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WO2008151749A2 - Aktivierbare diagnostische und therapeutische verbindung - Google Patents

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WO2008151749A2
WO2008151749A2 PCT/EP2008/004481 EP2008004481W WO2008151749A2 WO 2008151749 A2 WO2008151749 A2 WO 2008151749A2 EP 2008004481 W EP2008004481 W EP 2008004481W WO 2008151749 A2 WO2008151749 A2 WO 2008151749A2
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peptide
transport
compound
cells
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Stefan Heckl
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Eberhard-Karls-Universitaet Tuebingen Universitaetsklinikum
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    • A61K51/088—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins conjugates with carriers being peptides, polyamino acids or proteins

Definitions

  • the present invention relates to a compound which can be used as a contrast agent and as a therapeutic agent, the use of the compound for the preparation of a diagnostic or therapeutic composition, a diagnostic and therapeutic composition comprising this compound and a method for the diagnostic and therapeutic treatment of a living being.
  • Contrast agents e.g. Gadolinium complexes, which are commonly used routinely in magnetic resonance imaging (MRI), such as Magnevist (Schering) or DOTAREM (Guerbet), accumulate in the extracellular space after their administration to a patient and are unable to penetrate into the cytoplasm of the cells; Prantner et al. (2003), Synthesis and characterization of a Gd-DOTA-D permeation peptide for magnetic resonance enhancement of intracellular targets, Mol. Imaging 2 (4): 333-41.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • DOTAREM DOTAREM
  • WO 01/08712 A2 describes a gadolinium-containing contrast agent for use in magnetic resonance tomography, which has an extremely complex structure.
  • the known contrast agent is intended to be delivered via so-called “Target Binding Moieties” (TBM) to large proteins in the blood, such as albumin or fibrin bind and remain in the blood stream as long as possible.
  • TBM Target Binding Moieties
  • the known contrast agent is neither able to penetrate into the cytoplasm nor into the nucleus of biological cells.
  • Gadolinium-binding helix-turn-helix peptides DNA-dependent MRI contrast agents.
  • Chem. Commun., 2574-2575 describe a peptidic DNA-binding contrast agent consisting of a total of 33 amino acids, a centrally located portion derived from a calcium-binding EF hand capable of chelating gadolinium, and an N - And C-terminal peptide portion, via which a binding of the construct to DNA takes place.
  • the known contrast agent is capable of penetrating into the cytoplasm of cells, but not into the cell nucleus.
  • the affinity of the known peptide for gadolinium is too low, so that a biological application as a contrast agent due to the risk of release of toxic Gadoliniumions in the organism is out of the question.
  • gadolinium-containing contrast agents for use in magnetic resonance tomography.
  • these contrast agents contain 4 molecules of a chelating agent [(DTPH) 4 ] and a peptide containing so-called NLS and TPU segments.
  • the TPU section (“transport peptide unit” or “transmembrane module”) is derived from penetratin, transportan or the HOX-Bl protein and mediates the cell membrane permeability of the contrast agent.
  • the NLS section (“nuclear localization sequence”) mediates the nuclear membrane permeability of the known contrast agent, and the authors believe that this contrast agent is able to penetrate both the cytoplasm and the nucleus.
  • the compounds disclosed have molecular weights of about 4,700 kDa to 6,500 kDa Due to the unfavorable weight ratio of the large TPU portion to the gadolinium-containing signaling section, the emitted signal in the magnetic resonance tomography is adversely affected emitted signal is relatively weak Contrast agent also has a disulfide bridge. This has the disadvantage that the disulfide bridge can already be cleaved in the circulation by disulfide reductases, which leads to inactivation of the known contrast agent.
  • WO 2006/056227 A1 proposes a gadolinium-containing contrast agent for use in magnetic resonance tomography.
  • the known peptidic contrast agent has in central position a DTPA chelated gadolinium flanked N- and C-terminally by short peptides having a net positive charge. According to the authors, the flanking peptides allow a penetration of the cytoplasm and the nucleus or a penetration of the cell membrane and the cell membrane of biological cells.
  • conjugate 8 or C8 is at the C-terminus of the known compound via a short peptide having an interface for the tumor cell-specific enzyme matrix metalloproteinase 2 (MMP-2), a coupled negatively charged peptide that neutralize the charge and thus function of the two positively charged peptides flanking the Gd-DTPA complex.
  • MMP-2 matrix metalloproteinase 2
  • the modified conjugate thus modified is, according to the authors, unable to invade non-transformed, ie healthy, cells. Tumor cells secrete MMP-2 into their environment. If the known conjugate is in the vicinity of such a tumor cell, the interface in the connecting peptide is recognized and cut.
  • the negative charge of the coupled peptide can no longer neutralize the positive charge of the flanking peptides.
  • the cleaved conjugate 8 should now be able to reenter the cells. Since the enzyme MMP-2 is only secreted by tumor cells, uptake of the conjugate occurs only in tumor cells, but not in healthy cells. However, the known from WO 2006/056227 Al conjugate 8 has not been proven in practice. Thus, it has been found that the neutralizing negatively charged peptide, which consists essentially of glutamic acid residues, neurotoxic in the body after its cleavage; see. Garattini (2000), Glutamic Acid, Twenty Years Later, J. Nutr. 130 (4S Suppl): 901S-9S.
  • peptides are also selectively cleaved in the vicinity of tumor cells and then release neurotoxic glutamic acid-containing peptides into the body.
  • Jiang et al. described peptide has only one fluorescence marker, but not a radiopaque or in magnetic resonance imaging signaling unit, and therefore only superficial tumors are represented. Already for this reason eliminates an application in humans.
  • Cytotoxic agents currently used in the treatment of tumor diseases are largely nonspecific and are directed against all rapidly dividing cells. This results in serious side effects, e.g. damage to healthy tissues or cells such as the hematopoietic system, gonads or hair follicles etc.
  • the first step in the development of a cellular targeted and tumor specific agent would therefore be to provide a compound that targets the cytoplasm or nucleus of a cell Penetrate the tumor cell and develop its cytotoxic properties there, without damaging healthy cells.
  • the object of the present invention is to provide a diagnostically and / or therapeutically valuable compound with which the disadvantages of the compounds known in the prior art are largely avoided.
  • a compound should be provided which can be used as an improved contrast agent or therapeutic agent and can selectively and selectively penetrate into the cytoplasm or the nucleus of tumor cells or virus-infected cells and there develop the signaling or cytotoxic properties.
  • Such a connection should be cost effective to produce on a large scale.
  • a peptide having at least an interface for tumor- or virus-specific proteases (specificity-conferring peptide)
  • At least one complexing agent for metals wherein El is connected to E2 and E2 to E3.
  • Transport components that mediate permeability through the cell membrane and the nuclear membrane are well described in the art. They include peptidic compounds described, for example, in Martin and Rice (2007), Peptide-guided Gene Delivery, The AAPS Journal 9 (1), E18-E29, and Schwartz and Zhang (2000), Peptide-mediated cellular delivery , Current Opinion in Molecular Therapeutics 2 (2); the content of these publications is incorporated herein by reference.
  • transport components also include non-peptidic components, such as cortisone, progesterone or peroxydesolubilator-activated receptor (PPAR) ligand. Non-peptidic components have the advantage that they are very small.
  • the transport components usually have a net positive charge, but may also be neutral.
  • Cell membrane and cell membrane permeability means that under physiological conditions, the compound of the invention can specifically enter the cytoplasm and nucleus of intact cells.
  • the permeability of the compound of the invention through the cell membrane and cell membrane can be easily measured in vitro in cell culture, eg by incubation of a first aliquot of the compound in a tumor cell culture. a second aliquot of the compound in a culture of healthy cells.
  • the compound in the tumor cell culture can be found in the nucleus after a short time, whereas the compound can not be found in the culture of healthy cells or only to a very limited extent, essentially nonspecifically, in the nucleus.
  • Gd gadolinium
  • Ga gallium
  • Mn manganese
  • Fe iron
  • DAA tetraazacyclododecanetetraacetic acid
  • DTPA diethylenetriamine - Taacetic acid
  • BOPTA EOB-DTPA
  • DTPA-DMA tetraazacyclododecanetetraacetic acid
  • HP-DOBA tetraazacyclododecanetetraacetic acid
  • DTPA-BMEA BOPTA
  • EOB-DTPA DTPA-DMA
  • HP-DOBA DTPA-BMEA
  • HIDA DTDP
  • porphyrins texaphyrins etc.
  • Cathepsin D recognizes the sequence PIC (Et) FF, where "Et” denotes an ester branch
  • Cathepsin K recognizes and cuts the specific amino acid sequence GGPRGLPG
  • Prostate cancers express and secrete predominantly the prostate specific antigen (PSA)
  • PSA prostate specific antigen
  • PSA recognizes and cleaves the amino acid sequence HSSKLQ Tumor cell-specific enzymes and their specific genetic
  • the cleavage and cleavage sites are comprehensively described in the prior art. An overview of this is given in Hahn WC and Weinberg RA (2002), Rules for Making Human Tumor Cells, N. Engl. J. Med., 347: 1593-1603. The content of this publication is incorporated herein by reference.
  • HSV Herpes simplex virus
  • HSV Herpes simplex virus
  • the HSV protease recognizes and cuts the amino acid sequences LVLASSSVGY and LVLASSSFGYS.
  • Cells infected by the human immunodeficiency virus (HIV) express and secrete the HIV protease.
  • the HIV protease recognizes and cuts the amino acid sequence GVSQNYPIVG.
  • Cells infected by cytomegalovirus (CMV) express and secrete a CMV protease that recognizes and cuts the amino acid sequence GWQASCRLA.
  • CMV cytomegalovirus
  • the specific amino acid sequence of the specificity-conferring peptide is selected by the person skilled in the art as a function of the desired specificity of the compound according to the invention for a particular tumor or a specific viral infection.
  • the units El and E2, and E2 and E3 are connected to each other, eg. Linear E1-E2-E3, NH 2 -El E2-E3-COOH or COOH-E1-E2-E3-NH 2.
  • This compound can be made in any manner, preferably by covalent bonding or peptide bonding between the units.
  • the inventor was able to provide such a compound which itself blocks in its ability to penetrate into the cytoplasm or cell nuclei of healthy cells.
  • This self-blockade is ensured by the presence of at least two complexing agents for metals, namely as part of El and part of E3. Due to the associated size and configuration of the compound, an uptake into the cytoplasm or the Nucleus of healthy cells prevented. The compound remains rather in the interstitium and is excreted after some time from the organism. By contrast, in the vicinity of tumor cells or virus-infected cells, the specificity-promoting peptide in E2 is recognized and cut by the tumor- or virus-specific proteases.
  • the separated unit E3 is thereby cleaved from the compound and El can penetrate into the cytoplasm and the cell nucleus of the tumor cell due to the transport component.
  • the separated unit E3 remains after cleavage by the tumor or virus-specific protease for some time in the interstitium and acts in a configuration as a contrast agent advantageously significantly in the signaling in the tumor or infected area with them until they are removed from the interstitium and the organism is excreted. It is particularly advantageous that the separated unit E3 has no neurotoxic properties, as is the case, for example, with the cleaved peptide fragments described in WO 2006/056227 A1 (supra), by Jiang et al. (supra) or Liu et al. (supra).
  • the compound according to the invention is, as it were, "activated" in the vicinity of tumor or virus-infected cells and cell membrane and cell membrane permeabilization, whereas such activation does not occur in the presence of healthy cells Properties unfolded exclusively in tumor cells or virus-infected cells.
  • the compound of the invention is surprisingly compact and small and is therefore inexpensive to produce on a large scale.
  • the compound according to the invention has only one transport component, which mediates both the permeability through the cell membrane and through the cell nucleus membrane.
  • a separate TPU such as in the case of the known from WO 2004/050698 connection is not required.
  • a nuclear localization sequence (NLS) is not mandatory.
  • a transport component a short positively charged peptide, for example PKKKRKV, is sufficient, optionally extending it by 4 arginines can be, ie PKKKRKVflftRR. It is understood that variations of this are conceivable.
  • the compound according to the invention furthermore proceeds without a disulfide bridge.
  • the compound according to the invention is therefore particularly stable and there is no danger that it will already be split and inactivated in the bloodstream.
  • the compound of the invention advantageously does not exert cytotoxicity on healthy cells, i. the vitality of the cells remains unaffected.
  • the El-containing cleavage product of the compound according to the invention specifically triggers apoptosis without causing inflammatory processes or damaging surrounding healthy tissue.
  • the El-containing cleavage product is then disposed of as part of the apoptotic process together with apoptotic tissue of macrophages from the body, so that, in the case of complexation of metals, no potentially toxic metals remain in the body.
  • the underlying apoptosis-triggering mechanism is still largely unknown, with the complexing agent and the transport peptide being assigned an important role in this respect.
  • the compound according to the invention is therefore particularly suitable as a therapeutic and diagnostic agent.
  • the transport component is a peptide (transport peptide).
  • Transport peptides that mediate permeability through the cell membrane and the nuclear membrane are extensively described in the art; see. WO 2006/056227 Al. Martin ME and Rice KG, in particular Table 1 (loc. Cit.) And Schwartz, JJ. and Zhang S. esp. Table 2 (loc. cit.); the content of these publications and the tables is incorporated herein by reference.
  • the transport petides are characterized by their positive net charge passing through an excess of positively charged amino acids is provided, for example by arginine, lysine and histidine, and have a length of from 2 to 40 amino acids, preferably from 3 to 20 amino acids, more preferably 5 to 15 amino acids.
  • Transport peptides also include nuclear localization sequences (NLS). Transport peptides are preferably linear, but may be branched. A suitable transport peptide has, for example, the following amino acid sequence: PKKKRKVRRRR.
  • the compound has a molecular weight which is about 2,000 kDa to about 10,000 kDa, preferably about 3,000 kDa to about 6,000 kDa, most preferably about 4,000 kDa.
  • the compound of the invention is particularly strong due to the favorable ratio of signaling component, which is formed by the complexing agent after complexation of a metal, and the rest of the compound.
  • the compound of the invention can therefore emit a particularly strong signal or develop a particularly strong therapeutic effect.
  • the complexing agent for metals is preferably tetraazacyclododecantetraacetic acid (DOTA).
  • DOTA is a complexing agent for gadolinium. This is characterized by its particularly high stability and is much more stable both in vivo and in vitro than DTPA, the usual complexing agent for gadolinium; see. Magerstadt et al. (1986), An Alternative to Gd (DTPA) as a Tl, 2 Relaxation Agent for NMR Imaging or Spectroscopy, Magn. Reson. Med. 3 (5): 808-12; Bousquet et al. (1988), Gd-DOTA: Characterization of a New Paramagnetic Complex, Radiology 166 (3): 693-8.
  • the complexing agents for metals have complexed gadolinium (Gd).
  • gadolinium (Gd or Gd 3+ ) has proven particularly useful in contrast agents for use in magnetic resonance imaging.
  • Gadolinium has a large ion trapping radius and is therefore well suited for neutron capture therapy (NCT).
  • NCT neutron capture therapy
  • An overview of the features and possible uses of this therapy can be found, for example, in Sauerwein W. (1993), Principles and History of Neutron Capture Therapy, Strahlenther. Oncol. 169: 1-6.
  • gadolinium is radiopaque and therefore suitable for use in computed tomography; see. Henson et al. (2004), Gadolinium-enhanced CT Angiography of the Circle of Willis and Neck, AJNR Am. J. Neuroradiol.
  • Gd-DOTA and GdDOTA are examples of DOTA having chelated Gd 3+ , ie Gd 3+ DOTA, respectively.
  • the organism After the specific uptake of the compound according to the invention into the tumor or virus-infected cells, the organism is irradiated with a neutron radiation source, which results in a conversion or activation of the neutron-absorbing compound according to the invention into a radiotoxic substance. Since the compound according to the invention is in direct contact with the DNA exclusively of transformed or virus-infected cells, exclusively such cells are purposefully destroyed and side effects are largely avoided.
  • the complexed gadolinium is radioactively labeled.
  • the marking takes place, for example, by using radioactive gadolinium 1S3 Gd.
  • 32 P, 33 P, 35 S, 35 Cl, 37 Cl, 15 N, 13 N, 13 C, 14 C, 2 H, 3 H, 125 I, 131 I, 18 F, 1S O 67 Ga, 111 In etc. can be used.
  • This measure has the Advantage that the further developed compound of the invention can also be used in radiotherapy and radiodiagnostics.
  • El and / or E2 and / or E3 also has a fluorescence marker.
  • Suitable fluorescence markers include fluorescein (FITC), which is preferably rhodamine, dansyl chloride, fluorescamine, green fluorescent protein (GFP), ethidium bromide, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), coumarin, luciferase, phycogene. rythrin (PE), Cy2, Cy3.5, Cy5, Cy7, Texas Red, Alexa Fluor, Fluor X, Red 613, BODI-PY-FL, TRITC, DS Red, GFP, DS Red etc.
  • FITC fluorescein
  • GFP green fluorescent protein
  • DAPI 6-diamidino-2-phenylindole
  • PE rythrin
  • Cy2 Cy3.5 Cy5 Cy7, Texas Red, Alexa Fluor, Fluor X, Red 613, BODI-PY-FL, TRITC, DS Red, GFP, DS Red etc.
  • the Compound of the invention further developed as a research tool that can be used in cell biology, for example, to investigate mechanisms of cytoplasmic or nuclear import of molecules in vitro or even in vivo.
  • This marker makes it possible to detect the localization of the compound of the invention by methods well established in the art, such as fluorescence microscopy, which can even be used during surgery in vivo, or near-infrared imaging of superficial tumors.
  • the markers An El, E2, E3 may be different, so that, for example, the interstitium (E3, Marker 1, for example FITC) can be represented in a different color than the nucleus of the tumor cells (El, marker 2, for example rhodamine).
  • E3 of the compound according to the invention also has a transport peptide.
  • This measure has the advantage that, after cleavage of E2 by a tumor cell or virus-specific protease, not only E1 but also E3 can be used for intranuclear imaging and / or therapy.
  • both cleavage products, ie, El and E3 have a complexing agent for metals and a transport peptide, so that both components can penetrate the cell membrane and nuclear membrane.
  • the transport peptide (s) has a nuclear localization sequence (NLS).
  • NLS RNA binders to a wide range of proteins.
  • PPKKKRKV PPKKKRKV
  • PKKKRKV PKKKRKV
  • KRRRER KARKRLK from simian cytomegalovirus.
  • Other suitable NLS are derived from transcription factors:
  • HATF-3 ERKKRRRE
  • apoptin which contains two NLS sequences, but which can also be used isolated: KPPSKKR and RPRTAKRRIRL.
  • Transport peptides with sequences having homology of 80%, 85%, 90%, 95%, 98% to the above sequences are also suitable for mediating cell membrane and nuclear membrane permeability. These include so-called "mutated" NLS with altered amino acid sequence and those in which an amino acid, such as lysine, for another amino acid, such as threonine, is replaced.
  • the transport peptide (s) has a net positive charge.
  • the inventor has found that such a transport peptide is sufficient to ensure the cell wall and cell wall wall permeability of the compound of the invention. It is not necessary to provide a complete core localization sequence (NLS).
  • the transport peptide consists predominantly of basic amino acids, such as arginine, lysine, histidine or modified variants thereof.
  • the transport peptides have a length of from 3 to 20, more preferably from 5 to 15 and most preferably 7 amino acids.
  • transport peptides with a sufficient length are provided, but without unnecessarily increasing the compound according to the invention.
  • transport peptide (s) has the following amino acid sequence: PKKKRKV (SEQ ID NO: 1).
  • This measure has the advantage that a NLS derived from the SV40-T antigen is used, which has proven to be particularly suitable.
  • Transport peptides with sequences having homology of 80%, 85%, 90%, 95%, 98% to SEQ ID NO: 1 are also suitable.
  • the transport peptide (s) of the compound according to the invention has the following amino acid sequence: RRRR (SEQ ID NO: 2).
  • RRRR SEQ ID NO: 2
  • Transport peptides with sequences having homology of 80%, 85%, 90%, 95%, 98% to SEQ ID NO: 2 are also suitable.
  • transport peptide (s) of the compound according to the invention prefferably has the following amino acid sequence: PKKKRKVRRRR (SEQ ID NO: 1
  • the inventor has found that by terminally attaching 4 arginine residues to the NLS derived from the SV40 T antigen, the transport properties are significantly improved. Transport peptides with sequences having homology of 80%, 85%, 90%, 95%, 98% to SEQ ID NO: 3 are also suitable.
  • the specificity-promoting peptide of the compound according to the invention has a length of from 2 to 20, preferably from 3 to 15 and most preferably 5 amino acids.
  • This measure has the advantage of providing a peptide of such a length that is sufficient for the specificity mediation, but without unnecessarily increasing the compound according to the invention.
  • the specified lengths have proven to be particularly suitable.
  • the specificity-mediating peptide has the following amino acid sequence: PLGLA (SEQ ID NO: 4) or PLGVR (SEQ ID NO: 5).
  • This measure has the advantage that such a connection is provided with which specific and highly selective brain tumors can be represented or treated.
  • the indicated amino acid sequence is recognized and cut by the matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) characteristic of brain tumors.
  • MMP-2 matrix metalloproteinase 2
  • Specificity-mediating peptides having sequences having homology of 80%, 85%, 90%, 95%, 98% to SEQ ID NO: 4 or NO: 5 are also suitable.
  • the complexing agent for metals and / or the fluorescence marker is covalently bound to the ⁇ -amino group of a lysine residue.
  • DOTA or FITC can be coupled via simple routine measures to the ⁇ -amino group of such a lysine residue, which is a constituent of E1 and / or E2.
  • DOTA and FITC may also be simultaneously coupled to a lysine residue, especially if the lysine residue is positioned N-terminal in the compound.
  • the lysine residue may be part of the transport peptide, but also connect to it at the N- or C-terminal and, for example, represent the link to E2.
  • the lysine residue may preferably be covalently bound to the transport peptide or to E2 via its ⁇ -amino group or its ⁇ -carboxyl group.
  • the lysine residue is, so to speak, a "hanger" for the complexing agent or the fluorescent marker.
  • El and / or E3 has a spacer which preferably has 2 amino acids, which spaces the complexing agent and the fluorescent label from one another.
  • the spacer has the function to prevent any existing steric interference between the complexing agent and the fluorescent marker. This measure therefore has the advantage that the complexing and signaling capacity of the complexing agent or fluorescence marker is ensured, if necessary, even increased.
  • the spacer may consist of a short peptide of 2 to 15 arbitrary amino acids, for example 2 lysine residues, but 2 glycine residues are preferred. Alternatively come as a spacer in question aminohexanoic acid (Ahx), beta-alanine, Argininreste etc.
  • Another object of the present invention relates to the use of the compound of the invention for the preparation of a diagnostic or / and therapeutic composition, which is preferably a contrast agent for magnetic resonance imaging (MRI) or for nuclear medicine.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • Another object of the present invention relates to a diagnostic and therapeutic composition
  • a diagnostic and therapeutic composition comprising the compound of the invention and a diagnostically or therapeutically acceptable carrier.
  • Diagnostically and therapeutically acceptable carriers are comprehensively described in the art and are selected according to the desired application form by a person skilled in the art; see. Bauer et al. (1999), Textbook of Pharmaceutical Technology, 6th Edition,ticianliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart 1999; Row R.C., Sheskey et al. (2006), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5th Ed., Pharmaceutical Press and American Pharmacists Association. The content of the two aforementioned publications is incorporated by reference into the present application.
  • a further subject matter of the present invention relates to a method for the diagnostic and / or therapeutic treatment of a living being, comprising the following steps: (a) administering the diagnostic and / or therapeutic composition according to the invention to the animal, and (b) carrying out an imaging method.
  • the imaging technique is magnetic resonance imaging (MRI) (auto) radiography, PET, scintigraphy, computed tomography, etc.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • PET PET
  • scintigraphy computed tomography
  • Fig. 1 shows schematically various embodiments of the compound according to the invention
  • Fig. 2 shows schematically the operating principle of the compound according to the invention
  • FIG. 3 shows the result of confocal laser microscopy on LNI 8 glioma cells after incubation with compound V4 in the presence of blocked, inactive matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) or active MMP-2. Nuclei staining only occurs after cleavage of the cell nuclei Conjugates through the active MMP-2;
  • MMP-2 matrix metalloproteinase 2
  • FIG. 4 shows the result of a confocal laser microscopy of U373 (top) and Ll8 (bottom) glioma cells after incubation with compound V5 in culture medium with blocked, inactive MMP-2 or active MMP-2. Only the conjugate V5 cleaved by the active MMP-2 accumulates in the cell nuclei (bottom). If the compound V5 is not cleaved, the cells remain uncolored;
  • Figure 5 shows the result of FACS (fluorescence activated cell sorting) analysis of LN18 glioma cells after incubation with compounds V2 or V4 in culture media, each with inactive or active MMP-2. If both conjugates are cleaved by the active MMP-2, there is a marked increase in the strongly stained cells, recognizable by a shift of the histogram peak to the right. The shift is more pronounced after splitting of the connection V4.
  • 6 shows the result of HPLC (high-performance liquid chromatography) of compound V5 or V5a, ie with and without gadolinium, before and after cleavage by MMP-2. The large peak before cleavage split into two new peaks after cleavage, representing the two cleavage products;
  • Fig. 8 shows a magnetic resonance tomographic image of a human LN18 glioma between the anterior horns of the lateral ventricles of a nude mouse. Thirty minutes after intraperitoneal administration of compound V4a, the tumor significantly increases in signal intensity compared to the native image.
  • Example 1 Basic structure of the compound according to the invention.
  • Fig. 1 various embodiments of the compound according to the invention are shown in a schematic manner.
  • Partial figure A shows the basic structure of the connection in linear form. On the left side of the N-terminus and on the right side of the C-terminus of a peptidic compound of the invention is shown.
  • the first moiety El which has the transport peptide and a complexing agent for metals, is preferably covalently linked to the second moiety E2, which has the tumor or mouse interface virus-specific proteases, ie having the specificity-promoting peptide.
  • the bent arrow symbolizes the approach or interface for the tumor- or virus-specific proteases in E2.
  • the second unit E2 is preferably covalently linked to the third unit E3 comprising the second complexing agent for metals.
  • the transport peptide is represented by a nuclear localization sequence (NLS), at the C-terminal end of which is a lysine residue (K), which is covalently bound to the NLS via its ⁇ -amino group.
  • NLS nuclear localization sequence
  • K lysine residue
  • DOTA covalent coupling of the complexing agent, which is represented by DOTA, takes place via the ⁇ -amino group of the lysine residue.
  • the NLS, the lysine residue and DOTA are attributed to the first unit E.
  • the specificity-promoting peptide is the second unit E2.
  • the C-terminus of the specificity-conferring peptide is linked via a peptide bond to the ⁇ -amino acid of another lysine residue, which in this exemplary embodiment is assigned to the third unit E3 , to whose ⁇ -amino group the second complexing agent is covalently bonded, which is also represented by DOTA.
  • the first unit El has a further lysine residue (K), which connects C-terminally to the first lysine residue by means of peptide bonding.
  • the ⁇ -amino group of the second lysine residue is covalently linked to a fluorescent label represented by FITC.
  • the fluorescence marker coupled via a lysine residue is located at the C-terminal end of the compound according to the invention, ie in the third unit E3.
  • the third unit E3 has a further nuclear localization sequence (NLS) which is located at the C-terminus of the compound according to the invention and is covalently coupled with its N-terminus to the lysine residue which is used as a "hanger". carries the fluorescent marker FITC.
  • NLS nuclear localization sequence
  • the first unit E1 or the third unit E3 has the fluorescent marker FITC in addition to the complexing agent DOTA, but both the first unit E1 and the third unit E3.
  • the fluorescence signal emanating from the compound according to the invention is thereby further enhanced.
  • the embodiment according to partial illustration H has in the first unit E1 and the third unit E3 the NLS flanked by the complexing agent DOTA and the fluorescence marker FITC.
  • the first unit El and the third unit E3 each have two NLS, between each of which the complexing agent DOTA and FITC are arranged.
  • Partial Figure J shows a particular embodiment of the compound according to the invention, in which between the complexing agent DOTA and the fluorescent marker FITC a so-called spacer (SPACER) is arranged, which may consist of two amino acids, preferably of two glycine residues.
  • the spacer spaces the complexing agent from the fluorescent label and thereby prevents the formation of negative interactions between the two components and ensures their functionality.
  • the particular embodiments of the compound according to the invention according to the partial illustrations E to J have the advantage that after cleavage of the compound in E2 both cleavage products, i. El and E3 due to the respective presence of a transport peptide or a nuclear localization sequence (NLS) penetrate into the cytoplasm and the nucleus of tumor cells and can develop their effect there.
  • a transport peptide or a nuclear localization sequence NLS
  • only the cleavage product El is capable of doing so, since only this has a transport peptide or an NLS.
  • the cleavage product E3 remains in the interstitium and is removed after a certain time from the interstitium and the organism.
  • FIG. 2 schematically illustrates the mode of action with reference to a particular embodiment of the compound according to the invention, in which both the first unit E1 and the third unit E3 have a transport peptide represented by 4 arginine residues (RRRR).
  • a complexing agent is covalently coupled, which chelates gadolinium has (Gd-DOTA).
  • Gd-DOTA gadolinium has
  • the unit E2 which has an interface which is recognized and cleaved by the tumor-specific protease MMP-2.
  • This mirror-image construction of the invention compound can not invade healthy untransformed cells due to their size and lack of MMP-2 (left). Only in the presence of transformed tumor cells that secrete MMP-2 into the environment, the specificity-mediating centrally located peptide is cleaved. The released fission products, which contain E1 and E3 as well as fragments of E2, can be absorbed into the cytoplasm and the cell nucleus of the tumor cell due to the particular arginine-rich transport peptide and its reduced size (right).
  • the cleavage products are then "disposed of" via macrophages and the possibly complexed metal is finally eliminated from the organism.
  • the synthesis was carried out by the Fmoc solid phase method on an Eppendorf ECOSYN P peptide synthesizer (Eppendorf-Biotronik, Hamburg, Germany).
  • the basic cleavable 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group served as the amino-protecting group.
  • the carrier material used was the Tentagel S Rink amide resin (Rapp polymers, Tübingen, Germany).
  • the syntheses were carried out on a 0.1 mmol scale.
  • the Fmoc residue was cleaved with 25% piperidine / DMF solution in 11 min.
  • the N-terminal amino acid is introduced into the peptide in the case of proline as Boc-proline.
  • the peptide is protected by the Boc group. This is done by shaking the peptide resin with 10 eq. Di-tert-butyl dicarbonate [Boc 2 O] / 10 eq. Diisopropylethylamine in dichloromethane within one hour at room temperature.
  • the Mmt side-chain protecting group is cleaved by one-hour addition of 1% TFA / DCM solution containing 1% triisopropylsilane. After multiple washes with DMF and neutralization of the resulting TFA salt with diisopropylethalamine, the exposed side chain is coupled to l, 4,7,10-tetraacacyclododecane-1.4.7.
  • DFA Tritert-butyl ester-10-acetic acid
  • the deprotection group is cleaved by repeatedly adding the resin with a 2.5% hydrazine hydrate solution in DMF within one hour. After multiple washes with DMF, the fluorescein urea derivative is prepared by coupling 0.5 mM fluorescein 5 (6) isothiocyanate in the presence of eq. Amount of diisopropylethylamine in DMSO coupled overnight at room temperature.
  • K lysine
  • R arginine
  • P proline
  • V valine
  • G glycine
  • FITC fluorescent dye, fluorescein isothiocyanate
  • DOTA complexing agent for gadolinium, tetraazacyclododecan- tetraacetic acid
  • Gd gadolinium or gadolinium ion Gd 3+ .
  • the transport peptide is underlined, the specificity-promoting peptide in italics, the spacer shown in bold.
  • the N-terminus is on the left, the C-terminus on the right.
  • APMA 4-aminophenyl mercuric acetate
  • MMP-2 matrix metalloproteinases
  • MMP-2 The blocking of MMP-2 with the MMP-2 inhibitor I was as previously described by Yin et al. (2006), Matrix Metalloproteinases Expressed by Astrocytes Mediate Extracellular Amyloid- ⁇ Peptides Catabolism, The Journal of Neuroscience 26 (43): 10939-10948.
  • the controls used were four small bottles in which both cell lines were incubated with a one day old medium both with and without APMA. Detection of phosphatidylserine in the outer membrane leaf to determine apoptosis was performed with Annexin V-Alexa TM 568 reagent according to the manufacturer's recommendation (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, USA).
  • the cells were collected and then divided into 16 eppendorf tubes (6 x 10 6 cells per tube).
  • the cells in the first four tubes served as control (RPMI medium only with and without APMA, two cell lines).
  • the two cell lines in the other 12 tubes were incubated with compounds 2A, 4A and 5A (130 and 260 ⁇ M, respectively) for 2 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 both with and without MMP-2 inhibitor I. It was then washed 3 times with PBS and centrifuged at 800 rpm (rounds per minute) for 5 min.
  • TR repetition time
  • TE echo time
  • flip angle 90 ° averages: 1, concatenations: 2, measurements: 2, number of slices: 19, distance factor: 30%, slice thickness: 3 mm
  • field of view phase 100%
  • base resolution 256
  • phase resolution 100%
  • voxel size 0.7 x 0.7 x 3.0 mm
  • scan time 1:48 min.
  • TR 20-8000 ms (50 different TR values), TE: 6.4 ms, flip angle 90 °, averages: 1, measurements; 1, slice thickness: 1 mm, field of view read: 120 mm, field of view phase: 87.5, base resolution 128, phase resolution; 100%, voxel size: 0.9 x 0.9 x 1 mm.
  • the FACS analysis was performed on a Becton-Dickinson FACSCalibur. [100 ml of cell suspension (1 x 10 6 cells + 300 ml FACS buffer (DPBS buffer with 1% paraformaldehyde)] Approximately 25,000 to 35,000 cells were measured per sample [fluorescence excitation: argon ion laser (480 nm), fluorescence detection: 540 to 565 nm bandpass filter]. The experiments were repeated twice. 3.6 Implantation of tumors
  • mice CDI Female nude mice CDI (Nu / Nu) were from Charles River (Sulzfeld, Germany) (weight: 25 g, age: 7 weeks). Human LN18 glioma cells were cultured and implanted into the mouse brain as described by Friese et al. (2003), MICA / NKG2D-mediated Immunogenic Therapy of Experimental Gliomas, Cancer Res. 63 (24): 8996-9006. described. The experiments were carried out 3 weeks after implantation.
  • the MRI was performed with a 3 Tesla whole-body device (Trio Siemens).
  • mice were in a ball of the wrist in a belly.
  • the MRI protocol consisted of the following sequences:
  • the organs including the brain, were harvested and frozen in Tissue-Tek OCT (Sakuta, Tokyo, Japan) liquid nitrogen.
  • the nuclei were also stained with propidium iodide, a typical nuclear stain for control.
  • the conjugate was localized in the cells using the Confocal Laser Scanning Microscope.
  • Haematoxylin and eosin (H & E) stained sections were made for transmitted light microscopy to be sure that a tumor is present.
  • the investigations carried out were carried out with the compounds V2, V4 and V5 without gadolinium and the corresponding gadolinium-containing compounds V2A, V4A and V5A.
  • the NLS of the SV40 T antigen alone with the DOTA complex (compound 2) which is connected at the C-terminal end via an MMP-2-sensitive peptide bridge with a second DOTA complex
  • the NLS of SV40 T Antigen which is extended by 4 arginines and is connected at the N-terminal end via a MMP-2-sensitive peptide bridge with a second DOTA complex (compound 4).
  • the gadolinium-containing compounds 4A and 5A and the gadolinium-free compounds 4 and 5 resulted in a higher fluorescence after cleavage by MMP-2 compared to the compounds 2 and 2A depending on the concentration ( Figure 5, exemplified for compounds 2 and 4) and to higher signal intensity in MRI (see Figure 7, exemplified for compounds 2A and 4A), the presence of gadolinium within the DOTA complex in all compounds resulted in only a slight impairment of transmembrane transport.
  • Fig. 7 (exemplified for compounds 2A and 4A).
  • a significant shortening of the Tl time occurred after incubation of the cells with the compounds in an inhibitor-free medium, wherein the compounds 4A and 5A in the Compared to compound 2A, depending on the concentration, led to a greater reduction in Tl time; see. Fig. 7 (exemplified for compounds 2A and 4A).
  • the sites of increased signal intensity in the MRI histologically corresponded to the tumor areas. With the CLSM, stained nuclei only appeared in these areas. The healthy brain parenchyma remained unstained.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung, die als Kontrastmittel sowie als therapeutisches Agens eingesetzt werden kann, die Verwendung der Verbindung zur Herstellung einer diagnostischen oder therapeutischen Zusammensetzung, eine diagnostische und therapeutische Zusammensetzung, die die Verbindung aufweist sowie ein Verfahren zur diagnostischen und therapeutischen Behandlung eines Lebewesens.

Description

Aktivierbare diagnostische und therapeutische Verbindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung, die als Kontrastmittel sowie^ als therapeutisches Agens eingesetzt werden kann, die Verwendung der Verbindung zur Herstellung einer diagnostischen oder therapeutischen Zusammensetzung, eine diagnostische und therapeutische Zusammensetzung, die diese Verbindung aufweist sowie ein Verfahren zur diagnostischen und therapeutischen Behandlung eines Lebewesens.
Verbindungen und Verfahren dieser Art sind im Stand der Technik allgemein bekannt. Ein Ziel der modernen Medizin und Pharmazie ist es verbesserte therapeutische und diagnostische Verbindungen oder Zusammensetzungen zu entwickeln, die zielgerichtet eingesetzt werden können, d.h. in einer Art und Weise, dass diese nach der Verabreichung selbstständig die Gebiete oder Zielstrukturen des Organismus auffinden, in bzw. an denen sie ihre Wirkung entfalten bzw. sich akkumulieren sollen.
Kontrastmittel, wie z.B. Gadoliniumkomplexe, die üblicherweise routinemäßig in klinischen Magnetresonanzuntersuchungen (magnetic resonance imaging, MRI) eingesetzt werden, wie bspw. Magnevist (Schering) oder DOTAREM (Guerbet), reichern sich nach ihrer Verabreichung in einen Patienten in dem Extrazellularraum an und sind nicht in der Lage, in das Cytoplasma der Zellen einzudringen; Prantner et al. (2003), Synthesis and characterization of a Gd-DOTA-D-permeation peptide for magnetic resonance relaxation enhancement of intracellular targets, Mol. Imaging 2(4): 333-41. Bei der Darstellung von bspw. Hirntumoren ergeben sich dadurch erhebliche Nachteile. Das Tumorgewebe lässt sich nämlich häufig nicht exakt von gesundem oder entzündlichem Gewebe unterscheiden und es kommt nur zu einer verwaschenen Darstellung der Tumorgrenzen. Wird ein solches extrazelluläres Kontrastmittel während oder direkt nach einer Operation verabreicht, so läuft das Kontrastmittel sogar entlang des durch den Operateur eröffneten Zwischenzellraums bis über die Tumorgrenzen hinaus, was diese Technik sehr begrenzt; Okudera et al. (1994), Intraoperative CT scan findings during resection of glial tumours, Neurol. Res. 16(4): 265-7.
Mit Kontrastmitteln, die sich im Cytoplasma oder gar im Zellkern von Tumorzellen anreichern, würden sich aber Tumorränder in der Magnetresonanztomographie besser darstellen lassen.
In der WO 01/08712 A2 wird ein gadoliniumhaltiges Kontrastmittel zur Verwendung in der Magnetresonanztomographie beschrieben, das äußerst komplex aufgebaut ist. Das bekannte Kontrastmittel ist dafür vorgesehen, um über sog. „Target Binding Moieties" (TBM) an große Proteine im Blut, wie bspw. Albumin oder Fibrin, zu binden, und solange wie möglich im Blutstrom zu verbleiben. Das bekannte Kontrastmittel ist weder in der Lage in das Cytoplasma noch in den Zellkern von biologischen Zellen einzudringen.
Caravan et al. (2003), Gadolinium-binding helix-turn-helix peptides: DNA-dependent MRI contrast agents. Chem. Commun., 2574-2575, beschreiben ein peptidisches DNA-bindendes Kontrastmittel, das aus insgesamt 33 Aminosäuren besteht, einen zentral angeordneten Abschnitt, der sich von einer calciumbindenden EF-Hand ableitet und in der Lage ist Gadolinium zu chelieren, und einen N- und C-terminalen Peptidabschnitt aufweist, über den eine Bindung des Konstruktes an DNA erfolgt. Das bekannte Kontrastmittel ist in der Lage in das Cytoplasma von Zellen, nicht jedoch in den Zellkern einzudringen. Ferner ist die Affinität des bekannten Peptides für Gadolinium zu niedrig, so dass eine biologische Anwendung als Kontrastmittel aufgrund der Gefahr der Freisetzung des toxischen Gadoliniumions in den Organismus nicht in Frage kommt.
In dem Dokument WO 2004/050698 A2 werden gadoliniumenthaltende Kontrastmittel zur Verwendung in der Magnetresonanztomographie offenbart. Diese Kontrastmittel weisen neben Gadolinium 4 Moleküle eines chelierenden Agens [(DTPH)4] und ein Peptid auf, das sog. NLS- und TPU-Abschnitte enthält. Der TPU-Abschnitt („transport peptide unit" bzw. „transmembrane module") leitet sich von Penetratin, Transportan oder dem HOX-Bl -Protein ab und vermittelt die Zellmembranpermeabilität des Kontrastmittels. Der NLS-Abschnitt („nuclear localization sequence" bzw. Kernlokalisierungssequenz) vermittelt die Zellkernmembranpermeabilität des bekannten Kontrastmittels. Nach Auffassung der Autoren ist dieses Kontrastmittel deshalb in der Lage sowohl in das Cytoplasma als auch den Zellkern einzudringen. Nachteilig bei diesem bekannten Kontrastmittel ist insbesondere, dass es sehr groß und aufwändig herzustellen ist. Die offenbarten Verbindungen weisen Molekulargewichte von ca. 4.700 kDa bis 6.500 kDa auf. Aufgrund des ungünstigen Gewichtsverhältnisses des großen TPU-Abschnittes zu dem gadoliniumenthaltenden signalgebenden Abschnitt wird das emittierte Signal in der Magnetresonanztomographie negativ beeinflusst. D.h. das emittierte Signal ist relativ schwach. Das bekannte Kontrastmittel weist ferner eine Disulfidbrücke auf. Dies hat den Nachteil, dass die Disulfidbrücke bereits im Blutkreislauf durch Disulfidreduktasen gespalten werden kann, was zu einer Inaktivierung des bekannten Kontrastmittels führt.
In der WO 2006/056227 Al wird ein gadoliniumhaltiges Kontrastmittel zur Verwendung in der Magnetresonanztomographie vorgeschlagen. Das bekannte peptidische Kontrastmittel weist in zentraler Position ein von DTPA cheliertes Gadolinium auf, das N- und C-terminal von kurzen Peptiden flankiert wird, die eine positive Nettoladung aufweisen. Nach Auffassung der Autoren wird durch die flankierenden Peptide eine Penetration des Cytoplasmas und des Zellkerns bzw. eine Penetration der Zellmembran und der Zellkernmembran von biologischen Zellen ermöglicht. Nach einer modifizierten Ausgestaltung des bekannten Kontrastmittels, das als Konjugat 8 bzw. C8 bezeichnet wird, ist am C-Terminus der bekannten Verbindung über ein kurzes Peptid, das eine Schnittstelle für das tumorzellspezifische Enzym Matrix- Metalloproteinase 2 (MMP-2) aufweist, ein negativ geladenes Peptid angekoppelt, das die Ladung und damit Funktion der beiden positiv geladenen Peptide, die den Gd- DTPA-Komplex flankieren, neutralisieren. Das so modifizierte bekannte Konjugat ist dadurch nach Auffassung der Autoren nicht in der Lage in nicht-transformierte, d.h. gesunde Zellen einzudringen. Tumorzellen sekretieren MMP-2 in ihre Umgebung. Befindet sich das bekannte Konjugat in der Umgebung einer solchen Tumorzelle, wird die Schnittstelle in dem verbindenden Peptid erkannt und durchtrennt. Die negative Ladung des angekoppelten Peptides kann nun die positive Ladung der flankierenden Peptide nicht mehr neutralisieren. Das gespaltene Konjugat 8 soll nun in der Lage sein wieder in die Zellen einzudringen. Da das Enzym MMP-2 lediglich von Tumorzellen sekretiert wird erfolgt eine Aufnahme des Konjugates nur in Tumorzellen, nicht aber in gesunde Zellen. Das aus der WO 2006/056227 Al bekannte Konjugat 8 hat sich jedoch in der Praxis nicht bewährt. So hat sich gezeigt, dass das neutralisierende negativ geladene Peptid, das im Wesentlichen aus Glutaminsäureresten besteht, nach dessen Abspaltung im Körper neurotoxisch wirkt; vgl. Garattini (2000), Glutamic Acid, Twenty Years Later, J. Nutr. 130(4S Suppl):901S-9S. Eine Anwendung des Konjugates 8 im Menschen scheidet deshalb aus. Auf dem gleichen Prinzip beruhende Peptide, die selektiv in Zellen bzw. den Zellkern von Tumorzellen eindringen können, werden von Jiang et al. (2004), Tumor Imaging by Means of Proteolytic Activation of Cell-Penetrating Peptides, PNAS Vol. 101, No. 51, 17867 - 17872 (vgl. auch WO 2005/042034), und von Liu et al. (2007), Character- istics and In Vitro Imaging Study of Matrix Metalloproteinase-2 targeting Activable Cell-Penetrating Peptide, Natl. Med. J. China, Vol. 87, No. 4, 233 - 239, beschrieben. Auch diese Peptide werden in der Umgebung von Tumorzellen selektiv gespalten und setzen dann neurotoxische glutaminsäurehaltige Peptide in den Körper frei. Hinzu kommt, dass das von Jiang et al. beschriebene Peptid nur einen Fluoreszenzmarker aufweist, nicht aber eine röntgendichte oder in der Magnetresonanztomographie signalgebende Einheit, und damit deshalb lediglich oberflächliche Tumoren darstellbar sind. Bereits aus diesem Grunde scheidet eine Anwendung im Menschen aus.
Pharmazeutische Substanzen, z.B. cytotoxische Agenzien, die gegenwärtig in der Behandlung von Tumorerkrankungen eingesetzt werden, sind weitgehend unspezifisch und richten sich gegen sämtliche sich schnell teilende Zellen. Dies resultiert in schwerwiegenden Nebenwirkungen, z.B. der Schädigung von gesunden Geweben oder Zellen, wie die des blutbildenden Systems, den Gonaden oder Haarfollikeln etc. Der erste Schritt für die Entwicklung eines zellulär zielgerichteten und tumorspezifischen Agens läge deshalb in der Bereitstellung einer Verbindung, die zielgerichtet in das Cytoplasma bzw. den Zellkern einer Tumorzelle eindringen und dort ihre cytoto- xischen Eigenschaften entfalten kann, ohne jedoch gesunde Zellen zu schädigen.
Vor diesem Hintergrund liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine diagnostisch und/oder therapeutisch wertvolle Verbindung bereitzustellen, mit der die Nachteile der im Stand der Technik bekannten Verbindungen weitgehend vermieden werden. Insbesondere soll eine solche Verbindung bereitgestellt werden, die als verbessertes Kontrastmittel oder therapeutischer Wirkstoff eingesetzt werden kann und zielgerichtet und selektiv in das Cytoplasma bzw. den Zellkern von Tumorzellen bzw. virusinfizierten Zellen eindringen kann und dort die signalgebenden bzw. cytotoxischen Eigenschaften entfalten kann. Eine solche Verbindung sollte im Großmaßstab kosteneffizient herstellbar sein. Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung einer Verbindung gelöst, die Folgendes aufweist:
- eine erste Einheit (El), aufweisend:
- eine eine Permeabilität durch die Zellmembran und Zellkernmembran vermittelnde Komponente (Transportkomponente),
- einen Komplexbildner für Metalle,
- eine zweite Einheit (E2), aufweisend:
- ein zumindest eine Schnittstelle für tumor- oder virusspezifische Proteasen aufweisendes Peptid (spezifitätvermittelndes Peptid), und
- eine dritte Einheit (E3), aufweisend:
- zumindest einen Komplexbildner für Metalle, wobei El mit E2 und E2 mit E3 verbunden sind.
Eine nach diesem Grundprinzip aufgebaute Verbindung löst das der Erfindung zugrunde liegende Problem vollkommen.
Transportkomponenten, die eine Permeabilität durch die Zellmembran und die Zellkernmembran vermitteln, sind im Stand der Technik umfassend beschrieben. Sie umfassen peptidische Verbindungen, die bspw. beschrieben sind in Martin und Rice (2007), Peptide-guided Gene Delivery, The AAPS Journal 9(1), E18 - E29, und in Schwartz und Zhang (2000), Peptide-mediated cellular delivery, Current Opinion in Molecular Therapeutics 2(2); der Inhalt dieser Publikationen ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung. Transportkomponenten umfassen aber auch nicht-peptidische Komponenten, wie bspw. Cortison, Progesteron oder Peroxi- som-Proliferator-aktivierter Rezeptor (PPAR)-Ligand. Nicht-peptidische Komponenten haben den Vorteil, dass diese sehr klein sind. Die Transportkomponenten weisen in der Regel eine positive Nettoladung auf, können aber auch neutral sein. Zellmembran- und Zellkernmembranpermeabilität bedeutet, dass die erfindungsgemäße Verbindung unter physiologischen Bedingungen spezifisch in das Cytoplasma und in den Zellkern von intakten Zellen eindringen kann. Die Permeabilität der erfindungsgemäßen Verbindung durch die Zellmembran und Zellkernmembran lässt sich in vitro in der Zellkultur einfach messen, z.B. durch Inkubation eines ersten Aliquots der Verbindung in einer Tumorzellkultur vs. eines zweiten Aliquots der Verbindung in einer Kultur aus gesunden Zellen. Die Verbindung in der Tumorzellkultur lässt sich nach kurzer Zeit im Zellkern finden, wohingegen sich die Verbindung in der Kultur aus gesunden Zellen nicht oder nur in sehr geringem Maße, im wesentlichen unspezifisch, im Zellkern finden lässt.
Komplexbildner für Metalle, wie bspw. Gadolinium (Gd), Gallium (Ga), Mangan (Mn), Eisen (Fe), Yttrium (Y), sind im Stand der Technik umfassend beschrieben, und umfassen bspw. Tetraazacyclododecantetraessigsäure (DOTA), Diethylentriaminpen- taessigsäure (DTPA), BOPTA, EOB-DTPA, DTPA-DMA, HP-DOBA, DTPA-BMEA, HIDA, DTDP, Porphyrine, Texaphyrine etc. Diese Komplexbildner lassen sich mittels Routinemethoden leicht an Peptide koppeln, bspw. an Lysinreste.
Schnittstellen für tumor- oder virusspezifische Proteasen sind im Stand der Technik umfassend beschrieben. Es ist bekannt, dass verschiedene Tumor- bzw. Karzinomzellen charakteristische Enzyme exprimieren und die Letzteren in ihre zelluläre Umgebung sekretieren. Diese können bei invadierenden Tumoren das umgebende Bindegewebe verdauen, um das Eindringen der transformierten Zellen in bislang gesunde Gewebe oder Organe zu ermöglichen. Glioblastome exprimieren und sekretieren bspw. die Matrix-Metalloproteinase 2 (MMP- 2). MMP-2 erkennt die Aminosäuresequenz PLGVR oder PLGLA . Mammakarzinome exprimieren und sekretieren vorwiegend Cathepsine. Cathepsin B erkennt die spezifischen Aminosäuresequenzen HK und/oder RR. Cathepsin D erkennt die Sequenz PIC(Et)FF, wobei „Et" eine Esterzweigstelle bezeichnet. Cathepsin K erkennt und schneidet die spezifische Aminosäuresequenz GGPRGLPG. Prostatakarzinome exprimieren und sekretieren vorwiegend das prostataspezifische Antigen (PSA). PSA erkennt und schneidet die Aminosäuresequenz HSSKLQ. Andere tumorzellspezifische Enzyme und ihre spezifischen Erken- nungs- und Spaltstellen sind im Stand der Technik umfassend beschrieben. Ein Überblick hierüber wird in Hahn W. C. und Weinberg R.A. (2002), Rules for making human tumour cells, N. Engl. J. Med., 347: 1593-1603 gegeben. Der Inhalt dieser Publikation ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.
Im Stand der Technik ist ebenfalls gut bekannt, dass Zellen, die von Viren infiziert wurden, virusspezifische Proteasen exprimieren und sekretieren. Herpes-Simplex- Virus (HSV) infizierte Zellen sekretieren bspw. die HSV-Protease. Die HSV-Protease erkennt und schneidet die Aminosäuresequenzen LVLASSSVGY und LVLASSSFGYS. Zellen, die von dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) infiziert wurden, exprimieren und sekretieren die HIV-Protease. Die HIV-Protease erkennt und schneidet die Aminosäuresequenz GVSQNYPIVG. Zellen, die von dem Cytomegalovirus (CMV) infiziert wurden, exprimieren und sekretieren eine CMV-Protease, die die Aminosäuresequenz GWQASCRLA erkennt und schneidet.
Die konkrete Aminosäuresequenz des spezifitätvermittelnden Peptides wird von dem Fachmann in Abhängigkeit der gewünschten Spezifität der erfindungsgemäßen Verbindung für einen bestimmten Tumor oder eine bestimmte Virusinfektion ausgewählt.
Die Einheiten El und E2 sowie E2 und E3 sind miteinander verbunden, bspw. linear E1-E2-E3, NH2-El -E2-E3-COOH oder COOH-E1-E2-E3-NH2. Diese Verbindung kann auf jede beliebige Art und Weise erfolgen, vorzugsweise durch kovalente Bindung bzw. Peptidbindung zwischen den Einheiten.
Der Erfinder konnte überraschenderweise eine solche Verbindung bereitstellen, die sich in ihrer Fähigkeit in das Cytoplasma bzw. Zellkerne von gesunden Zellen eindringen zu können, selbst blockiert. Diese Selbstblockade wird durch das Vorhandensein der zumindest zwei Komplexbildner für Metalle gewährleistet, nämlich als Bestandteil von El und Bestandteil von E3. Aufgrund der damit verbundenen Größe und Konfiguration der Verbindung, wird eine Aufnahme in das Cytoplasma bzw. den Zellkern von gesunden Zellen verhindert. Die Verbindung verbleibt vielmehr im Interstitium und wird nach einiger Zeit aus dem Organismus ausgeschieden. In der Umgebung von Tumorzellen bzw. virusinfizierten Zellen hingegen wird das spezifi- tätvermittelnde Peptid in E2 von den tumor- bzw. virusspezifischen Proteasen erkannt und geschnitten. E3 wird dadurch von der Verbindung abgespalten und El kann aufgrund der Transportkomponente in das Cytoplasma und den Zellkern der Tumorzelle eindringen. Die abgetrennte Einheit E3 verbleibt nach der Abspaltung durch die tumor- oder virusspezifische Protease noch für einige Zeit im Interstitium und wirkt bei einer Ausgestaltung als Kontrastmittel vorteilhafterweise maßgeblich bei der Signalgebung im Tumor bzw. infizierten Areal mit, bis sie aus dem Interstitium abgeführt und dem Organismus ausgeschieden wird. Besonders vorteilhaft ist, dass die abgetrennte Einheit E3 keine neurotoxischen Eigenschaften aufweist, wie dies bspw. bei den abgespaltenen Peptidfragmenten der Fall ist, die in der WO 2006/056227 Al (a.a.O.), von Jiang et al. (a.a.O.) oder Liu et al. (a.a.O.) beschrieben werden.
Die erfindungsgemäße Verbindung wird in der Umgebung von tumor- bzw. virusinfizierten Zellen sozusagen „aktiviert" und Zellmembran- und zellkernmembranperme- abel, wohingegen eine solche Aktivierung in Gegenwart von gesunden Zellen ausbleibt. Dieser Vorgang ist hochselektiv und spezifisch, so dass die erfindungsgemäße Verbindung ihre Eigenschaften ausschließlich in Tumorzellen bzw. virusinfizierten Zellen entfaltet.
Die erfindungsgemäße Verbindung ist erstaunlich kompakt und klein und ist deshalb kostengünstig im Großmaßstab herstellbar. Insbesondere kommt die erfindungsgemäße Verbindung mit lediglich einer Transportkomponente aus, die sowohl die Permeabilität durch die Zellmembran als auch durch die Zellkernmembran vermittelt. Eine separate TPU, wie bspw. bei der aus der WO 2004/050698 bekannten Verbindung ist nicht erforderlich. Auch eine Kernlokalisierungssequenz (NLS) ist nicht zwingend erforderlich. Als Transportkomponente reicht ein kurzes positiv geladenes Peptid, bspw. PKKKRKV, aus, das fakultativ um 4 Arginine verlängert werden kann, d.h. PKKKRKVflftRR. Es versteht sich, dass Variationen hiervon denkbar sind.
Im Vergleich zu der aus der WO 2004/050698 bekannten Verbindung kommt die erfindungsgemäße Verbindung ferner ohne Disulfidbrücke aus. Die erfindungsgemäße Verbindung ist deshalb besonders stabil und es besteht nicht die Gefahr, dass diese bereits im Blutkreislauf gespalten und inaktiviert wird.
Wie der Erfinder feststellen konnte, übt die erfindungsgemäße Verbindung vorteilhafterweise auf gesunde Zellen keine Cytotoxizität aus, d.h. die Vitalität der Zellen bleibt unbeeinflusst. Im Zellkern der Tumor- und virusinfizierten Zellen jedoch löst das El -aufweisende Spaltprodukt der erfindungsgemäßen Verbindung zielgerichtet Apoptose aus ohne dass dabei entzündliche Prozesse auftreten oder etwa umliegendes gesundes Gewebe geschädigt wird. Das El -aufweisende Spaltprodukt wird dann im Rahmen des Apoptoseprozesses zusammen mit apoptotischem Gewebe von Makrophagen aus dem Körper entsorgt, so dass, im Falle der Komplexierung von Metallen, keine ggf. toxischen Metalle im Körper verbleiben. Dabei ist der zugrundeliegende apoptoseauslösende Mechanismus bislang noch weitgehend unbekannt, wobei dem Komplexbildner und dem Transportpeptid diesbezüglich eine wichtige Rolle zugeschrieben werden. Die erfindungsgemäße Verbindung ist deshalb als Therapeutikum und Diagnostikum besonders geeignet.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, wenn die Transportkomponente ein Peptid ist (Transportpeptid) .
Transportpeptide, die eine Permeabilität durch die Zellmembran und die Zellkernmembran vermitteln, sind im Stand der Technik umfassend beschrieben; vgl. WO 2006/056227 Al. Martin M.E. und Rice K.G., insbes. Tabelle 1 (a.a.O.) und Schwartz, JJ. und Zhang S. insbes. Tabelle 2 (a.a.O.); der Inhalt dieser Publikationen und der Tabellen ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung. Die Transportpetide sind durch ihre positive Nettoladung gekennzeichnet, die durch einen Überschuss an positiv geladenen Aminosäuren bereitgestellt wird, bspw. durch Arginin, Lysin und Histidin, und haben eine Länge von 2 bis 40 Aminosäuren, vorzugsweise von 3 bis 20 Aminosäuren, weiter vorzugsweise 5 bis 15 Aminosäuren. Eine bestimmte, konkrete Abfolge der Aminosäuren ist nicht erforderlich, wobei von Vorteil ist, wenn das Transportpeptid verschiedene positiv geladenen Aminosäuren aufweist. Entscheidend ist das Vorhandensein einer positiven Nettoladung. Zu den Transportpeptiden zählen auch Kernlokalisierungssequenzen (NLS). Transportpeptide sind vorzugsweise linear, können aber auch verzeigt sein. Ein geeignetes Transportpeptid weist bspw. folgende Aminosäuresequenz auf: PKKKRKVRRRR.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, wenn die Verbindung ein Molekulargewicht aufweist, das bei ca. 2.000 kDa bis ca. 10.000 kDa, vorzugsweise bei ca. 3.000 kDa bis ca. 6.000 kDa, höchst bevorzugt bei ca. 4.000 kDa liegt.
Hierbei ist von besonderem Vorteil, dass die erfindungsgemäße Verbindung aufgrund des günstigen Verhältnisses von signalgebender Komponente, die durch den Komplexbildner nach Komplexierung eines Metalls gebildet wird, und dem Rest der Verbindung besonders signalstark ist. Die erfindungsgemäße Verbindung kann deshalb ein besonders starkes Signal emittieren bzw. eine besonders starke therapeutische Wirkung entfalten.
Bei dem Komplexbildner für Metalle handelt es sich vorzugsweise um Tetraazacyclo- dodecantetraessigsäure (DOTA).
DOTA ist ein Komplexbildner für Gadolinium. Dieser zeichnet sich durch seine besonders hohe Stabilität aus und ist sowohl in vivo als auch in vitro wesentlich stabiler als DTPA, dem üblichen Komplexbildner für Gadolinium; vgl. Magerstadt et al. (1986), An Alternative to Gd(DTPA) as a Tl,2 Relaxation Agent for NMR Imaging or Spectroscopy, Magn. Reson. Med. 3(5): 808-12; Bousquet et al. (1988), Gd-DOTA: Characterization of a New Paramagnetic Complex, Radiology 166(3): 693-8. Nach einer bevorzugten Weiterbildung der erfindungsgemäßen Verbindung haben die Komplexbildner für Metalle Gadolinium (Gd) komplexiert.
Die Verwendung von Gadolinium (Gd bzw. Gd3+) hat sich bei Kontrastmitteln zur Verwendung in der Magnetresonanztomographie besonders bewährt. Gadolinium weist einen großen Ioneneinfangradius auf und ist deshalb für die Neutroneneinfang- therapie (Neutron Capture Therapy, NCT) gut geeignet. Ein Überblick über die Merkmale und Einsatzmöglichkeiten dieser Therapie findet sich bspw. in Sauerwein W. (1993), Principles and History of Neutron Capture Therapy, Strahlenther. Onkol. 169: 1-6. Ferner hat sich vor Kurzem herausgestellt, dass Gadolinium röntgendicht und deshalb zur Verwendung in der Computertomographie geeignet ist; vgl. Henson et al. (2004), Gadolinium-enhanced CT Angiography of the Circle of Willis and Neck, AJNR Am. J. Neuroradiol. 25(6), 969 - 972. Hinzu kommt, dass Gadolinium im Gegensatz zu bspw. Iod im Organismus keine Allergien auslöst. Im Folgenden wird DOTA, das Gd3+ cheliert hat, d.h. Gd3+-DOTA, als Gd-DOTA bzw. GdDOTA dargestellt.
Nach der spezifischen Aufnahme der erfindungsgemäßen Verbindung in die tumor- bzw. virusinfizierten Zellen wird der Organismus mit einer Neutronenstrahlungsquelle bestrahlt, was in einer Konversion bzw. Aktivierung der neutronenabsorbierenden erfindungsgemäßen Verbindung in eine radiotoxische Substanz resultiert. Da die erfindungsgemäße Verbindung in direktem Kontakt zu der DNA ausschließlich von transformierten bzw. virusinfizierten Zellen steht, werden zielgerichtet ausschließlich solche Zellen zerstört und Nebenwirkungen werden weitgehend vermieden.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung ist das komplexierte Gadolinium radioaktiv markiert.
Die Markierung erfolgt bspw. indem radioaktives Gadolinium 1S3Gd verwendet wird. Alternativ oder zusätzlich kann aber auch 32P, 33P, 35S, 35Cl, 37Cl, 15N, 13N, 13C, 14C, 2H, 3H, 125I, 131I, 18F, 1SO, 67Ga, 111In etc. eingesetzt werden. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die weitergebildete erfindungsgemäße Verbindung auch in der Radiotherapie und der Radiodiagnostik einsetzbar ist.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung weist El und/oder E2 und/oder E3 außerdem einen Fluoreszenzmarker auf.
Geeignete Fluoreszenzmarker umfassen Fluorescein (FITC), der bevorzugt ist, Rhoda- min, Dansylchlorid, Fluorescamin, grünfluoreszierendes Protein (GFP), Ethidi- umbromid, 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), Coumarin, Luciferase, Phycoe- rythrin (PE), Cy2, Cy3.5, Cy5, Cy 7, Texas Red, Alexa Fluor, Fluor X, Red 613, BODI- PY-FL, TRITC, DS Red, GFP, DS Red etc. Mit dieser Maßnahme wird die erfindungsgemäße Verbindung als Forschungswerkzeug weitergebildet, das in der Zellbiologie Verwendung finden kann, bspw. um Mechanismen des cytoplasmatischen oder nuklearen Imports von Molekülen in vitro oder sogar in vivo zu untersuchen. Dieser Marker ermöglicht die Feststellung der Lokalisierung der erfindungsgemäßen Verbindung mittels im Stand der Technik gut etablierter Methoden, wie bspw. die Fluoreszenzmikroskopie, die sogar während einer Operation in vivo angewendet werden kann, oder der Nah-Infrarot-Bildgebung bei oberflächlichen Tumoren. Dabei können die Marker An El, E2, E3 verschieden sein, so dass sich bspw. das Interstitium (E3; Marker 1, z.B. FITC) in einer anderen Farbe darstellen lässt als der Zellkern der Tumorzellen (El; Marker 2, z.B. Rhodamin).
Nach einer bevorzugten Weiterbildung weist E3 der erfindungsgemäßen Verbindung außerdem ein Transportpeptid auf.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass nach der Spaltung von E2 durch eine tumor- zell- oder virusspezifische Protease nicht nur El, sondern auch E3 für die intranukleä- re Bildgebung und/oder Therapie genutzt werden kann. Nach der Spaltung in E2 weisen beide Spaltprodukte, d.h. El und E3 einen Komplexbildner für Metalle und ein Transportpeptid auf, so dass beide Komponenten die Zellmembran und Zellkernmembran durchdringen können. Dabei ist es bevorzugt, wenn das bzw. die Transportpeptide eine Kernlokalisierungssequenz (NLS) aufweisen.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass bereits solche Transportpeptide bereitgestellt werden, die sich als funktionsfähig erwiesen haben. Beispiele von geeigneten NLS sind: PPKKKRKV, und PKKKRKV, beide aus dem SV40-T- Antigen. Weitere Beispiele sind KRRRER und KARKRLK aus dem Simian-Zytomegalovirus. Weitere geeignete NLS stammen aus Transkriptionsfaktoren:
NF-kappaB: VQRKRQKLMP
TFIIE-ß: SKKKKTKV
Oct-6: GRKRKKRT
TCF-l-α: GKKKKRKREKL
HATF-3: ERKKRRRE
C. elegans SDC3: FKKFRKF
Eine andere geeignete bipartite NLS stellt das Apoptin dar, das zwei NLS-Sequenzen enthält, die jedoch auch isoliert verwendet werden können: KPPSKKR und RPRTAKRRIRL.
Eine Übersicht zu NLS-Sequenzen findet seih in Jans D.A. (1995), The Regulation of Protein Transport to the Nucleus by Phosphorylation, Biochem. J., 311(Pt 3), 705- 716. Der Inhalt der vorstehenden Publikation ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.
Transportpeptide mit Sequenzen, die eine Homologie von 80%, 85%, 90%, 95%, 98% zu den vorstehend genannten Sequenzen aufweisen, sind ebenfalls geeignet, um Zellmembran- und Zellkernmembranpermeabilität zu vermitteln. Darunter fallen auch sogenannte „mutierte" NLS mit veränderter Aminosäurereihenfolge und solche, bei denen eine Aminosäure, z.B. Lysin, gegen eine andere Aminosäure, z.B. Threonin, ausgetauscht wird. Nach einer bevorzugten Ausgestaltung weist das bzw. die Transportpeptide eine positive Nettoladung auf.
Der Erfinder hat festgestellt, dass ein solches Transportpeptid ausreichend ist, um die Zellwand- und Zellkernwandpermeabilität der erfindungsgemäßen Verbindung zu gewährleisten. Es ist nicht erforderlich, dass eine vollständige Kernlokalisierungssequenz (NLS) bereitgestellt wird. Das Transportpeptid besteht dabei überwiegend aus basischen Aminosäuren, wie bspw. Arginin, Lysin, Histidin oder modifizierte Varianten hiervon.
Dabei ist es bevorzugt, wenn die Transportpeptide eine Länge von 3 bis 20, weiter bevorzugt von 5 bis 15 und höchst bevorzugt von 7 Aminosäuren aufweisen.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass Transportpeptide mit einer ausreichenden Länge bereitgestellt werden, ohne aber die erfindungsgemäße Verbindung unnötig zu vergrößern. Beispiele von geeigneten Transportpeptiden, die keine Motive einer NLS aufweisen, sind folgende: RRRKRRR, RQIKIWFQNRRMKWKK, RAhxRahxRAhxRAhx- RAhx (Ahx = Aminohexansäure), YGRKKRQRRRP, RHRHHRR, RKHRKH, etc.
Weiter ist es bevorzugt, wenn das bzw. die Transportpeptide folgende Aminosäuresequenz aufweisen: PKKKRKV (SEQ ID Nr. 1).
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine sich von dem SV40-T-Antigen ableitende NLS Verwendung findet, die sich als besonders geeignet erwiesen hat. Transportpeptide mit Sequenzen, die eine Homologie von 80%, 85%, 90%, 95%, 98% zu der SEQ ID Nr. 1 aufweisen, sind ebenfalls geeignet.
Weiter ist es bevorzugt, wenn das bzw. die Transportpeptide der erfindungsgemäßen Verbindung folgende Aminosäuresequenz aufweisen: RRRR (SEQ ID Nr. 2). Der Erfinder hat überraschenderweise festgestellt, dass ein solches kurzes Transport- peptid, das lediglich aus 4 Argininresten besteht, ausreichend ist, um die Zellmembran- und Zellkernmembranpermeabilität der Verbindung zu gewährleisten. Trans- portpeptide mit Sequenzen, die eine Homologie von 80%, 85%, 90%, 95%, 98% zu der SEQ ID Nr. 2 aufweisen, sind ebenfalls geeignet.
Besonders bevorzugt ist es, wenn das bzw. die Transportpeptide der erfindungsgemäßen Verbindung folgende Aminosäuresequenz aufweisen: PKKKRKVRRRR (SEQ ID
Nr. 3).
Der Erfinder hat festgestellt, dass durch terminales Anbringen von 4 Argininresten an die sich von dem SV40-T-Antigen ableitende NLS die Transporteigenschaften deutlich verbessern. Transportpeptide mit Sequenzen, die eine Homologie von 80%, 85%, 90%, 95%, 98% zu der SEQ ID Nr. 3 aufweisen, sind ebenfalls geeignet.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung weist das spezifitätvermittelnde Peptid der erfindungsgemäßen Verbindung eine Länge von 2 bis 20, vorzugsweise, von 3 bis 15 und höchst vorzugsweise von 5 Aminosäuren auf.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein Peptid mit einer solchen Länge bereitgestellt wird, die zur Spezifitätsvermittlung ausreichend ist, ohne aber die erfindungsgemäße Verbindung unnötig zu vergrößern. Die angegebenen Längen haben sich dabei als besonders geeignet erwiesen.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung weist das spezifitätvermittelnde Peptid folgende Aminosäuresequenz auf: PLGLA (SEQ ID Nr. 4) oder PLGVR (SEQ ID Nr. 5).
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine solche Verbindung bereitgestellt wird, mit der spezifisch und hochselektiv Gehirntumoren dargestellt, bzw. behandelt werden können. Die angegebene Aminosäuresequenz wird von der für Gehirntumoren charakteristischen Matrix-Metalloproteinase 2 (MMP-2) erkannt und geschnitten. Spezifitätvermittelnde Peptide mit Sequenzen, die eine Homologie von 80%, 85%, 90%, 95%, 98% zu der SEQ ID Nr. 4 oder Nr. 5 aufweisen, sind ebenfalls geeignet.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung der erfindungsgemäßen Verbindung ist der Komplexbildner für Metalle und/oder der Fluoreszenzmarker an die ε-Aminogruppe eines Lysinrestes kovalent gebunden.
Mit dieser Maßnahme werden die konstruktiven Voraussetzungen für eine stabile Anbringung des Komplexbildners geschaffen. So kann bspw. DOTA oder FITC über einfache Routinemaßnahmen an die ε-Aminogruppe eines solchen Lysinrestes gekoppelt werden, der Bestandteil von El und/oder E2 ist. Es können auch DOTA und FITC gleichzeitig an einen Lysinrest gekoppelt sein, insbesondere, wenn der Lysinrest N-terminal in der Verbindung positioniert ist. Der Lysinrest kann Bestandteil des Transportpeptides sein, sich aber auch N- oder C-terminal an dieses anschließen und bspw. das Verbindungsglied zu E2 darstellen. Der Lysinrest kann dabei vorzugsweise über seine α-Aminogruppe oder seine α-Carboxylgruppe kovalent an das Transportpeptid oder an E2 gebunden sein. Der Lysinrest stellt sozusagen ein „Aufhänger" für den Komplexbildner bzw. den Fluoreszenzmarker dar.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verbindung weist El und/oder E3 einen Spacer auf, der vorzugsweise 2 Aminosäuren aufweist, der den Komplexbildner und den Fluoreszenzmarker voneinander beabstandet.
Der Spacer hat die Funktion ggf. vorhandene sterische Beeinträchtigungen zwischen dem Komplexbildner und dem Fluoreszenzmarker zu verhindern. Diese Maßnahme hat deshalb den Vorteil, dass die Komplexierungs- und Signalgebungskapazität des Komplexbildners bzw. Fluoreszenzmarkers sichergestellt ggf. sogar erhöht wird. Der Spacer kann aus einem kurzen Peptid von 2 bis 15 beliebigen Aminosäuren bestehen, bspw. 2 Lysinresten, wobei jedoch 2 Glycinreste bevorzugt sind. Alternativ kommen als Spacer in Frage Aminohexansäure (Ahx), Beta-Alanin, Argininreste etc. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung zur Herstellung einer diagnostischen oder/und therapeutischen Zusammensetzung, bei der es sich vorzugsweise um ein Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie (MRT) oder für die Nuklearmedizin handelt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine diagnostische und therapeutische Zusammensetzung, die die erfindungsgemäße Verbindung sowie einen diagnostisch oder therapeutisch akzeptablen Träger aufweist.
Diagnostisch und therapeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik umfassend beschrieben und werden entsprechend der gewünschten Anwendungsform von einem Fachmann ausgewählt; vgl. Bauer et al. (1999), Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie, 6. Auflage, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart 1999; Row R.C., Sheskey et al. (2006), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5. Auflage, Pharmaceutical Press and American Pharmacists Association. Der Inhalt der beiden vorstehend genannten Publikationen ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung eines Lebewesens, das folgende Schritte aufweist: (a) Verabreichung der erfindungsgemäßen diagnostischen und/oder therapeutischen Zusammensetzung in das Lebewesen, und (b) Durchführung eines bildgebenden Verfahrens.
Bei dem bildgebenden Verfahren handelt es sich um Magnetresonanztomographie (MRT) (Auto-)Radiographie, PET, Szintgraphie, Computertomographie etc.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung ergeben. Dabei wird auf die beigefügten Figuren Bezug genommen, in denen Folgendes dargestellt ist:
Fig. 1 zeigt schematisch verschiedene Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Verbindung;
Fig. 2 zeigt schematisch das Wirkprinzip der erfindungsgemäßen Verbindung;
Fig. 3 zeigt das Ergebnis einer konfokalen Lasermikroskopie an LNl 8- Gliomzellen nach Inkubation mit der Verbindung V4 in Gegenwart blockierter, inaktiver Matrix-Metalloproteinase 2 (MMP-2) oder aktiver MMP- 2. Eine Färbung der Zellkerne zeigt sich nur nach Spaltung des Konjugates durch die aktive MMP-2;
Fig. 4 zeigt das Ergebnis einer konfokalen Lasermikroskopie von U373- (oben) und Ll 8- (unten) Gliomzellen nach Inkubation mit Verbindung V5 in Kulturmedium mit blockierter, inaktiver MMP-2 oder aktiver MMP-2. Nur das durch die aktive MMP-2 gespaltene Konjugat V5 reichert sich in den Zellkernen an (unten). Wird die Verbindung V5 nicht gespalten, so bleiben die Zellen ungefärbt;
Fig. 5 zeigt das Ergebnis einer FACS (fluoreszenzaktivierter Zellsortierung)- Analyse von LN18-Gliomzellen nach Inkubation mit den Verbindungen V2 oder V4 in Kulturmedien jeweils mit inaktiver oder aktiver MMP-2. Werden beide Konjugate durch die aktive MMP-2 gespalten, so kommt es zu einer deutlichen Zunahme der stark gefärbten Zellen, erkennbar durch eine Verschiebung des Histogrammgipfels nach rechts. Die Verschiebung ist nach Spaltung der Verbindung V4 stärker ausgeprägt. Fig. 6 zeigt das Ergebnis einer HPLC (Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogra- phie) der Verbindung V5 bzw. V5a, d.h. mit und ohne Gadolinium, vor und nach Spaltung durch MMP-2. Der große Peak vor der Spaltung hat sich nach der Spaltung in zwei neue Peaks aufgeteilt, welche die beiden Spaltprodukte darstellen;
Fig. 7 zeigt das Ergebnis einer Magnetresonanz- Relaxometrie von LN18-Gliom- zellzentrifugaten nach Inkubation mit der Verbindung V2a und V4a (jeweils 26 und 130 μm in einem Medium mit aktiver MMP-2 oder inaktiver MMP-2. Die Inkubation mit aktiver MMP-2 (linke Reihe) führt zu einer deutlich höheren Signalintensität bei TR: 400 ms als die Inkubation mit inaktiver MMP-2 (rechte Spalte). Nach der Inkubation der Zellen wurden diese dreimal gewaschen und zentrifugiert;
Fig. 8 zeigt ein Magnetresonanztomographiebild eines humanen LN18-Glioms zwischen den Vorderhörnern der Seitenventrikel einer Nacktmaus. 30 Minuten nach intraperitonealer Gabe der Verbindung V4a nimmt der Tumor gegenüber dem Nativ-Bild deutlich an Signalintensität zu.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1: Prinzipieller Aufbau der erfindungsgemäßen Verbindung.
In Fig. 1 sind verschiedene Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Verbindung auf schematische Art und Weise dargestellt.
Teilabbildung A zeigt die Grundstruktur der Verbindung in linearer Form. Auf der linken Seite ist der N-Terminus und auf der rechten Seite der C-Terminus einer peptidischen erfindungsgemäßen Verbindung dargestellt. Die erste Einheit El, die das Transportpeptid und einen Komplexbildner für Metalle aufweist, ist vorzugsweise kovalent mit der zweiten Einheit E2 verbunden, die die Schnittstelle für tumor- oder virusspezifische Proteasen, d.h. das spezifitätvermittelnde Peptid aufweist. Der geknickte Pfeil symbolisiert die Ansatz- bzw. Schnittstelle für die tumor- bzw. virusspezifischen Proteasen in E2. Die zweite Einheit E2 ist vorzugsweise kovalent mit der dritten Einheit E3 verbunden, die den zweiten Komplexbildner für Metalle aufweist.
In der Teilabbildung B ist eine bevorzugte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verbindung in größerem Detail dargestellt. Das Transportpeptid wird durch eine Kernlokalisierungssequenz (NLS) repräsentiert, an dessen C-terminalem Ende sich ein Lysinrest (K) anschließt, der über seine α-Aminogruppe kovalent an die NLS gebunden ist. Über die ε-Aminogruppe des Lysinrestes erfolgt die kovalente Kopplung des Komplexbildners, der durch DOTA repräsentiert ist. Der Lysinrest dient sozusagen als „Aufhänger" für DOTA. In diesem Ausführungsbeispiel wird die NLS, der Lysinrest und DOTA der ersten Einheit El zugerechnet. Über die α-Carboxylgruppe des Lysinrestes erfolgt die kovalente Anbindung des spezifitätvermittelnden Peptides (TUMOR/VIRUS), das eine Schnittstelle für tumor- oder virusspezifische Proteasen aufweist. Das spezifitätvermittelnde Peptid stellt die zweite Einheit E2 dar. Der C-Terminus des spezifitätvermittelnden Peptides ist über eine Peptidbindung mit der α-Aminosäure eines weiteren Lysinrestes verbunden, der in diesem Ausfuhrungsbeispiel der dritten Einheit E3 zugerechnet wird, an dessen ε-Aminogruppe der zweite Komplexbildner kovalent gebunden ist, der ebenfalls durch DOTA repräsentiert wird.
In Teilabbildung C weist die erste Einheit El einen weiteren Lysinrest (K) auf, der sich C-terminal an den ersten Lysinrest mittels Peptidbindung anschließt. Die ε-Aminogruppe des zweiten Lysinrestes ist mit einem Fluoreszenzmarker kovalent verbunden, der durch FITC repräsentiert wird.
In dem Ausführungsbeispiel aus Teilabbildung D befindet sich der über ein Lysinrest angekoppelte Fluoreszenzmarker am C-terminalen Ende der erfindungsgemäßen Verbindung, d.h. in der dritten Einheit E3. In dem Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Verbindung gemäß Teilabbildung E weist die dritte Einheit E3 eine weitere Kernlokalisierungssequenz (NLS) auf, die sich am C-Terminus der erfindungsgemäßen Verbindung befindet und mit ihrem N-Terminus kovalent an den Lysinrest gekoppelt ist, der als „Aufhänger" den Fluores- zenzmarker FITC trägt.
In der besonderen Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verbindung gemäß Teilabbildung F weist nicht nur die erste Einheit El oder die dritte Einheit E3 neben dem Komplexbildner DOTA den Fluoreszenzmarker FITC auf, sondern sowohl die erste Einheit El als auch die dritte Einheit E3. Das von der erfindungsgemäßen Verbindung ausgehende Fluoreszenzsignal wird dadurch nochmals verstärkt.
In der Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verbindung gemäß Teilabbildung G wurde eine Modifizierung gegenüber der Ausgestaltung gemäß Teilabbildung F insofern vorgenommen, als dass die Komplexbildner und Fluoreszenzmarker als Bestandteil der ersten Einheit El und dritten Einheit E3 nunmehr N- bzw. C-terminal an der Verbindung angebracht sind. Die NLS aus El ist somit mit ihrem C-Terminus kovalent an das spezifitätvermittelnde Peptid aus E2 gekoppelt, und die NLS aus E3 ist mit ihrem N-Terminus kovalent an das spezifitätvermittelnde Peptid aus E2 gekoppelt.
Die Ausgestaltung gemäß Teilabbildung H weist in der ersten Einheit El und der dritten Einheit E3 die NLS flankiert von dem Komplexbildner DOTA und dem Fluoreszenzmarker FITC auf.
In der Ausgestaltung gemäß Teilabbildung I weisen die erste Einheit El und die dritte Einheit E3 jeweils zwei NLS auf, zwischen denen jeweils der Komplexbildner DOTA und FITC angeordnet sind.
Teilabbildung J zeigt eine besondere Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verbindung, in der zwischen dem Komplexbildner DOTA und dem Fluoreszenzmarker FITC ein sog. Spacer (SPACER) angeordnet ist, der aus zwei Aminosäuren, vorzugsweise aus zwei Glycinresten, bestehen kann. Der Spacer beabstandet den Komplexbildner von dem Fluoreszenzmarker und verhindert dadurch, sich negativ auswirkende Wechselwirkungen zwischen den beiden Komponenten ausbilden können und stellt deren Funktionsfähigkeit sicher.
Die besonderen Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Verbindung gemäß der Teilabbildungen E bis J haben den Vorteil, dass nach Spaltung der Verbindung in E2 beide Spaltprodukte, d.h. El und E3 aufgrund des jeweiligen Vorhandenseins eines Transportpeptides bzw. einer Kernlokalisierungssequenz (NLS) in das Cytoplasma und den Zellkern von Tumorzellen eindringen und dort ihre Wirkung entfalten können. Bei den besonderen Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Verbindung gemäß der Teilabbildungen A bis D ist hierzu nur das Spaltprodukt El in der Lage, da nur dieses ein Transportpeptid bzw. eine NLS aufweist. Das Spaltprodukt E3 verbleibt hingegen im Interstitium und wird nach einer bestimmten Zeit aus dem Interstitium und dem Organismus entfernt.
Es versteht sich, dass die dargestellten Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Verbindung Beispiele sind, die nicht limitierend zu verstehen sind. Die einzelnen Komponenten innerhalb einer Einheit können selbstverständlich in ihrer Anordnung und Positionierung variiert werden. Ferner sind Kombinationen der verschiedenen Ausgestaltungen möglich, solange der prinzipielle Aufbau, der in Teilabbildung A dargestellt ist, eingehalten wird.
Beispiel 2: Wirkungsprinzip der erfindungsgemäßen Verbindung
In Fig. 2 ist das Wirkungsprinzip anhand einer besonderen Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verbindung schematisch erläutert, in der sowohl die erste Einheit El als auch die dritte Einheit E3 ein Transportpeptid aufweist, das durch 4 Argininreste (RRRR) repräsentiert wird. Am C- bzw. N-terminalen Ende der erfindungsgemäßen Verbindung ist kovalent ein Komplexbildner angekoppelt, der Gadolinium cheliert hat (Gd-DOTA). In der Mitte bzw. Zentrum der erfindungsgemäßen Verbindung befindet sich die Einheit E2, die eine Schnittstelle aufweist, die von der tumorspezifischen Protease MMP-2 erkannt und gespalten wird.
Diese spiegelbildlich aufgebaute erfindungsgemäße Verbindung kann in gesunde nicht-transformierte Zellen aufgrund ihrer Größe und des Fehlens von MMP-2 nicht eindringen (links). Erst in Gegenwart von transformierten Tumorzellen, die MMP-2 in die Umgebung sekretieren, wird das spezifitätvermittelnde zentral gelegene Peptid gespalten. Die frei werdenden Spaltprodukte, die El und E3 sowie Fragmente von E2 enthalten, können aufgrund des jeweils vorhandenen argininreichen Transportpep- tides und ihrer reduzierten Größe in das Cytoplasma und den Zellkern der Tumorzelle aufgenommen werden (rechts).
Nach der Induktion der Apoptose werden dann die Spaltprodukte über Makrophagen „entsorgt" und das ggf. komplexierte Metall schließlich aus dem Organismus ausgeschieden.
Beispiel 3 Material und Methoden
3.1 Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen
Die Synthese erfolgte nach der Fmoc-Festphasenmethode auf einem Eppendorf ECOSYN P Peptidsynthesizer (Eppendorf-Biotronik, Hamburg, Deutschland). Dabei diente die basisch abspaltbare 9-Fluorenylmethyloxycarbonylgruppe als Amino- schutzgruppe. Als Trägermaterial wurde das Tentagel S Rink-Amid-Harz (Rapp- Polymere, Tübingen, Deutschland) verwendet. Die Synthesen wurden im 0.1 mMol Massstab durchgeführt. Die Kopplungen wurden mit dem geschützten Fmoc- Aminosäuren bei 4-fachem Überschuss mit 2 (IH Benzotriaol-l-yl)-1.1.3.3-Tetra- methyluronoium Tetrafluoroborat [TBTU] (4eq) in Gegenwart von 8 eq. Diisopropyl- ethylamin innerhalb von 40 Minuten durchgeführt. Als Seitenkettenschutzgruppe wurden verwendet: Für Lysin: Tert. Butyloxycarbonyl (Boc), für Arginin: Pbf (N6-2.2.4.6.7-Pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-Sulfonyl).
Für die Seitenketten, die mit DOTA versehen wurden, wurde ein Lysin-Derivat mit 4-Methoxytrityl (Mmt)-Seitenkettenschutz verwendet, für die Positionen, die den Fluoresceinharnstoffrest tragen sollen, wurde das Lys-Dde-Derivat [Dde=l-(4.4- Dimethyl-2,6-Dioxocyclohex-l-Ylidene)-Ethyl] verwendet. Nach erfolgter Kopplung wurde der Fmoc-Rest jeweils mit 25 % Piperidin/DMF-Lösung in 11 Min. abgespalten.
Nach mehrfachem Waschen mit Dimethylformamid (DMF) steht das Peptidharz für eine weitere Kopplung zur Verfügung.
Nach sukzessivem Aufbau des Peptides vom C-Terminus beginnend wird die N-terminale Aminosäure im Falle von Prolin als Boc-Prolin in das Peptid eingeführt.
In allen anderen Fällen wird nach Abspaltung der Fmoc-Gruppe das Peptid durch die Boc-Gruppe geschützt. Dies wird durch Schütteln des Peptidharzes mit 10 eq. Di-Tert- Butyldicarbonat [Boc2O]/10 eq. Diisopropylethylamin in Dichlormethan innerhalb einer Stunde bei Raumtemperatur erreicht.
Dann wird die Mmt-Seitenkettenschutzgruppe durch mehrfaches Versetzen mit 1 % TFA/DCM-Lösung, die 1 % Triisopropylsilan enthält, innerhalb einer Stunde abgespalten. Nach mehrfachem Waschen mit DMF und Neutralisieren des entstandenen TFA-Salzes mit Diisopropylethalamin, steht die freigelegte Seitenkette für eine Kopplung mit l,4,7,10-Tetraacacyclododecane-1.4.7. Tritert-Butylester-10-Essigsäure (DOTA) jeweils 3 eq. in Gegenwart von 3 eq. TBTU und 6 eq. Diisopropylethylamin innerhalb 1,5 h bei Raumtemperatur zur Verfügung. Dann wird die Dde- Schutzgruppe durch mehrfaches Versetzen des Harzes mit einer 2,5 %-igen Hydra- zinhydrat-Lösung in DMF innerhalb einer Stunde abgespalten. Nach mehrfachem Waschen mit DMF, wird das Fluoresceinharnstoffderivat durch Kopplung von 0,5 mM Fluorescein 5(6)-Isothiocyanat in Gegenwart der eq. Menge Diisopropylethylamin in DMSO über Nacht bei Raumtemperatur gekoppelt.
Nach mehrfachem Waschen mit DMF, Methanol und Dichlormethan werden nach Trocknen die verbliebenen Schutzgruppen sowie das Peptid vom Harz simultan abgespalten; dies geschieht durch dreistündiges Rühren des getrockneten Harzes in einer Mischung aus 12 ml TFA, 0,3 ml Ethandithiol (EDT), 0,3 ml Anisol, 0,3 ml Wasser und 0, 1 ml Triisopropylsilan bei Raumtemperatur.
Dann wird direkt in gekühltem, absoluten Diethylether filtriert. Das präzipitierte Peptid wird abgefiltert, mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die so erhaltenen Rohpeptide werden wie in Teil I semipräparative HPLC gereinigt. Die DOTA-Peptide werden im Anschluss mit der eq. Menge Gadoliniumchloridlösung versetzt, mit 0,1 m NaOH auf einen pH-Wert von 5,2-5,6 gebracht und über 5 Stunden bei 50 0C gerührt.
Nach Versetzen mit einigen Tropfen Essigsäure wird die Lösung lyophilisiert. Die Analytik erfolgt durch analytische HPLC und Massenspektroskopie (Reinheit mindestens 98 %).
Auf diese Art und Weise wurden die folgenden Verbindungen synthetisiert:
Figure imgf000029_0001
Tab. 1 Synthetisierte Verbindungen
Einbuchstaben-Aminosäure-Code: K, Lysin; R, Arginin; P, Prolin; V, Valin; G, Glycin; FITC: Fluoreszenzfarbstoff, Fluoresceinisothiocyanat; DOTA: Komplexbildner für Gadolinium, Tetraazacyclododecan- tetraessigsäure; Gd: Gadolinium bzw. Gadoliniumion Gd3+.
Das Transportpeptid ist unterstrichen, das spezifitätvermittelnde Peptid kursiv, der Spacer im Fettdruck dargestellt. Der N-Terminus steht links, der C-Terminus rechts.
3.2 Spaltungstest
Die Verbindungen 1, 4 und 5 bzw. 2A, 4A und 5A wurden jeweils in HEPES-Puffer gelöst (μM), von denen einer bereits aktive MMP-2 (Calbiochem), der andere inaktive MMP-2-Proform (Calbiochem) enthielt.
Die Inkubation in HEPES-Puffer mit aktiver MMP-2 dauerte 2 Stunden.
Zur Umwandlung der inaktiven Proform in die aktive MMP-2 wurde APMA (4-Aminophenyl mercuric acetate) verwendet. Dazu wurde 1 %-ige APMA-Stamm- lösung (100 mM in DMSO) zur Lösung mit dem MMP2-Proenzym und den Verbindungen gegeben (endgültige APMA-Konzentration: 1 mM, mit 1 % DMSO).
Hiernach erfolgte ebenso die Inkubation über 2 Stunden. Zusätzlich wurden die Versuche mit dem MMP-2-Inhibitor I (Calbiochem) durchgeführt. Alle sechs Verbin- düngen wurden zur Kontrolle auch in HEPES-Puffer ohne MMP-2 zwei Stunden inkubiert.
Die Spaltprodukte wurden mit der HPLC untersucht:
Säule: Nucleosil 100 5 μm d8 (250x4); Puffer A: 0,07 % CF3COOH/H2O; Puffer B: 0,058 % CF3COOH/8O % CH3CN
10 → 90 % B in 36 min; 170 bar; 1 ml/min; 214 nm
3.3 Konfokale Laser Mikroskopie (CLSM) und Vitalitäts-AApoptoseprüfung
Humane maligne Gliomzellen (U373 und LNl 8) wurden in 25 cm2 Kulturflaschen ausgesät, welche 3 ml RPMI-Medium enthielten. Dieses wurde ein Tag so belassen, damit sich hierin genügend Matrix-Metalloproteinasen (MMP-2) anreicherten. Zur Aktivierung der im Medium in der inaktiven Proform vorliegenden MMP-2 wurde das Medium kurz vor der Untersuchung mit APMA (4-Aminophenyl mercuric acetate) in 0,1 % DMSO gelöst, inkubiert (Konfluenz der Zellen: 70 %).
In einem ersten Versuch wurden die Verbindung 2, 4 und 5 sowie die Verbindungen 2A, 4A und 5 A jeweils ohne MMP-2-Inhibitor in den Medien von 12 Flaschen gelöst (130 μM) (beide Zelllinien). In einem zweiten Versuch wurden die gleichen Verbindungen wiederum in den Medien von 12 Flaschen gelöst (130 μM), jedoch jetzt mit MMP-2-Inhibitor 1 (Calbiochem).
Die Blockierung der MMP-2 mit dem MMP-2-Inhibitor I wurde, wie zuvor von Yin et al. (2006), Matrix Metallo-proteinases Expressed by Astrocytes Mediate Extracellular Amyloid-ß Peptide Catabolism, The Journal of Neuroscience 26(43): 10939-10948 beschrieben, durchgeführt. Als Kontrollen dienten vier kleine Flaschen in denen beide Zelllinien mit einem einen Tag alten Medium sowohl mit als auch ohne APMA inkubiert wurden. Die Detektion von Phosphatidylserin im äußeren Membranblatt zu Bestimmung der Apoptose wurde mit dem Annexin- V-Alexa™ 568 Reagenz entsprechend der Empfehlung des Herstellers durchgeführt (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, USA).
Für die konfokale Lasermikroskopie wurde ein inverses LSM510 Laserscanmikroskop (Karl Zeiss, Jena, Deutschland) (Objektive: LD Achroplan 40x0.6, Plan Neofluar 20x0.50, 40x0.75) verwendet [Fluoreszenzanregung bei 488 nm (Argonionenlaser) und 534 nm (Helium-Neon-Laser)]. Überlagerte Bilder von FITC- und Alexa-gefärbten Zellen wurden hergestellt. Alle Messungen wurden an lebenden, nicht fixierten Zellen dreimal durchgeführt.
3.4 Magnetresonanz-Relaxometrie
Humane U373- und LN 18-Gliomzellen wurden in 25 cm2 Kulturflaschen (70 % Konfluenz) gezüchtet. Accutase™ (PAA laboratories, Pasching, Österreich) wurde hinzugefügt, um ein Ablösen der Zellen vom Kulturflaschenboden zu erreichen.
In einem ersten Versuch wurden die Zellen gesammelt und anschließend auf 16 Eppendorf-Röhrchen aufgeteilt (6 x 106 Zellen pro Röhrchen). Die Zellen in den ersten vier Röhrchen dienten als Kontrolle (nur RPMI-Medium sowohl mit als auch ohne APMA, zwei Zelllinien). Die beiden Zelllinien in den anderen 12 Röhrchen wurden mit den Verbindungen 2A, 4A und 5 A (jeweils 130 und 260 μM) für 2 Stunden bei 37 0C und 5 % CO2 sowohl mit als auch ohne MMP-2-Inhibitor I inkubiert. Anschließend wurde 3 mal mit PBS ausgewaschen und mit 800 rpm (rounds per minute) 5 Min. lang zentrifugiert.
In einem weiteren Versuch wurden adhärente U373- und LN 18-Gliomzellen mit den Verbindungen 2A, 4A und 4A inkubiert, anschließend abgelöst und in Eppendorf- Röhrchen für die MRT gesammelt. Die MRT-Untersuchung der Eppendorf-Röhrchen mit den Zellzentrifugaten wurde mit einem 3 Tesla Ganzkörper MRT-Gerät (Trio, Siemens Magnetom Sonata, circular polarised knee coil) durchgeführt. Mit der folgenden Spin-Echo-Sequenz wurden sagittale Tl-gewichtete MRT-Bilder gewonnen.
TR (repetition time): 200 ms, TE (echo time): 7.4 ms, flip angle 90°, averages: 1, concatenations: 2, measurements: 2, number of slices: 19, distance factor: 30 %, slice thickness: 3 mm, field of view read: 180 mm, field of view phase: 100 %, base resolu- tion: 256, phase resolution: 100 %, voxel size: 0.7 x 0.7 x 3.0 mm, scan time: 1:48 min.
Über multiple Spin-Echo-Messungen (TR: 20-8000 ms, 50 verschiedene TR-Werte) konnten unterschiedliche Signalintensitäten gemessen werden, wodurch sich die Tl Relaxationszeit bestimmen ließ.
TR: 20-8000 ms (50 verschiedene TR-Werte), TE: 6.4 ms, flip angle 90°, averages: 1, measurements; 1, number of slices: 1, slice thickness: 1 mm, field of view read: 120 mm, field of view phase: 87.5, base resolution 128, phase resolution; 100 %, voxel size: 0.9 x 0.9 x 1 mm.
Für die Analysen und Berechnungen wurde ein Matlab Programm (Math Works, Natick, MA, USA) verwendet. Die Tl -Werte wurden über einen Zwei-Parameter-Fit bestimmt. Alle Signalkurven wurden untersucht und als monoexponentiell eingestuft. Die Versuche wurden dreimal durchgeführt.
3.5 FACS
Die FACS-Analyse wurde auf einem Becton-Dickinson FACSCalibur durchgeführt. [100 ml der Zellsuspension (1 x 106 Zellen + 300 ml FACS-Puffer (DPBS-Puffer mit 1 % Paraformaldehyd)]. Ungefähr 25.000 bis 35.000 Zellen wurden pro Probe gemessen [Fluoreszenzanregung: Argonionenlaser (480 nm), Fluoreszenzdetektion: 540 bis 565 nm Bandpassfilter]. Die Versuche wurden zweimal wiederholt. 3.6 Implantation der Tumore
Die Tierexperimente wurden vom Regierungspräsidium Tübingen genehmigt.
Weibliche Nacktmäuse CDl (Nu/Nu) stammten von Charles River (Sulzfeld, Deutschland) (Gewicht: 25 g; Alter: 7 Wochen). Humane LN18-Gliomzellen wurden so gezüchtet und in das Gehirn der Mäuse implantiert wie von Friese et al. (2003), MICA/NKG2D-mediated Immunogene Therapy of Experimental Gliomas, Cancer Res. 63(24): 8996-9006. beschrieben. Die Versuche wurden 3 Wochen nach Implantation durchgeführt.
3.7 In vivo Magnetresonanztomographie und Konfokale Laser Mikroskopie
Von Verbindung 4A wurden 3,6 mg in 1 ml isotonischer Kochsalzlösung aufgelöst und jeweils 2 Mäusen intraperitoneal injiziert. Von Verbindung 4A wurden außerdem 3,6 mg mit 0,5 mg MMP-2-Inhibitor I in 1 ml isotonischer Kochsalzlösung aufgelöst und 2 Mäusen intraperitoneal injiziert. Als Kontrolle diente eine Maus, welcher intraperitoneal 1 ml reine Kochsalzlösung injiziert wurde. Die Narkose erfolgte mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) intraperitoneal.
Die MRT wurde mit einem 3 Tesla-Ganzkörper-Gerät (Trio. Siemens) durchgeführt.
Die Mäuse befanden sich bäuchlings in einer Handgelenksspule.
Das MRT-Protokoll bestand aus den folgenden Sequenzen:
tse 3D sequence: slice thickness 0.3125 mm, field of view read 63 mm, field of view phase 100.0 %, base resolution 256, phase resolution 100 %, slice resolution 100 %, voxel seize 0.2x0.2x0.3 mm, slab group 1, slabs 1, slices per slab 16, TR 300 ms, TE 15 ms, flip angle 70, distance factor 50, scan time 12:02 min. Tl weighted transverse images: slice thickness 2 mm, field of view read 31 mm, field of view phase 82.3 %, voxel seize 0.2x0.2x2 mm, TR 600 ms, TE 18 ms, flip angle 180, number of slices 12, distance factor 0, scan time 11:35 min.
120 Minuten nach intraperitonealer Injektion wurden die Organe, einschließlich des Gehirns entnommen und in Tissue-Tek OCT (Sakuta, Tokio, Japan) flüssigem Stickstoff eingefroren.
Die Zellkerne wurden zur Kontrolle auch mit Propidium-Iodid, einem typischen Zellkernfärbemittel, gefärbt.
Die Organe, einschließlich des Gehirns und Tumors, wurden 120 Minuten nach intraperitonealer Injektion entnommen und in Tissue-Tek OCT sowie flüssigem Stickstoff eingefroren.
Zur sicheren Lokalisation der Zellkerne wurden diese mit Propidium-Iodid gefärbt.
Das Konjugat wurde in den Zellen mit dem Konfokalen Laser Scanning Mikroskop lokalisiert.
Haematoxylin und Eosin (H&E)-gefärbte Schnitte wurden für die Durchlichtmikro- skopie angefertigt um sicher zu sein, dass auch ein Tumor vorliegt.
3.8 Semidünnschnitte
Ein Teil der mit der Faxanalyse untersuchten Zellen wurde in Paraformaldehyd mit 2 % Agar fixiert, in Ethanol dehydriert, in Lowicryl K4M eingebettet (Polysciences, Eppelheim, Deutschland) und bei Raumtemperatur entsprechend den Empfehlungen des Herstellers UV-polymerisiert. Semidünnschnitte (ca. 0.4 μm) wurden angefertigt und mit dem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Beispiel 4 Ergebnisse
4.1 Verbindungen
Die durchgeführten Untersuchungen wurden mit den Verbindungen V2, V4 und V5 ohne Gadolinium und den entsprechenden gadoliniumhaltigen Verbindungen V2A, V4A und V5A durchgeführt. Die NLS des SV40-T-Antigens allein mit dem DOTA- Komplex (Verbindung 2), welcher am C-terminalen Ende über eine MMP-2-sensitive Peptidbrücke mit einem zweiten DOTA-Komplex verbunden ist, sowie die NLS des SV40-T-Antigens, welche um 4 Arginine verlängert ist und am N-terminalen Ende über eine MMP-2-sensitive Peptidbrücke mit einem zweiten DOTA-Komplex verbunden ist (Verbindung 4). In der Verbindung 5 wurden jeweils 4 Arginine sowie ein FITC-Molekül und ein DOTA-Komplex spiegelbildlich über eine MMP-2-sensitive Peptidbrücke miteinander verbunden, so dass insgesamt 2 FITC-Moleküle und 2 GdDOTA-Komplexe in einer Verbindung vorliegen; vgl. auch Tab. 1 und Fig. 2.
4.2 Tumorspezifität/Apoptose
Die humanen malignen LN18- und U373-Gliomzellen (adhärent und abgelöst) zeigten nach alleiniger Inkubation in RPMI-Medium mit APMA (4-Aminophenyl- mercuric acetate, Aktivator der MMP-2) sowohl mit als auch ohne MMP-2-Inhibitor I keine Eigenfluoreszenz in der konfokalen Laser Mikroskopie; vgl. Fig. 3 bis 5, jeweils oben.
Sowohl der MMP-2-Inhibitor I als auch APMA im Medium führten zu keiner Beeinträchtigung der Zell Vitalität.
Bei Anwesenheit des Inhibitors im APMA-haltigen Medium führte die Inkubation von LN18- und U373-Gliomzellen (adhärent und abgelöst) mit den Konjugaten 2, 4 und 5 (gadoliniumfrei) sowie 2A, 4A und 5 A (gadoliniumhaltig) (130 μM) nur zu wenigen, gefärbten Zellkernen in der CLSM und FACS-Analyse; vgl. Figuren 3, 4 und 5 - „MMP-2 inaktiv". Diese Zellen zeigten keine Zelltodzeichen (Daten nicht gezeigt).
Bei Fehlen des Inhibitors im APMA-haltigen Medium führte die Inkubation von LNl 8- und U373-Gliomzellen (adhärent und abgelöst) mit den gleichen Verbindungen (130 μM) jedoch zu einer massiven Zunahme der Zellkernfärbung in der CLSM und FACS-Analyse, wobei diese Zellen nur nach Inkubation mit den Verbindungen 4 und 4A sowie den Verbindungen 5 und 5A apoptotisch waren (Bindung von Alexa- Annexin an Phosphatidylserin, Daten nicht gezeigt; morphologische Veränderungen); vgl. Figuren 3, 4 und 5 - „MMP-2 aktiv".
Die gadoliniumhaltigen Verbindungen 4A und 5A sowie die gadoliniumfreien Verbindungen 4 und 5 führten nach Spaltung durch MMP-2 im Vergleich zu den Verbindungen 2 und 2A in Abhängigkeit von der Konzentration zu einer stärkeren Fluoreszenz (Fig. 5; exemplarisch für Verbindungen 2 und 4) und zu einer höheren Signalintensität in der MRT (vgl. Fig. 7; exemplarisch für Verbindungen 2A und 4A), wobei die Anwesenheit von Gadolinium innerhalb des DOTA-Komplexes bei allen Verbindungen nur zu einer leichten Beeinträchtigung des transmembranen Transports führte.
Mit der HPLC (Chromatographie) konnte gezeigt werden, dass die Verbindungen 2, 4 und 5 bzw. 2A, 4A und 5A sowohl in Gegenwart der bereits aktiven MMP-2 als auch der durch APMA (4-Aminophenylmercuric acetate, Aktivator der MMP-2) aktivierten Proform der MMP-2 gespalten werden, und dass diese Spaltung durch den Inhibitor verhindert wird; vgl. Fig. 6 (exemplarisch für Verbindungen 5 und 5A).
In der MRT zeigten die Zellen nach Inkubation mit inhibitorhaltigem Medium nur eine geringfügige Verkürzung der Tl -Zeit im Vergleich zur Nativ-Kon trolle (26 und 130 μM); vgl. Fig. 7 (exemplarisch für Verbindungen 2A und 4A). Zu einer deutlichen Verkürzung der Tl -Zeit kam es aber nach Inkubation der Zellen mit den Verbindungen in einem inhibitorfreien Medium, wobei die Verbindungen 4A und 5A im Vergleich zu Verbindung 2A in Abhängigkeit von der Konzentration zu einer stärkeren Verkürzung der Tl-Zeit führten; vgl. Fig. 7 (exemplarisch für Verbindungen 2A und 4A) .
Nach intraperitonealer Gabe der Verbindung 4A bei Nacktmäusen mit intrazerebralen LN18-Hirntumoren, zeigte sich MR-tomographisch eine deutliche Zunahme der Signalintensität in den Hirntumoren; vgl. Fig. 8. Diese erhöhte Signalintensität war in abgeschwächter Form auch noch 1 Tag nach Gabe der Verbindung zu erkennen. Wurde jedoch die gleiche Verbindung in Gegenwart eines MMP-2-Inhibitors intraperitoneal verabreicht, so kam es in den Hirntumoren nur zu einer ganz geringen Zunahme der Signalintensität, die nur kurze Zeit anhielt.
Die Stellen erhöhter Signalintensität in der MRT entsprachen histologisch den Tumorarealen. Mit der CLSM zeigten sich nur in diesen Arealen gefärbte Zellkerne. Das gesunde Hirnparenchym blieb ungefärbt.

Claims

38Patentansprüche
1. Verbindung, aufweisend:
- eine erste Einheit (El), aufweisend:
- eine eine Permeabilität durch die Zellmembran und Zellkernmembran vermittelnde Komponente (Transportkomponente),
- einen Komplexbildner für Metalle,
- eine zweite Einheit (E2), aufweisend:
- ein zumindest eine Schnittstelle für tumor- oder virusspezifische Proteasen aufweisendes Peptid (spezifitätvermittelndes Peptid), und
- eine dritte Einheit (E3), aufweisend:
- zumindest einen Komplexbildner für Metalle, wobei El mit E2 und E2 mit E3 verbunden sind.
2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Transportkomponente ein Peptid (Transportpeptid) ist.
3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass diese ein Molekulargewicht aufweist, das bei ca. 2.000 kDa bis ca. 10.000 kDa, vorzugsweise bei ca. 3.000 kDa bis ca. 6.000 kDa, höchst bevorzugt bei ca. 4.000 kDa liegt.
4. Verbindung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Komplexbildner für Metalle Tetraazacyclododecantetraes- sigsäure (DOTA) aufweisen. 39
5. Verbindung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Komplexbildner für Metalle Gadolinium (Gd) komple- xiert haben.
6. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das kom- plexierte Gadolinium (Gd) radioaktiv markiert ist.
7. Verbindung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass El und/oder E2 und/oder E3 außerdem einen Fluoreszenz- marker aufweisen.
8. Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluo- reszenzmarker Fluoresceinisothiocyanat (FITC) aufweist.
9. Verbindung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass E3 außerdem eine Transportkomponente, vorzugsweise ein Transportpeptid aufweist.
10. Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Transportpeptide eine Kernlokalisierungssequenz (NLS) aufweisen.
11. Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Transportpeptide eine positive Nettoladung aufweisen.
12. Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Transportpeptide eine Länge von 3 bis 20, vorzugsweise von 5 bis 15, höchst vorzugsweise von 7 Aminosäuren aufweisen.
13. Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Transportpeptide folgende Aminosäuresequenz aufweisen: PKKKRKV (SEQ ID Nr. 1). 40
14. Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Transportpeptide folgende Aminosäuresequenz aufweisen: RRRR (SEQ ID Nr. 2).
15. Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Transportpeptide folgende Aminosäuresequenz aufweisen: PKKKRKVRRRR (SEQ ID Nr. 3).
16. Verbindung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das spezifi tätvermittelnde Peptid eine Länge von 2 bis 20, vorzugsweise von 3 bis 15, höchst vorzugsweise von 5 Aminosäuren aufweist.
17. Verbindung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das spezifitätvermittelnde Peptid folgende Aminosäuresequenz aufweist: PLGLA (SEQ ID Nr. 4).
18. Verbindung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das spezifitätvermittelnde Peptid folgende Aminosäuresequenz aufweist: PLGVA (SEQ ID Nr. 5).
19. Verbindung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplexbildner für Metalle an die ε-Aminogruppe eines Lysinrestes kovalent gebunden ist.
20. Verbindung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Lysinrest über seine α-Aminogruppe oder seine α-Carboxylgruppe kovalent an das Transportpeptid gebunden ist.
21. Verbindung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Lysinrest über seine α-Aminogruppe oder seine α-Carboxylgruppe kovalent an E2 gebunden ist. 41
22. Verbindung nach einem der Ansprüche 6 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzmarker an die ε-Aminogruppe eines Lysinrestes kovalent gebunden ist.
23. Verbindung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Lysinrest über seine α-Aminogruppe oder seine α-Carboxylgruppe kovalent an das Transportpeptid gebunden ist.
24. Verbindung nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Lysinrest über seine α-Aminogruppe oder seine α-Carboxylgruppe kovalent an E2 gebunden ist.
25. Verbindung nach einem der Ansprüche 7 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass El und/oder E3 einen Spacer aufweist, der den Komplexbildner und den Fluoreszenzmarker voneinander beabstandet.
26. Verbindung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Spacer zwei Aminosäuren aufweist.
27. Verbindung nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass der Spacer zwei Glycinreste aufweist.
28. Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 27 zur Herstellung einer diagnostischen oder/und therapeutischen Zusammensetzung.
29. Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die diagnostische Zusammensetzung ein Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie (MRT) ist.
30. Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die diagnostische Zusammensetzung ein Kontrastmittel für die Nuklearmedizin ist. 42
31. Diagnostische Zusammensetzung, die das Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 27 sowie einen diagnostisch akzeptablen Träger aufweist.
32. Therapeutische Zusammensetzung, die das Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 27 sowie einen therapeutisch akzeptablen Träger aufweist.
33. Verfahren zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung eines Lebewesens, das folgende Schritte aufweist:
(a) Verabreichung der Zusammensetzung nach Anspruch 31 oder 32 in das Lebewesen, und
(b) Durchführung eines bildgebenden Verfahrens.
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass das bildgebende Verfahren eine Magnetresonanztomographie (MRT) ist.
35. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass das bildgebende Verfahren eine Radiographie ist.
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