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WO2008038613A1 - Procédé de production de dipeptide - Google Patents

Procédé de production de dipeptide Download PDF

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WO2008038613A1
WO2008038613A1 PCT/JP2007/068509 JP2007068509W WO2008038613A1 WO 2008038613 A1 WO2008038613 A1 WO 2008038613A1 JP 2007068509 W JP2007068509 W JP 2007068509W WO 2008038613 A1 WO2008038613 A1 WO 2008038613A1
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WO
WIPO (PCT)
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protein
dna
dipeptide
transformant
microorganism
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/068509
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kuniki Kino
Youichi Kotanaka
Makoto Yagasaki
Original Assignee
Kyowa Hakko Bio Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. filed Critical Kyowa Hakko Bio Co., Ltd.
Priority to US12/442,472 priority Critical patent/US7939294B2/en
Priority to JP2008536367A priority patent/JP5256039B2/ja
Priority to AT07828326T priority patent/ATE553194T1/de
Priority to EP07828326A priority patent/EP2067857B1/en
Publication of WO2008038613A1 publication Critical patent/WO2008038613A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a protein having dipeptide synthesis activity, a DNA encoding the protein, a recombinant DNA containing the DNA, a transformant transformed with the recombinant DNA, and a dipeptide synthesis activity
  • the present invention relates to a method for producing a protein, a method for producing a dipeptide using a protein having dipeptide synthesis activity, and a method for producing a dipeptide using a microorganism or a transformant that produces a protein having dipeptide synthesis activity.
  • bacillicin synthase which is a dipeptide antibiotic derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus.
  • Basilicin synthase is known to have the activity of synthesizing bacillicin (L-alanyl-L-anticapsin, L-Ala-L-anticapsin) and L-alanyl L-alanin (L-Ala-L-Ala).
  • bacillicin synthase is known to have the activity of synthesizing bacillicin (L-alanyl-L-anticapsin, L-Ala-L-anticapsin) and L-alanyl L-alanin (L-Ala-L-Ala).
  • Non-Patent Documents 1 and 2 it has been recently reported that this enzyme has an activity to generate various dipeptides from various combinations of the same or different free amino acids (Patent Document 1). reference).
  • Bacillus subtilis ATCC6633 is a peptide antibacterial substance, lysoctocin A (L-Arg-L-2_ ⁇ mo_5_phospnono_ «5_cis_pentenoic acid, L_Arg_L_APPA), -L-Arg-L-APPA) and lysoctisin D (L-Leu_L-Arg-L-APPA) are known to be produced (see Non-Patent Document 3). However, there are no known biosynthetic pathways, biosynthetic proteins, or biosynthetic genes. Patent Document 1: International Publication No. 2004/058960 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 J. Ind. Microbiol., 2, 201-208 (1987)
  • Non-Patent Document 2 Enzyme. Microbial. Technol., 29, 400-406 (2001)
  • Non-Patent Document 3 Arch. Micromiol., 153, 276-281 (1990)
  • An object of the present invention is to provide a protein having dipeptide synthesis activity, a DNA encoding the protein, a recombinant DNA containing the DNA, a transformant transformed with the recombinant DNA, the trait
  • a method for producing a protein having dipeptide synthesis activity using a transformant a method for producing a dipeptide using a protein having the dipeptide synthesis activity, and a transformant or microorganism producing the protein having the dipeptide synthesis activity
  • Another object is to provide a method for producing a dipeptide using the above culture as an enzyme source.
  • the present invention relates to the following (1) to (; 10).
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a dipeptide synthesis activity
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having dipeptide synthesis activity
  • a microorganism having the ability to produce the protein of (1) above is cultured in a medium, the protein is produced and accumulated in the culture, and the protein is collected from the culture. Manufacturing method.
  • a culture of a microorganism having the ability to produce the protein of (1) or a treated product of the culture, or the protein of (1) and one or more amino acids are present in an aqueous medium.
  • a protein having an activity of synthesizing a dipeptide can be produced by the present invention, and the dipeptide can be produced using the protein or a transformant or a microorganism having an ability to produce the protein.
  • FIG. 1 is a diagram showing the process of constructing plasmid pBsRzcA.
  • PII represents a T7 promoter gene
  • His-tag represents a histidine tag (His-tag) sequence.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and having a dipeptide synthesis activity
  • [3] a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having dipeptide synthesis activity;
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is obtained. It can be obtained by introducing site-specific mutations into the encoded DNA.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is such a number that can be deleted, substituted or added by a known method such as the above-mentioned site-directed mutagenesis. Several dozen, preferably; !!-20, more preferably 1-; 10, more preferably 1-5.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 one or more amino acids have been deleted, substituted or appended when one or more amino acids are deleted, substituted or added at any position in the same sequence! / But! /
  • amino acid positions at which amino acid deletion, substitution or addition can be performed include one to several amino acids on the N-terminal side and C-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. That's the power S.
  • Natural amino acids include L-alanin, L-asparagine, L-aspartic acid, L-arginine, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L histidine, L isoleucine, L bite isine, L lysine, L methionine, L Norelanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine
  • amino acids that can be substituted with each other are shown below. Amino acids contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norpaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, 0-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexenolealanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-amino adipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-dianaminobutanoic acid, 2,3-dianaminopropionic acid
  • Group E proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • Group G phenylalanin, tyrosine
  • the homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 94% or more, and still more preferably It is desirable to have a homology of 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • the homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 94% or more, still more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • a protein comprising an amino acid sequence having the above and having dipeptide synthesis activity is also a protein of the present invention. Amino acid sequence homology can be determined using BLAST or FASTA as described above.
  • the protein of the present invention is a protein having dipeptide synthesis activity
  • a transformant expressing the protein of the present invention is prepared using a DNA recombination method, and the transformant is used.
  • the protein of the present invention one or more amino acids, preferably two amino acids selected from L-amino acid and glycine, and ATP are present in an aqueous medium, and the aqueous medium.
  • the DNA having the specific base sequence or a part of the DNA base sequence is useful as a probe for Northern or Southern blot analysis, or has a length that can be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis. It may be DNA.
  • DNA used as a probe for Northern or Southern blot analysis DNA of at least 100 bases or more, preferably 200 bases or more, more preferably 500 bases or more can be mentioned.
  • DNA used as an oligonucleotide primer D of at least 10 bases, preferably 15 bases or more Can give NA.
  • the above stringent conditions include, for example, a DNA-immobilized filter and probe DNA, 50% formamide, 5 X SSC (750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate), 50 mM sodium phosphate. ( ⁇ 7 ⁇ 6), 5 X Denhardt's solution, 10% dextrane sulfate, and 20 g / L of denatured salmon sperm DNA at 42 ° C, after incubation, for example about 65
  • Stringent conditions lower than the force that can increase the conditions for washing the filter in a 0.2 X SSC solution at ° C can also be used.
  • Stringent conditions can be changed by adjusting the concentration of formamide (the lower the formamide concentration, the lower the stringency), and changing the salt concentration and temperature conditions.
  • Low stringent conditions include, for example, 6 X SSCE (20 X SSCE is 3 mol / L sodium chloride, 0.2 mol / L sodium dihydrogen phosphate, 0.02 mol / L EDTA, ⁇ 7.4), 0.5 Incubate at 37 ° C in a solution containing 1% SDS, 30% formamide, 100 g / L denatured salmon sperm DNA, then 1 X SSC, 0.1% SDS solution at 50 ° C Increase the conditions for cleaning with. Further, as a lower stringent condition, the hybridization is performed using a solution having a high salt concentration (for example, 5 ⁇ SSC) under the above-mentioned low stringent condition, and then washed. Ability to raise conditions S.
  • 6 SSCE (20 X SSCE is 3 mol / L sodium chloride, 0.2 mol / L sodium dihydrogen phosphate, 0.02 mol / L EDTA, ⁇ 7.4), 0.5 Incubate at 37 °
  • Various conditions described above can also be set by adding or changing a blocking reagent used for suppressing the background of the hybridization experiment.
  • the addition of the blocking reagents described above may be accompanied by changes in hybridization conditions in order to adapt the conditions.
  • any of the above-mentioned [1] to [3] is used, for example, when calculated based on the above parameters using the above-mentioned programs such as BLAST and FASTA.
  • At least 80% of the DNA base sequence A DNA having a homology of preferably 90% or more, more preferably 94% or more, still more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more can be mentioned.
  • the homology of the base sequence is determined by the force S determined using a program such as BLAST or FASTA described above.
  • a DNA that encodes a protein having dipeptide synthesis activity means that a recombinant DNA that expresses the DNA is prepared, and the recombinant DNA
  • the protein is purified from a culture obtained by cultivating a microorganism obtained by culturing a microorganism obtained by introducing the protein into a host cell, and the purified protein is used as an enzyme source to produce the enzyme source and one or more amino acids, preferably L -Two kinds of amino acids selected from amino acids and glycine can be present in an aqueous medium, and whether or not a dipeptide is produced and accumulated in the aqueous medium can be confirmed by a method of analyzing by HPLC or the like.
  • the microorganism and transformant used in the production method of the present invention are not particularly limited as long as they are microorganisms and transformants having the ability to produce the protein of the present invention, but the microorganism is preferably Bacillus (M).
  • M Bacillus
  • a transformed transformant can be mentioned.
  • a transformant transformed with the DNA encoding the protein of the present invention a recombinant DNA containing the DNA of 2 above is used, and a trait obtained by transforming a host cell by a known method.
  • Host cells include prokaryotes such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells and plant cells, preferably prokaryotes such as bacteria, more preferably microorganisms belonging to the genus Escherichia. I can give it.
  • the DNA of the present invention may be a microorganism belonging to the genus Bacillus, preferably a microorganism belonging to Bacillus subtilis, using a probe that can be designed based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, for example, More preferably by Southern hybridization to the chromosomal DNA library of Bacillus subtilis ATC C6633, or Is a microorganism using a primer DNA that can be designed based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, preferably a microorganism belonging to the genus Bacillus, more preferably a microorganism belonging to Bacillus subtilis, more preferably a Bacillus subtilis ATCC6633 Can be obtained by PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)] using chromosomal DNA
  • a search is made for a mating IJ having a homology of 98% or more, particularly preferably 99% or more, and based on the base sequence obtained by the search, from the chromosomal DNA of the organism having the base sequence, the cDNA library, etc.
  • the DNA of the present invention or the DNA used in the production method of the present invention can also be obtained by the method.
  • the obtained DNA is cut as it is or cut with an appropriate restriction enzyme and incorporated into a vector by a conventional method, and the resulting recombinant DNA is introduced into a host cell, followed by analysis of commonly used nucleotide sequences.
  • the DNA is analyzed by using a nucleotide sequence analyzer such as the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 74, 5463 (1977)] or ABI3700 DNA analyzer (Applied Biosystems). The base sequence of can be determined.
  • the full length is determined by a Southern hybridization method for a chromosomal DNA library using the partial length DNA as a probe. DNA can be obtained.
  • the target DNA can be prepared by chemical synthesis using a 8905 type DNA synthesizer manufactured by Perceptive Biosystems.
  • Examples of the DNA obtained as described above include a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • pBluescriptll KS (+) (Stratagene)
  • pDIRECT [Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]
  • pCR—Script Amp SK (+) (Stratagene)
  • PT7Blue Novagene
  • pCR II Invitrogen
  • pCR -TRAP manufactured by Gene Nonter
  • Examples of host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia.
  • Examples of microorganisms belonging to the genus Escherichia include Escherichia coli XLl-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli ATCC 12435, Escherichia coli W1485 , Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli ⁇ ⁇ 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, Escherichia coli NM522, Escherichia coli BL21, Escherichia 15 I can give you.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. ScL, USA , 69, 2110 (1972)]
  • protoplast method Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394
  • electrovolution method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] and the like.
  • Escherichia coli Rosetta (DE3) / pBsRzcA which is a microorganism having a recombinant DNA containing a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 I can give you.
  • a DNA fragment having an appropriate length containing a portion encoding the protein of the present invention is prepared.
  • a transformant with an improved production rate of the protein can be obtained by substituting the base in the base sequence of the protein-encoding portion so as to be an optimal codon for host expression.
  • Recombinant DNA is prepared by inserting the DNA fragment downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant producing the protein of the present invention can be obtained by introducing the recombinant DNA into a host cell suitable for the expression vector.
  • any prokaryotic organism such as bacteria, yeast, animal cell, insect cell, plant cell, etc. can be used as long as it can express the target gene.
  • the expression vector is capable of autonomous replication in the above host cell or can be integrated into a chromosome, and contains a promoter at a position where the DNA of the present invention can be transcribed. Is used.
  • the recombinant DNA having the DNA of the present invention is capable of autonomous replication in prokaryotes, and at the same time, a promoter, a liposome binding sequence, and the DNA of the present invention. It is preferable that it is a recombinant DNA composed of a transcription termination sequence! /. Contains the genes that control the promoter!
  • Expression vectors include pBTrp2, pBTacl, pBTac2, pHelixl (all manufactured by Roche Diagnostax), pKK233_2 (manufactured by Amersham's Pharmacia Biotech), pSE280 (manufactured by Invitrogen), pGEMEX- ⁇ (Promega) ), PQE-8 (Qiagen), pET-3 (Novagen), 1? 10 (JP 58-110600), 1? 200 [ 8 Biol. Chem., 48, 6 69 (1984)], pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGELl [Proc. Natl. Acad.
  • the promoter may be any as long as it functions in a host cell such as Escherichia coli.
  • P trp k £ promoter
  • P lac PL promoter motor
  • p promoter p promoter, etc.
  • the xylA promoter for expression in microorganisms belonging to the genus Bacillus [Appl.
  • a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases). That's right.
  • a transcription termination sequence is not always necessary! /, But it is preferable to place the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • Prokaryotes include Escherichia, Bacillus, Brevibacterium, Corvnebacterium, Microbacterium, Serratia, Pseudomonas, Agro, Agrob acterium genus, Alicyclobacillus genus, Anabena genus, Anacvstis genus, Arthrobacter genus, Azoto bacter genus, Chromatium ⁇ , Erwinia, Methvlobacterium, Phormidium, Rhodobact, RhodoDseudomonas ⁇ , RhodosDirillum ⁇
  • Small cattle belonging to the genus (Svnechoccus), Zvmomonas, etc. for example, Escherichia coli XL1—Blue, Escherichia 'Colli XL2-Blue, Escherichia coli DH 1, Escherichia • Coli DH5a, Escherichia coli 1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli K1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB 101, Escherichia coli ⁇ ⁇ 49, Escherichia colli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, Escherichia 522 , Escherichia's BL2 U Bacillus subtilis ATC C33712, Bacillus megaterium, Brevibacterium ammonia enes, Pu, Levinocterium Brevi bacterium immariophilum) ATCC 14068, Brevibacterium sac
  • Grop 'Phonoremis Arthrobacter globformis
  • Arthrobacter mvsorens Arthrobacter mvsorens
  • Arthrobacter hvdrocarbogiutamicus ineus Asurobakuta scratch.
  • Purotofuorumie Art hrobacter protophormiae ⁇ , Roh 'Surono ⁇ Guta. Roseo 7 Finasu (Arthrobacter rose
  • Streptomvces griseus Streptomices Streptomices Streptomvces lividans, Streptomices Streptomvces rameus Streptomice , Strep tomvces vinaceus, ⁇ ⁇ ⁇ "Mov-S. Mohi" squirrel (Zvmomonas mobilis, etc.).
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]
  • protoplast method Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394
  • electrovolution method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] and the like.
  • yeast When yeast is used as a host cell, for example, YEpl3 (ATC C37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15, etc. can be used as an expression vector.
  • Yogu example be used any one as long as it can function in yeast strains, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH flop port motor, gal 1 promoter, gal 10 promoter, Examples of the promoter include heat shock polypeptide promoter, MFa 1 promoter, and CUP 1 promoter.
  • yeast the genus Saccharomvces, Schizos accnaromyces J ⁇ , luvveromyces>! Examples include yeast strains belonging to the genus Tungosporon (Tnchospor genus, Schwanniomvces genus, Pichia genus, Candida genus), and specifically, Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae).
  • any method for introducing recombinant DNA any method can be used as long as it introduces DNA into yeast.
  • the electoral position method [Methods Enzymol., 194, 182 (1990)]
  • Examples include the eroplast method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)] and the lithium acetate method [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)].
  • examples of expression vectors include pcDNAI, pcD M8 (sold by Funakoshi), pAGE107 (Japanese Patent Laid-Open No. 3-22979), pAS3_3 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [J. Biochem, 101, 1307 (1987)], pAGE210, pAMo, p AMoA, etc. S can.
  • Any promoter can be used as long as it functions in animal cells.
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 early promoter or meta-mouth Examples include thionein promoter, retrowinore promoter, heat shock promoter, SRa promoter and the like.
  • an enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with a promoter.
  • Animal cells include mouse's myeloma cell, rat. Myeloma cell, mouse. Neuroidoma cell, Namalwa cell or Namalva KJM-1 cell, human fetal kidney cell, human leukemia cell. And African green monkey kidney cells, CHO cells that are Chinese hamster cells, and HBT5637 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-299).
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • the electopore position method [Cytotechnology, 3, 133 ( 1990)]
  • calcium phosphate method JP-A-2-27075
  • ribofusion method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]
  • Virology, 52, 456 (1973), etc. I can give you.
  • insect cells are used as the host, for example, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. rreeman and Shim ompany, New York (1992), Karen Kaoru * Proto-Corrolez. Proteins can be produced by the methods described in Molecular Biology, A Laboratory Manual, Bio / Technology, 6, 47 (1988).
  • a recombinant gene transfer vector and a baculovirus are co-introduced into insect cells to obtain a recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is further infected into insect cells to produce a protein. You can make it S.
  • gene transfer vectors used in the method include pVL1392, pVLl
  • the autographa californica nu clear polyhedrosis virus which is a virus that infects the night stealing insects, can be used with Autographa californica nu clear polyhedrosis virus; #2.
  • Insect cells include podocytes of Spodoptera frueiperda
  • Trichoplusia ni ovary cells and cultured cells derived from silkworm ovary.
  • Spodoptera frugibelda ovarian cells are Si, Si21 (Baculovirus "Expression” Vector Zur “Laboratory” manual), etc., Trichopulcia ovary cells are High 5, ⁇ - ⁇ -5 ⁇ 1-4 (Invitrogen) Examples of cultured cells derived from silkworm ovary such as Bombyx mori N4 can be given.
  • Examples of a method for co-introducing the above recombinant gene transfer vector and the above baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, the calcium phosphate method (JP-A-2-227075), the lipofuxion method [Proc. Natl. Acad Sci., USA, 84, 7413 (1987)].
  • expression vectors include Ti plus Examples include midos and tobacco mosaic virus vectors.
  • Any promoter can be used as long as it functions in plant cells. Examples thereof include the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, the rice actin 1 promoter, and the like.
  • host cells include plant cells such as tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, oilseed rape, anolephanolefa, rice, wheat and barley.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into plant cells.
  • a method using agrobacterium (ACTobacterium) JP 59-140885, JP SHO 60-70080, WO94 / 00977
  • the Elect Mouth Position Method Japanese Patent Publication 60-251887
  • the method using a particle gun Gene Gun
  • Patent No. 2606856 Japanese Patent No. 2517813
  • the transformant obtained by the above method 5 is cultured in a medium, the protein of the present invention is produced and accumulated in the culture, and the protein can be produced by collecting from the culture.
  • the host of the transformant for producing the protein of the present invention may be any of prokaryotes, yeasts, animal cells, insect cells, plant cells, etc., preferably bacteria, etc.
  • Examples include prokaryotes, more preferably microorganisms belonging to the genus Escherichia, more preferably microorganisms belonging to Escherichia coli.
  • the method of culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • the medium As a medium for cultivating transformants obtained using prokaryotes such as Escherichia coli or eukaryotes such as yeast as a host, the medium contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the organism, Any medium that can efficiently cultivate the transformant may be natural / synthetic medium! /.
  • the carbon source may be glucose, fructose, or the like as long as the organism can assimilate.
  • Sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, alcohols such as ethanol and propanol, and the like can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids such as ammonium phosphate, other nitrogenous compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corns. Chiplicers, casein hydrolysates, soybean meal and soybean meal hydrolysates, various fermented cells, and digested products thereof can be used.
  • inorganic salt monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • the culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is 15-40 ° C.
  • the culture time is usually 5-7 days.
  • pH is 3.0-1
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as needed during the culture.
  • an inducer When cultivating a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example! ⁇ When cultivating a microorganism transformed with an expression vector using a promoter, use isopropyl ⁇ D thiogalatatopyranoside, etc. When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an im promoter, use indole acrylic acid, etc. May be added to the medium.
  • a medium for culturing a transformant obtained by using animal cells as a host RPMI1640 medium.
  • Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)] Eagle's MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Pro Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)]
  • a medium supplemented with fetal serum or the like can be used.
  • the culture is usually carried out for 1 to 7 days under conditions of pH 6 to 8, 25 to 40 ° C, 5% CO and the like.
  • antibiotics such as kanamycin, penicillin, streptomycin, etc. may be added to the medium as needed during culture! / ⁇ .
  • Cultivation is usually carried out under conditions of pH 6-7, 25-30 ° C, etc. for 1-5 days.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium as needed during the culture.
  • a transformant obtained using a plant cell as a host can be cultured as a cell or after being differentiated into a plant cell or organ.
  • a medium for cultivating the transformant commonly used Murashige & 'Stag (MS) medium, White medium, or plant hormones such as auxin and cytokinin were added to these mediums. You can use medium etc.
  • the culture is usually carried out under conditions of pH 5-9 and 20-40 ° C for 3-60 days.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium as needed during culture.
  • the method for producing the protein of the present invention includes a method for producing in the host cell, a method for secreting it outside the host cell, or a method for producing it on the outer membrane of the host cell, and the protein to be produced according to the selected method.
  • the structure of can be changed.
  • the protein can be actively secreted outside the host cell.
  • the protein of the present invention is produced by adding a signal peptide in front of the protein containing the active site of the protein of the present invention. It can be actively secreted outside the main cell.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • an animal individual transgenic non-human animal or plant individual (transgenic plant) into which the gene has been introduced is created. It is also possible to produce the protein of the present invention using these individuals.
  • the transformant producing the protein of the present invention is an animal individual or a plant individual, the protein is produced or accumulated by breeding or cultivating according to a usual method, and the protein is produced from the animal individual or plant individual. By collecting the protein, the protein can be produced.
  • Examples of methods for producing the protein of the present invention using an animal individual include known methods [A m. J. Clin. Nutr., 63, 639S (1996), Am. J. Clin. Nutr., 63, 627S (1996), Bio / Technology, 9, 830 (1991)], and a method for producing the protein of the present invention in an animal constructed by introducing a gene.
  • the protein of the present invention is produced and accumulated in the animal, and the The ability to produce the protein can be obtained by collecting the protein from the animal.
  • the place for producing and accumulating the protein in the animal include milk of the animal (Japanese Patent Laid-Open No. 63-309192), eggs and the like.
  • the plug motor used in this case any force that can function in animals can be used.
  • a promoter, a whey acid degeneration protein promoter, and the like are preferably used.
  • the protein of the present invention produced using the transformant producing the protein of the present invention is simply used.
  • As a method for separation and purification usual enzyme isolation and purification methods can be used.
  • the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, a French press, a manton. Crush the cells with a Gaurin homogenizer, dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation using an organic solvent, etc.
  • anion-exchange chromatography using resin such as dimethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical), positive using resin such as SS-marked harose FF (manufactured by Pharmacia) Ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing, etc.
  • a purified sample can be obtained by using a single method or a combination of these methods such as electrophoresis.
  • the cells are similarly collected, crushed, and centrifuged to obtain a conventional method from a precipitate fraction obtained by centrifugation. After recovering the protein, the insoluble matter of the protein is solubilized with a protein denaturant.
  • the solubilized solution is diluted with a solution containing no protein denaturing agent or a dilute solution so that the concentration of the protein denaturing agent does not denature the protein, or dialyzed to form the protein into a normal three-dimensional structure.
  • a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the protein of the present invention or a derivative such as a sugar modification product thereof is secreted extracellularly
  • the protein or a derivative such as a sugar adduct thereof can be recovered in the culture supernatant. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation as described above, and a purified sample is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. You can get power S.
  • Examples of the protein thus obtained include a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the protein of the present invention is produced as a fusion protein with another protein and fused. It can also be purified by affinity chromatography using a substance having an affinity for quality. For example, the method described in Law et al. [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], JP-A-5-336963, WO94 / 23021 According to the method, the protein of the present invention can be produced as a fusion protein with protein A and purified by affinity chromatography using immunoglobulin G.
  • affinity chromatography using the anti-Flag antibody produced as a fusion protein with the Flag peptide [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)]
  • affinity mouth matrix using a metal coordination resin that is produced as a fusion protein with polyhistidine and has a high affinity for polyhistidine it can.
  • affinity chromatography using an antibody against the protein itself can also be purified by affinity chromatography using an antibody against the protein itself.
  • the protein of the present invention is produced by a chemical synthesis method such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or tBoc method (tbutyloxycarbonyl method).
  • a chemical synthesis method such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or tBoc method (tbutyloxycarbonyl method).
  • Fmoc method fluorenylmethyloxycarbonyl method
  • tBoc method tbutyloxycarbonyl method
  • chemical synthesis using peptide synthesizers such as Advanced ChemTech, Monokino * enoremer Sat, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Syntheceil-Vega, Applied Biosystems, Shimadzu Corporation, etc. You can also.
  • a culture of the microorganism or transformant described above or a processed product of the culture, or the protein of the present invention described above and one or more amino acids are present in an aqueous medium to produce a dipeptide in the medium.
  • the dipeptide can be produced by accumulating and collecting the dipeptide from the medium.
  • one or two amino acids used as a substrate include L-amino acid, Gly and / 3-alanine (/ 3-A la) As long as it is an amino acid selected from a powerful group, a combination of les and misplaced amino acids may be used.
  • L amino acids examples include L-Ala, L-Gln, L-Glu, L_Val, L-Leu, L—Ile, L_Pro, L_Phe, L_Trp, L—Met, L—Ser, L_Thr, L_Cys, L_Asn, L_Tyr , L_L
  • One or two amino acids selected from ys, L-Arg, L_His, L-Asp, Gly and / 3-Ala can be mentioned.
  • Preferred amino acids used in the above production method are one amino acid selected from L-Arg, L-Lys and L-His and an amino acid selected from the group consisting of L-amino acids, Gly and / 3-Ala.
  • more preferred amino acids are L-Arg and L-Ala, L_Gln, L_Glu, L_Va 1, L—Leu, L—Ile, L—Pro, L—Phe, L—Trp, L—Met, L — Ser, L—Thr, L—Cys, L—Asn, L_Lys, L-Arg, L-His, L_Asp and Gly combinations and L-Lysl species only, L_Arg and L-Ala as particularly preferred amino acids And a combination with one amino acid selected from L-Arg, L_Ser, L-His, L_Asn and Gly.
  • the protein of the present invention is added in an amount of 0.01 to 100 mg, preferably 0.1 to 10 mg per mg of amino acid used as a substrate.
  • the amino acid used as the substrate is added to the aqueous medium at the beginning or during the reaction so as to have a concentration of 0.1 to 500 g / L, preferably 0.2 to 200 g / L.
  • ATP can be used as an energy source, and ATP is used at a concentration of 0.5 mmol to 10 mol / L.
  • the aqueous medium used in the above production method may be an aqueous medium of any component and composition as long as it does not inhibit the dipeptide formation reaction.
  • water, phosphate, carbonate examples include buffers such as acetates, borates, citrates and tris. It also contains alcohols such as methanol and ethanol, esters such as ethyl acetate, ketones such as acetone, and amides such as acetoamide.
  • the dipeptide formation reaction is carried out in an aqueous medium at pH 5 to ll, preferably pH 6 to 10, 20 to 50 ° C, preferably 25 to 45 ° C, for 2 to 150 hours, preferably 6 to 120 hours. .
  • Dipeptides produced by the above method include L-Ala, L-Gln, L-Glu, L_Val, L-Leu, L-lie, L—Pro, L—Phe, L—Trp, L—Met, L—Ser 1 or 2 amino acids selected from L-Thr, L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, Gly and / 3-Ala Dipeptides linked by peptide bonds, preferably one amino acid selected from L_Arg, L-Lys, L_His, and L-amino acid, amino acid selected from the group consisting of Gly and / 3-Ala Dipeptide in which one kind of amino acid is linked by a peptide bond, more preferably L-Arg and L-A1 a, L-Gln, L_Glu, L_Val, L-Leu, L_Ile, L_Pro, L_Phe, L-Trp, L-Met,
  • R 1 is L-Arg
  • R 2 is one amino acid selected from L-Ala, L_Arg, L_Ser and L_His). Can give and power S.
  • the culture obtained by culturing the microorganism or transformant by the culture method described above can be used.
  • the treated product of the culture of the microorganism or transformant includes a concentrate of the culture, a dried product of the culture, a cell obtained by centrifuging or filtering the culture,
  • an enzyme source such as a dried product, a freeze-dried product of the cell, a surfactant-treated product of the cell, a solvent-treated product of the cell, an enzyme-treated product of the cell, and an immobilized product of the cell Examples include those containing viable cells that retain the same function as the culture.
  • the amount of the enzyme source varies depending on the specific activity of the enzyme source, etc. For example, 5 to 1000 mg, preferably 10 to 400 mg, is added as wet cell weight per 1 mg of amino acid used as a substrate.
  • the amino acid used as the substrate can be added to the aqueous medium in the same manner as in the above (1).
  • ATP can be present in an aqueous medium and used as an energy source. And force S.
  • the above medium (1) can be used.
  • the culture supernatant of the microorganism or transformant culture used for the enzyme source can also be used as the aqueous medium.
  • a surfactant or an organic solvent may be added to the aqueous medium as necessary.
  • Surfactants include nonionic surfactants such as polyoxyethylene 'octadecylamine (eg, Niimine S_215, manufactured by NOF Corporation), cetyltrimethyl ammonium bromide, and alkyldimethyl benzyl ammonium chloride (eg, cation F2-40E).
  • Cationic surfactants such as Nippon Oil & Fats Co., Ltd., anionic surfactants such as lauroyl 'zalcosinate, and tertiary amines such as alkyldimethylamine (eg, tertiary amine FB, manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) Any one can be used as long as it promotes the production of a galactose-containing complex carbohydrate.
  • the surfactant is usually used at a concentration of 0.1 to 50 g / 1.
  • the organic solvent include xylene, toluene, aliphatic alcohol, acetone, ethyl acetate and the like, and are usually used at a concentration of 0.1 to 50 ml / 1.
  • reaction conditions for the dipeptide production reaction may be the same as in (1) above.
  • the dipeptide produced and accumulated in the aqueous medium can be collected by a normal method using activated carbon, ion exchange resin or the like, or extraction, crystallization, thinning with an organic solvent, etc. It can be carried out by layer chromatography, high performance liquid chromatography or the like.
  • DNA having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 3 and 4 (hereinafter referred to as "primer A” and “primer B”, respectively) using an 8905 DNA synthesizer manufactured by Persive Biosystems. Synthesized).
  • PCR was performed using the above-mentioned primer A and primer B and the chromosomal DNA of Bacillus subtilis ATCC6633 as the saddle type.
  • PCR consists of 0.50pg total DNA, 0.3 ⁇ mol / L each primer, 1 unit KOD plus DNA polymerase (Toyobo), 5 HL KOD plus DNA polymerase X 10 buffer (Toyobo), Prepare 50 L of each reaction solution containing 200 mol / L of dNTP (dATP, dGTP, dCTP and dTTP), heat at 94 ° C for 120 seconds, then at 94 ° C for 15 seconds and at 50 ° C for 30 seconds The process was repeated 25 times at 68 ° C for 120 seconds and further heated at 68 ° C for 5 minutes.
  • dNTP dATP, dGTP, dCTP and dTTP
  • reaction solution 1.46 a L, 2.5 mM dGTP, 5 mM dithiothreitol (DTT), 1 u nit T4 DNA polymerase, 2 ⁇ L X4 buffer for T4 DNA polymerase
  • reaction solution 1.46 a L, 2.5 mM dGTP, 5 mM dithiothreitol (DTT), 1 u nit T4 DNA polymerase, 2 ⁇ L X4 buffer for T4 DNA polymerase
  • Escherichia coli JM109 strain was transformed with the reaction solution by the heat shock method, and the transformant was applied to an LB agar medium containing 25 g / mL kanamycin, and then the mixture was applied at 30 ° C. After overnight culture, transformants were selected.
  • the transformed strain was obtained by culturing overnight in LB medium containing 20 g / ml kanamycin. Plasmids were prepared from the culture broth by alkaline SDS method (Molecular 'Cloning 3rd edition).
  • pBsRzcA was used to transform Escherichia coli Rosetta (DE3) strain (manufactured by Novagen) by a method using calcium ions, and the transformant was converted to 25 g / mL kanamycin and 25 g / mL chloramphenicol. After coating on a LB agar medium containing, a transformant was selected by incubation at 30 ° C.
  • the transformed strain was named Escherichia coli Rosetta (DE3) / pBsRzcA.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalatatopyranoside
  • a protein to which a His tag is added using a HisTrap (His-tagged protein purification kit, manufactured by Amersham) from a supernatant obtained by crushing the wet cells by sonication and then centrifuging. was purified.
  • the purified His-tagged protein obtained in Example 2 was treated with 0.1 mg / mL, 50 mmol / L Tris-HCl buffer.
  • Impulse ( ⁇ 8 ⁇ 0), 12.5mmol / L magnesium sulfate, 12.5mmol / L ATP, 12.5mmol / L L-arginine, 12.5mmol / L L-alanine (L-Ala), L-glutamine ( L-Gin), L-glutamic acid (L-Glu), L-valine (L-Val), L-leucine (L_Leu), L-isoleucine (L_Ile), L-proline (L_Pro), L-phenol Luaranin (L_Phe), L-tryptophan (L_Trp), L-methionine (L-Met), L-serine (L-Ser), L-threonine (L_Thr), L-cystine (L_Cys), L-asparagine ( L_Asn), L
  • Example 2 The purified His-tagged protein obtained in Example 2 was 0.1 mg / mL, 50 mmol / L Tris-HCl buffer (pH 8.0), 12.5 mmol / L magnesium sulfate, 12.5 mmol / L ATP, A reaction solution consisting of 25 mmol / L L-lysine was prepared and reacted at 30 ° C for 17 hours.
  • the amount of phosphoric acid released in the reaction solution was quantified using Determiner L IP (manufactured by Kyowa Medettas), MALDI-TOFMS (Matrix Assisted Laser Oesorption / Ionization-Time of r light Mass Spectrometry analysis, The product was identified by three methods of NMR (Nuclear Magnetic Resonance) analysis.
  • the protein of the present invention has been shown to have an activity of producing various dipeptides by binding one or two amino acids by peptide bonds.
  • a protein having an activity of synthesizing a dipeptide can be produced, and the dipeptide can be produced using the protein or a transformant or a microorganism having an ability to produce the protein.

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Description

明 細 書
ジペプチドの製造法
技術分野
[0001] 本発明は、ジペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードする DNA、該 DNAを含有する組換え体 DNA、該組換え体 DNAで形質転換された形質転換体、 ジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質 を用いたジペプチドの製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質を生産する微生 物または形質転換体を用いたジペプチドの製造法に関する。
背景技術
[0002] L-アミノ酸の α位カルボキシル基でのペプチド結合形成活性によるジペプチド生 成が知られているのはバチルス属に属する微生物由来のジペプチド抗生物質である バシリシン合成酵素のみである。バシリシン合成酵素は、バシリシン (L-ァラニルー L- アンチ力プシン、 L-Ala - L-anticapsin)及び L-ァラニル L-ァラニン（L- Ala - L-Ala )を合成する活性を有することが知られていた (非特許文献 1および 2参照）が、最近、 本酵素は多様な組み合わせの同一または異なる遊離のアミノ酸から種々のジぺプチ ドを生成する活性を有することが報告された (特許文献 1参照）。
[0003] しかしながら、上記酵素の基質特異性に起因し、生成効率が十分でないジぺプチ ドもあるため、該酵素とは基質特異性が異なる新たなジペプチド合成酵素が求められ ている。
バチルス'サチルス ATCC6633がペプチド抗菌物質であるリゾクチシン A(L-Arg-L- 2_匪 mo_5_phospnono_«5_cis_pentenoic acid、 L_Arg_L_APPA)、 ゾクチンノ B(L_Va ト L- Arg-L- APPA)、リゾクチシン C(L-Ile-L- Arg-L- APPA)、リゾクチシン D(L- Leu_L- Arg-L-APPA)を生産することは知られている（非特許文献 3参照）。し力もながら、生 合成の経路、生合成に関わる蛋白質、生合成に関わる遺伝子は知られていない。 特許文献 1：国際公開第 2004/058960号パンフレット
非特許文献 1 :J. Ind. Microbiol., 2， 201-208 (1987)
非特許文献 2 : Enzyme. Microbial. Technol., 29， 400-406 (2001) 非特許文献 3 : Arch. Micromiol., 153， 276-281 (1990)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明の目的は、ジペプチド合成活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードする DN A、該 DNAを含有する組換え体 DNA、該組換え体 DNAで形質転換された形質転 換体、該形質転換体等を用いたジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、該 ジペプチド合成活性を有する蛋白質を用いたジペプチドの製造法、および該ジぺプ チド合成活性を有する蛋白質を生産する形質転換体または微生物の培養物等を酵 素源に用いたジペプチドの製造法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明は、以下の（1)〜（； 10)に関する。
(1) 以下の [1]〜[3]のいずれかに記載の蛋白質。
[ 1 ]配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換ま たは付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
[3]配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列 からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
(2) 以下の [1]〜[3]のいずれかに記載の DNA。
[0006] [1]上記（1)の蛋白質をコードする DNA
[2]配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA
[3]配列番号 2で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジ ェントな条件下でハイブリダィズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコード する DNA
(3) 上記（2)の DNAを含有する組換え体 DNA。
(4) 上記（3)の組換え体 DNAを有する形質転換体。
(5) 形質転換体が、微生物を宿主として得られる形質転換体である上記 (4)の形質 転換体。
(6) 微生物が、ェシエリヒア (Escherichia.)属に属する微生物である上記（5)の形質 転換体。
(7) 上記（1)の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中 に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する上記（1)の蛋白質 の製造法。
(8) 上記（1)の蛋白質を生産する能力を有する微生物が上記 (4)〜（6)の!/、ずれ 力、 1つの形質転換体である、上記（7)の製造法。
(9) 上記（1)の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは該培養物 の処理物、または上記（1)の蛋白質と 1種以上のアミノ酸とを水性媒体中に存在せし め、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取するジ ペプチドの製造法。
(10) 上記（1)の蛋白質を生産する能力を有する微生物が上記 (4)〜（6)の!/、ずれ 力、 1つの形質転換体である、上記（9)の製造法。
発明の効果
[0007] 本発明によりジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を製造することができ、該 蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する形質転換体または微生物を用いて ジペプチドを製造することができる。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]図 1はプラスミド pBsRzcAの構築過程を示す図である。
符号の説明
[0009] 図中の PIIは T7プロモーター遺伝子、 His-tagはヒスチジンタグ (His-tag)配列を表 す。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 1.本発明の蛋白質
本発明の蛋白質としては、
[ 1 ]配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
[2]配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換また は付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、およ び
[3]配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
をあげることができる。
[0011] 上記において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からな り、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質は、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second dition, し old spring Haroor Laboratory Press (1989) (_^ 、 モ キ ユラ一.クローニング第 2版と略す)、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wi ley & Sons (1987-1997) (以下、カレント'プロトコールズ'イン'モレキュラー 'バイオ口 ジ一と略す）、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 P roc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用い て、例えば配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNAに部 位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
[0012] 欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異 的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、 1個か ら数十個、好ましくは;!〜 20個、より好ましくは 1〜； 10個、さらに好ましくは 1〜5個で ある。
配列番号 1で表されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付 カロされたとは、同一配列中の任意の位置において、 1または複数のアミノ酸が欠失、 置換または付加されて!/、てもよ!/、。
[0013] また、アミノ酸の欠失、置換または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配 列番号 1で表されるアミノ酸配列の N末端側および C末端側の 1〜数個のアミノ酸を あげること力 Sでさる。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよぐ置換または付加されるアミノ酸は天然 型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、 Lーァラニン、 Lーァスパラギン 、 Lーァスパラギン酸、 L—アルギニン、 L—グルタミン、 L—グルタミン酸、グリシン、 L ヒスチジン、 L イソロイシン、 L一口イシン、 L リジン、 L メチォニン、 L フエ二 ノレァラニン、 L—プロリン、 Lーセリン、 Lースレオニン、 L—トリプトファン、 Lーチロシン
[0014] 以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互 に置換可能である。
A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルパリン、ァラニン、 2-アミノブ タン酸、メチォニン、 0-メチルセリン、 t-ブチルグリシン、 t-ブチルァラニン、シクロへ キシノレァラニン
B群：ァスパラギン酸、グルタミン酸、イソァスパラギン酸、イソグルタミン酸、 2-ァミノ アジピン酸、 2-アミノスべリン酸
C群：ァスパラギン、グルタミン
D群：リジン、アルギニン、オル二チン、 2,4-ジァミノブタン酸、 2,3-ジァミノプロピオ ン酸
E群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、スレオニン、ホモセリン
G群：フエ二ルァラニン、チロシン
また、本発明の蛋白質がジペプチド合成活性を有するためには、配列番号 1で表さ れるアミノ酸配列との相同性が 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 94% 以上、さらに好ましくは 98%以上、特に好ましくは 99%以上の相同性を有しているこ とが望ましい。
[0015] アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAS T[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]や FASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズム BLASTに基づいて、 BLAST Nや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている [J. Mol. Biol., 215, 403(1990)]。
BLASTに基づいて BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例 えば Score = 100、 wordlength= 12とする。また、 BLASTに基づいて BLASTXによって アミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えば score = 50、 wordlength = 3と トパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である (http：〃 WW w.ncbi.nlm.nih.gov.)
[0016] また、配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上、好ましくは 90%以上、より好 ましくは 94%以上、さらに好ましくは 98%以上、特に好ましくは 99%以上の相同性を 有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質もまた本発 明の蛋白質である。アミノ酸配列の相同性は、上記したように BLASTや FASTAを用い て決定すること力できる。
本発明の蛋白質が、ジペプチド合成活性を有する蛋白質であることを確認する手 段としては、例えば DNA組換え法を用いて本発明の蛋白質を発現する形質転換体 を作製し、該形質転換体を用いて本発明の蛋白質を製造した後、本発明の蛋白質、 1種以上のアミノ酸、好ましくは L-アミノ酸およびグリシンから選ばれる 2種のアミノ酸、 および ATPを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄積 するか否かを HPLC等により分析する方法をあげることができる。
2.本発明の DNA
本発明の DNAとしては、
[1]上記 1の [1]〜[3]の本発明の蛋白質をコードする DNA、
[2]配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA、および
[3]配列番号 2で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコード する DNA、
をあげることができる。
[0017] ここで!/、う「ノ、イブリダィズする」とは、特定の塩基配列を有する DNAまたは該 DNA の一部に DNAがハイブリダィズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を 有する DNAまたは該 DNAの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解 析のプローブとして有用であるか、または PCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーと して使用できる長さの DNAであってもよい。ノーザンまたはサザンブロット解析のプロ ーブとして用いる DNAとしては、少なくとも 100塩基以上、好ましくは 200塩基以上、 より好ましくは 500塩基以上の DNAをあげることができ、オリゴヌクレオチドプライマ 一として用いられる DNAとしては少なくとも 10塩基以上、好ましくは 15塩基以上の D NAをあげることができる。
[0018] DNAのハイブリダィゼーシヨン実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー
.クローニング第 2版、第 3版（2001年）、 Methods for General and Molecular Bacteri olgy, ASM Press (1994)、 Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に 記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダィゼーシヨンの条件を決 定し、実験を fiうこと力できる。
[0019] 上記のストリンジェントな条件とは、例えば DNAを固定化したフィルターとプローブ DNAとを 50%ホルムアミド、 5 X SSC (750mMの塩化ナトリウム、 75mMのクェン酸ナト リウム）、 50mMのリン酸ナトリウム（ρΗ7·6)、 5 Xデンハルト溶液、 10%の硫酸デキスト ラン、および 20 g/Lの変性させたサケ精子 DNAを含む溶液中で 42°Cでー晚、イン キュペートした後、例えば約 65°Cの 0.2 X SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件 をあげることができる力 より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジ ヱンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ス トリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジ ェント条件としては、例ぇば6 X SSCE (20 X SSCEは、 3mol/Lの塩化ナトリウム、 0.2mol /Lのリン酸二水素ナトリウム、 0.02mol/Lの EDTA、 ρΗ7·4)、 0.5%の SDS、 30%のホル ムアミド、 100 g/Lの変性させたサケ精子 DNAを含む溶液中で、 37°Cでー晚インキ ュペートした後、 50°Cの 1 X SSC、 0.1 %SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげること 力 Sできる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント 条件にお!/、て、高塩濃度（例えば 5 X SSC)の溶液を用いてハイブリダィゼーシヨンを 行った後、洗浄する条件をあげること力 Sできる。
[0020] ハイブリダィゼーシヨン実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試 薬を添加、または変更することにより、上記した様々な条件を設定することもできる。 上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダィゼーショ ン条件の変更を伴ってもょレ、。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダィズ可能な DNAとしては、例えば上 記した BLASTおよび FASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計 算したときに、上記した [1]〜[3]いずれかの DNAの塩基配列と少なくとも 80%以上 、好ましくは 90%以上、より好ましくは 94%以上、さらに好ましくは 98%以上、特に好 ましくは 99%以上の相同性を有する DNAをあげることができる。
[0021] 塩基配列の相同性は、上記した BLASTまたは FASTA等のプログラムを用いて決定 すること力 Sでさる。
上記した DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA力 S、ジペプチド の合成活性を有する蛋白質をコードする DNAであることは、該 DNAを発現する組 換え体 DNAを作製し、該組換え体 DNAを宿主細胞に導入して得られる微生物を培 養して得られる培養物から該蛋白質を精製し、該精製蛋白質を酵素源に用いて、該 酵素源、並びに 1種以上のアミノ酸、好ましくは L-アミノ酸およびグリシンから選ばれ る 2種のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドが生成、蓄 積するか否かを HPLC等により分析する方法によって確認することができる。
3.本発明の製造法に用いられる微生物および形質転換体
本発明の製造法に用いられる微生物および形質転換体としては、本発明の蛋白質 を生産する能力を有する微生物および形質転換体であれば特に限定されないが、 該微生物としては、好ましくはバチルス (M )属に属する微生物、好ましくはバチ ルス .サチルス (Bacillus subtilis)に属する微生物、より好ましくはバチルス .サチルス ATCC6633をあげること力 Sでき、該形質転換体としては、本発明の蛋白質をコードす る DNAで形質転換された形質転換体をあげることができる。
[0022] 本発明の蛋白質をコードする DNAで形質転換された形質転換体としては、上記 2 の DNAを含む組換え体 DNAを用い、宿主細胞を公知の方法で形質転換して得ら れる形質転換体をあげることができ、宿主細胞としては、細菌等の原核生物、酵母、 動物細胞、昆虫細胞および植物細胞、好ましくは細菌等の原核生物、より好ましくは ェシエリヒア (Escherichia)属に属する微生物をあげるこ ができる。
4.本発明の DNAの調製
本発明の DNAは、例えば、配列番号 2で表される塩基配列に基づき設計すること ができるプローブを用い、バチルス（Bacillus)属に属する微生物、好ましくはバチルス 'サチルス（Bacillus subtilis)に属する微生物、より好ましくはバチルス.サチルス ATC C6633の染色体 DNAライブラリーに対するサザンハイブリダィゼーシヨンにより、また は配列番号 2で表される塩基配列に基づき設計することができるプライマー DNAを用 いた微生物、好ましくはバチルス属に属する微生物、より好ましくはバチルス ·サチル スに属する微生物、さらに好ましくはバチルス.サチルス ATCC6633の染色体 DNAを 铸型とした PCR[PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得すること力 Sできる
〇
[0023] また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号 1で表されるアミノ酸配列 をコードする DNAの塩基配列と 85%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95 %以上、さらに好ましくは 98%以上、特に好ましくは 99%以上の相同性を有する配 歹 IJを検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物 の染色体 DNA、 cDNAライブラリ一等から上記した方法により本発明の DNA、また は本発明の製造法に用いられる DNAを取得することもできる。
[0024] 取得した DNAをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりべク ターに組み込み、得られた組換え体 DNAを宿主細胞に導入した後、通常用いられ る塩基配列解析方法、例えばジデォキシ法 [Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 74, 5463 ( 1977)]あるいは ABI3700DNAアナライザー（アプライド 'バイオシステムズ社製）等の 塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該 DNAの塩基配列を決定すること ができる。
[0025] 塩基配列を決定した結果、取得された DNAが部分長であった場合は、該部分長 D NAをプローブに用いた、染色体 DNAライブラリーに対するサザンハイブリダィゼー シヨン法等により、全長 DNAを取得することができる。
更に、決定された DNAの塩基配列に基づいて、パーセプティブ'バイオシステムズ 社製 8905型 DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とする DNAを調 製することあでさる。
[0026] 上記のようにして取得される DNAとして、例えば、配列番号 2で表される塩基配列 を有する DNAをあげることができる。
本発明の DNAを組み込むベクターとしては、 pBluescriptll KS(+) (ストラタジーン社 製）、 pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、 pCR— Script Amp SK(+) (ストラ タジーン社製）、 pT7Blue (ノバジヱン社製）、 pCR II (インビトロジェン社製）および pCR -TRAP (ジーンノヽンター社製）などをあげることができる。
[0027] 宿主細胞としては、ェシエリヒア属に属する微生物などをあげることができる。ェシェ リヒア属に属する微生物としては、例えば、ェシエリヒア 'コリ（Escherichia coli) XLl-B lue、ェシエリヒア'コリ XL2-Blue、ェシエリヒア'コリ DH1、ェシエリヒア'コリ MC1000、 ェシエリヒア'コリ ATCC 12435、ェシエリヒア'コリ W1485、ェシエリヒア'コリ JM109、 ェシエリヒア'コリ HB101、ェシエリヒア'コリ Νο·49、ェシエリヒア'コリ W3110、ェシエリ ヒア.コリ NY49、ェシエリヒア'コリ MP347、ェシエリヒア'コリ NM522、ェシエリヒア'コリ BL21、ェシエリヒア'コリ ME8415等をあげることができる。
[0028] 組換え体 DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Ac ad. ScL, USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭 63-248394)、エレクトロボレ ーシヨン法 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の形質転換体としては、例えば配列番号 2で表さ れる塩基配列を有する DNAを含有する組換え体 DNAを保有する微生物であるェ シエリヒア'コリ Rosetta (DE3)/ pBsRzcAをあげることカできる。
5.本発明の製造法に用いられる形質転換体および微生物の製造法
本発明の DNAをもとにして、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含 む適当な長さの DNA断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列 を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の 生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
[0029] 該 DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に揷入することにより、 組換え体 DNAを作製する。
該組換え体 DNAを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することにより、本 発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌等の原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞 等、 目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
[0030] 発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中へ の組込が可能で、本発明の DNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているも のが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の DNAを有する組換 え体 DNAは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リポソ一 ム結合配列、本発明の DNA、転写終結配列より構成された組換え体 DNAであるこ とが好まし!/、。プロモーターを制御する遺伝子が含まれて!/、てもよ!/、。
[0031] 発現ベクターとしては、 pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2、 pHelixl (いずれもロシュ'ダイァ グノステイクス社製）、 pKK233_2 (アマシャム'フアルマシア'バイオテク社製）、 pSE280 (インビトロジェン社製）、 pGEMEX-Ι (プロメガ社製）、 pQE-8 (キアゲン社製）、 pET- 3 (ノバジェン社製）、 1丫？10 (特開昭58-110600)、 1丫？200[八8 Biol. Chem., 48,6 69 (1984)]、 pLSAl[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、 pGELl[Proc. Natl. Acad.Sc i.， USA, 82, 4306 (1985)]、 pBluescriptll SK )、 pBluescript II KS (-) (ストラタジーン 社製）、 pTrS30 [ェシエリヒア'コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、 TrS32 [ェシエリヒア'コリ JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、 PAC31 (W098/12343 )、 UC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、 pSTV28(タカラバイオ社製)、 pUC118 (タカラバィ ォ社製）、 pPAl (特開昭 63-233798)等を例示することができる。
[0032] プロモーターとしては、ェシエリヒア'コリ等の宿主細胞中で機能するものであれば いかなるものでもよい。例えば、 toプロモーター（P trp )、k£プロモーター（P lac )、 P Lプ 口モーター、 pプロモーター、 p プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来する
R SE
プロモーター、 SPOlプロモーター、 SP02プロモーター、 penPプロモーター等をあ げること力できる。また P を 2つ直列させたプロモーター、 tacプロモーター、 lacT7プ
trp
口モーター、 let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用 いること力 sでさる。
[0033] さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるための xylAプロモーター [Appl.
Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)Ίゃコリネバクテリゥム（Corvnebacterium) 属に属する微生物中で発現させるための P54-6プロモーター [Appl. Microbiol. Biote chnol., 53, 674-679 (2000)]なども用いることができる。
また、リボソーム結合配列であるシャインーダルガノ（Shine-Dalgarno)配列と開始コ ドンとの間を適当な距離 (例えば 6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ま しい。
本発明の DNAを発現ベクターに結合させた組換え体 DNAにおいては、転写終結 配列は必ずしも必要ではな!/、が、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置すること が好ましい。
このような組換え体 DNAとしては、例えば pBsRzcAをあげることができる。
原核生物としては、ェシエリヒア属、バチルス属、ブレビパクテリゥム（Brevibacterium )属、コリネノ クテリゥム (Corvnebacterium)属、ミクロバクテリゥム（Microbacterium)属 、セラチア（Serratia)属、シユードモナス（Pseudomonas)属、ァグロパクテリゥム（Agrob acterium)属、アリシクロバチルス（Alicvclobacillus)属、アナべナ（Anabena)属、アナ システィス (Anacvstis)属、アースロバクタ一 (Arthrobacter)属、ァゾトパクター (Azoto bacter)属、クロマチゥム（Chromatium)鼠、エルビニァ（Erwinia)属、メチロバクテリウ ム (Methvlobacterium)属、フオノレミディウム (Phormidium)属、口ドノくクタ一 (Rhodobact 属、ロドシユードモナス（RhodoDseudomonas)鼠、ロドスピリゥム（RhodosDirillum)鼠
(Svnechoccus)属、ザィモモナス（Zvmomonas)属等に属する微牛物、例えば、ェシェ リヒア.コリ XL1— Blue、ェシエリヒア 'コリ XL2-Blue、ェシエリヒア 'コリ DH 1、ェシエリヒア •コリ DH5 a、ェシエリヒア'コリ MC 1000、ェシエリヒア'コリ KY3276、ェシエリヒア'コリ W1485、ェシエリヒア'コリ JM109、ェシエリヒア'コリ HB 101、ェシエリヒア'コリ Νο·49、 ェシエリヒア 'コリ W3110、ェシエリヒア 'コリ NY49、ェシエリヒア 'コリ MP347、ェシエリ ヒア'コリ NM522、ェシエリヒア'コリ BL2 Uバチルス ·サチリス（Bacillus subtilis) ATC C33712、バチルス 'メガテリゥム（Bacillus megaterium)、ブレビパクテリゥム ·アンモニ ァグ不ス (Brevibacterium ammonia enes)、プ、レビノ クテリゥム 'イマリオフイノレム (Brevi bacterium immariophilum) ATCC 14068、ブレビバクテリゥム ·サッカロリティカム（Brevi bacterium saccharolvticum) ATCC 14066、ブレビバクテリゥム.フラバム（Brevibacteri urn flavum) ATCC 14067、ブレビバクテリウム-ラクトフアーメンタム（Brevibacterium lac tofermentum) ATCC 13869、コリネノ クテリゥム ·グノレタミカム（Corvnebacterium gluta micum) ATCC 13032、コリネバタテリゥム.グルタミカム ATCC 14297、コリネバクテリウ ammoniaphilum) ATCC15354、セラチ 、セラチア'フォンチコラ (Serratia fonticola)、セラチア · セラチア · marcesce ns)、シユードモナス'エスピー（Pseudomonas sp.) D_0110、ァグロバタテリゥム 'ラジ オノくクタ一 (A robacterium radiobacter)、ァグロノ クテリウム ·リンシーンズ (Agrobact erium rhizoggnes)、ァクロノヽクァリウム'ノレビ（ARrobacterium rubリ、アナべナ'シリン 力 (Anabaena cylindrica)、アナべナ · 才ノレム (Anabaena doliolum)、アナべナ-
-aguaej、アースロノくクタ一'オーレッセンス (Arthrobacter, aurescens ,)、ァー ァー
グロプ'フォノレミス（Arthrobacter globformis)、アースロバクタ一 'ヒドロカーボグノレタミ力 ス (Arthrobacter hvdrocarbogiutamicus ■、 ノ'ースロノ、グター' :^ソレノス (Arthrobacter mvsorens)、アースロノ クタ一 ·ニコチアナ (Arthrobacter nicotianae)、アースロノくクタ ineus) ,アースロバクタ一.プロトフオルミエ（Art hrobacter protophormiae ■、 ノ'ースロノヽグター.ロセォ 7フィナス (Arthrobacter rose
Figure imgf000014_0001
m buderi)、クロマチゥム )、クロマチゥム.ビノサム（Ch. romatium vinosum)■、クロマチウム'ワー^ン ( Chromatium warmingii)■、クロマテゥム. フノレビアタティレ (Chromatium fluviatile)、エノレビユア.ウレドノくラ (Erwinia uredovora) 、エノレビユア ·力ロトノ ラ（Erwinia carotovora)、エノレビユア ·ァナス (Erwinia, ananas)、 エノレビユア .ヘリコラ（Erwinia herbicola)、エノレビ二ァ'ノ ンクタタ (Erwinia punctata)、 エノレビユア .テレウス（Erwinia terreus)、メチロバクテリウム ·口デシアナム（Methylobac terium rhodesianum)、メテロノ クテリゥム.ェクソトノレクェンス (Methylobacterium extor quens)、フオノレミディウム 'エスピー (Phormidium sp.) ATCC29409,ロドパクター 'カプ
Figure imgf000014_0002
udomonas nalustris)、口 スヒリウム'リプフム (Rhodospirillum rubrum)、口トスピリ1ノム •サレキシゲンス (Rhodospirillum salexigens)、口ドスピリゥム ·サリナラム (Rhodospirillu m salinarum)、ストレフ。トマ ス' 7ノボノアンエノス ( Stregtomxces amboraciens)、ス トレプトマイセス'オーレオファシエンス（Strentomvces aureofaciens) 、ストレプトマイ セス ·ァゥレウス (Streptomvces aureus)、ストレプトマイセス 'フンジシディカス (Strepto myces fun icidicus)、ス卜レフ。トマイ ス'グリセスクロモク-ナス (Streptomvces riseoch romogenes)■、ストレフ。トマイセス ·グリセウス（Strentomvces griseus)■、ストレプトマイセ ス 'リビダンス (Streptomvces lividans、ストレプトマイセス.オリボグリセウス (Streptomvc es olivo riseus)、ストレフ。トマイセス .ラメヮス (Streptomvces rameus)、ストレフ。トマイセ ス 'タナシェンシス (Streptomvces tanashiensis)、ストレプトマイセス ·ビナセウス (Strep tomvces vinaceus)、 Ιτ^ι "モフ -ス.モヒ"リス (Zvmomonas mobilis 等をめ ί ' oこと力、" C きる。
[0035] 組換え体 DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Ac ad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭 63-248394)、エレクトロボレ ーシヨン法 [Nucleic Acids Res. , 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 YEpl3 (ATC C37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等を用いる こと力 Sでさる。
[0036] プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いて もよぐ例えば、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプ 口モーター、 gal 1プロモーター、 gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモ 一ター、 MF a 1プロモーター、 CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることが できる。
酵母としては、サッカロマイセス（Saccharomvces)属、シゾサッカロマイセス（Schizos accnaromyces) J禹、クノレ ベロマイセス ( luvveromyces) >！禹、トリコスホロン (Tnchospor 属、シヮニォマイミセス（Schwanniomvces)属、ピチア（Pichia)属、またはキャンデ イダ 属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイ セス 'セレビシェ (SaccharomYces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス'ボンべ（Schizosa ccharomyces pombe)、クノレイベロマイセス.ラクテイス ( luvveromyces lactis)、トリコス ポロン.プノレランス (Trichosporon pullulans)、シヮニォマイセス 'ァノレビウス (Schwanni omvces alluvius) 、ピチア ·パストリス（Pichia ipastoris)、キャンディダ ·ウテイリス（Candi da utilis)等をあげることができる。
[0037] 組換え体 DNAの導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であればいずれ も用いること力でき、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Methods Enzymol., 194, 182 ( 1990)]、スフエロプラスト法 [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 81, 4889 (1984)]、酢酸リチ ゥム法 [J. Bacteriol. , 153, 163 (1983)]等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pcDNAI, pcD M8 (フナコシ社より巿販）、 pAGE107 (特開平 3-22979)、 pAS3_3 (特開平 2-227075)、 pCDM8[Nature, 329, 840 (1987)]、 pcDNAI/Amp (インビトロジェン社製）、 pREP4 (ィ ンビトロジェン社製）、 pAGE103[J. Biochem, 101, 1307 (1987)]、 pAGE210、 pAMo、 p AMoA等を用いること力 Sできる。
[0038] プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることが でき、例えば、サイトメガロウィルス（CMV)の IE (immediate early)遺伝子のプロモータ 一、 SV40の初期プロモーターあるいはメタ口チォネインのプロモーター、レトロウイノレ スのプロモーター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター等をあげることがで きる。また、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
[0039] 動物細胞としては、マウス'ミエローマ細胞、ラット.ミエローマ細胞、マウス.ノヽイブリ ドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞またはナマルバ KJM-1細胞、 ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ 'ハム スターの細胞である CHO細胞、 HBT5637 (特開昭 63-299)等をあげることができる。 マウス.ミエローマ細胞としては、 SP2/0、 NSO等、ラット 'ミエローマ細胞としては YB2 /0等、ヒト胎児腎臓細胞としては HEK293(ATCC CRL_1573)、ヒト白血病細胞として は BALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としては COS_l、 COS-7等をあげることが できる。
[0040] 組換え体 DNAの導入方法としては、動物細胞に DNAを導入する方法であればい ずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Cytotechnology, 3， 133 ( 1990)]、リン酸カルシウム法（特開平 2-227075)、リボフヱクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]、 Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等をあげること ができる。
[0041] 昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W . H. rreeman and し ompany, New York (1992)、カレン卜 *プロト コーノレズ.イン.モレキュラー'ノ ィォロジ一、 Molecular Biology, A Laboratory Manual 、 Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を生産すること ができる。
[0042] 即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入して 昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、さらに組換えウィルスを昆虫細胞 に感染させ、蛋白質を生産させること力 Sできる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、 pVL1392、 pVLl
393、 pBlueBacIII (V、ずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。
[0043] バキュロウィルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであるアウトグ ラファ'カリフオノレニ力 'ヌクレア一'ポリへドロシス 'ゥイノレス (Autographa californica nu clear polyhedrosis virus; を用レヽる二と力 きな。
昆虫細胞としては、スポドプテラ ·フルギペルダ (Spodoptera frueiperda)の卵巣細胞
、トリコプルシア ·二 (Trichoplusia ni)の卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用 いること力 Sでさる。
[0044] スポドプテラ.フルギベルダの卵巣細胞としては Si、 Si21 (バキュロウィルス'イクスプ レツシヨン'ベクターズァ 'ラボラトリー 'マニュアル）等、トリコプルシア'二の卵巣細胞 としては High 5、 ΒΤΙ-ΤΝ-5Β1-4 (インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細 胞としてはボンビクス 'モリ (Bombvx mori) N4等をあげることができる。
組換えウィルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクター と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平 2 -227075)、リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]等をあげ ること力 Sでさる。
[0045] 植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 Tiプラス ミド、タバコモザイクウィルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いて もよぐ例えば、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV)の 35Sプロモーター、ィネアクチ ン 1プロモーター等をあげることができる。
[0046] 宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、ァノレファ ノレファ、イネ、コムギ、ォォムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞に DNAを導入する方法であればい ずれも用いることができ、例えば、ァグロパクテリゥム（ACTobacterium)を用いる方法 ( 特開昭 59-140885、特開昭 60-70080、 WO94/00977)、エレクト口ポレーシヨン法（特 開昭 60-251887)、パーティクルガン (遺伝子銃）を用いる方法（特許第 2606856、特 許第 2517813)等をあげることができる。
6.本発明の蛋白質の製造法
上記 5の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質 を生成、蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することができ
[0047] 本発明の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、原核生物、酵 母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌等 の原核生物、より好ましくはェシエリヒア属に属する微生物、さらに好ましくはェシエリ ヒア ·コリに属する微生物をあげることができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは 糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
[0048] 上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法 に従って行うことができる。
ェシエリヒア'コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形 質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類 等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培 地の!/、ずれを用いてもよ!/、。
[0049] 炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラクトース、 スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水 化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類 等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、酢酸アンモニ ゥム、リン酸アンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム塩、その他の含窒 素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼィ ン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化 物等を用いることができる。
[0050] 無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸 マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム 等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養 温度は 15〜40°Cがよぐ培養時間は、通常 5時間〜 7日間である。培養中 pHは 3.0〜1
1に保持する。 pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシ ゥム、アンモニア等を用いて fiう。
[0051] また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に 添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微 生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例 えば、！^プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するとき にはイソプロピル β D チォガラタトピラノシド等を、 imプロモーターを用いた発 現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地 に添加してもよい。
[0052] 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている RPMI1640培地 . Am. Med. Assoc. , 199, 519 (1967)]、イーグル（Eagle)の MEM培地 [Science, 122, 501 (1952)]、 DMEM培地 [Virology, 8, 396 (1959)]、 199培 地 [Pro Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)]またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した 培地等を用いることができる。 [0053] 培養は、通常 pH6〜8、 25〜40°C、 5% CO存在下等の条件下で 1〜7日間行う。 また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生 物質を培地に添加してもよ!/ヽ。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている TNM-FH培地 (ファーミンジェン社製)、 Sf-900 II SFM培地（ライフ.テクノロジ ーズ社製）、 ExCell400、 ExCell405 [いずれも JRHバイオサイエンシーズ社製]、 Grace' s Insect Medium[Nature, 195, 788 (1962)]等を用いることができる。
[0054] 培養は、通常 pH6〜7、 25〜30°C等の条件下で 1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい
〇
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器 官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般 に使用されているムラシゲ ·アンド '·スターグ (MS)培地、ホワイト (White)培地、またはこ れら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いるこ と力 Sできる。
[0055] 培養は、通常 pH5〜9、 20〜40°Cの条件下で 3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地 に添加してもよい。
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外 に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方 法に応じて、生産させる蛋白質の構造を変えることができる。
[0056] 本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポー ルソンらの方法 [J. Biol. Chem. , 264, 17619 (1989)]、ロウらの方法 [Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)]、または特開平 05-336
963、 WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に 積極的に分泌させることができる。
[0057] すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋 白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿 主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平 2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝 子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
[0058] さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子 が導入された動物個体（トランスジエニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニ ック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。 本発明の蛋白質を生産する形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通 常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成、蓄積させ、該動物個体ま たは植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
[0059] 動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法 [A m. J. Clin. Nutr. , 63, 639S (1996)、 Am. J. Clin. Nutr. , 63, 627S (1996)、 Bio/Techno logy, 9, 830 (1991)]に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を 生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明の DNAまたは本発明の製造法に用いられる DNAを導入したトランスジエニック非ヒト動物を飼育し、本発明の蛋白質を該動物中 に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造す ること力 Sできる。該動物中の該蛋白質を生成、蓄積させる場所としては、例えば、該 動物のミルク（特開昭 63-309192)、卵等をあげることができる。この際に用いられるプ 口モーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができる力 S、例 えば、乳腺細胞特異的なプロモーターである αカゼインプロモーター、 13カゼインプ 口モーター、 ラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸十生プロテインプロモーター等 が好適に用いられる。
[0060] 植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白 質をコードする DNAを導入したトランスジエニック植物を公知の方法 [組織培養， ( 1994)、組織培養， 21 (1995)、 Trends Biotechnol., 15, 45 (1997)]に準じて栽培し、該 蛋白質を該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、 該蛋白質を生産する方法があげられる。
[0061] 本発明の蛋白質を生産する形質転換体を用レ、て製造された本発明の蛋白質を単 離、精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了 後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレン チプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞 抽出液を得る。
[0062] 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精 製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジ ェチルアミノエチル（DEAE)—セファロース、 DIAION HPA-75 (三菱化学製)等レジン を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S-S印 harose FF (フアルマシア社製)等の レジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フエ二ルセフ ァロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過 法、ァフィ二ティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動 等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることが できる。
[0063] また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回 収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋 白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まなレ、あるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質 が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構 造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
[0064] 本発明の蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には 、培養上清に該蛋白質またはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。 即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性 画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精 製標品を得ること力 Sできる。
[0065] このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号 1で表されるアミノ酸配列 を有する蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白 質に親和性をもつ物質を用いたァフィ二ティークロマトグラフィーを利用して精製する こともできる。例えば、ロウらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、 G enes Develop., 4, 1288 (1990)]、特開平 5-336963、 WO94/23021に記載の方法に準 じて、本発明の蛋白質をプロテイン Aとの融合蛋白質として生産し、ィムノグロブリン G を用いるァフィ二ティークロマトグラフィーにより精製することができる。
[0066] また、本発明の蛋白質を Flagペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗 Flag抗体を 用いるァフィ二ティークロマトグラフィー [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989 )、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)]や、ポリヒスチジンとの融合蛋白質として生産し、 ポリヒスチジンと高親和性を有する金属配位レジンを用いるァフィ二ティーク口マトダラ フィ一によつて精製することもできる。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたァ フィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
[0067] 上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、 Fmoc法（フルォレニルメチ ルォキシカルボニル法）、 tBoc法（t ブチルォキシカルボニル法）等の化学合成法 により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、 Advanced ChemTech社、ノ 一キノ *ェノレマー f土、 Pharmacia社、 Protein Technology Instrument社、 Syntheceil-Ve ga社、アプライドバイォシステムズ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化 学合成することもできる。
7.本発明のジペプチドの製造法
上記 3の微生物または形質転換体の培養物もしくは該培養物の処理物、または上 記 1の本発明の蛋白質と 1種以上のアミノ酸とを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中 にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体中から該ジペプチドを採取することにより、ジ ペプチドを製造することができる。
( 1 )本発明の蛋白質を酵素源として用レ、るジぺプチドの製造法
本発明の製造法において、酵素源として本発明の蛋白質を用いる場合、基質に用 いられる 1種または 2種のアミノ酸としては、 L -アミノ酸、 Glyおよび /3—ァラニン（/3 -A la)力 なる群より選ばれるアミノ酸であれば、レ、ずれのアミノ酸を!/、ずれの組み合わ せで用いてもよい。 L アミノ酸としては、例えば L- Ala、 L- Gln、 L- Glu、 L_Val、 L- Le u、 L— Ile、 L_Pro、 L_Phe、 L_Trp、 L— Met、 L— Ser、 L_Thr、 L_Cys、 L_Asn、 L_Tyr、 L_L ys、 L-Arg, L_His、 L-Asp、 Glyおよび /3 -Alaから選ばれる 1種または 2種のアミノ酸 をあげることができる。
[0068] 上記製造法に用いられる、好ましいアミノ酸としては L-Arg、 L-Lysおよび L-Hisから 選ばれる 1種のアミノ酸と L-アミノ酸、 Glyおよび /3 -Alaからなる群より選ばれるァミノ 酸との組み合わせ、より好ましいアミノ酸としては L-Argと L-Ala、 L_Gln、 L_Glu、 L_Va 1、 L— Leu、 L— Ile、 L— Pro、 L— Phe、 L— Trp、 L— Met、 L— Ser、 L— Thr、 L— Cys、 L— Asn、 L_L ys、 L-Arg, L-His, L_Aspおよび Glyとの組み合わせ並びに L-Lysl種のみ、特に好ま しいアミノ酸としては L_Argと L-Ala、 L-Arg, L_Ser、 L-His, L_Asnおよび Glyから選ば れる 1種のアミノ酸との組み合わせをあげることができる。
[0069] 上記製造法において、本発明の蛋白質は、基質として用いるアミノ酸 lmgあたり 0.01 〜100mg、好ましくは 0.1mg〜10mg添カロする。
上記製造法において、基質として用いるアミノ酸は、 0.1〜500g/L、好ましくは 0.2〜 200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
上記製造法において、エネルギー源として ATPを用いることができ、 ATPは、 0.5m mol〜10mol/Lの濃度で用いる。
[0070] 上記製造法で用いられる水性媒体としては、ジペプチドの生成反応を阻害しなレ、 限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよぐ例えば、水、りん酸塩、炭酸塩 、酢酸塩、ほう酸塩、クェン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、 メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸ェチルなどのエステル類、アセトン などのケトン類、ァセトアミドなどのアミド類を含有して!/、てもよレ、。
[0071] ジペプチドの生成反応は水性媒体中、 pH5〜l l、好ましくは pH6〜10、 20〜50°C、 好ましくは 25〜45°Cの条件で 2〜150時間、好ましくは 6〜120時間行う。
上記方法で製造されるジペプチドとしては L-Ala、 L- Gln、 L- Glu、 L_Val、 L- Leu、 L -lie, L— Pro、 L— Phe、 L— Trp、 L— Met、 L— Ser、 L— Thr、 L— Cys、 L— Asn、 L— Tyr、 L-Lys, L-Arg, L-His, L-Asp, Glyおよび /3 -Alaから選ばれる 1種または 2種のアミノ酸がぺ プチド結合で連結したジペプチド、好ましくは L_Arg、 L-Lys, L_Hisより選ばれる 1種 のアミノ酸と L-アミノ酸、 Glyおよび /3—Alaカゝらなる群より選ばれるアミノ酸カゝら選ばれ る 1種のアミノ酸がペプチド結合で連結したジペプチド、より好ましくは、 L-Argと L-A1 a、 L-Gln, L_Glu、 L_Val、 L-Leu, L_Ile、 L_Pro、 L_Phe、 L-Trp, L-Met, L_Ser、 L-T hr、 L- Cys、 L-Asn、 L- Lys、 L_Arg、 L- His、 L- Aspおよび Glyより選ばれる 1種のアミノ 酸がペプチド結合で連結したジペプチド並びに L-Lys-L-LyS、さらに好ましくは L_Ar gと L-Ala、 L-Arg、 L_Ser、 L_His、 L_Asnおよび Glyより選ばれる 1種のアミノ酸がぺプ チド結合で連結したジペプチド、最も好ましくは式 (I)
[0072] [化 1]
R1— R2 ( I )
[0073] (ただし、 R1は L-Argであり、 R2は L-Ala、 L_Arg、 L_Serおよび L_Hisより選ばれる 1種 のアミノ酸）で表される 2つのアミノ酸がペプチド結合で連結したジペプチドをあげるこ と力 Sできる。
(2)微生物または形質転換体の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用い るジペプチドの製造法
本発明の製造法において酵素源として用いられる微生物または形質転換体の培養 物としては、該微生物または形質転換体を上記 6の培養方法で培養して得られる培 養物をあげること力 Sできる。微生物または形質転換体の培養物の処理物としては、該 培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得ら れる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、 該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素 源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるものなどをあげること ができる。
[0074] 形質転換体または微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いる 場合、基質に用いられる 1種以上のアミノ酸としては、上記（1)と同様のアミノ酸をあ げること力 Sでさる。
該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なる力 例えば、基質として用い るアミノ酸 lmgあたり湿菌体重量として 5〜1000mg、好ましくは 10〜400mg添加する。
[0075] 基質として用いるアミノ酸は、上記（1)と同じように水性媒体中に添加することができ る。上記（1)と同様、 ATPを水性媒体中に存在せしめ、エネルギー源として用いるこ と力 Sできる。
水性媒体としては、上記（1 )の媒体を用いることができ、加えて酵素源に使用する 微生物または形質転換体の培養物の培養上清も水性媒体として用いることもできる。
[0076] また上記製造法においては、必要に応じて、水性媒体中に界面活性剤あるいは有 機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン'ォクタデシルアミ ン (例えばナイミーン S_215、 日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメ チルアンモニゥム.ブロマイドやアルキルジメチル.ベンジルアンモニゥムクロライド（例 えばカチオン F2-40E、 日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル 'ザ ルコシネートなどのァニオン系界面活性剤、アルキルジメチルァミン (例えば三級アミ ン FB、 日本油脂社製)などの三級アミン類など、ガラクトース含有複合糖質の生成を 促進するものであればいずれでもよぐ 1種または数種を混合して使用することもでき る。界面活性剤は、通常 0. 1〜50 g/1の濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレ ン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸ェチルなどが挙げられ、通常 0.1〜5 0 ml/1の濃度で用いられる。
[0077] ジペプチドの生成反応の反応条件は、上記（1)と同様の条件をあげることができる
〇
上記方法で製造されるジペプチドとしては、上記（1)と同様のジペプチドをあげるこ と力 Sできる。
上記（1)および（2)の製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したジペプチドの 採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒によ る抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うこと ができる。
[0078] 以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例 1
[0079] リゾクチシン合成酵素遺伝子発現株の造成
バチルス .サチルス ATCC6633の染色体 DNA上に存在する配列番号 2で表される 塩基配列を有する、機能未知蛋白質をコードするリゾクチシン合成酵素遺伝子を以 下のようにして取得した。 まず、バチルス'サチルス ATCC6633を YPGA培地 [7g/Lイーストエキス（ディフコ社 製）、 7g/Lバクトペプトン (ディフコ社製）、 7g/Lグルコース、 1.5g/L寒天]に塗布して 30°Cで一晚静置培養した。生育した菌体 1白金耳を 3mLの YPG培地 [7g/Lイーストェ キス（ディフコ社製）、 7g/Lバクトペプトン（ディフコ社製）、 7g/Lグルコース]に植菌し 、 30°Cで 24時間振盪培養した。遠心分離により集菌した菌体から Dneasy Kit (キアゲ ン社製）を用いて染色体 DNAを調製した。
[0080] パーセプティブ'バイオシステムズ（Pers印 tive Biosystems)社製 8905型 DNA合成 機を用いて、配列番号 3および 4で表される塩基配列を有する DNA (以下、それぞ れプライマー A、プライマー Bと呼ぶ）を合成した。
リゾクチシン合成酵素遺伝子断片の増幅には上記のプライマー Aおよびプライマー B、铸型としてバチルス ·サチルス ATCC6633の染色体 DNAを用いて PCRを行った。
PCRは、 0.50pgの全 DNA、 0.3〃 mol/Lの各プライマー、 1 unitの KOD plus DNAポリ メラーゼ（東洋紡社製）、 5 H Lの KOD plus DNAポリメラーゼ用 X 10緩衝液（東洋紡社 製）、各 200 mol/Lの dNTP (dATP、 dGTP、 dCTPおよび dTTP)を含む反応液 50 L を調製し、 94°Cで 120秒間加温した後、 94°Cで 15秒間、 50°Cで 30秒間、 68°Cで 120秒 間の工程を 25回繰り返し、さらに 68°Cで 5分間加温することにより行った。該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、該 PCRによりリゾクチシン合成酵素遺伝子に 相当する約 1.2kbの DNA断片が増幅していることを確認した。
[0081] 次に、残りの反応液 1.46 a L、 2.5mMの dGTP、 5mMのジシオスレィトール (DTT)、 1 u nitの T4 DNA polymerase, 2 μ Lの T4 DNAポリメラーゼ用 X 10緩衝液 (ノバジェン社 製)を含む反応液 20 Lを調製し 22°Cで 30分間反応した後、 75°C度 20分間加温する ことで反応を停止した。
この反応液 2 H Lと LIVベクター pET-30 Xa/LIC (ノバジェン社製） 1 μ Lを混合して 22 °Cで 5分間反応した後に、 1 しの 25mM EDTAを加えてさらに 22°Cで分間反応した。
[0082] 該反応液を用いてェシエリヒア'コリ JM109株を、ヒートショック法によって形質転換 し、該形質転換体を 25 g/mLのカナマイシンを含む LB寒天培地に塗布した後、 30 °Cで一晩培養し形質転換株を選択した。
該形質転換株を 20 g/mlのカナマイシンを含む LB培地で終夜培養し、得られた 培養液からアルカリ SDS法 (モレキュラー 'クローニング第 3版）によりプラスミドを調製 した。
[0083] 制限酵素切断解析を行い、該プラスミドは、 pET-30 Xa/LICに上記で得られた約 1.
2kbの DNA断片が揷入された構造を有するプラスミドであることを確認した。このプラ
Figure imgf000028_0001
pBsRzcAを用いてェシエリヒア.コリ Rosetta (DE3)株（ノバジェン社製）を、カルシゥ ムイオンを用いる方法によって形質転換し、該形質転換体を 25 g/mLのカナマイシ ンと 25 g/mLのクロラムフエ二コールを含む LB寒天培地に塗布した後、 30°Cでー晚 培養し形質転換株を選択した。
[0084] 生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制 限酵素を用レ、てその構造を解析することにより、 pBsRzcAが保持されて!/、ることを確 した。
該形質転換株を、ェシエリヒア'コリ Rosetta (DE3)/pBsRzcAと命名した。
実施例 2
[0085] ジペプチド合成活性を有する蛋白質の生産
実施例 1で得られたェシエリヒア'コリ Rosetta (DE3)/pBsRzcAを 25 g/mLのカナマ イシンと 25 a g/mLのクロラムフエ二コールを含む 3mLの LB培地が入った試験管に接 種し、 37°Cで 12時間振盪培養した。得られた培養液のうち lmLを 25 8/½しのカナマ イシン、 25 g/mLのクロラムフエ二コールを含む LB培地 lOOmLが入った 500mL三角 フラスコに接種した。 25°Cで 3時間振盪培養した後に終濃度 lmmol/Lのイソプロピル - β—D—チォガラタトピラノシド (IPTG)を添加し、さらに 25°Cで 12時間振盪培養した 。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。
[0086] 該湿菌体を超音波処理により破砕した後、遠心分離して得られる上清から、 HisTra p (Hisタグ付加蛋白質精製キット、アマシャム社製）を用いて Hisタグが付加した蛋白 質を精製した。
実施例 3
[0087] Hisタグ付加蛋白質を用いたジペプチドの生産
実施例 2で得られた精製 Hisタグ付加蛋白質を 0. lmg/mL、 50mmol/Lの Tris-HCl緩 衝液（ρΗ8·0)、 12.5mmol/Lの硫酸マグネシウム、 12.5mmol/Lの ATP、 12.5mmol/Lの L-アルギニンと、 12.5mmol/Lの L-ァラニン（L- Ala)、 L-グルタミン（L- Gin)、 L -グル タミン酸（L-Glu)、 L-バリン（L-Val)、 L-ロイシン（L_Leu)、 L-イソロイシン（L_Ile)、 L- プロリン（L_Pro)、 L-フエ二ルァラニン（L_Phe)、 L-トリプトファン（L_Trp)、： L-メチォ ニン（L-Met)、 L-セリン（L-Ser)、 L-スレオニン（L_Thr)、 L-システィン（L_Cys)、 L- ァスパラギン（L_Asn)、 L-リジン（L_Lys)、 L-アルギニン（L_Arg)、 L-ヒスチジン（L- His)、レアスパラギン酸（L_Asp)のうち 1種の L-アミノ酸またはグリシン（Gly)力もなる 反応液、を調製し、 30°Cで 17時間反応を行った。及び、実施例 2で得られた精製 His タグ付加蛋白質を 0.1mg/mL、 50mmol/Lの Tris-HCl緩衝液（pH8.0)、 12.5mmol/Lの 硫酸マグネシウム、 12.5mmol/Lの ATP、 25mmol/Lの L-リジンからなる反応液を調製 し、 30°Cで 17時間反応を行った。反応終了後、反応液中に遊離したリン酸量をデタミ ナー L IP (協和メデッタス社製）を用いた定量、 MALDI-TOFMS (Matrix Assisted Las er Oesorption/Ionization - Time of r light Mass Spectrometryノ分析、 NMR(Nuclear Magnetic Resonance)分析の 3種の方法で生成物を特定した。
[0088] その結果、遊離したリン酸の定量による方法では、 L-Argと、 L-Ala、 L_Gln、 L_Glu、 L_Val、 L_Leu、 L_Ile、 L_Pro、 L_Phe、 L_Trp、 L-Met, L— Ser、 L_Thr、 L_Cys、 L— Asn 、 L-Lys、 L-His、 L_Aspより選ばれる L_アミノ酸または Glyとが結合したジペプチド、お よび Arg-Arg、 Lys-Lysの生成が、 MALDI-TOFMS分析では L_Argと、 L_Ala、 L_Ser、 L-Asnから選ばれる L-アミノ酸または Glyとが結合したジペプチドの生成が確認された 。また、 NMR分析による生成物の構造及び生成量の分析では、 Arg-Alaは 0.89mmol/ L、 Arg-Argは 1.65mmol/L、 Arg—Serは 3.1mmol/L、 Arg—Hisは 1.9mmol/L生成したこ とがわかった。
[0089] 以上により、本発明の蛋白質は、 1種または 2種のアミノ酸をペプチド結合で結合さ せ、種々のジペプチドを生成する活性を有することがわ力、つた。
産業上の利用可能性
[0090] 本発明によりジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を製造することができ、該 蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する形質転換体または微生物を用いて ジペプチドを製造することができる。 配列表フリーテキスト
配列番号 3—人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 4 人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請求の範囲 [1] 以下の [1]〜 [3]のいずれかに記載の蛋白質。 [ 1 ]配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質 [2]配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換また は付加したアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質 [3]配列番号 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質 [2] 以下の [1]〜[3]のいずれかに記載の DNA。
[1]請求項 1記載の蛋白質をコードする DNA
[2]配列番号 2で表される塩基配列を有する DNA
[3]配列番号 2で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズし、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコード する DNA
[3] 請求項 2記載の DNAを含有する組換え体 DNA。
[4] 請求項 3記載の組換え体 DNAを有する形質転換体。
[5] 形質転換体が、微生物を宿主として得られる形質転換体である請求項 4記載の形質 転換体。
[6] 微生物が、ェシエリヒア（Escherichia)属に属する微生物である請求項 5記載の形晳 転換体。
[7] 請求項 1記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中 に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する請求項 1記載の蛋 白質の製造法。
[8] 請求項 1記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物が請求項 4〜6のいずれか 1 項に記載の形質転換体である、請求項 7記載の製造法。
[9] 請求項 1記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは該培養物の 処理物、または請求項 1記載の蛋白質と 1種以上のアミノ酸とを水性媒体中に存在せ しめ、該媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体中からジペプチドを採取する ことを特徴とするジペプチドの製造法。 [10] 請求項 1記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物が請求項 4〜6のいずれか 1 項に記載の形質転換体である、請求項 9記載の製造法。
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