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WO2011114369A1 - 二本鎖ｄｎａ中の二本鎖標的配列を増幅する方法 - Google Patents

二本鎖ｄｎａ中の二本鎖標的配列を増幅する方法 Download PDF

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WO2011114369A1
WO2011114369A1 PCT/JP2010/001886 JP2010001886W WO2011114369A1 WO 2011114369 A1 WO2011114369 A1 WO 2011114369A1 JP 2010001886 W JP2010001886 W JP 2010001886W WO 2011114369 A1 WO2011114369 A1 WO 2011114369A1
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WO
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sequence
target sequence
nucleic acid
dna
stranded
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PCT/JP2010/001886
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Inventor
夜久英信
林美穂
Original Assignee
パナソニック株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction

Definitions

  • the present invention relates to a nested PCR having high specificity.
  • Nested Polymerase Chain Reaction shown in FIG. 1 represents a double-stranded target sequence 1 contained in a double-stranded DNA consisting of a first single-stranded DNA 6 and a second single-stranded DNA 7. This is a typical method for amplification.
  • the first single-stranded DNA 6 comprises: 3 ′ end—first non-amplified sequence 6a—second non-amplified sequence 6b—single-stranded target sequence 1a—third non-amplified sequence 6c—fourth non-amplified sequence 6d-5 ′ end Consists of.
  • the second single-stranded DNA 7 comprises: 5 ′ end—fifth unamplified sequence 7 a—sixth unamplified sequence 7 b—complementary single stranded target sequence 1 b—seventh unamplified sequence 7 c—eighth unamplified sequence 7 d-3 'It consists of the end.
  • the fifth non-amplified sequence 7a, the sixth non-amplified sequence 7b, the complementary single-stranded target sequence 1b, the seventh non-amplified sequence 7c, and the eighth non-amplified sequence 7d are respectively the first non-amplified sequence 6a, Complementary to 2 unamplified sequence 6b, single stranded target sequence 1a, third unamplified sequence 6c, and fourth unamplified sequence 6d
  • the double-stranded target sequence consists of a single-stranded target sequence 1a and a complementary single-stranded target sequence 1b.
  • DNA polymerase, deoxynucleoside triphosphate, double-stranded DNA (6.7), outer forward primer (4 of), and outer reverse primer (5 or) are mixed to prepare a first mixed solution.
  • the outer forward primer (4of) is composed of a nucleic acid having 5 to 40 bases and is complementary to the sequence portion at the 3 'end contained in the second non-amplified sequence 6b.
  • the outer reverse primer (5or) is composed of a nucleic acid having 5 to 40 bases, and is complementary to the sequence portion at the 3 'end contained in the seventh non-amplified sequence 7c. Therefore, the outer forward primer (4of) and the outer reverse primer (5or) are respectively a 3′-end sequence portion included in the second non-amplified sequence 6b and a 3′-end sequence portion included in the seventh non-amplified sequence 7c.
  • the first mixed solution is heated at 94 ° C. to 100 ° C. for 1 to 100 seconds. Thereafter, it is cooled at 50 to 70 ° C. for 1 to 100 seconds. Further, heating is performed at 70 to 80 ° C. for 1 to 600 seconds. These are repeated to amplify the intermediate double-stranded DNA.
  • Intermediate double-stranded DNA is double-stranded DNA consisting of an intermediate single-stranded target sequence 6m and a complementary intermediate single-stranded target sequence 7m.
  • the intermediate single-stranded target sequence and the complementary intermediate single-stranded target sequence are 3 ′ end—second unamplified sequence 6b—single stranded target sequence 1a—third unamplified sequence 6c-5 ′ end and 5 ′, respectively.
  • Amplified intermediate double-stranded DNA, DNA polymerase, deoxynucleoside triphosphate, inner forward primer (4if), and inner reverse primer (5ir) are mixed to prepare a second mixed solution.
  • the inner forward primer (4if) is composed of a nucleic acid having 5 to 40 bases and is complementary to the sequence portion at the 3 'end contained in the single-stranded target sequence (1a).
  • the inner reverse primer (5ir) is composed of a nucleic acid having 5 to 40 bases and is complementary to the sequence portion at the 3 'end contained in the complementary single-stranded target sequence 1b. Therefore, the inner forward primer (4if) and the inner reverse primer (5ir) are respectively the 3 ′ end sequence portion contained in the single-stranded target sequence 1a and the 3 ′ end side contained in the complementary single-stranded target sequence 1b.
  • the second mixed solution is heated at 94 ° C. to 100 ° C. for 1 to 100 seconds. Thereafter, it is cooled at 50 to 70 ° C. for 1 to 100 seconds. Next, heating is performed at 70 to 80 ° C. for 1 to 600 seconds. These are repeated to amplify the double-stranded target sequence.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1-3 may be related to the present invention.
  • Genome Research 4 376-379 (1995) Genome Research 2, 60-65 (1992) Phytopathology, 86, 493-497 (1996)
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently amplifying a target sequence (1) using nested PCR, and a method for suppressing the production of the unwanted amplification product.
  • a method for amplifying a double-stranded target sequence (1) in a double-stranded DNA comprising a first single-stranded DNA (6) and a second single-stranded DNA (7)
  • the double-stranded target sequence (1) consists of a single-stranded target sequence (1a) and a complementary single-stranded target sequence (1b)
  • the first single-stranded DNA (6) comprises 3 ′ end—first non-amplified sequence (6a) —second non-amplified sequence (6b) —the single-stranded target sequence (1a) —third non-amplified sequence ( 6c) —the fourth unamplified sequence (6d) —consisting of the 5 ′ end
  • the second single-stranded DNA (7) is composed of 5 ′ end-fifth non-amplified sequence (7a) -sixth non-amplified sequence (7b) -complement
  • the intermediate double-stranded DNA consists of an intermediate target sequence and a complementary intermediate target sequence
  • the intermediate target sequence consists of 3 ′ end—second unamplified sequence (6b) —the single stranded target sequence (1a) —third unamplified sequence (6c) —5 ′ end
  • the complementary intermediate target sequence consists of 5 ′ end—sixth unamplified sequence (7b) —complementary single-stranded target sequence (1b) —seventh unamplified sequence (7c) -3 ′ end
  • the outer forward primer (4of) is complementary to a portion of the sequence on the 3 ′ end side included in the second non-amplified sequence (6b)
  • the outer reverse primer (5or) is complementary to a portion of the sequence on the 3 ′ end side included in the seventh non-amplified sequence, DNA polymerase, deoxynucleoside triphosphate, intermediate double-stranded DNA, inner forward primer (4if), inner reverse primer (5ir), and outer forward block nucleic acid (4
  • an outer reverse block nucleic acid (5 orb) is further mixed, The method according to Item 1, wherein the outer reverse block nucleic acid (5 orb) is complementary to the outer reverse primer (5 or) and does not serve as a starting point for a DNA extension reaction by the DNA polymerase.
  • the OH group at the 3-position of the sugar contained in the nucleotide located at the 3 ′ end is hydrogen, phosphate group, amino group, biotin group, thiol group, or these
  • the OH group at the 3-position of the sugar contained in the nucleotide located at the 3 ′ end is hydrogen, phosphate group, amino group, biotin group, thiol group, or these
  • the method according to Item 1, wherein the outer forward block nucleic acid (4ofb) is composed of Peptide Nucleic Acid.
  • the OH group at the 3-position of the sugar contained in the nucleotide located at the 3 ′ end is hydrogen, phosphate group, amino group, biotin group, thiol group, or these 3.
  • the method according to item 2 comprising DNA substituted or modified with a derivative of (Item 7)
  • the OH group at the 3-position of the sugar contained in the nucleotide located at the 3 ′ end is hydrogen, phosphate group, amino group, biotin group, thiol group, or these
  • the method according to item 2 consisting of Locked Nucleic Acid substituted or modified with a derivative of (Item 8)
  • a method for amplifying a double-stranded target sequence (1) in a double-stranded DNA comprising a first single-stranded DNA (6) and a second single-stranded DNA (7) The double-stranded target sequence (1) consists of a single-stranded target sequence (1a) and a complementary single-stranded target sequence (1b),
  • the first single-stranded DNA (6) comprises 3 ′ end—first non-amplified sequence (6a) —second non-amplified sequence (6b) —the single-stranded target sequence (1a) —third non-amplified sequence ( 6c) —the fourth unamplified sequence (6d) —consisting of the 5 ′ end
  • the second single-stranded DNA (7) is composed of 5 ′ end-fifth non-amplified sequence (7a) -sixth non-amplified sequence (7b) -complementary single-stranded target sequence (1b) -seventh non-amplified Sequence (7c
  • the OH group at the 3-position of the sugar contained in the nucleotide located at the 3 ′ end is hydrogen, phosphate group, amino group, biotin group, thiol group, or these 10.
  • the method according to item 9, comprising DNA that is substituted or modified by a derivative of (Item 11)
  • the OH group at the 3-position of the sugar contained in the nucleotide located at the 3 ′ end is hydrogen, phosphate group, amino group, biotin group, thiol group, or these 10.
  • a method according to item 9, consisting of Locked Nucleic Acid substituted or modified by a derivative of (Item 12) The method according to Item 9, wherein the outer forward block nucleic acid (4ofb) is composed of Peptide Nucleic Acid.
  • the present invention provides a method for amplifying a target sequence that can improve amplification efficiency and significantly suppress non-specific amplification.
  • FIG. 1 is a diagram showing a conventional nested PCR.
  • FIG. 2 is a diagram showing a problem of a conventional nested PCR in which a DNA extension reaction occurs from an outer primer in the second stage PCR.
  • FIG. 3 is a diagram showing a nested PCR according to the first embodiment.
  • FIG. 4 is a diagram showing a problem when a block primer is used in place of the block nucleic acid in the first embodiment.
  • FIG. 5 is a diagram showing a nested PCR according to the second embodiment.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of electrophoresis using profile 1A in Comparative Example 1a (FIG. 6A) and Example 1 (FIG. 6B).
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of electrophoresis using profile 1A in Comparative Example 1a (FIG. 6A) and Example 1 (FIG. 6B).
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of electrophoresis using profile 1B in Comparative Example 1a (FIG. 7A) and Example 1 (FIG. 7B).
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of electrophoresis using profile 1C in Comparative Example 1a (FIG. 8A) and Example 1 (FIG. 8B).
  • FIG. 9 is a diagram in which non-specific amplification in Comparative Example 1a and Example 1 is quantitatively compared.
  • FIG. 10 is a diagram showing an electrophoresis result according to profile 1A in Comparative Example 1b (FIG. 8A).
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of electrophoresis based on profile 2A in Comparative Example 2 and Example 2.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of electrophoresis using profile 1C in Comparative Example 1a (FIG. 8A) and Example 1 (FIG. 8B).
  • FIG. 9 is a diagram in which non-specific amplification in Comparative Example 1
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of electrophoresis using profile 2B in Comparative Example 2 and Example 2.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of electrophoresis using profile 2C in Comparative Example 2 and Example 2.
  • FIG. 14 is a diagram in which non-specific amplification in Comparative Example 2 and Example 2 is quantitatively compared.
  • FIG. 15 is a diagram showing the results of electrophoresis using profile 3A in Comparative Example 3a (FIG. 15A) and Example 3 (FIG. 15B).
  • FIG. 16 is a diagram showing the results of electrophoresis using profile 3B in Comparative Example 3a (FIG. 16A) and Example 3 (FIG. 16B).
  • FIG. 17 is a diagram showing an electrophoresis result based on the profile 3A in the comparative example 3b.
  • first-stage PCR is performed using an outer primer.
  • the mixture does not contain an inner primer.
  • This embodiment is characterized by using an outer forward block nucleic acid (4 ofb) in the second stage PCR as shown in FIG.
  • an outer forward block nucleic acid (4 ofb) and an outer reverse block nucleic acid (5 orb) are used.
  • the outer forward block nucleic acid (4ofb) and the outer reverse block nucleic acid (5orb) have sequences complementary to the outer forward primer (4of) and the outer reverse primer (5or), respectively. Furthermore, none of the block nucleic acids (4ofb ⁇ 5orb) acts as a starting point for the extension reaction by DNA polymerase.
  • the block nucleic acid (4ofb ⁇ 5orb) is a synthetic oligonucleic acid.
  • block nucleic acids (4ofb ⁇ 5orb) are modified DNA, modified Locked Nucleic Acid (hereinafter “LNA”), and peptide nucleic acid (hereinafter “PNA”).
  • LNA lockeded Nucleic Acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • Nucleic acids are biopolymers in which a plurality of nucleotides composed of sugars, phosphate groups, and bases are linked via phosphodiester bonds.
  • the OH group at the 3-position of the sugar contained in the nucleotide located at the 3 ′ end of the modified DNA and LNA is substituted or modified with hydrogen, phosphate group, amino group, biotin group, thiol group, or derivatives thereof.
  • LNA is an artificially developed nucleic acid analog. PNA does not require this modification. This is because in PNA, the 2-aminoethylglycine bond replaces the sugar-phosphate diester skeleton.
  • the inner forward primer (4if) and the inner reverse primer (5ir) are added to the mixed solution. Furthermore, outer forward block nucleic acid (4 ofb) is added to the mixed solution. It is also preferable to add an outer reverse block nucleic acid (5 orb).
  • the outer forward block nucleic acid (4ofb ⁇ 5orb) binds to the outer forward primer (4of) to form a double-stranded DNA structure called a primer dimer.
  • the outer reverse block nucleic acid (5 orb) binds to the outer forward primer (4 of) and forms a double-stranded DNA structure. Formation of these double-stranded DNA structures decreases the activity of the outer forward primer (4of) and the outer reverse primer (5or). Therefore, the DNA extension reaction from the outer primer in the second stage PCR as shown in FIG. 2 is suppressed.
  • the outer forward block nucleic acid (4ofb) should not be a mere primer that is only complementary to the outer forward primer (4of). That is, the outer forward block nucleic acid (4 ofb) must not be the starting point for the DNA extension reaction by the DNA polymerase.
  • the reason will be described with reference to FIG.
  • the outer forward block primer forms a double-stranded DNA structure together with the outer forward primer (4of).
  • the outer forward block primer also binds to the sequence portion 7s. Then, the DNA extension reaction starts from the outer forward block primer. This causes unwanted amplification products as shown in FIG.
  • the outer reverse block nucleic acid (5orb) must also not be a simple primer that is only complementary to the outer reverse primer (5or).
  • the first single-stranded DNA 6 is This is because when the sequence portion 6s is the same as or similar to the sequence complementary to the outer reverse block primer, the outer reverse block primer binds to the sequence portion 6s and starts the DNA extension reaction. If the first single-stranded DNA 6 and the second single-stranded DNA 7 have a plurality of similar sequences 6s and a plurality of similar sequences 7s, respectively, a large amount of undesired amplification products can be caused. For details, see Example 1 and Comparative Example 1b, and Example 3 and Comparative Example 3b.
  • the outer forward block nucleic acid (4ofb) has a concentration higher than the concentration of the outer forward primer (4of). More specifically, the outer forward block nucleic acid (4ofb) preferably has a concentration 5 times that of the outer forward primer (4of), more preferably 10 times.
  • the outer reverse block nucleic acid (5 orb) also has a concentration higher than that of the outer reverse primer (5 orb). More specifically, the outer reverse block nucleic acid (5 orb) preferably has a concentration 5 times that of the outer reverse primer (5 or), more preferably 10 times.
  • components having pH buffering action such as MgCl 2 , reagents such as dithiothreitol, bovine serum albumin, and glycerol, as necessary Can be further mixed.
  • Embodiment 2 The second embodiment will be described with reference to FIG. The difference between Embodiment 2 and Embodiment 1 is that the inner reverse primer (5ir) also serves as the outer reverse primer (5or).
  • first-stage PCR is performed using an outer primer.
  • the mixed solution contains an inner reverse primer (5ir).
  • the first stage PCR consists of a second non-amplified sequence 6b-an intermediate single-stranded target sequence consisting of a single-stranded target sequence 1a and a sixth non-amplified sequence 7b-a complementary intermediate single consisting of a complementary single-stranded target sequence 1b A single-stranded target sequence is produced.
  • Outer forward block nucleic acid (4 ofb) is mixed before the second stage PCR. Unlike Embodiment 1, the outer reverse block nucleic acid (5 orb) is not mixed. In the second stage PCR, the single-stranded target sequence 1a and the complementary single-stranded target sequence 1b are amplified by the inner forward primer (4if) and the inner reverse primer (5ir).
  • the template DNA used in this example and the comparative example was prepared from a human blood sample using an automatic DNA extraction apparatus QIAcube (manufactured by Qiagen).
  • the 3 'end was modified with a phosphate group.
  • DNTP was purchased from Invitrogen Corporation.
  • Bioanalyzer 2100 manufactured by Agilent was used for electrophoretic analysis after PCR.
  • the target sequence was a DNA fragment contained in a human ABO blood group gene.
  • the sequence of the outer forward primer was 5′-GCCCGCTCTCCATGGCCGCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 1, hereinafter “ABO-OF”).
  • the sequence of the outer reverse primer was 5′-CCTGGGTCTCTACCCTCGCGC-3 ′ (SEQ ID NO: 2, hereinafter “ABO-OR”).
  • This primer pair amplifies a 210 bp DNA fragment contained in a human ABO blood group gene having an AB blood group.
  • This primer pair amplifies a 209 bp DNA fragment contained in a human ABO blood group gene having an O blood group.
  • the sequence of the inner forward primer was 5'-TGCAGTAGGAAGGAGTCCTC-3 '(SEQ ID NO: 3, hereinafter "ABO-IF”).
  • the sequence of the inner reverse primer was 5'-TTCTTGATGGCAAACACAGTTAAC-3 '(SEQ ID NO: 4, hereinafter "ABO-IR”).
  • This primer pair of ABO-IF and ABO-IR amplifies a 140 bp DNA fragment (when the blood type is AB or 139 bp DNA fragment when the blood type is O) present in the 210 bp DNA fragment.
  • nested PCR was performed as follows.
  • the composition of the first stage PCR solution was as follows. 1 ⁇ TITANIUM Taq DNA polymerase (Clontech), 1 ⁇ TITANIUM Taq PCR Buffer (manufactured by Clontech), 200 ⁇ M dNTP, 1 ⁇ M ABO-OF, 1 ⁇ M ABO-OR, 0.5 ng / ⁇ L 5ng / ⁇ l genomic DNA (from AB type subjects) Total volume: 10 ⁇ L
  • the second-stage PCR solution was prepared by adding 0.5 ⁇ L of 20 ⁇ M ABO-IF and 0.5 ⁇ L of 20 ⁇ M ABO-IR to the reaction solution after the first-stage PCR.
  • FIG. 6 (A) shows the result of electrophoretic analysis using profile 1A. Not only DNA fragments obtained from the combination of ABO-IF and ABO-IR (that is, target sequences) but also unwanted DNA fragments obtained from the combination of ABO-OF and ABO-OR were detected. FIG. 6 (A) shows this. Furthermore, FIG. 6 (A) shows a number of peaks indicating non-specific amplification products in addition to these amplification product peaks. The concentration of the DNA fragment obtained from the combination of ABO-IF and ABO-IR was 62.5 nM.
  • FIG. 7 (A) shows the result of electrophoretic analysis by profile 1B. Similar to FIG. 6A, FIG. 7A also shows a number of peaks indicating non-specific amplification products.
  • the concentration of the DNA fragment obtained from the combination of ABO-IF and ABO-IR was 137.8 nM.
  • FIG. 8 (A) shows the result of electrophoretic analysis by profile 1B. Similar to FIG. 6 (A), FIG. 8 (A) also shows a number of peaks indicating non-specific amplification products. The concentration of the DNA fragment obtained from the combination of ABO-IF and ABO-IR was 157.0 nM.
  • Example 1 In Example 1, the same outer forward primer (ABO-OF), outer reverse primer (ABO-OR), inner forward primer (ABO-IF), and inner reverse primer (ABO-IR) as in Comparative Example 1a were used. Using these primers, nested PCR was performed as follows.
  • the composition of the first stage PCR solution was exactly the same as in Comparative Example 1a as follows. 1 ⁇ TITANIUM Taq DNA polymerase, 1 x TITANIUM Taq PCR Buffer 200 ⁇ M dNTP 1 ⁇ M ABO-OF 1 ⁇ M ABO-OR 0.5 ng / ⁇ L genomic DNA Total volume: 10 ⁇ L
  • the temperature profile 1 was the same as in Comparative Example 1a.
  • the second stage PCR solution is added to the reaction solution after the first stage PCR.
  • 0.5 ⁇ L of 20 ⁇ M ABO-IF 0.5 ⁇ L of 20 ⁇ M ABO-IR Prepared by adding 1 ⁇ L of outer forward block nucleic acid and 1 ⁇ L of outer reverse block nucleic acid.
  • the outer forward block nucleic acid is an oligo DNA (hereinafter referred to as “ABO-OF-Block”) having a concentration of 100 ⁇ M consisting of 5′-GTGCGGCCACCATGGAGCTGGC-3 ′ (SEQ ID NO: 5) and phosphorylated at its 3 ′ end. there were. This sequence was complementary to ABO-OF.
  • the outer reverse block nucleic acid is a 100 ⁇ M oligo DNA consisting of 5′-GCCGAGGGTAGAGACCCAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 6) and phosphorylated at its 3 ′ end (hereinafter “ABO-OR-Block”). It was. This sequence was complementary to ABO-OR
  • FIG. 6 (B) shows the result of electrophoretic analysis using profile 1A.
  • a DNA fragment (ie, target sequence) obtained from the combination of ABO-IF and ABO-IR was detected, but a DNA fragment obtained from the combination of ABO-OF and ABO-OR was hardly detected. This is shown in FIG. Furthermore, FIG. 6 (B) shows few peaks indicating non-specific amplification products. The concentration of the DNA fragment obtained from the combination of ABO-IF and ABO-IR was 478.6 nM.
  • the PCR from the combination of ABO-IF and ABO-IR is extremely efficient because the second stage PCR solution contains ABO-OF-Block and ABO-OR-Block. And non-specific amplification is significantly suppressed.
  • FIG. 9 shows quantitatively the suppression of non-specific amplification. These are bar graphs obtained by calculating the concentration of pyrophosphate produced when all non-specific amplification products detected by electrophoresis analysis are amplified.
  • the nested PCR shown in FIG. 6 (B) can suppress approximately 45% non-specific amplification, as shown in FIG. ) And FIG. 9 (2).
  • concentration of pyrophosphate contained in the solution after the reaction the concentration of DNA amplification can be measured.
  • Pyrophosphate produced by non-specific amplification can be a big noise.
  • block nucleic acids can reduce noise due to pyrophosphate produced by non-specific amplification.
  • FIG. 7 (B) shows the result of electrophoretic analysis by profile 1B.
  • the target sequence was detected, but a peak indicating a non-specific amplification product including a DNA fragment obtained from the combination of ABO-OF and ABO-OR is shown in FIG. 7 (B). Shows very little.
  • the concentration of the DNA fragment obtained from the combination of ABO-IF and ABO-IR was 516.5 nM.
  • the nested PCR shown in FIG. 7 (B) can suppress approximately 66% non-specific amplification, as shown in FIG. ) And FIG. 9 (4).
  • FIG. 8 (B) shows the result of electrophoretic analysis by profile 1B.
  • the target sequence was detected, but a peak indicating a non-specific amplification product including a DNA fragment obtained from the combination of ABO-OF and ABO-OR is shown in FIG. 8 (B). Shows very little.
  • the concentration of the DNA fragment obtained from the combination of ABO-IF and ABO-IR was 375.2 nM.
  • the nested PCR shown in FIG. 7 (B) can suppress approximately 61% of non-specific amplification, as shown in FIG. 9 (5 ) And FIG. 9 (6).
  • Example 1 and Comparative Example 1a show that the addition of a block nucleic acid can significantly increase the amplification efficiency of a single-stranded target sequence and greatly suppress nonspecific amplification.
  • the present inventors experimented by adding only ABO-OF-Block after the first-stage PCR. As a result, in this case as well, although not as much as when both ABO-OF-Block and ABO-OR-Block were added, compared to the case where neither ABO-OF-Block nor ABO-OR-Block was added. It was confirmed that the amplification efficiency of the target sequence was increased and non-specific amplification was suppressed.
  • Comparative Example 1b In Comparative Example 1b, as shown in FIG. 4, ABO-OF-Block (“outer forward primer” in FIG. 4) whose 3 ′ end is not phosphorylated and ABO-OR whose 3 ′ end is not phosphorylated -Block ("outer reverse primer” in FIG. 4) was used. Profile 1A was used.
  • FIG. 10 shows the result of electrophoresis.
  • the DNA fragment concentration obtained from the combination of ABO-IF and ABO-IR in FIG. 10 is clearly smaller than that of FIG. 6 (B). Furthermore, the suppression effect of non-specific amplification in FIG. 10 is clearly smaller than that of FIG.
  • Example 2 and Comparative Example 2 correspond to FIG.
  • the target sequence was a DNA fragment contained in the human ALDH2 gene.
  • Comparative Example 2 In Comparative Example 2, the sequence of the outer forward primer was 5′-CAAATTACAGGGTCAACTGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 7, hereinafter “ALDH2-OF”). The sequence of the outer reverse primer was 5′-GGCAGGTCCTGAACCTC-3 ′ (SEQ ID NO: 8, hereinafter “ALDH2-OR”). This primer pair amplifies a 251 bp DNA fragment contained within the human ALDH2 gene.
  • the sequence of the inner forward primer was 5'-GTACGGGCTGCAGGCATACAC-3 '(SEQ ID NO: 9, hereinafter "ALDH2-IF").
  • the sequence of the inner reverse primer is the same as ALDH2-OR.
  • the primer pair with ALDH2-IF and ALDH2-OR can amplify a 160 bp DNA fragment present in the 251 bp DNA fragment. Using these primers, nested PCR was performed as follows.
  • the composition of the first stage PCR solution is as follows. 0.05 U / ⁇ L TaKaRa LA Taq HS (manufactured by Takara Bio Inc.), 1 ⁇ LA PCR Buffer II (Mg 2+ plus) (manufactured by Takara Bio Inc.), 200 ⁇ M dNTP, 1 ⁇ M ALDH2-OF, 1 ⁇ M ALDH2-OR, 0.83 ng / ⁇ L genomic DNA Total volume: 10 ⁇ L
  • the second-stage PCR solution was prepared by adding 1 ⁇ L of 10 ⁇ M ALDH2-IF to the reaction solution after the first-stage PCR.
  • FIG. 11 (A) shows the result of electrophoretic analysis by profile 2A.
  • FIG. 11 shows that not only the DNA fragment obtained from the combination of ALDH2-IF and ALDH2-IR (that is, the target sequence) but also the DNA fragment obtained from the combination of ALDH2-OF and ALDH2-OR was detected.
  • (A) shows.
  • FIG. 11 (A) shows a number of peaks indicating non-specific amplification products.
  • the concentration of the DNA fragment obtained from the combination of ALDH2-IF and ALDH2-IR was 10.7 nM.
  • FIG. 12 (A) shows the result of electrophoretic analysis by profile 2B. Similar to FIG. 11A, FIG. 12A also shows a number of peaks indicating non-specific amplification products.
  • the concentration of the DNA fragment obtained from the combination of ALDH2-IF and ALDH2-IR was 13.6 nM.
  • FIG. 13A shows the result of electrophoretic analysis by profile 2B. Similar to FIG. 11 (A), FIG. 13 (A) also shows a number of peaks indicating non-specific amplification products. The concentration of the DNA fragment obtained from the combination of ALDH2-IF and ALDH2-IR was 9.9 nM.
  • Example 2 In Experimental Example 2, the reaction solution after the first stage PCR was A PCR solution to which 1 ⁇ L of 10 ⁇ M ALDH2-IF and 1 ⁇ L of outer forward block nucleic acid were added was used.
  • the outer forward block nucleic acid is an oligo DNA consisting of 5′-AGCAGTTGACCCTGTAATTTG-3 ′ (SEQ ID NO: 10) and phosphorylated at its 3 ′ end at a concentration of 100 ⁇ M (hereinafter referred to as “ALDH2-OF-Block”).
  • ALDH2-OF-Block This sequence was complementary to ALDH2-OF.
  • FIG. 11 (B) shows the result of electrophoretic analysis by profile 2A.
  • a DNA fragment obtained from the combination of ALDH2-IF and ALDH2-IR ie, the target sequence
  • FIG. 11B shows few peaks indicating nonspecific amplification products.
  • the concentration of the DNA fragment obtained from the combination of ALDH2-IF and ALDH2-IR was 58.6 nM.
  • the second stage PCR solution contains ALDH2-OF-Block and ALDH2-OR-Block, PCR from the combination of ALDH2-IF and ALDH2-IR is extremely efficient. And non-specific amplification was significantly suppressed.
  • FIG. 14 quantitatively shows the suppression of non-specific amplification as in FIG. Compared to the results of the nested PCR shown in FIG. 11 (A), the nested PCR shown in FIG. 11 (B) can suppress approximately 95% non-specific amplification, as shown in FIG. ) And FIG. 14 (2).
  • FIG. 12 (B) shows the result of electrophoretic analysis by profile 2B. Similar to FIG. 11 (B), the target sequence was detected, but a peak indicating a non-specific amplification product including a DNA fragment obtained from the combination of ALDH2-OF and ALDH2-OR is shown in FIG. 12 (B). Shows very little. The concentration of the DNA fragment obtained from the combination of ALDH2-IF and ALDH2-IR was 58.6 nM.
  • the nested PCR shown in FIG. 12 (B) can suppress approximately 87% non-specific amplification, as shown in FIG. ) And FIG. 14 (4).
  • FIG. 13 (B) shows the result of electrophoretic analysis by profile 2B. Similar to FIG. 11 (B), the target sequence was detected, but a peak indicating a non-specific amplification product including a DNA fragment obtained from the combination of ALDH2-OF and ALDH2-OR was shown in FIG. 13 (B). Shows very little. The concentration of the DNA fragment obtained from the combination of ALDH2-IF and ALDH2-IR was 53.5 nM.
  • the nested PCR shown in FIG. 13 (B) can suppress about 81% non-specific amplification, as shown in FIG. ) And FIG. 14 (6).
  • Example 2 and Comparative Example 2 show that the addition of block nucleic acid can increase the amplification efficiency of the target sequence and suppress nonspecific amplification.
  • Example 3 Comparative Example 3a, and Comparative Example 3b correspond to FIG.
  • the target sequence was a DNA fragment contained in the human dystrophin gene.
  • Comparative Example 3 In Comparative Example 3, the sequence of the outer forward primer was 5′-GATGGCAAAAGTGTGAGAAAAGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 11, hereinafter “DYSTRO-OF”). The sequence of the outer reverse primer was 5′-TTCTACCACATCCCATTTTCTCCA-3 ′ (SEQ ID NO: 12, hereinafter “DYSTRO-OR”). This primer pair can amplify a 459 bp DNA fragment contained within the human dystrophin gene.
  • the sequence of the inner forward primer was 5'-AGGCTTGAAAGGGCAAGTAGAGAGT-3 '(SEQ ID NO: 13, hereinafter "DYSTRO-IF”).
  • the sequence of the inner reverse primer was 5'-GCTGATCTGCTGGGCATCTTGC-3 '(SEQ ID NO: 14, hereinafter "DYSTRO-IR”).
  • This primer pair of DYSTRO-IF and DYSTRO-OR can amplify a 147 bp DNA fragment present in the 459 bp DNA fragment. Using these primers, nested PCR was performed as follows.
  • the composition of the first stage PCR solution was as follows. 1 ⁇ TITANIUM Taq DNA polymerase (Clontech), 1 ⁇ TITANIUM Taq PCR Buffer (manufactured by Clontech), 200 ⁇ M dNTP, 1 ⁇ M DYSTRO-OF, 1 ⁇ M DYSTRO-OR, 0.5 ng / ⁇ L genomic DNA Total volume: 10 ⁇ L
  • PCR temperature profiles 3A-B are shown in Table 3.
  • the second stage PCR solution was prepared by adding 0.5 ⁇ L of 20 ⁇ M DYSTRO-IF and 0.5 ⁇ L of 20 ⁇ M DYSTRO-IR to the reaction solution after the first stage PCR.
  • FIG. 15 (A) shows the result of electrophoresis analysis by profile 3A.
  • FIG. 15 shows that not only a DNA fragment obtained from the combination of DYSTRO-IF and DYSTRO-IR (ie, the target sequence) but also a DNA fragment obtained from the combination of DYSTRO-OF and DYSTRO-OR was detected.
  • (A) shows.
  • FIG. 15 (A) shows a number of peaks indicating non-specific amplification products in addition to these amplification product peaks.
  • the concentration of the DNA fragment obtained from the combination of DYSTRO-IF and DYSTRO-IR was 294.5 nM.
  • FIG. 16 (A) shows the result of electrophoresis analysis by profile 3B. Similar to FIG. 15A, FIG. 16A also shows a number of peaks indicating non-specific amplification products. The concentration of the DNA fragment obtained from the combination of DYSTRO-IF and DYSTRO-IR was 196.1 nM.
  • Example 3 In Example 3, the same outer forward primer (DYSTRO-OF), outer reverse primer (DYSTRO-OR), inner forward primer (DYSTRO-IF), and inner reverse primer (DYSTRO-IR) as in Comparative Example 3 are used. It was. Using these primers, nested PCR was performed as follows.
  • the second stage PCR solution is added to the reaction solution after the first stage PCR.
  • 0.5 ⁇ L of 20 ⁇ M DYSTRO-IF 0.5 ⁇ L of 20 ⁇ M DYSTRO-IR Prepared by adding 1 ⁇ L of outer forward block nucleic acid and 1 ⁇ L of outer reverse block nucleic acid.
  • the outer forward block nucleic acid is 100 ⁇ M oligo DNA (hereinafter “DYSTRO-OF-Block”) consisting of 5′-GACTTTTTCTCAACACTTTGCCATC-3 ′ (SEQ ID NO: 15) and phosphorylated at its 3 ′ end. It was. This sequence was complementary to DYSTRO-OF.
  • the outer reverse block nucleic acid is 100 ⁇ M oligo DNA consisting of 5′-TGGAAGAAAATGGGATGTGGTAGAA-3 ′ (SEQ ID NO: 16) and phosphorylated at its 3 ′ end (hereinafter “DYSTRO-OR-Block”). It was. This sequence was complementary to DYSTRO-OR.
  • FIG. 15 (B) shows the result of electrophoresis analysis by profile 3A.
  • the amplification product concentration from the combination of DYSTRO-OF and DYSTRO-OR the amplification product concentration from the combination of DYSTRO-OF and DYSTRO-IR, and DYSTRO-IF and DYSTRO-OR
  • the amplification product concentration from each of the combinations was below the detection limit.
  • the concentration of the DNA fragment obtained from the combination of DYSTRO-IF and DYSTRO-IR was 593.2 nM.
  • FIG. 15 (B) since the second stage PCR solution contains DYSTRO-OF-Block and DYSTRO-OR-Block, PCR using a combination of DYSTRO-IF and DYSTRO-IR is extremely efficient. And non-specific amplification was significantly suppressed.
  • FIG. 16 (B) shows the result of electrophoresis analysis by profile 3B.
  • the amplification product concentration from the combination of DYSTRO-OF and DYSTRO-OR the amplification product concentration from the combination of DYSTRO-OF and DYSTRO-IR, and DYSTRO-IF and DYSTRO-OR
  • the amplification product concentration from each of the combinations was below the detection limit.
  • the concentration of the DNA fragment obtained from the combination of DYSTRO-IF and DYSTRO-IR was 571.6 nM.
  • PCR using a combination of DYSTRO-IF and DYSTRO-IR is extremely efficient. And non-specific amplification was significantly suppressed.
  • Comparative Example 3b In Comparative Example 3b, as shown in FIG. 4, DYSTRO-OF-Block (“outer forward primer” in FIG. 4) whose 3 ′ end is not phosphorylated and DYSTRO-OR whose 3 ′ end is not phosphorylated -Block ("outer reverse primer” in FIG. 4) was used. Profile 3A was used.
  • FIG. 17 shows the result of electrophoresis.
  • the DNA fragment concentrations obtained from the combination of ABO-IF and ABO-IR in FIG. 17 are clearly smaller than those in FIGS. 15 (B) and 16 (B). Furthermore, the suppression effect of non-specific amplification in FIG. 17 is clearly smaller than those in FIGS. 15 (B) and 16 (B).
  • the present invention provides a method for amplifying a target sequence, which is a method for amplifying a target sequence exhibiting a high amplification efficiency of the target sequence and a remarkable suppression effect of nonspecific amplification.
  • Target sequence 1a Single-stranded target sequence 1b
  • First single-stranded DNA 6a First non-amplified sequence 6b
  • Second non-amplified sequence 6c Third non-amplified sequence 6d
  • Intermediate single-stranded target sequence 6s Sequence portion identical or similar to sequence complementary to outer reverse block primer 7
  • Complementary intermediate single-stranded target sequence 7s Sequence part identical or similar to sequence complementary to outer forward block primer
  • SEQ ID NO: 1 Outer forward primer for ABO blood group gene
  • SEQ ID NO: 2 Outer reverse primer for ABO blood group gene
  • SEQ ID NO: 3 Inner forward primer for ABO blood group gene
  • SEQ ID NO: 4 ABO Inner reverse primer for formula blood group gene
  • SEQ ID NO: 5 Block nucleic acid (DNA) of outer forward primer for ABO blood group gene
  • Sequence number 6 Block nucleic acid (DNA) of outer reverse primer for ABO blood group gene
  • SEQ ID NO: 8 Outer reverse primer or inner reverse primer for ALDH2 gene
  • SEQ ID NO: 10 Outer for ALDH2 gene Block nucleic acid (DNA) of forward primer SEQ ID NO: 11: outer forward primer for dystrophin gene
  • SEQ ID NO: 13 inner forward primer for dystrophin gene

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Abstract

本発明は高い特異性を有する入れ子型ＰＣＲに関する。本発明は、標的配列（１）を増幅する方法であって、一本鎖標的配列の高い増幅効率、および非特異的増幅の著しい抑制効果を示す方法を提供する。一実施形態では、入れ子型ＰＣＲの第２段階において、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならないアウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）を混合する。

Description

二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列を増幅する方法
　本発明は高い特異性を有する入れ子型ＰＣＲに関する。
　図１に示されるＮｅｓｔｅｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「入れ子型ＰＣＲ」という）は、第１一本鎖ＤＮＡ６および第２一本鎖ＤＮＡ７からなる二本鎖ＤＮＡに含まれる二本鎖標的配列１を増幅する代表的な方法である。
　以下、図１を参照しながら入れ子型ＰＣＲ法を簡単に説明する。
　第１一本鎖ＤＮＡ６は、３’末端－第１非増幅配列６ａ－第２非増幅配列６ｂ－一本鎖標的配列１ａ－第３非増幅配列６ｃ－第４非増幅配列６ｄ－５’末端からなる。第２一本鎖ＤＮＡ７は、５’末端－第５非増幅配列７ａ－第６非増幅配列７ｂ－相補的一本鎖標的配列１ｂ－第７非増幅配列７ｃ－第８非増幅配列７ｄ－３’末端からなる。
　第５非増幅配列７ａ、第６非増幅配列７ｂ、相補的一本鎖標的配列１ｂ、第７非増幅配列７ｃ、および第８非増幅配列７ｄは、それぞれ、前記第１非増幅配列６ａ、第２非増幅配列６ｂ、一本鎖標的配列１ａ、第３非増幅配列６ｃ、および第４非増幅配列６ｄと相補的である。
　二本鎖標的配列は、一本鎖標的配列１ａと相補的一本鎖標的配列１ｂからなる。
　まず、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、二本鎖ＤＮＡ（６・７）、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）、およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）を混合して第１の混合液を調製する。
　アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）は５～４０塩基を有する核酸からなり、かつ第２非増幅配列６ｂに含まれる３’末端の配列部分と相補的である。アウターリバースプライマー（５ｏｒ）は５～４０塩基を有する核酸からなり、かつ第７非増幅配列７ｃに含まれる３’末端の配列部分と相補的である。そのため、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）は、それぞれ、第２非増幅配列６ｂに含まれる３’末端の配列部分および第７非増幅配列７ｃに含まれる３’末端の配列部分に結合する。
　次に、当該第１の混合液を９４℃～１００℃で１秒から１００秒の間加熱する。その後、５０～７０℃で１秒から１００秒間冷却する。さらに、７０～８０℃で１秒から６００秒間加熱する。これらを繰り返し、中間二本鎖ＤＮＡを増幅する。
　中間二本鎖ＤＮＡは、中間一本鎖標的配列６ｍおよび相補的中間一本鎖標的配列７ｍからなる二本鎖ＤＮＡである。中間一本鎖標的配列および相補的中間一本鎖標的配列は、それぞれ、３’末端－第２非増幅配列６ｂ－一本鎖標的配列１ａ－第３非増幅配列６ｃ－５’末端および５’末端－第６非増幅配列７ｂ－相補的一本鎖標的配列１ｂ－第７非増幅配列７ｃ－３’末端からなる。
　ここまでを「第１段階のＰＣＲ」と呼ぶ。
　次に、第２段階のＰＣＲが行われる。
　増幅された中間二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）、およびインナーリバースプライマー（５ｉｒ）を混合して第２の混合液を調製する。
　インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）は５～４０塩基を有する核酸からなり、かつ一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端の配列部分と相補的である。インナーリバースプライマー（５ｉｒ）は５～４０塩基を有する核酸からなり、かつ相補的一本鎖標的配列１ｂに含まれる３’末端の配列部分と相補的である。そのため、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）およびインナーリバースプライマー（５ｉｒ）は、それぞれ、一本鎖標的配列１ａに含まれる３’末端の配列部分および相補的一本鎖標的配列１ｂに含まれる３’末端側の配列部分に結合する。
　最後に、当該第２の混合液を９４℃～１００℃で１秒から１００秒の間加熱する。その後、５０～７０℃で１秒から１００秒間冷却する。次いで、７０～８０℃で１秒から６００秒間加熱する。これらを繰り返し、上記二本鎖標的配列を増幅する。
　特許文献１および非特許文献１－３は、本発明と関連し得る。
国際公開第９６／１７９３２号公報
Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４、３７６－３７９（１９９５） Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２、６０－６５（１９９２） Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、８６、４９３－４９７（１９９６）
　第１段階のＰＣＲの後、かつ第２段階のＰＣＲを行う前には、アウタープライマー４ｏｆ・５ｏｒが除去されることが必要である。なぜなら、第２の混合液がアウタープライマー４ｏｆ・５ｏｒを含有していると、図２に示すように、第２段階のＰＣＲにおいて、アウタープライマーからもＤＮＡ伸長反応が生じてしまう。
　すなわち、図２に示すように、第２段階のＰＣＲの後に、望まれる標的二本鎖ＤＮＡだけでなく、望まれない不要な増幅産物も得られる。当該望まれない不要な増幅産物は、標的二本鎖ＤＮＡの著しい増幅効率の低下、電気泳動によるＤＮＡ解析の困難化、および遺伝子診断のミスを招き得る。
　本発明の目的は、入れ子型ＰＣＲを利用して標的配列（１）を効率的に増幅する方法であって、当該望まれない不要な増幅産物の産生を抑制する方法を提供することである。
　上述の課題を解決するために、本発明は、以下に例示したような態様で提供される。
　（項目１)　第１一本鎖ＤＮＡ（６）および第２一本鎖ＤＮＡ（７）からなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列（１）を増幅する方法であって、
　前記二本鎖標的配列（１）は、一本鎖標的配列（１ａ）および相補的一本鎖標的配列（１ｂ）からなり、
　前記第１一本鎖ＤＮＡ（６）は、３’末端－第１非増幅配列（６ａ）－第２非増幅配列（６ｂ）－前記一本鎖標的配列（１ａ）－第３非増幅配列（６ｃ）－第４非増幅配列（６ｄ）－５’末端からなり、
　前記第２一本鎖ＤＮＡ（７）は、５’末端－第５非増幅配列（７ａ）－第６非増幅配列（７ｂ）－前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）－第７非増幅配列（７ｃ）－第８非増幅配列（７ｄ）－３’末端からなり、
　前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）、前記第５非増幅配列（７ａ）、第６非増幅配列（７ｂ）、第７非増幅配列（７ｃ）、および第８非増幅配列（８ｃ）は、それぞれ、前記一本鎖標的配列（１ａ）、前記第１非増幅配列（６ａ）、前記第２非増幅配列（６ｂ）、前記第３非増幅配列（６ｃ）および前記第４非増幅配列（６ｄ）と相補的であり、
　前記方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
　ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ（６・７）、およびアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）、およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて中間二本鎖ＤＮＡを増幅する工程（Ａ）、
　ここで、前記中間二本鎖ＤＮＡは、中間標的配列および相補的中間標的配列からなり、
　前記中間標的配列は、３’末端－第２非増幅配列（６ｂ）－前記一本鎖標的配列（１ａ）－第３非増幅配列（６ｃ）－５’末端からなり、
　前記相補的中間標的配列は、５’末端－第６非増幅配列（７ｂ）－前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）－第７非増幅配列（７ｃ）－３’末端からなり、
　前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）は、前記第２非増幅配列（６ｂ）に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
　前記アウターリバースプライマー（５ｏｒ）は、前記第７非増幅配列に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
　ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記中間二本鎖ＤＮＡ、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）、インナーリバースプライマー（５ｉｒ）、およびアウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的配列（１）を特異的に増幅する工程（Ｂ）、
　前記インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）は、前記一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
　前記インナーリバースプライマー（５ｉｒ）は、前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
　前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、方法。
（項目２)　前記工程（Ｂ）において、さらにアウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）が混合され、
　前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、前記アウターリバースプライマー（５ｏｒ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、項目１に記載の方法。
（項目３)　前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、項目１に記載の方法。
（項目４)　前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄからなる、項目１に記載の方法。
（項目５)　前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄからなる、項目１に記載の方法。
（項目６)　前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、項目２に記載の方法。
（項目７)　前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄからなる、項目２に記載の方法。
（項目８)　前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄからなる、項目２に記載の方法。
（項目９)　第１一本鎖ＤＮＡ（６）および第２一本鎖ＤＮＡ（７）からなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列（１）を増幅する方法であって、
　前記二本鎖標的配列（１）は、一本鎖標的配列（１ａ）および相補的一本鎖標的配列（１ｂ）からなり、
　前記第１一本鎖ＤＮＡ（６）は、３’末端－第１非増幅配列（６ａ）－第２非増幅配列（６ｂ）－前記一本鎖標的配列（１ａ）－第３非増幅配列（６ｃ）－第４非増幅配列（６ｄ）－５’末端からなり、
　前記第２一本鎖ＤＮＡ（７）は、５’末端－第５非増幅配列（７ａ）－第６非増幅配列（７ｂ）－前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）－第７非増幅配列（７ｃ）－第８非増幅配列（７ｄ）－３’末端からなり、
　前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）、前記第５非増幅配列（７ａ）、第６非増幅配列（７ｂ）、第７非増幅配列（７ｃ）、および第８非増幅配列（８ｃ）は、それぞれ、前記一本鎖標的配列（１ａ）、前記第１非増幅配列（６ａ）、前記第２非増幅配列（６ｂ）、前記第３非増幅配列（６ｃ）および前記第４非増幅配列（６ｄ）と相補的であり、
　前記方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
　ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ（６・７）、およびアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）、およびインナーリバースプライマー（５ｉｒ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて中間二本鎖ＤＮＡを増幅する工程（Ａ）、
　ここで、前記中間二本鎖ＤＮＡは、中間標的配列および相補的中間標的配列からなり、
　前記中間標的配列は、３’末端－第２非増幅配列（６ｂ）－前記一本鎖標的配列（１ａ）－５’末端からなり、
　前記相補的中間標的配列は、５’末端－第６非増幅配列（７ｂ）－前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）－３’末端からなり、
　前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）は、前記第２非増幅配列（６ｂ）に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
　前記インナーリバースプライマー（５ｉｒ）は、前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
　ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記中間二本鎖ＤＮＡ、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）、、およびアウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的配列（１）を特異的に増幅する工程（Ｂ）、
　前記インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）は、前記一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
　前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、方法。
（項目１０)　前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、項目９に記載の方法。
（項目１１)　前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄからなる、項目９に記載の方法。
（項目１２)　前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄからなる、項目９に記載の方法。
　本発明は、増幅効率を改善し、かつ非特異的増幅を著しく抑制し得る、標的配列を増幅する方法を提供する。
図１は、従来の入れ子型ＰＣＲを示す図である。 図２は、第２段階のＰＣＲにおいて、アウタープライマーからＤＮＡ伸長反応が生じてしまう従来の入れ子型ＰＣＲの問題点を示す図である。 図３は、本実施の形態１に係る入れ子型ＰＣＲを示す図である。 図４は、本実施の形態１において、ブロック核酸に代えてブロックプライマーを用いた場合の問題点を示す図である。 図５は、本実施の形態２に係る入れ子型ＰＣＲを示す図である。 図６は、比較例１ａ（図６（Ａ））および実施例１（図６（Ｂ））において、プロファイル１Ａによる電気泳動結果を示す図である。 図７は、比較例１ａ（図７（Ａ））および実施例１（図７（Ｂ））において、プロファイル１Ｂによる電気泳動結果を示す図である。 図８は、比較例１ａ（図８（Ａ））および実施例１（図８（Ｂ））において、プロファイル１Ｃによる電気泳動結果を示す図である。 図９は、比較例１ａおよび実施例１における非特異的増幅を定量的に比較した図である。 図１０は、比較例１ｂ（図８（Ａ））において、プロファイル１Ａによる電気泳動結果を示す図である。 図１１は、比較例２および実施例２において、プロファイル２Ａによる電気泳動結果を示す図である。 図１２は、比較例２および実施例２において、プロファイル２Ｂによる電気泳動結果を示す図である。 図１３は、比較例２および実施例２において、プロファイル２Ｃによる電気泳動結果を示す図である。 図１４は、比較例２および実施例２における非特異的増幅を定量的に比較した図である。 図１５は、比較例３ａ（図１５（Ａ））および実施例３（図１５（Ｂ））において、プロファイル３Ａによる電気泳動結果を示す図である。 図１６は、比較例３ａ（図１６（Ａ））および実施例３（図１６（Ｂ））において、プロファイル３Ｂによる電気泳動結果を示す図である。 図１７は、比較例３ｂにおいて、プロファイル３Ａによる電気泳動結果を示す図である。
　以下、図３を参照しながら、本発明の実施の形態を説明する。
　（実施の形態１）
　本実施の形態では、まず、図１と同様、アウタープライマーを用いて第１段階のＰＣＲが行われる。第１段階のＰＣＲでは、混合液はインナープライマーを含有しない。
　本実施の形態は、図３に示すように、第２段階のＰＣＲにおいて、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）を用いることによって特徴付けられる。好ましくは、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）およびアウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）の両方が用いられる。
　アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）およびアウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、それぞれ、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）と相補的な配列を有する。さらに、いずれのブロック核酸（４ｏｆｂ・５ｏｒｂ）も、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応のための起点として作用しない。好ましくは、ブロック核酸（４ｏｆｂ・５ｏｒｂ）は合成オリゴ核酸である。
　ブロック核酸（４ｏｆｂ・５ｏｒｂ）の例は、修飾されたＤＮＡ、修飾されたＬｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（以下、「ＬＮＡ」）、およびペプチド核酸（以下、「ＰＮＡ」）である。
　核酸は、糖、リン酸基、および塩基から構成される複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合を介して連結された生体高分子である。修飾されたＤＮＡおよびＬＮＡの３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基は、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されている。ＬＮＡは人工的に開発された核酸アナログである。ＰＮＡは当該修飾を必要としない。なぜなら、ＰＮＡでは、２アミノエチルグリシン結合が糖－リン酸ジエステル骨格を置換しているからである。
　第２段階のＰＣＲを開始する前に、混合液にインナーフォワードプライマー（４ｉｆ）およびインナーリバースプライマー（５ｉｒ）が添加される。さらに、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）が混合液に添加される。アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）も添加されることが好ましい。
　ブロック核酸（４ｏｆｂ・５ｏｒｂ）が添加されると、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）はアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）に結合し、プライマーダイマーと呼ばれる二本鎖ＤＮＡ構造を形成する。同様に、アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）はアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）に結合し、二本鎖ＤＮＡ構造を形成する。これらの二本鎖ＤＮＡ構造の形成は、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）の活性を低下させる。従って、図２に示すような、第２段階のＰＣＲにおけるアウタープライマーからのＤＮＡ伸長反応が抑制される。
　アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）が、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と相補的であるに過ぎない単なるプライマーであってはならない。すなわち、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）が、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点となってはならない。図４を参照しながら、以下、その理由を説明する。
　図４に示すように、図３と同様、アウターフォワードブロックプライマーは、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と共に二本鎖ＤＮＡ構造を形成する。しかし、第２一本鎖ＤＮＡ７が、アウターフォワードブロックプライマーに相補的な配列と同一または類似の配列部分７ｓを有している場合、アウターフォワードブロックプライマーは当該配列部分７ｓにも結合する。そして、アウターフォワードブロックプライマーからＤＮＡ伸長反応が開始する。これは、図２に示すような、不要な増幅産物を引き起こす。同様に、アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）もまた、アウターリバースプライマー（５ｏｒ）と相補的であるに過ぎない単なるプライマーであってはならない。第１一本鎖ＤＮＡ６が、
アウターリバースブロックプライマーに相補的な配列と同一または類似の配列部分６ｓを有する場合、当該配列部分６ｓにアウターリバースブロックプライマーが結合し、ＤＮＡ伸長反応を開始するからである。第１一本鎖ＤＮＡ６および第２一本鎖ＤＮＡ７が複数の類似配列６ｓおよび複数の類似配列７ｓをそれぞれ有する場合には、大量の望まれない増幅産物が引き起こされ得る。この詳細は、実施例１および比較例１ｂ、ならびに実施例３および比較例３ｂを参照されたい。
　アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）の濃度よりも高い濃度を有することが好ましい。より具体的には、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）の５倍の濃度を有することが好ましく、１０倍の濃度を有することがさらに好ましい。
　アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）も、アウターリバースプライマー（５ｏｒｂ）の濃度よりも高い濃度を有することが好ましい。より具体的には、アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、アウターリバースプライマー（５ｏｒ）の５倍の濃度を有することが好ましく、１０倍の濃度を有することがさらに好ましい。
　通常のＰＣＲと同様、第１段階のＰＣＲおよび第２段階のＰＣＲにおいて、必要に応じて、ｐＨ緩衝作用を有する成分、ＭｇＣｌ２のような塩、ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、牛血清アルブミン、およびｇｌｙｃｅｒｏｌのような試薬がさらに混合され得る。
　（実施の形態２）
　本実施の形態２を、図５を参照しながら説明する。本実施の形態２と実施の形態１との間の相違点は、インナーリバースプライマー（５ｉｒ）がアウターリバースプライマー（５ｏｒ）を兼ねることにある。
　本実施の形態２においても、まず、図１と同様、アウタープライマーを用いて第１段階のＰＣＲが行われる。実施の形態１とは異なり、実施の形態２における第１段階のＰＣＲでは、混合液はインナーリバースプライマー（５ｉｒ）を含有する。第１段階のＰＣＲは、第２非増幅配列６ｂ－一本鎖標的配列１ａからなる中間一本鎖標的配列および第６非増幅配列７ｂ－相補的一本鎖標的配列１ｂからなる相補的中間一本鎖標的配列を産生する。
　第２段階のＰＣＲの前に、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）が混合される。実施の形態１とは異なり、アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は混合されない。第２段階のＰＣＲは、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）およびインナーリバースプライマー（５ｉｒ）によって、一本鎖標的配列１ａおよび相補的一本鎖標的配列１ｂを増幅する。
　本実施例および比較例で用いられる鋳型ＤＮＡは、自動ＤＮＡ抽出装置ＱＩＡｃｕｂｅ（株式会社キアゲン製）を用いてヒトの血液試料より調製した。
　全てのプライマーおよびアウターフォワードブロック核酸およびアウターリバースブロック核酸は、つくばオリゴサービス株式会社より購入した。
　アウターフォワードブロック核酸およびアウターリバースブロック核酸のいずれもが、その３’末端がリン酸基によって修飾されていた。
　ｄＮＴＰは、インビトロジェン株式会社より購入した。ＰＣＲ後の電気泳動解析のためにＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）が用いられた。
　以下の実施例１、比較例１ａ、および比較例１ｂでは、標的配列はヒトのＡＢＯ式血液型遺伝子に含まれるＤＮＡ断片であった。
　（比較例１ａ）
　本比較例１ａでは、アウターフォワードプライマーの配列は５’－ＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＴＧＧＣＣＧＣＡＣ－３’（配列番号１、以降、「ＡＢＯ－ＯＦ」）であった。アウターリバースプライマーの配列は５’－ＣＣＴＧＧＧＴＣＴＣＴＡＣＣＣＴＣＧＧＣ－３’（配列番号２、以降、「ＡＢＯ－ＯＲ」）であった。このプライマー対は、ＡＢ型の血液型を有するヒトのＡＢＯ式血液型遺伝子内に含まれる２１０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅する。このプライマー対は、Ｏ型の血液型を有するヒトのＡＢＯ式血液型遺伝子内に含まれる２０９ｂｐのＤＮＡ断片を増幅する。
　インナーフォワードプライマーの配列は５’－ＴＧＣＡＧＴＡＧＧＡＡＧＧＡＴＧＴＣＣＴＣ－３’（配列番号３、以降、「ＡＢＯ－ＩＦ」）であった。インナーリバースプライマーの配列は５’－ＴＴＣＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡＣＡＧＴＴＡＡＣ－３’（配列番号４、以降、「ＡＢＯ－ＩＲ」）であった。このＡＢＯ－ＩＦとＡＢＯ－ＩＲのプライマー対は、上記２１０ｂｐのＤＮＡ断片内に存在する１４０ｂｐのＤＮＡ断片（血液型がＡＢの場合。Ｏ型の場合は１３９ｂｐのＤＮＡ断片）を増幅する。これらのプライマーを用いて以下の通り入れ子型ＰＣＲを行った。
　第１段階のＰＣＲ溶液の組成は、以下の通りであった。
　１×　ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ（クロンテック社製）、
　１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（クロンテック社製）、
　２００μＭ　ｄＮＴＰ、
　１μＭ　ＡＢＯ－ＯＦ、
　１μＭ　ＡＢＯ－ＯＲ、０．５ｎｇ／μＬ
　５ｎｇ／μｌ　ゲノムＤＮＡ（ＡＢ型被験者由来）
　全容量：１０μＬ
　ＰＣＲの温度プロファイル１Ａ～Ｃは表１の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　二段階目のＰＣＲ溶液は、第１段階のＰＣＲ後の反応液に０．５μＬの２０μＭ　ＡＢＯ－ＩＦおよび０．５μＬの２０μＭ　ＡＢＯ－ＩＲを添加することによって調製された。
　図６（Ａ）は、プロファイル１Ａによる電気泳動解析結果を示す。ＡＢＯ－ＩＦとＡＢＯ－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片（すなわち、標的配列）だけでなく、ＡＢＯ－ＯＦとＡＢＯ－ＯＲとの組み合わせから得られた望まれないＤＮＡ断片も検出されたことを図６（Ａ）は示す。さらに、図６（Ａ）は、これらの増幅産物のピーク以外にも、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＢＯ－ＩＦとＡＢＯ－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、６２．５ｎＭであった。
　図７（Ａ）は、プロファイル１Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図６（Ａ）と同様、図７（Ａ）もまた、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＢＯ－ＩＦとＡＢＯ－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、１３７．８ｎＭであった。
　図８（Ａ）は、プロファイル１Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図６（Ａ）と同様、図８（Ａ）もまた、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＢＯ－ＩＦとＡＢＯ－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、１５７．０ｎＭであった。
　（実施例１）
　本実施例１では、比較例１ａと同じアウターフォワードプライマー（ＡＢＯ－ＯＦ）、アウターリバースプライマー（ＡＢＯ－ＯＲ）、インナーフォワードプライマー（ＡＢＯ－ＩＦ）、インナーリバースプライマー（ＡＢＯ－ＩＲ）を用いた。これらのプライマーを用いて以下の通り入れ子型ＰＣＲを行った。
　第１段階のＰＣＲ溶液の組成は、以下の通り、比較例１ａと全く同じであった。
　１×　ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ、
　１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ　Ｔａｑ　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ
　２００μＭ　ｄＮＴＰ
　１μＭ　ＡＢＯ－ＯＦ
　１μＭ　ＡＢＯ－ＯＲ
　０．５ｎｇ／μＬ　ゲノムＤＮＡ
　全容量：１０μＬ
　温度プロファイル１は、比較例１ａと同様であった。
　二段階目のＰＣＲ溶液は、第１段階のＰＣＲ後の反応液に、
　０．５μＬの２０μＭ　ＡＢＯ－ＩＦ
　０．５μＬの２０μＭ　ＡＢＯ－ＩＲ
　１μＬのアウターフォワードブロック核酸、および
　１μＬのアウターリバースブロック核酸
を添加することによって調製された。
　当該アウターフォワードブロック核酸は、５’－ＧＴＧＣＧＧＣＣＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣ－３’（配列番号５）からなり、かつその３’末端がリン酸化修飾された濃度１００μＭのオリゴＤＮＡ（以降、「ＡＢＯ－ＯＦ－Ｂｌｏｃｋ」）であった。この配列は、ＡＢＯ－ＯＦに対して相補的であった。
　当該アウターリバースブロック核酸は、５’－ＧＣＣＧＡＧＧＧＴＡＧＡＧＡＣＣＣＡＧＧ－３’（配列番号６）からなり、かつその３’末端がリン酸化修飾された１００μＭのオリゴＤＮＡ（以降、「ＡＢＯ－ＯＲ－Ｂｌｏｃｋ」）であった。この配列は、ＡＢＯ－ＯＲに対して相補的であった
　図６（Ｂ）は、プロファイル１Ａによる電気泳動解析結果を示す。ＡＢＯ－ＩＦとＡＢＯ－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片（すなわち、標的配列）は検出されたが、ＡＢＯ－ＯＦとＡＢＯ－ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片はほとんど検出されなかったことを図６（Ｂ）は示す。さらに、図６（Ｂ）は、非特異的な増幅産物を示すピークをほとんど示していない。ＡＢＯ－ＩＦとＡＢＯ－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、４７８．６ｎＭであった。図６（Ｂ）から理解されるように、二段階目のＰＣＲ溶液がＡＢＯ－ＯＦ－ＢｌｏｃｋおよびＡＢＯ－ＯＲ－Ｂｌｏｃｋを含有するため、ＡＢＯ－ＩＦとＡＢＯ－ＩＲの組み合わせからのＰＣＲが極めて効率的に行われ、そして非特異的な増幅が著しく抑制される。
　図９は、非特異的な増幅の抑制を定量的に示している。これらは、電気泳動解析によって検出された全ての非特異的増幅産物が増幅される際に産生されたピロリン酸濃度を計算により求めた棒グラフである。
　ＤＮＡ伸長反応においては、一塩基の伸長反応が進むごとに一分子のピロリン酸が産生されることは周知である。非特異的に増幅された各ＤＮＡ断片の長さ（ｂｐ）×濃度（ｎＭ）を求め、それらを全て足し合わせることによって、全ての非特異的増幅産物が増幅される際に産生されたピロリン酸濃度を求められ得る。各ＤＮＡ断片の長さおよび濃度はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００より求められ得る。
　図６（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図６（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ４５％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図９（１）および図９（２）は示す。反応後の溶液が含有するピロリン酸の濃度を測定することによって、ＤＮＡ増幅の濃度が測定され得る。非特異的な増幅により産生されるピロリン酸は大きなノイズとなり得る。しかし、ブロック核酸の添加は、非特異的な増幅により産生されるピロリン酸によるノイズを低減し得る。
　図７（Ｂ）は、プロファイル１Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図６（Ｂ）と同様、標的配列は検出されたが、ＡＢＯ－ＯＦとＡＢＯ－ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片を含め、非特異的な増幅産物を示すピークを図７（Ｂ）はほとんど示していない。ＡＢＯ－ＩＦとＡＢＯ－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、５１６．５ｎＭであった。
　図７（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図７（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ６６％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図９（３）および図９（４）は示す。
　図８（Ｂ）は、プロファイル１Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図６（Ｂ）と同様、標的配列は検出されたが、ＡＢＯ－ＯＦとＡＢＯ－ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片を含め、非特異的な増幅産物を示すピークを図８（Ｂ）はほとんど示していない。ＡＢＯ－ＩＦとＡＢＯ－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、３７５．２ｎＭであった。
　図７（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図７（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ６１％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図９（５）および図９（６）は示す。
　実施例１および比較例１ａは、ブロック核酸の添加が、一本鎖標的配列の増幅効率を著しく高め、かつ非特異的増幅を大きく抑制し得ることを示している。
　念のため、本発明者らは、ＡＢＯ－ＯＦ－Ｂｌｏｃｋだけを第１段階のＰＣＲ後に添加して実験した。その結果、この場合も、ＡＢＯ－ＯＦ－ＢｌｏｃｋおよびＡＢＯ－ＯＲ－Ｂｌｏｃｋの両方を添加した場合ほどではないが、ＡＢＯ－ＯＦ－ＢｌｏｃｋおよびＡＢＯ－ＯＲ－Ｂｌｏｃｋのいずれも添加しなかった場合に比べ、標的配列の増幅効率が高められ、かつ非特異的増幅が抑制されたことが確認された。
　（比較例１ｂ）
　比較例１ｂでは、図４のように、３’末端がリン酸化修飾されていないＡＢＯ－ＯＦ－Ｂｌｏｃｋ（図４における「アウターフォワードプライマー」）および３’末端がリン酸化修飾されていないＡＢＯ－ＯＲ－Ｂｌｏｃｋ（図４における「アウターリバースプライマー」）が用いられた。プロファイル１Ａが用いられた。
　図１０はその電気泳動結果を示す。図１０におけるＡＢＯ－ＩＦとＡＢＯ－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片濃度は、図６（Ｂ）のそれにより明らかに小さい。さらに、図１０における非特異的増幅の抑制効果は、図６（Ｂ）のそれより明らかに小さい。
　以上の結果より、３’末端をリン酸化修飾しないブロックプライマーでは、充分な非特異的増幅の抑制効果を得られなかった。
　以下の実施例２および比較例２は図５に対応する。以下の実施例２および比較例２では、標的配列はヒトのＡＬＤＨ２遺伝子に含まれるＤＮＡ断片であった。
　（比較例２）
　本比較例２では、アウターフォワードプライマーの配列は５’－ＣＡＡＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＣＴ－３’（配列番号７、以降、「ＡＬＤＨ２－ＯＦ」）であった。アウターリバースプライマーの配列は５’－ＧＧＣＡＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＣＴＣ－３’（配列番号８、以降、「ＡＬＤＨ２－ＯＲ」）であった。このプライマー対は、ヒトのＡＬＤＨ２遺伝子内に含まれる２５１ｂｐのＤＮＡ断片を増幅する。
　インナーフォワードプライマーの配列は５’－ＧＴＡＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣ－３’（配列番号９、以降、「ＡＬＤＨ２－ＩＦ」）であった。インナーリバースプライマーの配列はＡＬＤＨ２－ＯＲと同じである。ＡＬＤＨ２－ＩＦおよびＡＬＤＨ２－ＯＲとのプライマー対は、上記２５１ｂｐのＤＮＡ断片内に存在する１６０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し得る。これらのプライマーを用いて以下の通り入れ子型ＰＣＲを行った。
　第１段階のＰＣＲ溶液の組成は、以下の通りである。
　０．０５Ｕ／μＬ　ＴａＫａＲａ　ＬＡ　Ｔａｑ　ＨＳ（タカラバイオ株式会社製）、
　１×ＬＡ　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＩＩ　（Ｍｇ２＋　ｐｌｕｓ）（タカラバイオ株式会社製）、
　２００μＭ　ｄＮＴＰ、
　１μＭ　ＡＬＤＨ２－ＯＦ、
　１μＭ　ＡＬＤＨ２－ＯＲ、
　０．８３ｎｇ／μＬ　ゲノムＤＮＡ
　全容量：１０μＬ
　ＰＣＲの温度プロファイル２Ａ～Ｃは表２の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　二段階目のＰＣＲ溶液は、第１段階のＰＣＲ後の反応液に１０μＭ　ＡＬＤＨ２－ＩＦを１μＬ添加することによって調製された。
　図１１（Ａ）は、プロファイル２Ａによる電気泳動解析結果を示す。ＡＬＤＨ２－ＩＦとＡＬＤＨ２－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片（すなわち、標的配列）だけでなく、ＡＬＤＨ２－ＯＦとＡＬＤＨ２－ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片も検出されたことを図１１（Ａ）は示す。さらに、図１１（Ａ）は、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＬＤＨ２－ＩＦとＡＬＤＨ２－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、１０．７ｎＭであった。
　図１２（Ａ）は、プロファイル２Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図１１（Ａ）と同様、図１２（Ａ）もまた、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＬＤＨ２－ＩＦとＡＬＤＨ２－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、１３．６ｎＭであった。
　図１３（Ａ）は、プロファイル２Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図１１（Ａ）と同様、図１３（Ａ）もまた、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＬＤＨ２－ＩＦとＡＬＤＨ２－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、９．９ｎＭであった。
　（実施例２）
　実験例２では、第１段階のＰＣＲ後の反応液に、
　１μＬの１０μＭ　ＡＬＤＨ２－ＩＦ、および
　１μＬのアウターフォワードブロック核酸
が添加されたＰＣＲ溶液が用いられた。
　当該アウターフォワードブロック核酸は、５’－ＡＧＣＡＧＴＴＧＡＣＣＣＴＧＴＡＡＴＴＴＧ－３’（配列番号１０）からなり、かつその３’末端がリン酸化修飾された濃度１００μＭのオリゴＤＮＡ（以降、「ＡＬＤＨ２－ＯＦ－Ｂｌｏｃｋ」）であった。この配列は、ＡＬＤＨ２－ＯＦに相補的であった。
　図１１（Ｂ）は、プロファイル２Ａによる電気泳動解析結果を示す。ＡＬＤＨ２－ＩＦとＡＬＤＨ２－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片（すなわち、標的配列）は検出されたが、ＡＬＤＨ２－ＯＦとＡＬＤＨ２－ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片はほとんど検出されなかったことを図１１（Ｂ）は示す。さらに、図１１（Ｂ）は、非特異的な増幅産物を示すピークをほとんど示していない。ＡＬＤＨ２－ＩＦとＡＬＤＨ２－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、５８．６ｎＭであった。図１１（Ｂ）から理解されるように、二段階目のＰＣＲ溶液がＡＬＤＨ２－ＯＦ－ＢｌｏｃｋおよびＡＬＤＨ２－ＯＲ－Ｂｌｏｃｋを含有するため、ＡＬＤＨ２－ＩＦとＡＬＤＨ２－ＩＲの組み合わせからのＰＣＲが極めて効率的に行われ、そして非特異的な増幅が著しく抑制された。
　図１４は、図９と同様、非特異的な増幅の抑制を定量的に示している。図１１（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図１１（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ９５％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図１４（１）および図１４（２）は示す。
　図１２（Ｂ）は、プロファイル２Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図１１（Ｂ）と同様、標的配列は検出されたが、ＡＬＤＨ２－ＯＦとＡＬＤＨ２－ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片を含め、非特異的な増幅産物を示すピークを図１２（Ｂ）はほとんど示していない。ＡＬＤＨ２－ＩＦとＡＬＤＨ２－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、５８．６ｎＭであった。
　図１２（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図１２（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ８７％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図１４（３）および図１４（４）は示す。
　図１３（Ｂ）は、プロファイル２Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図１１（Ｂ）と同様、標的配列は検出されたが、ＡＬＤＨ２－ＯＦとＡＬＤＨ２－ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片を含め、非特異的な増幅産物を示すピークを図１３（Ｂ）はほとんど示していない。ＡＬＤＨ２－ＩＦとＡＬＤＨ２－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、５３．５ｎＭであった。
　図１３（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図１３（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ８１％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図１４（５）および図１４（６）は示す。
　実施例２および比較例２は、ブロック核酸の添加が、標的配列の増幅効率を高め、かつ非特異的増幅を抑制し得ることを示している。
　以下の実施例３、比較例３ａ、および比較例３ｂは図３に対応する。以下の実施例３、比較例３ａ、および比較例３ｂでは、標的配列はヒトのジストロフィン遺伝子に含まれるＤＮＡ断片であった。
　（比較例３）
　本比較例３では、アウターフォワードプライマーの配列は５’－ＧＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＴＣ－３’（配列番号１１、以降、「ＤＹＳＴＲＯ－ＯＦ」）であった。アウターリバースプライマーの配列は５’－ＴＴＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡ－３’（配列番号１２、以降、「ＤＹＳＴＲＯ－ＯＲ」）であった。このプライマー対は、ヒトのジストロフィン遺伝子内に含まれる４５９ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し得る。
　インナーフォワードプライマーの配列は５’－ＡＧＧＣＴＴＧＡＡＡＧＧＧＣＡＡＧＴＡＧＡＡＧＴ－３’（配列番号１３、以降、「ＤＹＳＴＲＯ－ＩＦ」）であった。インナーリバースプライマーの配列は５’－ＧＣＴＧＡＴＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＣＴＴＧＣ－３’（配列番号１４、以降、「ＤＹＳＴＲＯ－ＩＲ」）であった。このＤＹＳＴＲＯ－ＩＦとＤＹＳＴＲＯ－ＯＲのプライマー対は、上記４５９ｂｐのＤＮＡ断片内に存在する１４７ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し得る。これらのプライマーを用いて以下の通り入れ子型ＰＣＲを行った。
　第１段階のＰＣＲ溶液の組成は、以下の通りであった。
　１×　ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ（クロンテック社製）、
　１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（クロンテック社製）、
　２００μＭ　ｄＮＴＰ、
　１μＭ　ＤＹＳＴＲＯ－ＯＦ、
　１μＭ　ＤＹＳＴＲＯ－ＯＲ、
　０．５ｎｇ／μＬ　ゲノムＤＮＡ
　全容量：１０μＬ
　ＰＣＲの温度プロファイル３Ａ～Ｂは表３の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　二段階目のＰＣＲ溶液は、上記第１段階のＰＣＲ後の反応液に０．５μＬの２０μＭ　ＤＹＳＴＲＯ－ＩＦおよび０．５μＬの２０μＭ　ＤＹＳＴＲＯ－ＩＲを添加することによって調製された。
　図１５（Ａ）は、プロファイル３Ａによる電気泳動解析結果を示す。ＤＹＳＴＲＯ－ＩＦとＤＹＳＴＲＯ－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片（すなわち、標的配列）だけでなく、ＤＹＳＴＲＯ－ＯＦとＤＹＳＴＲＯ－ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片も検出されたことを図１５（Ａ）は示す。さらに、図１５（Ａ）は、これらの増幅産物のピーク以外にも、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＤＹＳＴＲＯ－ＩＦとＤＹＳＴＲＯ－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、２９４．５ｎＭであった。
　図１６（Ａ）は、プロファイル３Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図１５（Ａ）と同様、図１６（Ａ）もまた、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＤＹＳＴＲＯ－ＩＦとＤＹＳＴＲＯ－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、１９６．１ｎＭであった。
　（実施例３）
　本実施例３では、比較例３と同じアウターフォワードプライマー（ＤＹＳＴＲＯ－ＯＦ）、アウターリバースプライマー（ＤＹＳＴＲＯ－ＯＲ）、インナーフォワードプライマー（ＤＹＳＴＲＯ－ＩＦ）、およびインナーリバースプライマー（ＤＹＳＴＲＯ－ＩＲ）が用いられた。これらのプライマーを用いて以下の通り入れ子型ＰＣＲを行った。
　第１段階のＰＣＲ溶液の組成および温度プロファイル３Ａ・３Ｂは、比較例３ａと全く同じであった。
　二段階目のＰＣＲ溶液は、第１段階のＰＣＲ後の反応液に、
　０．５μＬの２０μＭ　ＤＹＳＴＲＯ－ＩＦ
　０．５μＬの２０μＭ　ＤＹＳＴＲＯ－ＩＲ
　１μＬのアウターフォワードブロック核酸、および
　１μＬのアウターリバースブロック核酸
を添加することによって調製された。
　当該アウターフォワードブロック核酸は、５’－ＧＡＣＴＴＴＴＴＣＴＣＡＡＣＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＴＣ－３’（配列番号１５）からなり、かつその３’末端がリン酸化修飾された１００μＭのオリゴＤＮＡ（以降、「ＤＹＳＴＲＯ－ＯＦ－Ｂｌｏｃｋ」）であった。この配列は、ＤＹＳＴＲＯ－ＯＦに対して相補的であった。
　当該アウターリバースブロック核酸は、５’－ＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＧＡＴＧＴＧＧＴＡＧＡＡ－３’（配列番号１６）からなり、かつその３’末端がリン酸化修飾された１００μＭのオリゴＤＮＡ（以降、「ＤＹＳＴＲＯ－ＯＲ－Ｂｌｏｃｋ」）であった。この配列は、ＤＹＳＴＲＯ－ＯＲに対して相補的であった。
　図１５（Ｂ）は、プロファイル３Ａによる電気泳動解析結果を示す。図１５（Ｂ）から理解されるように、ＤＹＳＴＲＯ－ＯＦとＤＹＳＴＲＯ－ＯＲの組み合わせからの増幅産物濃度、ＤＹＳＴＲＯ－ＯＦとＤＹＳＴＲＯ－ＩＲの組み合わせからの増幅産物濃度、およびＤＹＳＴＲＯ－ＩＦとＤＹＳＴＲＯ－ＯＲの組み合わせからの増幅産物濃度は、いずれも、検出限界以下であった。
　ＤＹＳＴＲＯ－ＩＦとＤＹＳＴＲＯ－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は５９３．２ｎＭであった。図１５（Ｂ）から理解されるように、二段階目のＰＣＲ溶液がＤＹＳＴＲＯ－ＯＦ－ＢｌｏｃｋおよびＤＹＳＴＲＯ－ＯＲ－Ｂｌｏｃｋを含有するため、ＤＹＳＴＲＯ－ＩＦとＤＹＳＴＲＯ－ＩＲの組み合わせによるＰＣＲが極めて効率的に行われ、そして非特異的な増幅が著しく抑制された。
　図１６（Ｂ）は、プロファイル３Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図１６（Ｂ）から理解されるように、ＤＹＳＴＲＯ－ＯＦとＤＹＳＴＲＯ－ＯＲの組み合わせからの増幅産物濃度、ＤＹＳＴＲＯ－ＯＦとＤＹＳＴＲＯ－ＩＲの組み合わせからの増幅産物濃度、およびＤＹＳＴＲＯ－ＩＦとＤＹＳＴＲＯ－ＯＲの組み合わせからの増幅産物濃度は、いずれも、検出限界以下であった。
　ＤＹＳＴＲＯ－ＩＦとＤＹＳＴＲＯ－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は５７１．６ｎＭであった。図１６（Ｂ）から理解されるように、二段階目のＰＣＲ溶液がＤＹＳＴＲＯ－ＯＦ－ＢｌｏｃｋおよびＤＹＳＴＲＯ－ＯＲ－Ｂｌｏｃｋを含有するため、ＤＹＳＴＲＯ－ＩＦとＤＹＳＴＲＯ－ＩＲとの組み合わせによるＰＣＲが極めて効率的に行われ、そして非特異的な増幅が著しく抑制された。
　（比較例３ｂ）
　比較例３ｂでは、図４のように、３’末端がリン酸化修飾されていないＤＹＳＴＲＯ－ＯＦ－Ｂｌｏｃｋ（図４における「アウターフォワードプライマー」）および３’末端がリン酸化修飾されていないＤＹＳＴＲＯ－ＯＲ－Ｂｌｏｃｋ（図４における「アウターリバースプライマー」）が用いられた。プロファイル３Ａが用いられた。
　図１７はその電気泳動結果を示す。図１７におけるＡＢＯ－ＩＦとＡＢＯ－ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片濃度は、図１５（Ｂ）および図１６（Ｂ）のそれらより明らかに小さい。さらに、図１７における非特異的増幅の抑制効果は、図１５（Ｂ）および図１６（Ｂ）のそれらより明らかに小さい。
　以上の結果より、３’末端をリン酸化修飾しないブロックプライマーでは、充分な非特異的増幅の抑制効果を得られなかった。
　本発明は、標的配列を増幅する方法であって、標的配列の高い増幅効率、および非特異的増幅の著しい抑制効果を示す標的配列を増幅する方法を提供する。
　１　標的配列
　　１ａ　一本鎖標的配列
　　１ｂ　相補的一本鎖標的配列

　４ｏｆ　アウターフォワードプライマー
　４ｏｒｂ　アウターフォワードブロック核酸
　４ｉｆ　インナーフォワードプライマー
　５ｏｒ　アウターリバースプライマー
　５ｉｒ　インナーリバースプライマー
　５ｏｒｂ　アウターリバースブロック核酸

　６　第１一本鎖ＤＮＡ
　　６ａ　第１非増幅配列
　　６ｂ　第２非増幅配列
　　６ｃ　第３非増幅配列
　　６ｄ　第４非増幅配列
　　６ｍ　中間一本鎖標的配列
　　６ｓ　アウターリバースブロックプライマーに相補的な配列と同一または類似の配列部分
　７　第２一本鎖ＤＮＡ
　　７ａ　第５非増幅配列
　　７ｂ　第６非増幅配列
　　７ｃ　第７非増幅配列
　　７ｄ　第８非増幅配列
　　７ｍ　相補的中間一本鎖標的配列
　　７ｓ　アウターフォワードブロックプライマーに相補的な配列と同一または類似の配列部分
配列番号１：ＡＢＯ式血液型遺伝子のためのアウターフォワードプライマー
配列番号２：ＡＢＯ式血液型遺伝子のためのアウターリバースプライマー
配列番号３：ＡＢＯ式血液型遺伝子のためのインナーフォワードプライマー
配列番号４：ＡＢＯ式血液型遺伝子のためのインナーリバースプライマー
配列番号５：ＡＢＯ式血液型遺伝子のためのアウターフォワードプライマーのブロック核酸（ＤＮＡ）
配列番号６：ＡＢＯ式血液型遺伝子のためのアウターリバースプライマーのブロック核酸（ＤＮＡ）
配列番号７：ＡＬＤＨ２遺伝子のためのアウターフォワードプライマー
配列番号８：　ＡＬＤＨ２遺伝子のためのアウターリバースプライマーまたはインナーリバースプライマー
配列番号９：　ＡＬＤＨ２遺伝子のためのインナーフォワードプライマー
配列番号１０：ＡＬＤＨ２遺伝子のためのアウターフォワードプライマーのブロック核酸（ＤＮＡ）
配列番号１１：ジストロフィン遺伝子のためのアウターフォワードプライマー
配列番号１２：ジストロフィン遺伝子のためのアウターリバースプライマー
配列番号１３：ジストロフィン遺伝子のためのインナーフォワードプライマー
配列番号１４：ジストロフィン遺伝子のためのインナーリバースプライマー
配列番号１５：ジストロフィン遺伝子のためのアウターフォワードプライマーのブロック核酸（ＤＮＡ）
配列番号１６：ジストロフィン遺伝子のためのアウターリバースプライマーのブロック核酸（ＤＮＡ）

Claims (12)

  1. 　第１一本鎖ＤＮＡ（６）および第２一本鎖ＤＮＡ（７）からなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列（１）を増幅する方法であって、
    　前記二本鎖標的配列（１）は、一本鎖標的配列（１ａ）および相補的一本鎖標的配列（１ｂ）からなり、
    　前記第１一本鎖ＤＮＡ（６）は、３’末端－第１非増幅配列（６ａ）－第２非増幅配列（６ｂ）－前記一本鎖標的配列（１ａ）－第３非増幅配列（６ｃ）－第４非増幅配列（６ｄ）－５’末端からなり、
    　前記第２一本鎖ＤＮＡ（７）は、５’末端－第５非増幅配列（７ａ）－第６非増幅配列（７ｂ）－前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）－第７非増幅配列（７ｃ）－第８非増幅配列（７ｄ）－３’末端からなり、
    　前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）、前記第５非増幅配列（７ａ）、第６非増幅配列（７ｂ）、第７非増幅配列（７ｃ）、および第８非増幅配列（８ｃ）は、それぞれ、前記一本鎖標的配列（１ａ）、前記第１非増幅配列（６ａ）、前記第２非増幅配列（６ｂ）、前記第３非増幅配列（６ｃ）および前記第４非増幅配列（６ｄ）と相補的であり、
    　前記方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
    　ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ（６・７）、およびアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）、およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて中間二本鎖ＤＮＡを増幅する工程（Ａ）、
    　ここで、前記中間二本鎖ＤＮＡは、中間標的配列および相補的中間標的配列からなり、
    　前記中間標的配列は、３’末端－第２非増幅配列（６ｂ）－前記一本鎖標的配列（１ａ）－第３非増幅配列（６ｃ）－５’末端からなり、
    　前記相補的中間標的配列は、５’末端－第６非増幅配列（７ｂ）－前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）－第７非増幅配列（７ｃ）－３’末端からなり、
    　前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）は、前記第２非増幅配列（６ｂ）に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
    　前記アウターリバースプライマー（５ｏｒ）は、前記第７非増幅配列に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
    　ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記中間二本鎖ＤＮＡ、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）、インナーリバースプライマー（５ｉｒ）、およびアウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的配列（１）を特異的に増幅する工程（Ｂ）、
    　前記インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）は、前記一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
    　前記インナーリバースプライマー（５ｉｒ）は、前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
    　前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、方法。
  2. 　前記工程（Ｂ）において、さらにアウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）が混合され、
    　前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、前記アウターリバースプライマー（５ｏｒ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄからなる、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄからなる、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、請求項２に記載の方法。
  7. 　前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄからなる、請求項２に記載の方法。
  8. 　前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄからなる、請求項２に記載の方法。
  9. 　第１一本鎖ＤＮＡ（６）および第２一本鎖ＤＮＡ（７）からなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列（１）を増幅する方法であって、
    　前記二本鎖標的配列（１）は、一本鎖標的配列（１ａ）および相補的一本鎖標的配列（１ｂ）からなり、
    　前記第１一本鎖ＤＮＡ（６）は、３’末端－第１非増幅配列（６ａ）－第２非増幅配列（６ｂ）－前記一本鎖標的配列（１ａ）－第３非増幅配列（６ｃ）－第４非増幅配列（６ｄ）－５’末端からなり、
    　前記第２一本鎖ＤＮＡ（７）は、５’末端－第５非増幅配列（７ａ）－第６非増幅配列（７ｂ）－前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）－第７非増幅配列（７ｃ）－第８非増幅配列（７ｄ）－３’末端からなり、
    　前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）、前記第５非増幅配列（７ａ）、第６非増幅配列（７ｂ）、第７非増幅配列（７ｃ）、および第８非増幅配列（８ｃ）は、それぞれ、前記一本鎖標的配列（１ａ）、前記第１非増幅配列（６ａ）、前記第２非増幅配列（６ｂ）、前記第３非増幅配列（６ｃ）および前記第４非増幅配列（６ｄ）と相補的であり、
    　前記方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
    　ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ（６・７）、およびアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）、およびインナーリバースプライマー（５ｉｒ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて中間二本鎖ＤＮＡを増幅する工程（Ａ）、
    　ここで、前記中間二本鎖ＤＮＡは、中間標的配列および相補的中間標的配列からなり、
    　前記中間標的配列は、３’末端－第２非増幅配列（６ｂ）－前記一本鎖標的配列（１ａ）－５’末端からなり、
    　前記相補的中間標的配列は、５’末端－第６非増幅配列（７ｂ）－前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）－３’末端からなり、
    　前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）は、前記第２非増幅配列（６ｂ）に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
    　前記インナーリバースプライマー（５ｉｒ）は、前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
    　ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記中間二本鎖ＤＮＡ、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）、、およびアウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的配列（１）を特異的に増幅する工程（Ｂ）、
    　前記インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）は、前記一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
    　前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、方法。
  10. 　前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄからなる、請求項９に記載の方法。
  12. 　前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄからなる、請求項９に記載の方法。
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