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WO2018151347A1 - L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물 및 그를 이용하여 l-쓰레오닌을 생산하는 방법 - Google Patents

L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물 및 그를 이용하여 l-쓰레오닌을 생산하는 방법 Download PDF

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WO2018151347A1
WO2018151347A1 PCT/KR2017/001705 KR2017001705W WO2018151347A1 WO 2018151347 A1 WO2018151347 A1 WO 2018151347A1 KR 2017001705 W KR2017001705 W KR 2017001705W WO 2018151347 A1 WO2018151347 A1 WO 2018151347A1
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WO
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threonine
cobb
protein
microorganism
gene
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Application number
PCT/KR2017/001705
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French (fr)
Inventor
정기용
조승현
손승주
이광호
이지선
Original Assignee
씨제이제일제당(주)
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N1/205—Bacterial isolates
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism having L-threonine production capacity, and a method for producing L-threonine using the same.
  • L-threonine is an amino acid widely used as feed additives, pharmaceutical raw materials or food raw materials, and is produced in large quantities by fermentation methods using microorganisms.
  • a target substance specific approach such as increasing expression of a gene encoding an enzyme involved in the generation of a target substance or removing a gene for which expression is unnecessary is mainly used.
  • energy in the form of NADH, NADPH and Adenosine-5'-triphosphate (ATP) in vivo is necessary because of the production and maintenance of sufficient energy for high yield production of the desired substance.
  • NAD NAD
  • Methods of strengthening by attenuation or deletion are known (Metabolic Engineering, 2002, 4, 238-247).
  • CobB is known that a denitration oxidase or talsuk Xin enzyme, are known to make up a second oxidized lysine and a complex of histone H4 protein, Zn 2 + binding site is present (J Mol Biol, 2004, 337 (3) 731-41).
  • the present inventors have tried to increase the NAD (H) required for the biosynthesis of a useful target substance such as L-amino acid, and thus discovered a cobB gene and manipulated the gene to improve the yield of L-threonine.
  • the present invention was completed by discovering that it can increase.
  • One object of the present invention is to provide a microorganism having L-threonine production capacity.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing L-threonine by using the microorganism having the L-threonine production capacity.
  • the present invention provides a microorganism having an L-threonine production capacity in which the activity of the CobB protein is inactivated compared to the intrinsic activity.
  • the term "CobB protein” may mean a protein lysine deacetylase and / or lysine desuccinylase, NAD (H) during the deoxidation reaction or desuccinization reaction May refer to a class III sirtuin protein using as a cofactor.
  • the CobB may include an enzyme having a similar activity, even if the enzyme has a different name, for example, an enzyme of the genus Escherichia .
  • the CobB protein may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the CobB protein may be a protein having a sequence homology of at least 70%, at least 80%, at least 90%, or at least 95% with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the CobB protein is a sequence having such homology, and includes without limitation so long as it exhibits substantially the same or corresponding function as each protein.
  • the CobB protein is understood to include an amino acid sequence in which some amino acid sequences are deleted, modified, substituted or added as compared to the wild type CobB protein.
  • the gene encoding the CobB protein of the present invention may be to encode an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence having a sequence homology of 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more thereof.
  • the cobB gene may have a sequence homology of at least 70%, at least 80%, at least 90%, or at least 95% with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the cobB gene may be included without limitation so long as it encodes a protein exhibiting the same or corresponding function as the CobB protein.
  • a gene having such homology includes a gene in which some nucleotide sequences are deleted, modified, substituted or added as compared to the wild type cobB gene.
  • homology refers to a similar degree of nucleotide sequence or amino acid sequence of a gene encoding a protein. That is, the percentage of identity between two polynucleotide or polypeptide moieties. Homology between sequences from one moiety to another may be determined by techniques known in the art. For example, homology can be determined by aligning sequence information and directly aligning sequence information between two polynucleotide molecules or two polypeptide molecules using readily available computer programs.
  • the computer program may be BLAST (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign TM (DNASTAR Inc), or the like.
  • homology between polynucleotides can be determined by hybridizing polynucleotides under conditions of stable double stranding between homologous regions, followed by digestion with single-strand-specific nucleases to determine the size of the digested fragments.
  • intrinsic activity refers to the level of activity of a protein in its native state or in its natural state before it is modified.
  • the term “protein inactivated compared to endogenous activity” means that the protein mentioned in the microorganism is not expressed at all, or does not have any activity even when expressed, or the activity of the protein is weakened or eliminated compared to the endogenous activity. It means.
  • the term “attenuation” or “removal” of protein activity means that the expression of the gene encoding the protein is reduced or less than the intrinsic level.
  • a method of inactivating the activity of the protein a method of replacing a gene encoding the protein on a chromosome with a mutated gene such that the activity of the protein is reduced or absent; Introducing a mutation into an expression control sequence of a gene on a chromosome encoding said protein; Replacing the expression control sequence of the gene encoding the protein with a sequence having weak or no activity; Deleting all or part of a gene on a chromosome that encodes the protein; Introducing an antisense oligonucleotide (eg, antisense RNA) that complementarily binds to a transcript of a gene on the chromosome to inhibit translation from the mRNA to a protein; How to make the secondary structure impossible by attaching the complementary sequence to the SD sequence in front of the SD (Shine-Dalgarno) sequence of the gene encoding the protein to form a secondary structure and the ORF (open reading frame of the sequence)
  • a method of deleting part or all of a gene encoding a protein includes a polynucleotide or a marker in which a polynucleotide encoding an endogenous target protein in a chromosome through a bacterial chromosomal insertion vector is deleted in part or in entire nucleotide sequence thereof.
  • a method of deleting part or all of such genes a method of deleting genes by homologous recombination may be used.
  • the term "some" may vary depending on the type of polynucleotide, but may be, for example, 1 to 700, 1 to 500, 1 to 300, 1 to 100, or 1 to 50 nucleotides.
  • homologous recombination refers to genetic recombination occurring through linkage exchange at the locus of gene chains having homology with each other.
  • the protein was inactivated by homologous recombination.
  • the method of modifying an expression control sequence is carried out by inducing a mutation in the expression control sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof in the nucleotide sequence of the expression control sequence, or by replacing with a weaker promoter.
  • the expression control sequence may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosomal binding site, and a sequence that controls the termination of transcription and translation.
  • a method of modifying a gene sequence on a chromosome may be performed by inducing a mutation in the sequence by deleting, inserting, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, to further reduce the activity of the protein, or performing weaker activity. It can be carried out by replacing with a gene sequence that has been improved to have or a gene sequence that has been improved so that there is no activity.
  • microorganisms producing L-threonine or “microorganisms having L-threonine production capacity” refers to a microorganism or L-threonine which naturally has L-threonine production capacity. It refers to a microorganism to which the production capacity of threonine is given to a natural strain having no production capacity.
  • microorganisms having L-threonine producing ability may include all microorganisms producing L-threonine in which the activity of CobB protein of the present invention can be inactivated.
  • examples include Escherichia (Escherichia), An air Winiah (Erwinia) genus, Serratia marcescens (Serratia) genus, Providencia (Providencia) genus Corynebacterium (Corynebacterium) in and Brevibacterium genus Solarium (Brevibacterium) It may be a microorganism, but is not limited thereto.
  • the microorganism having the L-threonine production capacity of the present invention may be a microorganism of the genus Escherichia , more specifically, E. coli .
  • the present invention provides a method of preparing a culture medium comprising the steps of culturing an Escherichia spp. It provides a method for producing L-threonine comprising the step of obtaining L-threonine from the microorganism or the medium.
  • microorganism having the L-threonine production capacity or the Escherichia genus microorganism having the L-threonine production capacity is as described above.
  • the culture can be made according to the appropriate medium and culture conditions known in the art. Those skilled in the art can also easily adjust the medium and culture conditions. Specifically, the culture may be continuously cultured in a batch process, an injection batch or a repeated fed batch process, but is not limited thereto.
  • sugar sources that can be used include sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, palmitic acid, stearic acid, Fatty acids such as linoleic acid, glycerol, alcohols such as ethanol, gluconic acid, acetic acid, organic acids such as pyruvic acid may be included, but are not limited thereto. These materials can be used individually or as a mixture.
  • Nitrogen sources that may be used may include peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean wheat and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate, It is not limited to this. Nitrogen sources can also be used individually or as a mixture. Personnel that may be used may include, but are not limited to, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts.
  • the culture medium may contain a metal salt such as magnesium sulfate or iron sulfate required for growth. In addition to these substances, essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used.
  • precursors suitable for the culture medium may be used, but are not limited thereto. The above-mentioned raw materials may be added batchwise or continuously by a suitable method to the culture medium during the culturing process.
  • Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or acid compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid can be used in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to inhibit bubble generation.
  • Oxygen or an oxygen-containing gas eg, air
  • the temperature of the culture may be usually 20 °C to 45 °C, for example 25 °C to 40 °C, or 30 °C to 40 °C.
  • the incubation period can last until the desired amount of L-threonine is obtained, for example 10 to 160 hours, or 10 to 72 hours.
  • L-threonine may be excreted in the culture medium or contained in cells.
  • Obtaining L-threonine of the present invention may include the step of separating and obtaining L-threonine from the microorganism or the medium, specifically, the culture medium or culture from which the cultured microorganism or microbial cells have been removed. Can be.
  • the separation and obtaining method may be obtained by separating L-threonine produced from the culture medium or whole culture from which microorganisms or microbial cells have been removed using a suitable method known in the art according to the culture method.
  • the separating may include a purification process.
  • microorganisms having L-threonine production inactivated CobB protein activity compared to the intrinsic activity of the present invention increases the level of intracellular NAD (H), resulting in high efficiency and high yield of L-threonine. Can produce.
  • 1 is a view showing the intracellular NAD (H) level of a strain having L- threonine production capacity according to one embodiment.
  • Figure 2 is a view showing the intracellular NAD (H) level of the strain having L- threonine production capacity according to one embodiment.
  • cobB gene from the E. coli W3110 ATCC 39936
  • wild-type E. coli strain homologous recombination was produced in a strain with a cobB gene deletion.
  • the cobB gene in E. coli is known to encode CobB proteins with protein lysine deacetylase activity and / or protein lysine desuccinylase activity.
  • the cobB to be deleted The gene has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the chloramphenicol gene of pUCprmfmloxP a marker for confirming insertion into the gene, was prepared as follows.
  • the chromosomal DNA (gDNA) of E. coli W3110 was extracted using a Genomic-tip system (Qiagen, Germany), and the gDNA was used as a template, and SEQ ID NO: 3 and A polymerase chain reaction (PCR) was carried out using the polynucleotide of 4 as a primer.
  • PCR to amplify the above 30 cycles consisting of 30 seconds denaturation at 94 °C, 30 seconds annealing (55 °C), and elongation of 2 minutes 30 seconds at 72 °C.
  • the obtained PCR product was digested with KpnI and EcoRV, electrophoresed on 0.8% agarose gel, and eluted to yield 0.3Kb Prmf fragment.
  • Prmf fragment and pUC19 New England Biolabs, USA
  • restriction enzymes KpnI and SmaI respectively, to prepare a pUC-Prmf plasmid.
  • a vector pUCprmfmloxP having a mutant loxP-CmR-loxP cassette and a promoter of the rmf gene at the same time the pACYC184 plasmid (New England Biolab, USA) (Accession Number X06403) was used as a template.
  • PCR was repeated for 30 cycles consisting of 30 seconds of denaturation at 94 ° C., 30 seconds of annealing at 55 ° C., and 1 minute elongation at 72 ° C. to obtain 1.1 kb of PCR product.
  • Secondary PCR was performed by using a primer combination of SEQ ID NOS: 9 and 10 containing 20 bp sequences of the 5 'and 3' regions of the PCR product obtained in the primary PCR, using the eluted primary PCR product as a template.
  • the secondary PCR product of about 1.3 kb was obtained by a secondary polymerase chain reaction of 30 cycles consisting of denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 1 minute. .
  • the secondary PCR product obtained was eluted after electrophoresis on 0.8% agarose gel and used for recombination.
  • E. coli W3110 (hereinafter referred to as 'pKD46-induced E. coli W3110') transformed with a pKD46 vector (Accession Number AY048746) according to a one-step inactivation method developed by Datsenko KA et al.
  • the secondary PCR product was introduced into pKD46-induced Escherichia coli W3110 by electroporation.
  • the secondary PCR product and pKD46-induced Escherichia coli W3110 were cultured in LB medium containing chloramphenicol to select a primary recombinant strain having chloramphenicol resistance.
  • the pKD64 vector was removed from the recombinant strain. Then, the pJW168 vector carrying the Cre-recombinase gene (Gene, (2000) 247,255-264) was introduced into the recombinant strain from which the pKD64 vector was removed, and the pJW168 vector was added to express Cre-recombinase from the introduced pJW168 vector. The introduced recombinant strain was incubated at 30 ° C. in LB medium containing ampicillin.
  • strains were selected by smearing isopropyl- ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside (Isopropyl- ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside: IPTG) on the medium.
  • Selected strains were genetic recombination at the mutant loxP position by Cre-recombinase to remove the chloramphenicol marker gene.
  • the strain from which the chloramphenicol marker gene was removed was cultured at 42 ° C. to remove the pJW168 vector, and finally, the obtained strain was named W3110_ ⁇ cobB .
  • cobB by about 0.5 kb PCR product obtained by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 11 and 12 It was confirmed that the gene was deleted.
  • KCCM Culture Center microorganisms
  • pACYC184-thrABC vector was prepared to confirm the deletion effect of cobB in strains with enhanced threonine metabolic pathways, and this vector was introduced into the W3110_ ⁇ cobB strain prepared in Example 1 to W3110_ ⁇ cobB / pACYC184-thrABC was produced.
  • the vector pACYC184-thrABC was produced by the following method. Using the genomic DNA of Escherichia coli KCCM 10541 (Korean Patent Registration No. 10-0576342), a strain for producing L-threonine, as a template, a PCR reaction was performed using polynucleotides of SEQ ID NOs: 13 and 14 as primers, The obtained DNA fragment was separated and purified, digested with HindIII enzyme, and purified again to prepare a thrABC DNA fragment. The pACYC184 vector was digested with HindIII enzyme, purified and prepared, and ligated with the thrABC DNA fragment to prepare a pACYC184-thrABC vector.
  • the vectors thus prepared were introduced into the W3110 and W3110_ ⁇ cobB strains by electroporation and named W3110 / pACYC184-thrABC and W3110_ ⁇ cobB / pACYC184-thrABC, respectively.
  • cobB deletion strains were prepared from threonine producing strains in the same manner as in Example 1 using KCCM10541 (Korean Patent Registration No. 10-0576342), which is a threonine producing Escherichia coli, as a parent strain. It was named KCCM10541_ ⁇ cobB .
  • Example 1 The recombinant microorganisms prepared in Examples 1 and 2 of Example 1 were cultured in a 250 ml Erlenmeyer flask using the threonine titer medium of Table 1 to confirm the improvement of L-threonine productivity.
  • the parent strain W3110 did not produce any L-threonine when incubated for 48 hours, but the W3110_ ⁇ cobB strain produced 0.01 g / L of L-threonine in a small amount. It was.
  • the strain W3110 / pACYC184-thrABC which enhanced the threonine biosynthesis pathway, produced 1.42 g / L of threonine, whereas the strain W3110_ ⁇ cobB / pACYC184-thrABC produced 1.89 g / L of threonine. It was confirmed that the produced threonine concentration was increased by 33%.
  • intracellular NAD (H) levels were measured using strain W3110_ ⁇ cobB prepared in Example 1-1.
  • the NAD / NADH measurement kit EnzyChrom TM NAD + / NADH Assay Kit (ECND-100) developed by Bioassay systems was used (Mol Cancer Ther., 2008, 7 (1): 110-120).
  • W3110 and W3110_ ⁇ cobB of Example 1 were incubated overnight in the LB liquid medium containing glucose used in Example 1 of 1 contained in 250 ml of Erlenmeyer flasks. After incubation, the supernatant was removed by centrifugation, and the obtained cells were washed with ice-cold PBS, and treated with NADH / NAD extraction buffer (Permeable buffer) at room temperature and low temperature for 10 minutes and stirred to carry out NAD (H) in cells.
  • NADH / NAD extraction buffer Permeable buffer
  • Example 3 In order to measure the threonine production titers of KCCM10541_ ⁇ cobB , the cobB gene deletion strain prepared in Example 3, and the parent strain KCCM10541, the threonine yield was measured in the same manner as in Example 1-1.
  • Example 3 In order to evaluate the intracellular NAD (H) level of KCCM10541_ ⁇ cobB , the cobB gene deletion strain prepared in Example 3, and the parent strain KCCM10541, the NAD (H) level was measured in the same manner as in Example 2-2. Measured.

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Abstract

본 발명은 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물, 및 그를 이용한 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물 및 그를 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법
본 발명은 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물, 및 그를 이용한 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-쓰레오닌은 사료 첨가제, 의약 원료 또는 식품 원료 등으로 널리 사용되는 아미노산으로서 미생물을 이용한 발효 방법으로 대량 생산되고 있다.
미생물을 이용한 목적 물질의 생산방법은 주로 목적 물질의 생성에 관여된 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 발현이 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근방법이 주로 이용되었다. 한편으로, 목적 물질의 고수율 생산을 위해서는 충분한 에너지의 생성 및 유지가 필요하기 때문에, 생체 내에서 NADH, NADPH 및 아데노신-5'-트리포스페이트(Adenosine-5'-triphosphate: ATP)의 형태의 에너지를 확보하는 접근 방법도 이용되고 있다.
미생물 내의 NAD(H) 수준을 증가시키는 방법으로는 데 누보(de novo) 생합성 과정이나 살비지(salvage) 과정에 관여하는 유전자를 강화시켜 합성을 증가시키는 방법과 NAD(H)의 분해 경로를 감쇄(attenuation) 또는 결실(deletion)시켜 강화시키는 방법이 알려져 있다(Metabolic Engineering, 2002, 4, 238-247). 한편, CobB는 탈초산화효소 또는 탈숙신화효소로서, 히스톤 H4 단백질의 초산화된 라이신과 복합체를 이루는 것이 알려져 있으며, Zn2 + 결합 부위가 존재한다고 알려져 있다(J Mol Biol, 2004, 337(3);731-41).
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 L-아미노산과 같은 유용한 목적 물질의 생합성에 필요한 NAD(H)를 증가시키기 위해 노력한 결과, cobB 유전자를 발굴하였으며, 당해 유전자를 조작하여 L-쓰레오닌의 생산 수율을 증가시킬 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물을 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 CobB 단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화된 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "CobB 단백질"은 라이신 탈아세틸화효소(protein lysine deacetylase) 및/또는 라이신 탈숙시닐화효소(protein lysine desuccinylase) 를 의미할 수 있으며, 탈초산화 반응이나 탈숙신화 반응시 NAD(H)를 보조인자로서 사용하는 클라스 III 시르투인(sirtuin) 단백질을 의미할 수 있다. 상기 CobB는 효소의 이름이 상이하더라도, 그와 유사한 활성을 갖는 효소를 포함할 수 있으며, 예를 들면, 에스케리키아(Escherichia) 속유래의 효소일 수 있다. 구체적으로상기 CobB 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 CobB 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질일 수 있다. 상기 CobB 단백질은 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 기능을 나타내는 것이라면 제한 없이 포함한다. 또한 이러한 상동성을 갖는 아미노산 서열이라면, 상기 CobB 단백질은 야생형 CobB 단백질에 비하여 일부 아미노산 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열도 포함하는 것으로 이해된다.
아울러, 본 발명의 상기 CobB 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열 및 이와 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다. 구체적인 예로, 상기 cobB 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것일 수 있다. 상기 cobB 유전자는 상기 CobB 단백질과 동일하거나 상응하는 기능을 나타내는 단백질을 코딩하는 것이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 갖는 유전자라면, 야생형 cobB 유전자에 비하여 일부 뉴클레오티드 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 유전자도 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명에서 용어, "상동성"이란, 단백질을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열이나 아미노산 서열의 유사한 정도를 의미한다. 즉, 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 당해 기술분야에 알려진 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
본 발명에서 용어, "내재적 활성"은 본래 미생물이 변형되기 전 상태 또는 천연의 상태에서 가지고 있는 단백질의 활성의 수준을 의미한다.
본 발명에서 용어 "단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화된"은 미생물에서 언급된 단백질이 전혀 발현되지 않거나, 또는 발현되더라도 전혀 활성을 가지지 않는 것 또는 내재적 활성에 비해 단백질의 활성이 약화 또는 제거된 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어, 단백질 활성의 "약화" 또는 "제거"는 해당 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 내재적 수준보다 감소하거나 또는 전혀 존재하지 않는 것을 의미한다.
상기 단백질의 활성을 불활성화하는 방법의 예로, 상기 단백질의 활성이 감소되거나 존재하지 않도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 SD(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜의 부착이 불가능하게 만드는 법 및 해당 서열의 ORF (open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE (Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 단백질을 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 그의 일부 또는 전체 뉴클레오티드 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있다. 상기 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 예를 들면, 1 내지 700개, 1 내지 500개, 1 내지 300개, 1 내지 100개, 또는 1 내지 50개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기에서 "상동 재조합(homologous recombination)"이란, 서로 상동성을 지닌 유전자 사슬의 좌위에서 연결 교환을 통해 일어나는 유전자 재조합을 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상동 재조합에 의해 상기 단백질을 불활성화시켰다.
또한, 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 뉴클레오티드 서열에 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 프로모터로 교체하는 등의 방법으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절 서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.
아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성이 더욱 감소되도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.
본 발명에서 용어 "L-쓰레오닌을 생산하는 미생물" 또는 "L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물"이란, 자연적으로 L-쓰레오닌 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 L-쓰레오닌의 생산능이 없는 천연형 균주에 쓰레오닌의 생산능이 부여된 미생물을 의미한다.
본 발명에서 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물은 본 발명의 CobB 단백질의 활성이 불활성화될 수 있는 L-쓰레오닌을 생산하는 모든 미생물을 포함할 수 있다. 그 예로 에스케리키아 (Escherichia) 속, 어위니아 (Erwinia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속에 속하는 미생물일 수 있으나, 그에 제한되지는 않는다. 구체적으로, 본 발명의 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물은 에스케리키아 (Escherichia) 속 미생물일 수 있으며, 더 구체적으로는 대장균(E. coli)일 수 있다.
본 발명은 또 하나의 양태로서 CobB 단백질의 활성이 불활성화된 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 상기 미생물 또는 배지로부터 L-쓰레오닌을 수득하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물 또는 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 또한 통상의 기술자라면 배지 및 배양 조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 변형될 수 있다. 사용될 수 있는 당원으로는 글루코스, 수크로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 글루콘산, 아세트산, 피루브산과 같은 유기산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양 배지에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양 배지 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 예를 들면 25℃ 내지 40℃, 또는 30℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 원하는 L-쓰레오닌의 생성량이 얻어질 때까지 지속될 수 있으며, 예를 들면 10 내지 160 시간, 또는 10 내지 72 시간일 수 있다. L-쓰레오닌은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.
본 발명의 L-쓰레오닌을 수득하는 단계는, 미생물 또는 배지, 구체적으로는 배양한 미생물 또는 미생물 세포가 제거된 배지 또는 배양물 전체로부터 L-쓰레오닌을 분리하여 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 분리하여 수득하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 미생물 또는 미생물 세포가 제거된 배지 또는 배양물 전체로부터 생산된 L-쓰레오닌을 분리하여 수득할 수 있다. 예를 들면, 단백질 침전제에 의한 처리(예, 염석법), 원심분리, 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 겔여과를 포함한 크로마토그래피, 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 및 이들의 방법을 조합한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 분리하는 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.
본 발명에서의 CobB 단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화된 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 미생물을 사용하면 세포 내 NAD(H) 수준이 증가하여 고효율 및 고수율로 L-쓰레오닌을 생산할 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 균주의 세포내 NAD(H) 수준을 나타낸 도면이다.
도 2는 일 구체예에 따른 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 균주의 세포내 NAD(H) 수준을 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. cobB 가 결실된 대장균 균주의 제작
1. 대장균 야생형 균주에 cobB 가 결실된 균주의 제작
본 실시예에서는 야생형 대장균 균주인 대장균 W3110(ATCC 39936)에서 cobB 유전자를 상동 재조합에 의하여 결실시켜 cobB 유전자가 결실된 균주를 제작하였다. 대장균에서 cobB 유전자는 단백질 라이신 탈아세틸화효소(protein lysine deacetylase) 활성 및/또는 단백질 라이신 탈숙시닐화효소(protein lysine desuccinylase) 활성을 갖는 CobB 단백질을 코딩하는 것으로 알려져 있다. 결실되어질 상기 cobB 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
대장균 W3110에서 상동 재조합에 의하여 cobB 유전자를 결실시키는 구체적인 과정은 다음과 같다. 유전자 cobB의 결실을 위하여, Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 재조합효소(lambda Red recombinase)를 이용한, 1-단계 불활성화(one step inactivation) 방법을 사용하였다(Proc Natl Acad Sci USA, (2000) 97:6640-6645).
먼저, 유전자 내부로의 삽입을 확인하기 위한 마커인 pUCprmfmloxP의 클로람페니콜 유전자는 다음과 같이 제조하였다. rmf 유전자의 프로모터를 포함하는 DNA 단편 0.3 kb를 얻기 위해, Genomic-tip 시스템(Qiagen, 독일)을 이용하여 대장균 W3110의 염색체 DNA(gDNA)를 추출하고, 상기 gDNA를 주형으로 하고, 서열번호 3 및 4의 폴리뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 수행하였다. 상기를 증폭시키기 위한 PCR은 94℃에서 30초의 변성(denaturation), 55℃에서 30초의 어닐링(annealing), 및 72℃에서 2분30초의 신장(elongation)으로 이루어진 사이클을 30회 반복 수행하였다. 얻어진 PCR 산물을 KpnI과 EcoRV로 절단하고 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 용리하여 0.3Kb 크기의 Prmf 단편을 수득하였다. 이후에, 상기 수득한 Prmf 단편 및 pUC19 (New England Biolabs, USA) (Accession Number L09137)을 각각 제한효소 KpnI과 SmaI으로 절단하고 라이게이션(ligation)시켜서 pUC-Prmf 플라스미드를 제작하였다. 다음으로, 돌연변이 loxP-CmR-loxP 카세트와 rmf 유전자의 프로모터를 동시에 가지는 벡터 pUCprmfmloxP를 제작하기 위해, pACYC184 플라스미드(New England Biolab, USA)(Accession Number X06403)를 주형으로 하고, 서열번호 5 및 6의 폴리뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여, 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하는 PCR을 수행하여, 1.1kb의 PCR 산물을 얻었다. 상기 pUC-Prmf 벡터와 pACYA184를 주형으로한 PCR에서 얻은 1.1kb의 DNA를 각각 제한효소 NdeI/KpnI으로 절단한 후 라이게이션 반응을 수행하고 얻어진 라이게이션 산물을 대장균에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균으로부터 통상의 방법으로 정확하게 라이게이션된 DNA를 가진 세포주를 선별하고 이의 배양액으로부터 플라스미드 pUCprmfmloxP를 분리 정제하였다.
이후에, cobB 유전자의 일부분과 pUCprmfmloxP의 클로람페니콜 내성 유전자의 일부 뉴클레오티드 서열을 갖는 서열번호 7 및 8의 프라이머 조합을 이용하여 pUCprmfmloxP를 주형으로 하고, 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 및 72℃에서 1분간 신장시키는 것으로 이루어진 사이클을 30회 반복하는 1차 중합효소 연쇄반응에 의해 약 1.3 kb의 PCR 산물을 얻었다. 얻어진 PCR 산물을 0.8% 아가로스 겔에서의 전기영동 후 용리하여 2차 PCR의 주형으로 사용하였다. 2차 PCR은 1차 PCR에서 수득된 PCR 산물의 5' 및 3' 영역의 20 bp의 염기서열을 포함하는 서열번호 9 및 10의 프라이머 조합을 이용하여, 용리된 1차 PCR 산물을 주형으로 하여, 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 및 72℃에서 1분간 신장시키는 것으로 이루어진 사이클을 30회 반복하는 2차 중합효소 연쇄반응에 의해, 약 1.3 kb의 2차 PCR 산물을 얻었다. 얻어진 2차 PCR 산물을 0.8% 아가로스 겔에서의 전기영동 후 용리하여 재조합에 사용하였다.
그 후, Datsenko KA 등이 개발한 1-단계 불활성화 방법에 따라 pKD46 벡터(Accession Number AY048746)로 형질전환된 대장균 W3110(이하, 'pKD46-도입된 대장균 W3110' 이라 한다)를 컴페턴트(competent)한 상태로 제조한 후, 상기 2차 PCR 산물을 pKD46-도입된 대장균 W3110에 전기천공법을 통해 도입하였다. 다음으로, 상기 2차 PCR 산물과 pKD46-도입된 대장균 W3110을 클로람페니콜을 포함하는 LB 배지에서 배양하여 클로람페니콜 내성을 갖는 1차 재조합 균주를 선별하였다. 다음으로, 상기 재조합 균주에서 클로람페니콜 마커 유전자를 제거하기 위하여, 먼저 상기 재조합 균주에서 pKD64 벡터를 제거하였다. 이후, Cre-재조합효소 유전자를 갖는 pJW168 벡터(Gene, (2000) 247,255-264)를 상기 pKD64 벡터가 제거된 재조합 균주에 도입하고, 도입한 pJW168 벡터로부터 Cre-재조합효소를 발현시키기 위하여 pJW168 벡터가 도입된 재조합 균주를 암피실린을 포함한 LB배지에서 30℃로 배양하였다. 이후, 상기 배지에 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드(Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside:IPTG)를 도말하여 균주를 선별하였다. 선별된 균주는 Cre-재조합효소에 의해 mutant loxP 위치에서 유전자 재조합이 일어나 클로람페니콜 마커 유전자가 제거된 것이다. 이후, 상기 클로람페니콜 마커 유전자가 제거된 균주를 42℃에서 배양하여 pJW168 벡터를 제거하였고, 최종적으로 수득된 균주를 W3110_△cobB로 명명하였다. 이후, 서열번호 11 및 12의 프라이머를 사용한 PCR을 통해 얻어진 약 0.5 kb PCR 산물에 의해 cobB 유전자가 결실되었다는 것을 확인하였다.
상기 CobB 단백질의 활성이 불활성화된 상기 W3110_△cobB 를 CA03-8300로 명명하고, 부다페스트 조약 하에 2014년 12월 05일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11630P를 부여받았다.
2. 쓰레오닌 대사 경로가 강화된 균주에서 cobB 결실된 균주의 제작
본 실시예에서는 쓰레오닌 대사 경로를 강화한 균주에서 cobB의 결실 효과를 확인하기 위해서 pACYC184-thrABC 벡터를 제작하였고, 이 벡터를 상기 실시예 1에서 제작된 W3110_△cobB 균주에 도입하여 W3110_△cobB/pACYC184-thrABC를 제작하였다.
구체적으로, 상기 벡터 pACYC184-thrABC는 다음과 같은 방법으로 제작되었다. L-쓰레오닌 생산용 균주인 대장균 KCCM 10541(대한민국 특허 등록번호 제10-0576342호)의 유전체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 13 및 14의 폴리뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR 반응을 수행하고, 수득한 DNA 단편을 분리 정제하고, HindIII 효소로 절단한 후 다시 정제하여 thrABC DNA단편을 준비하였다. pACYC184 벡터를 HindIII 효소로 절단한 후 정제하여 준비하고, 상기 thrABC DNA단편과 라이게이션하여 pACYC184-thrABC 벡터를 제작하였다. 이렇게 제작된 벡터를 W3110 및 W3110_△cobB 균주에 전기천공법을 통해 도입하였고 각각 W3110/pACYC184-thrABC 및 W3110_△cobB/pACYC184-thrABC로 명명하였다.
3. 쓰레오닌 생산 균주에서 cobB 결실된 균주의 제작
본 실시예에서는 쓰레오닌을 생산하는 대장균인 KCCM10541(대한민국 특허 등록번호 제10-0576342호)을 모균주로 하여 실시예 1의 1과 동일한 방법으로 쓰레오닌 생산 균주에서 cobB 결실 균주를 제작하였고, 그를 KCCM10541_△cobB로 명명하였다.
실시예 2. cobB 결실된 균주의 L- 쓰레오닌 생산성 및 NAD (H) 수준 분석
1. 대장균 야생형 균주 및 쓰레오닌 대사 경로 강화 균주에서 cobB 결실된 균주의 L- 쓰레오닌 생산성 분석
상기 실시예 1의 1 및 2에서 제조한 재조합 미생물을 표 1의 쓰레오닌 역가 배지를 이용하여 삼각플라스크 250ml에서 배양하여 L-쓰레오닌 생산성 향상을 확인하였다.
조성물 농도 (리터당)
포도당 70 g
KH2PO4 2 g
(NH4)2SO4 25 g
MgSO4·H2O 1 g
FeSO4·H2O 5 mg
MnSO4·H2O 5 mg
DL-메티오닌 0.15 g
효모액기스 2 g
탄산칼슘 30 g
pH 6.8
33℃의 배양기(incubator) (진탕 배양기, 제이오텍社) 에서 LB 고체 배지 중에 밤새 배양한 W3110, W3110_△cobB, W3110/pACYC184-thrABC 및 W3110_△cobB/pACYC184-thrABC 균주 각각을 표 1의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 동안 배양하여 L-쓰레오닌의 생산성을 분석하였으며, 그의 결과를 표 2에 나타내었다.　
균주 L- 쓰레오닌 (g/L)
W3110 0.00
W3110_△cobB 0.01
W3110/pACYC184-thrABC 1.42
W3110_△cobB/pACYC184-thrABC 1.89
표 2에서 나타낸 바와 같이, 모 균주인 W3110 균주는 48시간 배양하였을 경우 L-쓰레오닌을 전혀 생산하지 못했으나, W3110_△cobB 균주는 소량이기는 하나 0.01 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였다. 또한 쓰레오닌 생합성 경로를 강화한 W3110/pACYC184-thrABC 균주의 경우, 1.42g/L의 쓰레오닌을 생산한 반면, W3110_△cobB/pACYC184-thrABC 균주는 1.89g/L의 쓰레오닌을 생산하여 생산된 쓰레오닌 농도가 33% 증가했음을 확인하였다.
2. 대장균 야생형 균주에서 cobB 가 결실된 균주의 NAD (H) 수준 평가
본 실시예에서는 실시예 1의 1에서 제작된 균주 W3110_△cobB를 이용하여 세포내 NAD(H) 수준을 측정하였다.
구체적으로, Bioassay systems사에서 개발한 NAD/NADH 측정키트(EnzyChromTM NAD+/NADH Assay Kit (ECND-100))를 사용하였다(Mol Cancer Ther.,2008, 7(1):110-120). 삼각플라스크 250ml에 포함된 실시예 2의 1에서 사용된 글루코오스가 포함된 LB 액체 배지에 실시예 1의 W3110 및 W3110_△cobB를 각각 밤새 배양하였다. 배양 후, 원심분리로 상층액을 제거하고 ice-cold PBS를 이용하여 수득된 균체를 세척하고, NADH/NAD 추출 완충액(Permeable buffer)을 10분간 상온과 저온에서 처리하고 교반하여 세포 내의 NAD(H)가 세포 외부로 스며 나오게 하였다. 그 후, 다시 원심분리하여 상등액을 분리하고, 분석 완충액(Assay buffer), 반응효소, 에탄올, PMS, 및 MTT를 섞은 뒤, 흡광기를 이용하여 OD565를 측정하여 NAD(H)를 정량하였다. 상기 과정을 3회 반복 후 실험 결과의 평균값을 측정하였다.
그 결과, 일구체예에 따른 대장균 W3110_△cobB에서 세포내 NAD(H) 수준이 야생형 대장균 W3110에 비해 10% 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 1).
3. 쓰레오닌 생산 균주에서 cobB가 결실된 균주의 쓰레오닌 생성능 평가
상기 실시예 1의 3에서 제조한 cobB 유전자 결실주인 KCCM10541_△cobB와 모균주인 KCCM10541의 쓰레오닌 생산 역가를 측정하기 위하여 상기 실시예 2의 1에서와 같은 방법으로 쓰레오닌 수율을 측정하였다.
균주 L- 쓰레오닌 (g/L)
KCCM10541 30.4
KCCM10541_△cobB 36.1
표 3에 나타낸 바와 같이, 대조군인 KCCM10541에 비해 KCCM10541_△cobB에서 쓰레오닌 농도가 약 20% 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
4. 쓰레오닌 생산 균주에서 cobB가 결실된 균주의 NAD (H) 수준 평가
상기 실시예 1의 3에서 제조한 cobB 유전자 결실주인 KCCM10541_△cobB와 모균주인 KCCM10541의 세포내 NAD(H) 수준을 평가하기 위하여 상기 실시예 2의 2에서와 같은 방법으로 NAD(H) 수준을 측정하였다.
그 결과, 일구체예에 따른 대장균 KCCM10541_△cobB에서 세포내 NAD(H) 수준이 모균주인 대장균 KCCM10541에 비해 14% 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 2).
[규칙 제91조에 의한 정정 08.06.2017]　
Figure WO-DOC-FIGURE-79

Claims (5)

  1. CobB 단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화된, L-쓰레오닌 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 CobB 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, L-쓰레오닌 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 CobB 단백질은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해서 코딩되는, L-쓰레오닌 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 에스케리키아속 미생물은 대장균인, L-쓰레오닌 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 미생물 또는 배지로부터 L-쓰레오닌을 수득하는 단계를 포함하는, L-쓰레오닌을 생산하는 방법.
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