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WO2013005269A1 - アルブミンを自己組織化膜上に固定する方法 - Google Patents

アルブミンを自己組織化膜上に固定する方法 Download PDF

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WO2013005269A1
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amino acid
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albumin
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由香利 畠岡
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パナソニック株式会社
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    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • G01N2610/00Assays involving self-assembled monolayers [SAMs]

Definitions

  • the present invention relates to a method for fixing albumin on a self-assembled film.
  • a biosensor is used to detect or quantify the target substance contained in the sample.
  • Some biosensors include an antigen to detect or quantify the antibody.
  • Patent Document 1 discloses a conventional biosensor having an antigen.
  • This Patent Document 1 corresponds to Japanese Patent Publication No. 2002-520618 (in Patent Document 1, page 24, line 23 to line 26, page 25, line 3 to line 20, page 25, page 27). Line to page 26, line 13, and page 26, line 14 to line 22, page 28, line 21 to line 23, or the corresponding paragraph numbers 0080, 0082, 0084, 0085, 0095, 0109, 0118, and 0119).
  • FIG. 2 shows the biosensor disclosed in FIG.
  • the biosensor is used for screening the activity of biomolecules.
  • the biosensor includes a monolayer 7, an affinity tag 8, an adapter molecule 9, and a protein 10.
  • the single layer 7 is composed of a self-assembled film represented by the chemical formula X—R—Y (in Patent Document 1, page 24, line 23 to line 26, page 25, line 3 to line 20).
  • X, R, and Y are HS-, alkane, and carboxyl group, respectively (see Patent Document 1, page 25, line 3 to line 20, page 25, page 27 to page 26, page 26).
  • the present inventor has found that the amount of albumin immobilized per unit area is remarkably increased by binding one molecule of amino acid to the self-assembled membrane and immobilizing albumin.
  • the present invention has been completed based on this finding.
  • An object of the present invention is to provide a method for increasing the amount of albumin immobilized on a self-assembled film, and a sensor having albumin immobilized according to the method.
  • a method for immobilizing albumin on a self-assembled film comprising the following steps (a) to (b) in this order: Providing a substrate comprising one molecule of amino acid and the self-assembled film (a), Here, the one molecule of amino acid is bound to the self-assembled membrane by a peptide bond represented by the following chemical formula (I):
  • the one molecule of amino acid is composed of cysteine, lysine, histidine, phenylalanine, tyrosine, glycine, asparagine, methionine, serine, tryptophan, leucine, glutamine, alanine, isoleucine, threonine, proline, glutamic acid, aspartic acid, arginine, and valine.
  • R represents the side chain of one molecule of amino acid
  • B supplying albumin onto the substrate and forming a peptide bond represented by the following chemical formula (II) as a result of the reaction between the carboxyl group of one molecule of amino acid and the amino group of the albumin (R represents the side chain of one molecule of amino acid).
  • step (a) comprises the following steps (a1) and (a2): Preparing a base material having a self-assembled film on its surface (a1), wherein the self-assembled film has a carboxyl group at one end; Peptide bond as a reaction between the carboxyl group at one end of the self-assembled film represented by the chemical formula (I) and the amino group of the one molecule of amino acid by supplying the one molecule of amino acid to the base material Forming the step (a2).
  • steps (a) comprises the following steps (a1) and (a2): Preparing a base material having a self-assembled film on its surface (a1), wherein the self-assembled film has a carboxyl group at one end; Peptide bond as a reaction between the carboxyl group at one end of the self-assembled film represented by the chemical formula (I) and the amino group of the one molecule of amino acid by supplying the one molecule of amino acid to the base material Forming the step (a2).
  • the one molecule of amino acid is selected from the group consisting of cysteine, lysine, histidine, phenylalanine, glycine, serine, alanine, glutamic acid, methionine and leucine.
  • the one molecule of amino acid is selected from the group consisting of cysteine, lysine, histidine, phenylalanine, glycine, serine, alanine, glutamic acid and methionine.
  • a sensor comprising a self-assembled membrane, a molecule of amino acids, and albumin, The one molecule of amino acid is sandwiched between the self-assembled membrane and the albumin, The albumin is bound to the self-assembled membrane by two peptide bonds represented by the following chemical formula (II): (R represents the side chain of one molecule of amino acid)
  • the one molecule of amino acid is composed of cysteine, lysine, histidine, phenylalanine, tyrosine, glycine, asparagine, methionine, serine, tryptophan, leucine, glutamine, alanine, isoleucine, threonine, proline, glutamic acid, aspartic acid, arginine, and valine.
  • B2. The sensor according to item B1, wherein the chemical formula (II) is represented by the following chemical formula (III). (R represents the side chain of one molecule of amino acid)
  • B3. The sensor according to item B1, wherein the amino acid of one molecule is cysteine, lysine, histidine, phenylalanine, glycine, serine, alanine, glutamic acid, methionine, leucine, valine, threonine, isoleucine, tyrosine, asparagine, tryptophan and asparagine
  • the sensor according to item B1 wherein the one molecule of amino acid is selected from the group consisting of cysteine, lysine, histidine, phenylalanine, glycine, serine, alanine, glutamic acid, methionine, and leucine.
  • B5. The sensor according to item B1, wherein the one molecule of amino acid is selected from the group consisting of cysteine, lysine, histidine, phenylalanine, glycine, serine, alanine, glutamic acid and methionine.
  • B6 wherein the one molecule of amino acid is selected from the group consisting of cysteine, lysine, histidine, phenylalanine, glycine, serine, alanine, glutamic acid and methionine.
  • C1. A method for detecting or quantifying an antibody contained in a sample using a sensor, comprising the following steps (a) to (c) in this order: Preparing a sensor comprising a self-assembled membrane, one molecule of amino acid, and albumin, wherein the one molecule of amino acid is sandwiched between the self-assembled membrane and albumin; The albumin is bound to the self-assembled membrane by two peptide bonds represented by the following chemical formula (II): (R represents the side chain of one molecule of amino acid)
  • the one molecule of amino acid is composed of cysteine, lysine, histidine, phenylalanine, tyrosine, glycine, asparagine, methionine, serine, tryptophan, leucine, glutamine,
  • the method according to C1, wherein the one molecule of amino acid is cysteine, lysine, histidine, phenylalanine, glycine, serine, alanine, glutamic acid, methionine, leucine, valine, threonine, isoleucine, tyrosine, asparagine, tryptophan and aspartic acid
  • the method according to C1, wherein the one molecule of amino acid is selected from the group consisting of cysteine, lysine, histidine, phenylalanine, glycine, serine, alanine, glutamic acid, methionine and leucine.
  • the present invention significantly increases the amount of albumin immobilized per unit area.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the method according to the invention.
  • FIG. 2 is FIG. 7 of Patent Document 1.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram of a method according to the prior art.
  • FIG. 1 shows the method according to the invention for fixing albumin to a self-assembled membrane.
  • the substrate 1 is preferably a gold substrate.
  • An example of a gold substrate is a substrate having gold uniformly on the surface.
  • the gold substrate can be glass, plastic, or a substrate having a gold film formed on the surface of SiO 2 by a sputtering method.
  • the substrate 1 is immersed in a solution containing alkanethiol.
  • the substrate 1 is washed before the substrate 1 is immersed.
  • the alkanethiol has a carboxyl group at the terminal.
  • the alkanethiol preferably has a carbon number in the range of 6-18. In this way, the self-assembled film 2 is formed on the substrate 1.
  • the preferred concentration of alkanethiol is approximately 1-10 mM.
  • the solvent is not limited.
  • An example of a preferred solvent is ethanol, dimethyl sulfoxide (hereinafter referred to as “DMSO”), or dioxane.
  • the preferred soaking time is approximately 12 to 48 hours.
  • the carboxyl group (—COOH) located at the upper end of the self-assembled film 2 reacts with the amino group (—NH 2 ) of amino acid 3 to form a peptide bond represented by the following chemical formula (I).
  • Amino acid 3 includes 20 types of cysteine, lysine, histidine, phenylalanine, tyrosine, glycine, asparagine, methionine, serine, tryptophan, leucine, glutamine, alanine, isoleucine, threonine, proline, glutamic acid, aspartic acid, arginine, and valine. Selected from amino acids. That is, in the chemical formula (I), R is a side chain of one amino acid selected from these 20 kinds of amino acids.
  • the amino acid 3 When the amino acid 3 is supplied to the self-assembled film 2, two or more types of amino acids can be supplied simultaneously. That is, when a solution containing amino acid 3 is supplied to self-assembled film 2, the solution can contain two or more amino acids 3. Considering the uniform binding of albumin to amino acid 3 described below, the solution preferably contains only one type of amino acid.
  • albumin 4 is supplied.
  • the amino group at the N-terminal of albumin 4 reacts with the carboxyl group of amino acid 3.
  • the amino group of lysine contained in albumin 4 also reacts with the carboxyl group of amino acid 3.
  • two peptide bonds represented by the following chemical formula (II) are formed to obtain a sensor.
  • the sensor thus obtained is used for detecting or quantifying the antibody contained in the sample.
  • albumin was directly bound to the carboxyl group located on the upper end of the self-assembled alkanethiol formed on the gold surface by an amide coupling reaction to immobilize albumin. Procedures and results are described below.
  • sample solution 16-mercaptohexadecanoic acid with a final concentration of 10 mM (16-Mercaptohexadecanoic acid) sample solution was prepared.
  • the solvent was ethanol.
  • the base material As the base material 1, a gold substrate (manufactured by GE Healthcare; BR-1004-05) having gold deposited on glass was used. The substrate 1 was washed with a piranha solution containing concentrated sulfuric acid and 30% hydrogen peroxide for 10 minutes. Furthermore, it wash
  • the gold substrate was immersed in the sample solution for 18 hours to form a self-assembled film on the surface of the gold substrate. Finally, the substrate 1 was washed with pure water and dried.
  • Albumin was bound to the carboxyl group located at the upper end of 16-mercaptohexadecanoic acid forming a self-assembled film, and albumin was fixed.
  • N-hydroxysuccinimide NHS
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • the carboxyl group located at the upper end of 16-mercaptohexadecanoic acid was activated by a 35 microliter mixture of (dimethylaminopropyl) propylcarbodiimide hydrochloride).
  • 35 microliters of albumin 40 microgram / ml
  • Example 1 The experiment was performed in the same manner as in the comparative example, except that glycine was supplied as one molecule of amino acid between the formation of the self-assembled film and the fixation of albumin. Procedures and results are described below.
  • albumin was bound to the carboxyl group of glycine to fix the albumin. Specifically, after the carboxyl group of glycine was activated as described above, 35 microliters of albumin (concentration: 250 microgram / ml) was added at a flow rate of 5 microliters / minute. In this way, the carboxyl group of glycine was coupled to the N-terminal amino group of albumin or the amino group of lysine contained in albumin.
  • Example 1 [Comparison of fixed amount] Using an SPR device Biacore 3000 (manufactured by GE Healthcare), the fixed amount of albumin in Example 1 and Comparative Example was measured.
  • the term “fixed amount” means the amount of albumin fixed per unit area.
  • the ratio of the fixed amount measured in Example 1 to the fixed amount measured in the comparative example was approximately 14.4: 1.
  • Example 2 to 20 Instead of glycine, threonine, methionine, isoleucine, proline, serine, glutamine, asparagine, phenylalanine, troptophan, cysteine, histidine, alanine, lysine, leucine, glutamic acid, valine, aspartic acid, arginine, and tyrosine were used. Each fixed amount was measured in the same manner as above. These amino acids are 20 kinds of natural amino acids. Table 1 shows the measured fixed amounts.
  • Cysteine, lysine, histidine, phenylalanine, glycine, serine, alanine, glutamic acid, methionine, leucine, valine, threonine, isoleucine, tyrosine, asparagine, tryptophan and aspartic acid are preferred. This is because when one amino acid selected from these amino acids is supplied, each fixed amount measured is 5 or more.
  • Cysteine, lysine, histidine, phenylalanine, glycine, serine, alanine, glutamic acid, methionine and leucine are more preferred. This is because, when one amino acid selected from these amino acids is supplied, each fixed amount measured is 10 or more.
  • Cysteine, lysine, histidine, phenylalanine, glycine, serine, alanine, glutamic acid and methionine are even more preferred. This is because, when one amino acid selected from these amino acids is supplied, each measured fixed amount is an average value (10.7) or more.
  • cysteine Most preferred are cysteine, lysine, histidine, phenylalanine, glycine and serine. This is because when one amino acid selected from these amino acids is supplied, each measured fixed amount exceeds 1.2 times the average value.
  • the present invention can remarkably increase the amount of albumin immobilized per unit area. This makes it possible to improve the sensitivity of the biosensor.
  • the biosensor can be used in tests and diagnoses that require detection or quantification of antibodies contained in a biological sample derived from a patient in a clinical setting.

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Abstract

 本発明の目的は、自己組織化膜上に固定されるアルブミンの量を増加させることである。本発明の方法は、自己組織化膜とアルブミンとの間に入る1分子のアミノ酸により特徴付けられる。例えば、アルブミンを自己組織化膜上に固定する方法であって、以下の工程(a)~(b)をこの順に具備する、方法が提供される:1分子のアミノ酸および前記自己組織化膜を具備する基材を用意する工程(a)および前記基材上にアルブミンを供給し、前記1分子のアミノ酸のカルボキシル基と前記アルブミンのアミノ基との反応の結果として所定の化学式で表現されるペプチド結合を形成する工程(b)。

Description

アルブミンを自己組織化膜上に固定する方法
 本発明はアルブミンを自己組織化膜上に固定する方法に関する。
 試料に含有される標的物質を検出または定量するために、バイオセンサが用いられる。いくつかのバイオセンサは、抗体を検出または定量するために抗原を具備する。
 抗体を含有する試料が、抗原であるアルブミンを具備するバイオセンサに供給されると、抗体はアルブミンに結合することによって、検出または定量される。
 特許文献1は、抗原を具備する従来のバイオセンサを開示している。この特許文献1は、特表2002-520618号公報に対応する(特許文献1における、第24頁第23行から26行まで、第25頁第3行から第20行まで、第25頁第27行から第26頁第13行、および第26頁第14行から第22行まで、第28頁第21行から第23行、または対応する公報の段落番号0080、0082、0084、0085、0095、0109、0118、および0119を参照)。図2は、特許文献1の図7に開示されたバイオセンサを示す。
 特許文献1の図7に関する記述によれば、当該バイオセンサは、生体分子の活性をスクリーニングするために用いられる。当該バイオセンサは、単層7、親和性タグ8、アダプター分子9、およびタンパク質10を具備している。単層7は、化学式X-R-Yによって表される自己組織化膜から構成される(特許文献1における、第24頁第23行から26行まで、第25頁第3行から第20行まで、第25頁第27行から第26頁第13行、および第26頁第14行から第22行までを参照。または、対応する公報の段落番号0080、0082、0084、0085を参照)。X、R、およびYの一例は、それぞれ、HS-、アルカン、およびカルボキシル基である(特許文献1における、第25頁第3行から第20行まで、第25頁第27から第26頁第13行、および第28頁第21行から第23行までを参照。または、対応する公報の段落0084、0085、および0095)。
国際公開第00/04382号公報
 抗体の検出感度または定量精度を向上させるためには、当該バイオセンサに固定されるアルブミンの量を増やすことが必要とされる。
 本発明者は、自己組織化膜に1分子のアミノ酸を結合させ、そしてアルブミンを固定することによって、単位面積あたりのアルブミンの固定量が著しく増加されるという知見を見いだした。本発明はこの知見を元に完成された。
 本発明の目的は、自己組織化膜上に固定されるアルブミンの量を増加させる方法、及び当該方法に従って固定されたアルブミンを有するセンサを提供することである。
 以下の項目A1~C6は、上記課題を解決する。
 A1.アルブミンを自己組織化膜上に固定する方法であって、以下の工程(a)~(b)をこの順に具備する、方法:
 1分子のアミノ酸および前記自己組織化膜を具備する基材を用意する工程(a)、
 ここで、前記1分子のアミノ酸は、以下の化学式(I)により表されるペプチド結合により前記自己組織化膜に結合しており、
 前記1分子のアミノ酸は、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる20種類のアミノ酸から選択され、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 (Rは前記1分子のアミノ酸の側鎖を示す)
 前記基材上にアルブミンを供給し、前記1分子のアミノ酸のカルボキシル基と前記アルブミンのアミノ基との反応の結果として以下の化学式(II)よって表されるペプチド結合を形成する工程(b)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 (Rは前記1分子のアミノ酸の側鎖を示す)。
 A2. 項目A1に記載の方法であって、前記工程(a)は、以下の工程(a1)および(a2)を具備する、方法:
 自己組織化膜を表面に具備する基材を用意する工程(a1)、ここで、前記自己組織化膜は一端にカルボキシル基を有し、
 前記1分子のアミノ酸を前記基材に供給し、前記化学式(I)により表される前記自己組織化膜の一端の前記カルボキシル基と前記1分子のアミノ酸のアミノ基との間の反応としてペプチド結合を形成する工程(a2)。
 A3. 項目A1に記載の方法であって、前記工程(a)および前記工程(b)との間にさらに前記工程(ab)を具備する、方法:
 前記1分子のアミノ酸のカルボキシル基を、N-ヒドロキシスクシンイミドおよび1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩の混合液により活性化する工程(ab)。
 A4. 項目A2に記載の方法であって、前記工程(a1)および前記工程(a2)との間にさらに前記工程(a1a)を具備する、方法:
 前記自己組織化膜のカルボキシル基を、N-ヒドロキシスクシンイミドおよび1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩の混合液により活性化する工程(a1b)。
 A5. 前記化学式(II)が以下の化学式(III)により表される、項目A1に記載の方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 (Rは前記1分子のアミノ酸の側鎖を示す)。
 A6. 項目A1に記載の方法であって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニン、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される、方法。
 A7. 項目A1に記載の方法であって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニンおよびロイシンからなる群から選択される、方法。
 A8. 項目A1に記載の方法であって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸およびメチオニンからなる群から選択される、方法。
 A9. 項目A1に記載の方法であって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択される、方法。
 B1. 自己組織化膜、1分子のアミノ酸、およびアルブミンを備えたセンサであって、
 前記自己組織化膜および前記アルブミンの間には前記1分子のアミノ酸が挟まれており、
 前記アルブミンが、以下の化学式(II)によって表される2つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 (Rは前記1分子のアミノ酸の側鎖を示す)
 前記1分子のアミノ酸は、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる20種類のアミノ酸から選択される、センサ。
 B2. 前記化学式(II)が以下の化学式(III)により表される、項目B1に記載のセンサ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 (Rは前記1分子のアミノ酸の側鎖を示す)
 B3. 項目B1に記載のセンサであって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニン、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される、センサ。
 
 B4. 項目B1に記載のセンサであって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニンおよびロイシンからなる群から選択される、センサ。
 
 B5. 項目B1に記載のセンサであって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸およびメチオニンからなる群から選択される、センサ。
 B6. 項目B1に記載のセンサであって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択される、センサ。
 C1. センサを用いて試料に含まれる抗体を検出または定量する方法であって、以下の工程(a)~(c)をこの順で具備する、方法:
 自己組織化膜、1分子のアミノ酸、およびアルブミンを備えたセンサを用意する工程(a)、ここで
 前記自己組織化膜および前記アルブミンの間には前記1分子のアミノ酸が挟まれており、
 前記アルブミンが、以下の化学式(II)によって表される2つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 (Rは前記1分子のアミノ酸の側鎖を示す)
 前記1分子のアミノ酸は、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる20種類のアミノ酸から選択され、
前記センサに前記試料を供給し、前記アルブミンに抗体を結合させる工程(b)、および
 工程(b)において結合した抗体を検出するか、または工程(b)において結合した抗体の量から前記試料に含有される抗体を定量する工程(c)。
 C2. C1に記載の方法であって、前記化学式(II)が以下の化学式(III)により表される、方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 (Rは前記1分子のアミノ酸の側鎖を示す)
 C3. C1に記載の方法であって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニン、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される、方法。
 C4. C1に記載の方法であって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニンおよびロイシンからなる群から選択される、方法。
 C5. C1に記載の方法であって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸およびメチオニンからなる群から選択される、方法。
 C6. C1に記載の方法であって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択される、方法。
 本発明は、単位面積あたりに固定されるアルブミンの量を著しく増加する。
図1は、本発明による方法の概略図を示す。 図2は、特許文献1の図7である。 図3は、従来技術による方法の概略図を示す。
 図1を参照しながら、本発明の実施の形態が、以下、説明される。
 (実施の形態1)
 図1は、アルブミンを自己組織化膜に固定するための本発明による方法を示す。
 基材1は、好ましくは金基板である。金基板の一例は、表面に金を一様に有する基板である。具体的には、金基板は、ガラス、プラスチック、またはSiO2の表面にスパッタリング法により形成された金膜を有する基板であり得る。
 まず、アルカンチオールを含有する溶液に基材1は浸漬される。好ましくは、基材1が浸漬される前に基材1は洗浄される。当該アルカンチオールは、末端にカルボキシル基を有する。アルカンチオールは、6~18の範囲内の炭素数を有することが好ましい。このようにして、基材1上に自己組織化膜2が形成される。
 アルカンチオールの好ましい濃度はおよそ1~10mMである。アルカンチオールを溶解する限り、溶媒は限定されない。好ましい溶媒の一例は、エタノール、ジメチルスルホキシド(以下、「DMSO」と記される)、またはジオキサンである。好ましい浸漬時間はおよそ12~48時間である。
 次に、自己組織化膜2にアミノ酸3が供給される。自己組織化膜2の上端に位置するカルボキシル基(-COOH)はアミノ酸3のアミノ基(-NH2)と反応して、以下の化学式(I)によって表されるペプチド結合を形成する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
(ここで、Rは1分子のアミノ酸の側鎖を表す)
 化学式(I)においては、1分子のアミノ酸3が自己組織化膜2と結合する。
 アミノ酸3は、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる20種類のアミノ酸から選択される。すなわち、化学式(I)において、Rはこれら20種類のアミノ酸から選択される1つのアミノ酸の側鎖である。
 自己組織化膜2にアミノ酸3が供給される際に、2種類以上のアミノ酸が同時に供給され得る。すなわち、自己組織化膜2にアミノ酸3を含有する溶液が供給される際に、当該溶液は2種類以上のアミノ酸3を含有し得る。後述するアルブミンのアミノ酸3への均一な結合を考慮すれば、当該溶液は1種類のみのアミノ酸を含有することが好ましい。
 続いて、アルブミン4が供給される。アルブミン4のN末端のアミノ基が、アミノ酸3のカルボキシル基と反応する。アルブミン4に含まれるリジンのアミノ基も、アミノ酸3のカルボキシル基と反応する。このようにして、以下の化学式(II)によって示される2つのペプチド結合が形成され、センサを得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
(ここで、Rは1分子のアミノ酸の側鎖を表す)
 1分子のアルブミン4は、そのN末端のアミノ基として1つのみを有する一方、1分子のアルブミン4は、アミノ基を有する多数のリジン基を有する。従って、ほとんど全ての化学式(II)は、詳細には、以下の化学式(III)によって表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
(ここで、Rは1分子のアミノ酸の側鎖を表す)
 このようにして得られたセンサは、試料に含有される抗体を検出または定量するために用いられる。
 (実施例)
 以下の実施例および比較例は、本発明をさらに詳細に説明する。本願明細書に記載された実施例は、例示目的のみのためものであり、それに鑑みて種々の改変および変形例が当業者にとって示唆されるものと理解され、そして、そのような改変および変形例も、本願明細書の趣旨および範囲ならびに添付の請求の範囲に当然含まれるべきものであると理解される。
 (比較例)
 図3に示されるように、金表面上に形成された自己組織化されたアルカンチオールの上端に位置するカルボキシル基に、直接、アルブミンがアミドカップリング反応により結合され、アルブミンを固定した。手順及び結果が以下に記述される。
 [試料溶液の調製]
 10mMの最終濃度を有する16-メルカプトヘキサデカン酸(16-Mercaptohexadecanoic
acid)の試料溶液が調製された。溶媒はエタノールであった。
 [自己組織化膜の形成]
 基材1として、ガラス上に蒸着された金を有する金基板(GEヘルスケア社製;BR-1004-05)が用いられた。当該基材1は、濃硫酸および30%過酸化水素水を含有するピラニア溶液で10分間洗浄した。さらに純水を用いて洗浄して乾燥した。当該ピラニア溶液に含有される濃硫酸の30%過酸化水素水に対する体積比は3:1であった。
 続いて、金基板は試料溶液中に18時間浸漬され、金基板の表面に自己組織化膜を形成した。最後に、純水により基材1は洗浄され、乾燥された。
 [アルブミンの固定]
 自己組織化膜を形成する16-メルカプトヘキサデカン酸の上端に位置するカルボキシル基にアルブミンが結合され、アルブミンが固定された。
 具体的には、0.1M N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS;N-Hydroxysuccinimide)および0.4M 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC;1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)の35マイクロリットルの混合液により、16-メルカプトヘキサデカン酸の上端に位置するカルボキシル基が活性化された。その後、35マイクロリットルのアルブミン(40マイクログラム/ml)が5マイクロリットル/分の流速で添加された。このようにして、16-メルカプトヘキサデカン酸のカルボキシル基はアルブミンのアミノ基にカップリングされた。
 (実施例1)
 自己組織化膜の形成とアルブミンの固定との間に、1分子のアミノ酸としてグリシンが供給されたこと以外は、比較例と同様に、実験が行なわれた。手順及び結果は以下に記述される。
 [アミノ酸(グリシン)の固定化]
 自己組織化膜2を形成する16-メルカプトヘキサデカン酸(16-Mercaptohexadecanoic
acid)の上端に位置するカルボキシル基にグリシンが結合され、グリシンを固定した。
 具体的には、比較例と同様にカルボキシル基が活性化された後に、35マイクロリットルの0.1Mグリシン(pH:8.9)が5マイクロリットル/分の流速で添加された。このようにして、16-メルカプトヘキサデカン酸のカルボキシル基がグリシンのアミノ基にカップリングされた。
 [アルブミンの固定]
 続いて、グリシンのカルボキシル基にアルブミンが結合され、アルブミンを固定した。具体的には、上記と同様にグリシンのカルボキシル基が活性化された後に、35マイクロリットルのアルブミン(濃度:250マイクログラム/ml)が5マイクロリットル/分の流速で添加された。このようにして、グリシンのカルボキシル基は、アルブミンのN末端のアミノ基またはアルブミンに含まれるリジンのアミノ基にカップリングされた。
 [固定量の比較]
 SPR装置Biacore3000(GEヘルスケア社製)を用いて、実施例1および比較例におけるアルブミンの固定量が測定された。
 本明細書において用いられる用語「固定量」とは、単位面積あたりに固定されたアルブミンの量を意味する。
 比較例において測定された固定量に対する実施例1において測定された固定量の比は、およそ14.4:1であった。
 (実施例2~20)
 グリシンに代え、スレオニン、メチオニン、イソロイシン、プロリン、セリン、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、トロプトファン、システイン、ヒスチジン、アラニン、リジン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、アスパラギン酸、アルギニン、およびチロシンが用いられ、実施例1と同様に各固定量を測定した。これらのアミノ酸は、20種類の天然アミノ酸である。表1は、測定された固定量を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 当業者は以下のことを表1から理解するであろう。
 20種類のアミノ酸が用いられた場合、比較例と比較して固定量が増加する。さらに、用いられるアミノ酸に応じて、固定量は変化する。
 システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニン、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、トリプトファンおよびアスパラギン酸が好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸から選択される1のアミノ酸が供給された際には、測定された各固定量は5以上であるからである。
 システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニンおよびロイシンがより好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸から選択される1のアミノ酸が供給された際には、測定された各固定量は10以上であるからである。
 システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸およびメチオニンがさらにより好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸から選択される1のアミノ酸が供給された際には、測定された各固定量は平均値(10.7)以上であるからである。
 システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシンおよびセリンが最も好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸から選択される1のアミノ酸が供給された際には、測定された各固定量は平均値の1.2倍を超えるからである。
 本発明は、単位面積あたりに固定されるアルブミンの量を著しく増加させ得る。このことにより、バイオセンサの感度を向上させることが可能になる。当該バイオセンサは、臨床現場において患者由来の生体試料に含有される抗体の検出または定量を必要とする検査および診断に用いられ得る。
1:金基材
2:アルカンチオール
3:アミノ酸
4:アルブミン

Claims (21)

  1. アルブミンを自己組織化膜上に固定する方法であって、以下の工程(a)~(b)をこの順に具備する、方法:
     1分子のアミノ酸および前記自己組織化膜を具備する基材を用意する工程(a)、
     ここで、前記1分子のアミノ酸は、以下の化学式(I)により表されるペプチド結合により前記自己組織化膜に結合しており、
     前記1分子のアミノ酸は、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる20種類のアミノ酸から選択され、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     (Rは前記1分子のアミノ酸の側鎖を示す)
     前記基材上にアルブミンを供給し、前記1分子のアミノ酸のカルボキシル基と前記アルブミンのアミノ基との反応の結果として以下の化学式(II)よって表されるペプチド結合を形成する工程(b)
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     (Rは前記1分子のアミノ酸の側鎖を示す)。
  2. 請求項1に記載の方法であって、前記工程(a)は、以下の工程(a1)および(a2)を具備する、方法:
     自己組織化膜を表面に具備する基材を用意する工程(a1)、ここで、前記自己組織化膜は一端にカルボキシル基を有し、
     前記1分子のアミノ酸を前記基材に供給し、前記化学式(I)により表される前記自己組織化膜の一端の前記カルボキシル基と前記1分子のアミノ酸のアミノ基との間の反応としてペプチド結合を形成する工程(a2)。
  3. 請求項1に記載の方法であって、前記工程(a)および前記工程(b)との間にさらに前記工程(ab)を具備する、方法:
     前記1分子のアミノ酸のカルボキシル基を、N-ヒドロキシスクシンイミドおよび1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩の混合液により活性化する工程(ab)。
  4. 請求項2に記載の方法であって、前記工程(a1)および前記工程(a2)との間にさらに前記工程(a1a)を具備する、方法:
     前記自己組織化膜のカルボキシル基を、N-ヒドロキシスクシンイミドおよび1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩の混合液により活性化する工程(a1b)。
  5. 前記化学式(II)が以下の化学式(III)により表される、請求項1に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     (Rは前記1分子のアミノ酸の側鎖を示す)。
  6. 請求項1に記載の方法であって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニン、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される、方法。
  7. 請求項1に記載の方法であって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニンおよびロイシンからなる群から選択される、方法。
  8. 請求項1に記載の方法であって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸およびメチオニンからなる群から選択される、方法。
  9. 請求項1に記載の方法であって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択される、方法。
  10. 自己組織化膜、1分子のアミノ酸、およびアルブミンを備えたセンサであって、
     前記自己組織化膜および前記アルブミンの間には前記1分子のアミノ酸が挟まれており、
     前記アルブミンが、以下の化学式(II)によって表される2つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     (Rは前記1分子のアミノ酸の側鎖を示す)
     前記1分子のアミノ酸は、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる20種類のアミノ酸から選択される、センサ。
  11. 前記化学式(II)が以下の化学式(III)により表される、請求項10に記載のセンサ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     (Rは前記1分子のアミノ酸の側鎖を示す)
  12. 請求項10に記載のセンサであって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニン、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される、センサ。
  13. 請求項10に記載のセンサであって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニンおよびロイシンからなる群から選択される、センサ。
  14. 請求項10に記載のセンサであって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸およびメチオニンからなる群から選択される、センサ。
  15. 請求項10に記載のセンサであって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択される、センサ。
  16. センサを用いて試料に含まれる抗体を検出または定量する方法であって、以下の工程(a)~(c)をこの順で具備する、方法:
     自己組織化膜、1分子のアミノ酸、およびアルブミンを備えたセンサを用意する工程(a)、ここで
     前記自己組織化膜および前記アルブミンの間には前記1分子のアミノ酸が挟まれており、
     前記アルブミンが、以下の化学式(II)によって表される2つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     (Rは前記1分子のアミノ酸の側鎖を示す)
     前記1分子のアミノ酸は、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる20種類のアミノ酸から選択され、
    前記センサに前記試料を供給し、前記アルブミンに抗体を結合させる工程(b)、および
     工程(b)において結合した抗体を検出するか、または工程(b)において結合した抗体の量から前記試料に含有される抗体を定量する工程(c)。
  17. 請求項16に記載の方法であって、前記化学式(II)が以下の化学式(III)により表される、方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     (Rは前記1分子のアミノ酸の側鎖を示す)
  18. 請求項16に記載の方法であって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニン、ロイシン、バリン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、アスパラギン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群から選択される、方法。
  19. 請求項16に記載の方法であって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸、メチオニンおよびロイシンからなる群から選択される、方法。
  20. 請求項16に記載の方法であって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、グルタミン酸およびメチオニンからなる群から選択される、方法。
  21. 請求項16に記載の方法であって、前記1分子のアミノ酸が、システイン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択される、方法。
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