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WO2018168777A1 - 嚢胞性線維症予防又は治療剤 - Google Patents

嚢胞性線維症予防又は治療剤 Download PDF

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WO2018168777A1
WO2018168777A1 PCT/JP2018/009524 JP2018009524W WO2018168777A1 WO 2018168777 A1 WO2018168777 A1 WO 2018168777A1 JP 2018009524 W JP2018009524 W JP 2018009524W WO 2018168777 A1 WO2018168777 A1 WO 2018168777A1
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WO
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amino acid
rffl
acid sequence
cftr
nucleic acid
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Application number
PCT/JP2018/009524
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English (en)
French (fr)
Inventor
司 沖米田
Original Assignee
学校法人関西学院
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Publication date
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to a preventive or therapeutic agent for cystic fibrosis, a screening method thereof, and the like.
  • Cystic fibrosis is a recessive hereditary disease whose main feature is chronic obstructive pulmonary disease, which is common in white people. There are 70,000 CF patients worldwide, but there is no fundamental cure, and many patients die by the age of 40.
  • the cause of CF is a gene mutation of a chloride ion channel (cytic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR) expressed in epithelial cells.
  • CFTR chloride ion channel
  • the ⁇ F508 CFTR mutant deletion of the 508th phenylalanine in the CFTR amino acid sequence found in the majority of CF is normal in transcription and translation, but causes steric structure abnormality of the protein. Received. As a result, the ⁇ F508 CFTR mutant is degraded by the proteasome and cannot be expressed on the plasma membrane.
  • a CFTR collector developed as a CF therapeutic drug partially improves the plasma membrane expression and chloride ion channel function of ⁇ F508 CFTR, but its clinical therapeutic effect is insufficient. This is because ⁇ F508 CFTR expressed in the plasma membrane by a collector or the like is quickly ubiquitinated by the plasma membrane quality control mechanism and is degraded by lysosomes after endocytosis.
  • ⁇ F508 CFTR expressed in the plasma membrane can inhibit the lysosomal degradation cascade, ⁇ F508 CFTR plasma membrane expression can be maintained, and clinical therapeutic effects can be further enhanced.
  • the clinical therapeutic effect can be dramatically enhanced by using the cascade inhibitor in combination with a CFTR collector.
  • ⁇ F508 CFTR expressed in the plasma membrane undergoes ubiquitination by the plasma membrane quality control mechanism and inhibits lysosomal degradation after endocytosis, thereby preventing or treating cystic fibrosis. It is an object to provide a method for obtaining the above.
  • the present inventors analyzed various types of ubiquitin ligases, and found that RFFL (Ring Finger and FYVE-like Containing E3 Ubiquitin Protein Ligase), which is a kind of ubiquitin ligase, was involved in decomposing mutant CFTR.
  • RFFL Ring Finger and FYVE-like Containing E3 Ubiquitin Protein Ligase
  • ⁇ F508 CFTR ubiquitination can be inhibited by inhibiting the expression of RFFL, and that when CFTR has no ⁇ F508 mutation (such as wild type), it does not interact with RFFL.
  • RFFL Fring Finger and FYVE-like Containing E3 Ubiquitin Protein Ligase
  • Item 1 In the system to which the test substance is applied, (1) a step of measuring the interaction between CFTR having a mutation in which the 508th phenylalanine is deleted or a peptide fragment containing the mutation and RFFL or a peptide fragment containing the fragment, or (2) ubiquitin of RFFL Measuring the ligase activity, A screening method for an agent for preventing or treating cystic fibrosis.
  • Item 2. Item 2. The method according to Item 1, wherein the CFTR having a mutation in which the 508th phenylalanine is deleted is the CFTR described in (i-1a) or (i-2a) below.
  • the peptide fragment according to Item 1 or 2, wherein the peptide fragment containing a mutation in which the 508th phenylalanine of CFTR is deleted is the polypeptide described in (i-1b), (i-2b), or (i-3b) below: the method of.
  • Item 4. The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the RFFL in the step (1) is the RFFL described in (ii-1a) or (ii-2a) below.
  • Item 5 The method according to any one of Items 1 to 4, wherein the peptide fragment containing a fragment of RFFL is the polypeptide according to (ii-1b), (ii-2b), or (ii-3b).
  • a preventive or therapeutic agent for cystic fibrosis comprising an expression vector in which a nucleic acid is incorporated. Item 8.
  • the preventive or therapeutic agent for cystic fibrosis according to Item 7, comprising at least one selected from the group consisting of: Item 9. At least one selected from the group consisting of a nucleic acid complementary to a nucleic acid encoding a peptide fragment containing RFFL or a fragment thereof, a nucleic acid comprising the complementary nucleic acid or a fragment thereof, or a nucleic acid and a fragment thereof
  • a preventive or therapeutic agent for cystic fibrosis comprising a nucleic acid donor capable of donating a nucleic acid into a cell.
  • the preventive or therapeutic agent for cystic fibrosis according to Item 9 comprising at least one selected from the group consisting of nucleic acid donors capable of donating at least one nucleic acid selected from the group consisting of: Item 11.
  • the screening method of the present invention can be used to screen for a candidate substance for the prevention or treatment of cystic fibrosis that can inhibit the lysosomal degradation cascade of ⁇ F508 CFTR expressed in the plasma membrane.
  • the present invention also provides a preventive or therapeutic agent for cystic fibrosis comprising a specific polypeptide or nucleic acid (and its expression vector) as an active ingredient.
  • the prophylactic or therapeutic agent can maintain the plasma membrane expression of ⁇ F508 CFTR, and can further enhance the clinical therapeutic effect.
  • the cascade inhibitor in combination with a CFTR collector, the clinical therapeutic effect can be dramatically enhanced.
  • the examination result of intracellular localization of RFFL is shown.
  • the examination result of plasma membrane expression of rescued ⁇ F508 CFTR (r ⁇ F508) at the time of RFFL knockdown is shown.
  • the examination result of the expression level of rescued ⁇ F508 CFTR (r ⁇ F508) at the time of RFFL knockdown is shown.
  • the examination result of the influence on the plasma membrane protein level by RFFL knockdown is shown.
  • the result of examination of the influence of RFFL knockdown on ⁇ F508 CFTR protein stability is shown.
  • the examination result of the influence of RFFL knockdown with respect to endocytosis of a plasma membrane protein is shown.
  • the examination result of localization to the endosome of r (DELTA) F508 CFTR by RFFL knockdown is shown.
  • r ⁇ F508 shows the interaction analysis results of CFTR and RFFL.
  • mold r (DELTA) F508 CFTR and RFFL by a pull-down experiment is shown.
  • the interaction analysis result of RFFL and r ⁇ F508 CFTR by BiFC method is shown.
  • mold r (DELTA) F508 CFTR ubiquitination is shown.
  • mold r (DELTA) F508 CFTR polyubiquitin modification is shown.
  • the examination result of mature type r ⁇ F508 CFTR in vitro polyubiquitination by RFFL is shown.
  • the result of having examined the influence when CFTR collector is administered to RFFL knockdown cells is shown.
  • the result of having examined the influence when CFTR collector is administered to RFFL knockdown cells is shown.
  • the result of examination of the influence on the CFTR channel function by the knockdown of RFFL and CFTR collector is shown.
  • summary estimated from the result of FIG.14 and FIG.15 is shown.
  • the examination result of interaction with RFFL and (DELTA) F508 CFTR-NBD1 (The peptide fragment which consists of the amino acid sequence 433-583 of (DELTA) F508 CFTR) is shown.
  • the present invention includes a screening method for an agent for preventing or treating cystic fibrosis.
  • a screening method for an agent for preventing or treating cystic fibrosis.
  • the screening method in a system to which a test substance is applied, (1) interaction between CFTR having a mutation in which the 508th phenylalanine is deleted or a peptide fragment containing the mutation and RFFL or a peptide fragment containing the fragment Or (2) a step of measuring the ubiquitin ligase activity of RFFL. Steps (1) and (2) can be performed as independent steps, and (1) and (2) do not represent the order of execution.
  • the screening method preferably includes a method including only step (1), a step including only step (2), and a method including steps (1) and (2).
  • the test substance here is not particularly limited.
  • it can be a compound and a composition.
  • the compound may be, for example, a low molecular compound, a high molecular compound such as a nucleic acid (for example, DNA or RNA), a protein (for example, an antibody or a part thereof), or a polymer.
  • the composition may be an extract obtained from a living organism (eg, animal, plant, microorganism, etc.), or may be a combination of two or more compounds.
  • step (1) the interaction between CFTR having a mutation in which the 508th phenylalanine is deleted or a peptide fragment containing the mutation and RFFL or a fragment thereof is measured.
  • CFTR Crystal Fibrosis Transmembrane Conductor Regulator
  • Versatile, particularly mammalian known CFTRs such as humans, monkeys, dogs, cats, mice, rats, sheep, cows, horses, etc. are preferably included. Humans, monkeys, mice and rats are more preferred.
  • the amino acid sequence of the human CFTR is shown in SEQ ID NO: 1.
  • such a CFTR having a mutation in which the 508th phenylalanine is deleted is used.
  • the CFTR used in the present invention preferably also includes the CFTRs defined in the following (i-1a) and (i-2a).
  • the CFTR defined in (i-1a) may be expressed as “ ⁇ F508-CFTR”, “ ⁇ F508 CFTR”, or the like.
  • amino acid sequence from 433 to 584 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is shown in SEQ ID NO: 2. Therefore, deletion of phenylalanine at amino acid sequence 508 of ⁇ F508-CFTR corresponds to deletion of phenylalanine at amino acid sequence 76 in SEQ ID NO: 2.
  • “1 or 2 or more” in (i-2a) is preferably 1 to 200, 1 to 150, 1 to 100, or 1 to 50, more preferably 1 to 40, still more preferably 1 to 30, More preferably 1 to 20, particularly preferably 1 to 15 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15), particularly preferably. 1-10. This number is the sum of the number of amino acids deleted, substituted or added.
  • the peptide fragment containing the ⁇ F508 displacement of CFTR used in the present invention preferably includes a polypeptide defined in the following (i-1b), (i-2b) or (i-3b).
  • “1 or 2 or more” in (i-2b) is preferably 1 to 50, 1 to 40, or 1 to 30, more preferably 1 to 20, and further preferably 1 to 15 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15), and more preferably 1-10. This number is the sum of the number of amino acids deleted, substituted or added.
  • the RFFL in (i-2b) is particularly preferably an RFFL consisting of the amino acid sequence of the following (ii-1b) SEQ ID NO: 3.
  • the polypeptide of (i-3b) is composed of an amino acid sequence including the amino acid sequence of the polypeptide of (i-1b) or (i-2b), so that it can interact with RFFL.
  • the polypeptide (i-3b) has a structure in which one or two or more amino acids are bonded to the N-terminus and / or C-terminus of the polypeptide (i-1b) or (i-2b) by a peptide bond.
  • the number of amino acids bound to the polypeptide of (i-1b) or (i-2b) is relatively large, the ability of the polypeptide of (i-3b) to interact with RFFL decreases due to steric hindrance or the like.
  • the number of amino acids bound to the polypeptide (i-1b) or (i-2b) is, for example, preferably about 1 to 100, more preferably about 1 to 80, and further about 1 to 60.
  • about 1 to 40 is more preferable, and about 1 to 20 is particularly preferable.
  • 1 to 15 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 Or about 15) is particularly preferable.
  • the number of amino acids bound to the N-terminus is, for example, preferably about 1 to 50, more preferably about 1 to 40, still more preferably about 1 to 30, and still more preferably about 1 to 20,
  • About 1 to 10 is preferable, and about 1 to 8 or about 1 to 7 (1, 2, 3, 4, 5, 6, or 7) is particularly preferable.
  • the number of amino acids bonded to the C-terminal is, for example, preferably about 1 to 50, more preferably about 1 to 40, still more preferably about 1 to 30, and still more preferably about 1 to 20, About 1 to 10 is preferable, and about 1 to 8 or about 1 to 7 (1, 2, 3, 4, 5, 6, or 7) is particularly preferable.
  • CFTR of (i-2a) or the above polypeptide can interact with RFFL can be confirmed as follows. That is, a host (preferably human cells) that stably expresses tagged ⁇ F508 CFTR or the above polypeptide is prepared by genetic engineering techniques, and the tagged RFFL expression vector is transfected into the host and cultured for several days. When a host lysate (for example, cell lysate) is prepared and protein is recovered using ⁇ F508 CFTR or polypeptide tag and RFFL tag as an index, the other tag is identified from the recovered product. If it can be detected automatically, it is understood that interaction is possible.
  • a host preferably human cells
  • tagged RFFL expression vector is transfected into the host and cultured for several days.
  • a host lysate for example, cell lysate
  • protein is recovered using ⁇ F508 CFTR or polypeptide tag and RFFL tag as an index
  • the other tag is identified from the recovered product. If it can
  • tags known in the art preferably peptide detection tags; HA tags, HB tags, etc.
  • affinity chromatography using an antibody that specifically binds to a tag
  • tag detection Western blotting, ELISA, or the like using an antibody that specifically binds to a tag can be used.
  • the RFFL used here is preferably an RFFL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 described below (ii-1a).
  • step (1) interaction between CFTR having a mutation in which the 508th phenylalanine is deleted or a peptide fragment containing the mutation and RFFL or a peptide fragment containing the fragment
  • the interaction in step (1) is measured by the method. can do.
  • the strength of interaction can also be measured.
  • RFFL Ring Finger and FYVE-like domain containing E3 ubiquitin protein Ligase
  • the RFFL used in the present invention preferably includes known RFFLs of vertebrates, particularly mammals, such as RFFLs of humans, monkeys, dogs, mice, rats and the like. Humans, monkeys, mice and rats are more preferred.
  • the accession no. Is NP_001017368.1 and the accession number of the amino acid sequence of mouse RFFL Is NP_001007466.1 or the like.
  • the amino acid sequence of the human RFFL is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the RFFL used in the step (1) of the present invention preferably includes RFFLs defined in the following (ii-1a) and (ii-2a).
  • (i-1a) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 RFFL capable of interacting with CFTR consisting of the amino acid sequence lacking the 508th phenylalanine
  • “1 or 2 or more” in (ii-2a) is preferably 1 to 50, more preferably 1 to 40, still more preferably 1 to 30, even more preferably 1 to 20, and particularly preferably 1 to 15 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15), particularly preferably 1 to 10. This number is the sum of the number of amino acids deleted, substituted or added.
  • the peptide fragment containing the RFFL fragment used in the step (1) of the present invention preferably includes a polypeptide defined in the following (ii-1b), (ii-2b) or (ii-3b).
  • the amino acid sequence of the polypeptide of (ii-1b) consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and (i-1a) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 From the amino acid sequence including the amino acid sequence of the polypeptide (ii-3b): (ii-1b) or (ii-2b) that can interact with CFTR ( ⁇ F508 CFTR) consisting of an amino acid sequence lacking phenylalanine
  • a polypeptide A polypeptide consisting of an amino acid sequence in
  • the polypeptide of (ii-1b) is a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted in the state where the amino acid sequence of 2 to 88 is maintained in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. It is more preferable. From the definition, the length of the polypeptide of (ii-1b) is 42 to 362 amino acids long, and any integer value can be taken as long as it is an integer within this range. For example, a range of 45 to 360, 50 to 350, 100 to 300, 150 to 250 or the like is preferably exemplified.
  • “1 or 2 or more” in (ii-1b) is defined from the description of the polypeptide length, preferably 1 to 321, 1 to 300, 1 to 250, 1 to 200, 1 to 150, 1 to 100, or 1 to 50, more preferably 1 to 40, further preferably 1 to 30, even more preferably 1 to 20, and particularly preferably 1 to 15 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15), particularly preferably 1 to 10.
  • the polypeptide of (ii-2b) has one or more amino acids in the amino acid sequence of the polypeptide of (ii-1b) with the 2nd to 88th sequences of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 maintained.
  • (I-1a) consisting of an amino acid sequence deleted, substituted or added, and capable of interacting with CFTR ( ⁇ F508 CFTR) consisting of an amino acid sequence in which the 508th phenylalanine is deleted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. More preferably, it is a polypeptide.
  • “1 or 2 or more” in (ii-2b) is preferably 1 to 50, more preferably 1 to 40, still more preferably 1 to 30, even more preferably 1 to 20, and particularly preferably 1 to 15 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15), particularly preferably 1 to 10. This number is the sum of the number of amino acids deleted, substituted or added.
  • the polypeptide of (ii-3b) consists of an amino acid sequence including the amino acid sequence of the polypeptide of (ii-1b) or (ii-2b), and thus can interact with ⁇ F508 CFTR.
  • the polypeptide of (ii-3b) has a structure in which one or two or more amino acids are bonded to the N-terminal and / or C-terminal of the polypeptide of (ii-1b) or (ii-2b) by a peptide bond.
  • the number of amino acids bound to the polypeptide of (ii-1b) or (ii-2b) is relatively large, the ability of the polypeptide of (ii-3b) to interact with CFTR decreases due to steric hindrance or the like.
  • the number of amino acids bound to the polypeptide of (ii-1b) or (ii-2b) is, for example, preferably about 1 to 100, more preferably about 1 to 80, and further about 1 to 60
  • about 1 to 40 is more preferable, and about 1 to 20 is particularly preferable.
  • 1 to 15 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 Or about 15) is particularly preferable.
  • the number of amino acids bound to the N-terminus is, for example, preferably about 1 to 50, more preferably about 1 to 40, still more preferably about 1 to 30, and still more preferably about 1 to 20,
  • About 1 to 10 is preferable, and about 1 to 8 or about 1 to 7 (1, 2, 3, 4, 5, 6, or 7) is particularly preferable.
  • the number of amino acids bonded to the C-terminal is, for example, preferably about 1 to 50, more preferably about 1 to 40, still more preferably about 1 to 30, and still more preferably about 1 to 20, About 1 to 10 is preferable, and about 1 to 8 or about 1 to 7 (1, 2, 3, 4, 5, 6, or 7) is particularly preferable.
  • RFFL of (ii-2a) and the peptide fragment containing the above RFFL fragment can interact with ⁇ F508 CFTR can be confirmed as follows. That is, a host (preferably a human cell) that stably expresses tagged ⁇ F508 CFTR is prepared by genetic engineering techniques, and the host is transfected with an expression vector of a peptide fragment containing tagged RFFL or a fragment thereof for several days.
  • a host lysate (eg cell lysate) is prepared, and when a protein is recovered using one of the CFTR tag and the peptide fragment tag containing RFFL or a fragment thereof as an index, If the other tag can be specifically detected, it can be seen that the interaction is possible.
  • tags not the same tags but tags known in the art (preferably peptide detection tags; HA tags, HB tags, etc.) can be used.
  • affinity chromatography using an antibody that specifically binds to a tag can be used.
  • tag detection Western blotting, ELISA, or the like using an antibody that specifically binds to a tag can be used.
  • the interaction in step (1) is performed.
  • the strength of interaction can also be measured.
  • test substance Since the degradation of ⁇ F508 CFTR is suppressed as the interaction is inhibited by the test substance, the test substance can be selected as a more promising candidate for the prevention or treatment of cystic fibrosis.
  • the RFFL used in the step (2) of the present invention preferably includes the RFFLs defined in the following (ii-1c) and (ii-2c).
  • the RFFL of (ii-1c) is the same as the RFFL of (ii-1a).
  • (ii-2c) is preferably 1 to 50, more preferably 1 to 40, still more preferably 1 to 30, even more preferably 1 to 20, and particularly preferably 1 to 15 ( 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15), particularly preferably 1 to 10. This number is the sum of the number of amino acids deleted, substituted or added.
  • the ubiquitin ligase activity can be confirmed as follows. That is, a host (preferably a human cell) that stably expresses tagged ⁇ F508 CFTR is prepared by genetic engineering techniques, and a peptide fragment containing RFFL or a fragment thereof is expressed in the host (for example, an expression vector is transfected, After culturing for several days, a host lysate (eg, cell lysate) is prepared, and when the protein is recovered using the ⁇ F508 CFTR tag as an index, the amount of ubiquitin bound to the recovered protein ( ⁇ F508 CFTR) is analyzed.
  • a host preferably a human cell
  • a host lysate eg, cell lysate
  • the ubiquitin ligase activity of a peptide fragment containing RFFL or a fragment thereof can be confirmed.
  • Western blotting using an ubiquitin-specific antibody, ELISA, or the like can be used.
  • the ubiquitin ligase activity of RFFL in step (2) can be measured by the method. By analyzing the intensity of the signal detected by the Western blot method or ELISA method, the strength of ubiquitin ligase activity can also be measured.
  • the test substance As the ubiquitin ligase activity is inhibited by the test substance, the degradation of ⁇ F508 CFTR is suppressed, so that the test substance can be selected as a more promising candidate for the prevention or treatment of cystic fibrosis.
  • the screening method of the present invention can be used to screen for substances useful as preventive or therapeutic agents for cystic fibrosis.
  • the cystic fibrosis here is particularly preferably cystic fibrosis that develops due to a mutation in which the 508th phenylalanine of CFTR is deleted.
  • the system to which the test substance is applied is not particularly limited as long as the step (1) or (2) can be performed.
  • it can be cell-based or cell-free.
  • CFTR having a mutation in which the 508th phenylalanine is deleted or a peptide fragment containing the mutation and a peptide fragment containing RFFL or a fragment thereof are expressed.
  • cell systems include mammalian cells (preferably human cultured cells).
  • Step (1) If the cell line expresses CFTR having a mutation lacking the 508th phenylalanine or a peptide fragment containing the mutation and a peptide fragment containing RFFL or a fragment thereof, and the interaction between them can be measured If the ubiquitin ligase activity of RFFL can be measured (Step (1)) (Step (2)), it can be said that the system can be preferably used in the present invention.
  • CFTR having a mutation in which the 508th phenylalanine is deleted or a peptide fragment containing the mutation and RFFL or a peptide fragment containing the fragment exist
  • the system can be preferably used in the present invention.
  • the present invention includes a preventive or therapeutic agent for cystic fibrosis containing a specific polypeptide.
  • specific polypeptide include the following polypeptides. That is, CFTR having a mutation in which the 508th phenylalanine is deleted or a peptide fragment containing the mutation, and a peptide fragment containing RFFL or a fragment thereof. These can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types.
  • Examples of CFTR having a mutation in which the 508th phenylalanine is deleted include, for example, the polypeptides defined in (i-1a) and (i-2a) above, and peptide fragments including the ⁇ F508 displacement of CFTR include, for example, the above The polypeptides defined in (i-1b), (i-2b), and (i-3b) are preferably mentioned. Further, as RFFL, for example, RFFL defined in the above (ii-1a) and (ii-2a), and as peptide fragments containing the fragment of RFFL, for example, the above (ii-1b), (ii-2b) ) And (ii-3b) are preferably mentioned.
  • the present invention also includes an agent for preventing or treating cystic fibrosis, which contains an expression vector in which a nucleic acid encoding the specific polypeptide is incorporated.
  • the polypeptide encoded by the nucleic acid to be incorporated can be one or a combination of two or more of the aforementioned polypeptides.
  • an expression vector a known expression vector can be used although it depends on the target species. For example, a plasmid equipped with an expression promoter can be exemplified.
  • these polypeptides interact with ⁇ F508 CFTR in the same manner as RFFL, they inhibit the action of RFFL in an antagonistic manner, thereby suppressing the degradation of ⁇ F508 CFTR and exhibiting the effect of preventing or treating cystic fibrosis. Can do.
  • the present invention includes a preventive or therapeutic agent for cystic fibrosis containing a specific nucleic acid.
  • the specific nucleic acid includes the following nucleic acids. That is, a nucleic acid complementary to a nucleic acid encoding a peptide fragment containing RFFL or a fragment thereof, or a nucleic acid comprising the complementary nucleic acid or a fragment thereof.
  • the agent for preventing or treating cystic fibrosis may contain a nucleic acid donor capable of donating these nucleic acids or fragments thereof into cells instead of (or together with) these nucleic acids or fragments thereof. These can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types.
  • nucleic acid examples include DNA, RNA, and PNA (peptide nucleic acid), but DNA or RNA (polynucleotide) is preferable. Further, these nucleic acids may be subjected to modification (chemical modification or the like) for suppressing degradation.
  • nucleic acid complementary to the nucleic acid encoding the peptide fragment containing RFFL or a fragment thereof include the following nucleic acids (I) to (III).
  • nucleic acids (I) to (III) can suppress the expression of the RFFL gene as an antisense nucleic acid. Thereby, the decomposition
  • examples of the nucleic acid preferably a double-stranded nucleic acid or a fragment thereof comprising these complementary nucleic acids preferably include the following (I-ds) to (IV-ds) nucleic acids or fragments thereof.
  • a nucleic acid comprising a base sequence having a base sequence of 80% or more (preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more), and the nucleic acid A double-stranded nucleic acid or a fragment thereof (III-ds) that suppresses the expression of RFFL: a nucleic acid that hybridizes with the nucle
  • Stringent conditions means hybridization in a 5 ⁇ SSC solution at 65 ° C. (composition of a 1-fold concentration SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate), and further 0.1% SDS. Means a condition of washing at 65 ° C. with a 0.5 ⁇ SSC solution containing Each hybridization operation under stringent conditions is described in “Molecular Cloning (Third Edition)” (J. Sambrook & D. W. Russell, Cold Spring Harbor Press, 2001, etc.). It can be performed by a known method.
  • the double-stranded nucleic acid or a fragment thereof is preferably a ds nucleic acid and can suppress the expression of the RFFL gene.
  • the nucleic acid is preferably RNA (double-stranded RNA; dsRNA).
  • dsRNA double-stranded RNA
  • the fragment here is also preferably a double-stranded nucleic acid, more preferably a double-stranded nucleic acid having a base length of about 15 to 50, more preferably a double-stranded nucleic acid having a base length of about 20 to 35. . It is particularly preferable that the fragment is also a dsRNA.
  • the (IV-ds) nucleic acid is a nucleic acid having a partially double-stranded nucleic acid structure, for example, by taking a hairpin structure, and the double-stranded nucleic acid moiety is (I-ds), (II-ds) Or a nucleic acid corresponding to (III-ds) double-stranded nucleic acid or a fragment thereof.
  • double-stranded nucleic acid include RNA having a hairpin structure (hairpin RNA).
  • the double-stranded nucleic acid portion when the double-stranded nucleic acid portion is the above fragment, the whole becomes a hairpin RNA having a relatively short base length, that is, shRNA (short hairpin RNA), which is also preferably included in the nucleic acid of (IV-ds).
  • shRNA short hairpin RNA
  • nucleic acid donor capable of donating the above-described nucleic acid or a fragment thereof into a cell
  • a nucleic acid obtained by incorporating the nucleic acid or a fragment thereof into a known vector can be preferably used.
  • the incorporated nucleic acid or a fragment thereof may be one or a combination of two or more of the aforementioned nucleic acids and fragments thereof.
  • the vector include plasmids, viruses (for example, adeno-associated virus, adenovirus, lentivirus, retrovirus, etc.), phages, liposomes and the like.
  • the above-mentioned agent for preventing or treating cystic fibrosis included in the present invention may contain other components as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • examples of such other components include pharmaceutically acceptable carriers and other cystic fibrosis preventive or therapeutic agents (for example, CFTR collectors, more specifically, Ivacaftor and Lumacabtor (VX-809)) and the like. Illustrated.
  • SEQ ID NO: 4 An example of a preferable sequence is shown in SEQ ID NO: 4 as the base sequence of the nucleic acid encoding RFFL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 4 is the base sequence of human RFFL gene.
  • the base sequence of the nucleic acid encoding RFFL consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 can be easily obtained by using a codon reverse control table. (In the case of DNA, U is read as T in the codon.)
  • the polypeptide or nucleic acid according to the present invention can be produced by a known method.
  • the nucleic acid may be produced by extracting DNA or RNA encoding CFTR or RFFL from an organism and artificially mutating it, or may be chemically synthesized.
  • a method of artificially mutating, site-specific mutagenesis Method of artificially mutating, site-specific mutagenesis [Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987); 100, 468 (1983); Nucleic Acids Res.
  • these proteins or a part thereof can be obtained by genetic engineering techniques.
  • the present invention also includes a preventive or therapeutic agent for cystic fibrosis containing a specific antibody or fragment thereof.
  • the specific antibody or fragment thereof is an antibody that recognizes RFFL or a fragment thereof (one that recognizes RFFL, for example, Fab).
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Moreover, it is preferable that it is a humanized antibody.
  • the antibody is preferably an antibody that recognizes human RFFL, particularly an antibody that specifically recognizes human RFFL. Furthermore, an antibody that recognizes a peptide portion consisting of amino acid sequences 1 to 44 of human RFFL is preferable.
  • Such an antibody can be produced by a known technique using, for example, RFFL or a peptide consisting of the 1st to 44th amino acid sequences of RFFL as an immunogen.
  • an appropriate mammal mammal (mouse, rat, Chinese hamster, rabbit, monkey, etc.) is immunized with a human RFFL protein or a fragment thereof (combined with an appropriate conjugate as necessary) as an immunogen, and a polyclonal antibody is obtained.
  • a hybridoma that produces an antibody with high characteristics in human RFFL is selected, and an antibody produced by the hybridoma is isolated and purified to prepare a monoclonal antibody.
  • a hybridoma that produces an antibody with high characteristics in human RFFL is selected, and an antibody produced by the hybridoma is isolated and purified to prepare a monoclonal antibody. Can do.
  • the specific antibody or a fragment thereof can suppress the interaction of RFFL with ⁇ F508 CFTR (in particular, an antibody or a fragment thereof that recognizes a peptide portion consisting of amino acid sequences 1 to 44 of human RFFL has a high effect) And / or may suppress the ubiquitin ligase activity of RFFL.
  • degradation of (DELTA) F508 CFTR can be suppressed and the effect which prevents or treats cystic fibrosis can be exhibited.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • HRP Horseradish Peroxidase
  • 3HA, V5, VN155, VC155, etc. are tags.
  • the CFTR and RFFL used were derived from humans (the amino acid sequence of human CFTR is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of RFFL is shown in SEQ ID NO: 3, respectively).
  • RFFL-GFP RFFL-mCherry
  • RFFL- ⁇ NT-GFP RFFL- ⁇ NT-GFP by lipofection.
  • cells were fixed with 4% paraformaldehyde, and immunofluorescent staining was performed using anti-Rab5 (early endosomal marker), anti-Rab7 (late endosomal marker), or anti-Rab9 (late late endosomal marker) antibody. It was.
  • the plasma membrane was stained with Alexa594-WGA (Wheat Germ Agglutinin), and the nucleus was stained with DAPI. After staining, the cells were observed with a confocal laser microscope.
  • RFFL- ⁇ NT means that the N-terminal site (amino acid 2-88) of RFFL has been deleted.
  • FIG. 2 shows that RFFL knockdown increases the plasma membrane expression and stability of r ⁇ F508 CFTR.
  • the cells were incubated at 37 ° C. for 1 hour, and the cell lysate was added to RIPA buffer (20 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton-X100, 0.5% sodium deoxycholate, 5 ⁇ g). / Ml pepstatin, 5 ⁇ g / ml leupeptin, 1 mM PMSF).
  • Anti-HA (16B12, BioLegend), anti-RFFL (N2C3, GeneTex), anti-Na + / K + ATPase (H-3, santa cruz biotechnology) antibodies were used for Western blotting.
  • ⁇ means “anti” and is a description for indicating the antibody species used. From the results, it was found that RFFL knockdown increases the expression level of mature r ⁇ F508 CFTR.
  • T70 CFTR is a kind of known CFTR variant different from ⁇ F508 CFTR.
  • CD4T is one of plasma membrane expressed proteins, and was used as a model protein for comparison with CFTR.
  • CD4Tl-Lamp, CD4TccUbAllR ⁇ G, and CD4Tl- ⁇ m are CD4T modified proteins (chimeras).
  • CD4TccUbAllR ⁇ G and CD4Tl- ⁇ m are known (Apaja PM, J Cell Biol. 2010 Nov 1; 191 (3): 553-70., Barriere H. Mol Biol Cell. 2007 Oct; 18 (10): 3952-65: 3952-65. H., Traffic.2006 Mar; 7 (3): 282-97.)
  • Cc is coiled-coiled (tetramer forming sequence)
  • UbAllR ⁇ G is a ubiquitin variant that is not polyubiquitinated
  • ⁇ m is a bacteriophage. Lambda mutants (L57C) are shown respectively.
  • CD4Tl-lamp is a modified protein in which the cytoplasmic region of Lamp1 (lysosomal protein) is fused to CD4.
  • r ⁇ F508 CFTR-HRP, WT CFTR-HRP, T70 CFTR-HRP After washing the cells twice with PBS, HRP substrate (SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Thermo Scientific) was added to the extracellular fluid, and the chemiluminescence was quantified with a plate reader (Varioscan, Thermo Scientific. Quantitative).
  • the plasma membrane expression of ⁇ F508 CFTR-HRP was induced by culture at 26 ° C. for 2 days (rescue treatment), and then the plasma membrane expression level of r ⁇ F508 CFTR-HRP after 1 hour incubation at 37 ° C. was expressed as r ⁇ F508 CFTR PM density. Quantified.
  • CD4Tl-Lamp, CD4TccUbAllR ⁇ G, CD4Tl- ⁇ m Quantification was performed by a cell surface ELISA method using an anti-CD4 antibody (OKT4) (Okiyoneda et al, Science 2010).
  • TfR Transferrin Receptor
  • ⁇ F508 CFTR-3HA was cultured at 26 ° C. for 2 days, and then incubated at 37 ° C. for 1 hour and used in the experiment.
  • anti-HA (16B12, BioLegend) antibody was used, and mature and immature bands were quantitatively analyzed by densitometry.
  • CHX is a protein synthesis inhibitor.
  • r ⁇ F508 CFTR, TfR and CD4TccUbAllR ⁇ G present in the plasma membrane were transformed into anti-HA antibody (16B12, BioLegend), Biotin-Tf (Transferrin Biotin-XX conjugate, ThermoT4, ThermoT4, Anti-HA4).
  • the amount of plasma membrane protein that was labeled with BioLegend) and disappeared from the plasma membrane upon incubation at 37 ° C. for 5 minutes was quantified by ELISA as the amount of endocytosis.
  • ⁇ F508 CFTR-3HA was used for experiments by inducing plasma membrane expression by culturing at 26 ° C. for 2 days, and then incubating at 37 ° C. for 1 hour.
  • extracellular anti-HA antibody was washed out and incubated at 37 ° C. for 2 hours (chase 2h).
  • immunofluorescence staining was performed, and the intracellular localization of r ⁇ F508 CFTR-3HA was observed with a confocal laser microscope.
  • ⁇ F508 CFTR-3HA was cultured at 26 ° C. for 2 days and then incubated at 37 ° C. for 1 hour for use in the experiment. Nuclei were stained with DAPI.
  • EEA1 which is an early endosome marker, was immunofluorescently stained with an anti-EEA1 antibody (MBL, PM062).
  • COS-7 cells were co-transfected with ⁇ F508 CFTR-3HA-VN155 ( ⁇ F508-VN) and RFFL-VC155 (RFFL-VC) by lipofection, and the cells were washed 3 days later. After fixation with 4% paraformaldehyde, immunofluorescence staining was performed using an anti-HA antibody (16B12, BioLegend) or an anti-RFFL antibody (N2C3, GeneTex).
  • ⁇ F508 CFTR-3HA was cultured at 26 ° C. (r ⁇ F508) or 37 ° C. ( ⁇ F508) for 36 hours and then incubated at 37 ° C.
  • the cells were observed with a confocal laser microscope.
  • the initial endosome marker mRFP-Rab5 was co-expressed, followed by immunofluorescence staining in the same manner as described above, followed by observation with a focused laser microscope. .
  • ubiquitinated CFTR was immobilized on Neutravidin coated 96 well white plate (ThermoFisher) under denaturing conditions, followed by anti-HA (16B12, BioLegend), anti-K48-Ub (DuM) CFTR, K48 by ELISA using an anti-K63-Ub (Apu3, EMD Millipore) antibody. Quantified re ubiquitin chains and K48 polyubiquitin chain modification, the ubiquitination CFTR amount corrected by CFTR amounts each ubiquitin chains weights were comparative analysis.
  • Tris-NP-40 solubilization buffer (20 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10% glycerol, 5 mM imidazole, 0.1% NP-40, 5 mM TCEP, 1 mM TCEP, 1 mM Cell lysate was prepared using PMSF, 5 ⁇ g / ml leupeptin, 5 ⁇ g / ml pepstatin A and 2.5 mM ATP, and then matured into NeutrAvidin agarose (Thermo Scientific).
  • the mature r ⁇ F508 CFTR immobilized on NeutrAvidin agarose was mixed with 2M urea wash buffer (2M urea, 20 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton-X100, 0.5%). After washing with sodium deoxycholate, ubiquitinated r ⁇ F508 CFTR was isolated with an elution buffer (8 Murea, 2% SDS, 3 mM biotin) and analyzed by Western blot.
  • E1 indicates ubiquitin activating enzyme (E1), UbcH5c and Ubc13 / Uev1a are one of ubiquitin-binding enzymes (E2), UbcH5c is non-selective ubiquitin binding, and Ubc13 / Uev1a is specific for K63.
  • Ub represents ubiquitin
  • Ub-63R represents ubiquitin in which K63 is changed to R
  • Ub-63K represents ubiquitin in which all K except K63 has been changed to R. From these results, it was found that RFFL directly promotes ubiquitination of r ⁇ F508 CFTR, in particular, K63-linked polyubiquitination.
  • cell lysate was added to RIPA buffer (20 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton-X100, 0.5% sodium deoxycholate, 5 ⁇ g / ml pepstatin, 5 ⁇ g / ml leupeptin, 1 mM PMSF) and the expression level of ⁇ F508 CFTR-3HA was quantified by Western blotting.
  • Anti-HA (16B12, BioLegend), anti-RFFL (N2C3, GeneTex), and anti-Na + / K + ATPase (H-3, santa cruz biotechnology) antibodies were used for Western blotting. The result is shown in FIG. 14a.
  • AllStars Netative Control siRNA siNT, Qiagen
  • RFFL siRNA Hs_RFFL_1 (SI00148232), Hs_RFFL_3 (SI00148246), a mixture of Hs_RFFL_5 (SI03089653), Qiagen
  • Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent The cells were transfected using Thermo Scientific).
  • VX-809 is a compound represented by the following structural formula and is said to have an effect of promoting normalization of misfolding of ⁇ F508 CFTR.
  • VX-809 in combination with C4 and glycerol referred to as Trio
  • the activation of the CFTR channel was performed using 20 ⁇ M forskolin, 0.5 mM 3-isobutyl-1-mthyl-xanthine (IBMX), 0.5 mM 8- (4-chlorophenylthio) -adenosine-3 ′, 5′-cyclic monophosphate ( cpt-cAMP) and 0.1 mM genistein.
  • FIG. 16 shows an outline estimated from the results of FIG. 14 and FIG.
  • ⁇ F508 CFTR-NBD1-VN155 ⁇ F-NBD1-VN
  • RFFL-VC155 RFFL-VC155
  • the cells were later fixed with 4% paraformaldehyde, and then immunofluorescent staining was performed using an anti-GFP (VC) antibody (mFX75, wako). After nuclear staining with DAPI, the cells were observed with a confocal laser microscope.
  • ⁇ F508 CFTR-NBD1 is a peptide fragment consisting of the amino acid sequence of amino acid sequence 433-583 of ⁇ F508 CFTR.

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Abstract

形質膜に発現したΔＦ５０８　ＣＦＴＲが、形質膜品質管理機構によりユビキチン化を受け、エンドサイトーシス後、リソソーム分解されることを阻害することにより、嚢胞性線維症の予防又は治療を行い得る方法等が提供される。 より具体的には、特定のポリペプチド又は核酸を含有する嚢胞性線維症予防又は治療剤、並びに、以下の（１）又は（２）の工程を含む嚢胞性線維症予防又は治療剤のスクリーニング方法、が提供される。 （１）５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を有するＣＦＴＲ又は当該変異を含むペプチドフラグメントとＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメントとの相互作用を測定する工程 （２）ＲＦＦＬのユビキチンリガーゼ活性を測定する工程

Description

嚢胞性線維症予防又は治療剤
　本発明は、嚢胞性線維症予防又は治療剤や、そのスクリーニング方法等に関する。
　嚢胞性線維症（Ｃｙｓｔｉｃ　Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，　ＣＦ）は白色人種に頻度が高い慢性閉塞性肺疾患を主徴とする劣性遺伝性疾患である。ＣＦ患者は世界に７万人存在するが、根本的な治療法はなく、多くの患者は４０歳までに死に至る。ＣＦの原因は上皮細胞に発現する塩素イオンチャネル（ｃｙｓｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ，　ＣＦＴＲ）の遺伝子変異である。ＣＦの大部分で見られるΔＦ５０８　ＣＦＴＲ変異体（ＣＦＴＲアミノ酸配列における５０８番目のフェニルアラニンが欠失）は転写、翻訳は正常であるが、タンパク質の立体構造異常を引き起こすため、小胞体品質管理機構によりユビキチン化を受ける。その結果、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ変異体はプロテアソームで分解され、形質膜に発現できない。
　また、ＣＦ治療薬として開発されているＣＦＴＲコレクターは、部分的にΔＦ５０８　ＣＦＴＲの形質膜発現および塩素イオンチャネル機能を改善させるが、その臨床治療効果は不十分である。コレクター等により形質膜に発現したΔＦ５０８　ＣＦＴＲは、形質膜品質管理機構により速やかにユビキチン化を受け、エンドサイトーシス後、リソソーム分解されてしまうからである。
米国特許出願公開第２０１６／０１９４６４４号明細書 国際公開第２００６／１０１７４０号 国際公開第２００９／０５１９０９号 特開２０１４－１３３７５７号公報
Ｏｋｉｎｙｏｎｅｄａ，　ｅｔ．　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ．　２０１３　Ｊｕｌ；　９（７）：４４４－５４ Ｏｋｉｎｙｏｎｅｄａ，　ｅｔ．　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．　２０１０　Ａｕｇ　１３；３２９（５９９３）：８０５－１０
　形質膜に発現したΔＦ５０８　ＣＦＴＲがリソソーム分解されるカスケードを阻害することができれば、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲの形質膜発現を維持することができ、臨床治療効果をより高めることができると期待される。特に、当該カスケード阻害剤とＣＦＴＲコレクターと組み合わせて用いることにより、臨床治療効果を飛躍的に高めることができると期待される。
　本発明は、形質膜に発現したΔＦ５０８　ＣＦＴＲは、形質膜品質管理機構によりユビキチン化を受け、エンドサイトーシス後、リソソーム分解されることを阻害することにより、嚢胞性線維症の予防又は治療を行い得る方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、多種のユビキチンリガーゼを解析し、ユビキチンリガーゼの１種であるＲＦＦＬ（Ｒｉｎｇ　Ｆｉｎｇｅｒ　ａｎｄ　ＦＹＶＥ－ｌｉｋｅ　Ｄｏｍａｉｎ　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｅ３　Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｇａｓｅ）が変異型ＣＦＴＲの分解に関与することを見出した。さらに、ＲＦＦＬの発現を阻害することによりΔＦ５０８　ＣＦＴＲのユビキチン化を阻害できること、ＣＦＴＲにΔＦ５０８変異が無い場合（野生型など）は、ＲＦＦＬとはインタラクト（相互作用）しないこと、等を見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
　本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
被験物質が適用された系において、
（１）５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を有するＣＦＴＲ又は当該変異を含むペプチドフラグメントとＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメントとの相互作用を測定する工程を含むか、あるいは
（２）ＲＦＦＬのユビキチンリガーゼ活性を測定する工程を含む、
嚢胞性線維症予防又は治療剤のスクリーニング方法。
項２．
５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を有するＣＦＴＲが、以下の（ｉ－１ａ）又は（ｉ－２ａ）に記載のＣＦＴＲである、項１に記載の方法。
（ｉ－１ａ）：配列番号１のアミノ酸配列において、５０８番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなる、ＣＦＴＲ
（ｉ－２ａ）：（ｉ－１ａ）のＣＦＴＲのアミノ酸配列において、前記５０８番目のフェニルアラニンの欠失が維持された状態で、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＦＦＬと相互作用可能な、ＣＦＴＲ
項３．
ＣＦＴＲの５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を含むペプチドフラグメントが、以下の（ｉ－１ｂ）、（ｉ－２ｂ）又は（ｉ－３ｂ）に記載のポリペプチドである、項１又は２に記載の方法。
（ｉ－１ｂ）：配列番号２のアミノ酸配列において、７６番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなる、ポリペプチド
（ｉ－２ｂ）：（ｉ－１ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記７６番目のフェニルアラニンの欠失が維持された状態で、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＦＦＬと相互作用可能な、ポリペプチド
（ｉ－３ｂ）：（ｉ－１ｂ）又は（ｉ－２ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる、ポリペプチド
項４．
工程（１）におけるＲＦＦＬが、以下の（ｉｉ－１ａ）又は（ｉｉ－２ａ）に記載のＲＦＦＬである、項１～３のいずれかに記載の方法。
（ｉｉ－１ａ）：配列番号３のアミノ酸配列からなるＲＦＦＬ
（ｉｉ－２ａ）：（ｉｉ－１ａ）のＲＦＦＬのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（ｉ－１ａ）配列番号１のアミノ酸配列において、５０８番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなるＣＦＴＲと相互作用可能な、ＲＦＦＬ
項５．
ＲＦＦＬの断片を含むペプチドフラグメントが、（ｉｉ－１ｂ）、（ｉｉ－２ｂ）又は（ｉｉ－３ｂ）に記載のポリペプチドである、項１～４のいずれかに記載の方法。
（ｉｉ－１ｂ）：配列番号３のアミノ酸配列において、２～４３番目のアミノ酸配列が維持された状態で、１又は２以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｉｉ－２ｂ）：（ｉｉ－１ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（ｉ－１ａ）配列番号１のアミノ酸配列において、５０８番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなるＣＦＴＲと相互作用可能な、ポリペプチド
（ｉｉ－３ｂ）：（ｉｉ－１ｂ）又は（ｉｉ－２ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる、ポリペプチド
項６．
工程（２）におけるＲＦＦＬが、以下の（ｉｉ－１ｃ）又は（ｉｉ－２ｃ）に記載のＲＦＦＬである、項１～５のいずれかに記載の方法。
（ｉｉ－１ｃ）：配列番号３のアミノ酸配列からなるＲＦＦＬ
（ｉｉ－２ｃ）：（ｉｉ－１ｃ）のＲＦＦＬのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつユビキチンリガーゼ活性を有する、ＲＦＦＬ
項７．
５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を有するＣＦＴＲ又は当該変異を含むペプチドフラグメント、あるいはＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメント、あるいはこれらのポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種のポリペプチドをコードする核酸が組み込まれた発現ベクター、を含有する、嚢胞性線維症予防又は治療剤。
項８．
（ｉ－１ａ）：配列番号１のアミノ酸配列において、５０８番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなる、ＣＦＴＲ、
（ｉ－２ａ）：（ｉ－１ａ）のＣＦＴＲのアミノ酸配列において、前記５０８番目のフェニルアラニンの欠失が維持された状態で、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＦＦＬと相互作用可能な、ＣＦＴＲ、
（ｉ－１ｂ）：配列番号２のアミノ酸配列において、７６番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｉ－２ｂ）：（ｉ－１ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記７６番目のフェニルアラニンの欠失が維持された状態で、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＦＦＬと相互作用可能な、ポリペプチド、
（ｉ－３ｂ）：（ｉ－１ｂ）又は（ｉ－２ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｉｉ－１ａ）：配列番号３のアミノ酸配列からなるＲＦＦＬ、
（ｉｉ－２ａ）：（ｉｉ－１ａ）のＲＦＦＬのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（ｉ－１ａ）配列番号１のアミノ酸配列において、５０８番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなるＣＦＴＲと相互作用可能な、ＲＦＦＬ、
（ｉｉ－１ｂ）：配列番号３のアミノ酸配列において、１～４４番目のアミノ酸配列が維持された状態で、１又は２以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ－２ｂ）：（ｉｉ－１ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（ｉ－１ａ）配列番号１のアミノ酸配列において、５０８番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなるＣＦＴＲと相互作用可能な、ポリペプチド、及び
（ｉｉ－３ｂ）：（ｉｉ－１ｂ）又は（ｉｉ－２ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、並びに、
これらのポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種のポリペプチドがコードされた核酸が組み込まれた発現ベクター、
からなる群より選択される少なくとも１種を含有する、項７に記載の嚢胞性線維症予防又は治療剤。
項９．
ＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメントをコードする核酸と相補的な核酸、あるいは当該相補的な核酸を備えた核酸又はその断片、あるいはこれらの核酸及びその断片からなる群より選択される少なくとも１種の核酸を細胞内に供与できる核酸供与体を含有する、嚢胞性線維症予防又は治療剤。
項１０．
（Ｉ）：配列番号３のアミノ酸配列からなるＲＦＦＬをコードする核酸と相補的な核酸、
（ＩＩ）：（Ｉ）の核酸の塩基配列と配列同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつＲＦＦＬの発現を抑制する核酸、
（ＩＩＩ）：（Ｉ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＲＦＦＬの発現を抑制する核酸、
（Ｉ－ｄｓ）：配列番号３のアミノ酸配列からなるＲＦＦＬをコードする核酸と、当該核酸と相補的な核酸とからなる、二重鎖核酸又はその断片、
（ＩＩ－ｄｓ）：（Ｉ）の核酸の塩基配列と配列同一性が８０％以上の塩基配列からなる核酸と、当該核酸と相補的な核酸とからなり、かつＲＦＦＬの発現を抑制する二重鎖核酸又はその断片、
（ＩＩＩ－ｄｓ）：（Ｉ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸と、当該核酸と相補的な核酸とからなり、かつＲＦＦＬの発現を抑制する二重鎖核酸又はその断片、及び
（ＩＶ－ｄｓ）：分子内アニーリングにより、（Ｉ－ｄｓ）、（ＩＩ－ｄｓ）、又は（ＩＩＩ－ｄｓ）の二重鎖核酸又はその断片を構成する核酸、並びに
これらの核酸及びその断片からなる群より選択される少なくとも１種の核酸を細胞内に供与できる核酸供与体
からなる群より選択される少なくとも１種を含有する、項９に記載の嚢胞性線維症予防又は治療剤。
項１１．
ＲＦＦＬを認識する抗体又はその断片を含有する、嚢胞性線維症予防又は治療剤。
　本発明のスクリーニング方法により、形質膜に発現したΔＦ５０８　ＣＦＴＲのリソソーム分解されるカスケードを阻害することができる嚢胞性線維症予防又は治療剤の候補物質をスクリーニングすることができる。また、本発明により、特定のポリペプチドや核酸（及びその発現ベクター）を有効成分とする嚢胞性線維症予防又は治療剤が提供される。当該予防又は治療剤は、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲの形質膜発現を維持することができ、臨床治療効果をより高めることができる。特に、当該カスケード阻害剤とＣＦＴＲコレクターと組み合わせて用いることにより、臨床治療効果を飛躍的に高めることができる。　
ＲＦＦＬの細胞内局在の検討結果を示す。 ＲＦＦＬノックダウン時のｒｅｓｃｕｅｄ　ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ（ｒΔＦ５０８）の形質膜発現の検討結果を示す。 ＲＦＦＬノックダウン時のｒｅｓｃｕｅｄ　ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ（ｒΔＦ５０８）の発現量の検討結果を示す。なお、「Ｃ」は成熟型の、「Ｂ」は未成熟型の、ＣＦＴＲのバンドを示しており、この記載は他の図でも同様である。 ＲＦＦＬノックダウンによる形質膜タンパク質レベルへの影響の検討結果を示す。 ΔＦ５０８　ＣＦＴＲタンパク質安定性に対するＲＦＦＬノックダウンの影響の検討の結果を示す。 形質膜タンパク質のエンドサイトーシスに対するＲＦＦＬノックダウンの影響の検討結果を示す。 ＲＦＦＬノックダウンによる、ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲのエンドソームへの局在の検討結果を示す。 ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲとＲＦＦＬの相互作用解析結果を示す。 プルダウン実験による成熟型ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲとＲＦＦＬの相互作用解析結果を示す。 ＢｉＦＣ法によるＲＦＦＬとｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲの相互作用解析結果を示す。 成熟型ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲ　ユビキチン化に対するＲＦＦＬノックダウンの影響の検討結果を示す。 成熟型ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲポリユビキチン修飾に対するＲＦＦＬノックダウンの影響の検討結果を示す。 ＲＦＦＬによる成熟型ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ポリユビキチン化の検討結果を示す。 ＲＦＦＬノックダウン細胞にＣＦＴＲ　ｃｏｒｒｅｃｔｏｒを投与したときの影響を検討した結果を示す。 ＲＦＦＬノックダウン細胞にＣＦＴＲ　ｃｏｒｒｅｃｔｏｒを投与したときの影響を検討した結果を示す。 ＲＦＦＬのノックダウン及びＣＦＴＲ　ｃｏｒｒｅｃｔｏｒによるＣＦＴＲチャネル機能への影響の検討結果を示す。 図１４及び図１５の結果から推察される概要を示す。 ＲＦＦＬとΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－ＮＢＤ１（ΔＦ５０８　ＣＦＴＲのアミノ酸配列４３３～５８３番目のアミノ酸配列からなるペプチドフラグメント）との相互作用の検討結果を示す。
　以下、本発明の各実施形態について、さらに詳細に説明する。
　本発明は、嚢胞性線維症予防又は治療剤のスクリーニング方法を包含する。当該スクリーニング方法においては、被験物質が適用された系において、（１）５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を有するＣＦＴＲ又は当該変異を含むペプチドフラグメントとＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメントとの相互作用を測定する工程を含むか、あるいは（２）ＲＦＦＬのユビキチンリガーゼ活性を測定する工程を含む。なお、工程（１）及び（２）は、それぞれ独立した工程として実施可能であり、当該（１）及び（２）は実施順を表しているわけではない。当該スクリーニング方法は、工程（１）のみを含む方法、工程（２）のみをふくむ工程、並びに工程（１）及び（２）を含む方法、を好ましく包含する。
　ここでの被験物質は、特に制限はされない。例えば、化合物及び組成物であり得る。化合物としては、例えば低分子化合物や、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ等）やタンパク質（例えば抗体又はその一部等）、ポリマー等の高分子化合物であってよい。組成物としても、生物（例えば動物、植物、微生物等）から得た抽出物等であってもよく、化合物を２種以上組み合わせたものであってもよい。
　工程（１）では、５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を有するＣＦＴＲ又は当該変異を含むペプチドフラグメントとＲＦＦＬ又はその断片との相互作用を測定する。
　ＣＦＴＲ（Ｃｙｓｔｉｃ　Ｆｉｂｒｏｓｉｓ　Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）としては、特に制限はされない。脊椎動物、特に哺乳動物の既知のＣＦＴＲ、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ウマ等のＣＦＴＲを好ましく包含する。ヒト、サル、マウス、ラットのものがより好ましい。例えば、ヒトのＣＦＴＲのアミノ酸配列のアクセッションＮｏ．はＮＰ＿０００４８３であり、マウスのＣＦＴＲのアミノ酸配列のアクセッションＮｏ．はＮＰ＿０６６３８８である。当該ヒトのＣＦＴＲのアミノ酸配列を配列番号１に示す。本発明においては、このようなＣＦＴＲにおいて、５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を有するＣＦＴＲを用いる。
　また、本発明に用いるＣＦＴＲは、次の（ｉ－１ａ）及び（ｉ－２ａ）に規定されるＣＦＴＲをも好ましく包含する。
（ｉ－１ａ）：配列番号１のアミノ酸配列において、５０８番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなる、ＣＦＴＲ
（ｉ－２ａ）：（ｉ－１ａ）のＣＦＴＲのアミノ酸配列において、前記５０８番目のフェニルアラニンの欠失が維持された状態で、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＦＦＬと相互作用可能な、ＣＦＴＲ
　本明細書では、（ｉ－１ａ）に規定されるＣＦＴＲを「ΔＦ５０８－ＣＦＴＲ」「ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ」などと表記することがある。
　また、配列番号１のアミノ酸配列の４３３～５８４番目アミノ酸配列を配列番号２に示す。よって、ΔＦ５０８－ＣＦＴＲのアミノ酸配列５０８番目のフェニルアラニンの欠失は、配列番号２においてはアミノ酸配列７６番目のフェニルアラニンが欠失することに相当する。
　また、（ｉ－２ａ）における「１又は２以上」とは、好ましくは１～２００、１～１５０、１～１００、又は１～５０、より好ましくは１～４０、さらに好ましく１～３０、よりさらに好ましくは１～２０、なかでも好ましくは１～１５（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）、特に好ましくは１～１０である。当該数は、欠失、置換、又は付加されたアミノ酸の数の合計である。
　また、本発明に用いるＣＦＴＲのΔＦ５０８変位を含むペプチドフラグメントは、次の（ｉ－１ｂ）、（ｉ－２ｂ）又は（ｉ－３ｂ）に規定されるポリペプチドを好ましく包含する。
（ｉ－１ｂ）：配列番号２のアミノ酸配列において、７６番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなる、ポリペプチド
（ｉ－２ｂ）：（ｉ－１ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記７６番目のフェニルアラニンの欠失が維持された状態で、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＦＦＬと相互作用可能な、ポリペプチド
（ｉ－３ｂ）：（ｉ－１ｂ）又は（ｉ－２ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる、ポリペプチド
　（ｉ－２ｂ）における「１又は２以上」とは、好ましくは１～５０、１～４０、又は１～３０、より好ましくは１～２０、さらに好ましくは１～１５（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）、よりさらに好ましくは１～１０である。当該数は、欠失、置換、又は付加されたアミノ酸の数の合計である。また、（ｉ－２ｂ）におけるＲＦＦＬは、下記（ｉｉ－１ｂ）配列番号３のアミノ酸配列からなるＲＦＦＬであることが特に好ましい。
　また、（ｉ－３ｂ）のポリペプチドは、（ｉ－１ｂ）又は（ｉ－２ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなることから、ＲＦＦＬと相互作用可能である。（ｉ－３ｂ）のポリペプチドは（ｉ－１ｂ）又は（ｉ－２ｂ）のポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸がペプチド結合で結合した構造を有する。ただ、（ｉ－１ｂ）又は（ｉ－２ｂ）のポリペプチドに結合するアミノ酸数が比較的多いと、立体障害等により、（ｉ－３ｂ）のポリペプチドのＲＦＦＬとの相互作用能が低下する可能性もあることから、（ｉ－１ｂ）又は（ｉ－２ｂ）のポリペプチドに結合するアミノ酸数は、例えば１～１００程度が好ましく、１～８０程度がより好ましく、１～６０程度がさらに好ましく、１～４０程度がよりさらに好ましく、１～２０程度が中でも好ましく、１～１５（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）程度が特に好ましい。また、特に制限はされないが、Ｎ末端に結合するアミノ酸数は、例えば１～５０程度が好ましく、１～４０程度がより好ましく、１～３０程度がさらに好ましく、１～２０程度がよりさらに好ましく、１～１０程度が中でも好ましく、１～８程度又は１～７（１、２、３、４、５、６、若しくは７）程度が特に好ましい。また、特に制限はされないが、Ｃ末端に結合するアミノ酸数は、例えば１～５０程度が好ましく、１～４０程度がより好ましく、１～３０程度がさらに好ましく、１～２０程度がよりさらに好ましく、１～１０程度が中でも好ましく、１～８程度又は１～７（１、２、３、４、５、６、若しくは７）程度が特に好ましい。
　（ｉ－２ａ）のＣＦＴＲや、上記ポリペプチドが、ＲＦＦＬと相互作用可能か否かは、次のようにして確認することができる。すなわち、タグ付きΔＦ５０８　ＣＦＴＲ又は上記ポリペプチドを安定発現する宿主（好ましくはヒト細胞）を遺伝子工学的手法により調製し、当該宿主にタグ付きＲＦＦＬ発現ベクターをトランスフェクションして、数日間培養してから宿主溶解液（例えばｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅ）を調製し、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ又はポリペプチドのタグ及びＲＦＦＬのタグのうち、一方のタグを指標としてタンパク質を回収したとき、当該回収物の中からもう一方のタグを特異的に検出できれば、相互作用が可能であることがわかる。これらのタグとしては、同じタグではない、本技術分野で公知のタグ（好ましくはペプチド検出タグ；ＨＡタグ、ＨＢタグなど）を用いることができる。また、タンパク質回収にあたっては、タグ特異的に結合する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー等を利用できる。また、タグ検出に当たっては、タグ特異的に結合する抗体を用いたウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法等を利用できる。なお、ここで用いるＲＦＦＬは下述する（ｉｉ－１ａ）配列番号３のアミノ酸配列からなるＲＦＦＬであることが好ましい。またさらに、当該方法により、工程（１）における相互作用（５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を有するＣＦＴＲ又は当該変異を含むペプチドフラグメントとＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメントとの相互作用）を測定することができる。前記ウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法により検出されるシグナルの強さを解析することで、相互作用の強さも測定し得る。
　ＲＦＦＬ（Ｒｉｎｇ　Ｆｉｎｇｅｒ　ａｎｄ　ＦＹＶＥ－ｌｉｋｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｅ３　ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｇａｓｅ）は別名Ｒｉｆｉｆｙｌｉｎとも呼ばれる。本発明に用いるＲＦＦＬは、脊椎動物、特に哺乳動物の既知のＲＦＦＬ、例えばヒト、サル、イヌ、マウス、ラット等のＲＦＦＬを好ましく包含する。ヒト、サル、マウス、ラットのものがより好ましい。例えば、ヒトのＲＦＦＬのアミノ酸配列のアクセッションＮｏ．はＮＰ＿００１０１７３６８．１であり、マウスのＲＦＦＬのアミノ酸配列のアクセッションＮｏ．はＮＰ＿００１００７４６６．１等である。当該ヒトのＲＦＦＬのアミノ酸配列を配列番号３に示す。
　　また、本発明の工程（１）に用いるＲＦＦＬは、次の（ｉｉ－１ａ）及び（ｉｉ－２ａ）に規定されるＲＦＦＬを好ましく包含する。
（ｉｉ－１ａ）：配列番号３のアミノ酸配列からなるＲＦＦＬ
（ｉｉ－２ａ）：（ｉｉ－１ａ）のＲＦＦＬのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（ｉ－１ａ）配列番号１のアミノ酸配列において、５０８番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなるＣＦＴＲと相互作用可能な、ＲＦＦＬ
　また、（ｉｉ－２ａ）における「１又は２以上」とは、好ましくは１～５０、より好ましくは１～４０、さらに好ましく１～３０、よりさらに好ましくは１～２０、なかでも好ましくは１～１５（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）、特に好ましくは１～１０である。当該数は、欠失、置換、又は付加されたアミノ酸の数の合計である。
　また、本発明の工程（１）に用いるＲＦＦＬの断片を含むペプチドフラグメントは、次の（ｉｉ－１ｂ）、（ｉｉ－２ｂ）又は（ｉｉ－３ｂ）に規定されるポリペプチドを好ましく包含する。
（ｉｉ－１ｂ）：配列番号３のアミノ酸配列において、２～４３番目のアミノ酸配列が維持された状態で、１又は２以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｉｉ－２ｂ）：（ｉｉ－１ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（ｉ－１ａ）配列番号１のアミノ酸配列において、５０８番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなるＣＦＴＲ（ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ）と相互作用可能な、ポリペプチド
（ｉｉ－３ｂ）：（ｉｉ－１ｂ）又は（ｉｉ－２ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる、ポリペプチド
　（ｉｉ－１ｂ）のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列において、２～８８番目のアミノ酸配列が維持された状態で、１又は２以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが、より好ましい。その定義から、（ｉｉ－１ｂ）のポリペプチドの長さは、４２～３６２アミノ酸長であるが、この範囲にある整数であればいずれの整数値もとり得る。例えば、４５～３６０、５０～３５０、１００～３００、又は１５０～２５０等の範囲が好ましく例示される。また、（ｉｉ－１ｂ）における「１又は２以上」とは、前記ポリペプチド長の記載から規定されることになるが、好ましくは１～３２１、１～３００、１～２５０、１～２００、１～１５０、１～１００、又は１～５０、より好ましくは１～４０、さらに好ましく１～３０、よりさらに好ましくは１～２０、なかでも好ましくは１～１５（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）、特に好ましくは１～１０である。
　（ｉｉ－２ｂ）のポリペプチドは、（ｉｉ－１ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号３のアミノ酸配列の２～８８番目の配列が維持された状態で、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（ｉ－１ａ）配列番号１のアミノ酸配列において、５０８番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなるＣＦＴＲ（ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ）と相互作用可能な、ポリペプチドであることが、より好ましい。また、（ｉｉ－２ｂ）における「１又は２以上」とは、好ましくは１～５０、より好ましくは１～４０、さらに好ましく１～３０、よりさらに好ましくは１～２０、なかでも好ましくは１～１５（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）、特に好ましくは１～１０である。当該数は、欠失、置換、又は付加されたアミノ酸の数の合計である。
　（ｉｉ－３ｂ）のポリペプチドは、（ｉｉ－１ｂ）又は（ｉｉ－２ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなることから、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲと相互作用可能である。（ｉｉ－３ｂ）のポリペプチドは（ｉｉ－１ｂ）又は（ｉｉ－２ｂ）のポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸がペプチド結合で結合した構造を有する。ただ、（ｉｉ－１ｂ）又は（ｉｉ－２ｂ）のポリペプチドに結合するアミノ酸数が比較的多いと、立体障害等により、（ｉｉ－３ｂ）のポリペプチドのＣＦＴＲとの相互作用能が低下する可能性もあることから、（ｉｉ－１ｂ）又は（ｉｉ－２ｂ）のポリペプチドに結合するアミノ酸数は、例えば１～１００程度が好ましく、１～８０程度がより好ましく、１～６０程度がさらに好ましく、１～４０程度がよりさらに好ましく、１～２０程度が中でも好ましく、１～１５（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）程度が特に好ましい。また、特に制限はされないが、Ｎ末端に結合するアミノ酸数は、例えば１～５０程度が好ましく、１～４０程度がより好ましく、１～３０程度がさらに好ましく、１～２０程度がよりさらに好ましく、１～１０程度が中でも好ましく、１～８程度又は１～７（１、２、３、４、５、６、若しくは７）程度が特に好ましい。また、特に制限はされないが、Ｃ末端に結合するアミノ酸数は、例えば１～５０程度が好ましく、１～４０程度がより好ましく、１～３０程度がさらに好ましく、１～２０程度がよりさらに好ましく、１～１０程度が中でも好ましく、１～８程度又は１～７（１、２、３、４、５、６、若しくは７）程度が特に好ましい。
　　（ｉｉ－２ａ）のＲＦＦＬや、上記ＲＦＦＬの断片を含むペプチドフラグメントが、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲと相互作用可能か否かは、次のようにして確認することができる。すなわち、タグ付きΔＦ５０８　ＣＦＴＲを安定発現する宿主（好ましくはヒト細胞）を遺伝子工学的手法により調製し、当該宿主にタグ付きＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメントの発現ベクターをトランスフェクションして、数日間培養してから宿主溶解液（例えばｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅ）を調製し、ＣＦＴＲのタグ及びＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメントのタグのうち、一方のタグを指標としてタンパク質を回収したとき、当該回収物の中からもう一方のタグを特異的に検出できれば、相互作用が可能であることがわかる。これらのタグとしては、同じタグではない、本技術分野で公知のタグ（好ましくはペプチド検出タグ；ＨＡタグ、ＨＢタグなど）を用いることができる。また、タンパク質回収にあたっては、タグ特異的に結合する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー等を利用できる。また、タグ検出に当たっては、タグ特異的に結合する抗体を用いたウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法等を利用できる。またさらに、当該方法によっても、工程（１）における相互作用（５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を有するＣＦＴＲ又は当該変異を含むペプチドフラグメントとＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメントとの相互作用）を測定することができる。前記ウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法により検出されるシグナルの強さを解析することで、相互作用の強さも測定し得る。
　被験物質によって当該相互作用が阻害されるほど、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲの分解が抑制されることになるため、当該被験物質をより有望な嚢胞性線維症予防又は治療剤候補として選択することができる。
　また、本発明の工程（２）に用いるＲＦＦＬは、次の（ｉｉ－１ｃ）及び（ｉｉ－２ｃ）に規定されるＲＦＦＬを好ましく包含する。
（ｉｉ－１ｃ）：配列番号３のアミノ酸配列からなるＲＦＦＬ
（ｉｉ－２ｃ）：（ｉｉ－１ｃ）のＲＦＦＬのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつユビキチンリガーゼ活性を有する、ＲＦＦＬ
　（ｉｉ－１ｃ）のＲＦＦＬは、（ｉｉ－１ａ）のＲＦＦＬと同一である。
　（ｉｉ－２ｃ）における「１又は２以上」とは、好ましくは１～５０、より好ましくは１～４０、さらに好ましく１～３０、よりさらに好ましくは１～２０、なかでも好ましくは１～１５（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）、特に好ましくは１～１０である。当該数は、欠失、置換、又は付加されたアミノ酸の数の合計である。
　ユビキチンリガーゼ活性は、次のようにして確認することができる。すなわち、タグ付きΔＦ５０８　ＣＦＴＲを安定発現する宿主（好ましくはヒト細胞）を遺伝子工学的手法により調製し、当該宿主においてＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメントを発現させ（例えば発現ベクターをトランスフェクションして、数日間培養し）た後、宿主溶解液（例えばｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅ）を調製し、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲのタグを指標としてタンパク質を回収したとき、その回収タンパク質（ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ）に結合したユビキチン量を解析することで、ＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメントのユビキチンリガーゼ活性を確認することができる。ΔＦ５０８　ＣＦＴＲに結合したユビキチン量を解析には、例えばユビキチン特異的抗体を用いたウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法等を利用できる。またさらに、当該方法によって、工程（２）におけるＲＦＦＬのユビキチンリガーゼ活性を測定することができる。前記ウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法により検出されるシグナルの強さを解析することで、ユビキチンリガーゼ活性の強さも測定し得る。
　被験物質によってユビキチンリガーゼ活性が阻害されるほど、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲの分解が抑制されることになるため、当該被験物質をより有望な嚢胞性線維症予防又は治療剤候補として選択することができる。
　本発明のスクリーニング方法により、嚢胞性線維症予防又は治療剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。ここでの嚢胞性線維症は、特にＣＦＴＲの５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異が原因で発症する嚢胞性線維症であることが好ましい。
　また、被験物質が適用される系は、工程（１）又は（２）を実施できれば特に制限はされない。例えば、細胞系又は無細胞系であり得る。当該系においては、５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を有するＣＦＴＲ又は当該変異を含むペプチドフラグメントとＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメントとが発現していることが好ましい。細胞系であれば、例えば哺乳類細胞（好ましくはヒト培養細胞）が挙げられる。当該細胞系において、５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を有するＣＦＴＲ又は当該変異を含むペプチドフラグメントとＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメントとが発現しており、これらの相互作用を測定することができれば（工程（１））、あるいは、ＲＦＦＬのユビキチンリガーゼ活性を測定することができれば（工程（２））、本発明に好ましく用いることができる系といえる。また、無細胞系であれば、例えば緩衝液中において、５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を有するＣＦＴＲ又は当該変異を含むペプチドフラグメントとＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメントとが存在しており、これらの相互作用を測定することができれば（工程（１））、あるいは、ＲＦＦＬのユビキチンリガーゼ活性を測定することができれば（工程（２））、本発明に好ましく用いることができる系といえる。
　本発明は、特定のポリペプチドを含有する嚢胞性線維症予防又は治療剤を包含する。当該特定のポリペプチドとしては、次のポリペプチドが挙げられる。すなわち、５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を有するＣＦＴＲ又は当該変異を含むペプチドフラグメント、並びに、ＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメントである。これらは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を有するＣＦＴＲとしては、例えば上記の（ｉ－１ａ）及び（ｉ－２ａ）に規定されるポリペプチドを、ＣＦＴＲのΔＦ５０８変位を含むペプチドフラグメントとしては、例えば上記の（ｉ－１ｂ）、（ｉ－２ｂ）、及び（ｉ－３ｂ）に規定されるポリペプチドを、それぞれ好ましく挙げることができる。また、ＲＦＦＬとしては、例えば上記の（ｉｉ－１ａ）及び（ｉｉ－２ａ）に規定されるＲＦＦＬを、ＲＦＦＬの断片を含むペプチドフラグメントとしては、例えば上記の（ｉｉ－１ｂ）、（ｉｉ－２ｂ）、及び（ｉｉ－３ｂ）に規定されるポリペプチドを、それぞれ好ましく挙げることができる。なお、本発明は、前記特定のポリペプチドをコードする核酸が組み込まれた発現ベクターを含有する嚢胞性線維症予防又は治療剤も包含する。組み込まれる核酸がコードするポリペプチドは、前述のポリペプチドの１種又は２種以上の組み合わせであり得る。このような発現ベクターとしては、対象生物種にもよるが、公知の発現ベクターを用いることができる。例えば、発現プロモーターを備えたプラスミドなどが例示できる。
　これらのポリペプチドは、ＲＦＦＬと同様にΔＦ５０８　ＣＦＴＲと相互作用することから、ＲＦＦＬの働きを拮抗的に阻害するため、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲの分解を抑制し、嚢胞性線維症を予防又は治療する効果を発揮し得る。
　本発明は、特定の核酸を含有する嚢胞性線維症予防又は治療剤を包含する。当該特定の核酸としては、次の核酸が挙げられる。すなわち、ＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメントをコードする核酸と相補的な核酸、あるいは当該相補的な核酸を備えた核酸又はその断片である。また、当該嚢胞性線維症予防又は治療剤は、これらの核酸又はその断片を細胞内に供与できる核酸供与体をこれらの核酸又はその断片の代わりに（あるいは一緒に）含有していてもよい。これらは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）が例示できるが、ＤＮＡ又はＲＮＡ（ポリヌクレオチド）が好ましい。また、これらの核酸は、分解を抑制するための修飾（化学修飾など）が施されていてもよい。
　ＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメントをコードする核酸と相補的な核酸としては、例えば以下の（Ｉ）～（ＩＩＩ）の核酸が好ましく挙げられる。
（Ｉ）：配列番号３のアミノ酸配列からなるＲＦＦＬをコードする核酸と相補的な核酸
（ＩＩ）：（Ｉ）の核酸の塩基配列と配列同一性が８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９８％以上）の塩基配列からなり、かつＲＦＦＬの発現を抑制する核酸
（ＩＩＩ）：（Ｉ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＲＦＦＬの発現を抑制する核酸
　これら（Ｉ）～（ＩＩＩ）の核酸は、アンチセンス核酸として、ＲＦＦＬ遺伝子の発現を抑制し得る。これにより、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲの分解を抑制し、嚢胞性線維症を予防又は治療する効果を発揮し得る。
　また、これら相補的な核酸を備えた核酸（好ましくは二重鎖核酸）又はその断片としては、例えば以下の（Ｉ－ｄｓ）～（ＩＶ－ｄｓ）の核酸又はその断片が好ましく挙げられる。
（Ｉ－ｄｓ）：配列番号３のアミノ酸配列からなるＲＦＦＬをコードする核酸と、当該核酸と相補的な核酸とからなる、二重鎖核酸又はその断片
（ＩＩ－ｄｓ）：（Ｉ）の核酸の塩基配列と配列同一性が８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９８％以上）の塩基配列からなる核酸と、当該核酸と相補的な核酸とからなり、かつＲＦＦＬの発現を抑制する二重鎖核酸又はその断片
（ＩＩＩ－ｄｓ）：（Ｉ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸と、当該核酸と相補的な核酸とからなり、かつＲＦＦＬの発現を抑制する二重鎖核酸又はその断片
（ＩＶ－ｄｓ）：分子内アニーリングにより、（Ｉ－ｄｓ）、（ＩＩ－ｄｓ）、又は（ＩＩＩ－ｄｓ）の二重鎖核酸又はその断片を構成する核酸
　なお、「ストリンジェントな条件」とは、６５℃で５×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）中でハイブリダイズさせ、更に０．１％のＳＤＳを含有する０．５×ＳＳＣ溶液で６５℃で洗浄する条件を意味する。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションの各操作は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）」（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　＆　Ｄ．　Ｗ．　Ｒｕｓｓｅｌｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　２００１）に記載されている方法など、従来公知の方法で行うことができる。
　ここでの二重鎖核酸又はその断片は、ｄｓ核酸として好ましくＲＦＦＬ遺伝子の発現を抑制し得る。特に当該核酸は、ＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ；ｄｓＲＮＡ）であることが好ましい。ｄｓＲＮＡを用いることで、ＲＮＡ干渉により、好ましくＲＦＦＬ遺伝子の発現が抑制される。また、ここでの断片も二重鎖核酸であることが好ましく、より好ましくは塩基長が１５～５０程度の二重鎖核酸、さらに好ましくは塩基長が２０～３５程度の二重鎖核酸である。当該断片も、ｄｓＲＮＡであることが特に好ましい。
　なお、（ＩＶ－ｄｓ）の核酸としては、例えばヘアピン構造を取ることにより一部二重鎖核酸構造を有する核酸であって、二重鎖核酸部分が（Ｉ－ｄｓ）、（ＩＩ－ｄｓ）、又は（ＩＩＩ－ｄｓ）の二重鎖核酸又はその断片に相当する核酸が例示される。このような二重鎖核酸としては、ヘアピン構造を有するＲＮＡ（ヘアピンＲＮＡ）が挙げられる。特に、当該二重鎖核酸部分が前記断片である場合には全体としては比較的塩基長の短いヘアピンＲＮＡ、すなわちｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ）となり、これも（ＩＶ－ｄｓ）の核酸に好ましく包含される。
　また、上記の核酸又はその断片を細胞内に供与できる核酸供与体としては、公知のベクターに当該核酸又はその断片を組み込んだものを好ましく用いることができる。組み込まれる核酸又はその断片は、前述の核酸及びその断片の１種又は２種以上の組み合わせであり得る。ベクターとしては、例えばプラスミド、ウイルス（例えばアデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスなど）、ファージ、リポソーム等が挙げられる。
　本発明に包含される上記嚢胞性線維症予防又は治療剤は、本発明の効果を損なわない範囲で、他の成分を含んでいてもよい。このような他成分としては、例えば薬学的に許容される担体や、他の嚢胞性線維症予防又は治療剤（例えばＣＦＴＲコレクター、より具体的にはＩｖａｃａｆｔｏｒやＬｕｍａｃａｆｔｏｒ　（ＶＸ－８０９）など）等が例示される。
　なお、配列番号３のアミノ酸配列からなるＲＦＦＬをコードする核酸の塩基配列として、好ましい配列の一例を配列番号４に示す。配列番号４の塩基配列は、ヒトのＲＦＦＬ遺伝子の塩基配列である。また、配列番号３のアミノ酸配列からなるＲＦＦＬをコードする核酸の塩基配列は、コドン逆対照表を用いることで容易に得られる。（ＤＮＡの場合、コドンにおいてＵはＴに読み替える。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明に係るポリペプチドや核酸は、公知の方法により製造することができる。例えば、核酸は、ＣＦＴＲやＲＦＦＬをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを生物から抽出し、これを人為的に変異させて製造しても良いし、化学合成してもよい。特に制限されないが、例えば、人為的に変異させる方法としては、サイトスペシフィック・ミュータゲネシス［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　１５４，　３５０，　３６７－３８２（１９８７）；同１００，　４６８（１９８３）；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１２，　９４４１（１９８４）；続生化学実験講座１「遺伝子研究法ＩＩ」、日本生化学会編，　ｐ１０５（１９８６）］などの遺伝子工学的手法；リン酸トリエステル法、リン酸アミダイト法などの化学合成手段［Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　８９，　４８０１（１９６７）；同９１，　３３５０（１９６９）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１５０，　１７８（１９６８）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．，　２２，　１８５９（１９８１）；同２４，　２４５（１９８３）］およびそれらの組合せ方法が例示できる。また、例えば、ホスホルアミダイト法またはホスホトリエステル法によって化学合成することができ、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置を利用して合成することもできる。
　ＣＦＴＲやＲＦＦＬをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを得た後、遺伝子工学的手法により、これらのタンパク質（ポリペプチド）又はその一部を得ることができる。
　また、本発明は、特定の抗体又はその断片を含有する嚢胞性線維症予防又は治療剤を包含する。当該特定の抗体又はその断片としては、ＲＦＦＬを認識する抗体又はその断片（ＲＦＦＬを認識するもの、例えばＦａｂ）である。当該抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。また、ヒト化抗体であることが好ましい。また、当該抗体は、ヒトＲＦＦＬを認識する抗体、特にヒトＲＦＦＬを特異的に認識する抗体であることが好ましい。またさらに、ヒトＲＦＦＬの１～４４番目のアミノ酸配列からなるペプチド部分を認識する抗体が好ましい。このような抗体は、ＲＦＦＬ又はＲＦＦＬの１～４４番目のアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原とするなどして、公知の技術により製造することができる。例えば、適当な哺乳動物（マウス、ラット、チャイニーズハムスター、ウサギ、サル等）に、（必要に応じて適当なコンジュゲートを組み合わせた）ヒトＲＦＦＬタンパク質又はその断片を免疫原として免疫してポリクローナル抗体を調製することができる。また、当該免疫源を用いてハイブリドーマを作製した後、好ましくはヒトＲＦＦＬに特性の高い抗体を産出するハイブリドーマを選択して、当該ハイブリドーマが産出する抗体を単離精製してモノクローナル抗体を調製することができる。
　当該特定の抗体又はその断片は、ＲＦＦＬのΔＦ５０８　ＣＦＴＲへの相互作用を抑制し得（特にヒトＲＦＦＬの１～４４番目のアミノ酸配列からなるペプチド部分を認識する抗体又はその断片は当該効果が高いと考えられる）、及び／又は、ＲＦＦＬのユビキチンリガーゼ活性を抑制し得る。これにより、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲの分解を抑制し、嚢胞性線維症を予防又は治療する効果を発揮し得る。
　なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（Ｔｈｅ　ｔｅｒｍ　"ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ"　ｉｎｃｌｕｄｅｓ　"ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ"　ａｎｄ　"ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｏｆ．"）。
　以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、特に断らない限り、ＧＦＰはＧｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎを、ＨＲＰはＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを、それぞれ示す。また、３ＨＡ、Ｖ５、ＶＮ１５５、ＶＣ１５５等はタグである。また、用いたＣＦＴＲ及びＲＦＦＬはヒト由来のものである（当該ヒトのＣＦＴＲのアミノ酸配列は配列番号１に、ＲＦＦＬのアミノ酸配列は配列番号３に、それぞれ示される）。
ＲＦＦＬの細胞内局在の検討
　ＨｅＬａ細胞にＲＦＦＬ－ＧＦＰ，ＲＦＦＬ－ｍＣｈｅｒｒｙ　（ｍＣｈ；蛍光タンパク質）またはＲＦＦＬ－ΔＮＴ－ＧＦＰをリポフェクション法によりトランスフェクションした．２日後に細胞を４％　パラホルムアルデヒドで固定し、ａｎｔｉ－Ｒａｂ５　（初期エンドソームマーカー）、　ａｎｔｉ－Ｒａｂ７　（後期エンドソームマーカー）、　またはａｎｔｉ－Ｒａｂ９　（後期期エンドソームマーカー）　抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。また、形質膜をＡｌｅｘａ５９４－ＷＧＡ　（Ｗｈｅａｔ　Ｇｅｒｍ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）　により染色し、核はＤＡＰＩで染色した。染色後、細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。なお、ＲＦＦＬ－ΔＮＴは、ＲＦＦＬのＮ末端部位（アミノ酸２－８８）を欠失させたことを意味する。
　結果を図１に示す。図１からＲＦＦＬがエンドソーム（一部は形質膜）に局在すること、Ｎ末端部位がエンドソームへの局在に重要であること、がわかった。
ＲＦＦＬノックダウン時のｒｅｓｃｕｅｄ　ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ（ｒΔＦ５０８）の形質膜発現の検討
　ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－ＨＲＰ安定発現ＣＦＢＥ細胞に５０ｎＭ　ＡｌｌＳｔａｒｓ　Ｎｅｔａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡ　（ｓｉＮＴ，　Ｑｉａｇｅｎ）　または　ＲＦＦＬ　ｓｉＲＮＡ　（Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿１　（ＳＩ００１４８２３２），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿３　（ＳＩ００１４８２４６），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿５　（ＳＩ０３０８９６５３），　Ｑｉａｇｅｎ）　を　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション５日後に、形質膜に存在する　ｒｅｓｃｕｅｄ　（ｒ）ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－ＨＲＰの発現量を、ＨＲＰの酵素活性を指標に定量した。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で２回洗浄後、細胞外液にＨＲＰ基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　Ｗｅｓｔ　Ｐｉｃｏ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、その化学発光をプレートリーダー（Ｖａｌｉｏｓｋａｎ，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量した。なお，ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－ＨＲＰの形質膜発現は　２６℃、２日間培養により誘導し（ｒｅｓｃｕｅ　処理）、その後、３７℃、１時間インキュベーション後のｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－ＨＲＰの形質膜発現量をｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲ　ＰＭ（ｐｌａｓｍａ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）　ｄｅｎｓｉｔｙ　として定量した（図２上側）。またさらに、３７℃、１時間インキュベーションし、ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－ＨＲＰの形質膜量の減少率を形質膜安定性として定量した（図２下側）。
　図２から、ＲＦＦＬノックダウンは、ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲの形質膜発現および安定性を増加させることが分かった。
ＲＦＦＬノックダウン時のｒｅｓｃｕｅｄ　ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ（ｒΔＦ５０８）の発現量の検討
　ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡ安定発現ＣＦＢＥ細胞に５０　ｎＭ　ＡｌｌＳｔａｒｓ　Ｎｅｔａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡ　（ｓｉＮＴ，　Ｑｉａｇｅｎ）　または　ＲＦＦＬ　ｓｉＲＮＡ　（Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿１　（ＳＩ００１４８２３２），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿３　（ＳＩ００１４８２４６），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿５　（ＳＩ０３０８９６５３）の混合物，　Ｑｉａｇｅｎ）を　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション５日後に、形質膜に存在する　ｒｅｓｃｕｅｄ　（ｒ）ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡ　の発現量を、ウエスタンブロット法により定量した。なお、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡの形質膜発現は、２６℃、２日間培養により誘導した。その後、３７℃、１時間インキュベーションし、ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅ　をＲＩＰＡ　ｂｕｆｆｅｒ　（２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ　８．０），１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％　ＳＤＳ，１％　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００，０．５％　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，　５μｇ／ｍｌ　ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，　５μｇ／ｍｌ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，　１ｍＭ　ＰＭＳＦ）を用いて調製した。ウエスタンブロットには、ａｎｔｉ－ＨＡ　（１６Ｂ１２，　ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ），　ａｎｔｉ－ＲＦＦＬ　（Ｎ２Ｃ３，　ＧｅｎｅＴｅｘ），　ａｎｔｉ－Ｎａ＋／Ｋ＋　ＡＴＰａｓｅ　（Ｈ－３，　ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）抗体を用いた。
　結果を図３に示す。なお、図中のαは「ａｎｔｉ」を意味し、用いた抗体種を示すための記載である。当該結果から、ＲＦＦＬノックダウンは成熟型　ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲの発現量を増加させることが分かった。
ＲＦＦＬノックダウンによる形質膜タンパク質レベルへの影響の検討
　ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－ＨＲＰ，　ＷＴ（野生型）　ＣＦＴＲ－ＨＲＰ，　Ｔ７０　ＣＦＴＲ－ＨＲＰ，ＣＤ４Ｔｌ－Ｌａｍｐ，ＣＤ４ＴｃｃＵｂＡｌｌＲΔＧ，または、ＣＤ４Ｔｌ－λｍ安定発現ＣＦＢＥ細胞に５０ｎＭ　ＡｌｌＳｔａｒｓ　Ｎｅｔａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡ　（ｓｉＮＴ，　Ｑｉａｇｅｎ）　または　ＲＦＦＬ　ｓｉＲＮＡ　（Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿１　（ＳＩ００１４８２３２），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿３　（ＳＩ００１４８２４６），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿５　（ＳＩ０３０８９６５３）　の混合物，　Ｑｉａｇｅｎ）　を　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション５日後に、形質膜に存在する以下の形質膜タンパク質の形質膜発現量を定量した。
　なお、Ｔ７０　ＣＦＴＲは、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲとは異なる既知のＣＦＴＲ変異体の１種である。また、ＣＤ４Ｔは形質膜発現タンパク質の１種であり、ＣＦＴＲとの比較のためにモデルタンパク質として用いた。
　また、ＣＤ４Ｔｌ－Ｌａｍｐ，ＣＤ４ＴｃｃＵｂＡｌｌＲΔＧ，ＣＤ４Ｔｌ－λｍは、ＣＤ４Ｔ改変タンパク質（キメラ）である。ＣＤ４ＴｃｃＵｂＡｌｌＲΔＧ，ＣＤ４Ｔｌ－λｍは公知（Ａｐａｊａ　ＰＭ，　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２０１０　Ｎｏｖ　１；１９１（３）：５５３－７０．，　Ｂａｒｒｉｅｒｅ　Ｈ．　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｃｅｌｌ．　２００７　Ｏｃｔ；１８（１０）：３９５２－６５．．　Ｂａｒｒｉｅｒｅ　Ｈ，，　Ｔｒａｆｆｉｃ．　２００６　Ｍａｒ；７（３）：２８２－９７．）であり、ｃｃはｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌｅｄ（４量体形成配列）を、ＵｂＡｌｌＲΔＧはポリユビキチン化されないユビキチン改変体を、λｍはバクテリオファージラムダの変異体（Ｌ５７Ｃ）を、それぞれ示す。また、ＣＤ４Ｔｌ－ｌａｍｐは、ＣＤ４にＬａｍｐ１（リソソームタンパク質）の細胞質領域を融合した改変タンパク質である。
ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－ＨＲＰ、　ＷＴ　ＣＦＴＲ－ＨＲＰ、　Ｔ７０　ＣＦＴＲ－ＨＲＰ：
　細胞をＰＢＳで２回洗浄後、細胞外液にＨＲＰ基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　Ｗｅｓｔ　Ｐｉｃｏ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、その化学発光をプレートリーダー（Ｖａｌｉｏｓｋａｎ，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量した．なお、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－ＨＲＰの形質膜発現は２６℃、２日間培養により誘導し（ｒｅｓｃｕｅ　処理）、その後，３７℃、１時間インキュベーション後のｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－ＨＲＰの形質膜発現量をｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲ　ＰＭ　ｄｅｎｓｉｔｙとして定量した。
ＣＤ４Ｔｌ－Ｌａｍｐ、ＣＤ４ＴｃｃＵｂＡｌｌＲΔＧ、ＣＤ４Ｔｌ－λｍ：　
ａｎｔｉ－ＣＤ４抗体（ＯＫＴ４）を用いたｃｅｌｌ　ｓｕｒｆａｃｅ　ＥＬＩＳＡ法（Ｏｋｉｙｏｎｅｄａ　ｅｔ　ａｌ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０１０）により定量した。
ＴｆＲ（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）：
４５分間血清飢餓させた細胞に，５μｇ／ｍｌ　Ｂｉｏｔｉｎ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　（Ｔ２３３６３，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　および　ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ　（＃３１００１，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を４℃で結合させ、形質膜のＴｆＲ発現量をＨＲＰ基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　Ｗｅｓｔ　Ｐｉｃｏ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の化学発光量として、プレートリーダー（Ｖａｌｉｏｓｋａｎ，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量した。
　以上の検討の結果を図４に示す。当該結果から、ＲＦＦＬは、ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲの形質膜発現を特異的に調節していること、また、ＲＦＦＬの発現を阻害するとｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲの形質膜発現量が増加すること、が分かった。
ΔＦ５０８　ＣＦＴＲタンパク質安定性に対するＲＦＦＬノックダウンの影響の検討
　ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡ　安定発現ＣＦＢＥ細胞に５０ｎＭ　ＡｌｌＳｔａｒｓ　Ｎｅｔａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡ　（ｓｉＮＴ，　Ｑｉａｇｅｎ）　または　ＲＦＦＬ　ｓｉＲＮＡ　（Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿１　（ＳＩ００１４８２３２），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿３　（ＳＩ００１４８２４６），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿５　（ＳＩ０３０８９６５３）　の混合物，　Ｑｉａｇｅｎ）　を　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション５日後に、細胞に１００μｇ／ｍｌ　ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（ＣＨＸ）を処理し、３７℃で１～３時間培養した。培養後、ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅをＲＩＰＡ　ｂｕｆｆｅｒ　（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ　８．０），１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％　ＳＤＳ，１％　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００，０．５％　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，　５μｇ／ｍｌ　ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，　５μｇ／ｍｌ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，　１ｍＭ　ＰＭＳＦ）　を用いて調製した．なお，ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡは２６℃、２日間培養し、その後、３７℃、１時間インキュベーションして実験に用いた。ウエスタンブロットには、ａｎｔｉ－ＨＡ（１６Ｂ１２，　ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）抗体を用い、成熟型および未成熟型のバンドをｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ　で定量解析した。なお、ＣＨＸはタンパク質合成阻害剤である。
　結果を図５に示す。当該結果から、ＲＦＦＬをノックダウン（発現阻害）することにより、成熟型ΔＦ５０８　ＣＦＴＲは安定化される（分解されにくくなる）ことが分かった。
形質膜タンパク質のエンドサイトーシスに対するＲＦＦＬノックダウンの影響の検討
　ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡ、または，ＣＤ４ＴｃｃＵｂＡｌｌＲΔＧ　安定発現ＣＦＢＥ細胞に５０ｎＭ　ＡｌｌＳｔａｒｓ　Ｎｅｔａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ，　Ｑｉａｇｅｎ）　または　ＲＦＦＬ　ｓｉＲＮＡ　（Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿１　（ＳＩ００１４８２３２），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿３　（ＳＩ００１４８２４６），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿５　（ＳＩ０３０８９６５３）　の混合物，　Ｑｉａｇｅｎ）　を　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　を用いてトランスフェクションした．トランスフェクション５日後に，形質膜に存在する　ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲ，　ＴｆＲ　および　ＣＤ４ＴｃｃＵｂＡｌｌＲΔＧ　を　ａｎｔｉ－ＨＡ抗体　（１６Ｂ１２，　ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ），Ｂｉｏｔｉｎ－Ｔｆ　（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　Ｂｉｏｔｉｎ－ＸＸ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，　ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、または、ａｎｔｉ－ＣＤ４抗体　（ＯＫＴ４，　ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）により標識し、３７℃、５分間インキュベートにより形質膜から消失する形質膜タンパク質の量をエンドサイトーシス量として、ＥＬＩＳＡ法で定量した。なお，ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡは、２６℃、２日間培養により形質膜発現を誘導し、その後、３７℃、１時間インキュベーションして実験に用いた。
　結果を図６に示す。当該結果から、ＲＦＦＬをノックダウン（発現阻害）することにより、ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲの分解を阻害できる（安定化する）ことが分かった。さらに、図５の結果も考慮することにより、当該ＣＦＴＲの安定化は、細胞膜に発現したＣＦＴＲがエンドサイトーシスにより分解されることが阻害されることによって起こることも分かった。
ＲＦＦＬノックダウンによる、ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲのエンドソームへの局在の検討　ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡ　安定発現ＣＦＢＥ細胞に５０ｎＭ　ＡｌｌＳｔａｒｓ　Ｎｅｔａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡ　（ｓｉＮＴ，　Ｑｉａｇｅｎ）　または　ＲＦＦＬ　ｓｉＲＮＡ　（Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿１　（ＳＩ００１４８２３２），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿３　（ＳＩ００１４８２４６），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿５　（ＳＩ０３０８９６５３）　の混合物，　Ｑｉａｇｅｎ）　を　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション５日後に、形質膜からエンドサイトーシスされたｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡを　ａｎｔｉ－ＨＡ　抗体　（１６Ｂ１２，　ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で３７℃、１時間標識した　（ｃｈａｓｅ　０ｈ）。その後、細胞外のａｎｔｉ－ＨＡ抗体をｗａｓｈｏｕｔし、３７℃、２時間インキュベートした（ｃｈａｓｅ　２ｈ）。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定後、免疫蛍光染色を行い、ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡの細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。なお、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡは２６℃、２日間培養し、その後、３７℃、１時間インキュベーションして実験に用いた。核はＤＡＰＩで染色した。また、初期エンドソームマーカーであるＥＥＡ１をａｎｔｉ－ＥＥＡ１抗体（ＭＢＬ，　ＰＭ０６２）で免疫蛍光染色を行った。
　結果を図７に示す。当該結果から、ＲＦＦＬをノックダウン（発現阻害）することにより、ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲが初期エンドソームに蓄積することが分かった。
ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲとＲＦＦＬの相互作用解析
　ＨＢＨ（Ｈｉｓ－Ｂｉｏｔｉｎ－Ｈｉｓ）－ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡ　または　ＨＢＨ－ＷＴ　ＣＦＴＲ－３ＨＡ　安定発現ＢＨＫ細胞に　ＧＦＰ－Ｖ５　または　ＲＦＦＬ－Ｖ５をリポフェクション法によりトランスフェクションした。２６℃、２４時間低温培養後、１００μｇ／ｍｌ　ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅを２６℃、２４時間処理し、さらに３７℃、５時間処理して、未成熟型ＣＦＴＲを除去した。トランスフェクション３日後に、細胞をｍｉｌｄ　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ，　２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ　８．０），　０．１％　ＮＰ－４０，　１　ｍＭ　ＰＭＳＦ，　５　μｇ／ｍｌ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ　ａｎｄ　ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）に可溶化し、ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅを調製した。Ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅをＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ　ａｇａｒｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と４℃、３時間インキュベーションし、ＲＦＦＬ－ＨＢと結合した成熟型ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲをａｎｔｉ－ＨＡ　（１６Ｂ１２，　ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）抗体を用いたウエスタンブロット法で検出した。
　結果を図８に示す。当該結果から、ＲＦＦＬは成熟型ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲと結合するが、ＷＴ（野生型）ＣＦＴＲとは結合しないことが分かった。推測するに、ＲＦＦＬは生体内で何らかの機能を担っているものの、その本来の機能とは関係なく、ΔＦ５０８変異を認識してＣＦＴＲに結合し、ユビキチン化してしまっているものと考えられる。
プルダウン実験による成熟型ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲとＲＦＦＬの相互作用解析
　ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡ　安定発現ＢＨＫ細胞に　ＲＦＦＬ－ＨＢ（Ｈｉｓ－Ｂｉｏｔｉｎ）野生型、または、各変異体をリポフェクション法によりトランスフェクションした。２６℃、３６時間低温培養後、５０μｇ／ｍｌ　ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅを、２６℃、１６時間処理し、さらに３７℃、４時間処理して、未成熟型ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲを除去した。トランスフェクション３日後に、細胞をｍｉｌｄ　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ，　２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ　８．０），　０．１％　ＮＰ－４０，　１　ｍＭ　ＰＭＳＦ，　５　μｇ／ｍｌ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ　ａｎｄ　ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）に可溶化し、ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅを調製した。Ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅをＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ　ａｇａｒｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と、４℃、４時間インキュベーションし、ＲＦＦＬ－ＨＢと結合した成熟型ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲをａｎｔｉ－ＨＡ（１６Ｂ１２，　ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）抗体を用いたウエスタンブロット法で検出した。
　結果を図９上側に示す。また、解析に用いたＲＦＦＬ各変異体の構造を図９下側に示す。当該結果から、ＲＦＦＬと成熟型ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲとのインタラクションには、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲのＮ末端側アミノ酸配列（特にΔＦ５０８　ＣＦＴＲアミノ酸配列の２～４３番目に含まれるアミノ酸配列）の存在が重要であることが分かった。
ＢｉＦＣ法によるＲＦＦＬとｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲの相互作用解析
　ＣＯＳ－７細胞に、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡ－ＶＮ１５５（ΔＦ５０８－ＶＮ）およびＲＦＦＬ－ＶＣ１５５（ＲＦＦＬ－ＶＣ）をリポフェクションによりｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、３日後に細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定後、ａｎｔｉ－ＨＡ抗体（１６Ｂ１２，　ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）またはａｎｔｉ－ＲＦＦＬ抗体（Ｎ２Ｃ３，　ＧｅｎｅＴｅｘ）を用いて免疫蛍光染色を行った。なお、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡは２６℃（ｒΔＦ５０８）、または、３７℃（ΔＦ５０８）で、３６時間培養し、その後、３７℃、２．５時間インキュベーションして実験に用いた。染色後、細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。また、ｒΔＦ５０８－ＶＮとＲＦＦＬ－ＶＣの相互作用する細胞内局在を調べるために、初期エンドソームマーカーであるｍＲＦＰ－Ｒａｂ５を共発現させ、上記と同様に免疫蛍光染色後、焦点レーザー顕微鏡で観察した。
　結果を図１０に示す。なお、図中、ΔＮＴ－ＶＣは、図９下側のΔＮＴにＶＣ１５５タグが結合したものを示す。当該結果から、ＲＦＦＬと成熟型ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲとのインタラクションは、主にエンドソームで起こっていることが分かった。
成熟型ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲ　ユビキチン化に対するＲＦＦＬノックダウンの影響の検討
　ＨＢＨ－ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡ　安定発現ＣＦＢＥ細胞に５０ｎＭ　ＡｌｌＳｔａｒｓ　Ｎｅｔａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡ　（ｓｉＮＴ，　Ｑｉａｇｅｎ）　または　ＲＦＦＬ　ｓｉＲＮＡ　（Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿１　（ＳＩ００１４８２３２），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿３　（ＳＩ００１４８２４６），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿５　（ＳＩ０３０８９６５３）　の混合物，　Ｑｉａｇｅｎ）　をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション５日後に、細胞に１００μｇ／ｍｌ　ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ　（ＣＨＸ）　を処理し、２７℃で１１時間培養後、１００μｇ／ｍｌ　ＣＨＸ、１０μＭ　ＭＧ－１３２、１μＭ　ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ　Ａ１および１０μＭ　ＰＲ－６１９を３７℃で１時間処理した。その後、ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅをＲＩＰＡ　ｂｕｆｆｅｒ　（２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ　８．０），１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％　ＳＤＳ，１％　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００，０．５％　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，　５μｇ／ｍｌ　ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，　５μｇ／ｍｌ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，　１ｍＭ　ＰＭＳＦ）を用いて調製し、ユビキチン化ＣＦＴＲを変性条件でＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ　ａｇａｒｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて単離後、ウエスタンブロットにより解析した。結果を図１１に示す。当該結果から、ＲＦＦＬをノックダウン（発現阻害）することにより、ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲのユビキチン化が抑制されることが分かった。
成熟型ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲポリユビキチン修飾に対するＲＦＦＬノックダウンの影響の検討
　ＨＢＨ－ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡ　安定発現ＣＦＢＥ細胞に５０ｎＭ　ＡｌｌＳｔａｒｓ　Ｎｅｔａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡ　（ｓｉＮＴ，　Ｑｉａｇｅｎ）　または　ＲＦＦＬ　ｓｉＲＮＡ　（Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿１　（ＳＩ００１４８２３２），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿３　（ＳＩ００１４８２４６），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿５　（ＳＩ０３０８９６５３）　の混合物，　Ｑｉａｇｅｎ）　を　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション５日後に、細胞に１００μｇ／ｍｌ　ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（ＣＨＸ）を処理し、２７℃で１１時間培養後、１００μｇ／ｍｌ　ＣＨＸ、１０μＭ　ＭＧ－１３２、１μＭ　ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ　Ａ１および１０μＭ　ＰＲ－６１９を３７℃で１時間処理した。その後、ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅをＲＩＰＡ　ｂｕｆｆｅｒ　（２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ　８．０），１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％　ＳＤＳ，１％　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００，０．５％　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，　５μｇ／ｍｌ　ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，　５μｇ／ｍｌ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，　１ｍＭ　ＰＭＳＦ）を用いて調製し、ユビキチン化ＣＦＴＲを変性条件でＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ　ｃｏａｔｅｄ　９６　ｗｅｌｌ　ｗｈｉｔｅ　ｐｌａｔｅ　（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に固定後、ａｎｔｉ－ＨＡ（１６Ｂ１２，　ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ａｎｔｉ－Ｋ４８－Ｕｂ　（Ａｐｕ２，　ＥＭＤ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ａｎｔｉ－Ｋ６３－Ｕｂ　（Ａｐｕ３，　ＥＭＤ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により、ＣＦＴＲ、Ｋ４８ポリユビキチン鎖およびＫ４８ポリユビキチン鎖修飾を定量し、各ユビキチン化ＣＦＴＲ量は各ユビキチン鎖量をＣＦＴＲ量で補正し、比較解析した。
　結果を図１２に示す。当該結果から、ＲＦＦＬは、ゴルジ体を通過した後のΔＦ５０８（すなわち成熟型ΔＦ５０８）のユビキチン化を調整していることが分かった。
ＲＦＦＬによる成熟型ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ポリユビキチン化の検討
　ＨＢＨ－ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡ　安定発現ＢＨＫ細胞を　２６℃、３６時間培養後、１００μｇ／ｍｌ　ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（ＣＨＸ）を処理し、２７℃で９時間培養した。その後、Ｔｒｉｓ－ＮＰ－４０　ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ　７．４），　１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ，　２　ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ，　５　ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，　０．１％　ＮＰ－４０，　５　ｍＭ　ＴＣＥＰ，　１　ｍＭ　ＰＭＳＦ，　５μｇ／ｍｌ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，　５μｇ／ｍｌ　ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　Ａ　ａｎｄ　２．５　ｍＭ　ＡＴＰ）　を用いて　ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅを調製後、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ　ａｇａｒｏｓｅ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　に成熟型　ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲを固定化した。さらに、常法により大腸菌から精製した０．２μＭ　Ｈｉｓ６－Ｅ１、６μＭ　Ｈｉｓ６－ｓｕｍｏ－ＵｂｃＨ５ｃ，　３μＭ　Ｈｉｓ６－Ｕｂｃ１３／Ｕｅｖ１ａ　（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍ），　５μＭ　Ｈｉｓ６－ｓｕｍｏ－ＲＦＦＬ，　２０μＭ　Ｕｂ，　Ｕｂ－６３Ｒ　（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍ），　Ｕｂ－６３Ｋ　（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍ）を添加し、ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ　７．５，　５０　ｍＭ　ＮａＣｌ，　５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　２．５　ｍＭ　ＡＴＰ，　５　ｍＭ　ＴＣＥＰ，　０．１％　ＮＰ－４０，　１０μＭ　ＭＧ－１３２）で３７℃、２時間インキュベートした。ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ　ａｇａｒｏｓｅに固定化された成熟型ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲを２Ｍ　Ｕｒｅａ　ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（２Ｍ　ｕｒｅａ，　２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ　８．０），１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％　ＳＤＳ，１％　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００，０．５％　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）　で洗浄後，ｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ　（８　Ｍ　ｕｒｅａ，　２％　ＳＤＳ，　３　ｍＭ　ｂｉｏｔｉｎ）でユビキチン化ｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲを単離し，ウエスタンブロットにより解析した。
　結果を図１３に示す。なお、Ｅ１はユビキチン活性化酵素（Ｅ１）を示し、ＵｂｃＨ５ｃ及びＵｂｃ１３／Ｕｅｖ１ａはユビキチン結合酵素（Ｅ２）の１種であり、ＵｂｃＨ５ｃは非選択的ユビキチン結合を、Ｕｂｃ１３／Ｕｅｖ１ａはＫ６３に特異的なユビキチン結合を起こし、Ｕｂはユビキチンを示し、Ｕｂ－６３ＲはＫ６３をＲに変えたユビキチンを示し、Ｕｂ－６３ＫはＫ６３以外のＫを全てＲに変えたユビキチンを示す。当該結果から、ＲＦＦＬは直接的にｒΔＦ５０８　ＣＦＴＲのユビキチン化を促進すること、特に、K６３結合型ポリユビキチン化を促進することが分かった。
ＲＦＦＬのノックダウンによるＣＦＴＲ　ｃｏｒｒｅｃｔｏｒの作用への影響の検討
　ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡ安定発現ＣＦＢＥ細胞に５０ｎＭ　ＡｌｌＳｔａｒｓ　Ｎｅｔａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡ　（ｓｉＮＴ，　Ｑｉａｇｅｎ）　または　ＲＦＦＬ　ｓｉＲＮＡ　（Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿１　（ＳＩ００１４８２３２），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿３　（ＳＩ００１４８２４６），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿５　（ＳＩ０３０８９６５３）　の混合物，　Ｑｉａｇｅｎ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション４日後に、３μＭ　ＶＸ－８０９、または３μＭ　ＶＸ－８０９、１０μＭ　Ｃ４（ＣＦＴＲ　ｃｏｒｒｅｃｔｏｒ　ＩＩ，　Ｃｏｒｒ－４ａ，　ＣＡＳ　４２１５８０－５３－２　－　Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、５％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ　（Ｔｒｉｏ）を、３７℃で２４時間処理した。トランスフェクション５日後に、ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅをＲＩＰＡ　ｂｕｆｆｅｒ（２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ　８．０），１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％　ＳＤＳ，１％　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００，０．５％　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，　５μｇ／ｍｌ　ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，　５μｇ／ｍｌ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，　１　ｍＭ　ＰＭＳＦ）を用いて調製し，ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡの発現量をウエスタンブロット法により定量した。ウエスタンブロットには，ａｎｔｉ－ＨＡ（１６Ｂ１２，　ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ａｎｔｉ－ＲＦＦＬ（Ｎ２Ｃ３，　ＧｅｎｅＴｅｘ）、ａｎｔｉ－Ｎａ＋／Ｋ＋　ＡＴＰａｓｅ（Ｈ－３，　ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）抗体を用いた。結果を図１４ａに示す。
　また、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－ＨＲＰ安定発現ＣＦＢＥ細胞に５０ｎＭ　ＡｌｌＳｔａｒｓ　Ｎｅｔａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡ　（ｓｉＮＴ，　Ｑｉａｇｅｎ）または　ＲＦＦＬ　ｓｉＲＮＡ　（Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿１　（ＳＩ００１４８２３２），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿３　（ＳＩ００１４８２４６），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿５　（ＳＩ０３０８９６５３）　の混合物，　Ｑｉａｇｅｎ）　をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション４日後に，３μＭ　ＶＸ－８０９　または３μＭ　ＶＸ－８０９、１０μＭ　Ｃ４（ＣＦＴＲ　ｃｏｒｒｅｃｔｏｒ　ＩＩ，　Ｃｏｒｒ－４ａ，　ＣＡＳ　４２１５８０－５３－２　－　Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、５％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ　（Ｔｒｉｏ）を、３７℃で２４時間処理した。その後、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－ＨＲＰの形質膜発現量をＨＲＰ基質　（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　Ｗｅｓｔ　Ｐｉｃｏ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。結果を図１４ｂに示す。
　なお、ＶＸ－８０９は以下の構造式で示される化合物であり、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲのミスフォールディングの正常化を促進する効果があると言われている。また、ＶＸ－８０９をＣ４及びグリセロールと併せて用いる（Ｔｒｉｏと呼ばれる）ことで、当該効果が強化されると言われている （Ｏｋｉｙｏｎｅｄａ，　Ｎａｔ　Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ　２０１３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　これらの結果から、ＣＦＴＲ　ｃｏｒｒｅｃｔｏｒとＲＦＦＬノックダウンを併用することにより、成熟型ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ発現量を飛躍的に増やすことができることが分かった。
ＲＦＦＬのノックダウン及びＣＦＴＲ　ｃｏｒｒｅｃｔｏｒによるＣＦＴＲチャネル機能への影響の検討
　ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－３ＨＡおよび　ＹＦＰ－Ｆ４６Ｌ／Ｈ１４８Ｑ／Ｉ１５２Ｌ　安定発現ＣＦＢＥ細胞に５０ｎＭ　ＡｌｌＳｔａｒｓ　Ｎｅｔａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡ　（ｓｉＮＴ，　Ｑｉａｇｅｎ）　または　ＲＦＦＬ　ｓｉＲＮＡ　（Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿１　（ＳＩ００１４８２３２），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿３　（ＳＩ００１４８２４６），　Ｈｓ＿ＲＦＦＬ＿５　（ＳＩ０３０８９６５３）　の混合物，　Ｑｉａｇｅｎ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション４日後に、３μＭ　ＶＸ－８０９単独、３μＭ　ＶＸ－８０９及び１０μＭ　Ｃ４、または３μＭ　ＶＸ－８０９、１０μＭ　Ｃ４、及び　５％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ（Ｔｒｉｏ）を３７℃で２４時間処理した。トランスフェクション５日後に、ＹＦＰ　ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ　ａｓｓａｙを行い、ＣＦＴＲチャネル活性を測定した。なお、ＣＦＴＲ　チャネルの活性化は、２０μＭ　ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、０．５ｍＭ　３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｔｈｙｌ－ｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ）、０．５ｍＭ　８－（４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏ）－ａｄｅｎｏｓｉｎｅ－３’，５’－ｃｙｃｌｉｃ　ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｃｐｔ－ｃＡＭＰ）、０．１ｍＭ　ｇｅｎｉｓｔｅｉｎの添加により行った。
　結果を図１５に示す。当該結果から、ＲＦＦＬのノックダウンはＣＦＴＲ　ｃｏｒｒｅｃｔｏｒ　により改善されたΔＦ５０８　ＣＦＴＲのチャネル機能を、さらに高めることが分かった。
　図１４及び図１５の結果から推測される概要を図１６に示す。
ＲＦＦＬとΔＦ５０８　ＣＦＴＲとの相互作用部位の探索
　ＣＯＳ－７細胞にΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－ＮＢＤ１－ＶＮ１５５（ΔＦ－ＮＢＤ１－ＶＮ）およびＲＦＦＬ－ＶＣ１５５（ＲＦＦＬ－ＶＣ）を、リポフェクションにより、ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、２日後に細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定後、ａｎｔｉ－ＧＦＰ（ＶＣ）抗体（ｍＦＸ７５，　ｗａｋｏ）を用いて免疫蛍光染色を行った。ＤＡＰＩで核染色後、細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。なお、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲ－ＮＢＤ１とは、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲのアミノ酸配列４３３～５８３番目のアミノ酸配列からなるペプチドフラグメントである。
　結果を図１７に示す。当該結果から、ΔＦ５０８　ＣＦＴＲがＲＦＦＬと相互作用するためには、その４３３～５８３番目のアミノ酸配列が重要であることが確認できた。

Claims (11)

  1. 被験物質が適用された系において、
    （１）５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を有するＣＦＴＲ又は当該変異を含むペプチドフラグメントとＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメントとの相互作用を測定する工程を含むか、あるいは
    （２）ＲＦＦＬのユビキチンリガーゼ活性を測定する工程を含む、
    嚢胞性線維症予防又は治療剤のスクリーニング方法。
  2. ５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を有するＣＦＴＲが、以下の（ｉ－１ａ）又は（ｉ－２ａ）に記載のＣＦＴＲである、請求項１に記載の方法。
    （ｉ－１ａ）：配列番号１のアミノ酸配列において、５０８番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなる、ＣＦＴＲ
    （ｉ－２ａ）：（ｉ－１ａ）のＣＦＴＲのアミノ酸配列において、前記５０８番目のフェニルアラニンの欠失が維持された状態で、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＦＦＬと相互作用可能な、ＣＦＴＲ
  3. ＣＦＴＲの５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を含むペプチドフラグメントが、以下の（ｉ－１ｂ）、（ｉ－２ｂ）又は（ｉ－３ｂ）に記載のポリペプチドである、請求項１又は２に記載の方法。
    （ｉ－１ｂ）：配列番号２のアミノ酸配列において、７６番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなる、ポリペプチド
    （ｉ－２ｂ）：（ｉ－１ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記７６番目のフェニルアラニンの欠失が維持された状態で、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＦＦＬと相互作用可能な、ポリペプチド
    （ｉ－３ｂ）：（ｉ－１ｂ）又は（ｉ－２ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる、ポリペプチド
  4. 工程（１）におけるＲＦＦＬが、以下の（ｉｉ－１ａ）又は（ｉｉ－２ａ）に記載のＲＦＦＬである、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
    （ｉｉ－１ａ）：配列番号３のアミノ酸配列からなるＲＦＦＬ
    （ｉｉ－２ａ）：（ｉｉ－１ａ）のＲＦＦＬのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（ｉ－１ａ）配列番号１のアミノ酸配列において、５０８番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなるＣＦＴＲと相互作用可能な、ＲＦＦＬ
  5. ＲＦＦＬの断片を含むペプチドフラグメントが、（ｉｉ－１ｂ）、（ｉｉ－２ｂ）又は（ｉｉ－３ｂ）に記載のポリペプチドである、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
    （ｉｉ－１ｂ）：配列番号３のアミノ酸配列において、２～４３番目のアミノ酸配列が維持された状態で、１又は２以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （ｉｉ－２ｂ）：（ｉｉ－１ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（ｉ－１ａ）配列番号１のアミノ酸配列において、５０８番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなるＣＦＴＲと相互作用可能な、ポリペプチド
    （ｉｉ－３ｂ）：（ｉｉ－１ｂ）又は（ｉｉ－２ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる、ポリペプチド
  6. 工程（２）におけるＲＦＦＬが、以下の（ｉｉ－１ｃ）又は（ｉｉ－２ｃ）に記載のＲＦＦＬである、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
    （ｉｉ－１ｃ）：配列番号３のアミノ酸配列からなるＲＦＦＬ
    （ｉｉ－２ｃ）：（ｉｉ－１ｃ）のＲＦＦＬのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつユビキチンリガーゼ活性を有する、ＲＦＦＬ
  7. ５０８番目のフェニルアラニンが欠失した変異を有するＣＦＴＲ又は当該変異を含むペプチドフラグメント、あるいはＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメント、あるいはこれらのポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種のポリペプチドをコードする核酸が組み込まれた発現ベクター、を含有する、嚢胞性線維症予防又は治療剤。
  8. （ｉ－１ａ）：配列番号１のアミノ酸配列において、５０８番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなる、ＣＦＴＲ、
    （ｉ－２ａ）：（ｉ－１ａ）のＣＦＴＲのアミノ酸配列において、前記５０８番目のフェニルアラニンの欠失が維持された状態で、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＦＦＬと相互作用可能な、ＣＦＴＲ、
    （ｉ－１ｂ）：配列番号２のアミノ酸配列において、７６番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
    （ｉ－２ｂ）：（ｉ－１ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記７６番目のフェニルアラニンの欠失が維持された状態で、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲＦＦＬと相互作用可能な、ポリペプチド、
    （ｉ－３ｂ）：（ｉ－１ｂ）又は（ｉ－２ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
    （ｉｉ－１ａ）：配列番号３のアミノ酸配列からなるＲＦＦＬ、
    （ｉｉ－２ａ）：（ｉｉ－１ａ）のＲＦＦＬのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（ｉ－１ａ）配列番号１のアミノ酸配列において、５０８番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなるＣＦＴＲと相互作用可能な、ＲＦＦＬ、
    （ｉｉ－１ｂ）：配列番号３のアミノ酸配列において、１～４４番目のアミノ酸配列が維持された状態で、１又は２以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｉｉ－２ｂ）：（ｉｉ－１ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（ｉ－１ａ）配列番号１のアミノ酸配列において、５０８番目のフェニルアラニンが欠失したアミノ酸配列からなるＣＦＴＲと相互作用可能な、ポリペプチド、及び
    （ｉｉ－３ｂ）：（ｉｉ－１ｂ）又は（ｉｉ－２ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、並びに、
    これらのポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種のポリペプチドがコードされた核酸が組み込まれた発現ベクター、
    からなる群より選択される少なくとも１種を含有する、請求項７に記載の嚢胞性線維症予防又は治療剤。
  9. ＲＦＦＬ又はその断片を含むペプチドフラグメントをコードする核酸と相補的な核酸、あるいは当該相補的な核酸を備えた核酸又はその断片、あるいはこれらの核酸及びその断片からなる群より選択される少なくとも１種の核酸を細胞内に供与できる核酸供与体を含有する、嚢胞性線維症予防又は治療剤。
  10. （Ｉ）：配列番号３のアミノ酸配列からなるＲＦＦＬをコードする核酸と相補的な核酸、
    （ＩＩ）：（Ｉ）の核酸の塩基配列と配列同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつＲＦＦＬの発現を抑制する核酸、
    （ＩＩＩ）：（Ｉ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＲＦＦＬの発現を抑制する核酸、
    （Ｉ－ｄｓ）：配列番号３のアミノ酸配列からなるＲＦＦＬをコードする核酸と、当該核酸と相補的な核酸とからなる、二重鎖核酸又はその断片、
    （ＩＩ－ｄｓ）：（Ｉ）の核酸の塩基配列と配列同一性が８０％以上の塩基配列からなる核酸と、当該核酸と相補的な核酸とからなり、かつＲＦＦＬの発現を抑制する二重鎖核酸又はその断片、
    （ＩＩＩ－ｄｓ）：（Ｉ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸と、当該核酸と相補的な核酸とからなり、かつＲＦＦＬの発現を抑制する二重鎖核酸又はその断片、及び
    （ＩＶ－ｄｓ）：分子内アニーリングにより、（Ｉ－ｄｓ）、（ＩＩ－ｄｓ）、又は（ＩＩＩ－ｄｓ）の二重鎖核酸又はその断片を構成する核酸、並びに
    これらの核酸及びその断片からなる群より選択される少なくとも１種の核酸を細胞内に供与できる核酸供与体
    からなる群より選択される少なくとも１種を含有する、請求項９に記載の嚢胞性線維症予防又は治療剤。
  11. ＲＦＦＬを認識する抗体又はその断片を含有する、嚢胞性線維症予防又は治療剤。
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