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WO2009150845A1 - 最適な抗ウイルス剤の選択方法 - Google Patents

最適な抗ウイルス剤の選択方法 Download PDF

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WO2009150845A1
WO2009150845A1 PCT/JP2009/002653 JP2009002653W WO2009150845A1 WO 2009150845 A1 WO2009150845 A1 WO 2009150845A1 JP 2009002653 W JP2009002653 W JP 2009002653W WO 2009150845 A1 WO2009150845 A1 WO 2009150845A1
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WO
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antiviral agent
patient
target protein
selecting
derived
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/002653
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English (en)
French (fr)
Inventor
弥重太 遠藤
澤崎達也
山本直樹
梁明秀
Original Assignee
株式会社セルフリーサイエンス
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社セルフリーサイエンス filed Critical 株式会社セルフリーサイエンス
Publication of WO2009150845A1 publication Critical patent/WO2009150845A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a method for selecting an optimal antiviral agent. More specifically, the optimal antiviral agent in each patient is simple, quick and reliable by detecting the inhibitory effect of the antiviral agent on the virus-derived target protein expressed using the cell-free protein synthesis system. Relates to the selection method.
  • This application which is incorporated herein by reference, claims priority from Japanese Patent Application No. 2008-154747.
  • HIV Human immunodeficiency virus
  • UNAIDS / WHO AIDS epidemic update
  • the number of infected people and the number of AIDS patients are small, so the educational effect is not sufficiently improved, and in the developed countries of the world, the increase in the number of infected people is still stopped. Absent.
  • HAART therapy has improved the patient's prognosis, the number of long-term patients has increased, and new complications such as problems with resistance to existing drugs and immune reconstitution syndrome have emerged.
  • HAART therapy a intensive therapy using a combination of two or four reverse transcriptase inhibitors such as azidothymidine (AZT) and protease inhibitors
  • ZHT azidothymidine
  • protease inhibitors such as azidothymidine (AZT) and protease inhibitors
  • the therapeutic effect is limited due to the emergence of resistant viruses and side effects.
  • resistant viruses to administered drugs can easily appear, and multiple drugs based on the same mechanism of action can be selected by careless selection of drugs. It has been reported many times that viruses resistant to drugs have emerged, resulting in difficulty in subsequent treatment.
  • anti-HIV-1 therapy it is important to detect a resistant virus quickly and accurately and select the most effective drug for the virus of each individual patient.
  • Genotyping and Phenotyping drug resistance test methods have been established as criteria for effective drug selection in HIV treatment using anti-HIV-1 drugs (Non-patent Document 1).
  • Genotyping performs base sequence analysis by amplification of the HIV-1 pol gene region. However, it has often been reported that the drug resistance resulting from amino acid mutations in the gene encoding the reverse transcriptase or protease of the viral genome in the specimen does not match the pharmacological drug resistance results of the patient.
  • Phenotyping is a method that reflects the actual drug resistance of viruses. However, Phenotyping is not suitable for processing a large number of samples because it may take several months to obtain a result and requires labor and cost.
  • the anti-HIV-1 drug is mentioned as an example of the antiviral drug. Furthermore, in recent years, drug resistance has become a problem for antiviral agents (neuraminidase inhibitors) against influenza viruses.
  • HCV hepatitis C virus
  • a treatment method is selected depending on the amount and genotype of hepatitis C virus in the patient. It is known that the therapeutic effect of interferon varies depending on the genotype. Therefore, it is necessary to quickly and accurately measure the patient-specific HCV infection status.
  • Patent Document 1 JP 2002-518065 discloses “a method for detecting a nucleotide sequence variation of an HIV protease gene by amplifying a relevant portion of the HIV protease gene in a sample using a characteristic probe”. ing. However, the HIV protease activity based on the nucleotide sequence variation in the sample has not been investigated.
  • Patent Document 2 JP-A-2002-191399 (Patent Document 2) states that “an animal cell capable of expressing a secreted reporter protein by HIV-1 infection is brought into contact with a sample containing HIV-1 in the presence of a test drug. Discloses a method for testing HIV drug resistance, which comprises detecting a reporter protein secreted into the culture supernatant by infection. However, the method for detecting HIV drug resistance described in this publication is clearly different from the method of the present invention because it uses HIV-1-infected cells.
  • JP 2002-508158 discloses "a method for detecting drug resistance of HIV, characterized by identifying a colony containing a drug resistant target protein based on the reporter mechanism of the reporter protein".
  • the method for detecting HIV drug resistance described in this publication is clearly different from the method of the present invention because it uses a bacterial reporter system.
  • Special table 2002-518065 gazette JP 2002-191399 A Special Table 2002-508158 Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1-Infected Adults and Adolescents (Jan. 29, 2008: Developed by the DHHS Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents)
  • an object of the present invention is to provide an optimal method for selecting an antiviral agent for each patient in a simple, rapid and reliable manner.
  • the present inventors have used a primer that specifically recognizes a sequence not involved in the physiological activity of a virus-derived target protein gene, and has been expressed in a cell-free protein synthesis system.
  • a primer that specifically recognizes a sequence not involved in the physiological activity of a virus-derived target protein gene, and has been expressed in a cell-free protein synthesis system.
  • a method for selecting an antiviral agent suitable for a patient comprising the following steps: 1) A gene amplification solution containing at least one 5 ′ primer and one 3 ′ primer that specifically hybridizes to a sequence not involved in the physiological activity of a target protein gene derived from a virus is brought into contact with a patient-derived sample.
  • Amplifying the target protein gene derived from the virus 2) A step of bringing the target protein gene amplified in 1) into contact with a transcription solution as it is or after purification to construct a translation template for the target protein derived from the virus, 3) A step of expressing the target protein derived from the virus by bringing the translation template of the target protein constructed in 2) into contact with a cell-free protein synthesis system as it is or after purification, 4) The target protein expressed in 3) and one or more antiviral agents are contacted simultaneously or separately to detect the inhibitory effect of the one or more antiviral agents on the target protein derived from the virus.
  • Process, 5) A step of selecting an antiviral agent suitable for the patient based on the detection result of 4), And a method for selecting an antiviral agent suitable for a patient.
  • 2. The method for selecting an antiviral agent suitable for the patient according to item 1 above, wherein the cell-free protein synthesis system is a wheat germ cell-free protein synthesis system. 3.
  • 3. The method for selecting an antiviral agent suitable for the patient according to item 1 or 2, wherein the target protein derived from the virus is a protease, and the antiviral agent is a protease inhibitor. 4).
  • 4. The method for selecting an antiviral agent suitable for the patient according to any one of 1 to 3 above, wherein the step 4) uses ALPHA (amplified luminescence proximity homogeneous assay).
  • the method for selecting an antiviral agent suitable for the patient according to item 4 above, wherein the step 4) includes the following steps: (1) contacting a biotinylated substrate sequence, an acceptor bead capable of directly or indirectly recognizing the biotinylated substrate sequence, a donor bead bound with streptavidin, and the protease and protease inhibitor expressed in the above 3), (2) The inhibitory effect of the protease inhibitor on the protease is detected by a signal change caused by the proximity of the acceptor bead and the donor bead. 6). 6.
  • the kit of claim 9 comprising at least: (1) at least one 5 ′ primer and one 3 ′ primer that specifically hybridize to a sequence other than the sequence portion involved in the physiological activity of the target protein gene derived from the virus, (2) Extract for cell-free protein synthesis derived from eukaryotes. 11.
  • a kit for performing a method of selecting an HIV protease inhibitor suitable for a patient including: (1) primers of SEQ ID NOs: 1 to 5, (2) An extract for cell-free protein synthesis derived from wheat germ.
  • the present invention provides a method for selecting an optimal antiviral agent that is simple, quick and reliable for each patient.
  • Promoter-splitting primer for amplifying HIV protease DNA A: Schematic diagram of HIV protease DNA B: Schematic diagram of biotinylated substrate sequence (“ ⁇ ” in the figure indicates the cleavage site) Detection of HIV protease mutations in vitro using ALPHA Results of examination of optimum base mass Results of examination of optimal amount of protease Results of study on optimal amount of antiviral agent Results of selection of HIV protease inhibitors suitable for patients Results of inhibition of reverse transcriptase activity by non-nucleic acid reverse transcriptase inhibitors Results of inhibition of reverse transcriptase activity by reverse transcriptase inhibitors
  • the method for selecting an antiviral agent suitable for the patient of the present invention mainly has the following characteristics.
  • a virus-derived target protein gene is amplified using a primer that specifically recognizes a sequence not involved in the physiological activity of the virus-derived target protein gene. Thereby, it is possible to detect mutations of all amino acids involved in physiological activity.
  • the target protein gene is synthesized as a transcription template without being introduced into a vector, and is further used as a translation template to express the target protein by a cell-free protein synthesis system. Thereby, since it is not necessary to introduce
  • the inhibitory effect of the antiviral agent on the target protein is preferably detected by a homogeneous assay.
  • an antiviral agent can be selected simply, quickly and easily.
  • the antiviral agent is a nucleic acid reverse transcriptase inhibitor and the target protein is a reverse transcriptase
  • the antiviral agent can be selected regardless of the type of the nucleic acid reverse transcriptase inhibitor. .
  • the “antiviral agent” of the present invention means an agent for treating a disease caused by the presence of a virus in a patient.
  • nucleic acid reverse transcriptase inhibitors for example, nucleic acid reverse transcriptase inhibitors, non-nucleic acid reverse transcriptase inhibitors, HIV-1 infection treatment drugs, protease inhibitors, neuraminidase inhibitors, influenza treatment drugs, HBV treatment drugs, HCV treatment drugs, etc.
  • the “antiviral agent” of the present invention also covers candidate antiviral agents in the research stage or clinical trial stage that are not marketed at this stage.
  • target protein means a virus-derived protein involved in a disease in a patient.
  • virus-derived protein involved in a disease in a patient.
  • HIV protease in HIV-1 infection HIV reverse transcriptase, neuraminidase in influenza virus infection
  • RNA-dependent RNA polymerase (HCV RdRp) in hepatitis C virus infection
  • HBV polymerase (HBV pol) in hepatitis B virus infection, etc.
  • sequence not involved in physiological activity means a sequence other than the base sequence necessary for the action specific to the target protein (for example, protease reaction, reverse transcriptase reaction, polymerase reaction, etc.).
  • sample of the present invention means a biological material obtained directly from a human (or animal) infected with each virus or after culturing.
  • Biological materials include, for example, all types of sputum, bronchial lavage, blood (plasma), skin tissue, biopsy, semen, lymphocyte blood culture, colony, liquid culture, fecal sample, urine, etc. May be. Particularly preferred is blood (plasma).
  • the patient sample means a fraction containing virus RNA extracted from the patient-derived sample (either in solution or in solid state).
  • Contact in each step of the present invention means both of adding the A solution to the B solution or adding the B solution to the A solution.
  • the gene amplification solution may be added to the patient-derived sample, or the patient-derived sample may be added to the gene amplification solution.
  • the “primer” of the present invention is complementary to a nucleic acid chain to be amplified (a gene encoding a target protein derived from a virus).
  • the primer is about 3-100 nucleotides in length, preferably 5-70, more preferably 10-50.
  • the primer of the present invention is characterized in that it specifically hybridizes to a sequence other than the sequence part involved in the physiological activity of the target protein gene. As a result, all amino acid mutations involved in the physiological activity of the target protein can be detected.
  • a primer of the present invention in order to hybridize to a sequence other than the sequence part involved in physiological activity more specifically, a promoter-divided type invented by Sawazaki, one of the inventors of the present application, known per se known nested PCR. It is preferred to use primers (see: WO02 / 018586).
  • the “promoter-splitting primer” means “two types of primers (5 ′ end of the promoter) that satisfy the condition that transcription from DNA constructed using only one type of primer as the 5′-side primer does not occur.
  • a polynucleotide having a sequence complementary to a base sequence including at least a part of a promoter functional site and a polynucleotide having a sequence complementary to a base sequence including at least a part of an RNA polymerase recognition site from the 3 ′ end of the promoter) 3'-side primer "(see: Fig. 1).
  • the individual length and sequence depend on primer usage conditions such as the complexity and temperature of the required gene and ionic strength.
  • the “gene amplification solution” of the present invention means a solution containing RNA of a target protein derived from a virus in a sample as DNA by reverse transcription and further containing an essential component capable of amplifying the DNA.
  • the gene amplification solution is a solution for performing PCR, reverse transcriptase, dNTPs, polymerase, and the primers described in the above paragraph are included.
  • NASBA method Nucleic Acid Sequence Based Amplification method, Nature, 350, 91-92, 1991, Patent No. 2648802 and Patent No.
  • the steps can be greatly reduced, and a large amount of transcription template can be synthesized in a short time with a small number of steps. Become. That is, since a step for preparing a plasmid incorporating a DNA encoding a target protein is not required, the time required for ultracentrifugation for plasmid purification can be shortened.
  • the “transcription solution” of the present invention means a solution containing essential components for using the amplified target protein gene (DNA) as a translation template.
  • it is a solution containing components necessary for a transcription reaction such as RNA polymerase (for example, SP6 RNA polymerase) and a substrate for RNA synthesis (four kinds of ribonucleoside triphosphates).
  • the transcription reaction is carried out by incubating the solution at about 20 ° C. to about 60 ° C., preferably about 30 ° C. to about 42 ° C., for about 30 minutes to about 16 hours, preferably about 2 hours to about 5 hours. Is called.
  • a transcription solution after transcription containing a target protein translation template can be easily expressed by adding it to the following cell-free protein synthesis system without purification. Thereby, a large amount of target proteins can be prepared easily and rapidly.
  • the “cell-free protein synthesis system” of the present invention preferably means a system in which an extract for cell-free protein synthesis using eukaryotic wheat germ or the like is used, and this is used to express a target protein.
  • Examples of commercially available extracts for protein synthesis include Rabbit Reticulocyte Lysate System (Promega) derived from rabbit reticulocytes and Wheat Germ Expression Premium Kit (WEPRO registered trademark , Cell Free Science Co., Ltd.) derived from wheat germ.
  • the best extract to be applied to the present invention is an extract derived from wheat germ, and an extract from which a metabolite such as glucose that causes inhibition of protein synthesis in the endosperm components and germ tissue cells is further removed.
  • the extract from which the endosperm component has been substantially removed means that the deadenification rate of ribosome is 7% or less, preferably 1% or less. Further preferably, in the cell extract, sugar and phosphorylated saccharide are reduced to 10 mM or less, preferably 6 mM or less (as the glucose concentration in the extract having an absorbance of 200 OD / ml at 260 nm). A method for preparing such an extract is exemplified in WO2005 / 063979 A1.
  • Translation reaction process The amino acid, energy source, various ions, buffer solution, ATP regeneration system, nucleolytic enzyme used as a substrate in the cell extract for protein synthesis to which the translation template of the unpurified or purified target protein obtained as described above is added Add a solution (also called “translation solution”) containing components necessary or suitable for translation reaction, such as inhibitors, reducing agents, polyethylene glycol, folate, antibacterial agents, etc.
  • the translation reaction is performed by incubating for a long time.
  • the substrate amino acids are usually 20 types of L-type amino acids constituting the protein, but analogs and isomers thereof can also be used depending on the purpose.
  • ATP and / or GTP are mentioned as an energy source.
  • Examples of various ions include acetates such as potassium acetate, magnesium acetate, and ammonium acetate, and glutamates.
  • As the buffer Hepes-KOH, Tris-acetic acid or the like is used.
  • the nuclease inhibitor include ribonuclease inhibitors and nuclease inhibitors. Among these, specific examples of ribonuclease inhibitors include human placenta-derived RNase inhibitors (TOYOBO, etc.).
  • Examples of the reducing agent include dithiothreitol.
  • Antibacterial agents include sodium azide, ampicillin and the like. These addition amounts can be appropriately selected within a range that can be usually used in cell-free protein synthesis.
  • the protein synthesis reaction liquid of the following compositions is preferable.
  • a reaction solution [1,000 units / ml ribonuclease inhibitor (RNAsin) (TAKARA) with the following composition and final concentration containing 48% of the wheat germ extract described above (concentration is 200 A 260 nm units / ml).
  • the mode of addition of the translation solution can be appropriately selected according to the translation reaction system to be used.
  • the synthesis system used in the method of the present invention may be any method known per se that can be applied to the cell-free protein synthesis method.
  • the batch method ⁇ Pratt, J. M. et al. , Hames, 179-209, B. D. & Higgins, S. J., eds, IRL Press, Oxford (1984) ⁇ and the multi-layer method (WO02 / 24939).
  • Detecting the inhibitory effect of an antiviral agent on a target protein means that when the target protein gene derived from each patient is mutated, the pharmacological effect of the antiviral agent on the mutated target protein derived therefrom is directly Or it may be indirectly affected, which means confirming it.
  • the target protein is HIV protease and the antiviral agent is an HIV protease inhibitor
  • the target protein is RNA polymerase and the antiviral agent is an RNA polymerase inhibitor
  • the method for detecting the inhibitory effect is to compare the physiological activities of the target protein derived from each patient and the wild-type target protein in the presence of the antiviral agent. Specifically, it is as described below.
  • a patient with a gene amplification solution containing at least one 5 ′ primer and one 3 ′ primer that specifically hybridizes to a sequence other than the sequence part involved in the physiological activity of a protease Directly contacting the sample to amplify the protease gene;
  • the protease gene amplified in (1), as it is or after purification, is brought into contact with a transcription solution to construct a translation template for the protease;
  • a step of expressing the protease by bringing the translation template of the protease constructed in (2) into contact with a cell-free protein synthesis system as it is or after purification, (4) Protease expressed in (3) and one or more protease inhibitors ⁇ Example: RTV (ritonavir), SQV (saquinavir), NFV (nelfinavir), IDV (indina
  • the positions of fluorescence modification at both ends are not close to each other, and the fluorescence intensity increases. That is, a protease having drug resistance does not increase in fluorescence intensity as compared with a protease having no drug resistance.
  • the method for detecting the inhibitory effect of the HCV protease inhibitor on the target protein can be carried out by using a detection kit known per se using the HCV protease expressed in the same manner as described above.
  • the expressed HCV protease and one or more HCV protease inhibitors including candidate HCV protease inhibitors
  • a substrate that is fluorescently modified at both ends eg, EDANA on the N-terminal side and DABCYL on the C-terminal side
  • HCV protease is recognized and cleaved simultaneously or separately
  • the drug resistance of the patient's HCV protease is detected using fluorescence intensity as an index (see: SensoLyte TM 490 HCV Protease Assay Kit, manufacturer: ANA SPEC, Japan distributor: Funakoshi Corporation).
  • a gene comprising at least one 5 ′ primer and one 3 ′ primer that specifically hybridizes to a sequence other than the sequence part involved in the physiological activity of reverse transcriptase (eg, HIV reverse transcriptase) Amplifying the reverse transcriptase gene by contacting the amplification solution directly with the patient sample; (2) a step of bringing the reverse transcriptase gene amplified in (1) into contact with a transcription solution as it is or after purification to construct a translation template for the reverse transcriptase, (3) a step of expressing a reverse transcriptase by bringing the translation template of the reverse transcriptase constructed in (2) into contact with a cell-free protein synthesis system as it is or after purification, (4) The reverse transcriptase expressed in (3) and one or more non-nucleic acid reverse transcriptase inhibitors ⁇ eg, viramune (generic name: nevirap)
  • a gene comprising at least one 5 ′ primer and one 3 ′ primer that specifically hybridizes to a sequence other than the sequence part involved in the physiological activity of reverse transcriptase (eg, HIV reverse transcriptase) Amplifying the reverse transcriptase gene by contacting the amplification solution directly with the patient sample; (2) a step of bringing the reverse transcriptase gene amplified in (1) into contact with a transcription solution as it is or after purification to construct a translation template for the reverse transcriptase, (3) a step of expressing a reverse transcriptase by bringing the translation template of the reverse transcriptase constructed in (2) into contact with a cell-free protein synthesis system as it is or after purification, (4) Reverse transcriptase expressed in (3) and one or more nucleic acid-based reverse transcriptase inhibitors ⁇ eg zidovudine (AZT, ZDV), didanosine
  • reverse transcriptase eg, HIV reverse transcriptase
  • each nucleic acid reverse transcriptase inhibitor used in the present invention preferably uses a triphosphorylated form.
  • nucleic acid-based reverse transcriptase inhibitors become triphosphates, which are active forms, and are incorporated into viral DNA instead of dTTP, dATP, dCTP, dGTP, and the like.
  • DNA chain elongation stops and virus growth is inhibited (see Table 1 below). That is, the template to be used (single-stranded nucleic acid recognized by reverse transcriptase) varies depending on the type of nucleic acid-based reverse transcriptase inhibitor. For this reason, conventionally, templates have been constructed in accordance with the types of various nucleic acid reverse transcriptase inhibitors.
  • a single-stranded nucleic acid (template) that can be commonly used in a method for selecting various nucleic acid reverse transcriptase inhibitors suitable for patients has been newly constructed.
  • the single-stranded nucleic acid is a combination of bases arbitrarily selected from adenine, guanine, cytosine, and uracil.
  • Biotin-dATP and DIG-dCTP are also used in addition to Biotin-dUTP and DIG-dUTP as substrates in order to improve detection sensitivity.
  • a gene amplification solution containing at least one 5 ′ primer and one 3 ′ primer that specifically hybridizes to a sequence other than the sequence part involved in the physiological activity of the neuraminidase gene is directly contacted with a patient sample.
  • Amplifying the neuraminidase gene (2) A step of constructing a neuraminidase translation template by bringing the neuraminidase gene amplified in (1) into contact with a transcription solution as it is or after purification, (3) A step of expressing neuraminidase by contacting the neuraminidase translation template constructed in (2), as it is or after purification, with a cell-free protein synthesis system, (4) Neuraminidase expressed in (3) and one or more neuraminidase inhibitors ⁇ Example: zanamivir (trade name: Relenza), oseltamivir (trade name: Tamiflu) ⁇ and 2 '-(4-methylumbelliferyl) a step of performing enzymatic reaction by contacting ammonium ⁇ -DN-acetylneuraminate simultaneously or separately and detecting drug resistance of neuraminidase in the patient using the enzyme activity as an index;
  • the enzyme reaction can be determined by measuring the fluorescence intensity
  • tritiated UTP tritiated UTP
  • a polymerase without drug resistance has a reduced nucleotide (tritiated UTP) incorporation as compared with a polymerase with drug resistance (see: WO96 / 37619, WO00 / 006529).
  • the detection method includes a homogeneous assay or a heterogeneous assay.
  • the homogeneous assay is more preferable because the washing step can be omitted.
  • the homogeneous assay is selected from any one or more of the following. 1) ALPHA, 2) surface plasmon resonance method, 3) fluorescence correlation analysis method, 4) fluorescence intensity distribution analysis method, 5) FRET, 6) BRET, 7) EFC, 8) FP
  • the heterogeneous assay is selected from any one or more of the following. 1) ELISA, 2) DELFIA, 3) SPA, 4) Flash plate analysis
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • ALPHA Analog to Physical Reduction Agent
  • ALPHA Analog to Physical Reduction Agent
  • the method is an analysis method based on the movement of singlet oxygen between a donor bead and an acceptor bead which are brought close to each other. This is because upon excitation at 680 nm, the photosensitizer in the donor bead converts ambient oxygen to singlet state oxygen, which diffuses to a distance of 200 nm.
  • the chemiluminescent group in the acceptor bead transfers energy to the fluorescent acceptor in the bead and subsequently emits about 600 nm light.
  • the acceptor beads are inert substances such as glass, silica gel, and resin, and are carriers for immobilizing the biomolecules.
  • Donor beads are inert substances such as glass, silica gel, and resin, and are carriers for immobilizing streptavidin.
  • SPR Surface plasmon resonance
  • FCS Fluorescence Correlation Spectroscopy
  • FIDA Fluorescence Intensity Distribution Analysis
  • FP Fluorescence Polarization
  • the fluorescent labeling substance binds to a polymer such as an antibody or a receptor
  • the apparent molecular weight increases, so that the molecular motion decreases, and as a result, fluorescence that maintains its polarization (high degree of polarization) is emitted.
  • fluorescence maintaining the polarized light is detected.
  • EFC analysis is based on a processed ⁇ -galactosidase enzyme that consists of two fragments, an enzyme acceptor (EA) and an enzyme donor (ED). When the fragments are separated, ⁇ -galactosidase activity is lost, but when the fragments are combined, they work together (complement) to form an active enzyme.
  • EFC analysis utilizes an ED-analyte conjugate, where the analyte can be recognized by a specific binding protein such as an antibody or receptor. In the absence of a specific binding protein, the ED-analyte conjugate can supplement EA and form active ⁇ -galactosidase, generating a positive luminescent signal.
  • ⁇ BRET Bioluminescent Resonance Energy Transfer
  • the protein fragment complementation method examples include a method using a fluorescent protein monomeric Kusabira-Green (mKG).
  • the fluorescent protein monomeric Kusabira-Green (mKG) is used as follows. A protease expressed in a cell-free protein synthesis system, one or a plurality of protease inhibitors, and a fluorescent protein-modified substrate ⁇ mKG-N terminus-substrate sequence-mKG-C terminus ⁇ are contacted simultaneously or separately to increase the fluorescence intensity. As an index, drug resistance of protease derived from the patient sample is detected (see: CoralHue registered trademark Fluo-chase Kit, Amalgaam product).
  • a biotinylated substrate sequence, acceptor beads capable of directly or indirectly recognizing the biotinylated substrate, donor beads to which streptavidin is bound, expressed HIV protease and HIV protease inhibitor are introduced in vitro.
  • the substrate P2-P7: SEQ ID NO: 12
  • the donor beads and the acceptor beads cannot be brought close to each other, and the signal does not increase.
  • the substrate is not cleaved. Therefore, as shown in the upper diagram of FIG. 3, the donor beads and the acceptor beads are close to each other, and the signal rises.
  • the detection method of a signal is performed by measuring using the fluorescence intensity which an acceptor bead emits, for example.
  • the “method for selecting an antiviral agent suitable for a patient” of the present invention is performed based on the signal detection result. Specifically, the above signal detection is performed using each HIV protease inhibitor, and drug resistance profiling as shown in FIG. 7 is created. Thereby, drug resistance peculiar to each patient can be specified, and one or a plurality of HIV protease inhibitors suitable for each patient can be selected. In FIG. 7, the reaction of only one inhibitor is detected for one sample of each patient. However, naturally, the additive / synergistic effect of a plurality of inhibitors can also be detected for one sample. it can.
  • the “kit for carrying out a method for selecting an antiviral agent suitable for a patient” of the present invention specifically hybridizes at least to a sequence other than a sequence portion involved in the physiological activity of a target protein gene derived from a virus. 5 'primer and one 3' primer, and an extract for cell-free protein synthesis. Furthermore, the “kit for carrying out a method for selecting an HIV protease inhibitor suitable for a patient” includes at least a primer of SEQ ID NOs: 1 to 5 and an extract for synthesis of cell-free protein derived from wheat germ.
  • Patient samples were prepared from blood obtained from patients. Details are as follows. Viral RNA was extracted from blood obtained from an HIV-infected patient, and a buffer was added to prepare a patient sample.
  • the protease gene of the patient sample obtained in Example 1 was amplified. Specifically, a primer specifically recognizing a sequence not involved in protease activity was used. Details are as follows. 5 'primer 1 (S1-plus35-HIVpro: SEQ ID NO: 1), 5' primer 2 (deSP6-E02-S1: SEQ ID NO: 2), 5 'primer 3 (Spu: SEQ ID NO: 3), 3' primer 1 (- 10 ⁇ l gene amplification solution (1 x PCR buffer, 400 nM dNTPs, 0.025 U / ⁇ l thermostable polymerase, reverse) containing 18-HIVpro-sUTR: SEQ ID NO: 4) and 3 ′ primer 2 (sUTR-2nd: SEQ ID NO: 5) was directly introduced into each patient sample obtained in Example 1.
  • S1 is a sequence that can be easily added with various tags to the N-terminus of the target protein when added to the 5 ′ side of the gene for protein synthesis.
  • RT-PCR conditions After 30 minutes at 60 ° C, 30 cycles of (98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute) were performed.
  • a translation template was prepared from the HIV protease DNA amplified in Example 2. Details are as follows. The solution containing 30 ⁇ l of the amplified HIV protease DNA template obtained in Example 2 was added to the transcription solution ⁇ 30 ⁇ l of 5 ⁇ transcription buffer (400 mM HEPES, pH 7.6; 80 mM Magnesium acetate; 10 mM Spermidine; 50 mM DTT). ), 15 ⁇ l of 25 mM 4NTPs, 1.875 ⁇ l of RNAsin (80 Units), 1.875 ⁇ l of SP6 polymerase (80 units), 71.25 ⁇ l water ⁇ , perform a transcription reaction at 37 ° C. for 3 hours, Created.
  • 5 ⁇ transcription buffer 400 mM HEPES, pH 7.6; 80 mM Magnesium acetate; 10 mM Spermidine; 50 mM DTT).
  • 15 ⁇ l of 25 mM 4NTPs 1.875 ⁇ l of RNAsin
  • Example 3 (Expression of HIV protease) The translation template obtained in Example 3 was added to a wheat germ cell-free protein synthesis solution (see paragraph “0026”) to express HIV protease from each patient. Details are as follows. The solution containing the translation template (mRNA) obtained in Example 3 was added to a wheat germ cell-free protein synthesis system, and protein synthesis was performed at 26 ° C. for 15 to 20 hours to obtain HIV protease derived from each patient.
  • a biotinylated substrate sequence that was cleaved by the protease activity of HIV protease was generated. Details are as follows.
  • a pEU ⁇ -SP6-E01 (SEQ ID NO: 11) -GST-p2-p7 (SEQ ID NO: 12) -bls ⁇ vector having a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence recognized by HIV protease was prepared (see FIG. 2B). ).
  • a transcription template was prepared using PCR using the pEU vector as a template.
  • the transcription template was transferred to a transcription reaction solution [final concentration, 80 mM HEPES-KOH pH 7.8, 16 mM magnesium acetate, 10 mM dithiothreitol, 2 mM spermidine, 2.5 mM 4NTPs (4 types of nucleotide triphosphates), 0.8 U / ⁇ l. RNase inhibitor, 1.6 U / ⁇ l SP6 RNA polymerase] and transcription was performed at 37 ° C. for 3 hours (see Proc Natl Acad Sci USA, 2002, vol 99, p14652-14657: Sawasaki, T et al .). The total amount of the resulting mRNA pellet was added to a wheat germ cell-free protein synthesis solution (see paragraph “0026”), and protein synthesis was performed at 26 ° C. for 15 to 20 hours to obtain a biotinylated substrate sequence.
  • a transcription reaction solution [final concentration, 80 mM HEPES-KOH pH 7.8, 16 mM magnesium a
  • the protein synthesis solution (30 nM: 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 ⁇ l) and 3 ⁇ l wild type HIV protease in 15 ⁇ l reaction buffer ⁇ 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 50 mM MgCl 2 , 500 mM CH 3 COOK, 0.1 mM DTT and 1 mg / ml BSA ⁇ were incubated at 23 ° C. for 1 hour to obtain a culture solution.
  • Each culture solution is placed in a 384-well plate ⁇ reaction buffer containing 10 ⁇ l anti-GST antibody, AlphaScreen protein A conjugated Acceptor Bead (PerkinElmer) and streptavidin donor bead (PerkinElmer) in each well: OptiPlate NEW microplate) ⁇ , 23 After 1 hour incubation at 0 ° C., analysis was performed with the Alpha Quest HTS analyzer (the threshold for the positive level of interaction was set to 200 AlphaScreen units). The wild type HIV protease (35-HIVpro (WT) -18) used above was synthesized in the wheat germ cell-free system.
  • WT wild type HIV protease
  • the substrate protein amount was 0.05 to 5.0 ⁇ l, preferably 0.2 to 2.0 ⁇ l. Therefore, in Example 7 below, the substrate protein amount was set to 0.5 ⁇ l.
  • DHFR is amplified using pEU-DHFR (50 ng) as a template and using primers SPu (described above) and AODA2306 (5′-AGCGTCAGACCCCGTAGAAA) to produce a wheat germ cell-free protein synthesis solution (see paragraph “0026” )).
  • Example 9 (Examination of optimal antiviral concentration) The optimal antiviral agent concentration in ALPHA screening in the cell-free protein synthesis system used in Example 9 below was examined. Details are as follows.
  • the protein synthesis solution and 3 ⁇ l wild-type HIV protease were incubated at 23 ° C. for 1 hour in 15 ⁇ l reaction buffer ⁇ 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 50 mM MgCl 2 , 500 mM CH 3 COOK, 0.1 mM DTT and 1 mg / ml BSA ⁇ .
  • Each culture solution is contained in a 384-well plate (each containing a reaction buffer (10 ⁇ l), anti-GST antibody (GE Healthcare), AlphaScreen protein A conjugated Acceptor Bead (PerkinElmer) and streptavidin donor bead (PerkinElmer)) ⁇ I put it in. Furthermore, HIV protease inhibitors (inhibitors A, B, C, D, E, and F) at various concentrations (1, 10, 100, 1000, and 10000 nM) are placed in the reaction buffer and incubated at 23 ° C. for 1 hour. And then analyzed with the Alpha Quest HTS analyzer (the threshold for the positive level of interaction was set to 200 AlphaScreen units).
  • Example 9 the concentration of inhibitor A is 100 nM, the concentration of inhibitor B is 1 ⁇ M, the concentration of inhibitor C is 100 nM, the concentration of inhibitor D is 100 nM, the concentration of inhibitor E is 100 nM, and the concentration of inhibitor F The concentration was set to 1 ⁇ M.
  • DMSO which is not an HIV protease inhibitor, did not detect an inhibitory effect at any concentration.
  • reaction buffer 15 ⁇ l reaction buffer ⁇ 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 50 mM MgCl 2 , 500 mM CH 3 COOK, 0.1 mM DTT and 1 mg / ml BSA containing a biosylated substrate sequence (30 nM: 0.5 ⁇ l) ⁇ At 23 ° C. for 1 hour to obtain a culture solution.
  • Each culture solution is contained in a 384-well plate (with a reaction buffer (10 ⁇ l), anti-GST antibody (GE Healthcare), AlphaScreen protein A conjugated Acceptor Bead (PerkinElmer) and streptavidin donor bead (PerkinElmer)) in each well ⁇ . I put it in.
  • each of post-translational protein synthesis solutions (0001 to 0016) containing HIV protease from 16 HIV-infected patients, and inhibitor A (100 nM), inhibitor B (1 ⁇ M), inhibitor C (100 nM), inhibition Agent D (100 nM), Inhibitor E (100 nM), or Inhibitor F (1 ⁇ M) was placed in a reaction buffer, incubated at 23 ° C. for 1 hour, and then analyzed by Alpha Quest HTS analyzer (positive level of interaction) was set to 200 AlphaScreen units).
  • Reverse transcriptase HIV-RT ⁇ HIV-1 reverse transcriptase (p51, p66) was prepared at a ratio of 1: 1 in the same manner as described in Example 4 ⁇ Reverse transcriptase inhibitor: EFV (0.01nM-1000nM)
  • Reverse transcriptase inhibitor EFV (0.01nM-1000nM
  • Substrate solution DIG-dUTP (75 nM), Biotin-dUTP (75 nM), dTTP (10 ⁇ M) in 50 mM Tris-HCl (pH 7.8)
  • Incubation buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 319 mM potassium chloride, 33 mM magnesium chloride, 11 mM DTT Template (Template / primer hybrid): PolyA, oligo (dT) 15 (9A260 / ml)
  • Lysis buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 80 mM potassium chloride, 2.5 mM DTT, 0.75 mM EDTA, 0.5% Triton X-100
  • AlphaScreen TM DIG detection kit No.6760604C (manufactured by PerkinElmer) Beads mix: Streptavidin Donor beads 0.1 ⁇ l, anti-Digoxin / Digoxigenin (DIG) Acceptor Beads 0.1 ⁇ l, 1mg / ml BSA, 1 * PBS
  • the inhibitory effect of various nucleic acid reverse transcriptase inhibitors was confirmed. Details are as follows.
  • the template used is a 6-mer single-stranded nucleic acid (the six nucleic acids are arbitrarily selected from any of adenine, guanine, cytosine, and uracil).
  • the template used as a comparative control is PolyA, oligo (dT) 15 (9A260 / ml).
  • Reverse transcriptase HIV-RT ⁇ HIV-1 reverse transcriptase (p51, p66) was prepared at a ratio of 1: 1 in the same manner as described in Example 4 ⁇
  • Nucleic acid reverse transcriptase inhibitors AZTTP (0,10 nM, 1000 nM), ddCTP (0,10 nM, 1000 nM), 3TCTP (0,10 nM, 1000 nM), Tenofovir.DP (0,10 nM, 1000 nM)
  • Substrate solutions DIG-dUTP (1 ⁇ M), DIG-dCTP (1 ⁇ M), Biotin-dUTP (1 ⁇ M), Biotin-dATP (1 ⁇ M), dTTP (1 ⁇ M), dATP (1 ⁇ M), dCTP (1 ⁇ M), dGTP (1 ⁇ M) in 50 mM Tris-HCl (pH 7.8) Incuba
  • Lysis buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 80 mM potassium chloride, 2.5 mM DTT, 0.75 mM EDTA, 0.5% Triton X-100 Reverse transcriptase assay kit: No.11 468 120 910 (Roche) POD-labeled anti-digoxigenin ⁇ Anti-DIG-POD working dilution (200mU / ml) ⁇ : 50 ⁇ l anti-DIG-POD (10U) and 4.95ml of conjugate dilution buffer ABTS substrate (ABTS substrate solution containing substrate enhancer): 1 mg of the substrate enhancer was dissolved in 1 ml of the substrate solution obtained by dissolving 1 ABTS tablet in 5 ml of the substrate buffer.
  • nucleic acid and non-nucleic acid reverse transcriptase inhibitors suitable for patients can be selected.
  • the present invention provides a simple method for selecting an optimal antiviral agent for each patient.

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Abstract

　各患者における簡便、迅速かつ信頼性の高い抗ウイルス剤の選択方法を提供すること。 　ウイルス由来の標的タンパク質遺伝子の生理活性に関与しない配列を特異的に認識するプライマーを使用しかつ無細胞タンパク質合成系により発現させた標的タンパク質に対する抗ウイルス剤の阻害効果を検出することにより各患者における最適な抗ウイルス剤の選択方法に関する。

Description

最適な抗ウイルス剤の選択方法
　本発明は、最適な抗ウイルス剤の選択方法に関する。より詳しくは、無細胞タンパク質合成系を利用して発現させたウイルス由来の標的タンパク質に対する抗ウイルス剤の阻害効果を検出することによる簡便、迅速かつ信頼性の高い各患者での最適な抗ウイルス剤の選択方法に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところ、日本特許出願番号2008-154747からの優先権を請求する。
　ヒト免疫不全ウイルス（HIV）はすでに全世界の１％の人が感染したという証拠があり、今も着実に感染が広がっている。AIDS epidemic update (Dec. 2007: UNAIDS/WHO)によれば、エイズの病原ウイルスであるHIVの感染者は世界中で3320万人であり、年間の新規感染者が250万人、感染が原因の死亡が210万人、と報告されている。わが国では欧米諸国に比較し、感染者の数もエイズ患者の数も少ないためか教育効果が十分に上がらず、世界の先進国の中では例外的に今も感染者の増加に歯止めがかかっていない。最近のHAART療法の確立により、患者の生命予後は改善したものの、一方で長期療養患者が増加し、既存の薬剤に対する耐性の問題や免疫再構築症候群などの新たな合併症も出現した。
　HIVの治療方法としてHAART療法｛アジドチミジン(AZT)などの逆転写酵素阻害剤とプロテアーゼ阻害剤の、２～４剤を併用する強化治療法｝の確立によりエイズの発症を遅らせることが可能となってきている。しかし、これらの薬剤においても、耐性ウイルスの出現や副作用により、治療効果にも限界が見られる場合が多くなっている。より詳しくは、ウイルス特性である、プロテアーゼや逆転写酵素への変異導入率の高さから、投与薬剤に対する耐性ウイルスが容易に出現し、不用意な薬剤の選択により、同一作用機序に基づく複数薬剤に耐性のウイルスを出現させ、以後の治療に困難をきたすことも多く報告されている。
　すなわち、抗ウイルス剤（抗HIV-1療法）を用いた治療では、迅速かつ正確に耐性ウイルスの検出を行い、個々の患者のウイルスに最も効果的な薬剤を選択することが重要である。
　抗HIV-1薬剤を用いたHIV治療法において、有効な薬剤選択の判定基準としてGenotypingとPhenotypingの薬剤耐性試験法が確立されている（非特許文献１）。
　GenotypingはHIV-1 pol遺伝子領域の増幅による塩基配列解析を行う。しかしながら、検体中のウイルスゲノムの逆転写酵素あるいはプロテアーゼをコードする遺伝子のアミノ酸変異による薬剤耐性と、患者の薬理学的な薬剤耐性の成績が一致しないことが多々報告されている。
　Phenotypingは実際のウイルスの薬剤耐性を反映する方法である。しかし、Phenotypingは、結果が得られるのに数ヶ月かかることがあり、且つ労力、費用を要することから多検体を処理するには不向きである。
　一方、上記では、抗ウイルス剤の一例として抗HIV-1薬剤について言及した。さらに、近年、インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス剤（ノイラミニダーゼ阻害剤）についても薬剤耐性が問題となりつつある。
　また、HCV（C型肝炎ウイルス）の治療では、患者体内のC型肝炎ウイルスの量と遺伝子型により治療方法が選択される。該遺伝子型によりインターフェロンの治療効果が異なることが知られている。よって、患者特有のHCV感染状態を迅速かつ正確に測定する必要がある。
　以上により、上記問題点を克服するために、いくつかの特許出願がされている（参照：下記特許出願）。
　特表2002-518065（特許文献１）は、「特徴的なプローブを使用して試料中のHIVプロテアーゼ遺伝子の関連部分を増幅することによりHIVプロテアーゼ遺伝子の塩基配列変異を検出する方法」を開示している。
　しかし、試料中の塩基配列変異に基づくHIVプロテアーゼ活性を調べていない。
　特開2002-191399（特許文献２）は、「HIV-1感染により分泌型レポータータンパク質を発現することができる動物細胞を被験薬剤の存在下においてHIV-1を含む試料と接触させ、HIV-1感染により培養上清に分泌されるレポータータンパク質を検出することを特徴とする、HIVの薬剤耐性の試験方法」を開示している。
　しかし、本公報に記載のHIV薬剤耐性の検出方法は、HIV-1感染細胞を使用するので、本発明の方法とは明らかに異なる。
　特表2002-508158（特許文献３）は、「レポータータンパク質のレポーター機構に基づく薬剤耐性標的タンパク質を含むコロニーを同定することを特徴とするHIVの薬剤耐性の検出方法」を開示している。
　しかし、本公報に記載のHIV薬剤耐性の検出方法は、細菌レポーター系を使用するので、本発明の方法とは明らかに異なる。
特表2002-518065号公報 特開2002-191399号公報 特表2002-508158号公報 Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1-Infected Adults and Adolescents (Jan. 29, 2008: Developed by the DHHS Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents)
　本発明は、上記した問題点を解決することを解決すべき課題とした。より詳しくは、本発明は、簡便、迅速かつ信頼性の高い各患者での最適な抗ウイルス剤の選択方法を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、ウイルス由来の標的タンパク質遺伝子の生理活性に関与しない配列を特異的に認識するプライマーを使用し、かつ無細胞タンパク質合成系で発現させた標的タンパク質に対する抗ウイルス剤の阻害効果を検出することにより、各患者における抗ウイルス剤の薬剤耐性の検出が簡便、迅速かつ信頼性が高く行えることを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明は、個別患者に最適な、テーラーメイド的な抗ウイルス薬剤の選択方法を提供する。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
　１．以下の工程を含む、患者に適した抗ウイルス剤の選択方法であって、
　１）ウイルス由来の標的タンパク質遺伝子の生理活性に関与しない配列に特異的にハイブダイズする、少なくとも１個の５'プライマーと１個の３'プライマー、を含む遺伝子増幅溶液を患者由来の試料に接触させて、該ウイルス由来の標的タンパク質遺伝子を増幅する工程、
　２）１）で増幅した標的タンパク質遺伝子を、そのまま又は精製後に、転写溶液に接触させて、該ウイルス由来の標的タンパク質の翻訳鋳型を構築する工程、
　３）２）で構築した標的タンパク質の翻訳鋳型を、そのまま又は精製後に、無細胞タンパク質合成系に接触させて、該ウイルス由来の標的タンパク質を発現させる工程、
　４）３）で発現させた標的タンパク質と、１又は複数の抗ウイルス剤を、同時又は別個に接触させて、該ウイルス由来の標的タンパク質に対する該１又は複数の抗ウイルス剤の阻害効果を検出する工程、
　５）４）の検出結果を基にして、該患者に適した抗ウイルス剤を選択する工程、
　を特徴とする患者に適した抗ウイルス剤の選択方法。
　２．前記無細胞タンパク質合成系が、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系である前項１の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法。
　３．前記ウイルス由来の標的タンパク質がプロテアーゼであり、前記抗ウイルス剤がプロテアーゼ阻害剤であることを特徴とする前項１又は２の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法。
　４．前記４）の工程が、ALPHA（増幅発光近接ホモジニアスアッセイ）を使用する前項１～３のいずれか１の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法。
　５．前記４）の工程が、以下の工程を含む前項４の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法；
　（１）ビオチン化基質配列、該ビオチン化基質配列を直接的又は間接的に認識可能なアクセプタービーズ、ストレプトアビジンが結合したドナービース、並びに前記３）で発現したプロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害剤を接触させ、
　（２）アクセプタービーズとドナービーズの近接によるシグナル変化により、プロテアーゼに対するプロテアーゼ阻害剤の阻害効果を検出する。
　６．前記ウイルス由来の標的タンパク質がHIVプロテアーゼであり、前記プロテアーゼ阻害剤がHIVプロテアーゼ阻害剤であることを特徴とする前項１～５のいずれか１の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法。
　７．前記ウイルス由来の標的タンパク質が逆転写酵素であり、前記抗ウイルス剤が逆転写酵素阻害剤であることを特徴とする前項１又は２の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法。
　８．前記抗ウイルス剤が核酸系逆転写酵素阻害剤であることを特徴とする前項７の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法。
　９．前項１～８のいずれか１の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法を実施するためのキット。
　１０．少なくとも以下を含む請求項９のキット；
　（１）ウイルス由来の標的タンパク質遺伝子の生理活性に関与する配列部分以外の配列に特異的にハイブダイズする、少なくとも１個の５'プライマーと１個の３'プライマー、
　（２）真核生物由来の無細胞タンパク質合成用抽出液。
　１１．少なくとも以下を含む前項８の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法を実施するためのキット；
　（１）逆転写酵素遺伝子の生理活性に関与する配列部分以外の配列に特異的にハイブダイズする、少なくとも１個の５'プライマーと１個の３'プライマー、
　（２）真核生物由来の無細胞タンパク質合成用抽出液、
　（３）該逆転写酵素により認識される、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルから任意に選択される塩基を組み合わせた配列から成る一本鎖核酸。
　１２．以下を含む患者に適したHIVプロテアーゼ阻害剤の選択方法を実施するためのキット；
　（１）配列番号１～５のプライマー、
　（２）コムギ胚芽由来の無細胞タンパク質合成用抽出液。
　本発明は、各患者における簡便、迅速かつ信頼性の高い最適な抗ウイルス剤の選択方法を提供する。
HIVプロテアーゼDNAを増幅するためのプロモーター分断型プライマー Ａ：HIVプロテアーゼDNAの模式図　　　　　Ｂ：ビオチン化基質配列の模式図（図中の「↓」は、切断箇所を示す） ALPHAを使用したin vitroでのHIVプロテアーゼ変異の検出 最適な基質量の検討結果 最適なプロテアーゼ量の検討結果 最適な抗ウイルス剤量の検討結果 患者に適したHIVプロテアーゼ阻害剤の選択結果 非核酸系逆転写酵素阻害剤による逆転写酵素の活性阻害結果 逆転写酵素阻害剤による逆転写酵素の活性阻害結果
発明を実施するための形態
　本発明の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法は、主に以下の特徴を有する。
（１）ウイルス由来の標的タンパク質遺伝子の生理活性に関与しない配列を特異的に認識するプライマーを使用して、ウイルス由来の標的タンパク質遺伝子を増幅する。これにより、生理活性に関与するすべてのアミノ酸の変異を検出することができる。
（２）上記標的タンパク質遺伝子を、ベクターに導入することなく転写鋳型として合成し、さらに翻訳鋳型にして、無細胞タンパク質合成系により、標的タンパク質を発現する。これにより、ベクターに導入する必要がないので、簡便かつ迅速に標的タンパク質を発現することができる。
（３）上記標的タンパク質に対する抗ウイルス剤の阻害効果を好ましくはホモジニアスアッセイで検出する。これにより、すべての工程で精製を必要としないので、簡便、迅速かつ容易に抗ウイルス剤を選択することができる。
（４）上記抗ウイルス剤が核酸系逆転写酵素阻害剤であり、上記標的タンパク質が逆転写酵素の場合、該核酸系逆転写酵素阻害剤の種類に関係なく抗ウイルス剤を選択することができる。
（抗ウイルス剤）
　本発明の「抗ウイルス剤」は、患者体内においてウイルスの存在により引き起こされる疾病を治療するための薬剤を意味する。
　例えば、HIV-1感染症治療薬である核酸系逆転写酵素阻害剤、非核酸系逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、インフルエンザ治療薬であるノイラミニダーゼ阻害剤、HBV治療薬、HCV治療薬等が挙げられる。
　さらに、本発明の「抗ウイルス剤」は、現段階で上市されていない、研究段階又は臨床試験段階の候補抗ウイルス剤も対象とする。
（標的タンパク質）
　本発明の「標的タンパク質」は、患者体内において疾病に関与するウイルス由来のタンパク質を意味する。
　例えば、HIV-1感染におけるHIVプロテアーゼ、HIV逆転写酵素、インフルエンザウイルス感染におけるノイラミニダーゼ、C型肝炎ウイルス感染におけるRNA依存RNA ポリメラーゼ（HCV RdRp）、B型肝炎ウイルス感染におけるHBVポリメラーゼ（HBV pol）等が挙げられる。
　なお、「生理活性に関与しない配列」とは、標的タンパク質固有の作用（例えば、プロテアーゼ反応、逆転写酵素反応、ポリメラーゼ反応等）に必要な塩基配列以外の配列を意味する。
（試料）
　本発明の「試料」は、各ウイルスに感染したヒト（または動物）から直接的に、あるいは培養後に得られる生物学的材料を意味する。生物学的材料は、例えば、あらゆる種類の痰、気管支洗浄物、血液（血漿）、皮膚組織、生検物、精液、リンパ球血液培養物、コロニー、液体培養物、糞試料、尿等であってもよい。特に好ましくは、血液（血漿）である。
　さらに、患者試料とは、患者由来の上記試料から抽出したウイルスRNAを含む画分（溶液又は固体のいずれの状態でも良い）を意味する。
（接触）
　本発明の各工程における「接触」とは、Ａ溶液をＢ溶液に添加する、又はＢ溶液をＡ溶液に添加する、の両方を意味する。
　例えば、遺伝子増幅溶液を患者由来の試料に接触させる場合には、遺伝子増幅溶液を患者由来の試料に添加しても、又は患者由来の試料を遺伝子増幅溶液に添加しても良い。
（プライマー）
　本発明の「プライマー」は、増幅されるべき核酸鎖（ウイルス由来の標的タンパク質をコードする遺伝子）に対して相補的なものをいう。プライマーは約3～100ヌクレオチド、好ましくは5～70、より好ましくは10～50の長さである。
　なお、本発明のプライマーは、標的タンパク質遺伝子の生理活性に関与する配列部分以外の配列に特異的にハイブダイズすることを特徴とする。これにより、標的タンパク質の生理活性に関与するすべてのアミノ酸の変異を検出することができる。
　また、本発明のプライマーとして、より特異的に生理活性に関与する配列部分以外の配列にハイブダイズさせるために、自体公知のnested PCRや本出願の発明者の一人である澤崎が発明したプロモーター分断型プライマーを使用することが好ましい（参照：WO02/018586）。
　なお、「プロモーター分断型プライマー」とは、「５'側プライマーとして、１種類のプライマーのみを用いて構築されたＤＮＡからの転写が起こらないという条件を満たす２種類のプライマー（プロモーターの５'末端から少なくともプロモーター機能部位の一部分を含む塩基配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドと、プロモーターの３'末端から少なくともＲＮＡポリメラーゼ認識部位の一部分を含む塩基配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチド）と３'側プライマー」から構成される（参照：図１）。
　なお、個々の長さおよび配列は、必要遺伝子の複雑性および温度ならびにイオン強度のごときプライマー使用条件に依存する。
（遺伝子増幅溶液）
　本発明の「遺伝子増幅溶液」は、試料中のウイルス由来の標的タンパク質のRNAを逆転写によりDNAにして、さらに該DNAを増幅させることができる必須の成分が含まれる溶液を意味する。
　例えば、遺伝子増幅溶液がPCRを実行するための溶液であれば、逆転写酵素、dNTPs、ポリメラーゼ、上記段落に記載のプライマーを含む。
　また、DNAを増幅するにはPCR以外では、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence Based Amplification 法、Nature,350,91-92,1991、特許第 2648802号公報及び特許第 2650159号公報記載）及びＬＡＭＰ法（Loop‐mediated isothermal amplification of DNA増幅法、特開2001-242169号公報）などを利用することができる。
　加えて、本発明では、逆転写工程とDNA増幅工程を別途分けて行うこともできる。さらに、転写鋳型構築工程とDNA増幅工程を別途分けて行うこともできる。
　なお、本発明では、発現プラスミドに導入しないので、大腸菌形質転換工程、鋳型DNAが導入されたクローンの選定工程を必要としない。さらに、一旦プラスミドを大量調製して、これを制限酵素処理して転写鋳型を得る方法と比較して、工程を格段に省略でき、少ない工程数で短時間での転写鋳型の大量合成が可能となる。すなわち、標的タンパク質をコードするDNAを組み込んだプラスミドを調製する工程を必要としないので、プラスミド精製のための超遠心に要する時間を短縮することができる。
（転写溶液）
　本発明の「転写溶液」は、増幅した標的タンパク質遺伝子（DNA）を翻訳鋳型にするための必須の成分が含まれる溶液を意味する。
　例えば、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ等）やＲＮＡ合成用の基質（４種類のリボヌクレオシド３リン酸）等の転写反応に必要な成分を含む溶液である。なお、転写反応は、約２０℃～約６０℃、好ましくは約３０℃～約４２℃で、約３０分間～約１６時間、好ましくは約２時間～約５時間該溶液をインキュベートすることにより行われる。
　なお、本発明では、標的タンパク質の翻訳鋳型を含む転写後の転写溶液は、精製することなく、下記無細胞タンパク質合成系に添加することにより、標的タンパク質を容易に発現することができる。これにより、簡便かつ迅速に大量の標的タンパク質を調製することができる。
（無細胞タンパク質合成系）
　本発明の「無細胞タンパク質合成系」は、好ましくは真核生物由来のコムギ胚芽等を用いた無細胞タンパク質合成用抽出液が用いられ、これを使用して標的タンパク質を発現する系を意味する。
　市販のタンパク質合成用抽出液としては、ウサギ網状赤血球由来のRabbit Reticulocyte Lysate System（Promega社）やコムギ胚芽由来のWheat Germ Expression Premium Kit（ WEPRO登録商標、株式会社セルフリーサイエンス）等が挙げられる。
　本発明に適用される最良の抽出液は、コムギ胚芽由来の抽出液であり、さらに混入する胚乳成分や胚芽組織細胞中のタンパク質合成阻害をもたらすグルコースなどの代謝物質が実質的に除去された抽出液である。なお、胚乳成分が実質的に除去された抽出液とは、リボソームの脱アデニン化率が７％以下、好ましくは１％以下になっていることを意味する。さらに、好適には、細胞抽出液は、糖、リン酸化糖が10mM以下、好ましくは6mM以下まで低減されている（260nmにおける吸光度200OD/mlの抽出液中のグルコース濃度として）。このような抽出液の調製方法は、WO2005/063979 A1号公報に例示される。
（翻訳反応工程）
　上記のようにして得られる未精製又は精製後の標的タンパク質の翻訳鋳型を添加したタンパク質合成用細胞抽出液に、基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ATP再生系、核酸分解酵素阻害剤、還元剤、ポリエチレングリコール、葉酸塩、抗菌剤等の、翻訳反応に必要もしくは好適な成分を含有する溶液（「翻訳溶液」ともいう）を添加して、翻訳反応に適した温度で適当な時間インキュベートすることにより翻訳反応を行う。基質となるアミノ酸は、通常、タンパク質を構成する２０種類のL型アミノ酸であるが、目的に応じてそのアナログや異性体を用いることもできる。また、エネルギー源としては、ＡＴＰ及び／又はＧＴＰが挙げられる。各種イオンとしては、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸アンモニウム等の酢酸塩、グルタミン酸塩等が挙げられる。緩衝液としては、Hepes－KOH、Tris－酢酸等が用いられる。核酸分解酵素阻害剤としては、リボヌクレアーゼインヒビターや、ヌクレアーゼインヒビター等が挙げられる。このうち、リボヌクレアーゼインヒビターの具体例としては、ヒト胎盤由来のRNase inhibitor（TOYOBO社製等）等が用いられる。還元剤としては、ジチオスレイトール等が挙げられる。抗菌剤としては、アジ化ナトリウム、アンピシリン等が挙げられる。これらの添加量は、無細胞タンパク質合成において通常使用され得る範囲で適宜選択することができる。
　また、以下のような組成のタンパク質合成反応液が好ましい。
　上記記載のコムギ胚芽抽出液を全容量の４８％容（濃度は、200Ａ260ｎｍ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）含む、次のような組成および終濃度の反応液〔１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ）（ＴＡＫＡＲＡ社製）、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、９５ｍＭ 酢酸カリウム、２．６５ｍＭ 酢酸マグネシウム、２．８５ｍＭ ジチオスレイトール、０．５ｍｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ、１．２ｍＭ アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、０．２５ｍＭ グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、１６ｍＭ クレアチンリン酸、０．３８ｍＭ スペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）〕。
　翻訳溶液の添加の態様は、用いる翻訳反応系に応じて適宜選択することができる。本発明の方法に用いられる合成系は、無細胞タンパク質合成法に適用し得る自体公知のいずれの方法であってもよく、例えば、バッチ法｛Pratt,J. M. et al., Transcription and Translation, Hames, 179-209, B. D. &Higgins, S. J., eds、,IRL Press, Oxford(1984)｝や重層法（WO02/24939号）等が挙げられる。
（標的タンパク質に対する抗ウイルス剤の阻害効果を検出する）
　本発明の「標的タンパク質に対する抗ウイルス剤の阻害効果を検出する」とは、各患者由来の標的タンパク質遺伝子が変異している場合、それに由来した変異標的タンパク質に対する抗ウイルス剤の薬理効果が直接的又は間接的に影響を受ける可能性があり、それを確認することを意味する。
　例えば、標的タンパク質がHIVプロテアーゼであり抗ウイルス剤がHIVプロテアーゼ阻害剤の場合では、HIVプロテアーゼ阻害剤が各患者由来のHIVプロテーゼの基質認識活性を阻害できるかどうかを確認することである。
　さらに、標的タンパク質がRNAポリメラーゼであり抗ウイルス剤がRNAポリメラーゼ阻害剤の場合では、RNAポリメラーゼ阻害剤が各患者由来のRNAポリメラーゼのヌクレオチド取り込み活性を阻害できるかどうかを確認することである。
（標的タンパク質に対する抗ウイルス剤の阻害効果を検出する方法）
　上記の阻害効果を検出する方法とは、該抗ウイルス剤の存在下において、各患者由来の標的タンパク質と野生型標的タンパク質の生理活性を比較することである。具体的には、以下に記載の通りである。
（標的タンパク質に対するプロテアーゼ阻害剤の阻害効果を検出する方法）
（１）プロテアーゼ（例：HIVプロテアーゼ）の生理活性に関与する配列部分以外の配列に特異的にハイブダイズする、少なくとも１個の５'プライマーと１個の３'プライマー、を含む遺伝子増幅溶液を患者試料に直接接触させて、該プロテアーゼ遺伝子を増幅する工程、
（２）（１）で増幅したプロテアーゼ遺伝子を、そのまま又は精製後に、転写溶液に接触させて、該プロテアーゼの翻訳鋳型を構築する工程、
（３）（２）で構築したプロテアーゼの翻訳鋳型を、そのまま又は精製後に、無細胞タンパク質合成系に接触させて、プロテアーゼを発現させる工程、
（４）（３）で発現させたプロテアーゼと１又は複数のプロテアーゼ阻害剤｛例：ＲＴＶ（ritonavir）、ＳＱＶ（saquinavir）、ＮＦＶ（nelfinavir）、ＩＤＶ（indinavir）、ＡＰＶ（amprenavir）、ＬＰＶ（ritonavir）｝並びに両端に蛍光修飾（FRET）した基質（HIVプロテアーゼにより認識されかつ切断される：配列番号１２）を同時又は別個に接触させて、蛍光強度を指標として、該患者由来のプロテアーゼの薬剤耐性を検出する工程。
　なお、基質はプロテアーゼにより切断されると、両端の蛍光修飾の位置が近接しなくなり、蛍光強度が上昇する。すなわち、薬剤耐性を持つプロテアーゼは、薬剤耐性のないプロテアーゼと比較して、蛍光強度が上昇しない。
　また、標的タンパク質に対するHCVプロテアーゼ阻害剤の阻害効果を検出する方法では、上記同様に発現させたHCVプロテアーゼを使用して自体公知の検出キットを用いることで行うことができる。
　例えば、発現させたHCVプロテアーゼと１又は複数のHCVプロテアーゼ阻害剤（候補HCVプロテアーゼ阻害剤も含む）並びに両端に蛍光修飾（例：N末端側にEDANA、Ｃ末端側にDABCYL）した基質（例：HCVプロテアーゼにより認識されかつ切断される）を同時又は別個に接触させて、蛍光強度を指標として、該患者のHCVプロテアーゼの薬剤耐性を検出する（参照：SensoLyteTM 490 HCV Protease Assay Kit、製造元：ANA SPEC、日本販売元：フナコシ株式会社）。
（標的タンパク質に対する非核酸系逆転写酵素阻害剤の阻害効果を検出する方法）
（１）逆転写酵素（例：HIV逆転写酵素）の生理活性に関与する配列部分以外の配列に特異的にハイブダイズする、少なくとも１個の５'プライマーと１個の３'プライマー、を含む遺伝子増幅溶液を患者試料に直接接触させて、該逆転写酵素遺伝子を増幅する工程、
（２）（１）で増幅した逆転写酵素遺伝子を、そのまま又は精製後に、転写溶液に接触させて、該逆転写酵素の翻訳鋳型を構築する工程、
（３）（２）で構築した逆転写酵素の翻訳鋳型を、そのまま又は精製後に、無細胞タンパク質合成系に接触させて、逆転写酵素を発現させる工程、
（４）（３）で発現させた逆転写酵素と１又は複数の非核酸系逆転写酵素阻害剤｛例：ビラミューン（一般名：ネビラピン）、デラビルジン、エファビレンツ｝をPoly-rAを固定したプレートに同時又は別個に添加する。さらにAP標識抗 BrdU 抗体を該プレートに添加して、pNPPを反応させ、吸光度（405nm）を指標として、該患者の非核酸系逆転写酵素の薬剤耐性を検出する工程。
　なお、薬剤耐性を持つ逆転写酵素は、薬剤耐性のない逆転写酵素と比較して、吸光度が低下する。
（標的タンパク質に対する核酸系逆転写酵素阻害剤の阻害効果を検出する方法）
（１）逆転写酵素（例：HIV逆転写酵素）の生理活性に関与する配列部分以外の配列に特異的にハイブダイズする、少なくとも１個の５'プライマーと１個の３'プライマー、を含む遺伝子増幅溶液を患者試料に直接接触させて、該逆転写酵素遺伝子を増幅する工程、
（２）（１）で増幅した逆転写酵素遺伝子を、そのまま又は精製後に、転写溶液に接触させて、該逆転写酵素の翻訳鋳型を構築する工程、
（３）（２）で構築した逆転写酵素の翻訳鋳型を、そのまま又は精製後に、無細胞タンパク質合成系に接触させて、逆転写酵素を発現させる工程、
（４）（３）で発現させた逆転写酵素と１又は複数の核酸系逆転写酵素阻害剤｛例：ジドブジン(AZT,ZDV)、ジダノシン(ddI)、ザルシタビン（ddC）等｝並びに各種の核酸（蛍光修飾した核酸も含む）を、テンプレートを固定したプレートに同時又は別個に添加する。さらにAP標識抗 BrdU 抗体を該プレートに添加して、pNPPを反応させ、吸光度（405nm）を指標として、該患者の核酸系逆転写酵素の薬剤耐性を検出する工程。
　なお、薬剤耐性を持つ逆転写酵素は、薬剤耐性のない逆転写酵素と比較して、吸光度が低下する（参照：AIDS 2003, 17:1463-1471）。
　加えて、本発明で使用する各核酸系逆転写酵素阻害剤は、好ましくは３リン酸化体を使用する。
（各種の核酸系逆転写酵素阻害剤の阻害効果を検出する方法）
　各種の核酸系逆転写酵素阻害剤は、活性型である３リン酸型になり、それぞれdTTP、dATP、dCTP、dGTP等の代わりにウイルスDNA中に取り込まれる。そして、取り込まれた結果、DNA鎖伸長が停止してウイルスの増殖が阻害される（下記表１参照）。すなわち、核酸系逆転写酵素阻害剤の種類によって、使用するテンプレート（逆転写酵素によって認識される一本鎖核酸）が異なる。そのため、従来では、各種の核酸系逆転写酵素阻害剤の種類に合わせたテンプレートを構築していた。
　本発明では、患者に適した各種の核酸系逆転写酵素阻害剤の選択方法に共通に使用できる一本鎖核酸（テンプレート）を新たに構築した。該一本鎖核酸は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルから任意に選択された塩基を組み合わせたものである。
　さらに、本発明では、好ましくは、検出感度を向上させるために、基質としてのBiotin-dUTP及びDIG-dUTPに加えて、Biotin-dATP及びDIG-dCTPも使用する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（標的タンパク質に対するノイラミニダーゼ阻害剤の阻害効果を検出する方法）
（１）ノイラミニダーゼ遺伝子の生理活性に関与する配列部分以外の配列に特異的にハイブダイズする、少なくとも１個の５'プライマーと１個の３'プライマー、を含む遺伝子増幅溶液を患者試料に直接接触させて、該ノイラミニダーゼ遺伝子を増幅する工程、
（２）（１）で増幅したノイラミニダーゼ遺伝子を、そのまま又は精製後に、転写溶液に接触させて、該ノイラミニダーゼの翻訳鋳型を構築する工程、
（３）（２）で構築したノイラミニダーゼの翻訳鋳型を、そのまま又は精製後に、無細胞タンパク質合成系に接触させて、ノイラミニダーゼを発現させる工程、
（４）（３）で発現させたノイラミニダーゼと１又は複数のノイラミニダーゼ阻害剤｛例：ザナミビル（商品名：リレンザ）、オセルタミビル（商品名：タミフル）｝並びに2'-（4-メチルウンベリフェリル）-α-D-N-アセチルノイラミン酸アンモニウムを同時又は別個に接触させて酵素反応を行い、該酵素活性を指標として、該患者のノイラミニダーゼの薬剤耐性を検出する工程。
　なお、酵素反応は、酵素反応の結果遊離する4-メチルウンベリフェロンをEX365nm、EM450nmの蛍光強度を計測することにより求めることができる（参照：特開平11-318445）。
（標的タンパク質に対するポリメラーゼ阻害剤の阻害効果を検出する方法）
（１）ポリメラーゼ（例：HCV RdRp、HBV pol）の生理活性に関与する配列部分以外の配列に特異的にハイブダイズする、少なくとも１個の５'プライマーと１個の３'プライマー、を含む遺伝子増幅溶液を患者試料に直接接触させて、該ポリメラーゼ遺伝子を増幅する工程、
（２）（１）で増幅したポリメラーゼ遺伝子を、そのまま又は精製後に、転写溶液に接触させて、該ポリメラーゼの翻訳鋳型を構築する工程、
（３）（２）で構築したポリメラーゼの翻訳鋳型を、そのまま又は精製後に、無細胞タンパク質合成系に接触させて、ポリメラーゼを発現させる工程、
（４）（３）で発現させたポリメラーゼ並びに１又は複数のポリメラーゼ阻害剤（候補ポリメラーゼ阻害剤も含む）を1μCi[3H]UTP（40 Ci/mmol、NEM社）、10μM UTPおよび10μg/mlポリ(A)を含む緩衝液で反応させた後に、オリゴ(U)12（1μg/ml、Genset社）をプライマーとして添加する。そして、20% 100μl TCAを加えて反応を停止させた後に、トリチウム化UTPの取り込みを、酸不溶性沈殿物の放射線量として測定する。
　なお、薬剤耐性のないポリメラーゼは、薬剤耐性を持つポリメラーゼと比較して、ヌクレオチド（トリチウム化UTP）取り込みが低下する（参照：WO96/37619、WO00/006529）。
　加えて、上記検出方法としては、ホモジニアスアッセイ又はヘテロジニアスアッセイがある。なお、ホモジニアスアッセイは、洗浄工程を省略できるのでより好ましい。
　また、ホモジニアスアッセイは、以下のいずれか１以上から選択される。
　１）ALPHA、２）表面プラズモン共鳴法、３）蛍光相関分析法、４）蛍光強度分布解析法、５）FRET、６）BRET、７）EFC、８）FP
　加えて、ヘテロジニアスアッセイは、以下のいずれか１以上から選択される。
　１）ELISA、２）DELFIA、３）SPA、４）フラッシュプレート分析
｛FRET（蛍光共鳴エネルギー移動）｝
　FRETは、ドナーおよびアクセプターと称される２種類の蛍光物質間のエネルギー転移を利用した手法である。代表的な例は、以下に示すALPHA等である。
｛ALPHA（増幅発光近接ホモジニアスアッセイ）｝
　ALPHA は、PerkinElmer社のAlphaScreenTMが代表的なアッセイ法である。
　その方法は、近接させられたドナービーズとアクセプタービースとの間に一重項酸素の移動に基づく分析方法である。これは、680nmでの励起において、ドナービース中の光増感剤は、周囲の酸素を一重項状態の酸素に変換し、その酸素が200nmの距離まで拡散する。アクセプタービーズ中の化学発光基は、エネルギーをビーズ内の蛍光アクセプターに移動させ、続いて約600nmの光を放出する。なお、アクセプタービーズは、ガラス、シリカゲル、樹脂のような不活性物質であって、上記生体分子を固定化しておくための担体である。ドナービースは、ガラス、シリカゲル、樹脂のような不活性物質であって、ストレプトアビジンを固定化しておくための担体である。
｛表面プラズモン共鳴法（SPR：surface plasmon resonance）｝
　患者試料由来の標的タンパク質を、リンカーを介して金属膜に固定する。次に、抗ウイルス剤、基質等を含む溶液をSPRに投入し、金属膜に固定化された標的タンパク質に対する抗ウイルス剤の阻害効果を光の屈折率の変化をマーカーにして検出する。なお、測定は、通常の表面プラズモン共鳴法で行うことができる。
｛蛍光相関分析法（FCS：Fluorescence　Correlation　Spectroscopy）｝
　患者試料由来の標的タンパク質を含む溶液を適当な希釈液で希釈し、抗ウイルス剤及び基質等と接触させた後に、そのまま測定装置で検出する。測定は、レーザー光を照射し、液中の蛍光分子の揺らぎを測定するので、特にpH、測定時間の条件はなく、温度も室温で可能である。また、FCS測定では、微小領域内の蛍光分子の揺らぎを測定し、得られた情報に基づいて並進拡散時間を求める。この並進拡散時間をマーカーにして、標的タンパク質に対する抗ウイルス剤の阻害効果を検出する。
　なお、FCSの改良方法であるFCCS（蛍光相互相関分析法）も含まれる。
｛蛍光強度分布解析法（FIDA：Fluorescence　Intensity　Distribution　Analysis）｝
　患者試料由来の標的タンパク質を含む溶液を適当な希釈液で希釈し、抗ウイルス剤及び基質等と接触させた後に、そのまま測定装置で検出する。測定は、レーザー光を照射し、液中の蛍光分子の揺らぎを測定するので、特にpH、測定時間の条件はなく、温度も室温で可能である。また、FIDA測定では、微小領域内の蛍光を発している分子の蛍光強度と数を測定する。測定した蛍光強度と数をマーカーにして、標的タンパク質に対する抗ウイルス剤の阻害効果を検出する。 
｛蛍光偏光法（FP：Fluorescence Polarization）｝
　患者試料由来の標的タンパク質を含む溶液を適当な希釈液で希釈し、抗ウイルス剤及び基質等と接触させた後に、そのまま測定装置で検出する。蛍光偏光法は、偏光励起光を蛍光物質に照射することにより、蛍光物質から発せられる蛍光が分子量に応じて異なった偏光を示すという特性に基づいた測定方法である。蛍光標識物質が、抗体、受容体等の高分子と結合すると、見かけ上の分子量が大きくなるため、分子運動が小さくなり、結果としてその偏光を維持した蛍光（偏光度が高い）を放出する。該偏光を維持した蛍光をマーカーにして、標的タンパク質に対する抗ウイルス剤の阻害効果を検出する。 
｛ＥＦＣ（酵素断片コンプリメンテーション）｝
　ＥＦＣ分析は、２つのフラグメント、すなわち酵素アクセプター（ＥＡ）および酵素ドナー（ＥＤ）からなる加工されたβ－ガラクトシダーゼ酵素に基づく。フラグメントが分離すると、β－ガラクトシダーゼ活性が失われるが、フラグメントが合わさると、それらは連携して（補い合って）、活性酵素を形成する。ＥＦＣ分析は、ＥＤ－分析物結合体を利用し、この場合、分析物は、抗体または受容体のような特異的結合タンパク質によって認識が可能である。特異的結合タンパク質の非存在下では、ＥＤ－分析物結合体は、ＥＡを補い、活性β－ガラクトシダーゼを形成することが可能であり、正の発光シグナルを発生する。ＥＤ－分析物結合体と特異的結合タンパク質とが結合する場合、ＥＡとの補完が阻害され、シグナルは生じない。遊離の分析物が（サンプル中に）提供される場合、その分析物は、特異的結合タンパク質に対する結合に関してＥＤ－分析物結合体と競合する。遊離の分析物は、ＥＡとの補完のためにＥＤ－分析物結合体を解放し、サンプル中に存在する遊離の分析物の量に応じてシグナルを発生する。
｛ＢＲＥＴ（Bioluminescent Resonance Energy Transfer：生物発光共鳴エネルギー転移）｝
　エネルギーがルシフェラーゼの生物発光発生反応から蛍光タンパク質に移行される生物発光共鳴エネルギー移行を利用したアッセイである。
（タンパク質断片コンプリメンテーション法を使用した方法）
　タンパク質断片コンプリメンテーション法として、蛍光タンパク質monomeric Kusabira-Green(mKG)を使用した方法を挙げられる。例えば、以下のように蛍光タンパク質monomeric Kusabira-Green(mKG)を使用する。
　無細胞タンパク質合成系で発現させたプロテアーゼと１又は複数のプロテアーゼ阻害剤並びに蛍光タンパク質修飾した基質｛mKG-N末端－基質配列－mKG-C末端｝を同時又は別個に接触させて、蛍光強度を指標として、該患者試料由来のプロテアーゼの薬剤耐性を検出する（参照：CoralHue登録商標 Fluo-chase Kit 、Amalgaam社製品）。
（ALPHAを使用したin vitroでのHIVプロテアーゼ変異の検出）
　ビオチン化基質配列、該ビオチン化基質を直接的又は間接的に認識可能なアクセプタービーズ、ストレプトアビジンが結合したドナービース、発現させたHIVプロテアーゼ並びにHIVプロテアーゼ阻害剤をin vitroに導入する。
　ここで、HIVプロテアーゼ阻害剤が、HIVプロテアーゼの変異により、該プロテアーゼ活性を阻害できない場合には、基質（P2-P7：配列番号１２）が切断される。よって、図３の下段図のようにドナービースとアクセプタービーズが近接できずシグナルの上昇が起こらない。
　一方、HIVプロテアーゼ阻害剤が、HIVプロテアーゼの活性を阻害する場合には、基質が切断されない。よって、図３の上段図のようにドナービースとアクセプタービーズが近接してシグナルの上昇が起こる。
　なお、シグナルの検出方法は、例えばアクセプタービーズが発する蛍光強度を使って測定しておこなわれる。
（患者に適した抗ウイルス剤の選択方法）
　本発明の「患者に適した抗ウイルス剤の選択方法」は、上記シグナル検出結果を基にして行う。詳しくは、各HIVプロテアーゼ阻害剤を使用して上記シグナル検出を行い、図７のような薬剤耐性プロファイリングを作成する。これにより、各患者特有の薬剤耐性を特定することができ、各患者に適した１又は複数のHIVプロテアーゼ阻害剤を選択することができる。
　なお、図７では、各患者の１試料に対して１つの阻害剤のみの反応を検出しているが、当然に１試料に対して複数の阻害剤の相加／相乗効果も検出することができる。
（患者に適した抗ウイルス剤の選択方法を実施するためのキット）
　本発明の「患者に適した抗ウイルス剤の選択方法を実施するためのキット」は、少なくともウイルス由来の標的タンパク質遺伝子の生理活性に関与する配列部分以外の配列に特異的にハイブダイズする、少なくとも１個の５'プライマーと１個の３'プライマー、並びに無細胞タンパク質合成用抽出液を含む。
　さらに、「患者に適したHIVプロテアーゼ阻害剤の選択方法を実施するためのキット」は、少なくとも配列番号１～５のプライマー並びにコムギ胚芽由来の無細胞タンパク質合成用抽出液を含む。
　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
（患者試料の調製方法）
　患者から得た血液から患者試料を調製した。詳細は以下の通りである。HIV感染患者から取得した血液よりウイルスRNAを抽出して、さらに緩衝液を加えて患者試料とした。
（検体中のHIVプロテアーゼ遺伝子の増幅）
　実施例１で得られた患者試料のプロテアーゼ遺伝子を増幅した。詳しくは、プロテアーゼ活性に関与しない配列を特異的に認識するプライマーを使用した。詳細は、以下の通りである。
　5'プライマー１（S1-plus35-HIVpro：配列番号１）、5'プライマー２（deSP6-E02-S1：配列番号２）、5'プライマー３（Spu：配列番号３）、3'プライマー１（-18-HIVpro-sUTR：配列番号４）及び3'プライマー２（sUTR-2nd：配列番号５）を含む10 μl 遺伝子増幅溶液（1 x PCRバッファー、400 nM dNTPs、0.025U/μl 耐熱性ポリメラーゼ、逆転写酵素）を、実施例１で得られた各患者試料に直接導入した。そして、以下のPCR条件によりHIVプロテアーゼのDNA鋳型を増幅した（参照：図２のＡ）。
　なお、図２中の「35aa」は、MRANSPTRRELQVWGRDNNSLSEAGADRQGTVSFSF（配列番号６）、「18aa」は PISPIETVPVKLKPGMDG（配列番号７）、「S1」は、CCACCCACCACCACCA（配列番号８）、「E02」はCTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCCCTACATACAACTTTCAACTTCCTATT（配列番号９）、「3'UTR」はTAAGTTTTTGTATAGAATTTACGGCTAGCGCCGGATGCGACGCCGGTCGCGTCTTATCCGGCCTTCCTATATCAGGTAGT（配列番号１０）である。なお、「S1」は、タンパク質合成したい遺伝子の５'側に付加すると、目的タンパク質のN末端への様々なタグの付加などが容易に行うことができる配列である。
　RT-PCR条件：60℃ 30minの後、（98℃　10sec、55℃　30sec、72℃　1min）を30サイクル行った。
（HIVプロテアーゼの翻訳鋳型の作成）
　実施例２で増幅したHIVプロテアーゼDNAにより翻訳鋳型を作成した。詳細は、以下の通りである。
　実施例２で得られた30μlの増幅したHIVプロテアーゼのDNA鋳型を含む溶液を、転写溶液｛30 μl の5ｘ転写バッファー（400 mM HEPES, pH 7.6; 80 mM Magnesium acetate; 10 mM Spermidine; 50 mM DTT）、15 μl の25 mM 4NTPs、1.875 μl のRNAsin (80 Units)、1.875μl のSP6 polymerase (80 units)、71.25 μl水｝に添加して、37℃、3時間転写反応を行い、翻訳鋳型を作成した。
（HIVプロテアーゼの発現）
　実施例３で得られた翻訳鋳型をコムギ胚芽無細胞タンパク質合成液（参照：段落「0026」）に添加して各患者由来のHIVプロテアーゼを発現させた。詳細は、以下の通りである。
　実施例３で得られた翻訳鋳型（mRNA）を含む溶液をコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系に添加し26℃、15～20時間タンパク質合成を行い、各患者由来のHIVプロテアーゼを得た。
（ビオチン化基質配列の作成）
　HIVプロテアーゼのプロテアーゼ活性により切断されるビオチン化基質配列を作成した。詳細は、以下の通りである。
　HIVプロテアーゼに認識されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を導入したpEU｛－SP6－E01（配列番号１１）－GST－p2-p7（配列番号１２）－bls｝ベクターを作成した（参照：図２Ｂ）。続いて、pEUベクターを鋳型にPCRを用いて転写鋳型を作成した。該転写鋳型を転写反応溶液〔最終濃度、８０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．８、１６ｍＭ 酢酸マグネシウム、１０ｍＭ ジチオトレイトール、２ｍＭ スペルミジン、２．５ｍＭ ４ＮＴＰｓ（４種類のヌクレオチド三リン酸）、０．８Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ阻害剤、１．６Ｕ／μｌ ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ〕に添加して、37℃、3時間転写を行った（参照：Proc Natl Acad Sci USA,2002, vol 99, p14652-14657 :Sawasaki,T et al.）。得られたmRNAのペレット全量をコムギ胚芽無細胞タンパク質合成液（参照：段落「0026」）に添加し26℃、15～20時間タンパク質合成を行い、ビオチン化基質配列を得た。
（最適な基質量の検討）
　コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系でのALPHAスクリーニングでの最適な基質量を検討した。詳細は、以下の通りである。
　実施例５のビオチン化基質配列を含む翻訳後のタンパク質合成液を洗浄することなくAlphaScreenTMに使用した。
　該タンパク質合成液（30nM：0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0μl）及び3 μl野生型HIVプロテアーゼを15μl反応緩衝液｛50mM Tris-HCl(pH 7.6)、50mM MgCl2、500mM CH3COOK、0.1mM DTT及び1mg/ml BSA｝で23℃、１時間インキュベートして、培養液を得た。各培養液を、384穴プレート｛各穴中に反応緩衝液（10μl 抗GST抗体、AlphaScreen protein A conjugated Acceptor Bead（PerkinElmer）及びstreptavidin donor bead（PerkinElmer）を含む：OptiPlate NEW microplate）｝に入れ、23℃、1時間インキュベートした後に、Alpha Quest HTS analyzerで解析した（相互作用のプラスレベルの閾値は、200 AlphaScreen単位に設定した）。
　なお、上記で使用した野生型HIVプロテアーゼ（35-HIVpro(WT)-18）は、上記コムギ胚芽無細胞系で合成した。
　上記結果を図４に示す。図４の結果より、基質タンパク質量の範囲は、0.05～5.0μl、好ましくは0.2～2.0μlであることがわかった。
　よって、下記実施例７では、基質タンパク質量を0.5μlに設定した。
（最適なプロテアーゼ量の検討）
　コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系でのALPHAスクリーニングでの最適なプロテアーゼ量を検討した。詳細は、以下の通りである。
　実施例５のビオチン化基質配列（30nM： 0.05μl）を含む翻訳後のタンパク質合成液を洗浄することなくAlphaScreenTMに使用した。
　該タンパク質合成液及び1.0、3.0、5.0μl野生型HIVプロテアーゼを15μl反応緩衝液｛50mM Tris-HCl(pH 7.6)、50mM MgCl2、500mM CH3COOK、0.1mM DTT及び1mg/ml BSA｝で23℃、１時間インキュベートして、培養液を得た。各培養液を、384穴プレート｛各穴中に反応緩衝液（10μl）、 抗GST抗体（GEヘルスケア）、AlphaScreen protein A conjugated Acceptor Bead（PerkinElmer）及びstreptavidin donor bead（PerkinElmer））を含む｝に入れ、23℃、1時間インキュベートした後に、Alpha Quest HTS analyzerで解析した（相互作用のプラスレベルの閾値は、200 AlphaScreen単位に設定した）。
　なお、検出結果は、同濃度のDHFRの検出値と比較して切断活性（Cleavage activity）を算出した。
　加えて、DHFRは、pEU-DHFR（50 ng）を鋳型に、プライマーSPu(上述)とAODA2306 (5'-AGCGTCAGACCCCGTAGAAA)を用いて増幅して、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成液（参照：段落「0026」）で合成した。
　上記結果を図５に示す。図５の結果より、いずれの濃度（1、3、5μl）のプロテアーゼ量でもALPHAスクリーニングでの検出可能であることがわかった。
　よって、下記実施例８では、プロテアーゼ量を3.0μlに設定した。
（最適な抗ウイルス剤濃度の検討）
　以下の実施例９で使用する無細胞タンパク質合成系でのALPHAスクリーニングでの最適な抗ウイルス剤濃度を検討した。詳細は、以下の通りである。
　実施例５のビオチン化基質配列（30nM： 0.5μl）を含む翻訳後のタンパク質合成液を洗浄することなくAlphaScreenTMに使用した。
　該タンパク質合成液及び3μl野生型HIVプロテアーゼを15μl反応緩衝液｛50mM Tris-HCl(pH 7.6)、50mM MgCl2、500mM CH3COOK、0.1mM DTT及び1mg/ml BSA｝で23℃、1時間インキュベートして、培養液を得た。各培養液を、384穴プレート｛各穴中に反応緩衝液（10μl）、抗GST抗体（GEヘルスケア）、AlphaScreen protein A conjugated Acceptor Bead（PerkinElmer）及びstreptavidin donor bead（PerkinElmer））を含む｝に入れた。
　さらに、各濃度（1、10、100、1000、10000 nM）のHIVプロテアーゼ阻害剤（阻害剤Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）を反応緩衝液に入れて、23℃、1時間インキュベートした後に、Alpha Quest HTS analyzerで解析した（相互作用のプラスレベルの閾値は、200 AlphaScreen単位に設定した）。
　上記結果を図６に示す。各阻害剤によって、最適な濃度が異なることがわかった。下記実施例９では、阻害剤Ａの濃度は100nM、阻害剤Ｂの濃度は1μM、阻害剤Ｃの濃度は100nM、阻害剤Ｄの濃度は100nM、阻害剤Ｅの濃度は100nM並びに阻害剤Ｆの濃度は1μMに設定した。
　なお、HIVプロテアーゼ阻害剤ではないDMSOは、いずれの濃度でも阻害効果を検出しなかった。
（患者に適したHIVプロテアーゼ阻害剤の選択方法）
　各患者特有のHIVプロテアーゼ変異による各阻害剤の治療効果を推定するために、HIVプロテアーゼの薬剤耐性プロファイリングを作成した。詳細は、以下の通りである。
　実施例５のビオチン化基質配列（30nM： 0.5μl）を含む翻訳後のタンパク質合成液を洗浄することなくAlphaScreenTMに使用した。同様に、実施例４の各患者由来のHIVプロテアーゼを含む翻訳後のタンパク質合成液を洗浄することなくAlphaScreenTMに使用した。
　ビオチン化基質配列（30nM：0.5μl）を含む翻訳後のタンパク質合成液を15μl反応緩衝液｛50mM Tris-HCl(pH 7.6)、50mM MgCl2、500mM CH3COOK、0.1mM DTT及び1mg/ml BSA｝で23℃、１時間インキュベートして、培養液を得た。各培養液を、384穴プレート｛各穴中に反応緩衝液（10μl）、 抗GST抗体（GEヘルスケア）、AlphaScreen protein A conjugated Acceptor Bead（PerkinElmer）及びstreptavidin donor bead（PerkinElmer））を含む｝に入れた。
　さらに、16人のHIV感染患者由来のHIVプロテアーゼを含む翻訳後のタンパク質合成液（0001～0016）各３μl並びに阻害剤Ａ（100nM）、阻害剤Ｂ（1μM）、阻害剤Ｃ（100nM）、阻害剤Ｄ（100nM）、阻害剤Ｅ（100nM）、又は阻害剤Ｆ（1μM）を反応緩衝液に入れて、23℃、1時間インキュベートした後に、Alpha Quest HTS analyzerで解析した（相互作用のプラスレベルの閾値は、200 AlphaScreen単位に設定した）。
　上記結果を図７に示す。図中の「+、++、+++、++++」は、各患者のHIVプロテアーゼの基質切断活性割合を、各阻害剤存在下でのコントロール（阻害剤非存在）の値を基にして算出したものである。すなわち、「++++」は、コントロールでの活性100に対して約75～100％のHIVプロテアーゼの基質切断活性が残っていることを意味する。
　よって、「++++」を示す阻害剤は、当該HIVプロテアーゼ活性を阻害できないことを意味する。すなわち、各患者由来のHIVプロテアーゼが変異したことにより、阻害剤の効果がない又は低減していることを示す。
　図７の結果から明らかなように、番号0008、0014のHIV感染患者由来のHIVプロテアーゼはどの阻害剤に対しても耐性であることがわかった。なお、番号0008、0014のHIV感染患者は、阻害剤Ａ～Ｆのいずれにも耐性があることを臨床的に確認している。一方、番号0003、0007、0009の患者の場合、阻害剤A及びBが最適な薬剤として選択される。
　以上により、本発明のHIVプロテアーゼ阻害剤の選択方法の結果は、実際の患者での薬剤耐性の臨床結果と一致していることがわかった。すなわち、本発明のHIVプロテアーゼ阻害剤の選択方法は、非常に信頼性の高い方法である。
（非核酸系逆転写酵素阻害剤の阻害効果の確認）
　非核酸系逆転写酵素阻害剤の阻害効果を確認した。詳細は、以下の通りである。
（使用した材料）
　逆転写酵素：HIV-RT｛HIV-1逆転写酵素(p51, p66)を1:1の割合、実施例４に記載の方法と同様に調製した｝
　逆転写酵素阻害剤：EFV（0.01nM～1000nM）
　基質溶液：DIG-dUTP(75nM), Biotin-dUTP(75nM), dTTP(10μM) in 50mM Tris-HCl(pH7.8)
　インキュベーション緩衝液：50mM Tris-HCl(pH7.8) , 319mM potassium chloride, 33mM magnesium chloride, 11mM DTT
　テンプレート（Template/primer hybrid）：PolyA,oligo(dT) 15 (9A260/ml)
　添加溶液：基質溶液と、テンプレートをインキュベーション緩衝液: 基質溶液: テンプレート=10:1:1の割合で混合。
　Lysis用緩衝液：50mM Tris-HCl(pH7.8), 80mM potassium chloride, 2.5mM DTT, 0.75mM EDTA, 0.5% Triton X-100
　AlphaScreenTM DIG detection kit：No.6760604C（PerkinElmer社製）
　ビーズ（Beads mix）：Streptavidin Donor beads 0.1μl, anti-Digoxin/Digoxigenin(DIG) Acceptor Beads 0.1μl, 1mg/ml BSA, 1*PBS
（方法）
　市販の384plateに、上記Lysis用緩衝液7.5μl、HIV-RT 1μl、各濃度に調整したEFV1.5μlを加え、37℃で15分間インキュベートした。さらに、上記添加溶液を5μlずつ各wellに加え、37℃で1時間インキュベートした。その後、ビーズ10μlを各wellに加え、26℃、１時間インキュベートを行った後、EnVisionを用いて測定を行った。
（結果）
　上記測定結果を図８に示す。図８の結果から明らかなように、EFVは濃度依存的にHIV逆転写酵素の活性を阻害した。すなわち、本発明では、患者に適した非核酸系逆転写酵素阻害剤を選択することができる。
（核酸系逆転写酵素阻害剤による逆転写酵素の阻害効果の確認）
　各種の核酸系逆転写酵素阻害剤の阻害効果を確認した。詳細は、以下の通りである。なお、使用したテンプレートは、６merの一本鎖核酸（６個の核酸は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルのいずれかから任意に選択される）である。なお、比較対照として使用したテンプレートは、PolyA,oligo(dT) 15 (9A260/ml)である。
（使用した材料）
　逆転写酵素：HIV-RT｛HIV-1逆転写酵素(p51, p66)を1:1の割合、実施例４に記載の方法と同様に調製した｝
　核酸系逆転写酵素阻害剤：AZTTP（0,10nM,1000nM）、ddCTP（0,10nM,1000nM）、3TCTP（0,10nM,1000nM）、Tenofovir.DP（0,10nM,1000nM）
　非核酸系逆転写酵素阻害剤：EFV（0,10nM,1000nM）
　基質溶液：DIG-dUTP(1μM), DIG-dCTP(1μM), Biotin-dUTP(1μM), Biotin-dATP (1μM) , dTTP(1μM), dATP(1μM), dCTP(1μM), dGTP(1μM) in 50mM Tris-HCl(pH7.8)
　インキュベーション緩衝液：50mM Tris-HCl(pH7.8), 319mM potassium chloride, 33mM magnesium chloride, 11mM DTT
　テンプレート（Template/primer hybrid）：mRNA(A,G,C,U mix)/Random primer(6mer)
｛mRNA (9A260/ml)とRandom primer(final 60μM)を混合し、65℃、10分間インキュベート後、氷水にて急冷した｝
　加えて、比較対照テンプレートとして、PolyA,oligo（dT）15 (9A260/ml)を使用した。
　添加溶液：基質溶液と、テンプレートをインキュベーション緩衝液: 基質溶液: テンプレート=10:1:1の割合で混合。
　Lysis用緩衝液：50mM Tris-HCl(pH7.8), 80mM potassium chloride, 2.5mM DTT, 0.75mM EDTA, 0.5% Triton X-100
　逆転写酵素アッセイキット：No.11 468 120 910 （Roche社製）
　POD標識抗ジゴキシゲニン｛Anti-DIG-POD working dilution(200mU/ml)｝：50μl anti-DIG-POD(10U) and 4.95ml of conjugate dilution buffer
　ABTS基質（ABTS substrate solution containing substrate enhancer）：ABTS tablet 1個を5mlのsubstrate bufferに溶かしたsubstrate solution 1mlに対して1mgのsubstrate enhancerを加え、溶かした。
　マイクロタイタープレート｛Microplate modules(8wells)｝：precoated with streptavidin and postcoated with blocking reagent
（方法）
　5ml チューブに上記添加溶液20.86μl、上記各種の逆転写酵素阻害剤 6μl、HIV-RT 1μl、上記Lysis用緩衝液 33μlを加えtotal 60μlとし、37℃、1時間インキュベートした。この反応液全量を上記マイクロタイタープレートに移し、37℃、1時間インキュベートした。反応液を完全に除去し、250μl の洗浄液で５回洗浄した。上記POD標識抗ジゴキシゲニン｛anti-DIG-POD working dilution (200mU/ml )｝を200μl加え、37℃、1時間インキュベートした。次に、反応液を完全に除去し、250μlの洗浄液で５回洗浄した。さらに、上記ABTS基質｛substrate solution with substrate enhancer（200μl）｝を添加し、測定に十分な発色（緑色）が得られるまで室温で10～30分間インキュベートした。最後に、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度405nmを測定した。
　上記測定結果を図９に示す。図９の結果から明らかなように、各種の逆転写酵素阻害剤は濃度依存的にHIV逆転写酵素の活性を阻害した（図9－左）。一方、比較対照（PolyAをテンプレート)では、基質Tの類縁体AZTTP及び非核酸系EFVのみ阻害効果が見られた（図9－右）。
　これにより、本発明のアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルから任意に選択される塩基を組み合わせた配列から成る一本鎖核酸をテンプレートとして使用することにより、各種の核酸系のみならず非核酸系逆転写酵素阻害剤による逆転写酵素の阻害効果を確認できる。
　さらに、本発明では、患者に適した核酸系及び非核酸系逆転写酵素阻害剤を選択することができる。
　本発明は、簡便な各患者に最適な抗ウイルス剤の選択方法を提供する。

Claims (12)

  1. 　以下の工程を含む、患者に適した抗ウイルス剤の選択方法であって、
    　１）ウイルス由来の標的タンパク質遺伝子の生理活性に関与しない配列に特異的にハイブダイズする、少なくとも１個の５'プライマーと１個の３'プライマー、を含む遺伝子増幅溶液を患者由来の試料に接触させて、該ウイルス由来の標的タンパク質遺伝子を増幅する工程、
    　２）１）で増幅した標的タンパク質遺伝子を、そのまま又は精製後に、転写溶液に接触させて、該ウイルス由来の標的タンパク質の翻訳鋳型を構築する工程、
    　３）２）で構築した標的タンパク質の翻訳鋳型を、そのまま又は精製後に、無細胞タンパク質合成系に接触させて、該ウイルス由来の標的タンパク質を発現させる工程、
    　４）３）で発現させた標的タンパク質と、１又は複数の抗ウイルス剤を、同時又は別個に接触させて、該ウイルス由来の標的タンパク質に対する該１又は複数の抗ウイルス剤の阻害効果を検出する工程、
    　５）４）の検出結果を基にして、該患者に適した抗ウイルス剤を選択する工程、
    　を特徴とする患者に適した抗ウイルス剤の選択方法。
  2. 　前記無細胞タンパク質合成系が、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系である請求項１の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法。
  3. 　前記ウイルス由来の標的タンパク質がプロテアーゼであり、前記抗ウイルス剤がプロテアーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項１又は２の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法。
  4. 　前記４）の工程が、ALPHA（増幅発光近接ホモジニアスアッセイ）を使用する請求項１～３のいずれか１の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法。
  5. 　前記４）の工程が、以下の工程を含む請求項４の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法；
    　（１）ビオチン化基質配列、該ビオチン化基質配列を直接的又は間接的に認識可能なアクセプタービーズ、ストレプトアビジンが結合したドナービース、並びに前記３）で発現したプロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害剤を接触させ、
    　（２）アクセプタービーズとドナービーズの近接によるシグナル変化により、プロテアーゼに対するプロテアーゼ阻害剤の阻害効果を検出する。
  6. 　前記ウイルス由来の標的タンパク質がHIVプロテアーゼであり、前記プロテアーゼ阻害剤がHIVプロテアーゼ阻害剤であることを特徴とする請求項１～５のいずれか１の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法。
  7. 　前記ウイルス由来の標的タンパク質が逆転写酵素であり、前記抗ウイルス剤が逆転写酵素阻害剤であることを特徴とする請求項１又は２の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法。
  8. 　前記抗ウイルス剤が核酸系逆転写酵素阻害剤であることを特徴とする請求項７の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法。
  9. 　請求項１～８のいずれか１の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法を実施するためのキット。
  10. 　少なくとも以下を含む請求項９のキット；
    　（１）ウイルス由来の標的タンパク質遺伝子の生理活性に関与する配列部分以外の配列に特異的にハイブダイズする、少なくとも１個の５'プライマーと１個の３'プライマー、
    　（２）真核生物由来の無細胞タンパク質合成用抽出液。
  11. 　少なくとも以下を含む請求項８の患者に適した抗ウイルス剤の選択方法を実施するためのキット；
    　（１）逆転写酵素遺伝子の生理活性に関与する配列部分以外の配列に特異的にハイブダイズする、少なくとも１個の５'プライマーと１個の３'プライマー、
    　（２）真核生物由来の無細胞タンパク質合成用抽出液、
    　（３）該逆転写酵素により認識される、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルから任意に選択される塩基を組み合わせた配列から成る一本鎖核酸。
  12. 　以下を含む患者に適したHIVプロテアーゼ阻害剤の選択方法を実施するためのキット；
    　（１）配列番号１～５のプライマー、
    　（２）コムギ胚芽由来の無細胞タンパク質合成用抽出液。
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