WO2018194036A1

WO2018194036A1 - 上皮細胞の水分泌機能測定方法

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Publication number: WO2018194036A1
Application number: PCT/JP2018/015761
Authority: WO
Inventors: 渡辺　守; 藤井　悟; 岡本　隆一
Original assignee: 国立大学法人東京医科歯科大学; 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス
Priority date: 2017-04-19
Filing date: 2018-04-16
Publication date: 2018-10-25
Also published as: US20200165653A1; JP2018174874A

Abstract

上皮細胞の水分泌機能を、蛍光色素等による染色を要さずに短時間で簡便に評価することを可能にする。上皮細胞から樹立されたオルガノイド(700)を培養容器に播種しその各ウェル(510)中のゲル(610)内で所定期間培養する予備培養工程と、オルガノイド(700)を含む各ウェル(510)をマルチピクセル画像として撮影する撮影工程と、撮影された画像について、バックグラウンドに対し所定以上のピクセル強度の差を有するエッジで囲まれた領域をオブジェクトとして検出する検出工程と、該オブジェクトについて、エッジ内の面積を算出する算出工程と、該オブジェクトがオルガノイドに由来するか否かを選別する選別工程と、該オブジェクトが分析対象であるか否かを判別する判別工程と、を有するとともに、撮影工程に際しては、前記オルガノイド(700)の染色を目的とした細胞染色物質は添加されない。

Description

上皮細胞の水分泌機能測定方法

　本発明は、腸管上皮細胞のような水分泌機能を有する上皮細胞についてその水分泌機能を測定する方法に関する。

　ヒト腸管上皮細胞を、個々の細胞ではなく、複数の細胞が凝集して生体内で構成している絨毛－陰窩構造を疑似化した三次元組織構造体「オルガノイド」を形成させて培養する技術が開発されている（Sato, T., et al., "Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche." Nature, 2009, 459(7244): 262-265）。すなわち、腸管上皮細胞のオルガノイドにおいては、腸管内における内腔側を内側になるようにして中空の部分が形成されるように凝集し、全体として球ないし回転楕円体（スフェロイド）に類した立体形状を有する。そして、このような培養系を用いて腸管上皮細胞の水分泌機能を定量的に評価する方法としてオルガノイドの膨張を利用する方法が報告されている（Dekkers, J.F., "A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids." Nature Med., 2013, 19(7): 939-945）。

　上記背景技術で開示の技術では、オルガノイドの断面積の変化を計測するに当たって、蛍光色素等でオルガノイドの外縁を標識し、この状態で撮影することで得られた画像から画像解析によって初めて定量的な計測が可能となっていた。したがって、対象となるオルガノイドを蛍光色素等によって適切に染色し、撮影する技術や設備が必要であり、その染色の工程を要することで多数の検体を短時間で簡便に評価することが困難であるといった問題点があった。また、蛍光色素等による染色がオルガノイドの反応に影響を与えることで、実験結果に及ぼす影響も懸念される。

　そこで本件発明は、腸管上皮細胞のような水分泌機能を有する上皮細胞についてその水分泌機能を、蛍光色素等による染色を要さずに短時間で簡便に評価することを可能とすることを課題とする。

　（１）第１の態様
　本発明の第１の態様は、水分泌機能を有する上皮細胞についての水分泌機能測定方法であって、
　対象とする前記上皮細胞から樹立されたオルガノイドを培養容器に播種し当該培養容器の各ウェル中のゲル内で所定期間培養する予備培養工程と、
　前記予備培養工程の後に、オルガノイドを含む各ウェルをマルチピクセル画像として撮影する撮影工程と、
　前記撮影工程で撮影された前記マルチピクセル画像について、測定対象のオルガノイドを含み得る大きさの所定の領域における平均ピクセル強度をバックグラウンドとしたときこのバックグラウンドに対し所定以上のピクセル強度の差を有するピクセルで構成されたエッジで囲まれた領域をオブジェクトとして検出する検出工程と、
　前記検出工程にて検出されたオブジェクトについて、前記エッジ内の面積を算出する算出工程と、
　前記検出工程にて検出されたオブジェクトがオルガノイドに由来するか否かを選別する選別工程と、
　前記選別工程にてオルガノイドに由来するとして選別されたオブジェクトが分析対象であるか否かを判別する判別工程と、
を有するとともに、
　前記撮影工程に際しては、前記オルガノイドの染色を目的とした細胞染色物質は添加されないことを特徴とする。

　予備培養工程とは培養容器のウェル中でオルガノイドを安定化させるためにある期間培養する工程をいい、使用するオルガノイドの種類によって様々に異なる。ここで、培養容器としては、たとえば９６ウェルプレートのようなマルチウェルプレートが挙げられる。

　バックグラウンドは、たとえば次のようにして決定することができる。測定対象として想定されるオルガノイドの大きさに対し、十分大きな領域（たとえば、１辺２００μｍの正方形）を設定する。そしてこの領域内の全ピクセルの平均ピクセル強度を求め、これをバックグラウンドの値とする。

　このバックグラウンドの値に対し、所定以上のピクセル強度があるピクセルを、オルガノイドのエッジを構成するものと定義して、このピクセルで閉じた図形が得られた場合には、この図形をオブジェクトとして検出する。このピクセル強度の差は、バックグラウンドとオルガノイドとのコントラストの差として検出されることになる。なお、ここでいうピクセル強度の差は、明視野観察の場合は暗い方に差が出ることになり、一方、暗視野観察の場合は明るい方に差が出ることになる。

　このように検出されたオブジェクトは、算出工程により面積が算出される。また、オブジェクトが果たしてオルガノイドに由来する画像なのかどうかを所定の基準により選別するのが選別工程である。さらに、オルガノイドに由来するとして選別されたオブジェクトのうち、分析の対象となるのか否かを判別するのが判別工程である。この判別工程でいう分析の対象とは、たとえば、「生きている」か否かとすることができる。

　本態様においては、オルガノイドをゲル内で培養するので、オルガノイドが浮遊により動くことがなく、個々のオルガノイド単位で経時的に観察することが可能となっている。また、蛍光色素のような細胞染色物質を添加することがないので、細胞染色工程が不要になり染色に要する時間による結果への影響を考慮する必要がないばかりでなく、細胞染色物質自体がオルガノイドに及ぼす影響を考慮する必要もなくなる。すなわち、オルガノイドをよりインタクトな状態で観察することが可能となっている。

　（２）第２の態様
　また、本発明の第２の態様は、前記第１の態様の特徴に加え、最も明度の高いピクセル強度と最も明度の低いピクセル強度との差を１００％と定義した場合、
　前記検出工程においては、
　前記バックグラウンドとのピクセル強度の差が７．８％以上あるピクセルをエッジ候補ピクセルとし、かつ、
　前記バックグラウンドとのピクセル強度の差が２９．２％以上あるピクセルをエッジ確定ピクセルとし、
　前記エッジ確定ピクセルのみで囲まれた領域又は前記エッジ確定ピクセル及び前記エッジ候補ピクセルで囲まれた領域がオブジェクトとして検出されることを特徴とする。

　たとえば、通常の画像解析で用いられるような、ピクセル強度が８ビット表示で表わされる場合、黒色を表すピクセル強度０と、白色を表すピクセル強度２５５との間のグレースケールで表されることになる。このような前提の本では、エッジ候補ピクセルとして設定される、前記バックグラウンドとのピクセル強度の差が７．８％以上とは、ピクセル強度としては２０以上の差に相当する。同様に、エッジ確定ピクセルとして前記バックグラウンドとのピクセル強度の差が２９．２％とは、ピクセル強度としては７５以上の差に相当する。すなわちこの場合、バックグラウンドのピクセル強度より７５以上大きなピクセルを「点」とし、これらの「点」の間が、バックグラウンドのピクセル強度より２０以上大きなピクセルで「線」として結ばれ、これが閉じた図形として得られた場合には、これをオブジェクトとして検出することとしている。

　（３）第３の態様
　さらに、本発明の第３の態様は、前記第１又は第２の態様の特徴に加え、前記選別工程においては、前記オブジェクトの面積Ａ（μｍ^２）及び当該オブジェクトの周囲長Ｐ（μｍ）について、
　Ｃ_Ｐ＝Ｐ^２／（４π・Ａ）
で定義される緊密度Ｃ_Ｐが２．０以下のオブジェクトをオルガノイドに由来するものとして選別することを特徴とする。

　選別工程とは、前記検出工程でオブジェクトとして検出されたもののうちから、これがオルガノイドに由来するものであるのか否かを選別する工程である。この工程では主に、オブジェクトがオルガノイドなのか、それともそれ以外の夾雑物（端的に言えば、ゴミ）なのかを選別することを主眼としており、上記の、緊密度に関する観点以外にも、オブジェクトがウェル中で占める面積がウェル全体の面積の所定割合（たとえば、２５％）を上回れば「ゴミ」と判断し、それ以下のものをオブジェクトとして選別することも可能である。あるいは、最も明度の高いピクセル強度と最も明度の低いピクセル強度との差を１００％と定義した場合、オブジェクトの平均ピクセル強度とバックグラウンドのピクセル強度との差が所定以上（たとえば、２５％以上）あるときには当該オブジェクトを「ゴミ」と判断して選別しないことも可能である。

　（４）第４の態様
　また、本発明の第４の態様は、前記第１から第３までのいずれかの態様の特徴に加え、前記判別工程においては、前記オブジェクトの面積をＡ（μｍ^２）及び当該オブジェクトのエッジの長さをＥ（μｍ）としたとき、
　Ｃ_Ｒ＝（４π・Ａ）／Ｅ^２
で定義される真円度Ｃ_Ｒが０．４５以上のオブジェクトが分析対象として判別されることを特徴とする。

　判別工程ではオブジェクトが生きているのか死んでいるのか判別することを目的としており、上記の観点以外にも、オブジェクトの面積が所定範囲内（たとえば、１，５００μｍ以上、かつ、２，４００，０００μｍ以下）であれば生きていると判別することができる。また、最も明度の高いピクセル強度の光学濃度を０と定義し、かつ、最も明度の低いピクセル強度の光学濃度を４００と定義した場合、前記オブジェクトを構成するピクセルの平均光学濃度が３０以下のときに当該オブジェクトが生きているものと判別されることとしてもよい。

　（５）第５の態様
　さらに、本発明の第５の態様は、前記第１から第４までのいずれかの態様の特徴に加え、前記撮影工程は、前記予備培養工程の直後に実施されるＴ_０撮影工程と、このＴ_０撮影工程に引き続き、前記各ウェルに所定の処置を施した所定時間経過後に実施されるＴ_Ｎ撮影工程とを含み、
　前記判別工程で分析対象と判定されたオブジェクトについて、前記Ｔ_０撮影工程に係る当該オブジェクトの面積に対する、前記Ｔ_Ｎ撮影工程に係る当該オブジェクトの面積の変化を算出する面積変化算出工程をさらに含むことを特徴とする。

　所定の処置とは、たとえば、観察対象とする試薬のウェルへの添加が挙げられる。

　ここで、本態様では、培養容器としてたとえばマルチウェルプレートを使用することができるので、ウェルごとに違う種類及び違う濃度の試薬を投入することができ、これをウェルごとに迅速に撮影することが可能となっている。さらに、細胞染色物質による染色工程を考慮する必要がないので、所定の処置を施す直前の時点（Ｔ_０）から、当該所定の処置を施してから所定時間経過後の時点（Ｔ_Ｎ）までの正味の時間（すなわち、Ｔ_Ｎ－Ｔ_０）の間でのオルガノイドの変化を観察することが可能となっている。

　（６）第６の態様
　また、本発明の第６の態様は、前記第１から第４までのいずれかの態様の特徴に加え、前記培養容器を前記オルガノイドの撮影に好適な条件下で載置しつつ観察が可能なステージと、
　前記ステージの上方から前記各ウェルを照明する照明手段と、
　前記照明手段によって照射され、前記各ウェルを透過した光線をマルチピクセル画像として撮影する撮影手段と、
　前記マルチピクセル画像を画像データとして記憶する画像データ記憶手段と、
　前記画像データに基づき演算を行う演算手段と、
を備えた画像解析装置を用いて、
　前記撮影工程は前記ステージに前記培養容器が載置された状態で前記照明手段及び前記撮影手段により実施され、
　前記画像データ記憶手段により記憶された前記画像データに基づき、前記演算手段が、前記検出工程、前記算出工程、及び前記判別工程を実施することを特徴とする。

　（７）第７の態様
　また、本発明の第７の態様は、前記第５の態様の特徴に加え、前記培養容器を前記オルガノイドの撮影に好適な条件下で載置しつつ観察が可能なステージと、
　前記ステージの上方から前記各ウェルを照明する照明手段と、
　前記照明手段によって照射され、前記各ウェルを透過した光線をマルチピクセル画像として撮影する撮影手段と、
　前記マルチピクセル画像を画像データとして記憶する画像データ記憶手段と、
　前記画像データに基づき演算を行う演算手段と、
を備えた画像解析装置を用いて、
　前記撮影工程は前記ステージに前記培養容器が載置された状態で前記照明手段及び前記撮影手段により実施され、
　前記画像データ記憶手段により記憶された前記画像データに基づき、前記演算手段が、前記検出工程、前記算出工程、前記判別工程及び前記面積変化算出工程を実施することを特徴とする。

　（８）第８の態様
　さらに、本発明の第８の態様は、前記第１から第７までのいずれかの態様の特徴に加え、前記上皮細胞は、腸管上皮細胞であることを特徴とする。

　すなわち、本発明の対象となる上皮細胞は、水分泌機能を有するものであれば、角膜内皮細胞又は気道上皮細胞など特に限定されるものではない。しかしながら、陰窩を模したオルガノイドの樹立方法が確立されていることから、本発明は、腸管上皮細胞を対象とする場合に特に適している。

　本発明の上記各態様により、腸管上皮細胞のような水分泌機能を有する上皮細胞についてその水分泌機能を、蛍光色素等による染色を要さずに短時間で簡便に評価することが可能となった。

本発明の実施の形態で使用される画像解析装置の外観を斜視図で示す。本発明の実施の形態で使用される画像解析装置においてハッチを開放した状態（Ｂ）を斜視図で示す。本発明の実施の形態で使用される画像解析装置の概要をブロック図で示す。本発明の実施の形態で使用される画像解析装置の測定系を模式的に示す。本発明の実施の形態で検出されたオブジェクトの画像の例を示す。ヒト空腸オルガノイドをフォルスコリンで刺激したフォルスコリン誘因性膨張を経時的に示す顕微鏡画像である。ヒト空腸オルガノイドをフォルスコリン（１０^－５Ｍ）で刺激したフォルスコリン誘因性膨張を、複数個のオルガノイドのそれぞれについて２４０分まで観察した結果をグラフにて示す。ヒト空腸オルガノイドをフォルスコリン(１０^－６Ｍ)で刺激したフォルスコリン誘因性膨張を、添加前（（Ａ）～（Ｃ））及び添加後３０分（（Ｄ）～（Ｆ））の画像を対比して示す。ヒト空腸オルガノイドをフォルスコリン(１０^－６Ｍ)で刺激したフォルスコリン誘因性膨張を、個々のオルガノイドごとに観察したグラフである。フォルスコリンにより誘引される膨張反応を、各ウェルごとにオルガノイドの断面積の合計の増加率を３ウェル間の平均で比較した。１０分、２０分及び３０分におけるスケールバーは、３つのウェルの平均値±標準誤差を示す。ヒト小腸オルガノイドを用いてフォルスコリン誘因性膨張の用量依存曲線を得た。用量依存曲線はシグモイド曲線を呈し、ｌｏｇＥＣ_５０は－７．５８と計算された。全ての結果は少なくとも３個の独立した実験の平均である。陰イオン／液体分泌に関する異なる内因性メディエータ６種類によるヒト空腸オルガノイド膨張の誘因について検証した。膨張誘因の前及び６０分後の位相コントラスト画像を示す。スケールバーは１００μｍを示す。誘因に際しては、ＰＧＥ_２（１０^－８Ｍ、（Ａ））、ＶＩＰ（１０^－７Ｍ、（Ｂ））、ＡＣｈ（１０^－３Ｍ、（Ｃ））、ヒスタミン（１０^－３Ｍ、（Ｄ））、ブラディキニン（１０^－５Ｍ、（Ｅ））又はセロトニン（１０^－３Ｍ、（Ｆ））を培養メディウムに加えた。ヒト空腸由来オルガノイドについて、ＰＧＥ_２、ＶＩＰ、ＡＣｈ及びヒスタミンに誘引される膨張反応の定量評価を３Ｄ－スキャニングシステムにより行い得られた用量反応曲線。潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者の非炎症粘膜由来のヒト結腸オルガノイドについて、ＰＧＥ_２、ＶＩＰ、ＡＣｈ及びヒスタミンに誘引される膨張反応の定量評価を３Ｄ－スキャニングシステムにより行い得られた用量反応曲線。オルガノイドは外科的に得られた数個の結腸断片からなる試料から確立した。

　以下、本発明の実施の形態を図面を参照しつつ説明する。

（画像解析装置の概要）
　本実施の形態に係る画像解析装置100は、図１Ａに示すような外観を呈する。すなわち、筐体101の上部に開閉自在なハッチ102が設けられている。このハッチ102を開放すると、図１Ｂに示すように、培養容器として最大４枚のマルチウェルプレート500を載置可能なステージ103が視認される。

　この画像解析装置100は、図２のブロック図に示すように、装置全体を制御するＣＰＵ200、各種のデータを記憶するハードディスク及びＲＯＭ等の不揮発性記憶装置300並びに揮発性の記憶装置であるＲＡＭ400を有するコンピュータ110と、これにより制御される照明手段120及び撮影手段130とを備える。

　ＣＰＵ200は、所定のプログラムを実行することによって、画像解析装置100の全般（特に、照明手段120及び撮影手段130）を制御する制御手段210、並びに、撮影手段130により得られた画像データに基づき各種の演算を行う演算手段220として機能する。

　制御手段210は、照明手段120を制御することで適切な照明をしつつ、撮影手段130による撮影工程を制御する。

　演算手段220は、画像データよりオブジェクトのエッジを決定することでオブジェクトとして検出する検出工程を実行する検出手段221、オブジェクトの断面積を算出する算出工程を実行する算出手段222、検出されたオブジェクトがオルガノイドに由来するか否かを選別する選別工程を実行する選別手段223、及び、選別されたオブジェクトが分析対象か否かを判別する判別工程を実行する判別手段224として機能する。演算手段220はさらに、算出工程により算出されたオブジェクトの断面積の経時的変化を算出する面積変化算出工程を実行する面積変化算出手段225としても機能する。

　不揮発性記憶装置300は、撮影手段130により得られたマルチピクセル画像を画像データとして記憶する画像データ記憶手段310を有する。

　この画像解析装置100における測定系は図３の模式図に示す通りである。照明手段120としてのＬＥＤ白色光装置121が、マルチウェルプレート500の上方に設置され、撮影手段130としてのＣＣＤカメラ131がマルチウェルプレート500の下方に装着されている。マルチウェルプレート500の各ウェル510には、後述するように、オルガノイド700を含む培養ゲル610と、これを被覆する培養メディウム600とが収容されている。ＬＥＤ白色光装置121から発せられた白色光は、マルチウェルプレート500の蓋520を透過し、ウェル内の培養メディウム600及び培養ゲル610も透過して、下方のレンズ132で集光された上でＣＣＤカメラ131にてマルチピクセル画像として撮影される。ここで、培養ゲル610の中のオルガノイド700は、培養ゲル610との屈折率の違いによって、オブジェクトとして認識される。このシステムで、１枚のマルチウェルプレート500全体について、解像度４，８００ｄｐｉでスキャンした画像データを１分以内で得ることができる。

（ヒト腸管オルガノイドの樹立及び培養）
　ヒト腸管生検試料を、便潜血陽性、過敏性腸症候群、クローン病及び潰瘍性大腸炎のような疾病の評価のために腸管内視鏡検査を受診した患者から得た。内視鏡下で正常と思われた領域から２回又は３回の生検を行った。潰瘍性大腸炎患者の外科摘出試料もオルガノイド樹立のために集められた。本研究は東京医科歯科大学及び横浜市立市民病院の倫理委員会の承認を受け、各患者からの書面でのインフォームドコンセントを得ている。２７人の患者から、小腸オルガノイド（非炎症性腸疾患由来の３系統及び炎症性腸疾患（以下、「ＩＢＤ」と略す。）由来の２０系統）及び大腸オルガノイド（非ＩＢＤ由来の４系統、ＩＢＤ由来の１１系統）の計３８系統が樹立された。全ての実験は承認ガイドラインに従って執り行われた。以下では、特に表示しない限り、クローン病患者の炎症を起こしていない粘膜から樹立された腸オルガノイドを主に使用した。なお、内視鏡的に現に病変であると思われたＩＢＤ患者の粘膜から樹立されたオルガノイドは一切使用しなかった。

　陰窩の分離及びそれに続く腸オルガノイドの樹立は既述（Sato, T., et al., "Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Bernett's epithelium." Gastroenterology, 2011, 340: 1762-1772）の通り行った。簡潔に記述すると、生検試料を２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ中で激しく振盪して陰窩を得た。分離された陰窩は、２４ウェル又は４８ウェル培養ディッシュ中、１ウェル中２０～３０個の密度で１５μＬのマトリゲル中に包埋した。

　これらの陰窩は、リコンビナントヒトＲ－スポンジン－１（１μｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄシステムズ、米国ミネアポリス）、リコンビナントヒトＷｎｔ－３（３００ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄシステムズ、米国ミネアポリス）、リコンビナントヒトノギン（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄシステムズ、米国ミネアポリス）、リコンビナントヒトＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ、ペプロテック、米国）、Ｙ－２７６３２（１０μＭ、シグマ－アルドリッチジャパン、東京）、Ａ８３－０１（５００ｎＭ、シグマ－アルドリッチジャパン、東京）及びＳＢ２０２１９０（１０μＭ、シグマ－アルドリッチジャパン、東京）を添加したＤＭＥＭベースの培養メディウム（Ａｄｖａｎｃｅｄ－ＤＭＥＭ、インヴィトロゲン、米国カリフォルニア）中で維持された。これらの培養条件で該オルガノイドを非分化状態に維持することが可能となっており、これらのオルガノイドを用いたヒト腸管上皮細胞の分泌機能を明らかにすることが可能となった。

（解析対象試薬）
　以下で使用した解析対象試薬としては、プロスタグランジンＥ_２（ＰＧＥ_２、ケイマンケミカル、米国ミシガン）並びに血管作動性腸管ペプチド（ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、ＶＩＰ）、アセチルコリン（ＡＣｈ）、ヒスタミン、ブラディキニン及び塩酸セロトニン（シグマ－アルドリッチジャパン、東京）を使用した。

（オルガノイド断面積の測定）
　オルガノイド断面積の測定は、前記画像解析装置100として、３Ｄ－スキャニングシステム（Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒ、ＳＣＲＥＥＮホールディングス、京都）を用いて実施した。３Ｄ－スキャニングに先立ち、オルガノイドを２μＬマトリゲル及び１００μＬ完全培地とともに９６ウェルプレートに播種した。播種後２４時間の予備培養工程を経て、解析対象試薬の添加前及び添加３０分後にスキャニングを実施した。スキャニングに当たっては、オートフォーカス（ＡＦ）モードで画像を得た。認識されたオルガノイドの断面積は、下記表１に要約した解析パラメータをセットして自動測定した。

　ここで、上記表１中の各パラメータについて簡単に説明する。

　「Allowable object's maximum area」は、ウェルの面積の何パーセントまでの大きさの物体をオルガノイド由来のオブジェクトとみなすかの閾値である。この設定値より大きいオブジェクトはオルガノイド由来のものとはみなされず、選別工程においては選別されないこととなる。

　「Debris threshold」は、オブジェクトか「ゴミ」かを判別するための閾値である。すなわち、この設定値よりバックグラウンドとの濃度の差が大きい部分は「ゴミ」とみなされ、選別工程においては選別されないこととなる。

　「Compactness upper limit」は、オブジェクトの領域のまとまり（前記緊密度Ｃ_Ｐ）についての上限を指定するものである。すなわち、オブジェクトの面積（Ａ）に対して前記周囲長Ｐ（オブジェクトの内外を画するエッジの長さのみならず、オブジェクトに中空部分が存在するときは、その中空部分のエッジの長さも加算される数値）が長くなればなるほどオブジェクトの領域にまとまりがなくなり、値が大きくなる。ここで、オブジェクトが真円で中空部分がない場合、この緊密度Ｃ_Ｐの値は１（１００％）となる。この設定値を超えたものは「ゴミ」とみなされ、選別工程においては選別されないこととなる。

　「Edge detection」は、バックグラウンドとの濃度差では検出されにくいオブジェクトが多い場合に「Ｏｎ」とすることで、オブジェクトのエッジ抽出を行いやすくするパラメータである。ここで、バックグラウンドの濃度は、オブジェクトの大きさより十分大きな領域（たとえば、２００μｍ四方の領域）における平均ピクセル強度として与えられる。この「Edge detection」が「Ｏｎ」とされた場合、下記の「Edge candidate」及び「Edge threshold」のパラメータ設定が有効となる。

　なお、上記表１中では記載していないが、この「Edge detection」と同時に、「Include highlight area」のパラメータも、デフォルト値の「Ｏｆｆ」から「Ｏｎ」に設定されている。この「Include highlight area」のパラメータを「Ｏｎ」に設定することで、ウェル画像中で明度が特に高い領域においてもエッジ抽出が行いやすくなる。

　「Edge candidate」は、画像上、バックグラウンドとのピクセル強度の差が小さいピクセルについてどこまでをエッジ候補とするかの閾値である。ここで、上記表１中ではこのパラメータは「２０」と設定されている。すなわち、本実施形態では、ピクセル強度は８ビット値で表現されており、その最大値は２５５、最小値は０であるから、この設定されているパラメータ「２０」は、バックグラウンドとのピクセル強度の差としては、７．８％（≒７．８１２５％＝２０÷２５６×１００）となる。よって、この設定値以上にバックグラウンドとのピクセル強度のあるピクセルはエッジ候補ピクセルとされる。

　「Edge threshold」は、画像上、バックグラウンドとのピクセル強度の差がエッジとして検出されるに十分な大きさを有するピクセルの閾値である。ここで、上記表１中ではこのパラメータは「７５」と設定されている。本実施形態では、ピクセル強度は８ビット値で表現されており、その最大値は２５５、最小値は０であるから、この設定されているパラメータ「７５」は、バックグラウンドとのピクセル強度の差としては、２９．２％（≒２９．２９６８７５％＝７５÷２５６×１００）となる。よって、この設定値以上にバックグラウンドとのピクセル強度のあるピクセルはエッジ確定ピクセルとして認識される。

　そして、上記エッジ確定ピクセルのみで囲まれている領域は、検出工程においてオブジェクトとして検出される。また、上記エッジ確定ピクセルのみでは囲まれていなくとも、エッジ確定ピクセルの間にエッジ候補ピクセルが存在していて、これらのピクセルで囲まれた領域についても検出工程においてオブジェクトとして検出されることとなる。

　上記「Edge detection」及び「Include highlight area」のパラメータ設定に伴うオブジェクト検出の例を図４に示す。図４（Ａ）は、エッジ検出を行う前の撮影画像である。この画像では、オブジェクトの輪郭のピクセル強度はバックグラウンドに対して余り強くないことが分かる。この画像について、「Edge detection」及び「Include highlight area」をいずれも「Ｏｆｆ」とした場合、エッジとして認識し得るのは図４（Ｂ）中、矢印で示した箇所のみである。これに対し、「Edge detection」及び「Include highlight area」をいずれも「Ｏｎ」とした場合、図４（Ｃ）に示すように、いずれのオブジェクトの輪郭も明瞭なエッジとして検出されることになり、オブジェクトの検出能力が劇的に改善されることとなった。このように検出されたエッジで囲まれた領域の面積が、オブジェクトの面積として算出されることとなる。

　「Spheroid size lower limit」は、選別されたオブジェクトについて、生きているオルガノイド由来とみなす面積の下限値である。すなわちこのパラメータは、前記エッジで囲まれた領域の面積が、この値に満たないものは死んだオルガノイドに由来するものとして、判別工程において分析対象から除外される。

　「Spheroid size upper limit」は、選別されたオブジェクトについて、生きているオルガノイド由来とみなす面積の上限値である。すなわちこのパラメータは、前記エッジで囲まれた領域の面積が、この値を上回るものは死んだオルガノイドに由来するものとして、判別工程において分析対象から除外される。

　「Circularity lower limit」は、オブジェクトの前記「真円度Ｃ_Ｒ」の下限値を示すパラメータであり、この値を下回るオブジェクトは、形がいびつであるために死んだオルガノイドに由来するものとして、判別工程において分析対象から除外される。ここで、オブジェクトが真円の場合、この真円度Ｃ_Ｒの値は１（１００％）となる。

　「Spheroid density upper limit」は、生きているオルガノイド由来のオブジェクトとみなされる光学濃度（ＯＤ）の上限値を設定するパラメータである。ここで、設定範囲の下限値である「０」は白色のピクセルを表すものであり、同じく上限値である「４００」は黒色のピクセルを表すものである。よって、上記表１中での設定値「３０」は、光学濃度の上限値が７．５％（＝３０÷４００×１００）を表し、これを上回る光学濃度のオブジェクトは死んだオルガノイドに由来するものとして、判別工程において分析対象から除外される。

　上記各パラメータの設定により、検出工程により明瞭なエッジを有することとなったオブジェクトが検出され、その面積が算出工程により算出される。この検出されたオブジェクトのうち、オルガノイドに由来すると判定されたものが選別工程により選別され、さらに、判別工程によって生きているオルガノイドと判別されたオブジェクトが最終的な分析対象となる。

　ここで、本実施の形態においては、オルガノイドはウェル中においてゲル内で培養されるので、培養メディウム中で浮遊して移動することがない。さらに、観察の際に蛍光色素の細胞染色物質による染色を行う必要がない。よって、同一のオルガノイドについて、経時的な断面積の変化を観察することができる。もちろん、複数のオルガノイドについて統計処理を行うことも可能である。

　なお、対象試薬の添加による経時的変化は、以下のようにして観察することができる。すなわち、対象試薬添加前の時点（Ｔ_０）において、オブジェクトの撮影を行う（Ｔ_０撮影工程）。そして、対象試薬を添加して所定時間（たとえば、３０分）結果した時点（Ｔ_Ｎ）において、同じオブジェクトの撮影を行う。そして、当該オブジェクトが分析対象であるか否かが判別される。ここで、前記選別工程及び判別工程を経て、Ｔ_０時点及びＴ_Ｎ時点の両方で分析対象と判別されたオブジェクトのみが、この経時的変化の観察に供されることとなる。

　そして、分析対象とされたオブジェクトについて、面積変化算出工程において、Ｔ_０時点の面積（Ａ_０）及びＴ_Ｎ時点の面積（Ａ_Ｎ）が算出される。これらに基づく経時的変化（％）は、たとえば下記式で求めることができる。
　（Ａ_Ｎ－Ａ_０）／Ａ_０×１００

　本実施の形態に係る上皮細胞の水分泌機能測定方法が、実際に対象試薬のスクリーニングに有用であることを下記にて示す。

（腸管オルガノイドの膨張反応を評価する定量的スクリーニング方法の確立）
　最初に、ヒト腸管由来オルガノイドの膨張反応をテストするために、陽性対照としてフォルスコリン誘因性膨張を試した。本実施例を通じて、クローン病患者の、炎症を起こしていない粘膜から確立された腸管オルガノイドを主に使用した。このオルガノイドは、陰窩細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏモデルとして幹細胞／前駆細胞エンリッチ培養条件下で維持した。

　オルガノイドの形状は、最終継代からいつ解析を行ったかによって多葉状又は回転楕円体状を呈する。すなわち、継代後２日以内に解析したオルガノイドは主に回転楕円体状を呈する一方、継代後７日以上経過して解析したオルガノイドは多葉状を呈していた。ルーティン培養におけるこれらの形状タイプの経時変化は反復的であり、同じ時点においては個々のオルガノイド間で変位は見られなかった。該３Ｄ－スキャンニングシステムを用いた本実施例では回転楕円体状のオルガノイドを用いた。

　過去の報告（Dekkers, J.F., "A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids." Nature Med., 2013, 19(7): 939-945、Foulke-Abel, J., et al., "Human Enteroids as a Model of Upper Small Intestinal Ion Transport Physiology and Pathophysiology." Gastroenterology, 2016, 150: 638-649）と同様、フォルスコリンの添加で、小腸オルガノイドは少なくとも６０分は継続する迅速な膨張反応を示した（図５参照）。すなわち、継代後１０日時点の腸管オルガノイドの位相コントラスト画像でフォルスコリン添加（１０^－５Ｍ）に対する反応において６０分まで連続的に膨張することが示された。

　さらに２４０分まで観察したところ、オルガノイドはフォルスコリン刺激後３０分までは連続的な線形の反応を常に示すことが分かった（図６参照）。なお、このグラフの数値は前記実施の形態に示す面積変化算出工程により求められたものである。しかし、３０分を過ぎると反応カーブはオルガノイドの間で異なるパターンを示した。オルガノイドのいくつかは、反応が平衡状態に達したことを示唆するプラトーパターンを示した。他のオルガノイドは、オルガノイドが崩壊していることを表す減少カーブを示した。これらの予備データから、３０分までの計測がオルガノイドの陰イオン／液体輸送反応の観察には適当であると結論した。

　フォルスコリン誘因性膨張を陽性対照として用いて、次に、このような膨張反応が本件３Ｄ－スキャニングシステムで定量できるかどうかをテストした。定量の効率及び正確性を最適化するため、オルガノイドは最後の継代から１日の予備培養工程を経た後に解析に供されることとした。なぜなら、この時点ではオルガノイドは概ね嚢状を呈しているからである。ここから、各オルガノイドの断面の境界線を認識するために最適化された閾値については前記表１の通りである。

　そして、その最適化した閾値の設定が、各オルガノイドの断面の境界線に正確に対応していることを確認した（図７）。ここで、図７（Ａ）～（Ｃ）はフォルスコリン添加前の画像であり、図７（Ｄ）～（Ｆ）は添加後３０分の画像である。図７（Ａ）及び（Ｄ）はウェル全体の画像を示し、それぞれ長方形で囲んだ領域を拡大したものが図７（Ｂ）及び（Ｅ）である。この状態で検出手段により検出されたエッジがそれぞれ図７（Ｃ）及び（Ｆ）で示されている。これらのオルガノイドはそれぞれ同一のものであり、各々についての面積の値が横に添えられた数字である（単位はμｍ^２）。

　すなわち、この設定で断面積が正確に測定できることとなった。フォルスコリンの添加前後にオルガノイドをスキャンすることで、各オルガノイドの断面積の増加を計算し、この値を膨張反応の指標とする。このシステムを用いて、時間依存的な膨張反応を個々のオルガノイドのレベルで定量的にモニターできることを確認した（図８）。前記非特許文献２に開示されている方法に従って、個々のウェル間でのフォルスコリン誘因性膨張の反応の差異も比較した（図９）。その結果、１つのウェル内のオルガノイドの総断面積に由来する断面積の変化率は、同条件下で実験を行った個々のウェルの間で高度に保持されていることも分かった。

　以上により、本実施の形態の水分泌機能測定方法を利用することによって、一度のスキャンで最大３８４ウェル（９６ウェル／プレート×４プレート）の膨張反応を定量化することができることが分かった。

　そして、本実施の形態の水分泌機能測定方法を用いて、限られた数の被検試薬の用量依存曲線を決定すると同時に薬物反応スクリーニングが可能となる。そこで、本システムでフォルスコリンの用量依存曲線を決定できるかどうかをテストした。ヒト空腸由来オルガノイドを用いて、フォルスコリン誘因性膨張の用量依存曲線は標準シグモイド曲線として表されることが判明し、ｌｏｇＥＣ_５０値は－７．５８と計算された（図１０）。

（陰イオン／液体分泌に関する内因性メディエータの候補物質の検証）
　次に、本実施の形態の水分泌機能測定方法によって、腸管上皮細胞から陰イオン／液体の分泌を誘引する可能性のある様々な内因性メディエータの直接効果を検証するために、６種類の内因性メディエータをテストして、フォルスコリン誘因性膨張と等価なオルガノイドの膨張反応を誘引する能力があるかどうかを決定した。Ｇｓ共役レセプターを通じて機能する２種類のメディエータ、すなわち、ＰＧＥ_２及びＶＩＰは、迅速かつ持続的な反応を示し、最終的には誘因後６０分でオルガノイドの断面積が全体に大きく増加した（図１１（Ａ）及び（Ｂ））。対照的に、Ｇｑ共役レセプターを通じて機能するメディエータ、すなわち、アセチルコリン及びヒスタミンは、遅くかつ限定的な反応を示し、オルガノイドの断面積の増加はＰＧＥ_２やＶＩＰに比べ小さいことが分かった（図１１（Ｃ）及び（Ｄ））。ブラディキニン又はセロトニンの添加ではオルガノイド膨張の誘因に関しては明瞭な効果は見られなかった（図１１（Ｅ）及び（Ｆ））。

　経時画像で得られたデータを確認するために、次に、メディエータによって誘因されるオルガノイドの用量依存性曲線の相違について調査を試みた。最初に、ヒト空腸オルガノイドを使ってこれらメディエータの直接反応を評価した。その結果、ＰＧＥ_２及びＶＩＰでは明瞭なシグモイド反応曲線が示された一方、アセチルコリン及びヒスタミンではかなり低い反応プロフィールであった（図１２）。このタイプの反応パターンは、潰瘍性大腸炎患者の非炎症粘膜由来のヒト大腸オルガノイドでも概ね同様であった（図１３）。よって、これらの結果で、テストしたメディエータのうちではＰＧＥ_２が最も低いｌｏｇＥＣ_５０値で空腸及び結腸オルガノイドの膨張を引き起こすことが示された。

　以上より、陰イオン／液体の分泌に関する種々の内因性メディエータのうち、ＰＧＥ_２が、腸管上皮細胞への直接効果によりキーインデューサーの一つとして機能することが強く示された。

　以上の通り、本実施の形態によって、腸管上皮細胞のような上皮細胞の水分泌機能を、的確かつ迅速にスクリーニングできることが明らかとなった。

産業上の利用分野

　本発明は、水分泌機能を有する上皮細胞についてその水分泌機能を測定する方法に利用可能であり、具体的にはそのような測定方法を実現する装置及びプログラムとして利用可能である。

Claims

　水分泌機能を有する上皮細胞についての水分泌機能測定方法であって、
　対象とする前記上皮細胞から樹立されたオルガノイドを培養容器に播種し当該培養容器の各ウェル中のゲル内で所定期間培養する予備培養工程と、
　前記予備培養工程の後に、オルガノイドを含む各ウェルをマルチピクセル画像として撮影する撮影工程と、
　前記撮影工程で撮影された前記マルチピクセル画像について、測定対象のオルガノイドを含み得る大きさの所定の領域における平均ピクセル強度をバックグラウンドとしたときこのバックグラウンドに対し所定以上のピクセル強度の差を有するピクセルで構成されたエッジで囲まれた領域をオブジェクトとして検出する検出工程と、
　前記検出工程にて検出されたオブジェクトについて、前記エッジ内の面積を算出する算出工程と、
　前記検出工程にて検出されたオブジェクトがオルガノイドに由来するか否かを選別する選別工程と、
　前記選別工程にてオルガノイドに由来するとして選別されたオブジェクトが分析対象であるか否かを判別する判別工程と、
を有するとともに、
　前記撮影工程に際しては、前記オルガノイドの染色を目的とした細胞染色物質は添加されないことを特徴とする、上皮細胞の水分泌機能測定方法。
　最も明度の高いピクセル強度と最も明度の低いピクセル強度との差を１００％と定義した場合、
　前記検出工程においては、
　前記バックグラウンドとのピクセル強度の差が７．８％以上あるピクセルをエッジ候補ピクセルとし、かつ、
　前記バックグラウンドとのピクセル強度の差が２９．２％以上あるピクセルをエッジ確定ピクセルとし、
　前記エッジ確定ピクセルのみで囲まれた領域又は前記エッジ確定ピクセル及び前記エッジ候補ピクセルで囲まれた領域がオブジェクトとして検出されることを特徴とする請求項１記載の、上皮細胞の水分泌機能測定方法。
　前記選別工程においては、前記オブジェクトの面積Ａ（μｍ^２）及び当該オブジェクトの周囲長Ｐ（μｍ）について、
　Ｃ_Ｐ＝Ｐ^２／（４π・Ａ）
で定義される緊密度Ｃ_Ｐが２．０以下のオブジェクトをオルガノイドに由来するものとして選別することを特徴とする請求項１又は２記載の上皮細胞の水分泌機能測定方法。
　前記判別工程においては、前記オブジェクトの面積をＡ（μｍ^２）及び当該オブジェクトのエッジの長さをＥ（μｍ）としたとき、
　Ｃ_Ｒ＝（４π・Ａ）／Ｅ^２
で定義される真円度Ｃ_Ｒが０．４５以上のオブジェクトが分析対象として判別されることを特徴とする請求項１から３までのいずれか１項に記載の、上皮細胞の水分泌機能測定方法。
　前記撮影工程は、前記予備培養工程の直後に実施されるＴ_０撮影工程と、このＴ_０撮影工程に引き続き、前記各ウェルに所定の処置を施した所定時間経過後に実施されるＴ_Ｎ撮影工程とを含み、
　前記判別工程で分析対象と判定されたオブジェクトについて、前記Ｔ_０撮影工程に係る当該オブジェクトの面積に対する、前記Ｔ_Ｎ撮影工程に係る当該オブジェクトの面積の変化を算出する面積変化算出工程をさらに含むことを特徴とする請求項１から４までのいずれか１項に記載の、上皮細胞の水分泌機能測定方法。
　前記培養容器を前記オルガノイドの撮影に好適な条件下で載置しつつ観察が可能なステージと、
　前記ステージの上方から前記各ウェルを照明する照明手段と、
　前記照明手段によって照射され、前記各ウェルを透過した光線をマルチピクセル画像として撮影する撮影手段と、
　前記マルチピクセル画像を画像データとして記憶する画像データ記憶手段と、
　前記画像データに基づき演算を行う演算手段と、
を備えた画像解析装置を用いて、
　前記撮影工程は前記ステージに前記培養容器が載置された状態で前記照明手段及び前記撮影手段により実施され、
　前記画像データ記憶手段により記憶された前記画像データに基づき、前記演算手段が、前記検出工程、前記算出工程、及び前記判別工程を実施することを特徴とする請求項１から４までのいずれか１項に記載の、上皮細胞の水分泌機能測定方法。
　前記培養容器を前記オルガノイドの撮影に好適な条件下で載置しつつ観察が可能なステージと、
　前記ステージの上方から前記各ウェルを照明する照明手段と、
　前記照明手段によって照射され、前記各ウェルを透過した光線をマルチピクセル画像として撮影する撮影手段と、
　前記マルチピクセル画像を画像データとして記憶する画像データ記憶手段と、
　前記画像データに基づき演算を行う演算手段と、
を備えた画像解析装置を用いて、
　前記撮影工程は前記ステージに前記培養容器が載置された状態で前記照明手段及び前記撮影手段により実施され、
　前記画像データ記憶手段により記憶された前記画像データに基づき、前記演算手段が、前記検出工程、前記算出工程、前記判別工程及び前記面積変化算出工程を実施することを特徴とする請求項５記載の、上皮細胞の水分泌機能測定方法。
　前記上皮細胞は、腸管上皮細胞であることを特徴とする請求項１から７までのいずれか１項に記載の、上皮細胞の水分泌機能測定方法。