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WO2023210713A1 - 心外膜細胞再生促進剤および心外膜細胞の再生促進方法 - Google Patents

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WO2023210713A1
WO2023210713A1 PCT/JP2023/016537 JP2023016537W WO2023210713A1 WO 2023210713 A1 WO2023210713 A1 WO 2023210713A1 JP 2023016537 W JP2023016537 W JP 2023016537W WO 2023210713 A1 WO2023210713 A1 WO 2023210713A1
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cells
inhibitor
cell
cdkn1a
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善紀 吉田
カカセ アントニオ ルセナ
雨 田
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Kyoto University NUC
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to an agent for promoting epicardial cell regeneration and a medicament containing the same for treating cardiac damage.
  • the present invention also relates to a method for promoting regeneration of epicardial cells and a method for producing epicardial cells with enhanced regenerative potential.
  • the ability of the heart to regenerate in response to injury differs depending on the species. Neonatal mice are able to regenerate their hearts and restore function after injury, but this regenerative ability is lost after birth. Furthermore, this regenerative ability is completely lacking in humans.
  • the epicardium which surrounds the heart, has functions essential for heart regeneration. In species capable of heart regeneration during the neonatal period, the epicardium undergoes a transition from non-proliferation to reactivation upon cardiac injury. However, the adult human epicardium permanently has little proliferative capacity.
  • Non-Patent Document 1 there are many approaches for differentiating epicardial cells derived from human pluripotent stem (iPS) cells (for example, Non-Patent Document 1).
  • these approaches do not result in accelerated epicardial regeneration, nor do they explore the regenerative potential of human iPS cell-derived epicardial cells for clinical purposes.
  • iPS pluripotent stem
  • cyclin-dependent kinase inhibitor p21 affects epimorphic regeneration and is involved in liver regeneration.
  • the effect of p21 on the regenerative ability of epicardial cells has not been reported. Because p21 is intricately involved in many cellular processes, it is difficult to predict what effect a decrease in p21 protein levels will have in a particular tissue or cell.
  • An object of the present invention is to provide a drug for promoting regeneration of epicardial cells.
  • the present invention aims to provide a drug for promoting epicardial cell regeneration and for treating cardiac damage.
  • a further object of the present invention is to provide a method for promoting regeneration of epicardial cells.
  • the present inventors conducted extensive research to solve the above problems and found that p21 is an important factor that inhibits the reactivation of epicardial cells, and by using a p21 inhibitor, The present invention was completed based on the discovery that the present invention can promote the regeneration of epicardial cells and exert therapeutic effects such as repair of damaged heart tissue.
  • An epicardial cell regeneration promoter containing a p21 inhibitor [2] The epicardial cell regeneration promoter according to [1], wherein the p21 inhibitor is a CDKN1A gene expression inhibitor. [3] The epicardial cell regeneration promoter according to [2], wherein the CDKN1A gene expression inhibitor is a nucleic acid containing an siRNA sequence targeting the CDKN1A gene. [4] The epicardial cell regeneration promoter according to [3], wherein the siRNA sequence includes a sense strand having the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and an antisense strand having the sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • the p21 inhibitor includes a guide RNA for a CRISPR-Cas system
  • the guide RNA for the CRISPR-Cas system is a guide RNA designed to target the CDKN1A gene.
  • a pharmaceutical composition for treating cardiac damage comprising the epicardial cell regeneration promoter according to any one of [1] to [5].
  • the method according to [7], wherein the step of inhibiting p21 is performed by inhibiting expression of the CDKN1A gene.
  • p21 inhibitor for promoting epicardial cell regeneration [13] p21 inhibitor for promoting epicardial cell regeneration. [14] Use of a p21 inhibitor in the manufacture of an epicardial cell regeneration promoter. [15] p21 inhibitors to treat heart damage. [16] Use of p21 inhibitors in the manufacture of medicaments for treating heart damage. [17] A method for promoting epicardial cell regeneration in a subject, comprising the step of administering an effective amount of a p21 inhibitor to a subject in need thereof. [18] A method of treating cardiac damage in a subject comprising administering an effective amount of a p21 inhibitor to a subject in need thereof.
  • regeneration of epicardial cells can be promoted. This promotes the regeneration of epicardial cells in damaged heart tissue, and also induces repair and regeneration of the myocardium, increasing the regenerative ability of the damaged heart and making it possible to treat heart damage. shall be.
  • Epicardial cell regeneration promoter relates to an epicardial cell regeneration promoter containing a p21 inhibitor.
  • Epicardial cells are cells that cover the surface of the myocardium and are characterized by the expression of markers such as WT1 (Wilms Tumor 1), TBX18 (T-Box Transcription Factor 18), and ALDH1A2 (Aldehyde Dehydrogenase 1 Family Member A2). .
  • Promoting epicardial cell regeneration means, for example, improving the survival rate of epicardial cells, improving the proliferation ability of epicardial cells, improving the epicardial tissue repair ability, and/or regenerating the epicardium. It is characterized by increased gene expression associated with reactivation of brain function.
  • the survival rate of epicardial cells can be shown, for example, by culturing epicardial cells and measuring the survival rate (percentage of living cells) after a certain period of time, by adding a p21 inhibitor to the medium. Sometimes, it can be determined that the survival rate of epicardial cells has improved when the survival rate of epicardial cells increases compared to when the p21 inhibitor is not added to the culture medium. The period for culturing the epicardial cells at this time may be, for example, 14 days.
  • the proliferation ability of epicardial cells can be shown, for example, by culturing epicardial cells, measuring the number of cells over time over a certain period of time, and drawing a growth curve. It can be determined that the proliferation ability of epicardial cells has improved when the slope of the proliferation curve of epicardial cells increases compared to the case where no p21 inhibitor is added to the medium. At this time, the period for culturing the epicardial cells may be, for example, 7 days. Further, the cell number may be measured over time, for example, on a daily basis.
  • the tissue repair capacity of the epicardium is demonstrated, for example, by wound healing assays.
  • a wound healing assay involves, for example, culturing epicardial cells until they reach confluence, and then physically scraping some of the cells to create a simulated wound that is repaired after a certain period of time. If the degree of repair of epicardial cells is improved when a p21 inhibitor is added to the medium compared to when a p21 inhibitor is not added to the medium, the epicardial tissue repair ability is It can be judged that it has improved.
  • genes related to reactivation of epicardial regeneration ability include the transcription factors WT1 and TBX18, and the aldehyde dehydrogenase ALDH1A2, and when cultured with a p21 inhibitor added to the medium, and when cultured with a p21 inhibitor added to the medium, In addition, when the expression level of these genes increased compared to when culturing without adding p21 inhibitor to the medium, the expression of genes related to reactivation of epicardial regenerative ability was improved. Can be judged. Gene expression level can be evaluated, for example, by a known method such as RT-PCR.
  • p21 is a protein known as a cyclin-dependent kinase inhibitor, also called CDKN1A, and is expressed from the CDKN1A gene locus.
  • CDKN1A cyclin-dependent kinase inhibitor
  • the p21 protein is also simply referred to as p21, and the gene that expresses p21 is sometimes referred to as the CDKN1A gene or CDKN1A.
  • p21 is known to have the function of binding to a complex of cyclin and cyclin-dependent kinase 2 or 4, inhibiting its activity, and controlling cycle progression in the G1 phase of the cell cycle.
  • the p21 protein and CDKN1A gene are not particularly limited, they can be selected based on epicardial cells that promote regeneration, and when promoting the regeneration of human epicardial cells, human p21 protein or human CDKN1A gene Preferably, inhibitors are used.
  • An example of the amino acid sequence of the human p21 protein is shown in SEQ ID NO: 10
  • an example of the nucleotide sequence of the human CDKN1A gene is shown in SEQ ID NO: 9.
  • inhibitortion of p21 includes inhibition of p21 expression and activity.
  • Inhibition of p21 expression means decreasing the amount of transcription (mRNA amount) or translation amount (amount of protein) of the gene encoding p21 protein (CDKN1A). Inhibition of p21 expression can be confirmed by comparing the expression level of p21 protein or CDKN1A gene per a certain number of epicardial cells before and after addition of the p21 inhibitor.
  • the expression level of the p21 protein or CDKN1A gene may be reduced compared to the expression level before addition of the p21 inhibitor, for example, 50% or less, 20% or less, or 10% or less of the expression level before addition of the p21 inhibitor. It is preferable that the expression level decreases to below the detection limit level, and the expression level may disappear below the detection limit level.
  • Expression of p21 protein or the gene encoding p21 protein can be measured by Western blotting, RT-PCR, etc.
  • Inhibition of p21 expression can be achieved, for example, by an operation that reduces the expression of the gene encoding the p21 protein (CDKN1A gene).
  • Inhibition of CDKN1A gene expression is not particularly limited, but includes, for example, introducing mutations into the CDKN1A gene that reduce transcription efficiency or translation efficiency, manipulating small molecules involved in transcription and translation control, and using nucleic acids such as siRNA that cause RNA interference. This is accomplished through manipulation, etc.
  • CDKN1A gene expression can be achieved by disrupting the CDKN1A gene.
  • Disruption of a gene means that the gene is modified so that it no longer produces a protein that functions normally. Failure to produce a protein that functions normally includes cases in which no protein is produced from the same gene, or cases in which a protein with reduced or lost function per molecule is produced from the same gene.
  • Gene disruption or mutation introduction may be performed, for example, by using the CRISPR-Cas system. Specifically, for example, it may be carried out using a guide RNA designed for gene modification or mutation introduction and a CRISPR enzyme. Moreover, at the same time, DNA fragments for homologous recombination may be used.
  • the p21 inhibitor is a substance for "p21 inhibition" described above. Specifically, it may be, for example, a p21 activity inhibitor, a nucleic acid such as siRNA that targets the CDKN1A gene and causes RNA interference, a guide RNA for a CRISPR-Cas system that targets the CDKN1A gene, and a CRISPR enzyme.
  • nucleic acids such as siRNA that cause RNA interference include siRNA, shRNA, miRNA, and their precursors. That is, the p21 inhibitor may be a nucleic acid such as siRNA, shRNA, miRNA, or a precursor thereof that targets the CDKN1A gene, or a DNA containing a sequence for expressing these RNAs.
  • a sequence of a nucleic acid such as siRNA that causes inhibition of CDKN1A gene expression can be designed by a known method based on the sequence of the CDKN1A gene.
  • the sequence of guide RNA that causes inhibition of CDKN1A gene expression by the CRISPR-Cas system can be designed by a known method based on the sequence of the CDKN1A gene.
  • the p21 inhibitor is an siRNA comprising a sense strand comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and an antisense strand comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, or contained in these sequences. It may be shRNA containing the sequence as a core sequence, or DNA containing the sequence for expressing these RNAs.
  • Examples of methods for introducing nucleic acids into cells or tissues include viral vectors and lipofection. Therefore, when the p21 inhibitor is a nucleic acid such as RNA or DNA, it may exist in the form of a viral vector or a complex for lipofection.
  • the virus vector any known vector can be used, and examples thereof include adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, and Sendai virus vectors.
  • substances that inhibit p21 protein activity include antibodies (including partial fragments) against p21 protein and compounds that bind to p21 protein and inhibit p21 protein activity. Inhibition of p21 protein activity can be confirmed by comparing the p21 protein activity per certain number of epicardial cells before and after addition of a p21 inhibitor. The activity of p21 protein only needs to be decreased compared to the cells before addition of the p21 inhibitor, but for example, the activity of p21 protein is 50% or less compared to the cells before addition of the p21 inhibitor, It is preferable that the activity is reduced to 20% or less or 10% or less, and the activity may be completely lost.
  • An antibody against p21 protein can be obtained by a known method using p21 protein or a partial peptide thereof (for example, a partial peptide of the C-terminal region of p21) as an antigen.
  • a commercially available anti-p21 antibody may be used.
  • the p21 inhibitor can be added at a concentration that can inhibit the expression and function of p21.
  • the p21 inhibitor is not particularly limited as long as it inhibits p21 expression or function, but specific examples include p21 antibodies, p21 siRNA, p21 shRNA, p21 antisense compounds, and 2-(2-chlorophenyl)- 5,7-dihydroxy-8-[(3S,4R)-3-hydroxy-1-methylpiperidin-4-yl]-4H-chromen-4-one (flavopiridol), (1R,2R,4S)- 4-[(2R)-2-[(1R, 9S, 12S, 15R, 16E, 18R, 19R, 21R, 23S, 24E, 26E, 28E, 30S, 32S, 35R)-1,18-dihydroxy-19, 30-dimethoxy-15,17,21,23,29,35-hexamethyl-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatricyclo[30.3.1.0 ⁇ 4 ,9 ⁇ ]hexatriacont
  • Epicardial cells have essential functions in the heart's regeneration in response to injury. Therefore, the epicardial cell regeneration promoting agent of the present invention reactivates the regenerative ability of the epicardium and acquires the ability of the heart to regenerate in response to damage, so that it can be used as a medicine for treating heart damage. Therefore, the present invention provides a medicament for treating heart damage that contains a p21 inhibitor as an active ingredient.
  • the above-mentioned p21 inhibitor can be used as a medicine for treating heart damage, but the p21 inhibitor can also be used as a pharmaceutical composition by combining it with a pharmacologically acceptable carrier.
  • pharmacologically acceptable carriers carriers used in pharmaceuticals such as solvents, buffers, stabilizers, excipients, etc. can be used, and they are selected as appropriate depending on the type of p21 inhibitor and the dosage form of the pharmaceutical. sell.
  • a medicament for treating cardiac damage may include reagents for delivering the nucleic acid to cells, such as lipofection reagents, and reagents for stabilizing the nucleic acid.
  • the target of the medicament of the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained, but it is preferably a mammal, more preferably a primate such as a human or a rodent such as a mouse, and a human Even more preferably.
  • the medicament of the present invention can be administered orally or parenterally, it is preferably administered locally to the damaged site of the heart.
  • the dosage form of the pharmaceutical is not particularly limited, but it can be administered, for example, in the form of an injection solution or a drip preparation.
  • the dosage of the medicament of the present invention varies depending on the type of p21 inhibitor, the age, sex, symptoms and administration method of the subject, and is selected as appropriate. 0.01 mg to 1000 mg per day, preferably 0.1 mg to 100 mg. Administration may be in a single dose or in multiple doses.
  • the medicament of the present invention may be used in combination with other cardiac damage therapeutics.
  • One embodiment of the method of the present invention is a method for promoting regeneration of epicardial cells in vitro, the method comprising the step of inhibiting p21 in the epicardial cells. It is.
  • Another aspect of the method of the present invention is a method for producing epicardial cells with enhanced regenerative potential, comprising: A) providing epicardial cells; and B) inhibiting p21 in the epicardial cells of step A). Regarding the method.
  • promoting the regeneration of epicardial cells means, for example, improving the survival rate of epicardial cells, improving the proliferation ability of epicardial cells, improving the ability of epicardial tissue repair, and and/or characterized by an increase in gene expression associated with reactivation of epicardial regenerative potential.
  • enhanced regenerative ability means, for example, improved survival rate of epicardial cells, improved proliferative ability of epicardial cells, improved ability to repair epicardial tissue, and/or improved ability to repair epicardial tissue. It may also mean an increase in gene expression associated with reactivation of membrane regeneration capacity.
  • the epicardial cells may be epicardial cells collected from a mammalian subject such as a human or a mouse, or may be epicardial cells induced to differentiate from pluripotent stem cells.
  • pluripotent stem cells include, but are not particularly limited to, embryonic stem (ES) cells, induced pluripotent stem (iPS) cells, and embryonic stem cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer (ntES). cells, spermatogonial stem cells ("GS cells”), embryonic germ cells (“EG cells”), cultured fibroblasts, and pluripotent cells derived from bone marrow stem cells (Muse cells).
  • ES embryonic stem
  • iPS induced pluripotent stem
  • GS cells spermatogonial stem cells
  • EG cells embryonic germ cells
  • cultured fibroblasts and pluripotent cells derived from bone marrow stem cells (Muse cells).
  • Preferred pluripotent stem cells are iPS cells and ES cells.
  • the origin of the pluripotent stem cells is not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained, but they are preferably derived from mammals, more preferably from primates such as humans or rodents such as mice, Even more preferably it is of human origin.
  • the initialization factors are, for example, Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15.
  • Examples include genes or gene products such as -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, or Glis1, and these reprogramming factors may be used alone or in combination. Also good.
  • Combinations of initialization factors include WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, WO2009/057831, WO2009/075119, WO2009/079007, W O2009/091659, WO2009/101084, WO2009/ 101407, WO2009/102983, WO2009/114949, WO2009/117439, WO2009/126250, WO2009/126251, WO2009/126655, WO2009/157593, WO2010/009015, WO 2010/033906, WO2010/033920, WO2010/042800, WO2010/050626, WO2010/056831, WO2010/068955, WO2010/098419, WO2010/102267, WO2010/111409, WO2010/111422, WO2010/115050, WO2010/124290, WO2010/14 7395, WO2010/147612,
  • Somatic cells used to obtain iPS cells include, but are not limited to, fetal somatic cells, neonatal somatic cells, and mature healthy or diseased somatic cells. It also includes primary cultured cells, subcultured cells, and established cell lines. Specifically, somatic cells include (1) tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells, (2) tissue progenitor cells, and (3) blood cells (peripheral stem cells).
  • tissue stem cells such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells
  • tissue progenitor cells tissue progenitor cells
  • blood cells peripheral stem cells
  • lymphocytes epithelial cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosal cells, intestinal cells, spleen cells, pancreatic cells (pancreatic exocrine cells) etc.), differentiated cells such as brain cells, lung cells, kidney cells, and fat cells.
  • epicardial cells derived from pluripotent stem cells may be, for example, epicardial cells induced to differentiate from pluripotent stem cells in vitro. Any known method can be used to induce differentiation of epicardial cells from pluripotent stem cells. For example, differentiation may be induced by adding an appropriate differentiation-inducing factor to the culture medium.
  • the method for inducing differentiation of epicardial cells from pluripotent stem cells is not particularly limited, and any known method may be used. Specifically, for example, embryoid bodies (EBs) are formed from pluripotent stem cells, and the EBs are treated with a GSK3 (Glycogen synthase kinase 3) inhibitor such as CHIR99021 or a TGF (Transforming growth factor) ⁇ inhibitor. Examples include monolayer culture in the presence of certain SB431542, BMP4 (Bone morphogenetic protein 4), and VEGF (Vascular endothelial growth factor). In addition, methods described in the following documents can also be used. 1. Witty A., et al. Nat Biotechnol.
  • epicardial cells induced to differentiate from pluripotent stem cells may be used after isolation and purification, or a cell population containing epicardial cells may be used as is.
  • the epicardial cells thus provided are treated to inhibit p21.
  • inhibiting p21 means inhibiting p21 using the above-mentioned "p21 inhibitor”.
  • the step of inhibiting p21 in epicardial cells may be carried out, for example, by adding the above p21 inhibitor to epicardial cells.
  • An example of a method for treatment with a p21 inhibitor is a method in which a p21 inhibitor is added to a culture solution of epicardial cells and cultured for a sufficient time for regeneration of epicardial cells, for example, 5 hours to 10 days. Ru.
  • the concentration of the p21 inhibitor added may be a concentration sufficient for the regeneration of epicardial cells, and can be appropriately set depending on the type of p21 inhibitor.
  • a p21 inhibitor may be additionally administered. Furthermore, after the p21 inhibitory effect is exerted, it may be removed from the culture medium. Epicardial cells with enhanced regenerative capacity may be purified or concentrated before use.
  • the epicardial cells produced by the method of the present invention may be used to treat cardiac damage by transplanting them into a subject as appropriate.
  • iPS cell line (409B2) was used to induce differentiation of human epicardial cells.
  • Human iPS cell lines are grown on radiation-treated mouse embryonic fibroblasts (MEFs) in ES cell medium (Primate ES Cell Medium (REPROCELL, Cat. RCHEMD001) supplemented with 4 ng/mL fibroblast growth factor (bFGF). )) was maintained.
  • ES cell medium Primary ES Cell Medium (REPROCELL, Cat. RCHEMD001) supplemented with 4 ng/mL fibroblast growth factor (bFGF).
  • bFGF fibroblast growth factor
  • StemPro-34 medium (Gibco) supplemented with 2mM L-glutamine, 50 ⁇ M/mL ascorbic acid, 0.4 ⁇ M monothioglycerol, and 150mg/mL transferrin was used.
  • 10 ⁇ M Y27632 Rock inhibitor
  • 2 ng/mL human recombinant BMP4 0.5% Matrigel (Corning) were added to the differentiation medium.
  • cell culture medium supplemented with 4 ng/mL activin A, 10 ng/mL human recombinant bFGF, 20 ng/mL human recombinant BMP4 was added 100% by volume.
  • EBs were dissociated into single cells and replated onto gelatin-coated dishes using basal medium containing 3mM CHIR99021, 10 ⁇ M SB431542, 30ng/mL human recombinant BMP4, and 5ng/mL human recombinant VEGF. (0.3x10 5 cells/cm 2 ), and differentiation of human epicardial cells was induced.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • siRNA transfection assay 0.8 x 106 human iPS cell-derived fetal epicardium cells were seeded per 10 cm dish, and transfection was performed using RNAiMax (Invitrogen). The medium was replaced with fresh medium 24 hours after transfection.
  • Small interfering RNA (siRNA) targeting CDKN1A sense strand: CAAGGAGUCAGACAUUUUAtt (SEQ ID NO: 1), antisense strand: UAAAAUGUCUGACUCCUUGtt (SEQ ID NO: 2)
  • negative control No. 1 derived from Ambion Silencer Select. 1 siRNA (4390843) was used according to the manufacturer's instructions.
  • Quantitative RT-PCR RNA was extracted using QIAzol lysis reagent (QIAGEN), and cDNA was synthesized from the total amount of RNA using ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (TOYOBO). Next, quantitative RT-PCR was performed using Thunderbird SYBR qPCR Mix (TOYOBO) in One Step Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Gene expression results were quantified by the ⁇ Ct method and normalized with GAPDH.
  • the primers used are as follows.
  • CDKN1A Forward 5'-AGGGGACAGCAGAGGAAG-3' (SEQ ID NO: 3); Reverse 5'-GCGTTTGGAGTGGTAGAAATCTG-3' (SEQ ID NO: 4), WT1: Forward 5'-CAGCTTGAATGCATGACCTG-3' (SEQ ID NO: 5); Reverse 5'- GATGCCGACCGTACAAGAGT-3' (SEQ ID NO: 6), GAPDH: forward 5'-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3' (SEQ ID NO: 7); reverse 5'-TCCTTGGAGGCCATGTGGCCAT-3' (SEQ ID NO: 8).
  • Cell growth Curve Assay Cell growth time course curves were evaluated on 6-well plates. Cells were seeded at a density of 4 ⁇ 10 4 per well, and total cell counts were performed with trypan blue at 24-hour intervals for 8 days. Cell growth curves were generated by plotting cell number versus time. After seeding, cells were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) and stained with crystal violet on the day of counting. Values were expressed as cell proliferation rate of cells grown in the presence of 10% FBS. 0% means the number of cells on day 0.
  • PFA paraformaldehyde
  • Colony Formation Assay For the cell colony formation assay, 5000 cells were seeded in a 10 cm dish and cultured for 10 days. Colonies were then fixed with 4% PFA, stained with crystal violet and counted by Image-J.
  • RNA-Seq analysis Data normalization in RNA-Seq analysis was performed using NOISeq. Adult epicardial data are released for analysis under GSE code GSE8484085. Primary data from RNA-Seq analysis was processed using RStudio for mapping and gene expression analysis. Gene expression data for exploration, loading, and preprocessing were processed using the Bioconductor package NOISeq to perform data analysis and differential expression analysis of RNA-Seq analysis data. A heat map for clustering differentially expressed genes (DEGs) was drawn using R script.
  • DEGs differentially expressed genes
  • CDKN1A knockout (KO) mouse CDKN1A knockout mouse was obtained from Jackson laboratory (strain #016565). The second exon of the Cdkn1a gene of the knockout mouse strain has been replaced with a neomycin resistance cassette (neo cassette). In addition, C57BL/6J mice were used as isogenic controls with similar genetic backgrounds.
  • E12 epicardial Explants
  • E12 mouse 12 day embryonic mice.
  • mouse E12 hearts were placed on gelatin-coated dishes in low glucose DMEM supplemented with 15% FBS. Proliferating cultures appeared within 24 hours, and after 7 days, the length of the explants was observed under the microscope.
  • Cells of explants were maintained in medium supplemented with 10 ⁇ M SB431542 to prevent spontaneous epithelial-mesenchymal transition (EMT).
  • Example 1 An siRNA transfection assay was performed on human iPS cell-derived fetal epicardium using siRNA targeting CDKN1A (siCDKN1A) or negative control siRNA (control), and the relative mRNA expression level of CDKN1A was quantitatively determined. Measured by RT-PCR. The results are shown in Figure 1. In addition, the amounts of p21 protein and WT1 protein were measured by Western blotting in human epicardial cells subjected to transfection assay using each siRNA. The results are shown in Figure 2.
  • siCDKN1A With siCDKN1A, the expression level of CDKN1A at the mRNA level in human iPS cell-derived fetal epicardium was reduced to 50% or less compared to the control, and a similar decrease was observed at the p21 protein level.
  • a wound healing assay was performed on human iPS cell-derived fetal epicardium that had been subjected to a transfection assay using each siRNA.
  • the percentage of the wound closure area over time is shown on the left of FIG. 5, and the photographs of the wound area after 0 and 24 hours are shown on the right of FIG.
  • transcriptome analysis was performed to detect gene signatures of cell quiescence using RNA-Seq analysis ( Figure 6).
  • the figure on the left shows a comparison between human iPS cell-derived fetal epicardium and adult epicardium. (Suppression of CDKN1A expression: siCDKN1A group) comparison is shown in the figure on the right.
  • the gene groups whose expression decreased in the cell quiescence state the gene expression was lowest in the order of adult epicardium, human iPS cell-derived fetal epicardium, and siCDKN1A group.
  • gene expression was highest in the order of adult epicardium, human iPS cell-derived fetal epicardium, and siCDKN1A group. Therefore, the adult epicardium, the human iPS cell-derived fetal epicardium, and the siCDKN1A group are strongly in a state of cell quiescence in that order.In other words, the siCDKN1A group has escaped the state of cell quiescence compared to the human epicardium. This was revealed at the gene expression level.
  • Example 2 Ex vivo explant assays of CDKN1A knockout mice were performed. First, epicardial explants were prepared and cultured ex vivo using E12 hearts of CDKN1A knockout mice and control mice (C57BL/6J mice). The CDKN1A knockout mouse and control mouse are as described in "CDKN1A knockout (KO) mouse” above. In addition, epicardial explants were prepared and cultured using the method described in "Epicardial Explants" above. Next, the amounts of p21 protein and WT1 protein were measured for each epicardial explant by Western blotting. The results are shown in FIG.
  • CDKN1A can reactivate the regenerative ability of epicardial cells and improve wound healing ability. It was also confirmed in explants.

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Abstract

心外膜細胞の再生を促進し、心臓の損傷を治療するための医薬として使用しうる薬剤を提供する。ｐ２１阻害物質を心外膜細胞再生促進剤として使用する。

Description

心外膜細胞再生促進剤および心外膜細胞の再生促進方法
　本発明は、心外膜細胞再生促進剤およびそれを含む心臓の損傷治療のための医薬に関する。本発明は、また、心外膜細胞の再生を促進するための方法および再生能が高められた心外膜細胞の製造方法に関する。
　損傷に対する心臓の再生能力は、種によって異なっている。新生児マウスは心臓を再生することができ、損傷があっても機能が回復するが、この再生能力は出生後に失われる。さらに、ヒトではこの再生能力は完全に欠如している。心臓を包んでいる心外膜は、心臓の再生に不可欠な機能を所持している。新生児時期に心臓再生が可能な種では、心臓損傷時において心外膜が非増殖から再活性化に移行する。しかし、成人のヒトの心外膜は恒久的にほとんど増殖能を持たない。
　これまで、ヒト多能性幹（ｉＰＳ）細胞由来の心外膜細胞を分化させるための多くのアプローチが存在する（例えば、非特許文献１）。しかし、これらのアプローチは、心外膜の再生の促進をもたらすものでなく、臨床目的のためのヒトｉＰＳ細胞由来心外膜細胞の再生可能性を探るものでもない。すなわち、ほとんどのアプローチは分化に焦点を当て、細胞の特性評価のためのヒトｉＰＳ細胞由来心外膜細胞の能力を保持しているが、心外膜細胞の再生を促進することに関する報告は存在しない。
　サイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ２１は、エピモルフィック再生などに影響を与えることや、肝臓再生に関わることがこれまでに示唆されている。しかし、ｐ２１が心外膜細胞の再生能に与える影響は報告されていない。ｐ２１は多くの細胞プロセスに複雑に関与しているため、そのタンパク質レベルの低下が特定の組織・細胞においてどのような影響をもたらすのか予測することは難しい。
Junghof J, et al. NPJ Regen Med. 2022 Feb 2;7(1):14. doi: 10.1038/s41536-022-00207-w.
　本発明は、心外膜細胞の再生を促進するための薬剤を提供することを課題とする。本発明は特に、心外膜細胞の再生を促進し、心臓の損傷を治療するための薬剤を提供することを課題とする。本発明は、さらに、心外膜細胞の再生を促進させるための方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ｐ２１が心外膜細胞の再活性化を阻害する重要な因子であることを見出し、ｐ２１阻害物質を用いることで、心外膜細胞の再生を促進し、損傷を受けた心臓組織の修復等の治療効果を発揮しうることを見出し、本発明を完成させた。
［１］
　ｐ２１阻害物質を含む、心外膜細胞再生促進剤。
［２］
　前記ｐ２１阻害物質が、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現阻害物質である、［１］に記載の心外膜細胞再生促進剤。
［３］
　前記ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現阻害物質が、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ配列を含む核酸である、［２］に記載の心外膜細胞再生促進剤。
［４］
　前記ｓｉＲＮＡ配列は、配列番号１に記載の配列を有するセンス鎖および配列番号２に記載の配列を有するアンチセンス鎖を含む、［３］に記載の心外膜細胞再生促進剤。
［５］
　前記ｐ２１阻害物質が、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのためのガイドＲＮＡを含み、前記ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのためのガイドＲＮＡは、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子を標的として設計されたガイドＲＮＡである、［１］または［２］に記載の心外膜細胞再生促進剤。
［６］
　［１］～［５］のいずれか一項に記載の心外膜細胞再生促進剤を含む、心臓の損傷を治療するための医薬組成物。
［７］
　in vitroで心外膜細胞の再生を促進するための方法であって、
　前記心外膜細胞においてｐ２１を阻害する工程を含む、方法。
［８］
　前記ｐ２１を阻害する工程が、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現を阻害することによって行われる、［７］に記載の方法。
［９］
　前記ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現の阻害が、ｓｉＲＮＡを前記心外膜細胞に導入することにより達成される、［８］に記載の方法。
［１０］
　前記ｐ２１を阻害する工程が、前記心外膜細胞にＣＤＫＮ１Ａ遺伝子を標的として設計されたガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素を導入することによって行われる、［８］に記載の方法。
［１１］
　再生能が高められた心外膜細胞を製造するための方法であって、
　Ａ）心外膜細胞を提供する工程、および
　Ｂ）工程Ａ）の心外膜細胞においてｐ２１を阻害する工程を含む、方法。
［１２］
　工程Ａ）の心外膜細胞が多能性幹細胞から分化誘導された心外膜細胞である、［１１］に記載の方法。
［１３］
　心外膜細胞再生促進のためのｐ２１阻害物質。
［１４］
　心外膜細胞再生促進剤の製造におけるｐ２１阻害物質の使用。
［１５］
　心臓の損傷を治療するためのｐ２１阻害物質。
［１６］
　心臓の損傷を治療するための医薬の製造におけるｐ２１阻害物質の使用。
［１７］
　有効量のｐ２１阻害物質を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、対象における心外膜細胞再生促進方法。
［１８］
　有効量のｐ２１阻害物質を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、対象における心臓の損傷を治療する方法。
　本発明により、心外膜細胞の再生を促進することができる。これにより、損傷を受けた心臓組織において、心外膜細胞の再生を促進し、さらには、心筋の修復と再生を惹起し、損傷を受けた心臓の再生能力を高め、心臓損傷の治療を可能とする。
ヒトｉＰＳ細胞株から分化誘導したヒト心外膜細胞における、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションアッセイ後の、ＣＤＫＮ１Ａの相対的なｍRNA発現量を示すグラフ。解析は、生物学的三重で行った。コントロール条件と比較して、＊＊：Ｐ＜０．０１を示す。 ヒト心外膜細胞における、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションアッセイ後の、ｐ２１タンパク質およびＷＴ１タンパク質のウエスタンブロット解析の結果を示す写真。 ヒト心外膜細胞における、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションアッセイ後７日間の細胞増殖曲線を示すグラフ。右の写真は７日目のディッシュ上の細胞を撮影したものを示す。解析は、生物学的三重で行った。コントロール条件と比較して、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊：Ｐ＜０．００１を示す。 ヒト心外膜細胞における、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションアッセイ後１４日間コロニー形成を行った、コロニー形成アッセイの結果を示すグラフ。右の写真は１４日目のディッシュ上のコロニーを撮影したものを示す。解析は、生物学的三重で行った。コントロール条件と比較して、＊：Ｐ＜０．０５を示す。 創傷治癒アッセイにより、ヒト心外膜細胞をスクラッチしてから０～２４時間後の創傷閉鎖率を示すグラフ、および２４時間後の創傷閉鎖の様子を撮影した写真を示す。解析は、生物学的三重で行った。コントロール条件と比較して、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊：Ｐ＜０．００１を示す。 ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析による、細胞静止状態の遺伝子シグネチャーを検出するためのトランスクリプトーム解析を行った図。ヒトｉＰＳ細胞由来胎児性心外膜と成人心外膜（ＧＳＥ８４０８５）の比較、およびヒトｉＰＳ細胞由来胎児性心外膜とｓｉＣＤＫＮ１Ａ群の比較を、相対的ｍＲＮＡ発現レベル（倍率変化の対数比：ｌｏｇ　ＦＣ）を表示したヒートマップにより表し、細胞静止状態を検出した。 ＣＤＫＮ１Ａノックアウトマウス及びコントロールマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス）の１２日齢胚（Ｅ１２）由来の心外膜外植片における、ｐ２１タンパク質およびＷＴ１タンパク質のウエスタンブロット解析結果を示す図である。 ＣＤＫＮ１Ａノックアウトマウス及びコントロールマウスのＥ１２胚の心臓由来心外膜外植片について、培養から７日後に心外膜外細胞の増殖と外植片の長さを顕微鏡下で観察した、ex vivo外植片アッセイ結果の写真である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞心外膜細胞再生促進剤
　本発明は、ｐ２１阻害物質を含む、心外膜細胞再生促進剤に関する。
　心外膜細胞に対して、ｐ２１阻害物質を添加することにより、成体の心外膜細胞においては停止している再生能を再活性化させ、心外膜細胞の再生を促進することができる。
　心外膜細胞は、心筋の表面を覆う細胞であり、ＷＴ１（Wilms Tumor 1）、ＴＢＸ１８(T-Box Transcription Factor 18)、ＡＬＤＨ１Ａ２(Aldehyde Dehydrogenase 1 Family Member A2)等のマーカーの発現により特徴づけられる。
　「心外膜細胞再生促進」は、例えば、心外膜細胞の生存率の改善、心外膜細胞の増殖能の改善、心外膜の組織修復能力の改善、および／または心外膜の再生能の再活性化に関連する遺伝子発現の向上によって特徴づけられる。
　心外膜細胞の生存率は、例えば、心外膜細胞を培養し、一定期間経過後の生存率（生細胞の割合）を測定することにより示すことができ、ｐ２１阻害物質を培地に添加したときに、ｐ２１阻害物質を培地に添加しない場合と比べて心外膜細胞の生存率が増加した場合に、心外膜細胞の生存率が改善したと判定できる。このとき心外膜細胞を培養する期間は、例えば、１４日であってよい。
　心外膜細胞の増殖能は、例えば、心外膜細胞を培養し、一定期間における細胞数を経時的に計測して増殖曲線を描くことで示され、ｐ２１阻害物質を培地に添加したときに、ｐ２１阻害物質を培地に添加しない場合と比べて心外膜細胞の増殖曲線の傾きが増加した場合に、心外膜細胞の増殖能が改善したと判定できる。このとき心外膜細胞を培養する期間は、例えば、７日であってよい。また、細胞数の経時的な計測は、具体的には、例えば、１日ごとの計測であってよい。
　心外膜の組織修復能力は、例えば、創傷治癒アッセイにより示される。創傷治癒アッセイは、具体的には、例えば、心外膜細胞をコンフルエントになるまで培養したのちに、一部の細胞を物理的に掻きとって生じた模擬的な傷が一定期間経過後に修復される度合いによって示され、ｐ２１阻害物質を培地に添加したときに、ｐ２１阻害物質を培地に添加しない場合と比べて心外膜細胞の修復度合いが向上した場合に、心外膜の組織修復能力が改善したと判定できる。
　心外膜の再生能の再活性化に関連する遺伝子は、例えば、転写因子であるＷＴ１やＴＢＸ１８、アルデヒド脱水素酵素であるＡＬＤＨ１Ａ２などが挙げられ、ｐ２１阻害物質を培地に添加して培養したときに、ｐ２１阻害物質を培地に添加せずに培養した場合と比べてこれらの遺伝子の発現量が増加した場合に、心外膜の再生能の再活性化に関連する遺伝子の発現が向上したと判定できる。遺伝子発現量は、例えば、RT-PCR等の公知の方法で評価することができる。
　ｐ２１はサイクリン依存性キナーゼ阻害因子として知られ、ＣＤＫＮ１Ａとも呼ばれるタンパク質であり、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子座から発現する。本発明ではｐ２１タンパク質を、単にｐ２１とも呼称し、ｐ２１を発現する遺伝子をＣＤＫＮ１Ａ遺伝子またはＣＤＫＮ１Ａと呼称することがある。ｐ２１はサイクリンとサイクリン依存性キナーゼ２または４との複合体に結合してその活性を阻害し細胞周期のＧ１期における周期進行の制御を担う機能を有することが知られている。
　ｐ２１タンパク質およびＣＤＫＮ１Ａ遺伝子は特に制限されないが、再生を促進する心外膜細胞に基づいて選択することができ、ヒトの心外膜細胞の再生を促進する場合は、ヒトｐ２１タンパク質またはヒトＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の阻害物質を用いることが好ましい。
　ヒトｐ２１タンパク質のアミノ酸配列の一例を配列番号１０に、ヒトＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の塩基配列の一例を配列番号９に示す。
　本発明において「ｐ２１の阻害」とは、ｐ２１の発現阻害および活性阻害を含む。
　ｐ２１の発現阻害は、ｐ２１タンパク質をコードする遺伝子（ＣＤＫＮ１Ａ）の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を減少させることを意味する。
　ｐ２１の発現の阻害は、一定数の心外膜細胞当たりのｐ２１タンパク質またはＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現量を、ｐ２１阻害剤添加前後で比較することにより確認することができる。ｐ２１タンパク質またはＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現量は、ｐ２１阻害剤添加前の発現量と比較して減少すればよいが、例えば、ｐ２１阻害剤添加前の発現量の５０％以下、２０％以下または１０％以下まで減少することが好ましく、発現量が検出限界レベル以下に消失していてもよい。
　ｐ２１タンパク質またはｐ２１タンパク質をコードする遺伝子（ＣＤＫＮ１Ａ）の発現はウエスタンブロットやＲＴ－ＰＣＲなどで測定することができる。
　ｐ２１の発現阻害は、例えば、ｐ２１タンパク質をコードする遺伝子（ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子）の発現を低下させる操作により達成できる。
　ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子発現の阻害は特に限定されないが、例えば、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子への転写効率または翻訳効率の低下をもたらす変異の導入、転写や翻訳制御に関わる低分子の操作、ＲＮＡ干渉をもたらすｓｉＲＮＡなどの核酸の操作などによって達成される。
　また、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子発現の阻害は、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子を破壊することにより達成できる。遺伝子の破壊は、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。正常に機能するタンパク質を産生しないことは、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能が低下又は消失したタンパク質が産生される場合が含まれる。
　遺伝子の破壊または変異の導入は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いることで実施されてもよい。具体的には、例えば、遺伝子の改変または変異の導入のために設計されたガイドＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ酵素を用いることで実施されてもよい。また、同時に、相同組み換えのためのＤＮＡ断片を用いてもよい。
　ｐ２１阻害物質は、上述した「ｐ２１阻害」のための物質である。具体的には、例えば、ｐ２１の活性阻害物質、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子を標的としてＲＮＡ干渉をもたらすｓｉＲＮＡなどの核酸、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子を標的としたＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのためのガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素であってよい。
　ＲＮＡ干渉をもたらすｓｉＲＮＡなどの核酸は、具体的には、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、それらの前駆体などが挙げられる。すなわち、ｐ２１阻害物質は、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはそれらの前駆体、またはこれらＲＮＡを発現するための配列を含むＤＮＡといった核酸であってよい。
　ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子発現の阻害を引き起こすｓｉＲＮＡなどの核酸の配列は、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の配列に基づいて公知の方法により設計することができる。
　また、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムによってＣＤＫＮ１Ａ遺伝子発現の阻害を引き起こすガイドＲＮＡの配列は、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の配列に基づいて公知の方法により設計することができる。
　具体的には、例えば、ｐ２１阻害物質は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むセンス鎖と配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡ、もしくはこれらの配列に含まれる配列をコア配列として含むｓｈＲＮＡ、またはこれらＲＮＡを発現するための配列を含むＤＮＡであってよい。
　核酸を細胞または組織に導入する方法としては、例えば、ウィルスベクターやリポフェクションなどが挙げられる。そのため、ｐ２１阻害物質は、ＲＮＡやＤＮＡといった核酸である場合、ウィルスベクターやリポフェクションのための複合体の形で存在してもよい。ウィルスベクターとしては、公知の任意のベクターを用いうるが、例えば、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、センダイウィルスベクターなどが挙げられる。
　ｐ２１タンパク質の活性を阻害する物質は、ｐ２１タンパク質に対する抗体（部分断片を含む）やｐ２１タンパク質に結合してｐ２１タンパク質の活性を阻害する化合物等が例示される。
　ｐ２１タンパク質の活性の阻害は、一定数の心外膜細胞当たりのｐ２１タンパク質の活性を、ｐ２１の阻害剤添加前後で比較することにより確認することができる。ｐ２１タンパク質の活性は、ｐ２１の阻害剤添加前の細胞と比較して減少していればよいが、例えば、ｐ２１の阻害剤添加前の細胞と比較して、ｐ２１タンパク質の活性が５０％以下、２０％以下または１０％以下に減少することが好ましく、活性が完全に消失していてもよい。
　ｐ２１タンパク質に対する抗体は、ｐ２１タンパク質またはその部分ペプチド（例えば、ｐ２１のＣ末端側領域の部分ペプチド）を抗原として、公知の方法で取得することができる。また、市販の抗ｐ２１抗体を利用してもよい。
　ｐ２１阻害物質は、ｐ２１の発現や機能を阻害しうる濃度で添加することができる。
　ｐ２１阻害物質はｐ２１の発現や機能を阻害する物質であれば特に制限されないが、具体的には、ｐ２１抗体、ｐ２１のｓｉＲＮＡ、ｐ２１のｓｈＲＮＡ、ｐ２１アンチセンス化合物および２－（２－クロロフェニル）－５，７－ジヒドロキシ－８－［（３Ｓ、４Ｒ）－３－ヒドロキシ－１－メチルピペリジン－４－イル］－４Ｈ－クロメン－４－オン（フラボピリドール）、（１Ｒ、２Ｒ、４Ｓ）－４－［（２Ｒ）－２－［（１Ｒ、９Ｓ、１２Ｓ、１５Ｒ、１６Ｅ、１８Ｒ、１９Ｒ、２１Ｒ、２３Ｓ、２４Ｅ、２６Ｅ、２８Ｅ、３０Ｓ、３２Ｓ、３５Ｒ）－１，１８－ジヒドロキシ－１９，３０－ジメトキシ－１５，１７，２１，２３，２９，３５－ヘキサメチル－２，３，１０，１４，２０－ペンタオキソ－１１，３６－ジオキサ－４－アザトリシクロ［３０．３．１．０＾｛４，９｝］ヘキサトリアコンタ－１６，２４，２６，２８－テトラエン－１２－イル］プロピル］－２－メトキシシクロヘキシル－３－ヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）－２－メチルプロパノエート（テムシロリムス）、（３Ｒ、４Ｓ、５Ｓ、６Ｒ、７Ｒ、９Ｒ、１１Ｓ、１２Ｒ、１３Ｓ、１４Ｒ）－６－｛［（２Ｓ、３Ｒ、４Ｓ、６Ｒ）－４－（ジメチルアミノ）－３－ヒドロキシ－６－メチルオキサン－２－イル］オキシ｝－１４－エチル－７，１２，１３－トリヒドロキシ－４－｛［（２Ｒ、４Ｒ、５Ｓ、６Ｓ）－５－ヒドロキシ－４－メトキシ－４，６－ジメチルオキサン－２－イル］オキシ｝－３，５，７，９，１１，１３－ヘキサメチル－１０－（２，４，７－トリオキサ－１－アザオクタン－１－イリデン）－１－オキサシクロテトラデカン－２－オン（ロキシスロマイシン）、６－ヒドロキシ－２－（４－ヒドロキシフェニル）ベンゾ［ｂ］チエン－３－イル］［４－［２－（１－ピペリジニル）エトキシ］フェニル］メタノン塩酸塩（塩酸ラロキシフェン）、（７Ｓ，９Ｅ，１１Ｓ，１２Ｒ，１３Ｓ，１４Ｒ，１５Ｒ，１６Ｒ，１７Ｓ，１８Ｓ，１９Ｅ，２１Ｚ）－２，１５，１７，２７，２９－ペンタヒドロキシ－１１－メトキシ－３，７，１２，１４，１６，１８，２２－ヘプタメチル－２６－｛（Ｅ）－［（４－メチルピペラジン－１－イル）イミノ］メチル｝－６，２３－ジオキソ－８，３０－ジオキサ－２４－アザテトラシクロ［２３．３．１．１４’７．０５’２８］トリアコンタ－１（２８），２，４，９，１９，２１，２５（２９）、２６－オクタエン－１３－イルアセテート（リファンピシン）、［（８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１７－アセチル－６，１０，１３－トリメチル－３－オキソ－２，８，９，１１，１２，１４，１５，１６－オクタヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－１７－イル］アセテート（酢酸メゲストロール）、８－（４－アミノ－１－メチルブチルアミノ）－６－メトキシキノリンニリン酸塩（プリマキン二リン酸）、カリウム；［２－ブチル－５－クロロ－３－［［４－［２－（１，２，３－トリアザ－４－アザニダシクロペンタ－２，５－ジエン－５－イル）フェニル］フェニル］メチル］イミダゾール－４－イル］メタノール（ロサルタンカリウム）、（２Ｓ）－３－メチル－２－［ペンタノイル－［［４－［２－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）フェニル］フェニル］メチル］アミノ］ブタン酸（バルサルタン）、（Ｚ）－ブト－２－エン－二酸；２－（２，２－ジシクロヘキシルエチル）ピペリジン（ペルヘキシリンマレイン酸塩）、３－Ｏ－メチル－５－Ｏ－（２－メチルプロピル）－２，６－ジメチル－４－（２－ニトロフェニル）－１，４－ジヒドロピリジン－３，５－ジカルボキシレート（ニソルジピン）などが例示される。
＜心臓の損傷治療のための医薬＞
　心外膜細胞は、損傷に対する心臓の再生に不可欠な機能を持つ。そのため、本発明の心外膜細胞再生促進剤は、心外膜の再生能を再活性化し、損傷に対する心臓の再生能力の獲得により、心臓の損傷治療のための医薬として使用しうる。したがって、本発明は、ｐ２１阻害物質を有効成分とする心臓の損傷治療のための医薬を提供する。
　心臓の損傷治療のための医薬は、上述したｐ２１阻害物質をそのまま使用することができるが、ｐ２１阻害物質を薬理学的に許容される担体と組み合わせて、医薬組成物としても使用しうる。薬理学的に許容される担体は、溶媒、緩衝剤、安定化剤、賦形剤等、医薬に使用される担体が使用でき、ｐ２１阻害物質の種類や医薬の剤形に合わせて適宜選択しうる。
　ｐ２１の阻害物質が核酸である場合、心臓の損傷治療のための医薬は、リポフェクション試薬など核酸を細胞に送達するための試薬や核酸を安定化させるための試薬を含んでもよい。
　本発明の医薬の対象は、本発明の効果が得られるならば特に限定されないが、哺乳動物であることが好ましく、ヒトなどの霊長類またはマウスなどのげっ歯類であることがより好ましく、ヒトであることがさらにより好ましい。
　本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与されうるが、心臓の損傷部位に局所的に投与されることが好ましい。医薬の剤形は特に制限されないが、例えば、注射液や点滴製剤などの形態で投与されうる。
　本発明の医薬の投与量は、ｐ２１阻害物質の種類、投与対象の年齢、性別、症状および投与方法等によって異なり、適宜選択されるが、例えば、有効成分であるｐ２１阻害物質の量として、１日あたり0.01mg～1000mg、好ましくは0.1mg～100mgである。
　投与は、単回投与でも複数回投与でもよい。
　本発明の医薬は、他の心臓損傷治療薬と組み合わせて使用されてもよい。
＜２＞本発明の方法
　本発明の方法の一態様は、in vitroにおいて心外膜細胞の再生を促進するための方法であって、前記心外膜細胞においてｐ２１を阻害する工程を含む、方法である。
　本発明の方法の他の態様は、再生能が高められた心外膜細胞を製造するための方法であって、
　Ａ）心外膜細胞を提供する工程、および
　Ｂ）工程Ａ）の心外膜細胞においてｐ２１を阻害する工程を含む、
方法に関する。
　ここで、「心外膜細胞の再生を促進する」とは、例えば、心外膜細胞の生存率の改善、心外膜細胞の増殖能の改善、心外膜の組織修復能力の改善、および／または心外膜の再生能の再活性化に関連する遺伝子発現の向上をもたらすことにより特徴づけられる。また、「再生能が高められた」とは、例えば、心外膜細胞の生存率の改善、心外膜細胞の増殖能の改善、心外膜の組織修復能力の改善、および／または心外膜の再生能の再活性化に関連する遺伝子発現の向上を意味してもよい。
　心外膜細胞は、ヒトやマウス等の哺乳動物の対象から採取された心外膜細胞であってよく、また、多能性幹細胞から分化誘導された心外膜細胞であってよい。
　ここで、多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（「ＧＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞である。多能性幹細胞の由来は本発明の効果が得られるならば特に限定されないが、哺乳動物由来であることが好ましく、ヒトなどの霊長類またはマウスなどのげっ歯類由来であることがより好ましく、ヒト由来であることがさらにより好ましい。
　ｉＰＳ細胞の製造方法は当該分野で公知であり、任意の体細胞へ初期化因子を導入することなどによって製造され得る。ここで、初期化因子とは、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等の遺伝子または遺伝子産物が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ２０１０／１１１４０９、ＷＯ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：７９５－７９７、Ｓｈｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２：５２５－５２８、Ｅｍｉｎｌｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２６：２４６７－２４７４、Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１２６９－１２７５、Ｓｈｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３，５６８－５７４、Ｚｈａｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３：４７５－４７９、Ｍａｒｓｏｎ Ａ，（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３，１３２－１３５、Ｆｅｎｇ Ｂ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：１９７－２０３、Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎ  ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７：４５９－４６１、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ ＣＡ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ  Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１０６：８９１２－８９１７、Ｋｉｍ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎａｔｕｒｅ．４６１：６４９－６４３、Ｉｃｈｉｄａ ＪＫ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．５：４９１－５０３、Ｈｅｎｇ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．６：１６７－７４、Ｈａｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｎａｔｕｒｅ．４６３：１０９６－１００、Ｍａｌｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２８：７１３－７２０、Ｍａｅｋａｗａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｎａｔｕｒｅ．４７４：２２５－９．に記載の組み合わせが例示される。
　ｉＰＳ細胞を得るために使用される体細胞には、非限定的に、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）血液細胞（末梢血細胞、臍帯血細胞等）、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
　多能性幹細胞に由来する心外膜細胞とは、具体的には、例えば、in vitroで多能性幹細胞から分化誘導させた心外膜細胞であってよい。多能性幹細胞から心外膜細胞を分化誘導する方法は、任意の既知の方法を用いることができ、例えば、培地に適切な分化誘導因子を加えることで分化誘導してもよい。
　多能性幹細胞から心外膜細胞を分化誘導する方法としては特に制限されず、公知の方法を使用しうる。
　具体的には、例えば、多能性幹細胞から胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ　ｂｏｄｙ：ＥＢ）を形成し、ＥＢをＣＨＩＲ９９０２１等のＧＳＫ３（Glycogen synthase kinase 3）阻害剤、ＴＧＦ（Transforming growth factor）β阻害剤であるＳＢ４３１５４２、ＢＭＰ４（Bone morphogenetic protein 4）、およびＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）の存在下で単層培養することが挙げられる。
　その他にも以下の文献に記載の方法も使用可能である。
1. Witty A., et al. Nat Biotechnol. 2014 Oct;32(10):1026-35. doi: 10.1038/nbt.3002. PMID: 25240927.
2. Iyer D, et al. Development. 2015 Apr 15;142(8):1528-41. doi: 10.1242/dev.119271. PMID: 25813541.
3. Bao X, et al. Nat Biomed Eng. 2016;1:0003. doi: 10.1038/s41551-016-0003. PMID: 28462012.
4. Guadix JA, et al. Stem Cell Reports. 2017 Dec 12;9(6):1754-1764. doi: 10.1016/j.stemcr.2017.10.023. PMID: 29173898.
 
　なお、多能性幹細胞から分化誘導された心外膜細胞は、心外膜細胞を単離精製して使用してもよいが、心外膜細胞を含む細胞集団をそのまま使用してもよい。
　このようにして提供された心外膜細胞においてｐ２１を阻害する処理を行う。
　ここで「ｐ２１を阻害する」とは、上述した「ｐ２１阻害物質」を使用してｐ２１の阻害を実施することである。心外膜細胞においてｐ２１を阻害する工程は、例えば、心外膜細胞に、上記ｐ２１阻害物質を添加することにより実施されてもよい。
　ｐ２１阻害物質での処理方法は、心外膜細胞の培養液にｐ２１阻害物質を添加して、心外膜細胞の再生に十分な時間、例えば、５時間～１０日間、培養する方法が例示される。ｐ２１阻害物質の添加濃度は心外膜細胞の再生に十分な濃度であればよく、ｐ２１阻害物質の種類に応じて適宜設定しうる。ｐ２１阻害物質は追加投与してもよい。また、ｐ２１阻害効果が発揮されたのちは培地から除いてもよい。
　再生能が高められた心外膜細胞は、精製または濃縮してから使用されてもよい。
　本発明の方法で製造された心外膜細胞を、適宜、対象に移植するなどにより心臓損傷の治療に用いてもよい。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施態様には限定されない。
（手順）
　ヒト心外膜細胞の分化誘導
　ヒト心外膜細胞の分化誘導には、ヒトｉＰＳ細胞株（409B2）を用いた。ヒトｉＰＳ細胞株は、放射線処理されたマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）上に、４ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を添加したＥＳ細胞培地（Primate ES Cell Medium (REPROCELL, Cat. RCHEMD001)）で維持した。
　まず、胚様体（ＥＢ）を形成するために、ヒトｉＰＳ細胞をシングルセルの懸濁液として低付着性のポリＨＥＭＡ（poly-2-hydroxyethyl methacrylate）コートディッシュに播種した。初期分化培地としては、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン、５０μＭ／ｍＬ　アスコルビン酸、０．４μＭ　モノチオグリセロール、１５０ｍｇ／ｍＬ　トランスフェリンを添加したＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いた。分化のトリガーのために、１０μＭ　Ｙ２７６３２（Rock阻害剤）、２ｎｇ／ｍＬ　ヒト組換えＢＭＰ４および０．５％　Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Corning社）を分化用培地に添加した。
　EB形成の２４時間後、４ｎｇ／ｍＬ　アクチビンＡ、１０ｎｇ／ｍＬ　ヒト組換えｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬ　ヒト組換えＢＭＰ４を添加した細胞培地を、体積量で１００％添加した。72～96時間後、EBをシングルセルに解離し、３ｍＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、１０μＭ　ＳＢ４３１５４２、３０ｎｇ／ｍＬ　ヒト組換えＢＭＰ４および５ｎｇ／ｍＬ　ヒト組換えＶＥＧＦを含む基本培地を用いて、ゼラチンコートしたディッシュに再播種（０．３ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）し、ヒト心外膜細胞の分化誘導を行った。7日目以降、分化誘導したヒト心外膜細胞は、１０μＭ　ＳＢ４３１５４２を添加した１０％　ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）で維持した。この、ヒトｉＰＳ細胞株から分化誘導したヒト心外膜細胞を、ヒトｉＰＳ細胞由来胎児性心外膜とも呼ぶ。
　ｓｉＲＮＡの導入
　ｓｉＲＮＡのトランスフェクションアッセイでは、ヒトｉＰＳ細胞由来胎児性心外膜を１０ｃｍディッシュあたり０．８ｘ１０６個播種し、ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションを行った。トランスフェクションから２４時間後に新鮮な培地に交換した。ＣＤＫＮ１Ａを標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（センス鎖：CAAGGAGUCAGACAUUUUAtt（配列番号１）、アンチセンス鎖：UAAAAUGUCUGACUCCUUGtt（配列番号２））、およびＡｍｂｉｏｎ　Ｓｉｌｅｎｃｅｒ　Ｓｅｌｅｃｔに由来するネガティブコントロールＮｏ．１のｓｉＲＮＡ（４３９０８４３）を、製造者の指示に従って使用した。
　定量的ＲＴ－ＰＣＲ
　ＱＩＡｚｏｌ　ｌｙｓｉｓ　ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　ｑＰＣＲ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ｗｉｔｈ　ｇＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ＲＮＡ全量からｃＤＮＡを合成した。次に、Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて定量的ＲＴ－ＰＣＲを行った。遺伝子発現結果は、ΔΔＣｔ法で定量し、ＧＡＰＤＨで正規化した。
　使用したプライマーは以下の通りである。ＣＤＫＮ１Ａ：フォワード５’－ＡＧＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧ－３’（配列番号３）；リバース５’－ＧＣＧＴＴＴＧＧＡＧＴＧＧＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧ－３’（配列番号４）、ＷＴ１：フォワード５’－ＣＡＧＣＴＴＧＡＡＴＧＣＡＴＧＡＣＣＴＧ－３’（配列番号５）；リバース５’－ＧＡＴＧＣＣＧＡＣＣＧＴＡＣＡＡＧＡＧＴ－３’（配列番号６）、ＧＡＰＤＨ：フォワード５’－ＴＧＡＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧ－３’（配列番号７）；リバース５’－ＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＴＧＧＣＣＡＴ－３’（配列番号８）。
　ウエスタンブロット
　まず、細胞をＭ－ＰＥＲ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解して総タンパク質を得て、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　ＢＣＡ　Ｋｉｔ（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）で定量した。ウエスタンブロットのために、８μｇの総タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの各ウェルにロードした。使用した抗体および希釈倍率は以下の通りである：ｐ２１（１：１０００、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ＃２９４７）、ＷＴ１（１：1000、Abcam; ab89901）、β－アクチン（１：１０００、Ｓｉｇｍａ、Ａ５４４１）。
細胞増殖曲線アッセイ
　細胞増殖の経時曲線は、６ウェルプレート上で評価した。細胞を１ウェルあたり４×１０４個の密度で播種し、８日間、２４時間間隔でトリパンブルーによる全細胞数のカウントを行った。細胞増殖曲線は、細胞数を時間に対してプロットすることで作成した。播種後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、計数日にクリスタルバイオレットで染色した。値は、１０％　ＦＢＳ存在下で増殖した細胞の細胞増殖率として表した。０％は０日目の細胞数を意味する。
コロニー形成アッセイ
　細胞コロニー形成アッセイでは、１０ｃｍディッシュに５０００個の細胞を播種し、１０日間培養した。その後、コロニーを４％ＰＦＡで固定し、クリスタルバイオレットで染色してＩｍａｇｅ－Ｊによって計数した。
創傷治癒アッセイ
　６ウェルプレートに細胞を播種し、１００％コンフルエントになるまで培養した。次に、細胞単層をピペットチップでスクラッチし、手動で物理的な傷を作成した。スクラッチして０、１２、１６、２０、２４時間後に、スクラッチした領域を画像化した。最初の細胞がない領域と、１２、１６、２０、２４時間後の残存領域をＩｍａｇｅ－Ｊで定量化した。そして、移動する細胞が再集合したスクラッチ領域の割合（創傷閉鎖領域の割合）を、最初のスクラッチ領域に対して計算した。
ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析
　ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析でのデータの正規化はＮＯＩＳｅｑを用いて行った。成人心外膜データはＧＳＥコードＧＳＥ８４８４０８５のもと、解析のために公開されている。ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析の一次データは、マッピングと遺伝子発現解析のためにＲＳｔｕｄｉｏを用いて処理された。探索、読み込み、前処理のための遺伝子発現データは、ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析データのデータ解析および差分発現解析を行うためにＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＮＯＩＳｅｑを用いて処理された。Ｒスクリプトを用いて差分発現遺伝子（ＤＥＧ）をクラスタリングさせるためのヒートマップを描いた。
ＣＤＫＮ１Ａノックアウト（ＫＯ）マウス
　ＣＤＫＮ１Ａノックアウトマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た（#016565系統）。当該ノックアウトマウス系統のＣｄｋｎ１ａ遺伝子は、第２エクソンがネオマイシン耐性カセット（ｎｅｏカセット）に置換されている。また、遺伝的な背景が近似しているアイソジェニックなコントロールとして、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いた。
心外膜外植片
　ex vivoの外植片アッセイは、マウス１２日齢胚（Ｅ１２）の心臓を用いて行った。まず、マウスＥ１２の心臓を、１５％ＦＢＳを添加した低グルコースＤＭＥＭ中の、ゼラチンコートディッシュ上に置いた。２４時間以内に増殖した培養物が出現し、７日後に、顕微鏡下で外植片の長さを観察した。外植片の細胞は、自発的な上皮間葉転換（ＥＭＴ）を防ぐために、１０μＭのＳＢ４３１５４２を添加された培地で維持された。
（結果）＜実施例１＞
　ヒトｉＰＳ細胞由来胎児性心外膜に、ＣＤＫＮ１Ａを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＤＫＮ１Ａ）またはネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（コントロール）を用いて、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションアッセイを行い、ＣＤＫＮ１Ａの相対的なｍＲＮＡ発現量を定量的ＲＴ－ＰＣＲで測定した。その結果を図１に示す。
　また、各々のｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクションアッセイを行ったヒト心外膜細胞について、ｐ２１タンパク質およびＷＴ１タンパク質の量をウエスタンブロットにより計測した。結果を図２に示す。
　ｓｉＣＤＫＮ１Ａにより、ヒトｉＰＳ細胞由来胎児性心外膜におけるＣＤＫＮ１ＡのｍＲＮＡレベルでの発現量はコントロールと比較して５０％以下に減少し、ｐ２１タンパク質レベルでも同様の減少が見られた。
　次に、各々のｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクションアッセイを行ったヒトｉＰＳ細胞由来胎児性心外膜について、細胞増殖曲線アッセイを行い、細胞増殖曲線を作成した。結果を図３に示す。ＣＤＫＮ１Ａの発現を減少させることで、ヒト心外膜細胞の増殖能の有意な増加が見られた。
　同様に、ヒト心外膜細胞の生存性を測定するため、コロニー形成アッセイを行った。結果を図４に示す。ＣＤＫＮ１Ａの発現を減少させることで、ヒト心外膜細胞の生存性の有意な上昇が見られた。
　さらに、各々のｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクションアッセイを行ったヒトｉＰＳ細胞由来胎児性心外膜に対して、創傷治癒アッセイを行った。経時的な創傷閉鎖領域の割合を図５左に、０時間および２４時間後の創傷領域の写真を図５右に示す。
　ヒト心外膜細胞においてＣＤＫＮ１Ａの発現を減少させることで、スクラッチ後の２０時間後から２４時間にかけて創傷治癒能力の有意な上昇が見られた。
　さらに、ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析によって、細胞静止状態（ｃｅｌｌ　ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ）の遺伝子シグネチャーを検出するためのトランスクリプトーム解析を行った（図６）。ヒトｉＰＳ細胞由来胎児性心外膜と成人心外膜の比較を左図に、ヒトｉＰＳ細胞由来胎児性心外膜とｓｉＣＤＫＮ１Ａを用いてトランスフェクションアッセイを行ったヒトｉＰＳ細胞由来胎児性心外膜（ＣＤＫＮ１Ａ発現抑制：ｓｉＣＤＫＮ１Ａ群）の比較を右図に示す。
　細胞静止状態において発現減少する遺伝子群は、成人心外膜、ヒトｉＰＳ細胞由来胎児性心外膜、ｓｉＣＤＫＮ１Ａ群の順で遺伝子発現が低かった。また、細胞静止状態において発現増加する遺伝子群においても、成人心外膜、ヒトｉＰＳ細胞由来胎児性心外膜、ｓｉＣＤＫＮ１Ａ群の順で遺伝子発現が高かった。よって、成人心外膜、ヒトｉＰＳ細胞由来胎児性心外膜、ｓｉＣＤＫＮ１Ａ群の順で強く細胞静止状態にあり、言い換えれば、ｓｉＣＤＫＮ１Ａ群はヒト心外膜と比較して細胞静止状態から脱していることが遺伝子発現レベルで明らかとなった。
　以上より、ヒト心外膜細胞においてＣＤＫＮ１Ａの発現を減少させることで、その再生能を再活性化させ、創傷治癒能力を向上させうることが明らかになった。
（実施例２）
　ＣＤＫＮ１Ａノックアウトマウスのex vivo外植片アッセイを行った。まず、ＣＤＫＮ１Ａノックアウトマウス及びコントロールマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス）のＥ１２の心臓を用いて、ex vivoで心外膜外植片を作製し培養した。ＣＤＫＮ１Ａノックアウトマウス及びコントロールマウスについては、上記「ＣＤＫＮ１Ａノックアウト（ＫＯ）マウス」に記載の通りである。また、心外膜外植片の作製及び培養は、上記「心外膜外植片」に記載の手法で行った。次に、それぞれの心外膜外植片について、ｐ２１タンパク質およびＷＴ１タンパク質の量をウエスタンブロットにより計測した。結果を図７に示す。
　ＣＤＫＮ１Ａノックアウトマウスから得た心外膜外植片では、ｐ２１タンパク質がほとんど見られず、ＣＤＫＮ１Ａノックアウトによる効果と一致した。
　また、作製したそれぞれの心外膜外植片について、培養から７日後に顕微鏡下で観察した外観を図８に示す。コントロールと比較して、ＣＤＫＮ１Ａノックアウトマウスから得られた心外膜外植片はより増殖速度が速く、２倍近い外植片の長さを示したことから、高い再生能を示唆する。
　以上より、ＣＤＫＮ１Ａの発現を減少ないし消失させることで、心外膜細胞の再生能を再活性化させ、創傷治癒能力を向上させうることが、マウスＥ１２心臓を用いて作製された心外膜外植片でも確認された。

Claims (12)

  1. 　ｐ２１阻害物質を含む、心外膜細胞再生促進剤。
  2. 　前記ｐ２１阻害物質が、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現阻害物質である、請求項１に記載の心外膜細胞再生促進剤。
  3. 　前記ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現阻害物質が、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ配列を含む核酸である、請求項２に記載の心外膜細胞再生促進剤。
  4. 　前記ｓｉＲＮＡ配列は、配列番号１に記載の配列を有するセンス鎖および配列番号２に記載の配列を有するアンチセンス鎖を含む、請求項３に記載の心外膜細胞再生促進剤。
  5. 　前記ｐ２１阻害物質が、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのためのガイドＲＮＡを含み、前記ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのためのガイドＲＮＡは、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子を標的として設計されたガイドＲＮＡである、請求項１または２に記載の心外膜細胞再生促進剤。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の心外膜細胞再生促進剤を含む、心臓の損傷を治療するための医薬組成物。
  7. 　in vitroで心外膜細胞の再生を促進するための方法であって、
    　前記心外膜細胞においてｐ２１を阻害する工程を含む、方法。
  8. 　前記ｐ２１を阻害する工程が、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現を阻害することによって行われる、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の発現の阻害が、ｓｉＲＮＡを前記心外膜細胞に導入することにより達成される、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記ｐ２１を阻害する工程が、前記心外膜細胞にＣＤＫＮ１Ａ遺伝子を標的として設計されたガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素を導入することによって行われる、請求項８に記載の方法。
  11. 　再生能が高められた心外膜細胞を製造するための方法であって、
    　Ａ）心外膜細胞を提供する工程、および
    　Ｂ）工程Ａ）の心外膜細胞においてｐ２１を阻害する工程を含む、方法。
  12. 　工程Ａ）の心外膜細胞が多能性幹細胞から分化誘導された心外膜細胞である、請求項１１に記載の方法。
     
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