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WO2010117010A1 - 腫瘍マーカーおよびその利用 - Google Patents

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Publication number
WO2010117010A1
WO2010117010A1 PCT/JP2010/056293 JP2010056293W WO2010117010A1 WO 2010117010 A1 WO2010117010 A1 WO 2010117010A1 JP 2010056293 W JP2010056293 W JP 2010056293W WO 2010117010 A1 WO2010117010 A1 WO 2010117010A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
snx5
antibody
human
detecting
tissue
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/056293
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English (en)
French (fr)
Inventor
慎吾 一宮
智樹 菊地
暁子 外岡
昇志 佐藤
Original Assignee
北海道公立大学法人札幌医科大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 北海道公立大学法人札幌医科大学 filed Critical 北海道公立大学法人札幌医科大学
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Priority to US13/263,015 priority patent/US20120129168A1/en
Priority to JP2011508374A priority patent/JPWO2010117010A1/ja
Priority to CN2010800141156A priority patent/CN102365551A/zh
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/046—Thyroid disorders

Definitions

  • the present invention relates to a tumor marker and use thereof, and more particularly, to a tumor marker detection method suitable for diagnosis of papillary thyroid cancer and a tool used in the method.
  • Papillary thyroid cancer is the most frequently occurring malignant tumor among thyroid cancers, and it can have a poor prognosis if it metastasizes to the lungs or cervical lymph nodes. Therefore, a definitive diagnosis of papillary thyroid cancer is very important. Histopathological examination is indispensable for the definitive diagnosis of papillary thyroid cancer. However, because there are many malignant tumors with papillary structures other than papillary thyroid cancer, not only whether the lesion is primary, but also the tumorous lesions of lymph node metastasis are determined. It is very difficult.
  • the characteristics of the pathological tissue of papillary thyroid cancer are evaluated by the expression pattern of molecules specific to thyroid tissue.
  • Known thyroid markers include thyroglobulin and thyroid transcription factor 1 (TTF-1).
  • Thyroglobulin is a dimeric glycoprotein secreted from thyroid tissue and is known to increase in cells or blood in thyroid diseases.
  • the measurement of the amount of thyroglobulin in the blood is used to observe the progress of thyroid cancer after surgery (especially, the possibility of metastasis).
  • the molecules that are reported to be specifically expressed in thyroid tissue there are molecules that are also expressed in other organs. Therefore, an excellent tumor marker specific for papillary thyroid cancer is eagerly desired.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a tumor marker specific for papillary thyroid cancer and a technique for discriminating thyroid papillary cancer using the tumor marker. .
  • SNX5 As a result of producing an antibody against human SNX5 protein and performing immunohistochemical staining for various human normal tissues and neoplastic lesions using this anti-human SNX5 antibody, SNX5 was found in follicular epithelium of thyroid gland. Responds specifically and is particularly responsive to papillary thyroid cancer, a malignant tumor derived from the thyroid gland, as well as thyroid cancers of other histological types, papillary carcinoma derived from the digestive tract, and papillae derived from the lungs The present inventors have found that almost no expression of SNX5 is observed in thyroid carcinomas, and have completed the present invention.
  • the method according to the present invention is a method for detecting a tumor marker, and includes a step of detecting SNX5 in a subject sample.
  • the subject sample is preferably a tissue collected from the subject or a culture or a slice thereof, but may be a cell lysate prepared from a tissue collected from the subject or a culture thereof.
  • the tissue is preferably a thyroid tissue, but may be a body fluid such as blood.
  • the subject is preferably a patient who may have thyroid disease, but may be a patient who has already developed papillary thyroid cancer.
  • the SNX5 is preferably a SNX5 protein or a fragment thereof.
  • the step of detecting SNX5 is preferably an immunoassay using an anti-SNX5 antibody.
  • the anti-SNX5 antibody used is preferably an anti-human SNX5 antibody, more preferably an anti-human SNX5 monoclonal antibody, and a mouse anti-human SNX5 monoclonal antibody produced from hybridoma 48C2 or a binding activity equivalent to the antibody. Most preferred is a monoclonal antibody having
  • the SNX5 may be a SNX5 gene or a fragment thereof.
  • the step of detecting SNX5 is preferably a step of hybridizing a nucleic acid probe to the SNX5 gene or a fragment thereof.
  • the nucleic acid probe is preferably a hybridization probe, but may be a PCR primer.
  • the method according to the present invention includes both a step of detecting an SNX5 protein or a fragment thereof and a step of detecting an SNX5 gene or a fragment thereof.
  • the above method may be a method for providing a diagnostic criterion for papillary thyroid cancer, and may be a method for providing a criterion for differentiation of a malignant tumor exhibiting a papillary morphology.
  • the above method may also be a method for providing a criterion for determining whether or not a lesion of papillary thyroid cancer is a primary lesion.
  • the above method may be a method for providing a criterion for determining whether or not a tumor having metastasized to a cervical lymph node is derived from the thyroid gland.
  • the kit according to the present invention is a kit for detecting a tumor marker and is characterized by comprising an anti-SNX5 antibody.
  • the kit according to the present invention preferably further comprises a reagent for detecting the antibody.
  • the antibody is preferably an anti-human SNX5 antibody, more preferably an anti-human SNX5 monoclonal antibody, a mouse anti-human SNX5 monoclonal antibody produced from hybridoma 48C2, or a monoclonal antibody having a binding activity equivalent to the antibody. Most preferably.
  • the kit according to the present invention is a kit for detecting a tumor marker, and is characterized by comprising an oligonucleotide capable of hybridizing to the SNX5 gene or a fragment thereof.
  • the kit according to the present invention preferably further comprises a reagent for detecting the oligonucleotide.
  • the oligonucleotide is preferably a hybridization probe for the SNX5 gene or a fragment thereof, but may be a PCR primer.
  • the kit is preferably a kit for providing a diagnostic standard for papillary thyroid cancer, but may also be a kit for providing a criterion for identifying a malignant tumor exhibiting a papillary morphology.
  • the kit may be a kit for providing a criterion for determining whether or not a lesion of papillary thyroid cancer is a primary lesion.
  • the kit may be a kit for providing a criterion for determining whether or not a tumor with cervical lymph node metastasis originates from the thyroid gland.
  • the present invention it is possible to detect a tumor marker suitable for diagnosis of whether or not it is papillary thyroid cancer.
  • SNX5 is highly expressed in papillary thyroid cancer, which is a malignant tumor derived from the thyroid gland, but thyroid cancer exhibiting other tissue types, papillary adenocarcinoma derived from the digestive tract It was found that almost no expression was observed in lung-derived papillary adenocarcinoma.
  • SNX5 Human sorting nexin-5
  • Patent Document 1 lists many gene candidates related to multiple myeloma, and one of them is SNX5.
  • Patent Document 2 lists many candidates for tumor-related peptides (antigen peptides) that bind MHC molecules, and one of them is a partial fragment of SNX5 protein (amino acids 292 to 300: SEQ ID NO: 524 of Patent Document 2). Is listed.
  • the specificity of SNX5 in papillary thyroid cancer is not disclosed or suggested in any literature.
  • the present invention provides an excellent tumor marker for papillary thyroid cancer.
  • tumor marker The present invention provides an excellent tumor marker for papillary thyroid cancer.
  • the tumor marker of the present invention is SNX5 protein or a fragment thereof.
  • the tumor marker of the present invention is the SNX5 gene or a fragment thereof.
  • a SNX5 protein is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; alternatively, one or several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are deleted, substituted or A polypeptide comprising an added amino acid sequence and having SNX5 activity.
  • the SNX5 protein is a polypeptide encoded by a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2; a nucleotide in which one or several bases of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 are deleted, substituted or added
  • a polypeptide encoded by a polynucleotide comprising the sequence and having SNX5 activity a polypeptide encoded by a polynucleotide capable of hybridizing under stringent conditions with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having SNX5 activity
  • it may be a polypeptide encoded by a polynucleotide having a homology of 80% or more with the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having SNX5 activity.
  • polypeptide amino acid
  • “one or several” is preferably in the range of 1 to 30, more preferably in the range of 1 to 20, and more preferably 1 to 10 More preferably, it is in the range of 1 to 5, and still more preferably in the range of 1 to 5.
  • a person skilled in the art can easily understand the extent of the number of amino acids indicated by the term “one or several” depending on the length of the target polypeptide.
  • one or several is preferably in the range of 1 to 100, more preferably in the range of 1 to 50, and 1 to 30 More preferably, it is within the range of 1 to 15, and still more preferably within the range of 1 to 15.
  • the term “one or several” is preferably in the range of 1 to 10, more preferably in the range of 1 to 7, more preferably 1 to 5 More preferably, it is within the range, and still more preferably within the range of 1 to 3.
  • the homology for the polypeptide or polynucleotide of interest is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, and more preferably 90% or more. Preferably, it is more preferably 95% or more.
  • SNX5 activity intends the ability to bind to an anti-SNX antibody elicited using a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 as an antigen.
  • the SNX antibody may be an anti-SNX5 antibody described later, and a 48C2 antibody described later is preferable.
  • the polypeptide may be a recombinant human SNX5 protein or an isolated and purified natural human SNX5 protein.
  • the SNX5 gene is a polynucleotide that encodes a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or alternatively one or several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • the SNX5 gene is a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, a nucleotide sequence in which one or several bases of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 are deleted, substituted or added, and SNX5 activity
  • a polynucleotide encoding a polypeptide having SNX5 activity a polynucleotide capable of hybridizing under stringent conditions with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • it may be a polynucleotide that is a polynucleotide having a homology of 80% or more with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encoding a polypeptide having SNX5 activity.
  • SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of SNX5 registered in GenBank (accession number AF121855)
  • SEQ ID NO: 2 is the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • GenBank (accession number) AF121855) corresponds to the open reading frame (positions 181 to 1395) of the nucleotide sequence of SNX5 (SEQ ID NO: 3) registered in AF121855).
  • polypeptide is used interchangeably with “peptide” or “protein” and is intended to be a polymer of amino acids.
  • fragment of a polypeptide is intended to be a partial fragment of the polypeptide.
  • the polypeptides according to the invention may also be produced recombinantly, chemically synthesized or isolated from natural sources.
  • polynucleotide is used interchangeably with “gene”, “nucleic acid” or “nucleic acid molecule” and is intended to be a polymer of nucleotides.
  • a “fragment” of a polynucleotide is intended to be a partial fragment of the polynucleotide.
  • nucleotide sequence is used interchangeably with “nucleic acid sequence” or “base sequence”.
  • the polynucleotide according to the present invention may exist in the form of RNA (for example, mRNA) or in the form of DNA (for example, cDNA or genomic DNA).
  • DNA can be double-stranded or single-stranded.
  • Single-stranded DNA or RNA can be the coding strand (also known as the sense strand) or it can be the non-coding strand (also known as the antisense strand).
  • oligonucleotide is intended to be a combination of several to several tens of nucleotides, and is used interchangeably with “polynucleotide”.
  • the term “stringent (hybridization) conditions” refers to a hybridization solution (50% formamide, 5 ⁇ SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM phosphorous. After overnight incubation at 42 ° C. in sodium acid (pH 7.6), 5 ⁇ Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g / ml denatured sheared salmon sperm DNA, Although it is intended to wash the filter in 1 ⁇ SSC, the washing conditions at high stringency are appropriately changed depending on the polynucleotide to be hybridized. For example, when using mammalian DNA, 0.1% SDS Washing at 65 ° C.
  • the tumor marker of the present invention it is possible to provide a criterion for determining a malignant tumor exhibiting papillary morphology, so that it is easy to diagnose whether or not it is papillary thyroid cancer.
  • the present invention is very effective in determining whether or not a lesion is a primary lesion. Furthermore, by using the present invention, it is possible to more clearly determine whether a tumor that has metastasized to the cervical lymph node is derived from the thyroid gland or another tissue (lung, mammary gland, etc.).
  • the present invention provides a method for detecting a tumor marker.
  • the tumor marker detection method according to the present invention includes a step of detecting SNX5 in a subject sample.
  • the detection method according to the present invention includes a step of detecting SNX5 protein or a fragment thereof.
  • the detection method according to the present invention includes a step of detecting an SNX5 gene or a fragment thereof.
  • a “subject sample” is intended any tissue (including bodily fluids such as blood) or cells collected from a subject, and tissue sections or cells prepared therefrom. Lysates can also be included in the subject sample.
  • Preferred subject samples for use in the present invention include, but are not limited to, tumor tissue and serum.
  • the process of taking out a tissue or a cell directly from a subject as a first stage of sample acquisition is performed by a doctor and is outside the scope of the present invention.
  • the step of determining whether or not the disease is a disease using the result obtained by the method of the present invention is also performed by a doctor and is outside the scope of the present invention.
  • the subject to be the subject of the present invention is preferably a patient who may suffer from thyroid disease, more preferably a patient who develops papillary thyroid cancer, but may be a normal patient.
  • the subject sample is thyroid tissue or a culture thereof collected from a patient who may have thyroid disease, or a tissue section or cell lysate prepared therefrom.
  • the procedure for obtaining a sample can be appropriately selected depending on the desired tissue or cell.
  • the step of detecting SNX5 may be an immunoassay using an anti-SNX5 antibody.
  • immunoassay intends an assay performed utilizing an immunological binding reaction based on an antigen-antibody reaction.
  • Assays that utilize immunological binding reactions include immunohistochemistry, immunoelectron microscopy, western blot, immunoprecipitation, sandwich ELISA assay, radioimmunoassay, and antibody assay (eg, immunodiffusion assay), and affinity chromatography Etc. These techniques are well known in the art, and those skilled in the art can easily carry out the present invention.
  • the anti-SNX5 antibody is preferably an anti-human SNX5 antibody, more preferably a monoclonal antibody, and more preferably a mouse anti-human SNX5 monoclonal antibody (also referred to as 48C2 antibody) produced from hybridoma 48C2.
  • 48C2 antibody recognizes the N-terminal side of human SNX5 protein (positions 1 to 177 of SEQ ID NO: 1: SEQ ID NO: 10) (results not shown).
  • the “SNX5 protein fragment” is a polypeptide consisting of a partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or an amino acid sequence consisting of 8 or more consecutive amino acids thereof. It is preferable that it is polypeptide containing.
  • monoclonal antibodies having binding properties equivalent to those of the 48C2 antibody are also within the range of antibodies suitably used in the present invention.
  • the immunoassay can be immunohistochemical staining.
  • the immunoassay may be a Western blot.
  • the subject sample is blood collected from the subject, the immunoassay can be an ELISA.
  • the mouse anti-human SNX5 monoclonal antibody produced from the hybridoma 48C2 is not only suitable for detecting SNX5 protein by Western blotting or SNX5 protein in formalin-fixed paraffin sections, but also for identifying SNX5 protein in paraform-fixed tissues I made it. So far, the function of SNX5 in the cytoplasm has been reported. Even when this mouse anti-human SNX5 monoclonal antibody was used, it was shown that SNX5 was localized in the cytoplasm. This supports the specificity of this mouse anti-human SNX5 monoclonal antibody.
  • Hybridoma 48C2 is maintained under the control of the Hokkaido University of Medicine Sapporo Medical University Intellectual Property Management Office (060-8556, Minami 1 Nishi 17-chome, Chuo-ku, Sapporo) and should be sold as needed. Is possible.
  • Immunohistochemical examination is very important when performing histopathological diagnosis of malignant tumors.
  • a tumor marker specific to a specific organ or tissue By using a tumor marker specific to a specific organ or tissue, it becomes easy to make a definitive diagnosis of a metastatic lesion whose primary lesion has not yet been established, and a diagnosis or treatment policy can be quickly determined.
  • Various organ-specific molecular markers have been found so far, but antibodies actually used for histopathological diagnosis are limited. In particular, an antibody suitable for differentiating papillary thyroid cancer has not yet been found.
  • the step of detecting SNX5 can be a step of hybridizing a nucleic acid probe to the SNX5 gene or a fragment thereof.
  • the “nucleic acid probe” is not particularly limited as long as it can hybridize to a target nucleic acid, and may be a so-called hybridization probe or a PCR primer.
  • Hybridization techniques and PCR techniques are well known in the art and one of ordinary skill in the art can readily practice the invention.
  • the subject sample is a tissue sample collected from the subject, various techniques known in the art can be employed, for example, in situ hybridization technology, in situ PCR technology, or the like.
  • a conventional PCR technique can be employed.
  • the nucleic acid probe is not particularly limited as long as it is an oligonucleotide containing a partial sequence of the SNX5 gene (or its complementary strand), and may be an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 5 or its complementary sequence, It may be an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 6 to 9 or its complementary sequence. Further, since the 48C2 antibody recognizes the N-terminal side of the human SNX5 protein, the nucleic acid probe may be an oligonucleotide encoding the “SNX5 protein fragment”.
  • the nucleic acid probe is preferably an oligonucleotide consisting of 15 to 50 consecutive bases of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence, more preferably 20 to 50, and still more preferably An oligonucleotide consisting of 20 to 45, most preferably 25 to 40 consecutive bases.
  • the nucleic acid probe is preferably an oligonucleotide consisting of 15 to 50 consecutive bases of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence, more preferably 15 An oligonucleotide consisting of ⁇ 40, more preferably 15-35, most preferably 25-35 consecutive bases.
  • the detection method according to the present embodiment includes the step of detecting the SNX5 gene, it is more preferable to further include the step of detecting the SNX5 protein described above.
  • the method for detecting a tumor marker according to the present invention it is possible to provide a criterion for determining a malignant tumor exhibiting a papillary morphology, so that it is easy to diagnose whether or not it is papillary thyroid cancer. .
  • the present invention is very effective in determining whether or not a lesion is a primary lesion. Furthermore, by using the present invention, it is possible to more clearly determine whether a tumor that has metastasized to the cervical lymph node is derived from the thyroid gland or another tissue (lung, mammary gland, etc.).
  • the method according to the present invention can also be a method that provides a diagnostic criterion for papillary thyroid cancer (for example, a method for obtaining data for diagnosing papillary thyroid cancer). It may also be a method of providing a criterion (for example, a method of acquiring data for distinguishing a malignant tumor exhibiting a papillary morphology). Further, the method according to the present invention provides a criterion for determining whether or not a lesion of papillary thyroid cancer is a primary lesion (for example, for determining whether or not a lesion of papillary thyroid cancer is a primary lesion). It can also be a method of acquiring data.
  • a diagnostic criterion for papillary thyroid cancer for example, a method for obtaining data for diagnosing papillary thyroid cancer. It may also be a method of providing a criterion (for example, a method of acquiring data for distinguishing a malignant tumor exhibiting a papillary morphology). Further, the method according
  • the method according to the present invention provides a criterion for determining whether or not a tumor with cervical lymph node metastasis originates from the thyroid gland (for example, whether or not a tumor with cervical lymph node metastasis originates from the thyroid gland). It may also be a method of acquiring data for determination.
  • the present invention provides a kit for detecting a tumor marker.
  • the kit according to the present invention is characterized by comprising a tool for detecting SNX5 in a subject sample.
  • kit is intended as a package with a container (eg, bottle, plate, tube, dish, etc.) containing a particular material, but as a composition. Forms containing the material in the substance are also encompassed by the term “kit”.
  • the kit preferably includes instructions for using each material.
  • “comprising” is intended to mean being contained in any of the individual containers that make up the kit.
  • the kit which concerns on this invention may be the packaging which packed several different compositions in one, and in the case of a solution form, you may enclose in the container.
  • the kit according to the present invention may comprise substance A and substance B mixed in the same container or in separate containers.
  • the “instructions” may be written or printed on paper or other media, or may be affixed to electronic media such as magnetic tape, computer readable disk or tape, CD-ROM, etc. .
  • the kit according to the present invention may also include a container containing a diluent, a solvent, a washing solution or other reagent.
  • the kit according to the present invention may include instruments and reagents necessary for collecting a subject sample.
  • the kit according to the present invention may be equipped with instruments and reagents necessary for preparing a section or cell lysate from a subject sample.
  • the kit according to the present invention includes an antibody for detecting SNX5 protein or a fragment thereof.
  • the antibody is preferably an anti-human SNX5 antibody, more preferably an anti-human SNX5 monoclonal antibody, a mouse anti-human SNX5 monoclonal antibody produced from hybridoma 48C2, or a monoclonal antibody having a binding activity equivalent to the antibody.
  • the kit according to the present invention preferably further comprises a reagent for detecting the above-described antibody, but as described above, a composition containing an antibody for detecting the SNX5 protein or a fragment thereof. May be provided as
  • the detection kit according to the present invention includes an oligonucleotide for detecting the SNX5 gene or a fragment thereof.
  • the oligonucleotide is preferably an oligonucleotide that can hybridize to the SNX5 gene or a fragment thereof, and is preferably a hybridization probe or a PCR primer for the SNX5 gene or a fragment thereof.
  • the kit according to the present invention preferably further comprises a reagent for detecting the oligonucleotide, but as described above, it contains an oligonucleotide for detecting the SNX5 gene or a fragment thereof. It may be provided as a composition.
  • the kit according to the present invention is preferably a kit for providing a diagnostic criterion for papillary thyroid cancer, but may also be a kit for providing a criterion for identifying a malignant tumor exhibiting a papillary morphology.
  • the kit according to the present invention may also be a kit for providing a criterion for determining whether or not a lesion of papillary thyroid cancer is a primary lesion.
  • the kit according to the present invention may be a kit for providing a criterion for determining whether or not a tumor that has metastasized to a cervical lymph node is derived from the thyroid gland.
  • an object of the present invention is to provide a tumor marker and to provide a diagnostic criterion for papillary thyroid cancer by detecting the tumor marker.
  • the obtained human SNX5 cDNA was inserted into an expression vector for Escherichia coli pET3c (Novagen) and a mammalian expression vector pCMV-HA (BD Bioscience) to prepare pET3c-SNX5 and pCMV-HA-SNX5, respectively.
  • pCMV-HA-SNX5 FW is obtained by ligating a restriction enzyme site or the like to the sequence of the 5 ′ region of human SNX5 cDNA (ATGGCCGCGGTTCCCGAG (SEQ ID NO: 6)), and pCMV-HA-SNX5 RV is human SNX5 cDNA.
  • a restriction enzyme site or the like is ligated to the complementary sequence of the 3 ′ region sequence (ataactgatatgccttcac (SEQ ID NO: 7)).
  • E. coli BL21 introduced with pET3c-SNX5 was cultured, and protein synthesis was induced by IPTG. Subsequently, human SNX5 protein was separated / concentrated from the bacterial cell components. The obtained protein was used as an immunogen, and 6-8 week old Balb / c mice were immunized intraperitoneally (100 ⁇ g) using complete adjuvant (primary immunization only) or incomplete adjuvant (second and subsequent immunizations) as an adjuvant. /individual). Booster immunization was performed every other week for 2 months, and final immunization was performed 3 days before the collection of splenocytes.
  • the collected spleen cells were fused with NS0 mouse myeloma cells using polyethylene glycol, and the fused cells were cultured in a 96-well plate in RPMI1640 medium containing HAT and 10% FBS for 2 to 3 weeks.
  • the anti-human SNX5 monoclonal antibody was screened by Western blotting using the culture supernatant.
  • PCMV-SNX5 was introduced into human 293 cells cultured in DMEM containing 10% FBS and penicillin / streptomycin according to the manufacturer's instructions.
  • the expression of SNX5 in the transformant was performed using the total RNA extracted from the transformant as a template, the forward primer (SNX5 AMP FW: 5'-ccggttaaagagcaaagacg-3 '(SEQ ID NO: 8)) and the reverse primer (SNX5 AMP It was confirmed by RT-PCR using RV: 5′-agctctgcaaaagggagaca-3 ′ (SEQ ID NO: 9)).
  • FIG. 2 shows a cell into which pCMV-SNX5 was introduced (left) and a cell into which pCMV was introduced as a negative control (right). It can be seen that the anti-human SNX5 monoclonal antibody specifically reacts with SNX5.
  • FIG. 3 shows that when an anti-human SNX5 monoclonal antibody was performed using formalin-fixed paraffin-embedded sections of adenocarcinoma tissue. Signals were detected using an automatic immunostaining device (manufactured by DAKO) (FIG. 3). As shown in FIG. 3 (a), strong expression of SNX5 was observed in papillary thyroid cancer. However, no expression of SNX5 was observed in lung adenocarcinoma (FIG. 3 (b)) and breast adenocarcinoma (FIG. 3 (c)) (FIG. 3 (b)).
  • FIG. 4 shows that in immunohistochemical staining using formalin-fixed paraffin sections of papillary thyroid cancer, strong expression of SNX5 was observed in tumor cells.
  • the present inventors found for the first time that SNX5 is highly expressed in papillary thyroid cancer.
  • the mouse anti-human SNX5 monoclonal antibody established by the present inventors has enabled immunohistochemical analysis of not only formalin-fixed paraffin sections but also paraform-fixed tissues.
  • the knowledge obtained by the present invention is that SNX5 is considered to be an excellent marker compared with known thyroid markers such as thyroglobulin and TTF-1, and can provide useful information in pathological diagnosis. Conceivable.
  • serodiagnosis of neoplastic lesions derived from the thyroid gland is considered possible by ELISA using an anti-human SNX5 monoclonal antibody.
  • the use of the present invention facilitates early diagnosis and definitive diagnosis of papillary thyroid cancer.
  • the present invention providing such an excellent tool can be used in the fields of medicine and pharmacy and can greatly contribute to the development of pharmaceuticals and biochemical reagents.

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Abstract

　被験体サンプル中のＳＮＸ５を検出する。甲状腺乳頭癌に特異的な腫瘍マーカーとして用いることによって、甲状腺乳頭癌の診断を容易にする。また、当該腫瘍マーカーを用いた甲状腺乳頭癌の判別技術を提供する。

Description

腫瘍マーカーおよびその利用
　本発明は、腫瘍マーカーおよびその利用に関するものであり、より詳細には、甲状腺乳頭癌の診断に好適な腫瘍マーカーの検出方法および当該方法に用いられるツールに関するものである。
　甲状腺乳頭癌は、甲状腺癌の中で最も発生頻度の高い悪性腫瘍であり、肺や頸部リンパ節へ転移した場合は予後不良となり得る。よって、甲状腺乳頭癌の確定診断は非常に重要である。甲状腺乳頭癌の確定診断には、病理組織学的な検討が不可欠である。しかし、乳頭状の構築物を呈する悪性腫瘍は、甲状腺乳頭癌以外にも多く存在するため、病巣が原発性であるか否かを判断することだけでなく、リンパ節転移の腫瘍性病変を判定することが非常に困難である。
　甲状腺乳頭癌の病理組織の特徴は、甲状腺組織に特異的な分子の発現様式によって評価される。既知の甲状腺マーカーとして、サイログロブリンや甲状腺転写因子１（ｔｈｙｒｏｉｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　１：ＴＴＦ－１）などが知られている。サイログロブリンは甲状腺組織から分泌される二量体の糖タンパク質であり、甲状腺疾患において、細胞中または血液中における濃度が上昇することが知られている。
ＷＯ２００６／１３３３６１（２００６年１２月１４日国際公開） 特表２００８－５０００３３号公表（２００８年１月１０日公表）
Otsuki, T et al., SNX5, a New Member of the Sorting Nexin Family, Binds to the Fanconi Anemia Complementation Group A Protein. Biochemical and Biophysical Research Communications 265: 630-635 (1999) Teasdale, R.D. et al., A large family of endosome-localized proteins related to sorting nexin 1. Biochem. J. 358: 7-16 (2001)
　血液中のサイログロブリン量の測定は、甲状腺癌の手術後における経過の観察（特に、転移の可能性の判断）に用いられている。しかし、サイログロブリンの測定からは、甲状腺癌が良性であるのか、それとも悪性であるのかを判別することができない。また、甲状腺組織に特異的に発現していると報告されている分子の中には他の臓器にも発現している分子がある。よって、甲状腺乳頭癌に特異的な、優れた腫瘍マーカーが切望されている。
　本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、甲状腺乳頭癌に特異的な腫瘍マーカー、および当該腫瘍マーカーを用いた甲状腺乳頭癌の判別技術を提供することにある。
　本発明者らは、ヒトＳＮＸ５タンパク質に対する抗体を作製し、この抗ヒトＳＮＸ５抗体を用いて種々のヒト正常組織および腫瘍性病変に対する免疫組織化学染色を行った結果、ＳＮＸ５が、甲状腺の濾胞上皮に特異的に反応し、特に甲状腺由来の悪性腫瘍である甲状腺乳頭癌に強い反応性を示したこと、ならびに他の組織型を示す甲状腺癌、消化管由来の乳頭状腺癌、および肺由来の乳頭状腺癌においてはＳＮＸ５の発現がほとんど認められないことを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明に係る方法は、腫瘍マーカーを検出する方法であって、被験体サンプル中のＳＮＸ５を検出する工程を包含することを特徴としている。
　本発明に係る方法において、上記被験体サンプルは、被験体から採取した組織またはその培養物もしくは切片が好ましいが、被験体から採取した組織またはその培養物から調製された細胞溶解物であってもよい。また、上記組織は、甲状腺組織であることが好ましいが、血液等の体液であってもよい。
　本発明に係る方法において、上記被験体は、甲状腺疾患に罹患している可能性がある患者であることが好ましいが、甲状腺乳頭癌をすでに発症している患者であってもよい。
　上記ＳＮＸ５は、ＳＮＸ５タンパク質またはそのフラグメントであることが好ましい。この場合、上記ＳＮＸ５を検出する工程は、抗ＳＮＸ５抗体を用いる免疫アッセイであることが好ましい。用いられる抗ＳＮＸ５抗体としては、抗ヒトＳＮＸ５抗体であることが好ましく、抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体であることがより好ましく、ハイブリドーマ４８Ｃ２から産生されるマウス抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体または当該抗体と同等の結合活性を有するモノクローナル抗体であることが最も好ましい。
　また、上記ＳＮＸ５は、ＳＮＸ５遺伝子またはそのフラグメントであってもよい。この場合、上記ＳＮＸ５を検出する工程は、核酸プローブを、ＳＮＸ５遺伝子またはそのフラグメントにハイブリダイズさせる工程であることが好ましい。上記核酸プローブは、ハイブリダイゼーションプローブであることが好ましいが、ＰＣＲプライマーであってもよい。
　本発明に係る方法は、ＳＮＸ５タンパク質またはそのフラグメントを検出する工程と、ＳＮＸ５遺伝子またはそのフラグメントを検出する工程とをともに包含することがより好ましい。
　上記方法は、甲状腺乳頭癌の診断基準を提供する方法でもあり得、乳頭状形態を示す悪性腫瘍の鑑別の判断基準を提供する方法であり得る。また、上記方法は、甲状腺乳頭癌の病変が原発巣であるか否かの判定基準を提供する方法でもあり得る。さらに、上記方法は、頸部リンパ節転移した腫瘍が甲状腺に由来するのか否かの判別基準を提供する方法でもあり得る。
　本発明に係るキットは、腫瘍マーカーを検出するためのキットであって、抗ＳＮＸ５抗体を備えていることを特徴としている。本発明に係るキットは、上記抗体を検出するための試薬をさらに備えていることが好ましい。上記抗体は、抗ヒトＳＮＸ５抗体であることが好ましく、抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体であることがより好ましく、ハイブリドーマ４８Ｃ２から産生されるマウス抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体または当該抗体と同等の結合活性を有するモノクローナル抗体であることが最も好ましい。
　本発明に係るキットは、腫瘍マーカーを検出するためのキットであって、ＳＮＸ５遺伝子またはそのフラグメントにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを備えていることを特徴としている。本発明に係るキットは、上記オリゴヌクレオチドを検出するための試薬をさらに備えていることが好ましい。上記オリゴヌクレオチドは、ＳＮＸ５遺伝子またはそのフラグメントに対するハイブリダイゼーションプローブであることが好ましいが、ＰＣＲプライマーであってもよい。
　上記キットは、甲状腺乳頭癌の診断基準を提供するためのキットであることが好ましいが、乳頭状形態を示す悪性腫瘍の鑑別の判断基準を提供するためのキットでもあり得る。また、上記キットは、甲状腺乳頭癌の病変が原発巣であるか否かの判定基準を提供するためのキットでもあり得る。さらに、上記キットは、頸部リンパ節転移した腫瘍が甲状腺に由来するのか否かの判別基準を提供するためのキットでもあり得る。
　本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。
　本発明を用いれば、甲状腺乳頭癌であるか否かの診断に好適な腫瘍マーカーを検出することができる。
ｐＣＭＶ－ＳＮＸ５を導入したヒト２９３細胞の細胞可溶性画分に対する、抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体によるウエスタンブロットの結果を示す図である。コントロールには、ｐＣＭＶ、ｐＣＭＶ－ｍｕｔａｎｔ　ＡＩＲＥ＃１またはｐＣＭＶ－ｍｕｔａｎｔ　ＡＩＲＥ＃２を導入したヒト２９３細胞を用いた。 ｐＣＭＶ－ＳＮＸ５を導入したヒト２９３細胞に対する、抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体による免疫組織化学染色の結果を示す図である。コントロールには、ｐＣＭＶを導入したヒト２９３細胞を用いた。いずれの細胞も、パラホルムアルデヒドによって固定した。 ヒト腺癌組織のホルマリン固定パラフィン包埋切片に対する、抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体による免疫組織化学染色の結果を示す図である。（ａ）は甲状腺乳頭癌における免疫組織化学染色の結果を示し、（ｂ）は肺腺癌における免疫組織化学染色の結果を示し、（ｃ）は乳腺腺癌における免疫組織化学染色の結果を示す。 ヒト腺癌組織のホルマリン固定パラフィン包埋切片に対する、抗ヒトＳＮＸ５ポリクローナル抗体による免疫組織化学染色の結果を示す図である。 甲状腺の正常組織および癌組織における、ヒトＳＮＸ５遺伝子についての定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示す図である。
　上述したように、本発明者らは、ＳＮＸ５が、甲状腺由来の悪性腫瘍である甲状腺乳頭癌に高度に発現しているが、他の組織型を示す甲状腺癌、消化管由来の乳頭状腺癌、および肺由来の乳頭状腺癌においては発現がほとんど認められないことを見出した。
　ヒトｓｏｒｔｉｎｇ　ｎｅｘｉｎ－５（ＳＮＸ５）は、細胞内の小胞体輸送に関与する分子であり、細胞の遊走に深く関係していることが示唆されている（例えば、非特許文献１および２参照）。また、特許文献１には、多発性骨髄腫に関連する遺伝子の候補が多数列挙されており、その１つとしてＳＮＸ５が挙げられている。特許文献２には、ＭＨＣ分子を結合する腫瘍関連ペプチド（抗原ペプチド）の候補が多数列挙されており、その１つとしてＳＮＸ５タンパク質の部分断片（アミノ酸２９２～３００：特許文献２の配列番号５２４）が挙げられている。しかし、甲状腺乳頭癌におけるＳＮＸ５の特異性は、いずれの文献にも開示も示唆もされていない。このように、本発明は、甲状腺乳頭癌についての優れた腫瘍マーカーを提供する。
　〔１．腫瘍マーカー〕
　本発明は、甲状腺乳頭癌についての優れた腫瘍マーカーを提供する。一実施形態において、本発明の腫瘍マーカーはＳＮＸ５タンパク質またはそのフラグメントである。他の実施形態において、本発明の腫瘍マーカーはＳＮＸ５遺伝子またはそのフラグメントである。
　本明細書中で使用される場合、ＳＮＸ５タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつＳＮＸ５活性を有するポリペプチド、である。また、ＳＮＸ５タンパク質は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；配列番号２に示されるヌクレオチド配列の１または数個の塩基が欠失、置換または付加されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってコードされかつＳＮＸ５活性を有するポリペプチド；配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドによってコードかつＳＮＸ５活性を有するポリペプチド；あるいは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドによってコードかつＳＮＸ５活性を有するポリペプチド、であってもよい。
　ポリペプチド（アミノ酸）の観点で用いられる場合、「１または数個」は、１～３０個の範囲内であることが好ましく、１～２０個の範囲内であることがより好ましく、１～１０個の範囲内であることがさらに好ましく、１～５個の範囲内であることがなおさらに好ましい。なお、当業者は、目的のポリペプチドの長さに応じて、用語「１または数個」によって示されるアミノ酸数の範囲がどの程度であるのかを容易に理解し得る。
　ポリヌクレオチド（塩基）の観点で用いられる場合、「１または数個」は、１～１００個の範囲内であることが好ましく、１～５０個の範囲内であることがより好ましく、１～３０個の範囲内であることがさらに好ましく、１～１５個の範囲内であることがなおさらに好ましい。なお、当業者は、目的のポリヌクレオチドの長さに応じて、用語「１または数個」によって示される塩基数の範囲がどの程度であるのかを容易に理解し得る。例えば、後述するオリゴヌクレオチドの場合、用語「１または数個」は、１～１０個の範囲内であることが好ましく、１～７個の範囲内であることがより好ましく、１～５個の範囲内であることがさらに好ましく、１～３個の範囲内であることがなおさらに好ましい。
　本明細書中で使用される場合、目的のポリペプチドまたはポリヌクレオチドについての相同性は、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがなおさらに好ましい。
　本明細書中で使用される場合、用語「ＳＮＸ５活性」は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として用いて惹起される抗ＳＮＸ抗体との結合能が意図される。上記ＳＮＸ抗体は、後述する抗ＳＮＸ５抗体であればよく、後述する４８Ｃ２抗体が好ましい。また、上記ポリペプチドは、リコンビナントヒトＳＮＸ５タンパク質であっても単離精製された天然のヒトＳＮＸ５タンパク質であってもよい。
　本明細書中で使用される場合、ＳＮＸ５遺伝子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；あるいは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつＳＮＸ５活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。また、ＳＮＸ５遺伝子は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；配列番号２に示されるヌクレオチド配列の１または数個の塩基が欠失、置換または付加されたヌクレオチド配列からなりかつＳＮＸ５活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドでありかつＳＮＸ５活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；あるいは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドでありかつＳＮＸ５活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、であってもよい。
　配列番号１は、ＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号ＡＦ１２１８５５）に登録されているＳＮＸ５のアミノ酸配列であり、配列番号２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり、ＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号ＡＦ１２１８５５）に登録されているＳＮＸ５のヌクレオチド配列（配列番号３）のオープンリーディングフレーム（第１８１位～第１３９５位）に対応する。
　本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用され、アミノ酸の重合体が意図される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、組換え的に生成されても、化学合成されても、天然供給源より単離されてもよい。
　本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。また、ポリヌクレオチドの「フラグメント」は、当該ポリヌクレオチドの部分断片が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」または「塩基配列」と交換可能に使用される。
　本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
　本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。
　本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図されるが、ハイブリダイゼーションさせるポリヌクレオチドによって、高ストリンジェンシーでの洗浄条件は適宜変更され、例えば、哺乳類由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％　ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中にて６５℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％　ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、ＲＮＡを用いる場合は、０．１％　ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、オリゴヌクレオチドを用いる場合は、０．１％　ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にてハイブリダイゼーション温度での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましい。
　本発明の腫瘍マーカーを用いることにより、乳頭状形態を示す悪性腫瘍の判断基準を提供することができるので、甲状腺乳頭癌であるか否かの診断が容易になる。また、本発明は、病変が原発巣であるか否かを判定する際に非常に有効である。さらに、本発明を用いれば、頸部リンパ節転移した腫瘍が甲状腺に由来するのか、あるいは他の組織（肺、乳腺など）に由来するのかを、より明確に判別し得る。
　〔２．腫瘍マーカーの検出方法〕
　本発明は、腫瘍マーカーの検出方法を提供する。本発明に係る腫瘍マーカーの検出方法は、被験体サンプル中のＳＮＸ５を検出する工程を包含することを特徴としている。一実施形態において、本発明に係る検出方法は、ＳＮＸ５タンパク質またはそのフラグメントを検出する工程を包含する。他の実施形態において、本発明に係る検出方法は、ＳＮＸ５遺伝子またはそのフラグメントを検出する工程を包含する。
　本明細書中において使用される場合、「被験体サンプル」は、被験体から採取された任意の組織（血液等の体液を含む。）または細胞が意図され、これらから調製された組織切片または細胞溶解物もまた被験体サンプルに包含され得る。本発明に用いるに好ましい被験体サンプルとしては、腫瘍組織および血清が挙げられるがこれらに限定されない。なお、サンプル取得の第一段階として組織または細胞を被験体から直接取り出す工程は、医師によるものであり、本発明の範囲外である。また、本発明の方法によって得られた結果を用いて、疾患か否かの判定を下す工程もまた、医師によるものであり、本発明の範囲外である。
　本発明の対象とされるべき被験体は、甲状腺疾患に罹患している可能性がある患者が好ましく、甲状腺乳頭癌を発症している患者がより好ましいが、正常な患者であってもよい。本発明に係る方法において、上記被験体サンプルは甲状腺疾患に罹患している可能性がある患者から採取された甲状腺組織またはその培養物、あるいはこれらから調製された組織切片または細胞溶解物であることが好ましいが、これに限定されない。サンプルの取得手順は、所望される組織または細胞に応じて適宜選択され得ることを当業者は容易に理解する。
　ＳＮＸ５タンパク質を検出する実施形態において、ＳＮＸ５を検出する工程は、抗ＳＮＸ５抗体を用いる免疫アッセイであり得る。本明細書中で使用される場合、用語「免疫アッセイ」は、抗原抗体反応に基づいた免疫学的な結合反応を利用して行われるアッセイが意図される。免疫学的な結合反応を利用したアッセイとしては、免疫組織化学、免疫電子顕微鏡法、ウエスタンブロット、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、放射性イムノアッセイ、および抗体アッセイ（例えば免疫拡散アッセイ）、ならびにアフィニティクロマトグラフィーなどが挙げられる。これらの技術は、当該分野において周知であり、当業者は、容易に本発明を実行し得る。
　抗ＳＮＸ５抗体としては、抗ヒトＳＮＸ５抗体が好ましく、モノクローナル抗体であることがより好ましく、ハイブリドーマ４８Ｃ２から産生されるマウス抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体（４８Ｃ２抗体ともいう。）であることがより好ましい。本発明者らは、４８Ｃ２抗体が、ヒトＳＮＸ５タンパク質のＮ末端側（配列番号１の１～１７７位：配列番号１０）を認識することを見出している（結果は示さず）。すなわち、「ＳＮＸ５タンパク質のフラグメント」は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドであり、配列番号１０に示されるアミノ酸配列、またはその連続する８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドであることが好ましい。なお、４８Ｃ２抗体と同等の結合特性を有するモノクローナル抗体もまた、本発明に好適に使用される抗体の範囲内であることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
　被験体サンプルが被験体から採取した組織またはその培養物もしくは切片である場合、上記免疫アッセイは、免疫組織化学染色であり得る。被験体から採取した組織またはその培養物から調製された細胞溶解物である場合、上記免疫アッセイはウエスタンブロットであってもよい。また、被験体サンプルが被験体から採取した血液である場合、上記免疫アッセイはＥＬＩＳＡであり得る。これらの免疫アッセイは、術前の鑑別診断に用いられることが好ましいが、術後の転移の有無を調べる際に用いられてもよい。
　ハイブリドーマ４８Ｃ２から産生されるマウス抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体は、ウエスタンブロットによるＳＮＸ５タンパク質の検出や、ホルマリン固定パラフィン切片におけるＳＮＸ５タンパク質の検出に適しているだけでなく、パラホルム固定組織におけるＳＮＸ５タンパク質の同定も可能にした。これまでに、ＳＮＸ５の細胞質における機能が報告されているが、このマウス抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体を用いた場合であっても、ＳＮＸ５が細胞質内に局在することを示した。このことは、このマウス抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体の特異性を支持する。なお、ハイブリドーマ４８Ｃ２は、北海道公立大学法人札幌医科大学知的財産管理室（060-8556　札幌市中央区南１条西１７丁目）の管理下にて維持されており、必要に応じて分譲することが可能である。
　悪性腫瘍の病理組織診断を行う際に、免疫組織化学的な検討は非常に重要である。特定の臓器または組織に特異的な腫瘍マーカーを用いれば、原発巣が未だ確定されていない転移性病変の確定診断を行うことが容易になり、診断または治療の方針を速やかに決定し得る。これまでに種々の臓器特異的な分子マーカーが見出されているが、病理組織診断に実際に用いられている抗体は限られている。特に、甲状腺乳頭癌を鑑別するに好適な抗体は未だ見出されていない。
　通常の病理組織検査で用いられているホルマリン固定パラフィン切片に対する、マウス抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色を行ったところ、甲状腺由来の乳頭癌においてはＳＮＸ５の強い発現が認められたが、他の腺癌の代表例である肺癌または乳癌由来の癌組織においては発現が全く認められなかった。この結果を検証する目的で、市販のウサギ抗ヒトＳＮＸ５ポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色を行ったところ、同様に腫瘍細胞におけるＳＮＸ５の高い発現が認められた。このように、ＳＮＸ５は甲状腺乳頭癌の腫瘍マーカーとして非常に優れている。また、上記マウス抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体は、パラホルム固定組織の免疫組織的解析を可能にした、非常に優れた検出ツールである。
　ＳＮＸ５遺伝子を検出する実施形態において、ＳＮＸ５を検出する工程は、核酸プローブを、ＳＮＸ５遺伝子またはそのフラグメントにハイブリダイズさせる工程であり得る。本明細書中で使用される場合、「核酸プローブ」は、目的の核酸にハイブリダイズし得るものであれば特に限定されず、いわゆるハイブリダイゼーションプローブであってもＰＣＲプライマーであってもよい。ハイブリダイゼーション技術およびＰＣＲ技術は、当該分野において周知であり、当業者は、容易に本発明を実行し得る。被験体サンプルが被験体から採取した組織サンプルである場合、当該分野にて公知の種々の手法が採用され得、例えば、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ＰＣＲ技術等が採用され得る。また、被験体サンプルが被験体から採取した血液である場合、例えば、慣用的なＰＣＲ技術が採用され得る。
　核酸プローブは、ＳＮＸ５遺伝子（またはその相補鎖）の部分配列を含むオリゴヌクレオチドであれば特に限定されず、配列番号４または５に示されるヌクレオチド配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであっても、配列番号６～９に示されるヌクレオチド配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよい。また、４８Ｃ２抗体が、ヒトＳＮＸ５タンパク質のＮ末端側を認識することから、核酸プローブは、上記「ＳＮＸ５タンパク質のフラグメント」をコードするオリゴヌクレオチドであってもよい。
　ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの場合、核酸プローブは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列またはその相補配列の、１５～５０個連続する塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましく、より好ましくは２０～５０個、さらに好ましくは２０～４５個、最も好ましくは２５～４０個連続する塩基からなるオリゴヌクレオチドである。また、ＰＣＲ（ｉｎ　ｓｉｔｕ　ＰＣＲを含む。）の場合、核酸プローブは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列またはその相補配列の、１５～５０個連続する塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましく、より好ましくは１５～４０個、さらに好ましくは１５～３５個、最も好ましくは２５～３５個連続する塩基からなるオリゴヌクレオチドである。
　なお、本実施形態に係る検出方法は、ＳＮＸ５遺伝子を検出する工程を包含することを特徴としているが、上述したＳＮＸ５タンパク質を検出する工程をさらに包含することがより好ましい。
　このように、本発明に係る腫瘍マーカーの検出方法を用いることにより、乳頭状形態を示す悪性腫瘍の判断基準を提供することができるので、甲状腺乳頭癌であるか否かの診断が容易になる。また、本発明は、病変が原発巣であるか否かを判定する際に非常に有効である。さらに、本発明を用いれば、頸部リンパ節転移した腫瘍が甲状腺に由来するのか、あるいは他の組織（肺、乳腺など）に由来するのかを、より明確に判別し得る。すなわち、本発明に係る方法は、甲状腺乳頭癌の診断基準を提供する方法（例えば、甲状腺乳頭癌を診断するためのデータを取得する方法）でもあり得、乳頭状形態を示す悪性腫瘍の鑑別の判断基準を提供する方法（例えば、乳頭状形態を示す悪性腫瘍を鑑別するためのデータを取得する方法）でもあり得る。また、本発明に係る方法は、甲状腺乳頭癌の病変が原発巣であるか否かの判定基準を提供する方法（例えば、甲状腺乳頭癌の病変が原発巣であるか否かを判定するためのデータを取得する方法）でもあり得る。さらに、本発明に係る方法は、頸部リンパ節転移した腫瘍が甲状腺に由来するのか否かの判別基準を提供する方法（例えば、頸部リンパ節転移した腫瘍が甲状腺に由来するのか否かを判定するためのデータを取得する方法）でもあり得る。
　〔３．腫瘍マーカーの検出ツール〕
　本発明は、腫瘍マーカーを検出するためのキットを提供する。本発明に係るキットは、被験体サンプル中のＳＮＸ５を検出するためのツールを備えていることを特徴としている。
　本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図されるが、組成物としての一物質中に材料を含有している形態もまた、用語「キット」に包含される。キットは、各材料を使用するための指示書を備えていることが好ましい。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明に係るキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得、溶液形態の場合は容器中に内包されていてもよい。本発明に係るキットは、物質Ａおよび物質Ｂを同一の容器に混合して備えていても別々の容器に備えていてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ－ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明に係るキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。さらに、本発明に係るキットは、被験体サンプルを採取するために必要な器具および試薬を備えていてもよい。また、本発明に係るキットは、被験体サンプルから切片または細胞溶解物を調製するために必要な器具および試薬を備えていてもよい。
　一実施形態において、本発明に係るキットは、ＳＮＸ５タンパク質またはそのフラグメントを検出するための抗体を備えている。上記抗体は、抗ヒトＳＮＸ５抗体であることが好ましく、抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体であることがより好ましく、ハイブリドーマ４８Ｃ２から産生されるマウス抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体または当該抗体と同等の結合活性を有するモノクローナル抗体であることが最も好ましい。なお、本発明に係るキットは、上記抗体を検出するための試薬をさらに備えていることが好ましいが、上述したように、ＳＮＸ５タンパク質またはそのフラグメントを検出するための抗体を含有している組成物として提供されてもよい。
　他の実施形態において、本発明に係る検出キットは、ＳＮＸ５遺伝子またはそのフラグメントを検出するためのオリゴヌクレオチドを備えている。上記オリゴヌクレオチドは、ＳＮＸ５遺伝子またはそのフラグメントにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであることが好ましく、ＳＮＸ５遺伝子またはそのフラグメントに対するハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーであることが好ましい。なお、本発明に係るキットは、上記オリゴヌクレオチドを検出するための試薬をさらに備えていることが好ましいが、上述したように、ＳＮＸ５遺伝子またはそのフラグメントを検出するためのオリゴヌクレオチドを含有している組成物として提供されてもよい。
　本発明に係るキットは、甲状腺乳頭癌の診断基準を提供するためのキットであることが好ましいが、乳頭状形態を示す悪性腫瘍の鑑別の判断基準を提供するためのキットでもあり得る。また、本発明に係るキットは、甲状腺乳頭癌の病変が原発巣であるか否かの判定基準を提供するためのキットでもあり得る。さらに、本発明に係るキットは、頸部リンパ節転移した腫瘍が甲状腺に由来するのか否かの判別基準を提供するためのキットでもあり得る。
　このように、本発明の目的は、腫瘍マーカーを提供するとともに、当該腫瘍マーカーを検出することによる甲状腺乳頭癌の診断基準を提供することにある。本明細書を読んだ当業者は、本明細書中の記載および技術常識に基づいて、種々の形態にて本発明を実行し得ることを容易に理解する。
　〔１．ヒトＳＮＸ５　ｃＤＮＡの取得〕
　ヒトＨａｃａＴ細胞から抽出した総ＲＮＡをテンプレートにして、フォワードプライマー（pCMV-HA-SNX5 FW: 5'-CAGGCCCGAATTCGGATGGCCGCGGTTCCCGAG-3'（配列番号４））およびリバースプライマー（pCMV-HA-SNX5 RV: 5'-GATCTCGGTCGACCGTGAAGGCATATCAGTTAT-3'（配列番号５））を用いたＲＴ－ＰＣＲを行い、ヒトＳＮＸ５　ｃＤＮＡを得た。得られたヒトＳＮＸ５　ｃＤＮＡを、大腸菌用発現ベクターｐＥＴ３ｃ（Novagen）および哺乳動物用発現ベクターｐＣＭＶ－ＨＡ（BD Bioscience）に挿入して、それぞれｐＥＴ３ｃ－ＳＮＸ５およびｐＣＭＶ－ＨＡ－ＳＮＸ５を作製した。なお、pCMV-HA-SNX5 FWは、ヒトＳＮＸ５　ｃＤＮＡの５’領域の配列（ATGGCCGCGGTTCCCGAG（配列番号６））に制限酵素部位等を連結したものであり、pCMV-HA-SNX5 RVは、ヒトＳＮＸ５　ｃＤＮＡの３’領域の配列（ataactgatatgccttcac（配列番号７））の相補配列に制限酵素部位等を連結したものである。
　〔２．抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体の作製〕
　ｐＥＴ３ｃ－ＳＮＸ５を導入した大腸菌ＢＬ２１を培養し、ＩＰＴＧによってタンパク質合成を誘導した。次いで、ヒトＳＮＸ５タンパク質を菌体成分から分離／濃縮した。得られたタンパク質を免疫原とし、アジュバントとして完全アジュバント（初回免疫のみ）または不完全アジュバント（２回目以降の免疫）を用いて、６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを腹腔内免疫した（１００μｇ／個体）。追加免疫を隔週にて２ヶ月間行い、脾細胞を採取する３日前に最終免疫を行った。採取した脾細胞を、ポリエチレングリコールを用いてＮＳ０マウスミエローマ細胞と融合させ、この融合細胞を、９６ウェルプレート中にて、ＨＡＴ、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中にて２～３週間培養した。培養上清を用いたウエスタンブロット法によって、抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体をスクリーニングした。
　〔３．哺乳動物細胞への遺伝子導入〕
　１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭにて培養したヒト２９３細胞に、ＬＦ２０００（インビトロジェン社）を製造業者の手引書に従って、ｐＣＭＶ－ＳＮＸ５を導入した。なお、形質転換体におけるＳＮＸ５の発現を、形質転換体から抽出した総ＲＮＡをテンプレートにして、フォワードプライマー（SNX5 AMP FW: 5'-ccggttaaagagcaaagacg-3'（配列番号８））およびリバースプライマー（SNX5 AMP RV: 5'-agctctgcaaaagggagaca-3'（配列番号９））を用いたＲＴ－ＰＣＲによって確認した。
　〔４．ウエスタンブロット解析〕
　ｐＣＭＶ－ＳＮＸ５を導入したヒト２９３細胞を、３日間培養した後に０．５％　ＮＰ－４０を含む溶解用緩衝液を用いて可溶化した。可溶化した画分に含まれるタンパク質を５～２０％のグラジエントゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。分離したタンパク質をナイロンメンブレンに転写し、抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体による一次抗体反応、ペルオキシダーゼ複合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体による二次抗体反応を各々１時間行った。ＥＣＬキット（アマシャム社製）を用いて、シグナルを可視化した。
　図１に示すように、５０ｋＤａの位置に非特異的なバンドが検出されるものの、ＳＮＸ５（分子量４７ｋＤａ）に特異的なシグナルがｐＣＭＶ－ＳＮＸ５を導入した細胞にのみ検出された。同様のシグナルはネガティブコントロール（ＣＭＶ、ｐＣＭＶ－ｍｕｔａｎｔ　ＡＩＲＥ＃１、ｐＣＭＶ－ｍｕｔａｎｔ　ＡＩＲＥ＃２）を遺伝子導入した細胞には認められなかった。
　〔５．免疫組織化学染色〕
　ｐＣＭＶ－ＳＮＸ５を導入したヒト２９３細胞を、３日間培養した後にパラホルムアルデヒドにて固定し、一次抗体として抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体を、２次抗体にはＡｌｅｘａ５９６を複合体化したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、室温で各々１時間反応させて免疫組織化学染色を行った。ＩＸ７１蛍光顕微鏡（オリンパス社製）を使用して、シグナルを検出した。図２に、ｐＣＭＶ－ＳＮＸ５を導入した細胞（左）、ネガティブコントロールとしてｐＣＭＶを導入した細胞（右）を示す。抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体がＳＮＸ５と特異的に反応していることがわかる。
　また、腺癌組織のホルマリン固定パラフィン包埋切片を用いて、抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体による免疫組織化学染色を行った。自動免疫染色装置（ＤＡＫＯ社製）を使用して、シグナルを検出した（図３）。図３（ａ）に示すように、甲状腺乳頭癌においてはＳＮＸ５の強い発現が認められた。しかし、肺腺癌（図３（ｂ））および乳腺腺癌（図３（ｃ））においてはＳＮＸ５の発現は認められなかった（図３（ｂ））。
　さらに、樹立した抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体を用いて調べた、腫瘍組織におけるＳＮＸ５発現分布を、市販のウサギ抗ヒトＳＮＸ５ポリクローナル抗体（Ｈ４０：Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて検証した（図４）。図４に示すように、甲状腺乳頭癌のホルマリン固定パラフィン切片を用いた免疫組織化学染色において、腫瘍細胞にＳＮＸ５の強い発現が認められた。
　さらに、マウス抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体を用いて、乳頭状増殖を示す各種の悪性腫瘍におけるＳＮＸ５の発現を解析した。結果を表１に示す。表１に示すように、甲状腺以外での上皮性悪性腫瘍（胃癌、大腸癌および膵癌を含む）２０例、および肉腫・非上皮性悪性腫瘍５例のいずれにおいても、ＳＮＸ５の発現は全く見られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　〔６．定量的ＰＣＲ〕
　被験体から生検によって取得した正常な甲状腺組織、あるいは甲状腺癌を発症している患者から手術によって摘出した甲状腺癌組織から総ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（Invitrogen）を用いてｃＤＮＡを作製した。次いで、このｃＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲプローブ（製品番号：Hs00429583）を用いた定量的ＰＣＲ（Applied Biosystems）を行った。得られた値を、ribosomal RNAを対照として解析し、delta delta CT法（ABI 7000、Applied Biosystems）によって比較検討した。なお、ヒト組織の遺伝子解析は、ＳＮＸ５の発現解析のみに限定し、ヒト組織の使用に際しては、十分なインフォームドコンセントの下で倫理委員会を通じて研究を行った。データの保護には万全の注意を払い、人権の保護および法令を遵守した。
　甲状腺癌３例についての結果を図５に示す。図に示すように、正常な甲状腺組織よりも甲状腺癌組織においてＳＮＸ５遺伝子の発現が高いことが確認された。
　このように、本発明者らは、ＳＮＸ５が甲状腺乳頭癌に高発現することを初めて見出した。また、本発明者らが樹立したマウス抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体は、ホルマリン固定パラフィン切片だけでなくパラホルム固定組織の免疫組織的解析を可能にした。本発明によって得られた知見は、既知の甲状腺マーカーであるサイログロブリンやＴＴＦ－１などと比較して、ＳＮＸ５は優れたマーカーであると考えられ、病理診断の際の有益な情報を提供し得ると考えられる。また、抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡ法などによって、甲状腺由来の腫瘍性病変の血清診断が可能であると考えられる。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
　本発明を用いれば、甲状腺乳頭癌の早期診断および確定診断が容易になる。このように優れたツールを提供する本発明は、医学、薬学の分野において利用可能であり、医薬品、生化学試薬の開発に大いに寄与することができる。

Claims (13)

  1. 　被験体サンプル中のＳＮＸ５タンパク質またはそのフラグメントを検出する工程を包含することを特徴とする甲状腺乳頭癌の腫瘍マーカーを検出する方法。
  2. 　上記工程が、抗ＳＮＸ５抗体を用いる免疫アッセイによって行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 　上記抗ＳＮＸ５抗体が、ハイブリドーマ４８Ｃ２から産生されるマウス抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体または当該抗体と同等の結合活性を有するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
  4. 　被験体サンプル中のＳＮＸ５遺伝子またはそのフラグメントを検出する工程を包含することを特徴とする甲状腺乳頭癌の腫瘍マーカーを検出する方法。
  5. 　上記工程が、核酸プローブを、ＳＮＸ５遺伝子またはそのフラグメントにハイブリダイズさせることによって行われることを特徴とする請求項４に記載の方法。
  6. 　上記核酸プローブが、配列番号４～９のいずれかに示されるヌクレオチド配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
  7. 　上記被験体サンプルが、被験体から採取した組織またはその細胞から調製された切片または細胞溶解物であることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　上記組織が甲状腺組織であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
  9. 　上記被験体が、甲状腺疾患に罹患している可能性がある患者であることを特徴とする請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　抗ＳＮＸ５抗体を備えていることを特徴とする甲状腺乳頭癌の腫瘍マーカーを検出するためのキット。
  11. 　上記抗ＳＮＸ５抗体が、ハイブリドーマ４８Ｃ２から産生されるマウス抗ヒトＳＮＸ５モノクローナル抗体または当該抗体と同等の結合活性を有するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１０に記載のキット。
  12. 　ＳＮＸ５遺伝子またはそのフラグメントにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを備えていることを特徴とする甲状腺乳頭癌の腫瘍マーカーを検出するためのキット。
  13. 　上記オリゴヌクレオチドが、配列番号４～９のいずれかに示されるヌクレオチド配列またはその相補配列からなることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
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