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WO2008038587A1 - Lignée cellulaire du lymphome b malin modifié négativement par cd20 - Google Patents

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WO2008038587A1
WO2008038587A1 PCT/JP2007/068370 JP2007068370W WO2008038587A1 WO 2008038587 A1 WO2008038587 A1 WO 2008038587A1 JP 2007068370 W JP2007068370 W JP 2007068370W WO 2008038587 A1 WO2008038587 A1 WO 2008038587A1
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cells
malignant lymphoma
cell malignant
negative
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Tomoki Naoe
Akihiro Tomita
Junji Hiraga
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National University Corporation Nagoya University
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Definitions

  • the present invention relates to a technique useful for the treatment of B-cell malignant lymphoma or the development of a therapeutic method.
  • the technology disclosed in this specification is based on the pathological condition (CD20 negatively converted B cells) that has become resistant to molecular target drugs targeting CD20 due to the negative conversion of CD20. It is particularly useful for the treatment or development of therapeutic methods for malignant lymphoma).
  • Rituximab is a monoclonal chimeric antibody that specifically recognizes the CD20 antigen expressed specifically in B lymphocytes (Non-patent Documents 1 and 2).
  • the CD20 antigen is widely expressed in B cell malignancies represented by relatively slow progression, follicular malignant lymphoma, fast progression /, and diffuse malignant lymphoma.
  • Rituximab has come to be administered as a molecular target drug for CD20 antigen in addition to chemotherapy for these B cell malignancies that express CD20 antigen (Non-patent Documents 3 to 8).
  • the power CHOP chemotherapy has been used on for patients with B-cell malignant lymphoma for over 25 years.Undoubtedly, combinations of other chemotherapeutic agents and dose changes can help cure disease.
  • Non-patent document 1 Cneson BD. Monoclonal antibody tnerapy for B-cell malignancies. Se min Oncol. Apr 2006; 33 (2 Suppl 5): S2-14
  • Non-patent document 2 Imai, Takaoka A. Comparing antibody and small-molecule therapies for cancer. Nat Rev Cancer. Sep 2006; 6 (9): 714_727 ⁇
  • Non-Patent Literature 3 Coiffier B, Lepage E, Briere J, et al. CHOP chemotherapy plus rituxi mab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large_B_cell lympho ma.N Engl J Med. Jan 24 2002; 346 (4): 235 -242
  • Non-Patent Literature 4 van Oers MH, Klasa R, Marcus RE, et al.
  • Rituximab maintenance imp roves clinical outcome of relapsed / resistant follicular non-Hodgkin 's lymphoma, bot h in patients with and without rituximab during induction: results of a prospective ra ndomized phase III intergroup trial. Blood. Jul 27 2006.
  • Non-patent document 5 Habermann TM, Weller EA, Morrison VA, et al. Rituximab-CHOP versus CHOP alone or with maintenance rituximab in older patients with diffuse large B-cell lymphoma. J Clin Oncol. Jul 1 2006; 24 (19 ): 3121-3127.
  • Non-Patent Document 6 Pfreundschuh M, Trumper L, Osterborg A, et al. CHOP- like chemot herapy plus rituximab versus CHOP—like chemotherapy alone in young patients with good-prognosis diffuse large-B-cell lymphoma: a randomized controlled trial by The MabThera International Trial (MInT) Group. Lancet Oncol. May 2006; 7 (5): 379-391
  • Non-Patent Document 7 Hiddemann W, Kneba M, Dreyling M, et al.
  • Patent Document 8 Czuczman MS, Weaver R, Alkuzweny B, Berlfein J, Grillo—Lopez AJ. Prolonged clinical and molecular remission in patients with low-grade or follicular no n-Hodgkin's lymphoma treated with rituximab plus CHOP chemotherapy: 9 -ye r foil ow-up. J Clin Oncol. Dec 1 2004; 22 (23): 4711- 4716.
  • Non-Patent Document 9 Alvaro-Naranjo T, Jaen-Martinez J, Guma-Padro J, Bosch- Princep R, Salvado-Usach MT. CD20 ⁇ negative DLBCL transformation after rituximab treatm ent in follicular lymphoma: a new case report and review of the literature. Ann Hema tol. Sep 2003; 82 (9): 585-588.
  • Patent Document 10 Yasuhito Terui TS, Yuji Mishima, Yuko Mishima, Natsuhiko Sugimur a, Kiyotsugu Kojima, Masahiro Yokoyama, Kiyohiko Hatake. Identification of CD20 Mutations in Malignant Lymphoma: Can They Be Predictors of Response to Rituxim ab? Paper presented at: 47th American Society Of Hematology Annual Meeting; December 12, 2005, 2005; Atlanta.
  • Patent Document 11 Davis TA, CzerwinsKi DK, Levy R. Therapy of B-cell lymphoma with anti-CD20 antibodies can result in the loss of CD20 antigen expression. Clin Cancer Res. Mar 1999; 5 (3): 611-615 .
  • Patent Document 12 Kinoshita T, Nagai H, Murate T, Saito H. CD20-negative relapse in B-cell lymphoma after treatment with Rituximab. J Clin Oncol. Dec 1998; 16 (12): 391 6.
  • Non-Patent Document 13 Crescenzi M, Seto M, Herzig GP, Weiss PD, Griffith RC, Korsmeyer SJ. Thermostable DNA polymerase chain amplification of t (14; 18) chromosome brea kpoints and detection of minimal residual disease. Proc Natl Acad Sci US A. Jul 198 8; 85 (13): 4869-4873.
  • Non-Patent Document 14 Gribben JG, Freedman A, Woo SD, et al. All advanced stage non-H odgkin's lymphomas with a polymerase chain reaction amplifiable breakpoint of bcl ⁇ 2 have residual cells containing the be 2 rearrangement at evaluation and after treat ment. Blood. Dec 15 1991; 78 (12): 3275- 3280
  • Non-Patent Document 15 Maloney DG, Grillo-Lopez AJ, White CA, et al. IDEC-C2B8 (Rituxi mab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non n-Hodgkin's lymphoma. Blood. Se 15 1997 ; 90 (6): 2188-2195
  • Non-Patent Document 16 Maloney DG, Grillo-Lopez AJ, Bodkin DJ, et al. IDEC-C2B8: result s of a phase I multiple-dose trial in patients with relapsed non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. Oct 1997; 15 (10): 3266_3274.
  • Non-patent literature 17 Egger, Liang G, Aparicio A, Jones PA. Epigenetics in human disea se and prospects for epigenetic therapy. Nature. May 27 2004; 429 (6990): 457_463.
  • Non-patent literature 18 Binder M, Otto F , Mertelsmann R, Veelken H, Trepel M. The epitope recognized by rituximab. Blood. May 16 2006.
  • Patent Document 19 Kiyoi H, Naoe T. immunoglobulin variable region structure and B_ce 11 malignancies. Int J Hematol. Jan 2001; 73 (1): 47_53
  • an object of the present invention is to provide tools and means useful for developing a therapeutic strategy effective for preventing or overcoming resistance to a molecular target drug targeting CD20, represented by rituximab. . It is also an issue to provide therapeutic drugs and treatment methods used in the treatment strategy. Means for solving the problem
  • the inventors of the present invention have repeatedly studied for the development of an effective treatment strategy for CD20 negatively converted B-cell malignant lymphoma. As a result, the following findings were obtained.
  • the present invention is mainly based on the above findings and results, and provides the following cell lines, screening methods and the like.
  • step (3) culturing CD20 negatively converted B cell malignant lymphoma cells in the presence of a test substance selected based on the result of step (2);
  • step (3) (4) a step of culturing the cells after step (3) in the presence of a molecular targeted drug targeting CD20, and
  • step (3) In the presence of a test substance selected based on the result of step (2) and a molecule-targeted drug targeting CD20, CD20 positive B cell malignant lymphoma cells or CD20 negatively converted B cell malignant lymphoma cells Culturing, and
  • a screening method for a substance effective against CD20-positive B-cell malignant lymphoma or CD20 negative B-cell malignant lymphoma
  • step (2) the step of culturing the cells after step (1) in the presence of a molecular targeted drug targeting CD20
  • a screening method for a substance effective against CD20-positive B-cell malignant lymphoma or CD20 negative B-cell malignant lymphoma
  • CD20 negative conversion A screening method for substances effective against B-cell malignant lymphoma
  • CD20 positive B-cell malignant lymphoma or CD20 negatively converted B-cell malignant lymphoma characterized by comprising a compound that increases the expression level of CD20 protein and used in combination with a molecular target drug targeting CD20 Medicine.
  • a CD20-positive B-cell malignant lymphoma characterized by using a DNA methylase inhibitor and / or a histone deacetylase inhibitor in combination with a molecular target drug targeting CD20 or CD20 negative conversion Treatment for B-cell malignant lymphoma.
  • FIG. 1 Clinical course of patients with RRBL1 cell line origin.
  • the patient visited the hospital in 1993.
  • Classical chemotherapy (T) was performed for the diagnosis of FSC.
  • chemotherapy with rituximab (V) was repeated.
  • Chemotherapy was repeated when the patient's medical condition progressed to the point where it was not fully resolved.
  • rapid progression of malignant lymphoma was observed during chemotherapy with rituximab.
  • peripheral blood containing tumor cells was collected and the RRBL1 cell line was established after long-term culture.
  • the patient did not include rituximab! /, A leukemia of lymphoma, which was treated with salvage chemotherapy but was less effective, February 2005 The patient died.
  • Detailed chromosomal abnormalities are as follows.
  • Ad- LN Lymph node collected at patient visit, TF-PB; Peripheral hematoma lymphoma cells collected in July 2004, RRBLla (after 90 days culture) and RRBLlb (after 120 days culture); in RRBL1 cells cultured in vitro.
  • E Gene sequence of BCL2-JH6 translocation site (Genbank accession number; DQ 979790).
  • FIG. 4 CD20 protein and mRNA expression in RRBL1 cells.
  • A Immunostaining using anti-CD20 antibody (B1 monoclonal antibody) in RRBL1 cells and Raji cells. CD20 expression is not observed in RRBL1 cells, but expression is confirmed on the cell surface in Raji cells. MG; Meigimza staining.
  • B Raji cells, RRBL1 cells, NALM6 cell strength, and whole cell lysates were collected and subjected to Western blotting using CD20 antibody. In Raji cells (lane 1), no expression was confirmed in RRBL1 cells and NALM6 cells in which expression of CD20 protein was confirmed (lanes 2 and 3). As a positive control, a Western blot for GAPDH was performed.
  • 293T cells were used as a negative control (lane 2).
  • CD20 mRNA expression level in RRBL1 cells (lane 3) is significantly lower than in positive control Raji cells (lane 1) won.
  • RNA was extracted from cells obtained from patients with CD20-positive B-cell malignant lymphoma and the same study was performed (lanes 4 to 11).
  • the expression level of CD20 mRNA in RRBL1 cells was significantly lower than these.
  • (D) RRBL1 cells were subcultured and substrain RRBL2 was established. Whole cell lysates were extracted from these cells, and Western blotting using anti-CD20 antibody was performed. CD20 expression was confirmed in RRBL2 cells (lane 3)
  • Lane 1 is the vector product with the CDS gene CDS inserted, and lane 2 is the translation product from the T7Ts_Flag vector alone.
  • FIG. 6 shows the resistance of RRBL1 cells to rituximab.
  • the numbers of Raji cells (A) and RRBL1 cells (B) are shown as line graphs.
  • FIG. 7 Reexpression of CD20 mRNA and CD20 protein in RRBL1 cells.
  • A Results of RT-PCR analysis of RRBLl cells treated with 5_Aza'-2-Deoxycytidine.
  • B Explanation of experimental procedure.
  • C Western plot results using RNA and protein extracted from cultured cells. Raji (lane 1) and NALM6 (lane 2) were used as positive and negative controls for CD20 expression, respectively.
  • FIG. 8 (A) Results of Western blot analysis of RRBLl cells treated with Aza and TSA. (B) Results of FCM analysis of RRBL1 cells cultured in the presence of Aza or in the presence of Aza and TSA. (C) Comparison of resistance to rituximab. Compare the number of viable cells after culturing RRBL1 cells (untreated group) and RRBL1 cells (treated group) treated with Aza and TSA in the absence ( ⁇ , country) or presence ( ⁇ , ⁇ ) of rituximab did.
  • FIG. 9 Analysis of CD20 transcriptional regulation in the CD20 gene promoter.
  • A CD20 gene promoter configuration.
  • the arrows (CD20pro_U, CD20pro_L) in the figure indicate the positions of the PCR primers used in chromatin immunoprecipitation (CMP).
  • B Results of CMP assembly using anti-Pul antibody, anti-IRF4 antibody, anti-acetylated H4 (Ac_H4) antibody, anti-Sin3 antibody, and anti-HDAC1 antibody.
  • C Western blot results using anti-CD20 antibody and anti-GAPDH antibody.
  • FIG. 10 shows the weight of a tumor formed in NOD / SCID mice transplanted with RRBL1 cells.
  • RRBL1 thin Cystic (5 ⁇ 10 6 ) force was injected subcutaneously into the back of SNOD / SCID immunodeficient mice.
  • tumors that could be visually confirmed were observed, and tumor size or tumor weight was calculated.
  • SCI, SC2 mice
  • FIG. 11 Comparison of pathological tissue of NOD / SCID mice administered with RRBL1 cells (left) and autopsy findings of patients with RRBL1 cells (right).
  • RRBL1 cells (5 ⁇ 10 6 ) were administered intravenously in NOD / SCID mice. At 8 weeks after transplantation, the mice were excised under appropriate anesthesia and examined pathologically. RRBL1 cells diffusely invaded organs such as liver, spleen, kidney and bone marrow (HE staining, left figure). Tumor cells were negative by immunostaining with anti-CD20 antibody, and tumor cells were positive by immunostaining with anti-CD79a antibody recognizing B cells. In addition, the autopsy findings of the patient who became the cell line are shown on the right.
  • CD20 clusters of differentiation 20
  • CD20 antigen CD20 antigen
  • CD20 is a phosphorylated protein with a molecular weight of 33-37 kDa, and is thought to be involved in the activation and proliferation of B cells.
  • CD20 is one of the B cell surface markers. In addition to mature B cells, the majority of B cell malignant lymphoma and chronic lymphocytic leukemia cells have been found to be expressed! .
  • CD20 positive B-cell malignant lymphoma is a B-cell malignant lymphoma with CD20 expression! /, Follicular B-cell non-Hodgkin lymphoma, diffuse large B-cell malignant Examples include lymphoma and mantle cell lymphoma.
  • CD20 negatively converted B-cell malignant lymphoma which was originally a CD20-positive B-cell malignant lymphoma, has been evaluated to be CD20-negative due to a significant decrease in the expression level of CD20 protein. It refers to a disease state. Such a change from CD20 positive to CD20 negative is referred to as “CD20 negative conversion” in the present specification. It has been experienced that CD20 negative conversion occurs with continued use of molecular therapeutics targeting CD20 (eg, rituximab).
  • Molecular-targeted drug targeting CD20 refers to a compound designed to target CD20 and exhibiting a medicinal effect through its action on CD20.
  • rituximab CD20 as molecular targeting drug, ibritumomab (9 ° Y Ibritumomab), tositumomab (m I To situmomab) actually used in the treatment of cancer? /, Ru.
  • Rituximab is the name of Rituxan (registered trademark, Neuogen 'IDEC)
  • Ibrilmomab is the name of Zevalin (registered trademark, Biogen' IDEC)
  • tositumomab is the name of BEXXAR (registered trademark, Daraxo 'SmithKline) Offered in! /
  • the first aspect of the present invention relates to a CD20 negatively converted B-cell malignant lymphoma cell line (hereinafter referred to as “cell line of the present invention”).
  • the cell line of the present invention is derived from B cell malignant lymphoma in which the expression of CD20 protein is inverted. That is, the cell line of the present invention was established on the basis of cells of B cell malignant lymphoma that were initially evaluated as CD20 negative from those that were CD20 positive B cell malignant lymphoma. .
  • the cell line of the present invention can be established by isolating mononuclear cells from the peripheral blood of a patient suffering from CD20 negatively converted B-cell malignant lymphoma, followed by culture.
  • a CD20 negatively converted B cell malignant lymphoma cell line was successfully established from a patient diagnosed with follicular lymphoma and transformed and relapsed as a CD20 negative diffuse B cell malignant lymphoma after treatment with rituximab.
  • the cell line (RRBL1) is deposited with a predetermined depository as follows and can be easily obtained.
  • the cell line (RRBL1) has been transferred to the international deposit as follows based on the transfer request dated September 12, 2007.
  • RBBL1 retains the CD20 protein expression ability, that is, has the potential expression ability of CD20 protein.
  • cell lines established from pathological conditions that acquired resistance to molecular targeting drugs targeting CD20 are similar to RRBL1.
  • the expression of CD20 protein is inverted due to a decrease in the expression level of CD20 mRNA, and it has a high probability of having the potential expression ability of CD20.
  • RRBL1 similar to RRBL1, a cell line in which CD20 inversion occurred due to reversible reduction of mRNA expression from various pathological conditions that acquired resistance to molecular target drugs targeting CD20 was established. It can be said that it is possible.
  • RRBL1 is CD 10 positive, CD 19 positive, CD20 negative, and immunoglobulin light chain ( ⁇ chain, ⁇ chain) negative (above, sputum cell marker), CD2 negative, CD3 shade Sex, CD4 negative, CD 5 negative, CD7 negative, CD8 negative, CD56 negative (above, T cell or NK cell marker), CD lc negative, CD 16 negative, CD25 positive, CD30 negative, and CD34 negative (See Figure 12).
  • the second aspect of the present invention relates to a model animal produced using the cell line of the present invention.
  • the model animal of the present invention is produced by transplanting or administering the cell line of the present invention to an immunodeficient non-human animal, and reflects the characteristic pathology corresponding to the cell line used. This feature makes it useful as an in vivo model for investigating therapeutic strategies for pathologies corresponding to the cell line used. For example, it is possible to examine the efficacy and side effects of candidate therapeutic agents using the model animals of the present invention, and to examine changes in the expression level of CD20 at the tissue level.
  • the pathology reflected by the model animal of the present invention varies depending on the cell line used. Typically, in the model animal of the present invention, infiltration of tumor cells into the liver, spleen, kidney, bone marrow, etc. is observed as a pathological finding.
  • the present inventors succeeded in producing a model mouse that satisfactorily reflects the pathology of the patient who became the origin of RRBL1 by administering RRBL1 to NOD / SCID mice. is doing.
  • a method for transplanting or administering cells to an immunodeficient non-human animal subdermal injection, intraperitoneal injection, intravenous administration, etc. can be adopted according to conventional methods (cell engineering separate volume, Mouse anatomical illustrations (Shintaro Nomura, Shujunsha) and other books are helpful).
  • the type of immunodeficient non-human animal to be used is not particularly limited.
  • BALB nude mice, BALB A nude mice, NU / NU mice, MH-III nude mice, Fox Chase Scid mice, Fox Chase S cid Beige mice Fox Chase Scid Ourbred mice, NOD / SCID mice, NOG mice, nude rats, etc. may be used.
  • NOD / SCID mice and NOG mice are particularly preferred from the viewpoint of engraftment.
  • the various immunodeficient non-human animals listed above are Claire Japan (Tokyo, Japan), Charles Charles Liver Co. (Yokohama, Japan), Charles River Labora tories (Wilmington, Massachusetts, USA), Taconic (New York, USA) etc. can be obtained. [0014] (Screening method)
  • the third aspect of the present invention provides a screening method for a substance effective against CD20-positive B cell malignant lymphoma or CD20 negatively converted B cell malignant lymphoma.
  • a step of culturing CD20 negatively converted B-cell aplastic lymphoma cells in the presence of a test substance and (2) a CD20 mRNA expression level or A step of measuring the CD20 protein expression level and evaluating the test substance's ability to induce CD20 expression is performed.
  • Substances selected by the screening method of the present invention are molecular therapeutic drugs targeting CD20 (hereinafter, unless otherwise specified, “molecular targeting drug” means “molecular target targeting CD20” It is a potential candidate (lead compound) as an active ingredient of a drug for CD20-positive B-cell malignant lymphoma or CD20 negatively converted B-cell malignant lymphoma. If the selected substance has a sufficient medicinal effect, it can be used as it is as an active pharmaceutical ingredient. On the other hand, even if it does not have a sufficient medicinal effect, it can be used as an active ingredient of a medicine after it has been modified by chemical modification to enhance its medicinal effect. Of course, even if it has a sufficient medicinal effect, the same modification may be made for the purpose of further increasing the medicinal effect.
  • the screening result has an ability to induce CD20 expression.
  • This ability to induce CD20 expression prevents screening results from acquiring resistance to molecular target drugs when applied to CD20 positive B cell malignant lymphoma. However, even if CD20 is positive, it promotes further expression of CD20 on B cells whose expression level is not relatively high, thereby creating an environment in which the molecular target drug works better.
  • CD20 negatively converted B-cell malignant lymphoma
  • CD20 negatively converted B-cell malignant lymphoma cells are converted to sensitivity to the targeted drug, and the targeted drug is once again effective. Create an environment.
  • screening results can be used in combination with molecular targeted drugs to produce effective therapeutic results for both CD20-positive B-cell malignant lymphoma and CD20 negative B-cell malignant lymphoma. Expected to bring.
  • CD20 negatively converted B-cell malignant lymphoma cells are prepared and subjected to culture in the presence of the test substance.
  • the cell line of the present invention for example, RRBL1
  • RRBL1 can be used as a CD20 negatively converted B cell malignant lymphoma cell. That is, cells collected from patients suffering from CD20 negatively converted B-cell malignant lymphoma may be directly used in the screening method of the present invention.
  • “As is” here means that stocking operations are not performed, and operations that are normally required for application to screening methods such as separation operations and washing operations are limited. is not
  • the number of cells to be used is not particularly limited, and can be determined in consideration of detection sensitivity, experimental equipment, and the like. For example, using IX 10 2 to IX 10 6 cells in a single screening operation requires a force S.
  • the abundance (addition amount) of the test substance in the culture solution can be set arbitrarily, but if the addition amount is set within a range that does not have a fatal effect when normal cells are cultured under the same conditions, Good.
  • a person skilled in the art can set an appropriate addition amount by preliminary experiments.
  • the culture time is not particularly limited, and is a force that is set so that the effect of the test substance can be sufficiently evaluated.
  • the culture time can be set within a range of 1 minute to 10 days.
  • a substance exhibiting the desired action / effect is found, it is possible to set a culture time for subsequent screening based on the time required for the substance to exhibit the action-effect.
  • RRBL1 as described in the examples below, it was revealed that 5-Aza_2'-Deoxycytidine induces CD20 expression by culturing for about! ⁇ 7 days. Based on this finding, the culturing time can be set within the range of 1 to 7 days with the screening method using RRBL1.
  • test substances to be used in the screening method of the present invention organic compounds of various molecular sizes (nucleic acids, peptides, proteins, lipids (simple lipids, complex lipids (phosphodaricelide, sphingolipids, glycosylglycerides, cerebrosides, etc.), Prostaglandins, isoprenoids, terpenes, steroids, vitamins, hormones, etc.)) or inorganic compounds can be used.
  • the test substance may be derived from natural products or may be synthetic. the latter In this case, for example, it is possible to construct an efficient screening system using a combinatorial synthesis method. Cell extracts and culture supernatants may be used as test substances.
  • the study using RRBL1 revealed that CD20 negative conversion occurred due to a decrease in the expression level of CD20 mRNA.
  • compounds that improve the transcription rate by affecting the transcriptional regulation of the CD20 gene are preferably used as test substances.
  • CD20 expression level the CD20 mRNA expression level or CD20 protein expression level (hereinafter referred to as “CD20 expression level”) in the cultured cells is measured, and the CD20 expression inducing ability of the test substance is evaluated.
  • the expression level of CD20 protein can be measured using a compound that specifically binds to CD20 protein.
  • the measurement of the CD 20 protein expression level is not limited to this, but is preferably performed by an immunological technique.
  • an antibody against a specific protein is used, and the protein is detected using the binding (binding amount) of the antibody as an index.
  • the term “antibody” herein includes a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a single chain antibody, a CDR graft antibody, a humanized antibody, or a fragment thereof.
  • the antibody in the present invention can be prepared by using an immunological technique, a fuzzy display method, a ribosome display method and the like.
  • the immunological detection method enables rapid and sensitive detection. The operation is also simple. Examples of the detection method include ELISA, radioimmunoassay, flow cytometry (FCM), immunoprecipitation, immunostaining, and immunoblotting.
  • a labeled antibody By using a labeled antibody, the above measurement can be easily performed.
  • fluorescent dyes such as lean
  • enzymes such as horseradish peroxidase, microperoxidase, alkaline phosphatase, ⁇ D galactosidase, chemical or bioluminescent compounds such as noreminol and acridine dyes, 32 ⁇ , 131 ⁇ , 125 Radioisotopes such as ⁇ and biotin can be used.
  • the ability of the test substance to induce CD20 expression is evaluated. For example, prepare cells cultured in the presence of the test substance (test group) and cells cultured in the absence of the test substance (control group), and measure and compare the CD20 expression level for each group. From the comparison results, the degree of change in the CD20 expression level as a result of the presence of the test substance (change in expression level) is obtained. If the CD20 expression level in the test group is high compared to the control group! /, That is, if the test substance has CD20 expression-inducing ability, the test substance is CD20-positive sputum malignant lymphoma or CD20 negative conversion It can be judged effective against sputum malignant lymphoma. When a marked increase in the expression level of CD 20 is observed in the test group, the test substance can be judged to be particularly effective!
  • this expression level can also be used as the control group expression level.
  • the ability S to evaluate the ability of the test substance to induce CD20 expression can be reduced.
  • the CD20 expression level is measured over time to obtain a plurality of measurement results at different measurement points, and the plurality of measurement results obtained are used to express the CD20 expression of the test substance. Evaluate inducibility. Based on such measurements over time, it is possible to obtain a lot of information useful for evaluating the effectiveness of a test substance, such as the method of action and duration of the test substance.
  • step (3) A step of culturing CD20 negatively converted B cell malignant lymphoma cells in the presence of a test substance selected based on the result of step (2).
  • step (3) A step of culturing the cells after step (3) in the presence of a molecular targeted drug targeting CD20.
  • test substance selected in steps (1) and (2) actually shows a therapeutic effect when used in combination with a molecular target drug.
  • steps (1) and (2) will be used for matters not specifically mentioned here.
  • CD20 negatively converted B-cell malignant lymphoma cells are cultured in the presence of a test substance that has been shown to induce CD20 expression.
  • the CD20 negatively converted B cell malignant lymphoma cells used here may be the same type or different types of cells used in step (1). As an example of the latter, there can be mentioned the case of using CD20 negatively converted B-cell malignant lymphoma collected from a patient different from the patient from which the cells used in step (1) are derived.
  • RRBL1 can also be used as CD20 negatively converted B-cell malignant lymphoma cells.
  • This culturing step is performed in the presence of a molecular target drug.
  • the force S that can suitably use rituximab, ibrilmomab, or tositumomab as a molecular target drug is not limited to these.
  • the abundance (addition amount) of the molecular target drug in the culture solution can be set arbitrarily, but it is better to set the addition amount in a range that does not have a fatal effect when normal cells are cultured under the same conditions.
  • a person skilled in the art can set an appropriate addition amount by preliminary experiments.
  • the culture time is set to a time sufficient for the action of the molecular target drug to be exerted.
  • the culture time here can be set within a range of 1 minute to 10 days.
  • the number of viable cells after culture is measured, and the cell killing effect of the test substance and molecular target drug is evaluated. Based on the evaluation results, the effectiveness of the test substance is determined. For example, a group that performs steps (3) and (4) (test group) and a group that performs only step (4) (ie, a group that only performs culture in the presence of a molecular target drug: a control group) And measure the number of viable cells after culture for each group and compare them. From the comparison results, the degree of change in cell viability as a result of culturing in the presence of the test substance is determined. versus When the number of viable cells in the test group is small compared to the control group!
  • the cell viability is low
  • the test substance can be determined to be effective. If the test group shows a significant decrease in cell viability, the test substance can be judged to be particularly effective.
  • the effectiveness of the test substance can also be determined by comparing the number of cells before and after culturing in the test group rather than setting a control group. However, more reliable results can be obtained by setting the control group as described above.
  • the measurement in this step may be performed over time, and the determination may be made based on a plurality of measurement results.
  • steps (3) and (4) are performed in place of the above steps (3) to (5).
  • step (3) In the presence of a test substance selected based on the result of step (2) and a molecule-targeted drug targeting CD20, CD20 positive B cell malignant lymphoma cells or CD20 negatively converted B cell malignant lymphoma cells Culturing step.
  • test substance selected in steps (1) and (2) actually show a therapeutic effect when administered simultaneously with a molecular targeted drug targeting CD20? You can check whether or not.
  • CD20-positive B-cell malignant lymphoma cells are employed as cells to be subjected to the culture step, the therapeutic effect on CD20-positive B-cell malignant lymphoma can be examined.
  • CD20 negatively converted B cell malignant lymphoma cells are employed, the therapeutic effect on CD20 negatively converted B cell malignant lymphoma can be examined.
  • the culture is carried out under conditions where the test substance and the molecular target drug coexist.
  • the number of viable cells after culture is measured, and the cell killing effect by the action of the test substance and molecular target drug is measured.
  • the effectiveness of the test substance is determined based on the evaluation result.
  • cells cultured in the absence of the test substance and in the presence of the molecular target drug, and cells cultured in the absence of the test substance and the molecular target drug can be used.
  • the corresponding descriptions described above are incorporated.
  • the present invention further provides a method for more easily screening for a substance that provides a good therapeutic effect when used in combination with a molecular target drug targeting CD20.
  • the cell line of the present invention (such as RRBL1) is used. Specifically, the following two types of screening methods are provided.
  • a method for screening a substance effective against CD20 positive B cell malignant lymphoma or CD20 negative B cell malignant lymphoma is a method for screening a substance effective against CD20 positive B cell malignant lymphoma or CD20 negative B cell malignant lymphoma
  • step (2) the step of culturing the cells after step (1) in the presence of a molecular targeted drug targeting CD20
  • a method for screening a substance effective against CD20 positive B cell malignant lymphoma or CD20 negative B cell malignant lymphoma is a method for screening a substance effective against CD20 positive B cell malignant lymphoma or CD20 negative B cell malignant lymphoma
  • the present invention further provides a screening method using the model animal of the present invention.
  • a substance effective against CD20 negatively converted B-cell malignant lymphoma can be selected by in vivo level experiments. Specifically, the following screening methods are provided.
  • a test substance is administered to the model animal of the present invention.
  • the route of administration is not particularly limited, and oral administration, intravenous administration (injection), intradermal administration (injection), subcutaneous administration (injection), transdermal administration, buccal administration, direct administration to the target organ (organ) ( Appropriate ones can be selected from (injection).
  • the “target organ” is an organ (organ) that shows the characteristics of CD20 negatively converted B cell malignant lymphoma in a model animal. For example, liver, spleen, kidney where tumor cell infiltration is observed Or bone marrow.
  • the dose can be set arbitrarily. For example, the dose can be maximized as long as it does not cause lethal effects on model animals.
  • the number of administrations can also be set arbitrarily.
  • the number of administrations should be within the range of 1 to 20 times.
  • step (2) a model animal after administration of the test substance is used to examine changes in pathological conditions characteristic of CD-negative B-cell malignant lymphoma. If the pathological condition is improved, the test substance can be judged to be effective. For example, pathological changes can be examined by macroscopic observation of target organs (organs), immunostaining, pathological histological observation, tumor weight measurement, pleural effusion ascites measurement, protein extraction, RNA extraction, FCM, and the like.
  • model animals (control group) to which the test substance is not administered are prepared, and the pathological condition is compared between the test group and the control group to determine the effectiveness of the test substance.
  • a further aspect of the present invention is that the findings obtained by the study using RRBL1, that is, the cause of CD20 inversion is due to epigenetic changes in CD20 mRNA, and that CD20 protein is expressed in CD20-inverted B cell malignant lymphoma cells.
  • a medicine for CD20 positive B-cell malignant lymphoma or CD20 negatively converted B-cell malignant lymphoma, comprising a compound that increases the expression level of CD20 protein on the basis of being capable of being re-expressed The provide.
  • the medicament of the present invention is used in combination with a molecular target drug.
  • the medicament of the present invention can also be configured as a mixed preparation with a molecular target drug (described later), and in this case, it can be used alone.
  • the medicament of the present invention suppresses or prevents a decrease in the expression level of CD20 protein, thereby allowing CD20-positive B-cell malignant lymphoma cells to be expressed. Preventing resistance to molecular target drugs. This creates an environment where the molecularly targeted drug can continue to act and provides a good therapeutic effect. In addition, even in B cells that are determined to be CD20 positive, when the expression level of CD20 is relatively low, the expression level is further increased to provide an environment in which the molecular target drug acts more effectively. .
  • the medicament of the present invention sensitizes CD20 negative B-cell malignant lymphoma cells to molecular target drugs by promoting the reexpression of CD20 protein. Change to the trait shown. As a result, the molecular target drug can act again, resulting in a good therapeutic effect.
  • the "compound that increases the expression level of the CD20 protein” here is to increase the expression level of the CD20 protein by acting on any stage of transcription, translation or post-translational modification of the CD20 gene. Do it with force S.
  • CD20 negative conversion and CD20 mRNA expression level are closely related. Considering this, it can be said that increasing the expression level of CD20 mRNA is effective as a means for increasing the expression level of CD20 protein. Therefore, preferably, in the present invention, as a “compound that increases the expression level of CD20 protein”, a compound that improves the transcription rate by affecting the transcriptional regulation of the CD20 gene (eg, DNA methylase inhibitor, histone depletion). Acetylase inhibitor, histone methylase inhibitor, RNA interference (siRNA), nucleic acid / protein abama, small peptide, dominant negative protein, etc. are used.
  • siRNA RNA interference
  • the expression level of CD20 mRNA increases when a DNA methylase inhibitor or a histone deacetylase inhibitor is used on CD20 negatively converted B-cell malignant lymphoma cells.
  • a DNA methylase inhibitor and / or a histone deacetylase inhibitor is used as an active ingredient.
  • DNA methylase inhibitors such as 5-Aza_2'-Deoxycytidine, 5_Azacytidine, 5-Fuluor o_2'_deoxycytidine, Ri, _Dihydro_5_azacytidine, Zebularine, Hydralazine, all of which are effective for the medicine of the present invention. It is a great candidate for ingredients.
  • histone deacetylase inhibitors include trichostatin A (TSA), valproic acid, fenenolev, tyrate, SAHA suberoylanilidie hydroxamic acid), FR901228 (depsipe ptide, FK228), MS_27_275, CHAPs, LAQ824, YM753, PDX101
  • TSA trichostatin A
  • valproic acid fenenolev
  • tyrate SAHA suberoylanilidie hydroxamic acid
  • FR901228 depsipe ptide, FK2278
  • MS_27_275 CHAPs
  • PDX101 Various compounds such as LBH589 are known, and all of them are potential candidates for the active ingredient of the medicament of the present invention.
  • Two or more compounds classified as DNA methylase inhibitors or histone deacetylase inhibitors may be combined (in combination) to constitute the medicament of the present invention! /.
  • combinations of different types of DNA methylase inhibitors, combinations of one or more DNA methylase inhibitors and one or more histone deacetylase inhibitors, etc. Is optional.
  • a molecular target drug is contained in the medicament of the present invention.
  • Such a medicament can be expected to have the same therapeutic effect as described above when used alone.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention can be formulated according to a conventional method.
  • other pharmaceutically acceptable ingredients e.g., carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspensions, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, Physiological saline and the like.
  • excipient lactose, starch, sorbitol, D-mannitol, sucrose and the like can be used. It is possible to use starch, carboxymethylcellulose, calcium carbonate, etc. as disintegrants.
  • As the buffering agent phosphate, citrate, acetate and the like can be used.
  • emulsifier gum arabic, sodium alginate, tragacanth and the like can be used.
  • suspending agent glyceryl monostearate, aluminum monostearate, methinoresenololose, canolepoxymethinoresenorelose, hydroxymethinoresenorelose, sodium laurinole sulfate and the like can be used.
  • soothing agent benzyl alcohol, black butanol, sorbitol and the like can be used.
  • Propylene glycol as stabilizer Diethylin sulfite, ascorbic acid and the like can be used.
  • phenol benzalkonium chloride
  • benzyl alcohol chlorobutanol, methyl paraben, or the like
  • benzalkonium chloride noroxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • the content of the active ingredient in the medicament of the present invention is generally about 0.001% by weight to about 100% by weight, for example, so that a desired dosage can be achieved depending on the dosage form.
  • the pharmaceutical dosage form of the present invention is not particularly limited.
  • the pharmaceutical of the present invention can be used as a drip, injection, tablet, powder, fine granule, granule, capsule, syrup, external preparation, suppository, or the like. Can be prepared.
  • the present invention further provides a method for treating CD20 positive B cell malignant lymphoma or CD20 negatively converted B cell malignant lymphoma.
  • a DNA methylase inhibitor and / or a histone deacetylase inhibitor and a molecular target drug are used in combination.
  • the former is administered followed by the latter, or both are administered simultaneously.
  • the administration route is not particularly limited, and examples thereof include oral, intravenous, intradermal, subcutaneous, intralymph node, intramuscular, intraperitoneal, transdermal, and transmucosal membranes.
  • administration routes are not mutually exclusive, and two or more arbitrarily selected can be used in combination (for example, intravenous injection or the like is performed simultaneously with oral administration or after a predetermined time has elapsed).
  • the “subject” here is not particularly limited, and includes humans and non-human mammals (including pet animals, livestock, and laboratory animals. Specifically, for example, mice, rats, monoremots, Nomstar, Sanore, U , Pig, goat, hidge, nu, cat, chicken, quail, etc.).
  • the subject in the treatment methods of the present invention is a human.
  • the dose varies depending on symptoms, age, sex, and body weight of the subject of administration, but those skilled in the art will consider the results of preliminary experiments (such as experiments using cells or model animals) and the results of clinical trials.
  • An appropriate dose can be set as appropriate.
  • As the administration schedule for example, once to several times a day, once every two days, once every three days, once every four days, once a week, once every two weeks, etc. can be adopted. In setting the administration schedule, it is possible to consider the condition of the administration subject and the duration of the drug effect.
  • CD10 (+), CD 19 (+), Characteristics of CD20 (+) and Ig K (+) were shown (Fig. 12).
  • the lymphoma cells were confirmed to be CD20 positive.
  • bone marrow infiltration was confirmed by bone marrow puncture.
  • Classical chemotherapy was repeated and partial remission (PR) was obtained ( Figure 1).
  • chemotherapy with rituximab (375 mg / kg) was administered. Thereafter, chemotherapy with rituximab was administered every time the disease progressed.
  • Rituximab was administered for a total of 14 doses. In June 2004, a rapid increase in tumor from the lower abdomen to the groin and an increase in splenomegaly were observed during chemotherapy with rituximab.
  • the bone marrow was infiltrated with lymphoma cells showing CD 10 (+), CD 19 (+), Ig ⁇ (+) and CD20 (-) (Fig. 12). Bone marrow findings confirmed infiltration of CD20-negative lymphoma cells. At this point !, the patient was diagnosed with transformation to CD20 negative diffuse large cell lymphoma (DLBCL). Later, rescue chemotherapy without rituximab was administered, but the condition worsened, and in July 2004, CD20-negative lymphoma cells were also found in the peripheral blood, and the number gradually increased. CD20-negative malignant lymphoma cells, which are worthy of chemotherapy, showed an acute leukemia-like condition, and the patient died of severe pneumonia on February 20, 2005. An autopsy was performed after obtaining informed consent from the patient's family. The patient ’s The clinical course is shown in Fig. 1.
  • Reciprocal translocation t (l; 7) (p36; pl5) between chromosome 1 and chromosome 7 and reciprocal translocation t (14; 18) (q32; q21) between chromosome 14 and 18 are both cells. It was saved with.
  • PCR was performed using a primer (C in Fig. 3) specific for the BCL2 / JH junction site. Genomic DNA was prepared from RRBL1 cells sampled at different culture times and malignant lymphoma cells from patients collected at different clinical stages and used for this PCR study (D in Fig. 3).
  • CD20 protein was unidentifiable (A in Fig. 4). Expression of CD20 protein was confirmed in the Burkitt lymphoma cell line Raji used as a positive control. Next, whole cell lysates were prepared from Raji cells, RRBL1 cells, and NALM6 cells, respectively, and Western blotting using anti-CD20 antibody was performed. NALM6 cells have been reported as a CD20 negative cell line and serve as a negative control. As shown in FIG.
  • CD20 protein expression was confirmed only in Raji cells, and NALM6 cells and RRBL1 cells were negative. Interestingly, however, CD20 protein expression was also observed in RRBL1 cells after exposure to long time (not shown). From this result, the expression level of CD20 protein is very high in RRBL1 cells. It was suggested that the amount was not confirmed by FCM or immunostaining.
  • CD20 mRNA in RRBL1 cells was confirmed by quantitative RT-PCR (C in Fig. 4). MRNA prepared from Raji cells was used as a positive control, and mRNA prepared from 293T cells was used as a negative control. In addition, the RNA of lymphoma cells collected from patients with CD20-positive B-cell malignant lymphoma was similarly examined. As a result of the experiment, it was confirmed that the expression level of CD20 mRNA in RRBL1 cells was about 100 times lower than Raji cells and patient samples as positive controls (C in FIG. 4). No amplification could be confirmed in the negative control 293T cells. Based on the above, it was suggested that the decrease in CD20 protein expression level in RRBL1 cells was due to the decrease in mRNA expression level.
  • sub-strain R RBL2 cells were established by long-term culturing of RRBL1 cells.
  • CD20 protein expression was confirmed by Western blot as in aji cells (D in Fig. 4). This clearly indicates that RRBL 1 cells retain the CD20 protein expression ability.
  • some epigenetic regulatory mechanism acts on the decrease in CD20 mRNA expression level! /, Te! /.
  • RNA prepared from RRBL1 cells was made into a saddle type, and the entire CDS gene CDS was amplified by RT-PCR and subcloned into the T7Ts_Flag vector. After translating the CD20 protein with the Flag tag by in vitro translation, SDS-PAGE was performed, and Western blotting using an anti-Flag antibody was performed (FIG. 5). Normal size CD20 protein is translated (lane 1). In addition, although the gene sequence was sequenced for 10 clones, no gene mutation was observed.
  • Rituximab 500 mg / ml was added to RPMI1640 culture medium containing 10% FCS, and cultured at 37 ° C for 2 days, and the number of viable cells was measured. Raji cells were cultured under the same conditions (control group). As shown in FIG. 6, the growth of Raji cells was significantly suppressed by rituximab. No inhibition of growth was observed in R RBL1 cells. Thus, RRBL1 cells were confirmed to be resistant to rituximab in vitro.
  • RNA and protein were extracted from the cultured cells and subjected to Western blot analysis (using anti-CD20 antibody, anti-IRF4 antibody, anti-PU.1 antibody, anti-DNMT1 antibody, anti-GAPDH antibody) and RT-PCR. The results are shown in Fig. 7C.
  • IRF4 and PU.1 are transcription factors that have been reported to bind to the CD20 gene promoter. These expressions are observed before Aza administration, and there is a temporary increase in expression (lane 5).
  • DNMT1 DNA methyltransferase 1
  • DNMT1 DNA methyltransferase 1
  • Aza and TSA were administered alone or in combination to the culture supernatant of RRBL1 cells.
  • Cells were washed 1 day after Aza administration. After further cultivation for 2 days, proteins were extracted from the cells.
  • protein was extracted from the cells 24 hours after TSA administration.
  • Aza was first administered and cultured for 1 day. The washed cells were cultured for 1 day, TSA was administered, and after 1 day, the cells were lysed and the protein was extracted.
  • Each sample thus obtained was subjected to SDS-PAGE, and then Western blotting using an anti-CD20 antibody and an anti-GAPDH antibody was performed. The results of Western blotting are shown in Fig.
  • RRBL1 cells (untreated group) and RRBL1 cells (treated group) treated with Aza and TSA were cultured in the absence (, country) or presence ( ⁇ , ⁇ ) for 2 days, respectively.
  • the number of viable cells was compared (C in Fig. 8).
  • Proliferation of RRBL1 cells treated with Aza and TSA was significantly inhibited by rituximab ( ⁇ ). This result indicates that RRBL1 cells in which CD20 protein expression was induced by treatment with Aza and TSA are sensitive to rituximab.
  • the structure of the CD20 gene promoter is shown in Fig. 9A.
  • the CD20 gene promoter contains the binding domains of transcription factors Pu.l and IRF4. Further downstream is an E-box that has been reported to bind to transcriptional regulators such as Oct2.
  • CMP assembly Chromatin immunoprecipitation of the CD20 gene promoter site in RRBL1 cells was performed. After fixing formalin-fixed RRBL1 cells treated with Aza and TSA (treated group) and untreated RRBL1 cells (untreated group), chromatin was extracted, anti-Pul antibody, anti-IRF4 antibody, anti-acetylated H4 (Ac_H4 ) Chi P assay was performed using antibody, anti-Sin3 antibody, and anti-HDAC1 antibody. The bound DNA was detected by PCR using the primers shown in Fig. 9A. As shown in FIG. 9B, Pu.l and IRF4 were bound to the CD20 plug motor with or without drug treatment (lanes 5 to 8 ).
  • RRBL1 cells are useful as a model of rituximab-resistant CD20 negative conversion B cell malignant lymphoma. If a model for transplantation of RRBL1 in vivo is established, it will be a more useful system. Therefore, RRBL1 cells were injected subcutaneously into the back of NOD / SCI D mice (Laboratory Research Laboratory Central Research Institute (Kana j11 Prefecture, J11 Sakizaki)) to examine whether or not a tumor was formed. Tumor formation became visible macroscopically on day 30 after injection, and tumor growth could be observed until day 53 ( Figure 10).
  • RRBL1 cells can be maintained in the in vivo environment of NOD / SCID mice.
  • RRBL1 cells were administered intravenously to observe tumor formation. 50 days after transplantation, the mice were anesthetized and the organs were taken out and examined for histopathology (left in FIG. 11). Tumor cells proliferate by infiltrating tumor organs such as liver, spleen, kidney, bone marrow, etc., and when immunostaining is performed, the tumor cells retain the characteristics of CD20 negative and CD79a positive B lymphocytes Was confirmed. As a result of comparison with the autopsy histology of the patient from whom the RRBL1 cells originated (Fig.
  • the patient tissue showed that CD20 negative and CD79a positive B cell malignant lymphoma cells were found in the liver, spleen, kidney, The bone marrow showed marked infiltration, and it was confirmed that the pathological findings were very similar to those of RRBL1-transplanted mice.
  • RRBL1 cell NOD / S CID transplantation model reflects the pathology of the patient from whom the RRBL1 cell line originated, and a novel treatment strategy for CD 20 negatively converted B-cell malignant lymphoma (conventional chemistry). It strongly suggests that it is extremely useful as an in vivo model for studying not only therapeutic agents but also molecular target drugs, hormones, vitamins, etc.).
  • Patent Documents 15 and 16 More than 5 years have passed since rituximab has been used in combination with classic chemotherapeutic agents (such as CHOP therapy) as a molecular target for CD20-positive malignant lymphoma in clinical settings! Patent Documents 15 and 16). There have been reports that remission rates, disease-free survival rates, or asymptomatic survival rates were significantly prolonged by the combined use of rituximab (Non-patent Documents 3 to 8). However, although combined with rituximab has improved the outcome of B-cell malignant lymphoma with CHOP therapy etc., the cure rate is still far from perfect.
  • classic chemotherapeutic agents such as CHOP therapy
  • Non-Patent Documents 9 to 12 Non-Patent Documents 9 to 12
  • this rituximab resistance problem will become an increasingly serious problem in the treatment of patients with recurrent B-cell lymphoma as well as the first. From these points of view, we believe that at least the following two points will need to be considered immediately.
  • the first is a detailed analysis of the CD20 negative conversion mechanism, and the second is overcoming rituximab resistance.
  • RRBL1 cells which are CD20 negatively transformed B cell malignant lymphoma cells, from patients who had CD20 negatively relapsed and transformed into diffuse large cell lymphoma (DLBCL) after administration of CD20 positive follicular lymphoma, capuximab. Succeeded in establishing a stock.
  • CD20 antigen was not detectable by FCM or immunostaining.
  • the Western blot method confirmed the expression of CD20 protein to a small extent, and interestingly, the quantitative RT-PCR method showed an amount of CD20 of about 1/100 of that of CD20 positive lymphoma cells. The expression of mRNA was confirmed.
  • CD20 mRNA expression level S and the expression of CD20 surface antigen are important factors contributing to the negative conversion and cause rituximab resistance in patients.
  • sufficient expression of the CD20 protein was confirmed in the sub-strain RRBL2 obtained by long-term culture of RRBL1. From this finding, it was considered that CD20 mRNA expression was abnormally suppressed for some reason, resulting in resistance to rituximab.
  • the causes of this suppression of mRNA expression include (1) gene mutation of CD20 promoter, (2) deletion of CD20 gene, (3) abnormal geneation of CpG, and other epigenetics of CD20 mRNA expression.
  • Non-patent Document 17 (4) Transcription factors that regulate the expression of CD20 mRNA and abnormalities in transcriptional regulatory factors are considered. Considering the fact that CD20 protein expression was observed in RR BL2, the possibility of (1) and (2) is considered to be low. [0061] Recently, a gene mutation in the coding sequence of CD20 was reported as one of the causes of the acquired resistance to rituximab (Non-patent Document 10). It can be understood that if a genetic mutation occurs at a specific site, it will be involved in the resistance mechanism. According to a recent report, rituximab has been reported to exert its function by recognizing the higher order structure of the CD20 protein (Non-patent Document 18).
  • CD20 mRNA expression is a major cause of rituximab resistance. It was also shown that CD20 mRNA expression can be induced and CD20 protein can be re-expressed, and that such treatment can increase the sensitivity to rituximab. This result confirms that CD20 mRNA expression is actually effective!
  • RRBL1 cells can be transplanted into NOD / SCID mice. What is important is that the invasion morphological power of tumor cells in this transplanted mouse reproduced the patient's pathology derived from RBBL1 cells very well. This suggests that RRBL1 cells are not only useful for in vitro analysis of CD20 negative conversion mechanisms, but are also very useful for developing therapeutic strategies for rituximab-resistant CD20-negative B-cell malignant lymphoma in vivo. You can say that.
  • the CD20 negatively converted B-cell malignant lymphoma cell, model animal, screening method provided by the present invention develops a therapeutic strategy for preventing or overcoming resistance to a molecular target drug targeting CD20 Useful above.

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Description

明 細 書
CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫細胞株及びその利用
技術分野
[0001] 本発明は B細胞性悪性リンパ腫の治療又は治療法の開発に有用な技術に関する。
本明細書が開示する技術は、 B細胞性悪性リンパ腫の中でも、 CD20の陰転化によつ て、 CD20を標的とした分子標的薬に対して耐性を示すに至った病態（CD20陰転化 B 細胞性悪性リンパ腫）の治療又は治療法の開発におレ、て特に有用である。
背景技術
[0002] リツキシマブ（Rituximab)は、 Bリンパ球に特異的に発現する CD20抗原を特異的に 認識するモノクローナルキメラ抗体である（非特許文献 1、 2)。 CD20抗原は、比較的 進行の遅レ、濾胞性悪性リンパ腫や進行の速!/、びまん性悪性リンパ腫などに代表され る B細胞性の悪性腫瘍に広く発現する。リツキシマブは CD20抗原に対する分子標的 薬として、 CD20抗原を発現するこれらの B細胞性悪性疾患に対する化学療法に加え て投与されるようになった（非特許文献 3〜8)。 25年以上にわたって、 CHOP化学療 法は B細胞性悪性リンパ腫患者に対して利用されてきた力 残念なことに、他の化学 療法剤の組み合わせや、投与量の変更によっても、疾患の治癒率を向上させること はできなかった。し力も最近の報告では、 CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫に対して、 CHOPをベースとした古典的な化学療法にリツキシマブを併用することで疾患の治癒 率や無病生存率が有意に改善されることが確認された (非特許文献 3〜8)。
[0003] リツキシマブが臨床の場で使用されるようになって 5年が経過する力 S、 CD20陽性悪 性リンパ腫の治癒率は未だ満足とは言!/、がたレ、値であり、リツキシマブで治療を受け た患者のうち無視できな!/、数の患者にお!/、て、リツキシマブに反応しな!/、腫瘍の進 展、形質転換が経験されるようになった (非特許文献 9〜； 12)。最近 Teruiらは、 48人 の CD20陽性リンパ腫患者のうち 5人の患者がリツキシマブに耐性を示し、また 48人の うち 10人の CD20コーディングシークェンス部分に遺伝子変異を認めたと報告した（非 特許文献 10)。遺伝子変異による CD20蛋白の構造変化カ^ッキシマブ耐性のメカ二 ズムの一つであろうと推測されている。しかし CD20のコーディングシークェンス部分 の遺伝子変異とリツキシマブ耐性との間に明確な関連性が示されず、このこと力、らも、 遺伝子変異以外にもリツキシマブ耐性のメカニズムが存在することが示唆された。 最近になって我々は、リツキシマブの反復投与の後にリツキシマブ耐性の特徴を持 つ腫瘍に形質転換した、 CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫 (発症時診断)の患者を経 験した。この患者の病勢は、リツキシマブ投与中に悪化を示し、その時点における病 理所見やフローサイトメトリー (FCM)による検討では、リンパ腫細胞に CD20の発現が 認められなかった。
非特許文献 1： Cneson BD. Monoclonal antibody tnerapy for B-cell malignancies. Se min Oncol. Apr 2006;33(2 Suppl 5):S2- 14·
非特許文献 2： Imai , Takaoka A. Comparing antibody and small-molecule therapies for cancer. Nat Rev Cancer. Sep 2006;6(9):714_727·
非特許文献 3 : Coiffier B, Lepage E, Briere J, et al. CHOP chemotherapy plus rituxi mab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large_B_cell lympho ma. N Engl J Med. Jan 24 2002;346(4):235- 242·
非特許文献 4 : van Oers MH, Klasa R， Marcus RE, et al. Rituximab maintenance imp roves clinical outcome of relapsed/ resistant follicular non-Hodgkin' s lymphoma, bot h in patients with and without rituximab during induction: results of a prospective ra ndomized phase III intergroup trial. Blood. Jul 27 2006.
非特許文献 5： Habermann TM, Weller EA， Morrison VA, et al. Rituximab-CHOP ve rsus CHOP alone or with maintenance rituximab in older patients with diffuse large B-cell lymphoma. J Clin Oncol. Jul 1 2006;24(19):3121- 3127.
非特許文献 6： Pfreundschuh M, Trumper L, Osterborg A, et al. CHOP- like chemot herapy plus rituximab versus CHOP—like chemotherapy alone in young patients with good-prognosis diffuse large-B-cell lymphoma: a randomised controlled trial by the MabThera International Trial (MInT) Group. Lancet Oncol. May 2006;7(5): 379-391 非特許文献 7： Hiddemann W, Kneba M, Dreyling M, et al. Frontline therapy with rit uximab added to the comoination of cyclophosphamide , doxorubicin, vincristine, and prednisone (CHOP) significantly improves the outcome for patients with advanced- stage follicular lymphoma compared with therapy with CHOP alone: results of a pros pective randomized study of the German Low-Grade Lymphoma Study Group. Blood • Dec 1 2005; 106(12):3725- 3732·
^特許文献 8 : Czuczman MS, Weaver R， Alkuzweny B， Berlfein J, Grillo—Lopez AJ. Prolonged clinical and molecular remission in patients with low-grade or follicular no n-Hodgkin's lymphoma treated with rituximab plus CHOP chemotherapy: 9 -ye r foil ow-up. J Clin Oncol. Dec 1 2004;22(23):4711- 4716.
非特許文献 9 : Alvaro-Naranjo T， Jaen- Martinez J， Guma-Padro J， Bosch- Princep R ， Salvado-Usach MT. CD20~negative DLBCL transformation after rituximab treatm ent in follicular lymphoma: a new case report and review of the literature. Ann Hema tol. Sep 2003;82(9):585-588.
特許文献 10 : Yasuhito Terui TS， Yuji Mishima, Yuko Mishima, Natsuhiko Sugimur a, Kiyotsugu Kojima, Masahiro Yokoyama, Kiyohiko Hatake. Identification of CD20 Mutations in Malignant Lymphoma: Can They Be Predictors of Response to Rituxim ab? Paper presented at: 47th American Society Of Hematology Annual Meeting; De cember 12， 2005， 2005; Atlanta.
特許文献 11： Davis TA， CzerwinsKi DK， Levy R. Therapy of B-cell lymphoma with anti-CD20 antibodies can result in the loss of CD20 antigen expression. Clin Cane er Res. Mar 1999;5(3):611- 615.
特許文献 12 : Kinoshita T， Nagai H， Murate T， Saito H. CD20-negative relapse in B-cell lymphoma after treatment with Rituximab. J Clin Oncol. Dec 1998; 16(12):391 6.
非特許文献 13 : Crescenzi M， Seto M， Herzig GP， Weiss PD， Griffith RC， Korsmeyer SJ. Thermostable DNA polymerase chain amplification of t(14; 18) chromosome brea kpoints and detection of minimal residual disease. Proc Natl Acad Sci U S A. Jul 198 8;85(13):4869-4873.
非特許文献 14 : Gribben JG， Freedman A， Woo SD， et al. All advanced stage non-H odgkin's lymphomas with a polymerase chain reaction amplifiable breakpoint of bcl~2 have residual cells containing the beト 2 rearrangement at evaluation and after treat ment. Blood. Dec 15 1991;78(12):3275- 3280·
非特許文献 15 : Maloney DG， Grillo-Lopez AJ， White CA， et al. IDEC-C2B8 (Rituxi mab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade no n-Hodgkin's lymphoma. Blood. Se 15 1997;90(6):2188- 2195·
非特許文献 16 : Maloney DG， Grillo-Lopez AJ， Bodkin DJ， et al. IDEC-C2B8: result s of a phase I multiple-dose trial in patients with relapsed non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. Oct 1997; 15(10):3266_3274.
非特許文献 17 : Egger , Liang G， Aparicio A， Jones PA. Epigenetics in human disea se and prospects for epigenetic therapy. Nature. May 27 2004;429(6990):457_463. 非特許文献 18 : Binder M， Otto F， Mertelsmann R， Veelken H， Trepel M. The epito pe recognized by rituximab. Blood. May 16 2006.
特許文献 19 : Kiyoi H， Naoe T. immunoglobulin variable region structure and B_ce 11 malignancies. Int J Hematol. Jan 2001;73(1):47_53
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
リツキシマブに耐性を示すに至った場合、有効な代替療法が存在しなレ、のが現状 であり、リツキシマブに対する耐性化の克服が急務となっている。耐性化を克服でき ればリツキシマブの継続的な使用が可能となり、多くの患者にとって福音となる。また 、医療界への貢献も計り知れない。ところで、現在のところ顕在化してはいないが、リ ツキシマブに限らず、 CD20を標的とした他の分子標的薬についても同様の機序に基 づく耐性化の出現が予想される。さらには、将来開発される分子標的薬についても同 様の機序に基づく耐性化の出現が懸念される。
そこで本発明は、リツキシマブに代表される、 CD20を標的とした分子標的薬に対す る耐性化の阻止又は克服に有効な治療戦略の開発に有用なツール、手段などを提 供することを課題とする。また、当該治療戦略に利用される治療薬及び治療法を提 供することも課題とする。 課題を解決するための手段
本発明者らは、 CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対する有効な治療戦略の開 発を目指して検討を重ねた。その結果、以下の知見'成果が得られた。
(1) CD20陰転化によって、 CD20を標的とした分子標的薬であるリツキシマブに耐性 となった患者の腫瘍細胞より細胞株 (CD20陰転化悪性リンパ腫細胞株)を樹立する ことに成功した。
(2)この細胞株（RRBL1)を用いて、 CD20の発現低下のメカニズムを解析した。その 結果、 CD20 mRNA発現量の減少が CD20の陰転化の重要な一因であることが強く示 唆された。興味深いことに、 RRBL1を長期培養することによって樹立された亜株 RRBL 2においては、 CD20蛋白の十分な発現が確認された。これらの結果は、 CD20陰転化 細胞において CD20を再発現させることが可能であることを示すとともに、 CD20の再 発現を誘導することが CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫の有効な治療戦略になるこ とを示唆する。
ここで、分子標的薬の高い特異性を考慮すれば、本発明者らが見出した耐性獲得 に至る上記の機序は普遍性が高いといえる。従って、 CD20の再発現を誘導するとい う戦略は、 RRBL1が由来する病態に限らず、 CD20の陰転化によって分子標的薬に 対して耐性を獲得するに至った様々な病態に対して有効であることが大いに期待さ れる。
(3) RRBL1に種々の薬剤を添加し経時的に CD20の発現を解析したところ、特定の薬 剤（DNAメチル化酵素阻害剤である 5-Aza_2'-Deoxycytidine及びヒストン脱ァセチル 化酵素阻害剤であるトリコスタチン A)によって CD20 mRNA及び CD20蛋白の誘導が 可能であった。即ち、 DNAメチル化酵素阻害剤及びヒストン脱ァセチル化酵素阻害 剤力 CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対する治療薬として有望であることが判 明した。また、 RBBL1を用いた試験系力 CD20の発現誘導に基づく治療戦略に有用 な化合物を見出すための有効な手段になることが裏付けられた。
(4) RRBL1を免疫不全マウスに移植し、腫瘍が形成されるか否かを検討した結果、腫 瘍の形成及び増大が観察され、 RBBL1細胞が免疫不全マウスの生体内の環境で維 持可能であることが判明した。また、 RBBL1細胞を経静脈的に投与して腫瘍の形成 を観察したところ、 RBBLl細胞の元になつた患者と非常に近似した病理所見を示した 。このように、 CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫を再現する in vivoモデルを作製する ことに成功した。また、 in vitroにとどまらず、 in vivoにおいて治療戦略の開発を進め る上でも RBBL1が非常に有用であることが示された。
本発明は主として以上の知見 ·成果に基づくものであり、以下の細胞株、スクリー二 ング方法などを提供する。
[1] CD20蛋白の発現が陰転化した B細胞性悪性リンパ腫に由来する CD20陰転化 B 細胞性悪性リンパ腫細胞株。
[2]前記 B細胞性悪性リンパ腫は、濾胞性リンパ腫から形質転換したびまん性 B細胞 性悪性リンパ腫である、 [1]に記載の細胞株。
[3] CD20蛋白の発現の陰転化が CD20 mRNAの発現量低下に起因する、 [1]に記 載の細胞株。
[4] CD20蛋白の潜在的発現能を有する、 [3]に記載の細胞株。
[5] CD10陽性、 CD19陽性、 CD20陰性、及び免疫グロブリン軽鎖（ K鎖、 λ鎖）陰性 である、 [1]に記載の細胞株。
[6]受託番号： FERM BP— 10910で特定される細胞株である、 [1]に記載の細胞 株。
[7] [1]〜 [6]の!/、ずれかに記載の細胞株を免疫不全非ヒト動物に移植又は投与す ることによって作製される、 CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫の病態を反映したモデ ノレ動物。
[8]前記免疫不全非ヒト動物が NOD/SCIDマウスである、 [7]に記載のモデル動物。
[9] CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫又は CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対し て有効な物質のスクリーニング方法であって、
(1)試験物質の存在下、 CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫細胞を培養するステツ プ、及び
(2)培養後の細胞における CD20 mRNA発現量又は CD20蛋白発現量を測定し、前 記試験物質の CD20発現誘導能を評価するステップ、
を含む方法。 [10]以下のステップを更に含む、 [9]に記載のスクリーニング方法、
(3)ステップ（2)の結果に基づいて選抜された試験物質の存在下、 CD20陰転化 B細 胞性悪性リンパ腫細胞を培養するステップ、
(4) CD20を標的とした分子標的薬の存在下、ステップ（3)後の細胞を培養するステツ プ、及び
(5)細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ。
[11]以下のステップを更に含む、 [9]に記載のスクリーニング方法、
(3)ステップ（2)の結果に基づいて選抜された試験物質と、 CD20を標的とした分子 標的薬の存在下、 CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫細胞又は CD20陰転化 B細胞性 悪性リンパ腫細胞を培養するステップ、及び
(4)細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ。
[12]前記 CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫細胞力 [1]〜[6]のいずれかに記載 の細胞株である、 [9]〜[； 11]の!/、ずれかに記載のスクリーニング方法。
[13] CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫又は CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対し て有効な物質のスクリーニング方法であって、
(1)試験物質の存在下、 [1]〜 [6]のいずれかに記載の細胞株を培養するステップ 、及び
(2) CD20を標的とした分子標的薬の存在下、ステップ（1)後の細胞を培養するステ ップ、及び
(3)細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ、 を含む方法。
[14] CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫又は CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対し て有効な物質のスクリーニング方法であって、
(1)試験物質、及び CD20を標的とした分子標的薬の存在下、 [1]〜[6]のいずれか に記載の細胞株を培養するステップ、及び
(2)細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ、 を含む方法。
[ 15] CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対して有効な物質のスクリーニング方法で あってゝ
(1) [7]又は [8]に記載のモデル動物に試験物質を投与するステップ、及び
(2)前記モデル動物が反映する、 CD陰性 B細胞性悪性リンパ腫に特徴的な病態の 変化を調べるステップ、
を含む方法。
[16] CD20蛋白の発現量を増大させる化合物を含み、 CD20を標的とした分子標的 薬と併用されることを特徴とする、 CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫又は CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対する医薬。
[17]前記化合物が、 CD20 mRNAの発現量を増大させる作用を有する、 [16]に記 載の医薬。
[18]前記化合物として DNAメチル化酵素阻害剤及び/又はヒストン脱ァセチル化酵 素阻害剤が用いられる、 [16]に記載の医薬。
[19]DNAメチル化酵素阻害剤及び/又はヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤と、 CD2 0を標的とした分子標的薬とを併用することを特徴とする、 CD20陽性 B細胞性悪性リ ンパ腫又は CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫の治療法。
[20] CD20を標的とした分子標的薬と併用されて薬効を発揮する、 CD20陽性 B細胞 性悪性リンパ腫又は CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対する医薬を製造するた めの DNAメチル化酵素阻害剤又はヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤の使用。
図面の簡単な説明
[図 1]RRBL1細胞株の由来である患者の臨床経過。患者は 1993年初診で来院。 FSC の診断にて古典的化学療法（T)を施行された。さらに 1998年からはリツキシマブ併 用化学療法（V)が繰り返し施行された。患者の病状は完解に入ることなぐ病勢進 行を見る際に化学療法が繰り返し施行された。 2004年、リツキシマブ併用化学療法 施行中に悪性リンパ腫の急速な進行が認められた。この時点で、 CD20陰転化 DLBC Lへの形質転換と診断された。この頃より、末梢血中に CD20陰性の腫瘍細胞が多数 認められるようになった。 2004年 7月に、腫瘍細胞を含む末梢血が採取され、長期の 培養を経て RRBL1細胞株が樹立された。患者に対しリツキシマブを含まな!/、救済化 学療法を施行したが効果は低ぐリンパ腫の白血病化が顕著に認められ、 2005年 2月 、患者は死亡した。
園 2]RRBL1細胞と、その元になつた患者のリンパ腫細胞に認められた染色体異常。
(A)は患者検体、（B)は RRBL1細胞。詳細な染色体異常は以下の通りである。 (A) 47， XY, t(l ;7)(p36;pl5), t (2;8)(pl2;q24), -6， add(6)(q21), t(14; 18)(q32;q21), +18， d er(18)t(14; 18)， +der (？) t(?; 13)(?;ql2), +mar2。 （B) 47， XY, der(l)t(l ;?7) (p36;pl5),d up(l)(q21q42), add(2)(pl l), -6， del(6)(ql5q21), add(7)(pl l), -8， add(10)(pl3), -13， t (14; 18)(q32;q21),+der(18)t(14; 18), +3mar。
園 3]RRBL1細胞と、その元になつた患者のリンパ腫細胞に認められた染色体異常。
(C) t(14; 18)(q32;q21)に認められる、 BCL2遺伝子と JH遺伝子の相互転座を示す。 転座部位は黒の矢印で示される。 JHにおける詳細な転座部位は、 J1力も J6まで報告 がある（非特許文献 13、 19)。転座部位を増幅するために用いられた PCRプライマー が黒の矢印で示される。 (D) RRBL1細胞とそのもととなった患者の臨床病期ごとに採 取された細胞よりゲノム DNAが抽出され、 BCL2-JH転座部位を増幅するための PCR が施行された。すべての検体において、同一サイズの単一バンドが確認された。 Ad- LN;患者が来院した際に採取されたリンパ節、 TF-PB; 2004年 7月に採取された末梢 血リンパ腫細胞、 RRBLla (90日培養後）と RRBLlb ( 120日培養後）； in vitroで培養 された RRBL1細胞。 （E) BCL2-JH6転座部位の遺伝子配列 (Genbank登録番号； DQ 979790)。
[図 4]RRBL1細胞における、 CD20蛋白と mRNAの発現。 （A) RRBL1細胞、 Raji細胞に おける抗 CD20抗体 (B 1モノクローナル抗体)を用いた免疫染色。 RRBL1細胞におい ては CD20の発現は認められないが、 Raji細胞においては細胞表面に発現が確認さ れる。 MG;メイギムザ染色。 （B) Raji細胞、 RRBL1細胞、 NALM6細胞力、ら全細胞溶 解液が採取され、 CD20抗体を用いたウェスタンブロット法を施行した。 Raji細胞（レー ン 1 )においては、 CD20蛋白の発現が確認された力 RRBL1細胞、 NALM6細胞にお いては発現が確認されなかった（レーン 2、 3)。陽性コントロールとして、 GAPDHに対 するウェスタンブロットが施行された。 （C) CD20 mRNAを検出する定量的 RT-PCR。 陰性コントロールとして 293T細胞が用いられた（レーン 2)。 RRBL1細胞における CD2 0 mRNAの発現量（レーン 3)は陽性コントロール Raji細胞（レーン 1 )に比べ有意に低 かった。さらに CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫患者から得られた細胞から RNAを抽 出し、同様の検討を行った（レーン 4〜11)。 RRBL1細胞における CD20 mRNA発現 量はこれらに比べても有意に低かった。 （D) RRBL1細胞を経代培養し、亜株 RRBL2 が樹立された。この細胞から全細胞溶解液を抽出し、抗 CD20抗体を用いたゥエスタ ンブロットが施行された。 RRBL2細胞において、 CD20の発現が確認された（レーン 3)
〇
[図 5]in vitroトランスレーションによって発現させた蛋白を、抗 Flag抗体で検出（ウェス タンプロット）した結果。レーン 1は CD20遺伝子の CDSを揷入したベクター力、らの翻訳 産物、レーン 2は T7Ts_Flagベクターのみからの翻訳産物。
[図 6]RRBL1細胞のリツキシマブに対する耐性を示す図。 Raji細胞（A)、 RRBL1細胞（ B)の細胞数がそれぞれ折れ線グラフで示される。
[図 7]RRBL1細胞における CD20 mRNA及び CD20蛋白の再発現。 （A) 5_Aza'-2-De oxycytidineで処理した RRBLl細胞を RT-PCRで解析した結果。 （B)実験手順の説明 。 （C)培養後の細胞より抽出した RNA及び蛋白を用いたウェスタンプロットの結果。 R aji (レーン 1)及び NALM6 (レーン 2)をそれぞれ、 CD20発現の陽性対照及び陰性対 照として使用した。
[図 8] (A) Aza、 TSAで処理した RRBLl細胞のウェスタンブロット解析の結果。 （B) Az aの存在下、又は Aza及び TSAの存在下で培養した RRBL1細胞を FCMで解析した結 果。 （C)リツキシマブに対する耐性の比較。 RRBL1細胞（非処理群）と、 Aza及び TSA で処理された RRBL1細胞（処理群）をリツキシマブ非存在下（譬、國）又は存在下（♦ 、▲)で培養した後、生細胞数を比較した。
[図 9]CD20遺伝子プロモーターにおける CD20転写調節の解析。 （A) CD20遺伝子 プロモーターの構成。図中の矢印（CD20pro_U、 CD20pro_L)は、クロマチン免疫沈 降法（CMP)で使用された PCRプライマーの位置を示す。 （B)抗 Pu. l抗体、抗 IRF4抗 体、抗ァセチル化 H4(Ac_H4)抗体、抗 Sin3抗体、及び抗 HDAC1抗体を用いた CMP アツセィの結果。 （C)抗 CD20抗体及び抗 GAPDH抗体を用いたウェスタンブロットの 結果。
[図 10]RRBL1細胞を移植した NOD/SCIDマウスに形成された腫瘍の重量。 RRBL1細 胞 (5 X 106)力 SNOD/SCID免疫不全マウスの背部に皮下注射された。投与から 30日 で肉眼的に確認できる腫瘍が認められ、腫瘍サイズか腫瘍の重量が計算された。二 匹のマウスに同様の検討を施行し（SCI, SC2)、ほとんど同様の経過が認められた。
[図 11]RRBL1細胞を投与した NOD/SCIDマウスの病理組織（図左）と RRBL1細胞の 元になつた患者の剖検組織所見（図右）の比較。 RRBL1細胞（5 X 106)が NOD/SCID マウスの静脈内に投与された。移植後 8週間でマウスは適切な麻酔のもとで臓器が摘 出され、病理学的に検討が加えられた。 RRBL1細胞はびまん性に肝臓、脾臓、腎臓 、骨髄等の臓器に浸潤していた (HE染色、図左）。抗 CD20抗体を用いた免疫染色で は腫瘍細胞は陰性を示し、 B細胞を認識する抗 CD79a抗体を用いた免疫染色では 腫瘍細胞は陽性に認められた。また、細胞株のもととなった患者の剖検組織所見を 右に示した。腫瘍細胞は、肝臓、脾臓、腎臓、骨髄にびまん性に浸潤し、抗 CD20抗 体を用いた免疫染色では陰性を示した。抗 CD79a抗体を用いた検討では、陽性を示 し、 B細胞のリンパ腫細胞であることが確認された。これらの結果から、 RRBL1細胞を 移植した NOD/SCIDマウスの病理所見は、患者の病態を良く反映した所見であること が確認された。
園 12]原発性リンパ腫細胞と RRBL1細胞の表面抗原。
園 13]名古屋大学医学部附属病院における CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫に対す るリツキシマブ使用経験と CD20陰性転化の頻度。名古屋大学医学部附属病院にお V、て、リツキシマブを含む化学療法を施行された CD20陽性悪性リンパ腫症例を示す 。 2001年末から 2006年の約 5年間において 124症例に対してリツキシマブを含む化学 療法が施行され、うち 36症例（29%)において再発、再燃が認められた。このうちの約 半数 19症例において再度組織生検が施行され、 5症例（再生検された症例のうち 26. 3%)にお!/、て CD20発現の陰性転化が確認された。 CD20が陰性転化した症例の予 後は極めて不良で、陰性転化確認後 1年以内に全ての症例が死亡している。
発明を実施するための最良の形態
(用語の説明）
説明の便宜上、本明細書中で使用する用語の一部についてその定義 ·意味を以 下にまとめて記す。 「CD20 (clusters of differentiation 20) (又は CD20抗原）」は分子量 33〜37kDaのリ ン酸化蛋白であり、 B細胞の活性化や増殖に関与すると考えられている。 CD20は B細 胞系表面マーカーの一つであり、成熟 B細胞の他、 B細胞性悪性リンパ腫の大部分、 及び慢性リンパ性白血病細胞にぉレ、てその発現が認められて!/、る。
「CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫」とは CD20の発現が認められる B細胞性悪性リン パ腫のことを!/、い、濾胞性 B細胞性非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型 B細胞性 悪性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫等が該当する。
「CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫」とは、もともと CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫 であったものが、 CD20蛋白の発現レベルの大幅な低下が生ずることによって CD20 陰性であると評価されるに至った病態のことをいう。このような CD20陽性から CD20陰 性への変化のことを本明細書では「CD20陰転化」と表現する。 CD20を標的とした分 子治療薬 (例えばリツキシマブ）の継続的な使用によって CD20陰転化が生ずることが 経験されている。
「CD20を標的とした分子標的薬」とは、 CD20を標的として設計された化合物であつ て、 CD20への作用を介して薬効を発揮するものをいう。現在、 CD20を標的とした分 子標的薬としてリツキシマブ、イブリルモマブ（9°Y Ibritumomab)、トシツモマブ（mI To situmomab)が実際に癌治療に使用されて!/、る。リツキシマブは Rituxan (登録商標、 ノ ィオジェン 'アイデック社)の名称で、イブリルモマブは Zevalin (登録商標、バイオジ ェン 'アイデック社）の名称で、トシツモマブは BEXXAR (登録商標、ダラクソ 'スミスクラ イン社）の名称で提供されて!/、る。
(CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫細胞株）
本発明の第 1の局面は CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫細胞株（以下、「本発明 の細胞株」という）に関する。本発明の細胞株は、 CD20蛋白の発現が陰転化した B細 胞性悪性リンパ腫に由来する。即ち、本発明の細胞株は、当初は CD20陽性 B細胞 性悪性リンパ腫であったものが CD20陰性と評価されるに至った B細胞性悪性リンパ 腫の細胞を基に株化されたものである。例えば、 CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫 を罹患する患者の末梢血より、単核球の分離、それに続く培養によって本発明の細 胞株を樹立することが可能である。後述の実施例に示すように本発明者らは、当初、 濾胞性リンパ腫と診断され、リツキシマブによる治療後に CD20陰性のびまん性 B細胞 性悪性リンパ腫として形質転換して再燃した患者より CD20陰転化 B細胞性悪性リン パ腫細胞株の樹立に成功している。当該細胞株（RRBL1)は以下の通り所定の寄託 機関に寄託されており、容易に入手可能である。
寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター ( T 305-85 66 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 1号 中央第 6)
寄託日：平成 18年 9月 20日
受託番号： FERM P- 21026
[0009] 尚、上記細胞株（RRBL1)は、平成 19年（2007年） 9月 12日付けの移管請求に基 づき、以下の通り国際寄託へ移管されている。
国際寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (〒 30 5-8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 1号 中央第 6)
受領番号： FERM ABP- 10910
受託番号： FERM BP— 10910
[0010] 本発明者らの検討の結果、 RRBL1では CD20 mRNAの発現レベルの大幅な低下が 生じていることが判明した。即ち、 CD20 mRNAの発現量低下に起因して CD20蛋白 の発現が陰転化していることが明らかとなった。このように RRBL1の樹立によって、分 子標的薬に対する耐性獲得の機序の一端が明らかとなった。
また、 RBBL1は CD20蛋白の発現能を保持していること、即ち CD20蛋白の潜在的発 現能を有することが明らかとなった。
ここで、分子標的薬の特異性の高さや作用機序の普遍性を考えると、 CD20を標的 とした分子標的薬に対して耐性を獲得した病態から樹立される細胞株では、 RRBL1 と同様に CD20 mRNAの発現量低下に起因して CD20蛋白の発現が陰転化しており、 且つ CD20の潜在的発現能を有する蓋然性が高い。つまり、 CD20を標的とした分子 標的薬に対して耐性を獲得した様々な病態より、可逆的に mRNAの発現量が低下す ることで CD20の陰転化が生じた細胞株を RRBL1と同様に樹立可能であるといえる。
[0011] 本発明者らの更なる検討によって RRBL1は CD 10陽性、 CD 19陽性、 CD20陰性、及 び免疫グロブリン軽鎖（ κ鎖、 λ鎖）陰性（以上、 Β細胞マーカー）、 CD2陰性、 CD3陰 性、 CD4陰性、 CD 5陰性、 CD7陰性、 CD8陰性、 CD56陰性（以上、 T細胞又は NK細 胞マーカー）、 CD l lc陰性、 CD 16陰性、 CD25陽性、 CD30陰性、及び CD34陰性であ ることが判明した（図 12を参照）。
[0012] (モデル動物）
本発明の第 2の局面は本発明の細胞株を利用して作製されるモデル動物に関する 。本発明のモデル動物は、本発明の細胞株を免疫不全非ヒト動物に移植又は投与 することによって作製され、使用する細胞株に対応した特徴的な病態を反映する。こ の特徴によって、使用する細胞株に対応した病態に対する治療戦略を検討するため の in vivoモデルとして有用となる。例えば、本発明のモデル動物を用いて候補治療 薬の薬効や副作用を検討することや、 CD20の発現量の変化を組織レベルで検討す ること等を fiうこと力 S可倉である。
使用する細胞株によって本発明のモデル動物が反映する病態は異なる力 典型的 には、本発明のモデル動物では病理所見として肝臓、脾臓、腎臓、骨髄等への腫瘍 細胞の浸潤が認められる。
尚、後述の実施例に示すように、本発明者らは RRBL1を NOD/SCIDマウスに投与 することによって、 RRBL1の元になつた患者の病態を良好に反映したモデルマウスを 作製することに成功している。
[0013] ここで、免疫不全非ヒト動物への細胞の移植又は投与方法は常法に従えばよぐ皮 下注射、腹腔内注射、経静脈投与等を採用することができる（細胞工学 別冊、マウ ス解剖イラストレイテッド（野村慎太郎 著、秀潤社)等の成書が参考になる）。使用す る免疫不全非ヒト動物の種類は特に限定されず、 BALBんヌードマウス、 BALBん Aヌ 一ドマウス、 NU/NUマウス、 MH- IIIヌードマウス、 Fox Chase Scidマウス、 Fox Chase S cid Beigeマウス、 Fox Chase Scid Ourbredマウス、 NOD/SCIDマウス、 NOGマウス、ヌ 一ドラット等を用いればよい。この中でも NOD/SCIDマウス及び NOGマウスが生着性 の点から特に好ましい。尚、上掲の各種免疫不全非ヒト動物は日本クレア株式会社（ 東京、 日本）、 日本チャールズ 'リバ一株式会社（横浜、 日本）、 Charles River Labora tories (ウィルミントン、マサチューセッツ州、米国）、 Taconic (ニューヨーク、米国）など 力、ら入手することが可能である。 [0014] (スクリーニング方法）
本発明の第 3の局面は、 CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫又は CD20陰転化 B細胞 性悪性リンパ腫に対して有効な物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスク リーユング方法の第 1の態様では、（1)試験物質の存在下、 CD20陰転化 B細胞性悪 性リンパ腫細胞を培養するステップと、 （2)培養後の細胞における CD20 mRNA発現 量又は CD20蛋白発現量を測定し、試験物質の CD20発現誘導能を評価するステツ プが実施される。
本発明のスクリーニング方法で選抜された物質 (スクリーニング結果物）は、 CD20を 標的とする分子治療薬 (以下、特に説明のない限り、「分子標的薬」とは「CD20を標 的とした分子標的薬」のことを指す）と併用されるという条件の下、 CD20陽性 B細胞性 悪性リンパ腫又は CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対する医薬の有効成分として 有力な候補 (リード化合物）となる。選抜された物質が十分な薬効を有する場合には そのまま医薬の有効成分として使用することができる。一方で十分な薬効を有しなレ、 場合であっても化学的修飾などの改変を施してその薬効を高めた上で医薬の有効 成分としての使用に供することができる。勿論、十分な薬効を有する場合であっても、 更なる薬効の増大を目的として同様の改変を施してもょレ、。
[0015] スクリーニング結果物は CD20発現誘導能を有する。この CD20発現誘導能によって スクリーニング結果物は、 CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫に対して適用された場合 には CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫細胞が分子標的薬に対して耐性を獲得するこ とを阻止し、 CD20が陽性であっても、その発現量が比較的高くはない B細胞に対して も CD20の更なる発現を促すことによって、分子標的薬がより良好に作用する環境を 作り出す。一方、 CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対して適用された場合には、 CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫細胞を分子標的薬に対して感受性へと変換し、 分子標的薬が再び薬効を奏する環境を作り出す。以上のようにスクリ一ユング結果物 は、分子標的薬と併用されることによって、 CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫及び CD2 0陰転化 B細胞性悪性リンパ腫のいずれに対しても効果的な治療成績をもたらすと期 待される。
以下、本発明のスクリーニング方法の詳細についてステップ毎に説明する。 [0016] (1)培養ステップ
このステップでは CD20陰転化 B細胞悪性リンパ腫細胞を用意し、試験物質の存在 下での培養に供する。 CD20陰転化 B細胞悪性リンパ腫細胞として上記本発明の細 胞株（例えば RRBL1)を用いることができるのは当然である力 株化していない細胞を 用いることもできる。即ち、 CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫を罹患した患者力 採 取した細胞をそのまま本発明のスクリーニング方法に供しても良い。尚、ここでの「そ のまま」とは、株化の操作が行われないことを意味し、分離操作や洗浄操作など、スク リーユング方法に適用するにあたって通常必要とされる操作を制限するものではない
〇
[0017] 使用する細胞の数は特に限定されず、検出感度、実験設備等を考慮して定めるこ とができる。例えば、 1回のスクリーニング操作に I X 102個〜 I X 106個の細胞を用いる こと力 Sでさる。
[0018] 培養液中の試験物質の存在量 (添加量）は任意に設定可能であるが、正常細胞を 同様の条件で培養した際に致命的な影響を与えない範囲で添加量を設定するとよ い。当業者であれば予備実験によって適切な添加量を設定可能である。
培養時間は、試験物質の作用'効果が十分に評価できるように設定されるものであ る力 特に限定されない。例えば、培養時間を 1分〜 10日の範囲内で設定すること 力できる。尚、 目的の作用 ·効果を示す物質が見出された場合には、その物質が作 用-効果を示すまでに要する時間を基に、以降のスクリーニングにおける培養時間を 設定すること力できる。例えば、後述の実施例に記載されるように RRBL1を用いた試 験では;!〜 7日程度の培養によって 5-Aza_2'-Deoxycytidineが CD20の発現を誘導 することが明らかになったことから、この知見に基づいて RRBL1を用いたスクリーニン グ方法であれば培養時間を 1〜7日の範囲内で設定することができる。
[0019] 本発明のスクリーニング方法に供する試験物質としては、様々な分子サイズの有機 化合物 (核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質 (ホスホダリセリド、ス フインゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノィ ド、テルペン、ステロイド、ビタミン、ホルモン等））又は無機化合物を用いることができ る。試験物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者 の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系 を構築すること力できる。尚、細胞抽出液、培養上清などを試験物質として用いてもよ い
ここで、上述の通り、 RRBL1を用いた検討によって CD20陰転化が CD20 mRNAの発 現レベルの低下に起因して生ずることが明ら力、となった。この知見より、 CD20遺伝子 の転写調節に影響を与えることによって転写率を向上させる化合物（DNAメチル化酵 素阻害剤、ヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤、ヒストンメチル化酵素阻害剤、 RNA干 渉（siRNA)、核酸.蛋白ァプタマ一、スモールペプチド、ドミナントネガティブ蛋白等） を試験物質として使用することが好ましレ、。
[0020] (2)測定'評価ステップ
このステップでは、培養後の細胞における CD20 mRNA発現量又は CD20蛋白発現 量 (以下、これら二つをまとめて「CD20発現量」という）を測定し、試験物質の CD20発 現誘導能を評価する。 CD20 mRNA発現量の測定には RT-PCR法（リアルタイム法を 含む）、特異的なプローブを用いた各種ハイブリダィゼーシヨン法（例えばノザンハイ ブリダィゼーシヨン、 in situハイブリダィゼーシヨン）などの常法を採用できる。 CD20蛋 白発現量は、 CD20蛋白に対して特異的に結合する化合物を用いて測定できる。 CD 20蛋白発現量の測定は、これに限定されるものではないが、免疫学的手法によること が好ましい。免疫学的手法では特定の蛋白に対する抗体が使用され、当該抗体の 結合性 (結合量)を指標として当該蛋白が検出される。ここでの用語「抗体」はポリクロ ーナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、 CDRグラフト抗体、ヒト 化抗体、又はこれらの断片等を含む。本発明における抗体は、免疫学的手法、ファ ージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して調製することができる。 免疫学的検出法によれば迅速で感度のよい検出が可能となる。また、操作も簡便 である。尚、検出方法としては例えば、 ELISA法、ラジオィムノアツセィ、フローサイトメ トリー (FCM)、免疫沈降法、免疫染色法、ィムノブロッテイング等の方法が挙げられる
〇
[0021] 標識化した抗体を用いることにより、上記の測定を容易に実施することが可能であ る。抗体の標識化には例えばフルォレセイン、ローダミン、テキサスレッド、オレゴング リーン等の蛍光色素、ホースラディッシュペルォキシダーゼ、マイクロペルォキシダー ゼ、アルカリ性ホスファターゼ、 β D ガラクトシダーゼ等の酵素、ノレミノール、ァク リジン色素等の化学又は生物発光化合物、 32Ρ、 131ι、 125ι等の放射性同位体、及びビ ォチン等を用いることができる。
[0022] 測定結果を用いて試験物質の CD20発現誘導能を評価する。例えば、試験物質の 存在下で培養する細胞 (試験群）と、試験物質の非存在下で培養する細胞（対照群） とを用意し、各群について CD20発現量を測定し、比較する。比較結果から、試験物 質が存在した結果として CD20発現量が変化した程度 (発現量変化）が求められる。 対照群に比較して試験群の CD20発現量が多!/、場合、即ち試験物質に CD20発現誘 導能が認められた場合、当該試験物質が CD20陽性 Β細胞性悪性リンパ腫又は CD2 0陰転化 Β細胞性悪性リンパ腫に対して有効であると判定できる。試験群において CD 20発現量の顕著な増加が認められた場合、当該試験物質の有効性は特に高!/、と判 定できる。
尚、試験物質の非存在下での CD20発現量が予め判明している場合には、この発 現量を対照群の発現量として用いることもできる。また、試験物質の存在下での培養 前後の CD20発現量を比較することによつても、試験物質の CD20発現誘導能を評価 すること力 Sでさる。
[0023] 本発明の一態様では、 CD20発現量の測定を経時的に行い、測定時点の異なる複 数の測定結果を得ることにし、得られた複数の測定結果を用いて試験物質の CD20 発現誘導能を評価する。このような経時的な測定に基づけば、試験物質の作用の仕 方や持続時間など、試験物質の有効性を評価する上で有益な多くの情報を得ること ができる。
[0024] 以上のステップ（1)及び（2)の後、以下のステップ（3)〜（5)を実施することにしても よい。
(3)ステップ（2)の結果に基づいて選抜された試験物質の存在下、 CD20陰転化 B 細胞性悪性リンパ腫細胞を培養するステップ。
(4) CD20を標的とした分子標的薬の存在下、ステップ（3)後の細胞を培養するステ ップ。 (5)細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ。
これらのステップを実施することによって、ステップ（1)及び（2)で選抜された試験 物質が分子標的薬と併用された際に実際に治療効果を示すか否かを確認できる。 以下、各ステップの詳細を説明するカ、ここで特に言及しない事項についてはステツ プ（1)及び（2)における対応する説明が援用される。
[0025] (3)培養ステップ (選抜された試験物質の存在下）
この培養ステップでは、 CD20発現誘導能が認められた試験物質の存在下、 CD20 陰転化 B細胞性悪性リンパ腫細胞が培養される。ここで使用する CD20陰転化 B細胞 性悪性リンパ腫細胞は、ステップ（1)で使用した細胞と同一種類のものでも異なる種 類のものでもよい。後者の例として、ステップ（1)で使用した細胞が由来する患者と異 なる患者から採取した CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫を用いる場合を挙げること 力できる。 CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫細胞として RRBL1を用いることもできる。
[0026] (4)培養ステップ (分子標的薬の存在下）
この培養ステップは分子標的薬の存在下で行われる。分子標的薬としてリツキシマ ブ、イブリルモマブ、又はトシツモマブを好適に用いることができる力 S、これらに限られ るものではない。
培養液中の分子標的薬の存在量 (添加量）は任意に設定可能であるが、正常細胞 を同様の条件で培養した際に致命的な影響を与えない範囲で添加量を設定すると よい。当業者であれば予備実験によって適切な添加量を設定可能である。
培養時間は、分子標的薬の作用が発揮されるのに十分な時間とする。例えば、ここ での培養時間を 1分〜 10日の範囲内で設定することができる。
[0027] (5)測定 ·評価ステップ
このステップでは培養後の細胞の生存数を測定し、試験物質及び分子標的薬の作 用による細胞殺傷効果を評価する。評価結果に基づ!/、て試験物質の有効性が判定 される。例えば、ステップ (3)と (4)を実施する群 (試験群）と、ステップ (4)のみを実施 する群 (即ち、分子標的薬の存在下での培養のみを実施する群：対照群）とを用意し 、各群について培養後の生細胞数を測定し、比較する。比較結果から、試験物質の 存在下での培養を実施した結果として細胞生存率が変化した程度が求められる。対 照群に比較して試験群の生細胞数が少な!/、（細胞生存率が低レ、）場合、即ち試験物 質に分子標的薬の作用 ·効果を高める能力が認められた場合、当該試験物質は有 効であると判定できる。試験群にぉレ、て細胞生存率の顕著な低下が認められた場合 、当該試験物質の有効性は特に高いと判定できる。
対照群を設定するのではなぐ試験群における培養前後の細胞数を比較すること によっても、試験物質の有効性を判定することが可能である。但し、上記の如き対照 群を設定した方が信頼性の高い結果を得ることができる。
尚、このステップにおける測定を経時的に行い、複数の測定結果に基づいて判定 することにしてあよい。
[0028] 本発明の一態様では上記ステップ（3)〜（5)に代えて以下のステップ（3)及び (4) を実施する。
(3)ステップ（2)の結果に基づいて選抜された試験物質と、 CD20を標的とした分子 標的薬の存在下、 CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫細胞又は CD20陰転化 B細胞性 悪性リンパ腫細胞を培養するステップ。
(4)細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ。
[0029] これらのステップを実施することによって、ステップ（1)及び（2)で選抜された試験 物質が、 CD20を標的とした分子標的薬と同時に投与された際に実際に治療効果を 示すか否かを調べることができる。培養ステップに供する細胞として CD20陽性 B細胞 性悪性リンパ腫細胞を採用した場合、 CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫に対する治療 効果を検討することができる。他方、 CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫細胞を採用 した場合は CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対する治療効果を検討することがで きる。
[0030] この態様では試験物質と分子標的薬が共存する条件下で培養を実施する。培養ス テツプに続いて実施される測定 ·評価ステップでは、上記のステップ（5)と同様に、培 養後の細胞の生存数を測定し、試験物質及び分子標的薬の作用による細胞殺傷効 果を評価する。そして評価結果に基づき試験物質の有効性を判定する。対照群とし て、試験物質の非存在下且つ分子標的薬の存在下で培養する細胞、試験物質及び 分子標的薬の非存在下で培養する細胞を用いることができる。 尚、ここで特に言及しなかった事項については、既述の対応する記載が援用される
[0031] 本発明は更に、 CD20を標的とした分子標的薬と併用された際に良好な治療効果を もたらす物質をより簡便にスクリーニングする方法を提供する。ここでのスクリーニング 方法では本発明の細胞株 (RRBL1等）が利用される。具体的には以下の二種類のス クリーニング方法が提供される。
(第 1の態様）
CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫又は CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対して 有効な物質のスクリーニング方法であって、
(1)試験物質の存在下、本発明の細胞株を培養するステップ、及び
(2) CD20を標的とした分子標的薬の存在下、ステップ（1)後の細胞を培養するステ ップ、及び
(3)細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ、 を含む方法。
[0032] (第 2の態様）
CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫又は CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対して 有効な物質のスクリーニング方法であって、
(1)試験物質、及び CD20を標的とした分子標的薬の存在下、本発明の細胞株を培 養するステップ、及び
(2)細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ、 を含む方法。
[0033] 本発明はさらに本発明のモデル動物を利用したスクリーニング方法を提供する。こ のスクリーニング方法によれば CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対して有効な物 質を in vivoレベルの実験によって選抜することができる。具体的には以下のスクリー ユング方法が提供される。
CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対して有効な物質のスクリーニング方法であ つて、
(1)本発明のモデル動物に試験物質を投与するステップ、及び (2)前記モデル動物が反映する、 CD陰性 B細胞性悪性リンパ腫に特徴的な病態の 変化を調べるステップ、
を含む方法。
以下、各ステップの詳細を説明する力 特に言及しない事項については既述の対 応する記載が援用される。
[0034] ステップ（1)では本発明のモデル動物に試験物質を投与する。投与経路は特に限 定されず、経口投与、静脈内投与 (注射）、皮内投与 (注射）、皮下投与 (注射）、経 皮投与、 口腔内投与、標的器官 (臓器)への直接投与 (注射)等から適当なものを選 択できる。尚、ここでの「標的器官 (臓器）」は、モデル動物において CD20陰転化 B細 胞性悪性リンパ腫の特徴を示す器官 (臓器)であり、例えば腫瘍細胞の浸潤が認めら れる肝臓、脾臓、腎臓、骨髄等が該当する。
投与量は任意に設定可能である。例えば、モデル動物に致死的な影響を与えない 範囲で可能な限り最大の投与量とすることができる。
投与回数も任意に設定可能である。例えば、投与回数を 1回〜 20回の範囲内とす
[0035] ステップ（2)では、試験物質投与後のモデル動物を用いて、 CD陰性 B細胞性悪性 リンパ腫に特徴的な病態の変化を調べる。病態の改善が認められた場合、試験物質 が有効であると判定できる。例えば、標的器官 (臓器)の肉眼的観察、免疫染色、病 理組織学的観察、腫瘍重量測定、胸水腹水測定、蛋白抽出、 RNA抽出、 FCM等に よって、病態の変化を調べることができる。好ましくは、試験物質を投与しないモデル 動物 (対照群)を用意し、試験群と対照群との間で病態を比較し、試験物質の有効性 を判定する。
[0036] (医薬）
本発明の更なる局面は、 RRBL1を用いた検討によって得られた知見、即ち CD20陰 転化の一因が CD20 mRNAのェピジエニックな変化によること、及び CD20陰転化 B細 胞性悪性リンパ腫細胞において CD20蛋白を再発現させることが可能であることに基 づいて、 CD20蛋白の発現量を増大させる化合物を含有することを特徴とする、 CD20 陽性 B細胞性悪性リンパ腫又は CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対する医薬を 提供する。本発明の医薬は分子標的薬と併用される。但し、本発明の医薬を分子標 的薬との混合製剤として構成することもでき（後述）、この場合には単独で使用され得
[0037] CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫に対して使用された場合、本発明の医薬は CD20 蛋白の発現量の低下を抑制ないし阻止することによって、 CD20陽性 B細胞性悪性リ ンパ腫の細胞が分子標的薬に対して耐性を獲得することを防止する。これによつて 分子標的薬が継続的に作用し得る環境が作り出され、良好な治療効果がもたらされ る。また、 CD20陽性と判定された B細胞においても、 CD20の発現量が比較的低い場 合には、その発現量をさらに増大させることにより、分子標的薬がより効果的に作用 する環境を提供する。一方、 CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対して使用された 場合、本発明の医薬は CD20蛋白の再発現を促すことで CD20陰転化 B細胞性悪性リ ンパ腫細胞を分子標的薬に感受性を示す形質へと変化させる。その結果、分子標的 薬が再び作用できるようになり、良好な治療効果がもたらされる。
[0038] ここでの「CD20蛋白の発現量を増大させる化合物」は、 CD20遺伝子の転写、翻訳 又は翻訳後修飾のいずれかの段階に作用することで、 CD20蛋白の発現量を増大さ せること力 Sでさればよい。
RRBL1を用いた検討の結果、 CD20の陰転化と CD20 mRNAの発現量の変化が密 接な関係にあることが判明した。このことを考慮すれば、 CD20蛋白の発現量を増大さ せる手段として CD20 mRNAの発現量を増大させること力 S有効といえる。そこで好まし くは、本発明では「CD20蛋白の発現量を増大させる化合物」として、 CD20遺伝子の 転写調節に影響を与えることによって転写率を向上させる化合物（例えば DNAメチル 化酵素阻害剤、ヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤、ヒストンメチル化酵素阻害剤、 RN A干渉（siRNA)、核酸 ·蛋白アブタマ一、スモールペプチド、ドミナントネガティブ蛋白 等）が用いられる。後述の実施例に示す通り、 CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫細 胞に対して DNAメチル化酵素阻害剤又はヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤を使用し た場合に CD20 mRNAの発現量が増大することが確認された。そこで本発明の好まし い一態様では DNAメチル化酵素阻害剤及び/又はヒストン脱ァセチル化酵素阻害 剤が有効成分として用いられる。 DNAメチル化酵素阻害剤として 5-Aza_2'-Deoxycytidine、 5_Azacytidine、 5-Fuluor o_2'_deoxycytidine、り，り _Dihydro_5_azacytidine、 Zebularine、 Hydralazineなど様々 な化合物が知られており、これらは全て本発明の医薬の有効成分の有力な候補とな る。同様に、ヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤として、トリコスタチン A(TSA)、バルプロ 酸、フエニノレフ、、チレート、 SAHA suberoylanilidie hydroxamic acid)、 FR901228(depsipe ptide，FK228)、 MS_27_275、 CHAPs、 LAQ824、 YM753、 PDX101、 LBH589など様々 な化合物が知られており、これらは全て本発明の医薬の有効成分の有力な候補とな る。尚、公知の DNAメチル化酵素阻害剤又はヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤に対 してその作用を損なわない程度に改変を施した各種誘導体を本発明における DNAメ チル化酵素阻害剤又はヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤として用いることもできる。
DNAメチル化酵素阻害剤又はヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤に分類される化合 物を二種類以上組み合わせて (併用して)本発明の医薬を構成してもよ!/、。例えば、 異なる種類の DNAメチル化酵素阻害剤の組合せや、一種又は二種以上の DNAメチ ル化酵素阻害剤と一種又は二種以上のヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤の組合せ など、この場合の組み合わせは任意である。
[0039] 本発明の一態様では分子標的薬を本発明の医薬中に含有させる。このような医薬 ではその単独での使用によって、上記同様の治療効果を期待できる。
[0040] 本発明の医薬の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製 剤上許容される他の成分 (例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤 、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など)を含有させることができる。 賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、 D-マンニトール、白糖等を用いること ができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等 を用いること力 Sできる。緩衝剤としてはリン酸塩、クェン酸塩、酢酸塩等を用いることが できる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いること ができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メ チノレセノレロース、カノレポキシメチノレセノレロース、ヒドロキシメチノレセノレロース、ラウリノレ 硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはべンジルアルコール、クロ口 ブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコー ル、ジエチリン亜硫酸塩、ァスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフ エノーノレ、塩化ベンザルコニゥム、ベンジルアルコーノレ、クロロブタノ一ノレ、メチルパラ ベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニゥム、ノ ラオキシ安息 香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
[0041] 本発明の医薬における有効成分の含量は一般に剤型によって異なる力 所望の投 与量を達成できるように例えば約 0.001重量％〜約 100重量％とする。
本発明の医薬の剤型も特に限定されず、例えば点滴剤、注射剤、錠剤、散剤、細 粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、外用剤、及び座剤などとして本発明の医薬 を調製できる。
[0042] (治療法）
本発明は更に、 CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫又は CD20陰転化 B細胞性悪性リ ンパ腫の治療法を提供する。本発明の治療法では、 DNAメチル化酵素阻害剤及び /又はヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤と分子標的薬とが併用される。好ましくは、 前者を投与後に後者を投与するか、両者を同時に投与する。投与経路は特に限定 されず例えば経口、静脈内、皮内、皮下、リンパ節内、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘 膜などを挙げること力できる。これらの投与経路は互いに排他的なものではなぐ任 意に選択される二つ以上を併用することもできる（例えば、経口投与と同時に又は所 定時間経過後に静脈注射等を行う等)。ここでの「対象」は特に限定されず、ヒト、及 びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウ ス、ラット、モノレモット、ノヽムスター、サノレ、ゥシ、ブタ、ャギ、ヒッジ、ィヌ、ネコ、ニヮトリ 、ゥズラ等である）を含む。好適には、本発明の治療法における対象はヒトである。
[0043] 投与量は症状、投与対象の年齢、性別、及び体重などによって異なるが、当業者 であれば予備実験（細胞又はモデル動物を用いた実験など）の結果や臨床試験の 結果を踏まえて適宜適当な投与量を設定することが可能である。投与スケジュールと しては例えば一日一回〜数回、二日に一回、三日に一回、四日に一回、一週間に 一回、二週間に一回などを採用できる。投与スケジュールの設定においては、投与 対象の病状や薬効の持続時間などを考慮することができる。
[0044] 尚、本明細書で特に言及しない事項（条件、操作方法など）については常法に従え ばよく、例えば Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pre ss， New York) し urrent protocols in molecular biology (edited by Frederick M. Ausu bel et al. , 1987)、 Current protocols in Immunology, John Wiley& Sons Inc等を参考 にすることカでさる。
実施例
1 . CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫細胞株の樹立
( 1 )患者背景
初診時 43歳日本人男性である患者より細胞を採取した。この患者は 1993年に両側 頸部リンパ節腫脹と盗汗を主訴に名古屋大学付属病院に外来受診した。来院時、全 身のリンパ節腫脹と触診上脾腫 (左肋骨下縁より 3横指）を認めた。血液検査にてへ モグロビン 9.9 g/dl、血小板 7.6万と、貧血、血小板減少を示した。 白血球、 LDHは正 常範囲であった。左頸部リンパ節の生検が施行され、濾胞性リンパ腫 (follicular small cleaved B-cell lymphoma : FSC)と診断され、表面抗原解析（FCM)にて CD 10 (+)， C D 19 (+)， CD20 (+)， Ig K (+)の特徴が示された（図 12)。このように、このリンパ腫の細 胞は CD20陽性であることが確認された。また、骨髄穿刺にて骨髄浸潤が確認された 。古典的化学療法が繰り返し施行され、部分緩解 (PR)が得られた (図 1)。 1997年から はリツキシマブ併用 (375 mg/kg)化学療法が施行された。その後は病状が進行する 度にリツキシマブ併用化学療法が施行された。リツキシマブは合計 14回にわたって 投与されたが、 2004年 6月、リツキシマブ併用化学療法施行中に、下腹部からそけい 部にかけての腫瘍の急速な増大と脾腫の増大が認められた。骨髄には CD 10 (+)， C D 19 (+)， Ig κ (+) and CD20 (-)を示すリンパ腫細胞の浸潤が確認された (図 12)。骨 髄所見にて、 CD20陰性のリンパ腫細胞の浸潤が確認された。この時点にお!/、て患 者は CD20陰性のびまん性大細胞型悪性リンパ腫 (DLBCL)への形質転換と診断さ れた。その後、リツキシマブを併用しない救済化学療法が施行されたが、病状は悪化 し、 2004年 7月には CD20陰性のリンパ腫細胞が末梢血中にも認められるようになり、 その数は次第に増加した。化学療法の甲斐なぐ CD20陰性悪性リンパ腫細胞は急 性白血病様の病態を呈し、患者は 2005年 2月 20日に重症肺炎にて死亡した。患者の 家族よりのインフォームドコンセントが取得された後、剖検が施行された。尚、患者の 臨床経過を図 1に示した。
[0046] (2) RRBL1細胞の樹立
2004年 7月、インフォームドコンセントの後、患者の末梢血を採取した。 FicoU-Paque (Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden)により単核球を分離し、 20 %ゥシ胎仔血清 (FCS)を含む RPMI 1640培養液（Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.)中での長期培養に供 した。細胞は 1年以上経代培養され、これにより株化されたと判断した。我々はこの細 胞株を RRBLl(Bituximab resistant B-cell lymphoma 1)と名付けた。 RRBLl細胞とそ の元になつた患者のリンパ腫細胞に認められた染色体異常を図 2に示した。第 1染色 体と第 7染色体の相互転座 t(l ;7)(p36;pl5)と、第 14染色体と第 18染色体の相互転座 t(14; 18)(q32;q21)は両細胞で保存されていた。 t(14; 18)(q32;q21)の詳細な切断部位 を確認するために、 BCL2/JHの接合部位に特異的なプライマー (図 3の C)を用いて P CRを施行した。異なる培養時期にサンプリングした RRBL1細胞と、異なる臨床病期に 採取した患者の悪性リンパ腫細胞よりゲノム DNAを調製し、この PCRによる検討に使 用した (図 3の D)。約 800bpの単一のバンドがすべてのサンプルで増幅された (図 3の D、レーン 1〜4)。この結果より、 RRBL1細胞は患者の CD20陰性リンパ腫細胞と基本 的に同一のクローン由来であることが確認された。
[0047] 2. RRBL1の解析、耐性化機序の解明
( l ) RRBLlにおける CD20抗原の発現
次に我々は、 RRBL1細胞における CD20蛋白の発現を検討した。 RRBL1細胞のサイ トスピン標本を用い、抗 CD20モノクローナル抗体にて免疫染色を施行した力 CD20 蛋白の発現は確認できな力、つた（図 4の A)。陽性対照（コントロール）として用いた Bu rkittリンパ腫細胞株 Rajiにおいては CD20蛋白の発現が確認された。次に、 Raji細胞 、 RRBL1細胞、 NALM6細胞よりそれぞれ全細胞溶解液を調製し、抗 CD20抗体を用 V、たウェスタンブロットを施行した。 NALM6細胞は CD20陰性細胞株として報告されて おり、陰性対照（コントロール）となる。図 4の Bに示す通り、 CD20蛋白の発現は Raji細 胞のみで確認され、 NALM6細胞と RRBL1細胞は陰性を示した。しかし興味深いこと に、長時間の露光によって、 RRBL1細胞にもごく僅かではあるが CD20蛋白の発現が 認められた（図示せず）。この結果より、 RRBL1細胞では CD20蛋白の発現量は非常 に少量であり、 FCMや免疫染色によっては確認できないものと示唆された。
[0048] 次に、定量的 RT-PCRによって RRBL1細胞における CD20 mRNAの発現量を確認し た（図 4の C)。 Raji細胞より調製した mRNAを陽性対照とし、 293T細胞より調製した mR NAを陰性対照とした。さらに CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫の患者より採取したリン パ腫細胞の RNAについても同様に検討を加えた。実験の結果、 RRBL1細胞における CD20 mRNAの発現量は Raji細胞や陽性対照である患者検体に比べて約 100倍低い ことが確認された（図 4の C)。陰性対照の 293T細胞では増幅を確認できなかった。以 上より、 RRBL1細胞における CD20蛋白発現量の低下は、 mRNA発現量の低下に起 因するものであると示唆された。
[0049] 非常に興味深いことに、 RRBL1細胞を長期に亘り経代培養することにより、亜株の R RBL2細胞が樹立された。 RRBL2細胞においては、 CD20蛋白の発現力 aji細胞と同 様にウェスタンブロットで確認された（図 4の D)。これは、 CD20蛋白の発現能を RRBL 1細胞が保持していることを明示しているといえる。また、 CD20 mRNAの発現量低下 には、何らかのェピジェネティックな調節機構が働!/、て!/、ることが強く示唆される。
[0050] 一方、 RRBL1細胞から調製した RNAを铸型にして、 CD20遺伝子の CDS全長を RT- PCRにて増幅し、 T7Ts_Flagベクターにサブクローニングした。 in vitroトランスレーショ ンによって、 Flagタグを付加した CD20蛋白を翻訳した後、 SDS-PAGEを施行し、抗 Fla g抗体を用いたウェスタンブロットを施行した（図 5)。正常サイズの CD20蛋白が翻訳さ れている（レーン 1)。尚、 10個のクローンについて遺伝子配列をシークェンスしたが、 遺伝子変異は認められなかった
[0051] (2)リツキシマブに対する耐性
10% FCSを含有する RPMI1640培養液にリツキシマブ（500 mg/ml)を加え、 37°Cで 2 日間培養し、生細胞数を測定した。尚、 Raji細胞を同様の条件下で培養した (対照群 )。図 6に示すように、 Raji細胞の増殖はリツキシマブによって有意に抑制される力 R RBL1細胞では増殖抑制が認められなかった。このように RRBL1細胞は in vitroにおい てリツキシマブ耐性を示すことが確認された。
[0052] (3) CD20 mRNA及び CD20蛋白の再発現
RRBL1細胞の培養液中に 5-Aza_2'-Deoxycytidine (SIGMA,以下「Aza」と略す)を 投与し、 24時間後に細胞を洗浄した。さらに 2日間培養した後、細胞から RNA及び全 細胞溶解液を抽出し、 RT-PCRとウェスタンプロット法による解析に供した。その結果 、 CD20 mRNAの発現は Aza処理後で上昇した（図 7の A、 RT、レーン 2)。ウェスタン ブロット解析では、 Aza処理後に CD20蛋白の発現が認められた（図 7の A、 IB、レーン 2)。
[0053] 続いて、 CD20 mRNA及び CD20蛋白の発現に関して継時的変化を調べた（図 7の B)。 0日目に Azaを培養液に投与し、 37°Cで 24時間培養した (1日目)。その後、細胞を 洗浄し、さらに 1〜6日間培養した (2日目〜 7日目)。培養後の細胞より RNAと蛋白を抽 出し、ウェスタンブロット (抗 CD20抗体、抗 IRF4抗体、抗 PU.1抗体、抗 DNMT1抗体、 抗 GAPDH抗体を使用)と RT-PCRによる解析に供した。結果を図 7の Cに示す。 Aza 投与後 1日目（レーン 4)より CD20蛋白の発現が上昇していることを確認できる力 発 現量は 3日目（レーン 6)をピークとし、その後減少した。 CD20 mRNAの発現は、 CD20 蛋白の発現と同様の傾向を示した（RT,レーン 3〜8)。
IRF4、 PU.1は、 CD20遺伝子プロモーターに結合することが報告されている転写因 子である。これらの発現は Aza投与前力 認められ、一時的に発現の上昇傾向が認 められる（レーン 5)。 DNMT1(DNAメチルトランスフェラーゼ 1)は、 Azaにより分解される ことが報告されている。既報の通り、 Aza投与後 1日目に DNMT1発現の著明な減少が 認められる（レーン 4)。
[0054] (4)分子標的薬併用投与時の CD20 mRNA及び CD20蛋白の発現
RRBL1細胞の培養上清に Aza及び TSA (トリコスタチン A：ヒストン脱ァセチル化酵素 阻害剤)を単独又は併用投与した。 Aza投与 1日後に細胞を洗浄した。さらに 2日間培 養後、細胞より蛋白を抽出した。 TSA投与群については TSA投与後 24時間の時点で 細胞から蛋白を抽出した。併用投与群についてはまず Azaを投与して 1日間培養した 。洗浄後の細胞を 1日間培養した後、 TSAを投与し、さらに 1日経過後に細胞を溶解 し、蛋白を抽出した。このようにして得られた各サンプルを SDS-PAGEに供した後、抗 CD20抗体と抗 GAPDH抗体を用いたウェスタンブロットを施行した。ウェスタンブロット の結果を図 8の Aに示す。 CD20蛋白の発現は Azaと TSAの併用によって、より強く誘 導された（図 8の A、レーン 6)。 [0055] RRBL1を Azaの存在下、又は Aza及び TSAの存在下で培養後、細胞表面抗原を FC Mで検討した。 CD20抗原を発現する細胞（緑部分）は、 Azaを単独使用した場合に比 較して、 Azaと TSAの併用使用した場合により多く認められた（図 8の B)。
[0056] RRBL1細胞（非処理群）と、 Aza及び TSAで処理された RRBL1細胞（処理群）をそれ ぞれリツキシマブ非存在下（ 、國）又は存在下（♦、▲)で 2日間培養し、生細胞数 を比較した（図 8の C)。 Azaと TSAで処理された RRBL1細胞の増殖は、リツキシマブに よって有意に阻害された（▲)。この結果より、 Aza及び TSAで処理されることによって CD20蛋白の発現が誘導された RRBL1細胞はリツキシマブに感受性であることが示さ れ 。
[0057] (5) CD20遺伝子プロモーターにおける CD20転写調節の解析
CD20遺伝子プロモーターの構成を図 9の Aに示す。 CD20遺伝子プロモーターに は転写因子 Pu. lと IRF4の結合ドメインが存在する。さらに下流には、 Oct2等の転写 調節因子が結合することが報告されている E-boxが存在する。
RRBL1細胞における CD20遺伝子プロモーター部位のクロマチン免疫沈降法（CMP アツセィ）を行った。 Aza及び TSAで処理した RRBL1細胞（処理群）と非処理の RRBL1 細胞（非処理群）をホルマリン固定した後、クロマチンを抽出し、抗 Pu. l抗体、抗 IRF4 抗体、抗ァセチル化 H4(Ac_H4)抗体、抗 Sin3抗体、及び抗 HDAC1抗体を用いて Chi Pアツセィを施行した。結合した DNAは図 9の Aに示したプライマーを用いた PCRで検 出した。図 9の Bに示すように、 Pu. l, IRF4は、薬剤処理の有無に関わらず、 CD20プ 口モーターに結合してレ、た（レーン 5〜8)。薬剤処理によって CD20プロモーター部位 のヒストン H4のァセチル化の割合が増加した (レーン 10)。転写抑制因子複合体の構 成蛋白である Sin3、 HDAC1は薬剤処理前にはプロモーターにリクルートされているが (レーン 11、 13)、処理後は解離していた（レーン 12、 14)。
一方、薬剤処理した RRBL1細胞より蛋白を抽出し、抗 CD20抗体及び抗 GAPDH抗 体を用いたウェスタンブロットを施行した。 Sin3、 HDAC1の蛋白発現自体は薬剤投与 の有無によって大きくは変化しないことが確認された（図 9の C)。これによつて、図 9 の Bで示された、 Sin3、 HDAC1の CD20遺伝子プロモーターからの消失は、リクルート されていた蛋白が解離されたことに起因することが示唆された。 [0058] 3. RBBL1の免疫の免疫不全 NOD/SCIDマウスへの移植
以上の解析の結果、 RRBL1細胞がリツキシマブ耐性 CD20陰転化 B細胞性悪性リン パ腫のモデルとして有用であることが確認された。 RRBL1の in vivoへの移植モデル が確立されればさらに有用な系となると考えられる。そこで、 RRBL1細胞を NOD/SCI Dマウス (財団法人実験動物中央研究所 (神奈 j 11県 j 11崎巿) )の背部に皮下注射し、 腫瘍が形成されるか否力、を検討した。注射から 30日目に腫瘍の形成が肉眼的に確 認できるようになり、腫瘍の増大は 53日目まで観察することが可能であった（図 10)。 このことは、 RRBL1細胞が NOD/SCIDマウスの生体内の環境で維持可能であることを 示す。次に、 RRBL1細胞を経静脈的に投与して腫瘍の形成を観察した。移植から 50 日後、マウスに麻酔を施行した後に臓器を取り出し、病理組織を検討した（図 11左） 。腫瘍細胞は肝臓、脾臓、腎臓、骨髄等の腫瘍臓器に著明に浸潤して増殖し、免疫 染色を施行するとその腫瘍細胞は CD20陰性、 CD79a陽性の Bリンパ球の性格を保持 していることが確認された。 RRBL1細胞の由来となる患者の剖検組織所見（図 11右） と比較した結果、患者組織にお!/、ても CD20陰性、 CD79a陽性の B細胞性悪性リンパ 腫細胞が肝臓、脾臓、腎臓、骨髄に著明な浸潤を認め、 RRBL1移植マウスと大変似 通った病理所見を示していることが確認された。これらの結果は、 RRBL1細胞 NOD/S CID移植モデルは、 RRBL1細胞株の元となった患者の病状を非常によく反映し、 CD 20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対する新規治療戦略 (従来の化学療法剤のみなら ず、分子標的薬、ホルモン、ビタミン等の併用など）を検討する in vivoモデルとして極 めて有用であることを強く示唆する。
[0059] 4.考察
臨床の場にお!/、て、でリツキシマブが CD20陽性悪性リンパ腫に対する分子標的薬 として古典的な化学療法剤（CHOP療法など）と併用されるようになってから 5年以上 が経過する（非特許文献 15、 16)。リツキシマブの併用によって緩解率、無病生存率 もしくは無症候生存率が有意に延長されたとの報告が相次いでいる（非特許文献 3 〜8)。しかし、リツキシマブ併用により CHOP療法等による B細胞性悪性リンパ腫の治 療成績が改善されたとはいえ、治癒率に関しては完璧というには未だほど遠い。最近 になって、リツキシマブにより治療された CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫患者におい て、リツキシマブ耐性化リンパ腫として再発、再燃する例が報告されるようになった（ 非特許文献 9〜； 12)。このようなリツキシマブ耐性の問題は、初発のみならず再発の B 細胞性リンパ腫患者の治療において、これからますます大きな問題となってくるであ ろうことは想像に難くない。これらの観点から、我々は少なくとも以下の 2点に関して早 急に検討しなくてはならないであろうと考えている。まず一点目は、 CD20陰転化機序 の詳細な解析、二点目はリツキシマブ耐性の克服である。
2001年 9月より約 5年間において、当施設においてリツキシマブを含む化学療法を 施行された CD20陽性悪性リンパ腫症例は 124例であつたが（図 13)、その中の 36症 例（29.0 %)にお!/、て再発 ·再燃を来した。再発 ·再燃症例のうち 19症例で腫瘍の再 生検が施行された力 うち 5症例（再生検施行症例中 26.3 %)で表面マーカー検査（F CM)、免疫染色において CD20発現の消失、もしくは低下が認められた。
我々は、 CD20陽性濾胞性リンパ腫カ^ッキシマブ投与後に CD20陰転化再燃し、 びまん性大細胞型悪性リンパ腫 (DLBCL)に形質転換した患者より、 CD20陰転化 B細 胞性悪性リンパ腫細胞である RRBL1細胞を株化することに成功した。この細胞株に おいて、 CD20抗原は FCMや免疫染色では検出不能であった。しかし、ウェスタンブ ロット法によっては、ごく僅かではあるが CD20蛋白の発現が確認され、興味深いこと には定量的 RT-PCR法によっては CD20陽性リンパ腫細胞に比較して約 1/100の量の CD20 mRNAの発現を確認した。このことから、 mRNAの発現量の減少力 S、 CD20表面 抗原の発現が陰転化した重要な一因であり、患者のリツキシマブ耐性化の原因であ ることが強く示唆された。大変興味深いことに、 RRBL1を長期培養することによって得 られた亜株 RRBL2においては、 CD20蛋白の十分な発現が確認された。この知見から 、 CD20 mRNAの発現が何らかの理由によって異常に抑制を受けた結果、リツキシマ ブに対する耐性化が生じたと考えられた。この mRNA発現抑制の原因として、（1) CD 20プロモーター部分の遺伝子変異、（2) CD20遺伝子の欠失、（3) CpGの異常なメチ ル化等を含む、 CD20 mRNA発現のェピジェネティックな変化（非特許文献 17)、（4) CD20 mRNAの発現を調節する転写因子や転写調節因子の異常、が考えられる。 RR BL2では CD20蛋白の発現が認められたという事実を考慮すれば（1)と（2)の可能性 は低いと考えられる。 [0061] 最近、 CD20のコーディングシークェンスにおける遺伝子変異がリツキシマブに対す る耐性の獲得の原因の一つとして報告された（非特許文献 10)。遺伝子変異が特定 の部位に起こればそれが耐性機序に関わるであろうことは理解できる。最近の報告 によるとリツキシマブは CD20蛋白の高次構造を認識することでその機能を発揮する ことが報告された（非特許文献 18)。しかし、我々が経験した症例においては、リツキ シマブに対する耐性の獲得は、 CD20蛋白の細胞表面への発現量が低下したことに よってリツキシマブが CD20抗原を認識できないことによると予想された。 CD20 mRNA の発現量が低下したことが問題であれば、何らかの方法によって CD20 mRNAの発現 量を増加できればリツキシマブに対する耐性を克服できるといえる。即ち、 CD20 mR NAの発現を誘導することが、リツキシマブに対する耐性の克服に向けた有望な戦略 となる。
我々の更なる検討の結果、 CD20 mRNA発現のェピジェネティックな変化力 S、リツキ シマブ耐性化の主要な原因であることが示唆された。また、 CD20 mRNAの発現を誘 導し、 CD20蛋白を再発現させることが可能であり、このような処理を施すことによって リツキシマブに対する感受性を高めることが可能であることが示された。この成果は、 CD20 mRNAの発現を誘導すると!/、う戦略が実際に有効であることを裏付ける。
[0062] 我々はまた、 RRBL1細胞が NOD/SCIDマウスに移植可能であることを示した。重要 なことは、この移植マウスにおける腫瘍細胞の浸潤形態力 RBBL1細胞の由来である 患者の病態を非常に良く再現していた点である。このことから、 RRBL1細胞は in vitro における CD20陰転化機序の解析に有用であることにとどまらず、 in vivoにおいてリツ キシマブ耐性 CD20陰性 B細胞性悪性リンパ腫に対する治療戦略を開発する上でも 非常に有用であるといえる。
産業上の利用可能性
[0063] 本発明が提供する CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫細胞、モデル動物、スクリー ユング方法は、 CD20を標的とした分子標的薬に対する耐性化の阻止又は克服のた めの治療戦略を開発する上で有用である。
[0064] この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものでは ない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々 の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その 全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims

請求の範囲
[1] CD20蛋白の発現が陰転化した B細胞性悪性リンパ腫に由来する CD20陰転化 B細 胞性悪性リンパ腫細胞株。
[2] 前記 B細胞性悪性リンパ腫は、濾胞性リンパ腫から形質転換したびまん性 B細胞性 悪性リンパ腫である、請求項 1に記載の細胞株。
[3] CD20蛋白の発現の陰転化が CD20 mRNAの発現量低下に起因する、請求項 1に 記載の細胞株。
[4] CD20蛋白の潜在的発現能を有する、請求項 3に記載の細胞株。
[5] CD10陽性、 CD19陽性、 CD20陰性、及び免疫グロブリン軽鎖（ κ鎖、 λ鎖）陰性で ある、請求項 1に記載の細胞株。
[6] 受託番号： FERM BP— 10910で特定される細胞株である、請求項 1に記載の細 胞株。
[7] 請求項;!〜 6のいずれかに記載の細胞株を免疫不全非ヒト動物に移植又は投与す ることによって作製される、 CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫の病態を反映したモデ ノレ動物。
[8] 前記免疫不全非ヒト動物が NOD/SCIDマウスである、請求項 7に記載のモデル動物
[9] CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫又は CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対して 有効な物質のスクリーニング方法であって、
(1)試験物質の存在下、 CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫細胞を培養するステツ プ、及び
(2)培養後の細胞における CD20 mRNA発現量又は CD20蛋白発現量を測定し、前 記試験物質の CD20発現誘導能を評価するステップ、
を含む方法。
[10] 以下のステップを更に含む、請求項 9に記載のスクリーニング方法、
(3)ステップ（2)の結果に基づいて選抜された試験物質の存在下、 CD20陰転化 B細 胞性悪性リンパ腫細胞を培養するステップ、
(4) CD20を標的とした分子標的薬の存在下、ステップ（3)後の細胞を培養するステツ プ、及び
(5)細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ。
[11] 以下のステップを更に含む、請求項 9に記載のスクリーニング方法、
(3)ステップ（2)の結果に基づいて選抜された試験物質と、 CD20を標的とした分子 標的薬の存在下、 CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫細胞又は CD20陰転化 B細胞性 悪性リンパ腫細胞を培養するステップ、及び
(4)細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ。
[12] 前記 CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫細胞力 S、請求項 1〜6のいずれかに記載の 細胞株である、請求項 9〜； 11のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[13] CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫又は CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対して 有効な物質のスクリーニング方法であって、
(1)試験物質の存在下、請求項;!〜 6のいずれかに記載の細胞株を培養するステ ップ、及び
(2) CD20を標的とした分子標的薬の存在下、ステップ（1)後の細胞を培養するステ ップ、及び
(3)細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ、 を含む方法。
[14] CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫又は CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対して 有効な物質のスクリーニング方法であって、
(1)試験物質、及び CD20を標的とした分子標的薬の存在下、請求項;!〜 6のいずれ かに記載の細胞株を培養するステップ、及び
(2)細胞の生存数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ、 を含む方法。
[15] CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対して有効な物質のスクリーニング方法であ つて、
(1)請求項 7又は 8に記載のモデル動物に試験物質を投与するステップ、及び
(2)前記モデル動物が反映する、 CD陰性 B細胞性悪性リンパ腫に特徴的な病態の 変化を調べるステップ、 を含む方法。
[16] CD20蛋白の発現量を増大させる化合物を含み、 CD20を標的とした分子標的薬と 併用されることを特徴とする、 CD20陽性 B細胞性悪性リンパ腫又は CD20陰転化 B細 胞性悪性リンパ腫に対する医薬。
[17] 前記化合物が、 CD20 mRNAの発現量を増大させる作用を有する、請求項 16に記 載の医薬。
[18] 前記化合物として DNAメチル化酵素阻害剤及び/又はヒストン脱ァセチル化酵素 阻害剤が用いられる、請求項 16に記載の医薬。
[19] DNAメチル化酵素阻害剤及び/又はヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤と、 CD20を 標的とした分子標的薬とを併用することを特徴とする、 CD20陽性 B細胞性悪性リンパ 腫又は CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫の治療法。
[20] CD20を標的とした分子標的薬と併用されて薬効を発揮する、 CD20陽性 B細胞性悪 性リンパ腫又は CD20陰転化 B細胞性悪性リンパ腫に対する医薬を製造するための D
NAメチル化酵素阻害剤又はヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤の使用。
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