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WO2018131909A1 - 뇌신경계 질환의 치료 또는 진단을 위한 표적 단백질로서 pcnt - Google Patents

뇌신경계 질환의 치료 또는 진단을 위한 표적 단백질로서 pcnt Download PDF

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WO2018131909A1
WO2018131909A1 PCT/KR2018/000539 KR2018000539W WO2018131909A1 WO 2018131909 A1 WO2018131909 A1 WO 2018131909A1 KR 2018000539 W KR2018000539 W KR 2018000539W WO 2018131909 A1 WO2018131909 A1 WO 2018131909A1
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WO
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disease
pcnt
nervous system
cerebral
cord blood
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Application number
PCT/KR2018/000539
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English (en)
French (fr)
Inventor
김민영
최지인
Original Assignee
의료법인 성광의료재단
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Definitions

  • composition for preventing or treating cerebral nervous system disease including cord blood or cord blood-derived cells expressing or secreting PCNT as an active ingredient, a composition for diagnosing cerebral neurological disease, including an agent for measuring the level of PCNT protein, or
  • the present invention relates to a kit, a method for analyzing information necessary for diagnosing cerebral nervous system disease using PCNT protein, and a method for screening a candidate drug for treating cerebral nervous system disease.
  • the cranial nervous system refers to a body control system composed of the brain, spinal cord, cranial nerve, spinal nerve, autonomic nervous system, and the like.
  • Cerebral nervous system diseases include cerebral palsy, brain injury, traumatic brain injury, ischemic brain injury, concussion, brain bruise, stroke, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, stroke, dementia, Lou Gehrig's disease, Huntington's disease, Pick Diseases, Creutzfeld-Jakob disease, amyotrophic atrophic sclerosis, primary axonal sclerosis, degenerative ataxia, multiple sclerosis, nervous system dysfunction, memory loss, epilepsy, encephalitis, prion disease, and neuropathy.
  • Brain injury refers to a condition in which abnormalities occur in the nerve tissues of the brain due to internal or external reasons and abnormalities in behavior or function. Brain damage can be caused by cerebrovascular diseases such as open head injury, obstructive head injury, slowing damage, exposure to toxic substances, lack of oxygen, tumors, infections, strokes.
  • Cerebral palsy is not a single disease but a collective term for syndromes with similar clinical characteristics. Cerebral palsy is a clinical syndrome with impaired movement and posture resulting from impaired lesions or damage to the immature brain. Cerebral palsy is a disease that causes problems in the ability to control muscles or maintain walking posture due to damage to the brain during development. Brain injury occurs mainly before and after birth, but can occur at any time during pregnancy and even in childhood. Can be.
  • Brain damage is non-progressive, but over time, the aspects of neuromotor disorders and musculoskeletal disorders change, so periodic examinations should provide the best rehabilitation treatment for the changed clinical picture.
  • Patent Document 1 relates to the use of oligodendrocyte precursor cells as a cell therapeutic agent for central nervous system disease, and is a doldol group which is a stem cell transformed with an expression vector containing an Olig2 gene encoding nucleic acid molecule Disclosed is a composition for treating a central nervous system disease comprising a ganglion cell as an active ingredient.
  • stem cells including mesenchymal stem cells
  • direct transplantation of stem cells may fail to differentiate and survive in vivo, and difficult to quantitatively administer, making it difficult to use as a cell therapy. Accordingly, there is a need for the development of a cell therapy agent having no rejection in vivo and having a therapeutic effect on motor and cognitive development.
  • the present inventors completed the present invention by identifying PCNT protein as a target protein for treating or diagnosing cerebral neurological diseases while studying cord blood as a cell therapeutic agent for cerebral nervous system diseases.
  • One aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cerebral nervous system disease, including the cord blood or cord blood-derived cells expressing or secreting PCNT as an active ingredient.
  • composition or kit for diagnosing cerebral nervous system disease comprising an agent that measures the level of mRNA of a PCNT protein or gene thereof.
  • Another aspect includes measuring the expression level or activity level of a PCNT protein or a gene thereof in a sample isolated from an individual; And comparing the measured expression level or activity level with the expression level or activity level of PCNT protein measured in a control sample isolated from a normal individual. .
  • Another aspect includes in vitro contacting a test substance with a cell expressing a PCNT protein; Measuring the expression level or activity of PCNT protein in said cell; And selecting a test substance to increase the expression amount or activity as compared with the control group by comparing the expression level or activity of the measured PCNT protein with the control group.
  • One aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cerebral nervous system disease, including the cord blood or cord blood-derived cells expressing or secreting PCNT as an active ingredient.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a cerebral nervous system disease comprising a PCNT protein or an active fragment thereof as an active ingredient.
  • PCNT Pericentrin
  • PCNT protein showed a higher expression level than before treatment in cerebral palsy patients undergoing cord blood cell treatment.
  • the PCNT protein may be secreted from cord blood or cord blood derived cells.
  • the PCNT protein may be derived from a mammal, for example from humans, monkeys or rodents.
  • the PCNT may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (GenBank Accession No. XP_005261181).
  • the cerebral neurological disease may be a cerebral nervous system disease with reduced expression of PCNT compared to normal.
  • the cerebral nervous system disease may include all diseases in which abnormalities or disorders occur in some or all of the brain, the spinal cord, the brain nerve, the spinal nerve, the autonomic nervous system, and the like, which constitute the brain nervous system.
  • the cerebral nervous system disease may be a brain injury disease.
  • the cerebral nervous system disease may be neuroinjury disease.
  • the cerebral nervous system disease is cerebral palsy, brain injury, Traumatic Brain Injury, ischemic brain injury, concussion, brain contusion, stroke, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, stroke, dementia, Lou Gehrig's disease, Huntington's disease, Pick's disease, Creutzfeld-Jakob's disease, amyotrophic atrophy, degenerative ataxia, degenerative ataxia, multiple sclerosis, neurological dysfunction , Memory loss, epilepsy, encephalitis, prion disease, and neuropathy, but is not limited thereto.
  • the cerebral nervous system disease may be cerebral palsy.
  • Cerebral palsy may refer to a disease in which the immature brain causes non-progressive lesions or injuries caused by various causative factors at birth or postnatally, resulting in clinically impaired movement and posture. .
  • cord blood refers to blood in the placenta or umbilical cord.
  • Umbilical cord blood contains a large amount of hematopoietic stem cells that make up blood components such as white blood cells, red blood cells, and platelets, and various stem cells that produce cartilage, bone, fat, muscle, and nerves.
  • stem cell is an undifferentiated cell that is capable of converting to any organ as a primitive cell, and includes a kind of embryonic stem cells and adult stem cells. can do.
  • Cord blood-derived stem cells may be adult stem cells such as mesenchymal stem cells (MSC).
  • MSC mesenchymal stem cells
  • Umbilical cord blood can be obtained after delivery from the umbilical cord. The cord blood may use a leukocyte concentrate from which red blood cells and plasma have been removed.
  • the leukocyte concentrate of umbilical cord blood is hematopoietic stem cells, monocytes, neutrophils, B-lymphocytes, T-lymphocytes, CD4 T cells, CD8 T cells, NK cells, peripheral blood mononuclear cells (PBMC), platelets, lymph nodes, tonsils And various cord blood-derived cells, such as bone marrow stromal cells, bone marrow mesenchymal stem cells, and the like.
  • the umbilical cord blood may be autologous umbilical cord blood or allogeneic umbilical cord blood.
  • the allogeneic cord blood may use cord blood of a family such as siblings and parents.
  • the cord blood-derived cells may be hematopoietic stem cells.
  • the cord blood derived cell may be a cell expressing or secreting PCNT.
  • the cord blood derived cells may be selected from the group consisting of monocytes, B-lymphocytes, CD4 T cells, CD8 T cells, NK cells, peripheral blood monocyte cells, platelets, and lymph nodes, but is not limited thereto.
  • the cord blood derived cells can be peripheral blood monocyte cells.
  • the cord blood derived cells may be genetically engineered to express or secrete or increase expression or secretion of PCNT.
  • the pharmaceutical composition may further include erythropoietin (EPO).
  • EPO erythropoietin
  • the erythropoietin may be a hormone that regulates the production of red blood cells in the bone marrow.
  • EPO erythropoietin
  • the therapeutic effect of umbilical cord blood may be enhanced to further improve motor and cognitive function of the patient.
  • treatment refers to or includes the alleviation, inhibition or prevention of a disease, disorder or condition, or one or more symptoms thereof, wherein “active ingredient” or “pharmaceutically effective amount” means a disease, disorder or condition, or By any amount of the composition used in the practice of the invention provided herein sufficient to alleviate, inhibit or prevent the progression of one or more symptoms.
  • administering are used interchangeably and in one embodiment into a subject by a method or route which results in at least partial localization of the composition to the desired site according to one embodiment. It may mean the arrangement of the composition according to the example.
  • the cells of the composition according to one embodiment, at least some of the cellular components, or cell-derived secretory components can be administered by any suitable route for delivery to the desired location in the surviving individual.
  • the survival time of cells after subject administration can be as short as several hours, for example between 24 hours and several days to many years.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • Pharmaceutically acceptable carriers or diluents may be known in the art.
  • the carrier or diluent may be lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water (e.g.
  • the pharmaceutical composition may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, or a preservative.
  • the pharmaceutical composition may be prepared in unit dose form or formulated into a multi-dose container by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient, according to methods known to those skilled in the art.
  • the formulations can then be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous solvents or in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may further comprise dispersants or stabilizers.
  • the aqueous solvent may be one containing physiological saline or PBS.
  • the pharmaceutical composition according to one embodiment may be formulated in an oral or parenteral dosage form, preferably parenterally.
  • a sterile solution of the active ingredient is typically prepared, and may include a buffer that can suitably adjust the pH of the solution, and for intravenous administration, it appears in the formulation.
  • Isotonic agents may be included to impart sex.
  • the pharmaceutical composition may include at least 1 ⁇ 10 7 / kg of nucleated cells, specifically 2 ⁇ 10 7 / kg, 3 ⁇ 10 7 / kg or more, or 3 ⁇ 10 7 / kg to the nucleated cells.
  • 10 x 10 7 / kg such as 3 x 10 7 / kg to 5 x 10 7 / kg.
  • the dosage (effective amount) of the pharmaceutical composition is about 0.01 to 200 ml per day, specifically about 0.01 to 150 ml, about 0.01 to 100 ml, about 0.1 to 150 ml, about 0.1 to 100 ml, about 1 to 100 ml, about 1 to 50 ml, about 5 to 50 ml, or about 10 to 40 ml, for example 15 to 30 ml.
  • the umbilical cord blood may be reduced in concentration by appropriate concentration.
  • the dosage may be variously prescribed by such factors as the formulation method, the mode of administration, the age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and reaction sensitivity of the patient.
  • the number of administrations may be once or twice a day within the range of clinically acceptable side effects, and may be administered in one or two or more places on the administration site, and may be administered daily or every two to five days. Dosing days can be administered from 1 to 30 days once treated. If necessary, the same treatment may be repeated after the titration period. In the case of animals other than humans, the same dosages as humans per kg or the above dosages are converted into volume ratios (for example, average values) of organs (heart, etc.) between the target animal and humans. One dose may be administered.
  • Possible routes of administration may include parenteral (eg, subcutaneous, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intradural, or intravenous), topical (including transdermal), and injection, or insertion of an implantable device or substance.
  • parenteral eg, subcutaneous, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intradural, or intravenous
  • topical including transdermal
  • injection, or insertion of an implantable device or substance may include parenteral (eg, subcutaneous, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intradural, or intravenous), topical (including transdermal), and injection, or insertion of an implantable device or substance.
  • Examples of the target animal for the treatment include humans and mammals for other purposes, and specifically, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, sheep, cattle, dogs, horses, pigs, and the like. Included.
  • composition or kit for diagnosing cerebral nervous system disease comprising an agent that measures the level of mRNA of a PCNT protein or gene thereof.
  • PCNT protein and cerebral nervous system disease are as described above.
  • the PCNT protein showed low expression level compared to the plasma of normal persons in cerebral palsy patients. Therefore, it is possible to diagnose the onset or progression of cerebral nervous system diseases such as cerebral palsy by measuring the expression or activity level of PCNT protein and comparing it with a sample derived from a normal person. Therefore, the PCNT protein may be a diagnostic marker of cerebral nervous system disease such as cerebral palsy.
  • diagnosis refers to identifying the presence or characteristic of a pathological condition. Therefore, the “diagnosis of the neurological diseases” may mean confirming the onset or possibility of the onset of the neurological diseases or to predict the risk of the onset.
  • diagnosis marker may refer to a substance capable of diagnosing or probable onset of the cerebral nervous system disease.
  • the agent measuring the protein may be an antibody that specifically binds to the PCNT protein or fragment thereof.
  • the agent for measuring mRNA level of the gene may comprise a primer or probe that specifically binds to the nucleic acid encoding the PCNT protein or fragment thereof.
  • Antibodies that specifically bind to PCNT proteins or fragments thereof may include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, and recombinant antibodies, and, in addition to the full form having the full length of two heavy and two light chains, have at least antigen binding functions. Retaining functional fragments such as Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv, and the like.
  • One skilled in the art can also design primers or probes that specifically amplify or recognize specific regions from the sequences of known PCNT genes.
  • primer refers to a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group, which can form complementary templates and base pairs and serve as a starting point for template strand copying. It means 7 to 50 nucleic acid sequences. Primers are usually synthesized but can also be used in naturally occurring nucleic acids. The sequence of the primer does not necessarily have to be exactly the same as the sequence of the template, but only if it is sufficiently complementary to hybridize with the template. Primers will initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffers and temperatures.
  • nucleoside triphosphates and reagents for polymerization ie, DNA polymerase or reverse transcriptase
  • PCR conditions, sense and antisense primers can be modified based on what is known in the art, thus PCR amplification using sense and antisense primers of the nucleotide sequence region of the PCNT gene. Cerebral neurological disease can be diagnosed by carrying out.
  • probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA, which is short to several bases to hundreds of bases capable of specific binding with mRNA, and labeled to identify the presence of a specific mRNA.
  • the probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, an RNA probe, or the like. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on what is known in the art. Therefore, hybridization may be performed using a probe complementary to the nucleotide sequence of the PCNT gene, thereby diagnosing cerebral nervous system disease through hybridization.
  • the primer or probe may be chemically synthesized using a phosphoramidite solid support method, or other well known methods.
  • Such nucleic acid sequences may incorporate additional features that do not change the underlying properties. Examples of additional features that may be incorporated include, but are not limited to, methylation, encapsulation, substitution of one or more nucleic acids with homologues, and modifications between nucleic acids.
  • the kit may be an RT-PCR kit, a microarray chip kit or a protein chip kit.
  • the kit may further comprise one or more other components suitable for the assay method.
  • the kit may further include a necessary container, reaction buffer, deoxynucleotide (dNTP), DNA polymerase for PCR, reverse transcriptase, and the like, in addition to a primer set specific for PCNT protein.
  • dNTP deoxynucleotide
  • DNA polymerase for PCR
  • reverse transcriptase and the like, in addition to a primer set specific for PCNT protein.
  • the assay method is ELISA, it may further comprise a reagent for detecting the bound antibody, for example, secondary antibodies, chromophores, enzymes and substrates thereof.
  • Another aspect includes measuring the expression level or activity level of a PCNT protein or a gene thereof in a sample isolated from an individual; And comparing the measured expression level or activity level with the expression level or activity level of PCNT protein measured in a control sample isolated from a normal individual. .
  • PCNT protein and cerebral nervous system disease are as described above.
  • the method comprises measuring the expression level or activity level of a PCNT protein or a gene thereof in a sample isolated from the subject.
  • the term "individual” refers to an individual who wants to confirm or predict the onset or possibility of developing a neurological disease of the brain.
  • the subject is not limited if the animal can develop a neurological disease, but specifically may be a mammal, for example, human ( Homo sapiens ).
  • the sample may include, but is not limited to, tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, urine, and the like, which are separated from an individual's body.
  • the sample may be plasma.
  • Measuring the expression level of the PCNT protein or its genes may be performed by measuring the amount of mRNA or PCNT protein of the PCNT gene.
  • the step of measuring the expression level, ie mRNA level of the PCNT protein is RT-PCR, competitive RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RNase protection assay) : RPA), Northern blotting (Northern blotting), DNA chip, etc., but may be performed by, but not limited to.
  • Measuring the activity level of the PCNT protein may be performed by a method such as Western blotting, magnetic bead-antibody immunoprecipitation, ELISA, mass spectrometry, radioimmunoassay, immunoprecipitation method, but is not limited thereto.
  • the method includes comparing the expression level or activity level measured in a sample with the expression level or activity level of PCNT protein measured in a control sample isolated from normal individuals. If the level of expression or activity of PCNT protein in a sample is lower than that of a control sample isolated from a normal individual, the sample may be determined to have a high probability of developing or progressing a neurological disease. Therefore, the method may include determining that there is a cerebral neurological disease when the measured expression level or activity level is lower than the expression level or activity level measured in the control sample.
  • Another aspect includes in vitro contacting a test substance with a cell expressing a PCNT protein; Measuring the expression level or activity of PCNT protein in said cell; And selecting a test substance to increase the expression amount or activity as compared with the control group by comparing the expression level or activity of the measured PCNT protein with the control group.
  • PCNT protein and cerebral nervous system disease are as described above.
  • PCNT protein was confirmed to show a higher expression level than before treatment in patients with cerebral palsy who underwent cord blood cell treatment, thereby improving the effect of cerebral palsy. Therefore, a substance that specifically increases the expression or activity of the PCNT protein may exert a therapeutic effect on cerebral nervous system diseases such as cerebral palsy. This effect indicates that the PCNT protein or its genes are the target of treatment of cerebral nervous system diseases such as cerebral palsy.
  • the method comprises contacting a test substance with a cell expressing a PCNT protein in vitro .
  • the cell expressing the PCNT protein may be, for example, blood cells, brain cells, or the like, but is not limited thereto.
  • Contact with the test substance may be performed by transfection, transformation or injection of the test substance.
  • Contact with the test substance may be made in a medium capable of maintaining the growth of the cells.
  • the method includes measuring the expression level or activity of PCNT protein in the cell.
  • the measurement may be performed by an antibody that specifically recognizes the PCNT protein or fragment thereof, or a primer or probe that specifically recognizes the nucleic acid encoding the PCNT protein or fragment thereof.
  • the measurement of the expression level can be performed by measuring the amount of mRNA or PCNT protein of the PCNT gene.
  • the amount of mRNA may be measured by RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA), northern blotting, or DNA chip, but the type is not limited.
  • the amount of the protein can be measured by Western blotting, magnetic bead-antibody immunoprecipitation, ELISA, or mass spectrometry radioimmunoassay, or immunoprecipitation, but the type is not limited.
  • the method includes the step of selecting a test substance for treating a neurological disorder of the brain as compared with the control group by expressing the amount or activity of the measured PCNT protein in the amount or activity compared to the control group. do.
  • the test substance may be selected as a substance that can be used for the treatment of cerebral nervous system disease by increasing the expression or activity of the PCNT protein.
  • the control is a cell under the same conditions except for contacting with the test substance.
  • composition comprising umbilical cord blood or umbilical cord blood-derived cells expressing or secreting PCNTs according to one aspect, it is possible to effectively prevent or treat cerebral neurological diseases.
  • the PCNT protein can be used as a target for early diagnosis of cerebral nervous system diseases and to develop therapeutics for cerebral nervous system diseases.
  • Figure 1A is a result of two-dimensional gel electrophoresis to confirm the change of the plasma protein before and after the cord blood (Pre) and 10 days after the procedure (Post + 10 days), Experiment 1 (4, 9 and 10 patients) Sample analysis).
  • Figure 1B is a result of two-dimensional gel electrophoresis to confirm the change of the protein in the plasma before the cord blood (Pre) and 10 days after the procedure (Post + 10 days), Experiment 2 (6, 7 and 8 patients) Sample analysis).
  • FIG. 2 is a Western blot result confirming the expression of pre- and post-umbilical cord PCNTs for plasma of 13 cerebral palsy patients.
  • FIG. 3 is a graph showing the change in the amount of PCNT expression before and after cord blood treatment by adding up the results of all the patients shown in FIG.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of repeatedly checking the expression level of PCNT four times after administration of cord blood mononuclear cells (UCB) in a cerebral palsy-induced rat model.
  • a comparison model was used to administer the model of EPO.
  • FIG. 5 is a graph showing the change in PCNT expression in FIG. 4 in terms of% based on when no umbilical cord blood was administered to the Sham model that did not cause cerebral palsy.
  • FIG. 6A shows the expression level of PCNT in umbilical cord blood (UCB) plasma, normal plasma, and cerebral palsy plasma samples.
  • UB umbilical cord blood
  • FIG. 6B is a graph showing the relative expression level (%) of PCNT in umbilical cord blood (UCB) plasma, normal plasma, and cerebral palsy plasma samples based on umbilical cord blood 1 sample.
  • FIG. 7 shows serum, plasma, monocytes, neutrophils, B-lymphocytes, T-lymphocytes, Lymphocytes, CD4 T cells, and CD8 as components present in cord blood.
  • T cells NK cells, Peripheral blood mononuclear cells, Platelets, Lymph nodes, Tonsils, Bone marrow stromal cells, and bone marrow mesenchymal stem cells (Bone marrow mesenchymal stem cell) It is a graph showing the amount of PCNT expression (Log 10 , ppm) of each.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of GMFCS evaluation (GMFCS total (%)) before umbilical cord blood treatment (GMFCS_pre) and after surgery (GMFCS_post) for 5, 11, and 13 cerebral palsy patients.
  • BSID_Mental_pre cord blood treatment
  • BSID_Mental_post post-treatment
  • cord blood was used to remove erythrocytes and plasma, to produce leukocyte concentrates, and to be frozen. Cryopreserved leukocyte concentrates were thawed in a 37 ° C. water bath prior to the procedure, followed by 10% dextran-40 (100 g dextran-40 / 1 L water) and 5% albumin (50 g albumin / 1 L water). ) washed with the same diluted solution.
  • the leukocyte concentrate was suspended in 10 ml of a mixture of 10% dextran-40 and 5% albumin in the same amount, with a minimum total nucleated cell count of 3 x 10 7 / kg, followed by intravenous injection of 15 ml to 30 Doses between ml were administered.
  • Table 1 is a table showing the diagnosis and cord blood treatment of children with cerebral palsy selected for screening proteins in plasma. About 1 to 3 cc of blood of cerebral palsy patients shown in Table 1 were collected in an EDTA tube and centrifuged at 2000 rpm. At this time, the blood layer is divided into red blood cells at the bottom, monocytes in the middle layer, and plasma at the top layer. Only the plasma is separated from the divided blood and stored in a -80 ° C cryogenic freezer.
  • 2-Dimensional gel electrophoresis (2DE) technique was used.
  • the 2DE technique, image analysis and qualitative analysis of the prepared samples were conducted by the Yonsei Proteome Research Institute at Yonsei University.
  • Table 2 shows information on experimental samples for screening proteins in plasma of six patients who had improved after receiving cord blood.
  • a mixture of plasma from 4, 9, and 10 patients was used as the blood before umbilical cord blood treatment, and plasma of 4 patients with plasma was analyzed as a sample after 10 days of cord blood treatment.
  • a mixture of plasmas of 6, 7, and 8 patients was used as the plasma before cord blood treatment, and the plasma of 6 patients with plasma was analyzed as a sample 10 days after the cord blood treatment.
  • Experiment 1 Experiment 2 Sample Before cord blood treatment 10 days after cord blood treatment Before cord blood treatment 10 days after cord blood treatment Plasma Mixtures in Children 4, 9 and 10 Plasma of Patient No. 4 Plasma Mixtures in Children 6, 7 and 8 Plasma of Child Six
  • Figure 1A is a result of two-dimensional gel electrophoresis to confirm the change of the plasma protein before and after the cord blood (Pre) and 10 days after the procedure (Post + 10 days), Experiment 1 (4, 9 and 10 patients) Sample analysis).
  • Figure 1B is a result of two-dimensional gel electrophoresis to confirm the change of the protein in the plasma before the cord blood (Pre) and 10 days after the procedure (Post + 10 days), Experiment 2 (6, 7 and 8 patients) Sample analysis).
  • the horizontal axis represents pH and the vertical axis represents protein size.
  • Table 3 shows the protein that appears to increase more than threefold in the plasma of the patients who showed improvement after the cord blood procedure after the qualitative analysis of each protein according to the 2DE results.
  • PCNT Perientrin
  • the score is -10 * Log (P), where P is the probability that the observed match is a random event. If the protein score is 72 or more, it is significant (p ⁇ 0.05).
  • Table 4 is a table showing the list of clinical cerebral palsy patients, the type of umbilical cord blood and whether or not the injection of erythropoietin (EPO). Allogeneic cord blood uses cord blood from siblings or family members. A total of 13 children with cerebral palsy shown in Table 4 were isolated and only plasma was collected. The collected plasma was diluted 5: 1 with PBS (Phosphate-buffered saline) and quantified by the Bradford assay. Quantitative protein was prepared by mixing 30 ⁇ g in sample buffer, boiling for 7 minutes, and spinning down.
  • PBS Phosphate-buffered saline
  • PCNT protein after umbilical cord blood was confirmed by Western blot technique.
  • the plasma sample prepared in Example 2-1 was dispensed into 8% SDS-polyacrylamide gel in order before and after cord blood procedure. After transferring the protein lowered to the gel onto the nitrocellulose (NC) membrane and reacting with the PCNT antibody for 16 hours or more, the amount of PCNT expression before and after umbilical cord blood was checked by a band.
  • NC nitrocellulose
  • FIG. 2 is a Western blot result confirming the expression of pre- and post-umbilical cord PCNTs for plasma of 13 cerebral palsy patients.
  • FIG. 3 is a graph showing the change in the amount of PCNT expression before and after cord blood treatment by adding up the results of all the patients shown in FIG.
  • Hypoxic ischemia (HI) model a cerebral palsy-induced rat model, was constructed using 7-day-old ICR mice. After 7 days of age, the right common carotid artery of the ICR rat was tied with 5-0 blue nylon, and placed in a closed special container maintained at O 2 8% and N 2 92%, and maintained at 37 ° C. Hypoxia-cerebral ischemia was induced for a period of time. Six days after the HI model was produced, the degree of brain tissue damage was visually checked, and more than 50% of the damaged models were excluded.
  • Umbilical cord blood was used for research umbilical cord blood donated from CHA Medical Cord Blood Bank icord. Umbilical cord blood was centrifuged at 2200rpm and separated into red blood cells, monocyte layer and plasma. Plasma was stored separately and only monocyte layer was separated using Ficoll (Ficoll, Pharmacia Corp., USA). Specifically, the red blood cells and monocyte layer excluding plasma were raised on Pico and diluted with PBS, followed by centrifugation at 2200 rpm for 20 minutes. By Piccol's principle, hematocrit, which is heavier than Piccol, sinks and the monocyte layer separates just above Piccol. Only the isolated monocytes were transferred separately and the concentration of 4 X 10 5 cells / 10 g was released in 100 ⁇ l saline. The prepared cord blood monocytes were prepared intraperitoneally with a cerebral palsy-induced rat model.
  • a cerebral palsy-induced rat model was removed with blood to kill brain tissue.
  • the extracted brain tissue was lysed using Lysis buffer and centrifuged to separate proteins.
  • the changed expression level of PCNT was confirmed by Western blot technique with respect to 30 ⁇ g of the isolated protein.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of repeatedly checking the expression level of PCNT four times after administration of cord blood mononuclear cells (UCB) in a cerebral palsy-induced rat model.
  • a comparison model was used to administer the model of EPO.
  • FIG. 5 is a graph showing the change in PCNT expression in FIG. 4 in terms of% based on when no umbilical cord blood was administered to the Sham model that did not cause cerebral palsy.
  • Example 4 cord blood, normal people and cerebral palsy Patient Present in plasma PCNT Positive Difference Verification
  • Umbilical cord blood was centrifuged to separate cord blood for research cord donation from an icord and frozen in -80 °C cryogenic freezer and stored. Normal blood was centrifuged to separate plasma from women and men in their 30s and 30s, and blood was collected from cerebral palsy patients by centrifuging blood prior to umbilical cord blood treatment. was stored frozen.
  • Table 5 is a table showing the information of normal people and cerebral palsy patients selected as a comparison group to confirm the expression of PCNT contained in the cord blood.
  • Example 4-1 The plasma stored in Example 4-1 was slowly dissolved on ice and diluted 5: 1 with PBS. Diluted samples were quantified using BradFord reagent and Western blot technique experiments were performed on 30 ⁇ g.
  • FIG. 6A shows the expression level of PCNT in umbilical cord blood (UCB) plasma, normal plasma, and cerebral palsy plasma samples.
  • FIG. 6B is a graph showing the relative expression level (%) of PCNT in umbilical cord blood (UCB) plasma, normal plasma, and cerebral palsy plasma samples based on umbilical cord blood 1 sample.
  • Umbilical cord blood is the blood in the tissues of the umbilical cord and contains a large amount of hematopoietic stem cells (hematopoietic stem cells).
  • Hematopoietic stem cells are the major constituents of blood and are potential cells that can differentiate into monocytes, macrophages, platelets, and lymphoid cells such as T-cells, B-cells, and NK cells that are produced in the bone marrow. Therefore, it was confirmed which kind of cells present in cord blood express PCNT. Information on cells expressing PCNT was found on the GeneCards website (http://www.genecards.org/).
  • FIG. 7 shows serum, plasma, monocytes, neutrophils, B-lymphocytes, T-lymphocytes, Lymphocytes, CD4 T cells, and CD8 as components present in cord blood.
  • T cells NK cells, Peripheral blood mononuclear cells (PBMC), platelets, lymph nodes, tonsils, bone marrow stromal cells, and bone marrow mesenchyme
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • platelets platelets
  • lymph nodes lymph nodes
  • tonsils tonsils
  • bone marrow stromal cells bone marrow mesenchyme
  • PCNTs were secreted from monocytes, B-lymphocytes, CD4 T cells, CD8 T cells, NK cells, peripheral blood monocytes, platelets, and lymph nodes among cells present in cord blood, among which peripheral blood monocytes. It was confirmed that the cells (PBMC) showed the most PCNT expression.
  • cord blood was used to remove erythrocytes and plasma, to produce leukocyte concentrates, and to be frozen.
  • Cryopreserved leukocyte concentrates were thawed in a 37 ° C. water bath prior to the procedure, followed by 10% dextran-40 (100 g dextran-40 / 1 L water) and 5% albumin (50 g albumin / 1 L water). ) washed with the same diluted solution.
  • the leukocyte concentrate was suspended in 10 ml of a mixture of 10% dextran-40 and 5% albumin in the same amount, with a minimum total nucleated cell count of 3 x 10 7 / kg, followed by intravenous injection of 15 ml to 30 Doses between ml were administered.
  • Table 6 is a table showing the sex, diagnosis and function evaluation results after cord blood treatment of 13 children with cerebral palsy selected to confirm the therapeutic effect of cord blood.
  • GFCS Gross Motor Function Classification System
  • BSID Bailey's Infant Scales of Infant Development for patients 5, 11, and 13 after cord blood procedures 2-4 months.
  • BSID II motor and Bailey's Infant Developmental Test (BSID II mental).
  • FIG. 8 is a graph showing the results of GMFCS evaluation (GMFCS total (%)) before umbilical cord blood treatment (GMFCS_pre) and after surgery (GMFCS_post) for 5, 11, and 13 cerebral palsy patients.
  • BSID_Mental_pre cord blood treatment
  • BSID_Mental_post post-treatment
  • the GMFCS, BSID II motor, and BSID II mental tests were performed on the patients with cerebral palsy before and after the cord blood procedure.
  • PCNT protein has been identified as a target protein for the treatment or diagnosis of cerebral nervous system diseases.
  • PCNT protein can be used as a target for diagnosing cerebral nervous system diseases and developing therapeutics for cerebral nervous system diseases.
  • composition including the cord blood or cord blood-derived cells expressing or secreting PCNT, it is possible to effectively prevent or treat cerebral nervous system disease.
  • composition or kit comprising an agent that measures the level of mRNA of a PCNT protein or a gene thereof can be used to diagnose cerebral nervous system disease.
  • candidates for the treatment of cerebral neurological diseases can be screened by measuring the expression level or activity of the PCNT protein after contacting the cell expressing the PCNT protein with the test substance.

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Abstract

PCNT를 발현 또는 분비하는 제대혈 또는 제대혈 유래 세포를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물, PCNT 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 조성물 또는 키트, PCNT 단백질을 이용하여 뇌신경계 질환 진단에 필요한 정보를 분석하는 방법, 및 뇌신경계 질환 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 일 양상에 따른 PCNT를 발현 또는 분비하는 제대혈 또는 제대혈 유래 세포를 포함하는 조성물을 사용하면, 뇌신경계 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, PCNT 단백질은 조기에 뇌신경계 질환을 진단하고 뇌신경계 질환 치료제를 개발하기 위한 표적으로 활용할 수 있다.

Description

뇌신경계 질환의 치료 또는 진단을 위한 표적 단백질로서 PCNT
PCNT를 발현 또는 분비하는 제대혈 또는 제대혈 유래 세포를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물, PCNT 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 조성물 또는 키트, PCNT 단백질을 이용하여 뇌신경계 질환 진단에 필요한 정보를 분석하는 방법, 및 뇌신경계 질환 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
뇌신경계는 뇌, 척수, 뇌신경, 척수신경, 자율신경계 등으로 구성된 신체 조절 시스템을 의미한다. 뇌신경계 질환은 뇌성마비, 뇌손상, 외상성 뇌손상, 허혈성 뇌손상, 뇌진탕, 뇌타박상, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 중풍, 치매, 루게릭병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병, 근위축성축삭경화증, 원발성축삭경화증, 퇴행성 운동 실조증, 다발성경화증, 신경계 기능장애, 기억력 감퇴, 간질, 뇌염, 프리온병, 및 신경병증 등 다양하다. 뇌손상이란 내적 또는 외적인 여러 이유로 뇌의 신경조직에 이상이 생겨 행동 또는 기능상에 이상이 오는 상태를 의미한다. 뇌손상은 개방성 두부 손상, 폐쇄성 두부 손상, 감속손상, 독성 물질의 노출, 산소 부족, 종양, 감염, 뇌졸중과 같은 뇌혈관 질환에 의해 발생할 수 있다.
뇌성마비는 하나의 질병이 아니라 비슷한 임상적 특징을 가진 증후군을 집합적으로 일컫는 용어로 미성숙한 뇌에 대한 비진행성 병변 혹은 손상으로 생기는 운동과 자세의 장애를 보이는 임상증후군을 말한다. 뇌성마비란 발달 과정중인 뇌에 대한 손상으로 인하여 근육 조절 능력이나, 보행 미 자세유지 등에 문제를 일으키는 질환으로 뇌 손상은 출생 전후나, 출생 도중에 주로 발생하지만 임신 중 어느 때나 발생 가능하고 심지어 소아기 때도 생길 수 있다.
뇌의 손상은 비진행성이지만 시간이 지나면서 신경운동 장애의 양상과 근골격계의 장애가 변화하므로 주기적인 진찰을 통해 변화된 임상 양상에 가장 적합한 재활 치료를 제공해야만 한다. 그 밖에 다른 치료 방법들이 있지만 이를 통한 획기적이고 근본적인 치료 방법은 없는 실정이다.
뇌성마비의 치료로 뇌 가소성의 가능성을 자극함으로써 잠재적 효과를 나타낼 수 있다고 보고되고 있으며, 이것은 뇌손상 환자에서 긍정적인 효과를 나타낸다. 뇌 가소성의 가능성을 자극하기 위한 방법으로 세포 치료의 방법이 있다.
한국 등록특허공보 제14093336호 (특허문헌 1)은 희돌기교전구세포의 중추신경계 질환의 세포 치료제로서의 용도에 관한 것으로서, Olig2 유전자 인코딩 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 줄기세포인 희돌기교전구세포를 유효성분으로 포함하는 중추신경계 질환 치료용 조성물을 개시하고 있다.
한편, 중간엽줄기세포를 포함한 줄기세포를 직접 이식하게 되면 생체 내에서 분화와 생존에 실패할 수 있으며, 정량적인 투여가 어렵다는 문제점이 있어 세포 치료제로의 사용이 어렵다. 이에 따라 생체 내에서 거부 반응이 없고, 운동 및 인지 발달에 치료효과가 있는 세포 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 뇌신경계 질환의 세포 치료제로서 제대혈을 연구하던 중 뇌신경계 질환의 치료 또는 진단을 위한 표적 단백질로서 PCNT 단백질을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 PCNT를 발현 또는 분비하는 제대혈 또는 제대혈 유래 세포를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 조성물 또는 키트를 제공한다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 시료의 PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 발현량 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현량 또는 활성 수준을 정상 개체로부터 분리된 대조군 시료에서 측정된 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 뇌신경계 질환 진단에 필요한 정보를 분석하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 인 비트로에서, PCNT 단백질을 발현하는 세포와 시험 물질을 접촉시키는 단계; 상기 세포에서 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성을 대조군에서 측정된 발현량 또는 활성과 비교하여 대조군에 비해 발현량 또는 활성이 증가되게 하는 시험 물질을 뇌신경계 질환 치료제 후보물질로 선택하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일 양상은 PCNT를 발현 또는 분비하는 제대혈 또는 제대혈 유래 세포를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 PCNT 단백질 또는 그의 활성 단편을 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
용어, "페리센트린 (Pericentrin: PCNT)"은 칼모둘린(calmodulin)과 결합되는 단백질로서, 중심체(centrosome)에서 발현되어 중심소체와 함께 중심체를 이루는 단백질을 의미한다. PCNT 단백질은 세포 분열시 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며(Liu Q et al., Aug 2010, Cell Research. 20 (8): 948-62.), 이 단백질의 이상으로 인한 정신에 관련된 질환들이 보고된 바 있다(Unal S et al., Feb 2014, Pediatric Blood & Cancer. 61 (2): 302-5.). 상기 PCNT 단백질은 제대혈에서 정상인의 혈장 대비 높은 발현 수준을 보였으며, 뇌성마비 환자에서 정상인의 혈장 대비 낮은 발현 수준을 보임을 확인하였다. 또한, PCNT 단백질은 제대혈 세포 치료를 시술받은 뇌성마비 환자에서 시술받기 전 대비 높은 발현 수준을 보임을 확인하였다. 이와 같은 결과는 PCNT 단백질이 뇌성마비와 같은 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 진단 마커로 사용될 수 있다는 점을 시사할 뿐만 아니라, PCNT 단백질이 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하는 데 관여한다는 점을 시사한다. 따라서, PCNT 단백질의 발현율이 높은 제대혈 또는 제대혈 유래 세포는 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하기 위하여 사용될 수 있다.
상기 PCNT 단백질은 제대혈 또는 제대혈 유래 세포로부터 분비되는 것일 수 있다. 또한, 상기 PCNT 단백질은 포유동물에서 유래된 것일 수 있고, 예를 들어 인간, 원숭이 또는 설치류로부터 유래된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 PCNT는 서열번호 1의 아미노산 서열(GenBank Accession No. XP_005261181)로 이루어진 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 뇌신경계 질환은 정상에 비해 PCNT의 발현이 감소된 뇌신경계 질환일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 뇌신경계 질환은 뇌신경계를 구성하는 뇌, 척수, 뇌신경, 척수신경, 자율신경계 등 중 일부 또는 전부에 이상이나 장애가 발생한 질환을 모두 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 뇌신경계 질환은 뇌손상 질환일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 뇌신경계 질환은 신경손상 질환일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 뇌신경계 질환은 뇌성마비, 뇌손상, 외상성 뇌손상(Traumatic Brain Injury), 허혈성 뇌손상, 뇌진탕(Concussion), 뇌타박상(Brain Contusion), 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 중풍, 치매, 루게릭병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병, 근위축성축삭경화증, 원발성축삭경화증, 퇴행성 운동 실조증, 다발성경화증, 신경계 기능장애, 기억력 감퇴, 간질, 뇌염, 프리온병, 및 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 다른 구체예에서, 상기 뇌신경계 질환은 뇌성마비일 수 있다.
용어, "뇌성마비(cerebral palsy)"란 미성숙한 뇌에 출생 시 또는 출생 후 여러 원인인자에 의해 비진행성 병변이나 손상이 발생하여 임상적으로 운동과 자세의 장애를 보이게 되는 질환을 의미할 수 있다.
용어, "제대혈(cord blood)"은 태반이나 탯줄 내의 혈액을 의미한다. 제대혈은 혈액 성분인 백혈구, 적혈구, 혈소판 등을 만드는 조혈모세포(hematopoietic stem cell)와 연골, 뼈, 지방, 근육, 신경 등을 만드는 다양한 줄기세포를 다량 함유하고 있다. 용어, "줄기세포(stem cell)"란 원시단계의 세포로 어떤 기관으로도 전환할 수 있는 미분화 세포이며, 그 종류는 배아줄기세포(embryonic stem cell) 및 성체줄기세포(adult stem cell)를 포함할 수 있다. 제대혈 유래 줄기세포는 중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cell: MSC) 등의 성체줄기세포일 수 있다. 제대혈은 출산 후 탯줄로부터 분리하여 얻을 수 있다. 상기 제대혈은 적혈구 및 혈장을 제거한 백혈구 농축액을 사용할 수 있다. 상기 제대혈의 백혈구 농축액은 조혈모세포, 단핵구, 호중구, B-림프구, T-림프구, CD4 T 세포, CD8 T 세포, NK 세포, 말초혈액 단핵구 세포(Peripheral blood mononuclear cell: PBMC), 혈소판, 림프절, 편도선, 골수 기질적 세포(Bone marrow stromal cell), 골수 중간엽 줄기세포(Bone marrow mesenchymal stem cell) 등 다양한 제대혈 유래 세포를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제대혈은 자가(autologous) 제대혈 또는 동종이계(allogeneic) 제대혈일 수 있다. 상기 동종이계 제대혈은 형제, 부모 등 가족의 제대혈을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제대혈 유래 세포는 조혈모세포일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 제대혈 유래 세포는 PCNT를 발현 또는 분비하는 세포일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 제대혈 유래 세포는 단핵구, B-림프구, CD4 T 세포, CD8 T 세포, NK 세포, 말초혈액 단핵구 세포, 혈소판, 및 림프절로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 다른 구체예에서, 상기 제대혈 유래 세포는 말초혈액 단핵구 세포일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 제대혈 유래 세포는 PCNT를 발현 또는 분비하거나 발현 또는 분비가 증가하도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 에리트로포이에틴 (Erythropoietin: EPO)을 더 포함할 수 있다. 상기 에리트로포이에틴은 골수에서의 적혈구의 생산을 조절하는 호르몬일 수 있다. 에리트로포이에틴을 제대혈 또는 제대혈 유래 세포와 복합 투여할 경우, 제대혈의 치료 효과가 증진되어 환자의 운동기능 및 인지기능이 보다 더 향상될 수 있다.
용어 "치료"는 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하거나, 그를 포함하며, "유효성분" 또는 "약제학적 유효량"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다.
용어, "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 세포, 세포 성분의 적어도 일부, 또는 세포 유래 분비 성분을 생존하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 개체 투여 후 세포의 생존 기간은 짧으면 수 시간, 예를 들면 24시간 내지 수일 내지 길면 수년일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 당업계에 알려진 것일 수 있다. 상기 담체 또는 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물(예를 들면, 식염수 및 멸균수), 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 링거액, 완충제, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 덱스트란, 알부민, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제를 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 당업자에게 알려진 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 용매 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있고, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 수성 용매는 생리식염수 또는 PBS를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에 따른 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 형태, 바람직하게는 비경구 투여 형태로 제제화될 수 있다. 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여 형태의 경우, 통상적으로 활성 성분의 멸균 용액을 제조하고, 용액의 pH를 적합하게 조절할 수 있는 완충제를 포함할 수 있으며, 정맥내 투여의 경우 제제에 등장성이 부여되도록 등장화제를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 제대혈 유래 세포를 유핵세포수 1 x 107/kg 이상, 구체적으로 2 x 107/kg 이상, 3 x 107/kg 이상, 또는 3 x 107/kg 내지 10 x 107/kg, 예를 들어 3 x 107/kg 내지 5 x 107/kg로 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물의 투여량(유효량)은 1일 약 0.01 내지 200 ml, 구체적으로 약 0.01 내지 150 ml, 약 0.01 내지 100 ml, 약 0.1 내지 150 ml, 약 0.1 내지 100 ml, 약 1 내지 100 ml, 약 1 내지 50 ml, 약 5 내지 50 ml, 또는 약 10 내지 40 ml, 예를 들어 15 내지 30 ml일 수 있다. 필요한 경우, 상기 제대혈은 적절히 농축하여 투여함으로써 전체 투여량을 감소시킬 수도 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 가능한 투여 경로에는 비경구 (예를 들어, 피하, 근육내, 동맥내, 복강내, 경막내, 또는 정맥내), 국소 (경피 포함), 및 주사, 또는 이식성 장치 또는 물질의 삽입을 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
다른 양상은 PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 조성물 또는 키트를 제공한다.
PCNT 단백질 및 뇌신경계 질환은 상술한 바와 같다.
일 실시예에서, PCNT 단백질은 뇌성마비 환자에서 정상인의 혈장 대비 낮은 발현 수준을 보임을 확인하였다. 따라서, PCNT 단백질의 발현이나 활성 수준을 측정하여 정상인 유래 샘플과 비교하는 것에 의해 뇌성마비와 같은 뇌신경계 질환의 발병 또는 진행 여부를 진단할 수 있다. 그러므로, PCNT 단백질은 뇌신경계 질환, 예를 들어 뇌성마비의 진단 마커일 수 있다.
용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 따라서, 상기 "뇌신경계 질환의 진단"이란 뇌신경계 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하거나 발병의 위험을 예측하는 것을 의미할 수 있다.
용어, "진단 마커(diagnosis marker)"는 상기 뇌신경계 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성을 진단할 수 있는 물질을 의미할 수 있다.
상기 단백질을 측정하는 제제는 상기 PCNT 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 PCNT 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.
공지된 아미노산 서열을 갖는 PCNT 단백질로부터 이에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 것은 통상의 기술자가 공지된 방법을 이용하여 용이하게 수행할 수 있다. PCNT 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체는 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 재조합 항체를 포함할 수 있고, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 갖는 완전한 형태 외에도, 적어도 항원 결합 기능을 보유하는 기능성 단편인 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함할 수 있다.
또한, 통상의 기술자는 공지된 PCNT 유전자의 서열로부터 특정 영역을 특이적으로 증폭하거나 인식하는 프라이머 또는 프로브를 설계할 수 있다.
용어, "프라이머"란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈(polymerase) 또는 역전사 효소(reverse transcriptase)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 3인산(nucleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 따라서, PCNT 유전자의 뉴클레오티드 서열 부위의 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 뇌신경계 질환을 진단할 수 있다.
용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링(labeling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 따라서, PCNT 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 뇌신경계 질환을 진단할 수 있다.
상기 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트(phospharamidite) 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한핵산 서열은 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.
상기 키트는 분석 방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성 성분을 더 포함할 수 있다. 분석 방법이 RT-PCR인 경우, 상기 키트는 PCNT 단백질에 특이적인 프라이머 세트 외에, 필요한 용기, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTP), PCR용 DNA 폴리머라아제 및 역전사 효소 등을 더 포함할 수 있다. 또한, 분석 방법이 ELISA인 경우, 결합된 항체 검출용 시약, 예를 들면, 2차 항체, 발색단, 효소 및 그 기질을 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 시료의 PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 발현량 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현량 또는 활성 수준을 정상 개체로부터 분리된 대조군 시료에서 측정된 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 뇌신경계 질환 진단에 필요한 정보를 분석하는 방법을 제공한다.
PCNT 단백질 및 뇌신경계 질환은 상술한 바와 같다.
상기 방법은 개체로부터 분리된 시료의 PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 발현량 또는 활성 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
용어, "개체"란 뇌신경계 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하거나 발병 위험도를 예측하고자 하는 개체를 의미한다. 상기 개체는 뇌신경계 질환이 발병할 수 있는 동물이라면 그 종류를 한정하지 않으나, 구체적으로 포유동물일 수 있고, 예를 들어 인간(Homo sapiens)일 수 있다.
상기 시료는 개체의 체외로 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에서, 상기 시료는 혈장일 수 있다.
상기 PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 발현량을 측정하는 단계는 PCNT 유전자의 mRNA 또는 PCNT 단백질의 양을 측정하는 것에 의해 수행될 수 있다.
상기 PCNT 단백질의 발현량, 즉 mRNA 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던블랏팅(Northern blotting), DNA칩 등의 방법에 의해 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 PCNT 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계는 웨스턴블랏팅, 자석비드-항체면역침강법, ELISA, 질량분석기, 방사선 면역분석법, 면역침전법 등의 방법에 의해 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법은 시료에서 측정된 발현량 또는 활성 수준을 정상 개체로부터 분리된 대조군 시료에서 측정된 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 시료에서의 PCNT 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상 개체로부터 분리된 대조군 시료의 수준보다 더 낮으면 상기 시료는 뇌신경계 질환이 발병하거나 또는 진행될 확률이 높은 것으로 판단할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 상기 측정된 발현량 또는 활성 수준이 상기 대조군 시료에서 측정된 발현량 또는 활성 수준보다 낮은 경우 뇌신경계 질환이 있는 것으로 판단하는 것을 포함할 수 있다.
다른 양상은 인 비트로에서, PCNT 단백질을 발현하는 세포와 시험 물질을 접촉시키는 단계; 상기 세포에서 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성을 대조군에서 측정된 발현량 또는 활성과 비교하여 대조군에 비해 발현량 또는 활성이 증가되게 하는 시험 물질을 뇌신경계 질환 치료제 후보물질로 선택하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
PCNT 단백질 및 뇌신경계 질환은 상술한 바와 같다.
PCNT 단백질은 제대혈 세포 치료를 시술받은 뇌성마비 환자에서 시술받기 전 대비 높은 발현 수준을 보임을 확인하였고, 이에 의한 뇌성마비의 호전 효과를 확인하였다. 따라서, PCNT 단백질의 발현이나 활성을 특이적으로 증가시키는 물질은 뇌성마비와 같은 뇌신경계 질환의 치료 효과를 발휘할 수 있다. 이와 같은 효과는 PCNT 단백질 또는 그 유전자가 뇌성마비와 같은 뇌신경계 질환 치료의 표적이라는 것을 나타낸다.
상기 방법은 인 비트로(in vitro)에서, PCNT 단백질을 발현하는 세포와 시험 물질을 접촉시키는 단계를 포함한다.
상기 PCNT 단백질을 발현하는 세포는, 예를 들어 혈액 세포, 뇌 세포 등일 수 있으나, 그 종류를 제한하지 않는다.
상기 시험 물질과의 접촉은 시험 물질의 형질감염, 형질전환 또는 주입에 의해 수행될 수 있다.
상기 시험 물질과의 접촉은 상기 세포의 성장을 유지할 수 있는 배지 중에서 이루어질 수 있다.
상기 방법은 세포에서 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 측정은 PCNT 단백질 또는 그의 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 또는 PCNT 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 특이적으로 인식하는 프라이머 또는 프로브에 의해 수행될 수 있다.
상기 발현량의 측정은 PCNT 유전자의 mRNA 또는 PCNT 단백질의 양을 측정하는 것에 의해 수행될 수 있다.
상기 mRNA의 양은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RPA), 노던블랏팅, 또는 DNA칩에 의해 측정할 수 있으나, 그 종류를 제한하지 않는다.
상기 단백질의 양은 웨스턴블랏팅, 자석비드-항체면역침강법, ELISA, 또는 질량분석기 방사선 면역분석법, 또는 면역침전법에 의해 측정할 수 있으나, 그 종류를 제한하지 않는다.
상기 방법은 측정된 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성을 대조군에서 측정된 발현량 또는 활성과 비교하여 대조군에 비해 발현량 또는 활성이 증가되게 하는 시험 물질을 뇌신경계 질환 치료제 후보물질로 선택하는 단계를 포함한다.
시험 물질의 처리 후에 PCNT 단백질의 발현 또는 활성 수준이 더 증가된 경우, 상기 시험 물질을 PCNT 단백질의 발현이나 활성을 증가시켜 뇌신경계 질환의 치료를 위해 사용될 수 있는 물질로 선별될 수 있다.
상기 대조군은 상기 시험 물질과 접촉시키는 단계를 제외하고는 동일한 조건에 있는 세포이다.
일 양상에 따른 PCNT를 발현 또는 분비하는 제대혈 또는 제대혈 유래 세포를 포함하는 조성물을 사용하면, 뇌신경계 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, PCNT 단백질은 조기에 뇌신경계 질환을 진단하고 뇌신경계 질환 치료제를 개발하기 위한 표적으로 활용할 수 있다.
도 1A는 제대혈 시술 전(Pre)과 시술 10일 후(Post+10 days)의 혈장 내 단백질의 변화를 확인하기 위한 2차원 겔전기영동 결과로서, 실험 1(4번, 9번 및 10번 환아의 샘플 분석)의 결과이다.
도 1B는 제대혈 시술 전(Pre)과 시술 10일 후(Post+10 days)의 혈장 내 단백질의 변화를 확인하기 위한 2차원 겔전기영동 결과로서, 실험 2(6번, 7번 및 8번 환아의 샘플 분석)의 결과이다.
도 2는 13명의 뇌성마비 환아들의 혈장에 대해 제대혈 시술 전(Pre)과 후(Post)의 PCNT의 발현을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 3은 도 2에 나타난 모든 환아들의 결과를 합산하여 제대혈 시술 전과 후의 PCNT 발현량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 뇌성마비 유발 쥐 모델에서 제대혈 단핵구(UCB) 투여 후 PCNT의 발현량을 각각 4번 반복하여 확인한 결과를 나타낸 도이다. 비교군으로 EPO를 투여한 모델을 사용하였다.
도 5는 뇌성마비를 유발하지 않은 샴(Sham) 모델에 제대혈을 투여하지 않았을 때를 기준으로 하여 도 4의 PCNT 발현 변화량을 %로 환산하여 나타낸 그래프이다.
도 6A는 제대혈(UCB) 혈장, 정상인 혈장, 뇌성마비 환아 혈장 샘플에서 PCNT의 발현량을 나타낸 그림이다.
도 6B는 제대혈 1번 샘플을 기준으로 하여, 제대혈(UCB) 혈장, 정상인 혈장, 뇌성마비 환아 혈장 샘플에서 PCNT의 상대적인 발현량(%)을 나타낸 그래프이다.
도 7은 제대혈 내에 존재하는 성분인 혈청(Serum), 혈장(Plasma), 단핵구(Monocyte), 호중구(Neutrophil), B-림프구(B-lymphocyte), T-림프구(Lymphocyte), CD4 T 세포, CD8 T 세포, NK 세포, 말초혈액 단핵구 세포(Peripheral blood mononuclear cell), 혈소판(Platelet), 림프절(Lymph node), 편도선(Tonsil), 골수 기질적 세포(Bone marrow stromal cell), 및 골수 중간엽 줄기세포(Bone marrow mesenchymal stem cell) 각각의 PCNT 발현량(Log10, ppm)을 나타낸 그래프이다.
도 8은 5번, 11번, 및 13번 뇌성마비 환아에 대한 제대혈 시술 전(GMFCS_pre) 및 시술 후(GMFCS_post)의 GMFCS 평가 결과(GMFCS total (%))를 나타낸 그래프이다.
도 9는 5번, 11번, 및 13번 뇌성마비 환아에 대한 제대혈 시술 전(BSID_Motor_pre) 및 시술 후(BSID_Motor_post)의 베일리 영아 발달검사 행동발달 영역 평가 결과(BSID II motor)를 나타낸 그래프이다.
도 10은 5번, 11번, 및 13번 뇌성마비 환아에 대한 제대혈 시술 전(BSID_Mental_pre) 및 시술 후(BSID_Mental_post)의 베일리 영아 발달검사 정신발달 영역 평가 결과(BSID II mental)를 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 제대혈 시술 후 발현 수준이 변화된 단백질 스크리닝
제대혈 세포 치료를 받은 뇌성마비 환아의 시술 전과 후의 혈액을 채취하여 혈장 내 존재하는 특정 단백질의 변화를 관찰하였다. 제대혈 세포 치료에서, 제대혈은 적혈구와 혈장을 제거하고 백혈구 농축액을 만들어 냉동 보관된 것을 사용하였다. 냉동 보관된 백혈구 농축액은 시술 전에 37℃ 워터 배스(water bath)에서 해동 후, 이를 10% 덱스트란(dextran)-40 (100g 덱스트란-40/1ℓ 물) 및 5% 알부민 (50g 알부민/1ℓ 물)을 동량으로 희석한 용액으로 세척하였다. 세척을 마친 백혈구 농축액은 10% 덱스트란-40 및 5% 알부민을 동량으로 희석한 혼합액 10 ml에 최소 총 유핵세포수가 3 x 107/kg이 되도록 현탁한 후, 정맥 내 주사로 15 ml 내지 30 ml 사이의 투여량을 투여하였다.
1-1. 스크리닝에 사용할 혈장 샘플의 준비
표 1은 혈장 내 단백질을 스크리닝하기 위해 선별된 뇌성마비 환아들의 진단명 및 제대혈 시술 여부를 나타낸 표이다. 표 1에 나타난 뇌성마비 환아들의 혈액 1~3cc 정도를 EDTA-튜브에 채취하여 2000rpm의 속도로 원심분리를 수행하였다. 이때 혈액의 층이 맨 아래쪽에 적혈구, 가운데 층에 단핵구, 맨 윗층에 혈장으로 나누어지게 되며, 이렇게 나누어진 혈액에서 혈장만을 분리하여 -80℃ 초저온 냉동고에 냉동 보관하였다.
No. 성별 나이 (개월) 동종이계 제대혈 치료 자가 제대혈 치료 시클로스포린 (cyclosporin) 진단
1 남성 123 O 발달 지연(Delayed milestone)
2 남성 42 O 미토콘드리아 근병증, NEC
3 남성 20 O O 뇌성마비
4 남성 137 O O 뇌성마비
5 여성 70 O O 발달 지연(Delayed milestone)
6 남성 13 O 뇌성마비
7 여성 42 O O 뇌성마비
8 여성 20 O O 뇌성마비
9 여성 81 O O 뇌성마비
10 여성 141 O O 발달 지연(Delayed milestone)
1-2. 제대혈 세포 치료 전후 혈장 내 단백질의 스크리닝
상기 실시예 1-1에서 분리한 혈장 내에 존재하고 있는 특정 단백질의 변화를 확인하기 위하여 2차원 겔전기영동(2-Dimensional gel Electrophoresis: 2DE) 기법을 사용하였다. 준비한 샘플에 대한 2DE 기법, 이미지 분석 및 정성 분석은 연세대학교 내 연세프로테옴연구원을 통해 진행하였다.
표 1의 10명의 뇌성마비 환아 중 제대혈 시술을 받은 후 호전을 보인 6명 즉, 4번, 6번, 7번, 8번, 9번 및 10번 환아를 선별하여 실험을 진행하였다.
표 2는 제대혈 시술을 받은 후 호전을 보인 6명의 환아의 혈장 내 단백질의 스크리닝을 위한 실험 샘플에 대한 정보이다. 실험 1에서는 제대혈 치료 전 혈장으로 4번, 9번 및 10번 환아의 혈장을 섞은 혼합물을 사용하였고, 제대혈 치료 10일 후 혈장으로 4번 환아의 혈장을 샘플로 사용하여 분석하였다. 실험 2에서는 제대혈 치료 전 혈장으로 6번, 7번 및 8번 환아의 혈장을 섞은 혼합물을 사용하였고, 제대혈 치료 10일 후 혈장으로 6번 환아의 혈장을 샘플로 사용하여 분석하였다.
실험 1 실험 2
샘플 제대혈 치료 전 제대혈 치료 10일 후 제대혈 치료 전 제대혈 치료 10일 후
4번, 9번 및 10번 환아의 혈장 혼합물 4번 환아의 혈장 6번, 7번 및 8번 환아의 혈장 혼합물 6번 환아의 혈장
도 1A는 제대혈 시술 전(Pre)과 시술 10일 후(Post+10 days)의 혈장 내 단백질의 변화를 확인하기 위한 2차원 겔전기영동 결과로서, 실험 1(4번, 9번 및 10번 환아의 샘플 분석)의 결과이다. 도 1B는 제대혈 시술 전(Pre)과 시술 10일 후(Post+10 days)의 혈장 내 단백질의 변화를 확인하기 위한 2차원 겔전기영동 결과로서, 실험 2(6번, 7번 및 8번 환아의 샘플 분석)의 결과이다. 가로축은 pH, 세로축은 단백질 크기를 나타낸다.
표 3은 2DE 결과에 따라 각각의 단백질을 정성분석 한 결과, 제대혈 시술 후 호전을 보인 환아들의 혈장 내에서 3배 이상 증가하는 것으로 보이는 단백질을 나타낸 것이다. 알파-2-매크로글로불린 이소폼의 경우 2개의 점에서 나타나는 것으로 보아 일반적으로 혈장 내에 존재하는 단백질로 실험 진행 시 샘플에서 완벽하게 걸러지지 않은 것으로 보인다. 626점의 결과로 나온 단백질은 피브리노겐에 결합하는 단편(fragment)으로 보여지며, 이것 또한 혈장 내 피브리노겐의 제거가 이루어 지지 않아 나타난 결과로 보여진다. 따라서, 페리센트린(Pericentrin: PCNT)이 제대혈 시술 후 혈장 내에서 증가하는 특정 단백질임을 확인하였다.
단백질 수준 점 No. 단백질명 (gray p>0.05) 점수* gi No. 분자량(Mw)
증가 62 알파-2-매크로글로불린 이소폼 X1 72 gi|578822814 168914
84 페리센트린 이소폼 X2 102 gi|530419252 368506
92 알파-2-매크로글로불린 이소폼 X1 168 gi|578822814 168914
626 3.4 옹스트롬 해상도에서 인간 C3c와 결합된 포도상구균 보체억제제 G의 잘려진 형태의 구조, 체인 E 106 gi|358009626 23690
* 점수는 -10*Log(P)이고, 여기에서 P는 관찰된 매치가 랜덤 이벤트인 확률이다. 단백질 점수가 72 이상인 경우 유의성이 있다 (p<0.05).
실시예 2: 제대혈 시술을 받은 뇌성마비 환아에서 PCNT의 발현 확인
2-1. 뇌성마비 환아들의 혈장 샘플 준비
표 4는 임상 뇌성마비 환아들의 명단, 시술한 제대혈의 종류 및 에리트로포이에틴(Erythropoietin: EPO)의 주입 여부에 대한 정보를 나타낸 표이다. 동종이계 제대혈은 형제나 가족의 제대혈을 사용하였다. 표 4에 나타낸 총 13명의 뇌성마비 환아들의 혈액을 분리하여 혈장만을 채취하였다. 채취한 혈장은 PBS (Phosphate-buffered saline)로 5:1로 희석하여 브래드포드법 (Bradford assay)으로 정량하였다. 정량한 단백질은 30μg을 샘플 버퍼에 섞어 7분 동안 끓인 뒤 스핀 다운(spin down)하여 준비하였다.
No. 성별 진단명 자가 제대혈 치료 (Auto UCB) 동종이계 제대혈 치료 (Allo UCB) 에리트로포이에틴 (EPO) 주입
1 여성 뇌성마비 - O -
2 남성 뇌성마비 - O -
3 여성 뇌성마비 - O -
4 남성 뇌성마비 - O -
5 남성 뇌성마비 - O -
6 여성 뇌성마비 - O O
7 여성 뇌성마비 - O O
8 남성 뇌성마비 O - O
9 남성 뇌성마비 O - O
10 남성 뇌성마비 O - O
11 남성 뇌성마비 O - O
12 남성 뇌성마비 O - O
13 남성 뇌성마비 O - O
2-2. 제대혈 시술 후 PCNT 단백질의 발현 확인
제대혈 시술 후 PCNT 단백질의 발현을 웨스턴 블랏(Western blot) 기법으로 확인하였다.
먼저, 상기 실시예 2-1에서 준비한 혈장 샘플을 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)에 제대혈 시술 전과 후의 순서대로 분주하여 내려주었다. 겔에 내려진 단백질을 니트로셀룰로스(nitrocellulose: NC) 멤브레인으로 옮겨 PCNT 항체와 16시간 이상 반응시킨 후, 제대혈 시술 전과 후의 PCNT 발현량을 밴드로 확인하였다.
도 2는 13명의 뇌성마비 환아들의 혈장에 대해 제대혈 시술 전(Pre)과 후(Post)의 PCNT의 발현을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 각 샘플들의 시술 전과 후의 날짜 차이가 있지만, 제대혈의 종류에 차이 없이 전반적으로 제대혈 시술 후 PCNT의 양이 늘어나는 것을 확인할 수 있었다.
도 3은 도 2에 나타난 모든 환아들의 결과를 합산하여 제대혈 시술 전과 후의 PCNT 발현량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 제대혈 시술 후 3일 또는 10일이 지났을 때 PCNT의 발현량이 증가하는 것을 확인하였으며, 결과에 유의성이 있었다.
따라서, 뇌성마비 환아에게 제대혈 시술을 하였을 때, PCNT의 발현량이 크게 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 뇌신경계 질환 동물 모델에서 PCNT의 변화 확인
3-1. 뇌성마비 유발 쥐 모델의 제작
생후 7일차 되는 ICR 쥐를 이용하여 뇌성마비 유발 쥐 모델인 저효소 허혈(Hypoxic ischemia: HI) 모델을 제작하였다. 생후 7일차 되는 ICR 쥐의 우측 총경동맥을 5-0 블루 나이론(blue nylon)을 이용하여 묶은 후 O2 8%, N2 92%로 유지되는 밀폐된 특수 용기에 넣고 37℃로 유지시킨 뒤 1시간 동안 저산소-뇌허혈을 유도하였다. HI 모델을 제작한 후 6일 뒤 뇌 조직의 손상 정도를 눈으로 확인하여 50% 이상 손상된 모델은 제외시켰다.
3-2. 뇌성마비 유발 쥐 모델에 제대혈의 투여
제대혈은 차병원 제대혈은행 아이코드(icord)에서 기증된 연구용 제대혈을 사용하였다. 연구용 제대혈은 2200rpm에서 원심분리하여 적혈구, 단핵구층, 혈장으로 분리한 뒤 혈장은 따로 보관하고 피콜(Ficoll, Pharmacia Corp., USA)을 이용하여 단핵구층만을 분리하였다. 구체적으로, 피콜 위에 혈장을 제외한 적혈구와 단핵구층을 PBS로 희석하여 올린 뒤, 2200rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 피콜의 원리에 의해 피콜보다 무거운 적혈구는 밑으로 가라앉고 피콜 바로 위쪽에 단핵구층이 분리되게 된다. 분리 된 단핵구층만을 따로 옮긴 뒤 4 X 105 cells/10g 농도를 100μl 살린(saline)에 풀어주었다. 준비한 제대혈 단핵구는 뇌성마비 유발 쥐 모델을 제작한 뒤 7일차 되는 모델에 무작위로 복강 투여하였다.
3-3. 뇌 조직 내에서의 PCNT 발현 변화 확인
제대혈 단핵구를 투여하고 일주일이 지난 뇌성마비 유발 쥐 모델을 혈액을 제거하여 죽인 뒤 뇌조직을 적출하였다. 적출한 뇌조직을 용해 버퍼(Lysis buffer)를 사용하여 파쇄한 뒤 원심분리하여 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질 30μg에 대하여 웨스턴 블랏(Western blot) 기법으로 PCNT의 변화한 발현량을 확인하였다.
도 4는 뇌성마비 유발 쥐 모델에서 제대혈 단핵구(UCB) 투여 후 PCNT의 발현량을 각각 4번 반복하여 확인한 결과를 나타낸 도이다. 비교군으로 EPO를 투여한 모델을 사용하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 제대혈 투여를 받은 뇌성마비 유발 쥐 모델에서 PCNT의 발현량이 증가하는 것을 확인하였고, 비교군으로 EPO를 투여한 모델과 비교하였을 때에도 제대혈에 의한 PCNT의 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
도 5는 뇌성마비를 유발하지 않은 샴(Sham) 모델에 제대혈을 투여하지 않았을 때를 기준으로 하여 도 4의 PCNT 발현 변화량을 %로 환산하여 나타낸 그래프이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 제대혈을 투여하지 않은 정상 쥐인 샴 모델과 비교하였을 때에도 뇌성마비 유발 쥐 모델에 제대혈을 투여하였을 때 PCNT의 발현량이 훨씬 많았다.
실시예 4: 제대혈, 정상인 및 뇌성마비 환아의 혈장 내에 존재하는 PCNT 양의 차이 검증
4-1. 제대혈, 정상인 혈액 및 뇌성마비 환아 혈액 내에서의 혈장 분리
제대혈은 아이코드(icord)에서 기증받은 연구용 제대혈을 원심분리하여 혈장만을 분리하여 -80℃ 초저온 냉동고에 냉동하여 보관하였다. 정상인의 혈액은 2~30대 여성과 남성의 혈액 3cc를 원심분리하여 혈장만을 분리하였고, 뇌성마비 환아의 혈액은 입원 중인 뇌성마비 환아의 제대혈 시술 전 혈액을 원심분리하여 혈장만을 분리하였으며, 두 혈장은 냉동 보관하였다. 표 5는 제대혈 내에 함유하고 있는 PCNT의 발현을 확인하기 위하여, 비교군으로 선정한 정상인과 뇌성마비 환아의 정보를 나타낸 표이다.
성별 나이
정상인 1 여성 28세
정상인 2 남성 31세
뇌성마비 환아 1 남성 2세
뇌성마비 환아 2 남성 3세
4-2. 제대혈, 정상인 혈장 및 뇌성마비 환아 혈장 내에 포함된 PCNT 발현량 확인
상기 실시예 4-1에서 보관하였던 혈장을 얼음 위에서 천천히 녹인 뒤, PBS로 5:1로 희석하였다. 희석된 샘플을 브래드포드(BradFord) 시약을 이용하여 정량하여 30μg에 대해 웨스턴 블랏(Western blot) 기법 실험을 진행하였다.
도 6A는 제대혈(UCB) 혈장, 정상인 혈장, 뇌성마비 환아 혈장 샘플에서 PCNT의 발현량을 나타낸 그림이다. 도 6B는 제대혈 1번 샘플을 기준으로 하여, 제대혈(UCB) 혈장, 정상인 혈장, 뇌성마비 환아 혈장 샘플에서 PCNT의 상대적인 발현량(%)을 나타낸 그래프이다.
도 6A 및 6B에 나타낸 바와 같이, 뇌성마비 환아의 혈장에는 PCNT의 발현량이 현저하게 적게 나타났으며, 그 다음으로 정상인이었고, PCNT를 가장 많이 포함하고 있는 것이 제대혈로 나타났다. 혈장 내 기준이 되는 단백질이 없으므로 폰소(Ponceau)로 염색한 밴드를 기준으로 잡고 PCNT의 발현량을 %로 환산하였을 때에도, 제대혈 내에 PCNT가 가장 많이 발현되고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: PCNT를 발현하는 제대혈 내 세포 종류의 확인
제대혈은 탯줄의 조직에 있는 혈액으로, 조혈줄기세포(조혈모세포)가 다량 함유되어 있다. 조혈모세포는 혈액의 주요 구성성분으로 골수에서 생성되는 단핵구, 대식세포, 혈소판 세포들과 T-세포, B-세포, NK 세포 등의 림프계 세포로 분화할 수 있는 잠재적인 세포이다. 따라서, 제대혈 내에 존재하는 세포 중 어떠한 세포가 PCNT를 발현하는지 그 종류를 확인하였다. PCNT를 발현하는 세포에 대한 정보는 GeneCards 웹사이트 (http://www.genecards.org/)에서 확인하였다.
도 7은 제대혈 내에 존재하는 성분인 혈청(Serum), 혈장(Plasma), 단핵구(Monocyte), 호중구(Neutrophil), B-림프구(B-lymphocyte), T-림프구(Lymphocyte), CD4 T 세포, CD8 T 세포, NK 세포, 말초혈액 단핵구 세포(Peripheral blood mononuclear cell: PBMC), 혈소판(Platelet), 림프절(Lymph node), 편도선(Tonsil), 골수 기질적 세포(Bone marrow stromal cell), 및 골수 중간엽 줄기세포(Bone marrow mesenchymal stem cell) 각각의 PCNT 발현량(Log10, ppm)을 나타낸 그래프이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 제대혈 내에 존재하는 세포 중 단핵구, B-림프구, CD4 T 세포, CD8 T 세포, NK 세포, 말초혈액 단핵구 세포, 혈소판, 및 림프절에서 PCNT가 분비되었으며, 이 중 말초혈액 단핵구 세포(PBMC)가 가장 많은 PCNT 발현을 나타냄을 확인하였다.
실시예 6: 제대혈의 뇌신경계 질환 치료 효과 확인
제대혈 시술이 실제로 뇌신경계 환자의 뇌신경계 질환을 치료하는 효과가 있는지 확인하기 위하여, 뇌성마비 환아에게 자가 제대혈 시술을 진행하였다.
제대혈 세포 치료에서, 제대혈은 적혈구와 혈장을 제거하고 백혈구 농축액을 만들어 냉동 보관된 것을 사용하였다. 냉동 보관된 백혈구 농축액은 시술 전에 37℃ 워터 배스(water bath)에서 해동 후, 이를 10% 덱스트란(dextran)-40 (100g 덱스트란-40/1ℓ 물) 및 5% 알부민 (50g 알부민/1ℓ 물)을 동량으로 희석한 용액으로 세척하였다. 세척을 마친 백혈구 농축액은 10% 덱스트란-40 및 5% 알부민을 동량으로 희석한 혼합액 10 ml에 최소 총 유핵세포수가 3 x 107/kg이 되도록 현탁한 후, 정맥 내 주사로 15 ml 내지 30 ml 사이의 투여량을 투여하였다.
표 6은 제대혈의 치료 효과를 확인하기 위해 선별된 13명의 뇌성마비 환아들의 성별, 진단명 및 제대혈 치료 후의 기능 평가 결과를 나타낸 표이다.
표 6에 나타낸 바와 같이, 13명의 뇌성마비 환자에게서 제대혈 시술 후 전반적인 기능의 향상이 나타남을 확인하였다.
No. 성별 진단명 자가 제대혈 치료 (Auto UCB) 후 기능 평가
1 여 뇌성마비 시술 후 양측 하지 근 긴장도 저하 및 손 뻗기 가능해짐.
2 남 뇌성마비 시술 후 목의 정중선 유지 가능해지고 전반적 경직 감소 관찰 됨.
3 여 뇌성마비 시술 후 목의 실조성 움직임 감소 하였고, 몸통 근력 향상되어 엎으린 자세에서 양손 사용 관찰됨.
4 남 뇌성마비 시술 후 전신의 실조성 움직임 감소 보였고, 상지의 선택적 움직임 호전 보임.
5 남 뇌성마비 시술 후 실조성 움직임 감소 하였고, 약간의 도움 주면 뒤집기 가능 해짐.
6 여 뇌성마비 시술 전 선자세 유지 어려운 수준이었으나, 시술 후 퇴원 시 붙잡고 서기 동작 가능해짐.
7 여 뇌성마비 시술 전보다 보행 시 균형도와 자세 호전 되었고, 보행 거리 증가 하였음.
8 남 뇌성마비 시술 이후 사물에 대한 관심도 증가 및 퍼즐 쌓기 하는 것 관찰됨.
9 남 뇌성마비 시술 후 약간의 도움 주면 뒤집기 가능해 지고, 양팔 지지한 상태로 10초간 앉은 자세 유지 가능해짐.
10 남 뇌성마비 시술 후 바 잡고 서서 유지 가능해 지고 양손 잡고 걷기 호전됨.
11 남 뇌성마비 시술 후 보조기 착용한 상태에서 양손 잡고 걷기 가능 해짐.
12 남 뇌성마비 시술 후 계단 오르기 시술 전 보다 호전 양상 보임.
13 남 뇌성마비 시술 후 몸통 균형 호전되어 앉은 자세 유지시간 길어 졌음.
또한, 제대혈 시술 2~4개월 후에 5번, 11번, 및 13번 환자에 대해 대동작기능분류시스템(The Gross Motor Function Classification System: GMFCS), 베일리 영아 발달검사 행동발달 영역(Bayley Scales of Infant Development (BSID) II motor) 및 베일리 영아 발달검사 정신발달 영역(BSID II mental)에 따른 평가를 수행하였다.
도 8은 5번, 11번, 및 13번 뇌성마비 환아에 대한 제대혈 시술 전(GMFCS_pre) 및 시술 후(GMFCS_post)의 GMFCS 평가 결과(GMFCS total (%))를 나타낸 그래프이다.
도 9는 5번, 11번, 및 13번 뇌성마비 환아에 대한 제대혈 시술 전(BSID_Motor_pre) 및 시술 후(BSID_Motor_post)의 베일리 영아 발달검사 행동발달 영역 평가 결과(BSID II motor)를 나타낸 그래프이다.
도 10은 5번, 11번, 및 13번 뇌성마비 환아에 대한 제대혈 시술 전(BSID_Mental_pre) 및 시술 후(BSID_Mental_post)의 베일리 영아 발달검사 정신발달 영역 평가 결과(BSID II mental)를 나타낸 그래프이다.
도 8 내지 10에 나타낸 바와 같이, 제대혈 시술 전후 뇌성마비 환아에 대해 GMFCS, BSID II motor 및 BSID II mental 검사를 수행한 결과, 제대혈 시술 후 호전 양상이 관찰되었다.
뇌신경계 질환의 치료 또는 진단을 위한 표적 단백질로서 PCNT 단백질을 확인하였는 바, PCNT 단백질은 초기에 뇌신경계 질환을 진단하고 뇌신경계 질환 치료제를 개발하기 위한 표적으로 활용할 수 있다.
따라서, PCNT를 발현 또는 분비하는 제대혈 또는 제대혈 유래 세포를 포함하는 조성물을 사용하면, 뇌신경계 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
또한, PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물 또는 키트를 사용하면, 뇌신경계 질환을 진단할 수 있다.
또한, PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 발현량 또는 활성 수준을 측정함으로써 뇌신경계 질환 진단에 필요한 정보를 분석할 수 있다.
또한, PCNT 단백질을 발현하는 세포와 시험 물질을 접촉시킨 후 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성을 측정함으로써 뇌신경계 질환 치료제 후보물질을 스크리닝할 수 있다.

Claims (20)

  1. 페리센트린 (Pericentrin: PCNT)을 발현 또는 분비하는 제대혈 또는 제대혈 유래 세포를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 PCNT는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인 약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 정상에 비해 PCNT의 발현이 감소된 뇌신경계 질환을 예방 또는 치료하기 위한 것인 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌신경계 질환은 뇌성마비, 뇌손상, 외상성 뇌손상, 허혈성 뇌손상, 뇌진탕, 뇌타박상, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 중풍, 치매, 루게릭병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병, 근위축성축삭경화증, 원발성축삭경화증, 퇴행성 운동 실조증, 다발성경화증, 신경계 기능장애, 기억력 감퇴, 간질, 뇌염, 프리온병, 및 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 약학적 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 제대혈은 자가 제대혈 또는 동종이계 제대혈인 것인 약학적 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 제대혈 유래 세포는 조혈모세포인 것인 약학적 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 제대혈 유래 세포는 단핵구, B-림프구, CD4 T 세포, CD8 T 세포, NK 세포, 말초혈액 단핵구 세포, 혈소판, 및 림프절로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 약학적 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 에리트로포이에틴 (Erythropoietin: EPO)을 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
  9. PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 단백질을 측정하는 제제는 상기 PCNT 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체이거나, 또는 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 PCNT 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인 조성물.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 뇌신경계 질환은 뇌성마비, 뇌손상, 외상성 뇌손상, 허혈성 뇌손상, 뇌진탕, 뇌타박상, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 중풍, 치매, 루게릭병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병, 근위축성축삭경화증, 원발성축삭경화증, 퇴행성 운동 실조증, 다발성경화증, 신경계 기능장애, 기억력 감퇴, 간질, 뇌염, 프리온병, 및 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  12. PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 키트.
  13. 개체로부터 분리된 시료의 PCNT 단백질 또는 그의 유전자의 발현량 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 발현량 또는 활성 수준을 정상 개체로부터 분리된 대조군 시료에서 측정된 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 뇌신경계 질환 진단에 필요한 정보를 분석하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 시료는 혈장인 것인, 뇌신경계 질환 진단에 필요한 정보를 분석하는 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 측정된 발현량 또는 활성 수준이 상기 대조군 시료에서 측정된 발현량 또는 활성 수준보다 낮은 경우 뇌신경계 질환이 있는 것으로 판단하는 것을 포함하는, 뇌신경계 질환 진단에 필요한 정보를 분석하는 방법.
  16. 청구항 13에 있어서, 상기 뇌신경계 질환은 뇌성마비, 뇌손상, 외상성 뇌손상, 허혈성 뇌손상, 뇌진탕, 뇌타박상, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 중풍, 치매, 루게릭병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병, 근위축성축삭경화증, 원발성축삭경화증, 퇴행성 운동 실조증, 다발성경화증, 신경계 기능장애, 기억력 감퇴, 간질, 뇌염, 프리온병, 및 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 뇌신경계 질환 진단에 필요한 정보를 분석하는 방법.
  17. 인 비트로에서, PCNT 단백질을 발현하는 세포와 시험 물질을 접촉시키는 단계;
    상기 세포에서 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 PCNT 단백질의 발현량 또는 활성을 대조군에서 측정된 발현량 또는 활성과 비교하여 대조군에 비해 발현량 또는 활성이 증가되게 하는 시험 물질을 뇌신경계 질환 치료제 후보물질로 선택하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 접촉은 상기 세포의 성장을 유지할 수 있는 배지 중에서 이루어지는 것인, 뇌신경계 질환 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 발현량의 측정은 PCNT 유전자의 mRNA 또는 PCNT 단백질의 양을 측정하는 것에 의해 수행되는 것인, 뇌신경계 질환 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법.
  20. 청구항 17에 있어서, 상기 뇌신경계 질환은 뇌성마비, 뇌손상, 외상성 뇌손상, 허혈성 뇌손상, 뇌진탕, 뇌타박상, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 중풍, 치매, 루게릭병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병, 근위축성축삭경화증, 원발성축삭경화증, 퇴행성 운동 실조증, 다발성경화증, 신경계 기능장애, 기억력 감퇴, 간질, 뇌염, 프리온병, 및 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 뇌신경계 질환 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법.
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