+

WO2009121992A2 - Uso del ácido maslínico para el tratamiento de patologías y sus síntomas mediante la inhibición de cox-2 - Google Patents

Uso del ácido maslínico para el tratamiento de patologías y sus síntomas mediante la inhibición de cox-2 Download PDF

Info

Publication number
WO2009121992A2
WO2009121992A2 PCT/ES2009/000195 ES2009000195W WO2009121992A2 WO 2009121992 A2 WO2009121992 A2 WO 2009121992A2 ES 2009000195 W ES2009000195 W ES 2009000195W WO 2009121992 A2 WO2009121992 A2 WO 2009121992A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
maslinic acid
cox
acid
derivatives
treatment
Prior art date
Application number
PCT/ES2009/000195
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2009121992A3 (es
Inventor
José PRADOS OSUNA
Andrés GARCÍA-GRANADOS LÓPEZ DE HIERRO
Andrés PARRA SÁNCHEZ
Antonio MARTÍNEZ RODRÍGUEZ
Original Assignee
Biomaslinic S.L.
Universidad De Granada
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomaslinic S.L., Universidad De Granada filed Critical Biomaslinic S.L.
Priority to JP2011502401A priority Critical patent/JP2011516457A/ja
Priority to EP09728965A priority patent/EP2258374A4/en
Priority to US12/920,435 priority patent/US20110105611A1/en
Priority to CN2009801072131A priority patent/CN102014922A/zh
Priority to MX2010009467A priority patent/MX2010009467A/es
Publication of WO2009121992A2 publication Critical patent/WO2009121992A2/es
Publication of WO2009121992A3 publication Critical patent/WO2009121992A3/es
Priority to MA33135A priority patent/MA32130B1/fr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/191—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having two or more hydroxy groups, e.g. gluconic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/70—Web, sheet or filament bases ; Films; Fibres of the matrix type containing drug
    • A61K9/7023—Transdermal patches and similar drug-containing composite devices, e.g. cataplasms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to the use of maslinic acid and any of its derivatives for the treatment of pathological processes related to the inhibition of endogenous cyclooxygenase-2 (COX-2). More specifically for the symptomatic and / or regenerative treatment of osteoarthritis, rheumatoid arthritis, fibromyalgia, sciatica and other joint problems that are difficult to diagnose. It also refers to the topical administration of a composition, comprising maslinic acid, any of its derivatives, or natural, synthetic or semi-synthetic mixtures rich in maslinic or its derivatives.
  • COX-2 endogenous cyclooxygenase-2
  • Oleanolic acid (3-betahydroxy-28-carboxy-lean-12-ene) is a triterpenic acid ubiquitously distributed in the plant kingdom.
  • the phytochemical database of the United States Department of Agriculture collects its presence in almost a hundred plants, among which is the Olea europaea, as well as a series of proven biological activities (antiabortive, anticariogenic, antifertility, antihepatotoxic , anti-inflammatory, antisarcomic, cancer preventive, cardiotonic, diuretic, hepatoprotective and uterotonic).
  • the isolation of oleanolic and maslinic acids from the waxes of the surface of the fruit of the Olea europaea has been described [Bianchi.G., Pozzi.N. And Vlahov, G. Phytochemistry (1994) 37, 205-207] by means of the methanolic extraction of olives previously washed with chloroform. The separation of this type of acids has been described by high speed countercurrent chromatography (HSCCC) [Du, QZ, Xiong, XP. and Ito, Y.; Journal of Liquid Chromatography (1995) 18, 1997-2004].
  • HCCC high speed countercurrent chromatography
  • maslinic acid acts as an active component: antitumor agent US2003153538 or WO0252956; apoptosis inducer WO03057224; abnormal food WO203039270 and WO03011267; external agent for skin and bleach US2003133958; vascular lesions WO02078685.
  • this triterpene can also have an anti-inflammatory activity (Marquez-Martin A, De La Puerta R, Fernandez-Arche A, Ruiz-Gutierrez V, Yaqoob P. Cytokine. (2006) Dec; 36 (5-6 ): 211-7).
  • This document also describes that maslinic acid inhibits the release of IL-6 and TNF ⁇ and the production of NO and hydrogen peroxide (ROS) in murine peritoneal macrophages stimulated with LPS, an effect that the same authors do not find in cells human peripheral blood mononuclear. In any case, what these discrepancies show is that the answers are not homogeneous and therefore not predictable, which makes the study necessary in each model and / or type of tissue.
  • prostaglandins are synthesized from arachidonic acid (and other C20 unsaturated fatty acids called eicosanoids) following the metabolic pathway of cyclooxygenase (COX), a widely distributed enzyme that is capable of producing a cycle and introducing oxygen in the precursors to create the prostaglandins that derive all of them prostanoic acid.
  • COX cyclooxygenase
  • COX-1 is constitutively expressed in many tissues, where it regulates important physiological functions.
  • COX-1 catalyzes the production of prostaglandins by the endothelium and by the gastric mucosa, which leads to antithrombogenic and cytoprotective effects, respectively.
  • COX-2 which is the inducible form, is undetectable in most of the fabrics
  • COX-2 is a specific isoform derived from a different gene from the one encoding COX-1. The expression of COX-2 increases during development and inflammation, but its constitutive expression remains low in most organs, except in the brain.
  • Prostaglandins in particular PGE 2 , exert multiple physiological and pathophysiological functions.
  • the low concentrations of PGE 2 maintain the integrity of the normal gastric mucosa and the homeostasis of the fluids and electrolytes while the levels of this mediator are involved in the inflammatory processes.
  • arachidonic acid Other metabolites of arachidonic acid are isoprostrans. These metabolites are structurally similar to prostaglandins and are generated by the oxidation of fatty acids of the plasma membrane.
  • isoprostanes represent one of the best cellular and systemic markers of oxidative stress. Since the antioxidant activity of maslinic acid has been demonstrated, it is possible that this compound can inhibit the formation of isoprostrans (Marquez-Martin A, De La Puerta R, Fernandez-Arche A, Ruiz-Gutierrez V, Yaqoob P. Cytokine. (2006 ) Dec; 36 (5-6): 211-7); Montilla MP, Agile A, Navarro MC, Jiménez Ml, Garcia- Granados A, Parra A, Cabo MM. Planta Med. (2003) May; 69 (5): 472-4).
  • Antimalarial drugs such as hydroxychloroquine (Plaquenil®) and sulfasalazine (Azulfidine®) are also generally beneficial in conjunction with methotrexate. But the benefits of these medications can take weeks to months to manifest and since they are associated with toxic side effects, it is imperative to perform frequent monitoring with blood tests while they are being used.
  • Tumor necrosis factor (TNF) inhibitors are a relatively new type of medication that are used to treat autoimmune disease and are among others: etanercept (Enbre®l), infliximab (Remicade®) and adalimumab (Humira®). Adalimumab® and Etanercept® are injectable medications, while Infliximab is given intravenously.
  • Another relatively new medicine is injectable Anakinra (Kineret ®), an artificial protein that blocks the inflammatory interleukin-1 protein. This medicine is used to reduce the moderate to severe progression of active rheumatoid arthritis in patients over 18 years of age who have not responded to one or more of the DMARDs (in English Antirheumatic Drugs
  • Kineret® can be used with another DMARD or with tumor necrosis factor inhibitors.
  • the present invention describes the use of maslinic acid or any of its derivatives for the treatment of any pathology that occurs with activation of the enzyme cyclooxygenase-2 (COX-2).
  • the present invention demonstrates the activity of maslinic acid as an inhibitor of the activity of COX-2 induced in human chondrocytes and therefore the usefulness of this acid in the treatment of diseases that occur with the activation of said enzyme COX-2
  • maslinic acid is not only capable of reducing inflammation, associated with this type of diseases, but also involved in the reduction or elimination of symptoms and in chondrocyte tissue regeneration demonstrating lasting effects.
  • the invention is about the symptomatic and / or regenerative treatment of diseases such as osteoarthritis, rheumatoid arthritis, fibromyalgia, sciatica, jumper syndrome, protuberance of the metatarsophalangeal joint (bunion) and processes that respond to NSAIDs (Anti Non-Steroidal Inflammatory) specific for COX-2, with a composition comprising maslinic acid or any of its derivatives.
  • This treatment is carried out with a simple administration and is effective since, among other things, it acts directly on the affected chondrocytes or tissues.
  • the efficacy in the symptomatic and / or regenerative treatment of osteoarthritis and rheumatoid arthritis is demonstrated in the present invention with the rapid and prolonged elimination of its symptoms.
  • Maslinic acid can be obtained either synthetically or naturally.
  • Compositions comprising this maslinic acid include in its definition, the use of plant extracts containing maslinic acid, extracts of the industrial processing by-products of the plant or its fruits or an industrial by-product of the plant that contains a higher concentration of maslinic acid than originally present in the plant.
  • extracts of plants of the genus Olea more particularly the European O.
  • its derivatives can also be used, understood as derivatives in the present invention, its salts, or derivatives accepted in pharmacopoeias that facilitate absorption and transport in the tissues to be treated. More particularly its sodium, potassium or biologically acceptable amines salts.
  • maslinic acid is a potent immunomodulator of the immune response since it inhibits the activation and proliferation of T lymphocytes stimulated via TCR and inhibits the production of TNF ⁇ and IL-6 pro-inflammatory cytokines, in addition to the Production of Prostaglandin E2 (PGE2) in primary monocytes.
  • PGE2 Prostaglandin E2
  • Maslinic acid inhibits the production of PGE2 in human monocytes. 2. Maslinic acid inhibits the enzymatic activity of COX-2.
  • Maslinic acid does not inhibit the transcriptional activation of the promoter of the COX-2 gene or the expression of the protein.
  • Maslinic acid at high doses inhibits the production of PGE2 in chondrocytes and in cells derived from a neuroblastoma. 5. Maslinic acid inhibits the production of isoprostrans in human monocytes.
  • Maslinic acid inhibits the production of IL-6 in human monocytes and chondrocytes.
  • the inhibition of IL-6 production by the MA is not due to a transcriptional inhibition of the IL-6 gene.
  • articular cartilage a tissue that does not contain capillaries or nerve endings.
  • this articular cartilage which contains chondrocytes, which represent 1-2% of the total volume, and whose function is to synthesize proteins from the extracellular matrix.
  • This matrix contains 70-80% water which allows it to have a structure that serves to dampen the pressures.
  • proteoglycans lubricated by hyaluronic polymers is the substance that maintains cartilage integrity. Glycosaminoglycans and proteoglycans maintain an intimate relationship with the collagen fibers produced by chondrocytes, which also produce proteoglycans.
  • a first aspect of the present invention refers to the use of maslinic acid, in its broadest definition as described above, or any of its derivatives for the preparation of a medicament for the treatment of pathologies related to activation. of the COX-2.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of maslinic acid or any of its derivatives to prepare a medicament that also favors chondrocyte tissue regeneration.
  • the pathologies related to the activation of COX-2 and / or in which chondrocyte tissue regeneration occurs are selected from the list comprising: osteoarthritis, rheumatoid arthritis, sciatica, fibromyalgia, hallux valgus or protuberance of the metatarsophalangeal joint (bunion), patellar tendonitis (jumper's knee) or other pathologies that respond to specific NSAIDs for COX-2.
  • An even more preferred embodiment comprises its use for the treatment of osteoarthritis or rheumatoid arthritis.
  • Another aspect of the present invention refers to a pharmaceutical composition
  • maslinic acid in its broadest definition (salts, metabolites, plant extracts containing it, extract of the industrial processing by-products of the plant or its fruits, or a industrial by-product or a combination of any of these components) or any of its derivatives for the treatment of diseases that occur with the activation of COX-2. More specifically useful for the treatment of diseases related to the activation of the COX-2 enzyme in human or animal chondrocytes by the inhibition of this COX-2.
  • said composition further comprises oleanolic acid and / or a pharmaceutically acceptable carrier. More preferably, the ratio of maslinic acid: oleanolic acid is between 2: 1 and 6: 1.
  • maslinic acid, its salts, pharmaceutically acceptable derivatives or its prodrugs will be formulated in an appropriate pharmaceutical composition, in the therapeutically effective amount, together with one or more pharmaceutically acceptable carriers, adjuvants or excipients. More particularly, maslinic acid or the mixture of maslinic acid and oleanolic acid is in a proportion of between 0.5 and 10% of the total composition, more specifically between 0.5 and 5% and even more specifically between 1 and Number 3%.
  • This composition can be administered in different ways, including, but not limited to, intraperitoneally, orally, orally, rectally, intramuscularly, topically, subcutaneously, intraarticularly or by inhalation.
  • composition is administered topically, subcutaneously or by joint infiltration.
  • said composition is presented in a form adapted to topical administration.
  • compositions described above can be presented in the form of tablets, dragees, capsules, solutions, emulsions, creams, body milk, ointments, inhalants, aerosols, suppositories or any other form of clinically permitted administration and in a therapeutically effective amount. More preferably in the form of solution, emulsion, cream, body milk or ointment.
  • this composition contains maslinic acid or any of its derivatives, obtained from a plant extract of the Olea genus or an industrial plant byproduct of the Olea genus.
  • a pharmaceutically acceptable derivative is meant any pharmaceutically acceptable salt or any other compound that, after administration, is capable of providing (directly or indirectly) the maslinic acid.
  • pharmaceutically acceptable vehicle refers to those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical sector, used in the preparation of pharmaceutical administration forms and includes solids or liquids, solvents, surfactants , etc.
  • FIG. 1.- Shows the effect of maslinic acid on the production of PGE-2 in human monoliths
  • FIG. 2.- Shows the effect of maslinic acid on the expression of COX-2 in human monoliths.
  • FIG. 3.- Shows the effect of maslinic acid on the activity of COX-2 in human monoliths.
  • FIG. 4.- Shows the effect of maslinic acid on the production of PGE-2 in SK-N-SH cells
  • FIG. 5. Shows the effect of maslinic acid on the production of PGE-2 in primary astrocytes.
  • FIG. 6.- Shows the effect of maslinic acid on the transcriptional activity of COX-2.
  • FIG. 7.- Shows the effect of maslinic acid on the expression of COX-2 in human monocytes.
  • FIG. 8.- Shows the effect of maslinic acid on the production of PGE-2 in chondrocytes.
  • FIG. 9. Shows the effect of maslinic acid on the production of IL-6 in condorcytes.
  • FIG. 10. Shows the effect of maslinic acid on the production of PGE-2 in monoliths.
  • FIG. 11. Shows the effect of maslinic acid on the activity of the promoter of IL-6 induced by P + 1.
  • FIG. 12.- Shows the effect of maslinic acid on the activity of the IL-6 promoter induced by IL-1.
  • FIG. 13.- Shows the effect of maslinic acid on the production of
  • Maslinic acid was used in its sodium salt form, which was dissolved in DMSO (dimethylsulfoxide) in a stock solution (10 and 50 mM). The final maximum concentration of DMSO in the cultures was 1% (vol / vol), which does not interfere with the measured parameters.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • EIA enzyme immunoassay experiments
  • Chondrocytes were purchased from Promocell (Heidelberg, Germany) and cultured in conditioned media for this type of cells. The cells were cultured in 24-well plates for the determination of PGE2 and IL-6.
  • the SK-N-SH (American Tissue Culture collection, HTB 11) is a cell line derived from a human neuroblastoma and was maintained exponentially in DMEM supplemented with 2 mmol / l L-glutamine, antibiotics and 10% FCS. Cells were grown at 37 0 C and in an atmosphere of 5% CO 2.
  • the cells primary monocytes or SK-N-SH
  • the cells were stimulated as indicated in each case and used in 50 ⁇ l of lysate solution (20 mM Hepes pH 8.0, 10 mM KCI, 0.15 mM EGTA, 0.15 mM EDTA, 0.5 mM Na 3 VO 4 , 5 mM NaF, 1 mM
  • the separated proteins were transferred to a Nitrocellulose membrane (0.5 A, 100V at 4 0 C) for 1 h.
  • the membranes were blocked in TBS containing 0.1% Tween 20 and 5% skimmed milk powder.
  • the immunodetection of the different proteins was carried out by incubation with the different primary antibodies for two hours, followed by incubation with the corresponding secondary antibodies labeled with peroxidase for an hour and a half and revealed by using the ECL chemiluminescence system (GE Healthcare Life Sciences).
  • SK-N-SH cells were transfected with the COX-2-Luc and IL-6- Luc plasmids using the Jet Pei reagent (Polyplus transfection, France) according to the manufacturer's instructions. Both plasmids contain the promoters of the indicated genes by directing the luciferase gene as a marker of transcriptional activation. The cells were maintained in culture under normal conditions up to 24 or 48 hours after transfection depending on the experiment and were stimulated in the manner indicated in each case.
  • the cells were used in lysate buffer (25 mM Tris-phosphate pH 7.8, 8 mM MgCI 2 , 1 mM DTT, 1% Triton X-100, and 7% glycerol) for 15 minutes at room temperature.
  • Luciferase activity in the protein extract was determined by using the Autolumat LB9510 (Berthold) luminometer following the instructions of the Luciferase assay system of Promega (Madison, Wl, USA).
  • Monocyte cultures were stimulated as for the production of PGE2 (stimulation with LPS for 24 h) and the amount of 8- / so-prostaglandin F 2 ⁇ (isoprostrans) or IL-6 released by the cells was determined respectively by the systems from EIA of Cayman (USA) (catalog number 516351) or Pelikine (catalog number RDI-M1916clb) following the manufacturers instructions.
  • Maslinic acid (MA) inhibits the enzymatic activity of the COX-2 enzyme and the production of PGE? in monocytes stimulated with LPS.
  • monocytes In inflammatory processes, monocytes produce numerous pro-inflammatory cytokines such as TNF ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6 and mediators of inflammation such as leukotrienes and prostaglandins, among others. It has already been shown previously that maslinic acid (MA) inhibited the production of PGE 2 in human monocytes obtained from peripheral blood and stimulated with LPS (FIG 1).
  • cytokines such as TNF ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6
  • mediators of inflammation such as leukotrienes and prostaglandins
  • SK-N-SH cells which are IL-6 producers, were transfected with a plasmid containing the luciferase gene directed by the complete promoter of IL-6 and stimulated with IL-1 or a combination of PMA plus ionomycin in the presence or absence of increasing doses of MA and the luciferase activity measured in cell extracts after 4 hours of treatment.
  • FIGs 10 and 11 FIG. 10 and 11
  • the MA does not inhibit the transcriptional activity of the IL-1 promoter, so that inhibitory activity on the release of IL-6 is surely due to an inhibition of post-transcriptional level.
  • maslinic acid MA
  • Isoprostranes such as endoperoxide 8- / so-prostaglandin F 2 ⁇ (8- / so-PGF 2 ⁇ ) are metabolites of arachidonic acid oxidation and are currently considered one of the best markers of oxidative stress.
  • Figure 12 shows that MA inhibits concentration dependently on the release of 8- / so-PGF 2 ⁇ produced in human monocytes peripheral blood after stimulation with LPS. This data confirms the anti-oxidant activity of MA previously demonstrated by other authors.
  • the inhibitory potency of MA on the production of isoprostanes is higher than that of tocopherol and trolox and is comparable to that of resveratrol (FIG. 13)
  • Clinical tests were performed by the topical administration of sodium salt of maslinic acid and mixtures, in varying proportions, of sodium salts of maslinic acid and oleanolic acid and of maslinic acid and oleanolic acid in varying proportions (between 70% and 85% of maslinic and between 30% and 15% of oleanolic).
  • the administration by topical route has been duly distributed in a type body milk and in the case of free acids the well-known Beeler base is used for its administration.
  • the body milk contained approximately between 0.5% to 1.5% of active ingredient (salts) and the cream contained approximately between 1.5% to 2.5% of the active substance (free acids) as well as waste extracts from the milling of olive enriched in oleanolic acid and maslinic acid.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere al uso del ácido maslínico o mezclas naturales, sintéticas o semisintéticas ricas en maslínico, o de una composición que contenga dicho ácido, para el tratamiento de procesos patológicos que cursen con la activación de la COX-2. Entre otros, para el tratamiento sintomático y/o regenerativo de artrosis, artritis reumatoide, fibromialgias, ciática y otras molestias articulares de difícil diagnóstico. También se refiere a su administración por vía tópica.

Description

USO DEL ÁCIDO MASLÍNICO PARA EL TRATAMIENTO DE PATOLOGÍAS Y
SUS SÍNTOMAS MEDIANTE LA INHIBICIÓN DE
COX-2
La presente invención se refiere al uso del ácido maslínico y cualquiera de sus derivados para el tratamiento de procesos patológicos relacionados con Ia inhibición de Ia ciclooxigenasa-2 endógena (COX-2). Más concretamente para el tratamiento sintomático y/o regenerativo de artrosis, artritis reumatoide, fibromialgias, ciática y otras molestias articulares de difícil diagnóstico. También se refiere a Ia administración por vía tópica de una composición, que comprende ácido maslínico, cualquiera de sus derivados, o mezclas naturales, sintéticas o semisintéticas ricas en maslínico o sus derivados.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El ácido oleanólico (3-betahidroxi-28-carboxiolean-12-eno) es un ácido triterpénico ubicuamente repartido en el reino vegetal. Así, Ia base de datos fitoquímica del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos recoge su presencia en casi un centenar de plantas, entre las que se encuentra Ia Olea europaea, así como una serie de actividades biológicas comprobadas (antiabortivo, anticariogénico, antifertilidad, antihepatotóxico, antiinflamatorio, antisarcómico, preventivo del cáncer, cardiotónico, diurético, hepatoprotector y uterotónico).
El ácido maslínico (2-alfa,3-betadihidroxi-28-carboxiolean-12-eno), también denominado ácido crataególico, es un ácido mucho menos repartido en Ia naturaleza, habiendo sido detectado en una decena de plantas. Se conoce su actividad como antihistamínico y antiinflamatorio, aunque su escasez hace que no se haya estudiado extensamente. El aislamiento de los ácidos oleanólico y maslínico de las ceras de Ia superficie del fruto de Ia Olea europaea, ha sido descrito [Bianchi.G., Pozzi.N. And Vlahov, G. Phytochemistry (1994) 37, 205- 207] mediante Ia extracción metanólica de olivas previamente lavadas con cloroformo. La separación de este tipo de ácidos ha sido descrita mediante cromatografía en contracorriente de alta velocidad (HSCCC) [Du, Q.Z., Xiong, XP. and Ito, Y. ; Journal of Liquid Chromatography (1995) 18, 1997-2004].
Figure imgf000003_0001
Acido maslínico
Existe en Ia actualidad, un gran número de patentes en las que el ácido maslínico actúa como componente activo: agente antitumoral US2003153538 o WO0252956; inductor de apoptosis WO03057224; alimento anorético WO203039270 y WO03011267; agente externo para Ia piel y blanqueador US2003133958; lesiones vasculares WO02078685.
En algunas publicaciones se sugiere que este triterpeno puede tener también una actividad antiinflamatoria (Marquez-Martin A, De La Puerta R, Fernandez- Arche A, Ruiz-Gutierrez V, Yaqoob P. Cytokine. (2006) Dec; 36 (5-6):211-7). En este documento también se describe que el acido maslínico inhibe Ia liberación de IL-6 y TNFα y Ia producción de NO y del peróxido de hidrogeno (ROS) en macrófagos peritoneales murinos estimulados con LPS, un efecto que los mismos autores no encuentran en células mononucleares de sangre periférica humana. En todo caso, Io que estas discrepancias ponen de manifiesto es que las respuestas no son homogéneas y por tanto no son predecibles, Io que hace necesario el estudio en cada modelo y/o tipo de tejido.
Por otro lado, las prostaglandinas son sintetizadas a partir del ácido araquidónico (y de otros ácidos grasos insaturados C20 llamados eicosanoides) siguiendo Ia vía metabólica de Ia ciclooxigenasa (COX), una enzima ampliamente distribuida que es capaz de producir un ciclo y de introducir oxígenos en los precursores para crear las prostaglandinas que derivan todas ellas ácido prostanoico. Existen dos isoformas distintas bien identificadas de ciclooxigenasa que son Ia COX-1 y COX-2. La COX-1 se expresa constitutivamente en muchos tejidos, donde regula funciones fisiológicas importantes. Por ejemplo, Ia COX-1 cataliza Ia producción de prostaglandinas por el endotelio y por Ia mucosa gástrica, Io que conduce a efectos antitrombogénicos y citoprotectores, respectivamente La COX-2, que es Ia forma inducible, es indetectable en Ia mayor parte de los tejidos La COX-2 es una isoforma específica derivada de un gen diferente del que codifica Ia COX-1. La expresión de Ia COX-2 aumenta durante el desarrollo y Ia inflamación, pero su expresión constitutiva permanece baja en Ia mayoría de los órganos, excepto en el cerebro.
Las prostaglandinas, en particular Ia PGE2, ejercen múltiples funciones fisiológicas y fisiopatológicas. Así, las concentraciones bajas de PGE2 mantienen Ia integridad de Ia mucosa gástrica normal y Ia homeostasis de los fluidos y electrólitos mientras que los niveles de este mediador están implicados en los procesos inflamatorios.
Otros metabolitos del acido araquidónico son los isoprostranos. Estos metabolitos son parecidos estructuralmente a las prostaglandinas y son generados por Ia oxidación de los ácidos grasos de Ia membrana plasmática.
En Ia actualidad está ampliamente reconocido que los isoprostanos representan un de los mejores marcadores celulares y sistémicos del estrés oxidativo. Ya que se ha demostrado Ia actividad antioxidante del acido maslínico es posible que este compuesto pueda inhibir Ia formación de isoprostranos (Marquez-Martin A, De La Puerta R, Fernandez-Arche A, Ruiz-Gutierrez V, Yaqoob P. Cytokine. (2006) Dec; 36(5-6):211-7); Montilla MP, Ágil A, Navarro MC, Jiménez Ml, Garcia- Granados A, Parra A, Cabo MM. Planta Med. (2003) May;69(5):472-4).
Según el Centro Médico de Ia Universidad de Maryland en Io que a tratamiento de Ia artritis reumatoide, este tratamiento se puede hacer, en principio, con inhibidores de Ia COX-2, indicando que "Los inhibidores COX-2 bloquean una enzima que favorece Ia inflamación, llamada COX-2" pero no contemplan tratamientos eficaces por administración tópica. Inicialmente se creía que esta clase de drogas funcionaba tan bien como las drogas anti-inflamatorias sin esteroides (NSAID), pero con menos problemas estomacales. Sin embargo, numerosos informes de ataques cardíacos y accidentes cerebrovasculares han llevado a Ia FDA a evaluar de nuevo Ia relación riesgo-beneficio de los COX-2. El rofecoxib (Vioxx®) y el valdecoxib (Bextra®) han sido retirados del mercado norteamericano después de los informes sobre ataques cardíacos en pacientes que los estaban tomando. Celecoxib (Celebrex®) aún está disponible, pero con una etiqueta de fuerte advertencia y con Ia recomendación de que sea prescrito en Ia dosis más baja y durante el menor tiempo posible. Los pacientes deben consultarle al médico si este medicamento es apropiado y seguro para ellos.
Los medicamentos antimaláricos como hidroxicloroquina (Plaquenil®) y sulfasalazina (Azulfidine®) también son beneficiosos por Io general en unión con metotrexato. Pero los beneficios de estos medicamentos pueden tomar de semanas a meses para manifestarse y ya que están asociados con efectos colaterales tóxicos, es un imperativo realizar control frecuente con pruebas sanguíneas mientras se estén usando.
Los inhibidores del factor de necrosis tumoral (TNF) son un tipo de medicamentos relativamente nuevos que se utilizan para tratar Ia enfermedad autoinmune y son entre otros: etanercept (Enbre®l), infliximab (Remicade®) y adalimumab (Humira®). Adalimumab® y Etanercept® son medicamentos inyectables, mientras que Infliximab se suministra por vía intravenosa.
Otro medicamento relativamente nuevo es Ia Anakinra inyectable (Kineret ®), una proteína artificial que bloquea Ia proteína inflamatoria interleucina-1. Este medicamento se utiliza para disminuir Ia progresión de moderado a grave de Ia artritis reumatoidea activa en pacientes de más de 18 años que no hayan respondido a uno o más de los DMARD (en inglés Medicamentos Antirreumáticos
Modificadores de Ia Enfermedad). El Kineret® se puede utilizar con otro DMARD o con inhibidores del factor de necrosis tumoral.
Otros medicamentos que suprimen el sistema inmune, como azatioprina (Imuran®) y ciclofosfamida (Cytoxan®), se utilizan algunas veces en personas que han fracasado con otras terapias. Estos medicamentos, que están asociados con efectos secundarios tóxicos, se reservan generalmente para casos severos de artritis reumatoidea.
Se desconoce Ia existencia de un tratamiento eficaz y sencillo de administrar para el tratamiento sintomático y/o regenerativo de artrosis, de artritis reumatoide u otras molestias articulares de difícil diagnóstico que actúe directamente sobre condrocitos y logre un tratamiento eficaz con eliminación rápida y prolongada de las sintomatologías indicadas. EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe el uso del ácido maslínico o cualquiera de sus derivados para el tratamiento de cualquier patología que curse con activación de Ia enzima ciclooxigenasa-2 (COX-2).
En este sentido, en Ia presente invención se demuestra Ia actividad del ácido maslínico como inhibidor de Ia actividad de Ia COX-2 inducida en condrocitos humanos y por tanto Ia utilidad de este ácido en el tratamiento de enfermedades que cursen con Ia activación de dicha enzima COX-2.
Se demuestra también que el ácido maslínico no solo es capaz de reducir Ia inflamación, asociada a este tipo de enfermedades, sino que además interviene en Ia reducción o eliminación de Ia sintomatología y en Ia regeneración tisular condrocitaria demostrando efectos duraderos.
Por todo Io anteriormente citado, Ia invención versa sobre el tratamiento sintomático y/o regenerativo de enfermedades tales como artrosis, artritis reumatoides, fibromialgias, ciática, síndrome del saltador, protuberancia de Ia articulación metatarsofalángica (juanete) y procesos que responden a AINES (Anti Inflamatorios No Esteroideos) específicos para COX-2, con una composición que comprende ácido maslínico o cualquiera de sus derivados. Este tratamiento se lleva a cabo con una administración sencilla y es eficaz puesto que, entre otras cosas, actúa directamente sobre los condrocitos o tejidos afectados. En particular se demuestra en Ia presente invención Ia eficacia en el tratamiento sintomático y/o regenerativo de artrosis y artritis reumatoide con Ia eliminación rápida y prolongada de sus sintomatologías.
En esta invención, se demuestra Ia eficacia del tratamiento incluso por administración tópica. Es muy importante destacar este hecho, puesto que otros AINES inhibidores de Ia COX-2 no muestran eficacia cuando se administran vía tópica y además, su administración por otras vías, presenta efectos secundarios o colaterales adversos.
El ácido maslínico, se puede obtener bien sintética o naturalmente. Las composiciones que comprenden este ácido maslínico, incluyen en su definición, el uso de extractos de plantas que contienen ácido maslínico, extractos de los subproductos de procesado industrial de Ia planta o sus frutos o un subproducto industrial de Ia planta que contiene una concentración mayor de ácido maslínico que Ia originalmente presente en Ia planta. Por ejemplo, pero sin limitarse, extractos de plantas del género Olea, más particularmente Ia especie O. europea. Además del ácido maslínico de este tipo, también se pueden utilizar sus derivados, entendiéndose por derivados en Ia presente invención, sus sales, o derivados aceptados en farmacopeas que faciliten Ia absorción y transporte en los tejidos a tratar. Más particularmente sus sales sódicas, potásicas o de aminas biológicamente aceptables.
Estos hechos se demuestran mediante las siguientes experiencias realizadas:
• Se ha determinado el efecto del acido maslínico y derivados sobre Ia expresión de Ia proteína COX-2 en monocitos primarios humanos de sangre periférica.
• Se ha determinado el efecto del ácido maslínico y derivados en Ia actividad enzimática de Ia COX-2 en monocitos de sangre periférica.
• Se ha determinado el efecto del ácido maslínico y derivados sobre Ia formación de isoprostranos en monocitos primarios humanos de sangre periférica.
• Se ha determinado el efecto del ácido maslínico y derivados sobre Ia liberación de PGE2 en condrocitos primarios humanos.
• Se ha determinado el efecto del acido maslínico y derivados sobre Ia liberación de PGE2 en astrocitos de rata primarios y en Ia línea celular de tipo neuroblastoma SK-S-NH .
• Se ha determinado el efecto del acido maslínico y derivados sobre Ia regulación transcripcional del gen COX-2 y sobre Ia expresión de Ia proteína COX-2 en astrocitos primarios.
• Se han realizado pruebas clínicas sobre pacientes afectados por procesos atrofíeos artrósicos, artríticos, fibromiálgicos o tendinosis, entre otros, para probar Ia eficacia del tratamiento "in vivo" y muy especialmente por administración tópica.
Es preciso tener en cuenta que, a veces, los diagnósticos que previamente tenían realizados los pacientes tratados, no son muy precisos, siendo en muchas ocasiones la sintomatología el único medio empleado para el antedicho diagnóstico.
Ya que Ia funcionalidad de COX-2 y Ia producción de PGE2 se regula a varios niveles y que el acido maslínico inhibe Ia producción de PGE2 en monocitos primarios humanos se ha estudiado en detalle el efecto de este triterpeno sobre Ia expresión y función de Ia COX-2 en diferentes tipos celulares "in vitro" como paso previo a los estudios con modelos animales específicos. Así, se ha demostrado por primera vez Ia acción "in vitro" del ácido maslínico en Ia inhibición de COX-2 inducida en condrocitos humanos y se ha llevado a cabo un amplio estudio clínico de pacientes con artrosis, artritis o fibromialgias, entre otros, pudiendo demostrar una sorprendente eficacia del ácido maslínico y sus sales incluso en tratamientos tópicos sencillos de las zonas que presentaban estos síndromes. De hecho, aunque en todos los pacientes con artrosis se observó una mejoría de los síntomas, en aquellos menores de aproximadamente 60 años los síntomas remitieron totalmente en menos de un mes de tratamiento. Además, en todos los casos, se observa de forma muy sintomática la paulatina reabsorción de calcificaciones propias de los síndromes artrósicos.
En más del 80% de los casos Ia eficacia en Io que a sintomatología se refiere se comienza a notar en 24/48 horas y entre 2 a 6 aplicaciones tópicas. Además de Ia mejora de Ia sintomatología en articulaciones (dolor y rigidez) los pacientes con inflamación evidente, por ejemplo en los dedos de Ia mano, notan en pocos minutos un aumento de temperatura en las zonas tratadas, Io que indica claramente el aumento de circulación sanguínea que el paciente empieza a experimentar en forma inmediata.
Se ha comprobado, que el ácido maslínico es un potente inmunomodulador de Ia respuesta inmune ya que inhibe Ia activación y Ia proliferación de los linfocitos T estimulados vía TCR e inhibe Ia producción de las citoquinas pro-inflamatorias TNFα e IL-6, además de Ia producción de Ia Prostaglandina E2 (PGE2) en monocitos primarios. Además, se observa que las concentraciones de ácido maslínico que actúan inhibiendo las respuestas inmunes innata y adquirida son sensiblemente más bajas que las requeridas para inducir apoptosis en líneas celulares tumorales. En Ia presente invención, y como consecuencia de los resultados obtenidos, mostrados en Ia sección de ejemplos, se demuestra que:
1. El acido maslínico inhibe Ia producción de PGE2 en monocitos humanos. 2. El acido maslínico inhibe Ia actividad enzimática de Ia COX-2.
3. El ácido maslínico no inhibe ni Ia activación transcripcional del promotor del gen de Ia COX-2 ni Ia expresión de Ia proteína.
4. El acido maslínico a dosis altas inhibe Ia producción de PGE2 en condrocitos y en células derivadas de un neuroblastoma. 5. El ácido maslínico inhibe Ia producción de isoprostranos en monocitos humanos.
6. El ácido maslínico inhibe Ia producción de IL-6 en monocitos y condrocitos humanos.
7. La inhibición de producción de IL-6 por el MA no se debe a una inhibición transcripcional del gen de Ia IL-6.
Hay que tener en cuenta que, las uniones entre los huesos están recubiertas por el cartílago articular, un tejido que no contiene capilares ni terminaciones nerviosas. Durante el movimiento articular Ia fricción entre huesos se minimiza por este cartílago articular, que contiene condrocitos, los cuales representan el 1- 2% del volumen total, y cuya función es sintetizar proteínas de Ia matriz extracelular. Esta matriz contiene un 70-80% de agua Io que Ie permite tener una estructura que sirve para amortiguar las presiones. La interacción electrostática entre las moléculas de agua y los mucopolisacáridos sulfatados es necesaria para mantener Ia hidratación del cartílago. Por tanto los proteoglicanos lubricados por los polímeros de hialurónico es Ia sustancia que mantiene Ia integridad del cartílago. Los glucosaminoglicanos y proteoglicanos mantienen una íntima relación con las fibras de colágeno producidas por los condrocitos, los cuales también producen los proteoglicanos.
Por todo ello, un primer aspecto de Ia presente invención se refiere al uso del ácido maslínico, en su definición más amplia como anteriormente se ha descrito, o cualquiera de sus derivados para Ia preparación de un medicamento para el tratamiento de patologías relacionadas con Ia activación de Ia COX-2. Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso del ácido maslínico o cualquiera de sus derivados para preparar un medicamento que además favorece Ia regeneración tisular condrocitaria.
En una realización preferida de Ia invención las patologías relacionadas con Ia activación de Ia COX-2 y/o en las que se produce regeneración tisular condrocitaria se seleccionan de Ia lista que comprende: artrosis, artritis reumatoides, ciática, fibromialgias, hallux valgus o protuberancia de Ia articulación metatarsofalángica (juanete), tendinitis rotuliana (rodilla del saltador) u otras patologías que responden a AINES específicos para COX-2. Una realización aún más preferida comprende su uso para el tratamiento de artrosis o artritis reumatoide.
Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere a una composición farmacéutica que comprende ácido maslínico en su definición más amplia (sales, metabolitos, extractos de plantas que Io contengan, extracto de los subproductos de procesado industrial de Ia planta o sus frutos, o un subproducto industrial o una combinación de cualquiera de estos componentes) o cualquiera de sus derivados para el tratamiento de enfermedades que cursen con Ia activación de Ia COX-2. Más concretamente útil para el tratamiento de enfermedades relacionadas con Ia activación de Ia enzima COX-2 en condrocitos de humanos o animales mediante Ia inhibición de esta COX-2.
En una realización preferida, dicha composición además comprende ácido oleanólico y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable. Más preferidamente, Ia relación de ácido maslínico:ácido oleanólico es de entre 2:1 y 6:1.
Es decir, el ácido maslínico, sus sales, derivados farmacéuticamente aceptables o sus profármacos, se formularán en una composición farmacéutica apropiada, en Ia cantidad terapéuticamente efectiva, junto con uno o más vehículos, adyuvantes o excipientes farmacéuticamente aceptables. Más particularmente, el ácido maslínico o Ia mezcla de ácido maslínico y ácido oleanólico, se encuentra en una proporción de entre 0.5 y 10% del total de Ia composición, más concretamente entre el 0.5 y el 5% y aún más concretamente entre el 1 y el 3%. Esta composición, se puede administrar de distintas formas, entre ellas, pero sin limitarse, intraperitonealmente, oralmente, bucalmente, rectalmente, intramuscularmente, de forma tópica, de forma subcutánea, intraarticularmente o por inhalación.
Mas preferiblemente se administra de forma tópica, subcutánea o mediante infiltraciones articulares. En otra realización preferida, dicha composición se presenta en una forma adaptada a Ia administración tópica.
En cada caso Ia composición se adaptará al tipo de administración utilizada, por ello, Ia composición descrita anteriormente se puede presentar bajo Ia forma de tabletas, grageas, cápsulas, soluciones, emulsiones, cremas, leche corporal, ungüentos, inhalantes, aerosoles, supositorios o cualquier otra forma de administración clínicamente permitida y en una cantidad terapéuticamente eficaz. Mas preferiblemente en forma de solución, emulsión, crema, leche corporal o ungüento.
En otra realización preferida, esta composición contiene ácido maslínico o cualquiera de sus derivados, obtenidos de un extracto de planta del genero Olea o de un subproducto industrial de planta del genero Olea.
Por un derivado farmacéuticamente aceptable se entiende cualquier sal, farmacéuticamente aceptable o cualquier otro compuesto que después de su administración, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el ácido maslínico.
En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en Ia elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye sólidos o líquidos, disolventes, tensioactivos, etc.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia producción de PGE-2 en monolitos humanos
FIG. 2.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia expresión de COX-2 en monolitos humanos.
FIG. 3.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia actividad de COX-2 en monolitos humanos.
FIG. 4.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia producción de PGE-2 en células SK-N-SH
FIG. 5.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia producción de PGE-2 en astrocitos primarios.
FIG. 6.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia actividad transcripcional de Ia COX-2.
FIG. 7.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia expresión de Ia COX-2 en monocitos humanos.
FIG. 8.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia producción de PGE-2 en condrocitos.
FIG. 9.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia producción de IL-6 en condorcitos.
FIG. 10.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia producción de PGE-2 en monolitos. FIG. 11.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia actividad del promotor de Ia IL-6 inducida por P+l.
FIG. 12.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre la actividad del promotor de Ia IL-6 inducida por IL-1.
FIG. 13.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia producción de
¡soprostanos en monolitos primarios.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto, entre otras cosas, Ia actividad y eficacia del ácido maslínico y demuestran Io que de forma general se ha descrito en los apartados anteriores.
De forma genérica para todos los ejemplos, se describen los compuestos, materiales y métodos utilizados:
1. Compuestos:
Se utilizó ácido maslínico en su forma de sal sódica, Ia cual se disolvió en DMSO (dimetilsulfóxido) en una solución stock (10 y 50 mM). La concentración máxima final de DMSO en los cultivos fue del 1% (vol/vol), Ia cual no interfiere con los parámetros medidos.
2. Cultivos celulares
• Aislamiento y cultivo de monocitos primarios de sangre periférica. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) procedentes de donantes voluntarios sanos y adultos, fueron aisladas por centrifugación de sangre venosa mediante gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque. Los monocitos fueron separados mediante adherencia al plástico y posteriormente cultivados en placas de 24 pozos a una densidad de 500.000 células/ml para los experimentos de enzimoinmunoensayos (EIA) y en placas de 6 pozos para los ensayos de inmunoblot.
• Cultivo de condrocitos primarios humanos. Los condrocitos fueron comprados a Promocell (Heidelberg, Alemania) y cultivados en medio condicionados para este tipo de células. Las células fueron cultivadas en placas de 24 pozos para Ia determinación de PGE2 e IL-6.
• Cultivo de astrocitos primarios de rata. Los cultivos primarios de astrocitos fueron preparados a partir de cerebros de rata neonatal (1 día de vida). La parte superior del cráneo fue abierta y las meninges cuidadosamente separadas para evitar Ia contaminación de los cultivos con fibroblastos. La corteza cerebral se aisló y se obtuvo una suspensión celular que se cultivo en DMEM condicionado para cultivo de astrocitos. Los cultivos fueron expandidos en placas de 6 pozos y Ia producción de PGE2 medida en células después del 3 o 4 pase.
- Cultivo de líneas celulares. La SK-N-SH (American Tissue Culture collection, HTB 11) es una línea celular derivada de un neuroblastoma humano y se mantuvo en crecimiento exponencial en DMEM suplementado con 2 mmol/l L-glutamina, antibióticos y 10% de FCS. Las células fueron cultivadas a 370C y en una atmósfera al 5 % de CO2.
3. Western blots
Las células (monocitos primarios o SK-N-SH) fueron estimuladas como se indica en cada caso y usadas en 50 μl de solución de lisado (20 mM Hepes pH 8.0, 10 mM KCI, 0.15 mM EGTA, 0.15 mM EDTA, 0.5 mM Na3VO4, 5 mM NaF, 1 mM
DTT, leupeptina 1 μg/ml, pepstatina 0.5 μg/ml, aprotinina 0.5 μg/ml, 1 mM PMSF y 0.5 % NP-40). La concentración de proteínas fue determinada mediante el reactivo de Bradford (Bio-Rad, Richmond, CA, EEUU) y 30 μg de proteínas fueron hervidos en solución Laemmli y sometidos a electroforesis en gel de
SDS/poliacrilamida al 10 %. Las proteínas separadas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa (0.5 A, 100V a 4 0C) durante 1 h. Las membranas fueron bloqueadas en TBS conteniendo 0.1 % de Tween 20 y 5 % de leche en polvo desnatada. La inmunodetección de las distintas proteínas fue llevada a cabo mediante incubación con los distintos anticuerpos primarios durante dos horas, seguido de incubación con los correspondientes anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa durante una hora y media y revelado mediante el uso del sistema de quimioluminiscencia ECL (GE Healthcare Life Sciences).
4. Transfecciones transitorias y ensayos de luciferasa
Las células SK-N-SH fueron transfectadas con los plásmidos COX-2-Luc e IL-6- Luc usando el reactivo Jet Pei (Polyplus transfection, Francia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ambos plásmidos contienen los promotores de los genes indicados dirigiendo el gen de Ia luciferasa como marcador de Ia activación transcripcional. Las células se mantuvieron en cultivo en condiciones normales hasta 24 ó 48 horas después de Ia transfección dependiendo del experimento y se estimularon de Ia manera indicada en cada caso. Tras los estímulos, las células fueron usadas en tampón de lisado (25 mM Tris-fosfato pH 7.8, 8 mM MgCI2, 1 mM DTT, 1 % Tritón X-100, y 7 % glicerol) durante 15 minutos a temperatura ambiente. La actividad luciferasa en el extracto de proteínas fue determinada mediante el uso del luminómetro Autolumat LB9510 (Berthold) siguiendo las instrucciones del sistema Luciferase assay de Promega (Madison, Wl, USA).
5. Determinación de Ia producción de PGE2 en distintos tipos celulares y de Ia actividad COX-2.
Los cultivos de condrocitos, monocitos y astrocitos fueron estimulados con los correspondientes activadores (IL-1 , LPS o PMA más lonomicina) en presencia o no de varias concentraciones de ácido maslínico durante los tiempos indicados. Posteriormente los sobrenadantes fueron recogidos para determinar Ia cantidad de PGE2 liberada por las células estimuladas. La PGE2 fue determinada usando el sistema EIA de Assay Designs (numero de catalogo 901-001) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la determinación de Ia actividad COX-2, las células se estimularon primero con LPS (10 ng/ml) durante 24 h para inducir Ia expresión celular de Ia proteína COX-2. Pasado este tiempo los cultivos fueron lavados y se añadió nuevo medio de cultivo libre de suero, acido maslínico (diferentes concentraciones) y acido araquidonico (AA) durante 15 min. En este tiempo Ia actividad enzimática de COX-2 se mide por su capacidad de producir PGE2 a partir del AA incluido en el cultivo.
6. Determinación de Ia producción de Isoprostanos e IL-6 en monocitos.
Los cultivos de monocitos fueron estimulados igual que para Ia producción de PGE2 (estimulación con LPS durante 24 h) y Ia cantidad de 8-/so-prostaglandina F2α (isoprostranos) o IL-6 liberada por las células fue determinada respectivamente mediante los sistemas de EIA de Cayman (USA) (numero de catalogo 516351) o de Pelikine (numero de catalogo RDI-M1916clb) siguiendo las instrucciones de los fabricantes.
EJEMPLO 1
El acido maslínico (MA) inhibe Ia actividad enzimática de Ia enzima COX-2 v Ia producción de PGE? en monocitos estimulados con LPS.
En los procesos inflamatorios los monocitos producen numerosas citoquinas pro- inflamatorias como el TNFα, Ia IL-1β y Ia IL-6 y mediadores de Ia inflamación como los leucotrienos y las prostaglandinas entre otros. Ya se demostró con anterioridad que el acido maslínico (MA) inhibió la producción de PGE2 en monocitos humanos obtenidos de sangre de periférica y estimulados con LPS (FIG 1).
Con el fin de identificar el mecanismo de acción del MA sobre Ia producción de PGE2, aspecto de gran importancia para buscar Ia causa y poder predecir aplicaciones, se realizaron una serie de experimentos destinados a estudiar el efecto del MA sobre Ia actividad transcripcional del gen de Ia COX-2 y sobre la expresión de Ia proteína. En primer lugar monocitos de sangre periférica se estimularon con LPS en presencia de dosis crecientes de MA y 12 horas después se extrajeron las proteínas celulares que fueron sometidas a electroforesis para detectar Ia expresión de COX-2 mediante western blots. En Ia figura 2 se puede observar que el MA no inhibió Ia expresión de COX-2 inducida por LPS. (FIG.2)
Ante Ia posibilidad del que el MA actuase como inhibidor de Ia actividad COX-2, indujimos Ia expresión de COX-2 mediante tratamiento de los monocitos con LPS durante 24 h. Pasado este tiempo las células fueron lavadas tres veces con medio sin suero e incubadas durante 15 min con dosis crecientes de MA. Pasado este tiempo, se añadió ácido araquidónico a los cultivos (15 μM) durante otros 15 min y Ia conversión a PGE2 medida mediante EIA. En Ia figura 3 se puede observar que el MA inhibió de forma dosis dependiente Ia actividad enzimática de COX-2 v explica su efecto sobre Ia producción de PGE2 en este tipo celular. (FIG 3).
EJEMPLO 2
Efecto dual del acido maslínico (MA) sobre Ia producción de PGE2 en astrocitos primarios v en Ia línea celular SK-N-SH (neuroblastoma).
A continuación se estudió el efecto del MA sobre Ia actividad transcripcional del promotor del gen de Ia COX-2 y sobre Ia expresión de Ia proteína en células SK-
N-SH. Estas células fueron transfectadas de forma transitoria con un plásmido que contiene el gen de Ia luciferasa dirigido por el promotor completo del gen
COX-2. 24 h después de Ia transfección las células se incubaron con dosis crecientes de MA y se estimularon con PMA más lonomicina durante 6 horas. Pasado este tiempo Ia actividad luciferasa fue medida en los usados celulares observándose que el MA no afectó a Ia actividad transcripcional del gen COX-2
(FIG.5).
La expresión inducible de Ia proteína COX-2 tampoco se vio afectada en células SK-N-SH por Ia presencia de MA (FIG 6).
EJEMPLO 3
Efecto del acido maslínico (MA) sobre Ia producción de PGE2 e IL-6 en condrocitos humanos estimulados con IL-1. Para determinar si el efecto del MA sobre Ia producción de PGE2 también ocurría en otro tipo celular involucrado en fenómenos inflamatorios se ha determinado Ia actividad anti-inflamatoria del acido maslínico sobre condrocitos primarios humanos. Las células fueron tratadas con dosis crecientes de MA y posteriormente estimuladas con IL-1 (10 U/ml) para determinar Ia liberación de PGE2 e IL-6. En Ia figura 7 (FIG.7) se muestra que el MA ejerce un efecto dual en la producción de PGE2 tras Ia estimulación con IL-1 en condrocitos. A dosis mas bajas (0.1 y 1 μg/ml) se produjo un incremento de la producción de PGE2, mientras que dosis más altas (25 y 50 μg/ml) se observó una completa inhibición de liberación de esta prostraglandina inducida por Ia IL-1.
Por el contrario Ia producción de IL-6 fue completamente inhibida por el MA en las mismas células y de una manera dependiente de Ia concentración (FIG. 8).
Estos resultados concuerdan totalmente con los resultados encontrados previamente en monocitos humanos donde Ia IL-6 inducida por LPS fue inhibida por el MA (FIG. 9).
A continuación se estudió si el efecto inhibitorio del acido maslínico sobre la liberación de IL-6 era debido a un efecto transcripcional sobre el gen que codifica dicha proteína. Así, las células SK-N-SH, que son productoras de IL-6, fueron transfectadas con un plásmido que contiene el gen de Ia luciferasa dirigido por el promotor completo de Ia IL-6 y estimuladas con IL-1 o una combinación de PMA mas ionomicina en presencia o ausencia de dosis crecientes de MA y Ia actividad luciferasa medida en los extractos celulares después de 4 horas de tratamiento. En las figuras 10 y 11 (FIG. 10 y 11) se muestra que el MA no inhibe Ia actividad transcripcional del promotor de Ia IL-1, por Io que actividad inhibitoria sobre Ia liberación de IL-6 es debida seguramente a una inhibición a nivel post- transcripcional.
EJEMPLO 4
Efecto del acido maslínico (MA) sobre la producción de isoprostranos en monocitos humanos estimulados con LPS. Los isoprostranos como el endoperoxido 8-/so-prostaglandina F2α (8-/so-PGF2α) son metabolitos de Ia oxidación de acido araquidónico y en Ia actualidad se considera unos de los mejores marcadores del estrés oxidativo. En Ia figura 12 (FIG.12) se muestra que el MA inhibe de forma concentración dependiente Ia liberación de 8-/so-PGF2α producida en monocitos humanos se sangre periférica tras Ia estimulación con LPS. Este dato confirma Ia actividad anti-oxidante del MA demostrada previamente por otros autores. La potencia inhibidora del MA sobre Ia producción de isoprostanos es superior a Ia del tocoferol y el trolox y es comparable a Ia del resveratrol (FIG.13)
EJEMPLO 5
Se realizaron pruebas clínicas mediante Ia administración por vía tópica de sal sódica del ácido maslínico y mezclas, en proporciones variables, de las sales sódicas de ácido maslínico y ácido oleanólico y de ácido maslínico y ácido oleanólico en proporciones variables (de entre 70% y el 85% de maslínico y entre el 30% y el 15% de oleanólico). En el caso de utilización de sales, Ia administración por vía tópica se ha realizado debidamente distribuida en una leche corporal tipo y en el caso de los ácidos libres se utilizado Ia conocida base Beeler para su administración. La leche corporal contenía aproximadamente de entre el 0.5% al 1.5% de principio activo (sales) y Ia crema contenía aproximadamente entre el 1.5% al 2,5% del principio activo (ácidos libres) así como de extractos de residuos de Ia molturación de aceituna enriquecidos en ácido oleanólico y ácido maslínico.
Las sales sódicas se obtuvieron por tratamientos básicos con MeONa en metanol o con disoluciones acuosas de NaOH siguiendo los procedimientos usuales de laboratorio.
Algunos de los resultados obtenidos por tratamientos tópicos se muestran en Ia tabla I:
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
TABLA
Resultado positivo significa disminución significativa de las molestias y aumento considerable de la flexibilidad de Ia articulación, dejando transcurrir entre 12 y 24 horas hasta el siguiente tratamiento tópico, Io que demuestra un efecto antiinflamatorio eficaz en Ia zona cartilaginosa. En algunos de los casos, Ia eliminación de síntomas ha sido permanente, Io que demuestra un proceso de regeneración condrocitaria. Es sorprendente que, en Io que a sintomatología se refiere se ha logrado en muchas ocasiones desde Ia primera aplicación.
De entre muchos más de un centenar de pacientes, se localizaron únicamente dos resultados catalogados como "negativos" que se evaluaron específicamente, el primero es una mujer de 60 años con un historial de más de 20 años de artrosis en rodillas y pies, al cabo de dos meses de tratamiento admitió una apreciable mejoría en las molestias de los pies. El segundo se trata de un hombre mayor de 85 años y con graves molestias de rodillas que no reconoció mejoría en el tratamiento.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso del ácido maslínico o cualquiera de sus derivados para Ia elaboración de un medicamento para el tratamiento de patologías que cursen con Ia activación de Ia COX-2.
2. Uso del ácido maslínico o cualquiera de sus derivados para Ia elaboración de un medicamento para Ia regeneración tisular condrocitaria.
3. Uso del ácido maslínico o cualquiera de sus derivados según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para Ia elaboración de un medicamento para el tratamiento de patologías seleccionadas de Ia lista que comprende: artrosis, artritis reumatoides, ciática, fibromialgias, tendinitis rotuliana o juanete.
4. Composición farmacéutica que comprende ácido maslínico o cualquiera de sus derivados para el tratamiento de enfermedades que cursen con Ia activación de Ia COX-2.
5. Composición farmacéutica según Ia reivindicación 4 que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5 que además comprende ácido oleanólico.
7. Composición según reivindicación 6 donde Ia relación entre el ácido maslínico y el ácido oleanólico es de entre 2:1 y 6:1.
8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 4-7 en una forma adaptada a Ia administración tópica.
9. Composición según reivindicaciones 4 a 8, donde el ácido maslínico o cualquiera de sus derivados se obtiene de un extracto de planta del género Olea.
10. Composición según reivindicaciones 4 a 9, donde el ácido maslínico o cualquiera de sus derivados se obtiene de un subproducto industrial de planta del género Olea.
11. Composición según reivindicaciones 4 a 9, donde el ácido maslínico o cualquiera de sus derivados se encuentran en una proporción de entre el 0,5 % y el 3% del total de Ia composición.
PCT/ES2009/000195 2008-04-03 2009-04-03 Uso del ácido maslínico para el tratamiento de patologías y sus síntomas mediante la inhibición de cox-2 WO2009121992A2 (es)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011502401A JP2011516457A (ja) 2008-04-03 2009-04-03 疾患とその症状をｃｏｘ−２阻害によって治療するためのマスリン酸の使用
EP09728965A EP2258374A4 (en) 2008-04-03 2009-04-03 USE OF MASLINIC ACID FOR THE TREATMENT OF DISEASES AND THEIR SYMPTOMS THROUGH COX-2 INHIBITION
US12/920,435 US20110105611A1 (en) 2008-04-03 2009-04-03 Use of maslinic acid for the treatment of pathologies and their symptoms through the inhibition of cox-2
CN2009801072131A CN102014922A (zh) 2008-04-03 2009-04-03 山楂酸通过抑制cox-2用于治疗病症和其症状的用途
MX2010009467A MX2010009467A (es) 2008-04-03 2009-04-03 Uso del acido maslinico para el tratamiento de patologias y sus sintomas mediante la inhibicion de cox-2.
MA33135A MA32130B1 (fr) 2008-04-03 2010-08-31 Utilisation de l'acide maslinique dans le traitement de pathologies et de leurs symptômes par inhibition de cox-2

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200801069A ES2328999B1 (es) 2008-04-03 2008-04-03 Uso del acido maslinico para el tratamiento de patologias y sus sintomas mediante la inhibicion de cox-2.
ESP200801069 2008-04-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2009121992A2 true WO2009121992A2 (es) 2009-10-08
WO2009121992A3 WO2009121992A3 (es) 2010-01-07

Family

ID=41135978

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2009/000195 WO2009121992A2 (es) 2008-04-03 2009-04-03 Uso del ácido maslínico para el tratamiento de patologías y sus síntomas mediante la inhibición de cox-2

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20110105611A1 (es)
EP (1) EP2258374A4 (es)
JP (1) JP2011516457A (es)
CN (1) CN102014922A (es)
ES (1) ES2328999B1 (es)
MA (1) MA32130B1 (es)
MX (1) MX2010009467A (es)
RU (1) RU2010135252A (es)
WO (1) WO2009121992A2 (es)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102210691A (zh) * 2010-04-01 2011-10-12 华东师范大学 山楂酸及其衍生物在制备抑制破骨细胞分化和功能的治疗和/或预防药物中的应用
CN102558278A (zh) * 2010-12-28 2012-07-11 复旦大学 三萜类化合物及其在制备抗补体药物中的用途

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9259405B2 (en) 2012-02-06 2016-02-16 Innovative Med Concepts, LLC Method of treating functional somatic syndromes with combination of famciclovir and diclofenac
JP6547183B2 (ja) * 2015-03-16 2019-07-24 日本製粉株式会社 トリテルペンを有効成分として含有する変形性関節症の予防又は治療の為の組成物
JP2017109942A (ja) * 2015-12-15 2017-06-22 日本製粉株式会社 オレアナン型トリテルペンを有効成分として含有するトレーニング機器を使用しないレジスタンストレーニングによる膝関節機能改善作用および骨格筋機能増強作用を促進させる為の組成物
CN106420765A (zh) * 2016-09-10 2017-02-22 浙江大学 山楂酸在制备治疗和预防中枢神经系统疾病药物中的用途
JP2019043876A (ja) * 2017-08-31 2019-03-22 日本製粉株式会社 マスリン酸を有効成分として含有するタンパク質合成促進剤及び骨格筋肥大促進剤

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002052956A1 (fr) 2000-12-27 2002-07-11 The Nisshin Oillio, Ltd. Boisson ou aliment antitumoral
WO2002078685A1 (fr) 2001-03-30 2002-10-10 The Nisshin_Oillio, Ltd. Medicaments pour une lesion vasculaire
WO2003011267A1 (fr) 2001-07-31 2003-02-13 The Nisshin Oillio, Ltd. Medicaments anti-obesite et ses substances
WO2003039270A1 (fr) 2001-11-08 2003-05-15 The Nisshin Oillio,Ltd. Aliments et boissons agissant contre l'obesite
WO2003057224A1 (fr) 2001-12-28 2003-07-17 The Nisshin Oillio, Ltd. Inducteur d'apoptose
US20030133958A1 (en) 2000-03-31 2003-07-17 Noriyasu Kuno External agent for the skin and whitening agent
US20030153538A1 (en) 2000-07-31 2003-08-14 The Nisshin Oillio, Ltd. Antitumor agent

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003029391A1 (fr) * 2001-09-28 2003-04-10 The Nisshin Oillio, Ltd. Procede de production de compositions de matiere grasse renfermant de l'acide oleanolique et/ou de l'acide maslinique
ES2267403B1 (es) * 2005-08-17 2008-03-16 Universidad De Granada Composicion nutraceutica obtenida de triterpenos naturales de la olea europaea.

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030133958A1 (en) 2000-03-31 2003-07-17 Noriyasu Kuno External agent for the skin and whitening agent
US20030153538A1 (en) 2000-07-31 2003-08-14 The Nisshin Oillio, Ltd. Antitumor agent
WO2002052956A1 (fr) 2000-12-27 2002-07-11 The Nisshin Oillio, Ltd. Boisson ou aliment antitumoral
WO2002078685A1 (fr) 2001-03-30 2002-10-10 The Nisshin_Oillio, Ltd. Medicaments pour une lesion vasculaire
WO2003011267A1 (fr) 2001-07-31 2003-02-13 The Nisshin Oillio, Ltd. Medicaments anti-obesite et ses substances
WO2003039270A1 (fr) 2001-11-08 2003-05-15 The Nisshin Oillio,Ltd. Aliments et boissons agissant contre l'obesite
WO2003057224A1 (fr) 2001-12-28 2003-07-17 The Nisshin Oillio, Ltd. Inducteur d'apoptose

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIANCHI, G.; POZZI, N.; VLAHOV, G., PHYTOCHEMISTRY, vol. 37, 1994, pages 205 - 207
DU, Q.Z.; XIONG, X.P.; ITO, Y., JOURNAL OF LIQUID CHROMATOGRAPHY, vol. 18, 1995, pages 1997 - 2004
MARQUEZ-MARTIN A; DE LA PUERTA R; FERNANDEZ-ARCHE A; RUIZ-GUTIERREZ V; YAQOOB P., CYTOKINE., vol. 36, no. 5-6, December 2006 (2006-12-01), pages 211 - 7
MARQUEZ-MARTIN A; DE. LA PUERTA R; FERNANDEZ-ARCHE A; RUIZ-GUTIERREZ V; YAQOOB P, CYTOKINE, vol. 36, no. 5-6, December 2006 (2006-12-01), pages 211 - 7
MONTILLA MP; AGIL A; NAVARRO MC; JIMENEZ MI; GARCIA-GRANADOS A; PARRA A; CABO MM, PLANTA MED., vol. 69, no. 5, May 2003 (2003-05-01), pages 472 - 4
See also references of EP2258374A4

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102210691A (zh) * 2010-04-01 2011-10-12 华东师范大学 山楂酸及其衍生物在制备抑制破骨细胞分化和功能的治疗和/或预防药物中的应用
CN102558278A (zh) * 2010-12-28 2012-07-11 复旦大学 三萜类化合物及其在制备抗补体药物中的用途
CN102558278B (zh) * 2010-12-28 2014-07-09 复旦大学 三萜类化合物及其在制备抗补体药物中的用途

Also Published As

Publication number Publication date
ES2328999A1 (es) 2009-11-19
EP2258374A2 (en) 2010-12-08
JP2011516457A (ja) 2011-05-26
EP2258374A4 (en) 2012-07-25
ES2328999B1 (es) 2010-10-27
CN102014922A (zh) 2011-04-13
US20110105611A1 (en) 2011-05-05
WO2009121992A3 (es) 2010-01-07
MX2010009467A (es) 2010-12-20
MA32130B1 (fr) 2011-03-01
RU2010135252A (ru) 2012-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2328999B1 (es) Uso del acido maslinico para el tratamiento de patologias y sus sintomas mediante la inhibicion de cox-2.
ES2751117T3 (es) Uso de cannabinoides en combinación con Aripriprazol
ES2992838T3 (en) Treatment of irritability in autism spectrum disorder with cannabidiol
RU2468809C2 (ru) Экстракт андрографиса метельчатого (andrographis paniculata)
ES2757051T3 (es) 7-hidroxi cannabidiol (7-OH-CBD) para uso en el tratamiento de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD)
Tang et al. Protective effect of tanshinone IIA on the brain and its therapeutic time window in rat models of cerebral ischemia-reperfusion
ES2861306T3 (es) Composición dermatológica que contiene Escherichia coli y Enterococcus faecalis
Hu et al. Increased PINK1/Parkin-mediated mitophagy explains the improved brain protective effects of slow rewarming following hypothermia after cardiac arrest in rats
Sarkari et al. Relapses and remissions in brain stem tumours
JP2008127325A (ja) リン酸化ｍｂｐ産生促進剤
ES2764750T3 (es) Composición que contiene monoterpeno para el tratamiento de pólipos nasales
KRASNOFF et al. Acetylsalicylic acid poisoning: with a report of a fatal case
ES2333638B2 (es) Uso del acido maslinico para el tratamiento de dolores de naturaleza nociceptiva, inflamatoria y neurogenica.
Townsend et al. The Effect of the Synthetic Haemorrhagic Agent, 3, 3′-Methylenebis (4-Hydroxycoumarin), in Prolonging the Coagulation and Prothrombin Time in the Human Subject
WO2010028515A2 (es) Una composición farmacéutica dermatológica, a base de pentoxifilina, de aplicación tópica, en forma de crema, gel ungüento, solución, en emulsión, en liposomas y en microcápsulas
Robson Perforated oesophagus following burns
ES2474765T3 (es) Agente profiláctico y/o terapéutico para la dismenorrea
WO2017193573A1 (zh) 一种治疗缺血性脑中风的药物组合物及其制备方法与用途
RU2322968C1 (ru) Суппозитории
Gould A Pocket medical dictionary
RU2300370C1 (ru) Способ лечения атрофического кольпита
ES2610208B1 (es) Formulación cosmética de uso tópico para el cuidado de la piel atópica
GIL et al. WCN23-0129 Indoxyl sulfate suppressed glycolysis related to apoptosis in human astrocyte
ES2209118T3 (es) Empleo de 2,3-dimetoxi-5-metil-6-decaprenil-1,4-benzoquinona en el tratamiento del zumbido de oidos.
Mancino et al. Antiinflammatory actions of tibolone in the spinal cord of experimental autoimmune encephalomyelitis mice

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200980107213.1

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009728965

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2010/009467

Country of ref document: MX

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011502401

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09728965

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010135252

Country of ref document: RU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12920435

Country of ref document: US

点击 这是indexloc提供的php浏览器服务，不要输入任何密码和下载