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WO2018185431A1 - Immunotherapie anti-tumorale basée sur des levures - Google Patents

Immunotherapie anti-tumorale basée sur des levures Download PDF

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WO2018185431A1
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yeast
protein
polypeptide
wall
antigen
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Clément DE OBALDIA
Pierre-Yves NOGUE
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Inovactis
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of an immunotherapeutic yeast, said immunotherapeutic yeast expressing at its wall one or more tumor antigen (s), as well as to immunotherapeutic yeasts that can be obtained by the implementation of the process of the invention.
  • Immunotherapies include passive immunotherapies and active immunotherapies, which may be targeted or untargeted.
  • active immunotherapies One of the advantages of active immunotherapies is that they can pass the blood-brain barrier in contrast to chemotherapy-type therapies.
  • lymphocytes are able to migrate across the blood-brain barrier (Larochelle C, Alvarez JI, Prat A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis? ; 585 (23): 3770-80).
  • immunotherapies In addition to this advantage of passage of the blood-brain barrier, immunotherapies generally have fewer adverse effects than traditional anticancer therapies, which is particularly true for targeted immunotherapies. Therefore, immunotherapies are particularly suitable in the treatment of high-grade stage III or IV metastatic cancers in already weakened patients.
  • Non-targeted active immunotherapies such as anti-PD-1 antibodies or anti-CTLA4 antibodies, significantly improve the median survival of patients. However, these treatments benefit a small percentage of patients and are accompanied by significant immunological side effects such as autoimmune diseases.
  • targeted active immunotherapies directed against a defined tumor antigen have been developed. Dendritic cells are major players in these new immunotherapies because they coordinate both an innate immune response and an adaptive response against cancer cells.
  • One of the objectives of targeted active immunotherapies is therefore to stimulate these dendritic cells to generate tumor-active T cells, killer T lymphocytes or cytotoxic T lymphocytes. The action of these T cells is to induce both a regression of the size of the tumor, which can go as far as the disappearance of the tumor, and to induce an immunological memory, limiting relapses.
  • Yeast Saccharomyces cerevisiae has been successfully used as a vector for targeted active immunotherapies because it is an excellent adjunct for the induction of dendritic cells, which in turn activates cytotoxic T lymphocytes to destroy cancer cells.
  • the yeast To enable the activation of dendritic cells, the yeast must produce the tumor antigen to be targeted.
  • US Pat. No. 5,830,463 describes the use of a non-pathogenic yeast, genetically modified to express at least one compound capable of modulating the immune response, and demonstrates that this genetically modified yeast is effective in stimulating both the cellular response and the response. humoral when the yeast is administered to a mammal.
  • 8,734,778 discloses yeasts capable of expressing various tumor antigens in their cytosol, said whole yeasts being killed by heat before injection.
  • US2008 / 0171059 describes the use of yeasts expressing a tumor antigen on their surface rather than in the cytosol.
  • the inventors have unexpectedly observed that a yeast genetically modified to express at its wall one or more tumor antigens that have been permeabilized can effectively stimulate cytotoxic T lymphocytes against the tumor.
  • the present invention relates to a method for preparing an immunotherapeutic yeast, said method comprising the steps of:
  • Another subject of the invention consists of an immunotherapeutic yeast that can be obtained by implementing the preparation method according to the invention.
  • Another subject of the invention relates to a genetically modified and permeabilized immunotherapeutic yeast which expresses at its wall:
  • one or more tumor antigens preferably selected from Melan-A, Tyrosinase, gp100, MAGE-B1, MAGEA1, MAGEA10, MAGEA11, MAGEA12, MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, AGEA8, MAGEA9, MAGEB1; MAGEB10, MAGEB16, MAGEB18, AGEB2, MAGEB3, MAGEB4, MAGEB5, MAGEB6, MAGEB6B, New York Esophageal 1 antigen (NY-ESO-1), MAGEC1, MAGEC2, L-antigen (LAGE), TRP-1, TRP-2, P53, KRAS, CEA, WT1, MUC1, SART3, SURVIVIN 2B, RNF43 / TO M34, TGFBRII, HER2 / neu, BRAF, PI3K, APC, BAX, beta2-microglobulin, telomerase or NRAS; and
  • Another subject of the invention consists of an immunotherapeutic composition
  • an immunotherapeutic yeast according to the invention and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • Another subject of the invention relates to a yeast according to the invention or a composition according to the invention for its use as a medicament, in particular for its use in the treatment or prevention of cancer.
  • peptide means an amino acid sequence which generally comprises from 2 to 9 amino acids.
  • polypeptide is meant an amino acid sequence which generally comprises from 10 to 100 amino acids.
  • protein is meant an amino acid sequence that generally comprises more than 100 amino acids.
  • yeast means any unicellular fungus, or any eukaryotic microorganism composed of a cell wall, a cytosplasmic membrane, a nucleus and mitochondria, capable of asexual reproduction by budding or not split.
  • yeasts include Ascomycetes (Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula), Basidiomycetes (Sporobolomyces) and Deuteromycetes.
  • yeast (s) is both singular and plural.
  • Genetically modified yeast means a yeast whose genetic heritage is artificially modified by the introduction of one or more nucleic acid sequences (or transgene (s)), transiently or definitively, so as to produce one or more peptides, polypeptides and / or proteins in said yeast.
  • the transgenes can be derived from nucleic acid sequences of the same species as the genetically modified yeast (eg the anchor polypeptide), another yeast expectant than the genetically modified yeast (eg the anchor polypeptide) or another prokaryotic or eukaryotic species (eg tumor antigen).
  • the transgene may, for example, code one or more fusion protein (s) of formula (Ia):
  • n is 0 or 1
  • m is 0 or 1
  • x is an integer from 1 to 300, preferably from 1 to 50, preferably from 1 to 9, preferably from 1 to 5 .
  • a "genetically modified yeast that expresses at its wall one or more tumor antigens” is a yeast whose genetic heritage is artificially modified by the introduction of one or more nucleic acid sequence (s) encoding one or more tumor antigen (s) at the wall of said yeast, for example, encoding a fusion protein of formula (Ia).
  • the terms "genetically modified yeast” and “modified yeast” are interchangeable.
  • tumor antigen (s) means all or part of a protein derived from a tumor protein and capable of triggering a humoral and / or cellular immune response against a tumor.
  • the tumor antigen (s) are / are chosen from among Melan-A, Tyrosinase, gp100, MAGE-B1, AGEA1, AGEA10, MAGEA11, MAGEA12, MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, AGEA8.
  • Ovalbumin which is not a tumor antigen in the sense of the invention, is used as a model antigen in a great many experiments, since the epitopes of the ovalbumin protein bind to MHC I and MHC II in mice.
  • the epitopes of ovalbumin are among the best characterized for their very specific immunogenicity, that is, their ability to trigger a targeted immune response against these epitopes.
  • To characterize a specific in vivo immune response we have OT-1 transgenic mice whose T cells are OVA-specific and specifically recognize OVA 257-264 residues. The specific immune response can also be studied in vitro with the T cell hybridoma B3Z cell line specific for the 257-264 OVA epitope.
  • an antigen expressed at the wall is meant to be presented to the wall of the yeast.
  • an antigen expressed at the wall is an antigen anchored to the yeast wall, for example via an anchoring protein or polypeptide.
  • permeabilized yeast means a yeast which has undergone a chemical treatment, enzymatic or mechanical, to permeabilize (or perforate) its wall and / or its cytoplasmic membrane.
  • the means for permeabilizing the wall and / or the cytoplasmic membrane of a yeast are well known to those skilled in the art and can be used without particular difficulty to obtain permeabilized yeasts.
  • the permeabilization of an entire yeast allows access to the proteins contained in its cytosol (Optimization of permeabilization process of yeast cells for catalase activity using a response surface methodology, Trawczynska et al, 2015) and / or in its periplasm.
  • Treatments to permeabilize the cytoplasmic membrane modify the cytoplasmic membrane of yeast by forming pores that allow the free diffusion of small molecules such as products or enzyme substrates, but maintain most of the proteins in the cytosol (Parmjit S Panesar, Reeba Panesar, Ram S. Singh, and Manav B. Bera, 2007. Permeabilization of Yeast Cells with Organic Solvents for ⁇ -Galactosidase Activity (Journal of Microbiology, 2: 34-41).
  • the wall of yeast is naturally permeable to proteins up to about 70 kDa.
  • the term "permeabilize" according to the invention is also understood as an increase in the permeability of the wall of the yeast.
  • a yeast is permeabilized or not by measuring the absorbance at 405 nm of a yeast incubated with p-nitrophenyl phosphate (pNPP) for 30 min. Under these conditions, a yeast is permeabilized when it has an absorbance at 405 nm greater than or equal to 0.1, for example greater than or equal to 0.2.
  • PNPP is the substrate of an enzyme, alkaline phosphatase, which is naturally present in the cytosol of yeast. PNPP does not enter the cytosol of a non-permeabilized yeast.
  • the pNPP can enter the yeast and be hydrolysed by the alkaline phosphatase present in the cytosol.
  • Example 9 presents the detailed protocol of a test for determining whether a yeast is permeabilized or not.
  • immunotherapeutic yeast means a yeast capable of inducing a humoral or cellular immune response in humans or animals, thus making it possible to treat or prevent cancer.
  • the present invention relates to a method for preparing an immunotherapeutic yeast, said method comprising the steps of:
  • the inactivation and permeabilization steps can be done in any order.
  • the method according to the invention comprises the steps of:
  • the method according to the invention comprises the steps of:
  • the tumor antigen (s) expressed on the wall of the yeast are oriented towards the external medium of the yeast and not towards the periplasm of the yeast.
  • An outward orientation of the yeast allows, after phagocytosis of the yeasts, the faster degradation of the tumor antigens by the proteases of the dendritic cells, thus facilitating the cross-presentation of tumor antigens to killer cells (Howland, Wittrup , Antigen Release Kinetics in the Phagosome Are Critical to Cross-Presentation Efficiency, J Immunol 2008 February 1; 180 (3): 1576).
  • the inactivation step aims to inactivate the yeasts.
  • inactivate yeast means a treatment which consists in stopping growth by cell division of the yeast.
  • the inactivation of yeast can be carried out by any means known to those skilled in the art to inactivate microorganisms.
  • the inactivation also makes it possible to fix the yeast.
  • the yeast is inactivated with paraformaldehyde (PFA) at a rate of 0.5% in PBS (v / v).
  • PFA paraformaldehyde
  • the permeabilization step is performed by means of a chemical, enzymatic or mechanical treatment, resulting in the permeabilization of the wall and / or the cytoplasmic membrane.
  • the genetically modified yeast is permeabilized with a solvent, for example a polar solvent.
  • the solvent may be chosen from ethanol, sorbitol, 2-mercaptoethanol, benzene, n-butanol, n-propanol, triton X-100, isopropanol, methanol, toluene, acetone or a mixture of lithium acetate and soda.
  • the genetically modified yeast is permeabilized with an enzyme, for example ⁇ -1,3-glucanase (Glu).
  • the genetically modified yeast is mechanically permeable by subjecting the yeast to freeze / thaw cycles (Hong-wei Zhao et al., 2011, Biotechnology & Biotechnological Equipment).
  • the genetically modified yeast is permeabilized with ethanol or isopropanol, for example with a mixture of 50% ethanol and 50% water (volume to volume, v / v). for example for about 15 minutes, about 20 minutes or about 25 minutes.
  • step a) is: obtaining a genetically modified yeast which expresses at its wall one or more fusion proteins of formula (Ia): [cell targeting protein or polypeptide dendritic] n - [tumor antigen] x - [peptide linker] m - [polypeptide or wall-anchored protein of genetically modified yeast] (la); n is 0 or 1, m is 0 or 1, and x is an integer from 1 to 300, preferably from 1 to 50, preferably ranging from 1 to 9, preferably ranging from 1 to 5, for example from 1 to 4, from 1 to 3, from 1 to 2, for example equal to 1, equal to 2, equal to 3, equal to 4, equal to 5.
  • formula (Ia) [cell targeting protein or polypeptide dendritic] n - [tumor antigen] x - [peptide linker] m - [polypeptide or wall-anchored protein of genetically modified yeast] (la); n is 0 or 1, m is 0 or 1, and x is an integer
  • the tumor antigens when x is an integer greater than 1, i.e., when x is an integer of from 2 to 300, the tumor antigens may be the same or different. For example, tumor antigens may all be different.
  • the tumor antigens when x is an integer greater than 1, i.e. when x is an integer of from 2 to 300, the tumor antigens may be separated or not by a linker peptide.
  • the tumor antigens when x is an integer greater than 1, i.e., when x is an integer of from 2 to 300, the tumor antigens may be the same or different.
  • the tumor antigens can be put one after the other or separated by a peptide sequence that connects said tumor antigens to each other.
  • Fusion proteins are widely described in the prior art.
  • a "fusion protein” is a protein obtained by the combination of different peptides, polypeptides and / or proteins. Fusion proteins can also be called chimeric proteins.
  • step a) comprises the steps of:
  • nucleic acid sequence encoding a genetically modified yeast wall-addressing polypeptide [nucleic acid sequence encoding a dendritic cell targeting polypeptide or protein] n - [nucleic acid encoding a tumor antigen] * - [nucleic acid sequence encoding a peptide linker] m - [nucleic sequence encoding a genetically modified yeast wall-anchoring polypeptide or protein] (Ha), n is 0 or 1, m is 0 or 1, and x is an integer from 1 to 300, preferably from 1 to 50, preferably from 1 to 9, preferably from 1 to 5, for example from 1 to 4, from 1 to 3, from 1 to 2, for example equal to 1, equal to 2, equal to 3, equal to 4, equal to 5;
  • nucleic acid sequence encoding a dendritic cell targeting polypeptide or protein [nucleic acid sequence encoding a dendritic cell targeting polypeptide or protein] n - [tumor antigen encoding nucleic sequence] x - [peptide linker encoding nucleic sequence] m - [nucleic acid sequence encoding an anchor polypeptide or protein at the wall of the genetically modified yeast] - [nucleic sequence encoding a polypeptide for addressing the wall of genetically modified yeast] (Ilb), n is not equal at 0 or 1, m is 0 or 1, and x is an integer from 1 to 300, preferably from 1 to 50, preferably from 1 to 9, preferably from 1 to 5, for example from 1 to 4, from 1 to 3, from 1 to 2, for example equal to 1, equal to 2, equal to 3, equal to 4, equal to 5;
  • a genetically modified yeast capable of expressing at its wall one or more fusion protein (s) of formula (Ia):
  • n is 0 or 1
  • m is 0 or 1
  • x is an integer from 1 to 300, preferably from 1 to 50, preferably from 1 to 9, preferably from 1 to 5, for example from 1 to at 4, from 1 to 3, from 1 to 2, for example equal to 1, equal to 2, equal to 3, equal to 4, equal to 5; and
  • a “vector” designates a vehicle used to introduce a nucleotide sequence into yeast, for its expression, for its replication and / or for its integration into the genome of said yeast.
  • the different types of vectors are widely known to those skilled in the art and all types of vectors can be used in the context of the present invention.
  • the vector (s) are also called plasmid (s).
  • the plasmid (s) can be linearized to allow homologous recombination in yeast, as explained in the examples.
  • nucleic sequences can be assembled in a vector by the Golden Gatte technique. (Engel et al., 2008, PLos One and EP2395087). This technique allows simultaneous and directional digestion and assembly of several nucleic sequences in a single reaction, using the use of restriction enzymes of type II, endonucleases that recognize particular sites and then cleave nucleic acid sequences. outside their recognition site.
  • nucleic sequences i.e. the vector or vectors
  • an integrative mode the nucleic sequences are inserted into the yeast genome stably.
  • replicative mode the nucleic sequences are inserted into the yeast transiently using a replicative plasmid.
  • the "genetically modified yeast wall-addressing polypeptide” or “targeting polypeptide” makes it possible to address the fusion protein (1a) to the wall of the genetically modified yeast. This addressing to the wall then allows the fusion protein to anchor itself to the wall of the genetically modified yeast.
  • the nucleic sequence coding for the addressing polypeptide is located at the 3 'end of the nucleic sequence (IIa) or (Ilb) coding for the fusion protein (1a).
  • the targeting polypeptide is advantageously N-terminal of the fusion protein (Ia).
  • the addressing polypeptide is naturally present in the polypeptide or anchoring protein (for example in the Aga2p sequence).
  • the addressing polypeptide is artificially added to the nucleic acid sequence coding for the fusion protein (1a) when the polypeptide or anchor protein does not naturally comprise an addressing polypeptide (for example in the sequence Sedlp).
  • the targeting polypeptide is the "prepro alpha factor leader peptide" derived from yeast pheromone (Mf (alpha ) lp).
  • Mf (alpha) 1p The nucleic sequence encoding Mf (alpha) 1p is SEQ ID No. 12.
  • Step a1) can be carried out in any culture medium ensuring viability and reproducibility of the yeast.
  • Yeast culture media are well known to those skilled in the art. For example, a glucose medium or a galactose medium.
  • the one or more vectors comprise a nucleic sequence encoding a peptide linker linking the anchoring protein or polypeptide and the tumor antigen (s).
  • peptide linker or “peptide linker” means an amino acid sequence that connects a polypeptide or protein to another polypeptide or protein.
  • the peptide linker connects the anchoring protein or polypeptide and the tumor antigen (s).
  • the peptide linker is G4S, composed of 4 glycines and a serine (GGGGS).
  • the G4S linker is commonly used in protein engineering because of its flexibility and protease resistance.
  • the vector (s) can also include a nucleic sequence encoding a protein tag (or tag), such as for example the c-myc tag.
  • the fusion protein may comprise a tag at its end.
  • the tag is used to detect the antigen (s) expressed on the yeast wall.
  • the yeast is selected from the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Ogataea or Candida.
  • the yeast is chosen from the genus Saccharomyces, preferably Saccharomyces cerevisiae. Saccharomyces cerevisiae is particularly advantageous because of the numerous works showing its safety for humans or animals.
  • the yeast INVSC1 (Life Technologies) is one example.
  • Saccharomyces cerevisiae is also well known for its tolerance when administered in humans or animals. Saccharomyces cerevisiae is especially used in the treatment of rhinitis or chronic rhinopharyngitis, in combination with sulfur and vitamins, the purpose of which is to reduce the inflammation of the mucous membranes of the nose and throat. This yeast is also used as a production system, for example vaccines, such as hepatitis B vaccine.
  • the anchoring protein or polypeptide maintains the fusion protein (1a) at the wall of the genetically modified yeast.
  • the anchoring protein or polypeptide is a protein or a polypeptide naturally expressed at the level of the yeast wall.
  • the anchoring protein or polypeptide may be selected from a protein or polypeptide naturally expressed by the selected yeast species or an exogenous protein or polypeptide, i.e., a non-expressed polypeptide or protein by the selected yeast species, for example a polypeptide or protein naturally expressed by another yeast species than the yeast species chosen to be genetically modified.
  • the anchoring protein or polypeptide is a yeast polypeptide or protein selected from Aga2p, Sedlp, Cwplp, Cwp2p, Flolp C, Tiplp or Tirlp / Srplp.
  • the anchoring protein or polypeptide is selected from Aga2p or Sedlp.
  • the nucleic acid coding sequence Aga2p is SEQ ID No: 10 and the nucleic sequence encoding Sedlp is SEQ ID No: 11.
  • the method according to the invention preferably comprises introducing into the yeast a nucleic sequence encoding Agalp.
  • This nucleic sequence encoding Agalp may be carried by a vector of step a1) or by another vector which is also introduced into the yeast.
  • the nucleic sequence encoding Agalp is SEQ ID No: 9.
  • the one or more vectors used in step a) further comprises a nucleic acid sequence encoding a dendritic cell targeting protein or polypeptide.
  • dendritic cell targeting protein or polypeptide is intended to mean any molecule of peptide nature that makes it possible to bring the immunotherapeutic yeast of the invention into contact with the dendritic cells of humans or animals. This approximation allows the dendritic cells to internalize the immunotherapeutic yeast and thus to internalize the tumor antigen (s), expressed at the wall of said yeast.
  • the targeting protein or polypeptide facilitates the interaction between the immunotherapeutic yeast and the dendritic cells of humans or animals. This interaction facilitates the endocytosis of the tumor antigen (s) and, therefore, the presentation of this tumor antigen (s) by T-cell dendritic cells.
  • the dendritic cell targeting proteins or polypeptides include any proteins or polypeptides capable of specifically binding an endocytic receptor of dendritic cells, for example the DEC205 (CD205) receptor.
  • DEC205 DEC205
  • polypeptide or the dendritic cell targeting protein is selected from:
  • an antibody or antibody fragment directed against i.e. capable of binding specifically to) the DEC205 receptor (CD205); or
  • PLA plasminogen activator
  • An antibody fragment may be chosen from Fv, Fab, Fab ', Fab'-SH and F (ab') 2 fragments; diabodies; linear antibodies; the antibodies with a single chain (eg scFv), preferably an antibody fragment according to the invention is a scFv, for example a scFv directed against CD205 of sequence SEQ ID No: 13.
  • the CD205 protein is a 205 kDa integral membrane glycoprotein homologous to the macrophage mannose receptor and related receptors.
  • CD205 an endocytic multilectin receptor that is used by dendritic cells and thymic epithelial cells to direct antigens captured in extracellular spaces to a specialized antigen processing compartment.
  • the activator PLA plasminogen from Yersinia pestis is a protease that plays an important role in the progression of the bacteria. Yersinia pestis has been shown to be able to use the DEC205 receptor via PLA plasminogen activator to disseminate in mice (J Biol Chem 2008 Nov 14; 283 (46): 31511-21).
  • the plasminogen activator may be the corresponding entire sequence or a partial sequence or an entire mutated sequence or a mutated partial sequence. Partial and / or mutated PLA sequences are also referred to as PLA derived sequences.
  • the tumor antigen (s) expressed at the wall of the immunotherapeutic yeasts are selected from solid or liquid tumor antigens, preferably from solid tumor antigens.
  • the tumor antigen (s) are / are chosen from among Melan-A, Tyrosinase, gp100, MAGE-B1, MAGEA1, MAGEA10, MAGEA11, MAGEA12, MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA8.
  • Another subject of the invention is an immunotherapeutic yeast, obtainable by the implementation of the process according to the invention.
  • Another subject of the invention is a genetically modified and permeabilized immunotherapeutic yeast which expresses at its wall:
  • tumor antigens preferably selected from Melan-A, Tyrosinase, gp100, MAGE-B1, MAGEAl, MAGEA10, MAGEA11, MAGEAl 2,
  • PI3K PI3K, APC, BAX, beta2-microglobulin, telomerase or NRAS;
  • the immunotherapeutic yeast according to the invention is genetically modified, permeabilized and inactivated.
  • the yeast of the invention expresses at its wall a fusion protein of formula (Ia):
  • n 0 or 1
  • m 0 or 1
  • x is an integer from 1 to 300, preferably from 1 to 50, preferably from 1 to 9, preferably from 1 to 5 , for example from 1 to 4, from 1 to 3, from 1 to 2, for example equal to 1, equal to 2, equal to 3, equal to 4, equal to 5.
  • the dendritic cell targeting agent is chosen from an antibody capable of binding specifically to the DEC205 protein, an antibody fragment capable of binding specifically to the DEC205 protein, plasminogen activator.
  • PHA plasminogen activator
  • the dendritic cell targeting agent is described above.
  • the tumor antigens when x is an integer greater than 1, i.e. when x is an integer from 2 to 300, the tumor antigens may be the same or different. For example, tumor antigens may all be different.
  • the tumor antigens when x is an integer greater than 1, that is to say when x is an integer ranging from 2 to 300, the tumor antigens may or may not be separated by a binding peptide; and or
  • the tumor antigens when x is an integer greater than 1, i.e. when x is an integer from 2 to 300, the tumor antigens may be the same or different.
  • the tumor antigens can be put one after the other or separated by a peptide sequence that connects said tumor antigens to each other.
  • immunotherapeutic composition comprising a yeast as described above, and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • immunotherapeutic composition means a composition intended for the prevention or treatment of a pathology, after administration in humans or animals, said composition comprising one or more components capable of stimulating a humoral immune response and / or or a cell-mediated immune response. Included among the components capable of stimulating a humoral immune response and / or a cell-mediated immune response, tumor antigens, microorganisms such as viruses, bacteria or yeasts, but also cell lysates, dendritic cells, genetically modified cytotoxic lymphocytes, cytokines, immune system checkpoint inhibitors.
  • the immunotherapeutic composition according to the invention is intended for the prevention or treatment of a cancer.
  • the immunotherapeutic composition is capable of stimulating a cell-mediated immune response.
  • the cell-mediated immune response is characterized by the intervention of cells of the immune system developing direct cytotoxicity, i.e., cells capable of destroying target cells expressing a non-self antigen.
  • Cells of the immune system capable of cytotoxicity are represented by NK (Natural Killer) cells and cytotoxic T lymphocytes.
  • Cytotoxic T lymphocytes are a subset of T lymphocytes, capable of inducing death by apoptosis of cells infected with an infectious agent or of inducing death of cancer cells.
  • the antigen To induce an immune response, the antigen must be presented to CD8 + T cells (cytolytic response) or CD4 + T lymphocytes (auxiliary response) by a major cell-mediated Major Histocompatibility Complex (MHC), class I or II, respectively antigen presenter.
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • the cells presenting the antigen dendritic cells are the most efficient: they have the capacity not only to activate naive T lymphocytes, but also to induce a humoral and cellular cytolytic response by the presentation of antigens in the cell. context of class I or II MHC molecules.
  • the stages of catabolism of the antigen are strictly correlated with the stages of dendritic cell maturation.
  • the immunotherapeutic yeast contained in the immunotherapeutic composition is capable of interacting with dendritic cells and stimulating a cell-mediated immune response by activation of T cells.
  • the immune response then results in a physiological response which results in a regression of the size of the target tumor.
  • the size of a tumor is measured in cubic millimeters (mm 3 ) and the regression of the size of a tumor treated by a therapeutic means is most often evaluated as a percentage relative to the size. an untreated tumor.
  • tumor size regression is measured as a percentage of the tumor initially detected and before treatment.
  • composition generally comprises several excipients.
  • Hydrophilic excipients such as water (purified or PPI), alcohols (ethanol, glycols, glycerol or polyethylene glycols), gelling agents such as gums, substances extracted from algae, proteins, cellulose and its derivatives and synthetic gelling agents.
  • Lipophilic excipients such as glycerides of natural or semi-synthetic origin and non-glyceric lipophilic excipients such as fatty acids, fatty alcohols, hydrocarbons and silicones are also found. Emulsifying excipients are also found, including ionic, anionic, cationic or amphoteric surfactants and nonionic surfactants. Still other components may serve as excipients, such as sugars (sucrose, glucose, fructose, lactose, sorbitol, starch) or mineral products such as colloidal silicas, talc, kaolin or titanium oxide.
  • the immunotherapeutic composition of the invention also comprises a therapeutic agent.
  • the therapeutic agent is chosen from an anticancer polypeptide or a chemotherapeutic agent. It can also be polysaccharides, lipid derivatives, vitamins, nucleic acids or aptamers.
  • the anticancer polypeptide may be selected from cytokines, chemokines, hormones, antibodies, antibody fragments, agonists, antagonists or growth factors. This list is not exhaustive.
  • Chemotherapeutic agents are well known to those skilled in the art. They are grouped into several families, which are alkylating agents, spindle agents, spindle poisons (vinca-alkaloids and related) spindle stabilizers (taxanes), anti-metabolites, proteasome inhibitors or inhibitors topoisomerases.
  • the chemotherapeutic agent is chosen from cyclophosphamide, docetaxel (taxane family), doxorubicin (anthracycline family), epirubicin (anthracycline family), fluoro-uracil (also called 5-FU), methotrexate, paclitaxel (taxane family), anthracyclines, capecitabine, eribulin, gemcitabine or vinorelbine.
  • the subject of the invention is also an immunotherapeutic yeast according to the invention or an immunotherapeutic composition according to the invention for its use as a medicament, more particularly for its use in the treatment or prevention of cancer.
  • cancer is meant a large group of pathologies that can affect any part of the body, one of the common features of which is the rapid and uncontrolled proliferation of abnormal cells that can spread into other organs, forming what we call metastases.
  • the term “cancer” includes solid cancers and liquid cancers also known as hematopoietic cancers that include leukemias and lymphomas.
  • the cancer is a solid cancer. Solid cancers can develop in any tissue. There are carcinomas and sarcomas.
  • the cancer is selected from melanomas, squamous cell carcinomas, breast cancers, carcinomas of the head and neck, thyroid carcinomas, soft tissue sarcomas, bone sarcomas, testicular cancers, prostate cancers, ovarian cancers, bladder cancers, skin cancers, brain cancers, angiosarcomas, hemangiosarcomas, mastoid cell tumors, liver cancers, cancers lungs, pancreatic cancers, gastrointestinal cancers, renal cell carcinomas and all metastatic cancers that derive from this list.
  • the solid cancer is a melanoma, whether extensive superficial melanoma, nodular melanoma, Dubreuilh melanoma or acrimonious melanoma and the metastasized forms that may be associated.
  • the solid cancer is a colon cancer.
  • the immunotherapeutic yeast expresses at its wall one or more antigen (s) chosen from elan-A, Tyrosinase, gp100, MAGE-B1, MAGEA1, MAGEA10, MAGEA11, AGEA12, MAGEA2.
  • MAGEA2B AGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA8, MAGEA9, MAGEB1, MAGEB10, MAGEB16, MAGEB18, MAGEB2, MAGEB3, MAGEB4, AGEB5, MAGEB6, MAGEB6B, New York Esophageal 1 antigen (NY-ESO-1), MAGEC1, AGEC2, Antigen (LAGE), TRP-1 or TRP-2.
  • the immunotherapeutic yeast advantageously expresses at its wall one or more antigen (s) chosen from P53, KRAS, CEA, WT1, MUC1, SART3, SURVIVIN 2B, RNF43 / TOM 34, TGFBRII, HER2 / neu, BRAF, PI3K, APC, BAX, beta2-microglobulin, telomerase or NRAS.
  • antigen chosen from P53, KRAS, CEA, WT1, MUC1, SART3, SURVIVIN 2B, RNF43 / TOM 34, TGFBRII, HER2 / neu, BRAF, PI3K, APC, BAX, beta2-microglobulin, telomerase or NRAS.
  • the immunotherapeutic yeast or the immunotherapeutic composition according to the invention may be administered by means of injections, intramuscularly, intraperitoneally, intravenously or subcutaneously, orally or by respiratory / pulmonary route.
  • the dosage form will be adapted.
  • the dosage form may be selected from tablets, including orodispersible tablets, capsules, capsules, oral solutions.
  • the dosage form may be in the form of a spray or inhalation products.
  • the immunotherapeutic yeast or the immunotherapeutic composition is administered by subcutaneous injection.
  • the yeast or the immunotherapeutic composition according to the invention is administered to the man or the animal at the rate of one or more doses per week, or of one or more doses per month, said a dose ranging from 0.1 to 200 YU (Yeast Unit), preferably 0.1 to 2 YU, or 0.1 to 5 YU, or 0.1 to 10 YU, or 1 to 10 YU, 10 to 20 YU, 20 to 30 YU, 30 to 40 YU, 40 to 50 YU, or 50 and 100 YU, 100 and 150 YU, or 150 YU and 200 YU, with a YU equal to 10 7 yeasts.
  • YU Yeast Unit
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a yeast expressing at its wall the MEQLESIINFEKLTEWTSA polypeptide (SEQ ID NO: 14) representing the OVA1 antigen derived from ovalbumin, said antigen being expressed at the yeast wall via the polypeptide of anchorage Aga2p bound via a disulfide bridge to Agalp.
  • the OVA1 antigen is bound to the anchor polypeptide via a G4S linker, composed of 4 glycines and a serine.
  • C-myc is a tag (label) for detecting and confirming the expression of the OVA1 antigen on the wall of the genetically modified yeast.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a yeast expressing at its wall the MEQLESIINFEKLTEWTSA polypeptide (SEQ ID NO: 14) representing the OVA1 antigen derived from ovalbumin, said antigen being expressed at the yeast wall via a protein of anchorage, Sedlp.
  • the OVA1 antigen is bound to the anchor polypeptide via a G4S linker, composed of 4 glycines and a serine.
  • C-myc is a tag (tag) for detecting and confirming the expression of OVA1 antigen on the wall of genetically modified yeast.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a yeast expressing at its wall the MEQLESIINFEKLTEWTSA polypeptide (SEQ ID NO: 14) representing the OVA1 antigen derived from ovalbumin, said antigen being expressed at the yeast wall via the polypeptide of anchorage Aga2p bound via a disulfide bridge to Agalp.
  • the OVA1 antigen is attached to the anchor polypeptide by a G4S linker, composed of 4 glycines and a serine.
  • the yeast also expresses at its wall the ScFv fragment of an antibody directed against the DEC205 receptor (ScFv anti-DEC205).
  • C-myc is a tag to detect and confirm the expression of the OVA1 antigen on the yeast wall.
  • FIG. 4 is a diagram which illustrates a yeast expressing at its wall the MEQLESIINFEKLTEWTSA polypeptide (SEQ ID NO: 14) representing the OVA1 antigen derived from ovalbumin, said antigen being expressed at the wall of the yeast via a protein of anchorage, Sedlp.
  • the OVA1 antigen is bound to the anchor polypeptide by a G4S linker, composed of 4 glycines and a serine.
  • the yeast also expresses at its wall the ScFv fragment of an antibody directed against the DEC205 receptor (ScFv anti-DEC205).
  • ScFv anti-DEC205 is a tag to detect and confirm the expression of the OVA1 antigen on the yeast wall.
  • Figure 5 is a diagram illustrating the assembly of a vector with nucleic sequences, by the method Golden Gatte.
  • Figure 6 is a diagram illustrating a vector assembled by the Golden Gatte method.
  • Figure 7 is a flow cytometry spectrum which shows expression of the OVA1 peptide at the yeast wall using an antibody directed against the c-myc tag.
  • FIG. 8 is a diagram which shows the activation of cytotoxic CD8 + T cells after cross-presentation of the SIINFEKL antigen (OVA 257-264) by the dendritic cells to said cytotoxic CD8 + T lymphocytes, with increasing doses of SIINFEKL antigen ( OVA 257-264) (from 0 nM to 10 nM).
  • SIINFEKL antigen is free, i.e., not attached to the yeast wall, and wild yeasts are used as adjuvant with a MOI of 20 (Multiplicity of infection).
  • Figure 9 is a diagram which shows the activation of cytotoxic CD8 + T cells after cross-presentation by dendritic cells using permeabilized yeasts or not.
  • D) yeasts express OVA1 antigen and ScFv anti-DEC205 fragment at the wall, using Sedlp anchor protein
  • Figure 10 is a graph showing tumor growth in cubic millimeters (mm 3 ) in mice after tumor challenge on day 0 with 5 ⁇ 10 5 B16-OVA melanoma cells (M05) injected subcutaneously.
  • Wild mice (WT for Wild Type) are represented by circles.
  • Mice treated with permeabilized yeasts expressing OVA1 fused to anti-DEC-205 scFv at their wall via the Sedlp anchor protein, are represented by triangles.
  • a dose of 1 YU (1.10 7 yeasts) was injected three times, seven days before the intraperitoneal tumor challenge, three days before the subcutaneous tumor challenge, and three days after the subcutaneous tumor challenge.
  • FIG 11 is a plot that shows the survival rate of mice after the same tumor challenge described for Figure 10.
  • Wild mice (WT for Wild Type) are represented by circles.
  • FIG. 12 is a diagram illustrating a yeast expressing, at its wall, the polypeptide SPSYAYHQF (SEQ ID NO: 15) representing the AH1A5 antigen derived from AH-1, said antigen being expressed at the wall of the yeast via a protein of anchorage, Sedlp.
  • the AH1A5 antigen is bound to the anchor polypeptide via a G4S linker, composed of 4 glycines and a serine.
  • C-myc is a tag (tag) for detecting and confirming the expression of the AH1A5 antigen on the wall of genetically modified yeast.
  • the yeast also expresses at its wall the ScFv fragment of an antibody directed against the DEC205 receptor (ScFv anti-DEC205 or ScFv DEC205).
  • Figure 13 is a diagram illustrating a yeast expressing at its wall the TAPDNLGYM polypeptide (SEQ ID NO: 16) representing the TRP1 antigen, said antigen being expressed at the wall of yeast via an anchor protein, Sedlp.
  • the TRP1 antigen is bound to the anchor polypeptide via a G4S linker, composed of 4 glycines and a serine.
  • C-myc is a tag to detect and confirm the expression of TRP1 antigen on the wall of genetically modified yeast.
  • the yeast also expresses at its wall the ScFv fragment of an antibody directed against the DEC205 receptor (ScFv anti-DEC205 or ScFv DEC205).
  • Figure 14 is a schematic diagram illustrating a yeast expressing at its wall the SVYDFFVWL polypeptide (SEQ ID NO: 17) representing the TRP2 antigen, said antigen being expressed at the yeast wall via an anchor protein, Sedlp.
  • the TRP2 antigen is bound to the anchor polypeptide via a G4S linker, composed of 4 glycines and a serine.
  • C-myc is a tag (tag) for detecting and confirming the expression of TRP2 antigen on the wall of genetically modified yeast.
  • the yeast also expresses at its wall the ScFv fragment of an antibody directed against the DEC205 receptor (ScFv anti-DEC205 or ScFv DEC205).
  • FIG. 15 is a diagram illustrating a yeast expressing at its wall the polypeptides TAPDNLGYM (SEQ ID NO: 16), MEQLESIINFEKLTEWTSA (SEQ ID NO: 14) and SVYDFFVWL (SEQ ID NO: 17) respectively representing the TRP1, OVA1 antigen. and TRP2, said antigens being expressed at the wall of yeast via an anchor protein, Sedlp.
  • the antigens are linked to the anchor polypeptide via a G4S linker, composed of 4 glycines and a serine, and also separated from each other by a G4S linker.
  • C-myc is a tag (tag) for detecting and confirming the expression of antigens on the wall of genetically modified yeast.
  • the yeast also expresses at its wall the ScFv fragment of an antibody directed against the DEC205 receptor (ScFv anti-DEC205 or ScFv DEC205).
  • FIG. 16 is a flow cytometry spectrum with an anti-C-myc antibody of yeasts expressing on their walls the antigens AH1A5 (FIG. 16A), TRP1 (FIG. 16B), TRP2 (FIG. 16C) or OVA1-TRP1-TRP2 (FIG. Figure 16D).
  • Figure 17 is a diagram which shows the absorbance at 405 nm of yeasts treated in different ways and contacted with p-nitrophenyl phosphate (pNPP).
  • PNPP is the substrate of an enzyme, alkaline phosphatase, which is naturally present in the cytosol of yeast. PNPP does not enter the cytosol of a non-permeabilized yeast.
  • the pNPP can return in yeast and be hydrolysed by alkaline phosphatase present in the cytosol. The hydrolysed pNPP then takes on a yellow color readable by the absorbance at 405 nm.
  • Figure 18 is a diagram which shows the absorbance at 405 nm of yeasts treated in different ways and contacted with p-nitrophenyl phosphate (pNPP).
  • PNPP is the substrate of an enzyme, alkaline phosphatase, which is naturally present in the cytosol of yeast. PNPP does not enter the cytosol of a non-permeabilized yeast.
  • the pNPP can enter the yeast and be hydrolysed by the alkaline phosphatase present in the cytosol. The hydrolysed pNPP then takes on a yellow color readable by the absorbance at 405 nm.
  • Figure 19 is a diagram which shows the activation of cytotoxic CD8 + T cells after cross-presentation of yeasts expressing on their wall MEQLESIINFEKLTEWTSA antigen (SEQ ID NO: 14) in the presence of dendritic cells. Yeasts have been treated in different ways to obtain permeabilized or non-permeabilized cells.
  • plasmids Two types were created by Abolis Biotechnologies (iSSB, Genopole, Evry, France), an integrative plasmid and a replicative plasmid.
  • an episomal plasmid fragment containing the 2 micron yeast replication origin, the URA3 selection marker (SEQ ID No. 4) and the ampicillin resistance were assembled by the Gibson method (Gibson Assembly Master Mix, NEB, Inc.) and then the plasmid was transformed with the inserts by Golden Gatte according to the method described in Figures 5 and 6.
  • the synthetic terminator T27 placed upstream of the terminator CYC1 to increase the production of the recombinant proteins (SEQ ID No. 3), was synthesized from the sequence of the terminator designated T27 in the article "Short Synthetic Terminators for Improved Heterologous Gene Expression in Yeast, Curran et al., ACS Synth Bio. 2015 Jul 17; 4 (7): 824-32. It reinforces the action of the terminator CYC1.
  • the URA3 gene was extracted from the yeast genome with its promoter and its terminator (SEQ ID No. 4)
  • Kanamycin resistance antibiotic Kan
  • bacterial origin of replication pMB1 comes from the plasmid pSBlK3 (SEQ ID No. 5)
  • the yellow fluorescent reporter gene YFP No. BBa_E0030 with the pLAC promoter No. BBa_R0010 and the terminator No. BBa_B0015, all come from the "parts registry iGEM" catalog.
  • XI-2 UP SEQ ID No. 6
  • XI-2 DOWN SEQ ID No. 7
  • insertion sites allow the chromosomal integration of the recombinant nucleotide sequences by homologous recombination in the genetically modified yeast (Microbial production of indolyglucosinolate through engineering of a multi-gene pathway in a versatile yeast expression platform, Metab Eng. 2012 Mar; 14 (2): 104-11), Mikkelsen MD, LD Buron, Salomonsen B, Olsen CE, Hansen BG, Mortensen UH, Halkier BA.)
  • the nucleic sequences were synthesized to contain Bsal cleavage sites and end-complementary primers.
  • An example of pairs of primers used in the implementation of the invention is: 5 'of the insert, GGTCTCTAATG (SEQ ID NO: 18) and 3' of the insert, GAGTTGAGACC (SEQ ID NO: 19). These primers are only compatible with the pieces that insert before and after, so that all fragments assemble in the correct order by mixing them in a single ligation reaction ( Figure 5 and Figure 6).
  • the insert is composed for example of
  • nucleic sequence encoding an Aga2p anchoring and addressing polypeptide the nucleic acid sequence coding for the OVA1 peptide (tumor antigen model) and the c-myc coding sequence
  • nucleic sequence encoding a Sedlp anchoring polypeptide the nucleic acid sequence coding for the AH1-A5 peptide (colon cancer antigen), the c-myc coding sequence, the sequence coding for the ScFv DEC 205 targeting polypeptide and the nucleic sequence coding an addressing polypeptide derived from the yeast pheromone protein Mf (alpha) lp and named "Pre pro alpha factor peptide leader",
  • nucleic sequence encoding a Sedlp anchoring polypeptide the nucleic acid sequence coding for the TRP1 peptide (melanoma antigen), the c-myc coding sequence, the sequence coding for the ScFv DEC 205 targeting polypeptide and the nucleic acid sequence encoding a polypeptide addressing derived from the yeast pheromone protein Mf (alpha) lp and named "Pre pro alpha factor peptide leader",
  • nucleic sequence encoding a Sedlp anchoring polypeptide the nucleic acid sequence coding for the TRP2 peptide (melanoma antigen), the c-myc coding sequence, the sequence coding for the ScFv DEC 205 targeting polypeptide and the nucleic sequence encoding a polypeptide addressing derived from the yeast pheromone protein Mf (alpha) lp and named "Pre pro alpha factor peptide leader",
  • nucleic sequence encoding a Sedlp anchoring polypeptide the nucleic acid sequence encoding the OVA1, TRP1 and TRP2 peptides, the c-myc coding sequence, the sequence coding for the ScFv DEC 205 targeting polypeptide and the nucleic acid coding sequence; addressing derived from the yeast pheromone protein Mf (alpha) lp and named "Pre pro alpha factor peptide leader".
  • 1 ⁇ L of concentrated DNA T4 Ligase was mixed at 400,000 units per mL with 2 ⁇ L of T4 DNA Ligase 10X buffer, 1 ⁇ of high fidelity Bsal restriction enzyme concentrated to 20,000 units per ml, 50 ng of each inserted nucleotide sequence (sequences 1 to 8), as well as 50 ng of the plasmid receiving the nucleotide insert.
  • the reaction medium was made up to 25 ⁇ with deionized water.
  • reaction medium was then subjected to different temperature cycles to allow the enzymatic reaction of cleavage by the Bsal enzyme (cycles at 37 ° C.) and the ligation of the digested nucleotide sequences as well as the plasmid digested with the enzyme T4 ligase ( cycles at 16 ° C) according to this protocol:
  • Step 3 65 ° C for 10 minutes
  • E. coli competent bacteria E. coli DH5-Alpha High Efficiency, NEB, Inc.
  • the bacteria were streaked on a culture medium containing a suitable selection antibiotic, Kanamycin or Ampicillin. After 24 hours of culture at 37 ° C., an isolated colony was cultured in liquid medium at 37 ° C. in a medium containing the same selection antibiotic as previously. After 24 hours, 2 ml of bacterial culture were taken to carry out purification of the plasmids. All the plasmids were checked by a PCR colony and sequenced by the Sanger method to verify the correct assembly.
  • the integrative plasmids were then digested with the enzyme Avril to linearize them to allow homologous recombination. Subsequently, the yeast S. cerevisiae INVSC1 (Life Technologies SAS) was transformed by the lithium-acetate method with these linearized integrative plasmids (Transformation of yeast by lithium acetate / single-stranded carrier DNA / polyethylene glycol method, Methods Enzymol 2002: 350: 87-96, Gietz et al).
  • the yeasts were cultured in YPAD (20 g / L glucose, 10 g / L Yeast Extract, 20 g / L bacto-peptone) until log phase, then collected by centrifugation at 3000 g for 5 minutes, washed in sterile water, and transformed with the following solution: 240 ⁇ l of PEG 4000 (50% (w / v)), 36 ⁇ l of LiAc 1.0 M, 50 ⁇ l of single stranded salmon sperm DNA (2.0 mg / ml), 34 ⁇ l of plasmid to be transformed. Yeasts suspended in this transformation solution were placed in a bath 42 ° C for 25 minutes.
  • yeasts After centrifugation at 13,000 g for 1 minute, the yeasts were resuspended in YPAD medium for 1h, before being streaked on a plate containing a selective medium for the plasmid inserted into the yeast.
  • the chromosomal insertion was then verified by genome extraction of genetically modified yeasts and IFN-specific PCR (Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications, Biotechniques 50 -328-328 (2011), Looke et al).
  • LiAc lithium acetate
  • the yeast Saccharomyces cerevisiae INVSC1 (Life Technologies SAS), an auxotrophic quadruple yeast (URA, TRP, HIS, LEU), was used in all the examples cited.
  • the yeast has been genetically engineered to express one or more tumor antigens with an anchoring protein or polypeptide, an addressing polypeptide, and a targeting peptide or protein after transformation with the plasmids described in FIG. Example 1 by the Lithium Acetate method.
  • a selective medium without the amino acids URA or TRP was used for the selection of recombinant yeasts.
  • the yeast was first cultured at 30 ° C until stationary phase in a selective medium comprising: 20g / L glucose, 6.7 g / L yeast nitrogen base without amino acids, 0.7 g / L of each acid amino among: Histidine, Leucine and Tryptophan.
  • the yeasts were then centrifuged for 5 minutes at 4000 rpm, washed in PBS (Phosphate Buffer Saline), and then resuspended in an inductive selective medium comprising: 20 g / L galactose, 6.7 g / L yeast nitrogen base without amino acids, 0.7 g / L of each of the following amino acids among: Histidine, Leucine and Tryptophan.
  • the yeasts were then placed in culture at 20 ° C. for 20 hours for the induction of the expression of recombinant proteins by galactose.
  • FIG. 1 shows the example of a genetically modified yeast which has been transformed by a first vector containing the nucleic sequence coding for the c-myc tag fused OVA1 antigen and the nucleic acid sequence coding for the anchoring and addressing polypeptide.
  • Aga2p SEQ ID NO: 10
  • Aga2p was linked by a disulfide bond to the Agalp protein (SEQ ID NO: 9) which anchored in the yeast wall and was produced from a second vector co-transformed with the first vector.
  • Figure 2 shows the example of a genetically modified yeast transformed by a single vector containing the c-myc tag fused OVA1 antigen and the Sedlp anchor protein (SEQ ID NO: 11).
  • FIG. 3 shows the example of a yeast genetically modified with a first vector containing the nucleic sequence coding for the OVA1 antigen fused to the ScFv DEC205 targeting polypeptide, the nucleic sequence coding for the c-myc tag and the nucleic sequence coding for the polypeptide. anchoring and addressing Aga2p. Aga2p was linked by a disulfide bond to the Agalp protein that anchored in the yeast wall and was produced from a second vector co-transformed into yeast with the first vector.
  • FIG. 4 shows the example of a genetically modified yeast which has been transformed with a single vector containing the nucleic sequence coding for the N-terminal "prepro alpha factor leader peptide" addressing polypeptide derived from the yeast pheromone Mf ( alpha) lp (SEQ ID NO: 12), the nucleic acid sequence encoding the scFv DEC205 targeting polypeptide (SEQ ID NO: 13), the nucleic acid sequence encoding the c-myc tagged OVA1 antigen and the nucleic acid coding sequence Sedlp anchor.
  • the natural flanking sequences of the ovalbumin protein were added to said peptide by synthesis: M EQLESIIN FEKLTEWTSA (SEQ ID NO: 14).
  • the SIINFEKL peptide associated with the flanking sequences represents OVA1.
  • a G4S linker was placed between the anchoring protein or polypeptide and OVA1. This linker is an amino acid chain composed of 4 glycines and one serine (GGGGS).
  • a protein tag, c-myc has also been added to allow the detection of complexes on the yeast surface.
  • fusion protein Addressing the fusion protein to the surface of the yeast required an N-terminal secretion signal. For fusion proteins comprising Aga2p, this protein already contained the required secretion signal. For fusion proteins using C-terminal Sedlp, an additional secretion signal was added at the N-terminus of the fusion protein, using the coding polypeptide encoded by the sequence. nucleic acid "prepro alpha factor leader" derived from the yeast pheromone Mf (alpha) lp (SEQ ID No. 12). The anti-DEC205 ScFv targeting polypeptide could be added among the inserts (FIGS. 3 and 4) (SEQ ID NO: 13) to fuse with surface-expressed OVA1 antigen using the previously described Golden Gatte technique.
  • the expression of the OVA1 peptide expressed on the surface of the genetically modified yeast was verified by spectral flow cytometry, using yeasts having the same antigen in the cytosol as a negative control. After the galactose induction described in Example 2, the yeasts at a concentration of 1.10 7 cells per ml were suspended in a 2% PFA solution. They were then washed in PBS containing 1% BSA. After washing, they were cultured for 1 h at room temperature with a primary anti-c-myc antibody at a ratio of 1: 100 (Myc.A7, Life Technologies SAS).
  • FIG. 7 This figure shows the expression of the OVA1 peptide on the yeast surface constructed according to the example described in FIG. 2.
  • An anti-c-myc antibody makes it possible to detect the yeasts which express to their surface the OVAl antigen. In the case where the yeasts express the antigen in the cytosol, there is no detection in flow cytometry. In the case of the construction of Figure 2, 50% of the yeasts express OVAl on their surface.
  • This example demonstrates the ability of the OVA1 antigen to activate CD8 + T cells independently of its expression by yeast.
  • the antigen has been cross-presented to CD8 + T cells via dendritic cells.
  • the activation of cytotoxic CD8 + T lymphocytes was measured using a colorimetric test using beta-galactosidase and one of its substrates, CPRG (Chlorophenol red-beta-galactopyranoside).
  • the test requires, a source of dendritic cells, a source of CD8 + T cells and yeasts modified to express an antigen on the surface, said yeasts being non-permeabilized.
  • the dendritic cells used are murine dendritic cells derived from the MutuDC line (obtained from the University of Lausanne). This line is derived from immortalized splenic CD8a dendritic cells that retain the ability to cross-present antigen and activate killer lymphocytes (LT).
  • the cells of the MutuDC line were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS, HEPES, 50 ⁇ l 2-mercaptoethanol, 50 U / ml penicillin, and 50 ⁇ g / ml streptomycin, at 37 ° C. with 5% CO 2 .
  • the T cells used come from the B3Z hybridoma.
  • the hybridoma B3Z a specific line for the peptide OVA 257-264 (SIINFEKL), was offered by Institut Curie (Paris V). These cells have the particularity of producing beta-galactosidase under the control of an IL2 promoter (Inter-leukine 2).
  • the B3Z cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS, Glutamax, HEPES, 50 ⁇ l 2-mercaptoethanol, 50 U / ml penicillin, and 50 ⁇ g / ml streptomycin, at 37 ° C. with 5% CO 2 .
  • OVA peptide 257-264 (SIINFEKL) was mixed with the dendritic cells for 5 hours in the presence of wild yeasts.
  • the dendritic cells were divided into 50,000 cells per well in 96-well round-bottom plates.
  • the lymphocytes of the B3Z line were added at a rate of 100,000 per well for 18 hours at 37 ° C. and 5% of C0 2 .
  • the plates were then washed and T-cell beta-galactosidase activity was measured after addition of 120 ⁇ l of lysis buffer which contained PBS, 9 mM MgCl 2, 0.125% NP40 and 0.15 mM chlorophenol red. beta-galactopyranoside).
  • Figure 8 shows the ability of OVA antigen 257-264 (SIINFEKL) to induce activation of CD8 + T cells, once cross-presented by dendritic cells.
  • the assay is performed with increasing doses of OVA peptide 257-264 (SIINFEKL) as a positive control.
  • Example 4 The experimental conditions of Example 4 are applicable to Example 5.
  • the condition which differs lies in the use of yeasts genetically modified to express an antigen to their wall, permeabilized or non-permeabilized.
  • Permeabilization was performed as previously described by subjecting the yeasts to 0.5% PFA treatment for 10 minutes, washing with PBS, and then ethanol treatment (50% ethanol, 50% PBS) for 5 minutes. 15 minutes, a new wash with PBS, before being co-cultivated with the MutuDC.
  • ethanol treatment 50% ethanol, 50% PBS
  • Figure 9 permeabilized yeasts that express the antigen on their surface
  • Figure 9 the genetically modified yeasts presenting the antigen at their wall induce a stronger activation of CD8 + T cells than yeasts presenting the antigen in their cytosol.
  • the permeabilization had no effect on the yeasts that produce the OVA1 antigen in the cytosol.
  • permeabilized yeasts which express the OVAl antigen at their wall significantly improve the activation of CD8 + T lymphocytes, compared with non-permeabilized yeasts, with an increase of activation between 33% and 255% by permeabilized yeasts. comparison with non permeabilized yeasts.
  • a measurement of melanoma growth was performed on mice receiving permeabilized yeasts presenting the OVA1 antigen to the wall, coupled to the anti-DEC205 scFv antibody fragment.
  • mice Female C57BL / 6 mice aged 6 and 8 weeks were maintained and treated in agreement with the Bioethics Committee of the Polish Academy of Sciences.
  • the M05 melanoma cell line (B16-OVA, obtained from Pr 0. Lantz, Institut Curie, Paris V) was cultured in RPMI + Glutamax + 10% FCS + 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol + Strep / Pen + 2 mg / mL G418 + 60 ⁇ g / mL hygromycin B at 37 ° C and 5% CO 2.
  • the M05 line is a melanoma B16 line, transfected with ovalbumin (OVA).
  • mice were immunized intraperitoneally 7 days before the tumor challenge, then subcutaneously, 3 days before the tumor challenge and 3 days after the tumor challenge, with a single dose of 1 YU each injection in 100 ⁇ l of PBS. .
  • mice received 1x10 s M05 subcutaneously in a volume of 100 ul of PBS.
  • Control mice immunized with wild type yeasts (WT). 5 mice were used per experimental group.
  • the tumor volume was evaluated with the formula (a * a * b) / 2, where "a" is the shortest tumor axis, "b" the longest tumor axis, in millimeters. Moribund mice whose tumors exceeded 1500 mm3 were sacrificed.
  • mice immunized with permeabilized yeasts expressing DEC205-OVA1-SED had an average tumor volume of 43.1 mm 3, compared with an average tumor volume of 162.5 mm 3 for the mice immunized with the so-called wild yeasts.
  • Wild-Type WT
  • the error bars represent the standard deviation of the average tumor volume per experimental group.
  • CONCLUSION Vaccination of mice with permeabilized yeasts that present the OVA1 antigen fused to DEC205 scFv dendritic cell targeting polypeptide resulted in a decrease in significant tumor growth and increased significant survival of the mice, compared to mice. vaccinated with wild yeasts.
  • Example 7 Preparation of immunotherapeutic yeasts expressing on their wall the tumor antigens AH1-A5, TRP1. TRP2 or OVA1-TRP1-TRP2
  • Yeast Saccharomyces cerevisiae INVSC1 (Life Technologies SAS), an auxotrophic quadruple yeast (URA, TRP, HIS, LEU), was used.
  • the yeast has been genetically engineered to express one or more tumor antigens (AH1-A5, TRP1, TRP2 or OVA1-TRP1-TRP2) with an anchor polypeptide, an addressing polypeptide, and a targeting polypeptide. after transformation with the plasmids described in Example 1 by the lithium acetate method.
  • a selective medium without the amino acids URA or TRP was used for the selection of recombinant yeasts.
  • the recombinant yeasts were first cultured at 30 ° C until stationary phase in a selective medium comprising: 20g / L glucose, 6.7 g / L of "yeast nitrogen base without amino acids” medium, 1.85 g / L of the selective medium "Yeast synthetic drop-out medium without Uracil and tryptophan".
  • the medium "Yeast synthetic drop-out medium without Uracil and tryptophan" is composed of:
  • each of the following amino acids Alanine, Arginine, Asparagine, Aspartic acid, Cysteine, Glutamic acid, Glutamine, Glycine, Histidine, Myo-Inositol, Isoleucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Proline, Serine, Threonine, Tyrosine, valine
  • the recombinant yeasts were then centrifuged for 5 minutes at 4000 rpm, washed in PBS (Phosphate Buffer Saline), then resuspended in 20 g / L galactose, 6.7 g / L of the "yeast nitrogen base without amino acids" medium and 1 , 85 g / L of the selective medium "Yeast synthetic drop-out medium without Uracil and tryptophan".
  • the yeasts were placed in culture at 30 ° C. for 48 hours for the induction of the expression of recombinant proteins by galactose.
  • the recombinant yeasts were then centrifuged for 5 minutes at 4000 rpm, washed in PBS (Phosphate Buffer Saline) and then treated as follows:
  • the tumor antigens that have been used in the constructs are:
  • the non-mutated antigen AH-1 (SPSYVYHQF, SEQ ID NO: 20) is the immunodominant antigen H-2Ld derived from gp70 423- 431, which causes a CD8 + response against murine CT26 (Enhanced Antigen-Specific Antitumor Immunity with Altered Peptide Ligands that Stabilize the MHC-Peptide-TCR Complex, Slansky et al, Immunity, Vol 13, 529-538, October, 2000). Gp70 is silent in most normal tissues in mice.
  • AH-1 antigen does not allow immunization against the CT26 tumor because of a low affinity of this epitope for the TCR.
  • a cryptic peptide of AH-1 (modification of GP70 423-431) is thus used which makes it possible to increase its affinity for the TCR and to immunize the mouse by the CMHI pathway.
  • the tumor antigen that was used in this example is the cryptic peptide of sequence SPSYAYHQF (SEQ ID NO: 15) (AH1A5).
  • TRP2 (180-188): Tyrosinase related protein 2 (TRP2) is a protein involved in the pigmentation of melanocytes that plays a role in the progression of melanoma.
  • the tumor antigen that was used in this example is the SVYDFFVWL (SEQ ID NO: 17) (TRP2) cryptic sequence peptide.
  • TRP1 (455-463): Tyrosinase related protein 1 (TRP1), also known as gp75 glycoprotein (Tyrpl / gp75), is a protein involved in the pigmentation of melanocytes that plays a role in the progression of melanoma.
  • the tumor antigen that was used in this example is the cryptic peptide of sequence TAPDNLGYM (SEQ ID NO: 16) (TRP1).
  • a G4S linker was placed between the anchor polypeptide and the tumor antigen. This linker is an amino acid chain composed of 4 consecutive glycines and a serine.
  • a G4S linker was also placed between each of the yeast antigens expressing the OVA1-TRP1-TRP2 antigens.
  • a protein tag, c-myc, has also been added between the anchor polypeptide and the tumor antigen to allow the detection of complexes on the yeast surface.
  • An anti-DEC205 ScFv targeting polypeptide was also added, as well as an additional secretion signal peptide in the N-terminal anti-DEC205 SCFv targeting polypeptide using the addressing polypeptide encoded by the prepro alpha factor leader nucleic acid sequence. peptide "from the yeast pheromone Mf (alpha) 1p (SEQ ID No. 12).
  • a yeast which expresses at its wall the fusion protein [scFv DEC205] - [G4S] - [TRP2] - [G4S] - [0VA1] - [G4S] - [TRP1] - [C-MYC] - [G4S] ] - [SED1P] ( Figure 15).
  • the four types of genetically modified yeasts obtained in Example 7, expressing the tumor antigens AH1A5, TRP1, TRP2 or OVA1-TRP1-TRP2 were cytometrically tested to confirm that they express the tumor antigens on their wall.
  • yeast induction in galactose the yeasts at a concentration of 1.10 7 cells per ml were suspended in a 2% PFA solution for 10 minutes.
  • the yeasts were then washed in PBS containing 1% BSA. After washing, they were cultured for 1h at room temperature with a primary anti-c-myc antibody at a ratio of 1: 100 (murine primary antibody IgG2a, MA1-16637, ThermoFisher).
  • yeasts After 3 washes with PBS containing 1% BSA, the yeasts were incubated for 1 hour at room temperature with a secondary anti-IgG2a antibody at a ratio of 1:50 (murine secondary antibody IgG2a, 31863, ThermoFisher) and were passed in cytometry. of spectral flux in the preferential channel PE.
  • the anti-c-myc antibody makes it possible to detect by spectral flow cytometry the yeasts which express at the wall each of the fusion proteins. Under the experimental conditions tested, the marker antibody of the fusion protein could not penetrate inside the yeasts, which made it possible to highlight the antigens directed towards the external medium of the yeast and not towards the periplasm. yeast.
  • 16C 9% of the yeasts express the [scFv DEC205] - [G4S] - [TRP2] - [C-MYC] - [G4S] - [SED1P] fusion protein at their wall;
  • 16D 13% of the yeasts express the [scFv DEC205] - [G4S] - [TRP1] - [C-MYC] - [G4S] - [SED1P] fusion protein at their wall.
  • the figures show the expression of the tumor antigens AH1A5, TRP1, TRP2 and OVA1-TRP1-TRP2 at the yeast wall obtained in Example 7.
  • the characterization test of a permeabilized yeast uses an enzyme naturally present in the cytosol of yeast, alkaline phosphatase. Its substrate, p-nitrophenylphosphate (pNPP), takes on a yellow color readable by the absorbance at 405 nm after hydrolysis, in proportion to the enzymatic activity (Galabova et al. , June 2008, Letters in Applied Microbiology 16 (3): 161-163).
  • pNPP substrate enters the yeast and is hydrolysed by the alkaline phosphatase, which generates an absorbance signal at 405 nm.
  • Yeast that has not been permeabilized is not permeable to pNPP. The wild S.
  • Ethanol + PFA permeabilization in a 50% v / v ethanol solution for 25 minutes, washing with PBS then fixing in a 2% PFA solution for 10 minutes;
  • Isopropanol permeabilization in a solution of isopropanol 50% v / v for 25 minutes;
  • Ethanol permeabilized in a 50% v / v ethanol solution for 25 minutes; or
  • cytotoxic CD8 + T lymphocytes The measurement of the activation of cytotoxic CD8 + T lymphocytes was carried out using a colorimetric test using beta-galactosidase and one of its substrates, CPRG (Chlorophenol red-beta-galactopyranoside) as described in Example 4.
  • CPRG Chlorophenol red-beta-galactopyranoside
  • Material non-permeabilized dendritic cells, CD8 + T lymphocytes and genetically modified yeast that express an antigen on its wall.
  • the dendritic cells used were murine dendritic cells derived from the MutuDC line (obtained from the University of Lausanne). This line is derived from immortalized splenic CD8a dendritic cells that retain the ability to cross-present antigen and activate killer lymphocytes (LT).
  • the cells of the MutuDC line were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS, HEPES, 50 ⁇ l-mercaptoethanol, 50 U / ml penicillin, and 50 ⁇ g / ml streptomycin, at 37 ° C. with 5% C02. .
  • the CD8 + T cells used were derived from the B3Z hybridoma.
  • Hybridoma B3Z a specific line for the peptide OVA 257-264 (SIINFEKL, SEQ ID NO: 21), was offered by Institut Curie (Paris V). These cells have the particularity of producing beta-galactosidase under the control of an IL2 promoter (Inter-leukine 2).
  • the B3Z cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS, Glutamax, HEPES, 50 ⁇ l 2-mercaptoethanol, 50 U / ml penicillin, and 50 ⁇ g / ml streptomycin, at 37 ° C. with 5% C02. .
  • the dendritic cells were distributed at a rate of 100,000 cells per well in 96-well round bottom plates.
  • the non-permeabilized genetically modified yeast expressed the OVA1 antigen at its wall fused to scFv DEC205 (scFv DEC205-OVA1-SED) and was prepared according to example 2 (FIG. 4). This yeast has undergone the following treatments:
  • Ethanol + PFA permeabilization in a 50% v / v ethanol solution for 25 minutes, washing with PBS and then fixing in a 2% PFA solution for 10 minutes;
  • - PFA + isopropanol fixation in a 2% PFA solution for 10 minutes, washing with PBS and permeabilization in a solution of isopropanol 50% v / v for 25 minutes;
  • Ethanol permeabilized in a 50% v / v ethanol solution for 25 minutes; or
  • lymphocytes of the B3Z line were added at a rate of 100,000 per well for 18 hours at 37 ° C. and 5% of C0 2 .
  • the plates were then washed and the beta-galactosidase activity produced by CD8 + T cells was measured after addition of 120 ⁇ l of lysis buffer (which contains PBS, 9 mM MgCl2, 0.125% NP40 and 0.15 mM chlorophenol red-beta-galactopyranoside). After the color change to red, the red absorbance at 575 nm was read using a ClarioStar plate reader. The results are presented in Figure 19. Conclusion: This cross-presentation test showed that permeabilized yeasts (inactivated or not) were able to activate killer lymphocytes significantly.
  • the activation obtained with permeabilized yeasts was much greater than the activation obtained with non-permeabilized yeasts (PFA or UV). It should be noted that yeasts treated with UV were not able to activate the killer lymphocytes, as for yeasts that have not undergone any treatment (Vivantes).

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Abstract

La présente invention est relative à un procédé de préparation d'une levure immunothérapeutique, ladite levure immunothérapeutique exprimant à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) de tumeur, ainsi qu'à des levures immunothérapeutiques susceptibles d'être obtenues par la mise en œuvre du procédé de l'invention.

Description

Immunothérapie anti-tumorale basée sur des levures
La présente invention est relative à un procédé de préparation d'une levure immunothérapeutique, ladite levure immunothérapeutique exprimant à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) de tumeur, ainsi qu'à des levures immunothérapeutiques susceptibles d'être obtenues par la mise en œuvre du procédé de l'invention.
ART ANTERIEUR
Le traitement du cancer est un domaine regroupant différents axes thérapeutiques parmi lesquels se trouvent les immunothérapies. Parmi les immunothérapies, se distinguent les immunothérapies passives et les immunothérapies actives, ces dernières pouvant être ciblées ou non ciblées. L'un des avantages des immunothérapies actives réside dans le fait qu'elles peuvent passer la barrière hémato-encéphalique contrairement aux thérapies de type chimiothérapie.
II a en effet été démontré que les lymphocytes étaient capables de migrer à travers la barrière hémato-encéphalique (Larochelle C, Alvarez JI, Prat A. How do immune cells overcome the blood-brain barrîer in multiple sclerosis. FEBS Lett. 2011 Dec l;585(23):3770-80).
Outre cet avantage de passage de la barrière hémato-encéphalique, les immunothérapies présentent de manière générale moins d'effets indésirables que les thérapies anticancéreuses traditionnelles, ce qui est particulièrement vérifié pour les immunothérapies ciblées. C'est pourquoi, les immunothérapies sont particulièrement appropriées dans le traitement de cancers de haut grade au stade métastatique, grade III ou IV chez des patients déjà très affaiblis.
Des immunothérapies actives non ciblées, comme les anticorps anti-PD-1 et ou les anticorps anti-CTLA4, améliorent significativement la survie médiane des patients. Cependant, ces traitements bénéficient à un faible pourcentage de patients et s'accompagnent d'effets secondaires immunologiques non négligeables comme les maladies auto-immunes. Pour s'affranchir des risques de maladies auto-immunes et améliorer leur efficacité, des immunothérapies actives ciblées dirigées contre un antigène tumoral défini ont été développées. Les cellules dendritiques sont des acteurs majeurs de ces nouvelles immunothérapies car elles coordonnent à la fois une réponse immunitaire innée et une réponse adaptative contre les cellules cancéreuses. Un des objectifs des immunothérapies actives ciblées est donc de stimuler ces cellules dendritiques pour générer des lymphocytes T actifs contre la tumeur, des lymphocytes T tueurs ou lymphocytes T cytotoxiques. L'action de ces lymphocytes T est d'induire à la fois une régression de la taille de la tumeur, pouvant aller jusqu'à la disparition de la tumeur, et d'induire une mémoire immunologique, limitant les rechutes.
La levure Saccharomyces cerevisiae a été utilisée avec succès comme vecteur d'immunothérapies actives ciblées, car elle constitue un excellent adjuvant pour l'induction des cellules dendritiques, qui activent à leur tour les lymphocytes T cytotoxiques pour détruire les cellules cancéreuses. Pour permettre l'activation des cellules dendritiques, la levure doit produire l'antigène tumoral à cibler. Le brevet US 5 830 463 décrit l'utilisation d'une levure non pathogène, génétiquement modifiée pour exprimer au moins un composé capable de moduler la réponse immunitaire et démontre que cette levure génétiquement modifiée est efficace pour stimuler aussi bien la réponse cellulaire que la réponse humorale, lorsque la levure est administrée à un mammifère. Le brevet US 8 734 778 décrit des levures capables d'exprimer divers antigènes de tumeur dans leur cytosol, lesdites levures entières étant tuées par la chaleur avant injection. La demande de brevet US2008/0171059 décrit l'utilisation de levures exprimant un antigène tumoral à leur surface plutôt que dans le cytosol.
Néanmoins, il existe un besoin de nouvelles thérapies anticancéreuses efficaces et/ou qui présenteraient des effets secondaires indésirables moindres, notamment par rapport aux levures immunothérapeutiques existantes.
Les inventeurs ont observé de manière inattendue qu'une levure génétiquement modifiée pour exprimer à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) de tumeur et ayant été perméabilisée permet de stimuler efficacement les lymphocytes T cytotoxiques contre la tumeur.
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une levure immunothérapeutique, ledit procédé comprenant les étapes de :
a) obtenir une levure génétiquement modifiée qui exprime à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) de tumeur et éventuellement un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques ;
b) perméabiliser la levure génétiquement modifiée afin d'obtenir une levure immunothérapeutique, éventuellement inactiver la levure avant ou après l'étape de perméabilisation. Un autre objet de l'invention consiste en une levure immunothérapeutique susceptible d'être obtenue par la mise en uvre du procédé de préparation selon l'invention.
Un autre objet de l'invention concerne une levure immunothérapeutique génétiquement modifiée et perméabilisée qui exprime à sa paroi :
(i) un ou plusieurs antigène(s) de tumeur, de préférence choisi(s) parmi Melan-A, Tyrosinase, gplOO, MAGE-B1, MAGEA1, MAGEA10, MAGEA11, MAGEA12, MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, AGEA8, MAGEA9, MAGEB1; MAGEB10, MAGEB16, MAGEB18, AGEB2, MAGEB3, MAGEB4, MAGEB5, MAGEB6, MAGEB6B, New York Esophageal 1 antigène (NY-ESO-1), MAGEC1, MAGEC2, L-antigène (LAGE), TRP-1, TRP-2, P53, KRAS, CEA, WT1, MUC1, SART3, SURVIVIN 2B, RNF43/TO M34, TGFBRII, HER2/neu, BRAF, PI3K, APC, BAX, beta2-microglobuline, télomérase ou NRAS ; et
(ii) éventuellement un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques.
Un autre objet de l'invention consiste en une composition immunothérapeutique comprenant une levure immunothérapeutique selon l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Un autre objet de l'invention concerne une levure selon l'invention ou une composition selon l'invention pour son utilisation comme médicament, notamment pour son utilisation dans le traitement ou la prévention du cancer.
DESCRIPTION DETAILLEE
Définitions
On entend par « peptide » une séquence d'acides aminés qui comprend généralement de 2 à 9 acides aminés. On entend par « polypeptide » une séquence d'acides aminés qui comprend généralement de 10 à 100 acides aminés. On entend par « protéine » une séquence d'acides aminés qui comprend généralement plus de 100 acides aminés.
On entend par « levure » tout champignon unicellulaire, ou tout micro-organisme eucaryote composé d'une paroi cellulaire, d'une membrane cytosplasmique, d'un noyau et de mitochondries, capable d'une reproduction asexuée par bourgeonnement ou pas scission. Parmi les levures bien connues, se trouvent les ascomycètes (Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula), les basidiomycètes (Sporobolomyces) et les deutéromycètes. Le terme « levure(s) » s'entend aussi bien au singulier qu'au pluriel. On entend par « levure génétiquement modifiée », une levure dont le patrimoine génétique est artificiellement modifié par l'introduction d'une ou plusieurs séquences nucléiques (ou transgène(s)), de manière transitoire ou définitive, de façon à produire un ou plusieurs peptides, polypeptides et/ou protéines dans ladite levure. Les transgènes peuvent dériver de séquences nucléiques de la même espèce que la levure génétiquement modifiée (e.g. le polypeptide d'ancrage), d'une autre espère de levure que la levure génétiquement modifiée (e.g. le polypeptide d'ancrage) ou d'une autre espèce procaryote ou eucaryote (e.g. l'antigène de tumeur). Dans le cadre de l'invention, le transgène peut, par exemple, coder une ou plusieurs protéine(s) de fusion de formule (la) :
[protéine ou polypeptide de ciblage des cellules dendritiques]n-[antigène de tumeur]*- [linker peptidique]m-[polypeptide ou protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (la) ; n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50, de préférence allant de 1 à 9, de préférence allant de 1 à 5.
Ainsi, une « levure génétiquement modifiée qui exprime à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) de tumeur » est une levure dont le patrimoine génétique est artificiellement modifié par l'introduction d'une ou plusieurs séquence(s) nucléique(s) codant un ou plusieurs antigène(s) de tumeur à la paroi de ladite levure, par exemple codant une protéine de fusion de formule (la). Dans la présente description, les termes « levure génétiquement modifiée » et « levure modifiée » sont interchangeables.
On entend par « antigène(s) de tumeur », tout ou partie d'une protéine issue d'une protéine tumorale et susceptible de déclencher une réponse immunitaire humorale et/ou cellulaire contre une tumeur. Avantageusement, le ou les antigène(s) de tumeur sont/est choisi(s) parmi Melan-A, Tyrosinase, gplOO, MAGE-B1, AGEA1, AGEA10, MAGEA11, MAGEA12, MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, AGEA8, MAGEA9, MAGEB1; MAGEB10, MAGEB16, MAGEB18, MAGEB2, MAGEB3, MAGEB4, MAGEB5, MAGEB6, MAGEB6B, New York Esophageal 1 antigène (NY-ESO-1), MAGEC1, MAGEC2, L- antigène (LAGE), TRP-1, TRP-2, P53, KRAS, CEA, WT1, MUC1, SART3, SURVIVIN 2B, RNF43/TOMM34, TGFBRII, HER2/neu, BRAF, PI3K, APC, BAX, beta2-microglobuline, télomérase ou NRAS.
L'ovalbumine, qui n'est pas un antigène de tumeur au sens de l'invention, est utilisée comme antigène modèle dans de très nombreuses expérimentations, car les épitopes de la protéine ovalbumine se lient au CMH I et CMH II chez la souris. Les épitopes de l'ovalbumine sont parmi les mieux caractérisés pour leur immunogénicité très spécifique, c'est à dire leur capacité à déclencher une réponse immunitaire ciblée contre ces épitopes. Pour caractériser une réponse immunitaire in vivo spécifique, on dispose de souris transgéniques OT-1 dont les lymphocytes T sont OVA-spécifiques et reconnaissent spécifiquement les résidus OVA 257-264. La réponse immunitaire spécifique peut être également étudiée in vitro avec la lignée cellulaire hybridome B3Z de lymphocytes T spécifiques de l'épitope OVA 257-264.
On entend par « exprimé à la paroi » le fait d'être présenté à la paroi de la levure. Dans le cadre de l'invention un antigène exprimé à la paroi est un antigène ancré à la paroi de la levure, par exemple via une protéine ou un polypeptide d'ancrage.
On entend par « levure perméabilisée », une levure qui a subi un traitement chimique, enzymatique ou mécanique, visant à perméabiliser (ou perforer) sa paroi et/ou sa membrane cytoplasmique. Les moyens pour perméabiliser la paroi et/ou la membrane cytoplasmique d'une levure sont bien connus de l'homme du métier et peuvent être utilisés sans difficulté particulière pour obtenir les levures perméabilisées. La perméabilisation d'une levure entière permet l'accès aux protéines contenues dans son cytosol (Optimization of permeabilization process of yeast cells for catalase activity using response surface methodology, Trawczynska et al, 2015) et/ou dans son périplasme. Les traitements permettant de perméabiliser la membrane cytoplasmique modifient la membrane cytoplasmique de la levure en formant des pores qui permettent la diffusion libre de petites molécules comme les produits ou les substrats d'enzymes, mais maintiennent l'essentiel des protéines dans le cytosol (Parmjit S. Panesar , Reeba Panesar, Ram S. Singh and Manav B. Bera, 2007. Permeabilization of Yeast Cells with Organic Solvents for β-galactosidase Activity. Research Journal of Microbiology, 2: 34-41). La paroi de la levure est naturellement perméable aux protéines jusqu'à environ 70 kDa. Ainsi, le terme « perméabiliser » selon l'invention s'entend également comme une augmentation de la perméabilité de la paroi de la levure.
Par exemple, il est possible de déterminer si une levure est perméabilisée ou pas en mesurant l'absorbance à 405nm d'une levure incubée avec du p-nitrophenylphosphate (pNPP) pendant 30 min. Dans ces conditions, une levure est perméabilisée lorsqu'elle présente une absorbance à 405nm supérieure ou égale à 0,1, par exemple supérieure ou égale à 0,2. Le pNPP est le substrat d'une enzyme, la phosphatase alcaline, qui est naturellement présente dans le cytosol de la levure. Le pNPP ne pénètre pas dans le cytosol d'une levure non-perméabilisée. Par contre, lorsque la levure est perméabilisée, le pNPP peut rentrer dans la levure et être hydrolysé par la phosphatase alcaline présente dans le cytosol. Le pNPP hydrolysé prend alors une couleur jaune lisible par l'absorbance à 405 nm {A rapid method for détermination of acid phosphatase activity of whole yeast cells, Galabova et al, June 2008, Letters in Applied Microbiology 16(3):161 - 163). L'Exemple 9 présente le protocole détaillé d'un test permettant de déterminer si une levure est perméabilisée ou pas.
On entend par « levure immunothérapeutique », une levure capable d'induire une réponse immunitaire humorale ou cellulaire chez l'homme ou l'animal, permettant ainsi de traiter ou de prévenir le cancer.
Procédé de préparation des levures
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une levure immunothérapeutique, ledit procédé comprenant les étapes de :
a) obtenir une levure génétiquement modifiée qui exprime à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) de tumeur et éventuellement un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques ;
b) perméabiliser la levure génétiquement modifiée afin d'obtenir une levure immunothérapeutique, éventuellement inactiver la levure avant ou après l'étape de perméabilisation.
Lorsque le procédé comprend une étape d'inactivation, les étapes d'inactivation et de perméabilisation peuvent être faites dans n'importe quel ordre.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend les étapes de :
a) obtenir une levure génétiquement modifiée qui exprime à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) de tumeur et éventuellement un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques ;
b) inactiver la levure génétiquement modifiée ; et
c) perméabiliser la levure génétiquement modifiée inactivée afin d'obtenir une levure immunothérapeutique.
Selon un autre mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend les étapes de :
a) obtenir une levure génétiquement modifiée qui exprime à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) de tumeur et éventuellement un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques ;
b) perméabiliser la levure génétiquement modifiée ; et
c) inactiver la levure génétiquement modifiée perméabilisée afin d'obtenir une levure immunothérapeutique. Avantageusement, le ou les antigène(s) de tumeur, exprimés à la paroi de la levure sont orientés vers le milieu extérieur de la levure et non vers le périplasme de la levure. Une orientation vers l'extérieur de la levure permet, après phagocytose des levures, la dégradation plus rapide des antigènes de tumeur par les protéases des cellules dendritiques, ce qui facilite ainsi la cross-présentation des antigènes de tumeur aux lymphocytes tueurs (Howland, Wittrup, Antigen Release Kinetics in the Phagosome Are Critical to Cross-Presentation Efficiency, J Immunol. 2008 February 1 ; 180(3) :1576). L'étape d'inactivation vise à inactiver les levures. On entend par « inactiver une levure » un traitement qui consiste à stopper la croissance par division cellulaire de la levure. L'inactivation d'une levure peut être réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier pour inactiver des micro-organismes. Avantageusement, l'inactivation permet également de fixer la levure. Avantageusement, la levure est inactivée avec du paraformaldéhyde (PFA) à raison de 0,5% dans du PBS (v/v).
L'étape de perméabilisation est réalisée au moyen d'un traitement chimique, enzymatique ou mécanique, entraînant la perméabilisation de la paroi et/ou de la membrane cytoplasmique.
Dans un mode de réalisation particulier, la levure génétiquement modifiée est perméabîlisée avec un solvant, par exemple un solvant polaire. Le solvant peut être choisi parmi, l'éthanol, le sorbitol, le 2-mercaptoethanol, le benzène, le n-butanol, le n-propanol, le triton X-100, l'isopropanol, le méthanol, le toluène, l'acétone ou un mélange de lithium acétate et de soude. Dans un autre mode de réalisation particulier, la levure génétiquement modifiée est perméabîlisée avec une enzyme, par exemple la β-1,3- glucanase ( Glu). Dans un autre mode de réalisation particulier, la levure génétiquement modifiée est perméabîlisée mécaniquement en soumettant la levure à des cycles de congélations/décongélations (Hong-wei Zhao et al., 2011, Biotechnology & Biotechnological Equipment). Dans un mode de réalisation préféré, la levure génétiquement modifiée est perméabîlisée avec de l'éthanol ou de l'isopropanol, par exemple avec un mélange de 50% d'éthanol et 50 % d'eau (volume à volume ; v/v), par exemple pendant environ 15 minutes, environ 20 minutes ou environ 25 minutes.
Dans un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, l'étape a) est : obtenir une levure génétiquement modifiée qui exprime à sa paroi une ou plusieurs protéines de fusion de formule (la) : [protéine ou polypeptide de ciblage des cellules dendritiques]n-[antigène de tumeur]x-[linker peptidique]m-[polypeptide ou protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (la) ; n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50, de préférence allant de 1 à 9, de préférence allant de 1 à 5, par exemple de 1 à 4, de 1 à 3, de 1 à 2, par exemple égal à 1, égal à 2, égal à 3, égal à 4, égal à 5.
Dans le cadre de la présente description, lorsque x est un entier supérieur à 1, c'est-à-dire lorsque x est un entier allant de 2 à 300, les antigènes de tumeur peuvent être identiques ou différents. Par exemple, les antigènes de tumeur peuvent être tous différents.
Dans le cadre de la présente description, lorsque x est un entier supérieur à 1, c'est-à-dire lorsque x est un entier allant de 2 à 300, les antigènes de tumeur peuvent être séparés ou pas par un peptide de liaison.
Dans le cadre de la présente description, lorsque x est un entier supérieur à 1, c'est-à-dire lorsque x est un entier allant de 2 à 300, les antigènes de tumeur peuvent être identiques ou différents. Par exemple, lorsque x=2, les antigènes de tumeur peuvent être deux antigènes MAGEA1 ou un antigène MAGEA1 et un antigène MAGEA2. Dans ce mode de réalisation, les antigènes de tumeur peuvent être mis l'un après l'autre ou séparés par une séquence peptidique qui relie lesdits antigènes de tumeur entre eux.
Les protéines de fusion sont largement décrites dans l'art antérieur. Une « protéine de fusion » est une protéine obtenue par la combinaison de différents peptides, polypeptides et/ou protéines. Les protéines de fusion peuvent également être appelées protéines chimères.
Dans un mode de réalisation particulier, l'étape a) comprend les étapes de :
al) introduire dans une levure un ou plusieurs vecteur(s) comprenant chacun une séquence nucléique de formule (Ha) ou (Ilb) :
[séquence nucléique codant un polypeptide d'adressage à la paroi de la levure génétiquement modifïée]-[séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques]n-[séquence nucléique codant un antigène de tumeur]*- [séquence nucléique codant un linker peptidique]m-[séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (Ha), n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50, de préférence allant de 1 à 9, de préférence allant de 1 à 5, par exemple de 1 à 4, de 1 à 3, de 1 à 2, par exemple égal à 1, égal à 2, égal à 3, égal à 4, égal à 5 ;
[séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques]n-[séquence nucléique codant un antigène de tumeur]x-[séquence nucléique codant un linker peptidique]m-[séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée]-[séquence nucléique codant un polypeptide d'adressage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (Ilb), n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50, de préférence allant de 1 à 9, de préférence allant de 1 à 5, par exemple de 1 à 4, de 1 à 3, de 1 à 2, par exemple égal à 1, égal à 2, égal à 3, égal à 4, égal à 5 ;
afin d'obtenir une levure génétiquement modifiée capable d'exprimer à sa paroi une ou plusieurs protéine(s) de fusion de formule (la) :
[protéine ou polypeptide de ciblage des cellules dendritiques]n-[antigène de tumeur]x- [linker peptidique]m-[polypeptide ou protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (la), n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50, de préférence allant de 1 à 9, de préférence allant de 1 à 5, par exemple de 1 à 4, de 1 à 3, de 1 à 2, par exemple égal à 1, égal à 2, égal à 3, égal à 4, égal à 5 ; et
a2) cultiver la levure génétiquement modifiée dans des conditions adaptées pour l'expression de la ou des protéine(s) de fusion à la paroi de la levure génétiquement modifiée.
Au sens de la présente invention, le terme « vecteur » doit être pris dans son sens le plus large. En particulier, un « vecteur » désigne un véhicule utilisé pour introduire une séquence nucléotidique dans une levure, pour son expression, pour sa réplication et/ou pour son intégration dans le génome de ladite levure. Les différents types de vecteurs sont largement connus de l'homme de l'art et tous types de vecteurs peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention. Le ou les vecteur(s) sont aussi appelé(s) plasmide(s). Le ou les plasmides peuvent être linéarisés pour permettre la recombinaison homologue dans la levure, comme expliqué dans les exemples.
Les différentes séquences nucléiques peuvent être assemblées dans un vecteur par la technique Golden Gâte. (Engel et al., 2008, PLos One et EP2395087). Cette technique permet de digérer et d'assembler simultanément et de manière directionnelle plusieurs séquences nucléiques en une seule réaction, grâce à l'utilisation d'enzymes de restriction de type Ils, des endonucléases qui reconnaissent des sites particuliers puis qui clivent des séquences nucléiques en dehors de leur site de reconnaissance. L'introduction dans le génome de la levure, des séquences nucléiques (i.e. du ou des vecteurs) est réalisée dans un mode réplicatif ou dans un mode intégratif. Dans un mode intégratif, les séquences nucléiques sont insérées dans le génome de la levure de manière stable. Dans un mode réplicatif, les séquences nucléiques sont insérées dans la levure de manière transitoire à l'aide d'un plasmide réplicatif.
Le « polypeptide d'adressage à la paroi de la levure génétiquement modifiée » ou « polypeptide d'adressage » permet d'adresser la protéine de fusion (la) à la paroi de la levure génétiquement modifiée. Cet adressage à la paroi permet ensuite à la protéine de fusion de s'ancrer à la paroi de la levure génétiquement modifiée. Avantageusement, la séquence nucléique codant le polypeptide d'adressage est située à l'extrémité -3' de la séquence nucléique (lia) ou (Ilb) codant la protéine de fusion (la). Ainsi, le polypeptide d'adressage est avantageusement en N-terminal de la protéine de fusion (la). Dans un mode de réalisation particulier, le polypeptide d'adressage est naturellement présent dans le polypeptide ou la protéine d'ancrage (par exemple dans la séquence d'Aga2p). Dans un autre mode de réalisation particulier, le polypeptide d'adressage est rajouté artificiellement à la séquence nucléique codant la protéine de fusion (la) lorsque le polypeptide ou la protéine d'ancrage ne comprend pas naturellement de polypeptide d'adressage (par exemple dans la séquence Sedlp). Dans un mode de réalisation particulier, lorsque le polypeptide ou la protéine d'ancrage ne comprend pas naturellement de polypeptide d'adressage, le polypeptide d'adressage est le « prepro alpha factor leader peptide » issue de la phéromone de levure (Mf(alpha)lp). La séquence nucléique codant Mf(alpha)lp est SEQ ID N°12.
L'étape al) peut être mise en œuvre dans tout milieu de culture assurant la viabilité et la reproductibilité de la levure. Les milieux de culture des levures sont bien connus de l'homme du métier. Citons pour exemple, un milieu glucose ou un milieu galactose.
Dans un mode de réalisation particulier, le ou les vecteurs comprennent une séquence nucléique codant un linker peptidique faisant le lien entre la protéine ou le polypeptide d'ancrage et le ou les antigène(s) de tumeur. Ainsi, dans ce mode de réalisation, la séquence nucléique (Ha) ou (Ilb) comprend une séquence nucléique codant le linker peptidique (i.e. m= l pour la séquence nucléique codant le linker peptidique).
On entend par « linker peptidique » ou « bras de liaison peptidique », une séquence d'acides aminés qui connecte un polypeptide ou protéine à un autre polypeptide ou protéine. Dans le cadre de l'invention, le linker peptidique connecte la protéine ou le polypeptide d'ancrage et le ou les antigène(s) de tumeur. Dans un mode de réalisation particulier, le linker peptidique est G4S, composé de 4 glycines et d'une sérine (GGGGS). Le linker G4S est couramment utilisé dans l'ingénierie des protéines du fait de sa flexibilité et de sa résistance aux protéases.
Le ou les vecteur(s) peu(ven)t aussi comprendre une séquence nucléique codant un tag protéique (ou tag), comme par exemple le tag c-myc. Ainsi, la protéine de fusion peut comprendre un tag à son extrémité. Le tag est utilisé pour permettre la détection du ou des antigène(s) exprimé(s) à la paroi des levures. Dans un mode de réalisation particulier, la levure est choisie parmi le genre Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Ogataea ou Candida. Avantageusement, la levure est choisie dans le genre Saccharomyces, de préférence Saccharomyces cerevisiae. Saccharomyces cerevisiae est particulièrement avantageux du fait des nombreux travaux montrant son innocuité pour l'homme ou l'animal. La levure INVSC1 (Life Technologies) en est un exemple. Saccharomyces cerevisiae est également bien connue pour sa tolérance lors de son administration chez l'homme ou l'animal. Saccharomyces cerevisiae est notamment utilisée dans le traitement de rhinites ou rhinopharyngites chroniques, en association avec du souffre et des vitamines, dont le but est de réduire l'inflammation des muqueuses du nez et de la gorge. Cette levure est par ailleurs utilisée comme système de production, par exemple de vaccins, comme le vaccin anti-hépatite B.
La protéine ou le polypeptide d'ancrage permet de maintenir la protéine de fusion (la) au niveau de la paroi de la levure génétiquement modifiée. Avantageusement, la protéine ou le polypeptide d'ancrage est une protéine ou un polypeptide exprimé naturellement au niveau de la paroi des levures. La protéine ou le polypeptide d'ancrage peut être choisi parmi une protéine ou un polypeptide naturellement exprimé par l'espèce de levure choisie ou une protéine ou polypeptide exogène, c'est-à-dire un polypeptide ou une protéine non exprimé(e) par l'espèce de levure choisie, par exemple un polypeptide ou une protéine naturellement exprimé(e) par une autre espèce de levure que l'espèce de levure choisie pour être génétiquement modifiée. Avantageusement, la protéine ou le polypeptide d'ancrage est un polypeptide ou une protéine de levure choisi(e) parmi Aga2p, Sedlp, Cwplp, Cwp2p, Flolp C, Tiplp ou Tirlp/Srplp. Dans un mode de réalisation préféré, la protéine ou le polypeptide d'ancrage est choisi(e) parmi Aga2p ou Sedlp. La séquence nucléique codant Aga2p est SEQ ID No : 10 et la séquence nucléique codant Sedlp est SEQ ID No : 11.
Lorsque le polypeptide Aga2p est utilisé dans la protéine de fusion (la), il est nécessaire que la levure génétiquement modifiée exprime également Agalp. En effet, Agalp s'intègre dans la paroi de la levure et Aga2p se lie à Agalp via un pont disulfure (voir Figure 1 et Figure 2). La levure choisie pour être génétiquement modifiée peut exprimer naturellement Agalp. Néanmoins, lorsque la protéine ou le polypeptide d'ancrage est Aga2p, le procédé selon l'invention comprend de préférence introduction dans la levure d'une séquence nucléique codant Agalp. Cette séquence nucléique codant Agalp peut être portée par un vecteur de l'étape al) ou par un autre vecteur qui est également introduit dans la levure. La séquence nucléique codant Agalp est SEQ ID No : 9. Dans un mode de réalisation particulier, le ou les vecteurs utilisés à l'étape a), comprend/comprennent en outre une séquence nucléique codant une protéine ou un polypeptide de ciblage des cellules dendritiques. Ainsi, dans ce mode de réalisation, la séquence nucléique (Ha) ou (Ilb) comprend séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques (i.e. n=l pour la séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques).
On entend par « protéine ou polypeptide de ciblage des cellules dendritiques », toute molécule de nature peptidique permettant le rapprochement entre la levure immunothérapeutique de l'invention et les cellules dendritiques de l'homme ou de l'animal. Ce rapprochement permet aux cellules dendritiques d'internaliser la levure immunothérapeutique et donc d'internaliser le ou les antigène(s) de tumeur, exprimés à la paroi de ladite levure. En d'autres termes, la protéine ou le polypeptide de ciblage permet de faciliter l'interaction entre la levure immunothérapeutique et les cellules dendritiques de l'homme ou l'animal. Cette interaction facilite l'endocytose du ou des antigène(s) de tumeur et, par conséquent, la présentation de ce ou ces antigène(s) de tumeur par les cellules dendritiques aux lymphocytes T.
Les protéines ou polypeptides de ciblage des cellules dendritiques comprennent toutes protéines ou polypeptides capables de lier spécifiquement un récepteur endocytique des cellules dendritiques, par exemple le récepteur DEC205 (CD205).
Dans un mode de réalisation particulier, le polypeptide ou la protéine de ciblage des cellules dendritiques est choisi(e) parmi :
- un anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre (i.e. capable de se lier spécifiquement à) le récepteur DEC205 (CD205) ; ou
- l'activateur du plasminogène (PLA) de la bactérie Yersinia pestis, ou une séquence dérivée de l'activateur du plasminogène (PLA) de la bactérie Yersinia pestis. PLA est connu pour se lier naturellement à CD205.
Un fragment d'anticorps peut être choisi parmi les fragments Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; les diabodies; les anticorps linéaires; les anticorps avec une seule chaîne (e.g. scFv), de préférence un fragment d'anticorps selon l'invention est un scFv, par exemple un scFv dirigé contre CD205 de séquence SEQ ID No : 13.
La protéine CD205 est une glycoprotéine membranaire intégrale de 205 kDa, homologue au récepteur du mannose des macrophages et aux récepteurs apparentés. CD205 un récepteur multilectine endocytique qui est utilisé par les cellules dendritiques et par les cellules épithéliales du thymus pour diriger les antigènes capturés dans les espaces extracellulaires vers un compartiment spécialisé de traitement des antigènes. L'activateur de plasminogène PLA de Yersinia pestis est une protéase qui joue un rôle important dans la progression de la bactérie. Il a été montré que Yersinia pestis était capable d'utiliser le récepteur DEC205 via l'activateur de plasminogène PLA pour se disséminer chez la souris (J Biol Chem. 2008 Nov 14;283(46):31511-21).
Dans un mode de réalisation particulier, l'activateur du plasminogène (PLA) peut être la séquence entière correspondante ou une séquence partielle ou une séquence entière mutée ou encore une séquence partielle mutée. Les séquences partielles et/ou mutées de PLA sont aussi appelées des séquences dérivées de PLA.
Dans un mode de réalisation particulier, le ou les antigène(s) de tumeur, exprimés à la paroi des levures immunothérapeutiques sont choisis parmi des antigènes de tumeurs solides ou liquides, de préférence parmi des antigènes de tumeurs solides. Avantageusement, le ou les antigène(s)de tumeur sont/est choisi(s) parmi Melan-A, Tyrosinase, gplOO, MAGE-Bl, MAGEAl, MAGEA10, MAGEAll, MAGEA12, MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA8, MAGEA9, MAGEB1; MAGEB10, MAGEB16, MAGEB18, MAGEB2, MAGEB3, MAGEB4, MAGEB5, MAGEB6, MAGEB6B, New York Esophageal 1 antigène (NY-ESO-1), MAGEC1, MAGEC2, L-antigène (LAGE), TRP-1, TRP-2, P53, KRAS, CEA, WT1, MUC1, SART3, SURVIVIN 2B, RNF43/TOMM34, TGFBRII, HER2/neu, BRAF, PI3K, APC, BAX, beta2-microglobuline, télomérase ou NRAS.
Levure immunothérapeutique
Un autre objet de l'invention est une levure immunothérapeutique, susceptible d'être obtenue par la mise en œuvre du procédé selon l'invention.
Un autre objet de llnvention est une levure immunothérapeutique génétiquement modifiée et perméabilisée qui exprime à sa paroi :
(i) un ou plusieurs antigène(s) de tumeur, de préférence choisi(s) parmi Melan-A, Tyrosinase, gplOO, MAGE-Bl, MAGEAl, MAGEA10, MAGEAll, MAGEAl 2,
MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA3, M AGE A4, MAGEA6, MAGEA8, AGEA9, MAGEB1; MAGEB10, MAGEB16, MAGEB18, MAGEB2, MAGEB3, MAGEB4, MAGEB5, MAGEB6, MAGEB6B, New York Esophageal 1 antigène (NY-ESO-1), MAGEC1, MAGEC2, L-antigène (LAGE), TRP-1, TRP-2, P53, KRAS, CEA, WT1, MUC1, SART3, SURVIVIN 2B, RNF43 TOMM34, TGFBRII, HER2/neu, BRAF,
PI3K, APC, BAX, beta2-microglobuline, télomérase ou NRAS ; et
(ii) éventuellement un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques.
De préférence, la levure immunothérapeutique selon llnvention est génétiquement modifiée, perméabilisée et inactivée. Dans un mode de réalisation particulier, la levure de l'invention exprime à sa paroi une protéine de fusion de formule (la) :
[protéine ou polypeptide de ciblage des cellules dendritiques]n-[antigène de tumeur]x- [linker peptidique]m-[polypeptide ou protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (la) ;
n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50, de préférence allant de 1 à 9, de préférence allant de 1 à 5, par exemple de 1 à 4, de 1 à 3, de 1 à 2, par exemple égal à 1, égal à 2, égal à 3, égal à 4, égal à 5.
Dans un mode de réalisation particulier, l'agent de ciblage des cellules dendritiques est choisi parmi un anticorps capable de se lier spécifiquement à la protéine DEC205, un fragment d'anticorps capable de se lier spécifiquement à la protéine DEC205, l'activateur du plasminogène (PLA) de la bactérie Yersinla pestis, ou une séquence dérivée de l'activateur du plasminogène (PLA) de la bactérie Yersinia pestis. L'agent de ciblage des cellules dendritiques est décrit précédemment.
Comme décrit précédemment :
- lorsque x est un entier supérieur à 1, c'est-à-dire lorsque x est un entier allant de 2 à 300, les antigènes de tumeur peuvent être identiques ou différents. Par exemple, les antigènes de tumeur peuvent être tous différents.
- lorsque x est un entier supérieur à 1, c'est-à-dire lorsque x est un entier allant de 2 à 300, les antigènes de tumeur peuvent être séparés ou pas par un peptide de liaison ; et/ou
- lorsque x est un entier supérieur à 1, c'est-à-dire lorsque x est un entier allant de 2 à 300, les antigènes de tumeur peuvent être identiques ou différents. Par exemple, lorsque x=2, les antigènes de tumeur peuvent être deux antigènes AGEA1 ou un antigène MAGEA1 et un antigène MAGEA2. Dans ce mode de réalisation, les antigènes de tumeur peuvent être mis l'un après l'autre ou séparés par une séquence peptidique qui relie lesdits antigènes de tumeur entre eux.
Composition immunothérapeutique
Un autre objet de l'invention est une composition immunothérapeutique comprenant une levure telle que décrite précédemment, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. On entend par « composition immunothérapeutique », une composition destinée à la prévention ou au traitement d'une pathologie, après administration chez l'homme ou chez l'animal, ladite composition comprenant un ou plusieurs composants capables de stimuler une réponse immunitaire humorale et/ou une réponse immunitaire à médiation cellulaire. Sont compris parmi les composants capables de stimuler une réponse immunitaire humorale et/ou une réponse immunitaire à médiation cellulaire, les antigènes de tumeurs, les microorganismes tels les virus, les bactéries ou les levures, mais également les lysats cellulaires, les cellules dendritiques, les lymphocytes cytotoxiques modifiés génétiquement, les cytokines, les inhibiteurs de points de contrôle du système immunitaire.
Plus particulièrement, la composition immunothérapeutique selon l'invention est destinée à la prévention ou au traitement d'un cancer. En particulier, la composition immunothérapeutique est capable de stimuler une réponse immunitaire à médiation cellulaire. La réponse immunitaire à médiation cellulaire est caractérisée par l'intervention de cellules du système immunitaire développant une cytotoxicité directe, c'est-à-dire des cellules capables de détruire des cellules cibles exprimant un antigène du non soi. Les cellules du système immunitaire capables de cytotoxicité sont représentées par les cellules NK (Natural Killer) et les lymphocytes T cytotoxiques. Les lymphocytes T cytotoxiques sont un sous-groupe de lymphocytes T, capables d'induire la mort par apoptose des cellules infectées par un agent infectieux ou d'induire la mort des cellules cancéreuses. Pour entraîner une réponse immunitaire, l'antigène doit être présenté aux lymphocytes TCD8+ (réponse cytolytique) ou lymphocytes TCD4+ (réponse auxiliaire) par une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), respectivement de classe I ou II, portée par une cellule présentatrice de l'antigène. Parmi les cellules présentatrices de l'antigène, les cellules dendritiques sont les plus performantes : elles ont la capacité non seulement d'activer des lymphocytes T naïfs, mais aussi d'induire une réponse humorale et cellulaire cytolytique par la présentation d'antigènes dans le contexte des molécules de classe I ou II du CMH. Les étapes du catabolisme de l'antigène sont strictement corrélées aux stades de la maturation des cellules dendritiques. Seules les cellules dendritiques immatures, concentrées dans les tissus périphériques, peuvent phagocyter et provoquer l'endocytose des antigènes solubles et particulaires, mais elles ne peuvent pas, à ce stade, les présenter aux lymphocytes T car les molécules du CMH sont retenues dans leurs lysosomes. En revanche, le processus de maturation de ces cellules dendritiques, contrôlé par des signaux inflammatoires et par le couple de molécules CD40-L/CD40, s'accompagne de changements morphologiques, de la relocalisation des molécules de classe I et II du CMH à la membrane, de l'expression de molécules de co-stimulation lymphocytaire, et surtout de la migration des cellules dendritiques des tissus périphériques vers les ganglions et la rate. Dans ces organes, les cellules dendritiques matures sont aptes à présenter aux lymphocytes T, l'antigène protéolysé en peptides et complexé aux molécules du C H-I.
La levure immunothérapeutique contenue dans la composition immunothérapeutique est capable d'interagir avec les cellules dendritiques et de stimuler une réponse immunitaire à médiation cellulaire par l'activation des lymphocytes T. De la réponse immunitaire découle alors une réponse physiologique qui se traduit par une régression de la taille de la tumeur visée. In vivo, chez l'animal, la taille d'une tumeur est mesurée en millimètre cube (mm3) et la régression de la taille d'une tumeur traitée par un moyen thérapeutique est le plus souvent évaluée en pourcentage par rapport à la taille d'une tumeur non traitée. Chez un patient humain, la régression de la taille d'une tumeur est mesurée en pourcentage par rapport à la tumeur initialement détectée et avant traitement.
On entend par « véhicule pharmaceutiquement acceptable » aussi appelé « excipient », tout composant, autre que le ou les principes actifs, qui est présent dans un médicament ou utilisé pour sa fabrication. La fonction d'un excipient est de transporter le/les principe(s) actif(s) contribuant ainsi à certaines propriétés du produit telle que la stabilité, le profil biopharmaceutique, l'aspect, l'acceptabilité pour le patient et/ou la facilité de fabrication. La formulation d'une composition immunothérapeutique comprend en général plusieurs excipients. On trouve des excipients hydrophiles comme l'eau (purifiée ou PPI), les alcools (l'éthanol, les glycols, le glycérol ou les polyéthylènes glycols), les agents gélifiants comme les gommes, les substances extraites d'algues, les protéines, la cellulose et ses dérivés et les gélifiants synthétiques. On trouve aussi des excipients lipophiles comme les glycérides d'origine naturelle ou hémi-synthétiques et les excipients lipophiles non glycériques tels que les acides gras, les alcools gras, les hydrocarbures et les silicones. On trouve aussi des excipients émuisifiants parmi lesquels les tensioactifs ioniques, anioniques, cationiques ou amphotères et les tensioactifs non ioniques. D'autres composants encore peuvent servir d'excipients, comme les sucres (saccharose, glucose, fructose, lactose, sorbitol, amidon) ou les produits minéraux comme les silices colloïdales, le talc, le kaolin ou encore l'oxyde de titane.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition immunothérapeutique de l'invention comprend également un agent thérapeutique. Avantageusement, l'agent thérapeutique est choisi parmi un polypeptide anticancéreux ou un agent chimiothérapeutique. Il peut également s'agir de polysaccha rides, de dérivés lipidiques, de vitamines, d'acides nucléiques ou d'aptamères. Le polypeptide anticancéreux peut être choisi parmi les cytokines, les chimiokines, les hormones, les anticorps, les fragments d'anticorps, les agonistes, les antagonistes ou les facteurs de croissance. Cette liste est non exhaustive.
Les agents chimiothérapeutiques sont bien connus de l'homme du métier. Ils sont regroupés en plusieurs familles, que sont les agents alkylants, les agents du fuseau, les poisons du fuseau (vinca-alcaloïdes et apparentés) les stabilisants du fuseau (taxanes), les anti-métabolites, les inhibiteurs de protéasome ou encore les inhibiteurs des topo- isomérases. Avantageusement, l'agent chimiothérapeutique est choisi parmi le cyclophosphamide, le docétaxel (famille des taxanes), la doxorubicine (famille des anthracyclines), l'épirubicine (famille des anthracyclines), le fluoro-uracile (aussi appelé 5- FU), le méthotrexate, le paclitaxel (famille des taxanes), les anthracyclines, la capécitabine, l'éribuline, la gemcitabine ou la vinorelbine. Cette liste est non exhaustive. L'invention a également pour objet une levure immunothérapeutique selon l'invention ou une composition immunothérapeutique selon l'invention pour son utilisation comme médicament, plus particulièrement pour son utilisation dans le traitement ou la prévention du cancer.
Par « cancer », on entend un grand groupe de pathologies pouvant toucher n'importe quelle partie de l'organisme, dont l'une des caractéristiques communes est la prolifération rapide et non contrôlée de cellules anormales pouvant essaimer dans d'autres organes, formant ce que l'on appelle des métastases. Le terme « cancer » englobe les cancers solides et les cancers liquides aussi appelés cancers hématopoïétiques qui regroupent les leucémies et les lymphomes. Dans un mode de réalisation particulier, le cancer est un cancer solide. Les cancers solides peuvent se développer dans n'importe quel tissu. On distingue les carcinomes et les sarcomes. Dans un mode de réalisation préféré, le cancer est choisi parmi les mélanomes, les carcinomes épidermoïdes, les cancers du sein, les carcinomes de la tête et du cou, les carcinomes de la thyroïde, les sarcomes des tissus mous, les sarcomes des os, les cancers testiculaires, les cancers de la prostate, les cancers des ovaires, les cancers de la vessie, les cancers de la peau, les cancers du cerveau, les angiosarcomes, les hemangiosarcomes, les tumeurs des cellules mastoïdiennes, les cancers hépatiques, les cancers des poumons, les cancers pancréatiques, les cancers gastro-intestinaux, les carcinomes des cellules rénales et tous les cancers métastatiques qui dérivent de cette liste. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le cancer solide est un mélanome, qu'il soit un mélanome superficiel extensif, un mélanome nodulaire, un mélanome de Dubreuilh ou un mélanome acro- lentigineux et les formes métastasées pouvant être associées. Dans un autre mode préféré de réalisation de l'invention, le cancer solide est un cancer du côlon. Avantageusement, lorsque le cancer solide est un mélanome, la levure immunothérapeutique exprime à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) choisi(s) parmi elan-A, Tyrosinase, gplOO, MAGE-B1, MAGEA1, MAGEA10, MAGEA11, AGEA12, MAGEA2, MAGEA2B, AGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA8, MAGEA9, MAGEB1, MAGEB10, MAGEB16, MAGEB18, MAGEB2, MAGEB3, MAGEB4, AGEB5, MAGEB6, MAGEB6B, New York Esophageal 1 antigène (NY-ESO-1), MAGEC1, AGEC2, L antigène (LAGE), TRP-1 ou TRP-2. Lorsque le cancer solide est un cancer du côlon, la levure immunothérapeutique exprime avantageusement à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) choisi(s) parmi P53, KRAS, CEA, WT1, MUC1, SART3, SURVIVIN 2B, RNF43/TOM 34, TGFBRII, HER2/neu, BRAF, PI3K, APC, BAX, beta2-microglobuline, télomérase ou NRAS.
La levure immunothérapeutique ou la composition immunothérapeutique selon l'invention peut être administrée par voie d'injections, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse ou encore sous-cutanée, par voie orale ou par voie respiratoire/pulmonaire. En fonction du mode d'administration, la forme galénique sera adaptée. L'homme du métier sait comment adapter les formes galéniques qui se prêtent à la voie d'administration choisie. Par exemple, pour l'administration par voie orale, la forme galénique peut être choisie parmi des comprimés, y compris les comprimés orodispersibles, des capsules, des gélules, des solutions buvables. Pour l'administration par voie pulmonaire, la forme galénique peut être sous forme de spray ou de produits pour inhalation. Avantageusement, la levure immunothérapeutique ou la composition immunothérapeutique est administrée par injection sous-cutanée. Dans un mode de réalisation particulier, la levure ou la composition immunothérapeutique selon l'invention est administrée à l'homme ou à l'animal à raison d'une ou plusieurs doses par semaine, ou d'une ou plusieurs doses par mois, ladite dose allant de 0,1 à 200 YU (Yeast Unit), de préférence de 0,1 à 2 YU, ou de 0,1 à 5 YU, ou de 0,1 à 10 YU, ou de 1 à 10 YU, de 10 à 20 YU, de 20 à 30 YU, de 30 à 40 YU, de 40 à 50 YU, ou de 50 et 100 YU, de 100 et 150 YU, ou de 150 YU et 200 YU, avec un YU égal à 107 levures. DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 est un schéma qui illustre une levure exprimant à sa paroi le polypeptide MEQLESIINFEKLTEWTSA (SEQ ID NO : 14) représentant l'antigène OVAl issu de l'ovalbumine, ledit antigène étant exprimé à la paroi de la levure via le polypeptide d'ancrage Aga2p lié via un pont disulfure à Agalp. L'antigène OVAl est lié au polypeptide d'ancrage via un linker G4S, composé de 4 glycines et d'une sérine. C-myc est un tag (étiquette) permettant de détecter et confirmer l'expression de l'antigène OVA1 à la paroi de la levure génétiquement modifiée.
La Figure 2 est un schéma qui illustre une levure exprimant à sa paroi le polypeptide MEQLESIINFEKLTEWTSA (SEQ ID NO : 14) représentant l'antigène OVA1 issu de l'ovalbumine, ledit antigène étant exprimé à la paroi de la levure via une protéine d'ancrage, Sedlp. L'antigène OVA1 est lié au polypeptide d'ancrage via un linker G4S, composé de 4 glycines et d'une sérine. C-myc est un tag (étiquette) permettant de détecter et confirmer l'expression de l'antigène OVA1 à la paroi de la levure génétiquement modifiée.
La Figure 3 est un schéma qui illustre une levure exprimant à sa paroi le polypeptide MEQLESIINFEKLTEWTSA (SEQ ID NO : 14) représentant l'antigène OVA1 issu de l'ovalbumine, ledit antigène étant exprimé à la paroi de la levure via le polypeptide d'ancrage Aga2p lié via un pont disulfure à Agalp. L'antigène OVA1 est fixé au polypeptide d'ancrage par un linker G4S, composé de 4 glycines et d'une sérine. La levure exprime également à sa paroi le fragment ScFv d'un anticorps dirigé contre le récepteur DEC205 (ScFv anti-DEC205). C-myc est un tag (étiquette) permettant de détecter et confirmer l'expression de l'antigène OVA1 à la paroi de la levure.
La Figure 4 est un schéma qui illustre une levure exprimant à sa paroi le polypeptide MEQLESIINFEKLTEWTSA (SEQ ID NO : 14) représentant l'antigène OVA1 issu de l'ovalbumine, ledit antigène étant exprimé à la paroi de la levure via une protéine d'ancrage, Sedlp. L'antigène OVA1 est lié au polypeptide d'ancrage par un linker G4S, composé de 4 glycines et d'une sérine. La levure exprime également à sa paroi le fragment ScFv d'un anticorps dirigé contre le récepteur DEC205 (ScFv anti-DEC205). C- myc est un tag (étiquette) permettant de détecter et confirmer l'expression de l'antigène OVA1 à la paroi de la levure.
La Figure 5 est un schéma qui illustre l'assemblage d'un vecteur avec des séquences nucléiques, par la méthode Golden Gâte.
La Figure 6 est un schéma qui illustre un vecteur assemblé par la méthode Golden Gâte. La Figure 7 est un spectre de cytométrie de flux qui montre l'expression du peptide OVA1 à la paroi des levures à l'aide d'un anticorps dirigé contre le tag c-myc.
La Figure 8 est un diagramme qui montre l'activation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques après cross-présentation de l'antigène SIINFEKL (OVA 257-264) par les cellules dendritiques auxdits lymphocytes T CD8+ cytotoxiques, selon des doses croissantes d'antigène SIINFEKL (OVA 257-264) (de 0 nM à 10 nM). L'antigène SIINFEKL est libre c'est-à-dire non fixé à la paroi des levures et des levures sauvages sont utilisées comme adjuvant avec une MOI de 20 (Multiplicity of infection).
La Figure 9 est un diagramme qui montre l'activation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques après cross-présentation par les cellules dendritiques à l'aide de levures perméabilisés ou non. A) les levures sauvages non perméabilisées (pointillé) et perméabilisées (hachuré), B) les levures expriment l'antigène OVAl dans le cytosol non perméabilisées (pointillé) et perméabilisées (hachuré), C) les levures expriment OVAl à la paroi via la protéine d'ancrage Sedlp non perméabilisées (pointillé) et perméabilisées (hachuré), D) les levures expriment l'antigène OVAl et un fragment ScFv anti-DEC205 à la paroi, à l'aide de la protéine d'ancrage Sedlp, E) les levures expriment l'antigène OVAl et un fragment ScFv anti-DEC205 à la paroi, via le polypeptide d'ancrage Aga2p, avec un plasmide intégratif.
La Figure 10 est une courbe qui montre la croissance tumorale en millimètre cube (mm3) chez des souris après un challenge tumoral à J0 avec 5.105 cellules de mélanome B16- OVA (M05) injectées en sous-cutané. Les souris sauvages (WT pour Wild Type) sont représentées par des ronds. Les souris traitées avec des levures perméabilisées exprimant OVAl fusionné au scFv anti-DEC-205 à leur paroi via la protéine d'ancrage Sedlp, sont représentées par des triangles. Une dose de 1 Y.U. (1.107 levures) a été injectée trois fois, sept jours avant le challenge tumoral en intra-péritonéal, trois jours avant le challenge tumoral en sous-cutané, puis trois jours après le challenge tumoral en sous- cutané.
La Figure 11 est une courbe qui montre le taux de survie des souris après le même challenge tumoral décrit pour la Figure 10. Les souris sauvages (WT pour Wild Type) sont représentées par des ronds. Les souris traitées avec des levures perméabilisées exprimant OVAl fusionné au scFv anti-DEC-205 à leur paroi via la protéine d'ancrage Sedlp, sont représentées par des triangles.
La Figure 12 est un schéma qui illustre une levure exprimant à sa paroi le polypeptide SPSYAYHQF (SEQ ID NO : 15) représentant l'antigène AH1A5 issu de AH-1, ledit antigène étant exprimé à la paroi de la levure via une protéine d'ancrage, Sedlp. L'antigène AH1A5 est lié au polypeptide d'ancrage via un linker G4S, composé de 4 glycines et d'une sérine. C-myc est un tag (étiquette) permettant de détecter et confirmer l'expression de l'antigène AH1A5 à la paroi de la levure génétiquement modifiée. La levure exprime également à sa paroi le fragment ScFv d'un anticorps dirigé contre le récepteur DEC205 (ScFv anti-DEC205 ou ScFv DEC205). La Figure 13 est un schéma qui illustre une levure exprimant à sa paroi le polypeptide TAPDNLGYM (SEQ ID NO : 16) représentant l'antigène TRP1, ledit antigène étant exprimé à la paroi de la levure via une protéine d'ancrage, Sedlp. L'antigène TRP1 est lié au polypeptide d'ancrage via un linker G4S, composé de 4 glycines et d'une sérine. C-myc est un tag (étiquette) permettant de détecter et confirmer l'expression de l'antigène TRP1 à la paroi de la levure génétiquement modifiée. La levure exprime également à sa paroi le fragment ScFv d'un anticorps dirigé contre le récepteur DEC205 (ScFv anti-DEC205 ou ScFv DEC205).
La Figure 14 est un schéma qui illustre une levure exprimant à sa paroi le polypeptide SVYDFFVWL (SEQ ID NO : 17) représentant l'antigène TRP2, ledit antigène étant exprimé à la paroi de la levure via une protéine d'ancrage, Sedlp. L'antigène TRP2 est lié au polypeptide d'ancrage via un linker G4S, composé de 4 glycines et d'une sérine. C-myc est un tag (étiquette) permettant de détecter et confirmer l'expression de l'antigène TRP2 à la paroi de la levure génétiquement modifiée. La levure exprime également à sa paroi le fragment ScFv d'un anticorps dirigé contre le récepteur DEC205 (ScFv anti-DEC205 ou ScFv DEC205).
La Figure 15 est un schéma qui illustre une levure exprimant à sa paroi les polypeptides TAPDNLGYM (SEQ ID NO : 16), MEQLESIINFEKLTEWTSA (SEQ ID NO : 14) et SVYDFFVWL (SEQ ID NO : 17) représentant respectivement l'antigène TRP1, OVA1 et TRP2, lesdits antigènes étant exprimés à la paroi de la levure via une protéine d'ancrage, Sedlp. Les antigènes sont lié au polypeptide d'ancrage via un linker G4S, composé de 4 glycines et d'une sérine, et également séparés entre eux par un linker G4S. C-myc est un tag (étiquette) permettant de détecter et confirmer l'expression des antigènes à la paroi de la levure génétiquement modifiée. La levure exprime également à sa paroi le fragment ScFv d'un anticorps dirigé contre le récepteur DEC205 (ScFv anti-DEC205 ou ScFv DEC205).
La Figure 16 est un spectre de cytométrie de flux avec un anticorps anti-C-myc des levures exprimant à leur parois les antigènes AH1A5 (Figure 16A), TRP1 (Figure 16B), TRP2 (Figure 16C) ou OVA1-TRP1-TRP2 (Figure 16D).
La Figure 17 est un diagramme qui montre l'absorbance à 405nm de levures traitées de différentes manières et mises en contact avec du p-nitrophenylphosphate (pNPP). Le pNPP est le substrat d'une enzyme, la phosphatase alcaline, qui est naturellement présente dans le cytosol de la levure. Le pNPP ne pénètre pas dans le cytosol d'une levure non-perméabilisée. Par contre, lorsque la levure est perméabilisée, le pNPP peut rentrer dans la levure et être hydrolysé par la phosphatase alcaline présente dans le cytosol. Le pNPP hydrolysé prend alors une couleur jaune lisible par l'absorbance à 405 nm.
La Figure 18 est un diagramme qui montre l'absorbance à 405nm de levures traitées de différentes manières et mises en contact avec du p-nitrophenylphosphate (pNPP). Le pNPP est le substrat d'une enzyme, la phosphatase alcaline, qui est naturellement présente dans le cytosol de la levure. Le pNPP ne pénètre pas dans le cytosol d'une levure non-perméabilisée. Par contre, lorsque la levure est perméabilisée, le pNPP peut rentrer dans la levure et être hydrolysé par la phosphatase alcaline présente dans le cytosol. Le pNPP hydrolysé prend alors une couleur jaune lisible par l'absorbance à 405 nm.
La Figure 19 est un diagramme qui montre l'activation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques après cross-présentation de levures exprimant à leur paroi l'antigène MEQLESIINFEKLTEWTSA (SEQ ID NO : 14) en présence de cellules dendritiques. Les levures ont été traitées de différentes manières pour obtenir des cellules perméabilisées ou non-perméabilisées.
Les exemples indiqués ci-après présentent des modes de mise en œuvre de l'invention, ces exemples sont donnés à titre d'illustration et ne sauraient limiter la portée des revendications. EXEMPLES
Exemple 1 : Construction des plasmides introduits dans les levures (figures 5 et 6) ;
Deux types de plasmides ont été créés par la société Abolis Biotechnologies (iSSB, Génopole, Evry, France), un plasmide intégratif et un plasmide réplicatif.
Pour le plasmide réplicatif, un fragment de plasmide épisomal contenant l'origine de réplication de levure 2 microns, le marqueur de sélection URA3 (SEQ ID N°4) et la résistance à l'ampicilline ont été assemblés par la méthode Gibson (Gibson Assembly Master Mix, NEB, Inc.) puis le plasmide a été transformé avec les inserts par Golden Gâte selon le procédé décrit en figures 5 et 6.
Pour les plasmides intégratifs, deux plasmides contenant des sites de recombinaisons homologues avec le génome de la levure génétiquement modifiée, les marqueurs de sélection URA3 (SEQ ID N°4) et TRPl (SEQ ID N°8), ainsi que le gène de résistance à la kanamycine, ont été transformés par Golden Gâte selon le procédé illustré en figures 5 et 6.
Ces deux plasmides ont été assemblés par Golden Gâte à partir des fragments suivants : - le promoteur inductible du gène de levure GAL1, synthétisé à partir de la séquence présente sur le chromosome II de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID N°l).
- le terminateur du gène CYC1, un terminateur de gène très utilisé dans la communauté scientifique, extrait d'une "biobrick" de la "Parts Registry iGEM" (SEQ
ID N°2). Il permet d'indiquer à une polymérase la fin de la transcription du gène qui code pour la protéine recombinante exprimée dans la levure génétiquement modifiée.
- le terminateur synthétique T27, placé en amont du terminateur CYC1 pour augmenter la production des protéines recombinantes (SEQ ID N°3), a été synthétisé à partir de la séquence du terminateur désigné T27 dans l'article « Short Synthetic Terminators for Improved Heterologous Gene Expression in Yeast, Curran et al, ACS Synth Bio. 2015 Jul 17;4(7): 824-32 ». Il vient renforcer l'action du terminateur CYC1.
- le gène URA3 a été extrait du génome de la levure avec son promoteur et son terminateur (SEQ ID N°4)
- l'antibiotique de résistance à la Kanamycine (Kan) et l'origine de réplication bactérienne pMBl provient du plasmide pSBlK3 (SEQ ID N°5)
- Le gène rapporteur fluorescent dans le jaune YFP N°BBa_E0030, avec le promoteur pLAC N°BBa_R0010 et le terminateur N°BBa_B0015, proviennent tous du catalogue "parts registry iGEM".
- les sites d'insertion, nommés XI-2 UP (SEQ ID N°6) et XI-2 DOWN (SEQ ID N°7) dans l'article de Mikkelsen et al, 2012, ont été amplifiés depuis le génome de la levure.
Les séquences nucléotidiques nommées « sites d'insertion » permettent l'intégration chromosomique des séquences nucléotidiques recombinantes par recombinaison homologue dans la levure génétiquement modifiée (Microbial production of indolyiglucosinolate through engineering of a multi-gene pathway in a versatile yeast expression platform, Metab Eng. 2012 Mar; 14(2): 104-11), Mikkelsen MD, Buron LD, Salomonsen B, Olsen CE, Hansen BG, Mortensen UH, Halkier BA.)
Pour l'insertion par Golden Gâte des séquences nucléiques codant les protéines de fusion dans les plasmides, les séquences nucléiques ont été synthétisées pour contenir des sites de clivage Bsal et des amorces complémentaires aux extrémités. Un exemple de couples d'amorces utilisés dans la mise en œuvre de l'invention est : en 5' de l'insert, GGTCTCTAATG (SEQ ID NO : 18) et en 3' de l'insert, GAGTTGAGACC (SEQ ID NO : 19). Ces amorces sont uniquement compatibles avec les morceaux qui s'insèrent avant et après, de sorte que tous les fragments s'assemblent dans le bon ordre en les mélangeant dans une seule réaction par ligation (Figure 5 et Figure 6). L'insert est composé par exemple de
- la séquence nucléique codant un polypeptide d'ancrage et d'adressage Aga2p, de la séquence nucléique codant le peptide OVA1 (modèle d'antigène de tumeur) et de la séquence codante c-myc,
- la séquence nucléique codant un polypeptide d'ancrage Sedlp, la séquence nucléique codant le peptide AH1-A5 (antigène de cancer du côlon), la séquence codante c-myc, la séquence codant le polypeptide de ciblage ScFv DEC 205 et la séquence nucléique codant un polypeptide d'adressage issu de la protéine de phéromone de levure Mf(alpha)lp et nommé « Pre pro alpha factor leader peptide »,
- la séquence nucléique codant un polypeptide d'ancrage Sedlp, la séquence nucléique codant le peptide TRP1 (antigène de mélanome), la séquence codante c-myc, la séquence codant le polypeptide de ciblage ScFv DEC 205 et la séquence nucléique codant un polypeptide d'adressage issu de la protéine de phéromone de levure Mf(alpha)lp et nommé « Pre pro alpha factor leader peptide »,
- la séquence nucléique codant un polypeptide d'ancrage Sedlp, la séquence nucléique codant le peptide TRP2 (antigène de mélanome), la séquence codante c-myc, la séquence codant le polypeptide de ciblage ScFv DEC 205 et la séquence nucléique codant un polypeptide d'adressage issu de la protéine de phéromone de levure Mf(alpha)lp et nommé « Pre pro alpha factor leader peptide »,
- la séquence nucléique codant un polypeptide d'ancrage Sedlp, la séquence nucléique codant les peptides OVA1, TRP1 et TRP2, de la séquence codante c- myc, la séquence codant le polypeptide de ciblage ScFv DEC 205 et la séquence nucléique codant un polypeptide d'adressage issu de la protéine de phéromone de levure Mf(alpha)lp et nommé « Pre pro alpha factor leader peptide ».
la séquence nucléique codant un polypeptide d'adressage issu de la protéine de phéromone de levure f(alpha)lp et nommé « Pre pro alpha factor leader peptide », de la séquence nucléique codant le peptide OVA1 et c-myc, et de la séquence nucléique codant la protéine d'ancrage Sedlp.
La méthode d'assemblage par Golden Gâte a été la suivante :
On a mélangé 1 pL de T4 Ligase à ADN concentrée à 400,000 unités par mL avec 2 pL de T4 DNA Ligase 10X buffer, 1 μΙ_ d'enzyme de restriction Bsal haute fidélité concentrée à 20,000 unités par ml_, 50 ng de chaque séquence nucléotidique insérée (séquences de 1 à 8), ainsi que 50 ng du plasmide recevant l'insert nucléotidique. Le milieu réactionnel a été complété jusqu'à 25 μί avec de l'eau dé-ionisée. Le milieu réactionnel a ensuite été soumis à différents cycles de température pour permettre la réaction enzymatique de clivage par l'enzyme Bsal (cycles à 37°C) et la ligation des séquences nucléotidiques digérées ainsi que du plasmide digéré par l'enzyme T4 ligase (cycles à 16°C) selon ce protocole :
lère étape : 98°C pendant 2 minutes,
2ème étape (répétée 32 fois) :
37°C pendant 30 secondes
16°C pendant 30 secondes
3ème étape : 65°C pendant 10 minutes
4eme étape : 12°C pendant 10 minutes
Une transformation bactérienne a été effectuée avec la solution du Golden Gâte obtenue après ces cycles de température. 10 μί du volume réactionnel ont été prélevés et mis en présence de 20 \iL de bactéries compétentes E coli (E. coli DH5-Alpha High Efficiency, NEB, Inc.). Les bactéries ont été striées sur un milieu de culture contenant un antibiotique de sélection approprié, la Kanamycine ou l'Ampicilline. Après 24 heures de culture à 37°C, une colonie isolée a été mise en culture liquide à 37°C dans un milieu contenant le même antibiotique de sélection que précédemment. Après 24 heures, 2mL de culture bactérienne ont été prélevés pour effectuer une purification des plasmides. Tous les plasmides ont été vérifiés par une colonie PCR et séquencés par la méthode Sanger pour vérifier l'assemblage correct.
Les plasmides intégratifs ont ensuite été digérés par l'enzyme Avril pour les linéariser afin de permettre la recombinaison homologue. Par la suite, la levure S. cerevisiae INVSC1 (Life Technologies SAS) a été transformée par la méthode du Lithium-Acétate avec ces plasmides intégratifs linéarisés (Transformation of yeast by lithium acetate/single- stranded carrier DNA/polyethylene glycol method, Methods Enzymol. 2002 ;350 :87-96, Gietz et al). Brièvement, les levures ont été cultivées dans du YPAD (20 g/L glucose, 10 g/L Yeast Extract, 20 g/L bacto-peptone) jusqu'en Log phase, puis collectées par centrifugation à 3000 g pendant 5 minutes, lavées à l'eau stérile, et transformées avec la solution suivante : 240 μί de PEG 4000 (50% (w/v)), 36 pL de LiAc 1.0 M, 50 [il d'ADN simple brin de sperme de saumon (2.0 mg/mL), 34 pL de plasmide à transformer. Les levures suspendues dans cette solution de transformation ont été placées dans un bain à 42°C pendant 25 minutes. Après centrifugation à 13,000 g pendant 1 minute, les levures ont été resuspendues dans du milieu YPAD pendant lh, avant d'être striées sur une plaque contenant un milieu sélectif pour le plasmide inséré dans la levure. L'insertion chromosomique a ensuite été vérifiée par extraction de génome des levures génétiquement modifiées et PCR spécifique de ïïnsert (Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications, Biotechniques 50 -.325-328 (2011), Looke et al). Brièvement, 100 pL de levures en culture à une densité optique DO= 0.4 à 600 nm ont été centrifugées, puis resuspendues dans 100 pL 200 mM lithium acétate (LiAc) 1% SDS solution, mélangées au vortex, et incubées 5 minutes à 70°C. 300 pL d'éthanol 96% ont été ajoutées pour précipiter l'ADN la solution a été mélangée au vortex et centrifugée à 13,000 g pendant 3 minutes. Le surnageant a été retiré et le culot a été lavé avec 500 pL d'éthanol à 70%, puis re-suspendu dans 100 pL d'eau stérile. 1 pL de surnageant a été utilisé ensuite pour les PCR en utilisant des amorces spécifiques à chaque insert génomique.
Exemple 2 : Préparation des levures immunothérapeutiques (figures 1 à 4^
La levure Saccharomyces cerevisiae INVSC1 (Life Technologies SAS), une levure quadruple auxotrophe (URA, TRP, HIS, LEU), a été utilisée dans tous les exemples cités. La levure a été génétiquement modifiée pour exprimer un ou plusieurs antigène(s) de tumeur avec une protéine ou un polypeptide d'ancrage, un polypeptide d'adressage, et un peptide ou une protéine de ciblage après transformation avec les plasmides décrits à l'exemple 1 par la méthode Lithium Acétate. Pour la sélection des levures recombinantes, un milieu sélectif sans les acides aminés URA ou TRP a été utilisé. La levure a d'abord été cultivée à 30°C jusqu'en phase stationnaire dans un milieu sélectif comprenant : 20g/L glucose, 6,7 g/L yeast nitrogen base sans acides aminés, 0,7 g/L de chaque acide aminé parmi : Histidine, Leucine et Tryptophane. Les levures ont alors été centrifugées pendant 5 minutes à 4000 rpm, lavées dans du PBS (Phosphate Buffer Saline), puis resuspendues dans un milieu sélectif inductif comprenant : 20g/L galactose, 6,7 g/L yeast nitrogen base sans acides aminés, 0,7 g/L de chacun des acides aminés suivants parmi : Histidine, Leucine et Tryptophane. Les levures ont alors été placées en culture à 20°C pendant 20h pour l'induction de l'expression des protéines recombinantes par le galactose.
Pour la perméabilisation, les levures ont été fixées à 0,5% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 minutes, lavées dans du PBS, puis elles ont été traitées par un mélange 50% éthanol 50% eau v/v pendant 15 minutes et encore lavées au PBS. La Figure 1 montre l'exemple d'une levure génétiquement modifiée qui a été transformée par un premier vecteur contenant la séquence nucléique codant l'antigène OVAl fusionné au tag c-myc et la séquence nucléique codant le polypeptide d'ancrage et d'adressage Aga2p (SEQ ID N°10). Aga2p a été relié par un pont disulfure à la protéine Agalp (SEQ ID N°9) qui s'est ancrée dans la paroi de la levure et qui a été produite à partir d'un deuxième vecteur co-transformé avec le premier vecteur.
La Figure 2 montre l'exemple d'une levure génétiquement modifiée transformée par un vecteur unique contenant l'antigène OVAl fusionné au tag c-myc et la protéine d'ancrage Sedlp (SEQ ID N°11).
La Figure 3 montre l'exemple d'une levure génétiquement modifiée par un premier vecteur contenant la séquence nucléique codant l'antigène OVAl fusionné au polypeptide de ciblage ScFv DEC205, la séquence nucléique codant le tag c-myc et la séquence nucléique codant le polypeptide d'ancrage et d'adressage Aga2p. Aga2p a été relié par un pont disulfure à la protéine Agalp qui s'est ancrée dans la paroi de la levure et qui a été produite à partir d'un deuxième vecteur co-transformé dans la levure avec le premier vecteur.
La Figure 4 montre l'exemple d'une levure génétiquement modifiée qui a été transformée par un vecteur unique contenant la séquence nucléique codant le polypeptide d'adressage en N-terminal « prepro alpha factor leader peptide » issue de la phéromone de levure Mf(alpha)lp (SEQ ID N°12), la séquence nucléique codant le polypeptide de ciblage scFv DEC205 (SEQ ID N°13), la séquence nucléique codant l'antigène OVAl fusionné au tag c- myc et la séquence nucléique codant la protéine d'ancrage Sedlp.
Pour permettre un traitement adéquat de l'antigène par les cellules dendritiques lors des tests de cross-présentation, les séquences naturelles flanquantes de la protéine ovalbumine ont été ajoutées audit peptide par synthèse : M EQLESIIN FEKLTEWTSA (SEQ ID N°14). Le peptide SIINFEKL associé aux séquences flanquantes représente OVAl. Un linker G4S a été placé entre la protéine ou le polypeptide d'ancrage et OVAl. Ce linker est une chaîne d'acides aminés, composée de 4 glycines et d'une sérine (GGGGS). Un tag protéique, le c-myc, a été également ajouté pour permettre la détection des complexes à la surface des levures.
L'adressage de la protéine de fusion à la surface de la levure a nécessité un signal de sécrétion en N-terminal. Pour les protéines de fusion comprenant Aga2p, cette protéine contenait déjà le signal de sécrétion nécessaire. Pour les protéines de fusion utilisant Sedlp en C-terminal, un signal de sécrétion supplémentaire a été ajouté en N-terminal de la protéine de fusion, en utilisant le polypeptide d'adressage codé par la séquence nucléique « prepro alpha factor leader peptide » issue de la phéromone de levure Mf(alpha)lp (SEQ ID N°12). Le polypeptide de ciblage ScFv anti-DEC205 a pu être ajouté parmi les inserts (figures 3 et 4) (SEQ ID N°13) pour se fusionner avec l'antigène OVAl exprimé à la surface en utilisant la technique du Golden Gâte précédemment décrite.
Exemple 3 : Contrôle de l'expression d'un peptide à la surface des levures (Figure 7)
L'expression du peptide OVAl exprimé à la surface de la levure génétiquement modifiée a été vérifiée par cytométrie de flux spectrale, en utilisant des levures présentant le même antigène dans le cytosol comme contrôle négatif. Après l'induction dans le galactose décrite dans l'exemple 2, les levures à une concentration de 1.107 cellules par mL ont été suspendues dans une solution de PFA à 2%. Elles ont ensuite été lavées dans du PBS contenant 1% de BSA. Après lavage, elles ont été mises en culture pendant lh à température ambiante avec un anticorps primaire anti-c-myc au ratio de 1:100 (Myc.A7, Life technologies SAS). Après 3 lavages au PBS contenant 1% de BSA, elles ont été incubées pendant lh à température ambiante avec un anticorps secondaire anti-IgGl au ratio de 1:50 (Goat anti-Mouse IgGl, PE-Texas red, Life technologies SAS). Après lavage, elles ont été passées en cytométrie de flux spectrale dans le canal préférentiel PE-Texas red.
Les résultats sont présentés sur la Figure 7. Cette figure montre l'expression du peptide OVAl à la surface des levures construites selon l'exemple décrit à la Figure 2. Un anticorps anti-c-myc permet de détecter les levures qui expriment à leur surface l'antigène OVAl. Dans le cas où les levures expriment l'antigène dans le cytosol, il n'y a aucune détection en cytométrie en flux. Dans le cas de la construction de la Figure 2, 50% des levures expriment OVAl à leur surface.
Conclusion : La cytométrie de flux spectrale a démontré d'une part l'ancrage effectif de l'antigène OVAl à la paroi des levures. D'autre part, dans les conditions expérimentales testées, l'anticorps de marquage de la protéine de fusion ne pouvait pas pénétrer à l'intérieur des levures, ce qui a démontré la présentation de l'antigène OVAl à l'extérieur de la levure.
Exemple 4 : Mesure de l'activation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques par présentation de l'antigène OVAl libre par des cellules dendritiques en présence de levures sauvages
Cet exemple montre la capacité de l'antigène OVAl à activer les lymphocytes T CD8+ indépendamment de son expression par une levure. L'antigène a été cross-présenté aux lymphocytes T CD8+ par l'intermédiaire de cellules dendritiques. La mesure de l'activation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques a été réalisée à l'aide d'un test colorimétrique utilisant le beta-galactosidase et un de ses substrats, le CPRG (Chlorophenol red-beta- galactopyranoside).
Le test nécessite, une source de cellules dendritiques, une source de lymphocytes T CD8+ et des levures modifiées de manière à exprimer un antigène à la surface, lesdites levures étant non perméabilisées. Les cellules dendritiques utilisées sont des cellules dendritiques murines issues de la lignée MutuDC (obtenus de l'Université de Lausanne). Cette lignée provient de cellules dendritiques CD8a spléniques immortalisés qui conservent la capacité de cross-présenter un antigène et d'activer les lymphocytes tueurs (LT). Les cellules de la lignée MutuDC ont été cultivées dans un milieu RPMI 1640 supplémenté par 10% FCS, HEPES, 50 μΜ 2-mercaptoethanol, 50 U/ml pénicilline, et 50 pg/ml streptomycine, à 37°C avec 5% de C02.
Les lymphocytes T utilisés proviennent de l'hybridome B3Z. L'hybridome B3Z, une lignée spécifique pour le peptide OVA 257-264 (SIINFEKL), a été offerte par l'Institut Curie (Paris V). Ces cellules ont la particularité de produire de la beta galactosidase sous contrôle d'un promoteur IL2 (Inter-leukine 2). Les cellules B3Z ont été cultivées dans un milieu RPMI 1640 supplémenté par 10% FCS, du Glutamax, HEPES, 50 μΜ 2-mercaptoethanol, 50 U/ml pénicilline, et 50 pg/ml streptomycine, à 37°C avec 5% de C02.
Le peptide OVA 257-264 (SIINFEKL) a été mélangé aux cellules dendritiques pendant 5h en présence des levures sauvages. Les cellules dendritiques ont été réparties à raison de 50 000 cellules par puit dans des plaques 96 puits à fond rond. Ensuite, les lymphocytes de la lignée B3Z ont été ajoutés à raison de 100 000 par puit pendant 18h à 37°C et 5% de C02. Les plaques ont été ensuite lavées et l'activité de la bêta-galactosidase produite par les lymphocytes T a été mesurée après addition de 120 pL de tampon de lyse qui contient du PBS, 9 mM MgCI2, 0.125% NP40 et 0.15 mM chlorophenol red-beta- galactopyranoside). Après le changement de couleur vers le rouge, la fluorescence dans le rouge à 580 nm a été lue en utilisant un lecteur de plaque ClarioStar. La Figure 8 montre la capacité de l'antigène OVA 257-264 (SIINFEKL) à induire l'activation des lymphocytes T CD8+, une fois cross-présenté par des cellules dendritiques. Le test est réalisé avec des doses croissantes de peptide OVA 257-264 (SIINFEKL) comme contrôle positif.
Conclusion : Ce test a démontré que les cellules dendritiques utilisées issues de la lignée MutuDC étaient capables de réaliser la cross-présentation d'un antigène tumoral en présence d'un adjuvant. D'autre part, ce test a démontré l'activation de la lignée cellulaire B3Z de lymphocytes tueurs en présence de ces cellules dendritiques. L'activation des B3Z a été matérialisée par la production de beta-galactosidase, de manière proportionnelle à la quantité d'antigène initialement fournie aux cellules dendritiques. Exemple 5 : Mesure de l'activation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques par présentation de l'antigène OVAl par des cellules dendritiques. ledit antigène OVAl étant exprimé à la paroi des levures perméabilisées ou non perméabilisées
Les conditions expérimentales de l'exemple 4 sont applicables à l'exemple 5. La condition qui diffère réside dans l'utilisation de levures génétiquement modifiées pour exprimer un antigène à leur paroi, perméabilisées ou non perméabilisées.
Les levures sauvages, ou des levures génétiquement modifiées présentant l'antigène OVAl dans le cytosol ou des levures génétiquement modifiées présentant l'antigène OVAl à leur paroi, perméabilisées ou non perméabilisées, ont été mises en culture avec les cellules de la lignée MutuDC pendant 5h au ratio 60:1 (MOI 60, pour Multiplicity of infection). Les lymphocytes de la lignée B3Z ont ensuite été ajoutés.
La perméabilisation a été réalisée comme décrite précédemment en soumettant les levures à un traitement par du PFA 0,5% pendant 10 minutes, à un lavage au PBS, puis à un traitement à l'éthanol (50% éthanol, 50% PBS) pendant 15 minutes, un nouveau lavage au PBS, avant d'être mises en co-culture avec les MutuDC. Une synergie est apparue pour les levures perméabilisées qui expriment l'antigène à leur surface (Figure 9), améliorant significativement l'activation des lymphocytes. Comme le montre la Figure 9, les levures génétiquement modifiées présentant l'antigène à leur paroi induisent une plus forte activation des lymphocytes T CD8+ que les levures présentant l'antigène dans leur cytosol. Par ailleurs, la perméabilisation n'a pas eu d'effet sur les levures qui produisent l'antigène OVAl dans le cytosol. En revanche, les levures perméabilisées qui expriment l'antigène OVAl à leur paroi améliorent significativement l'activation des lymphocytes T CD8+, comparées aux levures non perméabilisées, avec une augmentation de l'activation comprise entre 33% et 255% par les levures perméabilisées en comparaison avec les levures non perméabilisées.
Conclusion : Ce test de cross-présentation a démontré que les levures génétiquement modifiées et perméabilisées activent très significativement les lymphocytes tueurs lorsque ces levures expriment l'antigène OVA à leur paroi, en comparaison avec les levures non perméabilisées qui expriment également l'antigène OVA à la paroi. Exemple 6 : Mesure de la croissance d'une tumeur de mélanome et du taux de survie chez la souris
Une mesure de la croissance d'un mélanome a été effectuée sur des souris recevant des levures perméabilisées présentant l'antigène OVA1 à la paroi, couplé au fragment d'anticorps scFv anti-DEC205.
Des souris femelles C57BL/6 âgées de 6 et 8 semaines, ont été maintenues et traitées en accord avec le Comité de Bioéthique de l'Académie des sciences Polonaise.
La lignée de cellules de mélanome M05 (B16-OVA, obtenue du Pr 0. Lantz, Institut Curie, Paris V) a été cultivée dans du RPMI + Glutamax + 10% SVF + 50 μΜ 2-mercaptoethanol + Strep/Pen + 2 mg/mL G418 + 60 pg/mL hygromycine B à 37°C et 5% de C02. La lignée M05 est une lignée B16 de mélanome, transfectée avec l'ovalbumine (OVA).
Les souris ont été immunisées par voie intrapéritonéale 7 jours avant le challenge tumoral, puis par voie sous cutanée, 3 jours avant le challenge tumoral et 3 jours après le challenge tumoral, avec une dose unique de 1 Y.U. à chaque injection dans 100 pL de PBS. Lors du challenge tumoral, les souris ont reçu 1x10s M05 par voie sous cutanée dans un volume de 100 pL de PBS. Le contrôle sont des souris immunisées par des levures sauvages dites "wild-type" (WT). 5 souris ont été utilisées par groupe expérimental. Le volume tumoral a été évalué avec la formule (a*a*b)/2, où "a" est l'axe tumoral le plus court, "b" l'axe tumoral le plus long, en millimètres. Les souris moribondes ou dont la tumeur excédait 1500 mm3 ont été sacrifiées.
14 jours après le challenge tumoral, les souris immunisées par les levures perméabilisées exprimant DEC205-OVA1-SED présentaient un volume tumoral moyen de 43,1 mm3, versus un volume tumoral moyen de 162,5 mm3 pour les souris immunisées par les levures sauvages dites « Wild-Type » (WT), soit un volume tumoral inférieur par 3,77 fois en moyenne (Figure 10). Les barres d'erreurs représentent l'écart type du volume tumoral moyen par groupe expérimental.
20 jours après le challenge tumoral, 80% des souris immunisées par les levures perméabilisées exprimant DEC205-OVA1-SED avaient survécu, versus 20% des souris immunisées par les levures sauvages dites « Wild-Type » (WT) (Figure 11).
Conclusion : La vaccination des souris avec les levures perméabilisées qui présentent l'antigène OVA1 fusionné au polypeptide de ciblage des cellules dendritiques scFv DEC205 a permis une diminution de la croissance tumorale significative et une augmentation de la survie significative des souris, en comparaison avec les souris vaccinées avec des levures sauvages. Exemple 7 ; Préparation de levures immunothérapeutigues exprimant à leur paroi les antigènes de tumeurs AH1-A5, TRPl. TRP2 ou OVA1-TRP1-TRP2
La levure Saccharomyces cerevisiae INVSC1 (Life Technologies SAS), une levure quadruple auxotrophe (URA, TRP, HIS, LEU), a été utilisée. La levure a été génétiquement modifiée pour exprimer un ou plusieurs antigène(s) de tumeur (AH1-A5, TRPl, TRP2 ou OVA1-TRP1-TRP2) avec un polypeptide d'ancrage, un polypeptide d'adressage, et un polypeptide de ciblage après transformation avec les plasmides décrits à l'Exemple 1 par la méthode Lithium Acétate.
Pour la sélection des levures recombinantes, un milieu sélectif sans les acides aminés URA ou TRP a été utilisé. Les levures recombinantes ont d'abord été cultivées à 30°C jusqu'en phase stationnaire dans un milieu sélectif comprenant : 20g/L glucose, 6,7 g/L du milieu « yeast nitrogen base sans acides aminés », 1,85 g/L du milieu sélectif « Yeast synthetic drop-out médium without Uracil and tryptophan ». Le milieu « Yeast synthetic drop-out médium without Uracil and tryptophan » est composé de:
- 76 mg de chacun des acides aminés suivants : Alanine, Arginine, Asparagine, Aspartic acid, Cysteine ,Glutamic acid, Glutamine, Glycine, Histidine, myo-Inositol, Isoleucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Proline, Serine, Threonine, Tyrosine, Valine
- 380 mg de Leucine
- 18 mg d'Adénine
- 8 mg d'acide p-Aminobenzoïque.
Les levures recombinantes ont ensuite été centrifugées pendant 5 minutes à 4000 rpm, lavées dans du PBS (Phosphate Buffer Saline), puis resuspendues dans 20g/L galactose, 6,7 g/L du milieu « yeast nitrogen base sans acides aminés » et 1,85 g/L du milieu sélectif « Yeast synthetic drop-out médium without Uracil and tryptophan ». Les levures ont été placées en culture à 30°C pendant 48h pour l'induction de l'expression des protéines recombinantes par le galactose.
Les levures recombinantes ont ensuite été centrifugées pendant 5 minutes à 4000 rpm, lavées dans du PBS (Phosphate Buffer Saline) et ont ensuite été traitées de la façon suivante:
a) Resuspension dans un mélange 50% éthanol 50% eau v/v pendant 25 minutes et encore lavage au PBS (Perméabilisation à l'éthanol) ;
b) Resuspension dans un mélange 50% isopropanol 50% eau v/v pendant 25 minutes et encore lavage au PBS (Perméabilisation à l'isopropanol) ; c) Resuspension dans une solution 2% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 minutes, lavage dans du PBS, puis resuspension dans un mélange 50% éthanol 50% eau v/v pendant 25 minutes et encore lavage au PBS (Fixation au PFA puis perméabilisation à l'éthanol) ;
d) Resuspension dans une solution 2% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 minutes, lavage dans du PBS, puis resuspension dans un mélange 50% isopropanol 50% eau v/v pendant 25 minutes et encore lavage au PBS (Fixation au PFA puis perméabilisation à l'isopropanol) ; ou
e) Resuspension dans un mélange 50% éthanol 50% eau v/v pendant 25 minutes et encore lavage au PBS, puis resuspension dans une solution 2% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 minutes et encore lavage au PBS (Perméabilisation à l'éthanol puis fixation au PFA).
Les antigènes de tumeur qui ont été utilisés dans les constructions sont :
- AH1A5 (modification de GP70 423-431) : l'antigène AH-1 (SPSYVYHQF, SEQ ID NO : 20) non muté est l'antigène immunodominant H-2Ld dérivé de gp70 423- 431, qui provoque une réponse CD8+ contre la lignée murine de cancer colorectal CT26 (Enhanced Antigen-Specific Antitumor Immunity with Altered Peptide Ligands that Stabilize the MHC-Peptide-TCR Complex, Slansky et al, Immunity, Vol. 13, 529-538, October, 2000). Gp70 est silencieux dans la plupart des tissus normaux chez la souris. Malgré l'induction de CD8+, l'antigène natif AH-1 ne permet pas l'immunisation contre la tumeur CT26 à cause d'une faible affinité de cet épitope pour le TCR. On utilise donc un peptide cryptique d'AH-l (modification de GP70 423-431) qui permet d'augmenter son affinité pour le TCR et d'immuniser la souris par la voie CMHI. L'antigène de tumeur qui a été utilisé dans cet exemple est le peptide cryptique de séquence SPSYAYHQF (SEQ ID NO : 15) (AH1A5).
- TRP2 (180-188) : La Tyrosinase related protein 2 (TRP2) est une protéine impliquée dans la pigmentation des mélanocytes qui joue un rôle dans la progression du mélanome. L'antigène de tumeur qui a été utilisé dans cet exemple est le peptide cryptique de séquence SVYDFFVWL (SEQ ID NO : 17) (TRP2).
- TRP1 (455-463) : La Tyrosinase related protein 1 (TRP1), aussi connue comme glycoprotéine gp75 (Tyrpl/gp75), est une protéine impliquée dans la pigmentation des mélanocytes qui joue un rôle dans la progression du mélanome. L'antigène de tumeur qui a été utilisé dans cet exemple est le peptide cryptique de séquence TAPDNLGYM (SEQ ID NO : 16) (TRP1). Un linker G4S a été placé entre le polypeptide d'ancrage et l'antigène de tumeur. Ce linker est une chaîne d'acides aminés, composée de 4 glycines consécutives et d'une sérine. Un linker G4S a également été placé entre chacun des antigènes de la levure exprimant les antigènes OVA1-TRP1-TRP2. Un tag protéique, le c-myc, a également été ajouté entre le polypeptide d'ancrage et l'antigène de tumeur pour permettre la détection des complexes à la surface des levures. Un polypeptide de ciblage ScFv anti-DEC205 a également été ajouté, ainsi qu'un peptide signal de sécrétion supplémentaire en N-terminal polypeptide de ciblage ScFv anti-DEC205 en utilisant le polypeptide d'adressage codé par la séquence nucléique « prepro alpha factor leader peptide » issue de la phéromone de levure Mf(alpha)lp (SEQ ID N°12).
Quatre types de levures génétiquement modifiées ont ainsi été obtenus:
1) Une levure qui exprime à sa paroi la protéine de fusion [scFv DEC205]-[G4S]- [AH1A5]-[C-MYC]-[G4S]-[SED1P] (Figure 12) ;
2) Une levure qui exprime à sa paroi la protéine de fusion [scFv DEC205]-[G4S]- [TRP1]-[C-MYC]-[G4S]-[SED1P] (Figure 13) ;
3) Une levure qui exprime à sa paroi la protéine de fusion [scFv DEC205]-[G4S]- [TRP2]-[C-MYC]-[G4S]-[SED1P] (Figure 14) ; et
4) Une levure qui exprime à sa paroi la protéine de fusion [scFv DEC205]-[G4S]- [TRP2]-[G4S]-[0VA1]-[G4S]-[TRP1]-[C-MYC]-[G4S]-[SED1P] (Figure 15).
Exemple 8 : Contrôle de l'expression des protéines de fusion à la surface des levures
Les quatre types de levures génétiquement modifiées obtenues à l'Exemple 7, exprimant les antigènes de tumeur AH1A5, TRP1, TRP2 ou OVA1-TRP1-TRP2 ont été testées en cytométrie pour confirmer qu'elles expriment bien les antigènes de tumeur à leur paroi. Après l'induction des levures dans le galactose, les levures à une concentration de 1.107 cellules par mL ont été suspendues dans une solution de PFA à 2% pendant 10 minutes. Les levures ont ensuite été lavées dans du PBS contenant 1% de BSA. Après lavage, elles ont été mises en culture pendant lh à température ambiante avec un anticorps primaire anti-c-myc au ratio de 1:100 (Anticorps primaire murin IgG2a, MA1-16637, ThermoFisher). Après 3 lavages au PBS contenant 1% de BSA, les levures ont été incubées pendant lh à température ambiante avec un anticorps secondaire anti-IgG2a au ratio de 1:50 (Anticorps secondaire murin IgG2a, 31863, ThermoFisher) et ont été passées en cytométrie de flux spectrale dans le canal préférentiel PE. L'anticorps anti-c-myc permet de détecter par cytométrie de flux spectrale les levures qui expriment à la paroi chacune des protéines de fusion. Dans les conditions expérimentales testées, l'anticorps de marquage de la protéine de fusion ne pouvait pas pénétrer à l'intérieur des levures, ce qui a permis de mettre en évidence les antigènes orientés vers le milieu extérieur de la levure et non vers le périplasme de la levure.
Les résultats pour les quatre types de levures génétiquement modifiées sont présentés à la Figure 16 :
- Figure 16A : 34% des levures expriment la protéine de fusion [scFv DEC205]- [G4S]-[AH1A5]-[C-MYC]-[G4S]-[SED1P] à leur paroi ;
- Figure 16B : 15% des levures expriment la protéine de fusion [scFv DEC205]- [G4S]-[TRP2]-[G4S]-[0VA1]-[G4S]-[TRP1]-[C-MYC]-[G4S]-[SED1P] à leur paroi ;
- Figure 16C : 9% des levures expriment la protéine de fusion [scFv DEC205]- [G4S]-[TRP2]-[C-MYC]-[G4S]-[SED1P] à leur paroi ;
- Figure 16D : 13 % des levures expriment la protéine de fusion [scFv DEC205]- [G4S]-[TRP1]-[C-MYC]-[G4S]-[SED1P] à leur paroi.
Les figures montrent l'expression des antigènes de tumeur AH1A5, TRP1, TRP2 et OVA1- TRP1-TRP2 à la paroi des levures obtenues à l'Exemple 7.
Conclusion :
La cytométrie de flux spectrale a démontré d'une part l'ancrage effectif des protéines de fusion comportant un antigène de tumeur à la paroi des levures et d'autre part l'ancrage effectif d'une protéine de fusion comportant plusieurs antigènes de tumeur à la paroi des levures. Exemple 9 : Test de caractérisation d'une levure perméabilisée
Le test de caractérisation d'une levure perméabilisée utilise une enzyme naturellement présente dans le cytosol de la levure, l'alkaline phosphatase. Son substrat, le p- nitrophenylphosphate (pNPP), prend une couleur jaune lisible par l'absorbance à 405 nm après hydrolyse, proportionnellement à l'activité enzymatique (A rapid method for détermination of acid phosphatase activity of whole yeast cells, Galabova et al, June 2008, Letters in Applied Microbiology 16(3): 161 - 163). Lorsque la levure a été perméabilisée, le substrat pNPP entre dans la levure et est hydrolysé par l'alkaline phosphatase, ce qui génère un signal d'absorbance à 405 nm. Une levure qui n'a pas été perméabilisée n'est pas perméable au pNPP. Les levures sauvages S. cerevisiae ont été cultivées dans un milieu complet pour levure jusqu'à saturation à 30°C sous agitation 250 RPM en Erlenmeyer. Les levures ont été récoltées par centrifugation à 3000g pendant 5 minutes puis lavées une fois au PBS, et resuspendues dans du PBS à densité optique DO=l à 600 nm. Différents échantillons de levures ont alors subi les traitements suivants :
- Vivantes : aucun traitement ;
- PFA: fixation dans une solution de PFA 2% pendant 10 minutes (PFA) ;
- PFA + éthanol : fixation dans une solution de PFA 2% pendant 10 minutes, lavage au PBS puis perméabîlisation dans une solution d'éthanol 50% v/v pendant 25 minutes ;
- Ethanol + PFA : perméabîlisation dans une solution d'éthanol 50% v/v pendant 25 minutes , lavage au PBS puis fixation dans une solution de PFA 2% pendant 10 minutes ;
- PFA + isopropanol : fixation dans une solution de PFA 2% pendant 10 minutes, lavage au PBS puis perméabîlisation dans une solution d'isopropanol 50% v/v pendant 25 minutes ;
- Isopropanol : perméabîlisation dans une solution d'isopropanol 50% v/v pendant 25 minutes ;
- Ethanol: perméabilisées dans une solution d'éthanol 50% v/v pendant 25 minutes ; ou
- UV : irradiation deux fois à 999 J/cm2 avec homogénéisation entre les deux irradiations dans un HL-2000 HybriLinker permettant de faire de l'UV cross-linking.
100 pL de solution des différents échantillons de levures traités comme décrit ci-dessus ont été prélevés et mélangés avec 150 uL de solution de p-nitrophenylphosphate (P7998 SIGMA - Alkaline Phosphatase Yellow (pNPP) Liquid Substrate System for ELISA). Le mélange a été incubé 30 minutes à température ambiante. La réaction a été stoppée au bout de 30 minutes avec 35 pL de NaOH 3M. Les levures ont été centrifugées 5 minutes à 4000 RPM, puis 100 pL de surnageant a été prélevé pour lecture de son absorbance à 405 nm. Le blanc utilisé était le pNPP seul.
Les résultats sont présentés aux figures 17 et 18.
Conclusion : Le test a confirmé que le traitement avec l'isopropanol ou l'éthanol a permis de perméabiliser les levures la, avec et sans fixation au PFA. Le test a également montré qu'une irradiation aux UV ou une fixation au PFA n'a pas permis de perméabiliser les levures. Exemple 10 : mesure de l'activation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques avec une levure présentant à sa paroi l'antigène QVA1 et ayant subi différents traitements de perméabilisation.
La mesure de l'activation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques a été réalisée à l'aide d'un test colorimétrique utilisant le beta-galactosidase et un de ses substrats, le CPRG (Chlorophenol red-beta-galactopyranoside) comme décrit à l'Exemple 4.
Matériel: des cellules dendritiques, des lymphocytes T CD8+ et une levure génétiquement modifiée non-perméabilisées qui expriment à sa paroi un antigène.
Les cellules dendritiques utilisées étaient des cellules dendritiques murînes issues de la lignée MutuDC (obtenus de l'Université de Lausanne). Cette lignée provient de cellules dendritiques CD8a spléniques immortalisés qui conservent la capacité de cross-présenter un antigène et d'activer les lymphocytes tueurs (LT). Les cellules de la lignée MutuDC ont été cultivées dans un milieu RPMI 1640 supplémenté par 10% FCS, HEPES, 50 μΜ 2- mercaptoethanol, 50 U/ml pénicilline, et 50 pg/ml streptomycine, à 37°C avec 5% de C02.
Les lymphocytes T CD8+ utilisés provenaient de l'hybridome B3Z. L'hybridome B3Z, une lignée spécifique pour le peptide OVA 257-264 (SIINFEKL, SEQ ID NO : 21), a été offerte par l'Institut Curie (Paris V). Ces cellules ont la particularité de produire de la beta galactosidase sous contrôle d'un promoteur IL2 (Inter-leukine 2). Les cellules B3Z ont été cultivées dans un milieu RPMI 1640 supplémenté par 10% FCS, du Glutamax, HEPES, 50 μΜ 2-mercaptoethanol, 50 U/ml pénicilline, et 50 pg/ml streptomycine, à 37°C avec 5% de C02. Les cellules dendritiques ont été réparties à raison de 100 000 cellules par puit dans des plaques 96 puits à fond rond.
La levure génétiquement modifiée non-perméabilisée exprimaient l'antigène OVA1 à sa paroi fusionnée au scFv DEC205 (scFv DEC205-OVA1-SED) et a été préparée selon l'exemple 2 (Figure 4). Cette levure a subi les traitements suivants :
- Vivantes : aucun traitement ;
- PFA: fixation dans une solution de PFA 2% pendant 10 minutes (PFA) ;
- PFA + éthanol : fixation dans une solution de PFA 2% pendant 10 minutes, lavage au PBS puis perméabilisation dans une solution d'éthanol 50% v/v pendant 25 minutes ;
- Ethanol + PFA : perméabilisation dans une solution d'éthanol 50% v/v pendant 25 minutes , lavage au PBS puis fixation dans une solution de PFA 2% pendant 10 minutes ; - PFA + isopropanol : fixation dans une solution de PFA 2% pendant 10 minutes, lavage au PBS puis perméabilisation dans une solution d'isopropanol 50% v/v pendant 25 minutes ;
- Isopropanol : perméabilisation dans une solution d'isopropanol 50% v/v pendant 25 minutes ;
- Ethanol: perméabilisées dans une solution d'ethanol 50% v/v pendant 25 minutes ; ou
- UV : irradiation deux fois à 999 J/cm2 avec homogénéisation entre les deux irradiations dans un HL-2000 HybriLinker permettant de faire de l'UV cross-linking. puis mises en culture avec les cellules de la lignée MutuDC pendant 5h au ratio 30:1 (MOI 30, pour Multiplicity of infection),
Ensuite, les lymphocytes de la lignée B3Z ont été ajoutés à raison de 100 000 par puit pendant 18h à 37°C et 5% de C02. Les plaques ont été ensuite lavées et l'activité de la bêta-galactosidase produite par les lymphocytes T CD8+ a été mesurée après addition de 120 pL de tampon de lyse (qui contient du PBS, 9 mM MgCI2, 0.125% NP40 et 0.15 mM chlorophenol red-beta-galactopyranoside). Après le changement de couleur vers le rouge, l'absorbance dans le rouge à 575 nm a été lue en utilisant un lecteur de plaque ClarioStar. Les résultats sont présentés à la Figure 19. Conclusion: Ce test de cross-présentation a montré que les levures perméabilisées (inactivées ou pas) ont été capables d'activer significativement les lymphocytes tueurs. L'activation obtenue avec les levures perméabilisées a été bien supérieure à l'activation obtenue avec les levures non-perméabilisée (PFA ou UV). Il convient notamment de noter que les levures traitées aux UV n'ont pas été capables d'activer les lymphocytes tueurs, comme pour les levures n'ayant subi aucun traitement (Vivantes).

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'une levure immunothérapeutique, ledit procédé comprenant les étapes de :
a) obtenir une levure génétiquement modifiée qui exprime à sa paroi un ou plusieurs antigène(s) de tumeur et éventuellement un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques ;
b) perméabiliser la levure génétiquement modifiée afin d'obtenir une levure immunothérapeutique, éventuellement inactiver la levure avant ou après l'étape de perméabilisation.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape a) est : obtenir une levure génétiquement modifiée qui exprime à sa paroi une ou plusieurs protéines de fusion de formule (la) :
[protéine ou polypeptide de ciblage des cellules dendritiques]n-[antigène de tumeur]x- [linker peptidique]m-[polypeptide ou protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (la) ;
n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'étape a) comprend les étapes de : al) introduire dans une levure un ou plusieurs vecteur(s) comprenant chacun une séquence nucléique de formule (Ha) ou (Ilb) :
[séquence nucléique codant un polypeptide d'adressage à la paroi de la levure génétiquement modifiée]-[séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques]n-[séquence nucléique codant un antigène de tumeur]x-[séquence nucléique codant un linker peptidique]m- [séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (Ha), n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50 ;
[séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques]n-[séquence nucléique codant un antigène de tumeurk-tséquence nucléique codant un linker peptidique]m-[séquence nucléique codant un polypeptide ou une protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée]-[séquence nucléique codant un polypeptide d'adressage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (Ilb), n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50 ;
afin d'obtenir une levure génétiquement modifiée capable d'exprimer à sa paroi une ou plusieurs protéine(s) de fusion de formule (la) :
[protéine ou polypeptide de ciblage des cellules dendritiques]n-[antigène de tumeur]x-
[linker peptidique]m-[polypeptide ou protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (la), n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50 ; et
a2) cultiver la levure génétiquement modifiée dans des conditions adaptées pour l'expression de la ou des protéine(s) de fusion à la paroi de la levure génétiquement modifiée.
4. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la levure est choisie parmi le genre Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Ogataea. ou Candida, de préférence le genre Saccharomyces, de préférence la levure est Saccharomyces cerevisiae.
5. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel le polypeptide ou la protéine d'ancrage est un polypeptide ou une protéine de levure exprimé au niveau de la paroi des levures, de préférence choisi parmi Aga2p ou Sedlp.
6. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la levure génétiquement modifiée est perméabilisée avec un mélange eau/éthanol.
7. Procédé de préparation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le polypeptide ou la protéine de ciblage des cellules dendritiques est choisi parmi un anticorps capable de se lier spécifiquement à la protéine DEC205, un fragment d'anticorps capable de se lier spécifiquement à la protéine DEC205, l'activateur du plasminogène (PLA) de la bactérie Yersinia pestis ou une séquence dérivée de l'activateur du plasminogène (PLA) de la bactérie Yersinia pestis.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le ou les antigène(s) de tumeur sont/est choisi(s) parmi Melan-A, Tyrosinase, gplOO, MAGEA1, MAGEA10, MAGEA11, MAGEA12, MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, AGEA8, MAGEA9, MAGEB1; MAGEB10, MAGEB16, MAGEB18, MAGEB2, MAGEB3, MAGEB4, MAGEB5, MAGEB6, AGEB6B, New York Esophageal 1 antigène (NY-ESO-1), MAGEC1, AGEC2, L-antigène (LAGE), TRP-1, TRP-2, P53, KRAS, CEA, WT1, MUC1, SART3, SURVIVIN 2B, RNF43/TOMM34, TGFBRII, HER2/neu, BRAF, PI3K, APC, BAX, beta2-microglobuline, télomérase ou NRAS.
9. Levure immunothérapeutique susceptible d'être obtenue par la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
10. Levure immunothérapeutique génétiquement modifiée et perméabilisée qui exprime à sa paroi :
(iii) un ou plusieurs antigène(s) de tumeur, de préférence choisi(s) parmi Melan-A, Tyrosinase, gplOO, MAGEA1, MAGEA10, MAGEA11, MAGEA12, MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA8, MAGEA9, MAGEB1; MAGEB10, MAGEB16, MAGEB18, MAGEB2, MAGEB3, MAGEB4, MAGEB5, MAGEB6, MAGEB6B, New York Esophageal 1 antigène (NY-ESO-1), MAGEC1, MAGEC2, L-antigène (LAGE), TRP-1, TRP-2, P53, KRAS, CEA, WT1, MUC1, SART3, SURVIVIN 2B, RNF43/TOMM34, TGFBRII, HER2/neu, BRAF, PI3K, APC, BAX, beta2-microglobuline, télomérase ou NRAS ; et
(iv) éventuellement un polypeptide ou une protéine de ciblage des cellules dendritiques.
11. Levure selon la revendication 10, qui exprime à sa paroi une protéine de fusion de formule (la) :
[protéine ou polypeptide de ciblage des cellules dendritiques]n-[antigène de tumeur]x- [linker peptidique]m-[polypeptide ou protéine d'ancrage à la paroi de la levure génétiquement modifiée] (la) ;
n est égal à 0 ou 1, m est égal à 0 ou 1, et x est un entier allant de 1 à 300, de préférence allant de 1 à 50.
12. Levure selon l'une des revendications 10 ou 11, dans laquelle le polypeptide ou la protéine de ciblage des cellules dendritiques est choisi parmi un anticorps capable de se lier spécifiquement à la protéine DEC205, un fragment d'anticorps capable de se lier spécifiquement à la protéine DEC205, l'activateur du plasminogène (PLA) de la bactérie Yersinia pestis, ou une séquence dérivée de l'activateur du plasminogène (PLA) de la bactérie Yersinia pestis.
13. Composition immunothérapeutique comprenant une levure selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
14. Composition immunothérapeutique selon la revendication 13, comprenant en outre un agent thérapeutique.
15. Levure selon l'une quelconque des revendications 9 à 12 ou composition selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14 pour son utilisation comme médicament.
16. Levure selon l'une quelconque des revendications 9 à 12 ou composition selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14 pour son utilisation dans le traitement ou la prévention du cancer.
17. Levure selon l'une quelconque des revendications 9 à 12 ou composition selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14 pour son utilisation dans le traitement ou la prévention du cancer selon la revendication 16, caractérisé en ce que le cancer est un cancer solide, de préférence le mélanome ou le cancer du côlon.
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