WO2008150025A1

WO2008150025A1 - 新しい骨量増加薬

Info

Publication number: WO2008150025A1
Application number: PCT/JP2008/060731
Authority: WO
Inventors: Hisataka Yasuda; Yuriko Furuya; Yusuke Taguchi
Original assignee: Oriental Yeast Co., Ltd.
Priority date: 2007-06-05
Filing date: 2008-06-05
Publication date: 2008-12-11
Also published as: CA2689518A1; EP2165716B1; JPWO2008150025A1; EP2165716A1; EP2165716A4; US20100260680A1; JP5191487B2; CN101772351A; CN101772351B; JP2013032385A

Abstract

　骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化・成熟・石灰化を増強するＲＡＮＫＬ作用分子を含む骨形成増強剤の提供。骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞上のRANKLに作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物を有効成分として含む、骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

Description

新しい骨量増加薬技術分野

本発明は、骨芽細胞又は骨芽前駆細胞、間葉系幹細胞、間質細胞、筋芽細胞等の骨芽細胞に分化し得る細胞に作用しそれらの細胞の分化 ·成熟を増強する分子であって、その分子を有効量投与することにより骨形成を増強する方法に関する。

明

本発明はまた骨形成を刺激するための医薬品組成物に関する。

さらに本発明は RANKLに作用し、シグナルを伝える物質のスクリ一二ング方法、書

及びこれにより得られた物質、及び得られた物質を含有する医薬品組成物に関する。背景技術

骨は自らの形態変化や血中カルシウム濃度の維持のため、常に形成と吸収 ·破壊を繰り返し再構築を行う動的な器官である。通常は骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とは平衡状態にあり、これらの細胞間の相互応答機構により骨量が一定に保たれる（非特許文献 1を参照）。閉経、老化、炎症などによりこの平衡状態が破綻すると骨粗鬆症、関節リゥマチによる骨破壊などの骨代謝異常を発症する。これらの骨代謝異常症は現在高齢化社会の大きな問題の一つとなつており、その発症メ力二ズムの分子レベルでの解明と有効な治療薬の開発は急務である。

骨粗鬆症は日本においては 1千万人以上の潜在的な患者がいると推測されている。骨粗鬆症をはじめとする骨量減少症には、若年性骨粗鬆症、骨形成不全、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、関節リウマチ、変形性関節症による骨の低下、炎症性関節炎、骨髄炎、ダルココルチコィド処置、転移性の骨疾患、歯周の骨の喪失、癌による骨の喪失、加齢による骨の喪失、及びその他の骨量減少症が含まれる。これまで骨粗鬆症などの骨量減少を示す骨代謝疾患に対する治療薬としては、骨形成の増強よりむしろ骨吸収過程を阻害する骨吸収抑制剤が用いられてきた。骨吸収を阻害する能力により、骨粗鬆症の治療に使用又は示唆されている薬剤には、エストロゲン、選択的エストロゲンレセプター調節因子（SERM) 、ィプリフラボン、ビタミン K2、カルシウム、カルシトリオール、カルシトニン（非特許文献 2を参照）、アレンドロネートなどのビスホスホネートがある。（非特許文献 3 を参照）。しかし、これらの薬剤を用いた治療法は、その効果並びに治療結果において必ずしも満足できるものではなく、より安全かつ有効性の高い新しい治療薬の開発が待ち望まれている。特に、これらビスホスホネートを中心とする骨吸収抑制剤による過度の骨吸収抑制は、人体に悪影響を及ぼすのではないかといぅ懸念がある。医原性大理石骨病になる危険もあり（非特許文献 4を参照）、特に若年者への投与は慎重に行う必要がある。特にビスホスホネートによって高度に骨代謝回転が低下する症例では、骨折治癒が遅延する可能性も報告されている（非特許文献 5を参照）。

一方、日本では骨形成促進薬としては副甲状腺ホルモン（parathyroi d hormone, PTH)が臨床開発中である。その他には BMP2、 BMP7、 IGF1、 FGF2などに骨形成促進作用が知られているが、実際に骨形成促進薬として応用されている例は限られている。例えば、米国などで PTHが骨粗鬆症に、 BMP2、 BMP7が脊椎すベり症などに、 IGF1 が重症原発性 IGF1欠損症による低身長の小児に臨床応用されているのみである。このように骨形成促進薬の応用例が非常に少ないのは骨形成を行う骨芽細胞の分化 ·成熟のメカニズムが解明されていないからであった。

骨破壊を司る破骨細胞は単球 ·マクロファージ系の造血細胞に由来する大型の多核細胞である。その前駆細胞は骨表面におレ、て骨芽細胞/間質細胞による調節を受け破骨細胞へと分化 ·成熟する（非特許文献 1を参照）。破骨細胞分化因子

(RANKL ; receptor act ivator of NF- κ B l igand)は、骨吸収因子によって骨芽細胞 /間質細胞上に誘導される腫瘍壊死因子（TNF ; tumor necros i s factor)ファミリ一に属する膜結合タンパク質で、破骨細胞分化'成熟に必須の因子である（非特許文献 6及ぴ 7を参照）。その受容体である RANK (receptor act ivator of NF- κ B) 及びおとり受容体の OPG (osteoproteger in)を含めた RANKL/RANK/0PGを軸とした研究により、破骨細胞分化 ·成熟の調節メカニズムの解明が生体レベルで進み、これら 3分子と骨代謝疾患との関わりも明らかになってきている（非特許文献 8 を参照）。

骨吸収と骨形成は通常平衡状態にあり、吸収した量だけ形成するという絶妙のバランスを調節するメカニズムが存在する。この骨吸収と骨形成の共役のことはカップリングと呼ばれる（非特許:？:献 9を参照）。破骨細胞分化因子である RANKL は骨吸収因子の刺激を受けて骨芽細胞上に産生され、破骨細胞前駆細胞や破骨細胞上の RANKL受容体である RANKに結合することにより、分化 ·活性化シグナルを伝える。このメカニズムに基づいて、 TNF の結合領域の立体構造に似せた人エペプチドを RANKLから RANKへのシグナル伝達の抑制に用いたという報告がある（非特許文献 1 0〜 1 2を参照）。

一方、骨吸収のシグナルを受けて、骨芽細胞に骨形成シグナルを伝えるメカ二ズムは解明されていなかった。

非特許文献 1 Sudaら、 Endocr Rev, 13： 66, 1992

非特許文献 2 Sambookら， N Engl J Med 328： 1747, 1993

非特許文献 3 Luckmanら、 J Bone Miner Res 13 : 581, 1998

非特許文献 4 Whyteら、 N Engl J Med 349 ： 457, 2003

非特許文献 5 Odvinaら、 J Cl in Endocrinol Metab 90 ： 1294, 2005 非特許文献 6 Yasudaら、 Proc Natl Acad Sci USA 95： 3597, 1998

非特許文献 7 Laceyら、 Cel l 93： 165, 1998

非特許文献 8 Sudaら、 Endocr Rev, 20： 345, 1999

非特許文献 9 Martinら、 Trends Mol Med, 11： 76, 2005

非特許文献 1 0 Aoki ら、 J Cl in Invest 116： 1525, 2006

非特許文献 1 1 Takasaki ら、 Nat Biotec, 15 : 1266, 1997

非特許文献 1 2 Chengら、 J Biol Chem, 279； 8269, 2004 発明の開示

本発明は骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化 ·成熟 ·石灰化を増強する RANKL結合分子であって、その分子を有効量投与することにより骨形成を増強する方法及び骨形成を刺激するための医薬品組成物の提供を目的とする。本発明者らは、リガンドである RANKLからその受容体である RANKに順方向のシグナルが入るだけでなく、 RANKから RANKLに逆方向のシグナルが入ることを見出した。また、この RANKLと RANKの間の双方向性シグナルが、骨吸収と骨形成の力ップリングを司ることを見出した。破骨細胞上の膜型 RANKから骨芽細胞上の膜型 RANKL への逆シグナルは、生理的骨代謝において骨吸収と骨形成のカップリングを司ると考えられる。この逆シグナルを利用することにより、骨量を増加させる薬剤の開発が可能である。具体的には膜型 RANK、 RANK 類似ペプチド、抗 RANKL 抗体、可溶型 RANK、 0PG及びそれらの変異体、類似物などの RANKL結合分子による膜型 RANKLへの結合による逆シグナルにより、骨芽細胞分化 '成熟が亢進し、骨量を増加させることができる。

このようにして、本発明者等は、 RANKL に作用する分子として用いられる様々なタンパク質ゃぺプチドなどを骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞上の RANKLに作用させることにより、 in vi troにおいて骨芽細胞が分化 ·成熟し、石灰化が起こることを見出した。さらに、本発明者等は、 RANKL に作用する分子として用いられる様々なタンパク質ゃぺプチドなどをマウスに in vivoで投与すると、骨密度等が増加し、骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療や予防に用いられることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。

[ 1 ] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物を有効成分として含む、骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

[ 2 ] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞上の RANKLに作用する、 [ 1 ]の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

[ 3 ] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が RANK、 RANK の変異体若しくは断片べプチド、 RANKに構造が類似したぺプチド、 RANKの断片べプチドに構造が類似したぺプチド、 RANKに構造が類似した化学物質、 RANKの断片ペプチドに構造が類似した化学物質、 0PG、 OPG の変異体若しくは断片ペプチド、 0PGに構造が類似したべプチド、 0PGの断片べプチドに構造が類似したぺプチド、 0PGに構造が類似した化学物質、並びに 0PGの断片べプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、 [ 1 ]の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

[ 4 ] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞上の RANKLに作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が RANK, RANKLに作用し得る RANKの変異体若しくは断片ぺプチド、 RANKに構造が類似し RANKLに作用し得るぺプチド、 RANKの断片べプチドに構造が類似し RANKLに作用し得るぺプチド、 RANKに構造が類似し RANKLに作用し得る化学物質、 RANKL に作用し得る RANKの断片ぺプチドに構造が類似した化学物質、 0PG、 RANKLに作用し得る 0PGの変異体若しくは断片べプチド、 0PGに構造が類似し RANKLに作用し得るぺプチド、 0PGの断片べプチドに構造が類似し RANKLに作用し得るぺプチド、 0PGに構造が類似し RANKLに作用し得る化学物質、並びに RANKLに作用し得る 0PGの断片べプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、 [ 2 ]の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

[ 5 ] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が配列番号 7 又は配列番号 1 6で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、 [ 1 ]又は [ 2 ]の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

[ 6 ] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が配列番号 7 又は配列番号 1 6で表されるァミノ酸配列からなるぺプチドと GST又は IgGiの Fc 領域との融合タンパク質である、 [ 1 ]又は [ 2 ]の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

[ 7 ] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が抗 RANKL抗体又はその機能的断片である、 [ 1 ]又は [ 2 ]の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。 [8] 骨量減少を伴う骨代謝疾患が、骨粗鬆症、若年性骨粗鬆症、骨形成不全、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、関節リウマチ、変形性関節症による骨の低下、炎症性関節炎、骨髄炎、ダルココルチコイド処置、転移性の骨疾患、歯周の骨の喪失、癌による骨の喪失、及び加齢による骨の喪失からなる群から選択される、 [1 ] 〜[ 7 ]のいずれかの骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

[9] さらに、 BMP ファミリーメンバーを有効成分として含む、 [1]〜[8]のいずれかの骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

[1 0] 骨芽細胞に分化し得る細胞が、骨芽前駆細胞、間葉系幹細胞、間質細胞及び筋芽細胞からなる群から選択される、 [1 ]〜[ 9]のいずれかの骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

[1 1] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞にシグナルを伝達し、前記細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物を、 RANKL を発現している骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と接触させ、候補化合物が該骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進した場合に、候捕化合物が骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞にシグナルを伝達し、前記細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物であると判断することを含む、スクリーニング方法。

[1 2] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞上の RANKLに作用する、 [1 1]のスクリーニング方法。

[1 3] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞にシグナルを伝達し、前記細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物を、マウスに投与し、該マウスにおいて、骨密度の増加、骨塩量の増加、骨面積の増加、単位骨量の増加、骨梁幅の増加、骨梁数の増加からなる群から選択される少なくとも 1つの現象が認められた場合に、候補化合物が骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞にシグナルを伝達し、前記細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物であると判断することを含む、スクリーニング方法。

[14] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞上の RANKLに作用する、 [1 3]のスクリーニング方法。

[1 5] 骨芽細胞に分化し得る細胞が、骨芽前駆細胞、間葉系幹細胞、間質細胞及び筋芽細胞からなる群から選択される、 [1 1 ]〜[ 14]のいずれかのスクリ一ニング方法。

[1 6] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作甩し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物を有効成分として含む、骨芽細胞分化 ·成熟剤。

[1 7] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞上の RANKL に作用する、 [1 6]の骨芽細胞分化 ·成熟剤。

[1 8] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が RANK、 RANK の変異体若しくは断片べプチド、 RANKに構造が類似したぺプチド、 RANKの断片べプチドに構造が類似したべプチド、 RANKに構造が類似した化学物質、 RANKの断片ペプチドに構造が類似した化学物質、 0PG、 0PG の変異体若しくは断片ペプチド、

0PGに構造が類似したべプチド、 0PGの断片べプチドに構造が類似したべプチド、

0PGに構造が類似した化学物質、並びに 0PGの断片べプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、 [1 6]の骨芽細胞分化'成熟剤。

[1 9] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞上の RANKLに作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が RANK、 RANKLに作用し得る RANKの変異体若しくは断片べプチド、 RANKに構造が類似し RANKLに作用し得るぺプチド、 RANKの断片べプチドに構造が類似し RANKL に作用し得るペプチド、 RANKに構造が類似し RANKLに作用し得る化学物質、 RANKL に作用し得る RANKの断片べプチドに構造が類似した化学物質、 0PG、 RANKLに作用し得る 0PGの変異体若しくは断片べプチド、 0PGに構造が類似し RAMLに作用し得るぺプチド、 0PGの断片べプチドに構造が類似し RANKLに作用し得るぺプチド、 0PGに構造が類似し RANKLに作用し得る化学物質、並びに RANKLに作用し得る 0PGの断片べプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、 [ 1 7]の骨芽細胞分化 ·成熟剤。

[2 0] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が配列番号 7又は配列番号 1 6で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドである、 [ 1 6]〜 [1 9]のいずれかの骨芽細胞分化 ·成熟剤。

[2 1 ] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が配列番号 7又は配列番号 1 6で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドと GST又は 0₁の Fc領域との融合タンパク質である、 [1 6]〜[1 9]のいずれかの骨芽細胞分化 · 成熟剤。

[2 2] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が配列番号 7又は配列番号 1 6で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドの酢酸塩である、 [2 0]の骨芽細胞分化 ·成熟剤。

[2 3] 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が抗 RANKL 抗体又はその機能的断片である、 [ 1 9]の骨芽細胞分化 ·成熟剤。

[24] 骨芽細胞に分化し得る細胞が、骨芽前駆細胞、間葉系幹細胞、間質細胞及び筋芽細胞からなる群から選択される、 [ 1 6]〜[2 3]のいずれかの骨芽細胞分化 ·成熟剤。

[2 5] 配列番号 7又は配列番号 1 6で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

[ 2 6 ] 配列番号 7又は配列番号 1 6で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと GST又は IgGiの Fc領域との融合タンパク質を有効成分として含む、骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

[ 2 7 ] 有効成分が配列番号 7又は配列番号 1 6で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの酢酸塩である、 [ 2 5 ]の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。 .

[ 2 8 ] 骨量減少を伴う骨代謝疾患が、骨粗鬆症、若年性骨粗鬆症、骨形成不全、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、関節リウマチ、変形性関節症による骨の低下、炎症性関節炎、骨髄炎、ダルココルチコィド処置、転移性の骨疾患、歯周の骨の喪失、癌による骨の喪失、及び加齢による骨の喪失からなる群から選択される、 [ 2 5 ]〜[ 2 7 ]のいずれかの骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

[ 2 9 ] さらに、 BMPファミリーメンバーを有効成分として含む、 [ 2 5：！〜 [ 2 8 ] のいずれかの骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2007-149799号、日本国特許出願 2007-313822、日本国特許出願 2008-60145 及び日本国特許出願 2008-131572号の明細書およびまたは図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明

図 1は、ヒト間葉系幹細胞におけるペプチド Dによる ALP活性の上昇を示す図である。

図 2は、ヒト間葉系幹細胞におけるペプチド Dによる ALP活性の上昇（染色）を示す図である。

図 3は、ヒト間葉系幹細胞におけるペプチド Dによる石灰化作用を示す図である。

図 4は、マウス骨芽前駆細胞株 MC3T3- E1 細胞におけるぺプチド D による ALP 活性の上昇を示す図である。

図 5は、マウス骨芽前駆細胞株 MC3T3-E1細胞におけるぺプチド Dによる石灰化作用を示す図である。

図 6は、マウス骨芽細胞におけるぺプチド Dによる ALP活性の上昇を示す図である。

図 7は、マウス骨芽細胞における抗 RANKLポリクローナル抗体による ALP活性の上昇を示す図である。

図 8は、マウス骨芽細胞における抗 RANKLポリクローナル抗体及び抗 RANKLモノクローナル抗体による ALP活性の上昇を示す図である。

図 9は、ヒト骨芽細胞におけるぺプチド D、抗 RANKLポリクローナル抗体及び抗 RANKLモノクローナル抗体による ALP活性の上昇を示す図である。

図 1 0は、ヒト骨芽細胞におけるぺプチド D、 0PGFc、 RA KFc及び抗 RANKLモノクローナル抗体による ALP活性の上昇を示す図である。

図 1 1は、マウス筋芽細胞株 C2C12における抗 RANKLモノクローナル抗体による ALP活性の上昇を示す図である。

図 1 2は、ヒト間葉系幹細胞におけるぺプチド Dによる ALP及び I型コラーゲン遺伝子発現の上昇を示す図である。図 1 2 A は、電気泳動の結果を示し、図 1 2 B及び Cは GAPDHの発現量で標準化した結果を示す。

図 1 3は、膜型 RANKによる C2C12の ALP活性の上昇を示す図である。

図 1 4は、膜型 RANKによる ST2の ALP活性の上昇を示す図である。図 1 4 Aは通常培地にて、図 1 4 Bは Dexamethasone (10— ⁷M)及び活性型 Vitamin D₃ (10- ⁸M)存在下で培養した結果をそれぞれ示す。

図 1 5は、 RANKL を投与したマウス及び投与しないマウスにおける頸骨の単位骨量を示す図である。

図 1 6は、 RANKL を投与したマウス及び投与しないマウスにおける頸骨の破骨細胞数を示す図である。

図 1 7は、 RANKL を投与したマウス及び投与しないマウスにおける頸骨の骨梁数を示す図である。

図 1 8は、 RANKLを投与したマウス及び投与しないマウスの大腿骨の、 /z CTにより測定した骨形態を示す図である。

図 1 9は、 RANKL を投与したマウス及び投与しないマウスにおける頸骨の骨芽細胞面を示す図である。

図 2 O Aは、ぺプチド Dを投与したマウスにおける大腿骨の骨塩量を示す図である。

図 2 0 Bは、ぺプチド Dを投与したマウスにおける大腿骨の骨面積を示す図でめる。

図 2 0 Cは、ぺプチド Dを投与したマウスにおける大腿骨の骨密度を示す図である。

図 2 1は、ペプチド Dを投与したマウスにおける大腿骨の各領域における骨密度を示す図である。

図 2 2 Aは、ペプチド！）を投与したマウスにおける大腿骨の遠位骨端部から 5 mmの領域の骨密度を示す図である。

図 2 2 Bは、ベプチド Dを投与したマウスにおける大腿骨の遠位骨端部から 5 mmの領域の皮質骨量を示す図である。

図 2 3は、ぺプチド Dを投与したマウスにおける大腿骨の遠位骨端部から 2讓の領域の ju CTによる 3次元構造解析の結果を示す図である。

図 2 4 Aは、ぺプチド Dを投与したマウスにおける大腿骨の遠位骨端部から 2 讓の領域の CTによる海綿骨領域の骨梁構造計測による BV/TVを示す図である。図 2 4 Bは、ぺプチド Dを投与したマウスにおける大腿骨の遠位骨端部から 2 讓の領域の // CTによる海綿骨領域の骨梁構造計測による骨梁幅を示す図である。図 2 4 Cは、ぺプチド Dを投与したマウスにおける大腿骨の遠位骨端部から 2 匪の領域の CTによる海綿骨領域の骨梁構造計測による骨梁数を示す図である。図 2 5は、ぺプチド Dを投与したマウスにおける石灰化率（A)及び骨形成率（B) を示す図である。

図 2 6は、ペプチド Dを添加してから 12時間後の p38のリン酸化を示す図である。

図 2 7は、ペプチド Dを添加してから短時間での p38のリン酸化を示す図である。図 2 8は、ぺプチド D添加による GSK3 ]3のリン酸化を示す図である。

図 2 9は、ペプチド D添加による Smadのリン酸化を示す図である。

図 3 0は、 SB203580によるべプチド Dの ALP活性亢進の抑制を示す図である。図 3 1は、 Dkk-1によるペプチド Dの ALP活性亢進の抑制を示す図である。図 3 2は、 BMPR-IAによるべプチド Dの ALP活性亢進の抑制を示す図である。図 3 3は、 C2C12細胞におけるぺプチド D と BMP- 2の併用による ALP活性亢進作用を示す図である。

図 3 4は、 MC3T3- E1細胞におけるぺプチド Dと BMP- 2の併用による ALP活性の亢進を示す図である。

図 3 5は、 BMP-2添加による C2C12細胞での RANKLの発現の促進を示す図である。

図 3 6は、ぺプチド D及びぺプチド Eの RAW264細胞での TRAP活性抑制作用を示す図である。

図 3 7は、ぺプチド D及びべプチド Eの MC3T3-E1細胞での ALP活性の亢進作用を示す図である。

図 3 8は、 RANKLをノックダウンした MC3T3- E1細胞におけるぺプチド Dの ALP 活性亢進作用を示す図である。

図 3 9 Aは、ぺプチド Dの様々な塩置換体による ALP活性亢進作用を示す図である。

図 3 9 Bは、ぺプチド Dの酢酸塩の用量依存的な ALP活性亢進作用を示す図である。

図 3 9 Cは、ぺプチド Dと BMP- 4の併用による ALP活性亢進作用を示す図である。

図 4 0は、 C2C12細胞における RANKL抗体および RANKL抗体と BMP- 2の併用による ALP活性亢進作用を示す図である。

図 4 1は、マウス骨芽細胞における RANKL抗体による ALP活性亢進作用を示す図である。

図 4 2は、マウス骨芽細胞における RANKL抗体と BMP- 2の併用による ALP活性亢進作用を示す図である。図 4 3は、 MC3T3- El細胞におけるぺプチド Dと BMP- 2の併用による ALP活性亢進作用に対する GST-RANKLの影響を示す図である。

図 4 4は、ぺプチド Dおよび RANKL抗体のマウス骨芽細胞の増殖促進作用を示す図である。

図 4 5は、ペプチド Dによる MC3T3-E1細胞における遺伝子発現変化を示す図である（1 2時間後）。

図 4 6は、ぺプチド Dによる MC3T3-E1細胞における遺伝子発現変化を示す図である（9 6時間後）。

図 4 7 Aは、 MC3T3- E1細胞におけるペプチド Dおよび BMP- 2による ALP, Col l, 0Cそれぞれの遺伝子発現変化を示す電気泳動図である。

図 4 7 Bは、 MC3T3- E1細胞におけるペプチド Dおよび BMP- 2による ALP， Coll, 0Cそれぞれの遺伝子発現変化を示す図である。

図 4 8は、ぺプチド Dによる生体内骨形成マーカーの増加を示す図である。図 4 9は、ペプチド Dの骨形成作用を遺伝子発現変化にて示す図である。

図 5 O Aは、ぺプチド Dによる各種増殖因子およびその受容体などの発現を示す写真である。

図 5 0 Bは、ぺプチド Dによる各種増殖因子およびその受容体などの発現を示す図である。

図 5 1は、 Fc融合ペプチド Dの ALP活性亢進能を示す図である。

図 5 2は、塩置換したペプチド Dの破骨細胞形成活性に対する影響を示す図である。

図 5 3は、各種 RANKL抗体の RANKLによる破骨細胞形成活性に対する中和能を示す図である。

図 5 4は、抗ヒト RANKLモノクローナル抗体の RANKLによる破骨細胞形成活性に対する中和能を示す図である。

図 5 5は、 GST融合べプチド Dの ALP活性亢進能を示す図である。

図 5 6は、抗ヒト RANKLモノクローナル抗体の ALP活性亢進能を示す図である。発明を実施するための最良の形態以下、本発明を詳細に説明する。

RANKL (Receptor act i vator of NF- κ B l i gand) は、 TNF スーパーファミリ一のメンバーである RANK (NF- κ Βの受容体ァクティベータ一）のリガンドであり、細胞内ドメイン（RANKの Ν末端から第 1番目から 48番目のアミノ酸からなるドメイン）、膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを有する 2型貫通タンパク質である (特表 2002-509430号公報、国際公開第 W098/46644号パンフレツト、後者は現在特許公報 3523650号となっている）。 RANKLは骨吸収因子の刺激を受けて骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞上に発現する。ここで、骨芽細胞に分化し得る細胞には、骨芽細胞に分化し得る限りあらゆる細胞が含まれ、例えば、骨芽前駆細胞、間葉系幹細胞、間質細胞、筋芽細胞等が挙げられる。細胞外ドメイン中、 N 末端から第 152番目以降のアミノ酸からなるドメインは、 TNF リガンドファミリ一相同性ドメインである。ヒト由来の RANKLの全長塩基配列及びァミノ酸配列を、それぞれ配列番号 1及び 2に示す。 RANKの全長塩基配列及びァミノ酸配列を、それぞれ配列番号 3及び 4に示す。

OPG (osteoprotegerin)は、構造;^ RANK に類似したタンパク質であり、 RANKL に作用し得る。 0PG の全長塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号 5及び 6に示す。

本発明は、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用しそれら細胞の分化、増殖、成熟、石灰化を促進し、骨形成を促し、骨量増強等を引き起こす化合物を有効成分として含む医薬組成物である。該医薬組成物として、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞にシグナルを伝達し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟、石灰化を促進し、骨形成を促し、骨量増強等を引き起こす化合物を有効成分として含む医薬組成物、例えば、 RANKL に作用し、 RANKL から骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞にシグナルを伝達し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟、石灰化を促進し、骨形成を促し、骨量増強等を引き起こす化合物を有効成分として含む医薬組成物がある。前記化合物が RANKLに作用する場合、作用し得る RANKLの由来動物種は限定されず、ヒト由来 RANKL、マウス由来 RANKL、ラット由来 RANKL等あらゆる動物種由来の RANKL が対象となる。ここで、 RANKLに作用するとは、 RANKLに作用して RANKLから骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞にシグナルを伝達することをいい、例えば、

RANKLに結合し、 RANKLから骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞にシグナルを伝達する。

RANKLに作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟、石灰化を促進し、骨形成を促し、骨量増強等を引き起こす化合物として、あらゆる動物種由来のあらゆる RANKL作用化合物が挙げられる。該化合物は、天然及び非天然べプチドゃ化学合成あるいは微生物由来などの低分子化合物を含む。

本発明の骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟、石灰化を促進し、骨形成を促し、骨量増強等を引き起こす化合物として、 RANKの変異体若しくは断片べプチド、 RANKに構造が類似しているべプチド、 RANKの断片べプチドに構造が類似しているペプチド、 RANK に構造が類似している化学物質、 RANK の断片べプチドに構造が類似した化学物質等が挙げられる。このような化合物として、例えば、 RANK、 RANKLに作用し得る RANKの変異体若しくは断片べプチド、 RANKに構造が類似し RANKLに作用し得るぺプチド、 RANKの断片べプチドに構造が類似し RANKLに作用し得るぺプチド、 RANKに構造が類似し RANKLに作用し得る化学物質、 RANKLに作用し得る RANKの断片べプチドに構造が類似した化学物質等が挙げられる。

また、化学物質とは、ペプチド及びタンパク質以外の化合物をいう。 RANKは膜型 RANKも可溶型 RANKも含む。膜型 RANKとは、細胞表面に結合している状態の膜貫通領域を有する RANKをいい、天然型 RANKを発現している細胞ゃリコンビナント RANK を発現しているヒト細胞等の動物細胞を用いることができる。また、 RANKFc も含まれる。ここで、 RANKFcはヒト RANKの細胞外領域にヒト IgGiの Fc 領域を結合させた融合タンパク質である。

また、本発明において、構造が類似しているとは、例えば、 RANKL に作用し得る部分の立体構造が類似していることをいう。ペプチドやタンパク質の場合、通常ァミノ酸配列で表される 1次構造も類似しているが、ァミノ酸配列が類似しておらず、立体構造が類似しており、 RANKLに作用し得る化合物も含まれる。

さらに、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟、石灰化を促進し、骨形成を促し、骨量増強等を引き起こす化合物として、 0PG、 0PGの変異体若しくは断片べプチド、 0PGに構造が類似しているべプチド、 0PGの断片ぺプチドに構造が類似しているペプチド、 0PG に構造が類似している化学物質、 0PG の断片べプチドに構造が類似した化学物質等が挙げられる。このような化合物として、例えば、 RANKLに作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟、石灰化を促進し、骨形成を促し、骨量増強等を引き起こす化合物として、 0PG、 RANKLに作用し得る 0PGの変異体若しくは断片べプチド、 0PGに構造が類似し RANKLに作用し得るぺプチド、 0PGの断片べプチドに構造が類似し RANKL に作用し得るぺプチド、 0PGに構造が類似し RANKLに作用し得る化学物質、 RANKL に作用し得る 0PGの断片べプチドに構造が類似した化学物質等が挙げられる。また、化学物質とは、ペプチド及びタンパク質以外の化合物をいう。 0PG は膜型 0PGも可溶型 0PGも含む。膜型 0PGとは、 C末端領域などで細胞表面に結合している状態の 0PGをいい、天然型 0PGを発現している細胞ゃリコンビナント 0PG を発現しているヒト細胞等の動物細胞を用いることができる。また、 OPGFc も含まれる。ここで、 OPGFcとは、 0PGにヒト IgG!の Fc領域を結合させた融合タンパク質（Fc融合タンパク質）である。

RANK又は 0PGの類似体として、例えば、 RANK若しくは 0PG又はそれらの断片べプチドのアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列を含み、かつ RANK又は 0PGの活性を有するタンパク質若しくはペプチドを含む。ここで、 1又は数個とは 1〜9個、好ましくは 1〜5 個、さらに好ましくは 1若しくは 2個である。

RANKの RANKLに結合する部位の構造に似せたぺプチドとして、例えば、配列番号 7で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド（ぺプチド D)及び配列番号 1 6で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチド E)が挙げられる。これらのぺプチドは、 2番目の Cysと 8番目の Cysがジスルフィド結合で結ばれた環状ぺプチドである。

さらに、上記の RANKの RANKLに結合する部位の構造に似せたぺプチド塩も用い得る。ぺプチド塩は、薬学的に許容できる塩であれば限定されないが、たとえば、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、酢酸、リンゴ酸、コハク酸、トリフルォロ酢酸（TFA)塩、酒石酸またはクェン酸等の有機酸との塩、塩酸、硫酸、硝酸またはリン酸等の無機酸との塩が挙げられる。また塩基付加塩としては、ナトリウムまたはカリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウムまたはマグネシウム等のアル力リ土類金属との塩、アンモニゥムまたはトリェチルァミン等のアミン類との塩が挙げられる。この中でも、酢酸塩が好ましく、特に配列番号 7又は配列番号 1 6で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドの酢酸塩が好ましい。

また、上記の RANKの RANKLに結合する部位の構造に似せたぺプチドと GST (グルタチオン- S-トランスフェラーゼ）又はヒト IgGiの Fc領域を結合させた融合タンパク質（Fc融合タンパク質又は GST融合タンパク質）も用いることができる。このような融合タンパク質として、例えばべプチド Dと GST (ダルタチオン- S-トランスフェラーゼ）又はヒト IgGiの Fc領域を結合させた融合タンパク質（Fc融合ペプチド D又は GST融合ペプチド D) が挙げられる。これらの融合タンパク質は、生体内での安定性が増し、血中半減期が長くなる。また、 GSTと Fc領域の他のェピトープタグとの融合タンパク質も用いることができる。他のェピトープタグとしては、 2〜12個、好ましくは 4個以上、さらに好ましくは 4〜 7個、さらに好ましくは 5個若しくは 6個のヒスチジンからなるポリヒスチジン、 FLAGタグ、 Myc タグ、 V5 タグ、 Xpress タグ、 HQタグ、 HAタグ、 AU1 タグ、 T7 タグ、 VSV- G タグ、 DDDDKタグ、 S タグ、 CruzTag09、 CruzTag22、 CruzTag41、 Glu- Gluタグ、 Ha, 11タグ、 KT3タグ、チォレドキシン、マルトース結合タンパク質（ΜΒΡ)、 βガラクトシダーゼ等が挙げられる。

本発明において、 RANKL に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟、石灰化を促進し、骨形成を促し、骨量増強等を引き起こす化合物を、 RANKLに対するァゴニスト物質ということがある。

さらに、抗 RANKL抗体であって、 RANKLに作用することにより、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟、石灰化を促進し、骨形成を促し、骨量増強等を引き起こす抗体又はその機能的断片も含まれる。本発明において、これらの抗体を RANKLに対するァゴニスト抗体とレ、うことがある。抗 RANKL抗体は、公知の方法により、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることができ、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、及び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現べクタ一で形質転換した宿主に産生されるものを含む。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、公知の手法により、以下のようにして作製できる。すなわち、膜型若しくは可溶型 RANKL又はその断片べプチドを感作抗原として用いて、公知の免疫方法により免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、公知のスクリーニング法により、モノクローナル抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって作製することができる。 RANKL を免疫する際、ゥシ血清アルブミン（BSA)、キーホールリンペットへモシァニン等のキヤリアタンパク質と結合させて用いてもよレ、。モノクローナル抗体としては、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクタ一に組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用レヽることカできる（例え ίま、、 Vandamme, A. M. et al. , Eur. J. Biochem. 1990 ; 192 : 767-775.参照）。この際、抗体重鎖（H鎖）又は軽鎖（L鎖）をコードする DNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいは H鎖及び L鎖をコードする DNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（W0 94/11523 号公報参照）。また、トランスジエニック動物を使用することにより、組換え型抗体を産生することもできる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ャギカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、この胚を雌のャギへ導入する。胚を受容したャギから生まれるトランスジヱニックャギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る（Ebert, K. M. et al. , Bio/Technology 1994 ; 12 : 699-702)。

本発明の抗 RANKL抗体は、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化

(Humanized) 抗体をも含む。このような抗体としてはキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体が挙げられ、いずれも公知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、得た抗体 V領域をコードする DNAを得て、ヒト抗体 C領域をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。ヒト型化抗体は、再構成（reshaped) ヒト抗体ともいう。ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR ; complementari ty determining region) をヒ卜抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、公知の方法により作製することができる（欧州特許出願公開番号 EP 125023 号公報、 TO 96/02576 号公報参照）。キメラ抗体及びヒト型化抗体の C領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えば H鎖では、 C y l、 C y 2、 C y 3、 C y 4を、 L鎖では C K、 C λを使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体 C領域を修飾してもよい。

ヒト抗体は、例えばヒト抗体遺伝子座を導入し、ヒト由来抗体を産生する能力を有するトランスジエニック動物に抗原を投与することにより得ることができる。該トランスジヱニック動物としてマウスが挙げられ、ヒト抗体を産生し得るマウスの作出方法は、例えば、国際公開第 W002/43478号パンフレツトに記載されている。

抗 RANKL抗体は、完全抗体だけでなく、その機能的断片も含む。抗体の機能的断片とは、抗体の一部分（部分断片）であって、抗体の抗原への作用を 1つ以上保持するものを意味し、具体的には F (ab' ) ₂ 、 Fab' , Fab、 Fv、ジスルフィド結合 Fv、一本鎖 Fv ( scFv) , 及びこれらの重合体等が挙げられる [D. J. King. , Appl icat ions and Engineering of Monoclonal Antibodies. , 1998 T. j .丄 nternational Ltd]。

また、モノクローナル抗体を用いる場合、 1種類のみのモノクローナル抗体を用いてもよいが、認識するェピトープが異なる 2種類以上、例えば 2種類、 3種類、 4種類又は 5種類のモノクローナル抗体を用いてもよい。

上記の化合物が、 RANKL に対してシグナル伝達を促進させるァゴニスト活性を有するか否かは、例えば、抗体を RANKLを発現する骨芽細胞又はその骨芽前駆細胞、若しくは筋芽細胞や間質細胞等の骨芽前駆細胞、間葉系幹細胞と同様の性質を有する細胞に投与し、 RANKL に作用させ、これらの細胞が分化、増殖するかを検定することにより、決定することができる。分化、増殖は、例えば細胞のアル力リフォスファターゼ活性の上昇や石灰化等を指標に決定することができる。また、上記化合物を動物に投与した場合、骨密度、骨塩量、骨面積が増加する。骨密度とは、骨中のカルシゥムなどミネラル成分の密度を数字で表したものをいつ。骨密度は、 pQCT ^peripheral quantitative computerized tomography ; 木梢骨 X線 CT装置）、 SXA (Single Energy X-Ray Absorptiometry) , DXA (Dual Energy X-Ray Absorptiometry ; 二重エネルギー X線吸収法）等により計測することができる。さらに、上記化合物を動物に投与した場合、 /z CTで骨の 3次元構造解析を行った場合、海綿骨の密度の上昇が認められる。さらに、海綿骨骨梁構造計測により、 BV/TV (単位骨量： bone volume/total tissue volume)、骨梁幅、骨梁数の増加が認められる。さらに、上記化合物を動物に投与した場合、 pQCTによる骨形態計測により、皮質骨領域の骨密度の増加が認められる。

このことは、上記化合物が骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間葉系幹細胞、間質細胞、筋芽細胞上の RANKLに作用することにより、逆シグナルが入り、そのために骨形成が促進されたことを示している。本発明の組成物は、骨形成を増強し得、 in vitroで研究用試薬として用いることもでき、また in vivoで医薬組成物として用いることもできる。

本発明の医薬組成物は、骨形成を増強する医薬組成物として用いることができる。特に、骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のために用いることができる。このような、骨代謝疾患としては、骨粗鬆症、若年性骨粗鬆症、骨形成不全、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、関節リウマチ、変形性関節症による骨の低下、炎症性関節炎、骨髄炎、ダルココルチコイド処置、転移性の骨疾患、歯周の骨の喪失、癌による骨の喪失、加齢による骨の喪失、及びその他の骨量減少症が挙げられる。

投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、 1 日約 0. 01mg〜1000mgであり、これらを 1回、又は数回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、 1回約 0. 01mg〜1000mgを皮下注射、筋肉注射又は静脈注射によって投与することができる。また、投与時期としては、勲脈硬化性疾患の臨床症状が生ずる前後いずれでもよい。

組成物は、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射甩の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレンダリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。

本発明の医薬組成物は、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟、石灰化を促進し、骨形成を促し、骨量増強等を引き起こす化合物、例えば

RANKL に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟、石灰化を促進し、骨形成を促し、骨量増強等を引き起こす化合物の他、 BMP (Bone morphogenetic protein；骨形成タンパク質）ファミリーメンバーを含んでいてもよい。すなわち、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞上の RANKLに作用するか、あるいはしないで骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物を BMPファミリーメンバーと併用することにより、より優れた効果を得ることができる。特にべプチド D若しくはべプチド E又は抗

RANKL抗体と BMP ファミリーメンバーとの併用が好ましい。すなわち、本発明は骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物、特にべプチド D若しくはぺプチド E又は抗 RANKL抗体と BMPファミリ一メンバーを組合せてなる骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物を包含する。本発明の化合物と BMPファミリーメンバーとを併用する場合、両方を含む医薬製剤を調製し、それを投与してもよいし、本発明の化合物と

BMP ファミリーメンバーを別々に投与してもよい。すなわち、本発明の医薬組成物は、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物、特にべプチド D若しくはぺプチド E又は抗 RANKL抗体と BMPフアミリーメンバーの配合剤を含む。 BMP ファミリーメンバーとしては、 BMP - 4、

BMP- 2、 BMP-7、 BMP - 6等が挙げられる。本発明の化合物と BMP ファミリーメンバ一は共同作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟、石灰化を促進し、骨形成を促し、骨量増強等を引き起こし得る。 BMP メンバーの含有量は限定されないが、 1回約 0. 01mg〜1000mgである。

本発明は、さらに骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟、石灰化を促進し、骨形成を促し、骨量増強等を引き起こす化合物、例えば RANKL に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟、石灰化を促進し、骨形成を促し、骨量増強等を引き起こす化合物のスクリーニング方法を包含する。

該スクリーニング方法は、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間質細胞若しくは間葉系幹細胞又は筋芽細胞等の骨芽前駆細胞と同様の性質を有する細胞に候捕化合物を投与し、候補化合物が、上記細胞の分化、増殖を促進するかを検定すればよい。例えば、 RANKL を表面に発現している骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間葉系幹細胞、間質細胞又は筋芽細胞等の骨芽前駆細胞と同様の性質を有する細胞に候補化合物を投与し、候補化合物が RANKLに作用し、上記細胞の分化、增殖を促進するかを検定すればよい。分化、増殖は、例えば細胞のアルカリフォスファターゼ活性の上昇や石灰化等を指標に決定することができる。分化、増殖を促進する場合、候捕化合物を骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟、石灰化を促進し、骨形成を促し、骨量増強等を引き起こす化合物、例えば RANKLに作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟、石灰化を促進し、骨形成を促し、骨量増強等を引き起こす化合物であると判断することができる。

また、例えば候補化合物をマウス、例えば C57BL/6CrjCrljに投与し、骨密度、骨塩量、骨面積等の上昇が認められるか否かを指標に、該候補化合物が骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟、石灰化を促進し、骨形成を促し、骨量増強等を引き起こす化合物、例えば RANKLに作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟、石灰化を促進し、骨形成を促し、骨量増強等を引き起こす化合物であるか否かを判断することができる。

本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

実施例 1 ヒト間葉系幹細胞の分化誘導

試薬

実験には合成べプチドを使用した。合成べプチド Dは配列番号 7で表されるァミノ酸配列からなるペプチドであり、 9 アミノ酸から構成され、二つのシスティン残基がジスルフィド結合により結合した環状ペプチドである。合成ペプチド D は RANKLに結合することが報告されている（Aoki ら、 J Cl in Invest 116： 1525, 2006)。コントロールぺプチドはそのような機能を持たない合成べプチドを使用した。培養細胞

ヒト間葉系幹細胞は Cambrex社から購入した。専用の継代培地は Lonza社製品を使用した。ヒト間葉系幹細胞の分化誘導

ヒト間葉系幹細胞を、 1 X 10³個/ゥエルずつ 96 ゥヱルプレート（Nunc)に、又は 2. 4 X 10³個/ゥヱルずつ 48 ゥヱルプレート（IWAKI)に播種した。 24時間後に培養上清を除去し、骨芽細胞分化誘導培地（Lonza)に切換え、 3〜4日毎に培地を交換した。

同時に ΙΟΟ μ Μの濃度でペプチド Dを添加した（ペプチド D投与群）。ネガティブコントロールとしてコントロールぺプチドを同濃度で添加した。

ALP (アルカリフォスファタ一ゼ）活性測定

分化誘導後 7 日目に培養上清を除去し、細胞をァセトン ·エタノール固定液で固定した。固定後の ALP活性は、パラニトロフエニルリン酸を基質とする方法で測定を行った。すなわち、パラニトロフエニルリン酸（Nacalai) 1 mg/mLを含む炭酸バッファー（5 raM MgCl₂, 50 mM NaHC0₃)を各ゥヱルに 100 / L添加し、 37°Cでィンキュベート後に各ゥエルの 405mnにおける 0D値をマイクロプレートリーダー (BMG Labtech) にて測定した。ヒト間葉系幹細胞にペプチド D 100 μ Μを添加した群では、分化誘導後 7 日目において、分化誘導培地及び継代培地の両方で ALP活性が有意に上昇していた（図

1 )。また、分化誘導後 7 日目において細胞の ALP染色を行った場合にも、対照群に対しぺプチド D投与群で濃度依存的な ALP染色が認められた（図 2 )。実施例 2 ヒト間葉系幹細胞の石灰化

ALP染色

分化誘導と同時にぺプチド Dを 300 / Mの濃度で添加し、誘導後 7 日目に細胞を 10%中性緩衝ホルマリン溶液で固定後、アセトン ·エタノール固定液で再固定した。

細胞には、下記の通りに調製した染色液 500 しを添加し、 37°Cで 10分インキュペート後に水洗し、乾燥させた。

(染色液の組成）

ナフトール AS-MX リン酸塩（SIGMA) 5mg

N- N -ジメチルホルムアミド（Wako) 0. 5raL

0. 1M Tris-HCl (pH8. 5) 50mL

ファーストブルー塩へミ（SIGMA) 30mg ァリザリンレッド S染色

分化誘導後 21 日目に細胞を PBSで洗浄し、 10%中性緩衝ホルマリン溶液で固定した。

固定液除去後に水洗し、 1 %ァリザリンレツド S染色液（Nacalai)を 150 ^ L加え、室温で 3分間放置した。この後、染色液を除去後水洗し、乾燥後に顕微鏡下で観察した。ヒト間葉系幹細胞の培養は実施例 1と同様の方法で行なった。ヒト間葉系幹細胞にペプチド D を 300 _μ Μ添加することにより、分化誘導の有無に関わらず、 21 日目において強いァリザリンレツド染色が認められた。ペプチド Dが ALP活性上昇と共に石灰化も誘導することが示された（図 3 )。実施例 3 マウス骨芽前駆細胞株 MC3T3- E1の分化誘導

培養細胞

マウス骨芽前駆細胞株である MC3T3- E1 (サブクロ一ン No. 4)細胞は ATCCより購入したマウス骨芽前駆細胞 MC3T3- E1

8X10³個/ゥエルを 96ゥエルプレー卜に、又は 2 X10⁴個/ゥエルを 48ゥエルプレートに 10%FBS+aMEM (GIBC0)を用いて播種した。分化誘導のため 48時間後に培養上清を交換し、 5mMj3グリセ口リン酸（SIGMA) +10 i g/mL ァスコルビン酸ナトリゥム（SIGMA)を含む 10%FBS+ctMEMに切換え、 3〜4 日毎に培地を交換した。対照としてプレー卜の半分では継代培地である 10%FBS+ctMEMにて MC3T3-E1を培養した。培地交換と同時に 300 juMの濃度でペプチドを添加した。 ALP活性測定及びァリザリンレツド S染色は実施例 1と同様の方法で、それぞれ 7日目、 21 日目に行なった。マウス骨芽前駆細胞株の分化誘導

300μΜぺプチド Dを添加した群では、 MC3T3- E1細胞の分化誘導後 7 日目におレヽて ALP活性が有意に上昇していた（図 4)。ぺプチド Dによる石灰化作用

ペプチド！） 300 μΜを添加した群では、マウス骨芽前駆細胞 MC3T3-E1の分化誘導後 21 日目において、強いァリザリンレツド染色が認められた（図 5)。ぺプチド Dが ALP活性の上昇と共に石灰化も誘導することが示された。この現象は分化誘導培地だけでなく、継代培地で培養した MC3T3-E1でも観察された。実施例 4 マウス骨芽細胞の分化誘導実験には goat ポリクローナル mRANKL抗体（R&D、 Saint Cruz) , モノクローナル raRANKL抗体（（A)クローン 88227 (R&D)、及び（B)クローン 12A668) (ALEXIS) 及び合成べプチド Dを使用した。ネガティブコントロールとして goat IgG(ZYMED)、及びコントロールぺプチドを使用した。合成べプチド D及びコントロールぺプチドは実施例 1 と同じ物を使用した。また陽性対照として 300 ng/mL BMP-2 (R&D) を使用した。 ALP活性測定は実施例 1と同様に行った。マウス骨芽細胞の採取

新生児マウス頭蓋骨を酵素溶液（0· 1%コラゲナ一ゼ（Wako) + 0. 2%ディスパーゼ（合同酒精））に浸して、 37°Cの恒温槽にて 5分間振とうさせた。最初の細胞浮遊画分は除去し、新しい酵素液 lOmLを添加し、さらに 37°Cの恒温槽にて 10分間振とうさせた。この操作を 4回繰り返し、それぞれの細胞浮遊液を回収した。細胞浮遊液を 250 X gで 5分間遠心し、培地に懸濁して（：0₂ィンキュベータ一内で 3 〜4日間培養した。トリプシン- EDTA溶液（Nacalai)を用いてこれら細胞を回収し、セルバンカー（十慈科学）にて凍結保存した。マウス骨芽細胞の分化誘導

得られたマウス骨芽細胞を 0. 8 X 10⁴/wellとなるように％wellプレートに 10% FBS+ α ΜΕΜを用いて播種した。細胞が接着後に、 5 mMの i3グリセ口リン酸 + 10 μ g/mLのァスコルビン酸を含む培地にて分化誘導を行った。 300 μ Μの合成ペプチド Dにより分化培地にて 7日目に ALP活性化の上昇が認められた（図 6 )。各抗体は 1 /z g/mLを分化誘導と同時に添加した。分化誘導後 7日目に各因子を添加した群において、有意な ALP活性の上昇が確認された（図 7 )。この現象は分化誘導培地だけでなく、継代培地で培養したマウス骨芽細胞でも観察された。即ち、 RANKL に結合するポリクローナル抗体がコントロール抗体に比べて有意にマウス骨芽細胞の分化を誘導した。さらに詳細に抗体の効果を確かめるために、ポリクロ一ナル抗体の濃度を変えてマウス骨芽細胞に加え、 7日間継代培地で培養した。同時に抗 RANKLモノクローナル抗体 Aと Bを用いてモノクローナル抗体でも同様の分化作用が認められるかを調べた。その結果、ばらつきはあるものの抗 RANKLポリクローナル抗体は濃度依存的にマウス骨芽細胞の ALP活性を上昇させた（図 8 )。さらに抗 RANKLモノクローナル抗体 Aと Bの混合物は同様にマウス骨芽細胞の ALP 活性を上昇させた（図 8 )。以上のことから、マウス RANKLに対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体はマウス骨芽細胞の分化を誘導することがわかった。実施例 5 ヒト骨芽細胞の ALP活性化作用

抗 RANKLポリクローナル抗体ゃ抗 RANKLモノクローナル抗体などの試薬は実施例 4と同じものを使用した。さらに、抗 RANKLモノクローナル抗体（（C)クローン 12A380) (ALEXIS)、ヒト 0PGFc、ヒト RANKFc (R&D)を用いた。 ALP活性測定は実施例 1と同様に行った。これらの抗体はすべてマウス RANKLに対する抗体であるが、ヒト RANKLにも交差し、結合することが分かっている。培養細胞

ヒト骨芽細胞は Cambrex社から購入した。継代は専用培地（Lonza)にて行った。ヒト骨芽細胞の分化誘導

ヒト骨芽細胞は 96ゥエルプレートには 3. 1 X 10³/ゥエル、 48ゥエルプレートには 7. 65 X 10³/ゥエルとなるように播種した。細胞接着後に、 5mM ]3のグリセロリン酸を含む培地にて分化誘導を行った。抗体は 100 ng/mL又は 1 ng/mLを分化誘導と同時に添加した。 5日又は 6日間培養し、 ALP活性を測定した。抗 RANKLポリクローナル抗体ゃ抗 RANKLモノクローナル抗体、ぺプチド D、0PGFc、及び RANKFcによってヒト骨芽細胞の ALP活性が有意に上昇し、分化誘導が認められた（図 9、 1 0 )。以上のことから、マウス RANKLに対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、 0PGFc、及び RANKFcはヒト骨芽細胞の分化を誘導することがわかった。実施例 6 マウス筋芽細胞の分化誘導

モノクローナル mRANKL抗体などの試薬は実施例 4と同じものを使用した。 ALP 活性測定は実施例 1と同様に行った。培養細胞

マウス筋芽前駆細胞株である C2C12細胞は理化学研究所より購入した。マウス筋芽細胞の分化誘導

マウス筋芽前駆細胞である C2C12細胞 6. 5 X 10³個/ゥエルを 96 ゥヱルプレートに播種した。 48時間後に培養上清を交換し、 300 ng/mL BMP-2 (R&D)を含む 5% FBS + DMEM (SIGMA)に切換えた。培地交換と同時に抗体 lOOng/mLを添加し、 7日間培養した。 monoclonal mRANKL抗体（（A)クローン 88227 (R&D) ) によってマウス筋芽細胞の ALP活性が有意に上昇し、骨芽細胞へと分化誘導したことが確認できた（図 1 1 )。この実験では抗 RANKLモノクローナル抗体が単独で骨芽細胞前駆細胞の性質を持つマウス筋芽細胞に作用して骨芽細胞へと分化誘導したことが明らかとなつた。実施例 7 ペプチド Dによるヒト間葉系幹細胞の ALP活性化作用

RT-PCR解析

6ゥルプレートにヒト間葉系幹細胞 3 X 10⁴個を播種し、骨芽細胞分化誘導培地（Lonza)又は維持培地（Lonza)存在下で 7日間培養した。各ゥヱルには 100及び 300 /z Mのぺプチド D、さらにコントロール群にはぺプチドの溶媒を添加した。培養後に細胞を PBSで洗浄し、 QIAzol Lysis Reagent (QIAGEN) 0. 75mLに細胞を溶解させ、溶液を回収した。室温で 5分間溶液を放置後に 0. 15mL のクロ口ホルム (Wako) を添加し、激しく転倒混和させてから、 4 °C、 12000 X g の条件で 15分間遠心を行い、上清を新しいチューブに回収した。上清から EZ1 RNA universal tissue kit (QIAGEN)及び Magtration Systeml2GC (QIAGEN)を用いて RNAの単離を行った。 RNA濃度測定後に 250ngの各 RNAを 1 %ァガロースゲルにて電気泳動を行い、 RNA分解の有無を確認し、分解のない RNAそれぞれ 500 ngを RT-PCRに供した。 RT- PCR は ThermoScript RT-PCR Systemunvitrogen)及び random primer を用いて行った。

cDNA合成後に、ヒトのアル力リフォスファターゼ（hALP)及びヒトの I型コラーゲン（hCol lagen I )特異的なプライマーを用いて PCR を行った。標準化用にヒト

GAPDH特異的なプライマーを用いて PCRを行った。用いた PCRプライマー配列は下 tこ Sci載した。 Ex Taq™ Hot Start Version (Takara Bio Inc. , Shiga, Japan; を用いて以下の条件で PCRを行った。アル力リフォスファターゼ（hALP)は 94°Cで 15分初期熱変性を行った後、 94°Cで 1分、 58°Cで 1分、 72°Cで 30秒を 28サイクル行い、 72°Cで 10分間伸長反応を行った。 I型コラーゲン（hCollagen I )は、94°C で 15分初期熱変性を行った後、 94°Cで 1分、 58°Cで 1分、 72°Cで 30秒を 25サイクル行い、 72°Cで 10分間伸長反応を行った。 GAPDHは、 95°Cで 3分初期熱変性を行った後、 95°Cで 10秒、 60°Cで 15秒、 68°Cで 1分を 28サイクル行い、 68°Cで 10分間伸長反応を行った。

PCRプライマー配列

hALP-F ： 5 ' -GGGGGTGGCCGGAAATACAT-3 ' (配列番号 8 )

hALP-R ： 5' -GGGGGCCAGACCAAAGATAGAGTT-3 ' (配列番号 9 )

hCollagenl-F : 5， -ATTCCAGTTCGAGTATGGCG- 3 ' (配列番号 1 0 )

hCollagenl-R ： 5 ' - TTTTGTATTCAATCACTGTCTTGCC- 3 ' (配列番号 1 1 ) hGAPDH-F ： 5 ' - TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT- 3 ' (配列番号 1 2 )

hGAPDH-R ： 5 ' -CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3 ' (配列番号 1 3 )

PCR反応後得られたサンプルは、 1 %ァガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ェチジゥムブ口マイドを用いて、 UV下で特異的なバンドが形成されていることを確認した（図 1 2 A)。得られた画像は、 CSAnalyzerを用いて解析した。また、 GAPDH の発現量で標準化し、図 1 2 B及び Cに示した。ヒト間葉系幹細胞にペプチド D 300 Mを添加した群では、分化誘導後 7 日目において、分化誘導培地及び継代培地の両方で ALP活性が有意に上昇し、また、分化誘導後 7日目において細胞の ALP染色を行った場合にも、対照群に対しべプチド D投与群で濃度依存的な ALP染色が認められたが、 PCR解析の結果、ヒト間葉系幹細胞をべプチド存在下で 7日間分化誘導を行うと、ぺプチドの濃度依存的にアル力リフォスファターゼ及び I型コラーゲンの発現が上昇することが確認された（図 1 2 A)。また、継代培地下でも 300 μ Μの濃度でぺプチドはアル力リフォスファターゼ及び I型コラーゲンの mRNA発現を上昇させた（図 1 2 B及び C)。実施例 8 膜型 RANKによる C2C12の骨芽細胞への分化誘導 96ゥヱルプレートに C0S 1を lOOOOcel ls/wel lで DMEM- 5% FBSで播種し 1 日培養後、各種プラスミド DNA (pSR a -EXl (コントロール発現ベクター 1 )、 pSR α -mRANK (マウス RANK発現ベクター）、 pCAGGS- mBMP- 4 (マウス BMP - 4発現ベクター）、 QIAwel l8 plasmi d purification ki t (Qiagen)にて精製）をウエノレあたり 50 ng ずつ FuGENE HD (Roche)を用いてトランスフエクションした。同様に 0. 5 ng の pCAGGS-mBMP-4 は 24. 5 ng の pCAGGS (コントロール発現ベクター 2 ) 及び 25ng の pSR a -mRANK と混合し、トランスフエクシヨンした。その対照として 0. 5 ng の pCAGGS-mBMP- 4は 24· 5 ngの pCAGGS及び 25ngの pSR a - EX1 と混合し、トランスフエクシヨンした。翌日、 C2C12をゥエルあたり 10000cel lsずつトランスフェクシヨンした C0S1プレートに播種し共培養した。 3日ごとに DMEM-2. 5% FBSにて培地交換し、 1週間後、培地を除去し、アセトン 'エタノール 1 ： 1混合溶液を加えて細胞を固定した。固定液を 30秒で除去しプレートを 30分程度乾燥させ、乾燥中に ALP 検出溶液（ 5 mM MgCl₂, 40mM NaHC0₃, 1 mg/ral p-nitrophenyl phosphate)を作製し、 100 μ 1ずつ加えて反応を開始した。 60分後、マイクロプレ —トリーダーで ABS405nm を測定した。その結果、陽性コントロールである pCAGGS-mBMP-4が強い骨芽細胞分化活性を示すのに比べ弱いものの、 pSR a -mRANK は有意に ALP 活性を上昇させ、骨芽細胞分化活性を示した（図 1 3 )。また、 pCAGGS- mBMP- 4 量を 1 %に減らすとコントロール発現ベクターである pSR a - EX1 との間で有意差はなくなつたが、 pSR ct - mRANK と同時にトランスフエクシヨンすることにより、有意に ALP活性が上昇した（図 1 3 )。また、 pCAGGS_mBMP-4量を 1 %に減らし pSR ct - mRANK と同時にトランスフエクシヨンすることにより、 pSR α - mRANK単独のトランスフエクシヨンよりも有意に ALP活性が上昇した（図 1 3 )。これは膜型 RANKが BMP - 4と共同で作用したことを意味する。このように膜型 RANK は単独で、あるいは BMP-4と共同で骨芽細胞前駆細胞の性質を持つマウス筋芽細胞株である C2C12細胞を骨芽細胞へと分化誘導した。実施例 9 膜型 RANKによる ST2の骨芽細胞への分化誘導

マウス間質細胞株である ST2細胞は理化学研究所より購入した。 96ゥエルプレ

—トに C0S1を 10000cel ls/wel lで DMEM- 5 % FBSで播種し 1 日培養後、各種プラスミド DNA (pSR a - EX1 (コント口ール発現べクタ一 1 )、 pSRひ -mRANK (マウス RANK 発現べクタ一）、 QIAwel l8 plasraid purificat ion kit (Qiagen)にて精製）をゥェルあたり 50ngずつ FuGENE HD (Roche)を用いてトランスフエクションした。翌日、 ST2をゥエルあたり 5000cel lsずつトランスフエクションした C0S1プレートに播種し共培養した。このとき、 ST2 に RANKL 発現誘導するために Dexamethasone (10— ⁷M)、活性型 Vitamin D₃ (10"⁸M)をカロえる系と加えない系 (RANKL 発現誘導なし）を作製した。 3日後に DMEM-2. 5% FBSを追加し、さらに 3日後に DMEM-2. 5% FBSにて培地交換し、 1週間後、培地を除去し、アセトン 'エタノール 1 ： 1混合溶液を加えて細胞を固定した。固定液を 30 秒で除去しプレートを 30分程度乾燥させ、乾燥中に ALP検出溶液（5 mM MgCl₂， 40 niM NaHC0₃, 1 mg/ml p-nitrophenyl phosphate)を作製し、 100 μ 1ずつ加えて反応を開始した。 60分後、マイクロプレートリーダーで ABS405nm を測定した。その結果、 Dexamethasone (10"⁷M) , 活' 型 Vitamin D₃ (10— ⁸M)を加える系（RANKL 誘導）においてのみ、 pSR a -mRANKは有意に ALP活性を上昇させ、 ST2細胞は骨芽細胞分化活性を示した（図 1 4 及び¾。このように膜型 RANKは単独で骨芽細胞前駆細胞や脂肪細胞前駆細胞の性質を持つマウス間質細胞株である ST2細胞を骨芽細胞へと分化誘導したが、この現象は RANKLを発現誘導した ST2細胞を用いた場合にのみ認められた。これは膜型 RANKが ST2細胞上に発現誘導された膜型 RANKLに結合して ST2細胞内に骨芽細胞分化シグナルが伝わったことを示す。実施例 1 0 生体内で分化誘導された破骨細胞による骨芽細胞の増殖、分化 GST-RANKLの調製

ヒト型 RANKL残基 140— 317をコードする cDNAに PCRにて Sal I, Not Iサイトを付カ卩し、これらのェンドヌクレアーゼを用いて、 pGEX_4T-2 ( GE healthcare； Genbank Accession Number U丄 ύ8ο4) の Glutathione S- transferase の下流にクローユングした。配列番号 1 4及び 1 5に、 RANKL のアミノ酸配列中第 140番目のアミノ酸から第 317番目のアミノ酸配列からなるタンパク質に GST が融合したタンパク質をコードする DNAの塩基配列及び該タンパク質のアミノ酸配列を示す。 BL21 (DE3) Escherischia col i (invi trogen)における IPTG (終濃度： 0. 5mM) によるタンパク質発現の誘導後、菌体を抽出バッファー（50mM Tris_HCl， pH8. 0, lOOmM NaCl, IraM EDTA, lmM DTT, l% (v/v) TritonX-100) にて懸濁し、 4 °C でソニケ一ターを用いて破砕した。 18000 X g、 15min で遠心後、上清を回収し Glutathione Sepharoseカラムにかけた。続いて洗浄バッファー（50mM Tris- HC1， pH8. 0, lOOmM NaCl, IraM DTT, 0. 1 % (v/v) TritonX- 100) にて洗浄した。その後、 Glutathione溶液（20mM 還元型グルタチオン， 50mM Tris_HCl， pH8. 0) で溶出した。 SDS- PAGEにて精製した GST-RANKLの分子量及び純度を確認し、フィルターろ過した。分子量 47. 0kDa、純度 95%以上であった。また、リムルス変形細胞溶解物試験（l imulus amebocyte lysate assay) によりエンドトキシン濃度を測定し、 lEU/ug未満であることを確認した。

RANKL投与試験

7週齢の C57BL/6Nマウス雌 10匹に GST-RANKLを 57nmol (低用量）及び 426nmol (高用量）を 24時間毎 3回腹腔内投与し 3回目投与より 1. 5時間後に解剖した。比較対象として PBSを同様に投与した群を用いた。

解剖後のマウスは大腿骨、頸骨、大脳、肺、心臓、肝臓、胸腺、脾臓、腎臓、皮膚を採取し、大脳、肺、心臓、肝臓、胸腺、脾臓、腎臓、皮膚は HE染色により自然発生病変を観察した。骨形態計測

骨形態計測の結果単位骨量及び骨梁数は、 GST-RANKL 高用量の投与により約 50%まで減少し、破骨細胞数は増加した。また低用量の投与において減少は見られなかった（図 1 5、 1 6及び 1 7 )。

大腿骨の骨形態を CTにより測定したところ高用量の GST- RANKL投与群においては顕著な骨の減少が見られた（図 1 8 )。

採取した大脳、肺、心臓、肝臓、胸腺、脾臓、腎臓、及び皮膚を HE染色し観察したが、すべての群で異常所見及び自然発生病変は認められなかった。骨芽細胞面

高用量の GST-RANKL投与により破骨細胞数の増加、骨量の減少、骨吸収が見られた。さらに骨芽細胞面を調べたところ、有意に上昇していることがわかった（図

1 9 )。これは破骨細胞数の増加や破骨細胞の活性化による骨吸収の亢進により、骨形成が促進されるという現象、即ち骨吸収と骨形成の力ップリングが起こっていることを示す。高用量の GST-RANKLを投与されたマウスでは、骨の微少環境において増力 Ρ ·活性化した破骨細胞上の RANKが骨芽細胞上の RANKLに作用し、分化、増殖、成熟又は石灰化などのシグナルを伝えていると考えられる。実施例 1 1 合成ペプチド投与による生体内における骨量増加

ρ¾

実験には合成べプチドを使用した。合成べプチド Dは配列番号 7で表されるァミノ酸配列からなるペプチドであり、 9 アミノ酸から構成され、二つのシスティン残基がジスルフィド結合により結合した環状ペプチドである。合成ペプチド D は RANKLに結合することが報告されている（Aoki ら、 J Cl in Invest 116 : 1525， 2006)。合成べプチドは 10% DMSO (Nacalai) /PBSに 1 mg/mlの濃度で溶解させた。実験動物

C57BL/6CrjCrlj マウスは㈱ォリェンタルバイォサービスから購入した。 C57BL/6CrjCrljマウス近交系マウスであり、老化による細胞性免疫能の低下が少ないという特徴を有するマウスである。温度 23°C ± 3°C、湿度 50% ± 30%の環境下で 1週間予備飼育した。照明時間は 8 : 00〜20 : 00とした。

実験期間中は全数 CR-LPF (オリエンタル酵母工業）を給餌した。

コントロール群を _n=5でぺプチド D投与群を n=4でケージ飼育した。

投与方法及び期間

ペプチド Dは 10 mg/kgの用量で 8 : 00、 14 : 00及び 20 : 00の 1 日 3回、 5 日間皮下投与を行った。コントロール群には 5% DMS0/PBSを投与した。 5 日の投与期間終了後 12時間後に剖検を行い、全血採血後に大腿骨及び脛骨を採取した。全血は 1時間室温で放置後、 5000 rpm、 4°C、 5 minの条件で遠心分離を行い、血清を新しいチューブに回収した。大腿骨及び脛骨は冷 70%エタノールで固定した。骨密度解析

エタノール固定した大腿骨を Single energy X- ray absorptiometry (SXA)解析 (DCS-600EX-1HR 動物用 DXA， AL0KA) により骨密度、骨塩量及び骨面積の測定を行った。骨全長を 20分割し、各領域の骨密度を測定し、領域毎のペプチドの作用について解析を行った。骨構造解析及び骨梁構造解析

骨構造解析は末梢骨定量的コンピューター断層撮影（以下 pQCT)及びマイク口コンピューター断層撮影（以下/ z CT) により行った。 CTは Scan- Xmate- A080 (コムスキャンテクノ）を、 pQCTは XCT- Research SA+ (Stratec Medizintechnik GmbH) を用いた。 μ τデータを用いた三次元構造作製及び骨梁構造解析には専用ソフトである 3D-B0N (ラトック社）を用いて行った。なお pQCTによる解析において、骨密度が 395 mgん ra³以下の部分を海綿骨、骨密度が 690 mg/cm³以上の部分を皮質骨として解析を行った。ペプチド D10 rag/kgを 1 日 3回、 5日間投与した大腿骨を、 SXA解析により全体の骨塩量、骨面積及び骨密度を測定した。その結果、ペプチド D投与により骨塩量は増加し、骨密度は有意な増加（/7〈0. 05 vs コントロール群）を示した（図 2 0 A〜C)。さらに SXA20分割解析で各領域の骨密度を測定した結果、遠位骨端部から 6番目から 9番目の領域で骨密度の有意な増加 <0. 05 vs コントロール群）が確認できた（図 2 1 )。また pQCTによる大腿骨骨密度解析の結果、遠位骨端部から 5 mmの領域における皮質骨骨密度が有意（p〈0. 05 vs コントロール群）に増加した（図 2 2 A)。この領域での皮質骨の厚み、外膜周囲長、内膜周囲長、骨塩量及び骨面積を計測した結果、内膜周囲長が短くなつており、内側に向けて皮質骨が増えていることが示唆された（図 2 2 B)。

一方、成長板付近の海綿骨が多く含まれる骨幹端領域について、による 3 次元構造解析を行った結果、ペプチド Dを投与することにより遠位部骨端より 2 瞧の位置で海綿骨量が増加していることが観察された（図 2 3 )。そこで; u CTによる海綿骨領域の骨梁構造計測を行ったところ、海綿骨の BV/TV及び骨梁幅が増加した（図 2 4 A〜C)。ぺプチド Dの骨に対する作用としては、 / CTによる骨梁構造計測の結果から、弱いながらも骨吸収抑制作用を有していることは示された。しかしながら、わずか 5日間の投与で骨幹部付近の皮質骨の骨密度を上昇させる作用については、この弱い骨吸収抑制作用だけでは説明ができない。この結果は、このペプチドが骨形成作用を有していることを示唆する。実施例 1 2 骨形態計測

実施例 1 1において合成ペプチド Dをマウスに投与した実験において、各群のマウスには、投与開始後 1 日目及び 4 日目において、 2 %炭酸水素エタノール水溶液を用いて 1. 6 mg/mLに調整した力ルセイン（Nacalai) を 0. 01 mL/g (体重）の用量で各個体に腹腔内に投与し、力ルセインラベルを行った。剖検時に回収しェタノール固定した大腿骨の遠位骨端部から 5mm の領域を Methylraethacrylate (MMA) 樹脂包埋し、非脱灰標本を作製した。この領域は実施例 1 1における SXA 解析の結果、ペプチド D投与群にて骨密度が有意に増加していた領域である。標本はトルイジンブルー染色を行い、類骨面積、骨芽細胞面積、骨石灰化面積、石灰化速度及び骨形成率等を計測した。その結果、ペプチド D投与群にて石灰化率及び骨形成率の増加が認められた（図 2 5 A及び B)。 SXA解析及び pQCT解析でぺプチド D投与群において皮質骨骨密度の有意な増加が確認されたが、ぺプチド投与により in vivoでの石灰化率及び骨形成率が上昇した結果、皮質骨骨密度が増加したと考えられる。実施例 1 3 ペプチド Dの ALP活性亢進作用のメカニズム解析（シグナル分子のリン酸化）

MC3T3-E1細胞を 10%FBS+ CK MEM (S IGMA)を用いて 6ゥエルプレートに 7. 5 X 10⁴ 個/ゥエルにて播種した。 12時間後に培地を除去し、 200 _Μ Μペプチド D又は 200 ng/ml の BMP- 2を含む培地を添加した。それぞれの図に示した経過時間後に培地を除去し、 PBS を細胞に添加し、スクレイパー（Falcon) を用いて細胞を回収した。 1200rpm、 5min、 4°Cで遠心分離して回収した細胞ペレツトに RIPAバッファー 100 / Lを添加して細胞膜を溶解させた。さらに、これを 14500rpm、 25min、 4°Cの条件で遠心分離を行い、上清を細胞抽出液として回収した。細胞抽出液の一部を用いて BCAプロテインアツセィキット（PIERCE) にてタンパク質濃度の定量を行つた。 SDS- PAGE用に、細胞抽出液量の 1/4量のサンプルバッファー（Fermentas) を添加し、 95°Cで 5min加熱した。調整したサンプルを 10%ポリアクリルアミドゲル（BioRad)に 7.5又はアプライし、 170Vで 1時間電気泳動を行った。泳動後に PVDFメンブレン（Millipore) に 80mA、 40minでトランスファーした。メンブレンをブロッキング液（Nacalai)で室温 1時間振とう後に 1次抗体を添加し、室温で 1時間もしくは 4°Cで 12時間の振とうを行った。 1次抗体溶液を除去後、 3 回メンブレンを洗浄し、 2次抗体含有ブロッキング液で室温 1時間振とうした。 2 次抗体溶液を除去後に 3回メンブレンを洗浄した。検出は ECLplus (GEヘルスケァバイオサイエンス）にて行った。なお 1次抗体及び 2次抗体の組み合わせは以下に記載した通りである。

(1) 1次抗体：リン酸化 p38抗体（Cell signaling) , 2次抗体： Goat ant i rabbit IgG HRP conjugated (santa cruz)

(2) 1次抗体： p38抗体（santa cruz), 2次抗体： Goat anti mouse IgGl- HRP conjugated (SouthernBiotech)

(3) 1次抗体： j3ァクチン抗体（santa cruz), 2次抗体： Goat anti rabbit IgG HRP conjugated (santa cruz)

(4) 1次抗体： GSK3c /)3抗体（santa cruz), 2次抗体： Goat anti mouse IgG HRP conjugated (SIGMA)

(5) 1次抗体：リン酸化 GSK3a//3抗体（Cell signaling), 2次抗体： Goat anti mouse IgG HRP conjugated (SIGMA

(6) 1次抗体：リン酸化 smadl/5/8 (Cell signaling) , 2次抗体： Goat anti rabbit IgG HRP conjugated (santa cruz) 既知の骨形成因子である BMP- 2及び PTHが.、骨形成を誘導する際に用いる主要なシグナル伝達経路である MAPキナーゼ p38のリン酸化についてウェスタンブロッティングにより検出を行った。その結果ペプチド D添加後 12時間後に著しい _P38のリン酸化を検出できた（図 2 6 )。なお、ペプチド D添加から短時間での p38 のリン酸化についても検討を行ったが、顕著な変化は認められなかった（図 2 7 )。一方、対照として用いた BMP-2では添加 1時間後に p38のリン酸化が認められた。次に骨形成因子の 1つである Wntのシグナル伝達経路に使用される GSK3 i3のリン酸化についてウェスタンブロッティングにより検出を行った。ぺプチド D添加後 1及び 3時間後に、 GSK3 j3のリン酸化が誘導されていることが示された（図 2 8 )。対照として用いた BMP-2でも同様に添加後 1及び 3時間後に GSK3 のリン酸化が認められた。

さらに骨形成因子 BMPのシグナル伝達経路に使用される Smadl/5/8のリン酸化についてウェスタンブロッテイングにより検出を行った。その結果、 MC3T3-E1細胞では無刺激の状態で Smadがリン酸化を受けていることが示された。ぺプチド D 添加による Sraadl/5/8のリン酸化誘導は少なくとも 3時間以内には認められなかつた（図 2 9 )。一方、対照として用いた BMP-2 では添加 3時間後に Smadl/5/8 のリン酸化が認められた。以上から、ペプチド D添加後、少なくとも 3時間以内には BMP-2と同様の Smadl/5/8の活性化は起こらないが、 12時間後には BMP-2添加 1時間後に見られるよりも顕著な p38のリン酸化が起こることが分かった。従つてぺプチド Dは添加後数時間では明らかに BMP- 2とは異なるシグナルを使っていることが示された。一方、 GSK3 /3のリン酸化についてはペプチド！)、 BMP- 2共に添加後 1時間及び 3時間でほぼ同程度に認められたので、ペプチド D は一部で BMP-2と類似したシグナルを使っていることが示された。実施例 1 4 ペプチド Dの ALP活性亢進のメカニズム解析（阻害剤の作用）

MC3T3- E1細胞を 10%FBS+ a MEM (SIGMA)を用いて 96ゥェルプレートに 1. 5 X 10⁴ 個/ゥエルにて播種した。 12時間後に培地を除去し、 p38阻害剤 SB203580 (カルビオケム）を含む培地を添加した。さらに 1時間後に 200 μ Μのペプチド D又は

100 ng/ralの BMP- 2を添加し、 5 日間培養を行い、実施例 1に記載した方法で ALP 活性測定を行った。その結果、 SB203580の濃度依存的にペプチド Dによる ALP活性亢進が抑制され、 Ι μ Μで有意に、さらに 10 Μで完全に抑制された（図 3 0 )。一方、対照として用いた BMP - 2では Ι μ Μでは有意な ALP活性亢進の抑制が認められず、 10 で弱い抑制効果が見られた。

同様に Wnt アンタゴニストとしてそれぞれ 0· 25、 0. 5、 1 μ g/ral の濃度の hrDkk- 1 (R&D)を添加し、 1時間後に 200 μ Μのペプチド Dを添加し、 5 日間培養を行い、実施例 1に記載した方法で ALP活性測定を行った。その結果、 Dkk-1は弱いながらも有意にかつ濃度依存的に ALP活性亢進を抑制した（図 3 1 )。

また、同様に BMP アンタゴニストとしてそれぞれ 0. 25、 1 μ g/ral の濃度の BMPR-IA (R&D) を添加し、 1時間後に 200 μ Mのペプチド D又は 200 ng/mlの ΒΜΡ-2 を添加し、 5日間培養を行い、実施例 1に記載した方法で ALP活性測定を行った。その結果、 BMPR- IA はペプチド D及び BMP- 2による ALP活性亢進を著しく抑制した（図 3 2 )。以上の結果から、ペプチド Dの作用が BMPの誘導もしくは細胞が定常的に自己産生する BMPに依存している可能性が考えられた。実施例 1 5 ぺプチド！）の ALP活性亢進のメカニズム解析（ぺプチド Dと BMP-2 の協調作用）

ペプチド Dの BMP-2との相乗効果を検討するために、 BMP- 2添加に依存して ALP 活性亢進される C2C12細胞を用いて ALP活性測定を行った。 C2C12細胞を 5%FBS+ α ΜΕΜ (SIGMA)を用いて 96 ゥエルプレートに 1 X 10⁴個/ゥエルにて播種した。 6 時間後に培地を除去し、それぞれ 50 ^ Mのペプチド D、 100及び 200 ng/mlの BMP - 2、

50 μ Μのペプチド Dと 100 ng/mlの BMP- 2の組み合わせを含む培地を添加した。 6 日間培養を行い、実施例 1に記載した方法で ALP活性測定を行った。その結果、

50 μ Μのぺプチド D 単独では ALP活性亢進作用が認められなかった。 ΒΜΡ-2は濃度依存的に ALP活性を亢進した。一方、 50 μ Μのぺプチド Dに 100 ng/mL BMP-2 を加えた場合、 BMP-2単独添加時の 5倍以上の ALP活性亢進作用が確認できた（図

3 3 )。この結果は実施例 1 4にて示したぺプチド Dの作用が BMPの誘導又は細胞が定常的に自己産生する BMPに依存している可能性を支持する。筋芽細胞株である C2C12細胞は骨芽細胞株である MC3T3-E1細胞とは異なり、通常の培養条件では ALP活性が極めて低い。 BMP- 2を添加して培養すると本実施例のように ALP活性が亢進し、骨芽細胞に分化するが、 C2C12細胞ではペプチド D単独ではその作用は極めて弱いと考えられる。一方、これまでの実施例で示したように MC3T3-E1細胞ではべプチド D は単独でも強い ALP活性亢進作用を示す。このことは MC3T3- E1 細胞においてべプチド Dの作用が BMPの誘導もしくは細胞が定常的に自己産生する BMPに依存している可能性を強く示唆する。

さらに MC3T3-E1細胞における、 BMP - 2とぺプチド Dの協調作用についても検討を行った。 MC3T3-E1細胞を 10%FBS+ o; MEM (SIGMA)を用いて 96ゥエルプレートに 1. 5 X 10⁴個/ゥエルにて播種した。 12時間後に培地を除去し、 30 ng/mL の BMP- 2 にさらに 150 μぺプチド Dを添加した場合の ALP活性測定を行った。その結果、 MC3T3- E1細胞においてべプチド Dは BMP- 2と相加的な ALP活性亢進作用を示した (図 3 4 )。

C2C12細胞及び MC3T3-E1細胞における BMP- 2とぺプチド Dの ALP活性に対する相乗効果を図 3 3で示したが、 C2C12細胞に BMP-2を加えた場合に、 RANKLの発現が上昇するという報告があった（Fuj i ta ら、 Molecular Cancer 6： 71, 2007)。そこで BMP添加時の RANKL発現について RT-PCRを用いて確認を行った。

96ゥヱルプレートに各ゥヱル 5xl0³細胞ずつ C2C12細胞を播種した。細胞接着後 100 ng/mLとなるように BMP- 2を添加し、 36時間後に各ゥエルに 84 μ Lの TRIZ0L 液（Invi trogen) を添加し細胞を溶解させ RNAを抽出した。 1群 6 ゥヱル分をまとめ、 0. 1 mLのクロ口ホルム（Wako) を添加し、激しく転倒混和させてから、 4°C、

12000 X gの条件で 15分間遠心を行い、上清を新しいチューブに回収した。 0. 25raL イソプロパノール（Nacalai )を添加し、転倒混和後に室温で lOmin放置した。 4°C、

12000 X gの条件で 10分間遠心を行い、上清を除去後に 1 mLの 70%ェタノールを添加し 4°C、 12000 X gの条件で 5分間遠心し、さらに上清を除去した。 RNA濃度を測定後に 2 fi g を RT- PCR に供した。 RT- PCR は ThermoScript RT-PCR

System (Invi trogen)及ぴ random primerを用レヽて行った。 cDNA合成後【こ、マウスの RANKLに特異的なプライマーを用いて PCRを行った。標準化用にマウス GAPDH 特異的なプライマーを用いて PCRを行った。用いた PCRプライマー配列は下に記載した。 Ex Taq™ Hot Start Vers ion (Takara Bio Inc. , Shi ga, Japan)を用レヽて以下の条件で PCRを行った。

マウス RANKLは 94°Cで 2分初期熱変性を行った後、 94°Cで 20秒、 60°Cで 20秒、 72°Cで 40秒を 35サイクル行い、 72°Cで 10分間伸長反応を行った。 GAPDHは、 95°C で 3分初期熱変性を行った後、 95°Cで 10秒、 60°Cで 15秒、 68°Cで 1分を 25サイクル行い、 68°Cで 10分間伸長反応を行った。

mRANKL-F ： 5， -GGCAAGCCTGAGGCCCAGCCATTT-3 ' (配列番号 1 7 )

raRANKL-R ： 5 ' - GTCTCAGTCTATGTCCTGAACTTT - 3，（配列番号 1 8 )

mGAPDH-F ： 5， - CACCATGGAGAAGGCCGGGG- 3，（配列番号 1 9 )

mGAPDH-R ： 5， -GACGGACACATTGGGGGTAG-3 ' (配列番号 2 0 )

その結果、 BMP-2添加により C2C12細胞での RANKLの発現が上昇することが確認できた（図 3 5 )。この結果、 BMP- 2は C2C12細胞に作用して RANKLの発現を促し、ぺプチドりが RANKLに作用する補助をしていることが示唆された。実施例 1 6 ペプチド Dとぺプチド Eの活性比較

ペプチド Dに 1アミノ酸置換を行ったペプチド E (配列番号 1 6 ) を作製し、破骨細胞の分化及び骨芽細胞の分化に対する効果を、それぞれ TRAP活性及ぴ ALP 活性を測定することにより行った。 RAW264細胞を 10%FBS+ a MEM (SIGMA)を用いて 96 ゥエルプレートに 2 X 10³個/ゥエルにて播種した。細胞接着後に 10 nM GST- RANKL (オリエンタル酵母工業製）を含む 10%FBS+ a MEMに置換した。そこに 25、 50、 100及び 200 μ Μの濃度のペプチド D及びペプチド Eを添加し、 4日間培養を行った。培養終了後に 100 // Lのァセトン/エタノールを各ゥヱルに加え細胞を固定し、ドラフト内で 30min乾燥させた。

TRAP solution バッファ一は、 1. 5 mg/mL 濃度になるように p— nitrophenyl phosphate (Nacalai)を 50 raM クェン酸バッファーで調製後、 1 /10量の 0. 2 M酒石酸ナトリウム溶液を添加した溶液を用いた。 TRAP solution バッファーを各ゥエルに 100 / L力!]え、 45min 37°Cインキュベートを行った後に 50 の IN NaOH 溶液を加え反応停止させた。実施例 1と同様に各ゥエルの 405nmにおける 0D値をマイクロプレートリーダー（BMG Labtech) にて測定した。

さらにべプチド D及びべプチド E C MC3T3_El細胞での ALP活性亢進作用について比較を行った。 25、 50、 100及び 200 μ Μの濃度のペプチド D及びペプチド Eを用いて、実施例 1 4に示した条件にて培養を行い、実施例 1に示した方法にて ALP 活性測定を行った。

その結果、ぺプチド D及びべプチド Εは共に濃度依存的に TRAP活性の抑制及び ALP 活性の亢進を示した（図 3 6及び図 3 7 )。 TRAP 活性については、 100、 200 /x Mの濃度においてぺプチド E と比較してぺプチド Dが有意な抑制作用を示した (図 3 6 )。また、 ALP活性については 50、 ΙΟΟ μ Μの濃度においてペプチド E と比較してペプチド Dが有意な亢進作用を示した（図 3 7 )。ほぼ同等の効果を与えるぺプチド D及び Εの濃度を比較すると、 1アミノ酸置換により TRAP活性抑制作用がほぼ半減し、一方 ALP活性亢進作用も約 1/4まで低下していた。この 1アミノ酸置換によりペプチド Dの sRANKLに対する親和性が約 1/3まで低下することが知られている（Aoki ら、 J Cl i n Invest 116： 1525, 2006)。以上の結果から、ぺプチド Dによる TRAP活性の中和作用と骨芽細胞での ALP活性亢進作用は、共に RANKLへの作用を介して発揮されていることが示唆された。実施例 1 7 ペプチド Dレセプターのノックダウンによるペプチド Dの ALP活性亢進作用のメカニズム解析

C2C12 細胞において BMP- 2 とペプチド D の相乗効果が図 3 3で示されたが、

C2C12細胞に BMP-2添加時に RANKL発現の上昇が確認された（図 3 5 )。そこで、

MC3T3-E1細胞において RNAi stealthによる RANKLのノックダウンを行い、ぺプチド D の ALP 活性亢進作用と RANKL ノックダウンの影響を検討した。

OPTiMEM (Inv i trogen) 20 μ L RNA - stealth select (tnfrsfl l) (Invi trogen)

1. 2praol を穏ゃ力こウエノレ中で混合した。 5 分後に 0. 2 しの Lipofectamine

RNAiMAX (Invi trogen)を添加し、室温で 20 分間放置した。さらに各ゥヱルに

MC3T3-E1細胞 4xl0³を播種し、 C0₂インキュベータ内で 48時間培養を行った。培養液を除去した後、 200 μ Μのぺプチド D又は 200 ng/mlの BMP-2を含む α ΜΕΜを添加し、さらに 5 日間培養し、実施例 1に記載した方法で ALP活性測定を行った。なお、 3種類の RANKL (TNFRSFl l)の KDの negat ive control としては Stealth RNAi negat ive un iversal control (Inv itrogen) ¾用レヽて様の実験を？Tつに。 ——部糸田胞を回収し実施例 7の方法を用いて mRNAを抽出し、配列番号 1 7および 1 8のプライマーを用いて RT- PCRにより RANKLのノックダウンの確認を行ったところ、 KD1 及び KD2 いずれの場合もそれぞれの陰性コントロールである control l 及ぴ control2に比べて、 GAPDH mRNA量には影響せず、顕著にかつ特異的に RANKL mRNA 量を減少させた（図 3 8 )。 KD1及び KD2いずれの場合も RANKLノックダウン群ではぺプチド D添加時の ALP活性亢進が有意に低下しており、ぺプチド Dのレセプターが RANKLであることが示唆された（図 3 8 )。また、 MC3T3- E1細胞において BMP-2単独による ALP活性亢進は RANKLノックダウンによる影響を受けなかった。以上より、ペプチド Dは骨芽細胞や骨芽細胞前駆細胞、間葉系幹細胞、間質細胞、筋芽細胞など骨芽細胞に分化する細胞に作用し、その後、 BMP の作用を強める、あるいは BMPの作用と協調して骨芽細胞の分化を促進することが示唆された。また、細胞によっては BMPが RANKLの発現を促進し、ペプチド Dの作用と協調していることが示唆された。実施例 1 8 合成ペプチド Dの精製方法による ALP活性亢進作用への影響

通常、合成べプチド Dは精製時にトリフルォロ酢酸（TFA) を含むため、濃度を上げることにより細胞にダメージを与える可能性が考えられた。そこで、合成べプチド Dを酢酸塩及び塩酸塩で置換したものを作製し、毒性が低くなおかつ高い ALP活性を有するぺプチドを得ることを目的として以下の実験を行った。陽性対照として大腸菌にて作製した BMP-2 (R&D)及び塩置換を行わない合成ぺプチド D (50及び 150 μ Μ) を使用した。

マウス骨芽前駆細胞である MC3T3-E1細胞を 10%FBS+ a MEM (SIGMA)を用いて 96 ゥヱルプレートに 2 X 10⁴個/ゥエルにて播種した。細胞接着後に培地を除去し、

50及び 150 // Mのぺプチド D (酢酸塩および塩酸塩）を添加した場合の ALP活性測定を行った。陽性対照として大腸菌にて作製し.た 50 ng/raL BMP- 2 (R&D)、 CH0細胞で発現させた BMP-2 (R&D) と NS0細胞で発現させた BMP-4 (R&D)及び、 TFA塩の合成ペプチド D (50及び 150 M) を添加した。なお CH0細胞で発現させた BMP - 2の

ED50値は 40〜 200 ng/raLであり、大腸菌で発現させた BMP- 2の ED50値は 0. 3〜1. 0

W g/mLである。各因子を添加後 5 日目に培養上清を除去し、実施例 1の方法にて ALP活性測定を行った。その結果、 MC3T3-E1細胞において酢酸塩ペプチド Dが最も高い ALP活性亢進作用を示した（図 3 9 A) 。一方、塩酸塩ペプチド Dでは高い活性は見られなかった。このように同じアミノ酸配列でも用いる塩によって活性に影響が出ることが分かった。

次に酢酸塩合成べプチド Dと BMP- 2の ALP活性に対する相乗効果について検討を行った。マウス骨芽前駆細胞である MC3T3-E1細胞を 10%FBS+ a MEM (SIGMA)を用いて 96ゥエルプレートに 2 X 10⁴個/ゥヱルにて播種した。細胞接着後に培地を除去し、 6. 25、 12. 5、 25、 50および 100 // Mの合成ぺプチド Dに 5 ng/mLBMP- 2 (CH0 細胞製）を混合した場合の ALP活性測定を行った。各因子を添加後 5 日目に培養上清を除去し、実施例 1の方法にて ALP活性測定を行った。その結果、酢酸塩合成ペプチド Dの用量依存的に ALP活性の上昇が確認された（図 3 9 B) 。

最後に BMP- 4 (R&D) との相乗効果についても検討を行った。 MC3T3-E1細胞を 10%FBS+ a MEM (SIGMA)を用いて 96ゥエルプレートに 2 X 10⁴個/ゥエルにて播種した。細胞接着後に培地を除去し、 2 ng/mLの BMP- 4に対し ΙΟΟ μ Μの酢酸塩合成ペプチド Dを添加した。各因子を添加後 5 日目に培養上清を除去し、実施例 1の方法にて ALP活性測定を行った。

合成ぺプチド Dと ΒΜΡ-4を同時に添加することで有意な ALP活性の上昇が確認され、 BMP- 2だけでなく BMP- 4においても酢酸塩合成ペプチド Dが相乗効果を示すことが確認できた（図 3 9 C) 。

以上の結果から、合成ペプチド Dを精製する際に、細胞に障害を及ぼす可能性のある TFA塩よりは酢酸塩とする方がより高い ALP活性を誘導できることが示された。また、酢酸塩置換を行った合成べプチド Dにおいて、 BMP-2だけでなく BMP-4 についても ALP活性亢進能について相乗効果を示した。今後の実験には酢酸塩べプチド Dを用いることとした。実施例 1 9 RANKL抗体の ALP活性亢進のメ力二ズム解析（RANKL抗体と BMP-2 の協調作用）

実験にはモノクローナル mRANKL抗体（（A)クローン 88227 (R&D) 、及び（B)クローン 12A668) (ALEXIS) 及びコントロール抗体（オリエンタル酵母工業製）、モノクローナル _mRANKL抗体 # 22 (クローン IKK22/5)及び、 # 36抗体（クローン IKK36/12) を使用した。 # 22、 # 36抗体は、順天堂大学医学部に所属の奥村康氏より譲渡を受けた。また、これらの抗体は、 Biochemical and Biophysical Research Communication 2006； 347, 124- 132に記載されている。合成ペプチド Dは酢酸塩置換したものを用いた。添加する BMP-2は哺乳動物細胞（CH0細胞）で発現させたもの（R&D) (C2C12細胞に使用）及び大腸菌で発現させた BMP-2 (R&D) (マウス骨芽細胞に使用）を使用した。製造メーカーの説明書には哺乳動物細胞で発現させた BMP-2は大腸菌で発現させたものよりも約 10倍活性が強いと示されている。各因子を添加後 5 日目に培養上清を除去し、実施例 1の方法にて ALP活性測定を行った。

モノクローナル RANKL抗体の BMP- 2 との相乗効果を検討するために、 BMP- 2添加に依存して ALP活性亢進される C2C12細胞を用いて ALP活性測定を行った。 C2C12細胞を 5%FBS+ ct MEM (SIGMA)を用いて 96ゥエルプレートに I X 10⁴個/ゥェルにて播種した。 6時間後に培地を除去し、それぞれ 0. 3 /i g/mLのモノクローナル RANKL抗体、 50 ng/ralの BMP- 2 (CH0細胞で発現 R&D) 、モノクローナル RANKL 抗体と 50 ng/mlの BMP-2の組み合わせを含む培地を添加した。各因子を添加後 6 日目に培養上清を除去し、実施例 1の方法にて ALP活性測定を行った。その結果、 0. S ^ g/mLのモノクローナル抗体 A、 Bおよび #22単独で有意な ALP活性亢進作用が認められた。またモノクローナル抗体 Aおよび Bについては BMP- 2添加時にも ALP活性の有意な上昇が認められた（図 4 0 ) 。

さらにマウス骨芽細胞を用いた検討を行った。 10%FBS+ a MEM (SIGMA)を用いて

96ゥエルプレートに 8xl0³個/ゥヱルにて播種した。細胞接着後に培地を除去し、

0. 3-3 I g/mLの各 RANKL抗体、 RANKL抗体に 50 ng/mLの BMP- 2 (大腸菌で発現 R&D) を混合した場合の ALP活性測定を行った。各因子を添加後 4日目に培養上清を除去し、実施例 1の方法にて ALP活性測定を行った。その結果、マウス骨芽細胞においてモノクローナル抗体 Aは 3 / g/mLの濃度で、モノクローナル抗体 Bにおいては 0. 3 μ g/mLの濃度で弱いながらも有意な ALP活性の上昇が確認できた。陰性対照として用いたコントロール抗体（オリエンタル酵母工業製）ではそのような作用は認められなかった。またモノクローナル抗体 # 36及び #22については 0. 3 および 3 z g/raLの濃度で有意な ALP活性の上昇が確認できた（図 4 1 ) 。また、 BMP-2とモノクローナル RANKL抗体の ALP活性に対する協調作用は全てのモノク口一ナル抗体において確認できた（図 4 2 ) 。このように実験に用いたすべての抗 RANKLモノクローナル抗体は程度の差はあるものの、マウス骨芽細胞の ALP活性亢進作用を示し、また BMP-2と相乗的な ALP活性亢進作用を示した。実施例 2 0 ぺプチド D (酢酸塩）と BMP- 2の相乗効果に対する GST-RANKLの作用

BMP - 2と酢酸塩ぺプチド Dを MC3T3-E1細胞に同時に添加することにより ALP活性亢進作用に相乗効果が認められるが、その際に GST-RANKLを添加した場合の、 ALP活性亢進作用に対する影響について検討を行った。

RANKL抗体は実施例 1 9に示したものを、 GST-RANKL及び GSTはォリェンタル酵母工業製を使用した。 BMP- 2 (CHO細胞製）は R&D社のものを用いた。合成べプチド Dは酢酸塩置換したものを用いた。

マウス骨芽前駆細胞である MC3T3- E1細胞を 10%FBS+ a MEM (SIGMA)を用いて 96 ゥヱルプレートに 2 X 10⁴個/ゥヱルにて播種した。細胞接着後に培地を除去し、 100 // Mの酢酸べプチド D、 ΙΟΟ μ Μ酢酸べプチド Dに 5 ng/mLの BMP- 2を混合した培地、さらにぺプチド Dと BMP-2混合物に 100 nMの GST-RANKLもしくは GSTを添加した培地に交換した。各因子を添加後 5 日目に培養上清を除去し、実施例 1の方法にて ALP活性測定を行った。その結果、 MC3T3-E1細胞において GST-RANKLは、ぺプチド D (酢酸塩）と BMP - 2との相乗的な ALP活性亢進作用を有意に抑制した (図 4 3 ) 。一方、 GST添加群では有意な抑制は認められなかった。このことはぺプチド Dが MC3T3-E1細胞上に発現している RANKLに作用して ALP活性を亢進させていることを示す。 GST- RANKLは細胞膜上の RANKLに拮抗してぺプチド Dの作用を抑制したと考えられる。実施例 2 1 ペプチド D及び RANKL抗体のマウス骨芽細胞増殖作用

ペプチド Dまたは RANKL抗体と BMP-2を同時添加することで ALP活性亢進作用が認められることは実施例 1 9及び 2 0に示した。 BMP-2との相乗的な効果を有するぺプチド D及び RANKL抗体がマウス骨芽細胞に対し増殖作用を有するかどうかについて検討を行った。

合成べプチド Dは酢酸塩置換したものを用いた。 BMP-2 (CH0細胞製）は R&D社のものを用いた。

マウス骨芽細胞を 10%FBS+ o; MEM (SIGMA)を用いて 96ゥエルプレートに 2 X 10³ 個/ゥヱルにて播種した。細胞接着後に培地を除去し、 ΙΟΟ μ Μのペプチド D (酢酸塩）、実施例 1 9に記載の各種 RANKL抗体（3 / g/mL)及び各因子に 5 ng/mLの BMP - 2 を混合した培地を添加した。培養 72時間後に WST- 1 (Roche) を培地量の 1/10の量添加し、 37°Cで 3時間ィンキュベート後に各ゥエルの 450nmにおける 0D値（参照波長は 595mn) をマイクロプレートリーダー（BMG Labtech) にて測定した。その結果、 BMP- 2の有無に関わらず、ペプチド Dおよび RANKL抗体 Bはマウス骨芽細胞の増殖を促進した（図 4 4 ) 。但し、ペプチド Dの効果は弱く、他の RANKL 抗体（#22, #36, A) では増殖促進効果は認められなかった。

以上から、 RANKLに対するモノクローナル抗体は認識するェピトープの違いによりマウス骨芽細胞を増殖促進するものとそうでないものがあることが分かった。一方、実施例 1 9において示したように、マウス骨芽細胞を増殖促進しない抗 RANKLモノクローナル抗体でもマウス骨芽細胞の ALP活性亢進作用、即ち分化促進作用を示すことが分かった。まとめると、認識するェピトープの違う抗 RANKL モノクローナル抗体を使い分けることにより、骨芽細胞を増殖または分化させることが可能であった。実施例 2 2 ぺプチド Dの MC3T3- E1細胞に対する作用メカニズムの解析（DNAマイクロアレイ）

MC3T3-E1細胞を 10%FBS+ a MEM (SIGMA)を用いて 10 cmディッシュに 2 X 10⁵個

/ゥエルにて播種した。 12時間後に培地を除去し、 200 ペプチド D (酢酸塩）または 150 ng/ralの BMP-2 (R&D社、大腸菌製）を含む培地を添加した。 12及び 96 時間後に培地を除去し、各ゥエルに 3 mLの TRIZ0L液（Invitrogen) を添加して細胞を溶解させ、実施例 15の方法に従い total RNAを抽出した。抽出した total

RNAは 2 gを用いて DNAマイクロアレイ解析（Mouse Genomu 430 2. 0 Affymetrix) を行った。なおスキャンは GeneChip Scanner 3000 (Affyraetrix 690036)により行レヽ、数値ィ匕は Gene Chip Operating Software verl. 4にて行った。

その結果、ぺプチド D添加後 12時間で、 IRS- 1、 IGF- 1、 FGF レセプター 2、 PDGF レセプター i3、 PDGFレセプター α、 CTGF、 I型コラーゲン α 1及び α 2鎖の各遺伝子発現が顕著に増加した（図 4 5 ) 。 96時間後ではさらに IGF_2、 ALP、 BMP-4、 OC (ォステオカルシン）、 FGF2、 PDGFc、 PDGF a及び PDGF 0の各遺伝子発現が顕著に増加した（図 4 6 ) 。 I型コラーゲン、 ALP、ォステオカルシンは骨芽細胞のマーカーとして知られている。実施例 7ではペプチド Dによるヒト間葉系幹細胞での I型コラーゲン、 ALP各遺伝子の発現上昇を示したが、 MC3T3- E1細胞においてもこの二つの遺伝子発現の上昇が認められ、さらに骨芽細胞の後期分化マーカ一として知られるォステオカルシン（0C)遺伝子の発現も非常に上昇したことから、ぺプチド Dは MC3T3-E1細胞を骨芽細胞へと分化させたと考えられる。実施例 2 3 DNAァレイ解析の RT- PCRによる検証

DNAマイクロアレイにおいて発現シグナルの増加が確認された遺伝子の中で、骨芽細胞のマーカーとして知られているアル力リフォスファターゼ（ALP)、 I型コラーゲン（Col l)、ォステオカルシン（0C)について、確認の為 RT-PCRを行った。実施例 22で採取した total RNA各々 2 gを RT-PCRに供した。RT - PCRは ThermoScript RT-PCR Systenuinvitrogen)および： random primer■¾：用レヽ行つに。

cDNA合成後に、マウスのアル力リフォスファターゼ（mALP)およびマウスの I型コラーゲン α 1 (mCol I )およびマウスォステオカルシン（mOC)特異的なプライマ一を用いて PCRを行った。標準化用にマウス GAPDH特異的なプライマーを用いて PCR を行った。用いた PCRプライマー配列は下に記載した。 Ex TaqTM Hot Start Version

(Takara Bio Inc. , Shiga, Japan)を用いて以下の条件で PCRを行った。アルカリフォスファターゼ（mALP)は 95°Cで 3分初期熱変性を行つた後、 95°Cで 10秒、 60°C で 15秒、 68°Cで 1分を 28サイクル行い、 68°Cで 10分間伸長反応を行った。 I型コラーゲン α 1 (mCol I )は、 93°Cで 3分初期熱変性を行った後、 94°Cで 30秒、 58°C で 30秒、 72°Cで 15秒を 20サイクル行い 72°Cで 10分間伸長反応を行った。ォステオカルシン（mOC) は、 95°Cで 3分初期熱変性を行った後、 94°Cで 30秒、 58°C で 30秒、 72 :で 15秒を 28および 30サイクル行い 72°Cで 10分間伸長反応を行つた。 GAPDHは、 95°Cで 3分初期熱変性を行つた後、 94°Cで 10秒、 58°Cで 15秒、 68°Cで 1分を 20サイクル行い、 68°Cで 10分間伸長反応を行った。

PCRプライマー配列

mALP-F : 5 ' - CCAAGCAGGCTCTGCATGAA- 3 ' (配列番号 2 1 )

raALP- R : 5， - GCCAGACCAAAGATGGAGTT-3，（配列番号 2 2 )

mOC-F : 5， - TCTGACAAAGCCTTCATGTCC- 3，（配列番号 2 3 )

mOC-R : 5 ' -AAATAGTGATACCATAGATGCG-3 ' (配列番号 2 4 )

mCol l-F : 5 ' -CCTGGTAAAGATGGTGCC-3 ' (配列番号 2 5 )

raCol l-R : 5， - CACCAGGTTCACCTTTCGCACC- 3，（配列番号 2 6 )

mGAPDH-F : 5 ' - CACCATGGAGAAGGCCGGGG- 3，（配列番号 1 9 )

mGAPDH-R : 5 ' - GACGGACACATTGGGGGTAG- 3 ' (配列番号 2 0 )

反応液の一部をァガロースゲルにて電気泳動し、ェチジゥムブ口マイド液にて染色した。その結果、 DNAマイクロアレイ解析の結果と同様にペプチド Dおよび BMP-2により ALP, Col l, 0Cそれぞれの遺伝子発現が顕著に上昇していることが確認できた（図 4 7 A) 。発現強度を数値化し、コントロールにおけるそれぞれの遺伝子発現量を 1としてグラフ化したところ、 DNAマイクロアレイ解析よりもさらに顕著にこれらの遺伝子発現上昇が認められた（図 4 7 B) 。

以上から、ぺプチド Dによって MC3T3 - E1細胞が骨芽細胞へ分化したことが RT-PCRによる遺伝子発現レベルの変化でも確認できた。実施例 2 4 合成べプチド投与による生体内における骨形成マーカーの解析試薬

本実験では合成べプチド Dは酢酸塩置換品を使用した。 PBSに 1 _mg/mLの濃度で溶解させた。対照群には PBSを投与した。

実験動物

C57BL/6Crjマウスは㈱北山ラベスから購入した。 C57BL/6Cr jマゥス近交系マゥスであり、老化による細胞性免疫能の低下が少ないという特徴を有するマウスである。温度 23°C ± 3°C、湿度 50% ± 30%の環境下で 1週間予備飼育した。照明時間は 8 : 00〜20 : 00とした。

実験期間中は全数 MF (オリエンタル酵母工業）を給餌した。

コント口ール群を _n=6でぺプチド D投与群を n=7で各々をケージ飼育した。投与方法及び期間

酢酸塩合成ペプチド Dは 10 rag/kgの用量で 8 : 00、 14 : 00及び 20 : 00の 1 日 3 回、 5 日間皮下投与を行った。コントロール群には PBSを投与した。 5 日の投与期間終了後 12時間後に剖検を行い、全血採血後に大腿骨及び脛骨を採取した。全血は 1時間室温で放置後、 5000 rpm、 4°C、 5 minの条件で遠心分離を行い、血清を新しいチューブに回収した。大腿骨は冷 70%エタノールで固定させた。脛骨は筋肉等を丁寧に除去後、 PBSにて洗浄し、ハサミで 1匪断片にした後に液体窒素にて凍結させた。凍結させた脛骨に TRIZ0L液（Invitrogen) を lmL添加し、ポリトロンにてホモジナイズした。実施例 7の方法に従い total RNA抽出を行った後、 50 /z Lの DEPC水に溶解させた。個体別に抽出した total RNA 500 ngを実施例 7 の方法に従い RT-PCRに供した。 RT- PCRは ThermoScript RT-PCR

System (invitrogen)およひ random primerを用レ、 if丁った。

cDNA合成後、実施例 2 3と同様にマウスのアル力リフォスファタ一ゼ（mALP)およびマウスの I型コラーゲン α ΐ鎖（mCol lagen c I )およびマウスォステオカルシン（mOC)特異的なプライマーを用いて PCRを行った。標準化用にマウス GAPDH 特異的なプライマーを用いて PCRを行った。 PCR条件は実施例 2 3に従い、各々のサイクル数は mOCが 23サイクル、 mCol lagen ct Iが 20サイクル、 mALPが 28サィクル、最後に mGAPDHが 23サイクルのデータを用いた。- PCR反応後得られたサンプルは、 1%ァガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ェチジゥムブ口マイドを用いて、 UV下で特異的なバンドが形成されていることを確認した。得られた画像は CSAnalyzerを用いて解析し、 GAPDHの発現量で標準化した。その結果、各因子共にペプチド D投与群にて発現増加を示した（図 4 8 ) 。以上から、マウスの骨組織においてもぺプチド D投与による骨芽細胞分化マーカー遺伝子の発現が確認できた。実施例 2 5 ペプチド Dのマウス脛骨に対する作用メカニズムの解析（DNAマイクロアレイ）

DNA マイクロアレイには実施例 2 4に記載したマウス脛骨から個体別に抽出した total RNA 2 gを用いた。各群 n=2とした。定法に従い、 DNAマイクロアレイ解析（Mouse Genome 430 2. 0 Affymetrix) を行った。なおスキャンは GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix 690036)により行レヽ、数値ィ匕は Gene Chip Operat ing Software verl. 4にて行った。その結果、ぺプチド D投与群マウス脛骨において、 0C、 ALP、 I型コラーゲン α 2鎖（CoLl a 2)、血小板由来増殖因子 cペプチド（PDGFc)、血小板由来増殖因子レセプター（PDGFR jS ) およびインスリン様増殖因子（IGF-1) が標準サンプルに対し、有意に高いシグナルを示した（図 4 9 )。ペプチド Dを添加したマウス骨芽前駆細胞だけでなく、ぺプチド Dを投与したマウスの脛骨からも 0Cや ALPといった骨形成因子の増加が確認でき、 in vivoにおいてもぺプチド Dが骨形成を行っていることが示された。実施例 2 6 DNAアレイ解析の RT- PCRによる検証 2

実施例 2 3において ALP、 CoLlおよび 0Cについて RT- PCRを行い、 DNAマイクロアレイの検証データを得た。さらなる検証データを得る為に、実施例 2 3において MC3T3-E1細胞から得られた各群の cDNAを用いて、 DNAマイクロアレイにてシグナルの増強が見られた各種増殖因子およびそのレセプターについて確認の RT-PCRを行った。

各 cDNAは実施例 2 3に記載した方法にて合成した。合成後に、マウス骨形成因子 4 (mBMP-4)、マウス結合組織増殖因子（raCTGF) マウスの血小板由来増殖因子

(mPDGFc pept ide) とそのレセプター（mPDGFR ;3 )、マウスの繊維芽細胞増殖因子

2 (mFGF2) とそのレセプター（mFGFR2) 、インスリン様増殖因子 2 (raIGF-2) およびインスリンレセプターサブストレート（mIRS_l) 特異的なプライマーを甩ぃて PCRを行った。標準化用にマウス GAPDH特異的なプライマーを用いて PCRを行つた。用いた PCRプライマー配列は下に記載した。 Ex TaqTM Hot Start Vers ion

(Takara Bio Inc. , Shiga, Japan)を用いて以下の条件で PCRを行った。 BMP- 4は

95°Cで 3分初期熱変性を行った後、 95°Cで 10秒、 58°Cで 15秒、 72°Cで 30秒を

31サイクル行い、 68°Cで 10分間伸長反応を行った。 CTGFは 95°Cで 3分初期熱変性を行った後、 95°Cで 10秒、 58°Cで 15秒、 72°Cで 30秒を 31サイクル行い、 72°C で 10分間伸長反応を行った。 FGF2は 95°Cで 3分初期熱変性を行った後、 95°Cで 10秒、 58°Cで 15秒、 72°Cで 30秒を 34サイクル行い、 72°Cで 10分間伸長反応を行った。 FGFR2は 95°Cで 10秒、 58°Cで 15秒、 72°Cで 30秒を 25サイクル行い、 72°Cで 10分間伸長反応を行った。 IGF-2は 95°Cで 10秒、 58°Cで 15秒、 72°Cで 30秒を 31サイクル行い、 72°Cで 10分間伸長反応を行った。 PDGFc peptide, PDGFR i3および IRS-1は 95°Cで 10秒、 58°Cで 15秒、 72°Cで 30秒を 23サイクル行い、 72°Cで 10分間伸長反応を行った。 GAPDHは、 95°Cで 3分初期熱変性を行った後、 94°Cで 10秒、 58°Cで 15秒、 68°Cで 1分を 20サイクル行い、 68°Cで 10分間伸長反応を行った。反応液の一部を 2%ァガロースゲルにて電気泳動し、ェチジゥムブロマイド液にて染色した。

その結果、 MC3T3- E1細胞を用いた DNAマイクロアレイ解析の結果の中で、 0C、 ALPおよび Col 1の他に IRS1、 PDGFR β , PDGFc, FGFR2, FGF2、 CTGF、 BMP- 4および IGF-2についてそれぞれの遺伝子発現がぺプチド D添加により顕著に上昇していることが確認できた（図 5 O A) 。発現強度を数値化し、コントロールにおけるそれぞれの遺伝子発現量を 1としてグラフ化したところ、 IRS- 1および PDGFR βに関しては DNAマイクロアレイ解析よりもさらに顕著にこれらの遺伝子発現上昇が認められた（図 5 0 Β) 。その他の因子については DNAマイクロアレイとほぼ同様の結果が得られた。

以上のことからぺプチド！）による作用は、ぺプチド Dの刺激を受けた骨芽細胞が PDGFR i3、 PDGFc、 IGF- 1、 IGF- 2、 FGF2、 CTGF、および BMP-4などのサイトカイン、増殖因子群を自ら産生し、また PDGFR ]3、 FGFR2などのサイトカイン、増殖因子の受容体群をも産生させ、オートクライン的に骨芽細胞分化、増殖、骨形成を促進しているものと考えられる。生理的には、破骨細胞に接触している骨芽細胞に RANKから RANKLを介して逆シグナルが伝わり、オートクライン、パラクラィン的に連鎖反応を引き起こし、破骨細胞に接触している骨芽細胞だけでなく、その近傍に位置する骨芽細胞が分化、増殖、骨形成を促進すると考えられる。

PCRプライマー配列 mBMP-4-F 5， -ATGAGGGATCTTTACCGGCT-3 ' (配列番号 2 7 )

mBMP-4-R: 5' -TTTATACGGTGGAAGCCCTG-3 ' (配列番号 2 8)

mCTGF-F ： 5 ' -AGTGTGCACTGCCAAAGATG-3 ' (配列番号 2 9 )

mCTGF-R: 5' -GGCCAAATGTGTCTTCCAGT-3 ' (配列番号 3 0 )

mFGF2-F: 5' -AAGCGGCTCTACTGCAAGAA-3 ' (配列番号 3 1 )

mFGF2-R: 5' -TCGTTTCAGTGCCACATACC-3 ' (配列番号 3 2 )

mFGFR2- F: ： 5 ' -CTTTGGCCTGGCCAGGGATATCAAC -3' (配列番号 3 3)

mFGFR2-R: ： 5 ' -CCAACTGCTTGAATGTGGGTCTCT -3' (配列番号 34)

mIGF2-F: 5， -CCCGCTGTTCGGTTTGCATAC-3 ' (配列番号 3 5)

mIGF2-R: 5' -ACGGTTGGCACGGCTTGAAG-3 ' (配列番号 3 6 )

mIRSl-F: 5， -AGCGTAACTGGACATCACAGCAG-3 ' (配列番号 3 7)

mIRSl-R: 5' -CGGTGTCACAGTGCTTTCTTGTTG-3 ' (配列番号 3 8)

mPDGFR - -F: 5' - GTCTGGTCTTTTGGGATCCTACTCT- 3，（配列番号 3 9 )

mPDGFR β - R: 5' -CTCCTCATCTACCTGCTGGTACT-3 ' (配列番号 4 0)

mPDGFc - F: 5 ' -CTGATTCGGTACCTAGAGCCAGAT-3 ' (配列番号 41)

mPDGFc-R: 5 ' - CTGTCCTCTTTAGCTCTTCCCGT- 3，（配列番号 42)

mGAPDH-F: 5 ' -CACCATGGAGAAGGCCGGGG-3 ' (配列番号 1 9 )

mGAPDH-R: 5 ' -GACGGACACATTGGGGGTAG-3 ' (配列番号 2 0) 実施例 2 7 Fc融合べプチドの作製

発現ベクター pFUSE- hlgGl- Fc2 (Invivogen) を EcoRVおよび Bglll (TOYOBO) にて制限酵素処理した。 1%ァガロースゲル（Wako) を用いて電気泳動を行い、必要な断片をゲルから切り出し Mag Extractor (TOYOBO) にて断片の精製を行った。一方、インサート部分は PDF1- F (配列番号 4 3) と PDF1- R (配列番号 44) および PAF1-F (配列番号 4 5) と PAF1- R (配列番号 4 6) のオリゴヌクレオチドを用いて 95°C5分後、 1サイクル 1 °C下降の条件で 25°Cになるまでァニーリングを行い、 2種類の二本鎖 DNA (PDF1および PAF1) を合成した。ペプチド Dを含むインサ一ト DNAである PDF1に対し、ネガティブコントロールとして配列番号 4 7のァミノ酸配列からなるぺプチド Aを含むインサート DNAである PAF1を作製した。制限酵素処理したベクターおよび 2 種類のィンサートを Ligation Mighty Mix (TAKARA)を用いて、 16°Cにて 1時間ライゲーシヨンを行った。このうち 5 L を DH5 o; (Invitrogen)にトランスフォ一メーションした。ゼォシン（Invitrogen) を含む LB培地にてスクリ一二ングを行レ、、得られたコロニーをミニプレップキット（BioRad) を用いて精製した。各プラスミドは制限酵素処理およびシークェンス解析を行い、目的とするプラスミドを確認した。配列番号 5 0及び 5 1にそれぞれ、ペプチド！）と Fcの融合タンパク質である Fc融合ペプチド Dの塩基配列及びァミノ酸配列を示し、配列番号 5 2及び 5 3にぺプチド Aと Fcの融合タンパク質である Fc融合べプチド Dの塩基配列及びァミノ酸配列を示す。

PDF1-F： CTACTGCTGGAGCCAGTACCTGTGCTACGGTGGAGGTGGTAGCG (配列番号 4 3 ) PDF1-R： GATCCGCTACCACCTCCACCGTAGCACAGGTACTGGCTCCAGCAGTAG (配列番号 4 4 ) PAF1-F： CTACTGCGCTGCAGCTGCAGCTTGCTACGGTGGAGGTGGTAGCG (配列番号 4 5 ) PAF1-R： GATCCGCTACCACCTCCACCGTAGCAAGCTGCAGCTGCAGCGCAGTAG (配列番号 4 6 ) YCAAAAACY (配列番号 4 7 ) 実施例 2 8 Fc融合べプチド Dの ALP活性亢進能

COS- 1細胞を 10cmディッシュに 2xl0⁶個ずつ播種した。 FuGENE HD (Roche)を用いて、実施例 2 7にて作製した Fc融合ペプチド！）発現プラスミド、 Fc融合ぺプチド A発現プラスミド、さらにベクターである _PFUSE-hIgGl-Fc2を各々 5 // gずつ C0S-1細胞にトランスフエクションした。 8時間後に培地を 0ptiMEM (GIBC0) 10m Lと交換し、 72時間培養を行った。培養上清を回収し、 2000rpra、 4°C、 5分の条件で遠心を行い死細胞等の不純物を除去した後、濃縮フィルター（Amicori) を用いて、培養上清中に産生された Fc融合べプチドを濃縮した。培養上清中に産生された Fc融合ペプチド D (配列番号 5 0 )、 Fc融合ペプチド A (配列番号 5 2 )および Fcの産生は SDS-PAGEにて当該サイズ（約 30KDa) のバンドの検出により確認した。

得られた Fc融合べプチド D、Fc融合べプチド Aおよび Fcコント口ールは α MEM で希釈を行い、 MC3T3-E1細胞を 2xl0⁴個/ゥエルずつ播種した 96ゥエルプレート (Nunc)に添加し培養を行った。培養 5 日目に実施例 1に記載した方法で ALP活性測定を行った。その結果、 Fc融合ぺプチド Dにより MC3T3- E1細胞にて有意な ALP 活性亢進が認められた（図 5 1 ) _ό —方、 Fc融合ペプチド Αおよび Fcコントロール添加群には ALP活性亢進作用は認められなかった。以上より、ペプチド D を Fc に融合させた Fc融合ぺプチド Dは、ぺプチド Dと同様に MC3T3-E1細胞からの骨芽細胞分化誘導を促進させた。実施例 2 9 合成べプチド Dの精製方法による TRAP活性への影響

実施例 1 8で作製したぺプチド!)の塩置換品について TRAP活性に対する影響について検討を行った。

RAW264細胞を 10%FBS+ a MEM (SIGMA)を用いて 96ゥエルプレートに 2 X 10³個/ ゥヱルにて播種した。細胞接着後に 5 nM GST-RANKL (オリエンタル酵母工業）を含む 10%FBS+ o; MEMに置換した。そこに 25及び 100 の濃度の TFA塩ぺプチド

D、酢酸塩べプチド D及び塩酸塩ぺプチド Dを添加し、 4 日間培養を行った。培養終了後に 100 /x Lのァセトン /エタノールを各ゥエルに加え細胞を固定し、ドラフト内で 30min乾燥させた。実施例 1 6に記載した方法にて TRAP活性測定を行った。その結果、 TFA塩ぺプチド Dは 25 Mにおいて有意な TRAP活性抑制作用が確認されたが、酢酸塩および塩酸塩置換したペプチド Dには抑制効果は見られなかった。また、 ΙΟΟ μ Μの濃度においても TFA塩ペプチド D抑制効果は著しく高く、一方で酢酸塩ペプチド Dにより有意な抑制は認められたが、 TFA塩に比して弱い抑制効果しか認められなかった（図 5 2 )。また、塩酸塩ペプチド Dは ΙΟΟ μ Μの濃度においても TRAP活性抑制作用は認められなかった。実施例 1 8の図 3 9 Aで示したように、同じアミノ酸配列でも用いる塩によって活性に影響が出ることが、破骨細胞形成抑制活性においても認められた。ペプチド Dの場合、塩酸塩には骨芽細胞分化活性も、破骨細胞形成抑制活性も認められないが、酢酸塩は TFA塩に比して骨芽細胞分化活性は高く、破骨細胞形成抑制活性は低かった。このことはぺプチド Dが有する 2つの活性、即ち、骨芽細胞分化活性と破骨細胞形成抑制活性を塩置換などの修飾により、独立に調節することが可能であることを示す。骨芽細胞分化活性だけを有する修飾ペプチド D、あるいは、破骨細胞形成抑制活性だけを有する修飾ぺプチド Dも作製可能である実施例 3 0 各種 RANKL抗体の中和能の検討

ALP活性亢進能を示す RANKL抗体の機能を検討するために、 RANKLによる破骨細胞形成活性に対する各種 RANKL抗体の中和能を調べた。抗体はマウスモノクロ一ナル RANKL抗体（#22、 #36、 Aおよび B) を使用した。 RAW264細胞を 10%FBS+ α MEM (SIGMA)を用いて 96 ゥエルプレートに 2 X 10³個/ゥヱルにて播種した。細胞接着後に 5 nMマウス sRANKL (ぺプロテック社）を含む 10%FBS+ α MEMに置換した。そこに 1 /z g/mLの各種 RANKL抗体を添加し、 4 日間培養を行った。培養終了後に 100 Lのァセトン/エタノールを各ゥエルに加え細胞を固定し、ドラフト内で 30min乾燥させた。実施例 1 6に記載した方法にて TRAP活性測定を行った。その結果、 1*22および B抗体については TRAP活性抑制作用が見られたが、 #36および A抗体は中和活性を持たないことが示された（図 5 3 )。 #36および A抗体は逆に RANKL の破骨細胞形成活性を有意に促進した。これはこれらの抗体が sRANKL に結合することにより、 sRANKL が 3量体になるなどの構造的変化を起こし、 RAW26 細胞上の RANKに結合する際に RANKのクラスター化を促進し、破骨細胞形成を促進したものと考えられる。実施例 3 1 GST融合べプチドの作製

実施例 2 7と同様にべプチド Dをコードする配列にリンカー配列及び EcoRI、

BamHI制限酵素サイト両端に付加したインサート DNA部分は、 GPD1-F (配列番号

4 8 ) と GPD1-R (配列番号 4 9 ) のオリゴヌクレオチドを用いて作製し、これらのエンドヌクレア一ゼを用レヽて _pGEX-4T-2 (GE healthcare ; Genbank Accession

Number U13854) の Glutathione S— transferaseの下流 ίこ定法 {こよりクローニングした。配列番号 5 4及び 5 5に、それぞれペプチド Dと GSTの融合タンパク質である GST融合べプチド Dの塩基配列どアミノ酸配列を示す。トランスフォーメーシヨンには DH5 ct (Invitrogen) を用いた。得られた陽性クローンを定法により培養し、 IPTG (終濃度： 0. 5 mM) でタンパク質発現の誘導後、菌体を抽出バッファー（50 raM Tris- HC1、 H 8. 0、 100 mM NaCl、 1 mM EDTA、 1 mM DTT、 l%(v/v)TritonX-100)にて懸濁し、氷上にてソニケ一ターを用いて破砕した。 18000 Xg, 15 minで遠心後、上清を回収し Glutathione Sepharoseカラムにかけた。続いて洗浄バッファー（50 niM Tris- HC1、 pH 8·0、 100 mM NaCl、 1 raM DTT、 0. l%(v/v)TritonX-100) にて洗浄し、その後、 Glutathione 溶液（12 mM 還元型グルタチオン、 50 mM Tris-HCl, pH 8.0)で溶出した。溶出後リン酸バッファー（PBS) にて透析を行った。精製した GST融合べプチド Dを SDS- PAGEにて分子量を確認したところ、約 27 kDaであった。 0·22μπιのフィルター（ポ一ノレ）ろ過により滅菌し、以下の実験に用いた。実施例 3 2 抗ヒト RANKLモノクローナル抗体の調製

ヒト RANKLの細胞外ドメイン（aal40 - 317)を含む GST - RANKL (オリエンタル酵母工業）をマウスに免疫し、定法によりハイプリドーマを作製した。作製したハイブリドーマは細胞培養用の培地である DMEM(4.5g/L glucose, L-グルタミン含有） + 10% FBSにて培養を行レ、、限界希釈によるクローン化の後に 6種類を選び、培養上清をそれぞれ回収した。回収した培養上清は、 0.22//ra フィルター（ポール）によりろ過を行レ、、 protein Gセファロースカラム（GEヘルスケア）に力けた。続いて PBSにて洗浄し、溶出バッファー（0.1M グリシン- HC1， pH2.7) にて抗体を溶出した。また溶出した抗体は即座に中和バッファ一にて（lMTris-HCl， pH 9.0) 中和し、 PBSにて透析の後に 0.22 xmフィルターによりろ過滅菌を行なつた。 SDS- PAGEにて抗体の L鎖 H鎖のバンドを確認後、分光光度計にて A280の吸光度より濃度を算出した。実施例 3 3 抗ヒト RANKLモノクローナル抗体の中和能の検討

ALP活性亢進能と RANKL抗体の中和能の因果関係を検討するために、実施例 3

2にて作製した抗ヒト RANKLモノクローナル抗体を用いて RANKLの破骨細胞形成能に及ぼす中和活性を調べた。クローンは 4G4、 7H12および 10C11を使用した。

RAW264細胞を 10%FBS+aMEM (SIGMA)を用いて 96ゥエルプレートに 2X10³個/ゥエルにて播種した。細胞接着後に 5nMヒト sRANKL (ぺプロテック社）を含む 10%

FBS+ a MEMに置換した。そこに 0.0625、 0.25および 1 /z g/mLの抗ヒト RANKLモノクローナル抗体を添加し、 4 日間培養を行った。培養終了後に 100 // Lのァセトン /エタノールを各ゥ；ルに加え細胞を固定し、ドラフト内で 30min乾燥させた。実施例 1 6に記載した方法にて TRAP活性測定を行った。その結果、 10C11には l / g/mLで有意な TRAP活性抑制作用が認められたが、 0. 25および 0. 0625 g/mLの濃度では抑制作用は見られなかった（図 5 4 )。一方で 7H12には各濃度で強い中和能が確認されたが、 4G4は全く中和作用を示さなかった。実施例 3 4 ヒト間葉系幹細胞の分化誘導における GST融合ペプチド Dおよび抗ヒト RANKLモノクローナル抗体の効果

ヒト間葉系幹細胞（hMS (：、 Lonza社）を 2 X 10³個/ゥヱルずつ 96 ゥヱルプレート（Nunc)に播種した。細胞接着後に、専用維持培地（Lonza社）に 100 nMデキサメサゾン（SIGMA)、 10 mM BGP (SIGMA)および 50 μ g/mLァスコルビン酸を添加して作製した分化誘導培地に切換え、 10 nMの GST融合ペプチド Dおよび GST 、あるいは 0. 3および 3 μ g/mLの濃度で 3種類の抗ヒト RANKLモノクローナル抗体を添加し培養を行った。培養 5 日目に実施例 1に記載した方法で ALP活性測定を行つた。その結果、 hMSCにおいて GST融合ペプチド Dにより有意な ALP活性の上昇が確認された（図 5 5 )。 GSTだけでは ALP活性に変化は認められなかった。一方、実施例 3 3にて用いた 3種類の抗ヒト RANKLモノクローナル抗体を hMSCに添加すると、 10C11 抗体により ALP活性が有意に亢進した（図 5 6 )。 4G4および 7H12 には ALP活性亢進作用が認められなかった。

以上より、ぺプチド Dを GSTに融合させた GST融合べプチド Dは、ベプチド D と同様にヒト間葉系幹細胞からの骨芽細胞分化誘導を促進させた。実施例 2 8の

Fc融合ぺプチド Dによる骨芽細胞分化誘導を促進と合わせて考えると、ぺプチド

Dを何らかの蛋白質と融合させてもペプチド D と同様の作用を発揮させることが可能であることが明らかとなった。また、上記の実験から抗ヒト RANKLモノクローナル抗体の中にはヒト間葉系幹細胞からの骨芽細胞分化誘導を促進させる作用を有するものがあることが分かった。つまり、 RANKL のある特定の部分をェピトープとして抗体が認識することにより、 RANKL に作用して骨芽細胞分化シグナルを伝えることが示された。このことを利用して効果的に骨芽細胞分化シグナルを伝える抗 RANKLモノクローナル抗体をデザイン、スクリーニング、作製することが可能である。実施例 2 1の抗マウス RANKLモノクローナル抗体 Bのように、抗 RANKLモノクローナル抗体の中には RANKLに作用して骨芽細胞増殖シグナルを伝えるものも存在するので、 RANKL のある特定の部分をェピトープとして抗体が認識することにより、 RANKL に作用して骨芽細胞増殖シグナルを伝えることが示されている。このように多くの抗 RANKLモノクロ一ナル抗体をスクリーニングし、最適化することにより、骨芽細胞増殖または分化シグナルを効率よく伝える抗体を見つけることが可能である。

また、実施例 1 9および 3 0に示されているように、 RANKL の破骨細胞分化作用を中和する抗マウス RANKLモノクローナル抗体（#22および B抗体）の中にも骨芽細胞増殖作用を有するもの（B抗体）と有しないもの（#22) があること、中和抗体であってもなくても骨芽細胞分化作用を示す抗体（#22、 #36、 Aおよび B) があることが示された。さらに、 RANKL の破骨細胞分化作用を中和する抗ヒト RANKLモノクローナル抗体（7H12および 10C11) の中にも、骨芽細胞分化作用を有するもの（10C11) と有しないもの（7H12) があることが示された。一方、どちらの作用も示さない抗体（4G4)もあった。以上の事実は、抗 RANKLモノクローナル抗体が示し得る 3つの作用、即ち、破骨細胞分化作用の中和、骨芽細胞増殖、および骨芽細胞分化は、それぞれ独立に別々の抗 RANKLモノクローナル抗体によつて実現させることができることを示す。また、 B 抗体のように破骨細胞分化作用の中和と骨芽細胞増殖、および骨芽細胞分化の 3つの作用を一つの抗体に持たせることも可能である。さらに、 #22抗体や 10C11抗体のように、これら 3つの作用の内、任意の 2つの作用を一つの抗体に持たせることも可能である。産業上の利用可能性

本発明では、リガンドである RANKLからその受容体である RANKに順方向のシグナルが入るだけでなく、 RANKから RANKLに逆方向のシグナルが骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に入ることを見出しだ。また、この RANKLと RANKの間の双方向性シグナルが、骨吸収と骨形成のカップリングを司ることを見出した。破骨細胞上の膜型 RANKから骨芽細胞上の膜型 RANKLへの逆シグナルは、生理的骨代謝において骨吸収と骨形成の力ップリングを司ると考えられる。この逆シグナルを利用することにより、骨量を増加させる薬剤の開発が可能である。具体的には膜型 RANK、 RANK類似べプチド、抗 RANKL抗体、可溶型 RANK、 OPG及びそれらの変異体、類似物などの RANKLに作用する分子による膜型 RANKLへの作用による逆シグナルにより、骨芽細胞分化 ·成熟が亢進し、骨量を増加させることができる。膜型 RANK、 RANK類似べプチド、抗 RANKL抗体、可溶型 RANK、 OPG及びそれらの変異体、類似物、さらに天然あるいは合成の低分子化合物などの骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物、例えば RANKL作用分子により、骨芽細胞分化 ·成熟が亢進し、骨量を増加させることに利用できる。即ち、医薬品及び体外診断薬などへの利用が可能である。また、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物、例えば RANKL作用分子をスクリーニングすることにより、新しい骨形成促進薬を探索、開発することに利用できる。また、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物、例えば RANKL作用分子は骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞にシグナルを伝達し、分化 ·成熟させるための試薬としても利用できる。 RANKL を発現する細胞は骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞以外には T細胞、 B細胞、滑膜細胞など様々な細胞が. 知られているが、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物、例えば RANKL作用分子はこれらの細胞にも同様にシグナルを伝達し、分化 ·成熟 ·活性化を引き起こす物質として、医薬品、体外診断薬、研究用試薬など様々な用途に利用できる。配列表フリーテキスト

配列番号 7、 1 6 合成、 2番目の Cysは 8番目の Cys とジスルフイド結合により結ばれている

配列番号 8〜： 1 3、 1 7〜4 6、 4 8、 4 9 プライマー本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲

1 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物を有効成分として含む、骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

2 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞上の RANKLに作用する、請求項 1記載の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

3 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が RANK、 RANK の変異体若しくは断片ぺプチド、 RANKに構造が類似したぺプチド、 RANKの断片べプチドに構造が類似したぺプチド、 RANKに構造が類似した化学物質、 RANKの断片ペプチドに構造が類似した化学物質、 0PG、 0PG の変異体若しくは断片ペプチド、 0PGに構造が類似したぺプチド、 0PGの断片べプチドに構造が類似したべプチド、 0PGに構造が類似した化学物質、並びに 0PGの断片べプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、請求項 1記載の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。 .

4 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞上の RANKしに作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が

RANK, RANKLに作用し得る RANKの変異体若しくは断片べプチド、 RANKに構造が類似し RANKLに作用し得るぺプチド、 RANKの断片べプチドに構造が類似し RANKLに作用し得るぺプチド、 RANKに構造が類似し RANKLに作用し得る化学物質、 RANKL に作用し得る RANKの断片べプチドに構造が類似した化学物質、 0PG、 RANKLに作用し得る 0PGの変異体若しくは断片べプチド、 0PGに構造が類似し RANKLに作用し得るぺプチド、 0PGの断片べプチドに構造が類似し RANKLに作用し得るぺプチド、 0PGに構造が類似し RANKLに作用し得る化学物質、並びに RANKLに作用し得る 0PGの断片べプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、請求項 2記載の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

5 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が配列番号 7 又は配列番号 1 6で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドである、請求項 1又は 2に記載の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

6 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が配列番号 7 又は配列番号 1 6で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドと GST又は IgG_tの Fc 領域との融合タンパク質である、請求項 1又は 2に記載の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

7 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が抗 RANKL抗体又はその機能的断片である、請求項 1又は 2に記載の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

8 . 骨量減少を伴う骨代謝疾患が、骨粗鬆症、若年性骨粗鬆症、骨形成不全、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、関節リウマチ、変形性関節症による骨の低下、炎症性関節炎、骨髄炎、ダルココルチコィド処置、転移性の骨疾患、歯周の骨の喪失、癌による骨の喪失、及び加齢による骨の喪失からなる群から選択される、請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

9 . さらに、 BMP ファミリーメンバーを有効成分として含む、請求項 1〜8のいずれか 1項に記載の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

1 0 . 骨芽細胞に分化し得る細胞が、骨芽前駆細胞、間葉系幹細胞、間質細胞及び筋芽細胞からなる群から選択される、請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

1 1 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞にシグナルを伝達し、前記細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物を、 RANKL を発現している骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と接触させ、候補化合物が該骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進した場合に、候補化合物が骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞にシグナルを伝達し、前記細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物であると判断することを含む、スクリーニング方法。

1 2 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞上の RANKLに作用する、請求項 1 1記載のスクリ一二ング方法。

1 3 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞にシグナルを伝達し、前記細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物を、マウスに投与し、該マウスにおいて、骨密度の増加、骨塩量の増加、骨面積の増加、単位骨量の増加、骨梁幅の増加、骨梁数の増加からなる群から選択される少なくとも 1つの現象が認められた場合に、候補化合物が骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞にシグナルを伝達し、前記細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物であると判断することを含む、スクリーニング方法。

1 4 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞上の RANKLに作用する、請求項 1 3記載のスクリ一二ング方法。

1 5 . 骨芽細胞に分化し得る細胞が、骨芽前駆細胞、間葉系幹細胞、間質細胞及び筋芽細胞からなる群から選択される、請求項 1 1〜1 4のいずれか 1項に記載のスクリ一二ング方法。

1 6 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物を有効成分として含む、骨芽細胞分化 ·成熟剤。

1 7 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞上の RANKLに作用する、請求項 1 6記載の骨芽細胞分化 ·成熟剤。

1 8 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が RANK、RANK の変異体若しくは断片べプチド、 RANKに構造が類似したぺプチド、 RANKの断片ぺプチドに構造が類似したぺプチド、 RANKに構造が類似した化学物質、 RANKの断片ペプチドに構造が類似した化学物質、 0PG、 0PG の変異体若しくは断片ペプチド、 0PGに構造が類似したべプチド、 0PGの断片ぺプチドに構造が類似したべプチド、 0PGに構造が類似した化学物質、並びに 0PGの断片べプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、請求項 1 6記載の骨芽細胞分化 ·成熟剤。

1 9 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞上の RANKLに作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が RANK、 RANKLに作用し得る RANKの変異体若しくは断片ぺプチド、 RANKに構造が類似し RANKLに作用し得るぺプチド、 RANKの断片べプチドに構造が類似し RANKL に作用し得るペプチド、 RANKに構造が類似し RANKLに作用し得る化学物質、 RANKL に作用し得る RANKの断片べプチドに構造が類似した化学物質、 0PG、 RANKLに作用し得る 0PGの変異体若しくは断片べプチド、 0PGに構造が類似し RANKLに作用し得るぺプチド、 0PGの断片べプチドに構造が類似し RANKLに作用し得るぺプチド、 0PGに構造が類似し RANKLに作用し得る化学物質、並びに RANKLに作用し得る 0PGの断片べプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、請求項 1 7記載の骨芽細胞分化 ·成熟剤。

2 0 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が配列番号

7又は配列番号 1 6で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドである、請求項 1

6〜 1 9のいずれか 1項に記載の骨芽細胞分化 ·成熟剤。

2 1 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が配列番号

7又は配列番号 1 6で表されるァミノ酸配列からなるペプチドと GST又は IgG,の Fc領域との融合タンパク質である、請求項 1 6〜 1 9のいずれか 1項に記載の骨芽細胞分化 ·成熟剤。

2 2 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が配列番号

7又は配列番号 1 6で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの酢酸塩である、請求項 2 0記載の骨芽細胞分化 ·成熟剤。

2 3 . 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の分化、増殖、成熟又は石灰化を促進する化合物が抗 RANKL 抗体又はその機能的断片である、請求項 1 9記載の骨芽細胞分化 ·成熟剤。

2 4 . 骨芽細胞に分化し得る細胞が、骨芽前駆細胞、間葉系幹細胞、間質細胞及び筋芽細胞からなる群から選択される、請求項 1 6〜2 3のいずれか 1項に記載の骨芽細胞分化 ·成熟剤。

2 5 . 配列番号 7又は配列番号 1 6で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

2 6 . 配列番号 7又は配列番号 1 6で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと GST又は IgGiの Fc領域との融合タンパク質を有効成分として含む、骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

2 7 . 有効成分が配列番号 7又は配列番号 1 6で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの酢酸塩である、請求項 2 5記載の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

2 8 . 骨量減少を伴う骨代謝疾患が、骨粗鬆症、若年性骨粗鬆症、骨形成不全、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、関節リウマチ、変形性関節症による骨の低下、炎症性関節炎、骨髄炎、ダルココルチコィド処置、転移性の骨疾患、歯周の骨の喪失、癌による骨の喪失、及び加齢による骨の喪失からなる群から選択される、請求項 2 5〜 2 7のいずれか 1項に記載の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。

2 9 . さらに、 BMP ファミリーメンバーを有効成分として含む、請求項 2 5〜 2 8のいずれか 1項に記載の骨量減少を伴う骨代謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。