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WO2019073071A1 - Polymere antimicrobien pour semences animales - Google Patents

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Publication number
WO2019073071A1
WO2019073071A1 PCT/EP2018/077969 EP2018077969W WO2019073071A1 WO 2019073071 A1 WO2019073071 A1 WO 2019073071A1 EP 2018077969 W EP2018077969 W EP 2018077969W WO 2019073071 A1 WO2019073071 A1 WO 2019073071A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polymers
antimicrobial
poly
animal
additive according
Prior art date
Application number
PCT/EP2018/077969
Other languages
English (en)
Inventor
Quentin COURRIER
Original Assignee
Biodesiv Efnium
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biodesiv Efnium filed Critical Biodesiv Efnium
Publication of WO2019073071A1 publication Critical patent/WO2019073071A1/fr

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/12—Chemical aspects of preservation
    • A01N1/122—Preservation or perfusion media
    • A01N1/124—Disinfecting agents, e.g. antimicrobials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/52—Sperm; Prostate; Seminal fluid; Leydig cells of testes

Definitions

  • the present invention provides an additive for the preservation of animal seeds as total or partial substitution of antibiotic compounds.
  • This additive exhibiting an antimicrobial effect contains one or more synthetic polymers having an antimicrobial effect. It also has good solubility in the animal semen or in the medium for administering or preserving the animal semen, as well as total safety with respect to the spermatozoa so as not to compromise the viability of the animal semen as well as retained.
  • the field of application of the present invention is that of animal breeding by artificial insemination in the field of practice of veterinarians and specialists in insemination.
  • Animal husbandry both for the agri-food industry (rabbits, pigs, cattle) and for pleasure, sports or some work (horses, dogs) commonly use insemination for the reproduction of animals. animals to maintain selected phenotypic or genotypic characteristics.
  • sperm mixed with seminal plasma After collection of the animal semen, sperm mixed with seminal plasma have a very short life span. They should therefore be incorporated into an environment that can prolong their survival and maintain their functionality. In addition, the semen taken from males is not systematically used directly for insemination, it is then necessary to treat it to allow its conservation.
  • the sperm preservation medium must provide the necessary energy for the proper functioning and maintenance of cells, have a buffer system to prevent large pH variations, avoid the development of microbial germs and have an adequate ionic balance .
  • the prior art very widely describes the conservation of the seed in the liquid state in diluents of different compositions, as well as the preservation in the frozen state which also implements freezing and thawing diluents and various techniques. of preparation and conditioning of the seed. There are as many diluents as there are processes for doing this and in particular the conditioning of the seed with a diluter combined with the preservation of the mixture at low temperature (refrigeration, freezing, cryogenisation).
  • Each diluter provides the sperm with the nutrients and protectors allowing their survival after freezing.
  • the seed naturally contains different microorganisms, including bacteria and viruses, the development of which can alter the quality of the seed.
  • bacteria compete with spermatozoa by consuming the nutrients they need and, on the other hand, they can release substances that are toxic to spermatozoa.
  • the presence of microbes may also be the cause of disease transmission between the seed donor and the inseminated animal; the disease is transmitted more quickly than a seed donor is used to fertilize many females.
  • the defrosting step reactivates many mechanisms in dormancy and makes the microbes more virulent, which again risks contaminating the animal semen sample and compromising the quality of the spermatozoa.
  • antibacterial additives are antibiotic compounds chosen to eliminate or destroy the microbes conventionally present in the seed while affecting at least the quality of the spermatozoa.
  • antibiotics are found in the diluents: aminoglycosides or aminoglycosides, the most common of which are gentamicin sulfate (or gentamicin, typically dosed at 250 mg / l of diluent), streptomycin ( typically dosed at 1000 mg / L diluent), dibekacin, amikacin and apramycin; beta-lactams, the most common of which is penicillin (typically dosed at 625mg / L diluent).
  • Other additives of the fluoroquinolone family may be included in the diluents as antibiotics.
  • Patent application PCT / US2002 / 000777 describes a seed dilator comprising an amount of phospholipid protecting the sperm cell, an effective amount of surfactant reducing the formation of ice crystals during the freezing of the composition, a hydrate of carbon and a biological buffer conferring the solution use of the diluent a pH of from about 6.9 to about 7.5 and an osmolarity of from about 250 mOsM to about 350 mOsM.
  • Antibiotics such as gentamycin, tylosin, lyncomycin or spectinomycin are provided in this diluter.
  • the patent FR2813756 describes a liquid diluent for the preservation of porcine sperm which contains a preservative, a liquid antibiotic formulation, at least one salt and at least one antioxidant agent.
  • the preservative is a phospholipid (cyclohexanols, choline, ethanolamine and serine)
  • the antibiotic is chosen from enrofloxacin, lincomicyne and spectinomycin
  • the carbohydrate is chosen from sucrose, tralose, raffmose, glucose and fructose .
  • This diluter contains antibiotics.
  • Patent FR2720407 describes a medium for non-autonomous microorganisms, such as gametes and embryos, to be kept alive outside their natural environment and capable of being kept ready for use for prolonged periods, this medium including, in particular nutrition agents, buffers and mineral salts, a protective product in the form of a lecithin extracted from soybeans. This medium is particularly well suited to the conservation of cattle spermatozoa.
  • Patent application PCT / CN2016 / 000657 describes a freezing diluent for the semen of farmed species.
  • This diluent contains trihydroxymethyl aminomethane, citric acid, monosaccharide, fresh yolk, a permeable protection agent, penicillin, streptomycin, polyvinyl alcohol and ultrapure water.
  • a high molecular weight polyvinyl polymer is used here as an ice crystal inhibitor instead of a natural antifreeze protein. This polymer is in no way a substitute for an antimicrobial agent since penicillin and streptomycin are also used in this diluter.
  • Patent Application RU2177277 describes the use of an antibacterial preparation containing apramycin and eremomycin for the dilution and cryopreservation of animal semen. Again a mixture of known antibiotics is used to ensure the survival and conservation of sperm from the semen sample.
  • Patent application CN 104322483 discloses a diluter for boar semen containing alpha-D-glucopyranose powder, fructose, trisodium citrate dihydrate, disodium ethylenediamine tetraacetic acid, sodium bicarbonate polyvinyl alcohol, trishydroxymethylaminomethane, inositol, vitamin C, arginine, radix isatidis extract and ceftiofur sodium, and finally ribavirin.
  • the formula includes Rich nutrients, antibacterial components of Chinese medicine (Radix Isatidis, whose main active constituent is Onjisaponin B) and Western antibacterial components (Ribavirin, Ceftiofur sodium), thus ensuring the normal metabolism of sperm.
  • additives with antibacterial or antiviral properties such as plant extracts or peptides, with properties that promote the effectiveness of conserved spermatozoa such as indoles, lecithins or phospholipids, with favorable properties.
  • freezing or cryogenization such as polyvinyl alcohol, for the preservation of animal semen samples.
  • the prior art does not describe a substitute for the use of antibiotics for the preservation of animal semen.
  • Iodine is known to react with chemical functions (NH.sub.2.sup.- S-11 or carbon-carbon double bond, etc.) carried by the amino acids comprising in particular the proteins that inhibit or disrupt the activity of said proteins.
  • Hydrogen peroxide is at the same time oxidizing, reducing, acidic and because of its instability, it can decompose in particular radicals H °, HO ° or HOO °; hydrogen peroxide can therefore very easily react with biological substances, especially proteins, and denature them. In any case, since these proteins are involved in the biological processes of pathogens, their denaturation leads to the inactivation or death of the pathogen.
  • Iodine is the most commonly used, hydrogen peroxide is usually used in combination with iodine, the latter increasing the antimicrobial efficacy of iodine.
  • These nonpolymeric molecules are conventionally used in admixture with one or more organic molecules. When it comes to iodine, we bet then iodophore. Iodophor is defined as the product resulting from the combination of iodine with a complexing agent or solubilizer.
  • nonpolymeric molecules mixed with a polymer it will be classically used as iodopliores natural polymers such as albumin or synthetic such as povidone or PVP derivatives.
  • These polymers serve primarily as a vector of the antimicrobial agent (iodine or hydrogen peroxide) to the biological fluid to be treated. By complexing the antimicrobial agent, it improves its solubility in the biological fluid to be treated then it relays the antimicrobial agent in the biological fluid to be treated.
  • These polymers can also play a role in protecting the biological substances to be treated against their damage by the antimicrobial agent, the latter, given its mode of action, which can alter both the proteins of the pathogens to be eliminated and those of the biological substances. present in the biological fluid to be treated.
  • these polymers can serve as an adsorbent of the antimicrobial agent (iodine or hydrogen peroxide) to partially or completely remove the biological fluid to be treated.
  • antimicrobial agent iodine or hydrogen peroxide
  • these polymers do not possess intrinsic antimicrobial activity but fulfill functions of technological aids to enable, improve or control the antimicrobial power of non-polymeric antimicrobial molecules such as iodine.
  • these complexes for example of the povidone-iodine type
  • these complexes are obtained by simple mixing between the antimicrobial agent and the polymer; the antimicrobial agent is simply complexed by the polymer and not grafted thereto which would imply a chemical reaction between the antimicrobial agent and the polymer.
  • the objective is that the antimicrobial agent is salted out in its initial form in the biological solution to be treated so that it retains its antimicrobial activity.
  • the iodine thus retains its chemical structure 12.
  • natural or synthetic effects have many disadvantages. In the first place they promote the development of resistant bacteria, because of the chemical action on the microbes (bacteria and viruses) within the sample. The solution to this problem is to increase the concentrations of these substances or to regularly introduce new antimicrobial molecules into the diluter.
  • the antimicrobial molecules can cross the walls of the organs of the inseminated female (vagina, uterus) and end up in the blood of animals with multiple effects on the health of the animal and / or the consumer if inseminated animals or born from insemination are consumed by humans or other animals.
  • these antimicrobial compounds are effective only in high doses, typically from 100 to 1000 mg / L of diluent, their presence is therefore not innocuous and of no consequence for the inseminated animal and its offspring.
  • substances with antimicrobial effects are also disseminated in the environment since they are hardly stopped by the treatment plants. There is therefore a real need to reduce or even eliminate the antimicrobial compounds, especially antibiotics, in the artificial insemination procedure and in the preservation of the seed that is used.
  • these substances are particularly expensive and are therefore incompatible with the economic constraints of the field.
  • the present invention describes an antimicrobial additive for the preservation of animal semen, in substitution for the antibiotic compounds of the prior art, which can be used alone or in a diluter.
  • This additive consists of at least one synthetic polymer with antimicrobial activity solubilized in animal semen or in a medium for administering or preserving said seed, selected from polycationic polymers, polyanionic polymers or polymers on which substances are grafted. antimicrobial.
  • synthetic polymers with antimicrobial properties are effective in very small quantities while ensuring the complete functionality of sperm, which is a definite advantage over the compositions of the prior art.
  • This invention has many advantages over the diluent compositions described in the prior art.
  • an additive consisting of at least one synthetic polymer with antimicrobial effects limits the phenomenon of resistance because the synthetic polymers have a physico-chemical mode of action with respect to microbes, so vis-à-vis bacteria, viruses and fungi. They adsorb on the surface of microbes and can agglomerate them according to their relative concentrations.
  • the synthetic polymer interacts with the microbe membrane damaging it, leading to the destruction of the microbe.
  • Another interesting effect is that neither the inseminated animal nor its offspring are contaminated by the synthetic polymer because these polymers are macromolecules, typically having a molecular weight of from about 10,000g / mol to about 100,000g / mol per polymer chain, then that natural or synthetic antibiotics and antivirals have a molecular molar mass of the order of a few 100g / mol to 2000g / mol.
  • the large size of the synthetic polymers according to the invention prevents their migration through the tissues of the animal and their dissemination in other parts of the body.
  • the Synthetic polymers according to the invention are eliminated by the natural routes of the animal.
  • the synthetic antimicrobial polymers according to the invention are effective at low concentration, of the order of 1 mg / l of diluent to some 10 mg / l of diluent, whereas antibiotics and antivirals are commonly used at higher concentrations to be effective.
  • the synthetic polymers according to the invention retain the quality of the seed without any alteration and thus the reproductive performance of the seed (fertility and prolificity) because their effect is not spermicidal and retains the motility of spermatozoa.
  • the synthetic polymers according to the invention are perfectly soluble in conventional diluent compositions and are ecological in the sense that, because of their large size, these polymers are easily blocked during the treatment of water in the treatment plant. They are also perfectly inert. The last advantage is that the polymers according to the invention are not irritating to the mucous membranes of the inseminated animal.
  • the polymers according to the present invention are chosen from synthetic polymers exhibiting antimicrobial activity with respect to bacteria or viruses naturally present in animal seeds, good solubility in the formulation of diluents and safety against spermatozoa in the body. semen ie not spermidicity and not decreased sperm motility.
  • These synthetic polymers with antimicrobial properties are typically selected from the family of polycationic polymers, polyanionic or polymers on which are grafted antimicrobial substances, along the polymer chain or at the end of chain.
  • the present invention describes an antimicrobial additive for the conservation of animal seeds which consists of at least one synthetic polymer with antibacterial activity soluble in animal semen or in a medium for administering or preserving animal semen, selected from polycationic polymers, polyanionic polymers or polymers on which antimicrobial substances are grafted.
  • synthetic polymers with antibacterial activity soluble in animal semen or in a medium for administering or preserving animal semen, selected from polycationic polymers, polyanionic polymers or polymers on which antimicrobial substances are grafted.
  • the synthetic polymers according to the invention can be used in combination with other antimicrobial substances such as antibiotics to reduce the concentration or as peptides to reduce the cost of the antimicrobial preparation. It is also possible to obtain synergistic effects.
  • synthetic polymer is meant in the present invention a large molecule consisting of basic units called monomers connected by covalent bonds.
  • monomers connected by covalent bonds.
  • the synthetic polymers according to the present invention specifically exclude pure natural polymers but include naturally occurring polymers having undergone chemical transformations (functionalization reaction, for example deacetylation of chitin to obtain chitosan).
  • Polypeptides and polysaccharides are specifically excluded from this definition of synthetic polymers, so that the monomers can in no case be amino acids or monosaccharides unless the latter have been polymerized with one another by direct action or indirect human or if they have been copolymerized with synthetic monomers because in these two cases, the spolymers formed meet the definition of synthetic epoymers according to the invention.
  • These synthetic polymers may be homopolymers in which all monomers are the same or copolymers whose units consist of monomers of two or more different kinds, or two or more chemically different monomers.
  • These synthetic polymers may be linear, branched or crosslinked.
  • the invention describes an antimicrobial additive for the conservation of animal seeds which consists of at least one synthetic polymer dissolved in the animal semen or in a medium for administering or preserving the animal semen, polymer being neither a polypeptide nor a polysaccharide.
  • polymers on which are grafted antimicrobial substances synthetic polymers, excluding polypeptides and polysaccharides, on which are grafted antibacterial functions with strong bonds; in other words, they are not simple mixtures between an antibacterial compound and a polymer (for example: iodophors) with weak bonds.
  • polymers on which are grafted antimicrobial substances undergo a chemical modification that incorporates antibacterial functions in their structure.
  • synthetic anionic polymers are meant polymers which carry negatively charged groups and by synthetic cationic polymers are meant polymers which carry positively charged groups.
  • Synthetic polymers on which antimicrobial functions are grafted are polymers whose general structure does not has no antimicrobial activity but on which groups having said antimicrobial functions are grafted; these groups can be grafted at the end of the chain, on the main chain or on ramifications.
  • diluent in the present invention a diluent that provides the energy necessary for the proper functioning and maintenance of spermatozoa life, which has a buffer system prohibiting large variations in pH and has an adequate ionic balance .
  • antimicrobial function or antimicrobial effect is meant in the present invention the ability to eliminate or at least significantly reduce the proliferation of microbes.
  • the microbes involved may be bacteria, viruses, yeasts, fungi or parasites. In the case of the seed the microbes are more particularly viruses and bacteria, which are generally contained in the natural state in the seminal fluid. Without the artificial insemination step, said microbes would be transmitted naturally from the male to the female during copulation.
  • An additive according to the present invention contains a synthetic polymer having an antimicrobial effect that can be selected from quaternary ammonium salts such as:
  • diallyldimethylammonium chloride or DDA diallyldimethylammonium chloride or DDA
  • DDA diallyldimethylammonium chloride
  • poly (diallyldimethylammonium chloride) or PDDA homopolymer
  • poly [acrylamide-co- (diallyldimethylammonium chloride)] as a copolymer with a water-soluble monomer (acylamide)
  • acylamide acylamide
  • An additive according to the present invention contains a polymer having an antimicrobial effect that can be selected from phosphonium salts such as:
  • an additive according to the present invention contains a polymer exhibiting an antimicrobial effect whose antimicrobial functions are conferred by acid or aldehyde functions carried by the polymer chains, e.g. polymers or copolymers grafted with benzaldehyde derivatives such as 4-hydroxybenzaldehyde or 2,4-dihydroxybenzaldehyde, polymers or copolymers grafted with salicylic acid or polymers or copolymers grafted with 4-aminobenzoic acid. Polymers such as those cited by Brodkorb et al.
  • the polymer is selected from quaternary ammonium salts, phosphonium salts and polymer chains which are soluble in animal semen or in a medium of administration or preservation of said seed, on which are grafted antimicrobial functions of acid, aldehyde or aminoalkyl type
  • an additive according to the invention contains at least one polymer which is selected from quaternary ammonium salts said polymer is a homopolymer or copolymer based on 2- (dimethylamino) ethyl methacrylate, based on 2- (dimethylamino) acrylate ethyl, based on diallyldi
  • the polymer is selected from a quaternary salt of poly (2- (dimethylamino) ethyl methacrylate) (CAS 25154-86-3), poly (2- (dimethylamino) ethyl methacrylate methyl chloride) also called poly [chloride of 2- (methacryloyloxy) ethyl] trimethylammonium) or PDMAEMAq (CAS 26161-33-1), poly [(2-ethyldimethylammonioethyl ethyl methacrylate sulfate) -co- (1-vinylpyrrolidone)] (CAS 53633-54-8), poly ( 2- (dimethylamino) ethyl acrylate), poly [2- (acryloyloxy) ethyl] trimethylammonium chloride), poly (diallyldimethylammonium chloride) or PDDA, poly [acrylamide-co- (diallyldimethylammonium chloride)]
  • an additive according to the invention contains at least one polymer which is selected from phosphonium salts
  • the polymer is a copolymer of tributyl (4-vinylbenzyl) phosphonium chloride with acrylamide or a copolymer of methacryloyloxyethyl trioctyl phosphonium chloride with acrylamide.
  • an additive according to the invention contains one or more polymer chains on which antibacterial functions are grafted
  • said polymer is selected from polymers or copolymers grafted with benzaldehyde derivatives such as 4-hydroxybenzaldehyde or 2, 4-dihydroxybenzaldehyde, with salicylic acid, with 4-aminobenzoic acid or with an aminoalkyl group.
  • the polymers according to the present invention can be dissolved in the diluter or fixed on substrates placed in contact with the seed or the diluent: on solid or porous particles, on fibers, on films or on foams. In all cases the additive will mix with the seed or the diluter.
  • the present invention also describes a method of storing an animal semen sample which comprises the following steps:
  • This method can also be used with a diluter.
  • the invention describes a method of storing an animal semen sample which comprises the following steps:
  • the above method also comprises a step of preparing the diluent, whether or not containing antibiotics, before adding the additive according to the invention.
  • the invention describes a method for preserving an animal semen sample which comprises the following steps: preparation of a diluent containing or not antibiotics and an additive according to the invention, and then
  • an additional step of refrigeration, freezing or cryogenization is performed on the animal semen sample.
  • the invention describes a method of storing an animal semen sample which comprises the following steps:
  • a variant of the latter method is the preparation of a diluent containing one or more antibiotics in which one or more polymers according to the invention are added in order to broaden the spectrum of action.
  • the invention describes a method of storing an animal semen sample which comprises the following steps:
  • the present study aims to show the antimicrobial properties of polymers according to the invention.
  • the antimicrobial properties are evaluated on different bacteria and yeasts, classically present in mammalian seeds: ⁇ Gram -:
  • the bacteria and yeasts were cultured in suspension in a nutrient liquid and each polymer dissolved in the mixture. The solution was stirred for 24h at a temperature of 37 ° C.
  • the polymers according to the invention used here are the following:
  • Table 1 shows the effect of the polymers according to the invention on gram negative bacteria.
  • Table 2 shows the effect of the polymers according to the invention on gram-positive bacteria.
  • Table 3 shows the effect of the polymers according to the invention on a very wide variety of yeast.
  • Table 1 Antimicrobial Properties on Gram Negative Bacteria
  • the antibacterial effect of the 4 polymers according to the invention is 99% on all the gram negative bacteria tested.
  • the antibacterial effect of the 4 polymers according to the invention is 99% on all the gram-positive bacteria tested.
  • the antimicrobial effect on yeasts (or antifungal or antimycete effect) of the polymers according to the invention is 99% on the yeast species Candida Albicans.
  • An aqueous solution is produced containing: o 5 mg / l of PMAETP-AA
  • the 3 polymers according to the invention used here are the following:
  • a mixture is obtained which makes it possible to obtain a broad spectrum of efficacy, on gram-positive bacteria, on gram-negative bacteria and on yeasts.
  • This mixture constitutes an additive according to the invention containing several polymers.
  • This additive may be added to a sperm sample for direct use or added to a diluent for storage of the sperm sample for later use.
  • Example 3 Evaluation of the antimicrobial properties of a polymer blend and its effect on seed quality
  • Bovine semen T-sample
  • Bovine semen T-sample
  • sample A in a standard diluent containing a streptomycin antibiotic dosed at 1 mg / ml
  • Sample B in a diluent of the same composition with the exception of the antibiotic, replaced by the polymer mixture from example 2, dosed at 10 mg / L
  • sample C in a diluent of the same composition containing no antibiotic After dilution, all four semen samples were cooled to 5 ° C and stored for 72h. The quality of each of the samples after 72h was evaluated according to the following parameters:
  • T samples before dilution, A after 72 hours of incubation, B after 72 hours of incubation and C after 72 hours of incubation were cultured on a Petri dish packed with a nutrient medium in order to perform a colony count. having developed after 48 hours at 37 ° C.
  • the sample T represents the initial concentration of microbes of the ejaculate, either a measurement carried out before adding an additive or dissolving in a diluent. These microbes are naturally present in bovine semen.
  • the polymers according to the invention may have an effect at least equivalent to or even greater than that of the antibiotics conventionally used in diluents for the preservation of animal sperm.

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Abstract

La présente invention propose un additif pour la préservation des semences animales en substitution totale ou partielle de composés antibiotiques. Cet additif présentant un effet antimicrobien contient un ou plusieurs polymères synthétiques présentant un effet antimicrobien. Il présente également une bonne solubilité dans la semence animale ou dans le milieu d'administration ou de conservation de la semence animale, ainsi qu'une totale innocuité vis-à-vis des spermatozoïdes afin de ne pas compromettre la viabilité de la semence animale ainsi conservée.

Description

Polymère antimicrobien pour semences animales
La présente invention propose un additif pour la préservation des semences animales en substitution totale ou partielle de composés antibiotiques. Cet additif présentant un effet antimicrobien contient un ou plusieurs polymères synthétiques présentant un effet antimicrobien. Il présente également une bonne solubilité dans la semence animale ou dans le milieu d'administration ou de conservation de la semence animale, ainsi qu'une totale innocuité vis-à-vis des spermatozoïdes afin de ne pas compromettre la viabilité de la semence animale ainsi conservée.
Le domaine d'application de la présente invention est celui de la reproduction animale par insémination artificielle dans le champ d'exercice des vétérinaires et spécialistes de l'insémination. Les élevages d'animaux, aussi bien à destination de l'industrie agroalimentaire (lapins, porcs, bovins) que pour l'agrément, les disciplines sportives ou certains travaux (chevaux, chiens) ont couramment recours à l'insémination pour la reproduction des animaux en vue du maintien de caractéristiques phénotypiques ou génotypique sélectionnées.
Après la collecte de la semence animale, les spermatozoïdes mélangés au plasma séminal ont une très faible durée de vie. Il convient donc de les incorporer à un milieu susceptible de prolonger leur survie et de maintenir en vigueur leurs fonctionnalités. Par ailleurs, la semence prélevée sur les mâles n'étant pas systématiquement utilisée directement pour une insémination, il est alors nécessaire de la traiter pour permettre sa conservation.
Pour être efficace, le milieu de conservation des spermatozoïdes doit fournir l'énergie nécessaire au bon fonctionnement et au maintien en vie des cellules, avoir un système tampon interdisant les fortes variations de pH, éviter le développement des germes microbiens et présenter un équilibre ionique adéquat. L'art antérieur décrit très largement la conservation de la semence à l'état liquide dans des dilueurs de différentes compositions, ainsi que la conservation à l'état congelé qui elle aussi met en œuvre des dilueurs de congélation et de décongélation ainsi que différentes techniques de préparation et de conditionnement de la semence. II existe autant de dilueurs que de procédés pour ce faire et notamment le conditionnement de la semence avec un dilueur combiné à la conservation du mélange à basse température (réfrigération, congélation, cryogénisation). Chaque dilueur fournit aux spermatozoïdes les éléments nutritifs et protecteurs permettant leur survie après congélation. Cependant, la semence contient naturellement différents microorganismes, notamment des bactéries et virus, dont le développement peut altérer la qualité de la semence. En effet, d'une part les bactéries entrent en compétition avec les spermatozoïdes en consommant les nutriments qui leurs sont nécessaires et d'autre part elles peuvent libérer des substances toxiques pour les spermatozoïdes. La présence de microbes peut également être la cause de la transmission de maladies entre l'animal donneur de semence et l'animal inséminé ; la maladie se transmettant d'autant plus vite qu'un donneur de semence sert à la fécondation de nombreuses femelles. Enfin l'étape de décongélation réactive beaucoup de mécanismes en dormance et rend les microbes plus virulents ce qui risque une nouvelle fois de contaminer l'échantillon de semence animale et de compromettre la qualité des spermatozoïdes. Pour empêcher ou tout du moins minimiser ces inconvénients, il est d'usage d'utiliser des additifs antibactériens pour éliminer les microbes ou limiter leur développement au sein de la semence ou du mélange spermatozoïdes/dilueur. Ces additifs antibactériens sont des composés antibiotiques choisis pour éliminer ou détruire les microbes classiquement présents dans la semence tout en affectant au minimum la qualité des spermatozoïdes. A titre d'exemple et de manière non exhaustive, on retrouve dans les dilueurs, les antibiotiques suivant : aminoglycosides ou aminosides dont les plus courants sont le sulfate de gentamicine (ou gentamicine, typiquement dosée à 250mg/L de dilueur), la streptomycine (typiquement dosée à 1000mg/L de dilueur), la dibekacine, l'amikacine et l'apramycine ; les béta-lactames dont le plus courant est la pénicilline (typiquement dosée à 625mg/L de dilueur). D'autres additifs de la famille des fluoroquinolones peuvent entrer dans la composition des dilueurs en tant qu'antibiotiques. Il est également d'usage d'utiliser des antibiotiques seuls ou en mélange afin d'obtenir un spectre d'efficacité plus large. La demande de brevet FR2725342 décrit l'utilisation de dérivés d'indole pour la préparation de dilueurs de sperme qui permettent d'améliorer la conservation des spermatozoïdes. Ces dérivés ne présentent aucune activité antimicrobienne, ils ne sont pas des substituts d'antibiotiques, et sont simplement ajoutés aux composants connus de l'art antérieur pour améliorer les performances des spermatozoïdes. La demande de brevet PCT/US2002/000777 décrit un dilueur de semence comportant une quantité de phospholipide protectrice de la cellule spermatique, une quantité efficace de tensio-actif réduisant la formation de cristaux de glace lors de la congélation de la composition, un hydrate de carbone et un tampon biologique conférant à la solution d'utilisation du dilueur un pH compris entre environ 6,9 et environ 7,5 et une osmolarité comprise entre environ 250 mOsM et environ 350 mOsM. Des antibiotiques tels la gentamycine, la tylosine, la lyncomycine ou la spectinomycine sont prévus dans ce dilueur.
Le brevet FR2813756 décrit un dilueur liquide pour la conservation de spermatozoïdes porcins qui contient un conservateur, une formulation antibiotique liquide, au moins un sel et au moins un agent antioxydant. Le conservateur est un phospholipide (cyclohexanols, choline, éthanolamine et sérine), l'antibiotique est choisi parmi l'enrofloxacine, la lincomicyne et la spectinomycine, le carbohydrate est choisi parmi le saccharose, le tréalose, le raffmose, le glucose et le fructose. Ce dilueur contient des antibiotiques. Le brevet FR2720407 décrit un milieu pour micro-organismes non autonomes, tels que gamètes et embryons, à maintenir vivants en dehors de leur milieu naturel et susceptibles d'être conservés prêts à l'emploi sur des périodes prolongées, ce milieu comprenant, outre notamment des agents de nutrition, des tampons et des sels minéraux, un produit protecteur sous la forme d'une lécithine extraite de graines de soja. Ce milieu est particulièrement bien adapté à la conservation des spermatozoïdes de bovins.
La demande de brevet PCT/CN2016/000657 décrit un dilueur de congélation pour la semence d'espèces d'élevage. Ce dilueur contient du trihydroxyméthyl aminométhane, de l'acide citrique, du monosaccharide, du jaune d'oeuf frais, un agent de protection perméable, de la pénicilline, de la streptomycine, de l'alcool polyvinylique et de l'eau ultrapure. Un polymère polyvinylique à haut poids moléculaire commun est utilisé ici comme inhibiteur de cristaux de glace au lieu d'une protéine antigel naturelle. Ce polymère n'est en aucun cas un substitut à un agent antimicrobien puisque de la pénicilline et de la streptomycine sont également utilisées dans ce dilueur.
La demande de brevet RU2177277 décrit l'utilisation d'une préparation antibactérienne contenant de l'apramycine et de l'eremomycine pour la dilution et la cryoconservation de la semence animale. Là encore un mélange d'antibiotiques connus est utilisé pour assurer la survie et la conservation des spermatozoïdes de l'échantillon de semence.
La demande de brevet CN 104322483 décrit un dilueur pour la semence de verrat contenant de la poudre d'alpha-D-glucopyranose, du fructose, du citrate de trisodium dihydraté, de l'acide éthylènediamine tétraacétique disodique, du bicarbonate de sodium, de l'alcool polyvinylique, du trishydroxyméthylaminométhane, de l'inositol, de la vitamine C, de l'arginine, de l'extrait de radix isatidis et de ceftiofur sodium, et enfin de la ribavirine. La formule comprend des nutriments riches, des composants antibactériens de médecine chinoise (Radix Isatidis, dont le constituant actif principal est le Onjisaponin B) et occidentale et des composants antibactériens (Ribavirine, Ceftiofur sodium), assurant ainsi le métabolisme normal du sperme. On connaît donc de l'art antérieur l'utilisation d'additifs aux propriétés antibactériennes ou antivirales tels des extraits de plantes ou des peptides, aux propriétés favorisant l'efficacité des spermatozoïdes conservés tels des indoles, des lécithines ou des phospholipides, aux propriétés favorisant la congélation ou la cryogénisation tels l'alcool polyvinylique, pour la conservation d'échantillons de semence animale. Cependant l'art antérieur ne décrit pas de substitut à l'utilisation d'antibiotiques pour la conservation de la semence animale.
On connaît également de l'art antérieur l'utilisation de polymères naturels comme les polysaccharides (demandes de brevet WO 2010/139956 ou WO 97/14785) ou encore les polypeptides naturels communément appelés protéines naturelles (demandes de brevet WO 98/37904 ou WO 2015/181558). Cependant l'art antérieur ne décrit pas de substitut à l'utilisation d'antibiotiques pour la conservation de la semence animale car il n'est pas du tout évident que l'une des molécules naturelle ou synthétique décrites ci-dessus permettent à la fois la protection et la conservation des propriétés de la semence animale.
On connaît de plus de l'art antérieur l'utilisation de molécules non polymériques comme l'iode (demandes de brevet WO 00/16812, WO 92/04031 , WO 93/17693 ou WO 97/48482 et brevet US 5,360,605) ou le peroxyde d'hydrogène (demande de brevet WO 94/00161) en tant qu'agents antimicrobiens. L'iode est connu pour réagir avec des fonctions chimiques ( N-H. S- 11 ou double liaison carbone-carbone, etc.) portées par les acides aminés composant notamment les protéines inhibant ou perturbant l'activité desdites protéines. Le peroxyde d'hydrogène est à la fois oxydant, réducteur, acide et du fait de son instabilité, il peut se décomposer notamment en radicaux H°, HO° ou HOO°; le peroxyde d'hydrogène peut donc très facilement réagir avec des substances biologiques, notamment des protéines et les dénaturer. Dans tous les cas, ces protéines étant impliquées dans les processus biologiques des agents pathogènes, leur dénaturation mène à i'inactivation ou à la mort de l'agent pathogène. L'iode est le plus couramment utilisé, le peroxyde d'hydrogène est habituellement utilisé en combinaison avec l'iode, ce dernier augmentant l'efficacité anti microbienne de l'iode. Ces molécules non polymériques sont classiquement utilisées en mélange avec une ou plusieurs molécules organiques. Lorsqu'il s'agit d'iode, on parie alors d'iodophore. L'iodophore est défini comme le produit résultant de l'association d'iode avec un agent complexant ou solubilisant.
Dans ce contexte d'utilisation de molécules non polymériques mélangés avec un polymère, on utilisera classiquement comme ïodopliores des polymères naturels comme l'albumine ou synthétiques comme les dérivés de povidone ou PVP. Ces polymères servent en premier lieu de vecteur de l'agent antimicrobien (iode ou peroxyde d'hydrogène) vers le fluide biologique à traiter. En complexant l'agent antimicrobien, il améliore sa solubilité dans le fluide biologique à traiter puis il relargue l'agent antimicrobien dans le fluide biologique à traiter. Ces polymères peuvent également assurer un rôle de protection des substances biologiques à traiter contre leur endommagement par l'agent antimicrobien, ce dernier, étant donné son mode d'action, pouvant altérer aussi bien les protéines des agents pathogènes à éliminer que celles des substances biologiques présentes dans le fluide biologique à traiter. Enfin, ces polymères peuvent servir d'adsorbant de l'agent antimicrobien (iode ou peroxyde d'hydrogène) pour le retirer partiellement ou totalement du fluide biologique à traiter. En conclusion, ces polymères ne possèdent pas d'activité anti microbienne intrinsèque mais remplissent des fonctions d'auxiliaires technologiques pour permettre, améliorer ou contrôler le pouvoir antimicrobien des molécules non polymériques antimicrobiennes comme l'iode. En effet, ces complexes (par exemple du type povidone-iode) sont obtenus par simple mélange entre l'agent antimicrobien et le polymère ; l'agent antimicrobien est simplement complexé par le polymère et non greffé sur ce dernier ce qui sous-entendrait une réaction chimique entre l'agent antimicrobien et le polymère. En effet, l'objectif est que l'agent antimicrobien soit relargué sous sa forme initiale dans la solution biologique à traiter afin qu'il conserve son activité anti microbienne. Dans le cas d'un iodophore, l'iode conserve donc sa structure chimique 12. En effet, dans les dilueurs de l'art antérieur les composés aux effets antimicrobiens, antibiotiques et/ou antiviraux, naturels ou de synthèse présentent de nombreux inconvénients. En premier lieu ils favorisent le développement de bactéries résistantes, du fait de l'action chimique sur les microbes (bactéries et virus) au sein de l'échantillon. La solution à ce problème consiste à augmenter les concentrations en ces substances ou à introduire régulièrement de nouvelles molécules antimicrobiennes dans le dilueur. Ensuite du fait de la petite taille des molécules aux effets antimicrobiens, celles-ci peuvent traverser les parois des organes de la femelle inséminée (vagin, utérus) et se retrouver dans le sang des animaux avec des effets multiples sur la santé de l'animal et/ou du consommateur si les animaux inséminés ou nés de l'insémination sont consommés par l'homme ou d'autres animaux. Par ailleurs ces composés antimicrobiens sont efficaces uniquement à hautes doses, typiquement de 100 à 1000mg/L de dilueur, leur présence n'est donc pas anodine et sans conséquence pour l'animal inséminé et sa progéniture. Enfin les substances aux effets antimicrobiens sont également disséminées dans l'environnement puisque difficilement arrêtées par les stations d'épuration. Il y a donc un vrai besoin de réduire voire de supprimer les composés à effets antimicrobiens, en particulier des antibiotiques, dans la procédure d'insémination artificielle et dans la préservation de la semence qui y est utilisée.
Concernant les peptides, ces substances sont particulièrement coûteuses et de ce fait sont incompatibles à ce jour avec les contraintes économiques du domaine.
La présente invention décrit un additif antimicrobien pour la conservation de la semence animale, en substitution des composés antibiotiques de l'art antérieur, qui peut être utilisé seul ou au sein d'un dilueur. Cet additif consiste en au moins un polymère synthétique à activité antimicrobienne so lubie dans la semence animale ou dans un milieu d'administration ou de conservation de ladite semence, sélectionné parmi les polymères polycationiques, les polymères polyanioniques ou les polymères sur lesquels sont greffées des substances antimicrobiennes. Ces polymères synthétiques aux propriétés antimicrobiennes sont efficaces en très faibles quantités tout en assurant la complète fonctionnalité des spermatozoïdes, ce qui constitue un avantage certain par rapport aux compositions de l'art antérieur. Cette invention présente de nombreux avantages par rapport aux compositions de dilueurs décrites dans l'art antérieur. En effet, l'utilisation d'un additif consistant en au moins un polymère synthétique aux effets antimicrobiens limite le phénomène de résistance car les polymères synthétiques ont un mode d'action physico-chimique vis à vis des microbes, donc vis-à-vis des bactéries, virus et mycètes. Ils s'adsorbent à la surface des microbes et peuvent les agglomérer en fonction de leurs concentrations relatives. Le polymère synthétique interagit avec la membrane du microbe en l'endommageant ce qui mène à la destruction du microbe. Un autre effet intéressant est que ni l'animal inséminé ni sa progéniture ne sont contaminés par le polymère synthétique car ces polymères sont des macromolécules, ayant typiquement une masse molaire moléculaire de quelques 10000g/mol à quelques 100000g/mol par chaîne de polymère, alors que les antibiotiques et antiviraux naturels ou de synthèse ont une masse molaire moléculaire de l'ordre de quelques 100g/mol à 2000g/mol. L'importante taille des polymères synthétiques selon l'invention empêche leur migration au travers des tissus de l'animal et leur dissémination dans d'autres parties du corps. Les polymères synthétiques selon l'invention sont éliminés par les voies naturelles de l'animal. Les polymères synthétiques antimicrobiens selon l'invention sont efficaces à faible concentration, de l'ordre de lmg/L de dilueur à quelques 10mg/L de dilueur alors que les antibiotiques et antiviraux sont couramment utilisés à de plus grandes concentrations pour être efficaces. Enfin les polymères synthétiques selon l'invention conservent la qualité de la semence sans aucune altération et de ce fait les performances reproductives de la semence (fertilité et prolifîcité) car leur effet n'est pas spermicide et conserve la motilité de spermatozoïdes. Par ailleurs les polymères synthétiques selon l'invention sont parfaitement solubles dans les compositions classiques de dilueurs et sont écologiques dans le sens où du fait de leur grande taille, ces polymères sont facilement bloqués lors des traitements de l'eau en station d'épuration. Ils sont également parfaitement inertes. Le dernier avantage est que les polymères selon l'invention ne sont pas irritants pour les muqueuses de l'animal inséminé.
Les polymères selon la présente invention sont choisis parmi les polymères synthétiques présentant une activité antimicrobienne vis à vis des bactéries ou virus naturellement présents dans les semences animales, une bonne solubilité dans la formulation de dilueur et une innocuité vis-à-vis des spermatozoïdes de la semence c'est-à-dire non spermidicité et non diminution de la motilité des spermatozoïdes. Ces polymères synthétiques aux propriétés antimicrobiennes sont typiquement choisis dans la famille des polymères polycationiques, polyanioniques ou des polymères sur lesquels sont greffées des substances antimicrobiennes, tout au long de la chaîne polymérique ou en bouts de chaîne.
La présente invention décrit un additif antimicrobien pour la conservation de semences animales qui consiste en au moins un polymère synthétique à activité antibactérienne soluble dans la semence animale ou dans un milieu d'administration ou de conservation de la semence animale, sélectionné parmi les polymères polycationiques, les polymères polyanioniques ou les polymères sur lesquels sont greffées des substances antimicrobiennes. Afin d'augmenter le spectre d'efficacité de l'additif il est possible d'utiliser un mélange de différents polymères synthétiques. Il est également envisageable d'utiliser un mélange de polymères synthétiques selon l'invention et d'antibiotiques et/ou d'antiviraux pour augmenter le spectre d'efficacité de l'ensemble du dilueur. Au sein d'un dilueur les polymères synthétiques selon l'invention peuvent être utilisés en combinaison avec d'autres substances antimicrobiennes comme les antibiotiques afin d'en diminuer la concentration ou comme peptides afin de diminuer le coût de la préparation antimicrobienne. Il est également possible d'obtenir des effets de synergie. Par polymère synthétique on entend dans la présente invention une grande molécule constituée d'unités fondamentales appelées monomères reliées par des liaisons covalentes. On parle de polymères synthétique par opposition aux polymères naturels tels le caoutchouc naturel, les polypeptides (protéines, laine, soie, etc.), et les polysaccharides (glucides, cellulose, alginate, amidon, glucides sous forme d'osides, etc.). Les polymères synthétiques selon la présente invention excluent spécifiquement les polymères naturels purs mais incluent les polymères naturels ayant subi des transformations chimiques (réaction de fonctionnalisation, par exemple la désacétylation de la chitine pour obtenir du chitosane). Sont spécifiquement exclus de cette définition de polymères synthétiques les polypeptides et les polysaccharides (polyoses ou osides), ainsi les monomères ne peuvent en aucun cas être des acides aminés ou des oses sauf si ces derniers ont été polymérisés entre eux par l'action directe ou indirecte de l'homme ou s'ils ont été copolymérisés avec des monomères synthétiques car dans ces deux cas, le spolymères formés répondent à la présente définition d epoymères synthétiques selon l'invention. Ces polymères synthétiques peuvent être des homopolymères dans lesquels tous les monomères sont identiques ou des copolymères dont les unités sont constituées de monomères de deux ou plus sortes différentes, soit deux ou plus monomères chimiquement différents. Ces polymères synthétiques peuvent être linéaires, ramifiés ou réticulés.
Ainsi dans un mode de réalisation particulier l'invention décrit un additif antimicrobien pour la conservation de semences animales qui consiste en au moins un polymère synthétique so lubie dans la semence animale ou dans un milieu d'administration ou de conservation de la semence animale, ledit polymère n'étant ni un polypeptide ni un polysaccharide.
Dans la présente invention on entend par « polymères sur lesquels sont greffées des substances antimicrobiennes » des polymères synthétiques, à l'exclusion des polypeptides et des polysaccharides, sur lesquels sont greffées des fonctions antibactériennes avec des liaisons fortes ; en d'autres termes ce ne sont pas de simples mélanges entre un composé antibactérien et un polymère (par exemple : iodophores) avec des liaisons faibles. Ces « polymères sur lesquels sont greffées des substances antimicrobiennes » subissent une modification chimique qui intègre des fonctions antibactériennes dans leur structure. Par polymères synthétiques anioniques on entend des polymères qui portent des groupes chargés négativement et par polymères synthétiques cationiques on entend des polymères qui portent des groupes chargés positivement. Les polymères synthétiques sur lesquels sont greffées des fonctions antimicrobiennes sont des polymères dont la structure générale ne présente pas d'activité antimicrobienne mais sur lesquels sont greffés des groupes présentant lesdites fonctions antimicrobiennes ; ces groupes peuvent être greffées en bout de chaîne, sur la chaîne principale ou sur des ramifications.
Par dilueur standard on entend dans la présente invention un dilueur qui permet de fournir l'énergie nécessaire au bon fonctionnement et au maintien en vie des spermatozoïdes, qui dispose d'un système tampon interdisant les fortes variations de pH et qui présente un équilibre ionique adéquat.
Par fonction antimicrobienne ou effet antimicrobien on entend dans la présente invention la capacité d'éliminer ou tout du moins de réduire significativement la prolifération de microbes. Les microbes concernés peuvent être des bactéries, des virus, des levures, des mycètes ou des parasites. Dans le cas de la semence les microbes sont plus particulièrement des virus et des bactéries, qui sont en général contenus à l'état naturel dans le liquide séminal. Sans l'étape d'insémination artificielle, lesdits microbes seraient transmis par voie naturelle du mâle à la femelle lors de la copulation. Un additif selon la présente invention contient un polymère synthétique présentant un effet antimicrobien pouvant être sélectionné parmi les sels d'ammonium quaternaire tels :
- les homopolymères et copolymères à base de méthacrylate de 2-(diméthylamino)éthyle ou DMAEMA (CAS 2867-47-2), par ex. le poly(méthacrylate de 2-(diméthylamino)éthyle) (CAS 25154-86-3) comme homopolymère, le sel quaternaire de chlorure de méthyle de poly(méthacrylate de 2-(diméthylamino)éthyle) aussi nommé poly [chlorure de 2- (méthacryloyloxy)éthyle]triméthylammonium) ou PDMAEMAq (CAS 26161-33-1) comme homopolymère du monomère quaternisé, le poly[(2-éthyldiméthylammonioéthyle méthacrylate éthyle sulfate)-co-(l-vinylpyrrolidone)] (CAS 53633-54-8) comme copolymère avec un monomère hydrosoluble ; - les polymères et copolymères à base d'acrylate de 2-(diméthylamino)éthyle ou DMAEA, par ex. le poly(acrylate de 2-(diméthylamino)éthyle) comme homopolymère et le poly[chlorure de 2-(acryloyloxy)éthyle]triméthylammonium) comme homopolymère du monomère quaternisé ;
- les polymères et copolymères à base de chlorure de diallyldiméthylammonium ou DDA , par ex. le poly(chlorure de diallyldiméthylammonium) ou PDDA comme homopolymère et le chlorure de poly[acrylamide-co-(chlorure de diallyldiméthylammonium)] comme copolymère avec un monomère hydrosoluble (acylamide) ; - les polymères et copolymères à base de bromure de 2-vinyl-l-méthylpyridinium ;
-les polymères et copolymères à base d'aziridine, par ex. la polyéthylèneimine ou la polyéthylèneimine quaternisée par ajout de bromooctane et méthylation par iodure de méthyle (noté PEIq). Un additif selon la présente invention contient un polymère présentant un effet antimicrobien pouvant être sélectionné parmi les sels de phosphonium tels :
- le copolymère de chlorure de Tributyl(4-vinylbenzyl)phosphonium avec de l'acrylamide ;
-le copolymère de chlorure de Méthacryloyloxyéthyl trioctyl phosphonium avec de l'acrylamide (noté PMAETP-AA). Enfin un additif selon la présente invention contient un polymère présentant un effet antimicrobien dont les fonctions antimicrobiennes sont conférées par des fonctions acides ou aldéhydes portées par les chaînes polymériques, par ex. des polymères ou copolymère greffés par des dérivés de benzaldéhyde comme 4-hydroxybenzaldéhyde ou le 2,4- dihydroxybenzaldéhyde, des polymères ou copolymère greffés par de l'acide salicylique ou des polymères ou copolymère greffés par de l'acide 4-aminobenzoïque. Des polymères tels que ceux cités par Brodkorb et al. (Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 20050-20066) sont également parfaitement adaptés à leur utilisation dans un additif selon la présente invention, à savoir des polymères et copolymères possédant des groupes aminoalkyles, tels les alkylaminométhylstyrènes (par exemple le poly(2-(isobutylamino)méthylstyrène). Ainsi dans un mode de réalisation particulier le polymère est sélectionné parmi les sels d'ammonium quaternaire, les sels de phosphonium et des chaînes de polymères so lubies dans la semence animale ou dans un milieu d'administration ou de conservation de ladite semence, sur lesquelles sont greffées des fonctions antimicrobiennes de type acide, aldéhyde ou aminoalkyle. Dans un mode de réalisation où un additif selon l'invention contient au moins un polymère qui est sélectionné parmi les sels d'ammonium quaternaire, ledit polymère est un homopolymère ou un copolymère à base de méthacrylate de 2-(diméthylamino)éthyle, à base d'acrylate de 2-(diméthylamino)éthyle, à base de chlorure de diallyldiméthyl ammonium, à base de bromure de 2-vinyl-l-méthylpyridinium ou à base d'aziridine. Plus particulièrement le polymère est sélectionné parmi un sel quaternaire de poly(méthacrylate de 2- (diméthylamino)éthyle) (CAS 25154-86-3), de chlorure de méthyle de poly(méthacrylate de 2-(diméthylamino)éthyle) aussi nommé poly[chlorure de 2- (méthacryloyloxy)éthyle]triméthylammonium) ou PDMAEMAq (CAS 26161-33-1), le poly[(2-éthyldiméthylammonioéthyle méthacrylate éthyle sulfate)-co-(l-vinylpyrrolidone)] (CAS 53633-54-8), de poly(acrylate de 2-(diméthylamino)éthyle), de poly[chlorure de 2- (acryloyloxy)éthyle]triméthylammonium), de poly(chlorure de diallyldimethylammonium) ou PDDA, de chlorure de poly[acrylamide-co-(chlorure de diallyldiméthylammonium)], de polyéthylèneimine, ou de polyéthylèneimine quaternisée par ajout de bromooctane et méthylation par iodure de méthyle (noté PEIq).
Dans un mode de réalisation où un additif selon l'invention contient au moins un polymère qui est sélectionné parmi les sels de phosphonium, le polymère est un copolymère de chlorure de tributyl(4-vinylbenzyl)phosphonium avec de l'acrylamide ou un copolymère de chlorure de méthacryloyloxyéthyl trioctyl phosphonium avec de l'acrylamide.
Dans un mode de réalisation où un additif selon l'invention contient une ou plusieurs chaînes de polymères sur lesquelles sont greffées des fonctions antibactériennes, ledit polymère est sélectionnées parmi des polymères ou copolymères greffés par des dérivés de benzaldéhyde comme 4-hydroxybenzaldéhyde ou le 2,4-dihydroxybenzaldéhyde, par de l'acide salicylique, par de l'acide 4-aminobenzoïque ou par un groupe aminoalkyle.
Les polymères selon la présente invention peuvent être dissous dans le dilueur ou fixés sur des substrats placés au contact de la semence ou du dilueur : sur des particules pleines ou poreuses, sur des fibres, sur des films ou sur des mousses. Dans tous les cas l'additif viendra se mélanger à la semence ou au dilueur.
La présente invention décrit également une méthode de conservation d'un échantillon de semence animale qui comporte les étapes suivantes :
- prélèvement de l'échantillon de semence chez le mâle de l'espèce sélectionnée ; puis
- ajout d'un additif selon la présente invention audit échantillon. Cette méthode peut également être utilisée avec un dilueur. Dans ce mode de réalisation l'invention décrit une méthode de conservation d'un échantillon de semence animale qui comporte les étapes suivantes :
- ajout d'un additif selon l'invention au dilueur standard,
- prélèvement de l'échantillon de semence chez le mâle de l'espèce sélectionnée, et - mise en solution dans ledit dilueur. Dans un mode de réalisation particulier la méthode ci-dessus comporte en outre une étape de préparation du dilueur, contenant ou non des antibiotiques, avant l'ajout de l'additif selon l'invention. Dans ce mode de réalisation l'invention décrit une méthode de conservation d'un échantillon de semence animale qui comporte les étapes suivantes : - préparation d'un dilueur contenant ou non des antibiotiques et un additif selon l'invention, puis
- prélèvement de l'échantillon de semence chez le mâle de l'espèce sélectionnée, et
- mise en solution dans ledit dilueur.
Enfin dans un autre mode de réalisation particulier une étape supplémentaire de réfrigération, de congélation ou de cryogénisation est pratiquée sur l'échantillon de semence animale. Dans ce mode de réalisation l'invention décrit une méthode de conservation d'un échantillon de semence animale qui comporte les étapes suivantes :
- ajout d'un additif selon l'invention au dilueur standard,
- prélèvement de l'échantillon de semence chez le mâle de l'espèce sélectionnée, et - mise en solution dans ledit dilueur, puis
- réfrigération, congélation ou cryogénisation de l'échantillon.
Une variante de cette dernière méthode est la préparation d'un dilueur contenant un ou plusieurs antibiotiques dans lequel on ajoute un ou plusieurs polymères selon l'invention afin d'élargir le spectre d'action. Dans ce mode de réalisation l'invention décrit une méthode de conservation d'un échantillon de semence animale qui comporte les étapes suivantes :
- préparation d'un dilueur contenant un ou des antibiotiques et un additif selon l'invention, puis
- prélèvement de l'échantillon de semence chez le mâle de l'espèce sélectionnée, et
- mise en solution dans ledit dilueur, puis - réfrigération, congélation ou cryogénisation de l'échantillon.
Les exemples détaillés ci-après montrent l'intérêt particulier d'un additif selon l'invention contenant au moins un polymère selon l'invention en substitution totale ou partielle des antibiotiques pour la conservation des semences animales. Sont illustrés ci-dessous l'efficacité antimicrobienne des polymères sur des microbes (ici bactéries et levures) naturellement présents dans les sécrétions animales, la non spermidicité de ces polymères, ainsi que la préservation de la motilité des spermatozoïdes ; testé sur des échantillons de semence de mammifères (verrat et bovins).
Exemple 1 : propriétés antimicrobiennes
La présente étude vise à montrer les propriétés antimicrobiennes de 5 polymères selon l'invention. Les propriétés antimicrobiennes sont évaluées sur différentes bactéries et levures, classiquement présentes dans les semences de mammifères : · Gram - :
o Pseudomonas aeruginosa
o Escherechia coli
o Proteus vulgaris
o Citrobacter freundii
o Pantoea agglomerans
• Gram + :
o Micrococcus luteus
o Streptococcus viridans
o Staphylococcus aureus
· Levure :
o Candida albicans
Les bactéries et levures ont été mises en culture en suspension dans un liquide nutritif puis chaque polymère dissout dans le mélange. La solution a été agitée pendant 24h à une température de 37°C. Les 5 polymères selon l'invention utilisés ici sont les suivants :
PDMAEMAq pour poly[chlorure de 2-(méthacryloyloxy)éthyle]triméthylammonium)
PEIq pour polyéthylèneimine quaternisée
PDDA pour poly(chlorure de diallyldiméthylammonium)
PMAETP-AA pour copolymère de chlorure de méthacryloyloxyéthyl trioctyl phosphonium avec de l'acrylamide
poly(2-(isobutylamino)méthylstyrène.
Les tableaux ci-dessous présentent le pourcentage de microbes ou micro-organismes (ici des bactéries et des levures) inactivés suite à l'ajout des polymères. Le Tableau 1 montre l'effet des polymères selon l'invention sur des bactéries gram négatif. Le Tableau 2 montre l'effet des polymères selon l'invention sur des bactéries gram positif. Le Tableau 3 montre l'effet des polymères selon l'invention sur une variété très répandue de levure. Tableau 1 : Propriétés antimicrobiennes sur bactéries de gram négatif
Figure imgf000015_0001
L'effet antibactérien des 4 polymères selon l'invention est de 99% sur l'ensemble des bactéries gram négatif testées.
Tableau 2: Propriétés antimicrobiennes sur bactéries de gram positif
Figure imgf000015_0002
L'effet antibactérien des 4 polymères selon l'invention est de 99% sur l'ensemble des bactéries gram positif testées.
Tableau 3 : Propriétés antimicrobiennes sur une levure
PDMAEMAq PEIq PDDA PMAETP-AA poly(2(isobutylamino) lmg/L 3mg/L 5mg/L 10mg/L méthylstyrène) 10mg/L
Candida
>99% >99% >99% >99% >99% albicans L'effet antimicrobien sur les levures (ou effet antifongique ou antimycète) des 5 polymères selon l'invention est de 99% sur l'espèce de levure Candida Albicans.
Ces résultats montrent bien un effet antimicrobien puissant de plusieurs polymères selon l'invention sur des bactéries communes et une espèce de levure commune.
Exemple 2 : réalisation d'un mélange de polymères selon l'invention
On réalise une solution aqueuse contenant : o 5mg/L de PMAETP-AA
o 3mg/L de PEIq
o 2mg/L de PDDA
Les 3 polymères selon l'invention utilisés ici sont les suivants :
PDMAEMAq pour poly[chlorure de 2-(méthacryloyloxy)éthyle]triméthylammonium)
PEIq pour polyéthylèneimine quaternisée
PDDA pour poly(chlorure de diallyldiméthylammonium)
On obtient un mélange permettant d'obtenir un large spectre d'efficacité, sur des bactéries à gram positif, sur des bactéries gram négatif et sur des levures. Ce mélange constitue un additif selon l'invention contenant plusieurs polymères. Cet additif peut être ajouté à un prélèvement de sperme pour une utilisation directe ou ajouté à un dilueur en vue de la conservation de l'échantillon de sperme pour une utilisation ultérieure.
Exemple 3 : évaluation des propriétés antimicrobiennes d'un mélange de polymères et de son action sur la qualité de la semence
De la semence bovine (échantillon T) provenant d'un même éjaculat a été diluée de la façon suivante:
• échantillon A : dans un dilueur standard contenant un antibiotique à streptomycine dosé à lmg/ml
• échantillon B : dans un dilueur de même composition à l'exception de l'antibiotique, remplacé par le mélange de polymères issu de l'exemple 2, dosé à 10mg/L
• échantillon C : dans un dilueur de même composition ne contenant aucun antibiotique Après dilution, les quatre échantillons de semence ont été refroidies à une température de 5°C puis conservées pendant 72h. La qualité de chacun des échantillons après 72h a été évaluée suivant les paramètres suivants :
• Concentration en gamètes mesurée par spectrophotométrie
· Pourcentage de gamètes mobiles mesuré par microscopie optique
• Motilité des gamètes mesurée par microscopie optique
Après 72h les échantillons ne présentent pas de différence de qualité, la concentration en gamètes, le pourcentage de gamètes mobiles ainsi que leur mobilité est identique dans tous les échantillons. L'utilisation du mélange de polymères n'altère donc pas la qualité de la semence.
Les échantillons T avant dilution, A après 72h d'incubation, B après 72h d'incubation et C après 72h d'incubation ont été mis en culture sur une boite de Pétri garnie d'un milieu nutritif afin d'effectuer un comptage des colonies s'étant développées après 48h à 37°C.
Figure imgf000017_0001
L'échantillon T représente la concentration initiale en microbes de l'éjaculat, soit une mesure réalisée avant l'ajout d'un additif ou la mise en solution dans un diluant. Ces microbes sont naturellement présents dans la semence bovine.
On observe que pour l'échantillon C il y a un très important développement de colonies microbiennes en l'absence d'antibiotiques. Par contre pour les échantillons A et B il n'y a pas (pour B) ou peu (pour A) de
développement de colonies microbiennes.
Ceci illustre clairement le fait que les polymères selon l'invention peuvent présenter un effet au moins équivalent voire supérieur à celui des antibiotiques utilisés de façon classique dans les dilueurs pour la conservation du sperme animal.

Claims

REVENDICATIONS
1. Additif antimicrobien pour la conservation de semences animales caractérisé en ce qu'il consiste en au moins un polymère synthétique à activité antimicrobienne soluble dans la semence animale ou dans un milieu d'administration ou de conservation de la semence animale, sélectionné parmi les polymères polycationiques, les polymères polyanioniques ou les polymères sur lesquels sont greffées des substances antimicrobiennes.
2. Additif selon la revendication 1 caractérisé en ce que le au moins un polymère synthétique est sélectionné parmi les sels d'ammonium quaternaire, les sels de phosphonium et des chaînes de polymères solubles dans la semence animale ou dans un milieu d'administration ou de conservation de ladite semence, sur lesquelles sont greffées des fonctions antimicrobiennes de type acide, aldéhyde ou aminoalkyle.
3. Additif selon la revendication 2 caractérisé en ce que le sel d'ammonium quaternaire est un homopolymère ou un copolymère à base de méthacrylate de 2-(diméthylamino)éthyle, à base d'acrylate de 2-(diméthylamino)éthyle, à base de chlorure de diallyldiméthyl ammonium, à base de bromure de 2-vinyl-l-méthylpyridinium ou à base d'aziridine.
4. Additif selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi les composés suivants : sel quaternaire de poly(méthacrylate de 2-(diméthylamino)éthyle), chorure de méthyle de poly(méthacrylate de (2-(diméthylamino)éthyle), de poly[(2- éthyldiméthylammonioéthyle méthacrylate éthyle sulfate)-co-(l-vinylpyrrolidone)], de poly(acrylate de 2-(diméthylamino)éthyle), de poly [chlorure de 2- (acryloyloxy)éthyle]triméthylammonium), de poly(chlorure de diallyldimethylammonium) ou PDDA, de chlorure de poly[acrylamide-co-(chlorure de diallyldiméthylammonium)], de polyéthylèneimine, ou de polyéthylèneimine quaternisée.
5. Additif selon la revendication 2 caractérisé en ce que le sel de phosphonium est un copolymère de chlorure de tributyl(4-vinylbenzyl)phosphonium avec de l'acrylamide ou un copolymère de chlorure de méthacryloyloxyéthyl trioctyl phosphonium avec de l'acrylamide.
6. Additif selon la revendication 2 caractérisé en ce que les chaînes de polymères sur lesquelles sont greffées des fonctions antibactériennes sont sélectionnées parmi des polymères ou copolymères greffés par des dérivés de benzaldéhyde comme 4-hydroxybenzaldéhyde ou le 2,4-dihydroxybenzaldéhyde, par de l'acide salicylique ou par de l'acide 4-aminobenzoïque, ou par un groupe aminoalkyle.
7. Additif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il est associé à un dilueur standard.
8. Méthode de conservation d'un échantillon de semence animale caractérisée en ce qu'elle comporte les étapes suivantes : prélèvement de l'échantillon de semence chez le mâle de l'espèce sélectionnée, et ajout d'un additif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
9. Méthode de conservation selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'additif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 est ajouté à un dilueur standard et que l'échantillon y est mis en solution.
10. Méthode de conservation selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisée en ce que l'échantillon est ensuite soumis à une étape de réfrigération, de congélation ou de
cryogénisation.
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