péptidos de señal, los péptidos de señal endógenos NELL1 y NELL2 permiten niveles bajos de expresión del péptido en células COS7.

En una realización, la invención incluye un método para expresar un péptido funcional NELL, tal como el péptido NELL1 o NELL2, usando una línea celular de insecto. En una realización, la célula de insecto puede ser una célula High Five, células Sf9 y otras células Sf.

En una realización, el método puede incluir proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifique un péptido NELL, tal como el péptido NELL1 o NELL2. La secuencia de ácido nucleico puede ser un ADNc o un ADN genómico, que codifique al menos una parte funcional de un péptido NELL. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico puede seleccionarse del grupo que incluye, pero sin limitación, NELL1 humano, (SEC ID Nº: 1), NELL1 de rata (SEC ID Nº: 3), NELL1 de ratón (SEC ID Nº: 5) o NELL2 de ser humano (SEC ID Nº: 7), NELL2 de rata (SEC ID Nº: 9), NELL2 de ratón (SEC ID Nº: 11), NELL2 de pollo (SEC ID Nº: 13). La secuencia de ácido nucleico también puede incluir secuencias tales como aquellas con similitud de secuencia sustancial, tal como secuencias que tengan al menos aproximadamente una similitud de secuencia de 75% con cualquier parte de las secuencias indicadas anteriormente.

Adicionalmente el ácido nucleico puede incluir un vector de expresión para expresar la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido NELL, tal como el péptido NELL1 o NELL2. Por ejemplo, el vector de expresión puede ser pIZT/V%-His (Invitrogen) y los marcadores selectivos pueden también incluir blasticidina y neomicina.

Adicionalmente, la secuencia de ácido nucleico también puede incluir ácidos nucleicos adicionales que codifiquen productos indicadores para controlar niveles de expresión de genes o codificar etiquetas peptídicas que puedan visualizarse usando métodos conocidos en la materia para controlar niveles de expresión peptídica. Pueden seleccionarse secuencias adicionales de manera que no se interfieran con la expresión del ácido nucleico o con la funcionalidad del producto peptídico expresado.

En una realización, el método puede incluir proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifique un péptido NELL, tal como el péptido NELL1 o NELL2, en fase con una secuencia de ácido nucleico que codifique un péptido de señal de secrección. En una realización, el péptido de señal de secrección puede ser un péptido de señal de secrección procedente de una proteína de abeja secretada. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico puede seleccionarse de una secuencia de señal de melitina.

En una realización, el método puede incluir transfectar una línea celular de insecto con una construcción de ácido nucleico que codifique un péptido NELL, y cultivar la línea celular de insecto en condiciones que permitan la expresión y/o secreción del péptido NELL. Por ejemplo, la línea celular puede transfectarse transitoria o establemente con la construcción de ácido nucleico que codifica un péptido NELL.

El método también puede incluir recoger péptidos NELL secretados y/o purificar péptidos NELL para su uso. Los productos peptídicos pueden ensayarse para determinar su actividad en una diversidad de ensayos funcionales o de expresión. Por ejemplo, en cualquier ensayo, si un péptido NELL tiene un efecto significativo sobre una sustancia de control en un parámetro determinado, puede decirse que los péptidos NELL son funcionales para efectuar el parámetro medido.

En una realización, la invención puede incluir una construcción de ácido nucleico para expresar un péptido NELL, tal como el péptido NELL1 y/o NELL2 en una célula de insecto. La secuencia de ácido nucleico puede ser un ADNc o un ADN genómico, que codifica al menos una parte funcional de un péptido NELL. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico puede seleccionarse del grupo que incluye, pero sin limitación, NELL1 de ser humano (SEC ID Nº: 1), NELL1 de rata (SEC ID Nº: 3), NELL1 de ratón (SEC ID Nº: 5) o NELL2 de ser humano (SEC ID Nº: 7), NELL2 de rata (SEC ID Nº: 9), NELL2 de ratón (SEC ID Nº: 11), NELL2 de pollo (SEC ID Nº: 13). La secuencia de ácido nucleico también puede incluir secuencias tales como aquellas con similitud sustancial, de manera que las secuencias tengan al menos aproximadamente una similitud de secuencia del 75% con cualquier parte de las secuencias indicadas anteriormente.

La construcción de ácido nucleico puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifique un péptido de señal. El ácido nucleico puede incluir un vector de expresión para expresar la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido NELL. Adicionalmente, la secuencia de ácido nucleico puede incluir ácidos nucleicos adicionales que codifiquen productos indicadores para controlar niveles de expresión de genes o que codifiquen etiquetas peptídicas que puedan visualizarse usando métodos conocidos en la materia para controlar niveles de expresión peptídica.

Las construcciones de ácidos nucleicos pueden comprender vectores de expresión y de clonación que deban contener un gen de selección, denominado también marcador seleccionable, tal como un gen que codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de una célula hospedadora transformada con el vector. La presencia de este gen garantiza que cualquier célula hospedadora que suprima el vector no obtendrá ninguna ventaja sobre el crecimiento o reproducción de huéspedes sobre transformados. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos o a otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas.

Las construcciones de ácido nucleico también pueden incluir un promotor que reconoce el organismo hospedador y que está unido operativamente al ácido nucleico que codifica NELL. Los promotores son secuencias no traducidas localizadas aguas arriba desde el codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1.000 pb) que controlan la transcripción y la traducción del ácido nucleico bajo su control, incluyendo promotores inducibles y constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician niveles de transcripción aumentados a partir del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura. Actualmente se conocen bien diversos promotores reconocidos por una diversidad de posibles células hospedadores.

Un ácido nucleico puede estar unido operativamente cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder de secrección está unido operativamente al ADN para un polipéptido si este se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si este influye en la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está colocado de manera que se facilite la traducción.

En una realización, la invención puede incluir células que expresen péptidos NELL funcionales. En una realización, la célula puede ser una célula de insecto. En una realización la célula de insecto puede ser una célula high five.

En una realización, la célula puede transfectarse con una construcción de ácido nucleico que codifique un péptido NELL. Por ejemplo, la línea celular puede transfectarse transitoria o establemente con la construcción de ácido nucleico que codifica un péptido NELL. En una realización, los ácidos nucleicos que expresan NELL (por ejemplo, ADNc (o los ADNC)) pueden clonarse en el vector de expresión de genes o partículas virales que son competentes con células transfectadas (tales como células de insecto).

La secuencia de ácido nucleico también puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifique un péptido NELL, tal como el péptido NELL1 o NELL2, en fase con una secuencia de ácido nucleico que codifique un péptido de señal de secrección de insecto.

En una realización, la invención puede incluir células que expresen péptidos NELL funcionales y puedan secretar proteínas funcionales.

En una realización, la invención puede incluir un polipéptido (secuencia de aminoácidos) que comprenda un péptido NELL, tal como el péptido NELL1 o NELL2 y pueda incluir el péptido de señal de secrección.

Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del péptido NELL puede seleccionarse del grupo que incluye, pero sin limitación, NELL1 de ser humano (SEC ID Nº: 2), NELL1 de rata (SEC ID Nº: 4), NELL1 de ratón (SEC ID Nº: 6) o NELL2 de ser humano (SEC ID Nº: 8), NELL2 de rata (SEC ID Nº: 10), NELL2 de ratón (SEC ID Nº: 12), NELL2 de pollo (SEC ID Nº: 14). La secuencia de ácido nucleico también puede incluir secuencias tales como aquellas con similitud de secuencia sustancial, tales como las secuencias que tienen al menos aproximadamente una similitud de secuencia de 75% con cualquier parte de las secuencias indicadas anteriormente o contener dominios de unión activos similares a los péptidos NELL1.

En una realización, la invención incluye un método que purifica péptidos NELL1 y/o NELL2 secretados en el medio de cultivo, de acuerdo con protocolos de purificación de péptidos convencionales, que incluyen, pero sin limitación, los descritos más adelante.

En una realización, puede examinarse si una célula seleccionada expresa una secuencia de ácido nucleico seleccionada para expresar y/o secretar un péptido NELL. En una realización, puede examinarse la presencia, cantidad y/o actividad de péptidos NELL..

En una realización, se detectan y se cuantifican péptidos NELL mediante cualquiera de diversos métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Estos pueden incluir métodos bioquímicos analíticos tales como electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía por hiperdifusión y similar o diversos métodos inmunológicos tales como reacciones con precipitina líquida o en gel, inmunodifusión (sencilla o doble), inmunoelectroforesis, radioinmunoensayo (RIA), ensayos de inmunoabsorbencia asociados a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes, transferencias de Western y similares.

En una realización, puede usarse el análisis de transferencia de Western (inmunotransferencia) para detectar y cuantificar la presencia del péptido (o péptidos) NELL en una muestra seleccionada. Esta técnica puede incluir separar las proteínas de la muestra mediante electroforesis en gel, en base al peso molecular, transferir las proteínas separadas a un soporte sólido adecuado (tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nylon o un filtro de nylon derivatizado) e incubar la muestra con los anticuerpos que se unen específicamente a un péptido diana.

Los ensayos de esta invención pueden puntuarse (como positivos o negativos o cantidad de polipéptido diana) de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos por los expertos en la materia. El método de puntuación particular puede depender del formato de ensayo y de la elección de la etiqueta. Por ejemplo, un ensayo de transferencia de Western puede puntuarse visualizando el producto teñido producido por una etiqueta enzimática. Una banda o mancha teñida, claramente visible, en el peso molecular correcto puede puntuarse como un resultado positivo, mientras que la ausencia, claramente inexistente, de una mancha o banda puede puntuarse como un resultado negativo. La intensidad de la banda o de la mancha puede proporcionar una medida cuantitativa de la concentración del polipéptido diana.

Las proteínas NELL1 generadas en dichos sistemas de expresión pueden usarse de una manera análoga para el uso de proteínas morfogénicas óseas (por ejemplo MBP-1 a MBP-24). Por tanto, el polipéptido (o polipéptidos) NELL1 puede usarse para acelerar la reparación de fracturas óseas o para inducir la reparación o sustitución ósea en circunstancias en las que la cicatrización natural está limitada o es inexistente. Además, los polipéptidos NELL1 pueden incorporarse en materiales de injerto óseo. Estos materiales de injerto pueden usarse en el tratamiento de fracturas o para facilitar la sustitución/cicatrización de trasplantes de prótesis o de hueso y fusión vertebral.

La presente solicitud también puede incluir agentes y métodos para aumentar el grado y/o tasa de formación ósea. Más específicamente, la invención puede incluir la aplicación sistémica y/o local de agentes para aumentar la formación ósea. Los síntomas clínicos de un método o agentes capaces de aumentar el grado y/o tasa de formación ósea se manifiestan por mejoras en la densidad ósea en el lugar de formación ósea deseado como se evalúa por escáner DEXA. La formación ósea potenciada en una cicatrización de fractura se evalúa de manera rutinaria por rayos X regulares en el lugar de la fractura a intervalos de tiempo seleccionados. Para determinar los síntomas anteriores pueden usarse técnicas más avanzadas, tales como escáner CT cuantitativo.

En una realización, la aplicación puede incluir un método para aumentar la diferenciación celular osteogénica que comprende aumentar la concentración de un producto génico NELL1 en una célula osteogénica, aplicando opcionalmente un segundo agente e induciendo la expresión de marcadores celulares de diferenciación osteoblástica.

El método puede incluir aumentar la concentración de un producto génico NELL1 aplicando un péptido NELL1 a una célula osteogénica y el péptido NELL1 puede seleccionarse del grupo que comprende: la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4

o la SEC ID Nº: 6 o cualquier parte del péptido NELL que sea eficaz aumentando la diferenciación osteoblástica. El método puede incluir aumentar la concentración de un producto génico NELL1 induciendo la expresión de un gen NELL1 endógeno, tal como aumentando niveles celulares de la molécula reguladora de la expresión, Cbfa1. El método puede incluir aumentar la concentración de un producto génico NELL1 por transfección de la célula osteogénica con una construcción de ácido nucleico que codifica un péptido NELL1 y la construcción de ácido nucleico que codifica un péptido NELL1 puede seleccionarse del grupo que comprende la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3 o la SEC ID Nº: 5.

Las células osteogénicas pueden incluir, pero sin limitación, osteoblastos, células mesenquimales, fibroblastos, células embriónicas fetales, células madre, células de la médula ósea, células de la duramadre, condrocitos, condroblastos y células madre adiposas.

Las células osteogénicas también pueden incluir células que se localizan en, están en contacto con, o migran hacia (es decir “se dirigen a”), el tejido óseo y cuyas células estimulan directa o indirectamente la formación de tejido óseo. Como tal, las células osteogénicas pueden ser células que ellas mismas se diferencian finalmente en células osteoblásticas maduras, es decir, células que “directamente” forman tejido óseo.

Un segundo agente puede incluir, pero sin limitación: TGF-, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, colágeno. El segundo agente puede seleccionarse para tener un efecto complementario o sinérgico con NELL1 induciendo la diferenciación osteoblástica.

Los marcadores celulares de diferenciación osteoblástica incluyen, pero sin limitación, niveles aumentados de actividad de fosfatasa alcalina, la expresión de ARNm de osteocalcina y osteoponina, expresión de BMP7, expresión de decorina y expresión de laminina B1. Sin embargo, como marcador de este tipo, puede usarse cualquier marcador celular cuya actividad o expresión cambie como resultado de diferenciación osteoblástica.

En una realización, el método para aumentar la mineralización osteoblástica puede incluir aumentar la concentración de un producto génico NELL1 en una célula osteoblástica, opcionalmente aplicando un segundo agente; e induciendo la expresión de marcadores celulares de mineralización.

El método puede incluir aumentar la concentración de un producto génico NELL1 aplicando un péptido NELL1 a una célula osteogénica, y el péptido NELL1 puede seleccionarse del grupo que comprende: la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6 o cualquier parte del péptido NELL que sea eficaz aumentando la mineralización osteoblástica. El segundo agente puede seleccionarse para tener un efecto complementario o sinérgico con NELL1 induciendo la mineralización osteoblástica.

Los marcadores celulares de mineralización osteoblástica incluyen, pero sin limitación, niveles aumentados de incorporación de calcio. Sin embargo, como marcador de este tipo, puede usarse cualquier marcador celular cuya actividad o expresión cambie como resultado de mineralización osteoblástica.

En una realización, un método para aumentar la formación ósea intermembranosa puede incluir aumentar la concentración de un producto génico NELL1 en un lugar en el que se desea la formación ósea, aplicando opcionalmente un segundo agente aproximadamente en la misma zona en la que se desea la formación ósea; e inducir la formación de formación ósea intermembranosa.

El método puede incluir aumentar la concentración de un producto génico NELL1 aplicando un péptido NELL1 en la zona en la que se desea la formación ósea y el péptido NELL1 puede seleccionarse en el grupo que comprende: la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6 o cualquier parte del péptido NELL que sea eficaz aumentando la formación ósea intermembranosa.

El segundo agente puede incluir, pero sin limitación, TGF-, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, colágeno, células osteogénicas, hueso, matriz ósea, matriz de tendón, matriz de ligamento. El segundo agente puede seleccionarse para tener efecto complementario o sinérgico con NELL1 induciendo la formación ósea intermembranosa.

La formación ósea intermembranosa puede evaluarse por visualización con microscopio para determinar su histología, escáner DEXA, rayos X o escáner CT de densidad ósea en la zona en la que se desea la formación ósea.

En una realización, un método para aumentar la formación ósea endocondral puede incluir aumentar la concentración de un producto génico NELL1 en una región en el que se desea la formación ósea; aplicando opcionalmente un segundo agente en la región en la que se desea la formación ósea y al menos induciendo hipertrofia de condroblastos en la región en la que se desea la formación ósea.

El método puede incluir aumentar la concentración de un producto génico NELL1 aplicando un péptido NELL1 en la zona en la que se desea la formación ósea y el péptido NELL1 puede seleccionarse del grupo que comprende: la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6 o cualquier parte del péptido NELL que sea eficaz aumentando la formación ósea endocondral.

El segundo agente puede incluir, pero sin limitación, TGF-, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, colágeno, células osteogénicas, hueso, matriz ósea, matriz de tendón, matriz de ligamento. El segundo agente puede seleccionarse para tener efecto complementario o sinérgico con NELL1 induciendo la formación ósea endocondral.

La formación ósea endocondral puede evaluarse por hipertrofia condroblástica observada por un aumento de hipertrofia y condroblastos apoptóticos, visualizado mediante tinción TUNEL.

En una realización, la aplicación puede incluir un método de incorporación de NELL1 en vehículos o sustratos y en los sustratos resultantes.

En una realización, una composición para inducir la formación ósea puede incluir una cantidad eficaz de un primer agente para inducir la formación ósea, seleccionado del grupo que incluye, pero sin limitación, un péptido NELL1 y un agente que modifica la expresión del péptido NELL1 o un agente que modifica la actividad de un péptido NELL1 y opcionalmente un vehículo.

La composición puede incluir un péptido NELL1 seleccionado del grupo que comprende: la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6 o cualquier fragmento que sea eficaz induciendo la formación ósea.

La composición puede incluir un segundo agente que incluya, pero sin limitación, TGF-, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, colágeno, hueso, matriz ósea, matriz de tendón o matriz de ligamento, células osteogénicas y/u osteoblásticas.

En una realización, el vehículo puede ser biodegradable, tal como degradable por mecanismos enzimáticos o hidrolíticos. Los ejemplos de vehículos incluyen, pero sin limitación, polímeros sintéticos absorbibles, tales como pero sin limitación, poli (-hidroxi ácidos) tales como poli(L-lactida) (PLLA), poli(D, L-lactida) (PDLLA), poliglicolida (PGA), poli(lactida-co-glicolida (PLGA), poli(-caprolactona), poli(trimetilen carbonato), poli(p-dioxanona), poli (caprolactona-co-glicolida), poli(glicolida-co-trimetilen carbonato), poli(D,L-lactida-co-tiimetilen carbonato), poliarilatos, polihidroxibutirato (PHB), polianhídridas, poli(anhídrida-co-imida), propileno-co-fumaratos, polilactonas, poliésteres, policarbonatos, polímeros polianiónicos, polianhídridas, poliesteramidas, poli(aminoácidos), homopolipéptidos, poli(fosfacenos), poli(glaxanona), polisacáridos y poli(ortoésteres), poliglactina, ácido poligláctico, ácido polialdónico, ácidos poliacrílicos, polialcanoatos; copolímeros y mezclas de los mismos y cualquier derivado y modificaciones. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 4.563.489 y la solicitud internacional PCT Nº WO/03024316. Otros ejemplos de vehículos incluyen polímeros celulósicos tales como, pero sin limitación, alquilcelulosa, hidroxialquilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa y sus sales catiónicas. Otros ejemplos de vehículos incluyen biocerámicas sintéticas y naturales tales como, pero sin limitación, carbonatos de calcio, fosfatos de calcio, apatitas, materiales vítreos bioactivos y apatitas derivadas de coral. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos 2002187104; la solicitud internacional PCT WO/9731661 y la solicitud internacional PCT WO/0071083.

En una realización, el vehículo puede revestirse adicionalmente por composiciones, que incluyen vidrios biológicos y/ o apatitas que derivan de técnicas sol-gel o de técnicas de inmersión, tales como, pero sin limitación, fluidos corporales simulados con concentraciones de calcio y fosfato que varían de aproximadamente de 1,5 a 7 veces la concentración de suero natural y ajustados por diversos medios a soluciones con intervalo de pH de aproximadamente 2,8-7,8 a una temperatura de aproximadamente 15-65 grados C. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nº 6.426.114 y 6.013.591 y la solicitud internacional PCT WO/9117965.

Otros ejemplos de vehículos incluyen, colágeno (por ejemplo, esponjas de colágeno Collastat, Helistat), hialuronano, fibrina, quitosano, alginato y gelatina. Véanse, por ejemplo, las solicitudes internaciones PCT WO/9505846; WO/02085422.

En una realización, el vehículo puede incluir agentes de unión a heparina; que incluyen pero sin limitación polímeros de tipo heparina por ejemplo de sulfato de dextrano, sulfato de condroitina, sulfato de heparina, fucano, alginato o sus derivados; y fragmentos peptídicos con modificaciones de aminoácidos para aumentar la afinidad por la heparina. Véase, por ejemplo, Journal of Biological Chemistry (2003), 278(44), págs. 43229-43235.

En una realización, el sustrato puede estar en forma de un líquido sólido o gel.

En una realización, el sustrato puede incluir un vehículo que esté en forma de un gel fluido. El gel puede seleccionarse para ser inyectable, tal como mediante una jeringa en el lugar en el que se desea la formación ósea. El gel puede ser un gel químico que puede ser un gel químico formado por enlaces primarios y controlados por pH, grupos iónicos y/o concentración de disolvente. El gel también puede ser un gel físico que puede formarse por enlaces secundarios y controlarse por temperatura y viscosidad. Los ejemplos de geles incluyen, pero sin limitación, soluciones y conjugados plurónicos, de gelatina, de hialuronano, de colágeno, de polilactido-polietilenglicol, quitosano, citosano y b-glicerofosfato (gel BST), alginatos, agarosa, hidroxipropil celulosa, metil celulosa, óxido de polietileno, polilactidas/glicólidas en N-metil-2-pirrolidona. Véase por ejemplo, Anatomical Record (2001), 263(4), 342-349.

En una realización, el vehículo puede ser fotopolimerizable, tal como por radiación electromagnética con una longitud de onda de al menos aproximadamente 250 nm. Los ejemplos de polímeros fotopolimerizables incluyen derivados de polietilen (PEG) acrilato, derivados de PEG metacrilato, derivados de propileno fumarato-co-etilenglicol, de alcohol polivinílico, macrómeros de PEG-co-poli(-hidroxi ácido) diacrilato y polisacáridos modificados tales como derivados de ácido hialurónico y metacrilato de dextrano. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos

5.410.016.

En una realización, el sustrato puede incluir un vehículo que sea sensible a temperatura. Los ejemplos incluyen vehículos preparados a partir de N-isopropilacrilamida (NiPAM) o NiPAM modificada con una temperatura de solución crítica inferior (LCST) disminuida y unión peptídica (por ejemplo NELL1) potenciada por incorporación de etil metacrilato y N-acriloxisuccinimida o alquil metacrilatos tales como butilmetacrilato, hexilmetacrilato y dodecilmetacrilato. Solicitud Internacional PCT WO/2001070288; Patente de Estados Unidos 5.124.151.

En una realización, el vehículo puede tener una superficie que posea y/o esté inmovilizada con moléculas de adhesión celular, péptidos de adhesión y análogos peptídicos de adhesión que pueden promover la unión a la matriz celular mediante mecanismos mediados por receptores y/o restos moleculares que pueden promover la adhesión mediante unión por mecanismos mediados por no receptores tales como, pero sin limitación, a péptidos poliaminoácidos policatiónicos (por ejemplo poli-lisina), péptidos poliaminoácidos polianiónicos, moléculas adhesivas de la clase Mefp y otros péptidos ricos en DOPA (por ejemplo poli-lisina-DOPA), polisacáridos y proteoglicanos. Véanse por ejemplo, las solicitudes Int. PCT WO/2004005421; WO/2003008376; WO/9734016.

En una realización, el vehículo puede comprender agentes secuestrantes tales como, pero sin limitación, colágeno, gelatina, ácido hialurónico, alginato, poli(etilenglicol), alquilcelulosa (incluyendo hidroxialquilcelulosa), incluyendo metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropil-metilcelulosa y carboximetilcelulosa, sangre, fibrina, óxido de polioxietileno, hemihidrato de sulfato de calcio, apatitas, polímero carboxivinílico y alcohol poli(vinílico). Véase por ejemplo la patente de Estados Unidos 6.620.406.

En una realización, el vehículo puede incluir tensioactivos para promover la estabilidad y/o la distribución de NELL1 dentro de los materiales vehículo tales como, pero sin limitación, polioxiéster (por ejemplo polisorbato 80, polisorbato 20 o Pluronic F-68).

En una realización, el vehículo puede incluir agentes tamponantes tales como, pero sin limitación glicina, clorhidrato de ácido glutámico, cloruro de sodio, guanidina, heparina, clorhidrato de ácido glutámico, ácido acético, ácido succínico, polisorbato, sulfato de dextrano, sacarosa y aminoácidos. Véase por ejemplo la patente de Estados Unidos 5.385.887.

En una realización, el vehículo puede incluir una combinación de materiales tales como los indicados anteriormente.

A modo de ejemplo, el vehículo puede ser una membrana vehículo de PLGA/colágeno. La membrana puede sumergirse en una solución que incluya el péptido NELL1.

En una realización, un implante para su uso en el cuerpo humano puede incluir un sustrato que incluya NELL1 en una cantidad suficiente para inducir la formación ósea próxima al implante.

En una realización, un implante para su uso en el cuerpo humano puede incluir un sustrato que tiene una superficie que incluye NELL1 en una cantidad suficiente para inducir la formación ósea próxima al implante.

En una realización, un implante para su uso en el cuerpo humano puede incluir un sustrato que tenga una superficie que incluya células osteogénicas y NELL1 en una cantidad suficiente para inducir la formación ósea. En una realización, el implante puede sembrarse con células, incluyendo pero sin limitación, células autólogas, células osteogénicas u osteoblásticas, células que expresan NELL1 u otra molécula osteogénica.

Un implante puede incluir un sustrato formado en una forma de una malla, perno, tornillo, placa o junta prostética. A modo de ejemplo, un sustrato puede estar en forma de un implante dental u ortopédico y NELL1 puede usarse para potenciar la integración en el hueso cerca del implante. Un implante puede incluir un sustrato que sea reabsorbible tal como un sustrato que incluya colágeno.

En un ejemplo, en un comprimido de liberación temporizada, puede incluirse una composición de acuerdo con la presente invención.

El péptido NELL1 puede combinarse con un vehículo aceptable para formar una composición farmacológica. Los vehículos aceptables pueden contener un compuesto fisiológicamente aceptable que actúe, por ejemplo, para estabilizar la composición o para aumentar o disminuir la absorción del agente. Los compuestos fisiológicamente aceptables pueden incluir, por ejemplo, hidratos de carbono tales como glucosa, sacarosa, o dextranos, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o glutatión, agentes quelantes, proteínas de bajo peso molecular, composiciones que reduzcan la eliminación o hidrólisis de los agentes anti-mitóticos o excipientes u otros estabilizantes y/o tampones.

Otros compuestos fisiológicamente aceptables incluyen agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes dispersantes o conservantes que son particularmente útiles para prevenir el crecimiento o la acción de microorganismos. Se conocen bien diversos conservantes e incluyen, por ejemplo, fenol y ácido ascórbico. Un experto en la materia apreciaría que, la elección de un vehículo, incluyendo un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la vía de administración.

Las composiciones pueden administrarse en una diversidad de formas de dosificación unitaria dependiendo del método de administración. Por ejemplo; formas de dosificación unitarias adecuadas pueden incluir polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas.

Las composiciones de la presente invención pueden comprender una solución del péptido NELL1 disuelta en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un vehículo acuoso para péptidos hidrosolubles. Pueden usarse diversos vehículos, por ejemplo, solución salina tamponada y similar. Estas soluciones son estériles y generalmente no poseen material indeseable. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, según sea necesario, para aproximar las condiciones fisiológicas, tales como agentes ajustadores de pH y tamponantes, agentes ajustadores de toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares.

La concentración del péptido NELL1 en esas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionará principalmente en base a volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similar de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y con las necesidades del paciente.

El régimen de dosificación se determinará por la indicación clínica a realizar, así como por diversas variables del paciente (por ejemplo peso, edad, sexo) y presentación clínica (por ejemplo grado de lesión, lugar de lesión, etc.).

Sin embargo, una dosis terapéuticamente eficaz de un péptido NELL1 o agente útil en esta invención es una que tiene un efecto clínico positivo en un paciente o un efecto deseado en células como se mide por la capacidad del agente para potenciar la diferenciación osteoblástica, mineralización, formación ósea, como se ha descrito anteriormente. La dosis terapéuticamente eficaz de cada péptido o agente puede modularse para conseguir el efecto clínico deseado, minimizando al mismo tiempo efectos secundarios negativos. La dosificación del péptido o agente puede seleccionarse para un paciente individual dependiendo de la vía de administración, de la gravedad de la enfermedad, de la edad y peso del paciente, de otras medicaciones que tome el paciente y de otros factores normalmente tenidos en cuenta por el médico tratante, cuando se determina un régimen individual y un nivel de dosis apropiado para un paciente en particular.

Forma de dosificación. La dosis terapéuticamente eficaz de un agente incluido en la forma de dosificación puede seleccionarse considerando el tipo de agente seleccionado y la vía de administración. La forma de dosificación puede incluir un agente en combinación con otros ingredientes inertes, incluyendo adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables para facilitar la dosificación al paciente, como conocen los expertos en la técnica farmacéutica.

En una realización, la aplicación puede incluir un método para tratar un paciente para inducir la formación ósea, que comprende administrar el péptido NELL1 a una dosis terapéuticamente eficaz en una forma de dosificación eficaz a un intervalo seleccionado para potenciar la formación ósea. El método puede comprender adicionalmente administrar al menos un agente secundario en la región en la que se desea la formación ósea, incluyendo, pero sin limitación, TGF-, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, colágeno, hueso, matriz ósea, matriz de tendón o matriz de ligamento, células osteogénicas u osteoblásticas.

En una realización, un método para tratar un paciente para inducir la formación ósea puede incluir recoger células osteogénicas de mamífero, aumentar la concentración de expresión del péptido NELL1 en contacto con las células osteogénicas y administrar las células osteogénicas a una región en la que se desea la formación ósea.

En una realización, puede desearse la formación ósea para reparar traumatismo craneal o defectos craneales, tal como sucede en fetos, recién nacidos o adultos con disostosis cleidocraneal o paladar leporino. En una realización, la formación ósea puede desearse en una región de un defecto óseo no cicatrizante (conocido también como defecto de tamaño crítico en el que el hueso no puede regenerarse/cicatrizarse en el defecto). Los modelos de defecto de tamaño crítico se estudian como un ensayo riguroso sobre el agente que efectúa toda la cicatrización ósea, incluyendo fracturas de huesos largos, ya que se considera que todas las cicatrizaciones de lesiones óseas son por formación de huesos membranosos (denominados también intramembranosos). Por ejemplo, tanto las fracturas de huesos largos como los defectos de calota, cicatrizan por formación ósea membranosa. En una realización, la formación ósea puede desearse en injertos óseos alveolares o aumento de borde alveolar o defecto óseo periodontal. En una realización, la formación ósea puede desearse para potenciar la integración de implantes tales como implantes en articulaciones o dentales o implantes en cirugía cosmética.

En una realización, la formación ósea puede usarse en alternativa o junto con materiales autólogos, autógenos o aloplásticos para injertos óseos.

Ejemplos

Ejemplo 1. Expresión de péptidos NELL.

En el vector de expresión PiZT/V5-His (3,4 kb) (sitio EcoRV, Invitrogen) se ligó un fragmento de ADNc y se incluyó un péptido de señal de melitina, fragmento de ADNc BamHl-EcoRl de NELL1 de rata madura y una secuencia de etiqueta FLAG. La Figura 16 es una representación de la secuencia de ácido nucleico de la construcción de ADNc usada en este ejemplo y correspondiente a la secuencia peptídica prevista.

Se adaptaron células High five (BTI-TN-5B1-4) a medio asérico y se transfectaron con el vector de expresión del péptido NELL1. Las células se trataron con zeocina para seleccionar solamente las poblaciones de células que expresaban las construcciones NELL1 FLAG. Se confirmó que las poblaciones de células supervivientes eran transformantes estables. El medio extracelular se recogió y se ensayó para determinar la presencia del péptido NELL1. El péptido NELL1 se purificó y se usó en ensayos funcionales descritos a continuación.

La Figura 17A es una ilustración de un gel SDS-PAGE teñido con CBB de eluado UnoQ que contiene el péptido NELL1 purificado. El medio se aplicó sobre una columna UnoQ (Bio-Rad) como se describe en el presente documento. La Figura 4 es una ilustración de una transferencia de Western usando anticuerpo anti-FLAG que representa la expresión de NELL1-FLAG en referencia a una escala de proteínas. Péptido: 140 kDa (precursor intracelular), 130 kDa (forma madura; péptido de 90 kDa), 400 kDa (forma secretada, hotrímero). En el ejemplo anterior, la productividad del sistema de expresión era de aproximadamente 3 mg de péptido NELL1/ l de medio.

Con respecto a otros sistemas de expresión que no expresan ni secretan el péptido en modo alguno, (tales como expresión bacteriana, incluyendo levaduras) o cuya producción de péptidos era extremadamente baja (por ejemplo, sistema de péptido fusionado a E. coli, células CHO-dhfr, >10 mcg/l) la producción con los sistemas descritos (células de mamífero e insecto) fue sorprendentemente y de manera sustancial más eficaz produciendo grandes cantidades de proteína funcional.

Expresión y Purificación de la Proteína NELL1 de Rata Recombinante. Para la producción del péptido NELL1, marcado con FLAG en el extremo C, por células de insecto, se construyó el plásmido plZT-NELL1-FLC insertando el ADNc de NELL1 de rata fusionado a una secuencia epitópica FLAG derivada del plásmido pTB701-NELL1-FLC (Kuroda et al. BBRC, 265,752,757, 1999) en el vector de expresión de insecto plZT/V5-His (Invitrogen). Posteriormente, se sustituyó la secuencia de señal de secrección original de NELL1 por la secuencia de señal de melitina de abeja usando métodos por PCR. Las células High Five se adquirieron en Invitrogen y se cultivaron en Medio asérico High Five (Invitrogen). Las células High Five se transfectaron con el plásmido plZT-NELL1-FLC usando FuGene6 (Roche). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se seleccionaron con 400 mg/ml de Zeocina (Invitrogen). Cada 3 o 4 días se sustituía el medio selectivo hasta estabilizar la línea celular de expresión estable. La secreción de NELL1 se confirmó usando análisis de inmunoprecipitación y transferencia de Western. Se descubrió que las células High Five expresaban péptidos NELL1 (140-kDA) en el medio de cultivo.

El péptido NELL1-FLC de rata recombinante se purificó del medio de cultivo de células High Five resistentes a zeocina por cromatografía de intercambio aniónico usando una columna UNO Q-1 (Bio-Rad). El péptido NELL1 se eluyó a NaCl 500 mM.

Para la producción del péptido NELL1, marcado con FLAG en el extremo C, por células COS7, se construyó un plásmido pcDNA3.1-NELL1-FLC insertando el ADNc de NELL1 de rata unido a una secuencia epitópica FLAG derivada del plásmido pTB701-NELL1-FLC en el vector de expresión mamífero pcDNA3.1 (Invitrogen). Se cultivaron células COS7 en DMEM complementado con FBS al 10%. Las células COS7 se transfectaron con el pcDNA3.1NELL1-FLC usando el plásmido del péptido de señal NELL endógeno y usando el método de electroporación. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, el medio de cultivo se sometió a inmunoprecipitación y análisis de transferencia de Western para determinar el péptido NELL1.

La Figura 17C es una ilustración de un gel SDS-PAGE teñido con CBB de eluado UnoQ que incluye NELL1-FLAG. Estos estudios de expresión mostraron que las células COS no expresaban el péptido NELL funcional, sin modificar el extremo N de NELL para aumentar la eficacia de secreción tal como incluyendo una secuencia de señal. La Figura 17C es una ilustración de una transferencia de Western usando anticuerpo anti-FLAG representando la expresión de NELL1-FLAG.

Expresión y Purificación de la Proteína NELL2 de Rata Recombinante. Para la producción del péptido NELL2, marcado con FLAG en su extremo, por células de insecto, se construyó un plásmido plZT-NELL2-FLC insertando el ADNc de NELL2 de rata fusionado a una secuencia epitópica FLAG derivada del plásmido pTB701-NELL2-FLC en el vector de expresión de insecto plZT/V5-His (Invitrogen). Las células High Five se adquirieron en Invitrogen y se cultivaron en medio asérico High Five (Invitrogen). Las células High Five se transfectaron con el plásmido plZTNELL1-FLC usando FuGene6 (Roche). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se seleccionaron con 400 mg/ml de Zeocina (Invitrogen). El medio selectivo se sustituyó cada 3 o 4 días, hasta estabilizar la línea celular de expresión estable. La expresión de NELL2 se confirmó en medio de cultivo usando inmunoprecipitación y análisis de transferencia de Western. Se descubrió que las células High five expresaban péptidos NELL2 (140-kDA) en el medio de cultivo.

El péptido NELL2-FLC de rata recombinante se purificó del medio de cultivo de células High Five resistentes a zeocina por cromatografía por intercambio aniónico usando una columna UNO Q-1 (Bio-Rad). El péptido NELL2-FLC se eluyó a NaCl 500 mM.

Ejemplo 2. Purificación de la proteína NELL2 del medio de cultivo.

Células High Five portadoras de plZT- FLC-NELL2 se cultivaron durante aproximadamente tres días en medio de cultivo asérico (1 l). El medio de cultivo se centrifugó a 3.000 x g durante 5 minutos y se recogió el sobrenadante. Se añadió PMSF a una concentración final de 1 mM. Se añadió solución de sulfato de amonio saturado (saturación al 80% (v/v) y la solución se mantuvo a 4 grados durante 1 hora. La solución se centrifugó a 15.000 x g durante 30 minutos y el precipitado se recogió. El precipitado se disolvió en 50 ml de Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM a 4 grados y se aplicó sobre una columna UnoQ de cromatografía de intercambio aniónico (6 ml, Bio-Rad) se equilibró en Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM a 4 grados (velocidad 1 ml/min por FPCL (Amersham-Pharmacia). La columna se lavó minuciosamente con el mismo tampón.

Después, la proteína de unión se eluyó por cambio gradual de NaCl de 0 M a 1,5 M en el mismo tampón. Las fracciones NELL2-FLAG se identificaron por transferencia de Western usando anticuerpo anti-FLAG M2 (Sigma). Las fracciones positivas se recogieron en un tubo. El producto final se dializó en un tubo de celulosa de una sola pieza (Wako, PM límite 12.000) frente a PBS 1 l durante una noche a 4 grados. El producto se conservó a -70 grados.

La pureza del péptido NELL2-FLAG se examinó por SDS-PAGE/ tinción CBB. La Figura 18 es una ilustración de un gel SDS-PAGE teñido con CBB de eluado UnoQ que contenía el péptido NELL2 purificado. La columna A representa una banda peptídica a aproximadamente 130 kDa que se aisló del medio celular. “IP” se refiere al anticuerpo anti-FLAG usado para la inmunoprecipitación; “WB” se refiere al anticuerpo anti-FLAG usado para la detección por transferencia de Western.

La Figura 19 es una transferencia que ilustra la expresión de NELL1 y NELL2 de SFM Five. “ESF921” se refiere a un nombre comercial de un medio asérico; “SFM Five” se refiere a un medio comercial de un medio. Las construcciones para la expresión de las dos proteínas NELL son similares a las descritas anteriormente.

Ejemplo 3. El aumento de la actividad de la fosfatasa alcalina es un marcador celular temprano de diferenciación osteoblástica. En un estudio, se cultivaron células fetales de calota de rata en presencia de: NELL1 (1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml), producido usando los métodos descritos en el presente documento o BMP4 (100 ng/ml) durante un tiempo. La fosfatasa alcalina se ensayó en cada muestra por métodos convencionales.

La Figura 20 es un gráfico de barras que representa la inducción de la fosfatasa alcalina en función del tratamientoen cultivos de células de calota de rata (“OD” = Densidad Óptica). Por lo tanto, el tratamiento con NELL1 fue más potente que con BMP4 induciendo la diferenciación osteoblástica, como se mide por inducción con fosfatasa alcalina.

La Figura 21 son fotomicrografías de cultivos de células de calota de rata tratados con NELL1. El tratamiento con NELL1 indujo actividad fosfatasa alcalina y la formación de micronódulos celulares en ausencia de ácido ascórbico, lo que es una señal de diferenciación osteoblástica y un precursor para la formación ósea.

Ejemplo 4. El ensayo con fosfatasa alcalina es un marcador celular temprano de diferenciación osteoblástica. En un estudio, se cultivaron osteoblastos de calota de rata en una placa de 24 pocillos. Los pocillos se dividieron en grupos que incluían: NELL1, MBP2, NELL1/MBP2 y control (sin péptido). Los tratamientos incluyeron los péptidos de aplicación a 100 ng/ml. La fosfatasa alcalina se ensayó en cada muestra por métodos convencionales.

Tabla 1.

Tiempo

NELL1 BMP2 NELL1/BMP Control

24 h

134% 159% 210% 100%

3 días

154% 145% 189% 100%

Por lo tanto, NELL1 y BMP tienen un efecto adictivo sobre la diferenciación osteoblástica, como se mide por la actividad fosfatasa alcalina con respecto al control o células tratadas solo con péptidos sencillos.

Ejemplo5. Para investigar el efecto de la expresión de NELL1 sobre la diferenciación osteoblástica, se evaluó la expresión de genes relacionados con hueso en una micromatriz de células MC3T3 a los 3, 6 y 9 días después de la infección con una construcción que expresaba NELL1 con respecto a células infectadas con construcciones que expresaban -gal.

Tabla 2. Niveles de expresión sobre células control

3 Días después de la infección

6 Días después de la infección 9 Días después de la infección

Regulado positivamente

No disponible Osteocalcina 2,5 BMP7 2,1 Decorina 2,2 Osteocalcina 2,6 Laminina B1 2,0 BMP7 3,2 Osteopontina 3,5 Col 15alfa1 2,6

Se expresaron diversos genes relacionados con hueso en células transfectadas con NELL1 a niveles al menos dos veces más elevados que en las células transfectadas con control -gal. Por lo tanto, dado que los marcadores 5 celulares de diferenciación osteoblástica tardía (tales como osteocalcina y osteopontina) se regulan positivamente, la expresión y producción de NELL1 potencia la diferenciación osteoblástica.

Ejemplo 6. La formación de micronódulos o la agregación de una pluralidad de osteoblastos es un indicio de diferenciación osteoblástica y un precursor de formación ósea. Se piensa que el proceso está regulado por ácido

10 ascórbico.

Para investigar los efectos de NELL1 sobre la formación de micronódulos, se transfectaron células MC3TC con una construcción que codificaba NELL1 y se cultivaron en ausencia de ácido ascórbico.

15 Las Figuras 22A y B son microfotografías de células MC3TC que expresan NELL1 formando micronódulos y teñidos para determinar la fosfatasa alcalina (B). La expresión de NELL1 indujo la inducción con fosfatasa alcalina así como la formación de micronódulos. Por lo tanto, NELL1 es activo en la formación de micronódulos celulares, lo que es un precursor de formación ósea y NELL1 en solitario es suficiente para inducir la diferenciación osteoblástica.

20 Ejemplo 7. La mineralización o la acumulación intracelular de calcio es un indicio de diferenciación osteoblástica y un precursor para la formación ósea. Para investigar los efectos de mineralización de NELL1, se transfectaron células de calota primarias con una construcción adenoviral que codificaba NELL1 o una construcción de control que codificaba -gal o un virus NELL1 antisentido. Las células se examinaron posteriormente mediante tinción Von Kassa para detectar la presencia de acumulación de calcio intracelular después de 3, 6, 9 y 12 días en cultivo. Esto

25 demuestra que NELL1 puede acelerar la mineralización ósea.

Las Figuras 23A-C son fotomicrografías de células de calota tratadas con A) el virus NELL1 antisentido, B) -gal o C) NELL1. Las células control tuvieron una cantidad moderada de mineralización, las células que expresaban NELL1 tuvieron niveles aumentados de mineralización y en las células NELL1 antisentido la mineralización se inhibió. Este

30 estudio de inactivación (“knock-out”) demuestra que NELL1 es necesario para la diferenciación osteoblástica.

Las Figuras 23 D y E son gráficos de barras que representan la expresión de ARNm de osteocalcina y osteoponina como una relación con respecto a GAPFH de control, después de 3, 6, 9 y 12 días en cultivo. Las células que expresaban NELL1 expresaron niveles significativamente elevados de ARNm de osteocalcina y osteoponina

35 después de 12 días. Por lo tanto, NELL1 es activo induciendo la expresión de marcadores celulares tardíos de diferenciación y mineralización osteoblástica, lo que es un precursor de formación ósea.

Ejemplo 8. Para examinar el efecto de sobreexpresión de NELL1 en la formación ósea, se usaron modelos de animales transgénicos. El promotor del CMV se unió al ADNc de NELL1 y se microinyectó en huevos fecundados.

40 NELL1 se sobreexpresó por completo bajo el fuerte promotor del CMV.

La Figura 24 es una fotomicrografía de un tejido de ratón transgénico NELL1, que representa tinción Von Kassa. Como se muestra, en la Figura 24, ratones transgénicos NELL1 tenían sobrecrecimiento de calota, lo que confirma la capacidad de NELL1 para inducir el crecimiento óseo incluyendo la formación ósea membranosa.

45 Las Figuras 25 A y B son fotomicrografías que representan tinción Von Kassa de calota de un ratón transgénico NELL1 (A) y de miembros normales de la misma camada (B). Como se muestra en la Figura 25A, los ratones transgénicos NELL1 tenían mineralización potenciada con respecto a los miembros normales de la misma camada lo que confirma la función de NELL1 en la formación ósea membranosa.

50 Ejemplo 9. Para examinar el efecto de la expresión de NELL1 sobre defectos de desarrollo inducidos por déficit de Cbfa1 se usaron modelos animales transgénicos.

Para determinar si Cbfa1 puede desempeñar una función en la regulación de NELL1, se transfectaron células fetales 55 de calota de rata con vectores plasmídicos que contenían Cbfa1 de ratón.

La Figura 26 es una transferencia que representa la expresión de NELL1 en células transfectadas con Cbfa1 a las 24 y 48 horas con respecto a células de control. La transfección con Cbfa1 regula positivamente la expresión de NELL1 a las 24 horas (junto con cualquier osteocalcina de control positivo). Esto demuestra que NELL-1 es un “factor de transcripción osteoblástico” clave aguas abajo de Cbfa1.

La Figura 27 A-C son fotografías de tinción de esqueleto (superior, central) y micro CT (inferior). La Figura 27A representa el patrón de esqueleto normal de un ratón de tipo silvestre. Se observan los bordes de mineralización (líneas discontinuas) típicos, las fontanelas anterior y posterior (asteriscos) y puede observarse el perfil de la sutura coronal derecha (flechas). Además, se muestra una clavícula normal (A-central). La micro-CT revela la morfología ósea craneofacial típica. La Figura 27B representa defectos del esqueleto de un animal Cbfa1+/-. Específicamente, la mineralización ósea y la formación ósea defectuosa está presente en el lateral del tejido poco teñido (entre las líneas discontinuas) con respecto al defecto de calota central y también puede observarse transparencia en el área de la estructura coronal (flechas). Se observa un grado significativo de hidroplasia clavicular (B-central). La Figura C representa defectos del esqueleto de un animal Cbfa1 +/- + NELL1 sobreexp que demuestra formación ósea de calota significativamente aumentada con respecto al animal defectuoso haploide Cbfa1+/- en tinción esquelética y micro-CT. Además, un menor grado significativamente menor de hipoplasia clavicular con respecto al animal defectuoso haploide Cbfa1+/- (central). Obsérvese la reposición de imbricación ósea en las suturas coronales (flechas). Por lo tanto, la sobre-expresión de NELL1 redime la deficiencia de Cbfa1 en ratones transgénicos confirmando el papel de NELL1 en la formación ósea membranosa y en formación ósea endocondral. Adicionalmente, en enfermedades congénitas NELL 1 puede regenerar hueso en los huesos.

Ejemplo 10. El defecto de tamaño crítico es un modelo importante para el estudio de agentes capaces de inducir la reparación ósea intramembranosa. Para investigar los efectos de NELL1 sobre la reparación ósea, se crearon defectos de calota derecha e izquierda (3 mm) en ratones macho CD-1 adulto de tipo silvestre. Los defectos del lado derecho (control) se injertaron solo con una membrana vehículo de PLGA/colágeno mientras que los defectos del lado izquierdo se injertaron con una membrana portadora de PLGA/colágeno sumergida en 200 ng de NELL1 o BMP2 por sitio. La calota se extrajo y se examinó por análisis microCT.

La Figura 28A es una fotografía de tratamiento de control (izquierda) y con BMP2 (derecha) de defectos de calota; la Figura 28B es una fotografía de tratamiento de control (izquierda) y con NELL1 (derecha) de defectos de calota; la Figura 29 es una fotografía del tratamiento con NELL1 (izquierda) y con BMP2 (derecha) de defectos de la calota. Se observó una cantidad significativa de formación ósea tanto en los grupos NELL1 como en BMP2. Por lo tanto, la expresión de NELL1 efectuó significativamente formación ósea e indujo la regeneración ósea en el modelo de defecto de tamaño crítico lo que confirma la función de NELL1 sobre la formación ósea intramembranosa.

Ejemplo 11. La expansión rápida de paladar (RPE) es otro modelo para el estudio de agentes capaces de inducir reparación ósea intramembranosa. Para investigar los efectos de NELL1 sobre la reparación ósea, se dividieron ratas Sprague Dawley de 4 semanas en grupos para 1) expansión de control y 2) expansión con tratamiento con NELL1. Las ratas se sacrificaron y sus paladares se extirparon y se mantuvieron con vida en cultivo de órganos. Los paladares se expandieron y se añadió NELL1 al grupo de tratamiento durante 9 días.

La Figuras 30 A y B son fotografías de paladares expandidos tratados con NELL1 (A) y control (B). En los dos grupos NELL1 y BMP2, se observó una cantidad significativa de formación ósea. Por lo tanto, el tratamiento con NELL1 efectuó significativamente formación ósea en el modelo RPE confirmando la función de NELL1 sobre la formación ósea membranosa.

Ejemplo 12. La formación ósea endocondral es el proceso clave en el desarrollo de huesos argos. Esto tiene diversas etapas que incluyen: proliferación condroblástica, hipertrofia, apoptosis, invasión de vasos sanguíneos, sustitución por osteoblastos. La aceleración de cualquiera de estas etapas inducirá el crecimiento óseo endocrondral.

Las Figuras 31 A y B son fotomicrografías de cartílago con tinción TUNEL para células apoptóticas en ratones transgénicos que sobreexpresan NELL1 (A) y en ratones de tipo silvestre (B).

Como se muestra en la Figura 31A, en ratones que sobreexpresan NELL1, el cartílago muestra condroblastos hipertróficos y apoptosis (indicado por la tinción parda usando ENSAYO TUNEL para identificar la contracción de núcleos apoptóticos). En la Figura 31B se muestra un cartílago de ratón normal (de tipo silvestre) con escasa presencia de células apoptóticas con tinción TUNEL y las células no son hipertróficas. Por lo tanto, NELL1 puede inducir hipertrofia y apoptosis de cartílago, induciendo de esta manera la formación y regeneración de huesos largos.

Ejemplo 13. Preparación de sustrato con NELL.

In vitro. Se disolvió polilactida-co-glicólida (PLGA 85:15; viscosidad intrínseca -0,6 dUg, Birmingham Polymers, AL) en cloroformo para preparar una solución al 5% y se dispuso en placas de vidrio de cultivo y se dejó evaporar lentamente durante 24 horas. Después de la extracción del disolvente, las películas se recubrieron de acuerdo con los 8 grupos siguientes: (a) solo polímero sin recubrimiento; (b) apatita convencional (1 x SBF seguido por 1,5 x SBF); (c) apatita biomimética acelerada (5 x SBF seguido por 5 x SBF sin Mg y sin carbonato); (d) fibronectina (0, 01 mg/ml); (e) poli-L-lisina (0,01 mg/ml); (f) colágeno; (g) Mefp-1 (0,01 mg/ml); y (h) mezcla de colágeno e hialuronano. Cada grupo se subdividió en grupos que contenían NELL1 (100 ng) y grupos sin NELL1 y se cultivaron in vitro durante 7 días con osteoblastos primarios en medio sin diferenciación (sin ácido ascórbico ni fosfatos beta glicerol). Para cada material, los grupos con NELL1 estimularon mayor actividad fosfatasa que los homólogos NELL1. Entre los materiales, las apatitas aceleradas (grupo c) indujeron la mayor actividad fosfatasa alcalina y el control con polímero (grupo a) indujo la menor actividad fosfatasa alcalina.

In vivo. . Se disolvió polilactida-co-glicólida (85:15 PLGA; viscosidad intrínseca ~0,6 dUg, Birmingham Polymers, AL) en cloroformo y se mezcló con porógenos (gránulos de sacarosa con un diámetro de ~ 100-300 m) para producir estructuras de PLGA con porosidad del 90% después del lixiviado particulado y extracción del disolvente. Las estructuras porosas se grabaron con argón-plasma, se esterilizaron, se recubrieron con una mezcla de colágeno de tipo I bovino acuoso que contenía 200 ng de péptido NELL1, se secaron y se implantaron en defectos de calota de ratones macho adultos de tipo silvestre. También se implantaron controles positivos (PLGA/colágeno/BMP) y controles negativos (solo PLGA/colágeno; sin factores de crecimiento) en defectos similares. A las 4 semanas, el análisis microCT mostró que las estructuras de control negativo (solo PLGA/colágeno) indujeron escasa o ninguna formación ósea, mientras que las estructuras que contenían NELL1 y las que contenían BMP indujeron una mineralización rápida y completa a través de los defectos a las 4 semanas. La histología convencional confirmó que la mineralización presentaba las características clásicas del hueso maduro.

Se entiende que los ejemplos y las realizaciones que se describen en el presente documento se realizan únicamente con fines ilustrativos y que los expertos en la materia sugerirán diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos y deben incluirse dentro del espíritu y competencia de esta solicitud y ámbito de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en el presente documento se incorporan por la presente por referencia en su totalidad para todos los fines. Deberá entenderse que la invención también puede comprender cualquier combinación de las realizaciones descritas o combinación con métodos y composiciones conocidos.

Aunque no se han descrito algunas realizaciones de los sistemas de expresión del péptido NELL ni la actividad de formación ósea del péptido NELL, debe entenderse que en otras realizaciones también pueden usarse los conceptos implícitos en estas realizaciones. En resumen, la protección de esta solicitud se limita exclusivamente a las reivindicaciones que se indican más adelante.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA TING, Kang KURODA, Shunichi WU, Ben

<120> SISTEMAS DE EXPRESIÓN DE PÉPTIDOS NELL Y ACTIVIDAD DE FORMACIÓN ÓSEA DE PÉPTIDOS NELL

<130> 39370.00018

<140> PCT/US2004/003808

<141> 7-02-2003

<160> 17

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 2433

<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Construcción de ácido nucleico péptido de señal sintético NELL1-FLAG 10

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<223> Construcción Sintética

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<223> Construcción sintética

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> The Regents of the University of California Ting, Kang Kuroda, Shunichi Wu, Ben

<120> Sistemas de Expresión de Péptidos Nell y Actividad de Formación Ósea de Péptidos Nell

<130> 38586-332

<150> US 60/445.672

<151> 27-02-2003

<160> 14

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> The Regents of the University of California Ting, Kang Kuroda, Shunichi Wu, Ben

<120> Sistemas de Expresión de Péptidos Nell y Actividad de Formación Ósea de Péptidos Nell

<130> 38586-332

<140> PCT/US04/03808

<141> 09-02-2004

<150> US 60/445.672

<151> 07-02-2003

<160> 14

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<211> 2453 5 <212> ADN

<213> Gallus gallus

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)...(2453)

<400> 13

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<210> 14

<211> 816

<212> PRT

<213> Gallus gallus

<400> 14

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Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para expresar in vitro un péptido funcional en una célula de insecto, comprendiendo dicho método:

   a.

   proporcionar una construcción de ácido nucleico que incluya al menos un ácido nucleico que codifique al menos un péptido NELL1 en fase de lectura con un ácido nucleico que codifique un péptido de señal de secreción de insecto que sea un péptido de señal de secreción procedente de una proteína de abeja secretada, que sea una secuencia de señal de melitina;

   b.

   transfectar una célula de insecto con dicha construcción de ácido nucleico y

   c.

   cultivar dicha célula de insecto en condiciones que permitan la expresión del péptido NELL1.

2. 2.

   El método de acuerdo con la reivindicación 1 que además comprende opcionalmente recoger el péptido NELL1 secretado a partir de la línea celular; o purificar sustancialmente el péptido NELL1, o ensayar la actividad del péptido NELL1, o ensayar la actividad del péptido NELL1 para inducir formación ósea.

3. 3.

   El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha célula de insecto es una célula high five.

4. 4.

   El método de la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico que codifica NELL1 se selecciona del grupo que consiste en: la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3 y la SEC ID Nº: 5, seleccionándose la secuencia del péptido NELL1 del grupo que consiste en: la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4 y la SEC ID Nº: 6.

5. 5.

   Una construcción de ácido nucleico para expresar un péptido NELL1 en una célula de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo dicha construcción de ácido nucleico al menos un ácido nucleico que codifique al menos un péptido NELL1 en fase de lectura con un ácido nucleico que codifique un péptido de señal de secreción de insecto.

6. 6.

   Una línea celular para expresar un péptido NELL1 funcional de acuerdo con las reivindicación 1 a 4, incluyendo dicha línea celular una construcción de ácido nucleico que comprenda al menos un ácido nucleico que codifique al menos un péptido NELL1 en fase de lectura con un ácido nucleico que codifique un péptido de señal de secreción de insecto.

7. 7.

   Un polipéptido que comprende un péptido NELL1 y un péptido de señal de secreción de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4.

8. 8.

   Un método para expresar in vitro un péptido funcional en una célula de insecto, comprendiendo dicho método:

   a.

   proporcionar una construcción de ácido nucleico que incluya al menos un ácido nucleico que codifique al menos un péptido NELL2 en fase de lectura con un ácido nucleico que codifique un péptido de señal de secreción de insecto que es un péptido de señal de secreción procedente de una proteína de abeja secretada, que es una secuencia señal de melitina;

   b.

   transfectar una célula de insecto con dicha construcción de ácido nucleico y

   c.

   cultivar dicha célula de insecto en condiciones que permitan la expresión del péptido NELL2.

9. 9.

   El método de la reivindicación 8, que además comprende opcionalmente recoger el péptido NELL2 secretado a partir de la línea celular; o purificar sustancialmente el péptido NELL2, o ensayar la actividad del péptido NELL2, o ensayar la actividad del péptido NELL2 para inducir formación ósea.

10. 10.

    El método de la reivindicación 8, en el que dicha célula de insecto es una célula high five.

11. 11.

    El método de la reivindicación 8, en el que el ácido nucleico que codifica NELL2 se selecciona del grupo que consiste en: la SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 11, y la SEC ID Nº: 13, seleccionándose la secuencia del péptido NELL2 del grupo que consiste en: la SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº 12 y la SEC ID Nº: 14.

12. 12.

    Una construcción de ácido nucleico para expresar un péptido NELL2 en una célula de insecto de acuerdo con las reivindicaciones 8 a 11, comprendiendo dicha construcción de ácido nucleico al menos un ácido nucleico que codifique al menos un péptido NELL2 en fase de lectura con un ácido nucleico que codifique un péptido de señal de secreción de insecto.

13. 13.

    Una línea celular para expresar un péptido NELL2 funcional de acuerdo con las reivindicaciones 8 a 11, incluyendo dicha línea celular una construcción de ácido nucleico que comprenda al menos un ácido nucleico que codifique al menos un péptido NELL2 en fase de lectura con un ácido nucleico que codifique un péptido de señal de secreción de insecto.

14. 14.

    Un polipéptido que comprende un péptido NELL2 y un péptido de señal de secreción de insecto que es un péptido de señal de secreción procedente de una proteína de abeja secretada que es una secuencia de señal de melitina.

15. 15.

    El polipéptido de la reivindicación 14, en el que el péptido NELL2 se selecciona del grupo que consiste en: la SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12 y la SEC ID Nº: 14.