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WO2018178601A1 - Traitement d'une infection par le virus respiratoire syncytial - Google Patents

Traitement d'une infection par le virus respiratoire syncytial Download PDF

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Publication number
WO2018178601A1
WO2018178601A1 PCT/FR2018/050812 FR2018050812W WO2018178601A1 WO 2018178601 A1 WO2018178601 A1 WO 2018178601A1 FR 2018050812 W FR2018050812 W FR 2018050812W WO 2018178601 A1 WO2018178601 A1 WO 2018178601A1
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WO
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rsv
composition
enriched
hyper
immunoglobulin
Prior art date
Application number
PCT/FR2018/050812
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English (en)
Inventor
Abdessatar Chtourou
Gérald PERRET
Original Assignee
Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies filed Critical Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies
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    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to the use of a immunoglobulin (Ig) composition hyper-enriched with respiratory syncytial virus immunoglobulin (RSV) immunoglobulin in the prophylactic or curative treatment of RSV infection in a subject, by administering of the composition in a form adapted so that the anti-RSV immunoglobulins bind to the RSV in the lower respiratory tract, preferably in the lungs.
  • Ig immunoglobulin
  • RSV respiratory syncytial virus immunoglobulin
  • Respiratory syncytial virus is a common infectious agent of the respiratory tract.
  • RSV generally causes a mild, asymptomatic or weak (cold) infection in immunocompetent individuals, but may be responsible for several infectious episodes per year on the same individual, which may cause absenteeism or job.
  • RSV is the most important cause of bronchiolitis and pneumonia in infants and young children, and is largely responsible for respiratory infections in nursing homes.
  • the aim of the invention is to act locally in the lungs, and in a targeted manner, a composition of immunoglobulins (Ig) hyper-enriched with anti-RSV immunoglobulins.
  • the present invention relates to an immunoglobulin (Ig) composition hyper-enriched with anti-RSV immunoglobulins, for use in the prophylactic or curative treatment of RSV infection in a subject, by administering the composition in a form adapted for anti-RSV immunoglobulins to bind to RSV in the lower respiratory tract.
  • the lower airways are the lungs.
  • the composition according to the invention is intended to be administered in the form of particles or droplets with a size of between 0.025 ⁇ and 10 ⁇ , preferably between 0.5 ⁇ and 5 ⁇ and preferably between 1 ⁇ and 3 ⁇ .
  • the composition of hyper-enriched Ig anti-RSV immunoglobulin may further comprise a surfactant.
  • said composition may further comprise a viscosity modifying agent.
  • said composition comprises an anti-RSV immunoglobulin concentration of between 10 and 250 g / l, preferably between 10 and 100 g / l.
  • the useful composition according to the invention is intended to be administered by the pulmonary route.
  • the composition according to the invention may be administered by the pulmonary route by inhalation of an aerosol, preferably by means of a mouth spray or by nebulization by means of a nebulizer, in particular a sieve nebulizer.
  • Said composition may be administered by the pulmonary route with a delivery volume of between 250 ⁇ l and 12 ml, preferably between 250 ⁇ l and 10 ml.
  • the useful composition according to the invention is intended to be administered nasally.
  • the composition according to the invention can be administered nasally in the form of an aerosol.
  • Said composition may be administered nasally with a delivery volume of less than 20 ml, preferably less than 15 ml, more preferably between 2 ml and 8 ml.
  • the composition is used in the prophylactic or curative treatment of an RSV infection in a subject, the subject possibly belonging to at least one of the following groups: children, infants, immunocompromised persons, especially persons treated for a transplant especially a lung transplant, premature infants and children or elderly with lung disease especially chronic obstructive pulmonary disease (COPD), cardiac or immune.
  • a subject possibly belonging to at least one of the following groups: children, infants, immunocompromised persons, especially persons treated for a transplant especially a lung transplant, premature infants and children or elderly with lung disease especially chronic obstructive pulmonary disease (COPD), cardiac or immune.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • FIG. 1 Viral replication analysis by in vivo imaging: Preventive administration of the anti-RSV Ig enriched composition in the lungs intranasally.
  • the histogram represents the averages of the results obtained for each experimental condition. The results were obtained from 3 mice for the placebo condition and 4 mice for each of the other experimental conditions.
  • the histogram represents the averages of the results obtained for each experimental condition. The results were obtained from 3 mice for the placebo condition and 4 mice for each of the other experimental conditions.
  • Figure 3 represents the averages of the results obtained for each experimental condition. The results were obtained from 3 mice for the placebo condition and 4 mice for each of the other experimental conditions.
  • RSV N nucleocapsid gene Quantification of viral replication (by RT-Q-PCR), 5 days after RSV infection.
  • the histogram represents the averages of the results obtained for each experimental condition. The results were obtained from 3 mice for the placebo condition and 4 mice for each of the other experimental conditions.
  • a method for the prophylactic or curative treatment of respiratory syncytial virus (RSV) infection in a subject comprising the administration of an immunoglobulin (Ig) composition hyper-enriched in anti-inflammatory immunoglobulins.
  • RSV in a form adapted for anti-RSV immunoglobulins to bind to RSV in the lower respiratory tract, preferably in the lungs.
  • the subject may be any mammal, preferably a human being, regardless of age or sex. This may include a subject at risk for infection with the RSV virus, for example children, infants, or an immunocompromised person, particularly in premature infants and children or elderly with a lung, heart or immune disease.
  • the subject if infected, is asymptomatic, i.e., he has not yet developed symptoms associated with the infection.
  • the subject belongs to at least one of the following groups: children, infants, immunocompromised persons including persons treated for a transplant, in particular a lung transplant, premature infants and children or elderly people with a pulmonary disease especially chronic obstructive pulmonary disease (COPD), cardiac or immune.
  • a pulmonary disease especially chronic obstructive pulmonary disease (COPD), cardiac or immune.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • the term “prophylactic treatment” refers to preventing or stopping the development of the infection before it reaches the lower respiratory tract and causes inflammation of the lungs. It prevents the onset of symptoms, namely congestion or runny nose, but especially lung inflammation, especially in premature infants and children with lung, heart or immune disease.
  • curative treatment refers to the disappearance or decrease of RSV infection in the lower respiratory tract and / or the disappearance or alleviation of one or more symptoms, namely congestion or runny nose, but especially lung inflammation, especially in premature infants and children with pulmonary, cardiac or immune diseases.
  • the immunoglobulin composition useful according to the invention is a hyper-enriched immunoglobulin composition in anti-RSV immunoglobulins which has a neutralizing action vis-à-vis the RSV and has a therapeutic efficacy for the patient. More particularly, the composition is hyper-enriched with immunoglobulins directed specifically against the RSV virus.
  • the term "specific” means that immunoglobulins recognize and bind to an immunogen of said virus, substantially without cross-reactivity with another virus.
  • the terms "Ig", “immunoglobulin” and “antibody” may be interchangeable.
  • the immunoglobulin composition comprises antibodies that bind to the same viral immunogen (referred to as a monovalent antibody population), or to several immunogens different from RSV (it may then be referred to as a polyvalent antibody population). Essentially, it is polyclonal antibodies.
  • Said immunoglobulin composition essentially contains polyvalent human immunoglobulins which may be immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin E (IgE), immunoglobulin M (IgM) or immunoglobulin G (IgG).
  • the immunoglobulin composition essentially contains IgG and / or IgM and / or IgA.
  • the immunoglobulin composition essentially comprises IgG, regardless of their subclass (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4).
  • the composition is suitable for topical administration and preferably contains predominantly IgG and / or IgA, IgA allowing the recruitment of cells such as mucosal cells with alfa receptors.
  • composition of Ig hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin is meant an immunoglobulin composition comprising at least 10%, at least 20%>, at least 30%>, at least 40%>, at least 50% > at least 60%>, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%; at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%>, at least 99% by weight neutralizing immunoglobulins vis-à-vis the RSV.
  • the immunoglobulin hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin concentrate comprises at least 10% by weight of polyvalent immunoglobulins capable of recognizing and / or neutralizing the RSV virus or one of of its parts.
  • the immunoglobulin concentrate hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin comprises at least 30% by weight of polyvalent immunoglobulins capable of recognizing and / or neutralizing the RSV virus or a part thereof.
  • the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate comprises at least 60% by weight of polyvalent immunoglobulins capable of recognizing and / or neutralizing the RSV virus or one of its parts.
  • Immunoglobulins directed specifically against RSV can bind to any of the proteins of the virus, preferably a surface protein, playing a role in the mechanisms of infection, especially during recognition, binding of the particle viral to its host cell, from the fusion of the virus particle to its host cell and from the spread of the host cell host cell virus.
  • a surface protein playing a role in the mechanisms of infection, especially during recognition, binding of the particle viral to its host cell, from the fusion of the virus particle to its host cell and from the spread of the host cell host cell virus.
  • SH protein, protein G or RSV F protein There may be mentioned in particular SH protein, protein G or RSV F protein.
  • the composition is usually concentrated.
  • the composition may comprise an anti-RSV immunoglobulin concentration of between 10 and 250 g / l, preferably between 10 and 100 g / l.
  • a method for preparing immunoglobulins from plasma pools preferably human plasma.
  • concentration operations of the plasma preparations typically by a factor of 100 to 1000.
  • preparations of immunoglobulins derived from plasma or blood plasma fractions are subjected to affinity chromatography using a viral protein as an affinity ligand, to obtain a hyper-enriched immunoglobulin preparation.
  • immunoglobulins capable of recognizing, and advantageously neutralizing, said RSV.
  • This method uses affinity chromatography supports on which are grafted one or more RSV viral proteins, or antigenic fragments thereof.
  • the proteins of the envelope there may be mentioned for example the proteins of the envelope: the SH protein, the protein G (highly glycosylated transmembrane glycoprotein responsible for binding to the host cell), the F protein (transmembrane glycoprotein responsible for fusion to the host membrane, entry of the virus into the cell and formation of syncitia).
  • the chromatography uses a matrix comprising a support based on polymer particles, and is preferably in the form of a gel or a resin. These polymer particles are preferably of spherical or oblong shape, it may be in particular beads.
  • the polymer may be natural or non-natural, organic or inorganic, crosslinked or uncrosslinked.
  • the polymer is preferably an organic polymer, preferably crosslinked.
  • the polymer is cellulose, and the particles are preferably porous cellulose beads.
  • Other types of possible polymers include agarose, dextran, polyacrylates, polystyrene, polyacrylamide, polymethacrylamide, copolymers of styrene and divinylbenzene, or mixtures of these polymers.
  • the particles can provide a chromatography medium that can be used to fill a column, for example.
  • the substrate-grafted protein is an RSV surface protein, for example RSV F protein or RSV G protein, or an antigenic fragment thereof, either directly or via a spacer, which covalently binds the ligand to the particles of the chromatographic medium.
  • the grafted support has several different proteins and / or several different antigenic fragments belonging to the RSV, in order to obtain an immunoglobulin concentrate with different antigenic targets.
  • a particle can carry several spacers.
  • the bond between the ligand and the spacer may be, for example, an amide bond.
  • the gel matrix is prepared by conventional addition of a buffer to the ligand-carrying polymer particles, as known to those skilled in the art, so as to obtain a gel matrix suitable for chromatography. affinity.
  • the matrix as defined herein is useful in affinity chromatography binding immunoglobulins.
  • the matrix is particularly useful in mixed bed affinity chromatography.
  • Such a matrix advantageously comprises several different antigens specific for RSV and is therefore capable of binding immunoglobulins directed against several different epitopes of RSV.
  • the anti-RSV immunoglobulins present in the plasma or plasma fraction bind to the matrix, and the adsorbed product is eluted and recovered, enriched in anti-RSV immunoglobulins.
  • the conditions of implementation of the affinity chromatography are adapted by those skilled in the art to ensure the reuse of the matrix while maintaining non-degrading elution conditions for the product of interest.
  • the plasma or plasma fraction at the start of the enrichment process consists of plasma from blood plasma or pools of blood plasma from mammalian subjects (human or non-human) or a fraction of that plasma, being any part or part of the plasma, having been subjected to one or more purification steps.
  • the plasma or plasma fraction initially subjected to the enrichment process advantageously consist of plasma from pools of blood plasma of normal human subjects or a fraction thereof, any part or sub- part of the plasma, having undergone one or more purification steps.
  • the plasma fractions that can be used include the cryoprecipitated plasma supernatant, the plasma cryoprecipitate (resuspended), the fractions I to V obtained by ethanolic fractionation (according to the Cohn or Kistler & Nitschmann method), the supernatant and the precipitate obtained. after precipitation with caprylic acid and / or caprylate, the chromatographic eluates and the non-adsorbed fractions of the chromatography columns, and the filtrates.
  • the plasma or the initial plasma fraction subjected to the enrichment process come from blood plasma pools of normal human subjects, without prior selection of the donors, in particular, without selecting the donors on the basis of their possible rate.
  • plasma anti-RSV immunoglobulin The plasma or the initial plasma fraction subjected to the enrichment process thus advantageously comprises an anti-RSV immunoglobulin level similar to or equal to the anti-RSV immunoglobulin level of a plasma derived from the pool of at least 1000 human donors. Normal randomly chosen.
  • the plasma or the starting plasma fraction subjected to the enrichment process is advantageously not enriched with anti-RSV immunoglobulins of interest compared to the anti-RSV immunoglobulin level of a plasma derived from the pool of at least 1000 selected donors. random way.
  • the plasma or plasma starter fraction subjected to the enrichment process consists of plasma from blood plasma or blood plasma pools of non-human, male and / or female mammal subjects, preferably goat , ewe, goat, bison, buffalo, camel, llama, mouse, rat, cow, bull, pig, sow, rabbit, horse, mare.
  • the non-human mammal is advantageously transgenic and has been previously exposed to the RSV virus in order to produce anti-RSV human immunoglobulins in its plasma.
  • the plasma or starting plasma fraction subjected to the enrichment process contains polyvalent human immunoglobulins which may be immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin E (IgE), immunoglobulin M (IgM) or immunoglobulin G (IgG).
  • polyvalent human immunoglobulins which may be immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin E (IgE), immunoglobulin M (IgM) or immunoglobulin G (IgG).
  • the plasma or the initial plasma fraction essentially contains IgG irrespective of their subclass (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4) and / or IgA.
  • the method can typically be an independent method, dedicated to the purification of anti-RSV immunoglobulins, and is then advantageously performed from plasma or a plasma fraction.
  • the method advantageously comprises the following steps: providing a plasma sample or a plasma fraction,
  • the method may further comprise, after the step of capture on anti-RSV affinity chromatography, a dedicated depletion step of certain immunoglobulins, in particular immunoglobulins E (IgE) and / or immunoglobulins (IgM). , which may be involved in mechanisms of deleterious side effects in patients.
  • immunoglobulins E immunoglobulins E
  • IgM immunoglobulins
  • the method advantageously further comprises a step of subjecting the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin composition to at least one inactivation and / or viral elimination step.
  • the method for obtaining anti-RSV immunoglobulins is coupled to a polyvalent immunoglobulin G method in order to obtain, from the same starting plasma pool, both a multipurpose G immunoglobulin concentrate and a hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin concentrate.
  • the process then typically comprises a prior step of obtaining the plasma fraction, by ethanolic fractionation and / or caprylic fractionation and / or chromatographic separation.
  • the method advantageously comprises the following steps: providing a sample of a prepurified plasma fraction obtained by ethanolic fractionation and / or caprylic fractionation and / or chromatographic separation
  • chromatographic separation is meant any chromatography step, whether it is ion exchange chromatography (anion exchange and / or cation exchange), mixed mode, affinity (using chemical-type ligands, antibodies, antibody fragments, aptamers).
  • chromatographic separation is meant both a single chromatography column, or a set of chromatography columns, using or not the same type of support, in series (multicolumn mode for example) or in parallel.
  • the plasma fraction can be obtained by an ethanol fractionation originally developed by Cohn et al (Cohn et al, 1946. J. Am Chem Soc 68, 459, Oncley et al, 1949, J. Am. Soc 71, 541), or by chromatographic separation, as described, for example, in EP 0 703 922 and WO 99/64462, or by caprylic fractionation as described by Steinbuch et al 1969, Arch Biochem. Biophys. 134 (2): 279-84).
  • a blood plasma, or an Ig-enriched blood plasma fraction is subjected to caprylic fractionation (prepurification by precipitation of non-immunoglobulin contaminants), and a single chromatography on an anion exchange resin carrier carried out at pH. alkaline.
  • Viral inactivation treatment can be carried out, preferably carried out by solvent-detergent, as described by Horowitz in US Pat. No. 4,764,369, optionally supplemented by a step of viral elimination by nanofiltration on a 75N, 35N pore size filter. , 20N and / or 15N.
  • the Ig fraction thus harvested is already concentrated, but can then undergo additional concentration steps by ultrafiltration, and sterilizing filtration.
  • This concentrate is then subjected to an immunoaffinity chromatographic step on the matrix as described above.
  • the method may furthermore comprise, preferably after the step of capture on anti-virus affinity chromatography, a dedicated stage of depletion of certain immunoglobulins, in particular immunoglobulins A (IgA), and / or immunoglobulins. E (IgE) and / or immunoglobulin M (IgM), which may be involved in mechanisms of deleterious side effects in patients.
  • the immunoglobulins to be depleted are advantageously selected in particular according to the route of administration chosen for the anti-virus immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate and / or according to the content of the plasma sample or the starting plasma fraction.
  • the method may further comprise the subsequent steps of adding one or more pharmaceutically acceptable stabilizers; and optionally freeze or lyophilize the concentrate thus obtained.
  • an immunoglobulin composition as described above is in the form of a pharmaceutical composition comprising anti-RSV immunoglobulins, in combination with at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • pharmaceutically acceptable excipient means excipients which are not harmful or toxic vis-à-vis the respiratory tract and more particularly the tracheobronchial epithelium.
  • the formulation of the pharmaceutical composition useful according to the invention is adapted so that the anti-RSV immunoglobulins bind to RSV in the lower respiratory tract, preferably in the lungs.
  • the pharmaceutical composition can be prepared according to the usual methods, using appropriate excipients, preferably adapted for administration to reach the lower respiratory tract.
  • additives can be used in the formulation, such as
  • stabilizing agents such as albumin, and / or
  • antioxidants such as ascorbic acid, cysteine, alpha tocopherol, metbionme
  • sugars and glycols such as glucose, maltose, mannitol, sorbitol, glycerin, lactitol, stachyose, mannose, sorbose, xylose, ribose, ribitol, myoinisitosis, myoinisitol, galactose, galactitol, glycerol, cyclitols (such as Pinositol), and PEG), and / or complexing agents (such as sodium edetate), and / or
  • preservatives and / or bacteriostats such as anhydrous ethanol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, parabens, phenylethyl alcohol, benzoic acid, EDTA, 2-pyrrolidone, and their derivatives
  • bacteriostats such as anhydrous ethanol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, parabens, phenylethyl alcohol, benzoic acid, EDTA, 2-pyrrolidone, and their derivatives
  • / or - viscosity modifiers such as calcium chloride, magnesium chloride, sodium chloride, sodium bisphosphate, caffeine, theophylline, tyramine, procaine, lidocaine , imidazole, aspartame, saccharin, and acesulfame potassium
  • agents that influence osmolarity such as mannitol, arginine or glycine
  • surfactants such as nonionic surfactants, such as polysorbates (polysorbate 80 or polysorbate 20), poloxamers (such as poloxamer 188, PF68), Triton TM, sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium octyl glycoside, lauryl sulfobetaine, myristyl sulfobetaine, linoleyl sulfobetaine, stearyl sulfobetaine, lauryl sarcosine, myristyl sarcosine, linoleyl sarcosine, stearyl sarcosine, linoleyl betaine, myristyl betaine, cetyl betaine, lauroamidopropyl betaine, cocamidopropyl betaine, lino
  • pH-influencing agents such as citrate or phosphate buffer
  • agents that influence the tonicity of the formulation such as sodium chloride or arginine glutamate, metalloprotein complexes, polymers biodegradable (especially polyesters), ions capable of forming salts (such as sodium), polyhydric alcohol sugars, amino acids (such as alanine, glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, lysine, ornithine, leucine, 2-phenylalanine, glutamic acid and threonine), organic sugars or alcohol sugars (such as lactitol, stachyose, mannose , sorbose, xylose, ribose, ribitol, myoinisitose, myoinisitol, galactose, galactitol, glycerol, cyclitols including inositol, polyethylene glycol), sulfur reducing agents
  • cryoprotectants such as sucrose or trehalose
  • composition according to the invention may comprise a surfactant.
  • surfactant means an amphiphilic molecule having two parts of different polarity, one lipophilic and apolar, the other hydrophilic and polar.
  • a surfactant may be of ionic type (cationic or anionic), zwitterionic or nonionic.
  • the surfactant may advantageously be chosen from nonionic surfactants, such as polysorbates (polysorbate 80 or polysorbate 20), poloxamers (eg poloxamer 188, PF68), Triton TM, sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium octyl glycoside, lauryl sulfobetaine, myristyl sulfobetaine, linoleyl sulfobetaine, stearyl sulfobetaine, lauryl sarcosine, myristyl sarcosine, linoleyl sarcosine, stearyl sarcosine, linoleyl betaine, myristyl betaine, cetyl betaine, lauroamidopropyl betaine, cocamidopropyl betaine, linoleamidopropyl betaine, myristamidopropyl betaine, palmido
  • the composition according to the invention may comprise a viscosity modifying agent, the viscosity being the set of phenomena of resistance to flow occurring in the mass of a material.
  • the viscosity modifier may be a plasticizer.
  • the viscosity modifying agent may be advantageously chosen from calcium chloride, magnesium chloride, sodium chloride, sodium bisphosphate, caffeine, theophylline, tyramine, procaine, lidocaine, imidazole, and the like. aspartame, saccharin, and acesulfame potassium.
  • the composition comprises agents which influence the pH (such as citrate buffer or phosphate).
  • the composition comprises agents which influence the tonicity of the formulation (such as sodium chloride or arginine glutamate, metalloprotein complexes, biodegradable polymers (in particular polyesters ), ions capable of forming salts (such as sodium), polyhydric alcohol sugars, amino acids (such as alanine, glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine) , lysine, ornithine, leucine, 2-phenylalanine, glutamic acid and threonine), organic sugars or alcohol sugars (such as lactitol, stachyose, mannose, sorbose, xylose, ribose, ribitol, myoinisitosis, myoinisitol, galactose, galactitol, glycerol, cyclitols including inositol, polyethylene glycol), sulfur reducing agents (such as sodium chloride or arginine glut
  • the composition comprises cryoprotectants (such as sucrose or trehalose).
  • said composition is in the form of an inhalation powder which additionally contains suitable physiologically acceptable adjuvants, for example chosen from monosaccharides, disaccharides, oligo- and polysaccharides, polyalcohols, salts and the like. or mixtures of these adjuvants.
  • said composition is dispersed in a propellant gas selected from hydrocarbons, such as n-propane, n-butane or isobutane or halohydrocarbons, such as fluorinated derivatives of methane, ethane, propane, butane, cyclopropane or cyclobutane.
  • a propellant gas selected from hydrocarbons, such as n-propane, n-butane or isobutane or halohydrocarbons, such as fluorinated derivatives of methane, ethane, propane, butane, cyclopropane or cyclobutane.
  • the propellant may be trichlorofluoromethane, dichlorodifluoromethane, chlorodifluoromethane or dichlorotetrafluoroethane. These propellants can also act as a solvent because they are liquefied before being sprayed with said composition.
  • composition hyper-enriched with anti-RSV immunoglobulins as described above is intended to be administered in a form adapted so that the anti-RSV immunoglobulins bind to RSV in the lower respiratory tract, preferably in the lungs, particularly at the level of the pulmonary epithelium.
  • the composition according to the invention is administered in the form of particles or droplets of suitable size and morphology for targeting the lower respiratory tract, preferably the lungs, and more particularly the pulmonary epithelium.
  • the size (also called mass median aerodynamic diameter) of the particles (solid) or droplets (liquid) is adapted to allow the passage thereof through the respiratory tract to the pulmonary alveoli.
  • the size of the particles or droplets is between 0.025 microns (25 nm) and 10 ⁇ , preferably between 0.5 ⁇ and 5 ⁇ and more preferably between 1 ⁇ and 3 ⁇ .
  • Particle size can be measured by any technique known to those skilled in the art, especially laser diffraction techniques.
  • Droplet size may be measured by any technique known to those skilled in the art, including laser diffraction techniques and Doppler-based techniques.
  • those skilled in the art will be able to carry out their measurements using a device implementing laser diffraction and in particular the Visisize D30, Visisize P15, Visisize N60 and Visisize S200 (Oxford Lasers Inc) models.
  • said composition is intended to be administered by the pulmonary route.
  • pulmonary administration is intended to mean any release and / or application of the composition to the lower respiratory tract, and preferably to the lungs, more preferably to the level of the pulmonary epithelium, these surfaces constituting a major territory of the pulmonary epithelium.
  • RSV infection and are therefore of interest in the prophylaxis and curative treatment of RSV infection.
  • lower respiratory tract or “lower airway” is meant any intra-thoracic duct or cavity such as the trachea, bronchi and lungs (consisting of bronchioles and alveoli).
  • the administration allows the composition to reach and / or penetrate the pulmonary epithelium, characterized by a surface of 90000 cm 2 developed within the pulmonary alveoli.
  • the administration makes it possible to preventively and / or curatively treat a pulmonary infection caused by the RSV virus.
  • said composition is intended for inhalation.
  • Said immunoglobulin (Ig) composition which is hyper-enriched with anti-RSV immunoglobulins can thus be administered by the pulmonary route in the form of a powder, a solution, a suspension or an aerosol.
  • said composition is administered as an aerosol comprising solid particles or liquid droplets having a size and morphology adapted to target the lower respiratory tract, and preferably the lungs.
  • An aerosol is defined here as the dispersion of solid particles or very fine liquid droplets in a gas.
  • the aerosol comprises a continuous gaseous phase and, dispersed therein, a discontinuous phase of particles or droplets.
  • Said immunoglobulin (Ig) composition hyper-enriched with anti-RSV immunoglobulins may be administered by the pulmonary route using a dispenser, preferably using an inhaler device such as: a powder inhaler, a pressurized metered dose inhaler, a nebulizer or any other device known in the pharmaceutical literature that makes it possible to inhale a composition.
  • an inhaler device such as: a powder inhaler, a pressurized metered dose inhaler, a nebulizer or any other device known in the pharmaceutical literature that makes it possible to inhale a composition.
  • the composition is in the form of a micronized dry powder, which is inhaled by the subject with the aid of a deep inspiration.
  • said composition may be in the form of a micronized powder suspended in a gas or in the form of a solution dispersed in a gas.
  • the aerosol dispenser aerosolizes said composition in suspension or in solution by means of a propellant (such as a hydrofluoroalkane).
  • the metered dose inhaler is advantageously in the form of a mouth spray.
  • said composition is administered by inhalation of an aerosol, preferably by means of an oral spray.
  • a nebulizer is defined herein as a device capable of aerosolising a liquid material in a dispersed liquid phase. More particularly, the nebulizer makes it possible to transform said liquid composition into "mist" with the aid of a pressurized gas or an air compressor.
  • the nebulizer allows the administration of said composition by means of a mask or tip disposed on the mouth and / or the nose of the subject.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention are administered using a nebulizer chosen from the following group: a jet nebulizer, an ultrasound nebulizer and a sieve nebulizer.
  • said composition is administered by nebulization, in particular by means of a sieve nebulizer.
  • the duration of nebulization is adapted according to the subject.
  • the duration of nebulization will be a maximum of 20 minutes for an adult subject and a maximum of 10 minutes for a child.
  • the administration device allows the administration of said composition in aerosol form.
  • the delivery device is a nebulizer or a pressurized metered dose inhaler for spraying said composition in aerosol form.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may be in the form of unit doses (the device allows only one administration) or multidose (the device allows multiple administrations).
  • the pharmaceutical compositions are advantageously in the form of unit doses.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may be administered by the pulmonary route with a delivery volume of between 250 ⁇ l and 12 ml, preferably between 250 ⁇ l and 10 ml.
  • administration volume is meant the volume of said composition administered, dose or dose.
  • said dose or dose has a suitable administration volume so that the anti-RSV immunoglobulins bind to RSV in the lower respiratory tract, preferably in the lungs.
  • the administration volume is sufficient to allow the diffusion of said composition in the lower respiratory tract, preferably in the lungs.
  • said composition is intended to be administered nasally to reach the lower respiratory tract.
  • nasal administration is understood to mean any administration, release and / or application of the composition in the upper respiratory tract via the nasal cavity of a subject.
  • upper respiratory tract or “upper airway” is meant any duct or extra-thoracic cavity in contact with the air such as the nose, mouth, nasal cavity, pharynx or larynx.
  • nasal administration may allow the composition to reach and / or enter the lower respiratory tract.
  • the nasal administration allows the composition to reach and / or penetrate the lungs.
  • the administration of the composition through the nasal route is adapted so that the anti-RSV immunoglobulins bind to RSV in the lower respiratory tract, preferably in the lungs.
  • the nasal administration makes it possible to preventatively and / or curatively treat a pulmonary infection caused by the RSV virus.
  • the composition is administered nasally, in the form of an aerosol.
  • the immunoglobulin (Ig) composition hyper-enriched with anti-RSV immunoglobulins is administered nasally with a delivery volume of less than 20 ml, preferably less than 15 ml, more preferably between 2 ml and 8 ml. The dosage may be adjusted appropriately to achieve the desired levels of immunoglobulins in the lungs.
  • said hyper-enriched Ig anti-RSV immunoglobulin composition is administered once a day. In another particular embodiment of the invention, said hyper-enriched Ig anti-RSV immunoglobulin composition is administered once a week.
  • the sample used is a plasma fraction resulting from the immunoglobulin purification process as described in the patent application WO02092632.
  • the purification process comprises the following steps:
  • the eluate of the basic pH anion exchange chromatography is then subjected to immunoaffinity chromatography as described below.
  • the RSV-F 11049-V08B protein (Sino Biological Inc), a synthetic protein derived from an HRSV (RSS-2) DNA sequence from Met 1 to Thr 529, containing 518 amino acids, was used as an affinity ligand. cleavage of the propeptide and whose predicted molecular mass is 58 kDa. In SDS-PAGE analysis and reduction conditions, the apparent molecular weights are 45-55 kDa and 18 kDa.
  • the RSV-F 11049-V08B ligand used for grafting is in post-fusion conformation.
  • the coupled gel is washed with an alternation of 3 volumes of basic and then acidic buffers: 0.1M Tris-HCl pH 8.4 and 0.1M acetate, 0.5M NaCl pH 4, this cycle being repeated three times.
  • the gel is then stored in lOmM citrate buffer, 0.5M NaCl, O.Ig / L sodium azide pH 6.6
  • the coupling was evaluated at 98%, corresponding to a ligand density of 0.89 mg / ml of grafted gel.
  • the sample is equilibrated in the injection buffer by adding a concentrated solution of NaCl buffer and trisodium citrate qs 0.05M NaCl and 0.01M trisodium citrate.
  • the product is then passed over the column during 3.3min (contact time).
  • the elution is carried out in 0.1M glycine buffer, 30% propylene glycol at pH 2.57.
  • the eluate is immediately neutralized with 1M Tris-HCl pH 9 buffer to raise the pH to about 6.
  • the gel is then regenerated in order to remove the non-eluted Ig with a 6M guanidine buffer pH 6.
  • the fraction recovered is also neutralized by the addition of 1M Tris-HCl pH9 to raise the pH to 6.
  • the RSV-G strain A protein (ref 11070-V08H2, SB), a synthetic protein derived from a DNA sequence of hRSV (strain rsbl734) from Asn 66 to Arg 297, containing 242 amino acids after cleavage of the propeptide and with a predicted molecular weight of 26.3 kDa.
  • the apparent molecular weight is included because of a high glycosylation between 60 kDa and 90 kDa.
  • strain B (ref 13029-VO8H, SB), a synthetic protein derived from a hRSV DNA sequence (strain 036633-1) from His 67 to Ala 299, containing 244 amino acids after cleavage of the propeptide and whose mass predicted molecular is 27kDa.
  • strain 036633-1 a synthetic protein derived from a hRSV DNA sequence from His 67 to Ala 299, containing 244 amino acids after cleavage of the propeptide and whose mass predicted molecular is 27kDa.
  • the apparent molecular weight is included because of a high glycosylation between 80 kDa and 90 kDa.
  • the coupling is performed according to the same protocol as that used in section 1.
  • gel G-A corresponding to a density of Protein G strain A of 1 mg / ml of grafted gel
  • gel GB corresponding to a density of Protein G strain B of 1 mg / ml of grafted gel
  • G-AB gel corresponding to a mixture of 50% GA gel and 50%> GB gel.
  • the design of the experiment also revealed that the anti-RSV IgG purified on the variant A of the G protein also interacted with the variant B of the G protein and vice versa (anti-varB on variantA), suggesting that there is cross-reactivity between the anti-RSV polyclonal antibodies for both variants of the G protein.
  • a high proportion of the anti-RSV immunoglobulins bind to the hRSV-G affinity chromatography support, irrespective of the strain, which represents in this test at least 6 ⁇ g of anti-RSV immunoglobulin per ml of gel. .
  • the unadsorbed fraction and the wash fraction are depleted of anti-RSV immunoglobulins.
  • Fraction immunoglobulin eluted from the acidic pH support and in the presence of propylene glycol shows a minimum enrichment of 109 times in anti-RSV immunoglobulins.
  • the assay shows that affinity chromatography using a G protein ligand of A or B strains grafted via NHS chemistry allows the purification of anti-RSV immunoglobulins with a yield of at least 26.2% under the conditions tested, corresponding to a minimum enrichment factor of 109 times.
  • composition obtained after affinity chromatography on G protein ligand therefore comprises at least 30% by weight of immunoglobulins specifically directed against at least one epitope of the G protein.
  • composition enriched in anti-RSV Ig as prepared in Example 1 above was tested as a prophylactic treatment against RSV virus.
  • the composition was administered to the site of interest (the lung) via the nasal route.
  • the study is conducted over 7 days (D1 to D5), with female BALB / c mice 8 weeks old and made susceptible to RSV virus. 1st stage: administration of the prophylactic treatment.
  • Placebo and the composition comprising nonspecific antibodies serve as negative controls.
  • mice The study was performed on 2 groups of 16 mice (4 mice / condition / group).
  • the RSV virus infection was carried out after anesthesia of animals on day 10, by intranasal administration of a solution comprising RSV virus genetically modified to express luciferase.
  • luciferase When put in the presence of its substrate D-luciferin, luciferase can detect the virus by bioluminescence reaction and thus monitor in real time replication of RSV virus in mice. 3rd step: Analysis of viral replication in mice
  • mice The viral replication is analyzed (in the second group of mice) by an in vivo imaging system (IVIS) based on the detection of bioluminescence. Mice were previously anesthetized and D-luciferin administered intranasally just before reading. Results
  • control mice 5 days after RSV infection, control mice (either placebo or nonspecific Ig) showed significant viral replication in the lungs. Conversely, the viral replication is considerably reduced, or even suppressed (luminescent signal extinguished) in the lungs of the mice which have received, by prevention, by administration to the lung via the nasal route, the composition enriched with anti-RSV Ig. This effect is observed in the mice tested (FIG. 1), regardless of the dose (1 mg / kg or 0.1 mg / kg). These results suggest a protection of the lungs against the RSV virus in the mice which have received the anti-RSV Ig-enriched composition by administration to the lung via the nasal route.
  • Viral RNA was quantified by RT-qPCR (quantification of N nucleocapsid gene expression), 4 days after RSV infection.
  • the quantification results of the viral RNA (FIG. 3) are perfectly consistent with the results of the quantification of the luciferase activity.
  • composition enriched in anti-RSV Ig as prepared in Example 1 above was administered by nebulization in the macaque.
  • composition enriched in anti-RSV Ig is labeled with a radioactive tracer (2 x 40 ⁇ g anti-RSV Ig (each 40 ⁇ g in a final volume of 1 ml) of composition labeled with MBq of Tc99m).
  • composition is then administered by nebulization to the animal using a mask, using the Aerogen® Solo device (Aerogen®, Ireland). 2nd step: pulmonary deposition analysis
  • Pulmonary deposition is determined by scintigraphic imaging of the lung using an ECAM gamma camera (Siemens, Germany).
  • Bronchoalveolar lavage is also performed after scintigraphy at 30 min to measure the biological activity of the anti-RSV immunoglobulin.
  • the lung of the animal is washed twice with a final volume of 10 ml / kg pre-heated PBS IX at 37 ° C. The 2 washes are then grouped into a single vial for analysis.
  • nebulized anti-RSV Ig particles The size of nebulized anti-RSV Ig particles is measured to verify the possible impact of radioactive tracing:
  • nebulized anti-RSV Ig enriched immunoglobulin immunoglobulin composition was carried out with the nebulized anti-RSV Ig enriched immunoglobulin immunoglobulin composition, using the same non-nebulized composition as a control.
  • the results confirm that nebulized anti-RSV Ig enriched immunoglobulin composition retains its neutralization capacity after nebulization (with IC50 values between 11 and 49 ng / mL, for a non-nebulized control at 32 ng / ml). mL).
  • the results thus show that the immunoglobulin composition enriched in anti-RSV Ig can be nebulized in the form of particles or droplets of a size smaller than 5 ⁇ m and in the form of particles or droplets of a size less than ⁇ . while maintaining its neutralizing activity.
  • the results confirm that immunoglobulins enriched with anti-RSV Ig, despite their size of 150 kDa, can be administered by nebulization in the lower respiratory tract, and in particular the lung (target organ), in the form of particles or droplets smaller than 5 ⁇ and in the form of particles or droplets smaller than ⁇ and retain their neutralizing activity.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'une composition d'immunoglobulines (Ig) hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV dans le traitement prophylactique ou curatif d'une infection par le virus RSV chez un sujet, par administration de la composition sous une forme adaptée pour que les immunoglobulines anti-RSV neutralisent le virus au niveau des poumons.

Description

Traitement d'une infection par le virus respiratoire syncytial
La présente invention concerne l'utilisation d'une composition d'immunoglobulines (Ig) hyper- enrichie en immunoglobulines anti-virus respiratoire syncytial (RSV) dans le traitement prophylactique ou curatif d'une infection par le virus RSV chez un sujet, par administration de la composition sous une forme adaptée pour que les immunoglobulines anti-RSV se lient au RSV au niveau des voies respiratoires inférieures, de préférence au niveau des poumons.
ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION
Le virus respiratoire syncytial (RSV) est un agent infectieux répandu des voies respiratoires. Le RSV provoque généralement une infection bénigne, asymptomatique ou avec des symptômes faibles (rhume) chez les personnes immunocompétentes, mais qui peut être responsable de plusieurs épisodes infectieux par an sur un même individu, pouvant être à l'origine d'absentéisme scolaire ou au travail.
De plus, ce virus est un facteur important d'infections dans les hôpitaux chez les patients immunodéprimés, en attente ou en sortie de greffe, chez les nourrissons ou jeunes enfants ou chez les personnes âgées. Le RSV est la plus importante cause de bronchiolites et de pneumonies chez les nourrissons et les jeunes enfants, et est largement responsable d'infections respiratoires dans les établissements pour personnes âgées.
Actuellement, il n'existe pas de vaccin efficace disponible pour prévenir l'infection par le RSV. Bien que des médicaments anti-viraux soient proposés pour traiter les infections à RSV, leur efficacité est discutable, surtout chez les enfants.
Il existe donc toujours un besoin en traitement préventif et curatif capable de neutraliser le virus respiratoire syncytial (RSV) et ainsi prévenir ou traiter une infection par le RSV.
RESUME DE L'INVENTION
L'invention vise à faire agir localement au niveau des poumons, et de manière ciblée, une composition d'immunoglobulines (Ig) hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV.
La présente invention concerne une composition d'immunoglobulines (Ig) hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV, pour son utilisation dans le traitement prophylactique ou curatif d'une infection par le virus RSV chez un sujet, par administration de la composition sous une forme adaptée pour que les immunoglobulines anti-RSV se lient au RSV au niveau des voies respiratoires inférieures. De préférence, les voies respiratoires inférieures sont les poumons. La composition selon l'invention est destinée à être administrée sous forme de particules ou de gouttelettes d'une taille comprise entre 0,025 μιη et 10 μιη, de préférence entre 0,5 μιη et 5 μιη et préférentiellement entre 1 μιη et 3 μιη.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV peut comprendre en outre un agent tensio-actif. Selon un mode de réalisation particulier, ladite composition peut comprendre en outre un agent modifiant la viscosité.
Selon un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend une concentration d'immunoglobulines anti-RSV comprise entre 10 et 250 g/1, de préférence entre 10 et 100 g/1.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition utile selon l'invention est destinée à être administrée par voie pulmonaire. Notamment, la composition selon l'invention peut être administrée par voie pulmonaire par inhalation d'un aérosol, de préférence au moyen d'un spray buccal ou par nébulisation au moyen d'un nébuliseur, en particulier un nébuliseur à tamis. Ladite composition peut être administrée par voie pulmonaire avec un volume d'administration compris entre 250 μΐ et 12 ml, de préférence entre 250 μΐ et 10 ml.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition utile selon l'invention est destinée à être administrée par voie nasale. Notamment, la composition selon l'invention peut être administrée par voie nasale sous la forme d'un aérosol. Ladite composition peut être administrée par voie nasale avec un volume d'administration inférieur à 20 ml, de préférence inférieur à 15 ml, plus préférentiellement compris entre 2 ml et 8 ml.
Avantageusement, la composition est utilisée dans le traitement prophylactique ou curatif d'une infection par le virus RSV chez un sujet, le sujet pouvant appartenir à au moins un des groupes suivants : les enfants, les nourrissons, les personnes immunodéprimées notamment les personnes traitées pour une greffe en particulier une greffe de poumon, les nourrissons prématurés et les enfants ou personnes âgées atteints d'une maladie pulmonaire en particulier une broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO), cardiaque ou immunitaire. LEGENDE DES FIGURES
Figure 1. Analyse de la réplication virale par imagerie in vivo : administration préventive de la composition enrichie en Ig anti-RSV dans les poumons par voie intranasale. Etude par imagerie in vivo de la réplication virale 5 jours après une infection au virus RSV chez des souris ayant reçu préventivement, par voie intranasale : un placebo ; une composition comprenant des Ig non spécifiques (contrôle négatif, « anticorps irrelevant ») ; une composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de 1 mg/kg (= LFB 1) ; une composition enrichie en Ig anti- RSV à une dose de 0,1 mg/kg (= LFB 0,1). L'histogramme représente les moyennes des résultats obtenus pour chaque condition expérimentale. Les résultats ont été obtenus à partir de 3 souris pour la condition placebo et de 4 souris pour chacune des autres conditions expérimentales. Figure 2. Quantification de la réplication virale (par quantification de l'activité luciférase sur lysats pulmonaires), 4 jours après infection au RSV. La réplication virale est analysée via une quantification de l'activité luciférase dans des lysats pulmonaires de souris ayant reçu préventivement, dans les poumons par voie intranasale : un placebo ; une composition comprenant des Ig non spécifiques (« anticorps irrelevant »); une composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de 1 mg/kg (= LFB 1) ; une composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de 0,1 mg/kg (= LFB 0,1). L'histogramme représente les moyennes des résultats obtenus pour chaque condition expérimentale. Les résultats ont été obtenus à partir de 3 souris pour la condition placebo et de 4 souris pour chacune des autres conditions expérimentales. Figure 3. Quantification de la réplication virale (par RT-Q-PCR), 5 jours après infection au RSV. L'expression du gène de nucléocapside N du virus RSV est quantifiée par RT-qPCR à partir de lysats pulmonaires de souris ayant reçu préventivement, dans les poumons par voie intranasale : un placebo ; une composition comprenant des Ig non spécifiques (« anticorps irrelevant »); une composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de 1 mg/kg (= LFB 1); une composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de 0,1 mg/kg (= LFB 0,1). L'histogramme représente les moyennes des résultats obtenus pour chaque condition expérimentale. Les résultats ont été obtenus à partir de 3 souris pour la condition placebo et de 4 souris pour chacune des autres conditions expérimentales. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Traitement
Il est ici décrit une méthode de traitement prophylactique ou curatif d'une infection par le virus respiratoire syncytial (RSV) chez un sujet, ladite méthode comprenant l'administration d'une composition d'immunoglobulines (Ig) hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV sous une forme adaptée pour que les immunoglobulines anti-RSV se lient au RSV au niveau des voies respiratoires inférieures, de préférence au niveau des poumons.
Le sujet peut être tout mammifère, de préférence un être humain, quel que soit son âge ou son sexe. Il peut s'agir notamment d'un sujet à risque vis à vis d'une infection par le virus RSV, par exemple les enfants, les nourrissons, ou une personne immunodéprimée, notamment chez les nourrissons prématurés et les enfants ou personnes âgées atteints d'une maladie pulmonaire, cardiaque ou immunitaire. De préférence, le sujet, s'il est infecté, est asymptomatique, c'est-à- dire qu'il n'a pas encore développé de symptômes associés à l'infection.
En particulier, le sujet appartient à au moins un des groupes suivants : les enfants, les nourrissons, les personnes immunodéprimées notamment les personnes traitées pour une greffe en particulier une greffe de poumon, les nourrissons prématurés et les enfants ou personnes âgées atteints d'une maladie pulmonaire en particulier une broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO), cardiaque ou immunitaire. Le terme « traitement prophylactique » se réfère à la prévention ou l'arrêt du développement de l'infection, avant que celle-ci n'atteigne les voies respiratoires inférieures, et provoque une inflammation des poumons. Il prévient ainsi l'apparition des symptômes, à savoir congestion ou écoulement nasal, mais surtout inflammation pulmonaire, notamment chez les nourrissons prématurés et les enfants atteints d'une maladie pulmonaire, cardiaque ou immunitaire.
Le terme « traitement curatif » se réfère à une disparition ou une diminution de l'infection liée au RSV au niveau des voies respiratoires inférieures et/ou à une disparition ou une atténuation d'un ou des symptômes, à savoir congestion ou écoulement nasal, mais surtout inflammation pulmonaire, notamment chez les nourrissons prématurés et les enfants atteints d'une maladie pulmonaire, cardiaque ou immunitaire. Composition d'Ig hyper-enrichie en Ig anti-RSV
La composition d'immunoglobulmes utile selon l'invention est une composition d'immunoglobulmes hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV qui présente une action neutralisante vis-à-vis du RSV et présente une efficacité thérapeutique pour le patient. Plus particulièrement, la composition est hyper-enrichie en immunoglobulines dirigées de manière spécifique contre le virus RSV. Le terme « spécifique » signifie que les immunoglobulines reconnaissent et se lient à un immunogène dudit virus, substantiellement sans réaction croisée avec un autre virus. Dans l'ensemble de la description, les termes « Ig », « immunoglobulines » et « anticorps » peuvent être interchangeables.
La composition d'immunoglobulmes comprend des anticorps qui se lient à un même immunogène viral (on parle alors de population monovalente d'anticorps), ou à plusieurs immunogènes différents du RSV (on pourra alors parler de population polyvalente d'anticorps). Essentiellement, il s'agit d'anticorps polyclonaux.
Ladite composition d'immunoglobulmes contient essentiellement des immunoglobulines humaines polyvalentes qui peuvent être des immunoglobulines A (IgA), des immunoglobulines E (IgE), des immunoglobulines M (IgM) ou des immunoglobulines G (IgG). Avantageusement, la composition d'immunoglobulmes contient essentiellement des IgG et/ou des IgM et/ou des IgA.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition d'immunoglobulmes comprend essentiellement des IgG, quelle que soit leur sous-classe (IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4).
De préférence, la composition est adaptée à une administration locale et contient de préférence essentiellement des IgG et/ou des IgA, les IgA permettant le recrutement de cellules telles que des cellules mucosales présentant des alfa récepteurs.
Par « composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV» on entend une composition d'immunoglobulmes comprenant au moins 10%, au moins 20%>, au moins 30%>, au moins 40%>, au moins 50%>, au moins 60%>, au moins 65%, au moins 70%, au moins75%, au moins 80% ; au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%>, au moins 99% en poids d'immunoglobulmes neutralisantes vis-à-vis du RSV. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le concentré d'immunoglobulmes hyper- enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 10% en poids d'immunoglobulmes polyvalentes capables de reconnaître et/ou de neutraliser le virus RSV ou l'une de ses parties. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le concentré d'immunoglobulmes hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 30% en poids d'immunoglobulines polyvalentes capables de reconnaître et/ou de neutraliser le virus RSV ou l'une de ses parties. Dans encore un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le concentré d'immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 60% en poids d'immunoglobulines polyvalentes capables de reconnaître et/ou de neutraliser le virus RSV ou l'une de ses parties.
Les immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le RSV peuvent se lier à l'une quelconque des protéines du virus, de préférence une protéine de surface, jouant un rôle dans les mécanismes d'infection, notamment au cours de la reconnaissance, de la liaison de la particule virale à sa cellule-hôte, de la fusion de la particule virale à sa cellule-hôte et de la propagation du virus de cellules hôte à cellule hôte. On peut citer notamment la protéine SH, la protéine G ou la protéine F du RSV.
La composition est généralement concentrée. En particulier, la composition peut comprendre une concentration d'immunoglobulines anti-RSV comprise entre 10 et 250 g/1, de préférence entre 10 et 100 g/1.
Méthodes de préparation de la composition d'Ig hyper-enrichie en Ig anti-RSV
Plusieurs méthodes de préparation de la composition d'Ig hyper-enrichie en Ig anti-RSV sont possibles. Préférentiellement, on utilise une méthode de préparation d'immunoglobulines à partir de pools de plasma, avantageusement de plasma humain. Une telle méthode implique des opérations de concentration des préparations plasmatiques, typiquement d'un facteur 100 à 1000.
Selon un mode particulier de réalisation, des préparations d'immunoglobulines issues de plasma ou de fractions de plasma sanguin sont soumises à une chromatographie d'affinité utilisant une protéine virale comme ligand d'affinité, pour obtenir une préparation d'immunoglobulines hyper-enrichies en immunoglobulines capables de reconnaître, et avantageusement de neutraliser, ledit RSV. Cette méthode met en œuvre des supports de chromatographie d'affinité sur lesquels sont greffés une ou plusieurs protéines virales du RSV, ou des fragments antigéniques de ceux-ci. Parmi les protéines virales utiles comme ligands, on peut citer par exemple les protéines de l'enveloppe : la protéine SH, la protéine G (glycoprotéine transmembranaire hautement glycosylée responsable de la liaison à la cellule hôte), la protéine F (glycoprotéine transmembranaire responsable de la fusion à la membrane hôte, de l'entrée du virus dans la cellule et de la formation des syncitia). La chromatographie utilise une matrice comprenant un support à base de particules de polymère, et est de préférence sous forme d'un gel ou d'une résine. Ces particules de polymère sont de préférence de forme sphérique ou oblongue, il peut s'agir notamment de billes. Le polymère peut être naturel ou non-naturel, organique ou inorganique, réticulé ou non réticulé. Le polymère est de préférence un polymère organique, de préférence réticulé. Dans un mode de réalisation préféré, le polymère est de la cellulose, et les particules sont de préférence des billes de cellulose poreuses. D'autres types de polymères possibles incluent agarose, dextran, polyacrylates, polystyrène, polyacrylamide, polyméthacrylamide, des copolymères de styrène et divinylbenzène, ou des mélanges de ces polymères. Les particules peuvent fournir un milieu de chromatographie que l'on peut utiliser pour remplir une colonne par exemple.
Sur le support est greffé une protéine virale du RSV, ou un fragment antigénique de celle-ci, soit directement, soit via un espaceur, qui lie de manière covalente le ligand aux particules du support chromatographique. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la protéine greffée sur le support est une protéine de surface du RSV, par exemple la protéine F du RSV ou la protéine G du RSV, ou un fragment antigénique de celles-ci, soit directement, soit via un espaceur, qui lie de manière covalente le ligand aux particules du support chromatographique. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le support greffé présente plusieurs protéines différentes et/ou plusieurs fragments antigéniques différents appartenant au RSV, afin d'obtenir un concentré d'immunoglobulines présentant différentes cibles antigéniques. Une particule peut porter plusieurs espaceurs. La liaison entre le ligand et l'espaceur peut être, par exemple, une liaison amide.
La matrice sous forme de gel est préparée par addition classique d'un tampon sur les particules de polymère portant les ligands, comme cela est connu de l'homme du métier, de manière à obtenir une matrice sous forme de gel, adaptée pour une chromatographie d'affinité. La matrice telle que définie ici est utile dans une chromatographie d'affinité liant des immunoglobulines. La matrice est particulièrement utile dans une chromatographie d'affinité à lit mélangé. Une telle matrice comprend avantageusement plusieurs antigènes différents spécifiques du RSV et est donc capable de lier des immunoglobulines dirigées contre plusieurs épitopes différents du RSV. Les immunoglobulines anti-RSV présentes dans le plasma ou la fraction plasmatique se fixent à la matrice, et le produit adsorbé est élué et récupéré, enrichi en immunoglobulines anti- RSV. De manière avantageuse, les conditions de mise en œuvre de la chromatographie d'affinité sont adaptées par l'homme du métier pour garantir la réutilisation de la matrice tout en maintenant des conditions d'élution non dégradantes pour le produit d'intérêt. Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement consiste en du plasma provenant de plasmas sanguins ou de pools de plasmas sanguins de sujets mammifères (humains ou non humains) ou en une fraction de ce plasma, soit toute partie ou sous-partie du plasma, ayant fait l'objet d'une ou plusieurs étapes de purification. Dans un mode de réalisation particulier, le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement consistent avantageusement en du plasma provenant de pools de plasmas sanguins de sujets humains normaux ou en une fraction de ce plasma, soit toute partie ou sous- partie du plasma, ayant fait l'objet d'une ou plusieurs étapes de purification. Les fractions plasmatiques utilisables incluent ainsi le surnageant de plasma cryoprécipité, le cryoprécipité de plasma (remis en suspension), les fractions I à V obtenues par fractionnement éthanolique (selon la méthode de Cohn ou de Kistler & Nitschmann), le surnageant et le précipité obtenus après précipitation à l'acide caprylique et/ou caprylate, les éluats de chromatographies et les fractions non adsorbées des colonnes de chromatographie, et les filtrats.
De manière particulièrement avantageuse, le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement proviennent de pools de plasmas sanguins de sujets humains normaux, sans sélection préalable des donneurs, en particulier, sans sélection des donneurs sur la base de leur éventuel taux plasmatique en immunoglobulines anti-RSV. Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement comporte ainsi avantageusement un taux d'immunoglobulines anti-RSV similaire ou égal au taux d'immunoglobulines anti-RSV d'un plasma issu du pool d'au moins 1000 donneurs humains normaux aléatoirement choisis. Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement est avantageusement non enrichi en immunoglobulines anti-RSV d'intérêt comparé au taux d'immunoglobulines anti-RSV d'un plasma issu du pool d'au moins 1000 donneurs choisis de manière aléatoire.
Dans un mode de réalisation supplémentaire, le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement consistent en du plasma provenant de plasmas sanguins ou de pools de plasmas sanguins de sujets mammifères non humains, mâles et/ou femelles, avantageusement de chèvre, brebis, bouc, bison, buffle, chameau, lama, souris, rat, vache, taureau, cochon, truie, lapin(e), cheval, jument. Le mammifère non humain est avantageusement transgénique et a été préalablement exposé au virus RSV afin de produire dans son plasma des immunoglobulines humaines anti-RSV.
Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement contient des immunoglobulines humaines polyvalentes qui peuvent être des immunoglobulines A (IgA), des immunoglobulines E (IgE), des immunoglobulines M (IgM) ou des immunoglobulines G (IgG). Avantageusement, le plasma ou la fraction plasmatique de départ contient essentiellement des IgG quelle que soit leur sous-classe (IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4) et/ou des IgA.
Le procédé peut typiquement être un procédé indépendant, dédié à la purification d'immunoglobulines anti-RSV, et est alors avantageusement effectué à partir de plasma ou d'une fraction plasmatique.
Dans ce mode de réalisation, le procédé comprend avantageusement les étapes suivantes : fourniture d'un échantillon de plasma ou d'une fraction plasmatique,
passage de l'échantillon de plasma ou d'une fraction plasmatique sur une chromatographie d'immunoaffînité sur la matrice décrite ici,
récupération de la fraction adsorbée sur la matrice correspondant à la composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV.
De manière avantageuse, le procédé peut comprendre en outre, après l'étape de capture sur chromatographie d'affinité anti-RSV, une étape dédiée de déplétion de certaines immunoglobulines, en particulier les immunoglobulines E (IgE) et/ou immunoglobulines (IgM), qui peuvent être impliquées dans des mécanismes d'effets secondaires délétères chez les patients.
Le procédé comprend avantageusement en outre une étape consistant à soumettre la composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV à au moins une étape d'inactivation et/ou d'élimination virale.
Dans encore un autre mode de réalisation particulier, le procédé d'obtention des immunoglobulines anti-RSV est couplé à un procédé d'immunoglobulines G polyvalentes afin d'obtenir, à partir d'un même pool de plasma de départ, à la fois un concentré d'immunoglobulines G polyvalentes et un concentré d'immunoglobulines hyper-enrichies en anti-RSV.
Le procédé comprend alors typiquement une étape préalable d'obtention de la fraction plasmatique, par fractionnement éthanolique et/ou fractionnement caprylique et/ou séparation chromatographique.
Dans ce mode de réalisation, le procédé comprend avantageusement les étapes suivantes : fourniture d'un échantillon d'une fraction plasmatique prépurifiée obtenue par fractionnement éthanolique et/ou fractionnement caprylique et/ou séparation chromatographique
passage de la fraction plasmatique prépurifiée sur une chromatographie d'immunoaffînité sur la matrice décrite ici, récupération de la fraction adsorbée sur la matrice correspondant à la composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV.
Par « séparation chromatographique », on entend toute étape de chromatographie, qu'il s'agisse de chromatographie échangeuse d'ions (échangeuse d'anions et/ou échangeuse de cations), mixed mode, affinité (utilisant des ligands de type chimiques, anticorps, fragments d'anticorps, aptamères). Par séparation chromatographique, on entend aussi bien une seule et unique colonne de chromatographie, ou un ensemble de colonnes de chromatographie, utilisant ou non le même type de support, en série (mode multicolonnes par exemple) ou en parallèle.
Plus précisément, la fraction plasmatique peut être obtenue par un fractionnement éthanolique développé à l'origine par Cohn et al (Cohn et al, 1946. J. Am. Chem. Soc. 68, 459 ; Oncley et al, 1949, J. Am. Chem. Soc. 71, 541), ou bien par une séparation chromatographique, telle que décrite par exemple dans EP 0 703 922 et WO 99/64462, ou encore par un fractionnement caprylique tel que décrit par Steinbuch et al 1969, Arch Biochem Biophys. 134(2):279-84). On préfère tout particulièrement les procédés mis au point par la Demanderesse dans les demandes de brevet WO 94/29334 et WO 02/092632, et tout particulièrement celui décrit dans WO 02/092632. Dans ce cas, on soumet un plasma sanguin, ou une fraction de plasma sanguin enrichie en Ig, à un fractionnement caprylique (prépurification par précipitation de contaminants non immunoglobulines), et une chromatographie unique sur un support de résine échangeuse d'anions effectuée à pH alcalin. Un traitement d'inactivation virale peut être réalisé, de préférence effectué par solvant-détergent, comme décrit par Horowitz dans le brevet US 4 764 369, éventuellement complété par une étape d'élimination virale par nanofiltration sur filtre de taille de pores 75N, 35N, 20N et/ou 15N.
La fraction d'Ig ainsi récoltée est déjà concentrée, mais peut ensuite subir des étapes de concentration supplémentaire par ultrafîltration, et de fîltration stérilisante.
Ce concentré est ensuite soumis à une étape chromatographique d'immunoaffinité sur la matrice telle que décrite plus haut.
De manière avantageuse, le procédé peut comprendre en outre, de préférence après l'étape de capture sur chromatographie d'affinité anti- virus, une étape dédiée de déplétion de certaines immunoglobulines, en particulier les immunoglobulines A (IgA), et/ou immunoglobulines E (IgE) et/ou immunoglobulines M (IgM), qui peuvent être impliquées dans des mécanismes d'effets secondaires délétères chez les patients. Les immunoglobulines à dépléter sont avantageusement sélectionnées en particulier selon la voie d'administration choisie pour le concentré d'immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-virus et/ou selon le contenu de l'échantillon de plasma ou de la fraction plasmatique de départ. Le procédé peut en outre comprendre les étapes ultérieures consistant à additionner un ou plusieurs stabilisants pharmaceutiquement acceptables; et éventuellement congeler ou lyophiliser le concentré ainsi obtenu. Formulation
Avantageusement, une composition d'immunoglobulines telle que décrite plus haut est sous la forme d'une composition pharmaceutique comprenant les immunoglobulines anti-RSV, en association avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Par excipient pharmaceutiquement acceptable, on entend des excipients qui ne sont pas nocifs ou toxiques vis-à-vis du tractus respiratoire et plus particulièrement de l'épithélium trachéo -bronchique. La formulation de la composition pharmaceutique utile selon l'invention est adaptée pour que les immunoglobulines anti-RSV se lient au RSV au niveau des voies respiratoires inférieures, de préférence au niveau des poumons.
Ainsi, la composition pharmaceutique peut être préparée selon les méthodes habituelles, en utilisant des excipients appropriés, de préférence adaptés à une administration permettant d'atteindre les voies respiratoires inférieures.
En particulier, des additifs peuvent être mis en œuvre dans la formulation, tels que
- des agents stabilisants comme l'albumine, et/ou
les antioxydants (tels que l'acide ascorbique, cystéine, alpha tocophérol, métbionme), et/ou
les sucres et glycols (tels que glucose, maltose, mannitol, sorbitol, glycérine, lactitol, stachyose, mannose, sorbose, xylose, ribose, ribitol, myoinisitose, myoinisitol, galactose, galactitol, glycérol, cyclitols (tels que Pinositol), et le PEG), et/ou des agents complexants (tels que l'édétate de sodium), et/ou
des conservateurs et/ou bactériostatiques (tels que l'éthanol anhydre, le chlorure de benzalkonium, l'alcool benzylique, le chlorobutanol, les parabènes, l'alcool phényléthylique, l'acide benzoïque, l'EDTA, le 2-pyrrolidone, et leurs dérivés), et/ou - des agents modifiant la viscosité (tels que le chlorure de calcium, le chlorure de magnésium, le chlorure de sodium, le biphosphate de sodium, la caféine, la théophylline, la tyramine, la procaïne, la lidocaïne, l'imidazole, l'aspartame, la saccharine, et l'acésulfame de potassium), et/ou
des agents influençant l'osmolarité (tels que le mannitol, l'arginine ou la glycine), et/ou des tensio-actifs tels que les surfactants non-ioniques, comme les polysorbates (polysorbate 80 ou polysorbate 20), les poloxamères (tels que le poloxamère 188, le PF68), le Triton™, le sodium dodecyl sulfate (SDS), le sodium octyl glycoside, la lauryl-sulfobétaïne, la myristyl-sulfobétaïne, la linoleyl-sulfobétaïne, la stearyl- sulfobétaïne, la lauryl-sarcosine, la myristyl-sarcosine, la linoleyl-sarcosine, la stearyl- sarcosine, la linoleyl-bétaïne, la myristyl-bétaïne, la cetyl-bétaïne, la lauroamidopropyl- bétaïne, la cocamidopropyl-bétaïne, la linoleamidopropyl-bétaïne, la myristamidopropyl-bétaïne, palmidopropyl-bétaïne, l'isostearamidopropyl-bétaïne (tels que le lauroamidopropyl), le myristarnidopropyl-, palmidopropyl-, ou isostearamidopropyl- dimethylamine, le sodium methyl cocoyl-, ou disodium methyl ofeyl-taurate, les composés phosphatés quaternaires (tels que les séries Monaquat™ de Mona Industries, Inc., Paterson, N. J.), le polyethyl glycol, le polypropyl glycol, et/ou des acides aminés ou leurs dérivés (tels que l'isoleucine, le chlorhydrate d'arginine et le chlorhydrate de lysine), et/ou
des inhibiteurs d'enzymes et/ou
des agents qui influencent le pH (tels que le tampon de citrate ou phosphate) et/ou des agents qui influencent la tonicité de la formulation (tel que le chlorure de sodium ou le glutamate d'arginine, les complexes métallo-protéiques, les polymères biodégradables (notamment les polyesters), les ions capables de former des sels (tels que le sodium), les sucres d'alcool polyhydriques, les acides aminés (tels que l'alanine, la glycine, la glutamine, l'asparagine, l'histidine, l'arginine, la lysine, l'ornithine, la leucine, la 2-phenylalanine, l'acide glutamique et la thréonine), les sucres organiques ou les sucres d'alcool (tels que le lactitol, le stachyose, le mannose, le sorbose, le xylose, le ribose, le ribitol, le myoinisitose, le myoinisitol, le galactose, le galactitol, le glycérol, les cyclitols dont l'inositol, le polyéthylène glycol), les agents réducteurs soufrés (tels que l'urée, la glutathione, l'acide thioctique, le thioglycolate de sodium, le thioglycerol, Γα-monothioglycerol et le sodium thiosulfate) et/ou
des cryoprotectants (tels que le sucrose ou le tréhalose)
En particulier, la composition selon l'invention peut comprendre un agent tensio-actif. On entend par « tensio-actif » une molécule amphiphile présentant deux parties de polarité différente, l'une lipophile et apolaire, l'autre hydrophile et polaire. Un tensio-actif peut être de type ionique (cationique ou anionique), zwitterionique ou non-ionique. L'agent tensio-actif peut avantageusement être choisi parmi les surfactants non-ioniques, comme les polysorbates (polysorbate 80 ou polysorbate 20), les poloxamères (par exemple le poloxamère 188, le PF68), le Triton™, le sodium dodecyl sulfate (SDS), le sodium octyl glycoside, la lauryl-sulfobétaïne, la myristyl-sulfobétaïne, la linoleyl-sulfobétaïne, la stearyl-sulfobétaïne, la lauryl-sarcosine, la myristyl-sarcosine, la linoleyl-sarcosine, la stearyl-sarcosine, la linoleyl-bétaïne, la myristyl- bétaïne, la cetyl-bétaïne, la lauroamidopropyl-bétaïne, la cocamidopropyl-bétaïne, la linoleamidopropyl-bétaïne, la myristamidopropyl-bétaïne, la palmidopropyl-bétaïne, la isostearamidopropyl-bétaïne (tels que le lauroamidopropyl), la myristarnidopropyl-, palmidopropyl-, ou isostearamidopropyl- dimethylamine, le sodium methyl cocoyl-, ou disodium methyl ofeyl-taurate, les composés phosphatés quaternaires (tels que les séries Monaquat™ de Mona Industries, Inc., Paterson, N. J.), le polyéthyl glycol, le polypropyl glycol.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention peut comprendre un agent modifiant la viscosité, la viscosité étant l'ensemble des phénomènes de résistance à l'écoulement se produisant dans la masse d'une matière. Par exemple, plus la viscosité diminue, plus le fluide s'écoule facilement. En particulier, l'agent modifiant la viscosité peut être un fluidifiant. L'agent modifiant la viscosité peut être avantageusement choisi parmi le chlorure de calcium, le chlorure de magnésium, le chlorure de sodium, le biphosphate de sodium, la caféine, la théophylline, la tyramine, la procaïne, la lidocaïne, Pimidazole, l'aspartame, la saccharine, et l'acésulfame de potassium.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition comprend des agents qui influencent le pH (tels que tampon de citrate ou phosphate).
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition comprend des agents qui influencent la tonicité de la formulation (tel que le chlorure de sodium ou le glutamate d'arginine, les complexes métallo-protéiques, les polymères biodégradables (notamment les polyesters), les ions capables de former des sels (tels que le sodium), les sucres d'alcool polyhydriques, les acides aminés (tels que l'alanine, la glycine, la glutamine, l'asparagine, l'histidine, l'arginine, la lysine, l'ornithine, la leucine, la 2-phenylalanine, l'acide glutamique et la thréonine), les sucres organiques ou les sucres d'alcool (tels que le lactitol, le stachyose, le mannose, le sorbose, le xylose, le ribose, le ribitol, le myoinisitose, le myoinisitol, le galactose, le galactitol, le glycerol, les cyclitols dont l'inositol, le polyethylene glycol), les agents réducteurs soufrés (tels que l'urée, la glutathione, l'acide thioctique, le thioglycolate de sodium, le thioglycerol, Γα-monothioglycerol et le sodium thiosulfate). Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition comprend des cryoprotectant (tels que le sucrose ou le tréhalose). Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition est sous forme d'une poudre pour inhalation qui contient en outre des adjuvants physio logiquement acceptables appropriés, par exemple choisis parmi les monosaccharides, les disaccharides, les oligo- et polysaccharides, les polyalcools, les sels ou des mélanges de ces adjuvants. Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition est dispersée dans un gaz propulseur sélectionné parmi des hydrocarbures, comme le n-propane, le n-butane ou l'isobutane ou des halogénohydrocarbures, comme des dérives fluorés du méthane, de l'éthane, du propane, du butane, du cyclopropane ou du cyclobutane. Par exemple, le gaz propulseur peut être du trichlorofiuorométhane, du dichlorodifiuorométhane, du chlorodifluorométhane ou du dichlorotétrafluoroéthane. Ces gaz propulseurs peuvent également jouer le rôle de solvant car ils sont liquéfiés avant d'être pulvérisés avec ladite composition.
Administration Ladite composition d'immunoglobulines (Ig) hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV telle que décrite précédemment est destinée à être administrée sous une forme adaptée pour que les immunoglobulines anti-RSV se lient au RSV au niveau des voies respiratoires inférieures, de préférence au niveau des poumons, en particulier au niveau de l'épithélium pulmonaire. La composition selon l'invention est administrée sous forme de particules ou de gouttelettes ayant une taille et une morphologie adaptées pour cibler les voies respiratoires inférieures, de préférence les poumons, et plus particulièrement l'épithélium pulmonaire. En particulier, la taille (également appelée diamètre aérodynamique médian en masse) des particules (solides) ou gouttelettes (liquides) est adaptée pour permettre le passage de celles-ci à travers les voies respiratoires jusqu'aux alvéoles pulmonaires. Notamment, la taille des particules ou gouttelettes est comprise entre 0,025 microns (25 nm) et 10 μιη, de préférence entre 0,5 μιη et 5 μιη et plus préférentiellement entre 1 μιη et 3 μιη. La taille des particules peut être mesurée par toute technique connue de l'homme du métier, notamment les techniques de diffraction laser. La taille des gouttelettes peut être mesurée par toute technique connue de l'homme du métier, notamment les techniques utilisant la diffraction laser et les techniques basées sur l'effet doppler. En particulier, l'homme du métier pourra effectuer ses mesures à l'aide d'un appareil mettant en œuvre la diffraction laser et notamment les modèles d'appareils Visisize D30, Visisize P15, Visisize N60 et Visisize S200 (Oxford Lasers Inc).
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition est destinée à être administrée par voie pulmonaire. On entend par administration par « voie pulmonaire » toute libération et/ou application de la composition dans les voies respiratoires inférieures, et de préférence dans les poumons, plus préférentiellement au niveau de l'épithélium pulmonaire, ces surfaces constituant un territoire majeur de l'infection par le virus du RSV et présentent donc un intérêt dans la prophylaxie et dans le traitement curatif d'une infection au RSV.
Par « voies respiratoires inférieures » ou « voies aériennes inférieures », on entend tout conduit ou cavité intra thoracique tel que la trachée, les bronches et les poumons (constitués des bronchioles et alvéoles). En particulier, l'administration permet à la composition d'atteindre et/ou pénétrer l'épithélium pulmonaire, caractérisé par une surface de 90000 cm2 développée au sein des alvéoles pulmonaires. De manière préférée, l'administration permet de traiter de manière préventive et/ou curative une infection pulmonaire causée par le virus RSV.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite composition est destinée à une inhalation.
Ladite composition d'immunoglobulines (Ig) hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV peut ainsi être administrée par voie pulmonaire sous forme de poudre, de solution, de suspension ou d'aérosol. De préférence, ladite composition est administrée sous forme d'aérosol comprenant des particules solides ou des gouttelettes liquides ayant une taille et une morphologie adaptées pour cibler les voies respiratoires inférieures, et de préférence les poumons. Un aérosol est défini ici comme la dispersion de particules solides ou de gouttelettes liquides très fines dans un gaz. En particulier, l'aérosol comprend une phase gazeuse continue et, dispersée dans celle-ci, une phase discontinue de particules ou de gouttelettes. Ladite composition d'immunoglobulines (Ig) hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV peut être administrée par voie pulmonaire à l'aide d'un distributeur, de préférence à l'aide d'un dispositif inhalateur tel que : un inhalateur à poudre, un inhalateur doseur pressurisé, un nébuliseur ou tout autre dispositif connu dans la littérature pharmaceutique qui permet d'inhaler une composition.
Dans le cas de l'inhalateur à poudre, la composition se présente sous la forme d'une poudre sèche micronisée, qui est inhalée par le sujet à l'aide d'une profonde inspiration. Dans le cas d'un inhalateur doseur pressurisé, ladite composition peut être sous la forme d'une poudre micronisée en suspension dans un gaz ou bien sous la forme d'une solution dispersée dans un gaz. Plus particulièrement, l'aérosol doseur permet d'aérosoliser ladite composition en suspension ou en solution au moyen d'un gaz propulseur (tel qu'un hydrofluoroalcane). L'aérosol doseur se présente avantageusement sous la forme d'un spray buccal.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, ladite composition est administrée par inhalation d'un aérosol, de préférence au moyen d'un spray buccal.
Un nébuliseur est défini ici comme un dispositif capable d'aérosoliser un matériau liquide dans une phase liquide dispersée. Plus particulièrement, le nébuliseur permet de transformer ladite composition liquide en « brume » à l'aide d'un gaz pressurisé ou d'un compresseur à air. Le nébuliseur permet l'administration de ladite composition au moyen d'un masque ou d'un embout disposé sur la bouche et/ou le nez du sujet. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont administrées à l'aide d'un nébuliseur choisi au sein du groupe suivant : un nébuliseur à jet, un nébuliseur à ultrason et un nébuliseur à tamis.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, ladite composition est administrée par nébulisation, en particulier au moyen d'un nébuliseur à tamis.
Dans le cas d'une administration réalisée à l'aide d'un nébuliseur la durée de nébulisation est adaptée en fonction du sujet. De préférence, la durée de nébulisation sera au maximum de 20 minutes pour un sujet adulte et d'au maximum 10 minutes pour un enfant. De préférence le dispositif d'administration permet l'administration de ladite composition sous forme d'aérosol. De préférence, le dispositif d'administration est un nébuliseur ou un inhalateur doseur pressurisé permettant la pulvérisation de ladite composition sous forme d'aérosol.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut se présenter sous forme de doses unitaires (le dispositif ne permet qu'une seule administration) ou de multidoses (le dispositif permet plusieurs administrations). Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les compositions pharmaceutiques se présentent avantageusement sous forme de doses unitaires.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut être administrée par voie pulmonaire avec un volume d'administration compris entre 250 μΐ et 12 ml, de préférence entre 250 μΐ et 10 ml.
Par « volume d'administration » on entend le volume de ladite composition administrée, par dose ou prise. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite dose ou prise possède un volume d'administration adapté pour que les immunoglobulines anti-RSV se lient au RSV au niveau des voies respiratoires inférieures, de préférence au niveau des poumons. De manière préférée, le volume d'administration est suffisant pour permettre la diffusion de ladite composition dans les voies respiratoires inférieures, de préférence dans les poumons.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition est destinée à être administrée par voie nasale pour atteindre les voies respiratoires inférieures. On entend par administration par « voie nasale » toute administration, libération et/ou application de la composition dans les voies respiratoires supérieures via la cavité nasale d'un sujet. Par « voies respiratoires supérieures » ou « voies aériennes supérieures », on entend tout conduit ou cavité extra thoracique en contact avec l'air tel que le nez, la bouche, les fosses nasales, le pharynx ou le larynx. En particulier, l'administration par voie nasale peut permettre à la composition d'atteindre et/ou pénétrer dans les voies respiratoires inférieures. De préférence, l'administration par voie nasale permet à la composition d'atteindre et/ou pénétrer dans les poumons. Avantageusement, l'administration de la composition par voie nasale est adaptée pour que les immunoglobulines anti-RSV se lient au RSV au niveau des voies respiratoires inférieures, de préférence au niveau des poumons. De manière préférée, l'administration par voie nasale permet de traiter de manière préventive et/ou curative une infection pulmonaire causée par le virus RSV.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition est administrée par voie nasale, sous forme d'un aérosol. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition d'immunoglobulines (Ig) hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV est administrée par voie nasale avec un volume d'administration inférieur à 20 ml, de préférence inférieur à 15 ml, plus préférentiellement compris entre 2 ml et 8 ml. La posologie peut être ajustée de manière appropriée pour atteindre les niveaux souhaités d'immunoglobulines au niveau des poumons.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV est administrée une fois par jour. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, ladite composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV est administrée une fois par semaine.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
EXEMPLES EXEMPLE 1 : Préparation d'une composition enrichie en Ig anti-RSV, à partir de fractions plasmatiques
Dans cet exemple, l'échantillon utilisé est une fraction plasmatique issue du procédé de purification d'immunoglobulines tel que décrit dans la demande de brevet WO02092632. Le procédé de purification comprend les étapes suivantes :
- Récupération d'une fraction I+II+III, obtenue à partir de plasma sanguin traité à l'éthanol Précipitation à l'acide caprylique
Traitement solvant-détergent (Triton/TnBP)
Chromatographie échangeuse d'anions (TMAE) à pH basique
L'éluat de la chromatographie échangeuse d'anions à pH basique est ensuite soumis à une chromatographie d'immunoaffînité, comme décrit ci-dessous.
1. Chromatographie d'affinité anti-RSV (protéine F)
On utilise comme ligand d'affinité la protéine RSV-F 11049-V08B (Sino Biological Inc), protéine synthétique issue d'une séquence ADN du hRSV (RSS-2) de la Met 1 à la Thr 529, contenant 518 acides aminés après clivage du propeptide et dont la ma masse moléculaire prédite est de 58kDa. En analyse SDS-PAGE et conditions de réduction, les masses moléculaires apparentes sont 45-55 kDa et 18 kDa. Le ligand RSV-F 11049-V08B utilisé pour le greffage est en conformation post-fusion.
2mL de gel NHS-activated sepharoseTM 4 Fast Flow sont mis en place dans une colonne de chromatographie de diamètre 1.1cm et les tampons utilisés sont ceux recommandés par le fournisseur du gel. Après lavage (ImM HCL à 4°C) et équilibrage en tampon de couplage, 1,98 mg de protéine F à greffer sont ajoutées au gel et l'ensemble est mis en agitation. Le blocage des groupements réactifs sur le gel est réalisé en ajoutant 6 mL de tampon 0.5M ethanolamine, 0.5M NaCl, pH 8.3 (6mL), et le gel est mis en agitation pendant 12h. Le gel couplé est lavé avec une alternance de 3 volumes de tampons basique puis acide : 0.1M Tris-HCl pH 8.4 et 0.1M acétate, 0.5M NaCl pH 4, ce cycle étant répété trois fois. Le gel est ensuite stocké en tampon lOmM citrate, 0.5M NaCl, O.lg/L azide de sodium pH 6.6
Le couplage a été évalué à 98%, correspondant à une densité de ligand de 0,89mg/mL de gel greffé. L'échantillon est équilibré dans le tampon d'injection en y ajoutant une solution concentrée de tampon de NaCl et de citrate trisodique qsp 0,05M NaCl et 0,01 M Citrate trisodique. Le produit est ensuite passé sur la colonne durant 3.3min (temps de contact). Après lavage, l'élution est réalisée en tampon 0,1M glycine, 30% propylène glycol à pH 2,57. L'éluat est immédiatement neutralisé par du tampon 1M Tris-HCl pH 9 pour en remonter le pH à environ 6. Le gel est alors passé en régénération afin de décrocher les Ig non éluées avec un tampon 6M guanidine pH 6. La fraction récupérée est aussi neutralisée par l'ajout de 1M Tris-HCl pH9 pour en remonter le pH à 6.
2. Chromatographie d'affinité anti-RSV (protéine G)
Alternativement, ou en complément, on utilise comme ligand d'affinité la protéine RSV-G souche A (ref 11070-V08H2, SB), protéine synthétique issue d'une séquence ADN du hRSV (souche rsbl734) de la Asn 66 à l'Arg 297, contenant 242 acides aminés après clivage du propeptide et dont la masse moléculaire prédite est de 26,3kDa. En analyse SDS-PAGE et conditions réductrice, la masse moléculaire apparente est comprise du fait d'une importante glycosylation entre 60 kDa et 90 kDa.
souche B (ref 13029-VO8H, SB), protéine synthétique issue d'une séquence ADN du hRSV (souche 036633-1) de l'His 67 à l'Ala 299, contenant 244 acides aminés après clivage du propeptide et dont la masse moléculaire prédite est de 27kDa. En analyse SDS-PAGE et conditions réductrice, la masse moléculaire apparente est comprise du fait d'une importante glycosylation entre 80 kDa et 90 kDa.
Le couplage est réalisé selon le même protocole que celui utilisé à la section 1.
Trois colonnes sont réalisées :
gel G- A, correspondant à une densité de Protéine G souche A de 1 mg/mL de gel greffé, gel G-B, correspondant à une densité de Protéine G souche B de 1 mg/mL de gel greffé, gel G-AB, correspondant à un mélange 50% gel G-A et 50%> gel G-B.
Le design de l'expérience a en outre permis de constater que les IgG anti-RSV purifiés sur le variant A de la protéine G interagissaient également avec le variant B de la protéine G et inversement (anti-varB sur variantA) laissant penser qu'il existe une réactivité croisée entre les anticorps polyclonaux anti-RSV pour les deux variants de la protéine G.
Une forte proportion des immunoglobulines anti-RSV se fixe au support de chromatographie par affinité à la protéine hRSV-G, quelle que soit la souche, ce qui représente dans cet essai au moins 6^g d'immunoglobulines anti-RSV par mL de gel. La fraction non adsorbée et la fraction de lavage sont appauvries en immunoglobulines anti-RSV. La fraction d'immunoglobulines éluées du support à pH acide et en présence de Propylène glycol montre un enrichissement minimum de 109 fois en immunoglobulines anti-RSV.
L'essai montre que la chromatographie d'affinité utilisant un ligand protéine G de souches A ou B greffées via une chimie NHS permet la purification d'immunoglobulines anti-RSV avec un rendement d'au moins 26,2% dans les conditions testées, correspondant à un facteur d'enrichissement minimum de 109 fois.
La composition obtenue après chromatographie d'affinité sur ligand protéine G en comprend donc au moins 30%> en poids d'immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine G.
EXEMPLE 2 : Etude de l'efficacité d'un traitement préventif par administration au niveau des voies respiratoires inférieures de la composition enrichie en Ig anti-RSV
La composition enrichie en Ig anti-RSV telle que préparée dans l'exemple 1 ci-dessus a été testée en tant que traitement prophylactique envers le virus RSV. La composition a été administrée au site d'intérêt (le poumon) via la voie nasale.
Matériel et méthodes
L'étude est conduite sur 7 jours (J-l à J5), avec des souris femelles BALB/c âgées de 8 semaines et rendues sensibles au virus RSV. lere étape : administration du traitement prophylactique.
Un prélèvement sanguin initial est effectué au début de l'étude sur toutes les souris testées. Le traitement prophylactique est administré à J-l dans les poumons par voie intranasale selon les
Figure imgf000022_0001
Le placebo et la composition comprenant des anticorps non spécifiques servent de contrôles négatifs.
L'étude a été réalisée sur 2 groupes de 16 souris (4 souris/condition/groupe).
2eme étape : Infection par le virus RSV.
L'infection au virus RSV a été effectuée après anesthésie des animaux au jour J0, par administration intranasale d'une solution comprenant le virus RSV modifié génétiquement pour exprimer la luciférase. Lorsque mis en présence de son substrat la D-luciférine, la luciférase permet de détecter le virus par réaction de bioluminescence et ainsi suivre en temps réel la réplication du virus RSV chez la souris. 3eme étape : Analyse de la réplication virale chez la souris
Au jour J4 : Un groupe de souris a été sacrifié pour prélever les poumons/narines/liquide broncho-alvéolaire afin de conduire un test de bio luminescence sur broyats d'organes (basé sur la détection de la luciférase, complexée au virus RSV) ainsi qu'une quantification de l'ARN viral par RT-Q-PCR.
Au jour J5 : La réplication virale est analysée (chez le deuxième groupe de souris) par un système d'imagerie in vivo (IVIS) basé sur la détection de bioluminescence. Les souris ont été, au préalable, anesthésiées et la D-luciférine administrée par voie intranasale juste avant la lecture. Résultats
Analyse de la réplication virale par imagerie in vivo :
5 jours après l'infection au virus RSV, on observe chez les souris contrôle (ayant reçu un placebo ou des Ig non spécifiques), une réplication virale importante au niveau des poumons. A l'inverse, la réplication virale est considérablement réduite, voire supprimée (signal luminescent éteint) au niveau des poumons des souris ayant reçu, préventivement, par administration au niveau du poumon via la voie nasale, la composition enrichie en Ig anti-RSV. Cet effet est observé chez les souris testées (figure 1), quelle que soit la dose (1 mg/kg ou 0.1 mg/kg). Ces résultats suggèrent une protection des poumons vis-à-vis du virus RSV chez les souris ayant reçu préventivement la composition enrichie en Ig anti-RSV par administration au niveau du poumon via la voie nasale. Ces résultats confirment par ailleurs que l'administration de la composition enrichie en Ig anti-RSV, a permis une diffusion directement dans les voies pulmonaires, expliquant cet effet protecteur. Analyse de la réplication virale par analyse de l'activité luciférase (test de bioluminescence): L'activité luciférase (enzyme exprimée par le virus RSV modifié génétiquement) est révélée par réaction de bio luminescence et quantifiée (figure 2), permettant ainsi de quantifier indirectement la réplication virale du RSV dans des lysats pulmonaires des souris, 4 jours après infection. La figure 2 démontre que la réplication virale est supprimée dans les poumons grâce à une administration préventive intrapulmonaire via la voie nasale d'une composition enrichie en Ig anti-RSV, à une dose de lmg/kg. La réplication virale est également réduite suite à une administration préventive intrapulmonaire via la voie nasale d'une composition enrichie en Ig anti-RSV, à une dose de 0, lmg/kg.
Analyse de la réplication virale par quantification de Γ ARN viral (RT-qPCR) :
L'ARN viral a été quantifié par RT-qPCR (quantification de l'expression du gène de nucléocapside N), 4 jours après l'infection au virus RSV. Les résultats de quantification de l'ARN viral (figure 3) sont parfaitement cohérents avec les résultats de la quantification de l'activité luciférase. Ces résultats soutiennent qu'une administration préventive intrapulmonaire via la voie nasale d'une composition enrichie en Ig anti-RSV est efficace vis- à-vis de la réplication du RSV dans les poumons.
EXEMPLE 3 : Evaluation du dépôt dans les poumons de la composition enrichie en Ig anti-RSV administrée par nébulisation
La composition enrichie en Ig anti-RSV telle que préparée dans l'exemple 1 ci-dessus a été administrée par nébulisation chez le macaque. Matériel et méthodes
L'étude est conduite sur 3 macaques cynomolgus femelles.
1ère étape : administration de la composition enrichie en Ig anti-RSV
La composition enrichie en Ig anti-RSV est marquée à l'aide d'un traceur radioactif (2 x 40(^g d'Ig anti-RSV (chaque 40(^g dans un volume final de 1ml) de composition marquée avec 37 MBq de Tc99m).
La composition est ensuite administrée par nébulisation à l'animal à l'aide d'un masque, en utilisant le dispositif Aerogen® Solo (Aerogen®, Irelande). 2ème étape : analyse du dépôt pulmonaire
Le dépôt pulmonaire est déterminé par imagerie scintigraphique du poumon à l'aide d'une caméra gamma ECAM (Siemens, Allemagne).
- immédiatement après administration de la composition enrichie en Ig anti-RSV (T0)
- et 30 min après administration de la composition enrichie en Ig anti-RSV (T30) Un lavage broncho-alvéolaire est également effectué après la scintigraphie à 30 min pour mesure de l'activité biologique de l'immunoglobuline anti-RSV. Le poumon de l'animal est lavé 2 fois avec un volume final de 10ml/kg de PBS IX pré-chauffé à 37°C. Les 2 lavages sont ensuite groupés en un seul flacon pour analyse.
Résultats :
Taille des particules et conservation de l'activité de l'Ig anti-RSV nébulisée
La taille des particules d'Ig anti-RSV nébulisée est mesurée afin de vérifier l'impact éventuel du traçage radioactif :
Figure imgf000025_0001
Les résultats confirment que le marquage radioactif n'impacte pas la taille des particules d'Ig anti-RSV nébulisées, qui reste inférieure à ΙΟμιη.
De plus, un test d'activité neutralisante a été effectué avec la composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en Ig anti-RSV nébulisée, en utilisant comme témoin la même composition non nébulisée. Les résultats confirment que la composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en Ig anti-RSV nébulisée conserve sa capacité de neutralisation après nébulisation (avec des valeurs d'IC50 comprises entre 11 et 49 ng/mL, pour un témoin non nébulisé à 32 ng/mL). Les résultats montrent ainsi que la composition d'immunoglobulines enrichie en Ig anti-RSV peut être nébulisée sous la forme de particules ou de gouttelettes d'une taille inférieure à 5μιη et sous la forme de particules ou de gouttelettes d'une taille inférieure à Ιμιη tout en conservant son activité neutralisante. Dépôt de PIg anti-RSV nébulisée dans le poumon
Les résultats obtenus sont les suivants :
Figure imgf000026_0001
Les résultats montrent que la composition d' immunoglobulmes enrichie en Ig anti-RSV peut être administrée par nébulisation au niveau des voies respiratoires inférieures, et en particulier du poumon (organe cible).
Ainsi les résultats confirment que les immunoglobulmes enrichies en Ig anti-RSV, malgré leur taille de 150 kDa, peuvent être administrées par nébulisation au niveau des voies respiratoires inférieures, et en particulier du poumon (organe cible), sous la forme de particules ou de gouttelettes d'une taille inférieure à 5μιη et sous la forme de particules ou de gouttelettes d'une taille inférieure à Ιμιη et conserver leur activité neutralisante.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition d'immunoglobulines (Ig) hyper-enrichie en immunoglobulmes anti-RSV, pour son utilisation dans le traitement prophylactique ou curatif d'une infection par le virus RSV chez un sujet, par administration de la composition sous une forme adaptée pour que les immunoglobulmes anti-RSV se lient au RSV au niveau des voies respiratoires inférieures, ladite composition étant destinée à être administrée sous forme de particules ou de gouttelettes d'une taille comprise entre 0,025 μιη et 10 μιη.
2. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulmes anti-RSV pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les voies respiratoires inférieures consistent en les poumons, et de préférence l'épithélium pulmonaire.
3. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulmes anti-RSV pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, ladite composition étant destinée à être administrée sous forme de particules ou de gouttelettes d'une taille comprise entre 0,5 μιη et 5 μιη et préférentiellement entre 1 μιη et 3 μιη.
4. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulmes anti-RSV pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, ladite composition comprenant en outre un agent tensio-actif et/ou un agent modifiant la viscosité.
5. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulmes anti-RSV pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, ladite composition comprenant une concentration d'immunoglobulines anti-RSV comprise entre 10 et 250 g/1, de préférence entre 10 et 100 g/1.
6. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulmes anti-RSV pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, l'administration étant une administration par voie pulmonaire, de préférence par inhalation d'un aérosol, de préférence au moyen d'un spray buccal ou par nébulisation au moyen d'un nébuliseur, et de préférence un nébuliseur à tamis.
7. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulmes anti-RSV pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est destinée à être administrée par voie pulmonaire avec un volume d'administration compris entre 250 μΐ et 12 ml, de préférence entre 250 μΐ et 10 ml.
8. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'administration est une administration par voie nasale, de préférence sous la forme d'un aérosol.
9. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV pour son utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est destinée à être administrée par voie nasale avec un volume d'administration inférieur à 20 ml, de préférence inférieur à 15 ml, plus préférentiellement compris entre 2 ml et 8 ml.
10. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, le sujet appartenant à au moins un des groupes suivants : les enfants, les nourrissons, les personnes immunodéprimées notamment les personnes traitées pour une greffe en particulier une greffe de poumon, les nourrissons prématurés et les enfants ou personnes âgées atteints d'une maladie pulmonaire, en particulier une broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO), cardiaque ou immunitaire.
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