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WO2018159842A1 - ダルベポエチン組成物の製造方法およびダルべポエチン産生細胞の培養方法 - Google Patents

ダルベポエチン組成物の製造方法およびダルべポエチン産生細胞の培養方法 Download PDF

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WO2018159842A1
WO2018159842A1 PCT/JP2018/008156 JP2018008156W WO2018159842A1 WO 2018159842 A1 WO2018159842 A1 WO 2018159842A1 JP 2018008156 W JP2018008156 W JP 2018008156W WO 2018159842 A1 WO2018159842 A1 WO 2018159842A1
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WO
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darbepoetin
medium
cells
composition
culture
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Application number
PCT/JP2018/008156
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French (fr)
Inventor
正義 塚原
耕一 山本
石原　尚
眞礼登 細野
泰志郎 中川
直史 奥村
智子 磯田
Original Assignee
協和発酵キリン株式会社
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Publication date
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    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a darbepoetin composition, a method for culturing animal cells having the ability to produce darbepoetin, and the like.
  • glycoproteins are one of the genetically engineered proteins that are still difficult to produce even if genetic engineering technology advances. Many proteins exist as glycoproteins with added sugar chains, and it is known that the difference in the sugar chain structure greatly affects the function of the protein itself.
  • Biopharmaceuticals using genetic recombination technology are produced by introducing human protein genes into animal cells.
  • the sugar chain structure is not uniform due to sugar chain-degrading enzymes such as sialidase produced from the production cells, so that there may be cases where sufficient drug efficacy is not exhibited.
  • Erythropoietin a hematopoietic factor
  • EPO Erythropoietin
  • the blood half-life is decreased and hardly exhibits physiological activity.
  • darbepoetin has been found in which part of the amino acid sequence of EPO is modified for the purpose of further extending the half-life in blood of EPO and the number of sialic acids added is increased (Non-patent Document 2, Patent). Reference 1).
  • Darbepoetin has five N-linked sugar chains and one O-linked sugar chain, has a continuous erythrocyte-increasing action, and can reduce administration frequency compared to conventional EPO preparations. It becomes possible and the burden on the patient can be reduced.
  • the sugar chain control method includes, for example, 2-deoxy-2,3-dehydro, which is an inhibitor of sialidase, in order to inhibit elimination of sialic acid from glycoproteins by glycolytic enzymes secreted into the culture medium.
  • a method of culturing by adding a low molecular weight compound such as -N-acetylneuraminic acid (NeuAc2en) to the medium is known.
  • the medium conventionally used for culturing the animal cells is serum or serum-derived such as albumin, transferrin or insulin. Substances and animal-derived proteins have been added.
  • the addition of serum or serum-derived substances or animal-derived proteins to the culture medium may result in the risk of contamination of the cell culture and the product produced from it by hepatitis, viruses, bovine spongiform encephalopathy (BSE), etc. Therefore, development of a completely synthetic medium that does not contain serum or serum-derived substances and animal-derived proteins has been carried out.
  • the components of a typical fully synthetic medium include amino acids, organic or inorganic salts, vitamins, minerals, trace metals, sugars, lipids, nucleic acids, etc., but plant-derived protein hydrolysates such as soybeans It is known that by adding to a completely synthetic medium, the growth of animal cells and the production amount of the product obtained from the animal cells can be improved in the same manner as a serum-containing medium (Patent Documents 2 and 3). .
  • the present invention provides a method for producing a darbepoetin composition having a high sialic acid addition number by culturing darbepoetin-producing cells, and improving the total production amount of the darbepoetin composition secreted from the cells into the culture solution, and Another object of the present invention is to provide a method for producing a darbepoetin composition that improves the sialic acid content in one molecule of darbepoetin secreted from the cells into the culture medium.
  • the present inventors improve the total production amount of the darbepoetin composition secreted into the culture medium from the cells, Further, by inhibiting sialidase secreted into the culture solution, the sialic acid addition rate in one molecule of darbepoetin secreted into the culture solution from the cells is improved, and a darbepoetin composition having a high sialic acid addition number is markedly increased.
  • the present invention has been completed by finding that it can be produced.
  • the present invention provides the following (1) to (19).
  • (1) A method for producing a darbepoetin composition comprising the following steps 1 and 2.
  • Step 1 Step of culturing darbepoetin-producing cells in a medium to which a plant-derived protein hydrolyzate has been added to obtain a culture solution
  • Step 2 Step of recovering a darbepoetin composition from the culture solution obtained in Step 1
  • Step 1 Step of culturing darbepoetin-producing cells in a medium to which a plant-derived protein hydrolyzate has been added to obtain a culture solution
  • Step 2 Step of recovering a darbepoetin composition from the culture solution obtained in Step 1 (3 ) 67% or more of the darbepoetin composition containing 12-22 sialic acid per molecule of darbepoetin in the culture medium obtained in step 1 contains darbepoetin composition containing 18-22 sialic acid per darbepoetin molecule
  • the production method according to (1) or (2), which is a product is a product.
  • the total production amount of the darbepoetin composition in the culture solution obtained in step 1 is higher than that in culture in a plant-derived protein hydrolyzate-free medium, any of (1) to (6) 2.
  • the darbepoetin-producing cell is a transformed cell in which a vector containing a gene encoding darbepoetin is introduced into a host cell.
  • the host cell is an animal cell.
  • the animal cell is a Chinese hamster ovary (CHO) cell, a mouse melanoma (NS0) cell or a mouse myeloma (SP2 / 0) cell, or a cell derived from these cells. Production method.
  • the production method according to any one of (1) to (10), wherein the medium to which the plant-derived protein hydrolyzate is added is a completely synthetic medium.
  • the production method according to any one of (1) to (11), wherein the concentration of the plant-derived protein hydrolyzate added to the medium is 1 to 5 g / l.
  • the obtained darbepoetin composition is darbepoetin containing an average of 18 or more sialic acids per molecule.
  • a method for culturing darbepoetin-producing cells comprising culturing darbepoetin-producing cells in a medium to which a plant-derived protein hydrolyzate has been added and secreting the darbepoetin composition into the culture medium.
  • a method for culturing darbepoetin-producing cells comprising culturing darbepoetin-producing cells in a medium to which a plant-derived protein hydrolyzate has been added, and inhibiting sialic acid detachment from the darbepoetin molecules in the culture.
  • a method for inhibiting detachment of sialic acid from a darbepoetin molecule during storage of a culture solution comprising culturing darbepoetin-producing cells in a medium to which a plant-derived protein hydrolyzate has been added to obtain a culture solution .
  • culturing darbepoetin-producing cells in a medium to which a plant-derived protein hydrolyzate has been added improves the total production amount of the darbepoetin composition secreted from the cells into the culture medium.
  • the sialic acid content in one molecule of darbepoetin secreted from the cells into the culture medium can be improved.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of darbepoetin.
  • FIG. 2 is a diagram showing the structures of N-linked and O-linked sugar chains of darbepoetin.
  • NeuAc represents N-acetylneuraminic acid, which is one of sialic acids.
  • FIG. 3 is a graph showing changes with time of the sialic acid isoform distribution of darbepoetin in a culture supernatant cultured in a soybean hydrolyzate-added medium and a soybean hydrolyzate removing solution.
  • Lanes 1 and 14 show darbepotin with 18-22 sialic acid additions.
  • Lane 2 stores soybean hydrolyzate removal liquid at 8 ° C.
  • Lane 3 stores soybean hydrolyzate removal liquid at 8 ° C. for 24 hours
  • Lane 4 stores soybean hydrolyzate removal liquid at 8 ° C. for 48 hours
  • Lane 5 shows the sialic acid isoform distribution when the soybean hydrolyzate removal solution is stored at 8 ° C. for 72 hours.
  • Lane 6 is a culture supernatant cultured in soybean hydrolyzate-containing medium at 8 ° C. for 0 hours
  • Lane 7 is a culture supernatant cultured in soybean hydrolyzate-containing medium at 8 ° C. for 24 hours
  • Lane 8 is soybean The culture supernatant cultured in the hydrolyzate-containing medium is stored at 8 ° C. for 48 hours.
  • Lane 9 shows the sialic acid isoform distribution when the culture supernatant cultured in the soy hydrolyzate-containing medium is stored at 8 ° C. for 72 hours. Each is shown.
  • the sialidase inhibitor NeuAc2en is added to the soybean hydrolyzate removal solution and stored at 8 ° C. for 0 hour
  • the sialidase inhibitor NeuAc2en is added to the soybean hydrolyzate removal solution for 24 hours at 8 ° C.
  • lane 12 added sialidase inhibitor NeuAc2en to soybean hydrolyzate removal solution and stored at 8 ° C. for 48 hours
  • lane 13 added sialidase inhibitor NeuAc2en to soybean hydrolyzate removal solution at 8 ° C.
  • FIG. 4 is a bar graph showing the results of Table 1 in which the ratio (%) of the area value of each sialic acid addition number darbepoetin composition to the total area value of the darbepoetin composition having 12 to 22 sialic acid additions was measured. Is. A vertical axis
  • shaft shows the ratio (%) of the area value of the darbepoetin composition of each sialic acid addition number.
  • the ratio of the area value of 22 sialic acid additions in Table 1 is the ratio of the area values of 22, 22-1S and 22-2S isoforms indicating the darbepoetin composition having 22 sialic acid additions in FIG. It is shown as the sum of (%).
  • the method for producing a darbepoetin composition of the present invention includes the following step 1 and step 2.
  • Step 1 Step of culturing darbepoetin-producing cells in a medium to which a plant-derived protein hydrolyzate has been added to obtain a culture solution
  • Step 2 Step of recovering a darbepoetin composition from the culture solution obtained in Step 1 Each process will be described.
  • Step 1 is a step of culturing cells having the ability to produce darbepoetin in a medium to which a plant-derived protein hydrolyzate is added, and secreting the darbepoetin composition into the medium to obtain a culture solution.
  • darbepoetin was substituted with Asn, Thr, Val, Asn and Thr in WO 95/05465 in the amino acid sequence of human erythropoietin at positions 30, 32, 87, 88 and 90, respectively.
  • [Asn 30 Thr 32 Val 87 Asn 88 Thr 90 ] is a human erythropoietin analog shown as EPO and has the structure shown in FIG.
  • N-linked sugar chains are bound to Asn residues at positions 24, 30, 38, 83 and 88 of darbepoetin, and O-linked sugar chains are bound to Ser residues at position 126.
  • the main structure of the type sugar chain and the O-linked sugar chain includes the structure shown in FIG.
  • the N-linked sugar chain that binds to the darbepoetin molecule contains up to 4 sialic acids, and the end of the O-linked sugar chain contains up to 2 sialic acids.
  • One darbepoetin molecule contains up to 22 sialic acids. Of sialic acid.
  • darbepoetin includes, for example, darbepoetin alfa or darbepoetin alfa (genetical recombination) or biosuccessors thereof.
  • novel erythropoiesis stimulating protein and NESP (trademark) or Aranesp (trademark) disclosed in International Publication No. 2003/020299, or their biosequential products are also included in the darbepoetin of the present invention.
  • the host cell of the darbepoetin-producing cell used in the present invention may be any animal cell belonging to any one of mammals, birds, reptiles, amphibians, fish and insects.
  • animal cells derived from primates such as humans or monkeys or animal cells derived from rodents such as mice, rats or hamsters are used.
  • Examples of cells belonging to mammals include myeloma cells or cells derived from myeloma cells, ovary cells, kidney cells, blood cell cells, uterine cell connective tissue cells, mammary cells, or embryonic retinoblasts.
  • myeloma cells or cells derived from myeloma cells and ovarian cells are preferable.
  • cells selected from myeloma cells or cells derived from myeloma cells and ovarian cells are preferable.
  • Chinese hamster ovary (CHO) cells, mouse melanoma (NS0) cells, or mouse myeloma (SP2 / 0) Cells or cells derived from these cells.
  • Examples of cells belonging to mammals include human cell lines HL-60 (ATCC CCL-240), HT-1080 (ATCC CCL-121), HeLa (ATCC CCL-2), 293 (ECACC 85120602), Namalwa ( ATCC CRL-1432), Namalwa KJM-1 (Cytotechnology, 1, 151 (1988)), NM-F9 (DSM ACC2605, International Publication No. 05/17130) or PER. C6 (ECACC No. 9602940, US Pat. No.
  • VERO ATCC CCL-1651
  • COS-7 ATCC CRL-1651
  • a monkey cell line C127I
  • a mouse cell line a monkey cell line
  • Sp2 / 0-Ag14 ATCC CRL-1581
  • NIH3T3 ATCCCRL-1658
  • NS0 ATCC CRL-1827
  • CHO-K1 (ATCC CCL-61) is a hamster cell lines, CHO / dhfr - (ATCC CRL -9096), CHO / DG44 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)] or BHK21 (ATCC CRL-10) or MDCK (ATCC CCL-34) which is a canine cell.
  • Examples of cells belonging to birds include chicken cell line SL-29 (ATCC CRL-29), and examples of cells belonging to fish include zebrafish cell line ZF4 (ATCC CRL-2050). Examples thereof include Spodoptera frugiperda cell line Sf9 (ATCC CRL-1711). Examples of primary cultured cells include primary monkey kidney cells, primary rabbit kidney cells, primary chicken fetal cells, and primary quail fetal cells.
  • myeloma cells or cells derived from myeloma cells include Sp2 / 0-Ag14, NS0, Y3 Ag1.2.3. , YO or YB2 / 0.
  • the cells derived from the ovary cells or ovarian cells e.g., CHO-K1, CHO / dhfr - like or CHO / DG44.
  • kidney cells examples include 293, VERO, COS-7, BHK21, and MDCK.
  • blood cells examples include HL-60, Namalwa, Namalwa KJM-1, and NM-F9.
  • uterine cells include uterine cells. , HeLa, etc., as connective tissue cells, for example, HT-1080 or NIH3T3, etc., as mammary cells, for example, C1271I, etc., as embryonic retinoblasts, for example, PER. C6 etc. are mentioned, respectively.
  • Examples of the darbepoetin-producing cell include a transformed cell in which a vector containing a gene encoding darbepoetin is introduced into the above-described host cell, a cell that has been mutated to produce darbepoetin, or darbepoetin. Examples include hybridomas that are fusion cells of cells and myeloma cells. Furthermore, the darbepoetin-producing cells of the present invention include cells obtained by subjecting the above-described cells to a mutation treatment that increases the expression level of darbepoetin.
  • a recombinant vector containing a DNA involved in the production of darbepoetin and a promoter is introduced into the host cell used in the present invention described above. Obtained by.
  • DNA involved in the production of darbepoetin for example, DNA encoding darbepoetin, DNA encoding an enzyme or protein involved in biosynthesis of darbepoetin, and the like can be used.
  • Examples of the vector used for preparing the recombinant vector include pcDNAI, pcDM8 (manufactured by Funakoshi), pAGE107 [Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-22979, Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3. -3 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), pcDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI / Amp (manufactured by Invitrogen), pREP4 (manufactured by Invitrogen), pAGE103 [J. Biochem. , 101, 1307 (1987)], or pAGE210.
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 early promoter SV40 early promoter
  • retrovirus promoter examples include promoters, metallothionein promoters, heat shock promoters, SR ⁇ promoters, and the like.
  • an enhancer of IE gene of human CMV may be used together with a promoter.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the cell.
  • an electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)].
  • Calcium phosphate method Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075
  • lipofection method Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075
  • any protein hydrolyzate can be used as long as it is a protein hydrolyzate derived from plants such as wheat, rice or soybean, but protein hydrolyzate derived from soybean is particularly preferable. .
  • a plant-derived protein hydrolyzate is a mixture containing, as a main component, short-chain peptides such as amino acids and dipeptides or tripeptides obtained by degrading proteins obtained from plants as raw materials, and trace metals. .
  • an acid decomposition method using an acid such as hydrochloric acid
  • an enzyme decomposition method using an enzyme such as a protease can be mentioned, and membrane treatment is performed as necessary.
  • the average molecular weight of the plant-derived protein hydrolyzate is preferably 800 Da or less, stepwise, more preferably 600 Da or less, still more preferably 450 Da or less, and particularly preferably 300 Da or less.
  • the molecular weight distribution of the plant-derived protein hydrolyzate is preferably ⁇ 500 Da, preferably 45-80%, 500-1000 Da, preferably 15-30%, 1000-2000 Da, preferably 5-15%, 2000-5000 Da. Is 2 to 10%.
  • ⁇ 2000 Da is more preferably 90 to 98%, and ⁇ 2000 Da is further preferably 95 to 98%.
  • protein hydrolysates derived from soybean include Amysoy, Hy-Soy, NZ-Soy, HyPep (hereinafter, Quest International), Soy Pettone (Gibco), Bac-Soyton (Difco), SE50MK ( DMV International Nutritions), Peptone Hy-Soy T, or Soy Hydrolysate UF (from Sigma-Aldrich), and other protein hydrolysates derived from wheat or rice include HyPep (Quest International).
  • the timing of adding the plant-derived protein hydrolyzate to the culture solution is not particularly limited at the start of culture or during the culture, but it is preferably added to the medium at the start of culture.
  • the plant-derived protein hydrolyzate may be added to the medium alone as a feed medium, or previously mixed with other medium components. It may be added to the medium as a prepared feed medium.
  • the culture period is not particularly limited, but the final main culture period is preferably 8 days or longer.
  • the main culture period is preferably 8 days to 1 month, more preferably 10 days to 21 days, and particularly preferably 10 days to 14 days.
  • the concentration of the plant-derived protein hydrolyzate added to the medium may be appropriately selected depending on the type of cells used for the culture, the timing of addition of the plant-derived protein hydrolyzate, and preferably 0.1 to 100 g. / L, more preferably 1 to 10 g / L, particularly preferably 1 to 5 g / L.
  • the medium used in the present invention may be any medium as long as it can be used for culturing darbepoetin-producing cells, but a completely synthetic medium containing no serum or serum-derived substance or animal-derived protein should be used. Is preferred.
  • basal medium used for normal animal cell culture is used as the basal medium.
  • basal media used for normal animal cell culture include, for example, RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM (DMEM) medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biologic Medicine, 73, 1 (1950)], F12 medium (manufactured by LTI) [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Iskov modified Dulbecco medium IMDM medium
  • J. Experimental Medicine 147, 923 (1978)
  • EX-CELL325PF medium manufactured by JRH
  • modified medium or mixed medium thereof preferably RPMI1640 medium, DMEM medium, F12 medium, IMDM medium or EX- CELL 325PF medium or the like is used.
  • a nutrient factor or a physiologically active substance necessary for the growth of animal cells is added to the basal medium as necessary.
  • These additives are preferably contained in the medium in advance before culturing.
  • nutritional factors examples include sugars such as glucose, amino acids, vitamins, and the like.
  • amino acids examples include L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cystine, L-glutamic acid, L-glutamine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L -Lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine and the like are used, and one kind or a combination of two or more kinds is used.
  • vitamins include d-biotin, D-pantothenic acid, choline, folic acid, myo-inositol, niacinamide, pyridoxal, riboflavin, thiamine, cyanocobalamin, and DL- ⁇ -tocopherol. Used in combination.
  • substances that are added in place of animal-derived substances in a completely synthetic medium that does not contain animal-derived substances do not include, for example, physiologically active substances, hydrolysates, or animal-derived substances produced by genetic recombination methods. Examples thereof include lipids, minerals, trace metals, and nucleic acids. Examples of the physiologically active substance produced by the gene recombination method include gene recombinant insulin, gene transferrin, gene recombinant albumin, gene recombinant growth factor, and the like.
  • lipids that do not contain animal-derived substances include cholesterol, linoleic acid, and linolenic acid.
  • ADPF medium (Animated protein free medium; HyClone), CD-Hybridoma medium (Invitrogen), CD-CHO medium (Invitrogen), IS CD-CHO medium, or KINSM- 10 medium (Irvine Scientific).
  • a medium containing a high concentration of amino acids and vitamins such as a medium in which RPMI1640 medium, DMEM medium and F12 medium are mixed at a ratio of 1: 1: 1, DMEM medium and F12 A medium in which the medium is mixed at a ratio of 1: 1, a hybridoma SFM medium (manufactured by Invitrogen) and the like are preferably used.
  • the total production amount of the darbepoetin composition in the culture solution obtained in step 1 is improved when the culture is completed in a medium containing the above-mentioned plant-derived protein hydrolyzate. It means that the concentration of the darbepoetin composition in the unit culture volume is improved as compared with the case of culturing in the above plant-derived hydrolyzate-free medium.
  • the concentration of the darbepoetin composition in the unit culture volume can be determined using any known protein concentration measurement method such as ELISA or HPLC, but for example, Biacore (GE Healthcare) can be used.
  • the protein concentration measuring method used is mentioned.
  • sialic acid is preferably 18-22, more preferably 19-22, particularly preferably 20-22, most preferably 22 per molecule of darbepoetin. It has an added structure.
  • the darbepoetin composition in the culture solution obtained in step 1 preferably 67% or more of the darbepoetin composition containing 12 to 22 sialic acids per molecule of darbepoetin comprises 18 to 22 siaals per darbepoetin molecule. It is a darbepoetin composition containing an acid. Preferably, 55% or more of the darbepoetin composition containing 12-22 sialic acid per molecule of darbepoetin is a darbepoetin composition containing 19-22 sialic acid per molecule of darbepoetin.
  • the darbepoetin composition containing 12 to 22 sialic acid per molecule of darbepoetin is a darbepoetin composition containing 20 to 22 sialic acid per molecule of darbepoetin.
  • 18% or more of the darbepoetin composition containing 12 to 22 sialic acids per molecule of darbepoetin is a darbepoetin composition containing 22 sialic acids per molecule of darbepoetin.
  • the darbepoetin composition in the culture solution obtained in step 1 include, for example, preferably a darbepoetin composition containing 12 to 22 sialic acids per molecule of darbepoetin 10 to 14 days after the start of culture. Mention may be made of darbepoetin compositions in which more than 67% contain 18-22 sialic acids per molecule of darbepoetin. Further, specifically, for example, preferably 55% or more of the darbepoetin composition containing 12 to 22 sialic acids per molecule of darbepoetin on the 10th to 14th day after the start of the culture is 19 to 22 per darbepoetin molecule.
  • darbepoetin composition containing sialic acid preferably, at least 10% of darbepoetin composition containing 12-22 sialic acid per molecule of darbepoetin on the 10th to 14th day after the start of culturing is 20-22 per darbepoetin molecule.
  • a darbepoetin composition containing sialic acid preferably 18% or more of the darbepoetin composition containing 12 to 22 sialic acids per molecule of darbepoetin on the 10th to 14th day after the start of culturing is 22 siales per darbepoetin molecule.
  • a darbepoetin composition containing an acid may be mentioned.
  • the number of sialic acids in the darbepoetin composition can be determined by measuring the sialic acid isoform distribution of darbepoetin by an isoelectric focusing method using a capillary electrophoresis apparatus (manufactured by Beckman Coulter) or the like.
  • Step 2 is a step of recovering the darbepoetin composition from the culture solution obtained in Step 1.
  • the darbepoetin composition secreted into the culture medium by the culture in step 1 can be purified according to a known method, and the production method of the present invention may further include a purification step of purifying the darbepoetin composition.
  • a culture supernatant is obtained from the culture solution obtained in step 1 by a technique such as centrifugation, and from the culture supernatant, a normal recombinant protein isolation and purification method, that is, a solvent extraction method, ammonium sulfate, etc.
  • resin such as DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical), S-Sepharose FF (Pharmacia) Cation exchange chromatography using resin such as butyl sepharose, or hydrophobic chromatography using resin such as phenyl sepharose,
  • the darbepoetin composition is preferably darbepoetin containing an average of 18 or more sialic acids per molecule, more preferably an average of 18.5 or more per molecule.
  • the darbepoetin composition is preferably, for example, preferably an average of 18 or more per molecule, more preferably an average of 18.5 or more per molecule, obtained from a culture solution 10 to 14 days after the start of culture. Examples include darbepoetin containing an acid.
  • the number of sialic acids in the darbepoetin composition is determined by measuring the sialic acid isoform distribution of darbepoetin using isoelectric focusing using a capillary electrophoresis apparatus (manufactured by Beckman Coulter) or the like. Can do.
  • the present invention relates to a method for culturing darbepoetin-producing cells, comprising culturing darbepoetin-producing cells in a medium to which a plant-derived protein hydrolyzate has been added and secreting the darbepoetin composition into the culture solution.
  • the culture of darbepoetin-producing cells in the culture method is the same as in step 1 described above.
  • the present invention also relates to a method for producing a darbepoetin-producing cell comprising culturing darbepoetin-producing cells in a medium to which a plant-derived protein hydrolyzate has been added, and inhibiting detachment of sialic acid from darbepoetin molecules in the culture.
  • the present invention relates to a culture method.
  • the culture of darbepoetin-producing cells in the culture method is the same as in step 1 described above.
  • the present invention relates to detachment of sialic acid from a darbepoetin molecule during storage of a culture solution, including culturing darbepoetin-producing cells in a medium supplemented with a plant-derived protein hydrolyzate to obtain a culture solution. It relates to a method of inhibiting. According to the method of the present invention, the action of the plant-derived protein hydrolyzate contained in the culture solution inhibits the elimination of sialic acid from the darbepoetin molecule by sialidase until purification is started after completion of the culture. The rate of sialic acid addition to darbepoetin molecules during storage of the culture medium can be improved.
  • save conditions of a culture solution are not specifically limited, Preferably it can preserve
  • Example 1 Comparison of sialic acid addition rate of darbepoetin composition produced in soybean hydrolyzate-containing medium and non-containing medium Using CHO cells producing darbepoetin, fed batch culture was performed in a 1 L Erlenmeyer flask. The sialic acid addition rate of darbepoetin was compared between the hydrolyzate-containing medium and the non-containing medium.
  • the darbepoetin-producing CHO cells were expanded from a 125 mL Erlenmeyer flask to a 500 mL Erlenmeyer flask using EX-CELL325PF medium (Sigma-Aldrich), and further expanded in a 1 L Erlenmeyer flask (Corning). Thus, a seed culture solution necessary for the main culture was obtained.
  • Expansion culture was carried out at 37 ° C. for 3 or 4 days by seeding the cells so that the amount of medium was about 10-30% of each flask volume to 2 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • a medium based on KINSM-10 medium Irvine Scientific
  • 3 g / L of soybean hydrolyzate Soy Hydrateate UF Sigma-Aldrich; molecular weight distribution: ⁇ 500 Da is 66%, 500 to 1000 Da is 22 %, 1000-2000 Da 9%, 2000-5000 Da 3%) with or without (Soy) or added (without Soy)
  • the seed culture is centrifuged in a 1 L Erlenmeyer flask filled with 200 mL of production medium (1000 rpm, 25 ° C., 5 minutes), and the cells from which the supernatant was removed were seeded at 2.0 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • the cell density immediately after sowing was 2.4 ⁇ 10 5 cells / mL in the soybean hydrolyzate-
  • the culture solution was collected, and the total production amount of the darbepoetin composition in the culture solution was measured using Biacore (GE Healthcare). Furthermore, about 600 ⁇ g of the darbepoetin composition in the collected sample was separated and obtained from these collected samples using a separator [AKTA explorer (manufactured by GE Healthcare)] having an anti-darbepoetin monoclonal antibody column.
  • AKTA explorer manufactured by GE Healthcare
  • the sialic acid isoform distribution of the obtained darbepoetin composition was measured using a capillary electrophoresis apparatus (manufactured by Beckman Coulter).
  • the Cartridge temperature was set to 25 ° C.
  • the voltage value was set to 6 kV
  • 10 mmol / L Tricine 10 mmol / L NaCl
  • 10 mmol / L sodium acetate 7 mmol / L UREA
  • 2.5 mmol / L Putrescine, pH 4 was performed using a buffer consisting of .7.
  • Table 1 and FIG. 4 show the results of measuring the ratio (%) of the area value of the darbepoetin composition having each sialic acid addition number to the total area value of the darbepoetin composition having 12 to 22 sialic acid additions.
  • the ratio of darbepoetin having 18 to 22 sialic acid additions was higher than that in the soybean hydrolyzate-free medium (no Soy). Increased. On the 14th day of culture, the ratio was 12.3% for darbepoetin with 18 sialic acid additions, 11.2% for darbepoetin with 19 sialic acid additions, and 12 for darbepoetin with 20 sialic acid additions.
  • darbepoetin with 21 sialic acid additions is 13.6%
  • darbepoetin with 22 sialic acid additions is 18.6%
  • the ratio of darbepoetin with 22 sialic acid additions is particularly remarkable Increased to.
  • the average sialic acid addition number per molecule was 18.7.
  • the total production amount of the darbepoetin composition having 12 to 22 sialic acid additions was about 1.7 to 2.2 times higher in the soybean hydrolyzate-containing medium than in the soybean hydrolyzate-free medium.
  • soybean hydrolyzate is effective as a medium composition for producing a darbepoetin composition having a large number of sialic acid additions.
  • Example 2 Inhibition of sialic acid elimination from darbepoetin molecules by soybean hydrolyzate in the culture medium
  • a culture supernatant cultured in a soybean hydrolyzate-containing medium prepared in the same manner as in Example 1 was tested at 0 ° C. The stability test was conducted after storage for ⁇ 72 hours. Further, the culture supernatant cultured in a soybean hydrolyzate-containing medium prepared in the same manner as in Example 1 was concentrated using a concentrated membrane (Amicon Ultra-4 30000MWCO, manufactured by Millipore) and then replaced with MilliQ water. A hydrolyzate removing solution was prepared and stored at 8 ° C. for 0 to 72 hours in the same manner.
  • a concentrated membrane Amicon Ultra-4 30000MWCO, manufactured by Millipore
  • soybean hydrolyzate in the medium inhibits sialic acid elimination from sialicase-added darbepoetin molecules.

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Abstract

本発明は、ダルベポエチン生産細胞を培養してダルベポエチン組成物を製造する方法において、ダルベポエチン組成物の総生産量が向上し、かつ、該細胞より培養液中に分泌されるダルベポエチン１分子中のシアル酸含有率を向上させる、ダルベポエチン組成物の製造方法を提供することを目的とする。本発明は、植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養し、培養液を得る工程１、および工程１により得られた培養液からダルベポエチン組成物を回収する工程２を含むダルべポエチン組成物の製造方法に関する。

Description

ダルベポエチン組成物の製造方法およびダルべポエチン産生細胞の培養方法
　本発明は、ダルベポエチン組成物の製造方法、およびダルべポエチンを生産する能力を有する動物細胞の培養方法等に関する。
　近年、動物細胞を用いた遺伝子組換え蛋白質などの有用物質の生産が盛んに行われているが、最大の産生物収量を得るために、該動物細胞の該蛋白質などの発現能力自体を増加させるだけでなく、該動物細胞の増殖を向上させることが求められている。
　一方、遺伝子組み換え技術が進歩しても、いまだに生産することが困難な遺伝子組換え蛋白質の一つに糖蛋白質がある。蛋白質の多くは、糖鎖の付加した糖蛋白質として存在しており、その糖鎖構造の違いが蛋白質そのものの機能に大きな影響を与えることが知られている。
　遺伝子組み換え技術を応用したバイオ医薬品では、ヒトの蛋白質の遺伝子を動物細胞に導入することによって生産されている。しかし、動物細胞を用いて糖蛋白質を生産した場合、該生産細胞より生じるシアリダーゼ等の糖鎖分解酵素等によってその糖鎖構造が不均一となるため、十分な薬効を示さない場合もある。
　造血因子であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）は３本のＮ－結合型糖鎖と１本のＯ－結合型糖鎖を有しており、糖鎖末端のシアル酸数に応じて血中半減期が変化し、糖鎖末端のシアル酸数が減少すると血中半減期が減少しほとんど生理活性を示さないことが知られている（非特許文献１）。また、ＥＰＯの血中半減期を更に延長することを目的にＥＰＯのアミノ酸配列の一部を改変し、更にシアル酸付加数を増加させたダルベポエチンが見出されている（非特許文献２、特許文献１）。
　ダルベポエチンは５本のＮ－結合型糖鎖と１本のＯ－結合型糖鎖を有しており、持続的な赤血球増加作用を有し、従来のＥＰＯ製剤に比べて投与頻度を減らすことが可能となり、患者の負担を軽減することができる。
　しかし、上述の理由により、ＥＰＯよりも多くのシアル酸含有糖鎖を有する均一なダルベポエチンを効率的に生産するためには、生産量の向上と共により高度な糖鎖制御技術が求められていた。
　糖鎖制御方法としては、培養液中に分泌される糖鎖分解酵素による糖蛋白質からのシアル酸の脱離を阻害させる為に、例えばシアリダーゼの阻害剤である２－デオキシ－２，３－デヒドロ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ２ｅｎ）等の低分子化合物を培地に添加して培養する方法が知られている。
　一方、動物細胞の増殖及び該動物細胞による産生物質の生産量を向上させる為に、従来該動物細胞を培養する際に用いられる培地には、アルブミン、トランスフェリンまたはインスリンのような、血清または血清由来の物質や動物由来の蛋白質が添加されてきた。血清または血清由来の物質や動物由来の蛋白質の培地への添加は、細胞培養物およびそこから得られる産生物質が肝炎、ウイルスまたは牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などにより汚染される危険性があることから、血清または血清由来の物質および動物由来の蛋白質を含まない完全合成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ）の開発が行われてきた。
　典型的な完全合成培地の構成成分としては、アミノ酸、有機塩または無機塩、ビタミン、ミネラル、微量金属、糖、脂質、および核酸等が挙げられるが、ダイズなどの植物由来の蛋白質加水分解物を完全合成培地に添加することによって、血清含有培地と同等に動物細胞の増殖及び該動物細胞から得られる産生物質の生産量を向上させることが出来ることが知られている（特許文献２、３）。
日本国特許第２９３８５７２号明細書 国際公開第２００１／０２３５２７号 国際公開第２００６／０４５４３８号
Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｊ．，１９９３；１０；２６３ Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，２００１；１６；３－１３
　しかしながら、ダルベポエチン組成物の総生産量を向上しつつ、かつ、該細胞より培養液中に分泌されるダルベポエチン１分子中のシアル酸含有率を向上させる方法は知られていなかった。
　したがって、本発明は、ダルベポエチン生産細胞を培養して高いシアル酸付加数のダルベポエチン組成物を製造する方法において、該細胞より培養液中に分泌されるダルベポエチン組成物の総生産量を向上し、かつ、該細胞より培養液中に分泌されるダルベポエチン１分子中のシアル酸含有率を向上させる、ダルベポエチン組成物の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、植物由来の蛋白質加水分解物を含有した培地を用いてダルベポエチン生産細胞を培養することによって、該細胞より培養液中に分泌されるダルベポエチン組成物の総生産量が向上し、かつ、培養液中に分泌されるシアリダーゼを阻害することによって該細胞より培養液中に分泌されるダルベポエチン１分子中のシアル酸付加率が向上し、高いシアル酸付加数のダルベポエチン組成物を顕著に生産出来ることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下の（１）～（１９）を提供するものである。
（１）以下の工程１および工程２を含むダルベポエチン組成物の製造方法。
工程１：植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養して培養液を得る工程
工程２：工程１で得られた培養液からダルベポエチン組成物を回収する工程
（２）以下の工程１および工程２を含む、ダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離が阻害されたダルべポエチン組成物の製造方法。
工程１：植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養して培養液を得る工程
工程２：工程１で得られた培養液からダルベポエチン組成物を回収する工程
（３）工程１で得られた培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の６７％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１８～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、（１）または（２）に記載の製造方法。
（４）工程１で得られた培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の５５％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１９～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、（１）～（３）のいずれか１に記載の製造方法。
（５）工程１で得られた培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の４４％以上が、ダルベポエチン１分子あたり２０～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、（１）～（４）のいずれか１に記載の製造方法。
（６）工程１で得られた培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の１８％以上が、ダルベポエチン１分子あたり２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、（１）～（５）のいずれか１に記載の製造方法。
（７）工程１で得られた培養液中のダルベポエチン組成物の総生産量が植物由来の蛋白質加水分解物非含有培地中で培養時と比較して高い、（１）～（６）のいずれか１に記載の製造方法。
（８）ダルベポエチン生産細胞が、宿主細胞にダルベポエチンをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換細胞である、（１）～（７）のいずれか１に記載の製造方法。
（９）宿主細胞が動物細胞である、（８）に記載の製造方法。
（１０）動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウス黒色腫（ＮＳ０）細胞若しくはマウス骨髄腫（ＳＰ２／０）細胞、またはこれらの細胞に由来する細胞である、（９）に記載の製造方法。
（１１）植物由来の蛋白質加水分解物を添加する培地が完全合成培地である、（１）～（１０）のいずれか１に記載の製造方法。
（１２）培地中に添加する植物由来の蛋白質加水分解物の濃度が１～５ｇ／ｌである、（１）～（１１）のいずれか１に記載の製造方法。
（１３）植物由来の蛋白質加水分解物がダイズ由来の蛋白質加水分解物である、（１）～（１２）のいずれか１に記載の製造方法。
（１４）さらにダルベポエチン組成物を精製する精製工程を含む、（１）～（１３）のいずれか１に記載の製造方法。
（１５）精製工程が陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはゲルろ過から選ばれる少なくとも１つである、（１４）に記載の製造方法。
（１６）得られるダルベポエチン組成物が、１分子あたり平均１８個以上のシアル酸を含有するダルベポエチンである、（１）～（１５）のいずれか１に記載の製造方法。
（１７）植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養し、培養液中にダルベポエチン組成物を分泌させることを含む、ダルベポエチン生産細胞の培養方法。
（１８）植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養し、培養中のダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離を阻害することを含む、ダルベポエチン生産細胞の培養方法。
（１９）植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養して培養液を得ることを含む、培養液保存中のダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離を阻害する方法。
　本発明の製造方法においては、植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養することにより、該細胞より培養液中に分泌されるダルベポエチン組成物の総生産量が向上し、かつ該細胞より培養液中に分泌されるダルベポエチン１分子中のシアル酸含有率を向上させることができる。
図１は、ダルベポエチンの構造を示す図である。 図２は、ダルベポエチンのＮ－結合型糖鎖およびＯ－結合型糖鎖の構造を示す図である。図２において、ＮｅｕＡｃはシアル酸の１つであるＮ－アセチルノイラミン酸を表す。 図３は、ダイズ加水分解物添加培地で培養した培養上清およびダイズ加水分解物除去液でのダルベポエチンのシアル酸アイソフォーム分布の経時変化を示す図である。レーン１及びレーン１４はシアル酸付加数が１８～２２個のダルベポチンを示す。レーン２はダイズ加水分解物除去液を８℃で０時間保管、レーン３はダイズ加水分解物除去液を８℃で２４時間保管、レーン４はダイズ加水分解物除去液を８℃で４８時間保管、レーン５はダイズ加水分解物除去液を８℃で７２時間保管した場合のシアル酸アイソフォーム分布をそれぞれ示す。レーン６はダイズ加水分解物含有培地で培養した培養上清を８℃で０時間保管、レーン７はダイズ加水分解物含有培地で培養した培養上清を８℃で２４時間保管、レーン８はダイズ加水分解物含有培地で培養した培養上清を８℃で４８時間保管、レーン９はダイズ加水分解物含有培地で培養した培養上清を８℃で７２時間保管した場合のシアル酸アイソフォーム分布をそれぞれ示す。レーン１０はダイズ加水分解物除去液にシアリダーゼの阻害剤ＮｅｕＡｃ２ｅｎを添加して８℃で０時間保管、レーン１１はダイズ加水分解物除去液にシアリダーゼの阻害剤ＮｅｕＡｃ２ｅｎを添加して８℃で２４時間保管、レーン１２はダイズ加水分解物除去液にシアリダーゼの阻害剤ＮｅｕＡｃ２ｅｎを添加して８℃で４８時間保管、レーン１３はダイズ加水分解物除去液にシアリダーゼの阻害剤ＮｅｕＡｃ２ｅｎを添加して８℃で７２時間保管した場合のシアル酸アイソフォーム分布をそれぞれ示す。 図４は、シアル酸付加数１２～２２個のダルベポエチン組成物の総面積値に対する各シアル酸付加数のダルベポエチン組成物の面積値の割合（％）を測定した表１の結果を棒グラフで示したものである。縦軸は各シアル酸付加数のダルベポエチン組成物の面積値の割合（％）を示す。表１のシアル酸付加数２２個の面積値の割合は、図４におけるシアル酸付加数が２２個であるダルベポエチン組成物を示す２２、２２―１Ｓおよび２２－２Ｓのアイソフォームの面積値の割合（％）の合計で示される。
　本発明のダルベポエチン組成物の製造方法は、以下の工程１および工程２を含む。
工程１：植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養して培養液を得る工程
工程２：工程１で得られた培養液からダルベポエチン組成物を回収する工程
　以下、各工程を説明する。
［工程１］
　工程１は、植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にて、ダルベポエチンを生産する能力を有する細胞を培養して、培地中にダルベポエチン組成物を分泌させて、培養液を得る工程である。
　本発明において、ダルベポエチンは国際公開第９５／０５４６５号において、ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列中３０、３２、８７、８８および９０位のアミノ酸残基がそれぞれＡｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＡｓｎおよびＴｈｒに置換された、［Ａｓｎ３０Ｔｈｒ３２Ｖａｌ８７Ａｓｎ８８Ｔｈｒ９０］ＥＰＯとして示されるヒトエリスロポエチン類似体であり、図１に示す構造を有する。
　ダルベポエチンの２４、３０、３８、８３及び８８位のＡｓｎ残基にはＮ－結合型糖鎖が、１２６位のＳｅｒ残基にはＯ－結合型糖鎖がそれぞれ結合しており、Ｎ－結合型糖鎖およびＯ－結合型糖鎖の主な構造としては図２に示す構造が挙げられる。
　ダルベポエチン分子に結合するＮ－結合型糖鎖には最大４個のシアル酸が、Ｏ－結合型糖鎖の末端には最大２個のシアル酸が含まれており、ダルベポエチン１分子には最大２２個のシアル酸が含まれる。
　本発明において、ダルベポエチンとしては、例えば、ダルベポエチンアルファ若しくはダルベポエチンアルファ（遺伝子組換え）またはこれらのバイオ後続品も含まれる。また、国際公開第２００３／０２０２９９号にて開示されているｎｏｖｅｌ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ及びＮＥＳＰ（商標）若しくはＡｒａｎｅｓｐ（商標）、またはこれらのバイオ後続品も本発明のダルベポエチンに含まれる。
　本発明に用いられるダルベポエチン生産細胞の宿主細胞としては、哺乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類および昆虫類などのいずれかに属する動物細胞など、いずれを用いてもよいが、哺乳類に属する動物細胞が好適に用いられ、より好ましくは、ヒトまたはサルなどの霊長類に由来する動物細胞またはマウス、ラットまたはハムスターなどの齧歯類に由来する動物細胞が用いられる。
　哺乳類に属する細胞としては、例えば、ミエローマ細胞またはミエローマ細胞に由来する細胞、卵巣細胞、腎臓細胞、血球細胞、子宮細胞結合組織細胞、乳腺細胞または胚性網膜芽細胞などが挙げられる。特にミエローマ細胞またはミエローマ細胞に由来する細胞および卵巣細胞から選ばれる細胞が好ましく、具体的には例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウス黒色腫（ＮＳ０）細胞若しくはマウス骨髄腫（ＳＰ２／０）細胞、またはこれらの細胞に由来する細胞が挙げられる。
　哺乳類に属する細胞としては、例えば、ヒト細胞株であるＨＬ－６０（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－２４０）、ＨＴ－１０８０（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－１２１）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－２）、２９３（ＥＣＡＣＣ　８５１２０６０２）、Ｎａｍａｌｗａ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１４３２）、Ｎａｍａｌｗａ　ＫＪＭ－１（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，１５１（１９８８））、ＮＭ－Ｆ９（ＤＳＭ　ＡＣＣ２６０５、国際公開第０５／１７１３０号）若しくはＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ　Ｎｏ．９６０２２９４０、米国特許第６８５５５４４号明細書）、サル細胞株であるＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－１６５１）若しくはＣＯＳ－７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１６５１）、マウス細胞株であるＣ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１６１６）、Ｓｐ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１５８１）、ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ－１６５８）、ＮＳ０（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１８２７）、ラット細胞株であるＹ３　Ａｇ１．２．３．（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６３１）、ＹＯ（ＥＣＡＣＣＮｏ：８５１１０５０１）およびＹＢ２／０（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１６６２）、ハムスター細胞株であるＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ－（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－９０９６）、ＣＨＯ／ＤＧ４４［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）］若しくはＢＨＫ２１（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１０）、またはイヌ細胞であるＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－３４）などが挙げられる。
　鳥類に属する細胞としては、例えばニワトリ細胞株ＳＬ－２９（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－２９）など、魚類に属する細胞としては、例えばゼブラフィッシュ細胞株ＺＦ４（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－２０５０）など、昆虫類に属する細胞としては、例えば、蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株Ｓｆ９（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１７１１）などがそれぞれ挙げられる。また、例えば、初代培養細胞として、初代サル腎細胞、初代ウサギ腎細胞、初代ニワトリ胎児細胞または初代ウズラ胎児細胞などが挙げられる。
　ミエローマ細胞またはミエローマ細胞に由来する細胞としては、例えば、Ｓｐ２／０－Ａｇ１４、ＮＳ０、Ｙ３　Ａｇ１．２．３．、ＹＯまたはＹＢ２／０などが挙げられる。卵巣細胞または卵巣細胞に由来する細胞としては、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ－またはＣＨＯ／ＤＧ４４などが挙げられる。
　また、腎臓細胞としては、例えば、２９３、ＶＥＲＯ、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ２１またはＭＤＣＫ等が、血球細胞としてはＨＬ－６０、Ｎａｍａｌｗａ、Ｎａｍａｌｗａ　ＫＪＭ－１またはＮＭ－Ｆ９などが、子宮細胞としては、例えば、ＨｅＬａなどが、結合組織細胞としては、例えば、ＨＴ－１０８０またはＮＩＨ３Ｔ３などが、乳腺細胞としては、例えば、Ｃ１２７１Ｉなどが、胚性網膜芽細胞としては、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６などが、それぞれ挙げられる。
　ダルベポエチン生産細胞としては、例えば、上述の宿主細胞にダルベポエチンをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換細胞、変異処理を施してダルベポエチンを産生するようになった細胞、またはダルベポエチンを産生する細胞とミエローマ細胞との融合細胞であるハイブリドーマなどが挙げられる。さらに、上述の細胞にダルベポエチンの発現量を上昇させるような変異処理を施した細胞なども本発明のダルベポエチン生産細胞に包含される。
　ダルベポエチンをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換細胞は、ダルベポエチンの生産に関与するＤＮＡとプロモーターなどを含む組換え体ベクターなどを、上述の本発明に用いられる宿主細胞に導入することによって得られる。
　ダルベポエチンの生産に関与するＤＮＡとしては、例えば、ダルベポエチンをコードするＤＮＡ、ダルベポエチンの生合成に関わる酵素または蛋白質をコードするＤＮＡなどのいずれも用いることができる。
　該組換え体ベクターを調製するために用いられるベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３－２２９７９号公報、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、ｐｃＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、またはｐＡＧＥ２１０などが挙げられる。
　プロモーターとしては、本発明で用いる動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターまたはＳＲαプロモーター等が挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーなどをプロモーターとともに用いてもよい。
　宿主細胞への組換え体ベクターの導入方法としては、例えば、当該細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、またはリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）、またはＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］などが挙げられる。
　植物由来の蛋白質加水分解物としては、小麦、イネまたはダイズ等の植物由来の蛋白質加水分解物であれば、いかなる蛋白質加水分解物を用いることができるが、ダイズ由来の蛋白質加水分解物が特に好ましい。
　植物由来の蛋白質加水分解物は、原料となる植物から得られる蛋白質を分解して得られるアミノ酸及びジペプチドあるいはトリペプチド等の短鎖ペプチドを主成分とする他、微量金属等を含む、混合物である。植物由来の蛋白質加水分解物の製造においては、塩酸等の酸を用いた酸分解法またはプロテアーゼ等の酵素を用いた酵素分解法が挙げられ、必要に応じて膜処理が行われる。
　植物由来の蛋白質加水分解物の平均分子量は８００Ｄａ以下であることが好ましく、以下段階的に、より好ましくは６００Ｄａ以下、さらに好ましくは４５０Ｄａ以下、特に好ましくは３００Ｄａ以下である。
　植物由来の蛋白質加水分解物の分子量分布としては、＜５００Ｄａが好ましくは４５～８０％、５００～１０００Ｄａが好ましくは１５～３０％、１０００～２０００Ｄａが好ましくは５～１５％、２０００～５０００Ｄａが好ましくは２～１０％である。または、＜２０００Ｄａがより好ましくは９０～９８％、＜２０００Ｄａがさらに好ましくは９５～９８％である。
　ダイズ由来の蛋白質加水分解物としては、例えば、Ａｍｙｓｏｙ、Ｈｙ－Ｓｏｙ、Ｎ－Ｚ－Ｓｏｙ、ＨｙＰｅｐ（以上、Ｑｕｅｓｔ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）、Ｓｏｙ　ｐｅｐｔｏｎｅ（Ｇｉｂｃｏ社）、Ｂａｃ－Ｓｏｙｔｏｎ（Ｄｉｆｃｏ社）、ＳＥ５０ＭＫ（ＤＭＶ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎｓ社）、Ｐｅｐｔｏｎｅ　Ｈｙ－Ｓｏｙ　Ｔ、またはＳｏｙ　Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ　ＵＦ（以上、シグマ―アルドリッチ社製）等、小麦またはイネ由来の蛋白質加水分解物としてはＨｙＰｅｐ（Ｑｕｅｓｔ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）等が挙げられる。
　植物由来の蛋白質加水分解物を培養液に添加する時期は、培養開始時でも培養途中でも特に制限はないが、培養開始時の培地に添加して用いることが好ましい。フェドバッチ培養法またはパーフュージョン培養法等におけるフィード培地として培養途中に添加する場合は、植物由来の蛋白質加水分解物は単独でフィード培地として培地へ添加してもよいし、他の培地成分と予め混合されたフィード培地として培地へ添加してもよい。
　培養期間としては、特に制限はないが、最終の本培養の期間としては好ましくは８日以上である。フェドバッチ培養法において本培養の期間としては、好ましくは８日～１か月、より好ましくは１０日～２１日、特に好ましくは１０日～１４日である。
　培地中へ添加される植物由来の蛋白質加水分解物の濃度は、培養に用いる細胞の種類、植物由来の蛋白質加水分解物の添加時期等により適宜選択すればよいが、好ましくは０．１～１００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは１～１０ｇ／Ｌ、特に好ましくは１～５ｇ／Ｌである。
　本発明に用いられる培地としては、ダルベポエチン生産細胞の培養に用いることができればいかなるものでもよいが、血清あるいは血清由来の物質または動物由来の蛋白質も含まない完全合成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ）を用いることが好ましい。
　ダルベポエチン生産細胞の宿主細胞が動物細胞である場合には、基礎培地として通常の動物細胞の培養に用いられる基礎培地が用いられる。通常の動物細胞の培養に用いられる基礎培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］、Ｆ１２培地（ＬＴＩ社製）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）］、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）［Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）］若しくはＥＸ－ＣＥＬＬ３２５ＰＦ培地（ＪＲＨ社製）またはこれらの改変培地や混合培地等が挙げられるが、好ましくはＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地またはＥＸ－ＣＥＬＬ　３２５ＰＦ培地等が用いられる。
　本発明に用いられる培地としては、基礎培地に必要に応じて動物細胞の生育に必要な栄養因子、または生理活性物質等を添加する。これらの添加物は、培養前にあらかじめ培地に含有させることが好ましい。
　栄養因子としては、例えば、グルコース等の糖、アミノ酸、またはビタミン等が挙げられる。
　アミノ酸としては、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシンまたはＬ－バリン等が挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
　ビタミンとしては、例えば、ｄ－ビオチン、Ｄ－パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ－イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミンまたはＤＬ－α－トコフェロールなどが挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
　その他、動物由来物を含まない完全合成培地において、動物由来物の代わりに添加される物質としては、例えば、遺伝子組換え法で製造された生理活性物質、加水分解物若しくは動物由来物を含まない脂質、ミネラル、微量金属または核酸等が挙げられる。遺伝子組換え法で製造された生理活性物質としては、例えば、遺伝子組換えインシュリン、遺伝子組換えトランスフェリン、遺伝子組換えアルブミンまたは遺伝子組換え増殖因子等が挙げられる。
　動物由来物を含まない脂質としては、例えば、コレステロール、リノール酸、またはリノレイン酸などが挙げられる。
　完全合成培地としては、例えば、ＡＤＰＦ培地（Ａｎｉｍａｌ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ；ＨｙＣｌｏｎｅ社製）、ＣＤ－Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地（インビトロジェン社製）、ＣＤ－ＣＨＯ培地（インビトロジェン社製）、ＩＳ　ＣＤ－ＣＨＯ培地、またはＫＩＮＳＭ－１０培地（Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）などが挙げられる。
　長期間または高密度で培養する場合は、アミノ酸類およびビタミン類を高濃度に含有した培地、例えばＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地およびＦ１２培地を１：１：１の比率で混合した培地、ＤＭＥＭ培地およびＦ１２培地を１：１の比率で混合した培地、ハイブリドーマＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）などが好適に用いられる。
　本発明において、工程１で得られる培養液中のダルベポエチン組成物の総生産量が向上する、とは、上述の植物由来の蛋白質加水分解物を含有する培地で培養した時の培養終了時点での単位培養液量中のダルベポエチン組成物の濃度が、上述の植物由来の加水分解物非含有培地で培養した時と比較して向上することを意味する。
　単位培養液量中のダルベポエチン組成物の濃度は、ＥＬＩＳＡ法またはＨＰＬＣ法等の公知の蛋白質濃度測定方法であれば、いかなるものも用いて求めることが出来るが、例えばＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いた蛋白質濃度測定方法が挙げられる。
　工程１で得られる培養液中のダルベポエチン組成物としては、シアル酸がダルベポエチン１分子あたり好ましくは１８～２２個、より好ましくは１９～２２個、特に好ましくは２０～２２個、最も好ましくは２２個付加した構造を有する。
　工程１で得られる培養液中のダルベポエチン組成物としては、好ましくはダルベポエチン１分子あたり１２～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の６７％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１８～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である。また、好ましくはダルベポエチン１分子あたり１２～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の５５％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１９～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である。また、好ましくはダルベポエチン１分子あたり１２～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の４４％以上が、ダルベポエチン１分子あたり２０～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である。また、好ましくはダルベポエチン１分子あたり１２～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の１８％以上が、ダルベポエチン１分子あたり２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である。
　工程１で得られる培養液中のダルベポエチン組成物としては、具体的には例えば、好ましくは培養開始後１０～１４日目におけるダルベポエチン１分子あたり１２～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の６７％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１８～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物が挙げられる。また、具体的には例えば、好ましくは培養開始後１０～１４日目におけるダルベポエチン１分子あたり１２～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の５５％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１９～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物が挙げられる。また、具体的には例えば、好ましくは培養開始後１０～１４日目におけるダルベポエチン１分子あたり１２～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の４４％以上が、ダルベポエチン１分子あたり２０～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物が挙げられる。また、具体的には例えば、好ましくは培養開始後１０～１４日目におけるダルベポエチン１分子あたり１２～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の１８％以上が、ダルベポエチン１分子あたり２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物が挙げられる。
　ダルベポエチン組成物におけるシアル酸数は、キャピラリー電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）等を用いた等電点電気泳動法等により、ダルベポエチンのシアル酸アイソフォーム分布を測定することにより求めることができる。
［工程２］
　工程２は、工程１で得られた培養液からダルベポエチン組成物を回収する工程である。工程１における培養により培養液中に分泌されたダルベポエチン組成物は、公知の方法に従って精製することができ、本発明の製造方法は、さらに、ダルベポエチン組成物を精製する精製工程を含んでもよい。
　例えば、工程１で得られた培養液から遠心分離等の手法により培養上清を得て、該培養上清から、通常の遺伝子組換え蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、Ｑ－セファロース、若しくはＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱ケミカル社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－セファロースＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、若しくはフェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、逆相クロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法、ＭＦ、ＵＦ／ＤＦ、ウイルス除去膜等の膜を用いたろ過法または濃縮あるいは溶媒交換法等を、単独あるいは組み合わせて用いることにより、ダルベポエチン組成物を得ることができる。
　ダルベポエチン組成物としては、好ましくは１分子あたり平均１８個以上、より好ましくは１分子あたり平均１８．５個以上のシアル酸を含有するダルベポエチンである。ダルベポエチン組成物としては、具体的には例えば、好ましくは培養開始後１０～１４日目の培養液から得られる１分子あたり平均１８個以上、より好ましくは１分子あたり平均１８．５個以上のシアル酸を含有するダルベポエチンが挙げられる。上記と同様に、ダルベポエチン組成物におけるシアル酸数は、キャピラリー電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）等を用いた等電点電気泳動法等を用いてダルベポエチンのシアル酸アイソフォーム分布を測定し求めることができる。
　本発明は、植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養し、培養液中にダルベポエチン組成物を分泌させることを含む、ダルベポエチン生産細胞の培養方法に関する。該培養方法におけるダルベポエチン生産細胞の培養については、上述した工程１と同様である。
　また、本発明は、植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養し、培養中のダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離を阻害することを含む、ダルベポエチン生産細胞の培養方法に関する。該培養方法におけるダルベポエチン生産細胞の培養については、上述した工程１と同様である。
　また、本発明は、植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養して培養液を得ることを含む、培養液保存中のダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離を阻害する方法に関する。本発明の方法によれば、培養液に含有される植物由来の蛋白質加水分解物の作用により、シアリダーゼによるダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離を阻害し、培養終了後から精製が開始されるまでの培養液の保存中におけるダルベポエチン分子へのシアル酸付加率を向上させることができる。培養液の保存条件は特に限定されないが、好ましくは８℃にて７２時間保存することができる。
　以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
［実施例１］ダイズ加水分解物含有培地と不含有培地での生産されるダルベポエチン組成物のシアル酸付加率の比較
　ダルベポエチンを生産するＣＨＯ細胞を用いて、１Ｌ三角フラスコでフェドバッチ培養を行い、ダイズ加水分解物含有培地と不含有培地とでダルベポエチンのシアル酸付加率を比較した。ダルベポエチン産生ＣＨＯ細胞をＥＸ－ＣＥＬＬ３２５ＰＦ培地（シグマ―アルドリッチ社製）を用いて、１２５ｍＬ容量三角フラスコから５００ｍＬ容量三角フラスコに拡大培養を行った後、更に１Ｌ容量三角フラスコ（コーニング社製）で拡大培養し、本培養に必要な種培養液を得た。
　拡大培養は各フラスコ容量の約１０～３０％の培地量で２×１０５細胞／ｍＬとなるように細胞を播種し、３７℃で３日間または４日間で行った。ＫＩＮＳＭ－１０培地（Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を基本とする培地に、３ｇ／Ｌのダイズ加水分解物（Ｓｏｙ　Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ　ＵＦ　シグマ―アルドリッチ社製；分子量分布は、＜５００Ｄａが６６％、５００～１０００Ｄａが２２％、１０００～２０００Ｄａが９％、２０００～５０００Ｄａが３％）を添加（Ｓｏｙあり）または添加せず（Ｓｏｙなし）に調整した生産培地２００ｍＬを満たした１Ｌ三角フラスコに、種培養液を遠心分離（１０００ｒｐｍ、２５℃、５分間）し、上清を取り除いた細胞を２．０×１０５細胞／ｍＬとなるようにそれぞれ播種した。播種直後の細胞密度はダイズ加水分解物含有培地で２．４×１０５細胞／ｍＬ、ダイズ加水分解物不含有培地で１．８×１０５細胞／ｍＬであった。
　その後、３７℃、１００ｒｐｍ、５％ＣＯ２を吹き込んで本培養を開始した。ダイズ加水分解物含有培地には培養開始後４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３日目に、それぞれ培養液量の２％のフィード培地［ＦＭＤＦ－７培地（Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に２ｇ／Ｌのダイズ加水分解物（Ｓｏｙ　Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ　ＵＦ　シグマ―アルドリッチ社製）を添加した培地］を添加した。
　一方、ダイズ加水分解物不含有培地には培養開始後４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３日目に、それぞれ培養液量の２％のフィード培地［ＦＭＤＦ－７培地（Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に１．２ｇ／Ｌの塩化カリウム（和光純薬工業社製）を添加した培地］を添加した。
　培養開始後７日目、１０日目および１４日目に培養液を採取し、培養液中のダルベポエチン組成物の総生産量をＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて測定した。更に、これらの採取サンプルを抗ダルベポエチンモノクローナル抗体カラムを有する分離装置［ＡＫＴＡ　ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）］を用いて採取サンプル中のダルベポエチン組成物を約６００μｇずつ分離、取得した。
　キャピラリー電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて、得られたダルベポエチン組成物のシアル酸アイソフォーム分布を測定した。シアル酸アイソフォーム分布測定はＣａｒｔｒｉｄｇｅ温度を２５℃、電圧値を６ｋＶに設定し、１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｃｉｎｅ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム、７ｍｍｏｌ／Ｌ　ＵＲＥＡ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ、ｐＨ４．７から成るバッファーを用いて実施した。シアル酸付加数１２～２２個のダルベポエチン組成物の総面積値に対する各シアル酸付加数のダルベポエチン組成物の面積値の割合（％）を測定した結果を表１および図４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１および図４に示すように、ダイズ加水分解物含有培地（Ｓｏｙあり）ではダイズ加水分解物不含有培地（Ｓｏｙなし）に比べてシアル酸付加数が１８個～２２個のダルベポエチンの割合が増加した。培養１４日目では、その割合は、シアル酸付加数が１８個ダルベポエチンでは１２．３％、シアル酸付加数が１９個のダルベポエチンでは１１．２％、シアル酸付加数が２０個のダルベポエチンでは１２．４％、シアル酸付加数が２１個のダルベポエチンでは１３．６％、シアル酸付加数が２２個のダルベポエチンでは１８．６％であり、特にシアル酸付加数が２２個のダルベポエチンの割合が顕著に増加した。
　その結果として、表１に示すように、ダイズ加水分解物含有培地では１分子当たりの平均シアル酸付加数は１８．７個であった。また、シアル酸付加数１２～２２個のダルベポエチン組成物の総生産量は、ダイズ加水分解物含有培地ではダイズ加水分解物不含有培地に比べて約１．７～２．２倍に増加した。
　以上の結果から、シアル酸付加数の多いダルベポエチン組成物を製造するための培地組成物としてダイズ加水分解物が有効であることが確認された。
［実施例２］培地中のダイズ加水分解物によるダルベポエチン分子からのシアル酸脱離阻害
　実施例１と同様な方法で調製したダイズ加水分解物含有培地で培養した培養上清を８℃にて０～７２時間保管して安定性試験を行った。また、実施例１と同様な方法で調製したダイズ加水分解物含有培地で培養した培養上清を濃縮膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－４　３００００ＭＷＣＯ）を用いて濃縮後にＭｉｌｌｉＱ水で置換してダイズ加水分解物除去液を調製し、同様に８℃にて０～７２時間保管した。さらに、調製したダイズ加水分解物除去液に公知のシアリダーゼの阻害剤である２－デオキシ－２，３－デヒドロ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ２ｅｎ）を０．５ｍＭ添加し、同様に８℃にて０～７２時間保管した。
　それぞれの保管後の試料を、等電点電気泳動法を用いて解析した結果、ダイズ加水分解物除去液では、経時的なシアル酸高付加数のダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離が認められた（図３、レーン２～５）。一方、ダイズ加水分解物含有培地で培養した培養上清（図３、レーン６～９）およびダイズ加水分解物除去液にシアリダーゼの阻害剤であるＮｅｕＡｃ２ｅｎを添加して保管した場合には、シアル酸高付加数のダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離は認められなかった（図３、レーン１０～１３）。
　以上の結果より、培地中のダイズ加水分解物がシアリダーゼによるシアル酸高付加数のダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離を阻害することが示唆された。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１７年３月３日付けで出願された日本特許出願（特願２０１７－０４０７４７）に基づいており、その全体が引用により援用される。

Claims (19)

  1. 　以下の工程１および工程２を含むダルベポエチン組成物の製造方法。
    工程１：植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養して培養液を得る工程
    工程２：工程１で得られた培養液からダルベポエチン組成物を回収する工程
  2. 　以下の工程１および工程２を含む、ダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離が阻害されたダルべポエチン組成物の製造方法。
    工程１：植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養して培養液を得る工程
    工程２：工程１で得られた培養液からダルベポエチン組成物を回収する工程
  3. 　工程１で得られた培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の６７％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１８～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 　工程１で得られた培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の５５％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１９～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 　工程１で得られた培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の４４％以上が、ダルベポエチン１分子あたり２０～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　工程１で得られた培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２～２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の１８％以上が、ダルベポエチン１分子あたり２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 　工程１で得られた培養液中のダルベポエチン組成物の総生産量が植物由来の蛋白質加水分解物非含有培地中で培養時と比較して高い、請求項１～６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　ダルベポエチン生産細胞が、宿主細胞にダルベポエチンをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換細胞である、請求項１～７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　宿主細胞が動物細胞である、請求項８に記載の製造方法。
  10. 　動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ０）細胞、マウス黒色腫（ＮＳ０）細胞若しくはマウス骨髄腫（ＳＰ２／０）細胞、またはこれらの細胞に由来する細胞である、請求項９に記載の製造方法。
  11. 　植物由来の蛋白質加水分解物を添加する培地が完全合成培地である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の製造方法。
  12. 　培地中に添加する植物由来の蛋白質加水分解物の濃度が１～５ｇ／ｌである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の製造方法。
  13. 　植物由来の蛋白質加水分解物がダイズ由来の蛋白質加水分解物である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の製造方法。
  14. 　さらにダルベポエチン組成物を精製する精製工程を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の製造方法。
  15. 　精製工程が陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはゲルろ過から選ばれる少なくとも１つである、請求項１４に記載の製造方法。
  16. 　得られるダルベポエチン組成物が、１分子あたり平均１８個以上のシアル酸を含有するダルベポエチンである、請求項１～１５のいずれか１項に記載の製造方法。
  17. 　植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養し、培養液中にダルベポエチン組成物を分泌させることを含む、ダルベポエチン生産細胞の培養方法。
  18. 　植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養し、培養中のダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離を阻害することを含む、ダルベポエチン生産細胞の培養方法。
  19. 　植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養して培養液を得ることを含む、培養液保存中のダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離を阻害する方法。
     
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