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WO2018135646A1 - ＣＤ８α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法 - Google Patents

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WO2018135646A1
WO2018135646A1 PCT/JP2018/001667 JP2018001667W WO2018135646A1 WO 2018135646 A1 WO2018135646 A1 WO 2018135646A1 JP 2018001667 W JP2018001667 W JP 2018001667W WO 2018135646 A1 WO2018135646 A1 WO 2018135646A1
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medium
cytotoxic
culturing
cd8α
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PCT/JP2018/001667
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新 金子
洋平 河合
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国立大学法人京都大学
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    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells, and preferably relates to a method for producing CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells from pluripotent stem cells.
  • CTL cytotoxic T lymphocyte
  • Patent Document 1 includes a step of inducing hematopoietic progenitor cells from pluripotent stem cells, a step of inducing CD4CD8 positive cells from hematopoietic progenitor cells, and a step of inducing CD8 positive T cells from both CD4CD8 positive cells.
  • a method for producing cells is disclosed.
  • CD4CD8-positive T cells are induced from pluripotent stem cells using a medium supplemented with vitamin C, and cultured in a medium containing a corticosteroid agent to obtain CD8-positive T cells.
  • a method of manufacturing is disclosed. However, these methods are not sufficient for producing cytotoxic T cells from pluripotent stem cells.
  • Patent Document 3 iPSC is induced from human peripheral blood CTL, hematopoietic progenitor cells are produced from the iPSC, and IL (interleukin) -2, IL-7 and IL-15 are contained. It has been disclosed that terminal differentiation to CTL was successfully achieved by co-culture with OP9 / DLL1 cells expressing DLL-1 which is Notch ligand in the medium.
  • IL interleukin
  • the redifferentiated CTL disclosed in Patent Document 3 and Non-Patent Document 1 had all the CTL functions such as high cytotoxic activity, cytokine production, proliferation ability, etc. while maintaining the antigen specificity of the original CTL. On the other hand, it was revealed that it also has NK cell-like properties that are not observed in normal CTL. That is, normal CTLs, including the original CTL, belong to acquired immune system lymphocytes, whereas redifferentiated CTLs have the characteristics of innate immune system lymphocytes to which NK cells belong.
  • the present invention provides a method for efficiently producing CTL having the characteristics of original acquired immune system lymphocytes suitable for cell immunotherapy. The task is to do.
  • the present inventor has intensively studied to solve the above problems. As a result, when culturing both CD4CD8 positive T cells, NK activity is not shown and CD8 ⁇ expression is maintained for a long time by culturing in a medium containing IL-7 and T cell receptor activator. CTL, which is closer to the normal acquired immune system CTL, was successfully produced. Based on such knowledge, it came to complete this invention.
  • a method for producing CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells A method comprising the step of culturing CD4CD8 positive T cells in a medium containing IL (Interleukin) -7 and a T cell receptor activator to induce CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells.
  • IL Interleukin
  • a T cell receptor activator is an anti-CD3 antibody.
  • the medium further contains IL-21 and Flt3L (Flt3 Ligand).
  • [4] The method according to any one of [1] to [3], comprising the following steps (a) and (b): (A) culturing both CD4CD8 positive T cells in a medium containing IL-7 and a T cell receptor activator; And (b) culturing the cells obtained in step (a) in a medium containing IL-7 and not containing a T cell receptor activator. [5] The method according to [4], wherein the culture (b) is performed using a culture vessel containing a fibronectin fragment and / or a Notch ligand. [6] The method according to [5], wherein the fibronectin fragment is retronectin and the Notch ligand is Delta-like 4 (DLL4).
  • DLL4 Delta-like 4
  • the method further includes the step of expanding and culturing CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells in a medium containing IL-7 and IL-15, and one or more of IL-21, IL-18, IL-12 and TL1A. [1] to [12]. [15] The method according to any one of [1] to [14], wherein the CD4CD8 both positive T cells are derived from pluripotent stem cells. [16] The method according to [15], wherein the pluripotent stem cell is an induced pluripotent stem (iPS) cell. [17] The method according to [15] or [16], wherein the induction from pluripotent stem cells to both CD4CD8 positive T cells comprises the following steps (a) and (b).
  • step (A) culturing pluripotent stem cells in a medium supplemented with vitamin C to induce hematopoietic progenitor cells; and (b) hematopoietic progenitor cells obtained in step (a) are treated with vitamin Cs, FLT3L and A step of culturing in a medium containing IL-7 to induce both CD4CD8 positive T cells.
  • a method for producing CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells from pluripotent stem cells (A) culturing pluripotent stem cells in a medium supplemented with vitamin C to induce hematopoietic progenitor cells, (B) culturing the hematopoietic progenitor cells obtained in step (a) in a medium containing vitamin Cs, FLT3L and IL-7, and inducing CD4CD8-positive T cells; and (c) step (b) A method comprising the step of culturing the CD4CD8 positive T cells obtained in the above in a medium containing IL-7 and a T cell receptor activator and inducing CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells.
  • a CTL closer to the normal acquired immune system CTL that does not show NK activity and maintains the expression of CD8 ⁇ even after long-term culture can be produced.
  • CTLs obtained by the method of the present invention exhibit higher antigen-specific cytotoxic activity, cytokine production, and proliferation ability than conventional CTLs.
  • the CTL obtained by the method of the present invention has not only the shift of differentiation from the innate immune system to the acquired immune system lymphocytes, but also excellent properties such as maturation into naive / memory cells and maintenance of their traits without cell exhaustion. In particular, it shows a remarkable growth ability that can be expanded more than 100 trillion times in vitro. Therefore, the present invention greatly contributes to the current cellular immunotherapy, which is difficult to secure cells.
  • FIG. 1 shows an improved (modified) iPSC-CTL produced by the method of the present invention, a T cell clone (Original CTL clone) from which iPS cells are derived, and an iPSC-CTL (conventional iPSC-CTL) produced by a conventional method.
  • the results of flow cytometry are shown.
  • the upper diagram shows a diagram developed with CD8 ⁇ and CD8 ⁇
  • the lower diagram shows a diagram developed with TCR and HLA-tetramer staining intensities.
  • FIG. 2 shows K562 / HLA A-24 in which the modified iPSC-CTL (Modified CD8b + CTL) and the conventional iPSC-CTL (conventional CD8b- CTL) prepared by the method of the present invention are stained with CFSE and a specific antigen peptide is presented.
  • FIG. 3 shows that improved iPSC-CTL (Modified CD8b + CTL) and conventional iPSC-CTL (conventional CD8b- CTL) prepared by the method of the present invention were co-cultured with K562 / HLA A-24 pulsed with a specific antigen peptide.
  • FIG. 4 shows FACS analysis of the improved iPSC-CTL (Modified CD8b + CTL) and the conventional iPSC-CTL (conventional CD8b- CTL) and the original T cell clones prepared by the method of the present invention using CD28, CD27 and CCR7.
  • FIG. 5 shows the results of analyzing the growth of the improved iPSC-CTL (Modified CD8b + CTL) and the conventional iPSC-CTL (conventional CD8b-CTL) prepared by the method of the present invention (Day 0 at the start of expansion culture). Show).
  • Fig. 5 shows the results of analyzing the growth of the improved iPSC-CTL (Modified CD8b + CTL) and the conventional iPSC-CTL (conventional CD8b-CTL) prepared by the method of the present invention (Day 0 at the start of expansion culture). Show).
  • FIG. 6 shows the production and cytotoxicity of cytokine (IFN ⁇ ) by stimulating improved iPSC-CTL (Modified CD8b + CTL) prepared by the method of the present invention under PHA + PBMC or without feeder (with or without IL-21) The result of having quantified the expression level of the sex molecule (Granzyme B) is shown.
  • FIG. 7 shows the results of measuring cytokine (IFN ⁇ ) production and cytotoxic activity of the improved iPSC-CTL (Modified CD8b + CTL) produced by the method of the present invention.
  • FIG. 8 shows the results of quantifying the production of cytokines and the expression level of cytotoxic molecules of the improved iPSC-CTL (Modified CD8b + CTL) prepared by the method of the present invention and the original CTL.
  • FIG. 9 shows the analysis results of the effects of IL-7 and IL-21 addition on the production amount of CD8 ⁇ + ⁇ + CTL and the surface marker.
  • FIG. 10 shows the cytokine production profile analysis results of the produced iPSC-CTL and Primary® CTL.
  • FIG. 11 shows the results of FACS analysis after sorting CD8 ⁇ / CD5 positive cells from iPSC-CTL matured by the conventional method and conducting PHA ⁇ ⁇ on-feeder expansion culture for 2 weeks.
  • FIG. 12 shows the analysis of the proliferation ability after performing the second expansion culture under feeder-free conditions by dividing the conventional iPSC-CTL after expansion culture into CD8 ⁇ + CD5bright cells and CD8 ⁇ + CD5- cells.
  • FIG. 13 shows the results of FACS analysis after sorting CD8 ⁇ / CD5 positive cells from improved iPSC-CTL and repeating PHA-on-feeder expansion culture four times.
  • FIG. 14 shows the results of analyzing the growth of improved iPSC-CTL and naive CTL expanded and cultured with and without a feeder.
  • FIG. 15 shows the results of analyzing the growth of the improved iPSC-CTL (Modified CD8b + CTL) and the parent CTL clone (H25-4) when expanded in each cytokine-containing medium for 2 weeks (increase relative to the start of expansion culture). Shown as a rate).
  • FIG. 16 shows the results of measuring the cytotoxic activity, cytokine production and proliferation rate of the improved iPSC-CTL (Modified CD8b + CTL) when expanded for 2 weeks in each cytokine-containing medium.
  • the present invention relates to a method for producing CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells, There is provided a method comprising a step of culturing CD4CD8 both positive T cells in a medium containing IL-7 and a T cell receptor activator to induce CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells.
  • the CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cell means a cell in which both surface antigens CD8 ⁇ and CD8 ⁇ are positive (CD4 is negative) among T cells, and has a cytotoxic activity.
  • Cytotoxic T cells CTLs
  • CTLs Cytotoxic T cells
  • MHC class 1, HLA class 1 class 1 major histocompatibility antigens
  • TCR T cell receptors
  • it recognizes antigen peptides derived from viruses, tumors, etc., and specifically exhibits cytotoxic activity against cells presenting the antigen peptides as foreign substances.
  • the cytotoxic activity can be confirmed using, for example, secretion or production of granzyme or perforin as an index.
  • a CD4CD8 positive T cell means a cell (CD8 + CD4 + ) in which both the surface antigens CD4 and CD8 are positive among T cells.
  • Both CD4CD8 positive T cells can be differentiated into CD4 positive cells (CD8 ⁇ CD4 + ) or CD8 positive cells (CD8 + CD4 ⁇ ) by induction.
  • CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells are induced from both CD4CD8 positive T cells.
  • CD4CD8-positive T cells The origin of both CD4CD8-positive T cells is not particularly limited, but CD4CD8-positive T cells obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells are preferred.
  • the pluripotent stem cell is a stem cell having pluripotency that can be differentiated into many cells existing in the living body and also having proliferative ability, and both CD4CD8 positive T cells Any cell that is induced by is encompassed.
  • pluripotent stem cells include, but are not limited to, embryonic stem (ES) cells, cloned embryo-derived embryonic stem (ntES) cells obtained by nuclear transfer, sperm stem cells (“GS cells”), embryonic Examples include germ cells (“EG cells”), induced pluripotent stem (iPS) cells, cultured fibroblasts and bone marrow stem cell-derived pluripotent cells (Muse cells).
  • ES embryonic stem
  • ntES cloned embryo-derived embryonic stem
  • GS cells sperm stem cells
  • EG cells germ cells
  • iPS induced pluripotent stem
  • Muse cells bone marrow stem cell-derived pluripotent cells
  • IPS cell production methods are known in the art and can be produced by introducing reprogramming factors into somatic cells.
  • the reprogramming factor is, for example, Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15 -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 or Glis1, etc. genes or gene products are exemplified, and these reprogramming factors may be used alone or in combination. Also good.
  • Somatic cells include fetal (child) somatic cells, neonatal (child) somatic cells, and mature healthy or diseased somatic cells, as well as primary cultured cells, passaged cells, and strains. Any of the cells are included.
  • iPS cells are produced using lymphocytes (T cells) that have undergone T cell receptor (TCR) gene rearrangement as somatic cells for use in the production of CTLs. It is preferable. When lymphocytes are used as somatic cells, it is preferable to activate the lymphocytes by stimulation with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody in the presence of IL-2 prior to the initialization step.
  • Such stimulation can be performed, for example, by adding IL-2, anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody to the medium and culturing the lymphocytes for a certain period. Further, instead of adding these antibodies to the medium, stimulation may be given by culturing the T cells for a certain period on a culture dish having anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody bound to the surface. Further, stimulation may be given by adding an antigen peptide recognized by human T cells to the medium together with feeder cells.
  • CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells produced in the present invention preferably have a desired antigen specificity. Therefore, it is desirable that the lymphocytes that are the source of iPS cells have the desired antigen specificity, and the lymphocytes are specifically isolated by purification using an affinity column or the like on which the desired antigen is immobilized. Also good. For example, using a tetramerized MHC (major histocompatibility complex) to which a desired antigen is bound (so-called “MHC tetramer”), lymphocytes having a desired antigen specificity from human tissues A method of purifying can also be employed.
  • MHC major histocompatibility complex
  • the mammalian individual from which somatic cells are collected is not particularly limited, but is preferably a human.
  • CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells produced by the method of the present invention are used for cell immunotherapy, from the viewpoint of easy adaptation of the patient and human leukocyte antigen (HLA) type,
  • the somatic cell is preferably isolated from a subject to whom CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells are administered.
  • a method for obtaining CD4CD8-positive T cells from pluripotent stem cells is not particularly limited, and a known method may be used. Examples thereof include a method including the following steps (a) and (b).
  • (A) pluripotent stem cells are cultured in a medium supplemented with vitamin Cs to induce hematopoietic progenitor cells; and
  • (b) hematopoietic progenitor cells obtained in step (a) are treated with vitamin Cs, Culturing in a medium containing FLT3L and IL-7 to induce both CD4CD8 positive T cells.
  • the method for inducing CD4CD8-positive T cells from pluripotent stem cells is not limited to the following.
  • hematopoietic progenitor cells are lymphocytes, eosinophils, neutrophils, basophils, erythrocytes, megakaryocytes
  • the hematopoietic progenitor cells can be recognized by, for example, being positive for the surface antigens CD34 and / or CD43.
  • Hematopoietic progenitor cells can be produced, for example, by a method including a step of culturing pluripotent stem cells in a medium supplemented with vitamin Cs.
  • vitamin C means L-ascorbic acid and derivatives thereof
  • L-ascorbic acid derivative means a substance that becomes vitamin C by an enzymatic reaction in vivo.
  • L-ascorbic acid derivatives include vitamin C phosphate, glucoside ascorbate, ethyl ascorbyl, vitamin C ester, ascovir tetrahexyldecanoate, ascovir stearate and ascorbyl-2-phosphate-6 palmitic acid.
  • Preferred is vitamin C phosphate and examples thereof include phosphate-L ascorbate such as phosphate-L sodium ascorbate or Mg phosphate-L-ascorbate.
  • the medium used for the hematopoietic progenitor cell induction step is not particularly limited, and can be prepared by adding vitamin Cs to a basal medium as a medium used for culturing animal cells.
  • a basal medium as a medium used for culturing animal cells.
  • Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) medium Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium , Neurobasal Medium (Life Technologies) and mixed media thereof.
  • Serum may be contained in the medium, or serum-free may be used.
  • the basal medium can be, for example, albumin, insulin, transferrin, selenium, fatty acids, trace elements, 2-mercaptoethanol, thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, non-essential amino acids, vitamins, growth factors, low It may also contain one or more substances such as molecular compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, cytokines and the like.
  • the basal medium is, for example, an IMDM medium containing serum, insulin, transferrin, serine, thiol glycerol, L-glutamine, and ascorbic acid.
  • a cytokine selected from the group consisting of BMP4 (Bone morphogenetic protein 4), VEGF (vascular endothelial growth factor), SCF (Stem cell factor) and FLT3L (Flt3 Ligand) is added to the medium used for the hematopoietic progenitor cell induction step. It may be. More preferably, a medium supplemented with VEGF, SCF and FLT3L is used.
  • Vitamin Cs are added to the medium in an amount corresponding to, for example, 5 ng / ml to 100 ⁇ g / ml.
  • VEGF is added to the medium in an amount corresponding to, for example, 10 ng / ml to 100 ng / ml.
  • SCF is added to the medium in an amount corresponding to 10 ng / ml to 100 ng / ml.
  • FLT3L is added to the medium in an amount corresponding to, for example, 1 ng / ml to 100 ng / ml.
  • pluripotent stem cells are cultured in adhesion culture or suspension culture, and in the case of adhesion culture, they may be performed using a culture vessel coated with a coating agent, or co-cultured with other cells. May be.
  • Other cells to be co-cultured include C3H10T1 / 2 (Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830, 2010), heterologous stromal cells (Niwa A et al. J Cell Physiol. 2009 Nov; 221 ( 2): 367-77.).
  • the coating agent Matrigel (Niwa A, et al.
  • PLoS One.6 (7): e22261, 2011 is exemplified.
  • suspension culture the method described in Chadwick et al. Blood 2003, 102: 906-15, Vijayaragavan et al. Cell Stem Cell 2009, 4: 248-62, and Saeki et al. Stem Cells 2009, 27: 59-67 Is exemplified.
  • Hematopoietic progenitor cells can also be prepared from a net-like structure (also referred to as ES-sac or iPS-sac) obtained by culturing pluripotent stem cells.
  • a net-like structure also referred to as ES-sac or iPS-sac
  • the “net-like structure” is a three-dimensional sac-like structure (with space inside) derived from pluripotent stem cells, which is formed by an endothelial cell population and the like, and contains hematopoietic progenitor cells inside. It is a structure.
  • the temperature conditions for the hematopoietic progenitor cell induction step are not particularly limited, but are, for example, about 37 ° C. to about 42 ° C., and preferably about 37 to about 39 ° C.
  • the culture period is, for example, 6 days or longer.
  • the culture may be performed under hypoxic conditions, and examples of hypoxic conditions include 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5% or lower oxygen concentrations.
  • Culture of the hematopoietic progenitor cell induction step can be performed by appropriately combining the above conditions. In combination: (i) culturing pluripotent stem cells in basal medium supplemented with vitamin C under low oxygen conditions on C3H10T1 / 2, and (ii) VEGF, SCF and FLT3L (i) And a step of further culturing under normal oxygen conditions.
  • the period for performing the step (i) is 6 days or longer, and the period for performing the step (ii) is 6 days or longer.
  • CD4CD8-positive T cells can be induced by , for example, culturing hematopoietic progenitor cells in a medium supplemented with vitamin Cs.
  • the medium used for induction of both CD4CD8 positive T cells is not particularly limited, but can be prepared by adding vitamin Cs to a basal medium as a medium used for culturing animal cells.
  • a basal medium as a medium used for culturing animal cells.
  • Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) medium Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium , Neurobasal Medium (Life Technologies) and mixed media thereof.
  • Serum may be contained in the medium, or serum-free may be used.
  • the basal medium can be, for example, albumin, insulin, transferrin, selenium, fatty acids, trace elements, 2-mercaptoethanol, thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, non-essential amino acids, vitamins, growth factors, low It may also contain one or more substances such as molecular compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, cytokines and the like.
  • a preferred basal medium used for induction of both CD4CD8 positive T cells is an ⁇ MEM medium containing serum, transferrin, serine, and L-glutamine. The kind and concentration of vitamin C added to the basal medium are the same as those in the case of induction of hematopoietic progenitor cells described above.
  • the medium used for induction of both CD4CD8 positive T cells of the present invention preferably further contains a cytokine selected from the group consisting of FLT3L and IL-7.
  • the concentration of IL-7 in the medium used for induction of both CD4CD8 positive T cells is, for example, 0.01 ng / ml to 100 ng / ml, and preferably 0.1 ng / ml to 10 ng / ml.
  • the concentration of FLT3L in the medium used for the induction of both CD4CD8 positive T cells is, for example, 1 ng / ml to 100 ng / ml.
  • hematopoietic progenitor cells may be cultured by adhesion or suspension culture.
  • the culture vessel may be coated and used, or cocultured with feeder cells, etc. .
  • feeder cells to be co-cultured are bone marrow stromal cell line OP9 cells (available from RIKEN BioResource Center).
  • the OP9 cells may preferably be OP-DL1 cells that constantly express Dll1 (HolmesolR1 and Zuniga-Pflucker JC. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2)).
  • OP9 cells When OP9 cells are used as feeder cells, it can also be carried out by adding separately prepared fusion proteins such as Dll1 or Dll1 and Fc to the medium.
  • Dll1 as NCBI accession numbers, NM_005618 for humans, NM_007865 for mice, proteins encoded by the gene having the nucleotide sequence described in NM_007865, and high sequence identity (for example, 90% or more) with these And naturally occurring variants having equivalent functions are included.
  • feeder cells when producing both CD4CD8 positive T cells, it is preferable to perform the culture by appropriately replacing the feeder cells.
  • the exchange of the feeder cells can be performed by transferring the target cells in culture onto the feeder cells previously seeded.
  • the culture temperature conditions for culturing hematopoietic progenitor cells to induce both CD4CD8 positive T cells are not particularly limited, but for example, about 37 ° C to about 42 ° C, preferably about 37 to about 39 ° C are preferable.
  • the culture period can be appropriately determined by those skilled in the art while monitoring the number of CD4CD8 positive T cells.
  • the number of days is not particularly limited as long as hematopoietic progenitor cells can be obtained. For example, it is 10 days or more.
  • CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells activate CD4CD8 both positive T cells as IL-7 and T cell receptors. It can be produced by culturing in a medium containing an agent. This step is preferably an adhesion culture, preferably without feeder cells, and CD4CD8 positive T cells are directly adhered to a culture vessel coated with fibronectin fragment and / or Notch ligand. preferable.
  • the concentration of IL-7 in the medium used for the induction of CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells is the concentration of IL-7 in the medium used in the above-mentioned “step of inducing CD4CD8 positive T cells from hematopoietic progenitor cells”.
  • Higher concentrations of IL-7 are preferred, for example 0.05 ng / ml to 500 ng / ml, preferably 0.1 ng / ml to 100 ng / ml, more preferably 0.5 ng / ml 50 ng / ml.
  • the T cell receptor activator examples include PHA (phytohemagglutinin), anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody, PMA and ionomycin.
  • the T cell receptor (TCR) can be stimulated by adding anti-CD3 antibody or the like to the medium and culturing both CD4CD8 positive T cells for a certain period.
  • the anti-CD3 antibody or the like may be one to which magnetic beads or the like are bound, and instead of adding the antibody to the medium, the T cell is placed on a culture dish having the anti-CD3 antibody bound to the surface. Stimulation may be given by culturing for a certain period. This case also corresponds to culture in a medium containing a TCR activator.
  • the concentration of the anti-CD3 antibody to be bound on the surface of the culture dish is not particularly limited, but is, for example, 0.1 to 100 ⁇ g / ml.
  • the T cell receptor activator is contained in the medium together with IL-7 at the start of “the step of inducing CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells from both CD4CD8 positive T cells”, preferably 1-2 days, After culturing, replace with medium containing IL-7 and no T cell receptor activator (for example, T cell receptor activator concentration is less than 1 ng / mL to below detection limit) and continue culturing. It is preferable to do.
  • a culture vessel coated with a fibronectin fragment and / or a Notch ligand at the timing of replacement with a medium not containing a T cell receptor activator. Then, further culturing is preferably performed in a medium preferably containing IL-7, IL-21 and Flt3L using an incubator containing neither (not coated with) fibronectin fragment or Notch ligand. Is more preferable.
  • the medium used for the induction process of CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells is not particularly limited, but the medium used for animal cell culture may be prepared by adding IL-7 or a TCR activator to a basal medium. it can.
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • Ham's F12 medium RPMI 1640 medium
  • Fischer's medium Neurobasal Medium (Life Technologies) and mixed media thereof.
  • Serum may be contained in the medium, or serum-free may be used.
  • the basal medium can be, for example, albumin, insulin, transferrin, selenium, fatty acids, trace elements, 2-mercaptoethanol, thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, non-essential amino acids, vitamins, growth factors, low It may also contain one or more substances such as molecular compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, cytokines and the like.
  • a preferred basal medium is an ⁇ MEM medium containing serum, transferrin, serine, L-glutamine, and ascorbic acid.
  • the medium used in the CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cell induction step preferably further contains cytokines other than IL-7 and vitamin Cs.
  • the cytokine include FLT3L and IL-21. It is preferable that the medium does not contain IL-15 (for example, the IL-15 concentration is less than 1 ng / mL to the detection limit or less).
  • the medium used for the CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cell induction step may contain a caspase inhibitor. Examples of caspase inhibitors include Pan Caspase fmk Inhibitor Z-VAD.
  • the type and concentration of vitamin C used for induction of CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells are the same as in the case of induction of hematopoietic progenitor cells described above.
  • the concentration of FLT3L in the medium used for the induction of CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells is, for example, 1 ng / ml to 100 ng / ml.
  • the concentration of IL-21 in the medium used for induction of CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells is, for example, 1 ng / ml to 100 ng / ml.
  • the Notch ligand means a substance that can bind to the Notch signal receptor and activate the Notch signal.
  • Notch signal receptor is a one-time transmembrane protein.
  • Notch receptor consisting of extracellular domain (NECD), transmembrane domain (TM) and intracellular domain (NICD) is cleaved into TM-NICD by processing.
  • NECD extracellular domain
  • TM transmembrane domain
  • NICD intracellular domain
  • TM-NICD intracellular domain
  • TM-NICD intracellular domain
  • ligand of this Notch signal receptor include members of the Delta-like family (DLL1, DLL3, DLL4) and the Jagged family (JAG1, JAG2).
  • the ligand of the Notch signal receptor may be a recombinant or a fusion protein with Fc or the like, and is commercially available from Adipogen, for example, and can be easily used.
  • the ligand of the Notch signal receptor used in the present invention is preferably DLL4 or JAG1.
  • the fibronectin (FN) fragment is selected from fragments contained in the FN binding domain, cell adhesion domain or heparin binding domain.
  • at least one fragment selected from III 1 , III 2 , III 3 , III 7 , III 8 , III 9 , III 11 , III 12 , III 13 and CS-1 may be included, and more than one domain It may be a fragment linked repeatedly.
  • a fragment containing a cell adhesion domain containing a ligand for VLA-5, a heparin binding domain, a CS-1 domain that is a ligand for VLA-4, III 1 and the like can be used in the present invention.
  • the fragment include J.I. Biochem.
  • CH-271, CH-296, H-271, H-296, and derivatives and modifications thereof are exemplified.
  • the aforementioned CH-296 is commercially available under the name of RetroNectin (registered trademark).
  • RetroNectin registered trademark
  • 2/3 of the polypeptide of the C-terminal side of the III 1 are commercially available with Fibronectin Fragment III 1 -C name.
  • the FN fragment may be used after being immobilized on a suitable solid phase, for example, a cell culture carrier such as cell culture equipment, beads, membrane, slide glass or the like. Immobilization of the FN fragment to the solid phase can be performed, for example, according to the method described in WO 00/09168.
  • the concentration of the FN fragment used in the present invention is not particularly limited. For example, it is added to the medium so that the final concentration is 0.001 to 500 ⁇ g / mL, preferably 0.01 to 500 ⁇ g / mL.
  • the FN fragment When the FN fragment is used after being immobilized, it may be immobilized on a solid phase using the FN fragment solution having the above concentration.
  • Notch ligands can also be used by immobilizing them in cell culture equipment with the same concentration and method.
  • the temperature condition for culturing both CD4CD8 positive T cells to induce CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells is not particularly limited, but for example, about 37 ° C. to about 42 ° C., about 37 ° C. About about 39 ° C is preferable.
  • the culture period can be appropriately determined by those skilled in the art while monitoring the number of CD8-positive T cells.
  • the number of days is not particularly limited as long as hematopoietic progenitor cells can be obtained, but for example, it is 1 day or longer.
  • Expansion culture can be performed using, for example, a medium containing IL-7, IL-15, and IL-21. Or in addition to IL-7, IL-15, IL-21, IL-18, IL-12 and TL1A (TNF-like ligand 1A, also known as Vascular endothelial growth inhibitor (VEGI) or TNF superfamily member 15 (TNFSF15)) It can be performed using a medium containing one or more.
  • VEGI Vascular endothelial growth inhibitor
  • TNFSF15 TNF superfamily member 15
  • CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells from a cell group obtained from both CD4CD8 positive T cells using FACS, an affinity column or the like, and then use them for the above expansion culture.
  • the selection can be performed, for example, using one or more of CD8 ⁇ positive, CD5 positive, CD336 negative, and CD1a negative as an index. Since CD8 ⁇ is a TCR co-receptor, CD8 ⁇ -positive sorting makes it possible to select CTLs with high antigen recognition ability, and to remove abnormal NK-like cells. According to selection using CD5 positive as an index, cells that stably express CD8 ⁇ and have high proliferation ability can be selected.
  • CD1a is an immature T cell marker
  • immature cells can be removed by selection using CD1a negative as an indicator.
  • CD336 is a marker that is not expressed by normal CTLs and is expressed only by innate immune cells, abnormal NK-like cells can be removed by selection using CD336 negative as an index.
  • the medium used for the expansion culture process of CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells is not particularly limited, but the medium used for animal cell culture is changed to a basal medium such as IL-7, IL-15, and IL-21. It can be prepared by adding a cytokine.
  • a basal medium such as IL-7, IL-15, and IL-21.
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • Ham's F12 medium RPMI 1640 medium
  • Fischer's medium Neurobasal Medium (Life Technologies) and mixed media thereof.
  • Serum may be contained in the medium, or serum-free may be used.
  • the basal medium can be, for example, albumin, insulin, transferrin, selenium, fatty acids, trace elements, 2-mercaptoethanol, thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, non-essential amino acids, vitamins, growth factors, low It may also contain one or more substances such as molecular compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, cytokines and the like.
  • a preferred basal medium is an ⁇ MEM medium containing serum, transferrin, serine, L-glutamine, and ascorbic acid.
  • the medium used for the CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cell expansion culture step preferably further contains an anti-CD3 antibody and vitamin Cs.
  • the type and concentration of vitamin C used in the expansion culture process of CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells are the same as described above.
  • the concentration of IL-7 in the medium used for the expansion culture process of CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells is, for example, 1 ng / ml to 100 ng / ml.
  • the concentration of IL-15 in the medium used for the expansion culture process of CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells is, for example, 1 ng / ml to 100 ng / ml.
  • the concentration of IL-21 in the medium used for the expansion culture process of CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells is, for example, 1 ng / ml to 100 ng / ml.
  • the concentration of IL-12 in the medium used for the expansion culture process of CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells is, for example, 1 ng / ml to 100 ng / ml.
  • the concentration of IL-18 in the medium used for the expansion culture process of CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells is, for example, 1 ng / ml to 100 ng / ml.
  • the concentration of TL1A in the medium used for the expansion culture process of CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells is, for example, 1 ng / ml to 100 ng / ml.
  • the anti-CD3 antibody is not particularly limited as long as it specifically recognizes CD3, and examples thereof include an antibody produced from an OKT3 clone.
  • the concentration of the anti-CD3 antibody in the medium is, for example, 10 ng / ml to 10 ⁇ g / ml.
  • the anti-CD3 antibody may be immobilized in an incubator with an anti-CD3 antibody instead of being added to the medium.
  • the anti-CD3 antibody may be removed during expansion culture.
  • the temperature conditions for the expansion culture process of CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells are not particularly limited, but for example, about 37 ° C. to about 42 ° C., preferably about 37 to about 39 ° C. are preferable.
  • the culture period can be appropriately determined by those skilled in the art while monitoring the number of CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells.
  • the number of days is not particularly limited as long as CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells can be obtained, but it is, for example, 5 days or more.
  • IL-7 and IL-15 are preferably present in the medium throughout the expansion culture step, whereas IL-21, IL-18, IL-12 and TL1A are in the expansion culture step. As long as it is present in the medium at the initial stage (for example, 12 hours, 16 hours, 24 hours or 72 hours from the start of expansion culture), it may not be contained in the medium thereafter.
  • CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells may be co-cultured with feeder cells.
  • a feeder cell it is a peripheral blood mononuclear cell (PBMCC) from a viewpoint of promoting the maturation and proliferation of CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cell through cell contact etc. Is preferred.
  • PBMCC peripheral blood mononuclear cell
  • the expansion culture step can also be applied to T cells other than cells derived from pluripotent stem cells, such as T cell clones and T cells isolated from living bodies. Therefore, the present invention provides a method for expanding T cells comprising the step of culturing T cells in a medium containing IL-7 and IL-15, and one or more of IL-21, IL-18, IL-12 and TL1A. provide. The present invention also provides a T cell culture medium containing IL-7 and IL-15, and one or more of IL-21, IL-18, IL-12 and TL1A.
  • the T cell here is preferably a cytotoxic T cell, more preferably a CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cell, but as described above, it is not limited to a T cell other than a pluripotent stem cell-derived cell, It may be a T cell clone or a T cell isolated from a living body.
  • CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells (culture) produced by the method of the present invention have antigen-specific cytotoxic activity as shown in the Examples below. Accordingly, CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells, preferably human CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells, produced by the method of the present invention may be used in, for example, tumors, infections (eg, chronic infections), autoimmune deficiencies. It is useful in the treatment or prevention of diseases such as
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells produced by the method of the present invention, and cell immunotherapy using the CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells.
  • the administration of T cells (CD8 ⁇ + ⁇ + CTL) to a treatment subject is not particularly limited, but is preferably administered parenterally, for example, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous or intramuscular It can be administered, more preferably it can be administered intravenously. Alternatively, it can be administered locally to the affected area.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by formulating CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells produced by the method of the present invention by a known pharmaceutical method.
  • it can be used mainly parenterally as capsules, liquids, film coating agents, suspensions, emulsions, injections (intravenous injections, infusions, etc.).
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oil, solvent, base, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, vehicle, Combined with preservatives, binders, diluents, tonicity agents, soothing agents, extenders, disintegrating agents, buffering agents, coating agents, lubricants, colorants, solubilizers or other additives as appropriate.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oil, solvent, base, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, vehicle, Combined with preservatives, binders, diluents, tonicity agents, soothing agents, extenders, disintegrating agents, buffering agents, coating agents, lubricants, colorants, solubilizers or other additives as appropriate.
  • the dosage is appropriately selected according to the age, weight, symptom, health condition of the subject, type of composition (pharmaceutical, food and drink, etc.) and the like.
  • the cellular immunotherapy using the CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cell of the present invention comprises a step of isolating a T cell having a desired antigen specificity from a human and iPS from the T cell having the desired antigen specificity.
  • the subject from whom T cells are isolated is the subject to whom the CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells obtained by the present invention are administered and the type of HLA.
  • the cells to be administered CD8 ⁇ + ⁇ + cytotoxic T cells produced by the method of the present invention may be administered as they are, and as described above, they are administered in the form of a formulated pharmaceutical composition. Also good.
  • Cell iPS cells (TKT3v 1-7 strain) were isolated after consent using the method described in Nishimura T, et al., Cell Stem Cell. 12 (1): 114-126, 2013. It was established from human CD3-positive T cells.
  • C3H10T1 / 2 cells and OP9 / DLL1 cells were obtained from RIKEN / RIKEN BioResource Center and used.
  • K562 / HLA A-24 was provided by Dr. Tachikawa at the University of Tokyo (now the National Institute of Infectious Diseases).
  • Hematopoietic cells (CD34 + hematopoietic progenitor cells) contained in the obtained net-like structure (also referred to as iPS-SAC) were collected and seeded on OP9 / DLL1 cells.
  • OP9 medium supplemented with 10 ng / mL FLT3L and 1 ng / mL IL-7 (15% FBS, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml phospho ascorbic acid, 100 ng / ml streptomycin, 5.5 ⁇ g / mL human transferrin and
  • the cells were cultured for 23 days under normal pressure oxygen conditions ( ⁇ MEM supplemented with 5 ng / mL sodium selenite) (Day 37). Cells were seeded on new OP9 / DLL1 cells every 3-4 days.
  • the medium was transferred to a plate coated with 5 ⁇ g / ml Retronectin (Takara Bio Inc.) and cultured.
  • the medium used was that obtained by removing only anti-CD3 antibody from Day 37.
  • the incubator coated with Retrotronectin was prepared by placing these solutions in the incubator and allowing to stand at 4 ° C. overnight, and then washed with PBS.
  • the medium was changed to a medium composition of Day 38 with an IL-21 concentration of 10 ng / ml, transferred to a plate not coated with Fc-DLL4 and Retrotronectin, and further cultured.
  • Cells were collected at Day 43, and CD8 ⁇ + CD336 ⁇ CD5 + CD1a ⁇ cells were sorted by FACS.
  • Feeder-free expansion culture 1 ⁇ g / ml anti-CD3 antibody (OKT3) diluted with PBS was added to a 96-well flat bottom plate and allowed to stand at 4 ° C. overnight to prepare an OKT3 coated plate.
  • CD8 ⁇ + CD5 + CD1a - cells obtained above contain 20% FBS, PSG, ITS, 50 ⁇ g / ml phospho ascorbic acid, 5ng / ml IL-7, 5ng / ml IL-15, 10ng / ml IL-21 The suspension was suspended in ⁇ MEM medium, transferred to an OKT3 coated plate, and cultured for 16 hours.
  • CTL comparative control
  • a conventional protocol a method of directly expanding culture after the DP cell induction step without passing through the maturation step was adopted.
  • the cells were transferred to wells that were not coated with OKT3, and culture was continued by performing a half-medium change once every three days thereafter.
  • an ⁇ MEM medium containing 20% FBS, PSG, ITS, 50 ⁇ g / ml phospho ascorbic acid, 5 ng / ml IL-7, and 5 ng / ml IL-15 was used.
  • the cells on the 14th day from the start of expansion culture were subjected to the following experiment as CD8 ⁇ + ⁇ + CTL (improved iPSC-CTL).
  • the binding of the improved iPSC-CTL prepared by the method of the present invention to the HLA-tetramer was the same as that of the original CTL. It was equally high.
  • conventional CTL obtained by the conventional method did not express CD8 ⁇ even though it expressed TCR to the same extent, so binding to HLA-tetramer was remarkably weak.
  • iPSC-CTL Modified CD8b + CTL
  • conventional iPSC-CTL conventional CD8b - CTL
  • CFSE decay with proliferation and production of two types of cytokines, IFN ⁇ and IL-2 were examined.
  • CFSE is a reagent that is used in proliferation assays because the fluorescence intensity decreases with each proliferation (J Vis Exp. 2010; (44): 2259) (CFSE fluorescence is lower in cells that have been expanded).
  • FIG. the improved iPSC-CTL showed higher proliferation ability than the conventional one. It was also revealed that the cytokine production ability was significantly higher in the improved type.
  • iPSC-CTL Modified CD8b + CTL
  • conventional iPSC-CTL conventional CD8b - CTL
  • CD28 and CD27 are co-stimulatory molecules expressed only in naive or central memory cells
  • CCR7 is a homing molecule essential for immune surveillance, both of which are functional molecules directly linked to CTL function.
  • these molecules lost their expression from the original CTL during the ex vivo culture, but only the improved iPSC-CTL recovered the expression.
  • the iPSC-CTL is improved in a combination of CD45RA and CD45RO the most commonly used to distinguish naive cells and memory cells, CD45RA + CD45RO the conventional both - showed traits of naive cells.
  • iPSC-CTL Modified CD8b + CTL
  • expanded culture-part 1 expanded culture-part 1
  • PHA + PBMC or without feeder Stimulated with or without IL-21
  • production of cytokine IFN ⁇ and expression level of cytotoxic molecule Granzyme B were quantified.
  • FIG. 6 when IL-21 was added to the feeder-free expanded culture, it was revealed that not only the production of cytokine but also the expression of Granzyme B was promoted, and the functionality was maintained just like the on-feeder method. .
  • iPSC-CTL Modified CD8b + CTL prepared by the method of the present invention (expansion culture-1) is stimulated with PHA + PBMC to produce cytokine and cytotoxic activity I investigated. As shown in FIG. 7, the improved iPSC-CTL acquired cytotoxic activity with each repeated stimulation reflecting the naive phenotype, but lost the ability to produce IFN ⁇ .
  • iPSC-CTL Modified CD8b + CTL
  • original CTL prepared by the method of the present invention
  • FIG. time At the timing of 5 times, the production of cytokine IFN ⁇ and the expression level of the cytotoxic molecule Granzyme B were quantified.
  • iPSC-CTL prepared by a combination of on-feeder and feeder-free expansion culture assumed for clinical application was compared with the original CTL, the cytotoxic activity was slightly inferior to cytokine production ability. It became clear that both were equivalent.
  • CD56 and CD336, which are NK markers that are not expressed in normal CTL are induced by the addition of IL-15.
  • IL-15 increases the production efficiency of CD8 ⁇ + ⁇ + CTL, the desired cells are desirable CTL It was suggested that it does not have original characteristics.
  • the addition of IL-21 does not contribute to CD8 ⁇ + ⁇ + CTL production efficiency, but in addition to the absence of side effects that increase NK-related markers, the expression of CCR7 and important co-stimulatory molecule CD28 The effect of enhancing the amount was recognized.
  • Cytokine production profile analysis of prepared iPSC-CTL From past reports, mature CTL is differentiated from naive to central memory (CM), effector memory (EM), and most differentiated EMRA cells, IL-2 and IFN ⁇ It is known to alter the production profile of. Naive cells are more inclined to IL-2 production, and as differentiation progresses, cells that simultaneously produce IFN ⁇ and cells that produce only IFN ⁇ appear. The important point here is that it is well known that naive cells that are less differentiated show stronger antitumor effects in vivo than EM and EMRA that have undergone differentiation. As shown in FIG.
  • the IL-2 / IFN ⁇ profile of the improved iPSC-CTL produced by the method of the present invention was intermediate between naive and CM, and showed a very high IL-2 production ability like a shallowly differentiated cell.
  • iPSC-CTL naive / CM-like traits and high antitumor activity suggest iPSC-CTL naive / CM-like traits and high antitumor activity.
  • the results of FIG. 9 above suggested that the addition of IL-15 hindered the production of na ⁇ ve CTLs, but it was confirmed that the production capacity of IL-2 was reduced by the addition of IL-15. It was done.
  • the addition of IL-21 was found to increase IL-2 production. As described above, it was suggested that IL-21 addition is particularly useful in iPSC-CTL maturation culture by combining the results of FIGS.
  • the medium was transferred to a plate coated with 5 ⁇ g / ml Retronectin (Takara Bio Inc.) and 1 ⁇ g / ml Fc-DLL4 (Sino Biological Inc.) and cultured.
  • the medium used was that obtained by removing only anti-CD3 antibody from Day 37.
  • the incubator coated with Fc-DLL4 and Retrotronectin was prepared by placing these solutions in an incubator and allowing to stand at 4 ° C. overnight, and then washed with PBS.
  • the medium was replaced with Day ng medium further supplemented with 10 ng / ml IL-21, transferred to a plate not coated with Fc-DLL4 and Retrotronectin, and further cultured.
  • Cells were collected at Day 58, and CD8 ⁇ + CD336 ⁇ CD5 + CD1a ⁇ cells were sorted by FACS.
  • FIG. 11 shows the FACS result after the test.
  • conventional iPSC-CTL even when starting from both CD8 ⁇ / CD5 positive cells, both molecules (especially with CD5) have low expression stability, and thus expression greatly declined in one expanded culture.
  • CD8b + CD5 bright cells were found to be better than CD8b + CD5 ⁇ cells. It became clear that the overwhelmingly high proliferation ability was shown (FIG. 12). This is consistent with previous reports showing that CD5 is an indicator of hyperproliferative CTL (Nature Immunology, 16.1 (2015), 107-117.). The above results indicate that CD5 bright highly proliferative iPSC-CTL can be generated by the conventional method, but its efficiency and stability are very low, suggesting that CD 5- cells with low proliferation ability are mainly produced in many cases. It was done.
  • iPSC-CTL Modified CD8b + CTL prepared by the method of the present invention (expansion culture-2) is stimulated with PHA + PBMC to produce cytokine and cytotoxicity The activity was examined. As a result, as shown in FIG. 16, when expanded culture was performed by adding one or more of IL-21, IL-12, IL-18, and TL1A in addition to IL-7 and IL-15 basic cytokines, the proliferation rate was increased. It was found that not only cytokine production ability and cytotoxic activity were improved.

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Abstract

細胞免疫療法に適した本来の獲得免疫系リンパ球の特性を有する細胞傷害性Ｔ細 胞を効率よく製造する方法を提供すること。 D8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法であって、 CD4CD8両陽性T細胞を、IL-7およびT細胞受容体活性化剤を含む培地で培養してCD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞へと誘導する工程を含む方法。

Description

ＣＤ８α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法
　本発明は、CD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法に関し、好ましくは、多能性幹細
胞からのCD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法に関する。
　悪性腫瘍や慢性難治性感染症の制圧には疾患関連抗原に特異的な細胞傷害性T細胞（Cytotoxic T lymphocyte; CTL）を用いた細胞免疫療法が極めて有効な可能性がある。従来in vitroの培養系で抗原特異的CTLを製造することが試みられてきたが、in vitroの培養系で不可避である細胞疲弊のため十分な数の抗原特異的なCTLを調製することが困難であり、そのため治療効果も限定されていた。しかしながら近年登場した人工多能性幹細胞（iPSC）技術は細胞ソースの問題を抜本的に解決する道を示しつつある。つまり少数のしかも疲弊した疾患抗原特異的CTLから無限に増殖できるiPSCを作製し、in vitroで無限にCTLを再生する戦略が可能となりつつある。
　例えば、特許文献１では、多能性幹細胞から造血前駆細胞を誘導する工程、造血前駆細胞からCD4CD8両陽性細胞を誘導する工程、およびCD4CD8両陽性細胞からCD8陽性T細胞を誘導する工程を含むT細胞の製造方法が開示されている。
　また、特許文献２には、ビタミンC類を添加した培地を利用して多能性幹細胞からCD4CD8両陽性T細胞を誘導し、それを副腎皮質ホルモン剤を含む培地で培養してCD8陽性T細胞を製造する方法が開示されている。
　しかし、これらの方法では多能性幹細胞から細胞傷害性T細胞を製造するには十分とはいえない。
　また、特許文献３および非特許文献１では、ヒト末梢血CTLからiPSCを誘導し、そのiPSCから造血前駆細胞を製造し、そしてIL（インターロイキン）-2、IL-7及びIL-15を含む培地中でNotch ligandであるDLL-1を発現するOP9/DLL1細胞と共培養することでCTLまで最終分化させることに成功したことが開示されている。
WO 2011/096482 WO/2016/076415 WO/2013/176197
Cell Stem Cell. 2013 Jan 3;12(1):114-26.
　特許文献３および非特許文献１で開示された再分化CTLはオリジナルCTLの抗原特異性を保持しながら高い細胞傷害活性、サイトカイン産生、増殖能等のCTL機能の全てを備えるものであったが、一方で通常のCTLでは認められないNK細胞様の特性も併せ持つことが明らかとなった。すなわち、オリジナルCTLを含め通常のCTLは獲得免疫系リンパ球に属するのに対し、再分化CTLはNK細胞が属する自然免疫系リンパ球の特性を持っていたのである。この再分化CTLで認められた自然免疫系リンパ球の特性の中で臨床応用において特に影響が大きいと思われるものは、（１）抗原非特異的にターゲットを傷害するナチュラルキラー（NK）活性、（２）NK活性を惹起する各種活性化分子(NKp46等)の恒常的発現、（３）通常の獲得免疫系CTLに比べ相対的に低い増殖性と生存能、（４）抗原レセプターの補助分子であるCD8が通常のCD8αβヘテロダイマーではなくCD8ααホモダイマーであるため起きる抗原認識能の低下である。（１）、（２）についてはエスケープバリアントに対する有効性が期待できる一方、予期できない移植片対宿主病（graft versus host disease; GVHD）のリスクが伴う。（３）の低い増殖性、生存能については不十分なin vivo persistencyが細胞免疫療法の成績を悪化させることが過去の報告で既に示されている。そして（４）のCD8αβの発現欠如もCTLの抗原認識能低下に直結するため修正されなければならない。
　このような自然免疫系リンパ球の特性は必ずしも細胞免疫療法に適していないため、本発明は細胞免疫療法に適した本来の獲得免疫系リンパ球の特性を有するCTLを効率よく製造する方法を提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、CD4CD8両陽性T細胞を培養する際に、IL-7およびT細胞受容体活性化剤を含む培地で培養する工程を行うことにより、NK活性を示さず、CD8αβの発現を長期間維持したCTL、つまり通常の獲得免疫系CTLにより近いCTLの作製に成功した。このような知見に基づき、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
［１］CD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法であって、
CD4CD8両陽性T細胞を、IL（Interleukin）-7およびT細胞受容体活性化剤を含む培地で培養してCD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞へと誘導する工程を含む方法。
［２］前記T細胞受容体活性化剤は抗CD3抗体である、［１］に記載の方法。
［３］前記培地はさらにIL-21およびFlt3L(Flt3 Ligand)を含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］下記工程（ａ）および（ｂ）を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
（ａ）CD4CD8両陽性T細胞をIL-7およびT細胞受容体活性化剤を含む培地で培養する工程、
および
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、IL-7を含み、T細胞受容体活性化剤を含まない培地で培養する工程。
［５］前記培養（ｂ）はフィブロネクチンフラグメント及び／又はNotchリガンドを含む培養器を使用して行われる、［４］に記載の方法。
［６］フィブロネクチンフラグメントがレトロネクチンであり、NotchリガンドがDelta-like 4 (DLL4)である、［５］に記載の方法。
［７］さらに下記工程（ｃ）を含む、［５］または［６］に記載の方法。
（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、フィブロネクチンフラグメント及びNotchリガンドのいずれも含まない培養器を使用して、IL-7、IL-21およびFlt3Lを含む培地で培養する工程。
［８］下記工程（ａ１）、（ｂ１）および（ｃ１）を含む、［７］に記載の方法。
（ａ１）CD4CD8両陽性T細胞を、IL-7、Flt3L、IL-21および抗CD3抗体を含む培地で培養する工程、
（ｂ１）工程（ａ１）で得られた細胞を、IL-7、Flt3LおよびIL-21を含み、抗CD3抗体を含まない培地で、フィブロネクチンフラグメントを含む培養器を用いて培養する工程、および
（ｃ１）工程（ｂ１）で得られた細胞を、IL-7、IL-21およびFlt3Lを含む培地で、フィブロネクチンフラグメント及びNotchリガンドのいずれも含まない培養器を用いて培養する工程。
［９］下記工程（ａ２）、（ｂ２）および（ｃ２）を含む、［７］に記載の方法。
（ａ２）CD4CD8両陽性T細胞を、IL-7、Flt3Lおよび抗CD3抗体を含む培地で培養する工程、
（ｂ２）工程（ａ２）で得られた細胞を、IL-7、およびFlt3Lを含み、抗CD3抗体を含まない培地で、フィブロネクチンフラグメントおよびNotchリガンドを含む培養器を用いて培養する工程、
（ｃ２）工程（ｂ２）で得られた細胞を、IL-7、IL-21およびFlt3Lを含む培地で、フィブロネクチンフラグメント及びNotchリガンドのいずれも含まない培養器を用いて培養する工程。
［１０］前記培養はフィーダー細胞を用いずに行われる、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］さらに、得られたCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞の選別工程を含む、［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］前記選別工程はCD8β陽性、CD5陽性、CD336陰性およびCD1a 陰性の１つ以上を指標にして行われる、［１１］に記載の方法。
［１３］さらに、CD8α＋β＋細胞傷害性T細胞をIL-7、IL-15およびIL-21を含む培地で拡大培養する工程を含む、［１］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］さらに、CD8α＋β＋細胞傷害性T細胞をIL-7およびIL-15、並びにIL-21、IL-18、IL-12およびTL1Aの一種以上を含む培地で拡大培養する工程を含む、［１］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１５］前記CD4CD8両陽性T細胞は多能性幹細胞から誘導されたものである、［１］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］前記多能性幹細胞は人工多能性幹（iPS）細胞である、［１５］に記載の方法。
［１７］多能性幹細胞からCD4CD8両陽性T細胞への誘導が下記工程（ａ）および（ｂ）を含む、［１５］または［１６］に記載の方法。
（ａ）多能性幹細胞をビタミンC類を添加した培地で培養し、造血前駆細胞を誘導する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で得られた造血前駆細胞を、ビタミンC類、FLT3LおよびIL-7を含む培地で培養し、CD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程。
［１８］多能性幹細胞からのCD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法であって、
（ａ）多能性幹細胞をビタミンC類を添加した培地で培養し、造血前駆細胞を誘導する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた造血前駆細胞を、ビタミンC類、FLT3LおよびIL-7を含む培地で培養し、CD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得られたCD4CD8両陽性T細胞を、IL-7およびT細胞受容体活性化剤を含む培地で培養してCD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞へと誘導する工程を含む方法。
［１９］工程（ｃ）の培地におけるIL-7の濃度は、工程（ｂ）の培地におけるIL-7の濃度よりも高い、［１８］に記載の方法。
［２０］製造されるCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞はナチュラルキラー（NK）活性を示さない、［１］～［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］［１］～［２０］のいずれかに記載の方法で得られたCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞培養物。
［２２］［１］～［２０］のいずれかに記載の方法で得られたCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞を含む、医薬組成物。
　本発明によれば、NK活性を示さず、長期間培養してもCD8αβの発現を維持した通常の獲得免疫系CTLにより近いCTLを作製することができる。本発明の方法で得られるCTLは従来のものより高い抗原特異的細胞傷害活性、サイトカイン産生、増殖能を示す。さらに、本発明の方法で得られるCTLは自然免疫系から獲得免疫系リンパ球への分化シフトのみならず、細胞疲弊がないナイーブ/メモリー細胞への成熟とその形質維持という優れた性質を有し、in vitroで１００兆倍以上の拡大培養が可能という、特筆すべき増殖能力を示す。したがって、本発明は細胞の確保に難がある現状の細胞免疫療法に対し多大な貢献をするものである。
図１は、本発明の方法で作製した改良型（Modified）iPSC-CTL、iPS細胞の元になったT細胞クローン（Original CTL clone）および従来法で作製したiPSC-CTL（conventional iPSC-CTL）のフローサイトメトリーの結果を示す。上図は、CD8αとCD8βで展開した図を示し、下図は、TCRとHLA-tetramerの染色強度で展開した図を示す。 図２は、本発明の方法で作製した改良型iPSC-CTL(Modified CD8b+ CTL)と従来型iPSC-CTL(conventional CD8b- CTL)をCFSEで染色し特異抗原ペプチドを提示したK562/HLA A-24で刺激したときの増殖能（上図：縦軸は細胞数、横軸はCFSE蛍光強度）、並びにIFNγおよび IL-2の二種のサイトカイン産生を調べた結果（下図）を示す図。 図３は、本発明の方法で作製した改良型iPSC-CTL(Modified CD8b+ CTL)と従来型iPSC-CTL(conventional CD8b- CTL)を特異抗原ペプチドをパルスしたK562/HLA A-24と共培養したときの抗原ペプチド量と細胞傷害活性の関係を示す図。 図４は、本発明の方法で作製した改良型iPSC-CTL(Modified CD8b+ CTL)と従来型iPSC-CTL(conventional CD8b- CTL)、元のT細胞クローンを、CD28、CD27、CCR７でFACS解析した結果（左）およびCD45RAとCD45ROの組み合わせでFACS解析した結果（右）を示す。 図５は、本発明の方法で作製した改良型iPSC-CTL(Modified CD8b+ CTL)と従来型iPSC-CTL(conventional CD8b- CTL)の増殖を解析した結果を示す（拡大培養開始時をDay 0として示す）。 図６は、本発明の方法で作製した改良型iPSC-CTL(Modified CD8b+ CTL)をPHA + PBMCあるいは無フィーダー下（IL-21添加または非添加）に刺激しサイトカイン（IFNγ）の産生と細胞傷害性分子（Granzyme B）の発現量を定量した結果を示す。 図７は、本発明の方法で作製した改良型iPSC-CTL(Modified CD8b+ CTL)のサイトカイン（IFNγ）産生と細胞傷害活性を測定した結果を示す。 図８は、本発明の方法で作製した改良型iPSC-CTL(Modified CD8b+ CTL)とオリジナルのCTLをサイトカインの産生と細胞傷害性分子の発現量を定量した結果を示す。 図９は、IL-7, IL-21添加のCD8α+β+CTLの産生量及び表面マーカーに対する効果の解析結果を示す。 図１０は、作製されたiPSC-CTLおよびPrimary CTLのサイトカイン産生プロファイル解析結果を示す。 図１１は、従来法で成熟させたiPSC-CTLからCD8β/CD5両陽性細胞をソートし、PHA on-feeder拡大培養２週間を行った後のFACS解析の結果を示す。 図１２は、拡大培養後の従来法iPSC-CTLをCD8β+CD5bright細胞とCD8β+CD5- 細胞に分けてfeeder-free条件で二回目の拡大培養を行った後の増殖能の解析を示す。 図１３は、改良型iPSC-CTLからCD8β/CD5両陽性細胞をソートし、PHA on-feeder拡大培養を４回繰り返した後のFACS解析の結果を示す。 図１４は、フィーダー有り無しで拡大培養した改良型iPSC-CTLとナイーブCTLの増殖を解析した結果を示す。 図１５は、各サイトカイン含有培地で2週間拡大培養したときの改良型iPSC-CTL(Modified CD8b+ CTL)と親CTLクローン(H25-4)の増殖を解析した結果を示す（拡大培養開始時に対する増加率として示す）。 図１６は、各サイトカイン含有培地で2週間拡大培養したときの改良型iPSC-CTL(Modified CD8b+ CTL)の細胞傷害活性とサイトカイン産生と増殖率を測定した結果を示す。
　本発明は、CD8α＋β＋細胞傷害性T細胞の製造方法であって、
CD4CD8両陽性T細胞を、IL-7およびT細胞受容体活性化剤を含む培地で培養してCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞へと誘導する工程を含む方法を提供する。
　本発明において、CD8α＋β＋細胞傷害性T細胞とは、T細胞のうち、表面抗原のCD8αおよびCD8βの両方が陽性である細胞（CD4は陰性）を意味し、細胞傷害活性を有するT細胞を意味する。
　細胞傷害性T細胞（CTL）は、その細胞表面上に存在するT細胞受容体（TCR）を介して、抗原提示細胞のクラス１主要組織適合抗原（MHCクラス１、HLAクラス１）と共に提示された、ウィルスや腫瘍等由来の抗原ペプチドを認識し、異物である該抗原ペプチドを提示する細胞に対して、特異的に細胞傷害活性を発揮する。細胞傷害活性は例えばグランザイムやパーフォリンなどの分泌又は産生を指標として確認することができる。
　一方、CD4CD8両陽性T細胞は、T細胞のうち、表面抗原のCD4およびCD8が共に陽性である細胞（CD8+CD4+）を意味する。CD4CD8両陽性T細胞は、誘導によってCD4陽性細胞（CD8-CD4+）またはCD8陽性細胞（CD8+CD4-）へと分化させることができる。本発明においては、CD4CD8両陽性T細胞からCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞を誘導する。
　CD4CD8両陽性T細胞の由来は特に制限されないが、多能性幹細胞から分化誘導して得られるCD4CD8両陽性T細胞であることが好ましい。
多能性幹細胞
　本発明において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、CD4CD8両陽性T細胞に誘導される任意の細胞が包含される。多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、人工多能性幹（iPS）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、製造工程において胚、卵子等の破壊をしないで入手可能であるという観点から、iPS細胞であり、より好ましくはヒトiPS細胞である。
　iPS細胞の製造方法は当該分野で公知であり、体細胞へ初期化因子を導入することによって製造され得る。ここで、初期化因子とは、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等の遺伝子または遺伝子産物が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat. Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
　体細胞には、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含され、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。
　本発明では、CTLを製造する目的に使用するため、T細胞受容体（T cell receptor: TCR）の遺伝子再編成が行われたリンパ球（T細胞）を体細胞として用いてiPS細胞を製造することが好ましい。リンパ球を体細胞として用いる場合、初期化の工程に先立ち当該リンパ球をIL-2の存在下にて抗CD３抗体及び抗CD28抗体によって刺激して活性化することが好ましい。かかる刺激は、例えば、培地中に、IL-2、抗CD3抗体及び抗CD28抗体を添加して前記リンパ球を一定期間培養することによって行うことができる。また、これらの抗体を培地中に添加する代わりに、抗CD3抗体及び抗CD28抗体を表面に結合させた培養ディッシュ上で前記T細胞を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。さらに、ヒトT細胞が認識する抗原ペプチドをフィーダー細胞とともに培地中に添加することによって刺激を与えてもよい。
　本発明において製造されるCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞は、所望の抗原特異性を有することが好ましい。従って、iPS細胞の元となるリンパ球は、所望の抗原特異性を有することが望ましく、当該リンパ球は、所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製により特異的に単離されてもよい。例えば、所望の抗原を結合させたMHC（主要組織適合遺伝子複合体）を４量体化させたもの（いわゆる「MHCテトラマー」）を用いて、ヒトの組織より所望の抗原特異性を有するリンパ球を精製する方法も採用することができる。
　体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。本発明の方法によって製造されたCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞を細胞免疫療法に使用する場合、患者とヒト白血球型抗原（HLA）の型を適合させ易いという観点から、iPS細胞の元となる体細胞は、CD8α＋β＋細胞傷害性T細胞の投与対象から単離されることが好ましい。
　多能性幹細胞からCD4CD8両陽性T細胞を得る方法は特に限定されず、公知の方法を使用してもよいが、例えば、下記の工程（ａ）、（ｂ）を含む方法が挙げられる。
（ａ）多能性幹細胞を、ビタミンC類を添加した培地中で培養し、造血前駆細胞を誘導する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で得られた造血前駆細胞を、ビタミンC類、FLT3LおよびIL-7を含む培地中で培養し、CD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程。
　以下、これらの工程を具体的に説明する。ただし、本発明において、多能性幹細胞からCD4CD8両陽性T細胞を誘導する方法は以下には限定されない。
多能性幹細胞から造血前駆細胞を誘導する工程
　本明細書において、造血前駆細胞（Hematopoietic Progenitor Cells（HPC））とは、リンパ球、好酸球、好中球、好塩基球、赤血球、巨核球等の血球系細胞に分化可能な細胞であり、造血前駆細胞は、例えば、表面抗原であるCD34および/またはCD43が陽性であることによって認識できる。
　造血前駆細胞は、例えば、ビタミンC類を添加した培地中で多能性幹細胞を培養する工程を含む方法によって製造することができる。
　本発明において、ビタミンC類とは、L-アスコルビン酸およびその誘導体を意味し、L-アスコルビン酸誘導体とは、生体内で酵素反応によりビタミンCとなるものを意味する。L-アスコルビン酸の誘導体として、リン酸ビタミンC、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンCエステル、テトラヘキシルデカン酸アスコビル、ステアリン酸アスコビルおよびアスコルビン酸-2リン酸-6パルミチン酸が例示される。好ましくは、リン酸ビタミンCであり、例えば、リン酸-Lアスコルビン酸Naまたはリン酸-L-アスコルビン酸Mgなどのリン酸-Lアスコルビン酸塩が挙げられる。
　造血前駆細胞誘導工程に用いる培地は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地へビタミンC類を添加して調製することができる。基礎培地には、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清を使用してもよい。必要に応じて、基礎培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの1つ以上の物質も含有し得る。
　基礎培地は、例えば、血清、インスリン、トランスフェリン、セリン、チオールグリセロール、L-グルタミン、アスコルビン酸を含むIMDM培地である。
　造血前駆細胞誘導工程に用いる培地には、BMP4 (Bone morphogenetic protein 4)、VEGF (vascular endothelial growth factor)、SCF (Stem cell factor)およびFLT3L (Flt3 Ligand)からなる群より選択されるサイトカインが添加されていてもよい。より好ましくは、VEGF、SCFおよびFLT3Lを添加された培地が使用される。
　ビタミンC類は、例えば、5ng/mlから100μg/mlに相当する量で培地に添加される。
　VEGFは、例えば、10 ng/mlから100 ng/mlに相当する量で培地に添加される。
　SCFは、例えば、10 ng/mlから100 ng/mlに相当する量で培地に添加される。
　FLT3Lは、例えば、1 ng/mlから100 ng/mlに相当する量で培地に添加される。
　造血前駆細胞誘導工程において、多能性幹細胞は、接着培養または浮遊培養で培養され、接着培養の場合、コーティング剤をコーティングした培養容器を用いて行ってもよく、また他の細胞と共培養してもよい。共培養する他の細胞として、C3H10T1/2（Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830, 2010）、異種由来のストローマ細胞（Niwa A et al. J Cell Physiol. 2009 Nov;221(2):367-77.）が例示される。コーティング剤としては、マトリゲル（Niwa A, et al. PLoS One.6(7):e22261, 2011）が例示される。浮遊培養では、Chadwick et al. Blood 2003, 102: 906-15、Vijayaragavan et al. Cell Stem Cell 2009, 4: 248-62、およびSaeki et al. Stem Cells 2009, 27: 59-67に記載の方法が例示される。
　造血前駆細胞は、多能性幹細胞を培養することで得られるネット様構造物（ES－sac又はiPS－sacとも称する）から調製することもできる。ここで、「ネット様構造物」とは、多能性幹細胞由来の立体的な嚢状（内部に空間を伴うもの）構造体で、内皮細胞集団などで形成され、内部に造血前駆細胞を含む構造体である。
　造血前駆細胞誘導工程の温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃～約42℃程度であり、約37～約39℃程度が好ましい。培養期間は、例えば、6日間以上である。低酸素条件で培養してもよく、低酸素条件とは、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％またはそれら以下の酸素濃度が例示される。
　造血前駆細胞誘導工程の培養は、上記の条件を適宜組み合わせて行うことができる。組み合わせとして、（i）多能性幹細胞をビタミンC類を添加した基礎培地中で、C3H10T1/2上において低酸素条件下にて培養する工程、および（ii）VEGF、SCFおよびFLT3Lを（i）の培地へさらに添加し、通常の酸素条件下で培養する工程が例示される。当該工程（i）を行う期間は6日間以上であり、当該工程（ii）を行う期間は6日間以上である。
造血前駆細胞からCD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程
　CD4CD8両陽性T細胞は、例えば、ビタミンC類を添加した培地中で造血前駆細胞を培養する工程によって誘導することができる。
　CD4CD8両陽性T細胞の誘導に用いる培地は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地へビタミンC類を添加して調製することができる。基礎培地には、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清を使用してもよい。必要に応じて、基礎培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの1つ以上の物質も含有し得る。
　CD4CD8両陽性T細胞の誘導に用いる好ましい基礎培地は、血清、トランスフェリン、セリン、およびL-グルタミンを含むαMEM培地である。当該基礎培地へ添加するビタミンC類の種類と濃度は、上述した造血前駆細胞の誘導の場合と同様である。
　本発明のCD4CD8両陽性T細胞の誘導に用いる培地は、FLT3LおよびIL-7からなる群より選択されるサイトカインをさらに含むことが好ましい。
　CD4CD8両陽性T細胞の誘導に用いる培地中におけるIL-7の濃度は、例えば、0.01 ng/mlから100 ng/mlであり、好ましくは、0.1 ng/mlから10 ng/mlである。
　CD4CD8両陽性T細胞の誘導に用いる培地中におけるFLT3Lの濃度は、例えば、1 ng/mlから100 ng/mlである。
　CD4CD8両陽性T細胞の製造において、造血前駆細胞を接着培養または浮遊培養してもよく、接着培養の場合、培養容器をコーティングして用いてもよく、またフィーダー細胞等と共培養してもよい。共培養するフィーダー細胞として、骨髄間質細胞株OP9細胞（理研BioResource Centerより入手可能）が例示される。当該OP9細胞は、好ましくは、Dll1を恒常的に発現するOP-DL1細胞であってもよい（Holmes R1 and Zuniga-Pflucker JC. Cold Spring Harb Protoc. 2009(2)）。フィーダー細胞としてOP9細胞を用いる場合、別途用意したDll1またはDll1とFc等の融合タンパク質を適宜培地に添加することによっても行い得る。Dll1には、NCBIのアクセッション番号として、ヒトの場合、NM_005618、マウスの場合、NM_007865に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらと高い配列同一性（例えば９０％以上）を有し、同等の機能を有する天然に存在する変異体が包含される。CD4CD8両陽性T細胞を製造する際にフィーダー細胞を用いる場合、当該フィーダー細胞を適宜交換して培養を行うことが好ましい。フィーダー細胞の交換は、予め播種したフィーダー細胞上へ培養中の対象細胞を移すことによって行い得る。
　CD4CD8両陽性T細胞を誘導するために造血前駆細胞を培養する際の培養温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃～約42℃程度、約37～約39℃程度が好ましい。また、培養期間については、当業者であればCD4CD8両陽性T細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することが可能である。造血前駆細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、例えば、10日間以上である。
CD4CD8両陽性T細胞からCD8α ＋ β ＋ 細胞傷害性T細胞を誘導する工程
　本発明において、CD8α＋β＋細胞傷害性T細胞は、CD4CD8両陽性T細胞をIL-7およびT細胞受容体活性化剤を含む培地で培養することによって製造することができる。この工程は接着培養が好ましく、フィーダー細胞を使用せずに培養することが好ましく、CD4CD8両陽性T細胞を、フィブロネクチンフラグメント及び／又はNotchリガンドでコートされた培養器に直接接着させて培養することが好ましい。
　CD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の誘導に用いる培地中におけるIL-7の濃度は、前記「造血前駆細胞からCD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程」で使用される培地におけるIL-7の濃度よりも高い濃度のIL-7を使用することが好ましく、例えば、0.05ng/mlから500 ng/mlであり、好ましくは0.1 ng/mlから100 ng/ml、より好ましくは、0.5 ng/mlから50 ng/mlである。
　T細胞受容体活性化剤としては、例えば、ＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）、抗CD3抗体、抗CD28抗体、PMA及びイオノマイシンなどが挙げられる。
　例えば、培地中に、抗CD3抗体等を添加してCD4CD8両陽性T細胞を一定期間培養することによってT細胞受容体（TCR）に刺激を与えることができる。なお、抗CD3抗体等は磁性ビーズ等が結合されているものであってもよく、さらに抗体を培地中に添加する代わりに、抗CD3抗体を表面に結合させた培養ディッシュ上で前記T細胞を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。この場合もTCR活性化剤を含む培地での培養に該当する。CD4CD8両陽性T細胞のTCRを刺激するために、培養ディッシュの表面上に結合させるための抗CD3抗体の濃度としては特に制限はないが、例えば、０．１～１００μｇ／ｍｌである。
　なお、T細胞受容体活性化剤は「CD4CD8両陽性T細胞からCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞を誘導する工程」の開始時にIL-7とともに培地に含有させ、好ましくは1～2日、培養した後に、IL-7を含有し、T細胞受容体活性化剤を含有しない培地（例えば、T細胞受容体活性化剤濃度が1ng/mL未満～検出限界以下）に交換して培養を継続することが好ましい。この場合、T細胞受容体活性化剤を含有しない培地に交換するタイミングでフィブロネクチンフラグメント及び／又はNotchリガンドでコートされた培養器を用いて培養することが好ましい。
　そして、その後、フィブロネクチンフラグメント及びNotchリガンドのいずれも含まない（これらでコートされていない）培養器を使用して、好ましくはIL-7、IL-21およびFlt3Lを含む培地で、さらに培養を行うことがより好ましい。
　CD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の誘導工程に用いる培地は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地へIL-7やTCR活性化剤を添加して調製することができる。基礎培地には、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清を使用してもよい。必要に応じて、基礎培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの1つ以上の物質も含有し得る。好ましい基礎培地は、血清、トランスフェリン、セリン、L-グルタミン、アスコルビン酸を含むαMEM培地である。
　CD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の誘導工程に用いる培地は、さらに、IL-7以外のサイトカインやビタミンC類を含有することが好ましい。当該サイトカインは、FLT3LおよびIL-21等が例示される。なお、培地はIL-15を含まない（例えば、IL-15濃度が1ng/mL未満～検出限界以下）ことが好ましい。IL-15を含まない培地を用いることで、IL-15の要求性がより高い自然免疫系リンパ球の成熟を抑制して、獲得免疫系リンパ球の特性を有するCTLへと効率よく誘導することができる。また、CD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の誘導工程に用いる培地はカスパーゼ阻害剤を含んでもよい。カスパーゼ阻害剤としては、Pan Caspase fmk Inhibitor Z-VADなどが挙げられる。
　CD8α＋β＋細胞傷害性T細胞の誘導に用いるビタミンC類の種類と濃度は、上述した造血前駆細胞の誘導の場合と同様である。
　CD8α＋β＋細胞傷害性T細胞の誘導に用いる培地中におけるFLT3Lの濃度は、例えば、1 ng/mlから100 ng/mlである。
　CD8α＋β＋細胞傷害性T細胞の誘導に用いる培地中におけるIL-21の濃度は、例えば、1 ng/mlから100 ng/mlである。
　本発明において、NotchリガンドとはNotchシグナル受容体に結合し、Notchシグナルを活性化できる物質を意味する。Notchシグナル受容体とは、１回膜貫通型タンパク質であり、細胞外ドメイン（NECD）、膜貫通ドメイン（TM）および細胞内ドメイン（NICD）からなるNotch受容体がプロセッシングによりTM-NICDへと切断された後の、NECDとTM-NICDからなるヘテロ二量体を意味する。このNotchシグナル受容体のリガンドとしては、Delta-likeファミリー(DLL1、DLL3、DLL4)およびJaggedファミリー(JAG1、JAG2)のメンバーが例示される。Notchシグナル受容体のリガンドは、組み換え体であってもよく、Fcなどとの融合タンパク質であってもよく、例えばAdipogen社から市販されており容易に利用することができる。本発明において使用されるNotchシグナル受容体のリガンドは、好ましくは、DLL4またはJAG1である。
　本発明において、フィブロネクチン（FN）フラグメントは、FN結合ドメイン、細胞接着ドメイン又はヘパリン結合ドメインに含まれるフラグメントから選択される。例えば、ＩＩＩ１、ＩＩＩ２、ＩＩＩ３、ＩＩＩ７、ＩＩＩ８、ＩＩＩ９、ＩＩＩ１１、ＩＩＩ１２、ＩＩＩ１３及びＣＳ－１から選択される少なくとも１つのフラグメントを含めばよく、さらに複数のドメインが繰り返し連結されたフラグメントであってもよい。例えば、ＶＬＡ－５へのリガンドを含む細胞接着ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、ＶＬＡ－４へのリガンドであるＣＳ－１ドメイン、ＩＩＩ１等を含有するフラグメントが本発明に使用されうる。前記フラグメントとしては、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１１０巻、第２８４～２９１頁（１９９１）に記載されたＣＨ－２７１、ＣＨ－２９６、Ｈ－２７１、Ｈ－２９６、並びにこれらの誘導体や改変物が例示される。前記のＣＨ－２９６はレトロネクチン（登録商標）の名称で市販されている。また、ＩＩＩ１のＣ末端側の２／３のポリペプチドがＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　ＩＩＩ１－Ｃの名称で市販されている。
　FNフラグメントは、適切な固相、例えば、細胞培養器材、ビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。固相へのＦＮフラグメントの固定化は、例えば、国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載の方法に従って実施することができる。本発明において使用するＦＮフラグメントの濃度は、特に限定はなく、例えば最終濃度が０．００１～５００μｇ／ｍＬ、好適には０．０１～５００μｇ／ｍＬとなるよう培地に添加する。また、ＦＮフラグメントを固定化して使用する場合は、前記濃度のＦＮフラグメント溶液を使用して固相への固定化を実施すればよい。ＦＮフラグメント存在下での細胞集団の培養は、国際公開第０３／０８０８１７号パンフレットに詳細に記載されており、これを参照して実施することができる。 
　Notchリガンドについても同様の濃度及び方法で細胞培養器材に固定化して使用することができる。
　本発明において、CD8α＋β＋細胞傷害性T細胞を誘導するためにCD4CD8両陽性T細胞を培養する際の温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃～約42℃程度、約37～約39℃程度が好ましい。また、培養期間については、当業者であればCD8陽性T細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することが可能である。造血前駆細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、例えば、1日間以上である。
CD8α ＋ β ＋ 細胞傷害性Ｔ細胞の拡大培養工程
　上記のようにして得られたCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞を拡大培養することにより、大量のCD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞を得ることができる。拡大培養は、例えば、IL-7、IL-15およびIL-21を含む培地を用いて行うことができる。あるいは、IL-7、IL-15に加え、IL-21、IL-18、IL-12およびTL1A（TNF-like ligand 1A：別名Vascular endothelial growth inhibitor (VEGI) またはTNF superfamily member 15 (TNFSF15)）の１つ以上を含む培地を用いて行うことができる。
　なお、CD4CD8両陽性T細胞から得られた細胞群からFACSやアフィニティカラム等にてCD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞をさらに選別（ソート）してから上記拡大培養に供することが好ましい。選別は、例えば、CD8β陽性、CD5陽性、CD336陰性、CD1a 陰性の１つ以上を指標にして行うことができる。CD8βはTCR補助レセプターであるため、CD8β陽性のソーティングにより抗原認識能の高いCTLを選別することが可能となり、しかも異常なNK様細胞を除去することができる。CD5陽性を指標とした選別によればCD8βを安定的に発現し、なおかつ高い増殖能を持つ細胞を選別することができる。また、CD1aは未熟T細胞マーカーなので、CD1a陰性を指標とした選別によれば未熟細胞を除去することができる。さらに、CD336は通常のCTLでは発現せず、自然免疫系細胞のみで発現するマーカーなのでCD336陰性を指標とした選別によれば異常なNK様細胞を除去することができる。
　本発明においてCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞の拡大培養工程に用いる培地は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地へIL-7、IL-15およびIL-21などのサイトカインを添加して調製することができる。基礎培地には、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清を使用してもよい。必要に応じて、基礎培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの1つ以上の物質も含有し得る。好ましい基礎培地は、血清、トランスフェリン、セリン、L-グルタミン、アスコルビン酸を含むαMEM培地である。
　CD8α＋β＋細胞傷害性T細胞の拡大培養工程に用いる培地は、抗CD3抗体、ビタミンC類をさらに含有することが好ましい。
　本発明においてCD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の拡大培養工程に用いるビタミンC類の種類や濃度は上述と同じである。
　CD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の拡大培養工程に用いる培地中におけるIL-7の濃度は、例えば、1ng/mlから100ng/mlである。
　CD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の拡大培養工程に用いる培地中におけるIL-15の濃度は、例えば、1ng/mlから100ng/mlである。
　CD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の拡大培養工程に用いる培地中におけるIL-21の濃度は、例えば、1ng/mlから100ng/mlである。
　CD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の拡大培養工程に用いる培地中におけるIL-12の濃度は、例えば、1ng/mlから100ng/mlである。
　CD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の拡大培養工程に用いる培地中におけるIL-18の濃度は、例えば、1ng/mlから100ng/mlである。
　CD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の拡大培養工程に用いる培地中におけるTL1Aの濃度は、例えば、1ng/mlから100ng/mlである。
　抗CD3抗体は、CD3を特異的に認識する抗体であれば特に限定されないが、例えば、OKT3クローンから産生される抗体が挙げられる。抗CD3抗体の培地中における濃度は、例えば、10ng/mlから10μg/mlである。抗CD3抗体は培地に加える代わりに抗CD3抗体で培養器に固定化して用いてもよい。抗CD3抗体は拡大培養途中で除去してもよい。
　CD8α＋β＋細胞傷害性T細胞の拡大培養工程の温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃～約42℃程度、約37～約39℃程度が好ましい。また、培養期間については、当業者であればCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することが可能である。CD8α＋β＋細胞傷害性T細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、例えば、5日以上である。なお、拡大培養工程においては、IL-7およびIL-15は拡大培養工程全般にわたって培地中に存在していることが好ましいが、IL-21、IL-18、IL-12およびTL１Aは拡大培養工程の初期（例えば、拡大培養開始から12時間、16時間、24時間または72時間）に培地中に存在していれば、それ以降は培地中に含まれなくてもよい。
　かかる培養においては、CD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞をフィーダー細胞と共培養してもよい。フィーダー細胞としては特に制限はないが、細胞接触等を介して、CD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の成熟、増殖をより促進させるという観点から、末梢血単核球細胞（PBMCC）であることが好ましい。
　なお、上記拡大培養工程は、多能性幹細胞由来の細胞以外のT細胞、例えば、T細胞クローンや生体から単離されたT細胞などにも適用することができる。したがって、本発明は、T細胞をIL-7およびIL-15、並びにIL-21、IL-18、IL-12およびTL1Aの一種以上を含む培地で培養する工程を含む、T細胞の増殖方法を提供する。本発明はまた、IL-7およびIL-15、並びにIL-21、IL-18、IL-12およびTL1Aの一種以上を含むT細胞培養用培地を提供する。ここでいうT細胞は、好ましくは細胞傷害性T細胞、より好ましくはCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞であるが、上記の通り、多能性幹細胞由来の細胞以外のT細胞に限られず、T細胞クローンや生体から単離されたT細胞であってもよい。
　＜CD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬組成物、細胞免疫療法＞
　本発明の方法によって製造されるCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞（培養物）は、後述の実施例において示す通り、抗原特異的細胞傷害活性を有する。従って、本発明の方法によって製造したCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞、好ましくはヒトCD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞は、例えば、腫瘍、感染症（例えば、慢性感染症）、自己免疫不全等の疾患の治療又は予防において有用である。
　従って、本発明は、本発明の方法によって製造したCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞を含む医薬組成物、並びに該CD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞を用いた細胞免疫療法を提供する。
　本発明の細胞免疫療法では、治療対象者へのT細胞（CD8α＋β＋CTL）の投与は、特に限定されないが、好ましくは、非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内投与することができ、より好ましくは、静脈内投与することができる。あるいは、患部に局所投与することもできる。
　本発明の医薬組成物は、本発明の方法によって製造したCD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞を、公知の製剤学的方法により製剤化することにより調製することができる。例えば、カプセル剤、液剤、フィルムコーティング剤、懸濁剤、乳剤、注射剤（静脈注射剤、点滴注射剤等）、などとして、主に非経口的に使用することができる。
　これら製剤化においては、薬理学上許容される担体又は媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。また、前記疾患の治療又は予防に用いられる公知の医薬組成物や免疫賦活剤等と併用してもよい。
　本発明の医薬組成物を投与する場合、その投与量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品等）等に応じて、適宜選択される。
　本発明のCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞を用いた細胞免疫療法は、ヒトより所望の抗原特異性を有するT細胞を単離する工程と、該所望の抗原特異性を有するT細胞からiPS細胞を誘導する工程と、該iPS細胞をCD4CD8両陽性T細胞に分化させる工程と、該CD4CD8両陽性T細胞をCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞に分化誘導させる工程と、得られたCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞をヒトなどの哺乳動物の体内に投与する工程とを含む。
　細胞免疫療法を実施する場合、拒絶反応が起こらないという観点から、T細胞を単離される対象は、本発明によって得られたCD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞が投与される対象とHLAの型が一致していることが好ましく、本発明によって得られたCD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞が投与される対象と同一の対象であることがより好ましい。投与される細胞は、本発明の方法により製造されたCD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞をそのまま投与してもよく、また、上記の通り、製剤化された医薬組成物の形態で投与してもよい。
　本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれら実施例に限定されないものとする。
＜CD8αβ+ CTLの調製＞
細胞
　iPS細胞(TKT3v 1-7株)は、Nishimura T, et al., Cell Stem Cell. 12(1):114-126, 2013に記載の方法を用いて、告知後に同意を得て単離されたヒトCD3陽性T細胞より樹立した。
　C3H10T1/2細胞およびOP9/DLL1細胞は、理化学研究所・理研 BioResource Center より入手して用いた。
　K562/HLA A-24は東京大学（現、国立感染症研究所）立川博士から供与を受けた。
CD4CD8両陽性細胞の誘導（DP細胞誘導工程）
　10cm dishにおいてコンフルエントなC3H10T1/2細胞上にTKT3v 1-7株の小塊を播種し（Day0）、EB培地（１５％ウシ胎児血清（FBS）、10μg/mL ヒトインスリン、5.5μg/mL ヒトトランスフェリン、5ng/mL 亜セレン酸ナトリウム、2mM Ｌ－グルタミン、0.45mM α－モノチオグリセロール、および50μg/mL phospho ascorbic acidを添加したIMDM）中で、低酸素条件下(5% O2)にて7日間培養した（Day7）。
　続いて、20ng/mL VEGF、30ng/mL SCF及び10ng/mL FLT3L（Peprotech社製）を添加し、常圧酸素条件下にて7日間培養した（Day14）。
　得られたネット様構造物（iPS-SACともいう）に含まれている造血細胞（CD34+造血前駆細胞）を回収し、OP9/DLL1細胞上に播種した。10ng/mL FLT3Lおよび1ng/mL IL-7を添加したOP9培地（１５％ FBS、2mM L-グルタミン、100U/ml ペニシリン、50μg/ml phospho ascorbic acid 、100ng/ml ストレプトマイシン、5.5μg/mL ヒトトランスフェリンおよび5ng/mL 亜セレン酸ナトリウムを添加したαMEM）中で、常圧酸素条件下にて23日間培養した（Day37）。細胞は、3～4日毎に新たなOP9/DLL1細胞上へ播種した。
CD4CD8両陽性細胞からの分化誘導（成熟工程）（プロトコール１）
　Day37にて、OP9/DLL1と分化細胞の共培養を維持したまま、20% FBS, PSG (ペニシリン-ストレプトマイシン-L-グルタミン), ITS(インスリン-トランスフェリン-亜セレン酸 ナトリウム), 50μg/ml phospho ascorbic acid, 10μM Pan Caspase fmk Inhibitor Z-VAD (FMK001, R&D), 10ng/ml IL-7, 20ng/ml IL-21, 10ng/ml Flt3L, 2 μg/ml anti-human CD3 antibody (OKT3)を含むαMEM培地を加えた。
　Day38にて培地を完全に洗浄後、5μg/ml Retronectin（タカラバイオ株式会社）をコートしたプレートに移して培養を行った。培地はDay 37のものからanti-CD3 antibodyのみ抜いたものを使用した。なお、Retronectinでコートされた培養器はこれらの溶液を培養器に入れて４℃で一晩静置することで行い、その後、PBSで洗浄した。
　Day41にて、Day38の培地組成においてIL-21の濃度を10ng/mlとしたものに培地交換し、Fc-DLL4およびRetronectinがコートされていないプレートに移してさらに培養を継続した。
　Day43にて細胞を回収して、FACSにてCD8β+ CD336-CD5+CD1a-細胞をソートした。
Feeder-free expansion culture（拡大培養～その１）
　PBSで希釈した1μg/ml anti-CD3抗体（OKT3）を96-well flat bottom plateに加えて4℃で一晩静置してOKT3コートプレートを用意した。上記で得られたCD8β+CD5+CD1a-細胞を20% FBS, PSG, ITS, 50μg/ml phospho ascorbic acid, 5ng/ml IL-7, 5ng/ml IL-15, 10ng/ml IL-21を含むαMEM培地に懸濁し、OKT3コートプレートに移して１６時間培養を行った。
　その後、細胞をOKT3をコートしていないウェルに細胞を移し、以後三日に一度ハーフメディウムチェンジを行うことにより培養を継続した。なお、IL-21以外の成分は全てのメディウムチェンジで常時等量入れ、IL-21は初回メディウムチェンジのみ5ng/ml入れた。
　拡大培養開始から１４～２１日目の細胞をCD8α+β+ CTLとして下記の実験に供した（改良型iPSC-CTL）。
　比較対照として、従来法プロトコルで分化誘導したCTL(conventional CTL)を用いた。従来法プロトコルとして、上記DP細胞誘導工程の後、成熟工程を経ずに、直接、拡大培養を行う方法を採用した。
Feeder-free expansion culture（拡大培養～その２）
　PBSで希釈した1μg/ml anti-CD3抗体（OKT3）を96-well flat bottom plateに加えて4℃で一晩静置してOKT3コートプレートを用意した。上記で得られたCD8β+CD5+CD1a-細胞を20% FBS, PSG, ITS, 50μg/ml phospho ascorbic acid, 10μM Pan Caspase fmk Inhibitor Z-VAD (FMK001, R&D), 5ng/ml IL-7, 5ng/ml IL-15, 20ng/ml IL-21, 50ng/ml IL-12,50ng/ml IL-18,50ng/ml TL1Aを含むαMEM培地に懸濁し(2x10^4 cells/200ul/well)、OKT3コートプレートに移して１６時間培養を行った。
　その後、細胞をOKT3をコートしていないウェルに細胞を移し、以後三日に一度ハーフメディウムチェンジを行うことにより培養を継続した。なお、メディウムチェンジの際には20% FBS, PSG, ITS, 50μg/ml phospho ascorbic acid, 5ng/ml IL-7, 5ng/ml IL-15を含むαMEM培地を用いた。拡大培養開始から１４日目の細胞をCD8α+β+ CTLとして下記の実験に供した（改良型iPSC-CTL）。
＜CD8α+β+ CTLの評価＞
１．CD8αβの発現と抗原結合性解析
　本発明の方法で作製した改良型iPSC-CTL、従来法で作製したconventional CTLおよびiPS細胞の元となったオリジナルCTLについて、フローサイトメーターにてCD8α、CD8βの発現を確認したところ、図１上に示すように、改良型iPSC-CTLは拡大培養を重ねてもCD8αβを安定的に発現していることがわかった。さらに、テトラマー法によって上記各細胞のTCRの抗原結合性を定量したところ、図１下に示すように、本発明の方法で作製した改良型iPSC-CTLのHLA-tetramerとの結合はオリジナルCTLと同等に高かった。一方、従来法により得られたconventional CTLはTCRを同程度発現するにも関わらずCD8βを発現しないためHLA-tetramerへの結合が顕著に弱かった。
２．細胞増殖とサイトカイン産生の解析
　次に、改良型iPSC-CTL(Modified CD8b+ CTL)と従来型iPSC-CTL(conventional CD8b- CTL)をCFSEで染色し、0 (Unpulsed), 10nM, または100nMの特異抗原ペプチド（Nef138-8）を提示したK562/HLA A-24で刺激した。
　増殖に伴うCFSEの減衰とIFNγ、IL-2の二種のサイトカイン産生を調べた。なお、CFSEは増殖のたびに蛍光強度が落ちるため増殖アッセイに用いられる試薬である（J Vis Exp. 2010; (44): 2259）（増殖を重ねた細胞ほどCFSEの蛍光が低い）。
　結果を図２に示す。このCFSE assayにおいて改良型iPSC-CTLは従来のものより高い増殖能を示した。またサイトカイン産生能も改良型の方が顕著に高いことが明らかとなった。
３．細胞傷害活性の解析
　改良型iPSC-CTL(Modified CD8b+ CTL)と従来型iPSC-CTL(conventional CD8b- CTL)を各濃度の特異抗原ペプチド（Nef138）をパルスしたK562/HLA A-24と共培養し、LDH活性を指標として細胞傷害活性を調べた。結果を図３に示す。改良型iPSC-CTLではNK活性が消失する一方で抗原特異的な細胞傷害活性は従来型に比べ優れていたため、抗原を十分量提示するターゲット細胞に対して両者は同等の細胞傷害活性を示した。
４．細胞形質の解析
　改良型iPSC-CTL(Modified CD8b+ CTL)と従来型iPSC-CTL(conventional CD8b- CTL)、元のT細胞クローンをFACS解析した。CD28とCD27はnaiveまたはセントラルメモリー細胞のみで発現する補助刺激分子、CCR7は免疫監視に必須のホーミング分子であり、いずれもCTL機能に直結する機能分子である。図４に示すように、これらの分子はex vivo培養の過程でオリジナルCTLから発現が消失したが、改良型iPSC-CTLでのみ発現の回復が認められた。またナイーブ細胞とメモリー細胞の区別に最もよく使われるCD45RAとCD45ROの組み合わせにおいてiPSC-CTLは改良型、従来型ともにCD45RA+CD45RO-のナイーブ細胞の形質を示した。
５．拡大培養における増殖能の解析
　本発明の方法（拡大培養～その１）で作製した改良型iPSC-CTL(Modified CD8b+ CTL)と従来型iPSC-CTL(conventional CD8b- CTL)の増殖を解析した。図５に示すように、基礎培地としてαMEMを用い、さらにサプリメントとしてITSとphosphoアスコルビン酸を加えた改良型on-feeder拡大培養系において改良型iPSC-CTLは1020以上の極めて高い増殖能を示した。
６．拡大培養におけるIFNγの産生と細胞傷害性分子の発現量の解析
　本発明の方法（拡大培養～その１）で作製した改良型iPSC-CTL(Modified CD8b+ CTL)をPHA + PBMCあるいは無フィーダー下（IL-21添加または非添加）に刺激しサイトカインIFNγの産生と細胞傷害性分子Granzyme Bの発現量を定量した。図６に示すように、Feeder-free拡大培養にIL-21を加えるとサイトカインの産生だけでなくGranzyme Bの発現まで亢進させ、on-feeder法なみに機能性を維持することが明らかとなった。
７．抗原刺激下でのサイトカイン産生と細胞傷害活性の解析
　本発明の方法（拡大培養～その１）で作製した改良型iPSC-CTL(Modified CD8b+ CTL)をPHA + PBMCで刺激しサイトカイン産生と細胞傷害活性を調べた。図７に示すように、改良型iPSC-CTLはnaive phenotypeを反映してか刺激を重ねるごとに細胞傷害活性を獲得したが、一方でIFNγ産生能を失っていった。
８．サイトカイン産生と細胞傷害性分子の発現解析
　本発明の方法（拡大培養～その１）で作製した改良型iPSC-CTL(Modified CD8b+ CTL)とオリジナルのCTLをPHA + PBMCで刺激し、図７のExpansion time:５回経たタイミングで、サイトカインIFNγの産生と細胞傷害性分子Granzyme Bの発現量を定量した。図８に示すように、臨床応用で想定されるon-feederとfeeder-free拡大培養の組み合わせで調製したiPSC-CTLをオリジナルCTLと機能比較したところ、サイトカイン産生能力はやや劣るものの細胞傷害活性は両者で同等であることが明らかとなった。
９．IL-7, IL-21添加のCD8α+β+CTLの産生量及び表面マーカーに対する効果の解析
　iPSC-CTL成熟過程におけるIL-15, IL-21添加の効果を検討した。結果を図９に示す。図９の上のグラフはDP細胞に対するCD8α+β+CTLの作製効率を示しており、IL-15添加によりCD8α+β+CTLの作製効率が劇的に上がっていることが分かる。
　しかしながら、図９の下の図では、代表的なナイーブCTLのマーカーであり重要なケモカインレセプターでもあるCCR7や増殖能に関連していると考えられるCD5の発現がIL-15添加で顕著に減少していることがわかる。さらに、通常のCTLでは発現していないNKマーカーであるCD56やCD336がIL-15添加によって誘導されており、IL-15はCD8α+β+CTLの作製効率を上げるものの、得られる細胞は望ましいCTL本来の特性を持つものでないことが示唆された。
　一方でIL-21添加はCD8α+β+CTL作製効率への寄与は認められないものの、NK関連マーカーを上昇させる副作用が認められないことに加え、CCR7や重要な補助刺激分子であるCD28の発現を亢進させる効果が認められた。
１０．作製されたiPSC-CTLのサイトカイン産生プロファイル解析
　過去の報告から、成熟CTLはnaiveからcentral memory (CM), effector memory (EM)、分化が最も進んだEMRA細胞まで分化する過程でIL-2とIFNγの産生プロファイルを変化させることが知られている。ナイーブ細胞ほどIL-2産生に傾いており、分化が進むにつれてIFNγを同時に産生する細胞、IFNγのみを産生する細胞が現れる。ここで重要なポイントは、分化が進んだEMやEMRAより分化の浅いナイーブ細胞の方がin vivoでより強い抗腫瘍効果を示すことがよく知られている点である。図１０で示されるように本発明の方法で作製した改良型iPSC-CTLのIL-2/IFNγプロファイルはnaiveとCMの中間にあたり、分化の浅い細胞らしく極めて高いIL-2産生能を示した。この結果からiPSC-CTLのnaive/CM様の形質と高い抗腫瘍活性が示唆される。
　さらに、上記図９の結果からIL-15添加がナイーブCTLの作製を妨げていることが示唆されたが、それと合致してIL-15添加でIL-2の産生能力が落ちていることが確認された。その一方で、IL-21添加ではIL-2産生を押し上げる効果が認められた。
　以上、図９，１０の結果を総合して、IL-21添加がiPSC-CTL成熟培養において特に有用であることが示唆された。
１１．成熟工程の他の態様
CD4CD8両陽性細胞からの分化誘導（成熟工程）（プロトコール２）
　上記DP細胞誘導工程の後、Day37にて、OP9/DLL1と分化細胞の共培養を維持したまま、20% FBS, PSG (ペニシリン-ストレプトマイシン-L-グルタミン), ITS(インスリン-トランスフェリン-亜セレン酸 ナトリウム), 50μg/ml phospho ascorbic acid, 10μM Pan Caspase fmk Inhibitor Z-VAD (FMK001, R&D), 10ng/ml IL-7, 10ng/ml Flt3L, 2 μg/ml anti-human CD3 antibody (OKT3)を含むαMEM培地を加えた。
　Day38にて培地を完全に洗浄後、5μg/ml Retronectin（タカラバイオ株式会社）、1μg/ml Fc-DLL4 (Sino Biological Inc.)をコートしたプレートに移して培養を行った。培地はDay 37のものからanti-CD3 antibodyのみ抜いたものを使用した。なお、Fc-DLL4およびRetronectinでコートされた培養器はこれらの溶液を培養器に入れて４℃で一晩静置することで行い、その後、PBSで洗浄した。
　Day44にて、Day38の培地にさらにIL-21を10ng/ml入れたものに培地交換し、Fc-DLL4およびRetronectinがコートされていないプレートに移してさらに培養を継続した。
　Day58にて細胞を回収して、FACSにてCD8β+ CD336-CD5+CD1a-細胞をソートした。
１２．従来法iPSC-CTLと改良型iPSC-CTLのマーカー発現と増殖能の比較
　従来法で成熟させたiPSC-CTLからCD8β/CD5両陽性細胞をソートし、次いでPHA on-feeder拡大培養２週間を行った後のFACS結果を図１１に示す。従来型iPSC-CTLではたとえCD8β/CD5両陽性細胞からスタートしても両分子とも（特にCD5で）発現安定性が低いため、一回の拡大培養で発現が大きく落ち込んだ。さらにこの初回拡大培養後の細胞をCD8β+CD5bright細胞とCD8β+CD5-細胞に分けてfeeder-free条件で二回目の拡大培養を行ったところ、CD8b+CD5bright細胞がCD8b+CD5-細胞より圧倒的に高い増殖能を示すことが明らかとなった (図１２)。これはCD5が高増殖性CTLの指標になることを示した過去の報告と合致する(Nature Immunology, 16.1 (2015), 107-117.)。 以上の結果から従来法でもCD5bright高増殖性iPSC-CTLは生成されるがその効率と安定性は非常に低く、多くの場合増殖能の低いCD5-細胞が主要に産生されることが示唆された。
　一方、上記プロトコール２で誘導した改良型iPSC-CTLではCD5の発現が成熟直後から高く、その発現は拡大培養を４回経験してもprimary CTLと同等に高いレベルで維持された (図１３)。それに合致して改良型iPSC-CTLの連続刺激に対する増殖倍率はトータルでon-feederでは1020, feeder-freeでも1015を越え、いずれもprimary naive CTLには劣るものの臨床応用に適合する極めて高い増殖能が認められた (図１４)。
１３．拡大培養における増殖能の解析
　本発明の方法（拡大培養～その２）で作製した改良型iPSC-CTL(Modified CD8b+ CTL)と親CTLクローン(H25-4)の増殖を解析した。その結果、図１５に示すように、IL-7およびIL-15の基礎サイトカインに加え、IL-21, IL-12, IL-18, TL1Aの一種以上を添加して拡大培養したときに増殖亢進効果を示した。
　また、IL-7+IL-15の基礎サイトカインに加え、IL-21, IL-12, IL-18, TL1Aを添加して拡大培養したときには、親CTLクローンの増殖亢進効果も見られた。
１４．抗原刺激下でのサイトカイン産生と細胞傷害活性の解析
　本発明の方法（拡大培養～その２）で作製した改良型iPSC-CTL(Modified CD8b+ CTL)をPHA + PBMCで刺激しサイトカイン産生と細胞傷害活性を調べた。その結果、図１６に示すように、IL-7およびIL-15の基礎サイトカインに加え、IL-21, IL-12, IL-18, TL1Aの一種以上を添加して拡大培養したときには、増殖率だけでなく、サイトカイン産生能および細胞傷害活性も向上することが分かった。

Claims (22)

  1. CD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法であって、
    CD4CD8両陽性T細胞を、IL（Interleukin）-7およびT細胞受容体活性化剤を含む培地で培養してCD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞へと誘導する工程を含む方法。
  2. 前記T細胞受容体活性化剤は抗CD3抗体である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記培地はさらにIL-21およびFlt3L(Flt3 Ligand)を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 下記工程（ａ）および（ｂ）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
    （ａ）CD4CD8両陽性T細胞をIL-7およびT細胞受容体活性化剤を含む培地で培養する工程、
    および
    （ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、IL-7を含み、T細胞受容体活性化剤を含まない培地で培養する工程。
  5. 前記培養（ｂ）はフィブロネクチンフラグメント及び／又はNotchリガンドを含む培養器を使用して行われる、請求項４に記載の方法。
  6. フィブロネクチンフラグメントがレトロネクチンであり、NotchリガンドがDelta-like 4 (DLL4)である、請求項５に記載の方法。
  7. さらに下記工程（ｃ）を含む、請求項５または６に記載の方法。
    （ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、フィブロネクチンフラグメント及びNotchリガンドのいずれも含まない培養器を使用して、IL-7、IL-21およびFlt3Lを含む培地で培養する工程。
  8. 下記工程（ａ１）、（ｂ１）および（ｃ１）を含む、請求項７に記載の方法。
    （ａ１）CD4CD8両陽性T細胞を、IL-7、Flt3L、IL-21および抗CD3抗体を含む培地で培養する工程、
    （ｂ１）工程（ａ１）で得られた細胞を、IL-7、Flt3LおよびIL-21を含み、抗CD3抗体を含まない培地で、フィブロネクチンフラグメントを含む培養器を用いて培養する工程、および
    （ｃ１）工程（ｂ１）で得られた細胞を、IL-7、IL-21およびFlt3Lを含む培地で、フィブロネクチンフラグメント及びNotchリガンドのいずれも含まない培養器を用いて培養する工程。
  9. 下記工程（ａ２）、（ｂ２）および（ｃ２）を含む、請求項７に記載の方法。
    （ａ２）CD4CD8両陽性T細胞を、IL-7、Flt3Lおよび抗CD3抗体を含む培地で培養する工程、
    （ｂ２）工程（ａ２）で得られた細胞を、IL-7、およびFlt3Lを含み、抗CD3抗体を含まない培地で、フィブロネクチンフラグメントおよびNotchリガンドを含む培養器を用いて培養する工程、
    （ｃ２）工程（ｂ２）で得られた細胞を、IL-7、IL-21およびFlt3Lを含む培地で、フィブロネクチンフラグメント及びNotchリガンドのいずれも含まない培養器を用いて培養する工程。
  10. 前記培養はフィーダー細胞を用いずに行われる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. さらに、得られたCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞の選別工程を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記選別工程はCD8β陽性、CD5陽性、CD336陰性およびCD1a 陰性の１つ以上を指標にして行われる、請求項１１に記載の方法。
  13. さらに、CD8α＋β＋細胞傷害性T細胞をIL-7、IL-15およびIL-21を含む培地で拡大培養する工程を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. さらに、CD8α＋β＋細胞傷害性T細胞をIL-7およびIL-15、並びにIL-21、IL-18、IL-12およびTL1Aの一種以上を含む培地で拡大培養する工程を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記CD4CD8両陽性T細胞は多能性幹細胞から誘導されたものである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記多能性幹細胞は人工多能性幹（iPS）細胞である、請求項１５に記載の方法。
  17. 多能性幹細胞からCD4CD8両陽性T細胞への誘導が下記工程（ａ）および（ｂ）を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
    （ａ）多能性幹細胞をビタミンC類を添加した培地で培養し、造血前駆細胞を誘導する工程、および
    （ｂ）工程（ａ）で得られた造血前駆細胞を、ビタミンC類、FLT3LおよびIL-7を含む培地で培養し、CD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程。
  18. 多能性幹細胞からのCD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法であって、
    （ａ）多能性幹細胞をビタミンC類を添加した培地で培養し、造血前駆細胞を誘導する工程、
    （ｂ）工程（ａ）で得られた造血前駆細胞を、ビタミンC類、FLT3LおよびIL-7を含む培地で培養し、CD4CD8両陽性T細胞を誘導する工程、および
    （ｃ）工程（ｂ）で得られたCD4CD8両陽性T細胞を、IL-7およびT細胞受容体活性化剤を含む培地で培養してCD8α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞へと誘導する工程を含む方法。
  19. 工程（ｃ）の培地におけるIL-7の濃度は、工程（ｂ）の培地におけるIL-7の濃度よりも高い、請求項１８に記載の方法。
  20. 製造されるCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞はナチュラルキラー（NK）活性を示さない、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法で得られたCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞培養物。
  22. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法で得られたCD8α＋β＋細胞傷害性T細胞を含む、医薬組成物。
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