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WO2018100143A1 - Facteur de croissance placentaire pour le traitement des troubles causes par l'alcoolisation foetale (tcaf) - Google Patents

Facteur de croissance placentaire pour le traitement des troubles causes par l'alcoolisation foetale (tcaf) Download PDF

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WO2018100143A1
WO2018100143A1 PCT/EP2017/081159 EP2017081159W WO2018100143A1 WO 2018100143 A1 WO2018100143 A1 WO 2018100143A1 EP 2017081159 W EP2017081159 W EP 2017081159W WO 2018100143 A1 WO2018100143 A1 WO 2018100143A1
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WO
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pigf
alcohol
utero
fasd
subject
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PCT/EP2017/081159
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Inventor
Bruno José GONZALES
Stéphane MARRET
Matthieu Jean Alexandre LECUYER
Annie Laquerriere
Soumeya BEKRI
Céline LESUEUR
Sylvie Marguerite Alberte JEGOU
Pascale Yvonne Joséphine MARCORELLES
Original Assignee
Universite De Rouen Normandie
Centre Hospitalier Universitaire De Rouen
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • Alcohol is a teratogen responsible for physical and behavioral damage. In humans, prenatal exposure to alcohol can lead to alterations in brain development. Thus, alcohol consumption during pregnancy (fetal alcoholization) is the leading cause of disability and in particular mental retardation of non-genetic origin in the world and also in France.
  • the damage varies according to the period in which the fetus was exposed, blood alcohol levels, genetic and environmental factors, and the mode of consumption (chronic, binge drinking).
  • Fetal Alcohol Syndrome is the most extreme and disabling manifestation of fetal alcohol spectrum disorder (FASD). Its incidence is estimated in France at 1, 5% of births. FAS associates physical abnormalities such as hypotrophy (growth retardation), craniofacial dysmorphism and neurobehavioral abnormalities resulting in cognitive function disorders (attention deficit, motor skills, learning disorders, memorization). Neurological sequelae are also present in FASD children whose incidence is estimated in France at nearly 1% of births.
  • Cerebral angiogenesis is concomitant with the process of neurogenesis and contributes to good brain development by providing nerve cells with nutrients, oxygen and trophic factors.
  • cerebral angiogenesis is a prerequisite for the proper development of the neural network.
  • a direct impact of cerebral vessels on the migration process of neuronal populations and oligodendrocytes has recently been demonstrated. It has also been established previously by the inventors that alcohol in utero interferes with cerebral angiogenesis and that this effect contributes to brain abnormalities of alcoholization.
  • Targeting vascular abnormalities of in utero exposure to alcohol therefore appears as a therapeutic strategy to reduce the neurodevelopmental effects of alcohol and to correct impaired brain functions.
  • the current management of FASD children aims, by stimulating motor and cognitive functions, to reduce language, learning and attention disorders that are diagnosed late, often between 4 and 5 years of age. The scholarship. The results obtained by such monitoring are limited and the disorders
  • placental determination of placental growth factor makes it possible to identify, among children exposed in utero to alcohol, those who have suffered brain damage. In particular, these children show a decrease in placental PIGF levels which corresponds to impaired cerebral angiogenesis.
  • placental PIGF supplementation corrects the action of alcohol on morphometric and anatomical indicators indicative of fetal growth such as the size body and head at birth.
  • the inventors have demonstrated that increasing the amount of PIGF can greatly reduce the deleterious effect of alcohol on the cerebral vasculature of the fetus. In particular, it makes it possible to improve cerebral angiogenesis and to correct the disorganization of microvessels induced by alcohol.
  • PIGF Fetal Growth Factor
  • the present invention thus opens a new way in the prevention and / or treatment of FASD and in particular, in the prevention and / or treatment of neurological disorders (such as hyperactivity, loss of attention, depression, anxiety, emotional disturbances, excessive irritability, behavioral problems, etc.) due to abnormal neuronal and oligodendrocytic migraine-mediated migrations or growth disorders (hypotrophy) following alcohol consumption during the pregnancy.
  • the present invention thus relates to a placental growth factor (PIGF) for its use in the prevention and / or treatment of fetal alcohol spectrum disorder (FASD) in a subject having been exposed to alcohol. in utero.
  • PIGF placental growth factor
  • PIGF vascular endothelial growth factors
  • VEGF vascular endothelial growth factors
  • PIGF within the meaning of the invention is a 149 amino acid protein highly similar to VEGF-A which is recognized by the same receptor as the latter, VEGF-R1, but which is not recognized by the VEGF receptor. -R2.
  • PIGF is strongly expressed by the placenta, but not by the fetus and in particular by the fetal brain. N-terminal glycosylated PIGF is secreted and functions as a dimer to control angiogenesis.
  • PIGF refers in particular to all 4 isoforms PIGF1-4: PlGF-1 and PlGF-3 are isoforms that do not bind heparin while PlGF-2 and PlGF-4 contain additional domains that allow to fix heparin. Even more preferentially, PIGF is understood to mean a human protein whose sequence is chosen from any of the isoforms identified by Uniprot accession numbers P49763-2 (PlGF-1, the amino acid sequence of which corresponds to SEQ ID No.
  • recombinant PIGF or protein analogs of human PIGF can also be used in the prevention and / or treatment of FASD.
  • the PIGF of the present invention is obtained by using a prokaryotic or eukaryotic recombinant protein production system, in particular by i) culturing a microorganism or transformed eukaryotic cells using a nucleotide sequence coding for the Human PIGF (accession number NCBI of gene 5228, accession number of transcripts NM_002632.5 (SEQ ID NO: 5), NM001207012.1 (SEQ ID NO: 6), NM_001293643.1 (SEQ ID NO: 5) ID NO: 7)) and ii) isolating the protein produced by said microorganism or said eukaryotic cells.
  • This technique is well known to those skilled in the art.
  • the PIGF protein is preferably purified / isolated from cell lysates and / or cell supernatants by which it is expressed and / or secreted. This purification can be done by any means known to those skilled in the art. Many purification techniques are described in Voet D and Voet JG, Protein and Nucleic Acid Purification Techniques.
  • the recombinant protein production systems use nucleic acid vectors comprising nucleic acids encoding the polypeptides to be synthesized, which are introduced into host cells that produce said polypeptides (for more details, refer to "Recombinant DNA Technology I", Editors Aies Prokop, Raskesh K Bajpai, Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 646, 1991).
  • nucleic acid molecule of interest in which a nucleic acid molecule of interest can be inserted in order to introduce and maintain it in a eukaryotic or prokaryotic host cell are known; the choice of an appropriate vector depends on the use envisaged for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of this sequence in extrachromosomal form or integration into the chromosomal material of the host ), as well as the nature of the host cell (for example, plasmids are preferably introduced into bacterial cells, while YACs are preferably used in yeasts).
  • These expression vectors may be plasmids, YACs, cosmids, retroviruses, episomes derived from EBV, and all the vectors that the person skilled in the art may judge appropriate for the expression of said chains.
  • the vectors according to the invention comprise the nucleic acid encoding PIGF, or a similar sequence, as well as the means necessary for its expression.
  • the term "means necessary for the expression of a peptide” means the term peptide being used for any peptide molecule, such as protein, polyprotein, polypeptide, etc. any means which makes it possible to obtain the peptide, such as in particular a promoter, a transcription terminator, an origin of replication and preferably a selection marker.
  • the means necessary for the expression of a peptide are operably linked to the nucleic acid sequence encoding the polypeptide fragment of the invention.
  • operably related is meant a juxtaposition said elements necessary for the expression of the gene encoding the polypeptide fragment of the invention, which are in a relationship such that it allows them to function in an expected manner. For example, there may be additional bases between the promoter and the gene encoding the polypeptide fragment of the invention as long as their functional relationship is preserved.
  • the means necessary for the expression of a peptide can be homologous means, that is to say naturally understood in the genome of the vector used, or else be heterologous, that is to say artificially added to from another vector and / or organism.
  • heterologous promoters include viral promoters such as SV40 promoter (Simian Virus 40), Herpes simplex virus thymidine kinase gene promoter (TK-HSV-1), sarcoma virus LTR of Rous (RSV), the immediate first promoter of cytomegalovirus (CMV) and the major adenoviral major promoter (MLP), as well as any cellular promoter that controls the transcription of genes encoding peptides in higher eukaryotes, such as the promoter of constitutive phosphoglycerate kinase (PGK) gene (Adra et al., Gene Volume 60, Issue 1, 1987, Pages 65-74), the liver specific gene promoter alphal-antitrypsin and FIX, and the SM22 specific promoter smooth muscle (Moessler et al., Development 1996 Aug; 122 (8): 2415-25).
  • viral promoters such as SV40 promoter (Simian Virus 40), Herpes simple
  • the vectors of the invention may also include sequences necessary for targeting the peptides to particular cell compartments.
  • An example of targeting may be targeting to the endoplasmic reticulum obtained using adenovirus E3 leader-type targeting sequences (Ciernik IF, et al., The Journal of Immunology, vol. 162, 1999, pages 3915 -3925).
  • the term "transcription terminator” here designates a sequence of the genome that marks the end of the transcription of a gene or operon, into messenger RNA. The mechanism of transcription termination is different in prokaryotes and eukaryotes.
  • Rho-independent terminator inverted repeat sequence followed by a series of T (uracils on transcribed RNA) or a Rho-dependent terminator ( consisting of a consensus sequence recognized by the Rho protein).
  • Rho-independent terminator inverted repeat sequence followed by a series of T (uracils on transcribed RNA) or a Rho-dependent terminator ( consisting of a consensus sequence recognized by the Rho protein).
  • the term "origin of replication” also called ori
  • ori is a unique DNA sequence for the initiation of replication. It is from this sequence that unidirectional or bidirectional replication begins.
  • the skilled person knows that the structure of the replication origin varies from one species to another; it is species specific well that it has some common features between species. A protein complex is formed in this sequence and allows the opening of the DNA and the start of the replication.
  • the vectors comprising the genetic sequence encoding PIGF are prepared by methods commonly used by those skilled in the art.
  • the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods known to those skilled in the art to introduce polynucleotides into a host cell.
  • Such methods may be processing using dextran, precipitation by calcium phosphate, transfection using polybrene, protoplast fusion, electroporation, encapsulation of the polynucleotide into liposomes, the 'biolistic injection and direct microinjection of DNA into the nucleus.
  • Said sequence (isolated or inserted in a plasmid vector) can also be combined with a substance which allows it to cross the host cell membrane, such that a carrier as a nanotransporter or a liposome preparation, or cationic polymers.
  • a carrier as a nanotransporter or a liposome preparation, or cationic polymers.
  • these methods can advantageously be combined, for example by using electroporation associated with liposomes.
  • microorganisms suitable for the purposes of the invention include yeast (Buckholz RG, Current Opinion in Biotechnology vol 4, No. 5, 1993, pages 538 -.. 42) and bacteria (Olins and Lee, Current Opinion in Biotechnology, Vol 4, No. 5, 1993, pp. 520-5).
  • eukaryotic cells include cells from animals such as mammals (Edwards CP and Aruffo A, Current Opinion in Biotechnology vol 4, No. 5, 1993, pages 558 -.. 63), the reptiles, and the like.
  • the plant cells can also be used.
  • the host cell used to produce the fragment of the invention is a bacterium, preferably the bacterium E. coli.
  • the person skilled in the art knows the conditions under which these cells should be cultivated, as well as the experimental conditions necessary for the expression of the polypeptide fragments by these cells.
  • the method for producing recombinant PIGF may comprise the following steps: a) culturing in a suitable culture medium and conditions a host cell comprising the PIGF coding vector; and b) isolating the PIGF produced in step a).
  • PIGF can be isolated (purified) from the expressing cell. In this case, a preliminary step of lysis of said cells may be necessary.
  • the media and culture conditions associated with each cell type used for the production of recombinant proteins are well known to those skilled in the art.
  • Isolation (or purification) of IGFP can be done by any means known to those skilled in the art. For example, differential precipitation or ultracentrifugation. It may also be advantageous to purify the PIGF by ion exchange chromatography, affinity chromatography, molecular sieving, or isofocalization. All of these techniques are described in Voet D and Voet JG, Protein and Nucleic Acid Purification Techniques, Chapter 6, Biochemistry, 2nd Edition.
  • the material from which the protein is to be extracted (animal or plant tissue, bacteria, etc.) is generally ground.
  • Various devices “ Waring Blender” , Potter-Eveljhem apparatus, “ Polytron “ , etc.) may be used for this purpose.
  • This homogenization is done in a buffer of appropriate composition, well known to those skilled in the art.
  • the homogenate thus obtained is then clarified, usually by centrifugation, to remove large particles poorly ground or to obtain the cellular fraction containing the desired protein.
  • a mild detergent Triton X-100, Tween 20, sodium deoxycholate, etc.
  • the detergent use must often be done in a controlled manner because they can break lysosomes, releasing hydrolytic enzymes (proteases, nucleases, etc.) that can attack and destroy the proteins or other molecules that we want to isolate. Special precautions should be taken when working with degradation-sensitive or few proteins.
  • a Frequent solution to this problem is the inclusion in solutions of protease inhibitors that are physiological (trypsin inhibitors, antipain, leupeptin, etc.) or artificial (E64, PMSF, etc.). Then various techniques exist to isolate the desired protein.
  • a vector bearing a sequence making it possible to identify the PIGF of the invention.
  • PIGF can be produced at levels of at least 1 mg per liter, preferably 2 mg per liter, even more preferably 5 mg per liter of cell culture.
  • the PIGF by chemical synthesis.
  • chemical synthesis processes for example techniques employing solid phases or using partial solid phases, by condensation of the protein or by synthesis in conventional solution.
  • the fragments of the invention may for example be synthesized by synthetic chemistry techniques, such as Merrifield synthesis which is advantageous for reasons of purity, antigenic specificity, absence of undesired side products and for its ease of production.
  • This chemical synthesis can be coupled to a genetic engineering or genetic engineering approach alone using techniques well known to those skilled in the art and described for example in Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
  • PIGF Factorous Alcohol Spectrum Disorder
  • Reagents and starting materials are commercially available, or can be synthesized by well-known conventional techniques (see for example, WO 00/12508, WO 2005/085260).
  • PIGF analogs can be synthesized using the technique described by Zheng et al. (Acta Ophthalmologica 2012 90 (7): e512 - e523).
  • the present invention relates to a PIGF for its use in the prevention and treatment of FASD.
  • Fetal Alcohol Spectrum Disorder (FASD) refers to all disorders in children resulting from exposure to alcohol during pregnancy. This term includes, among other things, all the behavioral disorders that will gradually become apparent with age. Children with these disorders are called "FASD children.
  • FASD fetal alcohol syndrome
  • craniofacial dysmorphia including shortened palpebral fissures, a smooth, elongated, erased nasolabial fold, and a thin upper lip
  • nonspecific growth retardation prenatal or postnatal height or weight or head circumference
  • miscellaneous malformations cardiacopathies, urogenital malformations, digestive malformations or cerebral architectural disorders
  • neurodevelopmental disorders sometimes expressed by mental retardation and more often by learning difficulties.
  • cerebrovascular disease is meant here any alteration of the cerebrovascular system, including an alteration resulting in impaired or even defective operation of the system.
  • a cerebrovascular disease in the context of the invention may in particular be a disorganization of the cerebrovascular system. More particularly, fetal alcoholization induces a random orientation of the cerebral vessels.
  • the fetal alcohol disorder is linked to cerebrovascular disease. Even more particularly, said fetal alcohol disorder is related to disorganization of the cerebrovascular system.
  • Cerebral angiogenesis is the process of forming blood vessels in the brain.
  • PIGF is used to stimulate cerebral angiogenesis and thus improve brain function.
  • the PIGF can be used to prevent and / or treat at least one FASD selected from any of the above-mentioned maladjustment and behavior disorders.
  • PIGF can also be used to prevent and / or treat fetal alcohol syndrome (FAS), especially when FAS is manifested as hypotrophy.
  • FAS fetal alcohol syndrome
  • FES Fetal Alcohol Syndrome
  • FASD fetal alcohol spectrum disorder
  • Partial FAS is when the child has only a part of the FAS symptoms. Partial SAF children, however, always have one or more neurobehavioral abnormalities.
  • hypotrophic if its weight and height are below the 10th percentile of the reference curves. This is often the case for premature newborns and newborns exposed in utero to alcohol.
  • the hypotrophy can also be diagnosed before term, by ultrasound: one speaks about fetal hypotrophy or intrauterine growth retardation.
  • the present invention thus relates to a PIGF for its use in the prevention and / or treatment of FAS, especially when FAS is manifested in the form of hypotrophy due to intrauterine exposure to FAS. 'alcohol.
  • the subject is a hypotrophy of the whole body of a subject or one or more of its parts selected from the torso (or called the body), the abdomen and the skull.
  • the subject is a fetus or a child, particularly a premature baby.
  • the subject having been exposed in utero to the alcohol is selected from an embryo, a fetus or a child, preferably a fetus or a child, in particular, a premature child.
  • the period between the 30th gestational week and the term of pregnancy is the period during which brain angiogenesis is the most important. It is thus particularly preferred to administer the PIGF to a fetus exposed in utero to alcohol at precisely this time.
  • the treatment when the subject TCAF is a premature child, the treatment will consist in supplementing in PIGF this subject on the exerter period corresponding to the lost weeks of intra-uterine life.
  • the treatment window can extend from the 30th gestational week to the theoretical term (40 gestational weeks), during which time cerebral angiogenesis in humans is particularly intense.
  • subject means a human, and preferably an embryo, a fetus or a child.
  • An "embryo” as it is understood here corresponds to a fertilized oocyte less than three months old.
  • fetus is meant an individual taken before birth and whose gestational age is between 3 and 9 months. After childbirth, the subject becomes a child.
  • child is meant according to the invention an individual whose age is less than 3 years.
  • newborns whose age is between 0 and 1 month
  • infants who are between 1 month and 2 years
  • the children themselves who are at least 2 years old.
  • premature children may as well be born at term as it is premature.
  • premature refers to a child born alive before 37 weeks of amenorrhea. This term covers three sub-categories: extreme prematurity ( ⁇ 28 weeks); extreme prematurity (between the 28th and 32nd week); average prematurity or late (between the 32nd and 37th week).
  • premature children treated with PIGF are preferably in the category of medium or even late prematurity.
  • a subject with Fetal Alcohol Spectrum Disorder refers to an embryo, fetus or subject, particularly human, who is exposed to or likely to be exposed to In utero alcohol with fetal alcohol impairment or who is at risk of developing maternal alcohol consumption as a condition related to fetal alcohol spectrum disorder, including the effects described above.
  • a TCAF subject may have a whole body size or its parts below normal and a disorganized cerebral vascular network, said disorganization being notably related to a random orientation of the cerebral vessels.
  • treatment is meant any action to reduce or eradicate the symptoms or causes of FASD.
  • a treatment within the meaning of the invention may comprise the administration of PIGF, a pharmaceutical composition or a product comprising it with or without a psychotherapeutic follow-up.
  • prevention is meant any action that completely or partially prevents the risk of symptoms or the causes of FASD.
  • Prevention within the meaning of the present invention comprises the administration of PGIG, of a pharmaceutical composition, to a subject exposed in utero to alcohol or to a subject having been exposed in utero to alcohol but for which the symptoms of TCAF have not yet appeared and cerebral angiogenesis still in progress.
  • the inventors take advantage of the fact that PIGF is an angiogenic factor naturally present at these stages of fetal development in a healthy subject, which has the advantage of easy use of IFIG by compensation in the prevention of FASD.
  • the placental growth factor is administered in a therapeutically effective amount to a subject having been exposed to the alcohol in utero.
  • a therapeutically effective amount means an amount sufficient to influence the therapeutic course of a particular disease state.
  • a therapeutically effective amount is also that to which all the toxic effects or side effects of the agent are compensated by the therapeutically beneficial effects of the active ingredient used.
  • the placental growth factor is administered in utero and / or ex utero. It is thus conceivable to start a treatment (or prevention) by the administration of IGFI during the intrauterine period and to continue it after delivery especially when the child is born prematurely and therefore loses the physiological contribution of placental PIGF.
  • the PIGF will be administered alone or in a pharmaceutical composition systemically, particularly intravenously, intramuscularly, intradermally, intraperitoneally, subcutaneously, or orally. More preferably, the PIGF will be administered several times, spread over time.
  • IGF insulin growth factor
  • IFIG intravenously
  • Optimal modes of administration, dosages and dosage forms may be determined according to the criteria generally considered in establishing a patient-specific treatment such as, for example, the age or body weight of the patient, the severity of his or her general condition, tolerance to treatment and side effects noted.
  • PIGF When PIGF is administered as pharmaceutical compositions, for subcutaneous, intramuscular, intravenous, transdermal local administration, PIGF can be administered in unit dosage forms, in admixture with conventional pharmaceutical carriers to the subject in need thereof. . Suitable unit dosage forms include intramuscular, intravenous forms.
  • the choice of the most appropriate administrative voice will depend on when this administration is performed.
  • this will be done intermuscularly or intravenously, preferably at the placental level.
  • administration of the pharmaceutical composition comprising PIGF to a newborn child or a premature child is preferably made intravenously.
  • aqueous suspensions for parenteral, intranasal or intraocular administration, aqueous suspensions, isotonic saline solutions or sterile and injectable solutions containing dispersing agents and / or pharmacologically compatible wetting agents are used.
  • Forms for parenteral administration are conventionally obtained by mixing PIGF with buffers, stabilizing agents, preservatives, solubilizing agents, isotonic agents and suspending agents. In accordance with known techniques, these mixtures are then sterilized and then packaged in the form of intravenous injections.
  • buffers based on organic phosphate salts.
  • suspending agents include methylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, acacia and sodium carboxymethylcellulose.
  • useful stabilizers according to the invention are sodium sulfite and sodium metasulfite, while sodium p-hydroxybenzoate, sorbic acid, cresol and chlorocresol can be mentioned as preservatives.
  • compositions of the invention may be formulated to be administered to the patient by a single route or by different routes.
  • the dosage depends of course on the form in which the PIGF will be administered, the mode of administration, the therapeutic indication, the age of the patient and his condition.
  • the dose to be administered is preferably from 0.001 to 250 mg / kg of PIGF per day, preferably from 0.01 to 100 mg / kg of PIGF per day, more preferably from 0.1 to 50 mg / kg of PIGF per day. day and even more preferably from 1 to 25 mg / kg of PIGF per day.
  • the unit dose of PIGF preferably comprises from 0.1 to 50 mg / kg of this compound.
  • the initially administered dose of PIGF may be adjusted if necessary during treatment depending on the response to this treatment of the subject being treated.
  • the skilled person based on this general knowledge and on the present description will adjust the dose of PIGF so as to optimize its therapeutic effect.
  • the placental growth factor can also be used in the form of active ingredient in a pharmaceutical composition.
  • the present invention thus relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a placental growth factor (PIGF) as defined above and a pharmaceutically acceptable vehicle for its use in the prevention and / or treatment of disorders caused by the fetal alcoholization (FASD).
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be used in the prevention and / or treatment of different types of FASD as described for the PIGF below.
  • these FASD are selected from the group consisting of disorders of maladjustment and behavior or fetal alcohol syndrome (FAS), especially when manifested as hypotrophy and cerebrovascular disease due to exposure to alcohol in utero.
  • composition of the present invention can also be used to enhance cerebral angiogenesis in a subject having been exposed to alcohol in utero.
  • the term "pharmaceutically acceptable carrier” means any material which is suitable for use in a pharmaceutical product.
  • a pharmaceutically acceptable vehicle mention may be made of lactose, optionally modified starch, cellulose, hydroxypropylmethylcellulose, mannitol, sorbitol, xylitol, dextrose, calcium sulphate, sodium phosphate and the like.
  • composition according to the invention can be in various forms and be administered in different ways as indicated above in detail.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a PIGF as an active ingredient in a concentration of between 0.001 mg / kg and 250 mg / kg by weight relative to the total weight of the subject to whom the pharmaceutical composition will be administered.
  • the concentration of PIGF is between 0.01 mg / kg and 100 mg / kg by weight relative to the weight of the subject to which the pharmaceutical composition will be administered and even more particularly, between 0.15 mg / kg and 50 mg / kg. kg by weight relative to the weight of the subject to which the pharmaceutical composition will be administered or between 1 mg / kg and 25 mg / kg by weight relative to the total weight of the subject to which the composition will be administered.
  • the inventors have demonstrated that the increase in the amount of PIGF is particularly effective in restoring the attainment of cerebral vasculature thus making it possible to reduce the neuronal function to a normal state.
  • the PIGF or the pharmaceutical composition comprising it is therefore used for the treatment and / or prevention of cerebral vasculature damage due to exposure to alcohol in utero.
  • PIGF insulin growth factor
  • the inventors have also demonstrated that increasing the amount of PIGF makes it possible to increase the size of the entire body of a fetus or one or more of its parts, in particular the size of the skull, the size of the body, abdomen size and depth after exposure to alcohol during the intrauterine period. This allows partial or complete recovery of the normal morphometric appearance.
  • the present invention thus relates to a PIGF or a pharmaceutical composition comprising it for its use in the prevention and / or treatment of hypotrophy due to intrauterine exposure to alcohol, especially when this hypertrophy is a manifestation of FAS.
  • it is a hypotrophy of the whole body of a subject or one or more of its parts selected from the torso (or called the body), the abdomen and the skull.
  • the subject is a SAF subject who is a fetus or newborn, particularly a premature baby.
  • a fourth aspect of the invention relates to a method of treating fetal alcohol disorder in a subject.
  • the method comprises a step of administering or overexpressing PIGF or administering a pharmaceutical composition comprising same to a subject having FASD including in particular fetal alcohol syndrome (FAS), particularly when manifested in the form of FASD. hypotrophy and / or cerebrovascular disease of a subject who has been exposed to alcohol in utero.
  • FAS fetal alcohol syndrome
  • This method of treatment may comprise a prior stage of diagnosis of FASD.
  • the present invention relates to the placental growth factor (PIGF), a pharmaceutical composition or a product comprising it according to the invention for use in the treatment of FASD, said use comprising a step prior to identification of the subject, said identification comprising the steps of: a) measuring the amount of PIGF in a biological sample of said subject, preferably from the placenta or cord blood; b) comparing the amount of PIGF of step a) with a reference that is a measure of the amount of PIGF in a healthy individual, and c) determining a FASD or risk of developing FASD in said subject.
  • biological sample according to the invention any sample that can be taken from a subject.
  • the biological sample is a sample from the placenta, including the umbilical cord.
  • PIGF is expressed by placental cells throughout pregnancy. This makes it possible to assay the PIGF without compromising the integrity of the subject, in particular when the subject is an embryo or a fetus.
  • the biological sample must allow the determination of the level of expression of PIGF.
  • the test sample may be used as obtained directly from the biological source or as a result of pretreatment to change the character of the sample.
  • pretreatment may include plasma preparation from blood, dilution of viscous fluids, and so on.
  • Pre-treatment methods may also involve filtration, precipitation, dilution, distillation, mixing, concentration, inactivation of disrupting components, addition of reagents, lysis, etc.
  • it may be beneficial to modify a solid test sample to form a liquid medium or to release the analyte.
  • PIGF protein is a secreted protein (DeFalco, Exp Mol Med 44 (1): 1-9, 2012).
  • Preferred biological samples for determining the level of expression of said protein include in particular blood, plasma, or lymph samples.
  • the biological sample is a blood sample.
  • the biological sample is a sample of placental blood or cord blood. This is usually collected during childbirth. Blood from placental vessels can then be obtained to measure the rate of PIGF.
  • the subject when the amount of PIGF measured in step a) is less than the reference, the subject is determined to be suffering from or having a risk of developing a FASD and in particular an impairment of cerebral vasculature or FAS. , especially hypotrophy.
  • the amount of PIGF is measured when a subject has at least one disorder that may be related to intrauterine alcohol exposure.
  • the amount of PIGF will also be measured when a subject does not present one or more particular disorders related to intrauterine alcohol exposure but for whom exposure to alcohol during that period has been proven or suspected.
  • measuring the amount of PIGF as described above will make it possible to confirm or refute a FASD or the risk of developing one prior to the therapeutic management.
  • the amount of PIGF is determined by measuring the amount of transcripts encoding the PIGF or the amount of the polypeptide.
  • the level of gene expression or protein can be measured by many methods that are available to those skilled in the art. There may be several intermediate steps between taking the biological sample and measuring the PIGF expression, said steps corresponding to extracting from said sample an mRNA sample (or corresponding cDNA) ) or a protein sample. This can then be directly used to measure the expression of PIGF. Preparation or extraction of mRNA (as well as retrotranscription thereof into cDNA) or proteins from a cell sample are only routine procedures well known to those skilled in the art.
  • mRNA level i.e., all mRNAs or cDNAs
  • proteins i.e., all the proteins present in the sample
  • PIGF When the expression of PIGF is measured at the level of the mRNA (or corresponding cDNA), any technology usually used by those skilled in the art can be implemented. These technologies for analyzing the level of gene expression, such as, for example, transcriptome analysis, include well-known methods such as PCR (Polymerase Chain Reaction, based on DNA) and RT-PCR (reverse transcription). PCR transcription, if you start from RNA) or quantitative RT-PCR or nucleic acid chips (including DNA chips and oligonucleotide chips) for higher throughput.
  • PCR Polymerase Chain Reaction, based on DNA
  • RT-PCR reverse transcription
  • nucleic acid chips is meant herein several different nucleic acid probes that are attached to a substrate, which may be a microchip, a glass slide, or a microsphere-sized bead.
  • the microchip may consist of polymers, plastics, resins, polysaccharides, silica or a material based on silica, carbon, metals, inorganic glass, or nitrocellulose.
  • the probes can be nucleic acids such as cDNAs ("cDNA chips”), mRNAs (“mRNA chips”) or oligonucleotides (“oligonucleotide chips”), said oligonucleotides typically having a length of between about 25 and 60 nucleotides.
  • cDNA chips cDNA chips
  • mRNA chips mRNAs
  • oligonucleotide chips oligonucleotides
  • nucleic acid corresponding to all or part of said gene is labeled and then brought into contact with the chip under hybridization conditions, leading to the formation of complexes between said nucleic acid.
  • tissue chips also known as TMAs: "tissue microarrays”
  • the tests usually used with tissue chips include immunohistochemistry and fluorescent in situ hybridization. For mRNA analysis, the tissue chips can be coupled with fluorescent in situ hybridization.
  • RNA-Seq or "Whole Transcriptome Shotgun Sequencing”
  • mass sequencing in parallel several methods of mass sequencing in parallel are available. Such methods are described in, for example, US 4,882,127, US 4,849,077; US 7,556,922; US 6,723,513; WO 03/066896; WO 2007/11 1924; US 2008/0020392; WO 2006/084132; US 2009/0186349; US 2009/0181860; US 2009/0181385; US 2006/0275782; EP-B1-1141399; Shendure to Ji, Nat Biotechnol., 26 (10): 1135-45.
  • the expression of the PIGF is measured at the protein level by a method selected from immunohistology, immunoprecipitation, western blot, dot blot, ELISA or ELISPOT, protein chips, microarray chips.
  • the amount of PIGF is determined by a method chosen from immunoprecipitation, immunohistology, western blot, dot blot, ELISA or ELISPOT, protein chips, antibody chips, or tissue chips coupled with immunohistochemistry.
  • Antibodies directed against PIGF are commercially available (see, for example, RaD Systems, Santa Cruz, Abcam, etc.) and may be used in the methods of the invention. Even more preferably, the expression of PIGF is measured by Western Blot or ELISA.
  • the amount of PIGF is normalized with respect to a control marker which may be a gene selected from B2M, TFRC, YWHAZ, RPLO, 18S, GUSB, UBC, TBP, GAPDH, PPIA, POLR2A, ACTB, PGK1, HPRT1, IP08 and HMBS, or a polypeptide selected from the product of said genes.
  • a control marker which may be a gene selected from B2M, TFRC, YWHAZ, RPLO, 18S, GUSB, UBC, TBP, GAPDH, PPIA, POLR2A, ACTB, PGK1, HPRT1, IP08 and HMBS, or a polypeptide selected from the product of said genes.
  • the rate of PIGF thus measured is then compared to an expression level of reference PIGF to determine whether it is a FASD subject.
  • a level of expression of reference PIGF is meant within the meaning of the present application any rate of expression of said factor used for reference.
  • a reference expression level can be obtained by measuring the level of expression of PIGF in a biological sample, for example a placenta or umbilical blood, of a healthy subject, i.e. a subject who has not been exposed to alcohol in utero.
  • FIG. 1 Effects of in utero alcohol exposure on cortical angiogenesis in mouse E20 embryos.
  • A, B Effects of Fetal Alcohol Exposure from GD15 to GD20 on the Organization of Cortical Microvessels in Control (A) Animals and Exposed to Alcohol (B). Microvessels of the brain were visualized by immunohistochemistry against CD31. The arrows indicate the microvessels of the brain with a radial orientation in the "control" group. It should be noted a loss of the radial organization in the group "Alcohol”.
  • I -VI Cortical layers; CC: Corpus callosum.
  • C Distribution of orientation (angle categories) of cortical microvessels in the immature cortex of fetus GD20.
  • FIG. 1 Effects of In utero Alcohol Exposure on Expression of VEGF / PIGF Family Members in Mouse E20 Embryos.
  • AE Western blot quantification of protein levels of VEGFA (A), PIGF (B), sVEGF-RI (C), mVEGF-R1 (D) and VEGF-R2 in the cortex of the "Control” and “Alcohol” groups.
  • F Western blot comparison of PIGF protein levels in the cortex and placenta of the E20 embryos of the "control” group. * p ⁇ 0.05; *** p ⁇ 0.001 vs the "Witness" group using an unpaired t-test.
  • EH Images acquired by medium (E, F) and strong (G, H) electron microscopy showing the cellular morphology of giant trophoblasts and the presence of zonula occludens (arrows) in the "control” (E, G) and “Alcohol” (F, H). Zonula occludens (stars) is no longer visible in animals treated with alcohol.
  • the inserts in E and F indicate the area observed at higher magnification at G and H, respectively.
  • D maternal decidua
  • J junction area
  • L labyrinth area
  • Tg layer of giant trophoblasts.
  • FIG. 4 Effects of in utero alcohol exposure on the expression of proteins involved in the placental barrier and placental energy metabolism.
  • A, B Immunohistochemical observation of the ZO-1 protein in the mouse placenta maze area of the "Control” (A) and "Alcohol” (B) groups. The ZO-1 protein appears to form groups of points (arrows) in the "Control” group while the labeling is diffuse in the "Alcohol” group. The trophoblast layers were demonstrated by immunoreactivity with the Glut-1 glucose transporter. The nuclei were marked at Hoechst.
  • C Double labeling with antibodies against MCT-1 monocarboxylate transporters and glucose in the labyrinth zone of a "control" placenta.
  • EH Immunohistochemistry tests illustrate the distribution of VEGF-R1 (E), Glut-1 (F, G) and PIGF (H) in layers of syncytiotrophoblasts from the mouse placenta. The nuclei were marked at Hoechst.
  • FIG. 5 Effects of in utero alcohol exposure on the expression of VEGF / PIGF family members in murine placenta.
  • AF Western blot quantification of effects of alcohol exposure during the last week of gestation on placental expression of VEGF-A (A), PIGF (B), sVEGF-RI (C), mVEGF-R1 (D), VEGF-R2 (E) and CD31 (F) to GD20.
  • G, H Immunohistochemical labeling showing the distribution of VEGF-R2 (G) in Glut-1-labeled (H) labeled placenta syncytiotrophoblast layers. The nuclei were marked at Hoechst.
  • FIG. 6 Diffusion of Evans blue and recombinant human PIGF injected in utero from the placenta into the fetal brain and effect of placental repression of PIGF on cerebral vasculature.
  • A, B Time-course visualization of Evans Blue administered by microinjection into the placenta of a GD15-gravid mouse. The fluorescence was detected by UV illumination (A) and is represented using a dummy color scale (B).
  • C, D Time-based visualization of Evans Blue fluorescence in the fetal brain following GD15 placental microinjection.
  • E Quantification over time by spectrophotometry of the absorbance at 595 nm of the Evans blue signal injected into the placentas (E) and subsequently into the brains of the corresponding fetuses (F).
  • G ELISA quantification of human PIGF in mouse fetal brain 30 min after injection of hPIGF into placentas of GD15 pregnant mice. * p ⁇ 0.05 vs the "control" group using an unpaired t-test.
  • H Photomicrograph visualizing the expression of eGFP 48 hours after in utero transfection of GD15 pregnant mouse placenta with a plasmid encoding an eGFP.
  • I, J Triple staining eGFP / Glut-1 / Hoechst indicating that the fluorescence of eGFP (I) is mainly associated with Glut-1-tagged fetal trophoblastic layer (J) (arrowheads). The fetal part of the trophoblastic layers is identified by the presence of nucleated red blood cells specific to the fetal circulation (arrows).
  • K Western blot visualization of PIGF, GFP and actin proteins in placentas of non-transfected animals (sh- / GFP-), GFP-transfected (sh- / GFP +) and shPLGF / GFP transfected (sh + / GFP +).
  • L, M Western blot quantification of PIGF (L) levels and expression of GFP (M) in placentas of non-transfected animals (sh- / GFP-), GFP-transfected (sh- / GFP +) and shPLGF / GFP transfected (sh + / GFP +) four days after transfection.
  • N Western transfer quantification of VEGF-R1 expression levels in fetal brain from non-transfected (sh- / GFP-), GFP-transfected (sh- / GFP +) and shPLGF / GFP transfected placenta (sh + / GFP +) four days post-transfection. * P ⁇ 0.05 vs group "sh- / GFP" using one-way ANOVA followed by a post-hoc Tukey test.
  • Figure 7 Morphometric characterization of the effects of in utero alcohol exposure on the human placenta from gestational weeks 20 to 25.
  • A, B Immunohistochemical labeling against CD31 and counterstaining with toluidine blue to visualize microvessels (chestnuts) present in the placental villi (blue) of the "control” (A) and "FAS / pFAS” (B) groups at gestational ages [20-25 WG [.
  • C Percentage of villi classified by size in the placentas of the "control” and "FAS / pFAS” groups at gestational ages [20-25 WG [.
  • D Distribution of vessels by villous size in placentas of the "control” and "FAS / pFAS” groups at gestational ages [20-25 WG [.
  • E Village vascular vascular surface area in the placentas of the "control” and "FAS / pFAS” groups at gestational ages [20-25 WG [. * P ⁇ .05 vs the control group using an unpaired t-test.
  • Figure 8 Morphometric characterization of the effects of in utero alcohol exposure on the human placenta from gestational weeks 25 to 35.
  • A, B Immunohistochemical labeling against CD31 and toluidine blue staining to visualize microvessels (chestnuts) present in Placental (blue) villi of the "control” (A) and "FAS / pFAS” (B) groups at gestational ages [25-35 WG [.
  • C Percentage of villi classified by size in the placentas of the "control” and "FAS / pFAS” groups at gestational ages [25-35 WG [.
  • D Distribution of vessels by villous size in placentas of the "control” and "FAS / pFAS” groups at gestational ages [25-35 WG [.
  • E Vascular villous surface area in placentas of the "control” and “FAS / pFAS” groups at gestational age [25-35 WG [. * p ⁇ 0.05 vs the "control” group using an unpaired t-test.
  • Figure 9 Morphometric characterization of the effects of in utero alcohol exposure on the human placenta from gestational weeks 35 to 42.
  • A, B Immunohistochemical labeling against CD31 and toluidine blue staining to visualize the microvessels (chestnuts) present in placental villi (blue) groups' Witness "(A) and” FAS / pFAS "(B) at gestational ages ranging from [35-42 WG [. The luminal region of the microvessels is greatly reduced in the "FAS / pFas" group.
  • C Percentage of villi classified by size in placentas of the "control” and "FAS / pFAS” groups at gestational ages ranging from [35-42 WG [.
  • D Distribution of vessels by villous size in placentas of the "control” and “FAS / pFAS” groups at gestational ages ranging from [35-42 WG [.
  • E Village-size vascular area in placentas of the "control” and "FAS / pFAS” groups at gestational ages ranging from [35-42 WG [. * p ⁇ 0.05 vs the "control” group using an unpaired t-test.
  • Figure 10 Time-course effects of in utero alcohol exposure on villous and vessel densities in human placentas and western blot characterization of pro-angiogenic proteins and energy metabolism.
  • A Evolution of villous densities in placentas of the "control” (A) and "FAS / pFAS” (B) groups at gestational age [20-25 WG [, [25-35 WG [and [35-42 WG [.
  • B Evolution of vessel densities in placentas of the "control” and "FAS / pFAS” groups at gestational ages [20-25 WG [, [25- 35 WG [and [35-42 WG [.
  • Figure 1 Comparison of cerebral and placental damage observed in human fetuses and induced by in utero alcohol exposure and statistical correlation.
  • A-H Comparison of cerebral and placental damage observed in human fetuses and induced by in utero alcohol exposure and statistical correlation.
  • I, J Statistical correlation between cortical vascular disorganization and placental vascular density in patients in the "Control" (I) and FAS / pFAS (J) groups.
  • FIG. 12 Effects of overexpression of IFN in utero on fetal growth and cortical vascularization during intrauterine exposure to alcohol.
  • A, B A PGF / CRISPR / dCas9 activation approach coupled to electroporation of the placenta in utero was performed at GD13 (A) and overexpression of PIGF was monitored at GD20 (B). In the "Alcohol" group, exposure to alcohol in utero takes place between GD15 and GD20.
  • C, D Visualization of E20 fetuses from pregnant mice exposed to NaCl (C) or alcohol (D). It is worth noting the small size of fetuses exposed to alcohol.
  • E F: Visualization of E20 fetuses from pregnant mice after electroporation in utero PGF / CRISPR-dCas9 plasmids in placentas of "control" groups (E) or pregnant mice exposed to alcohol (F).
  • G, H Quantification of the size of the abdomen (G) and the whole fetus (H) in the group "Control” (NaCl) and in the group "Alcohol".
  • IK Visualization of the vascular system in the fetal cortex E20 from control (NaCl) / non-transfected (I), transfected alcohol / CRISPR-cas9 (J) and alcohol PGF / CRISPR-dCas9 placentas transfected. It is noted that overexpression of PIGF at the placental level corrects the disorganization of the cerebral vasculature induced by alcoholization in utero.
  • Figure 1 Effects of placental overexpression of PIGF on the size of the head and body of the fetus E20 in the "control" and “alcohol” groups.
  • A, B Quantification of the size of the head (A) and the body (B) in the group “Control” (NaCl) and the group “Alcohol”.
  • CRISPR-cas9 control plasmids black bars
  • PGF CRISPR-dCas9 plasmids white bars.
  • Examples A Abnormalities following alcohol abuse in utero Examples A below include several results of tests carried out prior to the present invention demonstrating that in mice and humans:
  • morphometric analysis indicates that the distribution of placental vessels by villous size and vascular area are significantly impacted by alcoholization (Figure 10).
  • a longitudinal analysis of vascular density taking into account the "age” factor indicates that in the "control” group, placental angiogenesis strongly increases between age groups [20-25GW [and [25-35GW [. This strong increase in placental vasculature is explained by significant brain development during the third trimester of pregnancy that requires increased oxygen and nutrient requirements.
  • fetal alcoholization induces stagnation or even a decrease in placental vascular density (Figure 10).
  • the present results indicate that there are vascular abnormalities in the human placenta as well as in the cerebral cortex in subjects who have been exposed to alcohol. These results therefore support the hypothesis of a correlation between brain disorders and placental deficits of angiogenesis.
  • the CRISPR-dCas9 approach is an innovative gene overexpression method for identifying the role of endogenous proteins in processes of development.
  • the PGF CRISPR-dCas9 activation plasmids (sc-42221 1 -ACT) constituting a complex of synergistic activation mediators (SAM) were designed and provided by Santa Cruz Biotechnology. SAM binds to a specific site upstream of the transcription initiation site of the PGF gene, thereby activating the endogenous transcription of the target gene.
  • the PGF-CRISPR dCas9 activation plasmids are transfected by in utero electroporation to GD13 in two groups of mice ("Control" and "Alcohol"). Exposure to alcohol occurs between GD15 to GD20. A two-day delay between transfection of PGF CRISPR-dCas9 activation plasmids and alcohol treatment is required to allow for plasmid expression and overexpression of PLGF.
  • control For a given pregnant mouse, 3 placentas were transfected with CRISPR-dCas9 PGF activation plasmids, 3 placentas were transfected with the CRISPR-cas9 control plasmids (sc-418922) targeting a non-specific 20 nt guide RNA (negative control). The other placentas are not transfected and are used as a control ("control" group).
  • the overexpression of PIGF in the placenta of a pregnant mouse exposed to alcohol allows the complete disappearance of morphometric abnormalities in the abdomen and of the skull of the fetus caused by exposure to alcohol.
  • the size of the skull and abdomen that is reduced following exposure to alcohol returns to normal after overexpression of PIGF
  • overexpression of PIGF in the placenta of a pregnant mouse exposed to Alcohol allows the reduction of morphometric abnormalities in the body of the fetus and the whole fetus caused by exposure to alcohol.
  • the size of the fetal body as well as the size of the whole fetus reduced during exposure to alcohol returns to almost normal after the overexpression of PIGF
  • the overexpression of PIGF at the placental level allows the improvement of the cerebral angiogenesis of the fetus altered by exposure to alcohol of a pregnant mouse.
  • the neuronal function of this fetus will thus be improved
  • overexpression of PIGF can be used effectively as a drug in the treatment of FASD-like abnormalities, particularly to improve cerebral angiogenesis and / or restore the normal morphological appearance of the vascularization of the fetus with FASD.

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Abstract

La présente invention concerne un facteur de croissance placentaire (PlGF) en tant que médicament pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des troubles causés par l'alcoolisation fœtale (TCAF) choisis dans le groupe comprenant le syndrome d'alcoolisation fœtale (SAF), l'atteinte vasculaire cérébrale et l'hypotrophie d'un sujet ayant été exposé à l'alcool in utero. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou un produit comprenant le PlGF pour ces mêmes applications thérapeutiques.

Description

FACTEUR DE CROISSANCE PLACENTAIRE POUR LE TRAITEMENT
DES TROUBLES CAUSES PAR L'ALCOOLISATION FOETALE (TCAF)
INTRODUCTION
L'alcool est un tératogène responsable d'atteintes physiques et comportementales. Chez l'Homme, l'exposition prénatale à l'alcool peut conduire à des altérations du développement cérébral. Ainsi, la consommation d'alcool au cours de la grossesse (alcoolisation fœtale) constitue la première cause de handicap et notamment de retard mental d'origine non génétique au monde et également en France.
Les dommages varient selon la période où le f tus a été exposé, les taux d'alcoolémie, les facteurs génétiques et environnementaux, le mode de consommation (chronique, binge drinking).
Le Syndrome d'Alcoolisation Fœtale (SAF) constitue la manifestation la plus extrême et invalidante des troubles causés par l'alcoolisation fœtale (TCAF). Son incidence est estimée en France à 1 ,5 % des naissances. Le SAF associe des anomalies physiques comme une hypotrophie (retard de croissance), une dysmorphie cranio-faciale et des anomalies neurocomportementales se traduisant par des troubles des fonctions cognitives (troubles de l'attention, d la motricité, de l'apprentissage ou encore de la mémorisation). Des séquelles neurologiques sont également présentes chez les enfants TCAF dont l'incidence est estimée en France à près de 1% des naissances.
L'angiogenèse cérébrale est concomitante avec le processus de neurogenèse et contribue au bon développement cérébral en assurant aux cellules nerveuses un apport en nutriments, en oxygène et en facteurs trophiques. En particulier, l'angiogenèse cérébrale constitue un prérequis au bon développement du réseau neuronal. De plus, il a été récemment démontré un impact direct des vaisseaux cérébraux sur le processus de migration de populations neuronales et des oligodendrocytes. Il a également été établi précédemment par les inventeurs que l'alcoolisation in utero perturbe l'angiogenèse cérébrale et que cet effet concourt aux anomalies cérébrales de l'alcoolisation.
Cibler les anomalies vasculaires de l'exposition in utero à l'alcool apparaît donc comme une stratégie thérapeutique afin de réduire les atteintes neurodéveloppementales de l'alcool et corriger les fonctions cérébrales altérées. En effet, la prise en charge actuelle des enfants TCAF vise, par une stimulation des fonctions motrices et cognitives, à réduire les troubles du langage, de l'apprentissage ou encore de l'attention qui sont diagnostiqués tardivement souvent entre 4 et 5 ans avec la scolarisation. Les résultats obtenus par un tel suivi sont limités et les troubles
1
FEU I LLE DE REM PLACEM ENT (RÈG LE 26) de l'alcoolisation in utero vont impacter à long terme sur l'intégration sociale et professionnelle de ces futurs adultes. Il n'existe à ce jour aucun traitement à visée curative des effets neurodéveloppementaux de l'alcool chez les enfants TCAF.
Il existe donc un besoin visant à développer une nouvelle thérapeutique des troubles liés à l'alcoolisation in utero destinée à traiter en particulier une vascularisation cérébrale anormale, d'améliorer l'angiogenèse cérébrale ou encore les troubles du développement qui y sont associés.
DESCRIPTION
Les inventeurs ont précédemment démontré que le dosage placentaire du facteur de croissance placentaire (PIGF) permet d'identifier, parmi les enfants exposés in utero à l'alcool, ceux qui ont subi des atteintes cérébrales. Ces enfants présentent notamment une diminution des taux de PIGF placentaire qui correspond à une angiogenèse cérébrale altérée.
Par la suite, dans un modèle pré-clinique d'alcoolisation in utero, les inventeurs ont découvert qu'une supplémentation en PIGF placentaire corrige l'action de l'alcool sur des paramètres morphométriques et anatomiques indicateurs de la croissance fœtale tels que la taille du corps et de la tête à la naissance. De plus, les inventeurs ont démontré que l'augmentation de la quantité de PIGF permet de réduire fortement l'effet délétère de l'alcool sur la vascularisation cérébrale du fœtus. Elle permet notamment d'améliorer l'angiogenèse cérébrale et de corriger la désorganisation des microvaisseaux induite par l'alcool. Le facteur de croissance fœtal (PIGF) a été décrit dans l'art antérieur comme une cible pour le traitement des maladies cardiovasculaires, des rétinopathies, des maladies cutanées ou encore de cancers (Lu et al. , Discov Med, 2016 21 :349-61 , Aprile et al. , Crit Rev Oncol Hematol, 2015 95:165-78 et Shibuya, Endocr Metab Immune Disord Drug Targets, 2015, 15:135-44). Plus spécifiquement, le PIGF a été décrit dans le traitement de rétinopathies chez l'adulte (US2015013359) et chez l'enfant (Hard et al., Fondation Act Paediatrica 2011 100, pp. 1063- 1065). Néanmoins, aucune étude ne suggère l'effet thérapeutique de PIGF dans le traitement des troubles causés par l'alcoolisation fœtale (TCAF). En outre, des traitements permettant de corriger l'effet néfaste de l'alcool sur la vascularisation cérébrale et la croissance d'un sujet ayant été exposé in utero à l'alcool n'ont pas été mis en évidence. La présente invention ouvre ainsi une nouvelle voie dans la prévention et/ou le traitement des TCAF et en particulier, dans la prévention et/ou le traitement des troubles neurologiques (tels que l'hyperactivité, perte de l'attention, dépression, anxiété, troubles émotionnels, irritabilité excessive, problèmes comportementaux, etc.) dus à des migrations neuronales et oligodendrocytaires vasculo- dépendantes anormales au niveau cérébral ou des troubles de croissance (hypotrophie) suite à la consommation d'alcool pendant la grossesse. Dans un premier aspect, la présente invention concerne ainsi un facteur de croissance placentaire (PIGF) pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des troubles causés par l'alcoolisation fœtale (TCAF) chez un sujet ayant été exposé à l'alcool in utero.
On entend par « PIGF » ou « Placental growth factor » ou « facteur de croissance placentaire » (tous ces termes sont synonymes) une protéine de la famille des facteurs de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF). Plus particulièrement, PIGF au sens de l'invention est une protéine de 149 acides aminés hautement similaire à VEGF-A qui est reconnue par le même récepteur que ce dernier, le VEGF-R1 , mais qui n'est pas reconnue par le récepteur VEGF-R2. PIGF est fortement exprimé par le placenta, mais pas par le fœtus et en particulier par le cerveau fœtal. PIGF glycosylé en N-terminal est sécrété et fonctionne en dimère pour contrôler l'angiogenèse. Le terme « PIGF » se réfère notamment à l'ensemble des 4 isoformes PIGF1 -4 : PlGF-1 et PlGF-3 sont des isoformes qui ne lient pas l'héparine tandis que PlGF-2 et PlGF-4 contiennent des domaines supplémentaires qui permettent de fixer l'héparine. Encore plus préférentiellement, on entend par PIGF une protéine humaine dont la séquence est choisie parmi l'une quelconque des isoformes identifiées par les numéros d'accession Uniprot P49763- 2 (PlGF-1 dont la séquences d'acides aminés correspond à la SEQ ID NO :1 ) ; P49763-3 (PlGF-2 dont la séquences d'acides aminés correspond à la SEQ ID NO :2) ; P49763-1 (PlGF-3 dont la séquences d'acides aminés correspond à la SEQ ID NO :3) ; P49763-4 (PlGF-4 dont la séquences d'acides aminés correspond à la SEQ ID NO :4) présentées dans le listage de séquences annexé à la présente demande. Selon un mode de réalisation de la présente invention, du PIGF recombinant ou des analogues protéiques du PIGF humain peuvent être également utilisés dans la prévention et/ou le traitement d'un TCAF.
Particulièrement, le PIGF de la présente invention est obtenu, en utilisant un système de production de protéine recombinante procaryote ou eucaryote, notamment en i) cultivant un microorganisme ou des cellules eucaryotes transformé(es) à l'aide d'une séquence nucléotidique codant le PIGF humain (numéro d'accession NCBI du gène 5228; numéro d'accession des transcrits NM_002632.5 (SEQ ID NO :5), NM001207012.1 (SEQ ID NO :6), NM_001293643.1 (SEQ ID NO :7)) et ii) isolant la protéine produite par ledit microorganisme ou lesdites cellules eucaryotes. Cette technique est bien connue de l'homme du métier. Pour plus de détails la concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après : Recombinant DNA Technology I, Editors Aies Prokop, Raskesh K Bajpai ; Annals of the New- York Academy of Sciences, Volume 646, 1991 . La protéine PIGF est de préférence purifiée / isolée à partir de lysats de cellules et/ou de surnageants de cellules par lesquelles elle est exprimée et/ ou sécrétée. Cette purification peut se faire par tout moyen connu de l'homme du métier. De nombreuses techniques de purification sont décrites dans Voet D et Voet JG, Techniques de purification des protéines et des acides nucléiques. Les systèmes de production de protéine recombinante utilisent des vecteurs nucléotidiques comprenant des acides nucléiques codant les polypeptides à synthétiser, qui sont introduits dans des cellules hôtes qui produisent lesdits polypeptides (pour plus de détails, se référer à « Recombinant DNA Technology I », Editors Aies Prokop, Raskesh K Bajpai ; Annals of the New- York Academy of Sciences, Volume 646, 1991 ). De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte (par exemple, les plasmides sont de préférence introduits dans des cellules bactériennes, tandis que les YACs sont de préférence utilisés dans des levures). Ces vecteurs d'expression peuvent être des plasmides, des YACs, des cosmides, des rétrovirus, des épisomes dérivés d'EBV, et tous les vecteurs que l'homme du métier peut juger appropriés à l'expression desdites chaînes. Les vecteurs selon l'invention comprennent l'acide nucléique codant le PIGF, ou une séquence similaire, ainsi que les moyens nécessaires à son expression. On entend par « moyen nécessaire à l'expression d'un peptide », le terme peptide étant utilisé pour toute molécule peptidique, telle que protéine, polyprotéine, polypeptide, etc. , tout moyen qui permet d'obtenir le peptide, tel que notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication et de préférence un marqueur de sélection. Les moyens nécessaires à l'expression d'un peptide sont liés de façon opérationnelle à la séquence d'acides nucléiques codant pour le fragment polypeptidique de l'invention. Par « liés de façon opérationnelle », on entend une juxtaposition desdits éléments nécessaires à l'expression du gène codant pour le fragment polypeptidique de l'invention, lesquels sont en une relation telle que cela leur permet de fonctionner de façon attendue. Par exemple, il peut exister des bases supplémentaires entre le promoteur et le gène codant le fragment polypeptidique de l'invention tant que leur relation fonctionnelle est préservée. Les moyens nécessaires à l'expression d'un peptide peuvent être des moyens homologues, c'est-à-dire naturellement compris dans le génome du vecteur utilisé, ou bien être hétérologues, c'est-à-dire rajouté de façon artificielle à partir d'un autre vecteur et/ou organisme. Dans ce dernier cas, lesdits moyens sont clonés avec le fragment polypeptidique à exprimer. Des exemples de promoteurs hétérologues comprennent les promoteurs viraux tels que le promoteur SV40 (Virus simien 40), le promoteur du gène de la thymidine-kinase du virus simplex de l'Herpès (TK-HSV-1 ), le LTR du virus du sarcome de Rous (RSV), le promoteur premier immédiat du cytomégalovirus (CMV) et le promoteur dernier majeur adénoviral (MLP), ainsi que tout promoteur cellulaire qui contrôle la transcription des gènes codant pour des peptides chez des eucaryotes supérieurs, tel que le promoteur du gène de phosphoglycérate-kinase (PGK) constitutif (Adra et al. , Gene Volume 60, Issue 1 , 1987, Pages 65-74), le promoteur des gènes spécifiques du foie alphal -antitrypsine et FIX et le promoteur SM22 spécifique des cellules du muscle lisse (Moessler et al. , Development 1996 Aug; 122(8):2415-25). Les méthodes de suppression et d'insertion de séquences d'ADN dans des vecteurs d'expression sont largement connues de l'homme du métier et consistent notamment en des étapes de digestion enzymatique et ligature. Les vecteurs de l'invention peuvent également comprendre des séquences nécessaires au ciblage des peptides vers des compartiments cellulaires particuliers. Un exemple de ciblage peut être le ciblage vers le réticulum endoplasmique obtenu en utilisant des séquences d'adressage du type de la séquence leader issue de la protéine E3 de l'adénovirus (Ciernik I. F. , et al. , The Journal of Immunology, vol. 162, 1999, pages 3915 -3925). Le terme « terminateur de transcription » désigne ici une séquence du génome qui marque la fin de la transcription d'un gène ou d'un opéron, en ARN messager. Le mécanisme de terminaison de la transcription est différent chez les procaryotes et chez les eucaryotes. L'homme du métier connaît les signaux à utiliser en fonction des différents types cellulaires. Par exemple, si la cellule dans laquelle le vecteur va être introduit est une bactérie, il utilisera un terminateur Rho-indépendant (séquence répétée inversée suivie d'une série de T (uraciles sur l'ARN transcrit) ou un terminateur Rho-dépendant (constitué d'une séquence consensus reconnue par la protéine Rho). Le terme « origine de réplication » (aussi appelée ori) est une séquence unique d'ADN permettant l'initiation de la réplication. C'est à partir de cette séquence que débute une réplication unidirectionnelle ou bidirectionnelle. L'homme du métier sait que la structure de l'origine de réplication varie d'une espèce à l'autre ; elle est donc spécifique d'une espèce bien qu'elle ait certaines caractéristiques communes entre espèces. Un complexe protéique se forme au niveau de cette séquence et permet l'ouverture de l'ADN et le démarrage de la réplication.
Les vecteurs comprenant la séquence génétique codant PIGF sont préparés par des méthodes couramment utilisées par l'homme du métier. Les clones résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards connues de l'homme du métier pour introduire des polynucléotides dans une cellule hôte. De telles méthodes peuvent être la transformation à l'aide de dextrane, la précipitation par du phosphate de calcium, la transfection à l'aide de polybrène, la fusion de protoplastes, l'électroporation, l'encapsulation des polynucléotides dans des liposomes, l'injection biolistique et la micro-injection directe d'ADN dans le noyau. On peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu'un transporteur comme un nanotransporteur ou une préparation de liposomes, ou de polymères cationiques. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utilisant l'électroporation associée à des liposomes.
A titre d'exemples de microorganismes qui conviennent aux fins de l'invention, on peut citer les levures (Buckholz RG, Current Opinion in Biotechnology vol. 4, no. 5, 1993, pages 538 - 42) et les bactéries (Olins et Lee, Current Opinion in Biotechnology vol. 4, no. 5, 1993, pages 520 - 5). A titre d'exemples de cellules eucaryotes, on peut citer les cellules provenant d'animaux tels que les mammifères (Edwards CP et Aruffo A, Current Opinion in Biotechnology vol . 4, no. 5, 1993, pages 558 - 63), les reptiles, et équivalent. On peut également utiliser les cellules de plantes. Parmi les cellules de mammifère, on peut notamment utiliser les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO), du singe (cellules COS et Vero), du rein de hamster nain (cellules BHK), du rein de cochon (cellules PK 1 5) et du rein de lapin (cellules RK13, les lignées cellulaires humaines de l'ostéosarcome (cellules 143 B), les lignées cellulaires humaines HeLa et les lignées cellulaires humaines de l'hépatome (du type cellules Hep G2). Il est également possible d'utiliser des cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en œuvre des baculovirus par exemple (Luckow VA, Journal of Virology vol. 67, no. 8, 1993, pages 4566 - 79). Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la cellule hôte utilisée pour produire le fragment de l'invention est une bactérie, de préférence la bactérie E. coli. L'homme du métier connaît les conditions dans lesquelles cultiver ces cellules, ainsi que les conditions expérimentales nécessaires à l'expression des fragments polypeptidiques par ces cellules.
Le procédé de production de PIGF recombinant peut comprendre les étapes suivantes : a) la culture dans un milieu et conditions de culture appropriés d'une cellule hôte comprenant le vecteur codant pour PIGF ; et b) l'isolement du PIGF produit à l'étape a).
Le PIGF peut être isolé (purifié) à partir de la cellule l'exprimant. Dans ce cas, une étape préalable de lyse desdites cellules pourra être nécessaire. Les milieux et conditions de culture associées à chaque type cellulaire utilisé pour la production de protéines recombinantes sont bien connus de l'homme du métier.
L'isolement (ou la purification) de PIGF peut se faire par tout moyen connu de l'homme du métier. On citera par exemple la précipitation différentielle ou l'ultracentrifugation. Il peut être également avantageux de purifier le PIGF par chromatographie d'échange ionique, par chromatographie d'affinité, par tamisage moléculaire, ou par isofocalisation. Toutes ces techniques sont décrites dans Voet D et Voet JG, Techniques de purification des protéines et des acides nucléiques, chapitre 6, Biochimie, 2nde édition.
Plus précisément, dans une première étape, le matériel dont on veut extraire la protéine (tissu animal ou végétal, bactéries, etc) est généralement broyé. Divers appareils ("Waring Blender", appareil Potter-Eveljhem, "Polytron", etc) peuvent être employés à cette fin. Cette homogénéisation se fait dans un tampon de composition appropriée, bien connue de l'homme du métier. L'homogénat ainsi obtenu est ensuite clarifié, le plus souvent par centrifugation, pour éliminer les grosses particules peu ou mal broyées ou encore pour obtenir la fraction cellulaire contenant la protéine recherchée. Si la protéine est justement dans un compartiment cellulaire, on utilise généralement un détergent doux (Triton X-100, Tween 20, Désoxycholate de sodium, etc) pour la libérer en dissolvant les membranes de ce compartiment. L'emploi de détergent doit souvent être fait de façon contrôlée car ils peuvent briser les lysosomes, ce qui libère des enzymes hydrolytiques (protéases, nucléases, etc. ) qui peuvent attaquer et détruire les protéines ou autres molécules qu'on veut isoler. Des précautions particulières doivent être prises si on travaille avec des protéines sensibles à la dégradation ou peu nombreuses. Une solution fréquente à ce problème est l'inclusion dans les solutions d'inhibiteurs de protéases qui sont physiologiques (inhibiteurs de trypsine, antipaïne, leupeptine, etc) ou artificiels (E64, PMSF, etc). Ensuite diverses techniques existent pour isoler la protéine recherchée.
Une des méthodes se prêtant le mieux à de gros volumes est la précipitation différentielle au sulfate d'ammonium. Les chromatographies d'échange ionique ou les chromatographies d ' affinité, applicables aussi à de gros volumes d'échantillon mais ayant un assez bon pouvoir de séparation, constituent de bonnes méthodes intermédiaires. Pour finaliser la purification, le tamisage moléculaire ou l'isofocalisation sont souvent utilisés. Ces techniques permettent de raffiner la pureté, mais nécessitent de très petits volumes de protéines concentrées. Il est souvent avantageux, entre ces étapes, d'éliminer les sels ou produits utilisés dans ces chromatographies. Ceci peut être obtenu par dialyse ou par ultrafiltration.
Il peut aussi être avantageux d'utiliser un vecteur portant une séquence permettant d'identifier le PIGF de l'invention. De plus, il peut être avantageux de faciliter la sécrétion dans un système procaryote ou eucaryote. En effet, dans ce cas, la protéine recombinante d'intérêt sera présente dans le surnageant de la culture cellulaire plutôt qu'à l'intérieur des cellules hôtes.
Le PIGF peut être produit à des taux atteignant au moins 1 mg par litre, de préférence 2 mg par litre, de manière encore plus préférée, 5mg par litre de culture cellulaire.
De manière alternative, il est possible de préparer le PIGF par synthèse chimique. L'homme du métier connaît les procédés de synthèse chimique, par exemple les techniques mettant en œuvre des phases solides ou utilisant des phases solides partielles, par condensation de la protéine ou par une synthèse en solution classique. Les fragments de l'invention peuvent par exemple être synthétisés par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production. Cette synthèse chimique peut être couplée à une approche de génie génétique ou par génie génétique seul en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier et décrites par exemple dans Sambrook J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 1989. Les réactifs et produits de départ sont commercialement disponibles, ou peuvent être synthétisés par des techniques conventionnelles bien connues (voir par exemple, WO 00/12508, WO 2005/085260). En particulier des analogues de PIGF peuvent être synthétisés en utilisant la technique décrite par Zheng et al. (Acta Ophthalmologica 2012 90(7) : e512 - e523). Comme indiqué précédemment, la présente invention a pour objet un PIGF pour son utilisation dans la prévention et le traitement des TCAF. On entend par « Troubles Causés par l'Alcoolisation Fœtale (TCAF) » l'ensemble des troubles chez l'enfant résultant de l'exposition à l'alcool durant la gestation. Ce terme comprend entre autres l'ensemble des troubles comportementaux qui vont se révéler progressivement avec l'âge. Les enfants présentant ces troubles sont appelés des « enfants TCAF. » Dans leur version la plus sévère, les TCAF correspondent au syndrome d'alcoolisation fœtale (SAF). Celui-ci se traduit par une dysmorphie craniofaciale (comprenant des fentes palpébrales raccourcies, un sillon naso-labial lisse, allongé, effacé et une lèvre supérieure mince) ; un retard de croissance non spécifique (taille ou poids ou périmètre crânien) prénatal ou postnatal ou les deux ; des malformations diversement associées (cardiopathies, malformations uro-génitales, malformations digestives ou troubles de l'architecture cérébrale) et des troubles du développement neurologique s'exprimant parfois par un retard mental et plus souvent par des difficultés d'apprentissage. Les enfants atteints de SAF sont appelés des « enfants SAF ». La majorité des enfants TCAF présente des troubles d'inadaptation et du comportement qui se révèlent progressivement avec l'âge (comprenant des difficultés d'allaitement et d'alimentation, des troubles du sommeil puis, à l'âge scolaire, des anomalies du comportement, des troubles cognitifs retentissant sur l'apprentissage, des déficits intellectuels avec un Ql abaissé de 20 points (1 à 2 écarts type), des difficultés d'apprentissage de la lecture (dyslexie) et plus encore du calcul (dyscalculie), des troubles de l'attention accompagnés d'hyperactivité ou d'hypercinésie. Ils sont connus sous le nom de Syndrome Déficitaire de l'Attention avec hyper kinésie (SDAH) (ou Attention Déficit Hyperactivity Desorder (ADHD) en anglais). Le terme TCAF est parfois substitué par le terme TSAF (Troubles du Spectre de l'Alcoolisation Fœtale) correspondant (ou Fetal Alcohol Spectrum Discorder (FASD) en anglais). Une définition complète des TCAF est donnée dans le Rapport de l'Académie Nationale Française de Médecine relatif à l'alcoolisation fœtale (adopté le 22 mars 2016).
Les inventeurs ont précédemment montré que l'exposition à l'alcool cause des atteintes vasculaires cérébrales. Par « atteinte vasculaire cérébrale », on entend ici toute altération du système vasculaire cérébral, notamment une altération entraînant un fonctionnement altéré, voire défectueux dudit système. Une atteinte vasculaire cérébrale dans le contexte de l'invention peut notamment être une désorganisation du système vasculaire cérébral. Plus particulièrement, l'alcoolisation fœtale induit une orientation aléatoire des vaisseaux cérébraux. Selon un mode de réalisation particulier, le trouble de l'alcoolisation fœtale est lié à une atteinte vasculaire cérébrale. Encore plus particulièrement, ledit trouble de l'alcoolisation fœtale est lié à une désorganisation du système vasculaire cérébral.
Les inventeurs ont également démontré par leurs travaux précédents que l'alcoolisation fœtale provoque une défaillance dans l'angiogenèse cérébrale. L'angiogenèse cérébrale est le processus de formation de vaisseaux sanguins dans le cerveau.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, le PIGF est utilisé pour stimuler l'angiogenèse cérébrale et ainsi améliorer le fonctionnement cérébral.
Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, le PIGF peut être utilisé pour prévenir et/ou traiter au moins un TCAF choisi parmi un quelconque des troubles de l'inadaptation et du comportement cités ci-dessus. Le PIGF peut aussi être utilisé pour prévenir et/ou traiter le syndrome d'alcoolisation fœtale (SAF), notamment lorsque le SAF se manifeste sous forme d'une hypotrophie.
Dans le contexte de la présente invention, le terme « Syndrome d'Alcoolisation Fœtale (SAF) » désigne la manifestation la plus extrême et invalidante des troubles causés par l'alcoolisation fœtale (TCAF). Elle associe des anomalies physiques comme une hypotrophie (retard de croissance), une dysmorphie cranio-faciale et des anomalies neurocomportementales se traduisant par des troubles des fonctions cognitives (troubles de l'attention, de la motricité, de l'apprentissage ou encore de la mémorisation). On parle de SAF partiel lorsque l'enfant ne présente qu'une partie des symptômes SAF. Les enfants SAF partiels présentent toutefois toujours une ou des anomalies neurocomportementales.
Dans le contexte de l'invention, un enfant SAF, en particulier un nouveau-né, est considéré comme "hypotrophique" si son poids et sa taille sont en dessous du 10e percentile des courbes de référence. C'est souvent le cas des nouveau-nés prématurés et des nouveau-nés exposés in utero à l'alcool. L'hypotrophie peut aussi être diagnostiquée avant terme, par échographie : on parle alors d'hypotrophie fœtale ou de retard de croissance intra-utérin.
Les inventeurs ont en outre démontré que l'augmentation de la quantité de PIGF permet d'augmenter la taille du corps entier d'un fœtus ou de l'une ou plusieurs de ses parties, en particulier la taille du crâne, la taille du corps, la taille d'abdomen et sa profondeur. Cela permet ainsi le rétablissement partiel ou complet de l'aspect morphométrique normal. L'administration de PIGF permet donc de compenser l'hypotrophie des sujets SAF qui représentent les formes les plus graves de TCAF. Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne ainsi un PIGF pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement du SAF, notamment lorsque le SAF se manifeste sous forme d'une hypotrophie due à l'exposition intra-utérine à l'alcool. En particulier, il s'agit d'une hypotrophie du corps entier d'un sujet ou de l'une ou plusieurs de ses parties choisies parmi le torse (ou encore appelé le corps), l'abdomen et le crâne. En particulier le sujet est un fœtus ou un enfant, en particulier un prématuré.
Selon un mode de réalisation de la présente invention le sujet ayant été exposé in utero à l'alcool est choisi parmi un embryon, un fœtus ou un enfant, de préférence un fœtus ou un enfant, en particulier, un enfant prématuré. La période entre la 30ème semaine gestationnelle et le terme de la grossesse est celle pendant laquelle l'angiogenèse cérébrale est la plus importante. Il est ainsi particulièrement préféré d'administrer le PIGF à un fœtus exposé in utero à l'alcool à cette période précisément.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, lorsque le sujet TCAF est un enfant prématuré, le traitement consistera à supplémenter en PIGF ce sujet sur la période ex utero correspondante aux semaines de vie intra-utérines perdues. De préférence, la fenêtre de traitement peut s'étendre de la 30ème semaine gestationnelle au terme théorique (40 semaines gestationnelles), période durant laquelle l'angiogenèse cérébrale chez l'Homme est particulièrement intense.
On entend par « sujet » selon l'invention un humain, et de préférence un embryon, un fœtus ou un enfant. Un « embryon », tel qu'on l'entend ici, correspond à un ovocyte fécondé de moins de trois mois. Par « fœtus », on entend ici un individu pris avant la naissance et dont l'âge gestationnel est compris entre 3 et 9 mois. Après l'accouchement, le sujet devient un enfant. Par « enfant », on entend selon l'invention un individu dont l'âge est inférieur à 3 ans. Sont ainsi compris dans la catégorie des enfants selon l'invention, les nouveau-nés, dont l'âge est compris entre 0 et 1 mois, les nourrissons, qui ont entre 1 mois et 2 ans, et les enfants proprement dits, qui sont âgés d'au moins 2 ans. Un « nouveau-né », comme on l'entend ici, peut aussi bien être né à terme qu'être prématuré. Dans le contexte de la présente demande le terme « prématuré » désigne un enfant né vivant avant 37 semaines d'aménorrhée. Ce terme recouvre trois sous-catégories : la prématurité extrême (<28 semaines); la grande prématurité (entre la 28e et la 32e semaine); la prématurité moyenne, voire tardive (entre la 32e et la 37e semaine). Dans la présente invention les enfants prématurés traités par PIGF sont de préférence dans la catégorie de prématurité moyenne, voire tardive.
L'expression « un sujet avec des troubles d'alcoolisation fœtale » ou « sujet TCAF » telle qu'utilisée ici se rapporte à un embryon, un fœtus ou un sujet, en particulier humain, qui est exposé ou susceptible d'être exposé à l'alcool in utero et qui souffre de troubles d'alcoolisation fœtale ou qui est en danger de développer en raison de la consommation maternelle d'alcool une des conditions liées aux troubles d'alcoolisation fœtale, y compris les effets décrits ci- dessus. En particulier, un sujet TCAF peut avoir une taille du corps entier ou de ses parties inférieure à la normale et un réseau vasculaire cérébral désorganisé, ladite désorganisation étant notamment liée à une orientation aléatoire des vaisseaux cérébraux. Lorsqu'un sujet TCAF est atteint en particulier par un SAF, on parle dans ce cas d'un « sujet SAF ».
Par « traitement », on entend ici toute action permettant de diminuer ou d'éradiquer les symptômes ou les causes des TCAF. Un traitement au sens de l'invention peut comprendre l'administration de PIGF, d'une composition pharmaceutique ou d'un produit le comprenant avec ou sans un suivi psychothérapeutique.
Par « prévention », on entend ici toute action permettant de prévenir complètement ou partiellement le risque d'apparition des symptômes ou les causes des TCAF. Une prévention au sens de la présente invention comprend l'administration de PIGF, d'une composition pharmaceutique, à un sujet exposé in utero à l'alcool ou à un sujet ayant été exposé in utero à l'alcool mais pour lequel les symptômes de TCAF ne sont pas encore apparus et l'angiogenèse cérébrale toujours en cours. Les inventeurs mettent à profit le fait que le PIGF est un facteur angiogénique naturellement présent à ces stades du développement fœtal chez un sujet sain ce qui présente l'avantage d'une utilisation aisée de PIGF par compensation dans la prévention de TCAF. Selon un mode de réalisation de la présente invention, le facteur de croissance placentaire est administré en une quantité thérapeutiquement efficace à un sujet ayant été exposé à l'alcool in utero.
Dans le contexte de l'invention, « une quantité thérapeutiquement efficace » signifie une quantité suffisante pour influencer le cours thérapeutique d'un état pathologique particulier. Une quantité thérapeutiquement efficace est également celle à laquelle tous les effets toxiques ou secondaires de l'agent sont compensés par les effets thérapeutiquement bénéfiques du principe actif utilisé.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, le facteur de croissance placentaire (PIGF) est administré in utero et/ou ex utero. Il est ainsi envisageable de débuter un traitement (ou une prévention) par l'administration de PIGF durant la période intra-utérine et de le continuer après l'accouchement notamment lorsque l'enfant est né prématurément et qu'il perd par conséquent l'apport physiologique du PIGF placentaire.
De préférence, le PIGF sera administré seul ou dans une composition pharmaceutique par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, sous-cutanée, ou orale. De manière plus préférée, le PIGF sera administré à plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps.
En particulier, lorsque l'administration de PIGF est effectuée in utero, celle-ci a lieu de préférence directement au niveau placentaire afin d'atteindre plus rapidement le cerveau fœtal et éviter la dégradation de la protéine par l'organisme maternel. Lorsque l'administration de PIGF a lieu après la naissance, de préférence, celui-ci est administré par voie parentérale, de préférence intraveineuse surtout s'il s'agit d'un enfant prématuré ou d'un nouveau-né.
Les modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés.
Lorsque le PIGF est administré sous forme de compositions pharmaceutiques, pour l'administration sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique locale, le PIGF peut être administré sous formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques au sujet en ayant besoin. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie intramusculaire, intraveineuse.
Comme indiqué ci-dessus, le choix de la voix d'administration la plus appropriée dépendra du moment où cette administration sera effectuée. En particulier, lorsque l'administration d'une composition cosmétique comprenant PIGF est effectuée in utero, celle-ci se fera par voie intermusculaire ou voie intraveineuse, de préférence au niveau placentaire. L'administration de la composition pharmaceutique comprenant le PIGF à un enfant nouveau-né ou un en enfant prématuré est faite de préférence par voie intraveineuse.
Pour une administration parentérale, intranasale ou intraoculaire, on utilise des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents de dispersion et/ou des agents mouillants pharmacologiquement compatibles.
Les formes pour l'administration parentérale sont obtenues de façon conventionnelle par mélange du PIGF avec des tampons, des agents stabilisants, des conservateurs, des agents solubilisants, des agents isotoniques et des agents de mise en suspension. Conformément aux techniques connues, ces mélanges sont ensuite stérilisés puis conditionnés sous la forme d'injections intraveineuses.
A titre de tampon, l'homme du métier pourra utiliser des tampons à base de sels de phosphate organique. Des exemples d'agents de mise en suspension englobent le méthylcellulose, l'hydroxyéthylcellulose, l'hydroxypropylcellulose, l'acacia et la carboxyméthylcellulose sodique. En outre, des stabilisants utiles selon l'invention sont le sulfite de sodium et le métasulfite de sodium, tandis que l'on peut citer le p-hydroxybenzoate de sodium, l'acide sorbique, le crésol et le chlorocrésol en tant que conservateurs.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées de manière à être administrées au patient par une unique voie ou par des voies différentes. La posologie dépend naturellement de la forme sous laquelle le PIGF sera administré, du mode d'administration, de l'indication thérapeutique, de l'âge du patient et de son état.
La dose à administrer est préférablement de 0,001 à 250 mg/kg de PIGF par jour, de préférence de 0,01 à 100 mg/kg de PIGF par jour, de manière plus préférée de 0,1 à 50 mg/kg de PIGF par jour et de manière encore plus préférée de 1 à 25 mg/kg de PIGF par jour. La dose unitaire du PIGF comprend de préférence de 0,1 à 50 mg/kg de ce composé.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, la dose initialement administrée du PIGF pourra être ajustée si nécessaire au cours d'un traitement en fonction de la réponse à ce traitement du sujet traité. L'Homme du métier se basant sur ces connaissances générales et sur la présente description saura ajuster la dose de PIGF de manière à optimiser son effet thérapeutique.
Comme mentionné plus haut dans la description, le facteur de croissance placentaire (PIGF) peut être utilisé également sous la forme de principe actif dans une composition pharmaceutique.
Selon un second aspect, la présente invention concerne ainsi une composition pharmaceutique comprenant un facteur de croissance placentaire (PIGF) tel que défini ci-dessus et un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des troubles causés par l'alcoolisation fœtale (TCAF). La composition pharmaceutique selon la présente invention peut être utilisée dans la prévention et/ou le traitement de différents types de TCAF comme décrit pour le PIGF ci-dessous. En particulier, ces TCAF sont choisis dans le groupe comprenant les troubles d'inadaptation et du comportement ou le syndrome d'alcoolisation fœtale (SAF), notamment lorsqu'il se manifeste sous forme d'une hypotrophie et l'atteinte vasculaire cérébrale due à l'exposition à l'alcool in utero.
La composition de la présente invention peut être également utilisée pour améliorer l'angiogenèse cérébrale d'un sujet ayant été exposé à l'alcool in utero.
On entend par « véhicule pharmaceutiquement acceptable » au sens de la présente invention, toute matière qui est appropriée à une utilisation dans un produit pharmaceutique. A titre d'exemple de véhicule pharmaceutiquement acceptable, on peut citer le lactose, l'amidon éventuellement modifié, la cellulose, l'hydroxypropylméthyl cellulose, le mannitol, le sorbitol, le xylitol, le dextrose, le sulfate de calcium, le phosphate de calcium, le lactate de calcium, les dextrates, l'inositol, le carbonate de calcium, la glycine, la bentonite et leurs mélanges.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut se présenter sous différentes formes et être administrée de différentes manières comme indiquées plus haut en détails.
Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique de la présente invention comprend un PIGF en tant que principe actif en une concentration comprise entre 0.001 mg/kg et 250 mg/kg en poids par rapport au poids total du sujet auquel la composition pharmaceutique sera administrée. Préférentiellement, la concentration de PIGF est comprise entre 0,01 mg/kg et 100 mg/kg en poids par rapport au poids du sujet auquel la composition pharmaceutique sera administrée et encore plus particulièrement, entre 0,15 mg/kg et 50 mg/kg en poids par rapport au poids du sujet auquel la composition pharmaceutique sera administrée ou encore, entre 1 mg/kg et 25 mg/kg en poids par rapport au poids total du sujet auquel la composition sera administrée.
Les inventeurs ont démontré que l'augmentation de la quantité de PIGF est particulièrement efficace dans le rétablissement de l'atteinte de la vascularisation cérébrale permettant ainsi de ramener la fonction neuronale à un état normal.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, le PIGF ou la composition pharmaceutique le comprenant est donc utilisé pour le traitement et/ou la prévention des atteintes de la vascularisation cérébrale dues à l'exposition à l'alcool in utero.
En outre, les inventeurs ont également démontré que l'augmentation de la quantité de PIGF permet d'augmenter la taille du corps entier d'un fœtus ou l'une ou plusieurs de ses parties, en particulier la taille du crâne, la taille du corps, la taille d'abdomen et sa profondeur après une exposition à l'alcool pendant la période intra-utérine. Cela permet ainsi le rétablissement partiel ou complet de l'aspect morphométrique normal.
Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne ainsi un PIGF ou une composition pharmaceutique le comprenant pour son utilisation dans la prévention et/ ou le traitement de l'hypotrophie due à l'exposition intra-utérine à l'alcool, notamment lorsque cette hypertrophie est une manifestation du SAF. En particulier, il s'agit d'une hypotrophie du corps entier d'un sujet ou de l'une ou plusieurs de ses parties choisies parmi le torse (ou encore appelé le corps), l'abdomen et le crâne. En particulier le sujet est un sujet SAF qui est un fœtus ou un nouveau-né, en particulier un prématuré.
Un quatrième aspect de l'invention a pour objet une méthode de traitement de troubles de l'alcoolisation fœtale chez un sujet. Ladite méthode comprend une étape d'administration ou surexpression de PIGF ou l'administration d'une composition pharmaceutique le comprenant à un sujet présentant des TCAF comprenant en particulier le syndrome d'alcoolisation fœtale (SAF), notamment lorsqu'il se manifeste sous forme d'une hypotrophie et/ou une atteinte vasculaire cérébrale d'un sujet ayant été exposé à l'alcool in utero. Cette méthode de traitement peut comprendre au préalable une étape de diagnostic de TCAF. Selon un cinquième aspect la présente invention concerne le facteur de croissance placentaire (PIGF), une composition pharmaceutique ou un produit le comprenant selon l'invention pour l'utilisation dans le traitement des TCAF, ladite utilisation comprenant une étape préalable à Identification du sujet, ladite identification comprenant les étapes suivantes: a) mesure de la quantité de PIGF dans un échantillon biologique dudit sujet, de préférence provenant du placenta ou du sang du cordon ; b) comparaison de la quantité de PIGF de l'étape a) avec une référence qui est une mesure de la quantité de PIGF dans un individu sain, et c) détermination d'un TCAF ou du risque de développer un TCAF chez ledit sujet. On entend par « échantillon biologique » selon l'invention tout échantillon qui peut être prélevé à partir d'un sujet. Alternativement, l'échantillon biologique est un échantillon provenant du placenta, notamment du cordon ombilical. En effet, le PIGF est exprimé par des cellules du placenta tout au long de la grossesse. Cela permet de doser le PIGF sans attenter à l'intégrité du sujet, en particulier quand celui-ci est un embryon ou un fœtus. De façon générale, l'échantillon biologique doit permettre la détermination du taux d'expression de PIGF. L'échantillon à tester peut être utilisé comme obtenu directement à partir de la source biologique ou à la suite d'un prétraitement pour modifier le caractère de l'échantillon. Par exemple, un tel prétraitement peut inclure la préparation de plasma à partir de sang, la dilution de fluides visqueux et ainsi de suite. Des procédés de prétraitement peuvent aussi impliquer la filtration, la précipitation, la dilution, la distillation, le mélange, la concentration, l'inactivation de composants perturbateurs, l'addition des réactifs, une lyse, etc. En outre, il peut être bénéfique de modifier un échantillon d'essai solide pour former un milieu liquide ou pour libérer l'analyte.
La protéine PIGF est une protéine sécrétée (DeFalco, Exp Mol Med. 44(1 ): 1 -9, 2012). Les échantillons biologiques préférés pour la détermination du taux d'expression de ladite protéine comprennent en particulier les échantillons de sang, de plasma, ou de lymphe. De préférence, l'échantillon biologique est un échantillon de sang. De façon encore plus préférée, l'échantillon biologique est un échantillon de sang du placenta ou de sang de cordon. Celui-ci est en effet habituellement recueilli lors de l'accouchement. Le sang des vaisseaux placentaires peut alors être obtenu pour mesurer le taux de PIGF. Selon un mode de réalisation, lorsque la quantité de PIGF mesurée à l'étape a) est inférieure à la référence le sujet est déterminé comme souffrant de ou ayant un risque de développer un TCAF et en particulier une atteinte de la vascularisation cérébrale ou un SAF, notamment une hypotrophie. Selon la présente invention, la quantité de PIGF est mesurée lorsqu'un sujet présente au moins un trouble pouvant être lié à l'exposition à l'alcool intra-utérine. La quantité de PIGF sera également mesurée lorsqu'un sujet ne présente pas un ou plusieurs troubles particuliers liés à l'exposition d'alcool intra-utérine mais pour qui l'exposition à l'alcool pendant cette période a été avérée ou supposée. Ainsi, la mesure de la quantité de PIGF comme décrit ci-dessus permettra de confirmer ou d'infirmer un TCAF ou le risque d'en développer un avant la prise en charge thérapeutique.
Selon un mode de réalisation, la quantité de PIGF est déterminée en mesurant la quantité de transcrits codant le PIGF ou la quantité du polypeptide.
Le taux d'expression génique ou protéique peut être mesuré par de nombreuses méthodes qui sont à la disposition de l'homme du métier. Il peut y avoir plusieurs étapes intermédiaires entre le prélèvement de l'échantillon biologique et la mesure de l'expression de PIGF, lesdites étapes correspondant à l'extraction à partir dudit échantillon d'un échantillon d'ARNm (ou de l'ADNc correspondant) ou d'un échantillon de protéine. Celui-ci peut ensuite être directement utilisé pour mesurer l'expression de PIGF. La préparation ou l'extraction d'ARNm (ainsi que la rétrotranscription de celui-ci en ADNc) ou de protéines à partir d'un échantillon cellulaire ne sont que des procédures de routine bien connues de l'homme du métier.
Une fois qu'un échantillon d'ARNm (ou d'ADNc correspondant) ou de protéine est obtenu, l'expression de PIGF, au niveau soit des ARNm (c'est-à-dire dans l'ensemble des ARNm ou des ADNc présents dans l'échantillon), soit des protéines (c'est-à-dire dans l'ensemble des protéines présentes dans l'échantillon), peut être mesurée. La méthode utilisée pour ce faire dépend alors du type de transformation (ARNm, ADNc ou protéine) et du type d'échantillon disponible.
Quand l'expression de PIGF est mesurée au niveau de l'ARNm (ou d'ADNc correspondant), n'importe quelle technologie habituellement utilisée par l'homme du métier peut être mise en œuvre. Ces technologies d'analyse du niveau d'expression des gènes, comme par exemple l'analyse du transcriptome, incluent des méthodes bien connues telles que la PCR (Polymerase Chain Reaction, si on part d'ADN), la RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, si on part d'ARN) ou la RT-PCR quantitative ou encore les puces d'acides nucléiques (dont les puces à ADN et les puces à oligonucléotides) pour un plus haut débit.
Par « puces d'acides nucléiques », on entend ici plusieurs sondes d'acides nucléiques différentes qui sont attachées à un substrat, lequel peut être une micropuce, une lame de verre, ou une bille de la taille d'une microsphère. La micropuce peut être constituée de polymères, de plastiques, de résines, de polysaccharides, de silice ou d'un matériau à base de silice, de carbone, de métaux, de verre inorganique, ou de nitrocellulose.
Les sondes peuvent être des acides nucléiques tels que les ADNc (« puce à ADNc »), les ARNm (« puce à ARNm ») ou des oligonucléotides (« puce à oligonucléotides »), lesdits oligonucléotides pouvant typiquement avoir une longueur comprise entre environ 25 et 60 nucléotides.
Pour déterminer le profil d'expression d'un gène particulier, un acide nucléique correspondant à tout ou partie dudit gène est marqué, puis mis en contact avec la puce dans des conditions d'hybridation, conduisant à la formation de complexes entre ledit acide nucléique cible marqué et les sondes attachées à la surface de la puce qui sont complémentaires de cet acide nucléique. La présence de complexes hybridés marqués est ensuite détectée.
Ces technologies permettent de suivre le niveau d'expression d'un gène en particulier ou de plusieurs gènes voire même de tous les gènes du génome (full génome ou full transcriptome) dans un échantillon biologique (cellules, tissus ...). Ces technologies sont utilisées en routine par l'homme du métier et il n'est donc pas besoin de les détailler ici.
Alternativement, il est possible d'utiliser toute technologie actuelle ou future permettant de déterminer l'expression des gènes sur la base de la quantité d'ARNm dans l'échantillon. Par exemple, l'homme du métier peut mesurer l'expression d'un gène par hybridation avec une sonde d'acide nucléique marquée, comme par exemple par Northern blot (pour l'ARNm) ou par Southern blot (pour l'ADNc), mais aussi par des techniques telles que la méthode d'analyse sérielle de l'expression des gènes (SAGE) et ses dérivés, tels que LongSAGE, SuperSAGE, DeepSAGE, etc. Il est aussi possible d'utiliser des puces à tissu (aussi connues en tant que TMAs : « tissue microarrays »). Les tests habituellement employés avec les puces à tissu comprennent l'immunohistochimie et l'hybridation fluorescente in situ. Pour l'analyse au niveau de l'ARNm, les puces à tissu peuvent être couplées avec l'hybridation fluorescente in situ. Enfin, il est possible d'utiliser le séquençage massif en parallèle pour déterminer la quantité d'ARNm dans l'échantillon (RNA-Seq ou « Whole Transcriptome Shotgun Sequencing »). À cet effet, plusieurs méthodes de séquençage massif en parallèle sont disponibles. De telles méthodes sont décrites dans, par exemple, US 4,882,127, U.S. 4,849,077; U.S. 7,556,922; U.S. 6,723,513; WO 03/066896; WO 2007/11 1924; US 2008/0020392; WO 2006/084132; US 2009/0186349; US 2009/0181860; US 2009/0181385; US 2006/0275782; EP-B1 -1141399; Shendure a Ji, Nat Biotechnol., 26(10): 1135-45. 2008; Pihlak et al. , Nat Biotechnol., 26(6) : 676- 684, 2008 ; Fuller et al. , Nature Biotechnol., 27(11 ): 1013-1023, 2009; Mardis, Génome Med., 1 (4): 40, 2009; Metzker, Nature Rev. Genêt., 1 1 (1 ): 31 -46, 2010.
De préférence, l'expression du PIGF est mesurée au niveau protéique par une méthode sélectionnée parmi l'immunohistologie, l'immunoprécipitation, le western blot, le dot blot, l'ELISA ou l'ELISPOT, les puces à protéines, les puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à l'immunohistochimie, les techniques de FRET ou de BRET, les méthodes de microscopie ou d'histochimie, dont notamment les méthodes de microscopie confocale et de microscopie électronique, les méthodes basées sur l'utilisation d'une ou plusieurs longueurs d'onde d'excitation et d'une méthode optique adaptée, comme une méthode électrochimique (les techniques voltamétrie et d'ampérométrie), le microscope à force atomique, et les méthodes de radiofréquence, comme la spectroscopie résonance multipolaire, confocale et non- confocale, détection de fluorescence, luminescence, chemiluminescence, absorbance, réflectance, transmittance, and biréfringence ou index de réfraction (par exemple, par résonance des plasmons de surface, par ellipsométrie, par méthode de miroir résonnant, etc), cytométrie de flux, imagerie par résonance radioisotopique ou magnétique, analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE); par spectrophotométrie HPLC-Mass, par chromatographie liquide/spectrophotométrie de masse/ spectrométrie de masse (LC-MS/MS).
Plus préférentiellement, la quantité de PIGF est déterminée par une méthode choisie parmi l'immunoprécipitation, l'immunohistologie, le western blot, le dot blot, l'ELISA ou l'ELISPOT, les puces à protéines, les puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à l'immunohistochimie. Des anticorps dirigés contre PIGF sont disponibles commercialement (voir par exemple, RaD Systems, Santa Cruz, Abcam, etc. ) et peuvent être utilisés dans les méthodes de l'invention. Encore plus préférablement, l'expression du PIGF est mesurée par Western Blot ou par ELISA. En outre, la quantité de PIGF est normalisée par rapport à un marqueur témoin qui peut être un gène choisi parmi B2M, TFRC, YWHAZ, RPLO, 18S, GUSB, UBC, TBP, GAPDH, PPIA, POLR2A, ACTB, PGK1 , HPRT1 , IP08 et HMBS, ou un polypeptide choisi parmi le produit desdits gènes.
Le taux de PIGF ainsi mesuré est comparé par la suite à un taux d'expression de PIGF de référence afin de déterminer s'il s'agit d'un sujet TCAF.
Par « un taux d'expression de PIGF de référence », on entend au sens de la présente demande tout taux d'expression dudit facteur utilisé à titre de référence. Par exemple, un taux d'expression de référence peut être obtenu en mesurant le taux d'expression de PIGF dans un échantillon biologique, par exemple un placenta ou le sang ombilical, d'un sujet sain, c'est-à- dire un sujet qui n'a pas été exposé à l'alcool in utero.
L'invention sera décrite plus précisément au moyen des exemples ci-dessous. Lesdits exemples sont fournis ici à titre d'illustration et ne sont pas, sauf indication contraire, destinés à être limitatifs.
LÉGENDES DES FIGURES
Figure 1. Effets de l'exposition alcoolique in utero sur l'angiogénèse corticale chez les embryons E20 de Souris. A,B: Effets de l'exposition alcoolique fœtale de GD15 à GD20 sur l'organisation des microvaisseaux corticaux chez des animaux témoin (A) et exposés à l'alcool (B). Les microvaisseaux du cerveau ont été visualisés par immunohistochimie contre CD31. Les flèches indiquent les microvaisseaux du cerveau présentant une orientation radiale dans le groupe « Témoin ». Il faut noter une perte de l'organisation radiale dans le groupe « Alcool ». I -VI : Couches corticales; CC: Corpus callosum. C: Distribution de l'orientation (catégories d'angles) des microvaisseaux corticaux dans le cortex immature de fœtus GD20. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du test x2. D: Quantification par western blot des effets de l'exposition alcoolique fœtale durant la dernière semaine de gestation sur l'expression corticale de CD31 à GD20. ns vs le groupe « Témoin » à l'aide d'un test t non-apparié.
Figure 2. Effets de l'exposition alcoolique in utero sur l'expression des membres de la famille VEGF/PIGF chez les embryons E20 de Souris. A-E: Quantification par western blot des niveaux protéiques de VEGFA (A), PIGF (B), sVEGF-RI (C), mVEGF-R1 (D) et VEGF-R2 dans le cortex des groupes « Témoin » et « Alcool ». F: Comparaison par western blot des niveaux protéiques de PIGF dans le cortex et le placenta des embryons E20 du groupe « Témoin ». *p<0.05 ; ***p<0.001 vs le groupe « Témoin » à l'aide d'un test t non-apparié. Figure 3. Effets de l'exposition alcoolique in utero sur les caractéristiques ultrastructurelles du placenta chez les souris GD20. A: Observation par marquage au violet de Cresyl de l'effet de l'exposition alcoolique sur la structure laminaire du placenta. Le côté maternel du placenta est orienté vers le haut. L'alcool affecte la ségrégation des zones de jonction et du labyrinthe (lignes pointillées). B: Quantification par analyse d'images des effets de l'alcool sur l'épaisseur de la membrane de Reichert. C,D: Observation à faible grossissement de la couche des trophoblastes géants dans les groupes « Témoin » (C) et « Alcool » (D). Les flèches indiquent les trophoblastes géants. Ceux-ci ont une forme rectangulaire typique dans le placenta du groupe « Témoin », alors que dans le groupe « Alcool », ils ont une forme arrondie. E-H: Images acquises par microscopie électronique à grossissement moyen (E,F) et fort (G, H) montrant la morphologie cellulaire des trophoblastes géants et la présence de zonula occludens (flèches) dans les groupes « Témoin » (E,G) et « Alcool » (F, H). La zonula occludens (étoiles) n'est plus visible dans les animaux traités à l'alcool. Les inserts dans E et F indiquent la zone observée à plus fort grossissement en G et H, respectivement. D: maternai decidua; J: zone de jonction; L: zone du labyrinthe; Tg: couche de trophoblastes géants. ***p<0.001 vs le groupe « Témoin » à l'aide d'un test t non -apparié.
Figure 4. Effets de l'exposition alcoolique in utero sur l'expression des protéines participant à la barrière placentaire et au métabolisme énergétique placentaire. A,B: Observation par immunohistochimie de la protéine ZO-1 dans la zone du labyrinthe du placenta de souris des groupes « Témoin » (A) et « Alcool » (B). La protéine ZO-1 apparaît comme formant des groupes de points (flèches) dans le groupe « Témoin » tandis que le marquage est diffus dans le groupe « Alcool ». Les couches de trophoblastes ont été mises en évidence par immunoréactivité avec le transporteur de glucose Glut-1 . Les noyaux ont été marqués au Hoechst. C: Double marquage avec des anticorps contre les transporteurs de monocarboxylate MCT-1 et de glucose dans la zone du labyrinthe d'un placenta « Témoin ». Par contraste avec Glut-1 , l'expression de MCT-1 est associée avec la couche maternelle du syncytiotrophoblaste. Les noyaux ont été marqués au Hoechst. D: Quantification par western blot des niveaux d'expression des protéines ZO-1 et MCT-1 dans les placentas des groupes « Témoin » et « Alcool ». *p<0.05, **p<0.01 vs le groupe « Témoin » à l'aide d'un test t non-apparié. Les analyses par Western blot ont montré que le taux de ZO-1 a diminué de façon significative dans les placentas des animaux exposés à l'alcool tandis que le taux de la protéine MCT-1 a augmenté significativement. * P <0,05, ** p <0,01 par rapport au groupe témoin en utilisant le test t non apparié. E-H : Des essais d'immunohistochimie illustrent la distribution du VEGF-R1 (E), Glut-1 (F, G) et du PIGF (H) dans les couches de syncytiotrophoblastes du placenta de souris. Les noyaux ont été marqués au Hoechst.
Figure 5. Effets de l'exposition alcoolique in utero sur l'expression des membres de la famille VEGF/PIGF dans des placentas murins. A-F: Quantification par western blot des effets de l'exposition à l'alcool pendant la dernière semaine de gestation sur l'expression placentaire of VEGF-A (A), PIGF (B), sVEGF-RI (C), mVEGF-R1 (D), VEGF-R2 (E) et CD31 (F) à GD20. G, H: Marquage par immunohistochimie montrant la distribution de VEGF-R2 (G) dans les couches de syncytiotrophoblastes du placenta marquées avec Glut-1 (H). Les noyaux ont été marqués au Hoechst. *p<0.05 vs le groupe « Témoin » à l'aide d'un test t non-apparié. Figure 6. Diffusion du Bleu Evans et du PIGF recombinant humain injectés in utero du placenta dans le cerveau du fœtus et effet de la répression placentaire du PIGF sur la vascularisation cérébrale. A,B: Visualisation au cours du temps du Bleu Evans administré par microinjection dans le placenta d'une souris gravide à GD15. La fluorescence a été détectée par illumination aux UV (A) et est représentée à l'aide d'une échelle de couleurs factices (B). C,D: Visualisation au cours du temps de la fluorescence du Bleu Evans dans le cerveau des fœtus après une microinjection placentaire à GD15. La fluorescence a été détectée par illumination aux UV (C) et est représentée à l'aide d'une échelle de couleurs factices (D). E,F: Quantification au cours du temps par spectrophotométrie de l'absorbance à 595 nm du signal du Bleu Evans injecté dans les placentas (E) et de la suite dans les cerveaux des fœtus correspondants (F). G: Quantification par ELISA du PIGF humain dans le cerveau de fœtus de souris 30 min après injection du hPIGF dans les placentas des souris gravides à GD15. *p<0.05 vs le groupe « Témoin » à l'aide d'un test t non-apparié. H : Microphotographie visualisant l'expression d'eGFP 48 heures après la transfection in utero de placentas de souris gravide GD15 avec un plasmide codant pour une eGFP. I,J : Triple coloration eGFP / Glut-1 / Hoechst indiquant que la fluorescence d'eGFP (I) est principalement associée à la couche trophoblastique fœtale (J) marquée avec Glut-1 (têtes de flèches). La partie fœtale des couches trophoblastiques est identifié par la présence de globules rouges nucléés spécifiques de la circulation fœtale (flèches). K : Visualisation par Western blot de PIGF, la GFP et les protéines d'actine dans les placentas des animaux non-transfectées (sh- / GFP -), GFP-transfectées (sh- / GFP +) et shPLGF/GFP transfectées (sh + / GFP +). L,M : Quantification par Western Blot des taux de PIGF (L) et l'expression de GFP (M) dans les placentas des animaux non-transfectées (sh- / GFP -), GFP-transfectées (sh- / GFP +) et shPLGF/GFP transfectées (sh + / GFP +) quatre jours après la transfection. N : Quantification par transfert de Western des taux d'expression du VEGF-R1 dans le cerveau de fœtus à partir des placentas non-transfectées (sh- / GFP -), GFP-transfectées (sh- / GFP +) et shPLGF/GFP transfectées (sh + / GFP +) quatre jours post-transfection. * P <0,05 vs le groupe "sh- / GFP" en utilisant le test ANOVA à sens unique suivie d'un test post-hoc de Tukey. O-R : Visualisation du système vasculaire dans le cortex de foetus à partir des placentas non transfectés (Sh- / GFP -) (0), GFP transfectés (Sh- / GFP +) (P) et shPLGF / GFP transfectés (Sh + / GFP +) (Q) Analyse statistique de la désorganisation des vaisseaux corticaux réalisée à l'aide du test de x2 (R).
Figure 7. Caractérisation morphométrique des effets de l'exposition alcoolique in utero sur le placenta humain des semaines gestationnelles 20 à 25. A,B: Marquage immunohistochimique réalisé contre CD31 et contre-coloration au bleu de toluidine pour visualiser les microvaisseaux (marrons) présents dans les villosités placentaires (bleu) des groupes « Témoin » (A) et "FAS/pFAS" (B) à des âges de gestation [20-25 WG [. C: Pourcentage de villosités classées par taille dans les placentas des groupes « Témoin » et "FAS/pFAS" à des âges de gestation [20-25 WG[. D: Répartition des vaisseaux par taille de villosités dans les placentas des groupes « Témoin » et "FAS/pFAS" à des âges de gestation [20-25 WG[. E: Surface vasculaire par taille de villosités dans les placentas des groupes « Témoin » et "FAS/pFAS" à des âges de gestation [20-25 WG[.*p<0,05 vs le groupe « Témoin » à l'aide d'un test t non- apparié.
Figure 8. Caractérisation morphométrique des effets de l'exposition alcoolique in utero sur le placenta humain des semaines gestationnelles 25 à 35. A,B: Marquage immunohistochimique réalisé contre CD31 et marquage au bleu de toluidine pour visualiser les microvaisseaux (marrons) présents dans les villosités placentaires (bleu) des groupes « Témoin » (A) et "FAS/pFAS" (B) à des âges de gestation [25-35 WG[. C: Pourcentage de villosités classées par taille dans les placentas des groupes « Témoin » et "FAS/pFAS" à des âges de gestation [25- 35 WG [. D: Répartition des vaisseaux par taille de villosités dans les placentas des groupes « Témoin » et "FAS/pFAS" à des âges de gestation [25-35 WG[. E: Surface vasculaire par taille de villosités dans les placentas des groupes « Témoin » et "FAS/pFAS" à des âges de gestation [25- 35 WG[. *p<0,05 vs le groupe « Témoin » à l'aide d'un test t non-apparié.
Figure 9. Caractérisation morphométrique des effets de l'exposition alcoolique in utero sur le placenta humain des semaines gestationnelles 35 à 42. A,B: Marquage immunohistochimique réalisé contre CD31 et marquage au bleu de toluidine pour visualiser les microvaisseaux (marrons) présents dans les villosités placentaires (bleu) des groupes « Témoin » (A) et "FAS/pFAS" (B) à des âges de gestation allant de [35-42 WG[. La région luminale des microvaisseaux est fortement réduite dans le groupe "FAS/pFas". C: Pourcentage de villosités classées par taille dans les placentas des groupes « Témoin » et "FAS/pFAS" à des âges de gestation allant de [35-42 WG[. D: Répartition des vaisseaux par taille de villosités dans les placentas des groupes « Témoin » et "FAS/pFAS" à des âges de gestation allant de [35-42 WG[. E: Surface vasculaire par taille de villosités dans les placentas des groupes « Témoin » et "FAS/pFAS" à des âges de gestation allant de [35-42 WG[.*p<0,05 vs le groupe « Témoin » à l'aide d'un test t non-apparié.
Figure 10. Effets au cours du temps de l'exposition alcoolique in utero sur les densités de villosités et de vaisseaux dans des placentas humains et caractérisation par western blot de protéines pro-angiogéniques et du métabolisme énergétique. A: Evolution des densités de villosités dans les placentas des groupes « Témoin » (A) et "FAS/pFAS" (B) à des âges de gestation [20-25 WG[, [25-35 WG[ et [35-42 WG[. B: Evolution des densités de vaisseaux dans les placentas des groupes « Témoin » et "FAS/pFAS" à des âges de gestation [20-25 WG[, [25- 35 WG[ et [35-42 WG[. p<0,05, p<0.01 vs le groupe « Témoin » comme indiqué sur le graphe. *p<0,05, ***p<0.001 pour les groupes « Témoin » vs « Alcool » pour une classe donnée d'âge gestationnel. C-H: Quantification par western blot des niveaux protéiques de ZO-1 (C), MCT-1 (D), PIGF (E), VEGFA (F), VEGF-R1 (G) et VEGF-R2 (H) dans les placentas des groupes « Témoin » et "FAS/pFAS". *p<0,05 vs le groupe « Témoin » à l'aide d'un test t non-apparié.
Figure 1 1. Comparaison des atteintes cérébrales et placentaires observées chez les fœtus humains et induites par l'exposition alcoolique in utero et corrélation statistique. A-H:
Organisation vasculaire dans les cerveaux (A,D) et les placentas (E,H) de patients du groupe « Témoin » a WG22 (A,E) et WG31 (C,G) et organisation vasculaire dans les cerveaux (B,D) et les placentas (F, H) des patients du groupe "FAS/pFAS" à WG21 (B,F) et WG33 (D,H). I,J: Corrélation statistique entre la désorganisation vasculaire corticale et la densité vasculaire placentaire dans les patients des groupes « Témoin » (I) et FAS/pFAS (J).
Figure 12. Effets de la surexpression de PIGF in utero sur la croissance du fœtus et de la vascularisation corticale lors de l'exposition intra-utérine à l'alcool. A,B : Une approche d'activation PGF/CRISPR/dCas9 couplée à une électroporation du placenta in utero a été réalisée à GD13 (A) et la surexpression de PIGF a été contrôlée à GD20 (B). Dans le groupe « Alcool », l'exposition à l'alcool in utero a lieu entre GD15 et GD20. C,D : Visualisation de fœtus E20 issues de souris gravides exposées à du NaCl (C) ou l'alcool (D). Il est à noter la petite taille des fœtus exposés à l'alcool. Les barres indiquent des mesures morphométriques qui ont été réalisées (taille de la tête (a); la taille du corps (b), la taille de l'abdomen (c) et la taille du foetus entier (a + b)). E,F : Visualisation de fœtus E20 issues de souris gravides après électroporation in utero des plasmides PGF/CRISPR-dCas9 dans les placentas de groupes « Témoin » (E) ou des souris gravides exposées à l'alcool (F). G, H : Quantification de la taille de l'abdomen (G) et du foetus entier (H) dans le groupe « Témoin » (NaCl) et dans le groupe « Alcool ». Dans une même corne utérine certains placentas n'ont pas subis d'électroporation (barres noires), d'autres ont subis une électroporation avec le plasmide CRISPR-cas9 de contrôle (barres grises) ou une électroporation avec les plasmides PGF/CRISPR-dCas9 (barres blanches) ## p <0,01 ; ### p < 0,001 ; #### p <0,0001 vs le groupe « Témoin » et *p <0,05; **p <0,01 ; ****p <0,0001 comme indiqué en utilisant le test ANOVA à deux voies suivi d'un test post-hoc de Tukey. I-K : Visualisation du système vasculaire dans le cortex du foetus E20 à partir des placentas de contrôle (NaCl) / non transfectés (I), d'alcool / contrôle de CRISPR-cas9 transfectés (J) et d'alcool PGF/CRISPR-dCas9 transfectés. On note que la surexpression du PIGF au niveau placentaire corrige la désorganisation de la vascularisation cérébrale induite par l'alcoolisation in utero. L: Quantification du pourcentage des vaisseaux radiaux dans le cortex des fœtus E20 à partir des placentas n'ayant pas subi d'électroporation (barres noires), ayant subis une électroporation avec des plasmides contrôle CRISPR-cas9 (barres grises) et une électroporation avec des plasmides PGF CRISPR-dCas9 (barres blanches). #p <0,05 ; ##p<0,01 vs le groupe « Témoin » et *p <0,05 comme indiqué en utilisant le test ANOVA à deux voies suivi d'un test post-hoc de Tukey.
Figure 1 3. Effets de la surexpression placentaire de PIGF sur la taille de la tête et du corps du fœtus E20 dans les groupes « Témoin » et « Alcool ». A,B : Quantification de la taille de la tête (A) et du corps (B) dans le groupe « Témoin » (NaCl) et le groupe « Alcool ». Dans une même corne utérine certains placentas n'ont pas subi d'électroporation (barres noires), d'autres ont subis une électroporation avec les plasmides de contrôle CRISPR-cas9 (barres grises) ou une électroporation avec des plasmides PGF CRISPR-dCas9 (barres blanches). ## P <0,01 ; ### P <0,001 ; #### P <0,0001 par rapport au groupe « Témoin » et * p <0,05; ** P <0,01 comme indiqué en utilisant le test ANOVA à deux voies suivi d'un test post-hoc de Tukey. EXEMPLES
Exemples A : Anomalies suite à une alcoolisation in utero Les exemples A ci-dessous regroupent plusieurs résultats des tests réalisés antérieurement à la présente invention démontrant que chez la Souris et l'Homme :
• l'alcoolisation fœtale impacte l'angiogenèse cérébrale et l'organisation du réseau vasculaire cérébral,
• ces altérations cérébrales sont corrélées avec des anomalies vasculaires du placenta,
• un facteur pro-angiogénique placentaire est en mesure d'atteindre le cerveau fœtal,
• les anomalies neurodéveloppementales de l'angiogenèse cérébrale chez les enfants TCAF sont associées à une dérégulation du système PIGF placentaire/VEGF-R1 cérébral,
• une invalidation placentaire du PIGF reproduit les effets de l'alcoolisation fœtale sur le VEGF-R1 cérébral, et
• une dérégulation des taux placentaires de PIGF suite à une alcoolisation fœtale permet de prédire une atteinte cérébrale.
Anomalies de l'angiogenèse cérébrale suite à une alcoolisation in utero
Effets d'une exposition in utero à l'alcool sur le développement du réseau vasculaire cérébral
Les présents inventeurs ont précédemment démontré qu'une alcoolisation prénatale à l'alcool induit une désorganisation vasculaire cérébrale. En particulier, l'effet de l'alcool est associé à une diminution significative du nombre de vaisseaux corticaux présentant une orientation radiale au profit du nombre de microvaisseaux possédant une orientation aléatoire (Figure 1 ). Parallèlement à l'étude effectuée chez la Souris, une analyse du système microvasculaire cérébral chez l'Homme a montré que, comme chez la Souris, les microvaisseaux corticaux qui ont une orientation radiale dans le groupe « Témoin » sont totalement désorganisés dans le groupe « FAS/pFAS » (Figure11 et Jegou et al., vol. 72, no. 6, 31 december 2012, pages 952- 960).
Effets d'une exposition in utero à l'alcool sur l'expression de gènes représentatifs du système vasculaire chez la Souris
Les études de RT-PCR quantitative (ARNm) et de Western blot (protéine) ont révélé une dérégulation marquée des taux de récepteurs VEG F- R1 et VEGF-R2 qui relaient les effets pro- angiogéniques de facteurs comme le VEGFA ou encore le PIGF. Les anomalies du réseau vasculaire cérébral sont donc associées à une dérégulation de l'expression de récepteurs pro- angiogéniques cérébraux (Figure 2 et Jegou et al. , vol. 72, no. 6, 31 december 2012, pages 952-960). Anomalies de l'angiogenèse placentaire suite à une alcoolisation in utero
Différents paramètres placentaires ont été étudiés chez la Souris (Figures 3-5) et chez l'Homme (Figures 7-9) par une approche immunohistochimique couplée à une analyse morphométrique comprenant notamment la densité et la taille des villosités placentaires, la densité et la surface vasculaire ou encore la proportion de vaisseaux par villosité. Chez l'Homme, ces paramètres ont été mesurés et comparés entre 34 placentas d'individus témoins et 36 placentas provenant d'individus exposés in utero à l'alcool. Les placentas ont été répartis en trois classes d'âges comparables à celles de l'étude cérébrale (Jegou et al., vol. 72, no. 6, 31 december 2012, pages 952-960). Sont présentés dans ce document les résultats concernant les classes d'âge [20- 25GW[, [25-35GW] et [35-42GW]. En particulier, l'analyse morphométrique indique que la répartition des vaisseaux placentaires par tailles de villosité et la surface vasculaire sont significativement impactées par l'alcoolisation (Figure 10). De plus, une analyse longitudinale de la densité vasculaire prenant en compte le facteur « âge » indique que dans le groupe « Témoins » l'angiogenèse placentaire augmente fortement entre les classes d'âge [20-25GW[ et [25-35GW[. Cette forte augmentation de la vascularisation placentaire s'explique par un développement important du cerveau au cours du troisième trimestre de la grossesse qui nécessite des besoins accrus en oxygène et en nutriments. En revanche, l'alcoolisation fœtale induit une stagnation voire une baisse de la densité vasculaire placentaire (Figure 10).
En conclusion, les présents résultats indiquent qu'il existe dans le placenta humain comme dans le cortex cérébral des anomalies vasculaires chez les sujets ayant été exposés à l'alcool. Ces résultats confortent donc l'hypothèse d'un corrélat entre troubles cérébraux et déficits placentaires de l'angiogenèse.
Démonstration d'une corrélation entre les anomalies vasculaires placentaires et cérébrales Les anomalies vasculaires placentaires et cérébrales observées chez l'Homme suite à une alcoolisation in utero peuvent être le fruit de processus totalement indépendants sans lien de cause à effet ou, au contraire, étroitement intriqués. Le fait que la source de PIGF soit unique et d'origine placentaire plaide en faveur de la seconde hypothèse. Toutefois, afin de démontrer un lien entre les atteintes vasculaires cérébrales et placentaires, nous avons effectué une étude de corrélation d'une part chez les sujets du groupe « Témoin » et, d'autre part, chez les individus du groupe « FAS/pFAS » (Figure 1 1 ).
Les résultats démontrent que dans le groupe « Témoin », l'accroissement de la vascularisation placentaire n'impacte pas l'organisation radiale des vaisseaux corticaux (R2 0,4719). En revanche, le défaut de vascularisation placentaire observé dans le groupe « FAS/pFAS » est étroitement corrélé avec l'orientation aléatoire des vaisseaux corticaux (R2 0,9995). Il existe donc une interaction très significative entre les altérations vasculaires placentaires et cérébrales.
Démonstration d'un lien fonctionnel entre le PIGF placentaire et son récepteur cérébral
L'administration in utero d'une molécule fluorescente au niveau placentaire chez la Souris gestante (GD15) est retrouvée après 20-30 min dans le cerveau du fœtus (Figure 6). De plus, du PIGF recombinant humain injecté chez la Souris au niveau du placenta est détecté après 30 min par ELISA au niveau du cerveau fœtal (Figure 6). Ces données indiquent que des molécules placentaires et notamment le PIGF sont en mesure d'atteindre le cerveau du fœtus.
L'invalidation par transfection in utero placentaire du PIGF murin par des shRNA se traduit par une répression des taux protéiques de PIGF placentaire après 48 heures (Figure 6). Cet effet est associé au niveau cérébral par une chute des niveaux protéiques du récepteur VEGF-R1 (Figure 6). Ces résultats indiquent que i) la répression spécifique du PIGF placentaire impacte directement l'expression du récepteur cérébral, ii) la répression spécifique du PIGF placentaire mime les effets de l'alcool sur l'expression du VEGF-R1 cérébral (Figures 2 et 6).
Les niveaux d'expression de protéines connues pour être soit des acteurs de l'angiogenèse soit des protéines spécifiques du système vasculaire ont été quantifiés par western blot. Ce travail a été effectué chez l'animal (Souris ; placenta/ cerveau) et chez l'Homme (placenta).
Chez la Souris, la quantification des taux d'expression de VEGFA et de PIGF placentaires démontre une diminution significative uniquement du PIGF (dont le placenta est la seule source dans l'organisme ; Figure 5). Parallèlement, la quantification des récepteurs au VEGFA et au PIGF indique que l'expression du VEGFR1 (unique récepteur du PIGF) est diminuée aussi bien dans le placenta que dans le cerveau (Figures 2 et 5). Cette diminution, très marquée, est de l'ordre de 50%. L'expression de VEGFR2 au niveau cérébral n'est quant à elle pas affectée. De plus, la quantification de la protéine vasculaire ZO-1 , impliquée dans l'établissement de la barrière placentaire et hématoencéphalique est fortement diminuée dans le placenta (Figure 4)· Parallèlement aux travaux menés chez la Souris, l'analyse d'expression protéique a été menée sur des placentas humains dont l'alcoolisation maternelle était avérée et les enfants vivants. Nous avons recueilli 7 placentas « Témoins » et 6 placentas « Alcool » et quantifié par western blot les marqueurs candidats identifiés chez la Souris. Les résultats indiquent que dans le groupe « Alcool » les expressions du PIGF et de ZO-1 sont très fortement diminuées comme chez la Souris (Figure 10). Ces données indiquent que les effets de l'alcoolisation fœtale observés aux niveaux placentaire et cérébral sont retrouvés chez deux espèces différentes, la Souris et l'Homme.
Exemples B : Effet thérapeutique de PIGF
Ces exemples correspondent aux résultats obtenus par des tests de surexpression de PIGF au niveau placentaire permettant ainsi de reverser l'effet délétère de l'alcool sur la morphologie et la taille de fœtus ainsi que sur l'angiogenèse cérébrale.
1 . Matériels et méthodes
Surexpression placentaire de PIGF par activation in vivo du gène PGF dans un système CRISPR-dCas9 Associée à l'électroporation in vivo, l'approche CRISPR-dCas9 est une méthode de surexpression génique innovante pour l'identification du rôle de protéines endogènes dans les processus de développement. Les plasmides d'activation PGF CRISPR-dCas9 (sc-42221 1 -ACT) constituant un complexe des médiateurs de l'activation synergique (SAM) ont été conçus et fournis par Santa Cruz Biotechnology. SAM se lie à un site spécifique situé en amont du site de-d'initiation de la transcription du gène PGF, activant ainsi la transcription endogène du gène cible. En pratique, les plasmides d'activation PGF-CRISPR dCas9 sont transfectés par électroporation in utero à GD13 dans deux groupes de souris (« Témoin » et « Alcool »). L'exposition à l'alcool a lieu entre GD15 à GD20. Un délai de deux jours entre la transfection des plasmides d'activation PGF CRISPR-dCas9 et le traitement par l'alcool est nécessaire pour permettre l'expression de plasmide et la surexpression de PLGF. Pour une souris gravide donnée, 3 placentas ont été transfectés avec les plasmides d'activation PGF CRISPR-dCas9, 3 placentas ont été transfectés avec les plasmides contrôle CRISPR-cas9 (sc-418922) ciblant un ARN guide non-spécifique de 20 nt (contrôle négatif). Les autres placentas ne sont pas transfectés et sont utilisés comme contrôle (groupe « Témoin »).
2. Résultats La surexpression placentaire du gène PGF permet de rétablir l'angiogenèse cérébrale du fœtus altérée par l'exposition à l'alcool in utero.
Une stratégie d'activation par le système CRISPR-dCas9 couplée à une transfection in utero a été utilisée pour permettre l'induction d'une forte expression du gène endogène PGF dans le placenta des souris gravides n'ayant pas été traitées à l'alcool (groupe « Témoin ») et des souris gravides ayant été exposées à l'alcool (groupe « Alcool ») (Fig. 12, A et B). À GD20, il a été observé que l'exposition à l'alcool in utero conduit à une diminution de la croissance intra- utérine du fœtus (figure 12, C et D.) avec une diminution significative de la taille de la tête (p <0,01 ; figure 13), de la taille du corps (p <0,0001 ; fig. S2) de la taille de l'abdomen (p <##; . la figure 12, G) et de la taille du fœtus entier (p <####; la figure 12, H). Dans le groupe « Témoin », la surexpression de PGF induit une évolution macromorphique du fœtus (figure 12, C et E), avec une augmentation significative de la taille de l'abdomen (p <0,01 ; figure 12, G) et de la taille du fœtus entier (p <0,01 ; figure 12 H). Dans le groupe « Alcool », la surexpression de PGF augmente de manière significative la taille du corps (p <0,05; figure 13) et la taille du fœtus entier (p <0,01 ; figure 12, H). En comparaison avec le groupe « Témoin », la surexpression de PGF a supprimé les effets délétères de l'alcool sur la taille de la tête (figure 13) et sur la taille de l'abdomen (figure 12, G) et a réduit de 38,6 ± 2,8% et 46,8 ± 2,9% les effets de l'alcool sur la taille du corps (figure 13) et la taille des fœtus entiers (figure 12, H), respectivement. Aucun effet sur la morphologie du fœtus n'a été observé chez des souris gravides transfectées avec le plasmide contrôle CRISPR-cas9 (figure 12, G et H). Comme, il a été démontré précédemment, dans le cerveau de fœtus des souris à E20, l'exposition à l'alcool in utero conduit à une désorganisation du système vasculaire cortical (figures 1 , A et B). La transfection du placenta avec un plasmide de contrôle CRISPR-cas9 n'a aucun effet sur les altérations angiogéniques induites par l'exposition à l'alcool in utero (figures. 12, I, J et L). En revanche, chez des souris gravides dont le placenta a été transfecté avec un plasmide d'activation CRISPR-PGF dCas9, l'organisation radiale des microvaisseaux corticaux a été rétablie de manière significative (p <0,05; fig. 4, K, L). Ces données constituent la première démonstration que la surexpression du PLGF dans le placenta permet de rétablir partiellement ou entièrement les déficiences morphologiques et les altérations de l'angiogenèse cérébrale induites par exposition à l'alcool in utero.
Conclusion
Au vu des différents résultats obtenus par les inventeurs chez la Souris gravide, il apparait que : « la surexpression de PIGF dans le placenta d'une souris gravide exposée à l'alcool permet la disparition complète des anomalies morphométriques au niveau de l'abdomen et du crâne du fœtus causées par l'exposition à l'alcool. Ainsi, la taille du crâne et de l'abdomen qui se trouve réduite suite à l'exposition à l'alcool revient à la normale après la surexpression de PIGF, · la surexpression de PIGF dans le placenta d'une souris gravide exposée à l'alcool permet la diminution des anomalies morphométriques au niveau de corps du fœtus et du fœtus entier causées par l'exposition à l'alcool. Ainsi, la taille du corps du fœtus ainsi que la taille du fœtus entier réduites lors de l'exposition à l'alcool revient quasiment à la normale après la surexpression de PIGF, · la surexpression de PIGF au niveau placentaire permet l'amélioration de l'angiogenèse cérébrale du fœtus altérée par l'exposition à l'alcool d'une souris gravide. La fonction neuronale de ce fœtus se trouvera ainsi améliorée,
• la surexpression de PIGF peut être utilisée efficacement en tant que médicament dans le traitement des anomalies de type TCAF, en particulier pour améliorer l'angiogenèse cérébrale et/ ou rétablir l'aspect morphologique normal de la vascularisation du fœtus atteint de TCAF.

Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1 . Facteur de croissance placentaire (PIGF) pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des troubles causés par l'alcoolisation fœtale (TCAF) chez un sujet ayant été exposé à l'alcool in utero.
2. PIGF pour son utilisation selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le TCAF est lié à une atteinte vasculaire cérébrale.
3. PIGF pour son utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que ledit PIGF stimule l'angiogenèse cérébrale.
4. PIGF pour son utilisation selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le TCAF est le syndrome d'alcoolisation fœtale (SAF), notamment lorsqu'il se manifeste sous forme d'une hypotrophie chez un sujet ayant été exposé à l'alcool in utero.
5. PIGF pour son utilisation selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'hypotrophie est une hypotrophie du sujet entier ou d'une de ses parties choisies parmi le torse, l'abdomen et le crâne.
6. PIGF pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit PIGF possède la séquence représentée par une parmi SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO :4.
7. PIGF pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est obtenu par génie génétique ou par synthèse chimique.
8. PLGF pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le sujet ayant été exposé à l'alcool in utero est choisi parmi un embryon, un fœtus et un enfant, en particulier un enfant prématuré.
9. PLGF pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est administré in utero ou ex utero ou in utero puis ex utero.
10. PIGF pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est administré ex-utero à un enfant prématuré.
1 1 . Composition pharmaceutique pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des troubles causés par l'alcoolisation fœtale (TCAF) comprenant un PIGF tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 10 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
12. PIGF pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 1 1 , ladite utilisation comprenant une étape préalable d'identification du sujet, ladite identification comprenant les étapes suivantes : a) mesure de la quantité de PIGF dans un échantillon biologique dudit sujet, de préférence provenant du placenta ou du sang du cordon ombilical ; b) comparaison de la quantité de PIGF de l'étape a) avec une référence qui est une mesure de la quantité de PIGF chez un sujet sain, et c) détermination d'un TCAF ou d'un risque de développer un TCAF chez ledit sujet.
13. PIGF ou composition pour leur utilisation selon la revendication 12 caractérisés en ce que le sujet souffre d'un TCAF ou a été identifié à risque de développer un TCAF si la quantité mesurée de PIGF à l'étape a) est inférieure à la référence de l'étape b).
14. PIGF ou composition pour leur utilisation selon la revendication 12, caractérisés en ce que la quantité de PIGF est déterminée en mesurant la quantité d'acide nucléique PIGF ou la quantité du polypeptide PIGF.
1 5. PIGF ou composition pour leur utilisation selon l'une quelconque des revendications 12 à 14 caractérisés en ce que la quantité de PIGF est mesurée par une méthode sélectionnée parmi le Northern blot, le Southern blot, la PCR, la RT-PCR, la RT-PCR quantitative, le SAGE et ses dérivés, les puces d'acides nucléiques, notamment les puces à ADNc, les puces à oligonucléotides et les puces à ARNm, les puces à tissu et le RNA- Seq et/ou par une méthode sélectionnée parmi l'immunohistologie, l'immunoprécipitation, le western blot, le dot blot, l'ELISA ou l'ELISPOT, les puces à protéines, les puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à l'immunohistochimie, les techniques de FRET ou de BRET, les méthodes de microscopie ou d'histochimie, dont notamment les méthodes de microscopie confocale et de microscopie électronique, les méthodes basées sur l'utilisation d'une ou plusieurs longueurs d'onde d'excitation et d'une méthode optique adaptée, comme une méthode électrochimique (les techniques voltamétrie et d'ampérométrie), le microscope à force atomique, et les méthodes de radiofréquence, comme la spectroscopie résonance multipolaire, confocale et non- confocale, détection de fluorescence, luminescence, chemiluminescence, absorbance, réflectance, transmittance, and biréfringence ou index de réfraction (par exemple, par résonance des plasmons de surface, par ellipsométrie, par méthode de miroir résonnant, etc), cytométrie de flux, imagerie par résonance radioisotopique ou magnétique, analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE); par spectrophotométrie HPLC- Mass, par chromatographie liquide/spectrophotométrie de masse/spectrométrie de masse (LC-MS/MS).
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