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WO2018155487A1 - 核酸含有ｄｐｉ用粉末製剤及びその用途 - Google Patents

核酸含有ｄｐｉ用粉末製剤及びその用途 Download PDF

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WO2018155487A1
WO2018155487A1 PCT/JP2018/006194 JP2018006194W WO2018155487A1 WO 2018155487 A1 WO2018155487 A1 WO 2018155487A1 JP 2018006194 W JP2018006194 W JP 2018006194W WO 2018155487 A1 WO2018155487 A1 WO 2018155487A1
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nucleic acid
composition
acid molecule
dpi
present
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PCT/JP2018/006194
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松本　貴博
秀一 豊福
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株式会社ボナック
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    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system

Definitions

  • the present invention relates to a powdery composition for administration by a dry powder inhaler (DPI) containing a nucleic acid molecule as an active ingredient, more specifically, a single-stranded nucleic acid molecule which is a miR-29b variant as an active ingredient. Further, the present invention relates to a powdery composition for DPI containing lactose and / or mannitol as an excipient, and a therapeutic agent for pulmonary fibrosis using the composition.
  • DPI dry powder inhaler
  • Pulmonary fibrosis is a disease in which fibrosis occurs in the interstitium of the lungs triggered by alveolar damage and collapse, but in many cases the cause is unknown. Unexplained pulmonary fibrosis is called idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF), and as fibrosis progresses, the lungs harden and the ability to exchange oxygen decreases. At present, there is no definitive treatment, and the treatment remains almost symptomatic.
  • IPF idiopathic Pulmonary Fibrosis
  • Nucleic acid drugs are expected as next-generation drug discovery technologies because they combine the ease of manufacturing of low-molecular-weight drugs with the effectiveness and safety of antibody drugs.
  • drug development has progressed as expected due to instability of nucleic acid molecules in vivo, side effects due to enhanced innate immune response, and the lack of efficient drug delivery technology (DDS). Not in.
  • Non-Patent Document 1 Used this technology to administer a single-stranded nucleic acid molecule loaded with a TGF- ⁇ 1 expression-suppressing sequence into a model mouse with pulmonary fibrosis and acute lung injury.
  • DPI dry powder inhaler
  • an object of the present invention is to provide a powder formulation containing a nucleic acid effective for the treatment of respiratory diseases, which can be uniformly dispersed in lung tissue by administration using DPI. Therefore, it is to provide a means that can be easily taken by the patient himself and can deliver an effective amount of nucleic acid to the lung.
  • PH-0071 a single-stranded nucleic acid molecule
  • PH-0071 a single-stranded nucleic acid molecule
  • a powdery composition for administration by a dry powder inhaler comprising a single-stranded nucleic acid molecule consisting of [2] The composition according to [1], wherein the excipient is lactose and / or mannitol.
  • a pulmonary fibrosis therapeutic agent comprising the composition according to [1] or [2].
  • a single-stranded nucleic acid molecule as an active ingredient can be uniformly dispersed and delivered to a patient's lung tissue by inhalation using DPI, and inhalation using an aerosol-type inhaler or nebulizer As compared with drugs, it is possible to provide an inhaled drug that is superior in operability and drug delivery.
  • the present invention comprises a single-stranded nucleic acid molecule PH-0071, which is a modified version of microRNA miR-29b that suppresses expression of a downstream factor of TGF- ⁇ signal such as Col1A1, and an excipient.
  • a powdered composition (hereinafter also referred to as “the composition of the present invention”) for administration by a powder inhaler (DPI) is provided.
  • nucleic acid molecule The single-stranded nucleic acid molecule PH-0071 which is an active ingredient contained in the composition of the present invention is represented by the following nucleotide sequence. 5'- UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU -P-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3 '(SEQ ID NO: 1) (In the sequence, P represents a proline derivative linker represented by the following formula (I).)
  • the underlined sequence in the above nucleotide sequence is the guide strand sequence of mature human miR-29b (registered as hsa-miR-29b-3p in miRBase (http://www.mirbase.org)) .
  • the “guide strand” of the mature miRNA is the strand that is incorporated into the Ago protein of the RISC complex and binds to the target mRNA.
  • Natural mature human miR-29b contains a 4-nucleotide mismatch between the guide strand and its complementary strand (passenger strand), whereas PH-0071 is a passenger strand (3 And has a structure in which the 3 ′ end of the guide strand and the 5 ′ end of the passenger strand are linked via the proline derivative linker.
  • the nucleic acid molecule may be modified with a sugar residue (eg, ribose) of each nucleotide in order to improve stability, drug delivery, and the like.
  • a sugar residue eg, ribose
  • Examples of the site modified in the sugar residue include those in which the hydroxyl group at the 2′-position, 3′-position and / or 4′-position of the sugar residue is replaced with another atom.
  • Examples of modifications include fluorination, O-alkylation (eg, O-methylation, O-ethylation), O-allylation, S-alkylation (eg, S-methylation, S-ethylation) ), S-allylation, and amination (eg, —NH 2 ).
  • Such sugar residue modification can be performed by a method known per se (for example, Sproat et al., (1991) Nucle. Acid. Res. 19,733-738; Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145).
  • the sugar residue may be BNA: “bridged nucleic acid” (LNA) in which a crosslinked structure is formed at the 2′-position and the 4′-position.
  • LNA bridged nucleic acid
  • Such sugar residue modification can also be performed by a method known per se (for example, Tetrahedron Lett., 38, 8735-8738 (1997); Tetrahedron, 59, 5123-5128 (2003), Rahman SMA, Seki S., Obika S., Yoshikawa H., Miyashita K., Imanishi T., J. Am. Chem. Soc., 130, 4886-4896 (2008)).
  • the nucleic acid molecule may also be a modified nucleobase (eg, purine, pyrimidine) (eg, chemical substitution).
  • modifications include, for example, 5-position pyrimidine modification, 6- and / or 8-position purine modification, modification with exocyclic amine, substitution with 4-thiouridine, substitution with 5-bromo or 5-iodo-uracil. Can be mentioned.
  • the phosphate group contained in the nucleic acid molecule may be modified so as to be resistant to nuclease and hydrolysis.
  • the phosphoric acid group P (O) O is changed to P (O) S (thioate), P (S) S (dithioate), P (O) NR 2 (amidate), P (O) R, R ( O) OR ′, CO or CH 2 (formacetal) or 3′-amine (—NH—CH 2 —CH 2 —) optionally substituted (where each R or R ′ is independently H, or substituted or unsubstituted alkyl (eg, methyl, ethyl)].
  • At least one of the phosphoric acid groups P (O) O is substituted with P (O) S (thioate) or P (S) S (dithioate), so-called phosphorothioation or phosphorodithioation Is preferred.
  • P (O) S (thioate) or P (S) S (dithioate) so-called phosphorothioation or phosphorodithioation Is preferred.
  • the activity of the nucleic acid molecule can be improved.
  • the phosphoric acid group to be phosphorothioated or phosphorodithioated is not particularly limited.
  • linking group examples include -O-, -N-, and -S-, which can be bonded to adjacent nucleotides through these linking groups. Modifications may also include 3 'and 5' modifications such as capping.
  • the nucleic acid molecule further includes polyethylene glycol, amino acid, peptide, inverted dT, nucleic acid, nucleoside, Myristoyl, Lithocolic-oleyl, Docosanyl, Lauroyl, Stearoyl, Palmitoyl, Oleoyl, Linoleoyl, other lipids, steroids, cholesterol, dyes, fluorescent substances,
  • the end modification can be performed by adding radioactive substances or the like to the 5 ′ end and / or the 3 ′ end.
  • the nucleic acid molecule contained in the composition of the present invention can be chemically synthesized by a method known per se such as the phosphoramidite method and the H-phosphonate method.
  • the chemical synthesis can be performed using a commercially available automatic nucleic acid synthesizer.
  • the nucleic acid molecule can be produced, for example, according to the method described in WO 2015/099187.
  • the obtained nucleic acid molecule can be purified by, for example, HPLC and then lyophilized by a conventional method.
  • the particle size of the nucleic acid molecule contained in the composition of the present invention is not particularly limited as long as the nucleic acid molecule can be uniformly dispersed in the lung tissue by inhalation administration, but in order to efficiently reach the peripheral airways or alveoli.
  • Preferably has an average particle size of 0.5 to 6 ⁇ m, preferably 0.8 to 5 ⁇ m, more preferably 0.8 to 3 ⁇ m (meaning “50% median diameter” in the present specification, and the same shall apply hereinafter).
  • the content of the nucleic acid molecule in the composition of the present invention is not particularly limited as long as a therapeutically effective amount of the nucleic acid molecule is contained in the single inhalation amount of the composition.
  • the lower limit of the single inhalation amount of the composition of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately set by devising the amount of the powder composition contained in the inhaler to be used and / or the capsule, blister, etc. to be filled. is there.
  • the upper limit of the inhalation amount depends on the respiratory function such as the inspiratory flow rate and the inspiratory vital capacity of the patient, but is usually about 10 to 20 mg.
  • the therapeutically effective amount of the nucleic acid molecule contained in the composition of the present invention is usually 0.1 to 1000 ⁇ g, preferably 1 to 500 ⁇ g, more preferably 10 to 200 ⁇ g as a single dose by inhalation administration. . Therefore, for example, when the single inhalation amount of the composition of the present invention is 10 mg, the content of the nucleic acid molecule is usually 0.001 to 10% by weight, preferably 0.01 to 5% by weight, based on the whole composition, More preferably, it is 0.1 to 2% by weight.
  • excipient contained in the composition of the present invention is not particularly limited as long as it can promote the uniform dispersion of nucleic acid molecules as an active ingredient in lung tissue by inhalation administration. Those added for the purpose of increasing the amount of solid preparations such as powders and tablets, dilution, filling, and prosthesis. An excipient that is biologically inactive and that is expected to have some degree of metabolism may be used. A water-soluble polymer can also be used and is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable.
  • sugars such as lactose, glucose, sucrose, trehalose, sucrose, sugar alcohols such as erythritol, mannitol, sorbitol, starches, crystalline cellulose, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, carmellose sodium, Pullulan, dextrin, gum arabic, agar, gelatin, tragacanth, sodium alginate, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol and other high molecular weight polymers, fatty acids such as stearic acid or salts thereof, waxes, calcium sulfate, calcium carbonate, talc, titanium oxide Light anhydrous silicic acid or the like can be used.
  • sugar alcohols such as erythritol, mannitol, sorbitol, starches, crystalline cellulose, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, carmellose sodium
  • Pullulan dextrin
  • a preferred excipient in the present invention is lactose or mannitol. Lactose may be any of monohydrates, anhydrides and mixtures thereof.
  • the particle size of the excipient is not particularly limited as long as it can promote the uniform dispersion of the nucleic acid molecule as the active ingredient in the lung tissue, and examples thereof include 0.1 to 20 ⁇ m, preferably 1 to 15 ⁇ m. .
  • the excipient is 1: 5000 to 10: 1, preferably 1: 1000 to 5: 1, more preferably 1: 500 to 1: 1 with respect to the nucleic acid molecule as the active ingredient. It can mix
  • composition of the present invention may further contain a carrier.
  • the carrier is used to form a complex with the nucleic acid molecule and the excipient to prevent aggregation of the drug until administration of the powder preparation, and to increase the efficiency of the drug reaching the lung at the time of inhalation administration.
  • a carrier for DPI formulation design it is desirable to ensure that the drug is released from the capsule or inhaler and to be separated from the carrier surface with a high probability.
  • Examples of carriers that can be used in the present invention include lactose, glucose, fructose, sucrose, maltose and dextran saccharides, sugar alcohols such as erythritol, sorbitol, mannitol, calcium sulfate, calcium carbonate, talc, titanium oxide, and the like. Common excipients can be mentioned and are not particularly limited. Preferred carriers are sugars or sugar alcohols, and more preferred carriers are lactose or mannitol.
  • the carrier has an aerodynamically acceptable particle size. Specifically, the average particle size of the carrier is in the range of 10 to 200 ⁇ m.
  • the composition of the present invention may further contain a nucleic acid introduction reagent known per se so that the nucleic acid molecule, which is an active ingredient, is efficiently taken up by the target cells in the lung tissue.
  • a nucleic acid introduction reagent include, but are not limited to, Lipofectamine® 2000, Oligofectamine, Optifect, GeneJammer® Tansfection® Reagent, Nucleofector® Solution, and the like.
  • the nucleic acid introduction reagent can be formulated in the composition of the present invention by, for example, mixing with a solution of a nucleic acid molecule, which is an active ingredient, and then lyophilizing.
  • composition of the present invention may further contain other pharmaceutically acceptable additives usually used for solid preparations such as powders and tablets.
  • the composition of the present invention can be produced , for example, by mixing and grinding nucleic acid molecules and excipients.
  • the pulverization can be performed simultaneously with mixing, for example, by putting a lyophilized product of a nucleic acid molecule (which may optionally contain additives such as a nucleic acid introduction reagent) and an excipient into an aerodynamic pulverizer.
  • a general dry pulverization can be used for the drug and excipient pulverization, but it is preferable to use an aerodynamic pulverizer.
  • a general dry pulverizer an apparatus for efficiently pulverizing a small amount such as a mortar or a ball mill is frequently used for a laboratory.
  • a rolling ball mill As the ball mill, a rolling ball mill, a centrifugal ball mill, a vibration ball mill, and a planetary ball mill are known, and these can be pulverized on the principle of grinding, rotation, vibration and impact.
  • Examples of industrial use include a medium stirring mill, a high-speed rotary milling / impact mill, and a jet mill.
  • High-speed rotary grinding mills include disk mills and roller mills.
  • High-speed rotary impact mills include cutter mills (knife mills), hammer mills (atomizers), pin mills, screen mills, etc. in addition to rotational impacts, and grinding is also performed by shearing force. There is something to do.
  • jet mills are mainly pulverized by impact, but the most orthodox particle / particle collision type, particle / collision plate collision type, and nozzle suction type (blowing) type are available.
  • the nucleic acid molecules are uniformly mixed with the excipient, and pulverized so that the average particles become fine particles of 20 ⁇ m or less.
  • the average particle size of the fine particles is preferably 10 ⁇ m or less.
  • the fine particles obtained in the above mixing and pulverization step are then mixed with the carrier to form a stable complex until administration.
  • Mixing of the carrier and the fine particles can be performed using a generally known mixer.
  • type (vertical, horizontal) mixers The continuous type is also divided into a rotary type and a fixed type.
  • the rotary type is a horizontal cylindrical mixer, a horizontal cone type mixer, and the fixed type is a screw type (vertical, horizontal) mixer, ribbon type (vertical, Horizontal) mixers and rotary disk mixers are known.
  • a mixing method using an aerodynamic pulverizer such as a medium agitating mill, a high-speed rotary milling / impact mill, a jet mill, and a container made of nylon, polyethylene, or similar properties are used, A uniform mixed preparation can be obtained by stirring.
  • the weight ratio of the fine particles and the carrier can be appropriately selected within the range of 1: 100 to 10: 1.
  • composition of the present invention obtained as described above is suitable for loading into a DPI such as a capsule, blister, reservoir, etc., depending on the type of dry powder inhaler (DPI) used for inhalation administration.
  • DPI dry powder inhaler
  • the dosage form is appropriately formed. Examples of DPI include swing heller, discus, dusk heller, turbuler, twist heller, handy heller, and ellipter.
  • Pulmonary fibrosis therapeutic agent The nucleic acid molecule that is an active ingredient in the composition of the present invention, the mismatch portion of the passenger strand sequence of miR-29b is replaced with a base complementary to the corresponding base of the guide strand, A single-stranded nucleic acid molecule in which a guide strand and a passenger strand are connected by a proline derivative linker, maintaining the biological activity of miR-29b, improving in vivo stability, and providing an innate immune response to double-stranded RNA It can be avoided. Since miR-29b targets a downstream factor of TGF- ⁇ (eg, Col1A1) and can suppress the expression of the gene, it is known to have a therapeutic effect on pulmonary fibrosis. Therefore, a pharmaceutical preparation combining the composition of the present invention and DPI (hereinafter also referred to as “DPI preparation of the present invention”) is useful as a therapeutic agent for pulmonary fibrosis for local administration.
  • DPI preparation of the present invention a pharmaceutical preparation
  • the subject to which the DPI preparation of the present invention can be applied is a person suffering from or at risk of pulmonary fibrosis and having an inspiratory flow rate capable of inhalation administration by DPI. It is done.
  • the inspiratory flow rate that can be administered by inhalation with DPI varies depending on the type of DPI, but is usually 20 to 45 L / min or more.
  • Inhalation administration can be carried out by a predetermined method depending on the type of DPI.
  • the dosage of the DPI preparation of the present invention is usually 0.1 to 1000 ⁇ g, preferably 1 to 500 ⁇ g, more preferably 10 to 200 ⁇ g as the weight of nucleic acid per one time. It can be administered once every 6 weeks.
  • composition of the present invention can also be used for non-human animals, for example, pet animals such as dogs, cats, rabbits, hamsters, guinea pigs, cattle, horses, It can also be used to treat pulmonary fibrosis in domestic animals such as pigs, sheep and goats.
  • Single-stranded nucleic acid molecule PH-0071 consisting of the following nucleotide sequence loaded with miR-29b guide strand sequence and a modified passenger strand sequence that is completely complementary thereto is disclosed in WO 2015/099187. Synthesis was performed in the same manner as described. The synthesized RNA was purified by HPLC and then lyophilized. As the linker region, L-proline diamide amidite was used. The underlined portion is the guide strand sequence of mature human miR-29b.
  • PH-0071-containing powder inhaler In order to confirm the pulmonary distribution of powdered PH-0071, two types of PH-0071-containing powder inhalers were prepared with the following compositions.
  • Example 1 (8 doses) PH-0071 (6-FAM labeled) 1 mg as nucleic acid Lipofectamine 2000 250 ⁇ L Add 42.4 mg of powdered lactose (DPE Pharma) to the lyophilized solution (dry weight 37.6 mg) of the above composition, and mix and grind by physicochemical mixing using a bead type cell crusher. went.
  • Example 2 (8 doses) PH-0071 (6-FAM labeled) 1 mg as nucleic acid (dry weight 21.6 mg) Powdered lactose for inhalation 58.4 mg The powder having the above composition was mixed and pulverized by a physicochemical mixing method using a bead type cell crusher.
  • Example 2 Test Example Administration of Powder Inhalant to Mice and Evaluation of Lung Tissue and Intrapulmonary Distribution Trypan blue-containing powder inhalant (Reference Example 2) and PH-0071-containing powder inhaler (Examples 1 and 2) prepared in the above formulation examples ) Using normal mice (C57BL / 6 mice, male, 14-16 weeks of age) under anesthesia using the administration device comprising the three-way stopcock, syringe barrel and pipetteman tip shown in FIG. 1 (Reference Example 2 and Example 1) or a pulmonary fibrosis model mouse (human TGF- ⁇ 1-expressing transgenic mouse described in Hamasaki et al., PLoS ONE, 7 (8), e42655, doi: 10.1371, 2012) (Example 2).
  • the administration device comprising the three-way stopcock, syringe barrel and pipetteman tip shown in FIG. 1 (Reference Example 2 and Example 1) or a pulmonary fibrosis model mouse (human TGF- ⁇ 1-expressing
  • Trypan blue solution (Reference Example 1) was intratracheally administered to normal mice using a microsprayer (MSA-250-M, manufactured by PENNCENTURY). Lungs were removed from mice administered with trypan blue-containing preparations (Reference Examples 1 and 2) under anesthesia 15 minutes after drug administration. The lung tissue distribution of trypan blue after administration is shown in FIG. Trypan blue was evenly distributed in the lung tissue as well as the solution when administered as a powder. On the other hand, with respect to mice administered with the PH-0071-containing powder inhalation preparation, the lungs were removed under anesthesia 24 hours after drug administration, and the intrapulmonary distribution was evaluated with a fluorescence microscope. The results are shown in FIG.
  • the powder inhalant containing PH-0071 to which a transfection agent was added was taken up into cells of normal mouse lungs.
  • uptake of PH-0071 into lung cells was confirmed even when no transfection agent was added. From the above, it was shown that the microRNA-type nucleic acid can be administered in the same manner as a solution even in a powder state by deliberately devising a microRNA type nucleic acid.
  • single-stranded nucleic acid molecules capable of suppressing the expression of TGF- ⁇ 1 can be uniformly dispersed in lung tissue by administration using DPI. Therefore, it is extremely useful in that it can provide a powder preparation effective for the treatment of respiratory diseases such as pulmonary fibrosis.

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Abstract

本発明は、5'-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-P-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3'（配列番号1）で表されるヌクレオチド配列 （該配列中、Pは、下記式（I）で表されるプロリン誘導体リンカーを示す。） からなる一本鎖核酸分子、及び賦形剤を含有してなる、ドライパウダー吸入器による投与のための粉末状組成物、好ましくは、賦形剤が乳糖及び／又はマンニトールである、前記組成物を提供する。該組成物は、呼吸器疾患の治療に有効な核酸を含有する粉末製剤であって、DPIを用いた投与により該核酸を肺組織内に均一に分散させることができる。

Description

核酸含有ＤＰＩ用粉末製剤及びその用途
　本発明は、核酸分子を有効成分とする、ドライパウダー吸入器（DPI）による投与のための粉末状組成物、より詳細には、miR-29b改変体である一本鎖核酸分子を有効成分とし、賦形剤として乳糖及び／又はマンニトールを含有するDPI用粉末状組成物、並びに該組成物を用いた肺線維症治療剤に関する。
　肺線維症は、肺胞の障害と虚脱をきっかけとして、肺の間質に線維化が起こる疾患であるが、多くの場合原因は不明である。原因不明の肺線維症は、特に特発性肺線維症（Idiopathic Pulmonary Fibrosis：IPF）と呼ばれ、線維化が進行すると、肺が硬化し、酸素交換能が低下する。現在のところ、決定的な治療法も無く、その治療はほぼ対症療法に留まっている。
　核酸医薬は、低分子医薬品の容易な製造性と、抗体医薬の有効性と安全性とを併せ持つことから、次世代の創薬技術として期待されている。しかし、核酸分子の生体内での不安定性、自然免疫応答の亢進による副作用、効率的な薬物送達技術（DDS）が開発されていないこと等が障壁となって、医薬品開発は思うように進んでいない。
　呼吸器疾患の場合、肺への薬剤の局所投与が可能であることから、肺線維症は核酸医薬の効果的な標的疾患である。一方、核酸分子の生体内安定性や自然免疫応答惹起の問題に対しては、siRNAやmiRNAの二本鎖核酸の末端を各種のリンカーで連結した一本鎖核酸分子が開発されている（例えば、特許文献1-5参照）。Hamasakiらは、当該技術を利用してTGF-β1の発現抑制配列を搭載させた一本鎖核酸分子を肺線維症及び急性肺傷害のモデルマウスに気管内投与したところ、症状が顕著に改善されたことを報告している（非特許文献1）。また、黒田らは、TGF-β下流の標的因子を抑制するmiR-29bの改変体である一本鎖核酸分子を肺線維症モデルマウスに点鼻投与したところ、I型コラーゲンα1鎖（Col1A1）の発現低下と肺組織の線維化改善が認められたことを報告している（非特許文献２）。
　しかしながら、上記の核酸含有肺線維症治療薬はいずれも溶液の形態で製剤化されており、これらを、患者が自分で服用可能な吸入薬として使用する場合、吸入器として加圧式定量噴霧吸入器（pMDI）かネブライザーを用いる必要がある。しかし、前者の場合、薬剤の噴霧と吸入のタイミングを合わせる必要があり熟練を要し、後者の場合、器具が大きく電力を要するなど携行に不向きであるといった使用上の問題がある。一方、吸入器としてドライパウダー吸入器（DPI）を用いると、噴霧と吸気を合わせる必要がなく自分のタイミングで吸入でき、携行上の問題もないが、薬物を粉末製剤として提供する必要がある。しかしながら、核酸を有効成分とするDPI用の粉末製剤はこれまでに報告されていない。
国際公開第2012/017919号パンフレット 国際公開第2013/103146号パンフレット 国際公開第2012/005368号パンフレット 国際公開第2012/077446号パンフレット 国際公開第2013/133393号パンフレット
PLoS One, 2012, 7(8):e42655. 東京医科大学雑誌, 2016, 74(2):205.
　従って、本発明の目的は、呼吸器疾患の治療に有効な核酸を含有する粉末製剤であって、DPIを用いた投与により、該核酸を肺組織内に均一に分散可能な粉末製剤を提供することであり、以って患者自身で簡便に服用でき、かつ有効量の核酸を肺に送達させ得る手段を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、miR-29bの改変体である一本鎖核酸分子（以下、「PH-0071」ともいう）に、賦形剤として乳糖及び／又はマンニトールを配合して粉末状組成物とし、該組成物を、DPIを用いて投与したところ、PH-0071を肺組織内に均一に分布させることに成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、次の通りである。
［１］5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-P-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’（配列番号1）で表されるヌクレオチド配列（該配列中、Pは、下記式（I）で表されるプロリン誘導体リンカーを示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
からなる一本鎖核酸分子、及び賦形剤を含有してなる、ドライパウダー吸入器による投与のための粉末状組成物。
［２］賦形剤が乳糖及び／又はマンニトールである、［１］に記載の組成物。
［３］［１］又は［２］に記載の組成物を含有してなる、肺線維症治療剤。
［４］ドライパウダー吸入器と組み合わせてなる、［３］に記載の剤。
　本発明によれば、有効成分である一本鎖核酸分子を、DPIを用いた吸入により患者の肺組織に均一に分散して送達させることができ、エアゾールタイプの吸入器やネブライザーを用いた吸入薬に比べて、操作性及び薬物送達性に優れた吸入薬を提供することができる。
試験例で粉末製剤の投与に使用した器具の構成を示す図である。 トリパンブルー溶液（Ａ）又はトリパンブルー含有粉末製剤を投与したマウスにおける、トリパンブルーの肺組織分布を示す図である。 FAM標識したPH-0071及びLipofectamine 2000を含有する粉末製剤を投与した正常マウス（Ａ）及びFAM標識したPH-0071を含有する粉末製剤を投与した肺線維症モデルマウスにおける、PH-0071の肺内分布を示す図である。
　本発明は、Col1A1等のTGF-βシグナルの下流因子の発現を抑制するマイクロRNA miR-29bの改変体である一本鎖核酸分子PH-0071と、賦形剤とを含有してなる、ドライパウダー吸入器（DPI）による投与のための粉末状組成物（以下、「本発明の組成物」ともいう）を提供する。
（1）核酸分子
　本発明の組成物に含有される有効成分である一本鎖核酸分子PH-0071は、下記のヌクレオチド配列で表される。
　5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-P-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’（配列番号1）
　（該配列中は、Pは下記式（I）で表されるプロリン誘導体リンカーを示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　上記ヌクレオチド配列中、下線を付した配列が、成熟ヒトmiR-29bのガイド鎖配列（miRBase (http://www.mirbase.org) にhsa-miR-29b-3pとして登録されている）である。成熟miRNAの「ガイド鎖」とは、RISC複合体のAgoタンパク質に取り込まれ、標的mRNAに結合する鎖のことである。天然型の成熟ヒトmiR-29bは、ガイド鎖とその相補鎖（パッセンジャー鎖）との間で4ヌクレオチドのミスマッチを含むが、PH-0071はガイド鎖配列に対して完全相補的なパッセンジャー鎖（3’末端に2ヌクレオチドのオーバーハングを含む）を有し、ガイド鎖の3’末端とパッセンジャー鎖の5’末端とが、前記プロリン誘導体リンカーを介して結合した構造を有する。
　該核酸分子は、安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の2’位、3’位及び／又は4’位のヒドロキシル基を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、O-アルキル化（例、O-メチル化、O-エチル化）、O-アリル化、S-アルキル化（例、S-メチル化、S-エチル化）、S-アリル化、アミノ化（例、-NH2）が挙げられる。このような糖残基の改変は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Sproat et al.,(1991)Nucle.Acid. Res.19,733-738;Cotton et al.,(1991) Nucl.Acid.Res.19,2629-2635;Hobbs et al.,(1973)Biochemistry 12,5138-5145参照）。
　また糖残基については、2’位及び4’位で架橋構造を形成したBNA: Bridged nucleic acid（LNA:Linked nucleic acid）とすることもできる。このような糖残基の改変も、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Tetrahedron Lett., 38, 8735-8738 (1997); Tetrahedron, 59, 5123-5128 (2003)、Rahman S.M.A., Seki S., Obika S., Yoshikawa H., Miyashita K., Imanishi T., J. Am. Chem. Soc., 130, 4886-4896 (2008)など参照）。
　該核酸分子はまた、核酸塩基（例、プリン、ピリミジン）が改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、5位ピリミジン改変、6及び／又は8位プリン改変、環外アミンでの改変、4-チオウリジンでの置換、5-ブロモ又は5-ヨード－ウラシルでの置換が挙げられる。
　また、ヌクレアーゼ及び加水分解に対して耐性であるように、該核酸分子に含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、リン酸基たるP(O)O基が、P(O)S（チオエート）、P(S)S（ジチオエート）、P(O)NR2（アミデート）、P(O)R、R(O)OR’、CO又はCH2（ホルムアセタール）又は3’-アミン(-NH-CH2-CH2-)で置換されていてもよい〔ここで各々のR又はR’は独立して、Hであるか、あるいは置換されているか、又は置換されていないアルキル（例、メチル、エチル）である〕。なかでも、リン酸基たるP(O)O基の少なくとも一つが、P(O)S（チオエート）又はP(S)S（ジチオエート）で置換されている、いわゆるホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化したものが好ましい。核酸分子に含まれるリン酸基の少なくとも一つがホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化されることによって、該核酸分子の活性が向上し得る。ホスホロチオエート化又はホスホロジチオエート化されるリン酸基は特に制限されない。
　連結基としては、-O-、-N-又は-S-が例示され、これらの連結基を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。改変はまた、キャッピングのような3’及び5’の改変を含んでもよい。
　該核酸分子はさらに、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、inverted dT、核酸、ヌクレオシド、Myristoyl、Lithocolic-oleyl、Docosanyl、Lauroyl、Stearoyl、Palmitoyl、Oleoyl、Linoleoyl、その他脂質、ステロイド、コレステロール、色素、蛍光物質、放射性物質などを5’末端及び／又は3’末端に付加することにより、末端修飾が行われ得る。
　本発明の組成物に含有される核酸分子は、例えば、ホスホロアミダイト法やH-ホスホネート法等の自体公知の方法により化学的に合成することができる。該化学合成は、市販の自動核酸合成機を用いて行うことができる。具体的には、該核酸分子は、例えば、WO 2015/099187に記載の方法に従って製造することができる。得られた核酸分子は、例えば、HPLCにより精製した後、常法により凍結乾燥することができる。
　本発明の組成物に含有される核酸分子の粒子径は、吸入投与により該核酸分子が肺組織に均一に分散し得る限り特に制限はないが、末梢気道ないし肺胞に効率よく到達させるためには、0.5～6 μm、好ましくは0.8～5 μm、より好ましくは0.8～3 μmの平均粒子径（本明細書においては「50%メジアン径」を意味する。以下同じ。）を有することが好ましい。
　本発明の組成物における核酸分子の含有量は、該組成物の1回吸入量中に治療上有効な量の核酸分子が含まれていれば特に制限はない。本発明の組成物の1回吸入量の下限は特に制限されず、使用する吸入器、及び／又は充填するカプセル、ブリスター等に含まれる粉末組成物の量を工夫することで、適宜設定可能である。一方、1回吸入量の上限は、患者の吸気流速や吸気肺活量等の呼吸機能に依存するが、通常約10～20 mg程度である。
　本発明の組成物に含有される核酸分子の治療上有効量としては、吸入投与による1回用量として、通常0.1～1000 μg、好ましくは1～500 μg、より好ましくは10～200 μgが挙げられる。従って、例えば、本発明の組成物の1回吸入量が10 mgである場合、核酸分子の含有量は、組成物全体に対して、通常0.001～10重量%、好ましくは0.01～5重量%、さらに好ましくは0.1～2重量%である。
（2）賦形剤
　本発明の組成物に含有される賦形剤は、吸入投与により有効成分である核酸分子が肺組織に均一に分散し得るのを促進し得る限り特に制限はなく、通常、散剤、錠剤などの固形製剤の増量、希釈、充填、補形等の目的で加えられるものが使用される。賦形剤は、生物学的に不活性であり、かつある程度の代謝が期待されるものを用いてもよい。また、水溶性高分子を用いることもでき、医薬として許容されるものであれば特に限定されない。具体的には、乳糖、ブドウ糖、白糖、トレハロース、ショ糖などの糖類、エリスリトール、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール類、デンプン類、結晶セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルメロースナトリウム、プルラン、デキストリン、アラビアゴム、寒天、ゼラチン、トラガント、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどの高分子ポリマー類、ステアリン酸等の脂肪酸あるいはその塩、ワックス類、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、タルク、酸化チタン、軽質無水ケイ酸などを用いることができる。賦形剤は1種のみを用いてもよく、2種以上を適宜組み合わせて用いることもできる。本発明において好ましい賦形剤は、乳糖又はマンニトールである。乳糖としては、一水和物、無水物及びそれらの混合物のいずれであってもよい。
　賦形剤の粒子径は、有効成分である核酸分子が肺組織に均一に分散し得るのを促進し得る限り特に制限はないが、例えば0.1～20 μm、好ましくは1～15 μmが挙げられる。
　本発明の組成物において、賦形剤は、有効成分である核酸分子に対して、1:5000～10:1、好ましくは1:1000～5:1、より好ましくは1:500～1:1の重量比で配合することができる。
（3）その他の添加剤
　本発明の組成物は、さらに担体を含んでもよい。担体は、核酸分子及び賦形剤と複合体を形成することにより粉末製剤投与までの薬物の凝集を防ぐとともに、吸入投与時には、薬物の肺内到達効率を高めるために使用される。DPI処方設計に担体を使用する際は、薬物がカプセル又は吸入器から確実に放出され、担体表面から高い確率で薬物が分離されることが望ましい。本発明において使用し得る担体として、例えば、乳糖、ブドウ糖、果糖、ショ糖、麦芽糖およびデキストラン類の糖類、エリスリトール、ソルビトール、マンニトールなどの糖アルコール類、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、タルク、酸化チタン等の一般的な賦形剤を挙げることができ、特に限定されるものではない。好ましい担体は、糖類または糖アルコール類であり、より好ましい担体は、乳糖又はマンニトールである。また、担体は空気力学的に許容される粒子径を有するものである。具体的には、担体の平均粒子径は10～200μmの範囲である。
　本発明の組成物は、肺組織内の標的細胞に有効成分である核酸分子が効率よく取り込まれるようにするために、自体公知の核酸導入試薬をさらに含有することができる。そのような核酸導入試薬としては、例えば、Lipofectamine 2000、Oligofectamine、Optifect、GeneJammer Tansfection Reagent、Nucleofector Solution等が挙げられるが、それらに限定されない。該核酸導入試薬は、例えば、有効成分である核酸分子の溶液と混合した後、凍結乾燥することにより本発明の組成物中に配合することができる。
　本発明の組成物は、散剤や錠剤等の固形製剤に通常使用される他の医薬上許容される添加物をさらに含有していてもよい。
（4）粉末状組成物の製造
　本発明の組成物は、例えば、核酸分子及び賦形剤を混和・粉砕することにより製造することができる。粉砕は、例えば、核酸分子（所望により核酸導入試薬等の添加物を含んでいてもよい）の凍結乾燥物と賦形剤とを、空気力学的粉砕器に投入し、混和と同時に行われ得る。薬剤及び賦形剤の粉砕には一般的な乾燥粉砕を用いることができるが、空気力学的粉砕器を使用することが好ましい。具体的には、一般的な乾燥粉砕器として、実験室用に乳鉢やボールミル等少量を効率的に粉砕する装置が繁用されている。ボールミルとしては転動ボールミル、遠心ボールミル、振動ボールミル、遊星ボールミルが知られており、これらは摩砕・回転・振動・衝撃などの原理で粉砕化を行うことができる。工業用としては媒体撹拌型ミル、高速回転摩砕・衝撃ミル、ジェットミルなどが挙げられる。高速回転摩砕ミルには、ディスクミル、ローラーミルがあり、高速回転衝撃ミルにはカッターミル（ナイフミル）、ハンマーミル（アトマイザー）、ピンミル、スクリーンミル等回転衝撃に加え、剪断力によっても粉砕を行うものが存在する。ジェットミルは主に衝撃にて粉砕を行うものが多いが、その種類としては最もオーソドックスな粒子・粒子衝突型、粒子・衝突板衝突型、ノズル吸い込み型（吹き出し）型がある。この粉砕工程によって、核酸分子は賦形剤と均一に混和され、その平均粒子が20 μm以下の微細化粒子になるように粉砕される。この粒子径とすることで、吸入投与により末梢気道や肺胞等の目的の部位まで到達することができる。微細化粒子の平均粒子径は、好ましくは10 μm以下である。
　本発明の組成物がさらに担体を含有する場合、上記混和・粉砕工程で得られた微細化粒子は、次いで担体と混和し、投与時まで安定な複合体を形成するようにする。担体と微細化粒子の混和は、一般的に知られている混合機を用いて行うことができる。主に回分式と連続式があり、回分式にはさらに回転型と固定型の二種が存在する。回転型には水平円筒型混合機、V型混合機、二重円錐型混合機、立方体型混合機があり、固定型にはスクリュー型（垂直、水平）混合機、旋回スクリュー型混合機、リボン型（垂直、水平）混合機が存在する。連続式もやはり回転型と固定型の二種に分かれ、回転型は水平円筒型混合機、水平円錐型混合機、そして固定型にはスクリュー型（垂直、水平）混合機、リボン型（垂直、水平）混合機、回転円盤型混合機が知られている。この他に、媒体撹拌型ミル、高速回転摩砕・衝撃ミル、ジェットミル等の空気力学的粉砕器を利用した混和方法や、ナイロン製、ポリエチレン製、またはそれに準ずる性質からなる容器を利用し、撹拌することにより均一な混合製剤を得ることができる。微細化粒子と担体の重量比は、1:100～10:1の範囲で適宜選択することができる。
（5）吸入器
　上記のようにして得られた本発明の組成物は、吸入投与に用いるドライパウダー吸入器（DPI）の種類に応じて、カプセル、ブリスター、リザーバー等のDPIへの装填に適した剤形に適宜成形される。DPIとしては、例えば、スイングヘラー、ディスカス、デュスクヘラー、タービュヘイラー、ツイストヘラー、ハンディヘラー、エリプタ等が挙げられる。
（6）肺線維症治療剤
　本発明の組成物における有効成分である核酸分子は、miR-29bのパッセンジャー鎖配列のミスマッチ部分をガイド鎖の対応する塩基に対して相補的な塩基に置換し、ガイド鎖とパッセンジャー鎖とをプロリン誘導体リンカーで連結した一本鎖核酸分子であり、miR-29bの生理活性を保持しつつ、生体内安定性が改善され、かつ二本鎖RNAに対する自然免疫応答を回避することができる。miR-29bはTGF-βの下流因子（例、Col1A1）を標的とし、該遺伝子の発現を抑制し得るので、肺線維症に対して治療効果を有することが知られている。従って、本発明の組成物とDPIとを組み合わせた医薬製剤（以下、「本発明のDPI製剤」ともいう）は、局所投与用の肺線維症治療剤として有用である。
　本発明のDPI製剤を適用することができる対象としては、肺線維症に罹患している又はそのおそれのあるヒトであって、DPIによる吸入投与が可能な吸気流速を有している者が挙げられる。DPIによる吸入投与が可能な吸気流速はDPIの種類によっても異なるが、通常20～45L/分以上である。吸入投与は、DPIの種類に応じて、それぞれ定められた方法により行うことができる。本発明のDPI製剤の投与量としては、1回あたり、核酸重量として、通常0.1～1000 μg、好ましくは1～500 μg、より好ましくは10～200 μgが挙げられ、この量を毎日1回～6週間に1回の間隔で投与することができる。
　本発明の組成物はまた、後述の実施例で使用されるような投与器具を用いることにより、非ヒト動物、例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット等のペット動物や、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等の家畜動物における肺線維症の治療にも用いることができる。
　以下に、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、これによって本発明が限定されるものではない。
製造例　一本鎖核酸分子の合成
　miR-29bのガイド鎖配列とそれに完全相補的な改変パッセンジャー鎖配列とを搭載した下記ヌクレオチド配列からなる一本鎖核酸分子PH-0071を、WO 2015/099187に記載の方法と同様にして合成した。合成したRNAは、HPLCにより精製した後、凍結乾燥した。
　リンカー領域は、L-プロリンジアミドアミダイトを用いた。下線部は、成熟ヒトmiR-29bのガイド鎖配列である。
（PH-0071）
　5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-[P]-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’（配列番号1）
　（Pは、下記式（I）で表されるプロリン誘導体リンカーを示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
製剤例
（1）トリパンブルー含有粉末吸入剤の調製
　PH-0071含有粉末吸入剤の調製前に、実験動物（マウス）での溶液及び粉末状態のトリパンブルーを用いて、乳糖を賦形剤とする粉末吸入剤の肺組織分布を確認するため、以下の組成で2種のトリパンブルー含有製剤を調製した。
（参考例1）トリパンブルー溶液
　市販の0.4 w/v% トリパンブルー溶液（入手先：和光純薬工業株式会社）をそのまま使用した。
（参考例2）トリパンブルー含有粉末製剤（1回投与分）
　トリパンブルー粉末　0.3 mg（前記トリパンブルー溶液を棚乾燥装置で乾燥させた粉末）
　粉末吸入用乳糖　　　9.7 mg（50%メジアン径:14-19μm, DPE Pharma社）
（2）PH-0071含有の粉末吸入剤の調製
　粉末状のPH-0071の肺内分布を確認するため、以下の組成で2種のPH-0071含有の粉末吸入剤を調製した。
（実施例1）（8回投与分）
　PH-0071 (6-FAM標識)　核酸として1 mg
　Lipofectamine 2000 　250 μL
　上記組成の溶液を凍結乾燥（乾燥重量37.6 mg）させたものに、粉末吸入用乳糖42.4 mg（DPE Pharma社）を加え、ビーズ式細胞破砕装置を用いて物理化学的混合法により混和・粉砕を行った。
（実施例2）（8回投与分）
　PH-0071 (6-FAM標識)　核酸として1 mg （乾燥重量21.6 mg）
　粉末吸入用乳糖　　　 58.4 mg
　上記組成の粉末を、ビーズ式細胞破砕装置を用いて物理化学的混合法により混和・粉砕した。
試験例　粉末吸入剤のマウスへの投与と肺組織および肺内分布評価
　上記製剤例において調製したトリパンブルー含有粉末吸入剤（参考例2）と、PH-0071含有粉末吸入剤（実施例1及び2）を、図１に示す三方活栓、注射筒及びピペットマンチップより構成される投与器具を用いて、麻酔下にて正常マウス（C57BL/6マウス, 雄, 14～16週齢）（参考例2及び実施例1）もしくは肺線維症モデルマウス（Hamasakiら, PLoS ONE, 7(8),e42655,doi:10.1371,2012に記載のヒトTGF-β1発現トランスジェニックマウス）（実施例2）に投与した。トリパンブルー溶液（参考例1）は、マイクロスプレイヤー（MSA-250-M, PENNCENTURY社製）を用いて正常マウスに気管内投与した。
　トリパンブルー含有製剤（参考例1及び2）を投与したマウスから、薬剤投与15分後に、麻酔下にて肺を摘出した。投与後のトリパンブルーの肺組織分布を図２に示す。トリパンブルーは、粉末で投与した場合においても、溶液と同様に肺組織に均一に分布した。
　一方、PH-0071含有粉末吸入製剤を投与したマウスについては、薬剤投与24時間後に麻酔下にて肺を摘出し、蛍光顕微鏡により肺内分布を評価した。結果を図３に示す。トランスフェクション剤を添加したPH-0071含有粉末吸入剤は正常マウスの肺の細胞への取り込みが確認された。また、ヒトTGF-β1を過剰発現するTGマウスにおいては、トランスフェクション剤未添加でも、PH-0071の肺細胞内への取り込みが確認された。
　以上より、マイクロRNA型核酸を鋭意工夫することにより粉末の状態においても、溶液と同様に投与することができることが示された。
　以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明の範囲内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
　ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本出願は、2017年2月21日付で日本国に出願された特願2017-030529を基礎としており、ここで言及することによりその内容は全て本明細書に包含される。
　本発明によれば、DPIを用いた投与により、TGF-β1の発現を抑制し得る一本鎖核酸分子を、肺組織内に均一に分散させることができる。従って、肺線維症等の呼吸器疾患の治療に有効な粉末製剤を提供できる点で極めて有用である。

Claims (4)

  1. 　5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-P-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’（配列番号1）で表されるヌクレオチド配列
    （該配列中、Pは、下記式（I）で表されるプロリン誘導体リンカーを示す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     からなる一本鎖核酸分子、及び賦形剤を含有してなる、ドライパウダー吸入器による投与のための粉末状組成物。
  2. 　賦形剤が乳糖及び／又はマンニトールである、請求項１に記載の組成物。
  3. 　請求項１又は２に記載の組成物を含有してなる、肺線維症治療剤。
  4. 　ドライパウダー吸入器と組み合わせてなる、請求項３に記載の剤。
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