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WO2010110361A1 - 二環性γ－アミノ酸誘導体の製造方法 - Google Patents

二環性γ－アミノ酸誘導体の製造方法 Download PDF

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WO2010110361A1
WO2010110361A1 PCT/JP2010/055202 JP2010055202W WO2010110361A1 WO 2010110361 A1 WO2010110361 A1 WO 2010110361A1 JP 2010055202 W JP2010055202 W JP 2010055202W WO 2010110361 A1 WO2010110361 A1 WO 2010110361A1
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acid
group
compound
general formula
salt
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豊 北川
今井　誠
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第一三共株式会社
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a bicyclic ⁇ -amino acid derivative, or a pharmacologically acceptable salt thereof, particularly active as an ⁇ 2 ⁇ ligand, against the ⁇ 2 ⁇ subunit of a voltage-gated calcium channel.
  • the present invention relates to a compound having affinity, or a method for producing the compound.
  • neuropathic pain is chronic pain caused by nerve tissue damage, etc., and is a disease that significantly impairs the quality of life, such as a patient becoming depressed when a painful attack is severe. .
  • ⁇ 2 ⁇ ligands are known as therapeutic agents for such neuropathic pain, and examples of ⁇ 2 ⁇ ligands include gabapentin and pregabalin.
  • ⁇ 2 ⁇ ligands such as these compounds are useful for the treatment of epilepsy, neuropathic pain and the like (for example, Patent Document 1).
  • the effective treatment rate by patient self-assessment in postherpetic neuralgia is about 60% (for example, see Non-Patent Document 3), and in the case of pregabalin, the patient's self in painful diabetic neuropathy It is reported that the therapeutic effective rate by evaluation is about 50% (for example, refer nonpatent literature 4).
  • Patent Document 2 Patent Document 3
  • Patent Document 4 Patent Document 4
  • An object of the present invention is to provide a bicyclic ⁇ -amino acid derivative having excellent activity as an ⁇ 2 ⁇ ligand, a production intermediate thereof, and a method for producing a salt thereof.
  • the following is preferable.
  • the optically active organic acid is any one of the following optically active organic acids selected from the following group: (1)-(3) Or a salt thereof.
  • this invention also includes the following manufacturing methods.
  • (6) A method for producing a compound having the general formula (X) or a salt thereof, [Wherein each substituent is defined as follows. R 1 : a hydrogen atom or a C1-C6 alkyl group]
  • a compound having the general formula (X) or a salt thereof is obtained by deprotecting the protecting group of the carboxy group of the compound having the general formula (I) prepared by (1) or forming a salt with an acid. How to manufacture.
  • a bicyclic ⁇ -amino acid derivative having excellent activity as an ⁇ 2 ⁇ ligand, a production intermediate thereof, and a salt thereof can be provided.
  • C1-C6 alkyl group refers to a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec -Butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, 2-methylbutyl, neopentyl, 1-ethylpropyl, hexyl, isohexyl, 4-methylpentyl, 3-methylpentyl, 2-methyl Pentyl group, 1-methylpentyl group, 3,3-dimethylbutyl group, 2,2-dimethylbutyl group, 1,1-dimethylbutyl group, 1,2-dimethylbutyl group, 1,3-dimethylbutyl group, 2 , 3-dimethylbutyl group, 2-ethylbutyl group and the like.
  • Salt or “pharmacologically acceptable salt” refers to an acid or a base in the compound represented by the general formula (I) and the like when it has an amino group and / or a carboxyl group in its structure. Since a salt is formed by reacting, the salt is referred to.
  • Carboxy protecting group means methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, t-butyl, hexyl, bromo-tert-butyl, trichloroethyl Group, benzyl group, p-nitrobenzyl group, o-nitrobenzyl group, p-methoxybenzyl group, pt-butylbenzyl group, acetoxymethyl group, propionyloxymethyl group, butyryloxymethyl group, isobutyryloxymethyl group , Valeryloxymethyl group, pivaloyloxymethyl group, acetoxyethyl group, acetoxypropyl group, acetoxybutyl group,
  • the compound having the general formula (I) can be obtained by a conventional method for deprotecting a carboxy group, for example, a method described in “Protective Groups in Organic Synthesis (3rd edition, 1999)” by TW Greene and PG Wuts. By deprotecting the carboxy group, a compound having the general formula (X) can be produced.
  • the compound having the general formula (X), or a pharmacologically acceptable salt thereof exhibits activity as an ⁇ 2 ⁇ ligand and has an affinity for the ⁇ 2 ⁇ subunit of the voltage-gated calcium channel, It is useful as an active ingredient in pharmaceutical compositions used for the treatment and / or prevention of pain, central nervous system disorders, and other disorders.
  • a pharmaceutical composition containing a compound having the general formula (X) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered to a mammal (eg, human, horse, cow, pig, etc., preferably human). In some cases, it is administered systemically or locally, orally or parenterally.
  • a mammal eg, human, horse, cow, pig, etc., preferably human. In some cases, it is administered systemically or locally, orally or parenterally.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by selecting an appropriate form according to the administration method and preparing various preparations usually used.
  • Oral pharmaceutical compositions include tablets, pills, powders, granules, capsules, liquids, suspensions, emulsions, syrups, elixirs and the like.
  • the preparation of such a pharmaceutical composition includes excipients, binders, disintegrants, lubricants, swelling agents, swelling aids, coating agents, plasticizers, stabilizers, antiseptics, anti-fouling agents, ordinarily used as additives.
  • An oxidizing agent, a coloring agent, a solubilizing agent, a suspending agent, an emulsifier, a sweetening agent, a preservative, a buffering agent, a diluent, a wetting agent and the like are appropriately selected as necessary, and are carried out according to a conventional method.
  • parenteral pharmaceutical compositions include injections, ointments, gels, creams, poultices, patches, sprays, inhalants, sprays, eye drops, nasal drops, suppositories, and inhalations.
  • agents Preparation of the pharmaceutical composition in such a form involves the use of stabilizers, preservatives, solubilizers, moisturizers, preservatives, antioxidants, flavoring agents, gelling agents, neutralizing agents, and dissolution agents that are commonly used as additives.
  • Adjuvants, buffering agents, isotonic agents, surfactants, colorants, buffering agents, thickeners, wetting agents, fillers, absorption enhancers, suspending agents, binders, etc. are selected as necessary. And carried out in accordance with conventional methods.
  • the dose of the compound having the general formula (X) or a pharmacologically acceptable salt thereof varies depending on symptoms, age, body weight, etc., but in the case of oral administration, one adult (with a body weight of about 60 kg)
  • the amount per compound is 1-2000 mg, preferably 10-600 mg, and in the case of parenteral administration, the amount is 0.1-1000 mg, preferably 1-300 mg per compound per adult.
  • a compound is obtained by mixing 5 g of the compound having the general formula (X), 90 g of lactose, 34 g of corn starch, 20 g of crystalline cellulose and 1 g of magnesium stearate with a blender and then tableting with a tablet machine.
  • a primer having the following sequence in the first half fragment Primer 1: 5'-agctgcggcc gctagcgcca ccatggctgg ctgcctgctg gc-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • Primer 2 5'-attaggatcg attgcaaagt aataccc-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • the latter fragment has primers with the following sequences:
  • Primer 4: 5'-agtcggatcc tcataacagc cggtgtgtgc tg-3 '(SEQ ID NO: 4) was purchased from Sigma Genesis and used.
  • a thermal cycler (GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) was used, and after heating at 94 ° C for 1 minute, temperature cycling (94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 68 ° C) 2 minutes) was repeated 35 times, followed by 5 minutes at 68 ° C and cooling to 4 ° C.
  • a-2) Preparation of vector A vector was prepared in which the multicloning site (hereinafter referred to as MCS) of the animal cell expression vector pRK5 (Pharmingen) was changed to MCS of the vector pBluescript 2 (STRATAGENE). That is, pRK5 was subjected to restriction enzyme treatment with Cla 1 (TOYOBO) and Hind 3 (TOYOBO), and then both ends of the DNA were smoothed using Klenow Fragment (TAKARA). Furthermore, after dephosphorylating both ends using bovine small intestine alkaline phosphatase (hereinafter referred to as CIAP: TAKARA), purification was performed using MiniElute Reaction Cleanup Kit (QIAGEN).
  • the enzyme-treated DNA was electrophoresed on a 1.0% agarose gel, the gel after electrophoresis was stained with ethidium bromide, and a band corresponding to about 4.7 kbp was irradiated with ultraviolet rays using a razor blade.
  • DNA was extracted using a gel extraction purification kit (MiniElute Gel Extraction Kit (QIAGEN)) according to the protocol attached to this kit.
  • pBluescript 2 is subjected to restriction enzyme treatment with Sac 1 (TOYOBO) and Kpn 1 (TOYOBO), and then both ends of DNA are smoothed using Klenow Fragment (TAKARA) Turned into.
  • the enzyme-treated DNA was electrophoresed on a 2.0% agarose gel, the gel after electrophoresis was stained with ethidium bromide, and the band portion corresponding to about 100 bp was separated with a razor blade under ultraviolet irradiation. Then, using a gel extraction purification kit (MiniElute Gel Extraction Kit (QIAGEN)), DNA was extracted according to the protocol attached to this kit.
  • the obtained DNA fragment and cleaved pRK5 were ligated using a DNA ligation kit (TAKARA) according to the protocol attached to the kit.
  • E. coli DH5 ⁇ competent cells TOYOBO
  • TOYOBO E. coli DH5 ⁇ competent cells
  • a plasmid was extracted from the cells obtained by culturing the collected colonies, and the base sequence was analyzed using a DNA sequencer (Model 3700 (Applied Biosystems)). Has been confirmed to be introduced into pRK5.
  • the orientation of the MCS sequence is upstream from the CMV promoter and the downstream direction is as follows: 5'-ccaccgcggtggcggccgctctagaactagtggatcccccgggctgcaggaattcgatatcaagcttatcgataccgtcgacctcgagggggggggcccg-3 '(SEQ ID NO: 5).
  • pRK-KS 5'-ccaccgcggtggcggccgctctagaactagtggatcccccgggctgcaggaattcgatatcaagcttatcgataccgtcgacctcgagggggggggcccg-3 '(SEQ ID NO: 5).
  • Plasmid construction pRK-SK obtained in a-2) was treated with the restriction enzyme Xba1 (TOYOBO), both ends of the DNA were blunted using Klenow Fragment (TAKARA), and the blunted DNA was digested with restriction enzyme Not 1 (TOTOBO) and purified in the same manner as in a-2).
  • the linearized pRK-SK and the first half DNA fragment of human Cacna2d1 gene obtained in a-1) were electrophoresed on a 1.0% agarose gel, and about 4.7 kbp and about 1.5 kbp DNA was extracted from the gel and purified. The obtained two DNAs were ligated in the same manner as in a-2), and E. coli was transformed.
  • a plasmid was extracted from the obtained Escherichia coli clone, and its base sequence was analyzed using a DNA sequencer (Model 3700 (Applied Biosystems)) to confirm that the sequence shown in SEQ ID NO: 6 was introduced. .
  • the obtained plasmid was treated with restriction enzymes Cla 1 (TOYOBO) and BamH 1 (TOYOBO), and CIAP treatment and purification were performed in the same manner as in a-2).
  • the linearized plasmid DNA and the DNA fragment of the latter half of the human Cacna2d1 gene obtained in a-1) were electrophoresed on a 1.0% agarose gel, and about 6.2 kbp and about 1.8 were obtained as in a-2).
  • kbp DNA was extracted from the gel and purified. The obtained two DNAs were ligated in the same manner as in a-2), and E. coli was transformed. A plasmid was extracted from the obtained Escherichia coli clone, the base sequence was analyzed using a DNA sequencer (Model 3700 (Applied Biosystems)), and the sequence shown in SEQ ID NO: 7 was introduced into the vector pRK-SK. I confirmed. The obtained plasmid was named pRK / hCacna2d1.
  • the collected cells were washed with a membrane fraction preparation buffer, and then disrupted using an ultrasonic disrupter. Thereafter, centrifugation was performed at 12,000 rpm, 4 ° C. for 1 hour using a centrifuge, and the supernatant was discarded and the precipitate was suspended in a membrane fraction preparation buffer. The process from sonication using an ultrasonic crusher to suspension of the precipitate after centrifugation was repeated three more times, and the resulting suspension was used as a human Cacna2d1-expressing cell membrane fraction. The total amount of protein contained in the membrane fraction was calculated from the absorbance of UV at a wavelength of 280 nm.
  • Test Example 2 Construction of detection system for binding reaction between Cacna2d1 and Gabapentin (hereinafter referred to as GBP) and detection of Cacna2d1 / GBP binding reaction inhibitory activity by test compound a) Construction of detection system for binding reaction between Cacna2d1 and GBP Human Cacna2d1 expression GBP labeled with cell membrane fraction and radioisotope 3 H (hereinafter referred to as 3 H-GBP: Tocris Cookson) Binding Assay Buffer (10 mM MOPS (pH7.4), 10 mM HEPES (pH7.4), 100 mM NaCl) The total amount of protein was diluted to a final concentration of 2.5 mg / ml and a final concentration of 3 H-GBP of 4.5 nM to prepare 120 ⁇ l of a reaction solution, which was allowed to stand at 4 ° C.
  • GBP Cacna2d1 and Gabapentin
  • 3 H-GBP Tocris
  • Inhibition rate [x] (%) (1- (binding amount [x] / binding amount [0])) ⁇ 100 (In the formula, the binding amount [0] represents the binding amount of 3 H-GBP when no compound is added) The inhibition rate (%) was obtained based on the above, and the inhibition rate was plotted against the concentration. From this result, the concentration of the test compound necessary to inhibit Cacna2d1 / GBP binding by 50%, “IC 50 value” was calculated.
  • This filtrate was prepared in advance from a dimethoxyethane solution (20 mL) of tert-butyl dimethoxyphosphoryl acetate (5.98 g, 25.9 mmol) and sodium hydride (> 65% oily, 986.7 mg, 25.9 mmol). And stirred for 1.5 hours. A saturated aqueous ammonium chloride solution, saturated brine and water were sequentially added to the reaction solution, and the reaction solution was extracted with ethyl acetate.
  • the mixture was allowed to cool, diluted with saturated brine, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and ethyl acetate, and insoluble material was removed by celite filtration.
  • the filtrate was separated into an organic layer and an aqueous layer, and the organic layer was washed with saturated brine and dried over anhydrous magnesium sulfate, and then the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain the desired product as a pale yellow solid (1.99 g, purification). Without using it in the next reaction).
  • N-Butyllithium (1.66 M hexane solution, 25.9 mL, 43.1 mmol) was added dropwise to the reaction solution, and the mixture was further stirred for 10 minutes under ice-cooling. In addition, after stirring for 30 minutes, the mixture was further stirred overnight at room temperature. 1N Hydrochloric acid and saturated brine were added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with diethyl ether. The organic layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure.
  • the aqueous layer was extracted with ethyl acetate, and the organic layers were combined, washed with saturated brine, and dried over anhydrous magnesium sulfate.
  • the solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography to obtain the desired product as a pale yellow oily substance (1.21 g, 40%, E / Z mixture).
  • N-Butyllithium (1.58 M hexane solution, 34.8 mL, 55 mmol) was added dropwise to the reaction solution, and the mixture was further stirred for 10 minutes under ice cooling, then allyl bromide (4.7 mL, 55 mmol) was added, and After stirring for an hour, the mixture was further stirred at room temperature for 4 hours.
  • 1N Hydrochloric acid and saturated aqueous ammonium chloride solution were added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with n-pentane. The organic layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure.
  • Hept-3-en-6-yl] tert-butyl acetate was obtained as an oil.
  • 16 ml of toluene was added, 2.28 g of p-toluenesulfonic acid monohydrate was added, and the mixture was stirred at 70 degrees. On the way, 15 ml of toluene was added and the mixture was allowed to cool after 3 hours.
  • SEQ ID NO: 1 is a PCR sense primer for the first half of human Cacna2d1.
  • SEQ ID NO: 2 is a PCR antisense primer in the first half of human Cacna2d1.
  • SEQ ID NO: 3 is a PCR sense primer in the latter half of human Cacna2d1.
  • SEQ ID NO: 4 is a PCR antisense primer in the latter half of human Cacna2d1.
  • SEQ ID NO: 5 is the multicloning site of vector pBluescript 2.

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Abstract

課題は、α2δリガンドとして優れた活性を有する化合物の製造方法を提供すること。 解決手段は、一般式（Ｉ）を有する化合物またはその塩を光学分割により製造する方法である。［式中、Ｒ１：水素原子又はＣ１－Ｃ６アルキル基、Ｒ２：水素原子又はカルボキシ基の保護基］

Description

二環性γ－アミノ酸誘導体の製造方法
　本発明は、二環性γ－アミノ酸誘導体、または、その薬理学的に許容される塩、特に、α2δリガンドとして活性を有し、電位依存性カルシウムチャネルのα2δサブユニットに対して親和性がある化合物、または、その製造方法に関する。
　電位依存性カルシウムチャネルのα2δサブユニットに対して高親和性結合を示す化合物は、例えば神経因性疼痛の治療において有効であることが明らかになっている（例えば、非特許文献１および非特許文献２参照）。ここで、神経因性疼痛とは、神経組織の損傷などによって引き起こされる慢性疼痛であり、疼痛発作が激しいと患者はうつ状態になるなど、生活の質（Quality of Life）を著しく損なう疾患である。
　現在、かかる神経因性疼痛の治療薬として数種類のα2δリガンドが知られており、α2δリガンドとしては、例えば、ガバペンチン、プレガバリンなどがある。これらの化合物のようなα2δリガンドは、てんかんおよび神経因性疼痛等の治療に有用である（例えば、特許文献１）。
　しかし、例えばガバペンチンの場合、帯状疱疹後神経痛における患者の自己評価による治療有効率は約60％（例えば、非特許文献３参照）、プレガバリンの場合、有痛性の糖尿病性神経障害における患者の自己評価による治療有効率は約50％（例えば、非特許文献４参照）と報告されている。
　その他の化合物としては、例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献４などに開示されている
国際公開第04/006836号パンフレット 国際公開第99/21824号パンフレット 国際公開第01/28978号パンフレット 国際公開第02/085839号パンフレット
J Biol. Chem. 271(10):5768-5776, 1996 J Med. Chem. 41:1838-18445, 1998 Acta Nerurol. Scand. 101:359-371, 2000 Drugs 64(24):2813-2820, 2004
　本発明は、α2δリガンドとして優れた活性を有する二環性γ－アミノ酸誘導体、その製造中間体及びそれらの塩の製造方法を提供することを目的とする。
[規則91に基づく訂正 12.05.2010]　
　本発明を以下に説明する。
（１）一般式（Ｉ）を有する化合物またはその塩を光学分割により製造する方法であり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
［式中、各置換基は以下のように定義される。
Ｒ１　：　水素原子またはＣ１－Ｃ６アルキル基
Ｒ２　：　水素原子またはカルボキシ基の保護基］
一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）及び（Ｖ）を有する化合物の混合物と光学活性有機酸を溶媒に溶解した後、
Figure WO-DOC-CHEMICAL-2
結晶を析出させることにより、一般式（Ｉ）を有する化合物またはその塩を製造する方法。
　また、本発明の態様として、好適には、以下に示すものである。
（２）Ｒ１が、水素原子、メチル基またはエチル基である、（１）に記載の一般式（Ｉ）を有する化合物またはその塩を製造する方法。
（３）Ｒ２が、ｔ－ブチル基である、（１）または（２）に記載の一般式（Ｉ）を有する化合物またはその塩を製造する方法。
（４）光学活性有機酸が、以下の群から選択されるいずれかの光学活性有機酸である、（１）－（３）から選択されるいずれか１項に記載の一般式（Ｉ）を有する化合物またはその塩を製造する方法。
Ｄ－マンデル酸、Ｌ－マンデル酸、Ｄｉ－ｐ－トルオイル－Ｌ－酒石酸、Ｎ－Ｂｏｃ－Ｌ－プロリン、（Ｒ）－α－メトキシフェニル酢酸、Ｏ－アセチル－Ｌ－マンデル酸、Ｄｉ－ベンゾイル－Ｌ－酒石酸、Ｏ－アセチル－Ｄ－マンデル酸、Ｎ－Ｂｏｃ－Ｌ－アラニン、（Ｓ）－２－（６－メトキシ－２－ナフチル）プロピオン酸、ジアセチル－Ｌ－酒石酸、Ｌ－酒石酸、Ｌ－リンゴ酸、Ｌ－ピログルタミン酸、（＋）－カンファール酸、（Ｓ）－２－メチルグルタミン酸、（＋）－３－ブロモカンファー－８－スルホン酸、（－）－メントキシ酢酸、（Ｓ）－２－フェノキシプロピオン酸
（５）溶媒が、以下の群から選択されるいずれかの溶媒である、（１）－（４）から選択されるいずれか１項に記載の一般式（Ｉ）を有する化合物またはその塩を製造する方法。
　アセトニトリル、酢酸エチル、トルエン、シクロペンチルメチルエーテル
　さらに、本発明は、以下の製造方法も包含する。
（６）一般式（Ｘ）を有する化合物またはその塩を製造する方法であり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
［式中、各置換基は以下のように定義される。
Ｒ１　：　水素原子またはＣ１－Ｃ６アルキル基］
（１）により製造された一般式（Ｉ）を有する化合物のカルボキシ基の保護基を脱保護し、または、さらに酸と塩を形成することによって、一般式（X）を有する化合物またはその塩を製造する方法。
　本発明の製造方法により、α2δリガンドとして優れた活性を有する二環性γ－アミノ酸誘導体、その製造中間体及びそれらの塩を提供することができる。
「Ｃ１－Ｃ６アルキル基」とは、炭素数１－６個の直鎖状または分岐鎖状アルキル基をいい、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、2-メチルブチル基、ネオペンチル基、1-エチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、4-メチルペンチル基、3-メチルペンチル基、2-メチルペンチル基、1-メチルペンチル基、3,3-ジメチルブチル基、2,2-ジメチルブチル基、1,1-ジメチルブチル基、1,2-ジメチルブチル基、1,3-ジメチルブチル基、2,3-ジメチルブチル基、2-エチルブチル基などがある。
「塩」または、「薬理上許容される塩」とは、一般式（Ｉ）で表される化合物等において、その構造中にアミノ基および／またはカルボキシル基を有する場合には酸または塩基とを反応させることにより塩を形成するので、その塩をいう。
　本明細書中の化合物名の標記において、「＊」は、その標記する不斉炭素がラセミ混合物であることを示す。ただし、「（１Ｓ＊，５Ｒ＊，６Ｒ＊）－」のように標記されている場合には、相対配置については、その関係を示すものとする。
　一般式（Ｉ）を有する化合物等は、大気中に放置したり、または、再晶析を行ったりすることにより、水分を吸収して吸着水が付き、水和物となる場合があり、そのような水和物も本発明の塩に包含される。
「カルボキシ基の保護基」とは、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、t-ブチル基、ヘキシル基、ブロモ-tert-ブチル基、トリクロロエチル基、ベンジル基、p-ニトロベンジル基、o-ニトロベンジル基、p-メトキシベンジル基、p-t-ブチルベンジル基、アセトキシメチル基、プロピオニルオキシメチル基、ブチリルオキシメチル基、イソブチリルオキシメチル基、バレリルオキシメチル基、ピバロイルオキシメチル基、アセトキシエチル基、アセトキシプロピル基、アセトキシブチル基、プロピオニルオキシエチル基、プロピオニルオキシプロピル基、ブチリルオキシエチル基、イソブチリルオキシエチル基、ピバロイルオキシエチル基、ヘキサノイルオキシエチル基、イソブチリルオキシメチル基、エチルブチリルオキシメチル基、ジメチルブチリルオキシメチル基、ペンタノイルオキシエチル基、メトキシカルボニルオキシメチル基、エトキシカルボニルオキシメチル基、プロポキシカルボニルオキシメチル基、t-ブトキシカルボニルオキシメチル基、メトキシカルボニルオキシエチル基、エトキシカルボニルオキシエチル基、イソプロポキシカルボニルオキシエチル基、t-ブチルジメチルシリル基、トリメチルシリル基、メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、（2-メチルチオ）-エチル基、3-メチル-2-ブテニル基、5-インダニル基、3-フタリジル基などであり、好適には、t-ブチル基である。
一般式（Ｉ）を有する化合物は、通常のカルボキシ基を脱保護する方法、例えば、、T.W. Greene及びP.G. Wuts著、「Protective Groups in Organic Synthesis（第3版、1999年）」に記載の方法により、カルボキシ基を脱保護することにより、一般式（X）を有する化合物を製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　一般式（X）を有する化合物、または、その薬理学的に許容される塩は、α2δリガンドとして活性を示し、電位依存性カルシウムチャンネルのα2δサブユニットに対して親和性があり、痛み、中枢神経性障害、およびその他の障害の治療および／または予防に使用される医薬組成物の有効成分として有用である。
　一般式（X）を有する化合物、または、その薬理学的に許容される塩を含有する医薬組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタなど、好ましくはヒト）に投与される場合には、全身的または局所的に、経口または非経口で投与される。
　本発明の医薬組成物は、投与方法に応じて適切な形態を選択し、通常用いられている各種製剤の調製法によって調製できる。
　経口用の医薬組成物の形態としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤などがある。かかる形態の医薬組成物の調製は、添加剤として通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、膨潤剤、膨潤補助剤、コーティング剤、可塑剤、安定剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、保存剤、緩衝剤、希釈剤、湿潤剤などを必要に応じて適宜選択し、常法に従って行われる。
　非経口用の医薬組成物の形態としては、注射剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、湿布剤、貼付剤、噴霧剤、吸入剤、スプレー剤、点眼剤、点鼻剤、座剤、吸入剤などがある。かかる形態の医薬組成物の調製は、添加剤として通常用いられる安定化剤、防腐剤、溶解補助剤、保湿剤、保存剤、抗酸化剤、着香剤、ゲル化剤、中和剤、溶解補助剤、緩衝剤、等張剤、界面活性剤、着色剤、緩衝化剤、増粘剤、湿潤剤、充填剤、吸収促進剤、懸濁化剤、結合剤などを必要に応じて適宜選択し、常法に従って行われる。
　一般式（X）を有する化合物、または、その薬理学的に許容される塩の投与量は、症状、年齢、体重などにより異なるが、経口投与の場合には、成人（体重約６０Ｋｇとして）一人一回当たり、化合物換算量で1－2000mg、好ましくは10－600mgであり、非経口投与の場合には、成人一人一回当たり、化合物換算量0.1－1000mg、好ましくは1－300mgである。
（製剤例）
　一般式（X）を有する化合物５g、乳糖９０g、トウモロコシデンプン３４g、結晶セルロース２０gおよびステアリン酸マグネシウム１gをブレンダーで混合した後、錠剤機で打錠することにより、錠剤が得られる。
（試験例１）ヒトカルシウムチャネルα2δ1サブユニット（以下、ヒトCacna2d1という）遺伝子発現プラスミドの構築、およびヒトCacna2d1発現細胞膜画分の調製
ａ）ヒトCacna2d1発現プラスミドpRK/hCacna2d1の構築
ａ－１）DNA断片の調製
　ヒトCacna2d1遺伝子は前半断片と後半断片に２分割して取得した。cDNAライブラリー（QUICK-Clone cDNA Human Brain（Clontech Laboratories, Inc））を鋳型として酵素KODポリメラーゼ（TOYOBO）を用いて、この酵素添付のプロトコールに従い、PCRを行った。PCRプライマーとしては、前半断片には下記の配列を有するプライマー：
プライマー1：5’-agctgcggcc gctagcgcca ccatggctgg ctgcctgctg gc-3’（配列番号：１）
プライマー2：5’-attaggatcg attgcaaagt aataccc-3’（配列番号：２）
後半断片には下記の配列を有するプライマー：
プライマー3：5’-aatgggtatt actttgcaat cgatcc-3’（配列番号：３）
プライマー4：5’-agtcggatcc tcataacagc cggtgtgtgc tg-3’（配列番号：４）
をシグマ・ジェネシスから購入して使用した。PCR反応は前半、後半両断片とも、サーマルサイクラー（GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)）を用い、94℃で1分間加熱後、温度サイクル（94℃で15秒、60℃で30秒、68℃で2分）を35回繰り返した後、68℃で5分おき、4℃に冷却する、という過程で行った。
　この２つの反応産物を、PCR産物精製キット（MiniElute PCR Purification Kit（QIAGEN））で、このキットに添付されているプロトコールに従い精製した。得られた前半断片は制限酵素Not1（TOYOBO）で消化した。後半断片は制限酵素Cla1（TOYOBO）とBamH1（TOYOBO）で消化した。次いで、これらを反応産物精製キット（MiniElute Reaction Cleanup Kit（QIAGEN））で、このキットに添付のプロトコールに従って用いて精製した。
ａ－２）ベクターの作製
　動物細胞用発現ベクターpRK5（Pharmingen）のマルチクローニングサイト（以下、MCSという）をベクターpBluescript 2（STRATAGENE）のMCSに変えたベクターを作製した。すなわち、pRK5をCla 1（TOYOBO）、およびHind 3（TOYOBO）で制限酵素処理を行った後、Klenow Fragment(TAKARA)を用いてDNA両末端を平滑化した。さらにウシ小腸アルカリホスファターゼ（以下、CIAPという：TAKARA）を用いて両末端を脱リン酸化した後、MiniElute Reaction Cleanup Kit（QIAGEN）で精製を行った。そして、この酵素処理したDNAを1.0％のアガロースゲルに電気泳動し、電気泳動後のゲルを臭化エチジウムで染色した後、紫外線照射下で約4.7kbpに相当するバンド部分を剃刀刃を用いて分離し、ゲル抽出精製キット（MiniElute Gel Extraction Kit（QIAGEN））を用い、このキットに添付のプロトコールに従って、DNAを抽出した。
　pBluescript 2のMCSに相当するDNA断片を得るため、pBluescript 2をSac 1（TOYOBO）、およびKpn 1（TOYOBO）で制限酵素処理を行った後、Klenow Fragment(TAKARA)を用いてDNA両末端を平滑化した。そして、この酵素処理したDNAを2.0％のアガロースゲルで電気泳動し、電気泳動後のゲルを臭化エチジウムで染色した後、紫外線照射下で約100bpに相当するバンド部分を剃刀刃を用いて分離し、ゲル抽出精製キット（MiniElute Gel Extraction Kit（QIAGEN））を用い、このキットに添付のプロトコールに従って、DNAを抽出した。
　得られたDNA断片と切断済みのpRK5を、DNAライゲーションキット（TAKARA）を用い、キットに添付されているプロトコールに従って連結した。この反応産物で大腸菌DH5αのコンピテント細胞（TOYOBO）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。いくつかのコロニーを採取した後、採取したコロニーを培養して得られた菌体からプラスミドを抽出して、その塩基配列をDNAシークエンサー（Model 3700 (Applied Biosystems)）を用いて解析し、MCS配列がpRK5に導入されていることを確認した。この際、MCS配列の向きがCMVプロモーターを上流として下流方向へ以下の向き：5’-ccaccgcggtggcggccgctctagaactagtggatcccccgggctgcaggaattcgatatcaagcttatcgataccgtcgacctcgagggggggcccg-3’（配列番号：５）で組み込まれたベクターをpRK-SK、逆向きに組み込まれたベクターをpRK-KSと命名した。
ａ－３）プラスミドの構築
　ａ－２）で得られたpRK-SKを制限酵素Xba1（TOYOBO）で処理し、Klenow Fragment(TAKARA)を用いてDNA両末端を平滑化し、さらに、平滑化したDNAを制限酵素Not 1（TOTOBO）で消化し、ａ－２）と同様の方法で精製を行った。この直鎖状にしたpRK-SKとａ－１）で得られたヒトCacna2d1遺伝子前半部DNA断片について、1.0％のアガロースゲルで電気泳動を行い、ａ－２）と同様に約4.7kbpおよび約1.5kbpのDNAをゲルより抽出して精製した。得られた2つのDNAをａ－２）と同様の方法でライゲーションし、大腸菌の形質転換を行った。得られた大腸菌のクローンからプラスミドを抽出して、その塩基配列をDNAシークエンサー（Model 3700 (Applied Biosystems)）を用いて解析し、配列番号：６に示される配列が導入されていることを確認した。次に、得られたプラスミドを制限酵素Cla 1（TOYOBO）とBamH 1（TOYOBO）で処理し、ａ－２）と同様の方法で、CIAP処理、および精製を行った。この直鎖状にしたプラスミドDNAとａ－１）で得られたヒトCacna2d1遺伝子後半部DNA断片について、1.0％のアガロースゲルで電気泳動を行い、ａ－２）と同様に約6.2kbpおよび約1.8kbpのDNAをゲルより抽出して精製した。得られた2つのDNAをａ－２）と同様の方法でライゲーションし、大腸菌の形質転換を行った。得られた大腸菌のクローンからプラスミドを抽出して、その塩基配列をDNAシークエンサー（Model 3700 (Applied Biosystems)）を用いて解析し、ベクターpRK-SKに配列番号：７に示される配列が導入されていることを確認した。得られたプラスミドをpRK/hCacna2d1と命名した。
ｂ）ヒトCacna2d1発現293細胞株の取得
　ａ）で構築したヒトCacna2d1発現プラスミドpRK/hCacna2d1を293細胞に遺伝子導入し、ヒトCacna2d1タンパク質の発現を指標にヒトCacna2d1安定発現細胞株を取得した。具体的には、φ6cm dishに2×106cellsの293細胞を播種し、12時間培養後に遺伝子導入試薬LipofectaminePlus（Invitrogen）を用いて、試薬に添付のプロトコールに従って、5μgのpRK/hCacna2d1と0.5μgのneomycin耐性遺伝子発現プラスミドpSV2neo（Clontech）を同時に導入した。
　遺伝子導入後、細胞を回収し、φ15cm dishに希釈して播種し、10％牛胎児血清（Cansera International Inc.）および500μg/mlのG418（Invitrogen）を添加したDMEM（Invitrogen）で２週間培養した。コロニーを形成したneomycin耐性細胞を単離して拡大培養後細胞を回収し、細胞溶解液をWestern assay法で評価することで、ヒトCacna2d1を発現する293細胞株を取得した。Western assayでは抗hCacna2d1抗体（Chemicon Inc.）を１次抗体として用いた。
ｃ）ヒトCacna2d1発現293細胞の細胞膜画分の調製
　ｂ）で取得したヒトCacna2d1発現293細胞を10％牛胎児血清（Cansera International Inc.）および500μg/mlのG418（Invitrogen）を添加したDMEM（Invitrogen）で大量培養し、回収した。Binding Assay Buffer（10mM MOPS（pH7.4）、10mM HEPES（pH7.4）、100mM NaCl）にプロテアーゼ阻害剤（Comlpete EDTA free (Roche)）を該試薬の推奨量添加し、膜画分調製バッファーとした。回収した細胞を膜画分調製バッファーで洗浄後、超音波破砕機を用いて細胞を破砕した。その後遠心機を用いて12,000rpm、4℃、1時間遠心分離を行い、上清を捨て膜画分調製バッファーで沈殿物を懸濁した。超音波破砕機を用いた超音波処理から遠心分離後の沈殿物の懸濁までをさらに３回繰り返して行い、得られた懸濁液をヒトCacna2d1発現細胞膜画分とした。波長280nmのUVの吸光度から膜画分に含まれる全タンパク質量を算出した。
（試験例２）Cacna2d1とGabapentin（以下GBPとする）の結合反応の検出系構築および被検化合物によるCacna2d1/GBP結合反応阻害活性の検出
ａ）Cacna2d1とGBPの結合反応の検出系構築
　ヒトCacna2d1発現細胞膜画分および放射性同位体3Hにより標識されたGBP（以下3H-GBPとする：Tocris Cookson）をBinding Assay Buffer（10mM MOPS（pH7.4）、10mM HEPES（pH7.4）、100mM NaCl）で、全タンパク質量終濃度2.5mg/ml、3H-GBP終濃度4.5nMとなるように希釈して、反応液120μlを調製し、4℃にて3時間静置した。この反応物をフィルタープレート（UniFilter350 GF/B（Whatman））のウェルに添加してフィルター濾過を行った。その後350μlのBinding Assay Buffer（10mM MOPS（pH7.4）、10mM HEPES（pH7.4）、100mM NaCl）を添加してフィルター濾過を行う洗浄作業を３回繰り返した。フィルタープレートを十分に乾燥させ、底面をシールし、Microscint 20（PerkinElmer）を50μl添加後、上面もシールし、フィルターに残る放射性同位体3H由来の放射線をTopCount（PerkinElmer）でカウントした。得られた値から、本アッセイに終濃度20μMの非標識GBP（SIGMA-ALDRICH）を添加した際の値を非特異的吸着由来として差し引き、Cacna2d1に対する3H-GBPの特異的な結合量（単位は「count」）とした。
ｂ）被検化合物によるCacna2d1/GBP結合反応阻害活性の検出
　ａ）で構築したCacna2d1/GBP結合反応の検出アッセイに被検化合物を様々な濃度で添加し、結合量をａ）に記載の方法で測定した。その後、化合物をx nM添加した際のCacna2d1/GBP特異的結合量を「結合量[x]」、そのときのCacna2d1/GBP結合阻害率を「阻害率[x]」とし、下記式：
阻害率[x]（％）＝（1-（結合量[x]/結合量[0]））×100
（式中、結合量[0]とは、化合物を添加しない場合の3H-GBPの結合量を表す）
に基づいて阻害率（％）を求め、濃度に対し阻害率をプロットした。この結果からCacna2d1/GBP結合を50％阻害するのに必要な被検化合物の濃度、「IC50値」を算出した。
（製造例１）
［６－（アミノメチル）ビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル］酢酸
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（１－ａ）（２Ｅ）－ヘプタ－２，６－ジエン酸
　４－ペンテナール（４．４５ｇ、５１．４ｍｍｏｌ）およびマロン酸（６．４１ｇ、６１．６ｍｍｏｌ）をピリジン（９．９ｍＬ）に溶解し、そこにピペリジン（１．９ｍＬ）を加えた後９０℃で５時間攪拌した。放冷後、２Ｎ塩酸を加えて酸性にした後、ジエチルエーテルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ろ液を減圧濃縮した。残渣を減圧蒸留し、目的物を無色油状物質として得た（３ｍｍＨｇ、１１０－１１６℃、３．２７ｇ、５０％）。
1H-NMR(400MHz、CDCl3) :δ ppm: 2.21-2.26 (2H, m), 2.32-2.37 (2H, m), 5.01-5.08 (2H, m), 5.75-6.87 (2H, m), 7.03-7.11 (1H, m).
（１－ｂ）ビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イリデン酢酸ｔｅｒｔ－ブチル
（２Ｅ）－ヘプタ－２，６－ジエン酸（３．２７ｇ、２５．９ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（６０ｍＬ）に塩化オキザリル（１０ｍＬ）を氷冷下で滴下した。２０分攪拌後、氷水浴をはずして徐々に室温まで昇温させた。５０分攪拌した後、反応液を加熱還流下で１時間攪拌した。放冷後、溶媒を減圧留去し、さらにトルエンを加えた後、再び溶媒を減圧留去した。残渣をトルエン（２０ｍＬ）に溶解させ、これをあらかじめ９０℃に加熱しておいたトリエチルアミン（９．１９ｇ、９１ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（２０ｍＬ）に１時間かけて滴下し、滴下終了後さらに２時間加熱攪拌した。反応液を冷却後、飽和食塩水、水で希釈し、セライトでろ過した。ろ液を有機層と水層に分離した後、有機層を１Ｎ塩酸で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過した。このろ液をジメトキシホスホリル酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（５．９８ｇ、２５．９ｍｍｏｌ）のジメトキシエタン溶液（２０ｍＬ）と水素化ナトリウム（＞６５％油性、９８６．７ｍｇ、２５．９ｍｍｏｌ）より予め調製した反応液に加え、１時間半攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和食塩水、水を順次加え、反応液を酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ろ過し、溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し目的物を淡黄色油状物質として得た（１．７３ｇ、３２％、Ｅ／Ｚ体混合物）。
1H-NMR(400MHz、CDCl3):δ ppm:
Major isomer: 1.45 (9H, S), 2.29-2.35 (1H, m), 2.62-2.71 (2H, m), 2.89-2.98 (1H, m), 3.27-3.35 (1H, m), 3.92 (1H, broad), 5.47-5.49 (1H, m), 5.80-5.87 (2H, m).
Minor isomer: 1.49 (9H, s), 2.42-2.48 (1H, m), 2.62-2.71 (2H, m), 2.89-2.98 (2H, m), 4.34-4.36 (1H, m), 5.37-5.38 (1H, m), 5.61-5.64 (2H, m).
（１－ｃ）［６－（ニトロメチル）ビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル］酢酸ｔｅｒｔ－ブチル
　ビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イリデン酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（１．７３ｇ、８．３９ｍｍｏｌ）をニトロメタン（１０ｍＬ）に溶解し、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（１．３ｍＬ、８．４ｍｍｏｌ）を加え、１時間室温で攪拌した後、５０－６０℃で５時間加熱攪拌した。放冷後、１Ｎ塩酸、飽和食塩水で希釈し、酢酸エチルで抽出後、無水硫酸マグネシウムで乾燥、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物を無色油状物質として得た（１．９８ｇ、８９％）。
1H-NMR(400MHz、CDCl3):δ ppm: 1.45 (9H, s), 1.53 (1H, dd, J=7.5, 12.9Hz), 2.17 (1H, d, J=15.2Hz), 2.31 (1H, ddd, J=2.4, 8.6, 12.1Hz), 2.47 (2H, s), 2.52-2.58 (1H, m), 2.87 (1H, quint, J=7.5Hz), 3.25-2.66 (1H, m), 4.78 (1H, d, J=11.4Hz), 4.87 (1H, d, J=11.4Hz), 5.65-5.67 (1H, m), 5.95 (1H, dd, J=1.6, 5.9Hz).
（１－ｄ）［６－（アミノメチル）ビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル］酢酸ｔｅｒｔ－ブチル
　［６－（ニトロメチル）ビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル酢酸］ｔｅｒｔ－ブチル（１．９８ｇ、７．４１ｍｍｏｌ）をエタノール（２０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）に溶解させ、鉄粉末（２．０７ｇ、３７．０ｍｍｏｌ）、塩化アンモニウム（３９２．７ｍｇ、７．４１ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下４時間半攪拌した。放冷後、飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、および酢酸エチルで希釈し、セライトろ過により不溶物を除去した。ろ液を有機層と水層に分離し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し目的物を淡黄色固体として得た（１．９９ｇ、精製せずそのまま次反応に使用）。
1H-NMR(400MHz、CDCl3):δ ppm: 1.39-1.49 (1H, m), 1.44 (9H, s), 1.97 (1H, ddd, J=2.8, 9.0, 11.7Hz), 2.14 (1H, dd, J=2.3, 16.8Hz), 2.25 (1H, d, J=13.7Hz), 2.32 (1H, d, J=13.7Hz), 2.47-2.55 (1H, m), 2.75 (1H, quint, J=7.4Hz), 2.88 (2H, s), 2.98-2.99 (1H, m), 5.77-5.79 (1H, m), 5.87-5.89 (1H, m).
（１－ｅ）［６－（アミノメチル）ビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル］酢酸
　［６－（アミノメチル）ビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル］酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（０．９９ｇ、４．１７ｍｍｏｌ）に４Ｎ塩酸　酢酸エチル溶液（１０ｍＬ）を加え室温で１時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣にジクロロメタンを加え懸濁させた後、トリエチルアミンを滴下して生じた粉末をろ取した。得られた粉末をジクロロメタンで洗浄後、減圧乾燥して目的物を白色粉末として得た（２１１．６ｍｇ、３５％）。
1H-NMR(400MHz、CDCl3):δ ppm: 1.49 (1H, dd, J=7.6, 12.5Hz), 2.06 (1H, ddd, J=2.6, 7.6, 12.5Hz), 2.17 (1H, dd, J=2.6, 16.8Hz), 2.49 (2H, s), 2.48-2.56 (1H, m), 2.86 (1H, quint, J=7.6Hz), 3.15-3.16 (1H, m), 3.18 (1H, d, J=12.7Hz), 3.22 (1H, d, J=12.7Hz), 5.75-5.78 (1H, m), 5.91-5.93 (1H, m).
（製造例２）
［６－（アミノメチル）ビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル］酢酸　塩酸塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
６－（アミノメチル）ビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル］酢酸（３２０．２ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）に水（５ｍＬ）、４Ｎ塩酸　１，４－ジオキサン溶液（２２ｍＬ）を加え、室温で５分攪拌した。溶媒を減圧留去し、残渣に１，４－ジオキサンを加え加熱後、室温まで放冷し生じた粉末をろ取した。得られた粉末を１，４－ジオキサンで洗浄後、乾燥し目的物を白色粉末として得た（３５０．０ｍｇ、９２％）。
1H-NMR(400MHz、CD3OD):δ ppm: 1.51 (1H, dd, J=7.6, 12.7Hz), 2.16 (1H, ddd, J=2.8, 7.6, 15.6Hz), 2.19 (1H, dd, J=2.2, 16.8Hz), 2.51 (2H, s), 2.53-2.59 (1H, m), 2.89 (1H, quint, J=7.6Hz), 3.18-3.19 (1H, m), 3.33 (1H, d, J=13.3Hz), 3.37 (1H, d, J=13.3Hz), 5.70-5.73 (1H, m), 5.97-6.00 (1H, m).
（製造例３）
［６－（アミノメチル）ビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル］酢酸　ベンゼンスルホン酸塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
６－（アミノメチル）ビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル］酢酸（１５２．２ｇ、３９１ｍｍｏｌ）を２－プロパノール（７．５ｍＬ）、水（２．６ｍＬ）に溶解させた後、ベンゼンスルホン酸一水和物（３０５．２ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ）を加えて室温で５分攪拌した。溶媒を減圧留去し、さらに２－プロパノールで共沸脱水をした後、残渣を２－プロパノールで洗浄後、目的物を白色粉末として得た（２６０．４ｍｇ、５５％）。
1H-NMR(400MHz、CD3OD):δ ppm: 1.51 (1H, dd, J=7.4, 12.7Hz), 2.12-2,21 (2H, m), 2.51 (2H, s), 2.51-2.59 (1H, m), 2.89 (1H, quint , J=7.4Hz), 3.17-3.18 (1H, m), 3.32 (1H, d, J=13.3Hz), 3.36 (1H, d, J=13.3Hz), 5.69-5.71 (1H, m), 5.97-6.00 (1H, m), 7.40-7.46 (3H, m), 7.80-7.84 (2H, m).
（製造例４）
［６－アミノメチル－３－メチルビシクロ［３．２．０］ヘプタ－３－エン－６－イル］酢酸
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
（４－ａ）４－メチル－３－ヒドロキシヘプタ－６－エン酸メチル
　３－オキソペンタン酸メチル（５．１０ｇ、３９．２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（５０ｍＬ）に水素化ナトリウム（＞６３％油性、１．６４ｇ、４３．１ｍｍｏｌ）を氷冷下加え、そのまま１０分攪拌した。反応液にｎ－ブチルリチウム（１．６６Ｍヘキサン溶液、２５．９ｍＬ、４３．１ｍｍｏｌ）を滴下し、さらに氷冷下で１０分攪拌した後、臭化アリル（５．１８ｇ、４３．１ｍｍｏｌ）を加え、そのまま３０分攪拌した後、室温でさらに一晩攪拌した。反応液に１Ｎ塩酸、飽和食塩水を加えた後、ジエチルエーテルで抽出した。飽和食塩水で有機層を洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をメタノール（１００ｍＬ）に溶解させ、氷冷下で水素化ホウ素ナトリウム（１．８９ｇ、５０ｍｍｏｌ）を加え、そのまま一時間半攪拌した。２Ｎ塩酸（５０ｍＬ）を加えて３０分攪拌した後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的物を淡黄色油状物質として得た（５．７２ｇ、８５％、ジアステレオマーの混合物）。
1H-NMR(400MHz、CDCl3):δ ppm: 0.89-0.94 (3H, m), 1.58-1.75 (1H, m), 1.91-2.03 (1H, m), 2.21-2.33 (1H, m), 2.43-2.56 (2H, m), 3.72 (3H, s), 3.84-4.00 (1H, m), 5.01-5.07 (2H, m), 5.74-5.84 (1H, m).
（４－ｂ）４－メチル－３－ヒドロキシヘプタ－６－エン酸
　４－メチル－３－ヒドロキシヘプタ－６－エン酸メチル（５．７２ｇ、３３．２ｍｍｏｌ）を２Ｎ水酸化カリウム　メタノール溶液（５０ｍＬ）に溶解させ室温で一晩攪拌した。反応液の溶媒を減圧留去した後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加え、ジエチルエーテルで抽出した。水層を氷冷下にて濃塩酸を加えて酸性にした後、再びジエチルエーテルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、目的物を黄色油状物質として得た（２．２１ｇ、４２％、ジアステレオマーの混合物）。
1H-NMR(400MHz、CDCl3):δ ppm: 0.90-0.94 (3H, m), 1.64-1.74 (1H, m), 1.93-2.00 (1H, m), 2.24-2.32 (1H, m), 2.45-2.61 (2H, m), 3.87-4.03 (1H, m), 5.03-5.08 (2H, m), 5.75-5.83 (1H, m).
（４－ｃ）３－メチルビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イリデン酢酸ｔｅｒｔ－ブチル
　４－メチル－３－ヒドロキシヘプタ－６－エン酸（２．２１ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）を無水酢酸（１４ｍＬ）に溶解し、酢酸カリウム（３．２９ｇ、３３．４ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間攪拌した。反応液を１１０－１２０℃に加熱し３時間半攪拌した後、反応液に氷水、トルエンを加えそのまま室温で一時間攪拌した。飽和食塩水、トルエンを加え分液後、有機層を１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ろ過した。このろ液を、ジメトキシホスホリル酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（３．２４ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（２０ｍＬ）に氷冷下で水素化ナトリウム（＞６３％油性、５３３．３ｍｇ、１４．０ｍｍｏｌ）を加えて調製した反応液に加え、さらに１時間半攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和食塩水を加え分液した。水層を酢酸エチルで抽出し、有機層を併せて飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的物を淡黄色油状物質として得た（１．２１ｇ、４０％、Ｅ／Ｚ体混合物）。
1H-NMR(400MHz、CDCl3):δ ppm:
Major isomer: 1.45 (9H, s), 2.11-2.22 (4H, m), 2.59-2.71 (2H, m), 2.87-2.97 (1H, m), 3.26-3.34 (1H, m), 3.87 (1H, broad), 5.22-5.23 (1H, m), 5.45-5.47 (1H, m).
Minor isomer: 1.49 (9H, s), 2.11-2.21 (4H, m), 2.43-2.46 (1H, m), 2.59-2.70 (1H, m), 2.75-2.83 (1H, m), 2.87-2.97 (1H, m), 4.29 (1H, broad), 5.36 (1H, s), 5.59 (1H, s).
（４－ｄ）［３－メチル－６－（ニトロメチル）ビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル］酢酸ｔｅｒｔ－ブチル
　３－メチルビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イリデン酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（１．２１ｇ、５．５０ｍｍｏｌ）をニトロメタン（７ｍＬ）に溶解し、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（０．９１ｍＬ、６．０ｍｍｏｌ）を加え、５０－６０℃で６時間加熱攪拌した。放冷後、飽和リン酸二水素カリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出後、無水硫酸マグネシウムで乾燥、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物を無色油状物質として得た（１．１４ｇ、７４％）。
1H-NMR(400MHz、CDCl3):δ ppm: 1.45 (9H, s), 1.53 (1H, dd, J=7.6, 12.9Hz), 1.80 (3H, s), 2.04 (1H, d, J=16.4Hz), 2.29 (1H, ddd, J=2.8, 7.6, 12.9Hz), 2.47 (2H, s), 2.49 (1H, dd, H=7.6, 16.4Hz), 2.86 (1H, quint, J=7.6Hz), 3.21-3.22 (1H, m), 4.74 (1H, d, J=11.7Hz), 4.84 (1H, J=11.7Hz), 5.25 (1H, s).
（４－ｅ）［６－アミノメチル－３－メチルビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル］酢酸ｔｅｒｔ－ブチル
　［３－メチル－６－（ニトロメチル）ビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル］酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（１．１２ｇ、３．９９ｍｍｏｌ）をエタノール（２０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）に溶解させ、鉄粉末（８９２．８ｍｇ、１５．９ｍｍｏｌ）、塩化アンモニウム（２１１．５ｍｇ、３．９９ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下４時間攪拌した。放冷後、飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、および酢酸エチルで希釈し、セライトろ過により不溶物を除去した。ろ液を有機層と水層に分離し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣に４Ｎ塩酸　酢酸エチル溶液（５ｍＬ）を加え室温で１時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。ジクロロメタンに懸濁させトリエチルアミンを滴下し、生じた粉末をろ取、ジクロロメタンで洗浄後、乾燥し、目的物を白色粉末として得た（１０５．８ｍｇ、２８％）。
1H-NMR(400MHz、CD3OD):δ ppm: 1.40 (1H, dd, J=7.6, 12.3Hz), 1.79 (3H, s), 2.02-2.08 (2H, m), 2.43-2.50 (1H, m), 2.45 (1H, d, J=16.2Hz), 2.51 (1H, d, J=16.2Hz), 2.85 (1H, quint, J=7.6Hz), 3.05-3.12 (1H, m), 3.13 (1H, d, J=13.0Hz), 3.17 (1H, d, J=13.0Hz), 5.36 (1H, t, J=1.6Hz)．
（製造例５）［６－アミノメチル－３－エチルビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル］酢酸
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
（５－ａ）４－エチル－３－ヒドロキシヘプタ－６－エン酸エチル
　３－オキソヘキサン酸エチル（７．９１ｇ、５０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（５０ｍＬ）に水素化ナトリウム（＞６３％油性、２．０９ｇ、５５ｍｍｏｌ）を氷冷下加え、そのまま１０分攪拌した。反応液にｎ－ブチルリチウム（１．５８Ｍヘキサン溶液、３４．８ｍＬ、５５ｍｍｏｌ）を滴下し、さらに氷冷下で１０分攪拌した後、臭化アリル（４．７ｍＬ、５５ｍｍｏｌ）を加え、そのまま１時間攪拌した後、室温でさらに４時間攪拌した。反応液に１Ｎ塩酸、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えた後、ｎ－ペンタンで抽出した。飽和食塩水で有機層を洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をエタノール（８０ｍＬ）に溶解させ、氷冷下で水素化ホウ素ナトリウム（１．５１ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、そのまま２時間攪拌した。１Ｎ塩酸（５０ｍＬ）を加えて３０分攪拌した後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的物を淡黄色油状物質として得た（３．６４ｇ、３７％、ジアステレオマーの混合物）。
1H-NMR(400MHz、CDCl3):δ ppm: 0.91 (3H, t, J=7.5Hz), 1.28 (3H, t, J=7.2Hz), 1.43-1.55 (2H, m), 1.98-2.28 (2H, m), 2.45-2.48 (2H, m), 2.88-2.93 (1H, m), 4.07-4.10 (1H, m), 4.10-4.20 (2H, m), 5.01-5.09 (2H, m), 5.75-5.86 (1H, m).
（５－ｂ）４－エチル－３－ヒドロキシヘプタ－６－エン酸
　４－エチル－３－ヒドロキシヘプタ－６－エン酸エチル（３．６４ｇ、１８．２ｍｍｏｌ）を２Ｎ水酸化カリウム　メタノール溶液（１２０ｍＬ）に溶解させ、室温で一晩攪拌した。反応液の溶媒を減圧留去した後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）を加え、ジエチルエーテルで抽出した。水層を氷冷下にて濃塩酸を加えて酸性にした後、再びジエチルエーテルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、目的物を淡黄色油状物質として得た（３．１４ｇ、＜１００％、ジアステレオマーの混合物）。
1H-NMR(400MHz、CDCl3):δ ppm: 0.91-0.96 (3H, m), 1.39-1.52 (3H, m), 2.01-2.28 (2H, m), 2.52-2.55 (2H, m), 4.05-4.15 (2H, m), 5.03-5.10 (2H, m), 5.74-5.86 (1H, m).
（５－ｃ）３－エチルビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イリデン酢酸ｔｅｒｔ－ブチル
　４－エチル－３－ヒドロキシへプタ－６－エン酸（３．１３ｇ、１８．２ｍｍｏｌ）を無水酢酸（１５ｍＬ）に溶解し、酢酸カリウム（４．２７ｇ、４３．６ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間４０分攪拌した。反応液を加熱還流し３時間半攪拌して、反応液中に「３－エチルビシクロ［３．２．０］ヘプタ－６－エン－６－オン」を生成させた後、反応液に氷水、トルエンを加えそのまま室温で一晩攪拌した。飽和食塩水（５０ｍＬ）、トルエン（２０ｍＬ）を加え分液後、有機層を１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥して、ろ過した。このろ液を、ジメトキシホスホリル酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（４．４８ｇ、２０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（５０ｍＬ）に氷冷下で水素化ナトリウム（＞６５％油性、７６１．９ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）を加えて調製した反応液に加え、さらに１時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和食塩水を加え分液した。水層を酢酸エチルで抽出し、有機層を併せて飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的物を淡黄色油状物質として得た（１．３２ｇ、３１％、Ｅ／Ｚ体混合物）。
1H-NMR(400MHz、CDCl3):δ ppm:
Major isomer: 1.06 (3H, t, J=7.4Hz), 1.45 (9H, s), 2.07-2.22 (3H, m), 2.59-2.70 (2H, m), 2.87-2.96 (1H, m), 3.30 (1H, ddt, J=8.6, 18.4, 2.7Hz), 3.86-3.88 (1H, m), 5.22-5.23 (1H, m), 5.45-5.47 (1H, m).
Minor isomer: 1.08 (3H, t, J=7.3Hz), 1.49 (9H, s), 2.07-2.21 (3H, m), 2.43-2.47 (1H, m), 2.59-2.70 (1H, m), 2.75-2.85 (1H, m), 2.87-2.96 (1H, m), 4.28-4.31 (1H, m), 5.35-5.38 (1H, m), 5.45-5.47 (1H, m).
（５－ｄ）［３－エチル－６－（ニトロメチル）ビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル］酢酸ｔｅｒｔ－ブチル
　［３－エチルビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イリデン酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（１．３２ｇ、５．６３ｍｍｏｌ）をニトロメタン（７ｍＬ）に溶解し、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（１．２ｍＬ、７．３ｍｍｏｌ）を加え、５０－６０℃で７時間加熱攪拌した。放冷後、飽和リン酸二水素カリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出後、無水硫酸マグネシウムで乾燥、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物を無色油状物質として得た（１．３９ｇ、８４％）。
1H-NMR(400MHz、CDCl3):δ ppm: 1.09 (3H, t, J=7.4Hz), 1.46 (9H, s), 1.52 (1H, dd, J=7.6, 13.2Hz), 2.06(1H,d, 16.6Hz), 2.14 (2H, q, J=7.4Hz), 2.30 (1H, ddd, J=2.4, 7.6, 13.2Hz), 2.47 (2H, s), 2.49 (1H, dd, J=7.6,16.6Hz), 2.86 (1H, quint, J=7.6Hz), 3.21-3.22 (1H, m), 4.75 (1H, d, J=11.7Hz), 4.84 (1H, d, J=11.7Hz), 5.27 (1H, s).
（５－ｅ）［６－アミノメチル－３－エチルビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル］酢酸
［３－エチル－６－（ニトロメチル）ビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル］酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（１．０９ｇ、４．７１ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）および水（５ｍＬ）に溶解させ、鉄粉末（１．３２ｇ、２３．５ｍｍｏｌ）、塩化アンモニウム（２４９．６ｍｇ、４．７１ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下２時間攪拌した。放冷後、飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、および酢酸エチルで希釈し、セライトろ過により不溶物を除去した。ろ液を有機層と水層に分離し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣に４Ｎ塩酸　酢酸エチル溶液（２０ｍＬ）を加え室温で１時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。ジクロロメタンに懸濁させトリエチルアミンを滴下し、生じた粉末をろ取、ジクロロメタンで洗浄後、乾燥し、目的物を白色粉末として得た（４２５．１ｍｇ、４３％）。
1H-NMR(400MHz、CD3OD):δ ppm: 1.10 (3H, t, J=7.4Hz), 1.48 (1H, dd, J=7.5, 12.5Hz), 2.03-2.08 (2H, m), 2.14 (2H, q, J=7.4Hz), 2.46 (1H, d, J=16.2Hz), 2.46-2.53 (1H, m), 2.51 (1H, d, J=16.2Hz), 2.85 (1H, quint, J=7.5Hz), 3.09-3.10 (1H, m), 3.14 (1H, d, J=13.0Hz), 3.18 (1H, d, J=13.0Hz), 5.38 (1H, dd, J=1.7, 3.7Hz).
（製造例６）
［６－アミノメチル－３－エチルビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル］酢酸　ｐ－トルエンスルホン酸塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　［６－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）メチル－３－エチルビシクロ［３．２．０］へプタ－３－エン－６－イル］酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（１１５２．２３ｇ、３９１．６ｍｍｏｌ）をベンゼン（１．２Ｌ）に溶解させた後、チオアニソール（１４５．５７ｇ、１１７３ｍｍｏｌ）およびｐ－トルエンスルホン酸　一水和物（８９．３９ｇ）を加えて還流下、２時間攪拌した。一晩室温で静置し、生じた粉末をろ取した。得られた粉末を酢酸エチルで洗浄後、乾燥し目的物を白色粉末として得た（８８．２９ｇ、５９％）。
1H-NMR(400MHz,CD3OD) :δ ppm: 1.11(3H, t, J=7.4Hz), 1.51(1H, dd, 7.4, 12.7Hz), 2.06-2,20 (4H, m), 2.37(3H, s), 2.49-2.56(1H, m), 2.51(2H,s), 2.87(1H, quint , J=7.4Hz), 3.12-3.14(1H, m), 3.28(1H, d, J=13.5Hz), 3.33(1H, d, J=13.5Hz), 5.31-5.32(1H, m), 7.21-7.25(2H, m), 7.69-7.72(2H, m).
（製造例７）［６－（アミノメチル）－３－エチルビシクロ［３．２．０］ヘプタ－３－エン－６－イル］酢酸　ベンゼンスルホン酸塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
６－（アミノメチル）－３－エチルビシクロ［３．２．０］ヘプタ－３－エン－６－イル］酢酸（４．５０ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）をベンゼンスルホン酸１水和物の１モル水溶液（２２．７ｍＬ）に加熱溶解させた後、室温まで放冷し生じた固体を濾取した。固体を水（１５ｍＬ）で洗浄した後、真空ポンプで乾燥し目的物を無色固体として得た（６．４５ｇ、７７％）。
1H-NMR(400MHz、CD3OD) :δ ppm: 1.11 (3H,t, J=7.4Hz), 1.50 (1H, dd, J=7.5, 12.6Hz), 2.08 (1H, d, 16.5Hz), 2.10-2.20 (3H, m), 2.46-2.56 (3H, m), 2.87 (1H, quint. J=7.5Hz), 3.12-3.13 (1H, m), 3.28 (1H, d, J=13.4Hz), 3.33 (1H, d, J=13.4Hz), 5.31 (1H, d, J=1.8Hz), 7.39-7.45 (3H, m), 7.80-7.85 (2H, m).
（ニトロ基の還元工程）
（製造例８）
[6-アミノメチル-3-エチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（ｉ）
[3-エチル-6-(ニトロメチル)ビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル709.0 g（Net :681.8 g, 2.31 mol, 85:15のジアステレオマー混合物）にラネー　ニッケル102.3 g（0.15 w/w）、ならびに、エタノール 5.5 L（8.0 v/w）を加え攪拌した。反応液にヒドラジン1水和物458.0 ml（9.23 mol, 4.00 eq.）を加え40度にて2時間攪拌した。室温まで冷却しラネー　ニッケルをろ去した後、溶媒を留去し茶色油状物として目的物637.0 g（Net :552.3 g, 収率 :90.2%）を得た (85:15のジアステレオマー混合物) 。
1H-NMR(400MHz、CDCl3):δppm: 1.05-1.10 (each t), 1.44-1.61 (m), 1.86-2.38 (m), 2.42-2.55 (m), 2.73-3.05 (m), 5.40-5.48 (m).
（ii）
[3-エチル-6-(ニトロメチル)ビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル59 mg（85:15のジアステレオマー混合物）にラネー　ニッケル96 mg（0.16w/w）、ならびに、エタノール 200 μLを加え水素雰囲気か室温で12時間攪拌した。ラネー　ニッケルをろ去した後、溶媒を留去し茶色油状物として目的物49 mg( 収率 :92%, 85:15のジアステレオマー混合物)を得た。
（製造例９）
[6-(アミノメチル)ビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
[6-(ニトロメチル)ビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル4.0 g（90:10のジアステレオマー混合物）にラネー　ニッケル0.4 g、ならびに、エタノール24 mlを加え攪拌した。反応液にヒドラジン1水和物2.9 mlを加え0.5時間攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、ラネー　ニッケルをろ去して溶媒を留去し茶色油状物として目的物3.62 gを得た (90:10のジアステレオマー混合物) 。
薄層クロマトグラフィー展開液：ヘキサン：酢酸エチル＝9:1　
ニトロ体Rf値0.7、還元体Rf値0.1テーリンク゛
1H-NMR(400MHz、CDCl3):δppm: 1.44-1.51 (m), 1.93-2.17 (m), 2.23-2.35 (m), 2.48-2.60 (m), 2.70-2.90 (m), 2.95-3.30 (m), 5.75-5.80 (m), 5.83-5.90 (m).
（製造例１０）
[6-アミノメチル-3-メチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
[6-(ニトロメチル)-3-メチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル2.81 g（90:10のジアステレオマー混合物）にラネー　ニッケル0.28 g、ならびに、エタノール20 mlを加え攪拌した。反応液にヒドラジン1水和物1.9 mlを加え0.75時間攪拌した。薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認後、ラネー　ニッケルをろ去して溶媒を留去し茶色油状物として目的物2.50gを得た (90:10のジアステレオマー混合物) 。
薄層クロマトグラフィー展開液：ヘキサン：酢酸エチル＝9:1　
ニトロ体Rf値0.7、還元体Rf値0.1テーリンク゛
1H-NMR(400MHz、CDCl3):δppm: 1.44-1.61 (m), 1.80-1.90 (m), 1.93-2.06 (m), 2.10-2.20 (m), 2.23-2.38 (m), 2.40-2.60 ( m), 2.73-2.90 (m), 2.92-3.30 (m), 5.40-5.45 (m).
[規則91に基づく訂正 12.05.2010]　
（ジアステレオマーを分割する工程）
（製造例１１）
[(1R＊,5S＊,6S＊)-6-アミノメチル-3-エチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル　p－トルエンスルホン酸塩
Figure WO-DOC-CHEMICAL-14
[6-アミノメチル-3-エチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル(87:13のジアステレオマー混合物) 7.8 g（純度86.7％, 22.03mmol）に酢酸エチル 70 ml（10.4 v/w）を加え室温にて攪拌した。p-トルエンスルホン酸一水和物4.2 g（22.03 mmol, 0.87 eq.）を加え室温にて3時間攪拌し、結晶をろ取した。その後、40度条件下減圧乾燥を行い、白色結晶として[(1R＊,5S＊,6S＊)-6-アミノメチル-3-エチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル　p－トルエンスルホン酸塩7.8 g（収率 :80.6 %, ジアステレオ比99.7:0.3）を得た。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6): δ ppm: 1.04 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.31-1.40 (1H, m), 1.40 (9H, s), 1.98-2.15 (4H, m), 2.25 (3H, s), 2.25-2.50 (3H, m), 2.76 (1H, quint, J=7.4 Hz), 3.05-3.18 (3H, m), 3.35 (1H, br s), 5.20 -5.22 (1H, m), 7.10 -7.12 (2H, m), 7.4 5 -7.48 (2H, m), 7.74 (1H, br s).
Anal. calcd for C23H35NO5S: C, 63.13; H, 8.06; N, 3.20; S, 7.33; Found C, 63.10; H, 8.14; N, 3.29; S, 7.30.
GC分析条件（ジアステレオマー比測定）
カラム：CP-Sil 8 CB for Amine (GL Science, 30 m×0.25 mm, 0.25μm)
検出器：FID
温度：column oven (130 ℃), injection (250 ℃), detector (250 ℃)
温度条件：(i)130 ℃ (5.5 min), (ii)130-270 ℃ (10 ℃/min), (iii)270 ℃ (4.5 min)
流速：1.5 ml/min （平均線速度：38ｃm/sec）
スプリット比：1/10
キャリアーガス：ヘリウム
分析時間：25 min
ピークカット：0.0-2.0 min
保持時間：13.8 min, 14.0 min
（光学分割工程）
（製造例１２）
[(1R,5S,6S)-6-アミノメチル-3-エチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル　光学活性カルボン酸塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
  [(1R＊,5S＊,6S＊)-6-アミノメチル-3-エチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル　p-トルエンスルホン酸塩を酢酸エチル(20 v/w)に懸濁し、炭酸水素ナトリウム水溶液(4 v/w)を加えて分液し、 [(1R＊,5S＊,6S＊)-6-アミノメチル-3-エチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチルのフリー体を得た。その[(1R＊,5S＊,6S＊)-6-アミノメチル-3-エチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル(200 mg, 0.754 mmol）にジイソプロピルエーテル（IPE）もしくはアセトニトリル（MeCN） 1.0 mL（5.0 v/w）を加え、光学活性カルボン酸(0.5当量)を添加して室温にて攪拌した。析出した結晶をろ過し、使用した溶媒0.5 mL（2.5v/w）で洗浄した。得られた結晶を減圧下で乾燥させ、下記表１の収率、光学純度にて相当する塩の形態を得た。
なお、光学純度は得られた塩を炭酸水素ナトリウム水溶液でフリー化した後、3,5-Dinitrobenzoyl体へ誘導後分析実施した。
HPLC分析条件（光学純度測定、3,5-Dinitrobenzoyl体へ誘導後分析実施）
カラム：CHIRALPAK AS-RH×2 (Daisel, 4.6 mm×150 mm, 5μm)
検出：220 nm、カラム温度：40 ℃、流速：0.8 ml/min
移動相：MeCN / 5 mM リン酸緩衝液（pH 7.0） = 55 / 45
保持時間： 29.6 min, 31.8 min, 36.1min
（表１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
[規則91に基づく訂正 12.05.2010]　
（ジアステレオマー混合物から光学分割を行う工程)
（実施例１）
[(1R,5S,6S)-6-アミノメチル-3-エチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル　D-マンデル酸塩
Figure WO-DOC-CHEMICAL-16
[6-アミノメチル-3-エチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル(85:15ジアステレオマー混合物) 627.0 g（Net :543.6 g, 2.05 mol）にアセトニトリル 4.7 L（8.6 v/w）を加え40度にて攪拌した。反応液にD-マンデル酸116.3 g（0.76 mmol, 0.37eq.）を加え40度にて1時間攪拌した後、3度まで徐冷した。3度にて1時間攪拌した後、結晶をろ取した。その後、40度条件下減圧乾燥を行い、白色粉末として [(1R,5S,6S)-6-アミノメチル-3-エチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル　D-マンデル酸塩251.2 g（収率:29.4% , 97.6%ee, 99.6%de）を得た。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6) δ ppm: 1.04 (3H, t, J=7.6 Hz), 1.28-1.35 (1H, m), 1.39 (9H, s), 1.96-2.11 (4H, m), 2.28 (1H, d , J=15.6 Hz),  2.33 (1H, d, J=15.6 Hz), 2.36-2.40 (1H, m), 2.72 (1H, quint, J=7.6 Hz), 3.00 (1H, d, J=13.2 Hz), 3.03 (1H, d, J=13.2 Hz), 3.31(1H, br s), 4.54 (1H, s), 5.21 -5.23 (1H, m), 7.13 -7.25 (3H, m), 7.35 -7.37 (2H, m).
 [α]20 D -104.4°(C=0.108, MeOH).
Anal. calcd for C24H35NO5: C, 69.04; H, 8.45; N, 3.35; Found C, 69.15; H, 8.46; N, 3.46.
[規則91に基づく訂正 12.05.2010]　
（実施例２）
 [(1R,5S,6S)-6-(アミノメチル)ビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル　(S)-Oアセチル-マンデル酸塩
Figure WO-DOC-CHEMICAL-17
 [6-(アミノメチル)ビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル(90:10ジアステレオマー混合物) 1.9 g (8.0 mmol) にアセトニトリル 10 mL（5.0 v/w）を加え、(S)-Oアセチル-マンデル酸(0.45当量)を添加して室温にて攪拌した。2.5時間後、析出した結晶をろ過し、アセトニトリルで洗浄した。得られた結晶を減圧下で乾燥させ、白色結晶として [(1R,5S,6S)-6-アミノメチル-3-エチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル　(S)-O‐アセチル-マンデル酸塩0.904 g（収率:26.2% , 90.4%ee, 99 %de）を得た。この白色結晶620 mg をアセトニトリル 6.2 mL（10.0 v/w）に懸濁させ、室温下10分撹拌した。結晶をろ過し、得られた結晶を減圧下で乾燥させ、白色粉末として(S)-O‐アセチル-マンデル酸塩557.6mg(光学純度95.7%ee)を得た。
1H-NMR(400MHz, CD3OD) δ ppm: 1.44-1.51 (1H, m), 1.45 (9H, s), 2.08-2.22 (2H, m), 2.13 (3H, s), 2.42 (2H, s), 2.50-2.57 (1H, m), 2.86 (1H, quint, J=7.6 Hz), 3.06 -3.16 (1H, m), 3.25-3.33 (2H, m), 5.65-5.70 (1H, m), 5.74 (1H, s), 5.95-5.99 (1H, m), 7.25 -7.34 (3H, m), 7.47 -7.51 (2H, m).
[α]20 D -18.9°(C 0.095, MeOH).
IR (KBr): cm-1: 3046, 2977, 1726, 1584, 1235, 1144, 1028, 752.      
MS (FAB+): m/z: 238 (free+H)+, MS (FAB+NaI): m/z: 260 (free+Na)+, 217 (O-acetyl-mandelic acid+Na)+.
Anal. calcd for C24H33NO6: C,66.80; H,7.71; N,3.25; Found C,66.60; H,7.72; N,3.36.
[規則91に基づく訂正 12.05.2010]　
（実施例３）
[(1R,5S,6S)-6-アミノメチル-3-メチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル　D-マンデル酸塩
 [6-アミノメチル-3-メチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル(90:10ジアステレオマー混合物) 237 mg(1 mmol) に溶媒2.5mL（10 v/w）を加え、D-マンデル酸 (0.5当量)を添加して氷冷下にて2時間攪拌した。析出した結晶をろ過した。得られた結晶を減圧下で乾燥させ、下記表２の収率、光学純度にてD-マンデル酸塩を得た。なお、光学純度は得られた塩を炭酸水素ナトリウム水溶液でフリー化した後、3,5-Dinitrobenzoyl体へ誘導後分析実施した。
Figure WO-DOC-CHEMICAL-18
（表２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
ａ）3,5-dintrobenzoly chloride , HPLC
 
HPLC分析条件（光学純度測定、3,5-Dinitrobenzoyl体へ誘導後分析実施）
カラム：CHIRALPAK AS-RH×2 (Daisel, 4.6 mm×150 mm, 5μm)
検出：220 nm、カラム温度：40 ℃、流速：0.8 ml/min
移動相：MeCN / 5 mM リン酸緩衝液（pH 7.0） = 55 / 45
保持時間： 28.0 min, 23.6 min, 26.0min
1H-NMR(400MHz, CD3OD): δ ppm: 1.45-1.51 (1H, m), 1.45 (9H, s), 1.82 (3H, s), 2.02-2.14 (2H, m), 2.41 (2H, s), 2.42-2.55 (1H, m), 2.85 (1H, quint, J=7.2 Hz), 3.06 -3.13 (1H, m), 3.23 (1H, d, J=13.2 Hz), 3.26 (1H, d, J=13.2 Hz), 4.84 (1H, s), 5.25 -5.28 (1H, m), 7.19 -7.30 (3H, m), 7.44 -7.47 (2H, m).
[α]20 D -97.4°(C 0.102, MeOH).
IR (KBr): cm-1: 3424, 2974,  2929, 1722, 1571, 1366, 1152, 1060, 755, 701. 
MS (FAB+): m/z: 252 (free+H)+, MS (FAB+NaI): m/z: 274 (free+Na)+, 175 (mandelic acid+Na)+.
（エステル基の脱保護と塩形成工程）
（実施例４）
 [(1R,5S,6S)-6-アミノメチル-3-エチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸 　p-トルエンスルホン酸塩
[(1R,5S,6S)-6-アミノメチル-3-エチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル　D-マンデル酸塩4.17 g (10 mmol)をトルエン21mlに懸濁させ、トリエチルアミン2.09mlを添加してさらに水21mlを加え、室温下で撹拌した。20分後有機層を分離抽出し、水10mlで再度有機層を洗浄した後、減圧濃縮してフリー体の[(1R,5S,6S)-6-アミノメチル-3-エチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチルを油状物として得た。このものにトルエン16mlを加え、p-トルエンスルホン酸一水和物2.28 gを加え、70度で撹拌した。途中トルエン15 mlを追加し3時間後に放冷した。析出した固体をろ過し、トルエンで洗浄した後、減圧乾燥して[(1R,5S,6S)-6-アミノメチル-3-エチルビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸p-トルエンスルホン酸塩を白色粉末3.90 gとして得た。
1H-NMR(400MHz, CD3OD) δ ppm: 1.10 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.49 (1H, dd, J=7.4, 12.4 Hz), 2.06-2.20 (4H, m), 2.37 (3H, s), 2.49 -2.55 (1H, m), 2.51 (2H, s), 2.87 (1H, quint, J=7.4 Hz), 3.12 (1H, br S), 3.29 (1H, d, J=13.3 Hz), 3.33 (1H, d, J=13.3 Hz), 5.31 -5.32 (1H, m), 7.22 -7.25 (2H, m), 7.69 -7.72 (2H, m).
[α]20 D -56.1°(C 0.108, MeOH)．
IR (KBr): cm-1: 3149, 2962, 1708, 1498, 1237, 1164, 1038, 1011, 813, 680, 566.
MS (FAB+): m/z: 210 (free+H)+, 412 (2Mfree+H)+.
（実施例５）
[(1R,5S,6S)-6-(アミノメチル)ビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸 　ベンゼンスルホン酸塩
[(1R,5S,6S)-6-(アミノメチル)ビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチル　(S)-Oアセチル-マンデル酸塩116 mg (0.269 mmol)をアニソール0.58 mlに懸濁させ、水0.6 mlを加え、さらにトリエチルアミン0.045 mlを添加して室温下で撹拌した。15分後有機層を分離抽出し、水300 mlで再度有機層を洗浄した後、減圧濃縮してフリー体の[(1R,5S,6S)-6-(アミノメチル)ビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸tert-ブチルのアニソール溶液を得た。このものにベンゼンスルホン酸46 mgを加え、70度で1.25時間撹拌し、放冷した。析出した固体をろ過し、ろ過した粉末に再度アセトンでかけ洗いし、減圧下乾燥して[(1R,5S,6S)-6-(アミノメチル)ビシクロ[3.2.0]へプタ-3-エン-6-イル]酢酸 　ベンゼンスルホン酸塩を白色粉末55.5 mgとして得た。
1H-NMR(400MHz, CD3OD) δ ppm: 1.51 (1H, dd, J=7.6, 12.4 Hz), 2.12-2.20 (2H, m), 2.51 (2H, s), 2.51-2.57 (1H, m), 2.88 (1H, quint, J=7.4 Hz), 3.17-3.18 (1H, m), 3.32 (1H, d, J=13.3 Hz), 3.36 (1H, d, J=13.3 Hz), 5.69-5.71 (1H, m), 5.97-5.99 (1H, m), 7.39 -7.44 (3H, m), 7.81-7.84 (2H, m).
[α]20 D -99.7°(C 0.09, MeOH)．
IR (KBr): cm-1: 3125, 3054, 2988, 1705, 1515, 1412, 1237, 1163, 1121, 1016, 730, 689, 621, 563.
MS (FAB+): m/z: 182(free+H)+,  m/z: 363(2Mfree+H)+.
Anal. calcd for C16H21NO5S: C,56.62; H,6.24; N,4.13; Found C,56.19; H,6.21; N,4.13.
配列番号１はヒトCacna2d1前半のPCRセンスプライマーである。
配列番号２はヒトCacna2d1前半のPCRアンチセンスプライマーである。
配列番号３はヒトCacna2d1後半のPCRセンスプライマーである。
配列番号４はヒトCacna2d1後半のPCRアンチセンスプライマーである。
配列番号５はベクターpBluescript 2のマルチクローニングサイトである。

Claims (6)

  1. [規則91に基づく訂正 12.05.2010]　
    一般式（Ｉ）を有する化合物またはその塩を光学分割により製造する方法であり、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    ［式中、各置換基は以下のように定義される。
    Ｒ１　：　水素原子またはＣ１－Ｃ６アルキル基
    Ｒ２　：　水素原子またはカルボキシ基の保護基］
    一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）及び（Ｖ）を有する化合物の混合物と光学活性有機酸を溶媒に溶解した後、
    Figure WO-DOC-CHEMICAL-2
    結晶を析出させることにより、一般式（Ｉ）を有する化合物またはその塩を製造する方法。
  2. Ｒ１が、水素原子、メチル基またはエチル基である、請求項１に記載の一般式（Ｉ）を有する化合物またはその塩を製造する方法。
  3. Ｒ２が、ｔ－ブチル基である、請求項１または２に記載の一般式（Ｉ）を有する化合物またはその塩を製造する方法。
  4. 光学活性有機酸が、以下の群から選択されるいずれかの光学活性有機酸である、請求項１－３から選択されるいずれか１項に記載の一般式（Ｉ）を有する化合物またはその塩を製造する方法。
    Ｄ－マンデル酸、Ｌ－マンデル酸、Ｄｉ－ｐ－トルオイル－Ｌ－酒石酸、Ｎ－Ｂｏｃ－Ｌ－プロリン、（Ｒ）－α－メトキシフェニル酢酸、Ｏ－アセチル－Ｌ－マンデル酸、Ｄｉ－ベンゾイル－Ｌ－酒石酸、Ｏ－アセチル－Ｄ－マンデル酸、Ｎ－Ｂｏｃ－Ｌ－アラニン、（Ｓ）－２－（６－メトキシ－２－ナフチル）プロピオン酸、ジアセチル－Ｌ－酒石酸、Ｌ－酒石酸、Ｌ－リンゴ酸、Ｌ－ピログルタミン酸、（＋）－カンファール酸、（Ｓ）－２－メチルグルタミン酸、（＋）－３－ブロモカンファー－８－スルホン酸、（－）－メントキシ酢酸、（Ｓ）－２－フェノキシプロピオン酸
  5. 溶媒が、以下の群から選択されるいずれかの溶媒である、請求項１－４から選択されるいずれか１項に記載の一般式（Ｉ）を有する化合物またはその塩を製造する方法。
    　アセトニトリル、酢酸エチル、トルエン、シクロペンチルメチルエーテル
  6. 一般式（Ｘ）を有する化合物またはその塩を製造する方法であり、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    ［式中、各置換基は以下のように定義される。
    Ｒ１　：　水素原子またはＣ１－Ｃ６アルキル基］
    請求項１に記載の製造方法により一般式（Ｉ）を有する化合物を製造した後、
    当該一般式（Ｉ）を有する化合物のカルボキシ基の保護基Ｒ２を脱保護する工程を経て、または、さらに酸と塩を形成する工程を経ることによって、一般式（Ｘ）を有する化合物またはその塩を製造する方法。
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