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WO2008145848A2 - Composition pharmaceutique et/ou cosmetique contenant des peptides derives de l ' aconitase - Google Patents

Composition pharmaceutique et/ou cosmetique contenant des peptides derives de l ' aconitase Download PDF

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WO2008145848A2
WO2008145848A2 PCT/FR2008/000571 FR2008000571W WO2008145848A2 WO 2008145848 A2 WO2008145848 A2 WO 2008145848A2 FR 2008000571 W FR2008000571 W FR 2008000571W WO 2008145848 A2 WO2008145848 A2 WO 2008145848A2
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seq
ser
cys
composition
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PCT/FR2008/000571
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Inventor
Claude Dal Farra
Nouha Domloge
Jean-Marie Botto
Original Assignee
Societe D'extraction Des Principes Actifs S.A. (Vincience)
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Publication date
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Publication of WO2008145848A3 publication Critical patent/WO2008145848A3/fr

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Definitions

  • the present invention is in the cosmetic and pharmaceutical field, and more particularly in the field of dermatology.
  • the present invention relates to a cosmetic or pharmaceutical, and especially dermatological, composition comprising, in a physiologically suitable medium, peptides derived from the aconitase enzyme, as active agents, alone or in combination with at least one other active agent.
  • the invention also relates to the cosmetic use of a composition capable of protecting mitochondria.
  • the invention also relates to a cosmetic treatment method intended to protect the skin and the integuments from external aggressions and to fight against skin aging.
  • Said peptides may also be used to prepare pharmaceutical compositions intended to prevent or combat pathologies related to mitochondrial dysfunctions, for example certain neuromuscular or cardiac degeneracies, ⁇ -type diabetes, or even certain pathologies of aging.
  • the term "superficial body growths" according to the invention encompasses all the keratinous appendages present on the surface of the body, in particular the hairs, the eyelashes, the eyebrows, the nails and the hair.
  • Mitochondria are the organelles of eukaryotic cells specialized in the production of energy. They have their own DNA (mtDNA). The energy produced by the respiratory chain is stored as ATP. Under certain cellular stress conditions, electrons, released by the oxidative phosphorylation respiratory chain, produce free radicals that can damage mitochondrial structures. These stressors can be intrinsic or external. Among these are: UV radiation, toxins, radiation, food oxidants. Thus, it has been possible to show a progressive decline in mitochondrial function with age, probably related to the accumulation of mutations on mtDNA (Singh, K., NY Acad Sci, 1019, 2004). These mutations in mtDNA can be induced by repeated exposures to UV radiation, and would even be a witness to photoaging (Bemeburg, M. et al., J. of Invest Dermatol 122 (5), 2004).
  • Mitochondria also play a central role in apoptosis. Mitochondrial degradations can thus be a triggering factor of the reaction cascade leading to apoptosis in many cell types (G. Kroemer et al., FASEB J. 9: 1277-87, 1995).
  • Aconitase (aconitate hydratase or Iron Regulatory Protein, EC 4.2.1.3) has thus been shown to be essential for maintaining the integrity of mtDNA, regardless of its catalytic activity.
  • Aconitase was first identified as a mitochondrial enzyme involved in the Krebs cycle; it catalyzes the stereospecific conversion of citrate to isocitrate and thus participates in the energy production of the cell. It has an active site with an iron-sulfur (4Fe-4S) cluster with pseudocubic geometry.
  • 4Fe-4S iron-sulfur
  • Figure 1 shows the peptide sequences of aconitase 1 and 2. Due to its dual functionality, aconitase establishes a direct link between mitochondrial energy-generating activity and mtDNA conservation. Aconitase could thus constitute a therapeutic target to prevent or fight against pathologies related to mitochondrial dysfunctions, for example, type II diabetes, certain neuromuscular disorders, certain pathologies of aging.
  • the main object of the present invention is to provide a new active agent capable of protecting the skin against external aggressions and of combating cutaneous aging.
  • the inventors have in fact demonstrated a therapeutic activity, and more particularly a dermatological and cosmetic activity, peptides derived from the aconitase enzyme.
  • peptides derived from the aconitase enzyme have been demonstrated that these peptides, when applied to the skin, significantly promote mitochondrial activity, demonstrated by an increased synthesis of ATP.
  • active agent protecting the mitochondria or capable of protecting the mitochondria any substance capable of limiting the functional or structural alterations of the mitochondria of cells or tissues subjected to a physicochemical or environmental stress.
  • the subject of the invention is primarily a cosmetic or pharmaceutical composition characterized in that it contains, as active agent, in a physiologically acceptable medium, alone or in combination with at least one other active agent, a peptide derived from the aconitase enzyme or a biologically active derivative thereof.
  • said peptides of the aconitase enzyme or their biologically active derivatives are peptides whose number of amino acids is between 3 and 50, and more particularly between 3 and 13.
  • the expression "derived peptides "aconitase enzyme” refers to any biologically active peptide fragment whose amino acid sequence is, wholly or partially, analogous or homologous to the peptide sequences of human aconitases 1 or 2, shown in FIG. -AT-
  • biologically active is meant "which has an activity in vivo or in vitro characteristic of the activity of the active agent according to the invention".
  • the peptide has a sequence which corresponds to the general formula (I):
  • Xi is threonine, leucine or isoleucine
  • X 2 is glutamine, asparagine or no amino acid
  • X 3 is threonine, serine or no amino acid.
  • AA represents any amino acid, or a derivative thereof, absent from the aconitase sequence, and n and p are integers between 0 and 4.
  • R 1 represents the primary amino function of the N-terminal amino acid, free or substituted by a protective group which may be chosen from an acetyl group, a benzoyl group, a tosyl group or a benzyloxycarbonyl group.
  • R 2 represents the hydroxyl group of the carboxyl function of the C-terminal amino acid, free or substituted by a protective group which may be chosen from an alkyl chain of Cl to C20, or an NH 2, NHY or NYY group with Y representing a C1 to C4 alkyl chain.
  • the biologically active peptide is of sequence:
  • the biologically active peptide corresponds to the sequence SEQ ID No. 4.
  • the biologically active peptide corresponds to the sequence SEQ ID No. 5.
  • the invention also relates to homologous forms of these sequences.
  • the term "homologue” denotes, according to the invention, any peptide sequence identical to at least 50%, or preferably at least 80%, and even more preferably to at least 90% of said peptide sequence, chosen from SEQ ID sequences. No. 1 to SEQ ID No. 10.
  • "Peptide sequence identical to at least X%” is intended to designate a percentage identity between the amino acid residues of the two sequences to be compared, obtained after the optimal alignment of the two sequences. Optimal alignment is achieved using local homology algorithms such as those used by BLAST P or T BLAST N computer software available on the NCBI site.
  • the term "homologue” can also refer to a peptide which differs from the sequence of a peptide of sequence SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 10 by the substitution of chemically equivalent amino acids, that is to say by the substitution of one residue for another with the same characteristics.
  • the classical substitutions are between Ala, Val, Leu and Ile; between Ser and Thr; between Asp and Glu acid residues; between Asn and GIn; and between the basic residues Lys and Arg; or between the aromatic residues Phe and Tyr.
  • amino acid refers herein to any natural or unnatural organic acid having the formula:
  • each -R is independently selected from hydrogen and an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms.
  • at least one -R group of each amino acid is a hydrogen.
  • alkyl is meant herein a carbon chain which may be linear or branched, substituted (mono- or poly-) or unsubstituted; saturated, mono-saturated (a double or triple bond in the chain) or polyunsaturated (two or more double bonds, two or more triple bonds, one or more double bonds and one or more triple bonds in the chain).
  • peptide refers to a sequence of two or more amino acids linked together by peptide bonds or modified peptide bonds.
  • peptide is meant the natural or synthetic peptide of the invention as described above or at least one of its fragments, whether obtained by proteolysis or synthetically, or any natural peptide or synthetic whose sequence is totally or partially constituted by the sequence of the previously described peptide.
  • the invention relates to a composition as defined above, characterized in that the peptide of sequence SEQ ID No. 1 to SEQ ED No. 10 is in protected form or not.
  • Protection based on a substitution on the amino-terminus by an acetyl group, a benzoyl group, a tosyl group or a benzyloxycarbonyl group can be used.
  • a protection based on the amidation of the hydroxyl function of the carboxy-terminal end is used by a NYY group with Y representing a C 1 to C 4 alkyl chain, or esterification with an alkyl group. It is also possible to protect both ends of the peptide.
  • the peptide derivatives also relate to amino acids and peptides linked together by a pseudo-peptide bond.
  • pseudo-peptide bond is meant all types of bonds capable of replacing “conventional” peptide bonds.
  • the amino acids constituting the peptide according to the invention can be in L- and D- configuration; preferably, the amino acids are in L form.
  • the peptide according to the invention can therefore be in L-, D- or DL- form.
  • the peptide of general formula (I) according to the invention can be obtained either by conventional chemical synthesis (in solid phase or in homogeneous liquid phase) or by enzymatic synthesis (Kullman et al., J. Biol Chem 1980, 225 , 8234), from constituent amino acids or their derivatives.
  • the peptide according to the invention can also be obtained by fermentation of a strain of bacteria modified or not, by genetic engineering, or by extraction of proteins of animal or plant origin, preferably of plant origin, followed by hydrolysis. controlled which releases peptide fragments totally or partially corresponding to the peptides of general formula (I).
  • proteins and peptides may be of natural or synthetic origin.
  • the peptide is obtained by chemical synthesis.
  • the active agent can be a mixture of peptide derivatives and / or constituted by amino acid derivatives.
  • the peptides derived from the aconitase enzyme of general formula (I) are first solubilized in one or more cosmetically or pharmaceutically acceptable solvents, conventionally used by those skilled in the art, such as water, glycerol, ethanol, propylene glycol, butylene glycol, dipropylene glycol, ethoxylated or propoxylated diglycols, cyclic polyols, petroleum jelly, a vegetable oil or any mixture of these solvents.
  • one or more cosmetically or pharmaceutically acceptable solvents conventionally used by those skilled in the art, such as water, glycerol, ethanol, propylene glycol, butylene glycol, dipropylene glycol, ethoxylated or propoxylated diglycols, cyclic polyols, petroleum jelly, a vegetable oil or any mixture of these solvents.
  • the peptides having the general formula (I) according to the invention are previously solubilized in a cosmetic or pharmaceutical vector such as liposomes or adsorbed on powdery organic polymers, mineral supports such as talcs and bentonites, and more generally solubilized in, or attached to, any cosmetically or pharmaceutically acceptable carrier. It is understood that the peptide according to the invention may be used alone or in combination with at least one other active agent, in a cosmetic composition or for the preparation of a pharmaceutical and / or dermatological composition.
  • compositions according to the invention may be applied by any appropriate route, in particular oral, parenteral or external topical, and their formulation will be adapted by those skilled in the art, in particular for cosmetic or dermatological compositions.
  • the compositions according to the invention are intended for topical administration to the skin.
  • These compositions must therefore contain a cosmetically and / or dermatologically acceptable medium, that is to say compatible with the skin and superficial body growths, and cover all cosmetic or dermatological forms.
  • These compositions may especially be in the form of creams, oil-in-water or water-in-oil emulsions or multiple emulsions, solutions, suspensions, gels, milks, lotions, sticks or even powders, suitable for application on the skin. , lips and / or integuments.
  • These compositions comprise the excipients necessary for their formulation, such as solvents, thickeners, diluents, surfactants, antioxidants, dyes, preservatives, perfumes.
  • the composition that may be used according to the invention may in particular consist of a composition for hair care, and in particular a shampoo, a conditioner, a setting lotion, a treatment lotion, a cream or a styling gel, a restructuring lotion for hair, a mask, etc.
  • the cosmetic composition according to the invention can be used in particular in treatments using an application that is followed or not followed by rinsing, or in the form of shampoo. It can also be in the form of dye or mascara to be applied with a brush or a comb, in particular on eyelashes, eyebrows or hair.
  • compositions that can be used according to the invention also contain other active agents that promote the action of the active agent according to the invention.
  • active agents having an anti-radical or antioxidant action, selected from vitamin C, vitamin E, coenzyme Q10 and polyphenolic extracts of plants.
  • active anti-radical agent any compound capable of trapping free radicals. These active agents are able to block free radical chain reactions before the ultimate stages of degradation of the biological constituents of the skin and thus have an antioxidant activity.
  • composition according to the invention may further associate with peptides derived from aconitase, active agents stimulating the synthesis of dermal macromolecules (laminin, fibronectin, collagen), for example the collagen peptide marketed under the name "Collaxyl®” by the Vincience company.
  • active agents stimulating the synthesis of dermal macromolecules for example the collagen peptide marketed under the name "Collaxyl®” by the Vincience company.
  • composition according to the invention can also associate aconitase-derived peptides with active agents stimulating energy metabolism, such as the active ingredient sold under the name "GP4G®" by the company Vincience.
  • active agents stimulating energy metabolism such as the active ingredient sold under the name "GP4G®” by the company Vincience.
  • the composition according to the invention may be a solar composition, that is to say a composition helping to protect against solar radiation.
  • assets assisting the sun protection such as, for example, sunscreens. It is obvious that the invention is directed to mammals in general and more particularly to humans.
  • the effective amount of active agent is the amount needed to achieve the desired result, i.e. protect the mitochondria and thus protect the skin from external aggressions and fight against skin aging.
  • the peptide of general formula (I) is present in the compositions of the invention at a concentration of between about 0.0005 and 500 ppm (parts per million), and preferably at a concentration of concentration between about 0.01 and 5 ppm relative to the total weight of the final composition.
  • compositions may especially be in the form of an aqueous solution, hydroalcoholic or oily; an oil-in-water, water-in-oil emulsion or multiple emulsions; they may also be in the form of creams, suspensions or powders, suitable for application to the skin, mucous membranes, lips and / or integuments.
  • These compositions may be more or less fluid and have the appearance of a cream, lotion, milk, serum, ointment, gel, paste or paste. a foam. They can also be in solid form, as a stick or be applied to the skin in aerosol form. They can be used as a care product and / or as a make-up product for the skin.
  • compositions additionally comprise any additive commonly used in the field of application envisaged as well as the adjuvants necessary for their formulation, such as solvents, thickeners, diluents, antioxidants, dyes, sunscreens, self-tanning agents, pigments, fillers, preservatives, perfumes, odor absorbers, cosmetic or pharmaceutical active ingredients, essential oils, vitamins, essential fatty acids, surfactants, film-forming polymers, etc. .
  • additives such as solvents, thickeners, diluents, antioxidants, dyes, sunscreens, self-tanning agents, pigments, fillers, preservatives, perfumes, odor absorbers, cosmetic or pharmaceutical active ingredients, essential oils, vitamins, essential fatty acids, surfactants, film-forming polymers, etc.
  • these adjuvants and their proportions are chosen in such a way as not to harm the properties advantageous of the composition according to the invention.
  • These adjuvants may, for example, correspond to 0.01 to 20% of the total weight of the composition.
  • the fatty phase may represent from 5 to 80% by weight and preferably from 5 to 50% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the emulsifiers and co-emulsifiers used in the composition will be chosen from those conventionally used in the field under consideration. For example, they can be used in a proportion ranging from 0.3 to 30% by weight, relative to the total weight of the composition.
  • the peptide according to the invention can be used advantageously in a cosmetic composition or for the preparation of a pharmaceutical composition.
  • the peptide according to the invention may advantageously be used in a cosmetic composition intended to fight in a preventive and / or curative manner against the manifestations of cutaneous aging and, more specifically, in order to fight against and / or prevent aging. -induced (photoaging).
  • Skin manifestations of aging means any changes in the external appearance of the skin and skin growth due to aging such as, for example, wrinkles and fine lines, wilted skin, soft skin, thinned skin, lack of elasticity and / or tone of the skin, dull and lackluster skin or skin pigmentation spots, discoloration of the hair or spots on the nails, but also any internal changes in the skin that does not systematically result by a modified external appearance such as, for example, any internal degradation of the skin resulting from exposure to ultraviolet (UV) radiation.
  • UV ultraviolet
  • the peptide according to the invention, or the composition containing it will make it possible, in particular, to combat the loss of elasticity and firmness of the skin.
  • the peptide according to the invention makes it possible to protect the skin and integuments against all types of external aggressions.
  • the use of the peptide, or a composition containing it, will allow the skin and the integuments to be protected and to better withstand environmental stresses.
  • the expression "external aggression” means the aggressions that the environment can produce. By way of example, mention may be made of aggressions such as pollution, UV, or irritating products such as surfactants, preservatives or perfumes.
  • Pollution means pollution as well " "particulate matter” due to, for example, diesel particulates, ozone or heavy metals, as "indoor” pollution which may be due to solvent emissions from paints, glues or wall paper (such as toluene styrene, xylene or benzaldehyde), or even cigarette smoke.
  • the peptide according to the invention can be advantageously used in a cosmetic composition or for the preparation of a pharmaceutical composition, as a photo-protective agent and, more particularly, as a so-called “secondary” photoprotective agent.
  • the primary photoprotective agents are distinguished from the secondary photoprotective agents.
  • Primary photoprotective agents are substances that exert physical power: they are able to absorb UV radiation and release it as heat to protect the skin.
  • Secondary photoprotective agents are substances that usually have a biological effect; these are, for example, the agents capable of limiting damage to DNA and membranes by the penetration of UV radiation into the skin.
  • the subject of the invention is also the use, in a cosmetic composition, or for the preparation of a pharmaceutical composition, of an effective amount of peptide as described above, the peptide, or the composition containing it, being intended to prevent damage to the skin caused by exposure to the sun or exposure to ionizing radiation during radiation therapy.
  • the subject of the invention is also the use, in a cosmetic composition, or for the preparation of a pharmaceutical composition, of an effective amount of peptide as described above, the peptide, or the composition containing it, being intended for protect mitochondria and increase the synthesis of intracellular ATP in skin cells.
  • the invention also relates to the use, in a cosmetic composition, or for the preparation of a pharmaceutical composition, of an effective amount of peptide as described above, the peptide, or the composition containing it, being intended for protect the skin from damage caused by free radicals.
  • the invention also consists in the use of the active agent according to the invention for preparing a pharmaceutical composition intended to prevent or fight against mitochondrial dysfunctions responsible for certain neuromuscular or cardiac degeneracies, type II diabetes, or certain pathologies. aging.
  • the invention also consists in a cosmetic treatment method intended to protect the skin and the integuments from external aggressions and to fight against skin aging, characterized by the application on the skin or integuments to be treated of a composition containing a quantity effective agent of the invention.
  • Figure 1 shows the peptide sequence of human aconitase 1 and human aconitase 2 (source: Genbank Database).
  • ATP produced by mitochondria, serves as a biochemical marker for this activity.
  • a dilution is carried out to l / 12 000 th in cold PBS before each reading.
  • the ATP assay is performed on these samples: 50 ⁇ L of this dilution are deposited in a luma-cuvette and 50 ⁇ L of luminol are added. After 10 seconds, the reading of the luminescence is triggered. The values are standardized with respect to the amount of protein for each sample. Measurements are made with one device: the LUMAC® / 3M Biocounter M2010A.
  • the ATP assays show that there is a clear increase in the amount of intracellular ATP after 1 hour (+ 43%) and after 3 hours, in cells treated with the peptide SEQ ID No. 5, in comparison of untreated cells.
  • the peptide SEQ ID No. 5 very significantly stimulates the mitochondrial activity of cutaneous cells such as fibroblasts.
  • the purpose of this study is to determine the protective effect of peptide SEQ ID No. 5 vis-à-vis dermal fibroblasts subjected to stress by UVB radiation. For this, cell viability tests were performed by the MTT technique.
  • the human dermal fibroblasts are treated with a 1% solution of a 50 ppm solution of peptide SEQ ID No. 5 for 24 hours, irradiated with UVB (from 25 to 100 mJ / cm 2 ) and then cultured. another 24 hours in the presence of the same concentration of peptide SEQ ID No. 5. Untreated and non-irradiated controls and untreated but irradiated controls are performed under the same conditions. At the end of the experiment, the cells are incubated in a solution containing 0.1 mg / ml of MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide).
  • MTT 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • This compound is absorbed by living cells and then metabolized by the mitochondrial enzymes into a blue violet compound, formazan, which will be assayed spectrophotometrically at 540 nm.
  • the optical density (OD) is then directly proportional to the mitochondrial enzymatic activity as well as to the number of living cells.
  • the evaluation of the cell viability by the MTT technique shows, on the one hand, that the peptide SEQ ID No. 5, independently of any UVB radiation, increases the cell viability and, on the other hand, that the irradiations by the UVB have had a dose-dependent cytotoxic effect on human fibroblasts, but this cytotoxic effect is not manifested in the presence of 0.5 ppm peptide SEQ ID No. 5.
  • Peptide SEQ ID No. 5 at a concentration of 0.5 ppm, increases cell viability and on the other hand effectively protects the skin cells against the cyto-toxic effects of UVB radiation.
  • the aim of this study is to determine the protective effect of the peptide SEQ ID No. 4, vis-à-vis dermal fibroblasts subjected to oxidative stress, caused by oxygenated water (H 2 O 2 ) at 4 mM and 5 mM.
  • H 2 O 2 oxygenated water
  • Human dermal fibroblasts are treated with a 1% solution of a 50 ppm stock solution of SEQ ID No. 4 peptide for 24 hours, subjected to oxidative stress caused by H 2 O 2 to 4 mM or 5 mM, for 30 minutes and then cultivated another 24 hours in the presence of the same concentration of peptide SEQ ED No. 4. Controls not treated with the peptide or with H 2 O 2 and controls treated only with the peptide are carried out under the same conditions.
  • the cells are incubated in a solution containing 0.1 mg / ml of MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide), according to the protocol described in Example 2.
  • MTT 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • the evaluation of the cell viability by the MTT technique shows, on the one hand, that the peptide SEQ ID No. 4, independently of oxidative stress, increases cell viability and, on the other hand, that a stress oxidative, caused by 4 mM or 5 mM H 2 O 2 for 30 minutes, had a dose-dependent cytotoxic effect on human fibroblasts, but this cytotoxic effect does not occur in the presence of 0.5 ppm of peptide SEQ ID No. 4.
  • Peptide SEQ ID No. 4 at a concentration of 0.5 ppm, increases cell viability and effectively protects the skin cells against the cytotoxic effects of oxidative stress.
  • Protocol Primary human fibroblasts are inoculated in dishes of diameters 100. When the cells have reached 70% confluence, they are treated with the peptide SEQ ID No. 5, diluted to 1% (from a 50% solution). ppm) for 24 hours. The cells are then subjected to UVB irradiation at 100 mJ / cm 2 , then grown in the presence of the peptide for another 24 hours. Boxes not treated with the peptide serve as a control. A cell suspension at 100,000 cells / ml is then performed, 500 .mu.l is taken, included in an agarose solution and cast between slide and coverslip. The cells are lysed cold.
  • the DNA is then denatured with an alkaline buffer and then subjected to a short electrophoresis (250 mA for 30 minutes) and evidenced by propidium iodide staining.
  • the slides are then observed under a fluorescence microscope. An altered cell sees its DNA stretch toward the anode in proportion to the number of breaks in the DNA and form a "comet".
  • the highly degraded DNA is in the "tail" of the comet.
  • An intact cell remains round and its DNA is then compacted at the level of the "head” of the comet.
  • the evaluation of the DNA breaks is carried out using an image analysis software which makes it possible to determine the percentage of degradation of the DNA, by the quantitative evaluation of the "Tail Moment", a parameter defining itself as the product of the length of the comet by the percentage of DNA in its distal part.
  • the peptide SEQ ID No. 5 plays an important role in the protection of the DNA of cutaneous cells subjected to irradiation with UVB.
  • Protocol Normal human keratinocytes are treated with a solution of
  • the cells are then fixed with Karnosky's fixative (20 ml of 16% paraformaldehyde / 8 ml of 50% glutaraldehyde / 25 ml of 0.2M sodium phosphate buffer / 25 ml of water), 1 h at room temperature and then left overnight. at
  • the culture supports are scraped into the Karnosky fixative and the cells are then centrifuged for 5 minutes at 5000 rpm. The supernatant is discarded and the pellet resuspended in 1 ml of 0.1M cacodylate. The samples are then stored at 4 ° C. until they are treated for observation by electron microscopy.
  • results The organelles of the cells treated with the peptide SEQ ID No. 5 have ultrastructural characteristics suggesting an increase in the metabolic activity. In particular, the specificities of the mitochondrial population, and the abundance of the elements of the Golgi apparatus are consistent with a stimulation of metabolic synthesis.
  • the peptide SEQ ID No. 5 has a stimulating action on the mitochondrial activity.
  • phase A and phase B are separately heated between 70 ° C. and 75 ° C.
  • Phase B is emulsified in phase A with stirring.
  • Phase C is added at 45 ° C, increasing stirring.
  • Phase D is then added when the temperature is below 40 ° C. Cooling is continued up to 25 ° C. with vigorous stirring.
  • phase A Prepares phase A with stirring. Incorporate the xanthan gum gradually, with deflocculating stirring. Phases C and D will be incorporated once the gel is complete. Phase E, prepared before perfect dissolution of the DHA, will be added later. Adjust the pH if necessary to 4 - 4.5. Color and perfume. 3 -Anti-age cream:
  • phase A Prepare and melt phase A at 65-70 ° C. Heat phase C at 65-70 ° C. Phase B is added to phase A just before emulsifying A in B. At about 45 ° C., the carbomer is neutralized by addition of phase D. Phase E is then added with gentle stirring and cooling is continued to 25 ° C. Phase F is then added if desired.
  • phase A Prepare phase A and heat to 75 ° C with stirring.
  • phase B by dispersing the carbopol, then the xanthan gum with stirring. Let rest.

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Abstract

La présente invention concerne une composition cosmétique ou pharmaceutique, et notamment dermatologique, comprenant dans un milieu physiologiquement adapté, des peptides dérivés de l'enzyme aconitase, en tant qu'agents actifs, seuls ou en association avec au moins un autre agent actif. L'invention est également relative à l'utilisation cosmétique d'une composition protectrice des mitochondries. L'invention porte encore sur un procédé de traitement cosmétique destiné à protéger la peau et les phanères des agressions extérieures et à lutter contre le vieillissement cutané.

Description

COMPOSITION PHARMACEUTIQUE ET/OU COSMETIQUE CONTENANT
DES PEPTIDES
La présente invention se situe dans le domaine cosmétique et pharmaceutique, et plus particulièrement dans le domaine de la dermatologie. La présente invention concerne une composition cosmétique ou pharmaceutique, et notamment dermatologique, comprenant dans un milieu physiologiquement adapté, des peptides dérivés de l'enzyme aconitase, en tant qu'agents actifs, seuls ou en association avec au moins un autre agent actif. L'invention est également relative à l'utilisation cosmétique d'une composition capable de protéger les mitochondries. L'invention porte encore sur un procédé de traitement cosmétique destiné à protéger la peau et les phanères des agressions extérieures et à lutter contre le vieillissement cutané. Lesdits peptides, dérivés de l'enzyme aconitase, peuvent également être utilisés pour préparer des compositions pharmaceutiques destinées à prévenir ou lutter contre les pathologies liées à des dysfonctionnements mitochondriaux, par exemple, certaines dégénérescences neuromusculaires ou cardiaques, le diabète de type π ou encore, certaines pathologies du vieillissement. Le terme « phanères » selon l'invention englobe l'ensemble des annexes kératiniques présentes à la surface du corps, en particulier les poils, les cils, les sourcils, les ongles et les cheveux.
Les mitochondries sont les organites des cellules eucaryotes spécialisées dans la production d'énergie. Elles sont dotées de leur propre ADN (ADNmt). L'énergie produite par la chaîne respiratoire est stockée sous forme d'ATP. Dans certaines conditions de stress cellulaire, les électrons, libérés par la chaîne respiratoire de phosphorylation oxydative, produisent des radicaux libres qui peuvent endommager les structures mitochondriales. Ces facteurs de stress peuvent être intrinsèques ou d'origine extérieure. Parmi ces derniers, on peut citer : les rayonnements UV, les toxines, les radiations, les oxydants alimentaires. Ainsi, on a pu montrer un déclin progressif des fonctions mitochondriales avec l'âge, probablement lié à l'accumulation de mutations sur l'ADNmt (K. Singh, Ann. N. Y. Acad. Sci. 1019, 2004). Ces mutations de l'ADNmt peuvent être induites par des expositions répétées aux rayonnements UV, et seraient même un témoin du photo- vieillissement (M. Bemeburg et al., J. of Invest. Dermatol. 122(5), 2004).
Les mitochondries jouent également un rôle central dans l'apoptose. Les dégradations mitochondriales peuvent ainsi être un facteur déclenchant de la cascade réactionnelle conduisant à l'apoptose dans de nombreux types cellulaires (G. Kroemer et al., FASEB J. 9: 1277-87, 1995).
Dans les mitochondries, des mécanismes naturels de réparations ont été identifiés. L'aconitase (aconitate hydratase ou Iron Regulatory Protein ; EC 4.2.1.3) s'est ainsi révélée être indispensable au maintien de l'intégrité de l'ADNmt, indépendamment de son activité catalytique. L'aconitase a tout d'abord été identifiée comme une enzyme mitochondriale impliquée dans le cycle de Krebs ; elle catalyse la conversion stéréospécifique du citrate en isocitrate et participe ainsi à la production d'énergie de la cellule. Elle possède un site actif comportant un agrégat fer-soufre (4Fe-4S) à géométrie pseudocubique. Récemment l'équipe du Dr Butow (X. J. Chen et al., Science 307, 2005) a pu montrer que l'aconitase jouait un rôle clé dans la préservation de l'intégrité de l'ADN mitochondrial. Elle interagirait avec l'ADN à l'intérieur de régions régulatrices suggérant un rôle dans le compactage du génome mitochondrial à la manière d'une protéine de la famille de HSP 70. Le passage de la forme liant l'ADN à la forme active de l'enzyme serait basé sur l'assemblage ou le désassemblage du cluster fer-soufre.
La figure 1 présente les séquences peptidiques de l'aconitase 1 et 2. Grâce à sa double fonctionnalité, l'aconitase établit un lien direct entre l'activité génératrice d'énergie de la mitochondrie et la conservation de l'ADNmt. L'aconitase pourrait ainsi constituer une cible thérapeutique pour prévenir ou lutter contre les pathologies liées à des dysfonctionnements mitochondriaux, par exemple, le diabète de type II, certaines affections neuromusculaires, certaines pathologies du vieillissement.
La recherche de composés pouvant stimuler ou protéger les mitochondries est une préoccupation de la recherche médicale et de la cosmétique. Concernant la peau, ces nouveaux composés pourraient être utiles pour prévenir ou lutter contre les signes du vieillissement cutané, mais aussi pour protéger ou réparer la peau après des brûlures, des expositions à des rayonnements UV ou des radiations, ou des expositions à des toxines ou à des polluants. A cet égard, il a été proposé des solutions par l'apport de substances anti oxydantes comme la L-ergothionéine (WO 9836748), ou encore des compositions contenant les substances chimiques impliquées dans le cycle de Krebs, tels que le succinate, fumarate, malate (WO 02064129). Mais à la connaissance de la demanderesse, aucune composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant des peptides dérivés de l'enzyme aconitase elle-même n'a été décrite.
La présente invention a pour principal objectif de fournir un nouvel agent actif, capable de protéger la peau des agressions extérieures et de lutter contre le vieillissement cutané. Les inventeurs ont en effet mis en évidence une activité thérapeutique, et plus particulièrement dermatologique et cosmétique, des peptides dérivés de l'enzyme aconitase. D a notamment été mis en évidence que ces peptides, lorsqu'ils sont appliqués sur la peau, favorisent de façon importante l'activité mitochondriale, démontrée par une synthèse accrue d'ATP. Ces nouveaux agents actifs protecteurs des mitochondries permettent ainsi d'ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques et cosmétiques.
On entend par « agent actif protecteur des mitochondries ou capable de protéger les mitochondries » toute substance capable de limiter les altérations fonctionnelles ou structurales des mitochondries de cellules ou de tissus soumis à un stress physico- chimique ou environnemental.
Ainsi, l'invention a pour objet premier une composition cosmétique ou pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient en tant qu'agent actif, dans un milieu physiologiquement acceptable, seul ou en association avec au moins un autre agent actif, un peptide dérivé de l'enzyme aconitase ou un dérivé biologiquement actif de celui-ci.
Préférentiellement, selon la présente invention, lesdits peptides de l'enzyme aconitase ou leurs dérivés biologiquement actifs sont des peptides dont le nombre d'acides aminés est compris entre 3 et 50, et plus particulièrement entre 3 et 13. L'expression « peptides dérivés de l'enzyme aconitase » désigne tout fragment peptidique biologiquement actif dont la séquence en acides aminés est, entièrement ou partiellement, analogue ou homologue des séquences peptidiques des aconitases humaines 1 ou 2, représentée en figure 1. -A-
Par l'expression « biologiquement actif », on entend « qui possède une activité in vivo ou in vitro caractéristique de l'activité de l'agent actif selon l'invention ».
Selon une méthode particulièrement avantageuse de réalisation de l'invention, le peptide possède une séquence qui répond à la formule générale (I) :
Ri-(AA)n-Ser-Cys- Xi-X2- X3-(AA)P-R2 Dans laquelle
Xi est la thréonine, la leucine ou l'isoleucine, X2 est la glutamine, l'asparagine ou aucun acide aminé,
X3 est la thréonine, la serine ou aucun acide aminé.
AA représente un acide aminé quelconque, ou un de ses dérivés, absent de la séquence de l'aconitase, et n et p sont des nombres entiers compris entre 0 et 4.
Ri représente la fonction aminé primaire de l'acide aminé N-terminal, libre ou substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi un groupement acétyle, un groupement benzoyle, un groupement tosyle ou un groupement benzyloxycarbonyle.
R2 représente le groupe hydroxyle de la fonction carboxyle de l'acide aminé C- terminal, libre ou substitué par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi une chaîne alkyle de Cl à C20, ou un groupement NH2, NHY ou NYY avec Y représentant une chaîne alkyle de Cl à C4.
Selon une méthode de réalisation de l'invention tout particulièrement préférée, le peptide biologiquement actif est de séquence :
(SEQ ID n°l) AIa- Ser-Cys-Ile-Asn-Thr-Ile-Ser
(SEQ ID n°2) Leu-Ala- Ser-Cys-Leu-Gln-Ser-Glu
(SEQ K) n°3) AIa- Ser-Cys-ϋe-Asn-Thr
(SEQ ID n°4) Ser-Cys-He-Asn-Thr (SEQ ID n°5) Ser-Cys-Ile-Asn-Thr-NH2
(SEQ ID n°6) Ser-Cys-Thr-Asn-Thr
(SEQ ID n°7) Ser-Cys-Thr-Asn-Thr-NH2
(SEQ ID n°8) Ser-Cys-Ile-Asn-Ser (SEQ ID n°9) Ser-Cys-ϋe-Gln (SEQ ID n°10) Ser-Cys-Thr
Selon un mode de réalisation particulièrement intéressant, le peptide biologiquement actif correspond à la séquence SEQ ID n°4.
Selon un autre mode de réalisation particulièrement intéressant, le peptide biologiquement actif correspond à la séquence SEQ ID n°5.
L'invention concerne aussi des formes homologues de ces séquences. Le terme « homologue » désigne, selon l'invention, toute séquence peptidique identique à au moins 50%, ou de préférence au moins 80%, et encore plus préférentiellement à au moins 90% de ladite séquence peptidique, choisie parmi les séquences SEQ ID n° 1 à SEQ ID n° 10. Par « séquence peptidique identique à au moins X% » on entend désigner un pourcentage d'identité entre les résidus d'acides aminés des deux séquences à comparer, obtenu après l'alignement optimal des deux séquences. L'alignement optimal est obtenu à l'aide d'algorithmes d'homologies locales tels que ceux utilisés par les logiciels informatiques BLAST P ou T BLAST N disponibles sur le site NCBI.
Le terme « homologue » peut également désigner un peptide qui diffère de la séquence d'un peptide de séquence SEQ ID n° 1 à SEQ ID n° 10 par la substitution d'acides aminés chimiquement équivalents, c'est-à-dire par la substitution d'un résidu par un autre possédant les mêmes caractéristiques. Ainsi, les substitutions classiques se font entre AIa, Val, Leu et Ile ; entre Ser et Thr ; entre les résidus acides Asp et Glu ; entre Asn et GIn ; et entre les résidus basiques Lys et Arg ; ou entre les résidus aromatiques Phe et Tyr.
Dans l'invention, le terme « acide aminé » se réfère ici à tout acide organique naturel ou non naturel ayant la formule :
-NHR-CR-C(O)-O- où chaque -R est indépendamment sélectionné entre un hydrogène et un groupement alkyl ayant entre 1 et 12 atomes de carbone. Préférentiellement, au moins un groupement -R de chaque acide aminé est un hydrogène. Par le terme « alkyl », on entend ici une chaîne carbonée pouvant être linéaire ou ramifiée, substituée (mono- ou poly-) ou non-substituée ; saturée, mono-saturée (une double ou triple liaison dans la chaîne) ou poly-insaturée (deux ou plusieurs doubles liaisons, deux ou plusieurs triples liaisons, une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs triples liaisons dans la chaîne).
Le terme « peptide » désigne un enchaînement de deux ou plusieurs acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques ou par des liaisons peptidiques modifiées.
Par « peptide », il faut entendre le peptide naturel ou synthétique de l'invention tel que décrit ci-dessus ou au moins l'un de ses fragments, qu'il soit obtenu par protéolyse ou de manière synthétique, ou encore tout peptide naturel ou synthétique dont la séquence est totalement ou partiellement constituée par la séquence du peptide précédemment décrit.
De façon à améliorer la résistance à la dégradation, il peut être nécessaire d'utiliser une forme protégée du peptide selon l'invention. La forme de protection doit évidemment être une forme biologiquement compatible et doit être compatible avec une utilisation dans le domaine des cosmétiques ou de la pharmacie. De nombreuses formes de protection biologiquement compatibles peuvent être envisagées, elles sont bien connues de l'homme du métier comme, par exemple, l'acylation ou l'acétylation de l'extrémité amino-terminale, ou l'amidation ou l'estérifïcation de l'extrémité carboxy-terminale. Ainsi, l'invention concerne une composition telle que définie précédemment, caractérisée par le fait que le peptide de séquence SEQ ID n°l à SEQ ED n°10 est sous forme protégée ou non. On peut utiliser une protection basée sur une substitution sur l'extrémité amino-terminale par un groupement acétyle, un groupement benzoyle, un groupement tosyle ou un groupement benzyloxycarbonyle. De préférence, on utilise une protection basée sur l'amidation de la fonction hydroxyle de l'extrémité carboxy-terminale par un groupement NYY avec Y représentant une chaîne alkyle de Ci à C4, ou l'estérification par un groupement alkyle. D est également possible de protéger les deux extrémités du peptide.
Les dérivés de peptides concernent aussi les acides aminés et les peptides reliés entre eux par une liaison pseudo-peptidique. On entend par « liaison pseudo- peptidique » tous les types de liaisons susceptibles de remplacer les liaisons peptidiques « classiques ».
Dans le domaine des acides aminés, la géométrie des molécules est telle qu'elles peuvent théoriquement se présenter sous la forme d'isomères optiques différents. D existe, en effet, une conformation moléculaire de l'acide aminé (AA) telle qu'elle dévie à droite le plan de polarisation de la lumière (conformation dextrogyre ou D-aa), et une conformation moléculaire de l'acide aminé (aa) telle qu'elle dévie à gauche le plan de polarisation de la lumière (conformation lévogyre ou L-aa). La nature n'a retenu pour les acides aminés naturels que la conformation lévogyre. En conséquence, un peptide d'origine naturelle ne sera constitué que d'acides aminés de type L-aa. Cependant, la synthèse chimique en laboratoire permet de préparer des acides aminés ayant les deux conformations possibles. A partir de ce matériel de base, il est ainsi possible d'incorporer lors de la synthèse de peptide aussi bien des acides aminés sous forme d'isomères optiques dextrogyre ou lévogyre. Ainsi, les acides aminés constituant le peptide selon l'invention peuvent être sous configuration L- et D- ; de manière préférentielle, les acides aminés sont sous forme L. Le peptide selon l'invention peut donc être sous forme L-, D- ou DL-.
Le peptide de formule générale (I) selon l'invention peut être obtenu soit par synthèse chimique classique (en phase solide ou en phase homogène liquide), soit par synthèse enzymatique (Kullman et al., J. Biol. Chem. 1980, 225, 8234), à partir d'acides aminés constitutifs ou de leurs dérivés.
Le peptide selon l'invention peut également être obtenu par fermentation d'une souche de bactéries modifiées ou non, par génie génétique, ou encore par extraction de protéines d'origine animale ou végétale, préférentiellement d'origine végétale, suivie d'une hydrolyse contrôlée qui libère des fragments peptidiques correspondant totalement ou partiellement aux peptides de formule générale (I).
De très nombreuses protéines trouvées dans les plantes sont susceptibles de contenir ces séquences au sein de leur structure. L'hydrolyse ménagée permet de dégager ces fragments peptidiques. D est possible, mais non nécessaire pour réaliser l'invention, d'extraire soit les protéines concernées d'abord et de les hydrolyser ensuite, soit d'effectuer l'hydrolyse d'abord sur un extrait brut et de purifier les fragments peptidiques ensuite. Il est également possible d'utiliser certains extraits hydrolyses sans en purifier les fragments peptidiques correspondant aux peptides de formule générale I selon l'invention, mais en s'assurant toutefois de la présence desdits fragments par des moyens analytiques appropriés.
D'autres procédés plus simples ou plus complexes peuvent être envisagés par l'homme du métier connaissant le métier de synthèse, d'extraction et de purification des protéines et des peptides. Ainsi le peptide selon l'invention peut être d'origine naturelle ou synthétique. Préférentiellement selon l'invention, le peptide est obtenu par synthèse chimique.
Selon l'invention, l'agent actif peut être un mélange de dérivés peptidiques et/ou constitués de dérivés d'acides aminés.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les peptides dérivés de l'enzyme aconitase de formule générale (I) sont préalablement solubilisés dans un ou plusieurs solvants cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptables, classiquement utilisés par l'homme du métier, comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, une huile végétale ou tout mélange de ces solvants.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, les peptides possédant la formule générale (I) selon l'invention sont préalablement solubilisés dans un vecteur cosmétique ou pharmaceutique comme les liposomes ou adsorbés sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites, et plus généralement solubilisés dans, ou fixés sur, tout vecteur cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable. II est bien entendu que le peptide selon l'invention peut être utilisé seul ou bien en association avec au moins un autre agent actif, dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique et/ou dermatologique.
Les compositions selon l'invention pourront être appliquées par toute voie appropriée, notamment orale, parentérale ou topique externe, et leur formulation sera adaptée par l'homme du métier, en particulier pour des compositions cosmétiques ou dermatologiques. Avantageusement, les compositions selon l'invention sont destinées à une administration par voie topique cutanée. Ces compositions doivent donc contenir un milieu cosmétiquement et/ou dermatologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau et les phanères, et couvrent toutes les formes cosmétiques ou dermatologiques. Ces compositions pourront notamment être sous forme de crèmes, émulsions huile-dans-eau, ou eau-dans-huile ou émulsions multiples, solutions, suspensions, gels, laits, lotions, sticks ou encore de poudres, adaptés à une application sur la peau, les lèvres et/ou les phanères. Ces compositions comprennent les excipients nécessaires à leur formulation, tels que solvants, épaississants, diluants, tensioactifs, anti-oxydants, colorants, conservateurs, parfums.
Bien entendu, l'homme de métier veillera à choisir les éventuels composés complémentaires, actifs ou non-actifs, et/ou leur quantité, de telle sorte que les propriétés avantageuses du mélange ne soient pas, ou sensiblement pas, altérées par l'adjonction envisagée.
La composition utilisable selon l'invention peut en particulier consister en une composition pour soins capillaires, et notamment un shampooing, un après- shampooing, une lotion de mise en plis, une lotion traitante, une crème ou un gel coiffant, une lotion restructurante pour les cheveux, un masque, etc. La composition cosmétique selon l'invention peut être utilisée notamment dans les traitements mettant en oeuvre une application qui est suivie ou non suivie d'un rinçage, ou encore sous forme de shampooing. Elle peut également se présenter sous forme de teinture ou de mascara à appliquer au pinceau ou au peigne, en particulier sur les cils, les sourcils ou les cheveux.
Avantageusement, les compositions utilisables selon l'invention contiennent en outre d'autres agents actifs favorisant l'action de l'agent actif selon l'invention. Par exemple, il peut être ajouté des agents actifs ayant une action anti-radicalaire ou antioxydante, choisis parmi la vitamine C, la vitamine E, le coenzyme QlO et les extraits polyphénoliques de plantes.
Par « agent actif anti-radicalaire », on entend tout composé capable de piéger les radicaux libres. Ces agents actifs sont capables de bloquer les réactions en chaînes des radicaux libres avant les étapes ultimes de dégradation des constituants biologiques de la peau et ont de ce fait une activité antioxydante.
La composition selon l'invention peut encore associer aux peptides dérivés de l'aconitase, des agents actifs stimulant les synthèses des macromolécules dermiques (laminine, fibronectine, collagène), par exemple le peptide de collagène commercialisé sous le nom « Collaxyl® » par la société Vincience.
La composition selon l'invention peut également associer aux peptides dérivés de l'aconitase, des agents actifs stimulant le métabolisme énergétique, comme le principe actif commercialisé sous la dénomination « GP4G® » par la société Vincience. Selon un autre aspect, la composition selon l'invention peut être une composition solaire, c'est-à-dire une composition aidant à la protection contre le rayonnement solaire. Ainsi, il peut être avantageusement ajouté, à la composition selon l'invention, des actifs aidant à la protection solaire tels que, par exemple, des filtres solaires. II est bien évident que l'invention s'adresse aux mammifères en général et plus particulièrement aux êtres humains.
La quantité efficace d'agent actif correspond à la quantité nécessaire afin d'obtenir le résultat recherché, à savoir; protéger les mitochondries et ainsi protéger la peau des agressions extérieures et lutter contre le vieillissement cutané. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le peptide de formule générale (I) est présent dans les compositions de l'invention à une concentration comprise entre 0,0005 et 500 ppm (parties par million) environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,01 et 5 ppm environ par rapport au poids total de la composition finale. Ces compositions pourront notamment se présenter sous forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse ; d'une émulsion huile-dans-eau, eau-dans-huile ou émulsions multiples ; elles peuvent aussi se présenter sous forme de crèmes, de suspensions, ou encore de poudres, adaptées à une application sur la peau, les muqueuses, les lèvres et/ou les phanères. Ces compositions peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un gel, d'une pâte ou d'une mousse. Elles peuvent aussi se présenter sous forme solide, comme un stick ou être appliquées sur la peau sous forme d'aérosol. Elles peuvent être utilisées comme produit de soin et/ou comme produit de maquillage de la peau. Ces compositions comprennent, en outre, tout additif communément utilisé dans le domaine d'application envisagé ainsi que les adjuvants nécessaires à leur formulation, tels que des solvants, des épaississants, des diluants, des anti-oxydants, des colorants, des filtres solaires, des agents auto-bronzants, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d'odeur, des actifs cosmétiques ou pharmaceutiques, des huiles essentielles, des vitamines, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, etc.
Dans tous les cas, l'homme du métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, correspondre de 0,01 à 20 % du poids total de la composition. Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80 % en poids et de préférence de 5 à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition seront choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés en une proportion allant de 0,3 à 30 % en poids, par rapport au poids total de la composition.
Par ses activités particulières, le peptide selon l'invention pourra être utilisé avantageusement dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique.
En particulier, le peptide selon l'invention pourra être utilisé avantageusement dans une composition cosmétique destinée à lutter de manière préventive et/ou curative contre les manifestations du vieillissement cutané et, plus spécifiquement, afin de lutter contre et/ou de prévenir le vieillissement photo-induit (photovieillissement). Par manifestations cutanées du vieillissement, on entend toutes modifications de l'aspect extérieur de la peau et des phanères dues au vieillissement comme, par exemple, les rides et ridules, la peau flétrie, la peau molle, la peau amincie, le manque d'élasticité et/ou de tonus de la peau, la peau terne et sans éclat ou les taches de pigmentation de la peau, la décoloration des cheveux ou les taches sur les ongles, mais également toute modification interne de la peau qui ne se traduit pas systématiquement par un aspect extérieur modifié comme, par exemple, toute dégradation interne de la peau consécutive à une exposition aux rayonnements ultraviolets (UV). Le peptide selon l'invention, ou la composition le contenant, permettra de lutter, en particulier, contre la perte d'élasticité et de fermeté de la peau.
Le peptide selon l'invention permet de protéger la peau et les phanères contre tous types d'agressions extérieures. L'utilisation du peptide, ou d'une composition le contenant, va permettre à la peau et aux phanères d'être protégés et de mieux résister aux stress environnementaux. On entend, par l'expression « agression extérieure », les agressions que peut produire l'environnement. A titre d'exemple, on peut citer des agressions telles que la pollution, les UV, ou encore les produits à caractère irritant tels que les tensioactifs, les conservateurs ou les parfums. Par pollution, on entend aussi bien la pollution « extérieure », due par exemple aux particules de diesel, à l'ozone ou aux métaux lourds, que la pollution « intérieure » qui peut être due notamment aux émissions de solvants de peintures, de colles, ou de papier-peints (tels que toluène, styrène, xylène ou benzaldehyde), ou bien encore la fumée de cigarette. Le peptide selon l'invention peut être avantageusement utilisé dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, en tant qu'agent photo-protecteur et, plus particulièrement, en tant qu'agent photoprotecteur dit « secondaire ». On distingue, en effet, les agents photo-protecteurs primaires des agents photo-protecteurs secondaires. Les agents photo-protecteurs primaires sont des substances qui exercent un pouvoir physique : ils sont en mesure d'absorber les rayonnements UV et de les restituer sous forme de chaleur afin de protéger la peau. Les agents photo-protecteurs secondaires sont des substances qui ont généralement un effet biologique ; ce sont, par exemple, les agents capables de limiter les dommages causés à l'ADN et aux membranes par la pénétration des rayonnements UV dans la peau.
Ainsi, l'invention a également pour objet l'utilisation, dans une composition cosmétique, ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, d'une quantité efficace de peptide tel que décrit précédemment, le peptide, ou la composition le contenant, étant destiné à prévenir les dommages causés à la peau par une exposition au soleil ou une exposition à des rayonnements ionisants lors de radiothérapies.
L'invention a également pour objet l'utilisation, dans une composition cosmétique, ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, d'une quantité efficace de peptide tel que décrit précédemment, le peptide, ou la composition le contenant, étant destiné à protéger les mitochondries et à augmenter la synthèse d'ATP intracellulaire des cellules de la peau.
L'invention se rapporte encore à l'utilisation, dans une composition cosmétique, ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, d'une quantité efficace de peptide tel que décrit précédemment, le peptide, ou la composition le contenant, étant destiné à protéger la peau des dommages causés par les radicaux libres. L'invention consiste encore en l'utilisation de l'agent actif selon l'invention pour préparer une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou lutter contre les dysfonctionnements mitochondriaux responsables de certaines dégénérescences neuromusculaires ou cardiaques, le diabète de type II, ou encore certaines pathologies du vieillissement.
L'invention consiste encore en un procédé de traitement cosmétique destiné à protéger la peau et les phanères des agressions extérieures et à lutter contre le vieillissement cutané, caractérisé par l'application sur la peau ou les phanères à traiter d'une composition contenant une quantité efficace de l'agent actif selon l'invention.
Des modes de réalisation particuliers de ce procédé de traitement cosmétique résultent également de la description précédente. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples donnés à titre illustratif et non limitatif.
La figure 1 représente la séquence peptidique de l'aconitase 1 humaine et de l'aconitase 2 humaine (source : Base de données Genbank) .
Exemple 1 : Mise en évidence de l'effet stimulant du peptide SEQ ID n°5 sur la synthèse d'ATP intracellulaire
Le but de cette étude est de déterminer l'influence du peptide SEQ ID n°5 sur l'activité mitochondriale. C'est l'ATP, produit par les mitochondries, qui sert de marqueur biochimique pour cette activité.
Protocole : Cette étude s'effectue à l'aide d'un Kit « ATP Bioluminescence Assay Kit HS II » (Roche Applied Science). Les fibroblastes dermiques sont traités avec une solution à 1 %, d'une solution à 50 ppm, contenant le peptide SEQ ID n°5, représentatif de la famille de peptide selon l'invention, pendant une période allant de 1 à 3 heures. A la fin des temps d'incubation, les puits sont vidés de leur milieu et rincés avec 2 ml de PBS froid avant d'ajouter 250 μl d'un tampon de lyse fourni par le kit. Les cellules de chaque puits sont ensuite grattées puis récoltées dans des tubes de 14 ml. Chaque puits est rincé avec 2 x 500 μl de PBS froid et le tout est de nouveau récolté dans les tubes respectifs. A partir de ces échantillons, une dilution est réalisée au l/12000ième dans du PBS froid avant chaque lecture. Le dosage d'ATP est réalisé sur ces échantillons : 50 μL de cette dilution sont déposés dans une luma-cuvette et 50 μL de luminol sont ajoutés. Après 10 secondes, la lecture de la luminescence est déclenchée. Les valeurs sont standardisées par rapport à la quantité de protéines pour chaque échantillon. Les mesures sont effectuées à l'aide d'un appareil : le Biocounter M2010A LUMAC®/3M.
Résultats : Les dosages d'ATP montrent qu'il y a une nette augmentation de la quantité d'ATP intracellulaire après 1 heure (+ 43 %) et après 3 heures, dans des cellules traitées par le peptide SEQ ID N°5, en comparaison des cellules non traitées. Conclusion : Le peptide SEQ ID n°5 stimule très significativement l'activité mitochondriale de cellules cutanées telles que les fibroblastes.
Exemple 2 ; Evaluation de l'effet protecteur du peptide SEQ ID n°5 sur les cellules cutanées soumises à des rayonnements ultraviolet (UVB)
Le but de cette étude est de déterminer l'effet protecteur du peptide SEQ ID n°5 vis-à-vis de fibroblastes dermiques soumis à un stress par des rayonnements UVB. Pour cela, des tests de viabilité cellulaire ont été réalisés par la technique au MTT.
Protocole : Les fibroblastes dermiques humains sont traités avec une solution à 1 %, d'une solution à 50 ppm de peptide SEQ ID N°5, pendant 24 heures, irradiés par des UVB (de 25 à 100 mJ/cm2) puis cultivés encore 24 heures en présence de la même concentration de peptide SEQ ID n°5. Des contrôles non traités et non irradiés et des contrôles non traités mais irradiés sont réalisés dans les mêmes conditions. A la fin de l'expérimentation, les cellules sont incubées dans une solution contenant 0,1 mg/ml de MTT (3-[4, 5-diméthylthiazol-2-yl]-2, 5-diphényltétrazolium, bromure). Ce composé est absorbé par les cellules vivantes puis métabolisé par les enzymes mitochondriales en un composé bleu violet, le formazan, qui sera dosé par spectrophotométrie à 540 nm. La densité optique (D. O.) est alors directement proportionnelle à l'activité enzymatique mitochondriale ainsi qu'au nombre de cellules vivantes.
Résultats :
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001
L'évaluation de la viabilité cellulaire par la technique du MTT montre, d'une part, que le peptide SEQ ID n°5, indépendamment de tout rayonnement UVB, augmente la viabilité cellulaire et, d'autre part, que les irradiations par les UVB ont eu un effet cytotoxique dose-dépendant sur les fibroblastes humains, mais que cet effet cytotoxique ne se manifeste pas en présence de 0,5 ppm de peptide SEQ ID n°5.
Conclusions : Le peptide SEQ ED n°5, à la concentration de 0,5 ppm, augmente la viabilité cellulaire et d'autre part protège efficacement les cellules cutanées contre les effets cyto toxiques des rayonnements UVB.
Exemple 3 : Evaluation de l'effet protecteur du peptide SEO ID n°4 sur les cellules cutanées soumises à un stress oxydatif
Le but de cette étude est de déterminer l'effet protecteur du peptide SEQ ID n°4, vis-à-vis de fibroblastes dermiques soumis à un stress oxydatif, provoqué par de l'eau oxygénée (H2O2) à 4 mM et 5 mM. Pour cela, des tests de viabilité cellulaire ont été réalisés par la technique au MTT.
Protocole : Les fibroblastes dermiques humains sont traités avec une solution à 1 %, d'une solution mère à 50 ppm de peptide SEQ ED n°4, pendant 24 heures, soumis à un stress oxydatif provoqué par de l'H2O2 à 4 mM ou 5 mM, pendant 30 minutes puis cultivés encore 24 heures en présence de la même concentration de peptide SEQ ED n°4. Des contrôles non traités par le peptide ou par de l'H2O2 et des contrôles traités seulement par le peptide sont réalisés dans les mêmes conditions. A la fin de l'expérimentation, les cellules sont incubées dans une solution contenant 0,1 mg/ml de MTT (3-[4, 5-diméthylthiazol-2-yl]-2, 5-diphényltétrazolium, bromure), selon le protocole décrit dans l'exemple 2.
Résultats :
Figure imgf000018_0001
L'évaluation de la viabilité cellulaire par la technique du MTT montre, d'une part, que le peptide SEQ ID n°4, indépendamment d'un stress oxydatif, augmente la viabilité cellulaire et, d'autre part, qu'un stress oxydatif, provoqué par de l'H2O2 à 4 mM ou 5 mM pendant 30 minutes, a eu un effet cytotoxique dose-dépendant sur les fibroblastes humains, mais que cet effet cytotoxique ne se manifeste pas en présence de 0,5 ppm de peptide SEQ ID n°4.
Conclusions : Le peptide SEQ ID n°4, à la concentration de 0,5 ppm, augmente la viabilité cellulaire et protège efficacement les cellules cutanées contre les effets cytotoxiques d'un stress oxydatif.
Exemple 4 : Evaluation de l'effet cvtoprotecteur du peptide SEQ ID n°5 sur les cellules cutanées soumises à des rayonnements ultraviolets (UVB)
Une étude de l'effet cytoprotecteur du peptide SEQ ID nc5, a été réalisée en évaluant les dommages provoqués au niveau de l'ADN. Cette étude a été réalisée grâce au test des comètes (ou « Single CeIl Gel Electrophoresis »), une technique micro-électrophorétique courte et sensible qui permet de visualiser et de quantifier les cassures de l'ADN sur des cellules individuelles.
Protocole : Des fibroblastes humains primaires sont ensemencés dans des boîtes de diamètres 100. Lorsque les cellules ont atteint 70 % de confluence, elles sont traitées avec le peptide SEQ ID n°5, dilué à 1 % (à partir d'une solution à 50 ppm) pendant 24 heures. Les cellules sont ensuite soumises à une irradiation UVB à 100 mJ/cm2, puis cultivées en présence du peptide pendant encore 24 heures. Des boîtes non traitées par le peptide servent de contrôle. Une suspension cellulaire à 100 000 cellules/ml est ensuite réalisée, 500 μl sont prélevés, inclus dans une solution d'agarose et coulés entre lame et lamelle. Les cellules sont lysées à froid. L'ADN est ensuite dénaturé par un tampon alcalin puis soumis à une courte électrophorèse (250 mA pendant 30 minutes) et mis en évidence par une coloration à l'iodure de propidium. Les lames sont alors observées au microscope à fluorescence. Une cellule altérée voit son ADN s'étirer vers l'anode proportionnellement au nombre de cassures présentes dans l'ADN et forme « une comète ». L'ADN fortement dégradé se trouve dans la « queue » de la comète. Une cellule intacte reste ronde et son ADN est alors compacté au niveau de la « tête » de la comète.
L'évaluation des cassures de l'ADN s'effectue à l'aide d'un logiciel analyseur d'image qui permet de déterminer le pourcentage de dégradation de l'ADN, par l'évaluation quantitative du « Tail Moment », un paramètre se définissant comme le produit de la longueur de la comète par le pourcentage d'ADN dans sa partie distale.
Résultats : Le tableau ci-dessous représente l'évaluation des « Tail Moment » mesurés dans des fibroblastes irradiés par les UVB et traités ou non par le peptide SEQ ID n°5.
Figure imgf000019_0001
Les résultats obtenus montrent que les cellules soumises à une irradiation UVB, en l'absence du peptide SEQ ID n°5 (contrôle UVB) présentent le « Tail Moment » le plus important, c'est-à-dire la condition où l'ADN est le plus endommagé. Au contraire, les cellules traitées avec le peptide SEQ ID n°5 à 0,5 ppm selon l'invention, ont un « Tail Moment », c'est à dire des dommages à l'ADN, diminué de 25 %.
Conclusion : Le peptide SEQ ID n°5 joue un rôle important dans la protection de l'ADN des cellules cutanées soumises à une irradiation par les UVB. Exemple 5 : Evaluation de l'action du peptide SEQ ID n°5 sur les l'ultrastrueture des mitochondries
Le but de cette étude est de déterminer l'action du peptide SEQ ID n°5 sur les mitochondries par l'observation des ultrastructures en microscopie électronique. Protocole : Des kératinocytes humains normaux sont traités avec une solution à
1 %, d'une solution mère à 50 ppm de peptide SEQ ID n°5, pendant 72 heures. Des contrôles négatifs sont réalisés dans les mêmes conditions mais en l'absence dudit peptide.
Les cellules sont ensuite fixées par le fixateur de Karnosky (20 ml de paraformaldehyde 16%/ 8 ml de glutaraldehyde 50% / 25 ml de tampon sodium phosphate 0,2M / 25 ml d'eau), Ih à température ambiante puis laissées une nuit à
4°C. Les supports de culture sont grattés dans le fixateur de Karnosky puis les cellules sont centrifugées pendant 5 minutes à 5000 rpm. Le surnageant est écarté et le culot resuspendu dans 1 ml de cacodylate à 0,1 M. Les échantillons sont ensuite conservés à 4°c jusqu'à leur traitement pour l'observation en microscopie électronique.
Résultats : Les organites des cellules traitées par le peptide SEQ ID n°5 présentent des caractéristiques ultrastructurales suggérant une augmentation de l'activité métabolique. En particulier, les spécificités de la population de mitochondries, et l'abondance des éléments de l'appareil de Golgi concordent avec une stimulation de la synthèse métabolique.
Conclusion : Le peptide SEQ ID n°5 a une action stimulante sur l'activité mitochondriale.
Exemple 6 : Préparation de compositions
1 - Crème protection solaire:
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
Les constituants de la phase A et de la phase B sont chauffés séparément entre 700C et 75°C. La phase B est émulsionnée dans la phase A sous agitation. La phase C est ajoutée, à 45°C, en augmentant l'agitation. La phase D est ensuite additionnée lorsque la température se situe en dessous de 400C. Le refroidissement est poursuivi jusqu'à 25°C sous vive agitation.
2 -Lait après-soleil :
Figure imgf000021_0002
Figure imgf000022_0001
Préparer la phase A sous agitation. Incorporer la gomme xanthane progressivement, sous agitation défloculeuse. Les phases C et D seront incorporées une fois le gel terminé. La phase E, préparée préalablement jusqu'à parfaite dissolution de la DHA, sera rajoutée ensuite. Ajuster le pH si nécessaire à 4 - 4,5. Colorer et parfumer. 3 -Crème anti-âge :
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Préparer et fondre la phase A à 65-7O0C. Chauffer la phase C à 65-700C. La phase B est ajoutée à la phase A juste avant d'émulsionner A dans B. A environ 45°C, le carbomer est neutralisé par addition de la phase D. La phase E est ensuite additionnée sous légère agitation et le refroidissement est poursuivi jusqu'à 250C. La phase F est alors additionnée si souhaité.
4 -Crème protectrice de jour :
Figure imgf000024_0002
Figure imgf000025_0001
Préparer la phase A et chauffer à 75°C sous agitation. Préparer la phase B en dispersant le carbopol, puis la gomme xanthane sous agitation. Laisser reposer.
Chauffer à 750C.
A température, émulsionner A dans B sous agitation rotor-stator. Neutraliser avec la phase C sous agitation rapide. Après refroidissement à 4O0C, additionner la phase D, puis la phase E. Le refroidissement est poursuivi sous agitation légère et la phase F rajoutée.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition cosmétique ou pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient en tant qu'agent actif, dans un milieu physiologiquement acceptable, seul ou en association avec au moins un autre agent actif, un peptide dérivé de l'enzyme aconitase ou un dérivé biologiquement actif de celui-ci, comprenant de 3 à 13 résidus d'acides aminés, et dont la séquence répond à la formule générale (I) :
Ri-(AA)n-Ser-Cys- Xi-X2- X3-(AA)P-R2
Dans laquelle
Xi est la thréonine, la leucine ou l'isoleucine, X2 est la glutamine, l'asparagine ou aucun acide aminé, X3 est la thréonine, la serine ou aucun acide aminé,
AA représente un acide aminé quelconque ou un de ses dérivés, absent de la séquence de l' aconitase, et n et p sont des nombres entiers compris entre 0 et 4,
Ri représente la fonction aminé primaire de l'acide aminé N-terminal, libre ou substituée par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi un groupement acétyle, un groupement benzoyle, un groupement tosyle ou un groupement benzyloxycarbonyle.
Ri représente le groupe hydroxyle de la fonction carboxyle de l'acide aminé C- terminal, libre ou substitué par un groupement protecteur pouvant être choisi parmi une chaîne alkyle de Ci à C20, ou un groupement NH2, NHY ou NYY avec Y représentant une chaîne alkyle de Ci à C4.
2. Composition cosmétique ou pharmaceutique selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le peptide de formule générale (I) correspond à une des séquences suivantes : (SEQ ID n° 1 ) AIa- Ser-Cys-Ile-Asn-Thr-Ile-Ser
(SEQ ID n°2) Leu-Ala- Ser-Cys-Leu-Gln-Ser-Glu (SEQ ID n°3) AIa- Ser-Cys-ϋe-Asn-Thr (SEQ ID n°4) Ser-Cys-Ile-Asn-Thr (SEQ ID n°5) Ser-Cys-Ue-Asn-Thr-NH2 (SEQ ID n°6) Ser-Cys-Thr-Asn-Thr (SEQ ID n°7) Ser-Cys-Thr-Asn-Thr-NH2 (SEQ ID n°8) Ser-Cys-Ee-Asn-Ser (SEQ ID n°9) Ser-Cys-Ile-Gln (SEQ ID n010) Ser-Cys-Thr
3. Composition selon la revendication 2 caractérisée en ce que le peptide de formule générale (I) correspond à la séquence SEQ ED n°4.
4. Composition selon la revendication 2 caractérisée en ce que le peptide de formule générale (I) correspond à la séquence SEQ ED n°5.
5. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le peptide de formule générale (I) possède au moins un groupement fonctionnel protégé par un groupement protecteur, ce groupement protecteur étant soit une acylation ou une acétylation de l'extrémité amino-terminale, soit une amidation ou une estérification de l'extrémité carboxy-terminale, soit les deux.
6. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le peptide de formule générale (I) est présent dans la composition à une concentration comprise entre 0,0005 et 500 ppm environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,01 et 5 ppm.
7. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le peptide de formule générale (I) est préalablement solubilisé dans un ou plusieurs solvants cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptables, comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, une huile végétale ou tout mélange de ces solvants.
8. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme adaptée à l'application par voie topique comprenant un milieu cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable.
9. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle contient, en outre, au moins un autre agent actif favorisant l'action dudit peptide de formule générale (I).
10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'autre agent actif est choisi parmi les agents actifs antioxydant et/ou les agents actifs stimulant la synthèse de la matrice extracellulaire, et/ou les agents actifs stimulant le métabolisme cellulaire énergétique.
11. Utilisation, dans une composition cosmétique, d'une quantité efficace d'agent actif, tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour protéger les mitochondries et pour augmenter la synthèse d'ATP intracellulaire des cellules de la peau.
12. Utilisation selon revendication 1 1, caractérisée en ce que la composition est destinée à protéger la peau et les phanères contre tous les types d'agressions extérieures.
13. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que les agressions extérieures sont les rayonnements UV.
14. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que la composition est destinée à prévenir ou à traiter les dommages causés à la peau et aux phanères par les radicaux libres.
15. Utilisation selon la revendication 11 caractérisée en ce que la composition est destinée à prévenir ou à traiter les signes cutanés du vieillissement et/ou du photovieillissement.
16. Utilisation d'une quantité efficace d'agent actif, tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour préparer des compositions pharmaceutiques destinées à prévenir ou à lutter contre les dysfonctionnements mitochondriaux responsables de certaines dégénérescences neuromusculaires ou cardiaques, du diabète de type II ou encore de certaines pathologies du vieillissement
17. Procédé de traitement cosmétique destiné à protéger la peau et les phanères des agressions extérieures, caractérisé en ce que l'on applique topiquement sur la peau ou les phanères à traiter une composition contenant une quantité efficace d'agent actif tel que défini dans l'une des revendications 1 à 5.
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