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WO2012066260A1 - Determination du pouvoir thrombogene d'immunoglobulines humaines - Google Patents

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WO2012066260A1
WO2012066260A1 PCT/FR2011/052703 FR2011052703W WO2012066260A1 WO 2012066260 A1 WO2012066260 A1 WO 2012066260A1 FR 2011052703 W FR2011052703 W FR 2011052703W WO 2012066260 A1 WO2012066260 A1 WO 2012066260A1
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WO
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factor
reaction medium
human
sample
activated
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PCT/FR2011/052703
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Inventor
Catherine Michalski
Original Assignee
Lfb Biomedicaments
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Publication date
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G01N2333/96463—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups

Definitions

  • the present invention relates to the determination of the thrombogenic power of human immunoglobulins contained in a test sample.
  • Human immunoglobulins containing mainly IgG, are commonly used in the therapy of pathologies such as immunodeficiency or autoimmune diseases and particularly intravenous (IvIG).
  • IvIG intravenous
  • Embolic thrombosis consists of the formation of a thrombus closing a blood vessel.
  • the thrombus can develop in the venous circulation and give rise to venous thrombosis, or in the arterial circulation and lead to arterial occlusion with ischemia or infarction.
  • Thrombus is a result of blood clotting, platelet aggregation and activation of the coagulation system, a chain reaction involving platelets and coagulation factors.
  • a thrombus essentially contains fibrin, an insoluble protein, formed from fibrinogen.
  • Factors XI and IX are among the factors involved in intrinsic blood coagulation.
  • Factor IX is activated by activated factor XI, the latter being itself activated by activated factor XII. This activation cascade eventually leads to the formation of fibrinogen (FI).
  • TGT thrombin generation test
  • thromboelastography consists of measuring the physical properties of whole blood by mechanically analyzing clot formation as a function of time. Depending on the parameters extracted from a graph (called thromboelastogram) generated by the thromboelastograph, one can evaluate the coagulation ability of a patient.
  • Hemker et al. propose in 2002 the concept of thrombinography to measure the thrombin generation by fluorometry (Pathophysiol Haemost thromb 2002; 32: 249-53).
  • Thrombinography involves using a thrombin calibrator and a specific fluorescent substrate in platelet-poor plasma or platelet-rich plasma to establish a thrombinogram.
  • a thrombin-induced signal generated by tissue factor is confronted with the signal generated by a normalized amount of exogenous thrombin in the same plasma.
  • a thrombin generation test also makes it possible to determine the presence of FVII, FXI, FIX, FXII, FX and / or their activated forms in a sample.
  • the object of the present invention is to provide a kit for determining the thrombogenic power of human immunoglobulins contained in a logically acceptable biological product.
  • the present invention also aims to provide a method for determining the thrombogenic power related to the presence of activated factor VII, activated XI, activated factor IX, activated factor XII and / or activated factor X in a sample. likely to be administered in humans.
  • the first aspect of the invention relates to the use of a kit comprising the following elements:
  • kits for determining the thrombogenic power of human immunoglobulins contained in a test sample, in particular a bio-logically acceptable sample, said elements of the kit and the sample to be tested when they are mixed forming a reaction medium.
  • the second aspect of the invention relates to the use of a kit comprising the following elements:
  • factor XI-deficient human blood plasma means a human blood plasma containing less than 1% (functional and antigenic assays) of the normal amount of factor XI and activated factor XI.
  • a factor XI deficient blood plasma is prepared by immunoadsorption such as factor XI deficient plasma marketed by Cryopep.
  • human immunoglobulins or "human IgG” in the context of the invention means polyvalent immunoglobulins which are essentially IgGs, possibly including IgMs. It may be whole immunoglobulins, or fragments such as F (ab ') 2 or F (ab) and any intermediate fraction obtained during the process of manufacturing polyvalent immunoglobulins.
  • thrombogenic power means the ability of human immunoglobulins to trigger coagulation and to form a thrombus in patients. Therefore, a "thrombogenic immunoglobulin preparation” is an immunoglobulin preparation having the ability to induce coagulation and form a thrombus in patients.
  • a "logically acceptable organic" sample is a sample that can be administered to humans by intravenous, parenteral, or intramuscular voice. These may include human immunoglobulin preparations for therapeutic purposes.
  • human immunoglobulin preparations for therapeutic purposes is intended to mean any medicament comprising human immunoglobulins in a pharmaceutically acceptable form. This may include IvIG.
  • a thrombogram is represented by a thrombin generation curve characterized by several parameters:
  • ETP Endogenous Thrombin Potential, in nM x min
  • Velocity Peak / (ttPeak-Lagtime) (in nM / min), representative of the formation rate of thrombin.
  • the invention relates to the use of a kit comprising the following elements:
  • kits comprising the following elements:
  • thrombogenic power related to the presence in particular of the factor XII and / or its activated form, of human immunoglobulins contained in a test sample, in particular a bio-logically acceptable sample, said elements of the kit and the test sample forming a reaction medium.
  • Vector XI-deficient human blood plasma means a human blood plasma containing less than 1% (functional and antigenic assays) of the normal amount of factor XI and less than ⁇ 10 9 platelets / L of plasma .
  • Platelet-poor blood plasma is prepared according to a method known to those skilled in the art such as centrifugation.
  • activated factor VII or “FVIIa” is meant an FVII protein capable of activating factor IX or factor X.
  • activated factor XII or "FXIIa” is meant an FXII protein capable of activating factor XI.
  • activated factor XI or “FXIa” is meant a protein consisting of two 80 kDa subunits, linked together by a disulfide bridge at the Cys-321 position and capable of recognizing its natural substrate: FIX.
  • activated factor IX or "FIXa” is meant a FIX protein capable of recognizing its natural substrate: FX.
  • activated factor X or “FXa” is meant an FX protein capable of recognizing its natural substrate prothrombin.
  • the present invention relates to the use of a kit according to the invention further comprising a dilution buffer such as a physiological buffer Tris NaCl or a buffer identical to that of the sample to test. It is then an acceptable formulation buffer for a preparation of immunoglobulins for therapeutic purposes.
  • a dilution buffer such as a physiological buffer Tris NaCl or a buffer identical to that of the sample to test. It is then an acceptable formulation buffer for a preparation of immunoglobulins for therapeutic purposes.
  • the human blood plasma sample contained in the kit and the dilution buffer form a negative control.
  • the kit according to the invention further comprises a fluorogenic or flurorescent substrate.
  • Human blood plasma is collected from healthy volunteers who do not have serious diseases, and contains all normal coagulation factors involved in intrinsic blood coagulation.
  • the human blood plasma is a pool of fresh or frozen human plasma blood or a calibrated commercial blood plasma.
  • the blood plasma used in the invention may contain or be devoid of tissue factor.
  • the human blood plasma is devoid of tissue factor.
  • the human tissue factor of the kit is of plasmatic origin, of recombinant origin, or of transgenic origin.
  • the invention relates to the use of a kit comprising:
  • a platelet-deficient human blood plasma deficient in FXI the volume of which represents from 80% to 40%, in particular from 75% to 50%, especially 53% of the volume of the reaction medium.
  • human phospholipids whose final concentration in the reaction medium is from 1 ⁇ to 10 ⁇ , in particular 4 ⁇ ,
  • human tissue factor the final concentration of which in the reaction medium is 0.05 ⁇ M at 10 ⁇ M, particularly 0.3 ⁇ M,
  • Said kit may further comprise a dilution buffer, in particular Tris NaCl buffer.
  • the ratio between the volume of the blood plasma and that of the sample to be tested is from 8: 1 to 2: 1, particularly 4: 1.
  • the ratio of 8: 1 to 2: 1 corresponds to the injection conditions of the immunoglobulin to the patient.
  • the ratio of 4: 1 is physio logically significant for an Ig concentration of 5%.
  • Another aspect of the invention relates to a method for measuring the thrombogenic power of human immunoglobulins contained in a test sample, in particular a bio-logically acceptable sample.
  • the method comprises the following steps:
  • step c) the addition in the intermediate reaction medium obtained in the preceding step and in the intermediate negative control obtained in step a) of a mixture comprising phospho lipids, CaCl 2, and possibly human tissue factor, to form a reaction medium and a negative control;
  • step c) obtaining a first thrombinogram by performing a thrombin generation test on the reaction medium obtained in step c) and a second thrombinogram by performing a thrombin generation test on the negative control obtained at the same time; step c);
  • step d) comparing at least one of the parameters of each of the thrombograms obtained from step d) with a homologous parameter obtained from standard thrombograms established on the basis of a series of calibrators whose thrombogenic power related to the presence of activated factor VII and / or activated factor XI and / or activated factor IX and / or activated factor XII and / or activated factor X is known and varies between each calibrator;
  • step e) the deduction of step e) from the thrombogenic power of human immunoglobulins contained in the sample to be tested.
  • platelet-poor human blood plasma is deficient in factor XI.
  • the standard thrombinogram is obtained by performing a thrombin generation test on a reaction medium comprising: i) a calibrator whose thrombogenic power related to the presence of activated factor VII and / or activated factor XI and / or activated factor IX and / or activated factor XII and / or activated factor X is known, ii) human platelet-poor blood plasma, possibly deficient in factor XI, iii) a reaction mixture comprising phopho lipids, CaCl 2 and possibly human tissue factor.
  • the calibrator is used by the software to perform corrections of the raw signals and overcomes some of the disadvantages of fluorescence and transform the signal initially into fluorescence units per minute directly into nanomolar thrombin.
  • the final concentration of human tissue factor in the reaction medium is 0.05 ⁇ M to 10 ⁇ M, particularly 0.3 ⁇ M.
  • Tissue factor and FVIIa form a complex to activate IX and X factors in the exogenous coagulation pathway.
  • the final concentration of human phospholipids in the reaction medium is 1 ⁇ to 10 ⁇ , particularly 4 ⁇ .
  • the volume of the blood plasma is from 80% to 40%, especially from 75% to 50%, particularly 53% of the volume of the reaction medium.
  • the ratio of blood plasma volume to that of the sample is from 8: 1 to 2: 1, particularly 4: 1.
  • the thrombogram is obtained by the method of thromboelastography or the thrombinography method.
  • Thromboelastography can be implemented according to the method known to those skilled in the art, as described by Savry et al. (Ann Fr Anesth Reanim 2005; 24: 607-16).
  • Thrombinography can be implemented according to the method known to those skilled in the art, as described by Hemker et al. (Pathophysiol Haemost thromb 2002; 32: 249-53).
  • the method according to the invention comprises the following steps: a) mixing the dilution buffer of a test sample with a human platelet-poor blood plasma and deficient in factor XI to form an intermediate negative control;
  • step c) the addition in the intermediate reaction medium obtained in the preceding step and in the intermediate negative control obtained in step a) of a mixture comprising 4 ⁇ l of phopholipids, and 3 ⁇ M of human tissue factor and CaCl 2, for form a reaction medium and a negative control;
  • step c) obtaining two thrombograms by the implementation of thrombinography, performing a thrombin generation test on the reaction medium and on the negative control obtained in step c);
  • step d) comparing at least one of the parameters of each of the thrombograms obtained in step d) with a homologous parameter obtained from standard thrombograms established on the basis of a series of calibrators whose thrombogenic power related to the presence of activated factor VII and / or activated factor XI and / or activated factor IX and / or activated factor X is known and varies between each calibrator;
  • step e) the deduction of step e) thrombogenic power related to the presence of factor VII, factor XI, factor IX, factor X and / or their activated form in the sample.
  • FIG. 1 represents the respective determination of the thrombogenic power of activated factor XI in a normal plasma pool, or a diluted normal plasma pool (1/9), of the dilution buffer in a normal plasma pool, or a diluted normal plasma pool (1/9) respectively, according to the first protocol. Concentration The final factor of the tissue factor in the reaction medium is 20 ⁇ M. The other reaction conditions are described in Table 1, under the column designated "Protocol 1".
  • Figure 2 shows the respective determination of the thrombogenic power of activated factor XI in a pool of normal plasma, or FXIa in a diluted normal plasma pool (1/9), and dilution buffer in a plasma pool. normal, or dilution buffer in a diluted normal plasma pool (1/9), according to the second protocol.
  • the final concentration of the tissue factor in the reaction medium is 0.3 ⁇ M.
  • the other reaction conditions are described in Table 1, under the column designated "Protocol 2".
  • Figure 3 shows the respective determination of the thrombogenic power of activated factor XI in a pool of normal plasma, FXI in a pool of diluted normal plasma (1/9), dilution buffer in a pool of normal plasma, or dilution buffer in a diluted normal plasma pool (1/9) according to the second protocol.
  • the reaction medium does not contain any tissue factor.
  • the other reaction conditions are described in Table 1, under the column designated "Protocol 2".
  • Figure 4 shows the respective determination of the thrombogenic power of activated factor XI of different concentrations in a pool of normal plasma containing IgG, activated Xla in a pool of normal plasma, a pool of normal plasma containing IgG, and dilution buffer in a normal plasma pool, according to the second protocol.
  • the final concentration of the tissue factor in the reaction medium is 0.3 ⁇ M.
  • the other reaction conditions are described in Table 1, under the column designated "Protocol 2".
  • Figure 5 shows the respective determination of the thrombogenic power of activated factor IX of different concentrations in a pool of normal plasma containing IgG, activated IXa in a pool of normal plasma, a pool of normal plasma containing IgG, and dilution buffer in a normal plasma pool, according to the second protocol.
  • the final concentration of tissue factor in the medium The other reaction conditions are described in Table 1, under the column designated "Protocol 2".
  • Figure 6 shows the respective determination of the thrombogenic potency of the dilution buffer in a pool of normal plasma, activated factor XI in a pool of normal plasma containing IgG, activated factor IX in a normal plasma pool containing IgG, activated factor XI and activated factor IX in a pool of normal IgG-containing plasma, Tglelin-type immunoglobulin (LFB) in a normal plasma pool containing Clairyg® immunoglobulin (LFB) in a pool of normal plasma, immunoglobulins of the IgNG (LFB) type in a normal plasma pool, IVHEBEX® type immunoglobulins (LFB) in a pool of normal plasma.
  • the final concentration of the tissue factor in the reaction medium is 0.3 ⁇ M.
  • the other reaction conditions are described in Table 1, under the column designated "Protocol 2".
  • FIG. 7 shows the respective determination of the thrombogenic power of the calibrated plasma marketed by Stago under the name "Unicalibrator®", of the “Unicalibrator®” plasma containing the dilution buffer, of the "Unicalibrator®” plasma containing the factor Activated IX, "Unicalibrator®” plasma containing activated factor XI, "Unicalibrator®” plasma containing activated factor IX and activated factor XI, of "Unicalibrator®” plasma containing Clairyg® type immunoglobulins.
  • the final concentration of the tissue factor in the reaction medium is 0.3 ⁇ M.
  • the other reaction conditions are described in Table 1, under the column designated "Protocol 2".
  • FIG. 8 shows the respective determination of the thrombogenic power of the "Unicalibrator®” plasma containing the dilution buffer, the "Unicalibrator®” plasma containing the activated factor IX, the “Unicalibrator®” plasma containing the activated factor XI, the “Unicalibrator®” plasma containing immunoglobulins of the IgNG type.
  • the reaction medium does not contain any tissue factor.
  • the other reaction conditions are described in Table 1, under the column designated "Protocol 2".
  • FIG. 9 shows the respective determination of thrombogenic power of FXI deficient plasma, FIXa in FXI deficient plasma, FXIa in FXI deficient plasma, FIXa and FXIa in FXI deficient plasma, Clairyg® type immunoglobulins in FXI deficient plasma.
  • the final concentration of the tissue factor in the reaction medium is 0.3 ⁇ M.
  • the other reaction conditions are described in Table 1, under the column designated "Protocol 2".
  • Figure 10 shows the respective determination of the thrombogenic power of FXI deficient plasma, FIXa in FXI deficient plasma, FXIa in FXI deficient plasma, IgNG immunoglobulins in FXI deficient plasma.
  • the reaction medium does not contain any tissue factor.
  • the other reaction conditions are described in Table 1, under the column designated "Protocol 2".
  • FIG. 11 represents the respective determination of the thrombogenic power of the FIX-deficient plasma, FIXa in a FIX-deficient plasma, FIX ⁇ in a FIX-deficient plasma, IgNG-type immunoglobulins in a FIX-deficient plasma.
  • the final concentration of the tissue factor in the reaction medium is 0.3 ⁇ M.
  • the other reaction conditions are described in Table 1, under the column designated "Protocol 2".
  • FIG. 12 represents the respective determination of the thrombogenic power of FIX-deficient plasma, FIXa in a FIX-deficient plasma, FIX ⁇ in a FIX-deficient plasma, IgNG immunoglobulins in FIX-deficient plasma.
  • the reaction medium does not contain any tissue factor.
  • the other reaction conditions are described in Table 1, under the column designated "Protocol 2". FIG.
  • Figure 14A represents the determination of the respective power thrombogenic samples containing 0.3 pM tissue factor, 4 ⁇ phospho lipids, ⁇ ⁇ , of thrombogenic intravenous immunoglobulin, ⁇ , normal plasma and optionally ⁇ ⁇ ⁇ d anti-FXI.
  • FIG. 14B represents the respective determination of the thrombogenic power of the samples containing 0.3 ⁇ M of tissue factor, 4 ⁇ l of phospho lipids, ⁇ ⁇ ⁇ , intravenous thrombogenic immunoglobulin, ⁇ ⁇ , FXI deficient plasma and possibly ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ anti-FXI.
  • Figure 15 shows the study of velocity versus FXI inhibitor concentration.
  • Figure 16 shows the respective determination of the thrombogenic power of samples respectively containing 1 to 16 ng / ml FXIa diluted in a lot of 5% IgNG or in the dilution buffer of said lot of 5% IgNG.
  • FIG. 17A represents the respective determination of the thrombogenic power of the samples respectively containing from 0.5 IU / ml to 200 IU / ml of FVIIa in an FXI deficient plasma or the Clairyg® buffer (formulation buffer of Clairyg® product marketed by Laboratory LFB BIOMEDICAMENTS) in a plasma deficient in FXI.
  • FIG. 17B represents the respective determination of the thrombogenic power of the samples respectively containing from 0.5 IU / ml to 200 IU / ml of FVIIa in a normal plasma or the Clairyg® buffer in a normal plasma.
  • FIG. 18A represents the respective determination of the thrombogenic power of the samples respectively containing from 0.68 IU / ml to 5.5 IU / ml of FIXa in an FXI deficient plasma or the Clairyg® buffer in an FXI deficient plasma. .
  • Figure 18B shows the respective determination of the thrombogenic power of the samples respectively containing 0.68 IU / ml at 5.5 IU / ml of FIXa in normal plasma or Clairyg® buffer in normal plasma.
  • Example 1 Determination of the thrombogenic power of a sample
  • Protocol 1 for determining the thrombogenic power of a test sample
  • Sample preparation 1 volume of product for 8 volumes of PN or NP at 1 / 5th dilution buffer (RI).
  • Protocol 2 for determining the thrombogenic power of a test sample
  • PN Normal Plasma
  • PN Frozen Plasma Pool (internal) or Unicalibrator (Stago) Sample Preparation: 1 product flight for 4 or 8 PN flight
  • reaction mixture 500 ⁇ ⁇ MP -reagent taken up with 0.5 ml of water + 300 ⁇ ⁇ PRP -reagent + 200 ⁇ ⁇ of dilution buffer
  • the thrombogenic power of FXIa in a pool of normal plasma or in a diluted plasma pool is determined according to protocol 1 (FIG. 1) or protocol 2 (FIG. 2), respectively described above.
  • Protocol 2 carried out at low final concentration of tissue factor, makes it possible to obtain a more sensitive result than that obtained by protocol 1, using a high final concentration of tissue factor.
  • the thrombogenic provision of FXIa in a pool of normal plasma or in a diluted plasma pool is determined, according to protocol 2, in a reaction medium containing 0.3 ⁇ M of tissue factor (FIG. 2) or without tissue factor (FIG. 3). .
  • the variability of the responses obtained in the reaction medium without FT is greater than that in the reaction medium with FT. In the absence of FT, the specificity of this response that occurs at late times (> 20min) is not assured.
  • the thrombogenic power of FXIa in a calibrated commercial plasma pool is determined, according to protocol 2, in a reaction medium containing 4 ⁇ (FIG. 8) or 8 ⁇ (FIG. 13) phospholipids and without FT.
  • Example 5 Determination of the thrombogenic power of immunoglobulins of the IgNG type
  • the protocol 2 described above is used to determine the thrombogenic power related to the presence of FXIa (FIG. 4) or FIXa (FIG. 5) of immunoglobulins of the IgNG (LFB) type.
  • the thrombogenic power of FXIa or FIXa is determined, according to protocol 2, in a reaction medium respectively containing a calibrated commercial normal plasma pool (Unicalibrator®) (FIGS. 7 and 8), an FXI deficient plasma pool (FIGS. and 10), or a FIX deficient plasma pool ( Figures 11 and 12).
  • the signal discriminating capacity against a sample containing FXIa in a reaction medium containing a commercial plasma pool is not significantly different from that in an FXI deficient plasma pool (FIGS. 12, 13, 14 and 14). 15).
  • the respective thrombogenic power of immunoglobulins of Tegéline® type (LFB), immunoglobulins of Clairyg® type (LFB), immunoglobulins of IvHEBEX® type (LFB), and immunoglobulins of IgNG type (LFB), related to the presence of FXIa and / or FIXa, is determined according to protocol 2.
  • a range of human anti-FXIa monoclonal antibodies was prepared and tested in the presence of a thrombogenic Ig preparation (IgT), a normal plasma (FIG. 14A) and a FXI deficient (FIG. 14B). ).
  • FIG. 15 shows the velocity parameter as a function of the doses of anti FXIa antibodies, in normal plasma and in FXIa deficient plasma.
  • the inhibition is maximal for the dose of 100 ⁇ g / ml of antibody at the two dilutions of Ig tested.
  • the thrombogram obtained has a velocity lower than that of the dilution buffer tested alone in normal plasma, the activated FXI from the plasma being also inhibited.
  • Figure 16 shows that the thrombin generation profiles do not differ significantly in the presence or absence of immunoglobulin. The absence of inhibitory effect related to immunoglobulins is demonstrated, even for very low concentrations of FXIa, of the order of ng / ml. EXAMPLE 10 Determination of Thrombogenic Power of Factor VIIa
  • FIG. 17A and FIG. 17B show that the use of the kit of the present invention containing an FXIa deficient human blood plasma makes it possible to give a better sensitivity to the possible presence of factor VIIa in a test sample compared to that obtained with a normal plasma.
  • FIG. 18A and FIG. 18B show that the use of the kit of the present invention containing a FXI deficient human blood plasma makes it possible to give a better sensitivity to the possible presence of factor IXa in a test sample compared with that obtained with a normal plasma.

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Abstract

La présente invention l'utilisation d'un kit pour la détermination du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un produit bio logiquement acceptable. La présente invention concerne également un procédé permettant de déterminer le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur XI activé et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur XII activé, et/ou du facteur VII activé et/ou du facteur X activé dans un échantillon susceptible d'être administré chez des humains.

Description

DETERMINATION DU POUVOIR THROMBOGENE
D'IMMUNOGLOBULINES HUMAINES
La présente invention concerne la détermination du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester.
Les immunoglobulines humaines, contenant essentiellement des IgG, sont utilisées couramment dans la thérapie des pathologies telles que l'immunodéficience ou des maladies auto-immunes et particulièrement par voie intraveineuse (IvIG).
Néanmoins, selon l'observation clinique, l'utilisation des IvIG chez des patients entraîne parfois des effets secondaires graves, comme par exemple des accidents thrombo -embo liques .
Une thrombose embolique consiste en la formation d'un thrombus obturant un vaisseau sanguin. Le thrombus peut se développer dans la circulation veineuse et donner lieu à une thrombose veineuse, ou dans la circulation artérielle et entraîner une occlusion artérielle avec ischémie voire infarctus. Un thrombus résulte de la coagulation sanguine, par l'agrégation plaquettaire et l'activation du système de coagulation, ceci étant une réaction en chaîne qui met en jeu les plaquettes et les facteurs de la coagulation. Un thrombus contient essentiellement de la fibrine, une protéine insoluble, formée à partir du fîbrinogène.
Les facteurs XI et IX font partie des facteurs intervenant dans la coagulation sanguine par voie intrinsèque. Le facteur IX est activé par le facteur XI activé, ce dernier étant lui-même activé par le facteur XII activé. Cette cascade d'activation aboutit finalement à la formation du fîbrinogène (FI).
Les études de la Demanderesse présentées dans la présente demande ont permis de montrer que la présence des facteurs de coagulation, tels que le facteur VII, le facteur IX, le facteur XI, le facteur XII ou le facteur X et/ou leurs formes activées dans un produit d'immunoglobuline humaine, tel que les IvIG, pourrait être la cause d'accidents thrombo-embo liques après l'injection des IvIG chez des patients.
Par conséquent, il y a une grande nécessité à mettre à disposition un procédé fiable et sensible permettant de déterminer la présence de facteur VII activé, de facteur XI activé, de facteur IX activé, de facteur XII activé et/ou de facteur X activé dans un produit bio logiquement acceptable contenant des immunoglobulines. Le test de génération de thrombine (TGT) est connu de l'homme du métier. Le principe de ce test concerne l'analyse de la cinétique de la formation de thrombine qu'un plasma donné produit en réponse à une stimulation standardisée.
Parmi les TGT développés à ce jour, la thromboélastographie consiste à mesurer les propriétés physiques d'un sang total en analysant de manière mécanique la formation du caillot en fonction du temps. Selon les paramètres extraits d'un graphique (appelé thromboélastogramme) généré par le thromboélastographe, on peut évaluer l'aptitude à la coagulation d'un patient.
Par ailleurs, Hemker et al. proposent en 2002 le concept de thrombinographie permettant de mesurer la génération de thrombine par fluorométrie (Pathophysiol Haemost thromb 2002 ; 32 : 249-53). La thrombinographie consiste à utiliser un calibrateur de thrombine et un substrat fluorescent spécifique en plasma pauvre en plaquettes ou en plasma riche en plaquettes, afin d'établir un thrombinogramme. Un signal induit par la thrombine générée par le facteur tissulaire est confronté au signal généré par une quantité normalisée de thrombine exogène dans ce même plasma.
La Demanderesse de la présente demande a trouvé de manière surprenante qu'un test de génération de thrombine permet également de déterminer la présence de FVII, de FXI, de FIX, de FXII, de FX et/ou de leurs formes activées dans un échantillon.
La présente invention a pour l'objectif de fournir un kit pour la détermination du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un produit bio logiquement acceptable.
La présente invention a également pour l'objectif de fournir un procédé permettant de déterminer le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé, XI activé, du facteur IX activé, du facteur XII activé et/ou du facteur X activé dans un échantillon susceptible d'être administré chez des humains.
Le premier aspect de l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant les éléments suivants:
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes,
- des phospholipides,
- du CaCl2, et éventuellement
- du facteur tissulaire humain, pour déterminer le pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester, notamment bio logiquement acceptable, lesdits éléments du kit et l'échantillon à tester lorsqu'ils sont mélangés formant un milieu réactionnel. Le deuxième aspect de l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant les éléments suivants:
- un plasma sanguin humain déficient en facteur XI,
- des phospholipides,
- du CaCl2, et éventuellement
- du facteur tissulaire humain,
pour déterminer le pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester, notamment bio logiquement acceptable, lesdits éléments du kit et l'échantillon à tester lorsqu'ils sont mélangés formant un milieu réactionnel. On entend par « plasma sanguin humain déficient en facteur XI », un plasma sanguin humain contenant moins de 1% (essais fonctionnels et antigéniques) de la quantité normale de facteur XI et de facteur XI activé.
Un plasma sanguin déficient en facteur XI est préparé par immuno-adsorption tel que le plasma déficient en facteur XI commercialisé par la société Cryopep.
On entend par « Immunoglobulines humaines » ou « IgG humaines » dans le cadre de l'invention, des immunoglobulines polyvalentes qui sont essentiellement des IgG, incluant éventuellement des IgM. Il peut s'agir d'immunoglobulines entières, ou de fragments tels que F(ab')2 ou F(ab) et toute fraction intermédiaire obtenue au cours du procédé de fabrication des immunoglobulines polyvalentes.
Dans le cadre de l'invention, on entend par « pouvoir thrombogène », la capacité d'immunoglobulines humaines à déclencher une coagulation et former un thrombus chez des patients. Par conséquent, une « préparation d'immunoglobulines thrombogène » est une préparation d'immunoglobulines ayant la capacité d'induire une coagulation et former un thrombus chez des patients.
Etant donné que les facteurs de coagulation sont naturellement présents dans les plasmas humains, le pouvoir thrombogène d'immunoglobulines est un index relatif par rapport à la coagulation sanguine pouvant être déclenchée naturellement chez des patients. On entend un échantillon « bio logiquement acceptable », un échantillon susceptible d'être administré chez les humains par voix intraveineuse, parentérale, ou intramusculaire. Il peut s'agir notamment de préparations d'immunoglobulines humaines à visée thérapeutique.
Par « préparations d'immunoglobulines humaines à visée thérapeutique » on entend tout médicament comprenant des immunoglobulines humaines sous une forme pharmaceutiquement acceptable. Il peut s'agir notamment d'IvIG.
L'utilisation du kit selon la présente invention permet d'établir un thrombmogramme pour l'échantillon à tester. Un thrombmogramme est représenté par une courbe de génération de thrombine caractérisée par plusieurs paramètres :
- Le Temps de latence ou Lagtime (en minutes) qui est corrélé au temps de coagulation
- L'aire sous le pic ou ETP (Endogenous Thrombin Potential, en nM x min), directement corrélée à la quantité totale de thrombine générée
- La hauteur de pic ou Peak (en nM), représentant la quantité maximale de thrombine présente dans l'échantillon au cours de la lecture
- Le Temps au pic ou Time to peak : ttPeak (en minutes), qui est le temps permettant d'atteindre le sommet du pic
- La Vélocité : Peak/(ttPeak-Lagtime) (en nM/min), représentative de la vitesse de formation de la thrombine.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant les éléments suivants:
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI,
- des phospholipides,
- du CaC12, et éventuellement
- du facteur tissulaire humain,
pour déterminer le pouvoir thrombogène, lié à la présence notamment du facteur VII, du facteur XI, du facteur IX, du facteur X et/ou de leurs formes activées, d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester, notamment bio logiquement acceptable, lesdits éléments du kit et l'échantillon à tester formant un milieu réactionnel. Encore plus avantageusement, l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant les éléments suivants:
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes,
- des phospholipides,
- du CaC12, et éventuellement
- du facteur tissulaire humain,
pour déterminer le pouvoir thrombogène, lié à la présence notamment du facteur XII et/ou de sa forme activée, d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester, notamment bio logiquement acceptable, lesdits éléments du kit et l'échantillon à tester formant un milieu réactionnel.
Par « plasma sanguin humain déficient en facteur XI et pauvre en plaquettes », on entend un plasma sanguin humain contenant moins de 1% (essais fonctionnels et antigéniques) de la quantité normale de facteur XI et moins de ΙΟχ 109 plaquettes/L de plasma.
Un plasma sanguin pauvre en plaquettes est préparé selon une méthode connue de l'homme du métier telle que la centrifugation.
Par « facteur VII activé » ou « FVIIa », on entend une protéine de FVII capable d'activer le facteur IX ou le facteur X.
Par « facteur XII activé » ou « FXIIa », on entend une protéine de FXII capable d'activer le facteur XI.
Par « facteur XI activé » ou « FXIa », on entend une protéine constituée de deux sous-unités de 80 kDa, liées entre elle par un pont disulfure à la position Cys-321 et capable de reconnaître son substrat naturel : FIX.
Par « facteur IX activé » ou « FIXa », on entend une protéine de FIX capable de reconnaître son substrat naturel : FX.
Par « facteur X activé » ou « FXa », on entend une protéine de FX capable de reconnaître son substrat naturel la prothrombine.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne l'utilisation d'un kit selon l'invention comprenant en outre un tampon de dilution tel qu'un tampon physiologique Tris NaCl ou un tampon identique à celui de l'échantillon à tester. Il s'agit alors d'un tampon de formulation acceptable pour une préparation d'immunoglobulines à visée thérapeutique.
L'échantillon de plasma sanguin humain contenu dans le kit et le tampon de dilution forment un témoin négatif.
Dans un mode de réalisation particulier, le kit selon l'invention comprend en outre un substrat fluorogénique ou flurorescent.
Le plasma sanguin humain est prélevé chez des donneurs volontaires sains ne présentant pas de maladies graves, et contient tous les facteurs de la coagulation, en taux normal, intervenant dans la coagulation sanguine par voie intrinsèque.
Dans un mode de réalisation avantageux, le plasma sanguin humain est un pool de plasmas sanguins humains frais ou congelé ou un plasma sanguin commercial calibré.
Le plasma sanguin utilisé dans l'invention peut contenir ou être dépourvu de facteur tissulaire.
Dans un mode de réalisation avantageux, le plasma sanguin humain est dépourvu de facteur tissulaire.
Dans un mode de réalisation avantageux, le facteur tissulaire humain du kit est d'origine plasmatique, d'origine recombinante, ou d'origine transgénique.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant :
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en FXI, dont le volume représente de 80% à 40%>, notamment de 75% à 50%>, particulièrement 53% du volume du milieu réactionnel.
- des phospholipides humains, dont la concentration finale dans le milieu réactionnel est de 1 μΜ à 10 μΜ, particulièrement 4 μΜ,
- du facteur tissulaire humain, dont la concentration finale dans le milieu réactionnel est de 0,05 pM à 10 pM, particulièrement 0,3 pM,
- du CaC12.
Ledit kit peut comprendre en outre un tampon de dilution, notamment du tampon Tris NaCl.
Dans un mode de réalisation avantageux, le ratio entre le volume du plasma sanguin et celui de l'échantillon à tester est de 8: 1 à 2: 1, particulièrement 4: 1. Le ratio de 8: 1 à 2: 1 correspond aux conditions d'injection de l'immunoglobuline au patient. Le ratio de 4: 1 est physio logiquement significatif pour une concentration en Ig de 5%. Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de mesure du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester notamment bio logiquement acceptable.
Ledit procédé comprend les étapes suivantes :
a) le mélange du tampon de dilution, notamment du tampon Tris NaCl, avec un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes pour former un témoin négatif intermédiaire ;
b) le mélange d'un échantillon à tester avec le plasma sanguin humain pauvre en plaquettes pour former un milieu réactionnel intermédiaire ;
c) l'ajout dans le milieu réactionnel intermédiaire obtenu à l'étape précédente et dans le témoin négatif intermédiaire obtenu à l'étape a) d'un mélange comprenant des phospho lipides, du CaC12, et éventuellement du facteur tissulaire humain, pour former un milieu réactionnel et un témoin négatif ;
d) l'obtention d'un premier thrombinogramme en effectuant un test de génération de thrombine sur le milieu réactionnel obtenu à l'étape c) et d'un second thrombinogramme en effectuant un test de génération de thrombine sur le témoin négatif obtenu à l'étape c) ;
e) la comparaison d'au moins l'un des paramètres de chacun des thrombinogrammes obtenus de l'étape d) à un paramètre homologue obtenu à partir de thrombinogrammes standards établis sur la base d'une série de calibrateurs dont le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé et/ou du facteur XI activé et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur XII activé et/ou du facteur X activé est connu et varie entre chaque calibrateur ;
f) la déduction de l'étape e) du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans l'échantillon à tester.
Dans un mode de réalisation particulier, le plasma sanguin humain pauvre en plaquettes est déficient en facteur XI. Dans un mode réalisation particulier, le thrombinogramme standard est obtenu en effectuant un test de génération de thrombine sur un milieu réactionnel comprenant i) un calibrateur dont le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé et/ou du facteur XI activé et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur XII activé et/ou du facteur X activé est connu, ii) un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et éventuellement déficient en facteur XI , iii) un mélange réactionnel comprenant des phopho lipides, du CaCl2 et éventuellement le facteur tissulaire humain. Le calibrateur est utilisé par le logiciel pour effectuer des corrections des signaux bruts et permet de palier à certains inconvénients de la fluorescence et de transformer le signal initialement en Unités de fluorescence par minute directement en nanomolaires de thrombine.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la concentration finale du facteur tissulaire humain dans le milieu réactionnel est de 0,05 pM à 10 pM, particulièrement 0,3 pM. Le facteur tissulaire et le FVIIa forment un complexe pour activer des facteurs IX et X au niveau de la voie exogène de la coagulation.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la concentration finale des phospho lipides humains dans le milieu réactionnel est de 1 μΜ à 10 μΜ, particulièrement 4 μΜ.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le volume du plasma sanguin représente de 80% à 40%, notamment de 75% à 50%, particulièrement 53% du volume du milieu réactionnel.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le ratio entre le volume du plasma sanguin et celui de l'échantillon est de 8: 1 à 2: 1, particulièrement 4: 1.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le thrombinogramme est obtenu par la méthode de la thromboélastographie ou la méthode de thrombinographie.
La thromboélastographie peut être mise en œuvre selon la méthode connue de l'homme du métier, telle que décrite par Savry et al. (Ann Fr Anesth Reanim 2005 ; 24 :607-16).
La thrombinographie peut être mise en œuvre selon la méthode connue de l'homme du métier, telle que décrite par Hemker et al. (Pathophysiol Haemost thromb 2002 ; 32 : 249-53).
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes : a) le mélange du tampon de dilution d'un échantillon à tester avec un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI pour former un témoin négatif intermédiaire;
b) le mélange d'un échantillon avec un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI représentant 53% du volume du milieu réactionnel, dans lequel le ratio entre le volume du plasma sanguin et celui de l'échantillon est de 8:1 à 2: 1 , particulièrement 4: 1 pour former un milieu réactionnel intermédiaire ;
c) l'ajout dans le milieu réactionnel intermédiaire obtenu à l'étape précédente et dans le témoin négatif intermédiaire obtenu à l'étape a) d'un mélange comprenant 4μΜ des phopho lipides, et 3pM de facteur tissulaire humain et du CaC12, pour former un milieu réactionnel et un témoin négatif;
d) l'obtention de deux thrombinogrammes par la mise en œuvre de thrombinographie, en effectuant un test de génération de thrombine sur le milieu réactionnel et sur le témoin négatif obtenus à l'étape c) ;
e) la comparaison d'au moins l'un des paramètres de chacun des thrombinogrammes obtenu à l'étape d) à un paramètre homologue obtenu à partir de thrombinogrammes standards établis sur la base d'une série de calibrateurs dont le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé et/ou du facteur XI activé et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur X activé est connu et varie entre chaque calibrateur ;
f) la déduction de l'étape e) du pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII, du facteur XI, du facteur IX, du facteur X et/ou de leur forme activée dans l'échantillon.
La présente invention est illustrée davantage par les figures et les exemples ci- dessous. Ces figures et exemples représentant les modes de réalisation particuliers de l'invention, ne visent en aucun cas à limiter la portée de l'invention.
Figures Figure 1 : la figure 1 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du facteur XI activé dans un pool de plasma normal, ou un pool de plasma normal dilué (1/9), du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, ou un pool de plasma normal dilué (1/9) respectivement, selon le premier protocole. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 20 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée « Protocole 1 ».
Figure 2 : la figure 2 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du facteur XI activé dans un pool de plasma normal, ou du FXIa dans un pool de plasma normal dilué (1/9), et du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, ou du tampon de dilution dans un pool de plasma normal dilué (1/9), selon le deuxième protocole. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée « Protocole 2 ».
Figure 3 : la figure 3 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du facteur XI activé dans un pool de plasma normal, du FXI dans un pool de plasma normal dilué (1/9), du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, ou du tampon de dilution dans un pool de plasma normal dilué (1/9), selon le deuxième protocole. Le milieu réactionnel ne contient pas de facteur tissulaire. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée « Protocole 2 ». Figure 4 : la figure 4 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du facteur XI activé de concentrations différentes dans un pool de plasma normal contenant IgG, du Xla activé dans un pool de plasma normal, d'un pool de plasma normal contenant IgG, et du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, selon le deuxième protocole. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée « Protocole 2 ».
Figure 5 : la figure 5 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du facteur IX activé de concentrations différentes dans un pool de plasma normal contenant IgG, du IXa activé dans un pool de plasma normal, d'un pool de plasma normal contenant IgG, et du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, selon le deuxième protocole. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 M. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée « Protocole 2 ».
Figure 6 : la figure 6 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, du facteur XI activé dans un pool de plasma normal contenant IgG, du facteur IX activé dans un pool plasma normal contenant IgG, du facteur XI activé et du facteur IX activé dans un pool de plasma normal contenant IgG, des immunoglobulines de type Tégéline® (LFB) dans un pool de plasma normal contenant, des immunoglobulines de type Clairyg® (LFB) dans un pool de plasma normal, de des immunoglobulines de type IgNG (LFB) dans un pool de plasma normal, des immunoglobulines de type IVHEBEX® (LFB) dans un pool de plasma normal. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée « Protocole 2 ».
Figure 7 : la figure 7 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du plasma calibré commercialisé par la société Stago sous le nom « Unicalibrator® », du plasma « Unicalibrator® » contenant le tampon de dilution, du plasma « Unicalibrator® » contenant le facteur IX activé, du plasma « Unicalibrator® » contenant le facteur XI activé, du plasma « Unicalibrator® » contenant le facteur IX activé et le facteur XI activé, du plasma « Unicalibrator® » contenant des immunoglobulines de type Clairyg®. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée « Protocole 2 ».
Figure 8 : la figure 8 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du plasma « Unicalibrator® » contenant le tampon de dilution, du plasma « Unicalibrator® » contenant le facteur IX activé, du plasma « Unicalibrator® » contenant le facteur XI activé, du plasma « Unicalibrator® » contenant des immunoglobulines de type IgNG. Le milieu réactionnel ne contient pas de facteur tissulaire. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée « Protocole 2 ». Figure 9 : la figure 9 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du plasma déficient en FXI, du FIXa dans un plasma déficient en FXI, du FXIa dans un plasma déficient en FXI, du FIXa et du FXIa dans un plasma déficient en FXI, de des immunoglobulines de type Clairyg® dans un plasma déficient en FXI. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée « Protocole 2 ».
Figure 10 : la figure 10 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du plasma déficient en FXI, du FIXa dans un plasma déficient en FXI, du FXIa dans un plasma déficient en FXI, des immunoglobulines de type IgNG dans un plasma déficient en FXI. Le milieu réactionnel ne contient pas de facteur tissulaire. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée « Protocole 2 ».
Figure 11 : la figure 11 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du plasma déficient en FIX, du FIXa dans un plasma déficient en FIX, du FIXa dans un plasma déficient en FIX, des immunoglobulines de type IgNG dans un plasma déficient en FIX. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée « Protocole 2 ».
Figure 12 : la figure 12 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du plasma déficient en FIX, du FIXa dans un plasma déficient en FIX, du FIXa dans un plasma déficient en FIX, des immunoglobulines de type IgNG dans un plasma déficient en FIX. Le milieu réactionnel ne contient pas de facteur tissulaire. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée « Protocole 2 ». Figure 13 : la figure 13 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du tampon de dilution dans le plasma « Unicalibrator® », du FXIa dans le plasma « Unicalibrator® », des immunoglobulines de type Tégéline dans le plasma « Unicalibrator® », des immunoglobulines de type Clairyg dans le plasma « Unicalibrator® », des immunoglobulines de type IVhebex dans le plasma « Unicalibrator® », des immunoglobulines de type IgNG 10% dans le plasma « Unicalibrator®», des immunoglobulines de type IgNG 5% dans le plasma « Unicalibrator®». Le milieu réactionnel ne contient pas de facteur tissulaire. La concentration finale des phospho lipides dans le milieu réactionnel est 8μΜ. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1 , sous la colonne désignée « Protocole 2 ».
Figure 14A : la figure 14 A représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant 0,3 pM de facteur tissulaire, 4μΜ de phospho lipides, Ι ΟμΙ, d'immunoglobuline intraveineuse thrombogène, θμΐ, de plasma normal et éventuellement Ι ΟμΙ^ d'anti-FXI.
Figure 14B : la figure 14 B représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant 0,3 pM de facteur tissulaire, 4μΜ de phospho lipides, Ι ΟμΙ, d'immunoglobuline intraveineuse thrombogène, θμΐ, de plasma déficient en FXI et éventuellement Ι ΟμΙ^ d'anti-FXI.
Figure 15 : la figure 15 représente l'étude de la vélocité en fonction de la concentration en inhibiteur du FXI.
Figure 16 : la figure 16 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant respectivement de 1 à 16ng/ml de FXIa dilués dans un lot d'IgNG 5% ou dans le tampon de dilution dudit lot d'IgNG 5%.
Figure 17A : la figure 17A représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant respectivement de 0,5UI/ml à 200UI/ml de FVIIa dans un plasma déficient en FXI ou le tampon Clairyg® (tampon de formulation du produit Clairyg® commercialisé par le Laboratoire LFB BIOMEDICAMENTS) dans un plasma déficient en FXI.
Figure 17B : la figure 17B représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant respectivement de 0,5UI/ml à 200UI/ml de FVIIa dans un plasma normal ou le tampon Clairyg® dans un plasma normal. Figure 18A : la figure 18A représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant respectivement de 0,68 Ul/ml à 5,5 Ul/ml de FIXa dans un plasma déficient en FXI ou le tampon Clairyg® dans un plasma déficient en FXI.
Figure 18B : la figure 18B représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant respectivement de 0,68 Ul/ml à 5,5 Ul/ml de FIXa dans un plasma normal ou le tampon Clairyg® dans un plasma normal.
Exemples
Exemple 1 : détermination du pouvoir thrombogène d'un échantillon
Protocole 1 pour déterminer le pouvoir thrombogène d'un échantillon à tester
Equipement: système CAT (Stago) Réactifs: Stago
Plasma Normal : pool de Plasma congelé (interne)
Préparation des échantillons: 1 volume de produit pour 8 volumes de PN ou de PN au l/5ème en Tampon de dilution (RI).
Conditions expérimentales:
- 80 Préparation. +20 PPP-reagent High (4 μΜ phospholipides et 20 pM
FT final)
- 20 FluCa-reagent ajoutés par l'appareil
Fluorescence: λ excitation = 390 nm, λ émission = 460 nm
Protocole 2 pour déterminer le pouvoir thrombogène d'un échantillon à tester
Equipement : Fuoroscan / système CAT (Stago) Réactifs: Stago
Plasma Normal (PN): Pool de Plasma congelé (interne) ou Unicalibrator (Stago) Préparation des échantillons: 1 vol de produit pour 4 ou 8 vol de PN
mélange réactionnel : 500 μΐ^ MP -reagent repris avec 0,5mL d'eau + 300 μΐ^ PRP -reagent + 200 μΐ^ de tampon de dilution
Conditions expérimentales: 80 Préparation
20 mélange réactionnel (4 μΜ phospho lipides et 0,3 pM FT final)
20 FluCa-reagent ajoutés par l'appareil
Fluorescence: λ excitation = 390 nm, λ émission = 460 nm
Les conditions de réactions selon le protocole 1 ou le protocole 2 sont résumés dans le tableau ci-dessous.
Figure imgf000016_0001
Exemple 2 : Concentration finale du facteur tissulaire
Le pouvoir thrombogène du FXIa dans un pool de plasma normal ou dans un pool de plasma dilué est déterminé selon le protocole 1 (Figure 1) ou le protocole 2 (Figure 2), respectivement décrits ci-dessus.
Le protocole 2, effectué en faible concentration finale du facteur tissulaire, permet d'obtenir un résultat plus sensible que celui obtenu par le protocole 1, utilisant une forte concentration finale du facteur tissulaire.
Exemple 3 : Présence du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel
Le pourvoir thrombogène du FXIa dans un pool de plasma normal ou dans un pool de plasma dilué est déterminé, selon le protocole 2, dans un milieu réactionnel contenant 0,3 pM du facteur tissulaire (Figure 2) ou sans facteur tissulaire (Figure 3). La variabilité des réponses obtenues dans le milieu réactionnel sans FT est plus importante que celle dans le milieu réactionnel avec FT. En l'absence de FT, La spécificité de cette réponse qui intervient à des temps tardifs ( >20min) n'est pas assurée.
Exemple 4 : Concentration finale des phospholipides
Le pouvoir thrombogène du FXIa dans un pool de plasma commercial calibré (Unicalibrator®, Stago) est déterminé, selon le protocole 2, dans un milieu réactionnel contenant 4μΜ (Figure 8) ou 8μΜ (Figure 13) des phospholipides et sans FT.
II ressort que l'augmentation de la concentration en phospholipides de 4 μΜ à 8 μΜ en absence de facteur tissulaire n'a pas permis de stabiliser les réponses.
Exemple 5 : Détermination du pouvoir thrombogène des immunoglobulines de type IgNG
Le protocole 2 décrit ci-dessus est mis en œuvre pour déterminer le pouvoir thrombogène lié à la présence du FXIa (Figure 4) ou du FIXa (Figure 5) des immunoglobulines de type IgNG (LFB).
Le signal de l'apparition de la thrombine dans l'échantillon contenant seulement des immunglobulines de type IgNG est apparu quasiment en même temps que celui de l'apparition de la thrombine dans l'échantillon contenant le tampon de dilution. Il ressort que les immunoglobulines de type IgNG ne contient quasiment pas du FXIa ou FIXa.
Exemple 6 : Origine du pool de plasma sanguin
Le pouvoir thrombogène du FXIa ou du FIXa est déterminé, selon le protocole 2, dans un milieu réactionnel contenant respectivement un pool de plasma normal commercial calibré (Unicalibrator®) (Figures 7 et 8), un pool de plasma déficient en FXI (Figures 9 et 10), ou un pool de plasma déficient en FIX (Figures 11 et 12).
La capacité discriminant du signal vis-à-vis d'un échantillon contenant FXIa dans un milieu réactionnel contenant un pool de plasma commercial n'est pas signifïcativement différente de celle dans un pool de plasma déficient en FXI (Figures 12, 13, 14 et 15).
Il ressort que les modifications observées entre les résultats obtenus dans les milieux réactionnels contenant de différentes origines de pool de plasma sont très faibles. Exemple 7 : Pouvoir thrombogène de différentes immunoglobulines
Le pouvoir thrombogène respectif des immunoglobulines de type Tégéline® (LFB), des immunoglobulines de type Clairyg® (LFB), des immunoglobulines de type IvHEBEX® (LFB), et des immunoglobulines de type IgNG (LFB), lié à la présence du FXIa et/ou du FIXa, est déterminé, selon le protocole 2.
Les résultats sont illustrés par la figure 6.
Exemple 8 : Inhibition du potentiel FXIa de préparation d'Ig thrombogène
Une gamme d'anticorps monoclonal anti-FXIa humain, de 20 à 400 μg/ml a été réalisée et testée en présence de préparation d'Ig thrombogène (IgT), en plasma normal (figure 14 A) et déficient en FXI (figure 14B).
Il a été observé une inhibition du potentiel thrombogène de l'Ig testée pure en fonction des doses croissantes en anticorps anti-FXI. L'inhibition n'est pas totale à la concentration la plus élevée en anti FXIa de 400 μg/ml.
Afin de limiter la consommation de l'anticorps, le même essai a été refait sur le même lot d'immunoglobuline diluée au 1/10 et au 1/30. Les mêmes doses d'anticorps ont été testées de 20 à 400 μg/ml.
Dans ces conditions, on observe une inhibition totale du FXIa exogène (immunoglobuline) et du FXIa issu du zymogène FXI dans le cas du plasma normal : un phénomène de plateau est observé.
La figure 15 présente le paramètre de vélocité en fonction des doses d'anticorps anti FXIa, en plasma normal et en plasma déficient en FXIa.
En plasma normal, l'inhibition est maximale pour la dose de 100 μg/ml d'anticorps aux 2 dilutions d'Ig testées. Dans ce cas, le thrombinogramme obtenu présente une vélocité inférieure à celle du tampon de dilution testé seul en plasma normal, le FXI activé issu du plasma étant également inhibé.
En plasma déficient en FXI et FXI a, l'inhibition est complète pour une dose plus faible de 50 μg/ml d'anticorps. Dans ce cas, on retrouve une vélocité comparable à celle du tampon de dilution seul en plasma déficient en FXI et FXIa. Ce résultat montre que le FXIa exogène est pour ce lot le seul responsable de l'augmentation du potentiel thrombique.
Ces résultats démontrent que : • Le pic de génération de thrombine observé pour la préparation d'Ig thrombogène testé est bien lié à la présence de FXIa.
• L'utilisation d'un test sensible au FXIa pour l'étude du potentiel thrombique de lots d'immunoglobulines est pertinente.
Exemple 9 : Recherche d'un éventuel effet inhibiteur sur la génération de thrombine : environnement protéique
Les lots d'immunoglobulines étant fortement concentrés (50 g/1), il a été vérifié que cet environnement n'avait pas un impact (effet inhibiteur) sur la génération de thrombine. Un tel phénomène conduirait en effet à conclure à un résultat faussement négatif.
Une gamme de FXIa de 1 à 15 ng/ml a été réalisée (figure 16) ; les dilutions ont été faites en parallèle dans un lot d'IgNG 5% (courbes FXIa + IgNG) et dans le tampon de formulation d'IgNG 5% (courbes FXIa + Tp).
La figure 16 montre que les profils de génération de thrombine ne diffèrent pas signifîcativement en présence ou en absence d'immunoglobuline. L'absence d'effet inhibiteur lié aux immunoglobulines est démontrée, même pour des concentrations très faibles de FXIa, de l'ordre du ng/ml. Exemple 10 : Détermination du pouvoir thrombogène du facteur Vlla
La figure 17A et la figure 17B montrent que l'utilisation du kit de la présente invention contenant un plasma sanguin humain déficient en FXIa permet de donner une meilleure sensibilité à la présence éventuelle du facteur Vlla dans un échantillon à tester par rapport à celle obtenue avec un plasma normal.
Exemple 11 : Détermination du pouvoir thrombogène du facteur IXa
La figure 18A et la figure 18B montrent que l'utilisation du kit de la présente invention contenant un plasma sanguin humain déficient en FXI permet de donner une meilleure sensibilité à la présence éventuelle du facteur IXa dans un échantillon à tester par rapport à celle obtenue avec un plasma normal.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un kit comprenant les éléments suivants:
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes,
- des phospholipides,
- du CaCl2, et éventuellement
- du facteur tissulaire humain, et éventuellement
- un tampon de dilution, notamment du tampon Tris-NaCl
pour déterminer le pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester, notamment bio logiquement acceptable, lesdits éléments du kit et l'échantillon à tester lorsqu'ils sont mélangés formant un milieu réactionnel.
2. Utilisation d'un kit comprenant les éléments suivants:
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI,
- des phospholipides,
- du CaCl2, et éventuellement
- du facteur tissulaire humain, et éventuellement
- un tampon de dilution, notamment du tampon Tris-NaCl
pour déterminer le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII, du facteur XI, du facteur IX, du facteur X et/ou de leurs formes activés dans un échantillon à tester, notamment bio logiquement acceptable, lesdits éléments du kit et l'échantillon à tester formant un milieu réactionnel.
3. Utilisation d'un kit selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le tampon de dilution dudit kit est identique à celui de l'échantillon à tester.
4. Utilisation d'un kit selon l'une des revendications 1 à 3, ledit kit comprenant en outre un substrat fluorogénique.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, d'un kit comprenant :
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et éventuellement déficient en FXI dont le volume représente de 80% à 40%, notamment de 75% à 50%, particulièrement 53% du volume du milieu réactionnel. - des phospholipides humains, dont la concentration finale dans le milieu réactionnel est de 1 μΜ à 10 μΜ, particulièrement 4 μΜ,
- du facteur tissulaire humain, dont la concentration finale dans le milieu réactionnel est de 0,05 pM à 10 pM, particulièrement 0,3 pM,
- du CaCl2.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle le ratio entre le volume du plasma sanguin et celui de l'échantillon à tester est de 8: 1 à 2: 1, particulièrement 4: 1.
7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle le facteur tissulaire humain du kit est d'origine plasmatique, d'origine recombinante, ou d'origine transgénique.
8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle le plasma sanguin humain est un pool de plasmas sanguins humains frais ou congelé ou un plasma sanguin commercial calibré.
9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, dans laquelle le plasma sanguin humain est dépourvu de facteur tissulaire.
10. Procédé de mesure du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester notamment bio logiquement acceptable, comprenant les étapes suivantes :
a) le mélange du tampon de dilution, notamment du tampon Tris NaCl, avec un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes pour former un témoin négatif intermédiaire, b) le mélange d'un échantillon à tester avec le plasma sanguin humain pauvre en plaquettes pour former un milieu réactionnel intermédiaire,
c) l'ajout dans le milieu réactionnel intermédiaire obtenu à l'étape précédente et dans le témoin négatif intermédiaire obtenu à l'étape a) d'un mélange comprenant des phopho lipides, du CaCl2, et éventuellement le facteur tissulaire humain, pour former un milieu réactionnel et un témoin négatif ;
d) l'obtention d'un premier thrombinogramme en effectuant un test de génération de thrombine sur le milieu réactionnel obtenu à l'étape c) et d'un second thrombinogramme en effectuant un test de génération de thrombine sur le témoin négatif obtenu à l'étape c) ;
e) la comparaison d'au moins l'un des paramètres de chacun des thrombinogrammes obtenu de l'étape d) à un paramètre homologue obtenu à partir de thrombinogrammes standards établis sur la base d'une série de calibrateurs dont le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé et/ou du facteur XI activé et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur XII activé et/ou du facteur X activé est connu et varie entre chaque calibrateur ;
f) la déduction de l'étape e) du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans l'échantillon à tester.
11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel le thrombinogramme standard est obtenu en effectuant un test de génération de thrombine sur un milieu réactionnel comprenant i) un calibrateur dont le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé, et/ou du facteur XI activé et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur XII activé et/ou du facteur X activé est connu, ii) un plasma sanguin humain, iii) un mélange réactionnel comprenant des phopholipides et éventuellement le facteur tissulaire humain.
12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, dans lequel la concentration finale du facteur tissulaire humain dans le milieu réactionnel est de 0,05 pM à 10 pM, particulièrement 0,3 pM.
13. Procédé selon l'une des revendications 10 à 12, dans lequel la concentration finale des phospho lipides humains dans le milieu réactionnel est de 1 μΜ à 10 μΜ, particulièrement 4 μΜ.
14. Procédé selon l'une des revendications 10 à 13, dans lequel le volume du plasma sanguin représente de 80% à 40%>, notamment de 75% à 50%>, particulièrement 53% du volume du milieu réactionnel.
15. Procédé selon l'une des revendications 10 à 14, dans lequel le ratio entre le volume du plasma sanguin et celui de l'échantillon est de 8: 1 à 2: 1, particulièrement 4: 1.
16. Procédé selon l'une des revendications 10 à 15, dans lequel le thrombinogramme est obtenu par la méthode de la thromboélastographie ou la méthode de thrombinographie.
17. Procédé de mesure du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester notamment bio logiquement acceptable, comprenant les étapes suivantes :
a) le mélange du tampon de dilution d'un échantillon à tester avec un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI pour former un témoin négatif intermédiaire;
b) le mélange d'un échantillon avec un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI représentant 53% du volume du milieu réactionnel, dans lequel le ratio entre le volume du plasma sanguin et celui de l'échantillon est de 8:1 à 2: 1 , particulièrement 4: 1 pour former un milieu réactionnel intermédiaire ;
c) l'ajout dans le milieu réactionnel intermédiaire obtenu à l'étape précédente et dans le témoin négatif intermédiaire obtenu à l'étape a) d'un mélange comprenant 4μΜ des phopho lipides, et 3pM de facteur tissulaire humain et du CaC12, pour former un milieu réactionnel et un témoin négatif;
d) l'obtention de deux thrombinogrammes par la mise en œuvre de thrombinographie, en effectuant un test de génération de thrombine sur le milieu réactionnel et sur le témoin négatif obtenus à l'étape c) ;
e) la comparaison d'au moins l'un des paramètres de chacun des thrombinogrammes obtenu à l'étape d) à un paramètre homologue obtenu à partir de thrombinogrammes standards établis sur la base d'une série de calibrateurs dont le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé et/ou du facteur XI activé et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur X activé est connu et varie entre chaque calibrateur ;
f) la déduction de l'étape e) du pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII, du facteur XI, du facteur IX, du facteur X et/ou de leur forme activée dans l'échantillon.
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