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WO2018134980A1 - 軟骨組織の分析装置 - Google Patents

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WO2018134980A1
WO2018134980A1 PCT/JP2017/002003 JP2017002003W WO2018134980A1 WO 2018134980 A1 WO2018134980 A1 WO 2018134980A1 JP 2017002003 W JP2017002003 W JP 2017002003W WO 2018134980 A1 WO2018134980 A1 WO 2018134980A1
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raman
cartilage tissue
raman spectrum
band
tissue
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PCT/JP2017/002003
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佐藤　亮
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オリンパス株式会社
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    • G01N21/65—Raman scattering
    • G01N2021/653—Coherent methods [CARS]
    • G01N2021/656—Raman microprobe

Definitions

  • the present invention relates to an analysis apparatus for cartilage tissue.
  • OA osteoarthritis
  • X-ray images nuclear magnetic resonance images
  • GAG glycosaminoglycan
  • a method for acquiring information and optically evaluating the cartilage state has been proposed. (For example, refer nonpatent literature 1, nonpatent literature 2, and patent literature 1.).
  • the articular bone is composed of a cartilage tissue covering the bone surface and a bone tissue existing under the cartilage tissue.
  • the cartilage tissue is hyaline cartilage, and its main components are type II collagen, glycosaminoglycan (GAG) such as chondroitin sulfate, and water.
  • the main components of bone tissue are type I collagen, calcium phosphate such as hydroxyapatite, and calcium carbonate.
  • the thickness of human cartilage tissue is about 2 to 4 mm in normal cartilage and is known to have a tendency to become thinner as the lesion progresses such as osteoarthritis.
  • Conventionally proposed optical evaluation methods for cartilage properties measure a spectroscopic spectrum derived from cartilage tissue and bone tissue at the joint bone tip.
  • the apparatus of Patent Document 1 measures a cartilage tissue of a joint bone and a Raman spectrum derived from the bone tissue, and evaluates a state of the cartilage tissue based on information on a specific Raman band in the Raman spectrum.
  • FIG. 8 of Patent Document 1 describes a method of diagnosing osteoarthritis (OA) based on the intensity ratio of the calcium phosphate and calcium carbonate Raman bands contained in bone tissue.
  • FIG. 9 of Patent Document 1 shows a method for diagnosing osteoarthritis of the knee (OA) based on the intensity ratio between the Raman band of calcium carbonate and calcium phosphate and the Raman band derived from a CH group derived from a protein. Is described.
  • FIG. 19 of Patent Document 1 OA based on the intensity ratio of the two amide III band at 1240 cm -1 and 1270 cm -1 molecular structure change of collagen, namely to be correlated with collagen degeneration are known A method for diagnosing is described.
  • a Raman spectrum in which a Raman spectrum of a cartilage tissue and a Raman spectrum of a bone tissue are superimposed is acquired.
  • the Raman spectrum intensity of bone tissue components such as calcium phosphate and calcium carbonate such as hydroxyapatite and type I collagen is significantly stronger than the Raman spectrum intensity of cartilage tissue components such as type II collagen and glycosaminoglycan. Therefore, the information of the Raman spectrum derived only from the cartilage tissue of the joint bone surface layer is obscured by the information of the Raman spectrum derived from the bone tissue of the deep joint bone layer, and it is difficult to select and observe the cartilage tissue. It is described.
  • Patent Document 1 can diagnose any osteoarthritis (OA) lesion that has progressed to the bone tissue, but can detect early osteoarthritis (OA) lesion in the cartilage tissue. There is a problem that it is difficult.
  • cartilage regeneration treatment by transplantation of cultured chondrocytes it is necessary to evaluate that the cartilage tissue is regenerated into hyaline cartilage at the cartilage defect site where the cells are transplanted.
  • the present invention has been made in view of the above-described circumstances, and is capable of acquiring a Raman spectrum selectively from a Raman spectrum of a joint bone and accurately evaluating the state of the cartilage tissue.
  • An object is to provide an apparatus.
  • One embodiment of the present invention includes a laser light source that outputs laser light, an illumination surface that has an emission surface at a tip, and emits laser light incident from the laser light source toward a living tissue including cartilage tissue from the emission surface.
  • a first light collecting fiber and a second light collecting fiber each having a fiber, a light receiving surface at a tip, and receiving scattered light from the living tissue at the light receiving surface; and the first light collecting fiber
  • a first Raman spectrum is detected from the received scattered light
  • a second Raman spectrum is detected from the scattered light received by the second condensing fiber, and detected by the detection unit.
  • the intensity ratio between the Raman band derived from the cartilage tissue and the Raman band derived from the bone tissue is determined.
  • An intensity ratio calculation unit to calculate, and a Raman spectrum in which the intensity ratio calculated by the intensity ratio calculation unit is within a predetermined range is selected from the first Raman spectrum and the second Raman spectrum.
  • An evaluation unit that analyzes the Raman spectrum and evaluates the state of the cartilage tissue, the distance of the light receiving surface of the first condensing fiber from the exit surface, and the second condensing fiber This is an apparatus for analyzing cartilage tissue in which the distance of the light receiving surface from the exit surface is different from each other.
  • the scattered light of the living tissue generated in the illumination region of the laser light is the first and First and second Raman spectra are respectively acquired by the detector from the scattered light received by the second condensing fiber and received by the first and second condensing fibers.
  • the first and second Raman spectra include only the Raman spectrum of the cartilage tissue located in the surface layer of the joint bone or the Raman spectra of both the cartilage tissue and the bone tissue located under the cartilage tissue.
  • the light receiving surface of the first light collecting fiber and the light receiving surface of the second light collecting fiber are arranged at different positions from the exit surface of the illumination fiber.
  • the 2nd condensing fiber receives the scattered light from a mutually different range in the depth direction (irradiation direction of a laser beam) among the illumination areas of a laser beam. Accordingly, the ratio of the cartilage tissue contributing to the Raman spectrum in the first Raman spectrum and the ratio of the cartilage tissue contributing to the Raman spectrum in the second Raman spectrum can be different from each other.
  • a Raman spectrum that includes only the Raman spectrum of the cartilage tissue or a Raman spectrum that greatly contributes to the Raman spectrum of the cartilage tissue can be selected from the first and second Raman spectra. It can.
  • the selected Raman spectrum can be used to accurately evaluate the state of the cartilage tissue by eliminating as much information as possible from the bone tissue.
  • the intensity ratio calculation unit uses the Raman band intensity of type II collagen as the Raman band derived from the cartilage tissue, and the hydroxyapatite Raman band as the Raman band derived from the bone tissue. Intensity may be used.
  • the intensity ratio calculation unit uses the Raman band intensity of glycosaminoglycan (GAG) as the Raman band derived from the cartilage tissue for the intensity ratio calculation, and the Raman band derived from the bone tissue.
  • GAG glycosaminoglycan
  • the Raman band strength of hydroxyapatite may be used.
  • the evaluation unit calculates an intensity ratio of two types of Raman bands derived from the cartilage tissue in the selected Raman spectrum and having different Raman shifts, and based on the calculated intensity ratio, The condition of the cartilage tissue may be evaluated. Since the Raman band intensity of each component contained in the cartilage tissue is proportional to the content of the component, the Raman band intensity ratio of the two different components reflects the relative amount of the two different components. Alternatively, it is known that the intensity ratio of two types of Raman bands having different Raman shifts in a predetermined component reflects the molecular structure of the component.
  • the component contained in the cartilage tissue information on the relative amount of the component and the change in the molecular structure, that is, the denaturation of the cartilage matrix molecule can be obtained from the calculated Raman band intensity ratio. Based on such information, the biochemical state of the cartilage tissue such as cartilage lesions including osteoarthritis (OA) and the maturity of regenerated cartilage can be evaluated.
  • cartilage lesions including osteoarthritis (OA)
  • maturity of regenerated cartilage can be evaluated.
  • the two types of Raman bands may be a collagen Raman band and a glycosaminoglycan (GAG) Raman band.
  • This glycosaminoglycan is a sulfated glycosaminoglycan such as chondroitin sulfate and keratan sulfate, which is the main glycosaminoglycan contained in cartilage tissue.
  • the intensity ratio between the Raman band of collagen and the Raman band of glycosaminoglycan (GAG) reflects the relative amount of glycosaminoglycan (GAG) contained in the cartilage tissue to collagen.
  • cartilage tissue lesions characterized by changes in glycosaminoglycan (GAG) amount can be evaluated based on the calculated intensity ratio.
  • glycosaminoglycan (GAG) is abundant in hyaline cartilage and hardly contained in fibrocartilage
  • the amount of glycosaminoglycan (GAG) in the regenerating cartilage tissue is , Fibrocartilage, or a mixture of hyaline cartilage and fibrocartilage. Therefore, based on the amount of glycosaminoglycan (GAG) in the cartilage tissue, the maturation state of the cartilage tissue being regenerated can be evaluated.
  • the two types of Raman bands may be Raman bands of amino acids contained in extracellular matrix such as collagen and proteoglycan and proteins in chondrocytes and Raman bands of glycosaminoglycan (GAG).
  • the intensity ratio between the amino acid Raman band of the protein and the glycosaminoglycan (GAG) Raman band reflects the relative amount of glycosaminoglycan (GAG) relative to the amount of total protein in the cartilage tissue. Therefore, based on the calculated intensity ratio, a cartilage lesion characterized by a change in the amount of glycosaminoglycan (GAG) can be evaluated. In addition, based on the amount of glycosaminoglycan (GAG), the maturation state of cartilage that is in the process of regeneration can be evaluated.
  • the two types of Raman bands may be a Raman band of an amino acid contained in an extracellular matrix such as collagen or proteoglycan and a protein in chondrocytes, and a Raman band of collagen.
  • the intensity ratio between the amino acid Raman band of the protein and the collagen Raman band reflects the relative amount of collagen to the amount of total protein in the cartilage tissue. Therefore, based on the calculated intensity ratio, it is possible to evaluate a lesion in the cartilage tissue accompanied by a change in the amount of collagen.
  • the amount of type II collagen indicates whether the cartilage tissue is normal hyaline cartilage, defective fibrocartilage as regenerated cartilage, or cartilage being regenerated. Fluctuates depending on. Therefore, based on the amount of collagen, the maturation state of cartilage in the process of regeneration can be evaluated.
  • the two types of Raman bands may be an extracellular matrix such as collagen or proteoglycan, a protein in chondrocytes, or a methylene group Raman band and a methyl group Raman band contained in lipids.
  • the intensity ratio between the methylene group Raman band and the methyl group Raman band correlates with the relative amount of cells contained in the cartilage tissue. Therefore, based on the calculated intensity ratio, the maturation state of cartilage in the process of regeneration can be evaluated.
  • the two types of Raman bands may be amide III bands of collagen.
  • Amide III band of collagen is the Raman shift range of 1230 ⁇ 1280 cm -1, is observed as a Raman band with two peaks in the high wavenumber lower wavenumber and 1260 cm -1 vicinity of 1240 cm -1 vicinity.
  • the intensity ratio of the Raman band on the low wavenumber side of the amide III band and the Raman band on the high wavenumber side may reflect changes in the molecular structure characterized by the secondary structure of collagen in the cartilage tissue.
  • cartilage tissue lesions such as osteoarthritis are characterized by degeneration of type II collagen in the cartilage tissue, that is, a molecular structural change. Therefore, based on the calculated intensity ratio of the amide III Raman band, a cartilage lesion characterized by collagen degeneration such as osteoarthritis can be evaluated.
  • the evaluation unit performs the multivariate analysis such as principal component analysis (PCA), principal component regression analysis (PCR), or partial least square analysis (PLS) on the selected Raman spectrum, thereby Calculate the Raman spectrum features that correlate with the amount of glycosaminoglycan (GAG), collagen or cells contained in the cartilage tissue, or estimate the amount of these components,
  • PCA principal component analysis
  • PCR principal component regression analysis
  • PLS partial least square analysis
  • the state of the cartilage tissue may be evaluated based on glycosaminoglycan (GAG), collagen, or the amount of cellular components.
  • GAG glycosaminoglycan
  • changes in the amount of glycosaminoglycans such as osteoarthritis, or cartilage tissue lesions characterized by tissue degeneration mainly collagen degeneration Can do.
  • the evaluation unit calculates an intensity ratio between the Raman band derived from the cartilage tissue and the Raman band derived from the bone tissue from each of the first Raman spectrum and the second Raman spectrum. And the calculated two intensity ratios, and a calibration curve or a statistical estimation method prepared in advance that correlates the intensity ratio of the cartilage tissue and the bone tissue with the Raman band and the thickness of the cartilage tissue.
  • the thickness of the cartilage tissue may be estimated. In this way, the thickness of the cartilage tissue can be evaluated based on the calculated intensity ratio of the two Raman bands of the cartilage tissue and the bone tissue.
  • the Raman spectrum derived from the cartilage tissue and the Raman spectrum derived from the bone tissue are separated from the Raman spectrum of the joint bone composed of the cartilage tissue and the bone tissue to selectively obtain the Raman spectrum derived from the cartilage tissue,
  • the Raman spectrum derived from the cartilage tissue By analyzing the Raman spectrum derived from the cartilage tissue, there is an effect that the state of the cartilage tissue existing on the surface layer of the joint bone can be accurately evaluated.
  • FIG. 1 is an overall configuration diagram of a cartilage tissue analyzer according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of a tip portion of the optical probe of FIG. 1.
  • FIG. 3 is a longitudinal sectional view taken along line II of the optical probe of FIG. 2.
  • FIG. 3 is a longitudinal sectional view taken along line II-II of the optical probe in FIG. 2. It is a figure explaining the positional relationship of the illumination area
  • FIG. 13B is an example of a first Raman spectrum and a second Raman spectrum obtained from the joint bone when the tissue thickness of the cartilage tissue with respect to the observation range is FIG. 13A.
  • FIG. 13A It is a figure which shows the Raman spectrum (solid line) of a normal cartilage tissue, and the Raman spectrum (broken line) of the lesioned cartilage tissue which deficient in sulfated glycosaminoglycan (GAG).
  • FIG. 25 is a diagram for explaining a method of creating teacher data for estimating the thickness of the cartilage tissue B, and shows a three-dimensional coordinate system with the Y-intercept Y and the slope A of the graph of FIG. 24 and the thickness of the cartilage tissue as axes.
  • FIG. 25 is a diagram for explaining a method of creating teacher data for estimating the thickness of the cartilage tissue B, and shows a three-dimensional coordinate system with the Y-intercept Y and the slope A of the graph of FIG. 24 and the thickness of the cartilage tissue as axes.
  • a cartilage tissue analyzing apparatus 100 irradiates a joint bone (living tissue) A with a laser light source 1 and laser light from the laser light source 1 and from the joint bone A.
  • the optical probe 2 that receives the Raman scattered light
  • the spectroscope (detector) 3 that splits the Raman scattered light received by the optical probe 2
  • the coupling disposed between the optical probe 2 and the spectroscope 3
  • An optical system 4 and a light detector (detection unit) 5 that detects the light separated by the spectroscope 3 and acquires a Raman spectrum are provided.
  • the laser light source 1 is a semiconductor laser that outputs near-infrared laser light having a wavelength of 785 nm.
  • the wavelength of the laser light source 1 may be a wavelength other than 785 nm.
  • the optical probe 2 includes an illumination fiber 6 that guides laser light from the laser light source 1, and a first condensing fiber 71 and a second condensing fiber 72 that receive and guide Raman scattered light. .
  • the illumination fiber 6 and the collection fibers 71 and 72 are bundled together at the distal end side, and the distal end portion of the illumination fiber 6 and the distal end portions of the collection fibers 71 and 72 are accommodated in the probe head 2a at the distal end portion of the optical probe 2. Has been.
  • the illumination fiber 6 and the collecting fibers 71 and 72 are branched from each other in the middle of the longitudinal direction, the proximal ends of the illumination fibers 6 are connected to the laser light source 1, and the proximal ends of the collecting fibers 71 and 72 are coupled to the coupling optical system 4. Is optically coupled to the spectroscope 3.
  • the laser light incident on the illumination fiber 6 from the laser light source 1 is guided through the illumination fiber 6 and emitted from the probe head 2a toward the joint bone A. Further, the Raman scattered light excited in the joint bone A by the irradiation of the laser light is collected by the condensing fibers 71 and 72, guided through the condensing fibers 71 and 72 and the coupling optical system 4, and sent to the spectroscope 3. Incident.
  • the coupling optical system 4 includes a lens 4 a that converts light emitted from the base ends of the collecting fibers 71 and 72 as a divergent light beam into a parallel light beam, and a parallel light beam formed by the lens 4 a at the entrance slit of the spectrometer 3.
  • This is a collimating optical system composed of a combination with a lens 4b that forms an image at a position.
  • an optical filter 4c that blocks the reflected light of the laser light L and transmits Raman scattered light having a wavelength longer than the wavelength of the laser light is provided.
  • the spectroscope 3 spatially separates the light incident from the condensing fibers 71 and 72 via the coupling optical system 4 for each wavelength, and re-images the obtained spectrum on the light receiving surface of the photodetector 5. .
  • the photodetector 5 is a camera including an imaging device in which photoelectric conversion elements such as CCD elements are two-dimensionally arranged, and is attached to the spectroscope 3.
  • the photodetector 5 obtains Raman spectrum data by converting light incident on the light receiving surface from the spectroscope 3 into an electrical signal by a photoelectric conversion element.
  • the optical probe 2 includes one illumination fiber 6, a plurality of first light collection fibers 71, and a plurality of second light collection fibers 72.
  • FIG. 2 shows a cross section of the probe head 2a (cross section perpendicular to the longitudinal direction of the optical probe 2).
  • FIGS. 3 and 4 show the longitudinal section of the probe head 2a taken along lines II and II-II in FIG. Each of the surfaces (the longitudinal section of the optical probe 2) is shown.
  • the illumination fiber 6 and the collecting fibers 71 and 72 are, for example, silica optical fibers having a core diameter of 105 ⁇ m or 200 ⁇ m and a cladding diameter of 125 ⁇ m or 240 ⁇ m and a low hydroxyl group content.
  • the numerical aperture NA of the illumination fiber 6 is preferably 0.22 or more, and the numerical aperture NA of the condensing fibers 71 and 72 is preferably 0.22 or less.
  • the illumination fiber 6 and the collecting fibers 71 and 72 are arranged in parallel to each other along the longitudinal direction of the probe head 2a.
  • the first condensing fiber 71 and the second condensing fiber 72 are arranged concentrically with the illumination fiber 6 as the center, the first condensing fiber is radially inward, and the second condensing fiber 72 is Arranged radially outside. Therefore, the radial distance from the front end surface (emission surface) of the illumination fiber 6 to the front end surface (light receiving surface) of each first condensing fiber 71 is the second condensing fiber from the front end surface of the illumination fiber 6. 72 is shorter than the radial distance to the tip surface (light receiving surface) of 72.
  • the tip surface of the illumination fiber 6 is perpendicular to the longitudinal direction of the probe head 2a. Therefore, the laser light emitted from the distal end surface of the illumination fiber 6 with a predetermined numerical aperture is irradiated onto the conical illumination region D in front of the distal end of the probe head 2a as shown in FIGS. In the region D, Raman scattered light is generated.
  • the distal end surfaces of the collecting fibers 71 and 72 have this length about the major axis of the probe head 2 a that is parallel to the illumination fiber 6 and the collecting fibers 71 and 72. It is inclined by a predetermined angle ⁇ with respect to a plane perpendicular to the axis, and faces obliquely outward.
  • the collecting fibers 71 and 72 collect light incident obliquely with respect to the respective longitudinal axes from the illumination fiber 6 side.
  • F2 increases in volume.
  • the amount of Raman scattered light received by the concentrating fibers 71 and 72 increases as the volume of the observation ranges F1 and F2 increases. Therefore, the surface layer of the joint bone A is inclined by inclining the distal end surfaces of the converging fibers 71 and 72. The Raman scattered light generated in the vicinity can be effectively collected, and the Raman spectrum of the joint bone A having a high signal-to-noise ratio can be obtained.
  • the predetermined angle ⁇ is an angle determined depending on the numerical aperture NA of the collecting fibers 71 and 72.
  • Raman scattered light emitted from the surface layer can be collected.
  • the predetermined angle ⁇ is 30 degrees.
  • a Raman spectrum derived from the cartilage tissue B having a thickness of about 1 to 2 mm from the surface of the joint bone A By setting to a predetermined angle included in the range of 37 degrees or less, it is possible to selectively observe a Raman spectrum derived from the cartilage tissue B having a thickness of about 1 to 2 mm from the surface of the joint bone A. Further, by further reducing the core diameters of the illumination fiber 6 and the collecting fibers 71 and 72, a Raman spectrum derived from a thinner cartilage tissue can be selectively observed.
  • a synthetic quartz or sapphire window material is disposed on the tip surface of the probe head 2a so as to be in contact with the cross section (tip surface) of the illumination fiber 6, and is formed at an angle of ⁇ with a plane including the window material.
  • An air gap may be provided between the tip surfaces of the optical fibers 71 and 72 and the window material.
  • the refractive index difference between the refractive index of the constituent material of the condensing fibers 71 and 72 and the refractive index of water Since it is smaller than the difference in refractive index between the material and air, the overlap between the condensing regions E1 and E2 and the illumination region D is small, which is disadvantageous for observation of the vicinity of the surface layer of the joint bone A. Therefore, by providing the gap as described above, the overlapping of the light collection regions E1 and E2 and the illumination region D is kept large, and the cartilage tissue B near the surface layer of the joint bone A can be selectively observed even in a water immersion environment. There is.
  • the 1st condensing fiber 71 is located near the illumination fiber 6 rather than the 2nd condensing fiber 72, the 1st condensing area
  • the observation range F1 is closer to the tip of the probe head 2a than the second observation range F2 where the second light collection region E2 and the illumination region D overlap. Therefore, the first collection fiber 71 collects Raman scattered light from a relatively shallow position of the joint bone A, and the second collection fiber 72 collects Raman scattering from a relatively deep position of the joint bone A. Collect light. That is, in the Raman scattered light collected by the first collecting fiber 71, the Raman scattered light of the cartilage tissue B covering the surface layer portion of the joint bone A is compared with the Raman scattered light collected by the second collecting fiber 72. Is included more.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view of the proximal end portion of the optical probe 2.
  • the first condensing fiber 71 and the second condensing fiber 72 are gathered on one side and the first condensing fiber 71 gathers on the other side.
  • the second light collecting fibers 72 are arranged in a line so as to gather. Therefore, as shown in FIG. 8, the Raman scattered light emitted from the first light collecting fiber 71 is re-imaged on the first light receiving region G1 on the light receiving surface 25, and the second light collecting fiber 72 is obtained.
  • the Raman scattered light emitted from the light is re-imaged on a second light receiving region G2 different from the first light receiving region G1 on the light receiving surface 25. Thereby, the first Raman spectrum in the first observation range F1 and the second Raman spectrum in the second observation range F2 are acquired separately.
  • FIG. 9 shows a portion of the first and second Raman spectra obtained from articular bone A where cartilage tissue B is sufficiently thick
  • FIG. 10 is obtained from articular bone A where cartilage tissue B is thin. 2 shows a part of the first Raman spectrum and the second Raman spectrum.
  • the main components contained in the cartilage tissue B are water, collagen (type II collagen), proteoglycan which is a complex of glycosaminoglycan (GAG) and protein, and chondrocytes.
  • the main components contained in the bone tissue C are collagen (type I collagen), calcium phosphate (hydroxyapatite), and calcium carbonate.
  • the Raman band having a peak in the vicinity of 921 cm ⁇ 1 is derived from proline which is an amino acid contained in type II collagen in the cartilage tissue, and the Raman band having a peak in the vicinity of 958 cm ⁇ 1. Is a band in which the Raman band of type II collagen in the cartilage tissue and the Raman band of the phosphate group of calcium phosphate (hydroxyapatite) in the bone tissue are superimposed.
  • FIGS. 9 and 10 Focusing on the intensity of the two Raman bands at 921cm -1 and 958cm -1 are shown in FIGS. 9 and 10, the Raman bands and 958Cm of 921cm -1 in the first Raman spectrum and the second Raman spectra of FIG. 9 - While the intensity ratio of the Raman band of 1 hardly changes, in the first Raman spectrum and the second Raman spectrum of FIG. 10, the Raman band intensity of 958 cm ⁇ 1 in the second Raman spectrum is the Raman band of 921 cm ⁇ 1 . It is larger than the strength.
  • the second Raman spectrum of FIG. 10 includes more Raman spectrum contributions derived from hydroxyapatite, which is a component of bone tissue, as compared to the second Raman spectrum of FIG. Yes.
  • the cartilage tissue analyzing apparatus 100 further includes a control unit 8, a storage unit 9, a calculation unit (intensity ratio calculation unit, evaluation unit) 10, and a display unit 11, as shown in FIG.
  • the control unit 8 controls the irradiation intensity and irradiation timing of the laser light by controlling the output intensity and output timing of the laser light emitted from the laser light source 1.
  • the control unit 8 controls the center wavelength of the spectroscope 3 and the light detection conditions (for example, exposure time and gain) by the photodetector 5.
  • the storage unit 9 stores first and second Raman spectrum data acquired by the photodetector 5 and a calculation result (described later) by the calculation unit 10.
  • the display unit 11 displays the Raman spectrum stored in the storage unit 9 and the calculation result by the calculation unit 10.
  • the calculation unit 10 reads out the first and second Raman spectra from the storage unit 9, analyzes the first and second Raman spectra, and evaluates the state of the cartilage tissue B included in the joint bone A. The following first and second processes are executed.
  • Raman bands from cartilage tissue B can be used a Raman band of type II collagen, Raman band of 921cm -1 amino acid (proline), the Raman bands of 815 cm -1 of the polypeptide backbone of collagen .
  • the Raman band derived from the bone tissue C is a Raman band of phosphate ions contained in hydroxyapatite (HAP) at 958 cm ⁇ 1 , for example.
  • Each Raman band intensity may be either the peak value of the band or the area intensity.
  • the calculation unit 10 compares the first band intensity ratio and the second band intensity ratio with a predetermined threshold value, and a Raman spectrum having a band intensity ratio larger than the predetermined threshold value is used as the Raman spectrum of the cartilage tissue B. select.
  • FIG. 11A illustrates the relationship between the observation range F1 and the observation range F2 and the joint bone A when the cartilage tissue B is sufficiently thick to include the observation range F1 and the observation range F2.
  • the first Raman spectrum acquired by the collecting fiber 71 and the second Raman spectrum acquired by the collecting fiber 72 are substantially caused by the Raman spectrum of the cartilage tissue B, as shown in FIG. 11B.
  • the Raman band intensity of collagen having a peak at 921 cm ⁇ 1 and the Raman band intensity of hydroxyapatite (HAP) having a peak at 958 cm ⁇ 1 are substantially equal.
  • FIG. 12A shows the relationship between the observation range F1 and the observation range F2 and the joint bone A when the cartilage tissue B is sufficiently thin or does not exist so as to hardly include the observation range F1 and the observation range F2.
  • the relationship is illustrated.
  • the first Raman spectrum acquired by the collecting fiber 71 and the second Raman spectrum acquired by the collecting fiber 72 are substantially caused by the Raman spectrum of the bone tissue C as shown in FIG. 12B.
  • Raman band intensity hydroxyapatite (HAP) having a peak at 958cm -1 in this case is 10 times or more of the Raman band intensity of collagen with a peak at 921cm -1.
  • HAP Raman band intensity hydroxyapatite
  • FIG. 13A illustrates a case where the thickness of the cartilage tissue B is intermediate between the case of FIG. 11A and the case of FIG. 12A.
  • collagen Raman having a peak at 921 cm ⁇ 1.
  • the intensity ratio between the band intensity and the Raman band intensity of hydroxyapatite (HAP) having a peak at 958 cm ⁇ 1 varies depending on the ratio of the cartilage tissue B and the bone tissue C included in the observation range F1 and the observation range F2.
  • the band intensity ratio of the Raman bands of hydroxyapatite having a peak at a Raman band and 958cm -1 of collagen with a peak at 921cm -1 is different according to the thickness of the cartilage B in the joint bone A, first And changes depending on the contribution ratio of the Raman spectrum of the cartilage tissue B in the second Raman spectrum. Therefore, based on the band intensity ratio, the Raman spectrum of the bone tissue C that is small and the contribution of the Raman spectrum of the cartilage tissue B can be selected from the first and second Raman spectra.
  • a predetermined threshold value that serves as a reference for selecting the Raman spectrum of the cartilage tissue B is experimentally determined.
  • the predetermined threshold is set to 0.8.
  • the band intensity ratios are 1.15 and 1.0, respectively.
  • both the first and second Raman spectra are selected as the Raman spectra of the cartilage tissue.
  • the Raman spectrum of the cartilage tissue B only the first Raman spectrum may be used for the subsequent second processing, or the first Raman spectrum and the second Raman spectrum may be used. The sum may be used for the subsequent second processing.
  • the band intensity ratios are 0.95 and 0.56, respectively. Therefore, only the first Raman spectrum is selected as the Raman spectrum of the cartilage tissue B.
  • the arithmetic unit 10 analyzes the Raman spectrum of the selected cartilage tissue B, calculates the amount of glycosaminoglycan (GAG) contained in the cartilage tissue B, and calculates the calculated glycosaminoglycan (GAG).
  • the condition of the cartilage tissue B is evaluated based on the amount of saminoglycan (GAG).
  • the calculation unit 10 calculates the intensity of the Raman band of collagen and the intensity of the Raman band of glycosaminoglycan (GAG) from the Raman spectrum of the cartilage tissue B.
  • the Raman bands of collagen for example, Raman band proline residue at 921cm -1, or Raman bands of collagen in 815 cm -1 is selected.
  • Raman band of glycosaminoglycan for example, Raman band of sulfate groups of the sulfated glycosaminoglycan (GAG) in 1063Cm -1 or Raman band at 1380 cm -1 it is selected.
  • Each Raman band intensity may be either the peak value of the band or the area intensity.
  • FIG. 14 shows an example of the Raman spectrum of the cartilage tissue B selected in the first process after the Raman spectrum of the joint bone A is acquired by the analyzer 100 shown in FIG.
  • the solid line shows the Raman spectrum of the cartilage tissue B in the normal joint bone A
  • the broken line shows the glycosaminoglycan (GAG) that is immersed in the proteoglycan degrading enzyme (trypsin).
  • GAG glycosaminoglycan
  • trypsin proteoglycan degrading enzyme
  • the calculation unit 10 calculates the intensity ratio between the Raman band of sulfated glycosaminoglycan (GAG) and the Raman band of collagen (the intensity of the Raman band of GAG ⁇ the intensity of the Raman band of collagen) GAG / Col.
  • GAG Raman band of sulfated glycosaminoglycan
  • a Raman band having an intensity peak in the vicinity of 1063 cm ⁇ 1 or 1380 cm ⁇ 1 is used, and as a Raman band of collagen, an intensity peak is in the vicinity of 921 cm ⁇ 1 or 940 cm ⁇ 1.
  • the Raman band which has can be used.
  • 15A and 15B show the correlation between the Raman band intensity ratio GAG / Col and the weight of sulfated glycosaminoglycan (GAG) per unit wet weight in the cartilage tissue obtained by biochemical analysis. Show.
  • GAG Raman band intensity ratio
  • GAG the intensity ratio GAG / Col is expressed as glycosaminoglycan ( GAG) showed a high correlation with a correlation coefficient of 0.9 or more.
  • the amount of GAGs such as chondroitin sulfate may be reduced in regenerated cartilage that is in the process of regeneration and is not mature as hyaline cartilage, fibrous cartilage, or osteoarthritic cartilage tissue compared to normal cartilage tissue.
  • the calculation unit 10 estimates the amount of GAG in the cartilage tissue B based on the Raman band intensity ratio GAG / Col, and evaluates the state of the cartilage tissue B such as regenerated cartilage or osteoarthritis.
  • Analysis results such as the amount of GAG and evaluation results obtained by the calculation unit 10 are stored in the storage unit 9 and displayed on the display unit 11.
  • the laser light output from the laser light source 1 is guided by the illumination fiber 6 of the optical probe 2 and irradiated to the joint bone A from the probe head 2a (step S1).
  • Raman scattered light derived from the components of the joint bone A is generated by laser light irradiation, and Raman scattered light (inelastic scattered light) and laser light scattered light (elastic scattered light) are generated. It is diffusely reflected from the articular bone A.
  • the scattered light from the first observation range F1 is received by the first condensing fiber 71, and the scattered light from the second observation range F2 is the second collection light.
  • Light is received by the optical fiber 72 (step S2).
  • the scattered light received by the first condensing fiber 71 and the second condensing fiber 72 is respectively guided to the spectroscope 3 through the coupling optical system 4 and spatially separated by wavelength by the spectroscope 3. And detected by the photodetector 5.
  • the 1st Raman spectrum of the 1st observation range F1 and the 2nd Raman spectrum of the 2nd observation range F2 are acquired (Step S3).
  • the acquired Raman spectrum is stored in the storage unit 9 and transmitted to the calculation unit 10.
  • the calculation unit 10 calculates the first band intensity ratio from the intensity of the Raman band of the cartilage tissue B and the Raman band of the bone tissue C in the first Raman spectrum (step S4).
  • the second band intensity ratio is calculated from the intensities of the Raman band of the cartilage tissue B and the Raman band of the bone tissue C in the second Raman spectrum (step S5).
  • a Raman spectrum that gives a band intensity ratio larger than a predetermined threshold is selected as the Raman spectrum of the cartilage tissue B from the first and second Raman spectra (steps S6 and S7).
  • the calculation unit 10 calculates the intensity ratio GAG / Col between the glycosaminoglycan (GAG) and the collagen Raman band in the Raman spectrum of the selected cartilage tissue B (step S8), and the calculated intensity ratio.
  • the state of the cartilage tissue B is evaluated based on GAG / Col (step S9).
  • the evaluation result is displayed on the display unit 11.
  • the evaluation result of the cartilage tissue B displayed on the display unit 11 is, for example, an estimated amount of glycosaminoglycan (GAG) in the cartilage tissue B.
  • it may be a classification index indicating the state of cartilage tissue B that is staged to correlate with an estimated amount of glycosaminoglycan (GAG).
  • the articular bone A differs depending on the first concentrating fiber 71 and the second concentrating fiber 72 having the distal end surfaces arranged at different distances from the distal end surface of the illumination fiber 6.
  • Two Raman spectra of the depth observation ranges F1 and F2 are acquired. Then, by selecting the Raman spectrum of the cartilage tissue B based on the Raman band intensity ratio between the Raman band derived from the cartilage tissue B and the Raman band derived from the bone tissue C calculated from each Raman spectrum, the bone tissue C origin In addition, the Raman spectrum of the cartilage tissue B can be used for evaluation after eliminating the influence of the above signal as much as possible.
  • the state of regenerated cartilage in the process of regeneration in the cartilage tissue B existing on the surface layer of the joint bone A, or the cartilage tissue in early osteoarthritis with an abnormality only in the cartilage tissue B existing on the surface layer of the joint bone A There is an advantage that the state of B can be evaluated with high accuracy.
  • the plurality of first light collection fibers 71 and the plurality of second light collection fibers 72 are arranged concentrically, but the first light collection fibers 71 and the second light collection fibers are arranged.
  • the number and arrangement of the optical fibers 72 are not limited to this. For example, as shown in FIGS. 17A to 17C, only one first condensing fiber 71 and two second condensing fibers 72 are provided, and the illumination fiber 6, the first condensing fiber 71, and the first condensing fiber 71 are provided.
  • Two concentrating fibers 72 may be arranged in a row in the radial direction.
  • the distance from the distal end surface of the illumination fiber 6 to the distal end surface of the first condensing fiber 71 is different from the distance from the distal end surface of the illumination fiber 6 to the distal end surface of the second condensing fiber.
  • the optical fibers 6, 71, 72 are arranged.
  • the tip surfaces of the collecting fibers 71 and 72 are inclined by a predetermined angle ⁇ 2 with respect to a plane perpendicular to the long axis direction of the probe head 2a.
  • the tip surfaces of the collecting fibers 71 and 72 are not only inclined by a predetermined angle ⁇ 2 with respect to a plane perpendicular to the long axis direction of the probe head 2a, but also the illumination fibers 6
  • the distal end surface may also be inclined by a predetermined angle ⁇ 1 with respect to a plane perpendicular to the major axis direction of the probe head 2a.
  • regions E1 and E2 which the condensing fibers 71 and 72 form overlap, are the probe head. Since it is formed at a position closer to the tip of 2a, it is more effective than the structure shown in FIG. 17C in observing the cartilage tissue B existing on the surface of the joint bone A.
  • the Raman band of collagen and HAP is used for calculating the first and second band intensity ratios.
  • glycosaminoglycan (GAG) is included only in the cartilage tissue B, and the bone tissue C Therefore, as a Raman band derived from cartilage tissue B, a Raman band of glycosaminoglycan (GAG) may be used instead of collagen.
  • the intensity ratio of the Raman bands of glycosaminoglycan (GAG) and hydroxyapatite (HAP) also reflects the contribution ratio of the Raman spectrum of cartilage tissue B in the first and second Raman spectra. Therefore, the Raman spectrum of the cartilage tissue B can be selected based on the intensity ratio.
  • the intensity ratio GAG / Col between the glycosaminoglycan (GAG) and the Raman band of collagen is calculated, but instead of this, the intensity ratio of the other two types of Raman bands included in the cartilage tissue B may be calculated.
  • glycosaminoglycan GAG
  • protein Raman bands are used as the Raman band of the protein.
  • the Raman band of the protein for example, the Raman band of the phenylalanine residue of the protein having a peak near 1003 cm ⁇ 1 is selected as shown in FIG.
  • Raman band of glycosaminoglycan (GAG) for example as shown in FIG. 14, it is possible to select the Raman bands of sulfated glycosaminoglycan having a peak near 1063cm -1 vicinity or 1380 cm -1.
  • the intensity ratio between the Raman band of glycosaminoglycan (GAG) and the Raman band of protein (the intensity of Raman band of GAG ⁇ the intensity of Raman band of protein) GAG / Protein is calculated.
  • the amount of glycosaminoglycan (GAG) relative to the amount of total protein in cartilage tissue B The amount is reduced. Therefore, the state of the cartilage tissue B can be evaluated based on the intensity ratio GAG / Protein that is proportional to the relative amount of the total protein and the glycosaminoglycan (GAG) in the cartilage tissue B.
  • the Raman bands of collagen in addition to the Raman band of 921cm -1 and 815 cm -1 as described above, as shown in FIG. 14, the collagen of the amide III band at 1230 cm -1 ⁇ 1240 cm -1, or,, 1650 cm -1 A nearby collagen amide I band may be selected.
  • the Raman band of the protein the Raman band of the phenylalanine residue of the protein having a peak in the vicinity of 1003 cm ⁇ 1 is selected. Then, the intensity ratio of the collagen Raman band to the protein Raman band (collagen Raman band intensity ⁇ protein Raman band intensity) Col / Protein is calculated.
  • the state of the cartilage tissue B can also be evaluated by using the strength ratio Col / Protein that is proportional to the relative amount of collagen to the total amount of protein in the cartilage tissue B thus obtained.
  • Raman bands of methyl groups (CH 3 ) and methylene groups (CH 2 ) derived from proteins and lipids in cartilage tissue B can be used. 18, of the Raman spectra of cartilage tissue B, and shows a Raman shift range of 3050 cm -1 from 2830cm -1 Raman bands of methyl group and methylene group are observed. As shown in FIG. 18, the Raman bands of methyl group, 2940 ⁇ 2950 cm band of -1 is selected, the Raman bands methylene group, Raman band having a peak in the vicinity 2855Cm -1 or near 2885Cm -1 Is selected. Then, the intensity ratio between the methylene group Raman band and the methyl group Raman band (methylene group Raman band intensity ⁇ methyl group Raman band intensity) CH 2 / CH 3 is calculated.
  • FIG. 19 shows the correlation between the intensity ratio CH 2 / CH 3 of the Raman band of methylene group and methyl group and the amount of DNA in the cartilage tissue (dry weight in 1 mg of cartilage tissue).
  • the intensity ratio CH 2 / CH 3 has a strong correlation with a correlation coefficient of 0.8 or more with respect to the amount of DNA in the cartilage tissue. It was suggested that it is derived from the lipids. Therefore, the amount of cells in the cartilage tissue B is estimated based on the intensity ratio CH 2 / CH 3 of the Raman band of the methylene group and the methyl group, and the state of the cartilage or osteoarthritic cartilage that is being regenerated based on the cell amount Can be evaluated.
  • a bisected amide III band having peaks near 1240 cm ⁇ 1 and 1270 cm ⁇ 1 is used. It is known that the intensity ratio of the amide III band of the collagen split into two reflects the molecular structure of the collagen in the cartilage tissue B and changes as the collagen denatures. Osteoarthritic cartilage is known to exhibit type II collagen degeneration in hyaline cartilage, and cartilage tissue type II like osteoarthritis based on the strength ratio of the two amide III bands The extent of lesions associated with collagen degeneration can be evaluated.
  • the calculation unit 10 performs a multivariate analysis on the Raman spectrum of the cartilage tissue B selected in step S7, thereby the Raman spectrum feature amount reflecting a predetermined component amount contained in the cartilage tissue B. Or the state of the cartilage tissue may be evaluated by performing quantification of the predetermined component itself.
  • an arbitrary Raman shift range including the Raman band (1063 cm ⁇ 1 ) of sulfated glycosaminoglycan (GAG) is selected from the Raman spectrum of cartilage tissue B, and the selected range is selected.
  • Multivariate analysis of the Raman spectrum of As the multivariate analysis for example, principal component analysis (PCA), principal component regression analysis (PCR), partial least square analysis (PLS), or classical least square analysis (CLS) method is used.
  • PCA principal component analysis
  • PCR principal component regression analysis
  • PLS partial least square analysis
  • CLS classical least square analysis
  • FIG. 20A shows Raman spectrum groups of cartilage tissue B in various states selected in step S7
  • FIG. 20B shows loading of the first principal component obtained as a result of principal component analysis of the Raman spectrum group of FIG. 20A.
  • a spectrum (first principal component waveform) is shown.
  • the loading spectrum of the first main component is derived from sulfated glycosaminoglycan because it has a strong positive peak in the Raman shift value near 1063 cm ⁇ 1 corresponding to the peak of the Raman band of sulfated glycosaminoglycan (GAG). Signal.
  • FIG. 20A shows Raman spectrum groups of cartilage tissue B in various states selected in step S7
  • FIG. 20B shows loading of the first principal component obtained as a result of principal component analysis of the Raman spectrum group of FIG. 20A.
  • a spectrum (first principal component waveform) is shown.
  • the loading spectrum of the first main component is derived from sulfated glycosaminoglycan because it has a strong positive
  • the magnitude of the score of the first principal component obtained by projecting the Raman spectrum group of FIG. 20A onto the loading spectrum of the first principal component, and sulfated glycosaminoglycan (GAG).
  • GAG sulfated glycosaminoglycan
  • FIG. 21 shows the correlation between the first principal component score obtained by principal component analysis and the amount of sulfated glycosaminoglycan (GAG) contained in the unit dry weight in the cartilage tissue.
  • GAG sulfated glycosaminoglycan
  • a Raman spectrum analysis method by other multivariate analysis may be used. For example, after preparing a large number of mixed samples having different component ratios from isolated products of sulfated glycosaminoglycan (GAG) and collagen (type II collagen), which are the main components of cartilage tissue B, A Raman spectrum is measured, and data in which a component ratio for each mixed sample is associated with a Raman spectrum is created. Based on the data, a calibration curve of sulfated glycosaminoglycan (GAG) or type II collagen is prepared by a regression analysis method such as PLS (partial least squares regression) or PCR (principal component regression), The calibration curve data is stored in the storage unit 9. In this way, by measuring the Raman spectrum of the unknown cartilage tissue B, the relative amount of sulfated glycosaminoglycan (GAG) or type II collagen can be estimated using the calibration curve.
  • GAG sulfated glycosaminoglycan
  • type II collagen type II collagen
  • an arbitrary Raman shift range including a methylene group Raman band is selected, and Multivariate analysis of Raman spectra.
  • multivariate analysis for example, principal component analysis is used.
  • FIG. 22A shows a Raman spectrum group of the cartilage tissue B selected in step S7
  • FIG. 22B shows a loading spectrum (first main component) obtained by principal component analysis of the Raman spectrum group of FIG. 22A. Component waveform).
  • Loading spectrum of the first principal component in order to have a strong positive peak Raman shift value of 2855cm -1 and 2885cm -1 corresponding to the peak of the Raman bands methylene group, the contribution of lipids contained in the cartilage tissue B It was suggested that the spectrum included.
  • FIG. 23 there is a positive correlation between the magnitude of the first principal component score obtained by projecting the Raman spectrum group of FIG. 22A to the loading spectrum of the first principal component and the amount of DNA in the cartilage tissue B.
  • This methylene group Raman band is thought to be derived from the lipids in chondrocytes B.
  • FIG. 23 shows the correlation between the first principal component score obtained by principal component analysis and the amount of DNA in cartilage tissue B (DNA dry weight in 1 milligram of cartilage tissue).
  • a strong correlation with a correlation coefficient of 0.82 is recognized between the first principal component score of the principal component analysis and the amount of DNA in the cartilage tissue B.
  • the cartilage tissue B is in the process of being regenerated based on the amount of cells. The state of certain cartilage or osteoarthritic cartilage can be assessed.
  • the Raman band derived from bone tissue C is a hydroxyapatite (HAP) having a Raman shift value having a peak in the vicinity of 958 cm ⁇ 1.
  • HAP hydroxyapatite
  • FIG. 24 is a graph plotting the intensity ratio calculated from the first Raman spectrum and the intensity ratio calculated from the second Raman spectrum after acquiring Raman spectra for cartilage tissues of various thicknesses.
  • the computing unit 10 further calculates a Y-intercept value Y and a slope A of the straight line passing through two plots indicating the intensity ratio of the first Raman spectrum and the intensity ratio of the second Raman spectrum.
  • both Y and the slope A become small.
  • FIG. 12A when the thickness of the cartilage tissue B is sufficiently thin so as to hardly include the observation range F1 and the observation range F2 (see the triangular plot in FIG. 24), Y increases and the slope A Becomes smaller.
  • the thickness of the cartilage tissue B is the above intermediate thickness (see the square plot in FIG. 24), Y becomes smaller and the inclination A becomes larger.
  • the values of (Y, A) are different depending on the relative thickness of the cartilage tissue B with respect to the observation range F1 and the observation range F2. Therefore, after storing the database measuring the relationship between the actual thickness of the cartilage tissue B and the value of (Y, A) in the storage unit 9, the calculation unit 10 reads the database from the storage unit 9, and based on the database Then, (Y, A) is obtained from the intensity ratio of the two Raman bands calculated from the first and second Raman spectra of the unknown joint bone, and the cartilage tissue B is calculated from the obtained (Y, A) value. The thickness can be estimated.
  • the thickness estimation of the cartilage tissue B can be performed as follows.
  • the intensity ratio of the first and second Raman spectra is determined for various cartilages, and (Y, A) is determined by performing the plot shown in FIG.
  • the thickness Z of the cartilage tissue is measured, and a coordinate point (Y, A) in a three-dimensional coordinate system with the Y-intercept value Y, the inclination A, and the cartilage tissue thickness Z as coordinate axes as shown in FIG. , Z).
  • three types of (Y 1 , A 1 , Z 1 ), (Y 2 , A 2 , Z 2 ), and (Y 3 , A 3 , Z 3 ) are selected for three types of cartilage tissues having different tissue thicknesses.
  • a thickness estimation surface (planar or curved surface) is calculated by spatial interpolation so that the cartilage tissue thickness Z for any (Y, A) can be estimated. Calculate it. If such a thickness estimation surface is calculated, the Raman spectrum of an unknown joint bone is measured, and if only (Y, A) is calculated from the first and second Raman spectra, the cartilage thickness at the observation point is calculated. Can be estimated.
  • a spatial statistical method such as Kriging interpolation may be used.
  • the thickness of the cartilage tissue B can vary depending on the maturity of the regenerated cartilage that is in the process of reproduction and the degree of progression of osteoarthritis, by estimating the thickness of the cartilage tissue B, the cartilage tissue of the regenerated cartilage or osteoarthritis You can know about the state of The classification index indicating the state of the cartilage tissue B, which is displayed on the display unit 11 or correlated with the thickness of the cartilage tissue B, is displayed on the display unit 11. May be displayed.
  • a data group of (Y, A) is obtained from a large number of joint bones A, and cartilage tissue is obtained by regression analysis such as principal component regression (PCR) or partial least squares (PLS) based on the obtained data group.
  • a calibration curve that correlates the thickness of B with the Y intercept and the slope A may be created in advance, and the thickness of the cartilage tissue B may be estimated from Raman spectrum data of unknown joint bones using the calibration curve.
  • the thickness of the cartilage tissue B may be estimated by multivariate analysis of the Raman spectrum.
  • a large number of articular bone A samples having different thicknesses of cartilage tissue B include a Raman band of hydroxyapatite having a Raman shift value of about 958 cm ⁇ 1 and a type II collagen Raman band of about 921 cm ⁇ 1.
  • first and second Raman spectra are obtained, and the intensity ratio between the Raman band of collagen and the Raman band of hydroxyapatite (HAP) is obtained from each of the first and second Raman spectra in the same manner as in steps S4 and S5. Is calculated.
  • the sum of the Raman band intensity ratio in the first Raman spectrum and the Raman band intensity ratio in the second Raman spectrum was calculated, and the sum of the Raman band intensity ratio and the thickness of the actual cartilage tissue were correlated.
  • Create data Based on the data, a calibration curve for the thickness of the cartilage tissue is created by a regression analysis method such as a PLS analysis method or a PCR analysis method, and the calibration curve is stored in the storage unit 9. By doing in this way, the thickness of the cartilage tissue can be estimated from the first and second Raman spectra of the unknown joint bone.
  • the control unit 8 and the calculation unit 10 of the above-described cartilage tissue analysis apparatus 100 include, for example, a CPU (central processing unit), a control program for causing the CPU to execute the processes of the control unit 8 and the calculation unit 10 described above, and
  • the present invention is realized by a computer including an auxiliary storage device such as an HDD for storing an arithmetic program and a main storage device such as a RAM or a ROM that functions as a work area of the CPU.
  • the storage unit 9 is realized by a main storage device, for example.

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Abstract

軟骨組織の分析装置（１００）は、レーザ光源（１）からのレーザ光を射出面から射出する照明ファイバ（６）と、射出面からの距離が互いに異なる受光面において散乱光をそれぞれ受光する２つの集光ファイバ（７１，７２）と、集光ファイバ（７１，７２）によって受光された散乱光の各々からラマンスペクトルを検出する検出部（３，５）と、２つのラマンスペクトルの各々から軟骨組織および骨組織にそれぞれ由来する２つのラマンバンドの強度比を演算する演算部（１０）と、強度比が所定の範囲内であるラマンスペクトルを２つのラマンスペクトルの中から選択し、選択されたラマンスペクトルを解析する評価部（１０）とを備える。

Description

軟骨組織の分析装置
　本発明は、軟骨組織の分析装置に関するものである。
　関節軟骨の病変である変形性関節症（ＯＡ：Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）や外傷による軟骨損傷の診断、あるいは培養軟骨細胞移植による再生治療後の再生軟骨診断においては、従来、Ｘ線画像や核磁気共鳴画像、および関節鏡視に基づく診断が行われている。近年、細径の光ファイバプローブ下で、近赤外光の拡散反射法やラマン散乱法等の分光測定を実施することにより、コラーゲンやグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）等の関節軟骨基質の変化の情報を取得して、光学的にその軟骨状態を評価する方法が提案されている。（例えば、非特許文献１、非特許文献２および特許文献１参照。）。
　関節骨は、骨表面を覆う軟骨組織と該軟骨組織の下層に存在する骨組織から構成されている。軟骨組織は硝子軟骨であり、その主成分は、ＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン硫酸等のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、および水である。また、骨組織の主成分は、Ｉ型コラーゲン、ヒドロキシアパタイト等のリン酸カルシウム、および炭酸カルシウムである。ヒト軟骨組織の厚みは、正常軟骨では約２～４ｍｍ程度であり、変形性関節症等の病変進行に伴ってより薄くなる傾向を有することが知られている。従来提案されている軟骨性状の光学評価法は、上記関節骨端において軟骨組織および骨組織に由来する分光スペクトルを測定する。例えば、特許文献１の装置では、関節骨の軟骨組織および骨組織に由来するラマンスペクトルを測定し、該ラマンスペクトルにおける特定ラマンバンドの情報に基づいて軟骨組織の状態を評価している。
　例えば、特許文献１の図８には、骨組織に含まれるリン酸カルシウムと炭酸カルシウムのラマンバンドの強度比に基づいて変形性関節症（ＯＡ）を診断する方法が記載されている。また、特許文献１の図９には、炭酸カルシウムおよびリン酸カルシウムのラマンバンドと、さらに蛋白質に由来するＣＨ基由来のラマンバンドとの強度比に基づいて変形性膝関節症（ＯＡ）を診断する方法が記載されている。またさらに、特許文献１の図１９には、コラーゲンの分子構造変化、すなわちコラーゲン変性と相関することが知られている１２４０ｃｍ－１および１２７０ｃｍ－１における２つのアミドＩＩＩバンドの強度比に基づいてＯＡを診断する方法が記載されている。
Karen　A.　Esmonde-White、外３名、"Fiber-optic　Raman　Spectroscopy　of　Joint　Tissues"、Analyst、2011年4月、Vol.136、p.1675-1685 I.　Afara、外４名、"Non-destructive　evaluation　of　articular　cartilage　defects　using　near-infrared　spectroscopy　in　osteoarthriticrat　models　and　its　direct　relation　to　Mankin　score"、Osteoartthritis　and　Cartilage、2012年11月、Vol.20、p.1367-1373
米国特許第７７２９７４９号明細書
　特許文献１に開示される測定方法では、軟骨組織のラマンスペクトルと骨組織のラマンスペクトルとが重畳されたラマンスペクトルを取得している。この場合、ヒドロキシアパタイト等のリン酸カルシウムや炭酸カルシウム、およびＩ型コラーゲン等の骨組織成分のラマンスペクトル強度が、ＩＩ型コラーゲンやグリコサミノグリカン等の軟骨組織成分のラマンスペクトル強度と比較して著しく強いため、関節骨表層の軟骨組織のみに由来するラマンスペクトルの情報は、関節骨深層の骨組織に由来するラマンスペクトルの情報に覆い隠されて、軟骨組織を選択して観測することが困難であることが記載されている。
　変形性関節症（ＯＡ）では、一般に早期には軟骨組織表層付近において病変が生じ、さらに深部の軟骨組織や骨組織へ病変が拡大することが知られている。したがって、特許文献１の方法では、骨組織まで進行した変形性関節症（ＯＡ）病変であれば診断することができるが、軟骨組織における早期の変形性関節症（ＯＡ）病変を検出することが難しいという問題がある。また、培養軟骨細胞移植による軟骨再生治療においては、細胞移植される軟骨欠損部位において、軟骨組織が硝子軟骨へと再生していることを評価することが必要である。しかし、特許文献１で開示される測定方法では、そのラマンスペクトルから、軟骨組織の固有成分であるＩＩ型コラーゲンやコンドロイチン硫酸をはじめとするグリコサミノグリカン等の軟骨組織の基質成分を検出することが難しく、軟骨組織の再生状態の良悪を評価することが難しいという問題がある。
　本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、関節骨のラマンスペクトルから軟骨組織選択的にラマンスペクトルを取得し、軟骨組織の状態を精度良く評価することができる軟骨組織の分析装置を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
　本発明の一態様は、レーザ光を出力するレーザ光源と、先端に射出面を有し、前記レーザ光源から入射されたレーザ光を前記射出面から軟骨組織を含む生体組織に向けて射出する照明ファイバと、先端に受光面を各々有し、前記生体組織からの散乱光を前記受光面においてそれぞれ受光する第１の集光ファイバおよび第２の集光ファイバと、前記第１の集光ファイバによって受光された前記散乱光から第１のラマンスペクトルを検出するとともに、前記第２の集光ファイバによって受光された前記散乱光から第２のラマンスペクトルを検出する検出部と、該検出部によって検出された前記第１のラマンスペクトルおよび前記第２のラマンスペクトルの各々から、軟骨組織に由来するラマンバンドと骨組織に由来するラマンバンドとの強度比を演算する強度比演算部と、該強度比演算部によって算出された強度比が所定の範囲内であるラマンスペクトルを前記第１のラマンスペクトルおよび前記第２のラマンスペクトルの中から選択し、選択されたラマンスペクトルを解析して前記軟骨組織の状態を評価する評価部とを備え、前記第１の集光ファイバの前記受光面の前記射出面からの距離と、前記第２の集光ファイバの前記受光面の前記射出面からの距離とが、互いに異なる軟骨組織の分析装置である。
　本態様によれば、レーザ光源から照明ファイバにレーザ光が供給されて射出面から生体組織にレーザ光が照射されると、レーザ光の照明領域内で発生した生体組織の散乱光が第１および第２の集光ファイバによって受光され、第１および第２の集光ファイバによって受光された散乱光から第１および第２のラマンスペクトルがそれぞれ検出部によって取得される。このときに、第１および第２のラマンスペクトルは、関節骨表層に位置する軟骨組織のラマンスペクトルのみ、あるいは、軟骨組織と該軟骨組織の下に位置する骨組織の両方のラマンスペクトルを含む。
　この場合に、第１の集光ファイバの受光面と第２の集光ファイバの受光面は、照明ファイバの射出面からの距離が互いに異なる位置に配置されているので、第１の集光ファイバおよび第２の集光ファイバは、レーザ光の照明領域の内、深さ方向（レーザ光の照射方向）に互いに異なる範囲からの散乱光を受光する。したがって、第１のラマンスペクトルにおいて軟骨組織が該ラマンスペクトルへ寄与する割合と、第２のラマンスペクトルにおいて軟骨組織が該ラマンスペクトルへ寄与する割合は、互いに異なり得る。
　ここで、軟骨組織成分由来のラマンバンドと骨組織成分由来のラマンバンドとの強度比を、第１のラマンスペクトルと第２のラマンスペクトルの各ラマンスペクトルについて算出することによって、該各ラマンスペクトルにおける軟骨組織のラマンスペクトルの寄与の割合を見積もることが可能である。したがって、算出された強度比に基づいて、第１および第２のラマンスペクトルから、軟骨組織のラマンスペクトルのみを含むラマンスペクトル、あるいは、軟骨組織のラマンスペクトルの寄与が大きいラマンスペクトルを選択することができる。そして、選択されたラマンスペクトルを用いて、骨組織由来のラマンスペクトルの情報を可能な限り排除して軟骨組織の状態を精度良く評価することができる。
　上記態様においては、前記強度比演算部が強度比の演算に、前記軟骨組織に由来するラマンバンドとしてＩＩ型コラーゲンのラマンバンド強度を用い、前記骨組織に由来するラマンバンドとしてヒドロキシアパタイトのラマンバンド強度を用いてもよい。あるいは、上記態様においては、前記強度比演算部が強度比演算に、前記軟骨組織に由来するラマンバンドとしてグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンド強度を用い、前記骨組織に由来するラマンバンドとしてヒドロキシアパタイトのラマンバンド強度を用いてもよい。
　このようにすることで、第１および第２のラマンスペクトルにおける、軟骨組織のラマンスペクトルおよび骨組織のラマンスペクトルの寄与の割合を精度良く算出することができる。
　上記態様においては、前記評価部が、前記選択されたラマンスペクトルにおける前記軟骨組織に由来する、ラマンシフトが互いに異なる２種類のラマンバンドの強度比を算出し、算出された強度比に基づいて前記軟骨組織の状態を評価してもよい。
　軟骨組織に含有される各成分のラマンバンド強度は、該成分の含有量に比例するため、異なる２種類の成分のラマンバンド強度比は、異なる２種類の成分の相対量を反映する。あるいは所定成分において、ラマンシフトが互いに異なる２種類のラマンバンドの強度比が、該成分の分子構造を反映することが知られている。
　したがって、算出されたラマンバンドの強度比から、軟骨組織に含有される成分について、該成分の相対量や分子構造の変化、すなわち軟骨基質分子の変性についての情報を得ることができる。このような情報に基づいて、変形性関節症（ＯＡ）をはじめとする軟骨病変や再生軟骨の成熟度などの軟骨組織の生化学的状態を評価することができる。
　上記態様においては、前記２種類のラマンバンドが、コラーゲンのラマンバンドとグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドであってもよい。このグリコサミノグリカンは、軟骨組織に含有される主たるグリコサミノグリカンである、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸等の硫酸化グリコサミノグリカンである。
　ここで、コラーゲンのラマンバンドとグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドとの強度比は、軟骨組織に含まれるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の、コラーゲンに対する相対量を反映する。
　したがって、算出された強度比に基づいて、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）量の変化を特徴とする軟骨組織の病変を評価することができる。また、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は硝子軟骨において多く含まれ、線維軟骨においてはほとんど含まれないことから、再生途上の軟骨組織において、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）量は、軟骨組織が硝子軟骨であるか、線維軟骨であるか、あるいは硝子軟骨と線維軟骨との混合であるかによって変動する。したがって、軟骨組織中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量に基づいて、再生途上にある軟骨組織の成熟状態を評価することができる。
　上記態様においては、前記２種類のラマンバンドが、コラーゲンやプロテオグリカン等の細胞外基質および軟骨細胞中のタンパク質に含まれるアミノ酸のラマンバンドと、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドであってもよい。
　タンパク質のアミノ酸のラマンバンドとグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドとの強度比は、軟骨組織の全タンパク質の量に対するグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の相対量を反映する。したがって、算出された強度比に基づいて、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量の変化を特徴とする軟骨組織の病変を評価することができる。また、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）量に基づいて、再生途上にある軟骨の成熟状態を評価することができる。
　上記態様においては、前記２種類のラマンバンドが、コラーゲンやプロテオグリカン等の細胞外基質および軟骨細胞中のタンパク質に含まれるアミノ酸のラマンバンドと、コラーゲンのラマンバンドであってもよい。
　タンパク質のアミノ酸のラマンバンドとコラーゲンのラマンバンドとの強度比は、軟骨組織において、全タンパク質の量に対するコラーゲンの相対量を反映する。したがって、算出された強度比に基づいて、コラーゲン量の変化を伴う軟骨組織の病変を評価することができる。また、再生過程にある軟骨組織のコラーゲンのうち、ＩＩ型コラーゲン量は、軟骨組織が正常な硝子軟骨であるか、再生軟骨としては不良な線維軟骨であるか、または再生途中の軟骨であるかによって変動する。したがって、コラーゲン量に基づいて、再生途上にある軟骨の成熟状態を評価することができる。
　上記態様においては、前記２種類のラマンバンドが、コラーゲンやプロテオグリカン等の細胞外基質および軟骨細胞中のタンパク質、あるいは脂質に含まれるメチレン基のラマンバンドとメチル基のラマンバンドであってもよい。
　メチレン基のラマンバンドとメチル基のラマンバンドとの強度比は、軟骨組織に含まれる細胞の相対量と相関する。したがって、算出された強度比に基づいて、再生途上にある軟骨の成熟状態を評価することができる。
　上記態様においては、前記２種類のラマンバンドが、コラーゲンのアミドＩＩＩバンドであってもよい。
　コラーゲンのアミドＩＩＩバンドは、１２３０～１２８０ｃｍ－１のラマンシフト範囲において、１２４０ｃｍ－１近傍の低波数および１２６０ｃｍ－１近傍の高波数に２つのピークを有するラマンバンドとして観測される。このアミドＩＩＩバンドの低波数側のラマンバンドと高波数側のラマンバンドの２つのラマンバンドの強度比は、軟骨組織中のコラーゲンの二次構造に特徴づけられる分子構造の変化を反映することが知られている。変形性関節症などの軟骨組織病変は、軟骨組織中のＩＩ型コラーゲンの変性、すなわち分子構造変化を特徴とすることが知られている。したがって、算出されたアミドＩＩＩラマンバンドの強度比に基づいて、変形性関節症のようなコラーゲン変性を特徴とする軟骨組織の病変を評価することができる。
　上記態様においては、前記評価部が、前記選択されたラマンスペクトルを主成分分析（ＰＣＡ）、主成分回帰分析（ＰＣＲ）、または部分最小二乗分析（ＰＬＳ）等の多変量解析することによって、前記軟骨組織に含まれるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、コラーゲンまたは細胞の量と相関するラマンスペクトルの特徴量を算出するか、あるいはそれら成分量を推定し、得られたラマンスペクトルの特徴量、あるいは前記グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、コラーゲンまたは細胞の成分量に基づいて前記軟骨組織の状態を評価してもよい。
　このようにすることで、再生軟骨の成長の度合いや、変形性関節症等のグリコサミノグリカン量の変化、もしくはコラーゲン変性を主とした組織変性を特徴とする軟骨組織の病変を評価することができる。
　上記態様においては、前記評価部が、前記第１のラマンスペクトルおよび前記第２のラマンスペクトルの各々から、前記軟骨組織に由来するラマンバンドと前記骨組織に由来するラマンバンドとの強度比を演算し、算出された２つの強度比、および、前記軟骨組織と前記骨組織のラマンバンドの強度比と前記軟骨組織の厚みとを相関づける予め準備された検量線または統計的推定法に基づいて前記軟骨組織の厚みを推定してもよい。
　このようにすることで、算出された軟骨組織のラマンバンドと骨組織のラマンバンドの２つのラマンバンドの強度比に基づいて、軟骨組織の厚みを評価することができる。
　本発明によれば、軟骨組織と骨組織からなる関節骨のラマンスペクトルから軟骨組織由来のラマンスペクトルと骨組織由来のラマンスペクトルを分離して軟骨組織由来のラマンスペクトルを選択的に取得し、該軟骨組織由来のラマンスペクトルを解析することにより、関節骨表層に存在する軟骨組織の状態を精度良く評価することができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る軟骨組織の分析装置の全体構成図である。 図１の光学プローブの先端部の横断面図である。 図２の光学プローブのＩ－Ｉ線における縦断面図である。 図２の光学プローブのＩＩ－ＩＩ線における縦断面図である。 照明ファイバから射出されるレーザ光の照明領域と、第１の集光ファイバによって散乱光が集められる第１の集光領域との位置関係を説明する図である。 照明ファイバから射出されるレーザ光の照明領域と、第２の集光ファイバによって散乱光が集められる第２の集光領域との位置関係を説明する図である。 図１の光学プローブの基端部の横断面図である。 図１の光検出器の受光面上に結像される第１のラマンスペクトルおよび第２のラマンスペクトルを模式的に示す図である。 軟骨組織が厚い関節骨から得られた第１のラマンスペクトルおよび第２のラマンスペクトルの一例である。 軟骨組織が薄い関節骨から得られた第１のラマンスペクトルおよび第２のラマンスペクトルの一例である。 観察範囲に対して軟骨組織の組織厚みが十分に厚い場合における、軟骨組織と観察範囲との位置関係を説明する図である。 観察範囲に対して軟骨組織が十分に厚い関節骨から得られた第１のラマンスペクトルと第２のラマンスペクトルの一例である。 観察範囲に対して軟骨組織の組織厚みが十分に薄い場合における、軟骨組織と観察範囲との位置関係を説明する図である。 観察範囲に対して軟骨組織の組織厚みが十分に薄い関節骨から得られた第１のラマンスペクトルおよび第２のラマンスペクトルの一例である。 観察範囲に対する軟骨組織の組織厚みが、図１１Ａおよび図１２Ａの場合の中間的な場合における、軟骨組織と観察範囲との位置関係を説明する図である。 観察範囲に対する軟骨組織の組織厚みが図１３Ａの場合において、関節骨から得られた第１のラマンスペクトルおよび第２のラマンスペクトルの一例である。 正常軟骨組織のラマンスペクトル（実線）と、硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）が欠損した病変軟骨組織のラマンスペクトル（破線）を示す図である。 硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（１０６３ｃｍ－１）およびコラーゲンのラマンバンドの強度比と、軟骨組織中の硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量との相関関係を示すグラフである。 硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（１３８０ｃｍ－１）およびコラーゲンのラマンバンドの強度比と、軟骨組織中の硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量との相関関係を示すグラフである。 図１の軟骨組織の分析装置の動作を説明するフローチャートである。 図２の光学プローブの先端部の変形例の横断面図である。 図１７Ａの光学プローブの縦断面図である。 図１７Ａの光学プローブの他の例の縦断面図である。 軟骨組織のラマンスペクトル群を示す図である。 軟骨組織のラマンスペクトル群における、メチル基およびメチレン基のラマンバンドの強度比と、軟骨組織中のＤＮＡ量との相関関係を示すグラフである。 軟骨組織のラマンスペクトル群を示す図である。 図２０Ａのラマンスペクトル群を主成分分析して得られた第１主成分のローディングスペクトルを示す図である。 第１主成分スコアと軟骨組織中の硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量との相関関係を示すグラフである。 軟骨組織のラマンスペクトル群を示す図である。 図２２Ａの軟骨組織のラマンスペクトル群を主成分分析して得られた第１主成分のローディングスペクトルを示す図である。 第１主成分スコアと軟骨組織中のＤＮＡ量との相関関係を示すグラフである。 様々な軟骨組織の厚さと、第１および第２のラマンスペクトルにおける、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）とコラーゲン（Ｃｏｌ）のラマンバンドの強度比ＨＡＰ／Ｃｏｌとの関係を示すグラフである。 軟骨組織Ｂの厚みを推定するための教師データの作成方法を説明する図であり、図２４のグラフのＹ切片Ｙおよび傾きＡと、軟骨組織の厚みとを軸とする３次元座標系を示す図である。
　以下に、本発明の一実施形態に係る軟骨組織の分析装置１００について図面を参照して説明する。
　本実施形態に係る軟骨組織の分析装置１００は、図１に示されるように、レーザ光源１と、該レーザ光源１からのレーザ光を関節骨（生体組織）Ａに照射するとともに関節骨Ａからのラマン散乱光を受光する光学プローブ２と、該光学プローブ２によって受光されたラマン散乱光を分光する分光器（検出部）３と、光学プローブ２と分光器３との間に配置された結合光学系４と、分光器３によって分光された光を検出してラマンスペクトルを取得する光検出器（検出部）５とを備えている。
　レーザ光源１は、７８５ｎｍの波長を有する近赤外のレーザ光を出力する半導体レーザである。レーザ光源１の波長は、７８５ｎｍ以外の波長であってもよい。
　光学プローブ２は、レーザ光源１からのレーザ光を導光する照明ファイバ６と、ラマン散乱光を受光および導光する第１の集光ファイバ７１および第２の集光ファイバ７２とを備えている。照明ファイバ６および集光ファイバ７１，７２は先端側において１本に束ねられ、光学プローブ２の先端部のプローブヘッド２ａ内に照明ファイバ６の先端部および集光ファイバ７１，７２の先端部が収容されている。照明ファイバ６と集光ファイバ７１，７２は、長手方向の途中位置において互いに分岐し、照明ファイバ６の基端はレーザ光源１に接続され、集光ファイバ７１，７２の基端は結合光学系４を介して分光器３と光学的に結合されている。
　レーザ光源１から照明ファイバ６に入射したレーザ光は、照明ファイバ６を導光し、プローブヘッド２ａから関節骨Ａに向けて射出されるようになっている。また、レーザ光の照射によって関節骨Ａにおいて励起されたラマン散乱光は、集光ファイバ７１，７２によって集められ、該集光ファイバ７１，７２および結合光学系４を導光し、分光器３に入射するようになっている。
　結合光学系４は、集光ファイバ７１，７２の基端から発散光束として射出される光を平行光束に変換するレンズ４ａと、該レンズ４ａによって形成された平行光束を分光器３の入口スリットの位置に結像させるレンズ４ｂとの組み合わせからなるコリメート光学系である。レンズ４ａ，４ｂの間には、レーザ光Ｌの反射光を遮断し、レーザ光の波長よりも波長の長いラマン散乱光を透過させる光学フィルタ４ｃが設けられている。
　分光器３は、結合光学系４を介して集光ファイバ７１，７２から入射した光を波長毎に空間的に分離し、得られたスペクトルを光検出器５の受光面上に再結像する。
　光検出器５は、例えば、ＣＣＤ素子のような光電変換素子が２次元的に配列する撮像素子を備えるカメラであり、分光器３に取り付けられている。光検出器５は、分光器３から受光面に入射した光を光電変換素子によって電気信号へ変換してラマンスペクトルのデータを取得する。
　次に、光学プローブ２の詳細な構成について説明する。
　光学プローブ２は、図２から図４に示されるように、１本の照明ファイバ６と、複数本の第１の集光ファイバ７１と、複数本の第２の集光ファイバ７２とを備えている。図２は、プローブヘッド２ａの横断面（光学プローブ２の長手方向に垂直な断面）を示し、図３および図４は、図２のＩ－Ｉ線およびＩＩ－ＩＩ線におけるプローブヘッド２ａの縦断面（光学プローブ２の長手方向の断面）をそれぞれ示している。
　照明ファイバ６および集光ファイバ７１，７２は、例えば、１０５μｍまたは２００μｍのコア径と１２５μｍｍまたは２４０μｍのクラッド径とを有し、水酸基の含有量が少ないシリカ製の光ファイバである。照明ファイバ６の開口数ＮＡは０．２２以上であることが好ましく、集光ファイバ７１，７２の開口数ＮＡは０．２２以下であることが好ましい。
　図２に示されるように、プローブヘッド２ａにおいて、照明ファイバ６および集光ファイバ７１，７２は、プローブヘッド２ａの長手方向に沿って互いに平行に配列している。第１の集光ファイバ７１および第２の集光ファイバ７２は、照明ファイバ６を中心とする同心円状に配列され、第１の集光ファイバが径方向内側に、第２の集光ファイバ７２が径方向外側に配置されている。したがって、照明ファイバ６の先端面（射出面）から各第１の集光ファイバ７１の先端面（受光面）までの径方向の距離は、照明ファイバ６の先端面から各第２の集光ファイバ７２の先端面（受光面）までの径方向の距離よりも短くなっている。
　図３および図４に示されるように、照明ファイバ６の先端面は、プローブヘッド２ａの長手方向に対して垂直である。したがって、照明ファイバ６の先端面から所定の開口数で射出されたレーザ光は、図５および図６に示されるように、プローブヘッド２ａの先端前方の円錐状の照明領域Ｄに照射され、照明領域Ｄにおいてラマン散乱光が発生する。
　一方、集光ファイバ７１，７２の先端面は、図３および図４に示されるように、照明ファイバ６および集光ファイバ７１，７２に対して平行であるプローブヘッド２ａの長軸について、この長軸に垂直な面に対して所定角δだけ傾斜しており、斜め外方を向いている。これにより、集光ファイバ７１，７２は、図５および図６に示されるように、照明ファイバ６側から各々の長手軸に対して斜め方向に入射する光を集めるので、集光ファイバ７１，７２の先端面をプローブヘッド２ａの長軸に垂直に形成した場合と比べて、集光ファイバ７１，７２によって光が集められる集光領域Ｅ１，Ｅ２と照明領域Ｄとが重なり合う範囲（観察範囲）Ｆ１，Ｆ２の体積が増大する。集光ファイバ７１，７２によるラマン散乱光の受光量は、観察範囲Ｆ１，Ｆ２の体積が大きい程、増大するので、集光ファイバ７１，７２の先端面を傾斜させることによって、関節骨Ａの表層付近において発生したラマン散乱光を効果的に集光し、信号対雑音比の高い関節骨Ａのラマンスペクトルを取得することができる。
　所定角δは集光ファイバ７１，７２の開口数ＮＡの大きさに依存して決められる角度であって、集光ファイバ７１，７２の開口数ＮＡが小さい程、所定角δを大きく設定することが可能であり、関節骨Ａにおいて、より表層部から発せられるラマン散乱光を集めることができる。例えば、照明ファイバ６のコア径が２００μｍかつ開口数ＮＡが０．２２であり、集光ファイバ７１，７２のコア径が２００μｍかつ開口数ＮＡが０．１５であるとき、所定角δを３０度以上３７度以下に含まれる所定の角度に設定することにより、関節骨Ａのうち、表面からの厚みが１乃至２ｍｍ程度の軟骨組織Ｂに由来するラマンスペクトルを選択的に観測することができる。また、照明ファイバ６および集光ファイバ７１，７２のコア径を更に小さくすることによって、より薄い軟骨組織に由来するラマンスペクトルを選択的に観測することもできる。
　また、プローブヘッド２ａの先端面において、照明ファイバ６の断面（先端面）と接するように合成石英またはサファイア製の窓材が配置されていて、該窓材を含む平面とδの角を成す集光ファイバ７１，７２の先端面と、該窓材との間に空隙が設けられるようにしても良い。関節骨を測定するにおいて、灌流液によって集光ファイバ７１，７２が水浸される場合には、集光ファイバ７１，７２の構成材の屈折率と水の屈折率との屈折率差が該構成材と空気との屈折率差よりも小さくなるために、集光領域Ｅ１およびＥ２と照明領域Ｄとの重なりが小さくなり、関節骨Ａの表層付近の観察に不利である。そこで、上記のように空隙を設けることで集光領域Ｅ１およびＥ２と照明領域Ｄとの重なりを大きく保ち、水浸環境でも関節骨Ａの表層付近にある軟骨組織Ｂを選択的に観測できる効果がある。
　ここで、第１の集光ファイバ７１は、第２の集光ファイバ７２よりも照明ファイバ６の近くに位置しているため、第１の集光領域Ｅ１と照明領域Ｄとが重なり合う第１の観察範囲Ｆ１は、第２の集光領域Ｅ２と照明領域Ｄとが重なり合う第２の観察範囲Ｆ２よりも、プローブヘッド２ａの先端部に近くなる。したがって、第１の集光ファイバ７１は、関節骨Ａの相対的に浅い位置からのラマン散乱光を集め、第２の集光ファイバ７２は、関節骨Ａの相対的に深い位置からのラマン散乱光を集める。すなわち、第１の集光ファイバ７１によって集められるラマン散乱光には、第２の集光ファイバ７２によって集められるラマン散乱光に比べて、関節骨Ａの表層部を覆う軟骨組織Ｂのラマン散乱光がより多く含まれる。
　図７は、光学プローブ２の基端部の横断面図である。図７に示されるように、光学プローブ２の基端部において、第１の集光ファイバ７１および第２の集光ファイバ７２は、一側に第１の集光ファイバ７１が集まり、他側に第２の集光ファイバ７２が集まるように、一列に配列されている。したがって、図８に示されるように、第１の集光ファイバ７１から射出されるラマン散乱光は、受光面２５上の第１の受光領域Ｇ１に再結像し、第２の集光ファイバ７２から射出されるラマン散乱光は、受光面２５上の第１の受光領域Ｇ１とは異なる第２の受光領域Ｇ２に再結像する。これにより、第１の観察範囲Ｆ１の第１のラマンスペクトルと、第２の観察範囲Ｆ２の第２のラマンスペクトルとが、分離して取得されるようになっている。
　図９は、軟骨組織Ｂが十分に厚い関節骨Ａから得られた第１のラマンスペクトルおよび第２のラマンスペクトルの一部を示し、図１０は、軟骨組織Ｂが薄い関節骨Ａから得られた第１のラマンスペクトルおよび第２のラマンスペクトルの一部を示している。
　軟骨組織Ｂに含まれる主な成分は、水、コラーゲン（ＩＩ型コラーゲン）、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）とタンパク質との複合体であるプロテオグリカン、および、軟骨細胞である。骨組織Ｃに含まれる主な成分は、コラーゲン（Ｉ型コラーゲン）、リン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイト）、および炭酸カルシウムである。図９および図１０のラマンスペクトルにおいて、９２１ｃｍ－１近傍にピークを有するラマンバンドは、軟骨組織中のＩＩ型コラーゲンに含まれるアミノ酸であるプロリン由来であり、９５８ｃｍ－１近傍にピークを有するラマンバンドは、軟骨組織中のＩＩ型コラーゲンのラマンバンドと骨組織中のリン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイト）のリン酸基のラマンバンドとが重畳されたバンドである。
　図９および図１０に示される９２１ｃｍ－１および９５８ｃｍ－１における２つのラマンバンドの強度に着目すると、図９の第１のラマンスペクトルおよび第２のラマンスペクトルにおける９２１ｃｍ－１のラマンバンドと９５８ｃｍ－１のラマンバンドの強度比はほとんど変化しない一方、図１０の第１のラマンスペクトルと第２のラマンスペクトルにおいては、第２のラマンスペクトルにおける９５８ｃｍ－１のラマンバンド強度は９２１ｃｍ－１のラマンバンド強度より大きくなっている。これは、図９の第２のラマンスペクトルに対し、図１０の第２のラマンスペクトルには、骨組織の成分であるヒドロキシアパタイトに由来するラマンスペクトルの寄与がより多く含まれることを意味している。このように、図９の第１および第２のラマンスペクトルに含まれる信号のほとんどは、軟骨組織Ｂからの信号であるのに対し、図１０の第１のラマンスペクトルおよび第２のラマンスペクトルには、軟骨組織Ｂの成分由来の信号と骨組織Ｃの成分由来の信号の両方が含まれることが分かる。
　また、軟骨組織の分析装置１００は、図１に示されるように、制御部８、記憶部９、演算部（強度比演算部、評価部）１０および表示部１１をさらに備えている。
　制御部８は、レーザ光源１から出射されるレーザ光の出力強度および出力タイミングを制御することによって、レーザ光の照射強度および照射タイミングを制御する。また、制御部８は、分光器３の中心波長、光検出器５による光の検出条件（例えば、露光時間およびゲイン）を制御する。
　記憶部９は、光検出器５によって取得された第１および第２のラマンスペクトルのデータと、演算部１０による演算結果（後述）とを記憶する。
　表示部１１は、記憶部９に記憶されているラマンスペクトルおよび演算部１０による演算結果を表示する。
　演算部１０は、記憶部９から第１および第２のラマンスペクトルのデータを読み出し、第１および第２のラマンスペクトルを解析して関節骨Ａに含まれる軟骨組織Ｂの状態を評価するための以下の第１および第２の処理を実行する。
　第１の処理において、演算部１０は、第１および第２のラマンスペクトルのうち、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルであるものを選択する。具体的には、演算部１０は、下式に定義されるように、第１のラマンスペクトルにおける軟骨組織Ｂ由来のラマンバンドおよび骨組織Ｃ由来のラマンバンドの強度比（第１のバンド強度比）を算出する。
　バンド強度比＝軟骨組織由来のラマンバンドの強度÷骨組織由来のラマンバンドの強度
　同様にして、演算部１０は、第２のラマンスペクトルにおける軟骨組織Ｂ由来のラマンバンドおよび骨組織Ｃ由来のラマンバンドの強度比（第２のバンド強度比）を算出する。
　軟骨組織Ｂ由来のラマンバンドは、例えば、ＩＩ型コラーゲンのラマンバンドであって、アミノ酸（プロリン）の９２１ｃｍ－１のラマンバンド、コラーゲンのポリペプチド骨格の８１５ｃｍ－１のラマンバンドを用いることができる。骨組織Ｃ由来のラマンバンドは、例えば、９５８ｃｍ－１におけるヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）に含まれるリン酸イオンのラマンバンドである。各ラマンバンド強度は、バンドのピーク値および面積強度のいずれであってもよい。
　続いて、演算部１０は、第１のバンド強度比および第２のバンド強度比をそれぞれ所定の閾値と比較し、バンド強度比が所定の閾値よりも大きいラマンスペクトルを軟骨組織Ｂのラマンスペクトルとして選択する。
　ここで、軟骨組織Ｂの厚みとラマンバンド強度比との関係および所定の閾値について説明する。
　図１１Ａに示すのは、観察範囲Ｆ１および観察範囲Ｆ２を含む程度に軟骨組織Ｂが十分厚い場合における、観察範囲Ｆ１および観察範囲Ｆ２と関節骨Ａとの関係を図示するものである。この場合において、集光ファイバ７１で取得される第１のラマンスペクトルおよび集光ファイバ７２で取得される第２のラマンスペクトルは、図１１Ｂに示されるように、ほぼ軟骨組織Ｂのラマンスペクトルに因るものである。このときの９２１ｃｍ－１にピークを有するコラーゲンのラマンバンド強度と、９５８ｃｍ－１にピークを有するヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）のラマンバンド強度は略等しくなる。
　図１２Ａに示すのは、観察範囲Ｆ１および観察範囲Ｆ２をほとんど含まない程度に軟骨組織Ｂが十分薄いか、軟骨組織Ｂが存在しない場合における、観察範囲Ｆ１および観察範囲Ｆ２と関節骨Ａとの関係を図示するものである。この場合において、集光ファイバ７１で取得される第１のラマンスペクトルおよび集光ファイバ７２で取得される第２のラマンスペクトルは、図１２Ｂに示されるように、ほぼ骨組織Ｃのラマンスペクトルに因るものである。このときの９５８ｃｍ－１にピークを有するヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）のラマンバンド強度は、９２１ｃｍ－１にピークを有するコラーゲンのラマンバンド強度の１０倍以上となる。
　図１３Ａに示すのは、軟骨組織Ｂの厚みが図１１Ａの場合と図１２Ａの場合の中間的な場合を図示するものである。この場合、図１３Ｂに示されるように、集光ファイバ７１で取得される第１のラマンスペクトルおよび集光ファイバ７２で取得される第２のラマンスペクトルにおいて、９２１ｃｍ－１にピークを有するコラーゲンのラマンバンド強度と、９５８ｃｍ－１にピークを有するヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）のラマンバンドの強度の強度比は、観察範囲Ｆ１および観察範囲Ｆ２に含まれる軟骨組織Ｂと骨組織Ｃの割合によって変化する。
　このように、９２１ｃｍ－１にピークを有するコラーゲンのラマンバンドと９５８cm－１にピークを有するヒドロキシアパタイトのラマンバンドのバンド強度比は、関節骨Ａにおける軟骨組織Ｂの厚みに応じて異なり、第１および第２のラマンスペクトルにおける軟骨組織Ｂのラマンスペクトルの寄与の割合に依存して変化する。したがって、バンド強度比に基づいて、骨組織Ｃのラマンスペクトルの寄与が小さく軟骨組織Ｂのラマンスペクトルの寄与が大きいものを、第１および第２のラマンスペクトルの中から選択することができる。
　軟骨組織Ｂのラマンスペクトルの選択の基準となる所定の閾値は実験的に決定される。
　例えば、観察範囲Ｆ１に対して軟骨組織が十分に厚いブタ関節骨（サンプル数ｎ＝２０）のラマンスペクトルを測定して、９２１ｃｍ－１と９５８ｃｍ－１のラマンバンドのバンド強度比を計算した結果、バンド強度比は、０．８０以上１．２５以下であった。したがって、所定の閾値を当該範囲の最小値以上の値に設定することによって、関節骨Ａのラマンスペクトルから、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを選択的に観測することができる。
　例えば、所定の閾値は、０．８に設定される。図９に示される第１および第２のラマンスペクトルの場合、バンド強度比はそれぞれ１．１５および１．０である。したがって、第１および第２のラマンスペクトルの両方が、軟骨組織のラマンスペクトルとして選択される。このような場合には、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルとして、第１のラマンスペクトルのみを、この後の第２の処理に用いても良いし、第１のラマンスペクトルと第２のラマンスペクトルとの和を、この後の第２の処理に用いてもよい。図１０に示される第１および第２のラマンスペクトルの場合、バンド強度比はそれぞれ０．９５および０．５６である。したがって、第１のラマンスペクトルのみが、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルとして選択される。
　次に、第２の処理において、演算部１０は、選択された軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを解析して軟骨組織Ｂに含まれるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量を算出し、算出されたグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量に基づいて軟骨組織Ｂの状態を評価する。具体的には、演算部１０は、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルからコラーゲンのラマンバンドの強度およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドの強度を算出する。コラーゲンのラマンバンドとしては、例えば、９２１ｃｍ－１におけるプロリン残基のラマンバンド、または、８１５ｃｍ－１におけるコラーゲンのラマンバンドが選択される。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドとして、例えば、１０６３ｃｍ－１における硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の硫酸基のラマンバンド、または、１３８０ｃｍ－１のラマンバンドが選択される。各ラマンバンド強度は、バンドのピーク値および面積強度のいずれであってもよい。
　図１４は、図１に示す分析装置１００において関節骨Ａのラマンスペクトルを取得した後に、第１の処理において選択された軟骨組織Ｂのラマンスペクトルの一例を示している。図１４において、実線は、正常な関節骨Ａにおける軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを示し、破線は、正常な関節骨Ａをプロテオグリカン分解酵素（トリプシン）に浸漬してグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を一部欠失させた病変モデルの関節骨Ａにおける軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを示している。２つのラマンスペクトルを比較すると、９２１ｃｍ－１のコラーゲンのラマンバンドの強度は変化していないのに対し、１０６３ｃｍ－１近傍および１３８０ｃｍ－１近傍の硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドの強度には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を欠損させた軟骨組織のラマンスペクトルにおいて減少が見られる。
　続いて、演算部１０は、硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドとコラーゲンのラマンバンドの強度比（ＧＡＧのラマンバンドの強度÷コラーゲンのラマンバンドの強度）ＧＡＧ／Ｃｏｌを算出する。硫酸化グリコサミノグリカンのラマンバンドとしては、１０６３ｃｍ－１近傍または１３８０ｃｍ－１近傍に強度ピークを有するラマンバンドを用い、コラーゲンのラマンバンドとしては９２１ｃｍ－１近傍または９４０ｃｍ－１近傍に強度ピークを有するラマンバンドを用いることができる。
　図１５Ａおよび図１５Ｂは、ラマンバンドの強度比ＧＡＧ／Ｃｏｌと、生化学分析によって得られた軟骨組織中における、単位湿重量当たりの硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の重量との相関関係を示している。硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドとして１０６３ｃｍ－１近傍および１３８０ｃｍ－１近傍のいずれのラマンバンドを用いた場合にも、強度比ＧＡＧ／Ｃｏｌは、軟骨組織中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量に対して相関係数０．９以上の高い相関を示した。再生途中にあって硝子軟骨として成熟していない再生軟骨や、線維性軟骨や、変形性関節症の軟骨組織においては、正常な軟骨組織に比べてコンドロイチン硫酸等のＧＡＧの量が減少することが知られている。演算部１０は、ラマンバンドの強度比ＧＡＧ／Ｃｏｌに基づいて、軟骨組織Ｂ中のＧＡＧの量を推定し、再生軟骨や変形性関節症等の軟骨組織Ｂの状態を評価する。
　演算部１０によって得られたＧＡＧの量、評価結果等の解析結果は、記憶部９に記憶されるとともに、表示部１１に表示される。
　次に、このように構成された軟骨組織の分析装置１００の作用について説明する。
　図１６に示されるように、レーザ光源１から出力されたレーザ光は、光学プローブ２の照明ファイバ６によって導光され、プローブヘッド２ａから関節骨Ａへ照射される（ステップＳ１）。関節骨Ａの照明領域Ｄにおいては、レーザ光の照射によって関節骨Ａの成分由来のラマン散乱光が発生し、ラマン散乱光（非弾性散乱光）とレーザ光の散乱光（弾性散乱光）が関節骨Ａから拡散反射される。関節骨Ａから拡散反射された散乱光のうち、第１の観察範囲Ｆ１からの散乱光は第１の集光ファイバ７１によって受光され、第２の観察範囲Ｆ２からの散乱光は第２の集光ファイバ７２によって受光される（ステップＳ２）。
　第１の集光ファイバ７１および第２の集光ファイバ７２によって受光された散乱光はそれぞれ、結合光学系４を介して分光器３に導光され、分光器３によって波長毎に空間的に分離され、光検出器５によって検出される。これにより、第１の観察範囲Ｆ１の第１のラマンスペクトルと第２の観察範囲Ｆ２の第２のラマンスペクトルが取得される（ステップＳ３）。取得されたラマンスペクトルは、記憶部９に記憶されるとともに演算部１０に送信される。
　次に、演算部１０において、第１のラマンスペクトル内の軟骨組織Ｂのラマンバンドおよび骨組織Ｃのラマンバンドの強度から、第１のバンド強度比が算出される（ステップＳ４）。同様に、第２のラマンスペクトル内の軟骨組織Ｂのラマンバンドおよび骨組織Ｃのラマンバンドの強度から、第２のバンド強度比が算出される（ステップＳ５）。次に、第１および第２のラマンスペクトルの中から、所定の閾値よりも大きなバンド強度比を与えるラマンスペクトルが軟骨組織Ｂのラマンスペクトルとして選択される（ステップＳ６，Ｓ７）。
　次に、演算部１０において、選択された軟骨組織Ｂのラマンスペクトル内のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびコラーゲンのラマンバンドの強度比ＧＡＧ／Ｃｏｌが算出され（ステップＳ８）、算出された強度比ＧＡＧ／Ｃｏｌに基づいて軟骨組織Ｂの状態が評価される（ステップＳ９）。評価結果は、表示部１１に表示される。表示部１１に表示される軟骨組織Ｂの評価結果は、例えば、軟骨組織Ｂ中におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の推定量である。あるいは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ)の推定量と相関するように段階付けされている、軟骨組織Ｂの状態を示す分類指標であってもよい。
　このように、本実施形態によれば、照明ファイバ６の先端面から互いに異なる距離に先端面が配置された第１の集光ファイバ７１および第２の集光ファイバ７２によって、関節骨Ａの異なる深さの観察範囲Ｆ１，Ｆ２の２つのラマンスペクトルが取得される。そして、各ラマンスペクトルから算出された軟骨組織Ｂ由来のラマンバンドと骨組織Ｃ由来のラマンバンドとのラマンバンド強度比に基づいて、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを選択することにより、骨組織Ｃ由来の信号の影響を極力排除した上で、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを評価に用いることができる。これにより、関節骨Ａの表層に存在する軟骨組織Ｂにおいて再生途上にある再生軟骨の状態や、関節骨Ａ表層に存在する軟骨組織Ｂのみに異常を伴う早期の変形性関節症等における軟骨組織Ｂの状態を、精度良く評価することができるという利点がある。
　本実施形態においては、複数の第１の集光ファイバ７１と複数の第２の集光ファイバ７２が同心円状に配列されていることとしたが、第１の集光ファイバ７１および第２の集光ファイバ７２の数および配列はこれに限定されるものではない。
　例えば、図１７Ａから図１７Ｃに示されるように、第１の集光ファイバ７１および第２の集光ファイバ７２が、それぞれ１本のみ設けられ、照明ファイバ６、第１の集光ファイバ７１および第２の集光ファイバ７２が径方向に一列に配列されていてもよい。この場合も、照明ファイバ６の先端面から第１の集光ファイバ７１の先端面までの距離と、照明ファイバ６の先端面から第２の集光ファイバの先端面までの距離とが互いに異なるように、光ファイバ６，７１，７２は配列される。
　図１７Ｃに示されるように、集光ファイバ７１，７２の先端面はプローブヘッド２ａの長軸方向に垂直な平面に対して所定角δ２だけ傾斜している。あるいは、図１７Ｂに示されるように、集光ファイバ７１，７２の先端面がプローブヘッド２ａの長軸方向に垂直な平面に対して所定角δ２だけ傾斜しているのみならず、照明ファイバ６の先端面も、プローブヘッド２ａの長軸方向に垂直な平面に対して所定角δ１だけ傾斜していてもよい。このようにすることで、照明ファイバ６が形成する照明領域Ｄと、集光ファイバ７１，７２が形成する集光領域Ｅ１およびＥ２が重なりあう範囲として形成される観察範囲Ｆ１とＦ２が、プローブヘッド２ａ先端により近い位置に形成されるため、関節骨Ａ表層に存在する軟骨組織Ｂを観察するにおいて、図１７Ｃに示される構造よりもさらに効果的である。
　本実施形態においては、第１および第２のバンド強度比の算出にコラーゲンとＨＡＰのラマンバンドを用いることとしたが、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は軟骨組織Ｂのみに含まれ、骨組織Ｃには含まれないため、軟骨組織Ｂ由来のラマンバンドとして、コラーゲンに代えてグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドを用いてもよい。
　グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）とヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）のラマンバンドの強度比も、第１および第２のラマンスペクトルにおける軟骨組織Ｂのラマンスペクトルの寄与の割合を反映したものとなる。したがって、当該強度比に基づいて、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを選択することができる。
　本実施形態においては、軟骨組織Ｂの状態を評価するために、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）とコラーゲンのラマンバンドの強度比ＧＡＧ／Ｃｏｌを算出することとしたが、これに代えて、またはこれに加えて、軟骨組織Ｂに含まれる他の２種類のラマンバンドの強度比を算出してもよい。
　２種類のラマンバンドの第１の例として、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）とタンパク質のラマンバンドが用いられる。タンパク質のラマンバンドとしては、例えば、図１４に示されるように、１００３ｃｍ－１近傍にピークを有するタンパク質のフェニルアラニン残基のラマンバンドが選択される。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドは、例えば図１４に示される、１０６３ｃｍ－１近傍もしくは１３８０ｃｍ－１近傍にピークを有する硫酸化グリコサミノグリカンのラマンバンドを選択することができる。そして、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドとタンパク質のラマンバンドの強度比（ＧＡＧのラマンバンドの強度÷タンパク質のラマンバンドの強度）ＧＡＧ／Ｐｒｏｔｅｉｎが算出される。
　再生途中にあって硝子軟骨として成熟していない再生軟骨や、線維性軟骨や、変形性関節症の軟骨組織においては、軟骨組織Ｂの全タンパク質の量に対してグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量が低下する。したがって、軟骨組織Ｂ中の全タンパク質とグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の相対量に比例する強度比ＧＡＧ／Ｐｒｏｔｅｉｎに基づいて、軟骨組織Ｂの状態を評価することができる。
　２種類のラマンバンドの第２の例として、コラーゲンとタンパク質のラマンバンドが用いられる。コラーゲンのラマンバンドとしては、上述した９２１ｃｍ－１および８１５ｃｍ－１のラマンバンドの他に、図１４に示されるように、１２３０ｃｍ－１～１２４０ｃｍ－１のコラーゲンのアミドＩＩＩバンド、または、１６５０ｃｍ－１近傍のコラーゲンのアミドＩバンドを選択してもよい。タンパク質のラマンバンドとしては、１００３ｃｍ－１近傍にピークを有するタンパク質のフェニルアラニン残基のラマンバンドが選択される。そして、コラーゲンのラマンバンドとタンパク質のラマンバンドの強度比（コラーゲンのラマンバンドの強度÷タンパク質のラマンバンドの強度）Ｃｏｌ／Ｐｒｏｔｅｉｎが算出される。このように取得された軟骨組織Ｂ中の全タンパク質量に対するコラーゲンの相対量に比例する強度比Ｃｏｌ／Ｐｒｏｔｅｉｎを用いることによっても、軟骨組織Ｂの状態を評価することができる。
　２種類のラマンバンドの第３の例として、軟骨組織Ｂ中のタンパク質や脂質に由来するメチル基（ＣＨ３）とメチレン基（ＣＨ２）のラマンバンドを用いることができる。図１８は、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルの内、メチル基およびメチレン基のラマンバンドが観測される２８３０ｃｍ－１から３０５０ｃｍ－１のラマンシフト範囲を示している。
　図１８に示されるように、メチル基のラマンバンドとしては、２９４０～２９５０ｃｍ－１のバンドが選択され、メチレン基のラマンバンドとしては、２８５５ｃｍ－１近傍または２８８５ｃｍ－１近傍にピークを有するラマンバンドが選択される。そして、メチレン基のラマンバンドとメチル基のラマンバンドの強度比（メチレン基のラマンバンド強度÷メチル基のラマンバンド強度）ＣＨ2／ＣＨ3が算出される。
　図１９は、メチレン基とメチル基のラマンバンドの強度比ＣＨ２／ＣＨ３と、軟骨組織中のＤＮＡ量（１ｍｇの軟骨組織における乾燥重量）との相関関係を示している。図１９に示されるように、強度比ＣＨ２／ＣＨ３は、軟骨組織中のＤＮＡ量に対して相関係数０．８以上の強い相関を有することから、メチレン基のラマンバンドは、細胞中の脂質に由来することが示唆された。
　したがって、メチレン基とメチル基のラマンバンドの強度比ＣＨ２／ＣＨ３に基づいて軟骨組織Ｂ中の細胞量を推定し、細胞量に基づいて再生途上にある軟骨または変形性関節症軟骨の状態を評価することができる。
　２種類のラマンバンドの第４の例として、１２４０ｃｍ－１近傍および１２７０ｃｍ－１近傍にピークを有する２つに分裂したアミドＩＩＩバンドが用いられる。この２つに分裂したコラーゲンのアミドＩＩＩバンドの強度比は、軟骨組織Ｂ中のコラーゲンの分子構造を反映し、コラーゲンの変性に伴って変化することが知られている。変形性関節症の軟骨においては、硝子軟骨中のＩＩ型コラーゲンの変性を示すことが知られており、２つのアミドＩＩＩバンドの強度比に基づいて変形性関節症のような軟骨組織のＩＩ型コラーゲンの変性を伴う病変の程度を評価することができる。
　本実施形態においては、演算部１０が、ステップＳ７において選択された軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを多変量解析することで、軟骨組織Ｂ中に含まれる所定の成分量を反映するラマンスペクトルの特徴量を算出するか、あるいは所定の成分そのものの定量を実行することで、軟骨組織の状態を評価してもよい。
　多変量解析の第１の例において、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルから、硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンド（１０６３ｃｍ－１）を含む任意のラマンシフト範囲を選択し、選択された範囲のラマンスペクトルを多変量解析する。多変量解析としては、例えば、主成分分析（ＰＣＡ）、主成分回帰分析（ＰＣＲ）、部分最小二乗分析（ＰＬＳ）、あるいは古典最小二乗分析（ＣＬＳ）法が用いられる。
　ここで、様々な状態にある軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを多変量解析した例として、主成分分析を実施した例について説明する。図２０Ａは、ステップＳ７において選択された様々な状態にある軟骨組織Ｂのラマンスペクトル群を示し、図２０Ｂは、図２０Ａのラマンスペクトル群を主成分分析した結果得られた第１主成分のローディングスペクトル（第１主成分波形）を示している。第１主成分のローディングスペクトルは、硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のラマンバンドのピークに相当する１０６３ｃｍ－１近傍のラマンシフト値に強い正のピークを有するため硫酸化グリコサミノグリカンに由来する信号である。図２１に示すように、この第１主成分のローディングスペクトルへ図２０Ａのラマンスペクトル群を射影した第１主成分のスコア（第１主成分スコア）の大きさと硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量との間には正の相関が存在する。
　図２１は、主成分分析により得られた第１主成分スコアと軟骨組織において単位乾燥重量中に含まれる硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量との相関関係を示している。図２１から分かるように、第１主成分スコアと硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量との間には、相関係数が０．８６の強い相関が認められた。このように、軟骨組織Ｂ中の硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量と相関するラマンスペクトル特徴量として主成分分析の第１主成分スコアを計算することで、硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量に基づいて軟骨組織Ｂの状態を評価することができる。
　主成分分析に代えて、他の多変量解析によるラマンスペクトル分析法を用いてもよい。
　例えば、軟骨組織Ｂの主成分である硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびコラーゲン（ＩＩ型コラーゲン）の単離品から、成分比の異なる多数の混合サンプルを調整した上で、各混合サンプルのラマンスペクトルを測定し、混合サンプル毎の成分比とラマンスペクトルとを対応付けたデータを作成する。そして、当該データに基づき、ＰＬＳ（部分最小二乗回帰）分析法またはＰＣＲ（主成分回帰）等の回帰分析法によって硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）やＩＩ型コラーゲンの検量線を作成し、該検量線のデータを記憶部９に記憶しておく。このようにすることで、未知の軟骨組織Ｂのラマンスペクトルを測定することで、該検量線を用いて硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）やＩＩ型コラーゲンの相対量を推定することができる。
　多変量解析の第２の例において、軟骨組織Ｂのラマンスペクトルから、メチレン基のラマンバンド（２８５５ｃｍ－１近傍および２８８５ｃｍ－１近傍）を含む任意のラマンシフト範囲を選択し、選択された範囲のラマンスペクトルを多変量解析する。多変量解析としては、例えば、主成分分析が用いられる。
　図２２Ａは、ステップＳ７において選択された軟骨組織Ｂのラマンスペクトル群を示し、図２２Ｂは、図２２Ａのラマンスペクトル群を主成分分析して得られた第１主成分のローディングスペクトル（第１主成分波形）を示している。第１主成分のローディングスペクトルは、メチレン基のラマンバンドのピークに相当する２８５５ｃｍ－１および２８８５ｃｍ－１のラマンシフト値に強い正のピークを有するために、軟骨組織Ｂに含まれる脂質の寄与を含むスペクトルであることが示唆された。図２３に示すように、この第１主成分のローディングスペクトルへ図２２Ａのラマンスペクトル群を射影した第１主成分スコアの大きさと軟骨組織Ｂ中のＤＮＡ量との間には正の相関が存在することが明らかにされ、このメチレン基のラマンバンドは、軟骨細胞Ｂ中の脂質に由来すると考えられる。
　図２３は、主成分分析により得られた第１主成分スコアと軟骨組織Ｂ中のＤＮＡ量（１ミリグラムの軟骨組織におけるＤＮＡ乾燥重量）との相関関係を示している。主成分分析の第１主成分スコアと軟骨組織Ｂ中のＤＮＡの量との間には、相関係数０．８２の強い相関が認められる。このように、軟骨組織Ｂ中の細胞の量と相関するラマンスペクトルの特徴量として主成分分析の第１主成分スコアを計算することで、細胞の量に基づいて、軟骨組織Ｂにおいて再生途上にある軟骨または変形性関節症の軟骨の状態を評価することができる。
　本実施形態においては、演算部１０が、第１および第２のラマンスペクトルに基づいて、軟骨組織Ｂの厚みをさらに推定してもよい。
　具体的には、演算部１０は、下式に定義されるように、第１および第２のラマンスペクトルの各々における軟骨組織Ｂ由来のラマンバンドおよび骨組織Ｃ由来のラマンバンドの強度比を算出する。
　強度比＝骨組織由来のラマンバンドの強度÷軟骨組織由来のラマンバンドの強度
　ここで、骨組織Ｃ由来のラマンバンドとしては、ラマンシフト値が９５８ｃｍ－１近傍にピークを有するヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）のラマンバンドを用い、軟骨組織Ｂ由来のラマンバンドとしては、ラマンシフト値が９２１ｃｍ－１近傍または８１５ｃｍ－１近傍にピークを有するＩＩ型コラーゲンのラマンバンドを用いることができる。
　図２４は、様々な厚みの軟骨組織についてラマンスペクトルを取得し、第１のラマンスペクトルから算出された強度比と第２のラマンスペクトルから算出された強度比とをプロットした図である。演算部１０はさらに、第１のラマンスペクトルの強度比と第２のラマンスペクトルの強度比を示す２つのプロットを通る直線のＹ切片の値Ｙおよび直線の傾きＡを算出する。
　ここで、図１１Ａに示すように、軟骨組織Ｂの厚みが、観察範囲Ｆ１と観察範囲Ｆ２を含む程度に十分厚い場合（図２４の丸いプロット参照。）、Ｙおよび傾きＡは共に小さくなる。また、図１２Ａに示すように、軟骨組織Ｂの厚みが、観察範囲Ｆ１と観察範囲Ｆ２をほとんど含まない程度に十分薄い場合（図２４の三角のプロット参照。）、Ｙは大きくなり、傾きＡは小さくなる。また、軟骨組織Ｂの厚みが上記の中間的な厚みである場合（図２４の四角のプロット参照。）、Ｙは小さくなり、傾きＡは大きくなる。
　このように、観察範囲Ｆ１と観察範囲Ｆ２に関する軟骨組織Ｂの相対的な厚みに応じて（Ｙ，Ａ）の値が異なる。したがって、軟骨組織Ｂの実際の厚みと（Ｙ，Ａ）の値との関係を計測したデータベースを記憶部９に記憶した上で、演算部１０が記憶部９から当該データベースを読み出し、データベースに基づいて、未知の関節骨の第１および第２のラマンスペクトルから算出された２つのラマンバンドの強度比から（Ｙ，Ａ）を求め、求められた（Ｙ，Ａ）の値から軟骨組織Ｂの厚みを推定することができる。
　軟骨組織Ｂの厚み推定は、次のようにして実施することができる。
　様々な軟骨について第１および第２のラマンスペクトルの強度比を求め、さらに図２４に示すプロットを実施することによって（Ｙ，Ａ）を求める。また同時に軟骨組織の厚みＺを計測し、図２５に示すような、Ｙ切片の値Ｙと、傾きＡと、軟骨組織の厚みＺを座標軸にとった３次元座標系における座標点（Ｙ，Ａ，Ｚ）をプロットする。例えば、組織厚みが異なる３種類の軟骨組織について、（Ｙ１，Ａ１，Ｚ１）、（Ｙ２，Ａ２，Ｚ２）、および（Ｙ３，Ａ３，Ｚ３）の３点を３次元空間にプロットすることができる。このような座標点を多数の軟骨組織について教師データとして取得した上で、任意の（Ｙ，Ａ）に対する軟骨組織厚みＺを推定できるように、空間補間計算により厚み推定面（平面または曲面）を算出しておけばよい。このような厚み推定面を算出しておけば、未知の関節骨のラマンスペクトルを測定し、第１および第２のラマンスペクトルから（Ｙ，Ａ）を計算しさえすれば、観察点における軟骨厚みを推定することが可能である。このような空間補間による推定法としては、クリギング補間などの空間統計法を使用すればよい。
　再生途上にある再生軟骨の成熟度や変形性関節症の進行度によって軟骨組織Ｂの厚みは変化し得るので、軟骨組織Ｂの厚みを推定することにより、再生軟骨や変形性関節症の軟骨組織の状態について知ることができる。上記方法で推定された軟骨組織Ｂの厚みが表示部１１に表示されるか、軟骨組織Ｂの厚みと相関するように段階付けされている、軟骨組織Ｂの状態を表す分類指標が表示部１１に表示されてもよい。
　多数の関節骨Ａから（Ｙ，Ａ）のデータ群を得て、得られたデータ群に基づいて主成分回帰法（ＰＣＲ）や部分最小二乗法（ＰＬＳ）等の回帰分析法により、軟骨組織Ｂの厚みとＹ切片および傾きＡとを相関付ける検量線を予め作成しておき、該検量線を用いて未知の関節骨のラマンスペクルデータから軟骨組織Ｂの厚みを推定してもよい。
　あるいは、ラマンスペクトルの多変量解析によって軟骨組織Ｂの厚みを推定してもよい。具体的には、軟骨組織Ｂの厚みが異なる多数の関節骨Ａサンプルについて、ラマンシフト値が９５８ｃｍ－１近傍のヒドロキシアパタイトのラマンバンドと、９２１ｃｍ－１近傍のＩＩ型コラーゲンのラマンバンドとを含む範囲において、第１および第２のラマンスペクトルを取得し、ステップＳ４，Ｓ５と同様にして第１および第２のラマンスペクトルの各々からコラーゲンのラマンバンドとヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）のラマンバンドの強度比を算出する。さらに、第１のラマンスペクトルにおけるラマンバンド強度比と第２のラマンスペクトルにおけるラマンバンド強度比との和を算出し、該ラマンバンド強度比の和と、実際の軟骨組織の厚みとを対応付けたデータを作成する。そして、当該データに基づき、ＰＬＳ分析法またはＰＣＲ分析法等の回帰分析法によって軟骨組織の厚みの検量線を作成し、検量線を記憶部９に記憶しておく。
　このようにすることで、未知の関節骨の第１および第２のラマンスペクトルから軟骨組織の厚みを推定することができる。
　上述した軟骨組織の分析装置１００の制御部８および演算部１０は、例えば、ＣＰＵ（中央演算処理装置）と、上述した制御部８および演算部１０の処理をＣＰＵに実行させるための制御プログラムおよび演算プログラムを格納するＨＤＤのような補助記憶装置と、ＣＰＵの作業領域として機能するＲＡＭまたはＲＯＭのような主記憶装置とを備えるコンピュータによって実現される。記憶部９は、例えば、主記憶装置によって実現される。
１　レーザ光源
３　分光器（検出部）
５　光検出器（検出部）
６　照明ファイバ
７１　第１の集光ファイバ
７２　第２の集光ファイバ
１０　演算部（強度比演算部、評価部）
１００　軟骨組織の分析装置
Ａ　関節骨
Ｂ　軟骨組織
Ｃ　骨組織

Claims (13)

  1. 　レーザ光を出力するレーザ光源と、
    　先端に射出面を有し、前記レーザ光源から入射されたレーザ光を前記射出面から軟骨組織を含む生体組織に向けて射出する照明ファイバと、
    　先端に受光面を各々有し、前記生体組織からの散乱光を前記受光面においてそれぞれ受光する第１の集光ファイバおよび第２の集光ファイバと、
    　前記第１の集光ファイバによって受光された前記散乱光から第１のラマンスペクトルを検出するとともに、前記第２の集光ファイバによって受光された前記散乱光から第２のラマンスペクトルを検出する検出部と、
    　該検出部によって検出された前記第１のラマンスペクトルおよび前記第２のラマンスペクトルの各々から、前記軟骨組織に由来するラマンバンドと骨組織に由来するラマンバンドとの強度比を演算する強度比演算部と、
    　該強度比演算部によって算出された前記強度比が所定の範囲内であるラマンスペクトルを前記第１のラマンスペクトルおよび前記第２のラマンスペクトルの中から選択し、選択されたラマンスペクトルを解析して前記軟骨組織の状態を評価する評価部とを備え、
    　前記第１の集光ファイバの前記受光面の前記射出面からの距離と、前記第２の集光ファイバの前記受光面の前記射出面からの距離とが、互いに異なる軟骨組織の分析装置。
  2. 　前記強度比演算部が、前記強度比の演算に、前記軟骨組織に由来するラマンバンドとしてＩＩ型コラーゲンのラマンバンド強度を用い、前記骨組織に由来するラマンバンドとしてヒドロキシアパタイトのラマンバンド強度を用いる請求項１に記載の軟骨組織の分析装置。
  3. 　前記強度比演算部が、前記強度比の演算に、前記軟骨組織に由来するラマンバンドとしてグリコサミノグリカンのラマンバンド強度を用い、前記骨組織に由来するラマンバンドとしてヒドロキシアパタイトのラマンバンド強度を用いる請求項１に記載の軟骨組織の分析装置。
  4. 　前記評価部が、前記選択されたラマンスペクトルにおける前記軟骨組織に由来する、ラマンシフトが互いに異なる２種類のラマンバンドの強度比を算出し、算出された強度比に基づいて前記軟骨組織の状態を評価する請求項１から請求項３のいずれかに記載の軟骨組織の分析装置。
  5. 　前記２種類のラマンバンドが、コラーゲンのラマンバンドとグリコサミノグリカンのラマンバンドである請求項４に記載の軟骨組織の分析装置。
  6. 　前記２種類のラマンバンドが、タンパク質に含まれるアミノ酸のラマンバンドとグリコサミノグリカンのラマンバンドである請求項４に記載の軟骨組織の分析装置。
  7. 　前記２種類のラマンバンドが、タンパク質に含まれるアミノ酸のラマンバンドとコラーゲンのラマンバンドである請求項４に記載の軟骨組織の分析装置。
  8. 　前記２種類のラマンバンドが、メチレン基のラマンバンドとメチル基のラマンバンドである請求項４に記載の軟骨組織の分析装置。
  9. 　前記２種類のラマンバンドが、コラーゲンのアミドＩＩＩバンドである請求項４に記載の軟骨組織の分析装置。
  10. 　前記評価部が、前記選択されたラマンスペクトルを多変量解析することによって前記軟骨組織に含まれるグリコサミノグリカンの量を推定するか、グリコサミノグリカン量と相関するラマンスペクトルの特徴量を算出し、得られた前記グリコサミノグリカンの量または前記ラマンスペクトルの特徴量に基づいて前記軟骨組織の状態を評価する請求項１から請求項９のいずれかに記載の軟骨組織の分析装置。
  11. 　前記評価部が、前記選択されたラマンスペクトルを多変量解析することによって前記軟骨組織に含まれるコラーゲンの量を推定するか、コラーゲンの量と相関するラマンスペクトルの特徴量を算出し、得られた前記コラーゲンの量または前記ラマンスペクトルの特徴量に基づいて前記軟骨組織の状態を評価する請求項１から請求項１０のいずれかに記載の軟骨組織の分析装置。
  12. 　前記評価部が、前記選択されたラマンスペクトルを多変量解析することによって前記軟骨組織に含まれる細胞の量を推定するか、細胞の量と相関するラマンスペクトルの特徴量を算出し、得られた前記細胞の量または前記ラマンスペクトルの特徴量に基づいて前記軟骨組織の状態を評価する請求項１から請求項１１のいずれかに記載の軟骨組織の分析装置。
  13. 　前記評価部が、前記第１のラマンスペクトルおよび前記第２のラマンスペクトルの各々から、前記軟骨組織に由来するラマンバンドと前記骨組織に由来するラマンバンドとの強度比を演算し、算出された２つの強度比に基づいて前記軟骨組織の厚みを推定する請求項１から請求項１２のいずれかに記載の軟骨組織の分析装置。
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