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WO2013038776A1 - 炎症性腸疾患治療剤 - Google Patents

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WO2013038776A1
WO2013038776A1 PCT/JP2012/066394 JP2012066394W WO2013038776A1 WO 2013038776 A1 WO2013038776 A1 WO 2013038776A1 JP 2012066394 W JP2012066394 W JP 2012066394W WO 2013038776 A1 WO2013038776 A1 WO 2013038776A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
chitin
group
nanofibers
nanofiber
agent
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/066394
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
南　三郎
和生 東
智弘 大▲崎▼
伸介 伊福
博之 斎本
Original Assignee
国立大学法人鳥取大学
鳥取県
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人鳥取大学, 鳥取県 filed Critical 国立大学法人鳥取大学
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Priority to US14/344,962 priority patent/US20140363673A1/en
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    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/716—Glucans
    • A61K31/722—Chitin, chitosan
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
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    • Y10T428/2913—Rod, strand, filament or fiber
    • Y10T428/298—Physical dimension

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic and / or preventive agent for inflammatory bowel disease containing chitin nanofibers or chitosan nanofibers, and an NF-kB activation inhibitor.
  • IBD Inflammatory bowel disease
  • IBD is a troublesome disease that tends to become chronic and relapse easily.
  • immunosuppressive agents such as corticosteroids are exclusively used for the treatment of IBD, there are problems in that side effects are serious and long-term administration is difficult.
  • IBD therapeutic agents containing N-acetylglucosamine Patent Document 1
  • glucosamine salts Patent Document 2
  • the inventors of the present invention have intensively studied to solve the above problems, and found that administration of chitin nanofiber or chitosan nanofiber to an animal suffering from IBD significantly improves the symptoms of IBD. It came to be completed.
  • the present invention provides the following: (1) A therapeutic and / or prophylactic agent for inflammatory bowel disease comprising chitin nanofibers.
  • Chitin nanofibers are processed as follows: A material derived from a chitin-containing organism is produced by a method characterized in that it is subjected to at least one deproteinization step and at least one decalcification step, and then to a defibration step. ). (3) The agent according to (1) or (2), wherein the fiber has a width of 2 nm to 20 nm. (4) The agent according to any one of (1) to (3), which is an orally administered agent. (5) A therapeutic and / or prophylactic agent for inflammatory bowel disease comprising chitosan nanofibers.
  • Chitosan nanofibers are processed as follows: By subjecting the chitin-containing organism-derived material to at least one deproteinization step, at least one decalcification step and at least one deacetylation step, and then to a defibration step The agent according to (5), which is produced. (7) The agent according to (5) or (6), wherein the fiber has a width of 2 nm to 40 nm. (8) The agent according to any one of (5) to (7), which is an orally administered agent. (9) An NF-kB activation inhibitor containing chitin nanofibers. (10) An NF-kB activation inhibitor containing chitosan nanofibers.
  • a therapeutic and / or prophylactic agent for IBD and an NF-kB activation inhibitor that can be administered for a long period of time without worrying about side effects and that are excellent in effect.
  • FIG. 1 is a tissue section photograph showing the effect of chitin nanofibers on histological changes in the large intestine of mice with ulcerative colitis induced by DSS.
  • Tissue sections from 1 mouse each from the chitin powder (+) group (upper panel), chitin nanofiber (+) group (middle panel), and control (+) group (lower panel) on the 6th day of the test start Got.
  • the large intestine was fixed, and the tissue sections were stained with hematoxylin-eosin.
  • the erosion is indicated by an arrow.
  • the scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIG. 2 is a bar graph showing the effect of chitin nanofibers on the histological score in the large intestine of ulcerative colitis mice induced by DSS.
  • FIG. 3 is a tissue section photograph showing the effect of chitin nanofibers on the number of MPO-positive colon cells in ulcerative colitis mice induced by DSS.
  • One day from 3 mice for each group of the chitin powder (+) group (upper panel), chitin nanofiber (+) group (middle panel) and control (+) group (lower panel) on the 6th day of the test To obtain a tissue section. MPO positive cells are indicated by arrows.
  • FIG. 4 is a bar graph showing the effect of chitin nanofibers on the number of MPO positive colon cells in ulcerative colitis mice induced by DSS.
  • (-) Is a group to which dextran sulfate sodium (DSS) was not administered. * Indicates p ⁇ 0.05, and ** indicates p ⁇ 0.01.
  • FIG. 5 shows the results of examining the effect of chitin nanofibers on NF-kB activation in the colon epithelium of mice with ulcerative colitis induced by DSS.
  • FIG. 5A (a) shows an NF-kB positive region (arrow) in the control (+) group, FIG.
  • FIG. 5A (b) shows an NF-kB positive region (arrow) in the chitin nanofiber (+) group
  • FIG. 5A (c) These are microscopic images showing NF-kB positive regions (arrows) in the chitin powder (+) group. The bar is 100 microns.
  • FIG. 5B is a graph showing the ratio of the NF-kB positive area of the control ( ⁇ ) group, the control (+), the chitin nanofiber (+) group, and the chitin powder (+) group. * : P ⁇ 0.05, ** : p ⁇ 0.01.
  • the present invention provides a therapeutic and / or prophylactic agent for inflammatory bowel disease (sometimes referred to as “IBD”) comprising chitin nanofibers or chitosan nanofibers.
  • IBD inflammatory bowel disease
  • the disease targeted by the therapeutic and / or prophylactic agent of the present invention (sometimes referred to as “the agent of the present invention”) is IBD, which includes two major diseases, ulcerative colitis and Crohn's disease.
  • the agent of the present invention can be used for the treatment and / or prevention of these diseases.
  • the agent of the present invention can be preferably used for treatment and / or prevention of ulcerative colitis.
  • prevention of recurrence of IBD is also included in treatment and / or prevention.
  • “treatment”, “prevention” and “prevention of recurrence” have the meanings generally recognized in the medical field.
  • the chitin nanofiber used in the agent of the present invention has a fiber length of 1 ⁇ m or more, an average degree of deacetylation of 5% or less, and a relatively uniform width (or diameter).
  • Diameter is about 2 nm to about 200 nm, preferably about 2 nm to about 100 nm, more preferably about 2 nm to about 50 nm, such as about 5 nm to about 20 nm.
  • the fibers are extended chain microcrystals.
  • “the width (or diameter) of chitin nanofibers is about 2 nm to about 20 nm” means that the width (or diameter) is about 2 nm to about 20 nm or less when observed with an electron microscope. A state in which a certain fiber occupies about 50% or more of the whole, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more. The same applies to the width (or diameter) of chitosan nanofibers described later.
  • the chitosan nanofiber used in the cosmetic, bathing agent and pharmaceutical composition of the present invention has a nanofiber length of 1 ⁇ m or more, an average degree of deacetylation of the entire nanofiber of 5% or more, and a width ( Or diameter) is relatively uniform, and typically has a width (or diameter) of about 2 nm to about 200 nm, preferably about 2 nm to about 100 nm, more preferably about 2 nm to about 50 nm, such as about 5 nm to about 20 nm. It is.
  • the fibers are extended chain microcrystals.
  • Such chitosan nanofibers may be selectively deacetylated only on the surface of the N-acetyl group of the chitin nanofibers.
  • the chitin nanofibers used in the agent of the present invention may be produced by any method / means, but the chitin-containing organism-derived material is treated with at least one deproteinization step and at least one time. What was manufactured by the method characterized by attaching
  • the production method of the preferred chitin nanofiber and the chitin nanofiber obtained by the production method will be described below (see also the specification of International Publication WO2010 / 073758, the contents of which are incorporated herein by reference) ).
  • the chitin nanofiber of the present invention can be obtained from the natural world, for example, a material derived from a chitin-containing organism.
  • chitin-containing organisms include, but are not limited to, crustaceans such as shrimps and crabs, insects, and krill.
  • the chitin nanofibers of the present invention may be obtained from shells and shells of crustaceans such as shrimp and crabs, which have a high chitin content.
  • chitin nanofibers in the living body have a matrix containing protein and calcium carbonate existing around and in the gap, they cannot be obtained unless dematrixing is performed.
  • the chitin nanofibrated by the above-described process may be chitin having an ⁇ -type crystal structure such as chitin derived from crab shell or shrimp shell, or ⁇ -type crystal such as chitin derived from squid shell Chitin having a structure may be used.
  • Deproteinization removes the protein that forms the matrix surrounding the chitin nanofibers.
  • the deproteinization treatment include an alkali treatment method and a proteolytic enzyme method such as protease, and the alkali treatment method is preferred.
  • an aqueous solution of an alkali such as potassium hydroxide, sodium hydroxide, or lithium hydroxide is preferably used, and the concentration depends on the amount of the chitin-containing organism-derived material, the type of chitin-containing organism, the site, etc. Although it can be appropriately selected depending on the situation, it is usually about 2 to about 10% (w / v), preferably about 3 to about 7% (w / v), for example about 5% (w / v).
  • the temperature of deproteinization by the alkali treatment can be appropriately selected according to the amount of the chitin-containing organism-derived material, the type of chitin-containing organism, the site, etc., but is usually about 80 ° C. or higher, preferably about 90 ° C. or higher, Preferably, it is carried out while refluxing an alkaline aqueous solution.
  • the treatment time can also be appropriately selected according to the amount of the chitin-containing organism-derived material, the type of chitin-containing organism, the site, etc., but it is usually several hours to about 3 days, preferably several hours to about 2 days. Good.
  • Deashing removes the ash that surrounds chitin nanofibers, mainly calcium carbonate.
  • the decalcification treatment includes an acid treatment method and an ethylenediamine tetraacetic acid treatment method, and an acid treatment method is preferred.
  • an aqueous solution of hydrochloric acid is preferably used, and the concentration thereof can be appropriately selected according to the amount of the chitin-containing organism-derived material, the type of chitin-containing organism, the site, etc. 4 to about 12% (w / v), preferably about 5 to about 10% (w / v).
  • the temperature of deproteinization by acid treatment can be appropriately selected depending on the amount of the chitin-containing organism-derived material, the type of chitin-containing organism, the site, etc., but is usually about 10 to about 50 ° C., preferably about 20 to about It may be 30 ° C., for example room temperature.
  • the decalcification time by acid treatment can be appropriately selected depending on the amount of the material derived from the chitin-containing organism, the kind of the chitin-containing organism, the site, etc., but usually several hours to several days, preferably about 1 to about 3 days. For example, you may carry out for 2 days.
  • the outer skin (mostly chitin nanofibers) obtained in the above process is defibrated to obtain the target chitin nanofiber. Since chitin nanofibers are hydrogen-bonded and strongly aggregated when dried, it is preferable to perform each step of the method for producing chitin nanofibers of the present invention without always drying the material.
  • a stone mill grinder, a high-pressure homogenizer, a freeze grinder, or the like can be used, and the grinder treatment is preferably performed by a stone mill grinder. If a device capable of applying a stronger load, such as a stone mill, is used, it is possible to quickly disentangle even shell-derived alpha chitin such as crabs and shrimps.
  • a decoloring step may be performed if necessary or desired.
  • the decolorization step may be performed at any stage of the above method, but is preferably performed after the deproteinization and decalcification treatments are completed.
  • Decolorization may be performed by any method, but extraction with an organic solvent such as alcohol, use of a chlorine-based bleaching agent, an oxygen-based bleaching agent, or a reducing bleaching agent is preferable. It may be performed at about 70 to about 90 ° C. for several hours using 1 to about 2% sodium hypochlorite.
  • a pulverization step may be performed in order to efficiently perform the deproteinization step, the deashing step, the decolorization step, the defibration step, and the treatment with the acidic reagent described below.
  • the pulverization step may be performed at any stage of the above method, but is preferably performed immediately before the defibration step.
  • the pulverization step may be performed by any method, but a method such as a homogenizer treatment or a mixer treatment is preferable, and may be performed by, for example, a household food processor.
  • the above-described steps such as the deproteinization step, the deashing treatment step, the decolorization step, and the pulverization step may be repeated, performed a plurality of times or alternately. Moreover, the order of each process is not ask
  • the water-dispersibility of chitin nanofibers may be improved by treating the decalcified chitin-containing material with an acidic reagent.
  • an acidic reagent By performing the treatment with an acidic reagent, the chitin nanofiber fibers obtained in the defibrating step become thin and uniform, so that the water dispersibility of the chitin nanofibers is improved.
  • the film formed when applied to the skin becomes uniform, and advantageous effects such as a moisturizing effect are exhibited. Since the acidic reagent generates a positive charge on the chitin fiber surface, it is convenient to efficiently loosen the strongly aggregated chitin fiber.
  • the treatment method with an acidic reagent is not particularly limited as long as it is a method for allowing the acidic reagent to penetrate into the material.
  • the treatment with an acidic reagent can be typically performed by immersing the decalcified chitin-containing material in an aqueous acid solution. In this step, not only the improvement in water dispersibility but also the variation in the width (or diameter) of the chitin nanofibers can be suppressed.
  • the acid that can be used in this step may be any acid and is not particularly limited, but a weak acid is preferred.
  • the weak acid examples include, but are not limited to, acetic acid, formic acid, chloroacetic acid, fluoroacetic acid, propionic acid, butyric acid, lactic acid, citric acid, malonic acid, and ascorbic acid.
  • the preferred weak acid used in this step is acetic acid.
  • the pH of the aqueous weak acid solution is usually adjusted to about 2 to about 5, preferably about 2.5 to about 4.5, such as about 3 to about 4.
  • the temperature of this step can be appropriately selected according to the amount of the chitin-containing organism-derived material, the type of chitin-containing organism, the site, etc., but is usually about 10 to about 50 ° C., preferably about 20 to about 30 ° C., For example, it may be room temperature.
  • the treatment time for this step can also be appropriately selected depending on the amount of the chitin-containing organism-derived material, the type of chitin-containing organism, the site, etc., but is usually 1 hour to about 1 day, preferably about 3 to about 12 hours. For example, it may be overnight.
  • This acid treatment step may be performed at any stage before the defibration step, but preferably after the deproteinization and decalcification, the purification of chitin nanofibers proceeds to some extent. It may be performed immediately before the defibrating step.
  • the chitin nanofibers that can be obtained by the above production method are thin and homogeneous, and extremely long, and the fibers are stretched chain crystals.
  • the widths (or diameters) of the chitin nanofibers obtained by the above production method are relatively uniform, and usually the width (or diameter) is about 2 nm to about 200 nm, preferably about 2 nm to about 100 nm, more preferably about 2 nm. To about 50 nm, for example, about 5 nm to about 20 nm.
  • Chitosan nanofibers can be used instead of the chitin nanofibers or mixed with the chitin nanofibers.
  • Chitosan nanofiber is a deacetylated product of chitin nanofiber, and may be partially deacetylated or completely deacetylated.
  • the chitosan nanofibers used in the agent of the present invention may be produced by any method or means, but the chitin-containing organism-derived material is treated with at least one deproteinization step and at least one time. What was manufactured by the method characterized by attaching
  • the production method of the above preferred chitosan nanofiber and the chitosan nanofiber obtained by the production method will be described below (see also the specification of International Publication WO2010 / 073758).
  • the chitin-containing material, the deproteinization step, the deashing step, and the defibration step are the same as described above for the production of chitin nanofibers.
  • the deproteinization step and the deacetylation step can be performed simultaneously.
  • it is also possible to produce chitosan nanofibers by subjecting a commercially available chitin powder that has already undergone a deproteinization step and a deashing step to a deacetylation step.
  • an alkali treatment method is preferred.
  • an aqueous solution of an alkali such as potassium hydroxide, sodium hydroxide or lithium hydroxide is preferably used, and its concentration is usually about 20 to about 50% (w / v), preferably about 30 to about 40% (w / v), for example about 40% (w / v).
  • the temperature of deacetylation by alkali treatment can be appropriately selected according to the amount of the chitin-containing organism-derived material, the type of chitin-containing organism, the site, etc., but is usually about 80 ° C. or higher, preferably about 90 ° C.
  • the treatment time can also be appropriately selected depending on the amount of the chitin-containing organism-derived material, the type of chitin-containing organism, the site, etc., but it is usually 30 minutes to about 3 days, preferably 30 minutes to overnight. .
  • the widths (or diameters) of chitosan nanofibers produced by the above production method are relatively uniform, and usually the width (or diameter) is about 2 nm to about 200 nm, preferably about 2 nm to about 100 nm, more preferably Is about 2 nm to about 50 nm, for example, about 5 nm to about 20 nm, and the fiber state is a stretched chain crystal.
  • the chitin nanofiber or chitosan nanofiber used in the agent of the present invention may be modified or derivatized, and may be in the form of a salt (for example, hydrochloride).
  • a salt for example, hydrochloride
  • the hydrogen at the hydroxyl group at the 3-position, the hydroxyl group at the 6-position, or the hydroxyl group at the end of the sugar chain may be substituted with another group such as an alkyl group.
  • the methyl group in the acetyl group at the 2-position of the sugar of chitin may be substituted with another group such as an ethyl group.
  • the hydrogen of the amino group at the 2-position of the sugar of chitosan may be substituted with another group such as an alkyl group, and may form a salt with an anion such as a halide ion.
  • these modifications and derivatives or salts are merely examples and are not limiting. In this specification, these modifications and derivatives or salts are also included in chitin nanofibers or chitosan nanofibers. Such derivatives and modifications or salts are known to those skilled in the art, and their production methods are also known.
  • Chitin nanofiber or chitosan nanofiber is a natural product contained in crabs and shrimps, and has very high safety. Therefore, the agent of the present invention containing chitin nanofibers or chitosan nanofibers can be administered over a long period of time, and there are no or very few side effects. Since the agent of the present invention is suitable for long-term administration, it is extremely effective for inflammatory bowel diseases that are easily chronicized and easily relapsed. On the other hand, immunosuppressive agents such as corticosteroids are exclusively used for inflammatory bowel disease, but these drugs have serious side effects and are difficult to administer for a long time.
  • the agent of the present invention solves the problem of immunosuppressive agents conventionally used for the treatment of inflammatory bowel disease. Moreover, as shown in the Examples, the agent of the present invention is also excellent in the treatment and / or prevention effect of inflammatory bowel disease.
  • the agent of the present invention can be made into various known dosage forms.
  • an oral preparation is particularly preferable.
  • oral preparations include, but are not limited to, tablets, granules, powders, capsules, and drinks. These dosage forms can be manufactured according to a well-known method.
  • the agent of the present invention may be in the form of a food or supplement in addition to the pharmaceutical composition.
  • the present invention provides a method for treating and / or preventing inflammatory colitis, wherein an effective amount of chitin nanofibers is administered to a subject in need of treating and / or preventing inflammatory colitis
  • a method for treating and / or preventing inflammatory colitis wherein an effective amount of chitin nanofibers is administered to a subject in need of treating and / or preventing inflammatory colitis
  • the present invention provides, in a further aspect, the use of chitin nanofibers for the manufacture of a medicament for treating and / or preventing inflammatory colitis.
  • the present invention relates to the use of chitin nanofibers for treating and / or preventing inflammatory colitis.
  • Chitin nanofibers preferably used in the above method or use,
  • the following method A material derived from a chitin-containing organism is produced by a method characterized in that it is subjected to at least one deproteinization step and at least one decalcification step, and then to a defibration step.
  • the present invention provides a method for treating and / or preventing inflammatory colitis, wherein an effective amount of chitosan nanofiber is administered to a subject in need of treating and / or preventing inflammatory colitis
  • a method for treating and / or preventing inflammatory colitis wherein an effective amount of chitosan nanofiber is administered to a subject in need of treating and / or preventing inflammatory colitis
  • the present invention provides, in a further aspect, the use of chitosan nanofibers for the manufacture of a medicament for treating and / or preventing inflammatory colitis.
  • the present invention relates to the use of chitin nanofibers for treating and / or preventing inflammatory colitis.
  • Chitosan nanofibers preferably used in the above method or use, The following method: By subjecting the chitin-containing organism-derived material to at least one deproteinization step, at least one decalcification step and at least one deacetylation step, and then to a defibration step It is manufactured.
  • the dose of chitin nanofibers or chitosan nanofibers administered for the treatment and / or prevention of inflammatory bowel disease can usually be appropriately determined by a doctor while observing the effect.
  • the daily dose of chitin nanofibers or chitosan nanofibers per adult is usually about 1 g to about 50 g, preferably about 1 g to about 5 g, but is limited to these doses.
  • the weight of the symptom, the weight of the patient, the health condition, and the like may be appropriately changed.
  • the present invention provides the following inventions in a further aspect.
  • V Use of chitosan nanofibers for producing a medicament that suppresses the activity of NF-kB.
  • agents and chitin nanofibers preferably used for use are prepared by the following method: A material produced by a method characterized by subjecting a chitin-containing organism-derived material to at least one deproteinization step and at least one deashing step, and then to a defibration step is preferable.
  • agents and chitosan nanofibers preferably used for use are the following methods: By subjecting the chitin-containing organism-derived material to at least one deproteinization step, at least one decalcification step and at least one deacetylation step, and then to a defibration step It is manufactured.
  • the dose of chitin nanofibers or chitosan nanofibers administered to the subject in order to suppress the activity of NF-kB can usually be determined appropriately by a doctor while observing the effect.
  • the daily dose of chitin nanofibers or chitosan nanofibers per adult is usually about 1 g to about 50 g, preferably about 1 g to about 5 g, but is limited to these doses.
  • the weight of the symptom, the weight of the patient, the health condition, and the like may be appropriately changed.
  • mice Female, 6 weeks old were purchased from CLEA Japan (Osaka, Japan).
  • the chitin nanofiber (+) group and the chitin powder (+) group DSS was administered from the test start date (day 0) to the sixth day after the test to induce colitis.
  • the chitin nanofiber was administered for 7 days before the start of the test (the chitin nanofiber gel dissolved in drinking water to 0.1%) ).
  • the chitin powder (+) group and the chitin powder (-) group the chitin powder was administered for 7 days before the start of the test (the chitin powder suspension dissolved in drinking water to 0.1% was free) Ingested). Common feed was given to each group.
  • DAI disease activity index
  • the length and weight of the large intestine were also measured.
  • the colon tissue was processed for use in the histological evaluation described below.
  • Histological evaluation of colitis Colon tissue was fixed in 10% buffered formalin. A section (thickness 3 microns) was prepared from each sample, and histological observation was performed after hematoxylin-eosin staining. Each obtained section was observed under a microscope and histologically scored. Histological scores were performed as described in Ohkawara et al. Scandinavian Journal of Gastroenterology, 40 (9), 1049-1057 (2005).
  • Score 0 Normal mucosa
  • Score 1 Infiltration of inflammatory cells
  • Score 2 Shortening of the crypt by less than half of the height
  • Score 3 Intestine Villus length shortened by more than half of normal (shortening of the crypt by more than half of the height)
  • score 4 intestinal villi lost (crypt loss)
  • score 5 epithelial cell destruction. Histological scores were performed on 10 fields with a magnification of 100 using 3 mice in each group. The average of a total of 30 fields of view was scored for each group.
  • MPO staining is a marker for leukocyte invasion into tissues. MPO staining was performed according to the method described in Schneidhelm et al. Clinical Chemistry, 55 (8), 1462-1470 (2009). MPO positive cells in the submucosa layer were counted in 20 fields of view at 400 times magnification using 3 mice in each group. A total of 60 fields were taken as the number of MPO positive cells in each group.
  • Serum IL-6 concentration was measured using Mouse IL-6 ELISA kit (Thermo SCIENTIFIC, Rockford, IL, USA).
  • the colon was significantly longer in the chitin nanofiber (+) group than in the chitin powder (+) group (p ⁇ 0 on the third and fifth days). .05, p ⁇ 0.01 on day 6 (Table 3 (a)).
  • the colon wall was thinner in the chitin nanofiber (+) group than in the control (+) group.
  • FIG. 3 shows the results of MPO staining on the 6th day from the start of the test in each group
  • FIG. 4 shows the number of MPO-positive cells. Shown in In the control ( ⁇ ) group, chitin nanofiber ( ⁇ ) group and chitin powder ( ⁇ ) group, 0 to 1 MPO positive cells were observed (observed at a magnification of 400 times, data not shown). From the 3rd day to the 6th day from the start of the test, the number of MPO positive cells gradually increased in the control (+) group and the chitin nanofiber (+) group.
  • the chitin nanofiber (+) group had significantly fewer MPO positive cells than the control (+) group (p ⁇ 0.01). Furthermore, on the 3rd, 5th and 6th days from the start of the test, the chitin nanofiber (+) group had significantly fewer MPO positive cells than the chitin powder (+) group (p3 on the 3rd and 5th days). ⁇ 0.01, p ⁇ 0.05 on the sixth day).
  • chitin nanofibers significantly improved IBD symptoms and colon tissue damage, but chitin powder did not show such effects. Furthermore, in the above experiments, chitin nanofibers did not cause animal weight loss and no side effects were observed. Therefore, it was found that the agent of the present invention containing chitin nanofibers or chitosan nanofibers is effective for the treatment and / or prevention of therapeutic agents for IBD.
  • NF-kB Nuclear factor kB
  • NF-kB activity increases in the large intestine when presenting with symptoms of active inflammatory bowel disease (Zarubin and Han. (2005) Cell Research, 15 (1), 11-18) . Therefore, the influence of chitin nanofibers on the activation of NF-kB was examined.
  • Colon tissue sections were obtained from mice in the chitin nanofiber (+) group, the chitin powder (+) group, the control (+) group, and the control ( ⁇ ) group.
  • Large intestine tissue sections (3 microns) on a slide glass were deparaffinized, washed with ethanol and water, and immersed in PBS. Sections were microwaved in 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) for 5 minutes. Thereafter, the sections were washed with PBS and incubated in 1% hydrogen peroxide / methanol at room temperature for 30 minutes.
  • FIG. 5A shows the result of calculating the ratio of the NF-kB positive stained area by performing digital image analysis on 30 fields of view at a magnification of 100 times.
  • chitin nanofibers have an NF-kB activation inhibitory action, thereby suppressing inflammatory colitis.
  • the present invention provides a therapeutic and / or prophylactic agent for inflammatory bowel disease having a natural product as an active ingredient, high safety, and excellent effects, it can be used in the fields of pharmaceuticals, foods and the like.

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Abstract

　本発明は、キチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーを含む、炎症性腸疾患の治療および／または予防剤、ならびにＮＦ－ｋＢ活性化阻害剤を提供する。

Description

炎症性腸疾患治療剤
　本発明は、キチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーを含有する炎症性腸疾患の治療および／または予防剤、ならびにＮＦ－ｋＢ活性化阻害剤に関する。
　炎症性腸疾患（ＩＢＤ, Inflammatory Bowel Disease）は、消化管に慢性の炎症を起こす疾患の総称で、潰瘍性大腸炎およびクローン病を包含する。近年、我が国では食事の欧米化に伴って罹患数が急激に増加している。その病因は不明であり、いくつかの因子が複合的に作用して免疫機能に影響し、サイトカイン異常を生じさせて、ついには粘膜免疫に異常をきたすことにより発病すると考えられている。
　また、ＩＢＤは慢性化しやすく、再燃しやすい厄介な病気である。ＩＢＤの治療には副腎皮質ホルモンなどの免疫抑制剤がもっぱら使用されているが、副作用が重大であり、長期投与も困難ある点で問題となっている。
　これまでに、免疫抑制剤を用いずにＩＢＤを治療する試みがなされてきた。例えば、糖類を用いてＩＢＤの治療剤を治療する例として、Ｎ－アセチルグルコサミン（特許文献１）やグルコサミン塩（特許文献２）を含有するＩＢＤの治療剤が公表されているが、さらに効果のある、しかも副作用の心配のない、長期投与可能な治療剤の開発が望まれている。
特公平６－７８２３５号公報 特開２００７－２９１０１１号公報
　副作用の心配がなく、長期投与が可能で、しかも効果が優れたＩＢＤの治療および／または予防剤を提供することが本発明の課題であった。
　本発明者らは上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、をＩＢＤにかかっている動物にキチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバー投与すると、ＩＢＤの症状が顕著に改善されることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は下記のものを提供する：
　（１）キチンナノファイバーを含む炎症性腸疾患の治療および／または予防剤。
　（２）キチンナノファイバーが下記方法：
　　キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、（１）に記載の剤。
　（３）ファイバーの幅が２ｎｍ～２０ｎｍである、（１）または（２）に記載の剤。
　（４）経口投与剤である、（１）～（３）のいずれかに記載の剤。
　（５）キトサンナノファイバーを含む炎症性腸疾患の治療および／または予防剤。
　（６）キトサンナノファイバーが下記方法：
　　キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程および少なくとも１回の脱アセチル化工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである、（５）に記載の剤。
　（７）ファイバーの幅が２ｎｍ～４０ｎｍである、（５）または（６）に記載の剤。
　（８）経口投与剤である、（５）～（７）のいずれかに記載の剤。
　（９）キチンナノファイバーを含むＮＦ－ｋＢ活性化抑制剤。
　（１０）キトサンナノファイバーを含むＮＦ－ｋＢ活性化抑制剤。
　本発明によれば、副作用の心配がなく、長期投与が可能で、しかも効果が優れたＩＢＤの治療および／または予防剤、ならびにＮＦ－ｋＢ活性化阻害剤が提供される。
図１は、ＤＳＳにより誘発された潰瘍性大腸炎マウスの大腸における組織学的変化に対するキチンナノファイバーの効果を示す組織切片写真である。試験開始６日目にキチン粉末（＋）群（上パネル）、キチンナノファイバー（＋）群（中パネル）および対照（＋）群（下パネル）の各群から各１匹のマウスから組織切片を得た。大腸を固定し、組織切片をヘマトキシリン－エオシンにて染色した。びらんを矢印で示す。スケールバーは１００μｍである。 図２は、ＤＳＳにより誘発された潰瘍性大腸炎マウスの大腸における組織学的評点に対するキチンナノファイバーの効果を示す棒グラフである。白棒は対照（＋）群、黒棒はキチンナノファイバー（＋）群、灰色棒はキチン粉末（＋）群である。（－）はデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を投与しなかった群である。＊＊はｐ＜０．０１であることを示す。 図３は、ＤＳＳにより誘発された潰瘍性大腸炎マウスのＭＰＯ陽性大腸細胞数に対するキチンナノファイバーの効果を示す組織切片写真である。試験開始６日目にキチン粉末（＋）群（上パネル）、キチンナノファイバー（＋）群（中パネル）および対照（＋）群（下パネル）の各群につき、３匹のマウスから１匹を選び組織切片を得た。ＭＰＯ陽性細胞を矢印で示す。スケールバーは１００μｍである。 図４は、ＤＳＳにより誘発された潰瘍性大腸炎マウスのＭＰＯ陽性大腸細胞数に対するキチンナノファイバーの効果を示す棒グラフである。（－）はデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を投与しなかった群である。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１であることを示す。 図５は、ＤＳＳにより誘発された潰瘍性大腸炎マウスの大腸上皮におけるＮＦ－ｋＢ活性化に対するキチンナノファイバーの影響を調べた結果を示す。図５Ａ（ａ）は、対照（＋）群のＮＦ－ｋＢ陽性領域（矢印）、図５Ａ（ｂ）はキチンナノファイバー（＋）群のＮＦ－ｋＢ陽性領域（矢印）、図５Ａ（ｃ）はキチン粉末（＋）群のＮＦ－ｋＢ陽性領域（矢印）を示す顕微鏡像である。バーは１００ミクロンである。図５Ｂは、対照（－）群、対照（＋）、キチンナノファイバー（＋）群、キチン粉末（＋）群のＮＦ－ｋＢ陽性面積の割合を示すグラフである。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１。
本発明は、キチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーを含む、炎症性腸疾患（「ＩＢＤ」と称することがある）の治療および／または予防剤を提供するものである。本発明の治療および／または予防剤（「本発明の剤」と称することがある）が対象とする疾患はＩＢＤであり、これには２つの主要疾患、潰瘍性大腸炎およびクローン病が包含される。本発明の剤はこれらの疾患の治療および／または予防に用いることができる。本発明の剤は、好ましくは潰瘍性大腸炎の治療および／または予防に用いることができる。なお、本明細書において、ＩＢＤの再発防止も治療および／または予防に包含されるものとする。本明細書において「治療」、「予防」および「再発防止」は医学分野にて通常認識されている意味を有するものとする。
　本発明の剤に用いられるキチンナノファイバーは、ファイバーの長さが１μｍ以上であり、平均脱アセチル化度が５％以下、幅（または径）が比較的揃っており、通常は、幅（または径）が約２ｎｍ～約２００ｎｍ、好ましくは約２ｎｍ～約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎｍ～約５０ｎｍ、例えば、約５ｎｍ～約２０ｎｍである。好ましくは、その繊維は伸びきり鎖微結晶である。本明細書において、例えば、「キチンナノファイバーの幅（または径）は約２ｎｍ～約２０ｎｍ」とは、電子顕微鏡観察にて観察した場合に、幅（または径）が約２ｎｍ～約２０ｎｍ以下であるファイバーが全体の約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上を占める状態をいう。さらに、後述するキトサンナノファイバーの幅（または径）についていう場合も同様である。
　本発明の化粧料、入浴剤および医薬組成物に使用されるキトサンナノファイバーは、ナノファイバーの長さが１μｍ以上であり、ナノファイバー全体の平均脱アセチル化度は５％以上であり、幅（または径）が比較的揃っており、通常は、幅（または径）が約２ｎｍ～約２００ｎｍであり、好ましくは約２ｎｍ～約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎｍ～約５０ｎｍ、例えば約５ｎｍ～約２０ｎｍである。好ましくは、その繊維は伸びきり鎖微結晶である。このようなキトサンナノファイバーは、上記のキチンナノファイバーのＮ－アセチル基の表面のみを選択的に脱アセチル化しても良い。
　本発明の剤に使用されるキチンナノファイバーはいずれの方法・手段にて製造されたものであってもよいが、キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法によって製造されたものが好ましい。上記の好ましいキチンナノファイバーの製造方法および該製造方法により得られるキチンナノファイバーについて以下に説明する（国際公開ＷＯ２０１０／０７３７５８の明細書も参照のこと、参照により本明細書にその内容を一体化させる）。
　本発明のキチンナノファイバーは天然界から、例えばキチン含有生物由来の材料から得ることができる。キチン含有生物としては、エビ、カニなどの甲殻類、昆虫類またはオキアミなどが例示されるが、これらに限定されない。好ましくは、キチン含量の多い生物、例えばエビ、カニなどの甲殻類の殻および外皮から本発明のキチンナノファイバーを得てもよい。ただし、生体中のキチンナノファイバーは、その周囲および間隙に存在する蛋白および炭酸カルシウムを含むマトリクスを有しているので、脱マトリクス処理を行わなければ得ることができない。上で説明した工程によりナノファイバー化されるキチンは、カニ殻やエビ殻由来のキチンなどのα型の結晶構造を有するキチンであってもよく、イカの甲由来のキチンなどのβ型の結晶構造を有するキチンであってもよい。
　脱蛋白により、キチンナノファイバーを囲んでマトリックスを形成している蛋白が除去される。脱蛋白処理には、アルカリ処理法、プロテアーゼなどのタンパク質分解酵素法などがあるが、アルカリ処理法が好適である。アルカリ処理による脱蛋白において、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウムなどのアルカリの水溶液が好ましく用いられ、その濃度は、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は約２～約１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約３～約７％（ｗ／ｖ）、例えば約５％（ｗ／ｖ）である。アルカリ処理による脱蛋白の温度は、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は約８０℃以上、好ましくは約９０℃以上、さらに好ましくはアルカリ水溶液を還流しながら行う。処理時間も、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は数時間～約３日間、好ましくは数時間～約２日間行ってもよい。
　脱灰により、キチンナノファイバーを囲んでいる灰分、主に炭酸カルシウムが除去される。脱灰処理には、酸処理法、エチレンジアミン４酢酸処理法などがあるが、酸処理法が好適である。酸処理による脱灰において、塩酸の酸の水溶液が好ましく用いられ、その濃度は、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は約４～約１２％（ｗ／ｖ）、好ましくは約５～約１０％（ｗ／ｖ）である。酸処理による脱蛋白の温度は、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は約１０～約５０℃、好ましくは約２０～約３０℃、例えば室温であってもよい。酸処理による脱灰時間も、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は数時間～数日間、好ましくは約１～約３日、例えば２日間行ってもよい。
　次いで、上記工程で得られた外皮（ほとんどがキチンナノファイバーとなっている）を解繊処理し、目的のキチンナノファイバーを得る。キチンナノファイバーは乾燥すると水素結合して強固に凝集するため、本発明のキチンナノファイバーの製造方法の各工程を、材料を常に乾燥させずに行うことが好ましい。酸の添加により解繊処理には、石臼式摩砕器、高圧ホモジナイザー、凍結粉砕装置などの装置を用いることができ、好ましくは石臼式磨砕機などによりグラインダー処理を行う。石臼式磨砕機などのような、より強い負荷をかけることができる装置を用いれば、カニやエビなどの殻由来のアルファキチンでも速やかに解繊することができる。
　上記のキチンナノファイバーの製造方法において、必要ならば、あるいは所望により、脱色工程を行ってもよい。脱色工程は、上記方法のいずれの段階において行ってもよいが、好ましくは、脱蛋白および脱灰処理が終わった後に行う。脱色はいずれの方法で行ってもよいが、アルコール等の有機溶剤による抽出、塩素系漂白剤や酸素系漂白剤、還元系漂白剤の使用が好ましく、例えば、酢酸緩衝液などの緩衝液中約１～約２％の次亜塩素酸ナトリウムを用いて、約７０～約９０℃で数時間行ってもよい。
　さらに、脱蛋白工程、脱灰処理工程、脱色工程、解繊工程および以下に説明する酸性試薬での処理を効率よく行うために、粉砕工程を行ってもよい。粉砕工程は、上記方法のいずれの段階において行ってもよいが、好ましくは、解繊工程の直前に行う。粉砕工程はいずれの方法で行ってもよいが、ホモジナイザー処理やミキサー処理などの方法が好ましく、例えば、家庭用フードプロセッサーにより行ってもよい。
　上記の脱蛋白工程、脱灰処理工程、脱色工程、粉砕工程などの工程は、繰り返し、複数回、あるいは交互に行ってもよい。また、それぞれの行程は順序を問わない。
　さらに、必要ならば、あるいは所望により、脱灰処理されたキチン含有材料を酸性試薬にて処理することにより、キチンナノファイバーの水分散性を向上させてもよい。酸性試薬にて処理を行うことによって、解繊工程で得られるキチンナノファイバー繊維が細く均一なものとなるので、キチンナノファイバーの水分散性が向上する。繊維が細くなり、水分散性が向上すると、皮膚に塗布した場合に形成される膜が均一なものとなり、保湿効果などの有利な効果が発揮される。酸性試薬はキチン繊維表面に正の電荷を生じさせるため、強固に凝集したキチン繊維を効率的にほぐすために都合がよい。よって、酸性試薬を用いることにより、上記の脱蛋白工程、脱灰処理工程、脱色工程を行った後、乾燥して得られるキチン凝集体も容易に解すことが可能である。酸性試薬での処理方法は特に限定されず、材料に酸性試薬を浸透させる方法であればよい。酸性試薬での処理は、典型的には酸の水溶液に脱灰処理されたキチン含有材料を浸漬することにより行うことができる。この工程では、水分散性の向上のみならず、キチンナノファイバーの繊維の幅（または径）のばらつきを抑えることもできる。この工程に使用できる酸はいずれの酸であってもよく特に限定されないが、弱酸が好ましい。弱酸としては、酢酸、蟻酸、クロロ酢酸、フルオロ酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸、クエン酸、マロン酸、アスコルビン酸などが挙げられるがこれらに限らない。この工程に使用される好ましい弱酸は酢酸である。この工程において弱酸の水溶液のｐＨを通常は約２～約５、好ましくは約２．５～約４．５、例えば、約３～約４に調節する。この工程の温度は、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は約１０～約５０℃、好ましくは約２０～約３０℃、例えば、室温であってもよい。この工程の処理時間も、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は１時間～約１日、好ましくは約３～約１２時間、例えば、一晩であってもよい。この酸による処理工程は、解繊工程の前であればいずれの段階で行ってもよいが、脱蛋白および脱灰の後、キチンナノファイバーの精製がある程度進んだ段階で行うことが好ましく、例えば、解繊工程の直前に行ってもよい。
　上記製造方法により得ることのできるキチンナノファイバーは、細くて均質であり、しかも極めて長く、繊維が伸びきり鎖結晶である。上記製造方法により得られるキチンナノファイバーの幅（または径）は比較的揃っており、通常は、幅（または径）が約２ｎｍ～約２００ｎｍ、好ましくは約２ｎｍ～約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎｍ～約５０ｎｍ、例えば、約５ｎｍ～約２０ｎｍである。
　さらに本発明の剤において、上記キチンナノファイバーに代えて、あるいは上記キチンナノファイバーと混合して、キトサンナノファイバーを用いることもできる。キトサンナノファイバーはキチンナノファイバーの脱アセチル化物であり、部分的に脱アセチル化されていてもよく、完全に脱アセチル化されていてもよい。
　本発明の剤に使用されるキトサンナノファイバーはいずれの方法・手段にて製造されたものであってもよいが、キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程および少なくとも１回の脱アセチル化工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法によって製造されたものが好ましい。上記の好ましいキトサンナノファイバーの製造方法および該製造方法により得られるキトサンナノファイバーについて以下に説明する（国際公開ＷＯ２０１０／０７３７５８の明細書も参照のこと）。
　キチン含有材料、脱蛋白工程、脱灰工程、解繊工程については、キチンナノファイバーの製造に関して上で説明したのと同様である。なお、本発明において、脱蛋白工程と脱アセチル化工程を同時に行うことも可能である。さらに、既に脱蛋白工程および脱灰工程を行った市販のキチン粉末を脱アセチル化工程に付すことによって、キトサンナノファイバーを製造することも可能である。
　脱アセチル化方法はいくつかの方法が公知であるが、アルカリ処理法が好適である。アルカリ処理による脱アセチル化において、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウムなどのアルカリの水溶液が好ましく用いられ、その濃度は、通常は約２０～約５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約３０～約４０％（ｗ／ｖ）、例えば約４０％（ｗ／ｖ）である。アルカリ処理による脱アセチル化の温度は、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は約８０℃以上、好ましくは約９０℃以上、さらに好ましくはアルカリ水溶液を還流しながら行う。処理時間も、キチン含有生物由来の材料の量、キチン含有生物の種類、部位などに応じて適宜選択されうるが、通常は３０分～約３日間、好ましくは３０分～一晩行ってもよい。なお、キトサンナノファイバーの凝集を避けるために、本発明のキトサンナノファイバーの製造方法の各工程を、材料を常に乾燥させずに行うことが非常に好ましい。
　上記製造方法により製造されるキトサンナノファイバーの幅（または径）は比較的揃っており、通常は、幅（または径）が約２ｎｍ～約２００ｎｍであり、好ましくは約２ｎｍ～約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎｍ～約５０ｎｍ、例えば約５ｎｍ～約２０ｎｍであり、線維状態が伸びきり鎖結晶である。
　本発明の剤に用いるキチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーは修飾または誘導体化されていてもよく、塩（例えば塩酸塩など）の形態であってもよい。例えば、糖の３位の水酸基、６位の水酸基、または糖鎖の末端の水酸基の水素が、アルキル基などの他の基に置換されていてもよい。あるいはキチンの糖の２位のアセチル基中のメチル基が、エチル基などの他の基に置換されていてもよい。あるいはキトサンの糖の２位のアミノ基の水素はアルキル基などの他の基で置換されていてもよく、ハロゲン化物イオンなどの陰イオンとの間で塩を形成してもよい。これらの修飾および誘導体あるいは塩はあくまでも例示であり、限定的なものではない。本明細書では、これらの修飾および誘導体あるいは塩もキチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーに包含されるものとする。このような誘導体および修飾体あるいは塩は当業者に知られており、それらの製造方法も公知である。
　キチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーはカニやエビなどに含まれる天然物であり、安全性が非常に高い。したがって、キチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーを含む本発明の剤は長期間にわたって投与することができ、副作用がないか、あったとしても極めて少ない。本発明の剤は長期投与に適するので、慢性化しやすく再燃しやすい炎症性腸疾患に対して極めて有効である。一方、副腎皮質ホルモンなどの免疫抑制剤がもっぱら炎症性腸疾患に使用されているが、これらの薬剤は副作用が重大であり、長期投与も困難ある。したがって、本発明の剤は、従来から炎症性腸疾患の治療用いられている免疫抑制剤の問題を解決するものである。しかも、実施例に示すように、本発明の剤は炎症性腸疾患の治療および／または予防効果の点でも優れている。
　本発明の剤は公知の様々な剤形とすることができる。本発明の剤の剤形としては、経口剤が特に好ましい。経口剤としては錠剤、顆粒、粉末、カプセル剤、ドリンク剤などがあるが、これらに限定されない。これらの剤形は、公知の方法に従って製造することができる。本発明の剤は、医薬組成物の形態のほか、食品やサプリメントの形態であってもよい。
　本発明は、さらなる態様において、炎症性大腸炎の治療および／または予防方法であって、炎症性大腸炎を治療および／または予防することを必要とする対象に、有効量のキチンナノファイバーを投与することを特徴とする方法を提供する。
　本発明は、さらなる態様において、炎症性大腸炎を治療および／または予防するための医薬の製造のためのキチンナノファイバーの使用を提供する。本発明は、さらなる態様において、炎症性大腸炎を治療および／または予防するためのキチンナノファイバーの使用に関する。
　上記方法または使用において好ましく用いられるキチンナノファイバーは、
　下記方法：
　　キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである。
　本発明は、さらなる態様において、炎症性大腸炎の治療および／または予防方法であって、炎症性大腸炎を治療および／または予防することを必要とする対象に、有効量のキトサンナノファイバーを投与することを特徴とする方法を提供する。
　本発明は、さらなる態様において、炎症性大腸炎を治療および／または予防するための医薬の製造のためのキトサンナノファイバーの使用を提供する。本発明は、さらなる態様において、炎症性大腸炎を治療および／または予防するためのキチンナノファイバーの使用に関する。
　上記方法または使用において好ましく用いられるキトサンナノファイバーは、
下記方法：
　　キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程および少なくとも１回の脱アセチル化工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである。
　炎症性腸疾患の治療および／または予防のために投与されるキチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーの投与量は、通常は医師が効果を観察しながら適宜決定することができる。一般的には、成人１人あたりの１日のキチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーの投与量は、通常は約１ｇ～約５０ｇ、好ましくは約１ｇ～約５ｇであるが、これらの投与量に限定されることはなく、症状の重さ、患者の体重、健康状態などにより適宜変更されうる。
　本発明者らの研究によって、キチンナノファイバーの炎症性大腸炎抑制効果は、ＮＦ－ｋＢの活性化を抑制することにより得られるものであることがわかった。キトサンナノファイバーについても同様の効果があると考えられる。したがって、本発明は、さらなる態様において、下記の発明を提供する。
　（ｉ）キチンナノファイバーを含むＮＦ－ｋＢ活性化抑制剤。
　（ｉｉ）ＮＦ－ｋＢの活性を抑制する医薬を製造するためのキチンナノファイバーの使用。
　（ｉｉｉ）ＮＦ－ｋＢの活性を抑制するためのキチンナノファイバーの使用。
　（ｉｖ）キトサンナノファイバーを含むＮＦ－ｋＢ活性化抑制剤。
　（ｖ）ＮＦ－ｋＢの活性を抑制する医薬を製造するためのキトサンナノファイバーの使用。
　（ｖｉ）ＮＦ－ｋＢの活性を抑制するためのキトサンナノファイバーの使用。
　これらの剤および使用に好ましく用いられるキチンナノファイバーは、下記方法：
　　キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものが好ましい。
　これらの剤および使用に好ましく用いられるキトサンナノファイバーは、下記方法：
　　キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程および少なくとも１回の脱アセチル化工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法
によって製造されたものである。
　ＮＦ－ｋＢの活性を抑制するために対象に投与されるキチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーの投与量は、通常は医師が効果を観察しながら適宜決定することができる。一般的には、成人１人あたりの１日のキチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーの投与量は、通常は約１ｇ～約５０ｇ、好ましくは約１ｇ～約５ｇであるが、これらの投与量に限定されることはなく、症状の重さ、患者の体重、健康状態などにより適宜変更されうる。
　以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は例示説明であり、本発明を限定するものではない。
　　Ｉ．実験方法および材料
　（１）試薬類
　キチンナノファイバーは国際公開ＷＯ２０１０／０７３７５８の明細書に記載の方法により、ベニズワイガニのカニ殻から調製した。キチン粉末はNacalai Tesque (Lot No.: M0A3811; Kyoto, Japan)から購入した。キチン粉末の平均粒子径は約２００ミクロンであった。デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）（分子量３６～５０ｋＤａ；試薬グレード）はMP Biochemicals LLC (Solon, OH, USA)から購入した。
　（２）動物
　Ｃ５７ＢＬ／６マウス（メス、６週齢）をCLEA Japan (Osaka, Japan)から購入した。
　（３）実験動物群および投与方法
　マウス（ｎ＝６８）を下記の６群にランダムに振り分けた：
　　対照（＋）群（ｎ＝１７）：この群にはＤＳＳ＊のみを投与した。
　　対照（－）群（ｎ＝５）：この群には水道水を投与した。
　　キチンナノファイバー（＋）群（ｎ＝１７）：この群にはキチンナノファイバー＊＊およびＤＳＳ＊を投与した。
　　キチンナノファイバー（－）群（ｎ＝７）：この群にはキチンナノファイバー＊＊のみを投与した。
　　キチン粉末（＋）群（ｎ＝１６）：この群にはキチン粉末＊＊＊およびＤＳＳ＊を投与した。
　　キチン粉末（－）群（ｎ＝１６）：この群にはキチン粉末＊＊＊のみを投与した。
　　　＊ＤＳＳを飲料水に３％となるよう溶解したもの。自由に摂取させた。
　　　＊＊酢酸にてｐＨ３に調節した水にキチンナノファイバーを１％となるよう懸濁してゲル状とし、得られたゲル状物質を飲料水に０．１％となるよう溶解したものを自由に摂取させた。
　　　＊＊＊酢酸にてｐＨ３に調節した水にキチン粉末を１％となるよう懸濁し、得られた懸濁物を飲料水に０．１％となるよう溶解したものを自由に摂取させた。
　対照（＋）群、キチンナノファイバー（＋）群およびキチン粉末（＋）群において、試験開始日（０日目）から試験開始後６日目までＤＳＳを投与して大腸炎を誘発した。キチンナノファイバー（＋）群およびキチンナノファイバー（－）群において、試験開始前の７日間にわたりキチンナノファイバーを投与した（上記キチンナノファイバーゲルを飲料水に０．１％となるよう溶解したものを自由に摂取させた）。キチン粉末（＋）群およびキチン粉末（－）群において、試験開始前の７日間にわたりキチン粉末を投与した（上記キチン粉末懸濁液を飲料水に０．１％となるよう溶解したものを自由に摂取させた）。各群に共通の飼料を与えた。
　試験開始３日目および５日目に対照（＋）群、キチンナノファイバー（＋）群およびキチン粉末（＋）群の動物から採血し、大腸試料を採取した（各群ｎ＝５）。試験開始６日目に全ての群の動物から採血し、大腸試料を採取した（各群ｎ＝５～７）。
　（４）臨床分析
　疾病活性指数（DAI, disease activity index）を用いて動物の潰瘍性大腸炎を評価した。ＤＡＩはMelger et al., American Jopurnal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology, 288(6), G1328-1338に記載された方法に準じて評価した。ＤＡＩの例を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　大腸の長さおよび重量も測定した。大腸組織を以下に述べる組織学的評価に使用するために処理加工した。
　（５）大腸炎の組織学的評価
　大腸組織を１０％緩衝化ホルマリン中に固定した。各試料から切片（厚さ３ミクロン）を作成して、ヘマトキシリン－エオシン染色後に組織学的観察を行った。各得切片を顕微鏡観察し、組織学的評点を行った。組織学的評点は、Ohkawara et al. Scandinavian Journal of Gastroenterology, 40(9), 1049-1057 (2005)に記載されたようにして行った。
　評点０：正常粘膜；評点１：炎症細胞の浸潤；評点２：腸絨毛の長さが正常の半分までは短縮していない（shortening of the crypt by less than half of the height）；評点３：腸絨毛の長さが正常の半分以上短縮している（shortening of the crypt by more than half of the height）；評点４：腸絨毛は消失している（crypt loss）；評点５：上皮細胞の破壊。組織学的評点は、各群３匹のマウスを用いて倍率１００倍にて１０個の視野において行った。合計３０個の視野の平均を各群の評点とした。
　（６）ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）染色
　ＭＰＯ染色は組織中への白血球侵入のマーカーである。Schneidhelm et al. Clinical Chemistry, 55(8), 1462-1470 (2009)に記載された方法に従ってＭＰＯ染色を行った。各群３匹のマウスを用いて倍率４００倍にて２０個の視野において粘膜下組織層中のＭＰＯ陽性細胞をカウントした。合計６０個の視野を各群のＭＰＯ陽性細胞数とした。
　（７）血清ＩＬ－６濃度の測定
　Mouse IL-6 ELISA kit (Thermo SCIENTIFIC, Rockford, IL, USA)を用いて血清ＩＬ－６濃度を測定した。
　（８）統計学的分析
　データを平均値±標準偏差として表した。1-way ANOVAおよびTukey-Kramer's testを用いて統計学的分析を行った。０．０５よりも小さいｐ値の場合に統計学的に有意であると見なした。
　ＩＩ．結果
　（１）ＤＳＳにより誘発された潰瘍性大腸炎マウスのＤＡＩに対するキチンナノファイバーの効果
　試験開始３日目に対照（＋）群およびキチン粉末（＋）群において、試験開始４日目にキチンナノファイバー（＋）群において、体重減少、軟便および肛門からの出血を観察した（表２）。試験開始４～６日目においてキチンナノファイバー（＋）群は対照（＋）群よりも有意にＤＡＩが低く（ｐ＜０．０５）、試験開始５日目および６日目においてキチン粉末（＋）群よりも有意にＤＡＩが低かった（それぞれｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５）（表２）。対照（－）群、キチンナノファイバー（－）群およびキチン粉末（－）群においてはＤＡＩの変化は観察されなかった（データ示さず）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（２）ＤＳＳにより誘発された潰瘍性大腸炎マウスの大腸長さおよび大腸重量／長さ比（大腸壁の厚肥）に対するキチンナノファイバーの効果
　ＤＳＳの投与によりマウスの大腸が短くなり、大腸壁が厚くなることが知られている（Melger et al. American Journal of Physiology Gastrointesinal and Liver Physiology, 288'6), G1328-1338 (2005））。試験開始３、５および６日目において、対照（＋）群と比較してキチンナノファイバー（＋）群では大腸が有意に長くなった（３日目および５日目でｐ＜０．０５、６日目でｐ＜０．０１）（表３（ａ））。さらに、試験開始３、５および６日目において、キチン粉末（＋）群と比較してキチンナノファイバー（＋）群では大腸が有意に長くなった（３日目および５日目でｐ＜０．０５、６日目でｐ＜０．０１）（表３（ａ））。対照（－）群、キチンナノファイバー（－）群およびキチン粉末（－）群では大腸長さに変化はなかった（データ示さず）。試験開始５日目および６日目において、キチンナノファイバー（＋）群では対照（＋）群と比較して大腸壁が薄くなった。試験開始５日目において、キチンナノファイバー（＋）群およびキチン粉末（＋）群では対照（＋）群と比較して大腸壁が有意に薄くなった（ｐ＜０．０５）（表３（ｂ））。試験６日目において、キチンナノファイバー（＋）群では対照（＋）群およびキチン粉末（＋）群と比較して大腸壁が有意に薄くなった（ｐ＜０．０１）（表３（ｂ））。対照（－）群、キチンナノファイバー（－）群およびキチン粉末（－）群では大腸壁厚さに変化はなかった（データ示さず）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（３）ＤＳＳにより誘発された潰瘍性大腸炎マウスの大腸における組織学的変化に対するキチンナノファイバーの効果
　顕微鏡観察により組織学的評点付けを行って腸粘膜のダメージを評価した。対照（－）群、キチンナノファイバー（－）群およびキチン粉末（－）群では組織学的変化は見られなかった。試験開始３日目において、対照（＋）群、キチンナノファイバー（＋）群およびキチン粉末（＋）群では炎症細胞の浸潤が観察された。試験開始５日目において、対照（＋）群およびキチン粉末（＋）群ではびらんおよび陰窩の短縮または破壊、ならびに浮腫が見られた。試験開始５日目にキチンナノファイバー（＋）群でいくつかのびらんが見られたが、陰窩の短縮または破壊は著しく抑制され、浮腫もわずかに抑制された。試験開始６日目には、対照（＋）群およびキチン粉末（＋）群では重篤なびらん、陰窩の破壊および浮腫が観察され、さらにいくつかの潰瘍も観察された。対照（＋）群およびキチン粉末（＋）群と比較してキチンナノファイバー（＋）群ではびらん、陰窩の破壊および浮腫が著しく抑制された（図１）。
　さらに、ヘマトキシリン－エオシン染色切片を用いて組織学的評点により組織ダメージの重篤度を調べた。試験開始５日目において、キチンナノファイバー（＋）群では対照（＋）群と比較して組織学的評点が有意に減少し（ｐ＜０．０１）、６日目において対照（＋）群およびキチン粉末（＋）群と比較して組織学的評点が有意に減少した（ｐ＜０．０１）（図２）。
　（４）ＤＳＳにより誘発された潰瘍性大腸炎マウスのＭＰＯ陽性大腸細胞数に対するキチンナノファイバーの効果
　各群の試験開始６日目のＭＰＯ染色の結果を図３に、ＭＰＯ陽性細胞数を図４に示す。対照（－）群、キチンナノファイバー（－）群およびキチン粉末（－）群では０～１個のＭＰＯ陽性細胞が観察された（倍率を４００倍として観察、データ示さず）。試験開始３日目から６日目にかけて、対照（＋）群およびキチンナノファイバー（＋）群ではＭＰＯ陽性細胞数が徐々に増加した。しかしながら、試験開始３、５および６日目において、キチンナノファイバー（＋）群では対照（＋）群と比較してＭＰＯ陽性細胞数が有意に少なかった（ｐ＜０．０１）。さらに、試験開始３、５および６日目において、キチンナノファイバー（＋）群ではキチン粉末（＋）群と比較してＭＰＯ陽性細胞数が有意に少なかった（３日目および５日目ではｐ＜０．０１、６日目でｐ＜０．０５）。
　（５）ＤＳＳにより誘発された潰瘍性大腸炎マウスの血清ＩＬ－６濃度に対するキチンナノファイバーの効果
　ＩＬ－６はＩＢＤにおける中心的なサイトカインであり、炎症部位におけるＴ細胞生存率およびアポトーシス抵抗性の向上に貢献していることが知られている（Mudeter et al. Inflammatory Bowel Disease, 13(8), 1016-1023 (2007)）。試験開始５日目に、キチンナノファイバー（＋）群（８５．８±１．２ｐｇ／ｍｌ）では対照（＋）群（２３７．１±４１．９ｐｇ／ｍｌ）と比較して有意に血清ＩＬ－６濃度が低かった（ｐ＜０．０１）。
　以上の実験結果から、キチンナノファイバーはＩＢＤの症状や大腸組織の損傷を有意に改善するが、キチン粉末にはそのような効果が見られないことが確認された。さらに、以上の実験において、キチンナノファイバーは動物の体重減少を引き起こさず、副作用も見られなかった。したがって、キチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバーを含む本発明の剤は、ＩＢＤの治療剤の治療および／または予防に有効であることがわかった。
　核内因子ｋＢ（ＮＦ－ｋＢ）は、いくつかの内在性の免疫シグナリング経路において中心的な役割を果たしていることが報告されている。ＮＦ－ｋＢは、炎症誘発性応答に関連する遺伝子の発現に必要な転写因子であることも報告されている（Elson et al. (2005) Immunological Reviews. 206(1), 260-276）。さらに、ＮＦ－ｋＢは、炎症性大腸炎の大腸粘膜において活性化されることが報告されている（Reed et al. (2005) Digestive Disease and Science, 50(12), 2366-2378; Visekruna et al. (2006) Journal of Clinical Investigation, 116(12), 3195-3203）。活動性の炎症性大腸炎の症状を呈しているときにＮＦ－ｋＢ活性が大腸において上昇することも報告されている（Zarubin and Han. (2005) Cell Research, 15(1), 11-18）。そこで、キチンナノファイバーがＮＦ－ｋＢの活性化に及ぼす影響について調べた。
　キチンナノファイバー（＋）群、キチン粉末（＋）群、対照（＋）群および対照（－）群のマウスから大腸組織切片を得た。スライドグラス上の大腸組織切片（３ミクロン）を脱パラフィンし、エタノールおよび水で洗浄し、ＰＢＳに浸漬した。切片を０．０１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中で５分間マイクロウェーブ処理した。その後、切片をＰＢＳで洗浄し、１％ hydrogen peroxide methanol中、室温で３０分インキュベーションした。切片をＰＢＳで洗浄し、ウサギポリクローナル抗－ＮＦ－ｋＢ　ｐ６５抗体（１：５００，ｓｃ－３７２；Santa cruz biotechnology, inc., California, USA）とともに室温で６０分インキュベーションした。スライドをＰＢＳで洗浄し、diaminobenzidine tetrahydrochlorideにて発色させた。対比染色はhematoxylinにて行った。この免疫組織学的染色図を図５Ａに示す。倍率１００倍で３０個の視野についてデジタルイメージ分析を行ってＮＦ－ｋＢ陽性染色面積の割合を計算した結果を図５Ｂに示す。対照（＋）群およびキチン粉末（＋）群の上皮細胞中のＮＦ－ｋＢ陽性面積に比べて、キチンナノファイバー（＋）群のそれは著しく小さかった。なお、対照（－）、キチンナノファイバー（－）群およびキチン粉末（－）群についても実験を行ったが、ＮＦ－ｋＢ陽性染色面積の割合は１．８～３．０％であった。
　これらの結果から、キチンナノファイバーは、ＮＦ－ｋＢ活性化抑制作用を有しており、それにより炎症性大腸炎を抑制すると考えられた。
　本発明は、天然物を有効成分とし、安全性が高く、優れた効果を有する炎症性腸疾患の治療および／または予防剤を提供するので、医薬品、食品等の分野において利用可能である。

Claims (10)

  1. 　キチンナノファイバーを含む炎症性腸疾患の治療および／または予防剤。
  2. 　キチンナノファイバーが下記方法：
    　　キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法
    によって製造されたものである、請求項１に記載の剤。
  3. 　ファイバーの幅が２ｎｍ～２０ｎｍである、請求項１または２に記載の剤。
  4. 　経口投与剤である、請求項１～３のいずれか１項に記載の剤。
  5. 　キトサンナノファイバーを含む炎症性腸疾患の治療および／または予防剤。
  6. 　キトサンナノファイバーが下記方法：
    　　キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程および少なくとも１回の脱アセチル化工程に付し、次いで、解繊工程に付すことを特徴とする方法
    によって製造されたものである、請求項５に記載の剤。
  7. 　ファイバーの幅が２ｎｍ～４０ｎｍである、請求項５または６に記載の剤。
  8. 　経口投与剤である、請求項５～７のいずれか１項に記載の剤。
  9. 　キチンナノファイバーを含むＮＦ－ｋＢ活性化抑制剤。
  10. 　キトサンナノファイバーを含むＮＦ－ｋＢ活性化抑制剤。
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