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WO2008019651A2 - Anordnung zum erfassen von substanzen, herstellung der anordnung und ihre verwendung - Google Patents

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WO2008019651A2
WO2008019651A2 PCT/DE2007/001362 DE2007001362W WO2008019651A2 WO 2008019651 A2 WO2008019651 A2 WO 2008019651A2 DE 2007001362 W DE2007001362 W DE 2007001362W WO 2008019651 A2 WO2008019651 A2 WO 2008019651A2
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Bernhard Ay
Prosper Hartig
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Nikolaus Bartels
Bernhard Ay
Prosper Hartig
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Definitions

  • the invention relates to an arrangement for the specific detection of substances from samples, in particular a biochip, based on a substrate and a bonding layer located on the substrate, a method for the production of the device and its use, in particular for detecting association events.
  • Fields of application of the invention are, inter alia, the environmental technology, food technology, the pharmaceutical industry and the
  • Substances can be detected or neutralized by means of a biologically active arrangement.
  • Bioly active arrangements consisting of support materials and organic compounds applied thereto / immobilized, in particular biologically active substances, are of outstanding importance in today's biotechnology and so-called life sciences.
  • Purpose of such carriers which are usually formed on the basis of non-water-soluble inorganic or organic polymers, is quite generally the local fixation or immobilization and the accumulation or concentration of biologically active substances, for example.
  • Detection molecules or pharmaceuticals As a result, surfaces are also created that can be used for a wide variety of applications, for example as detection systems or as pharmaceutical suppliers.
  • biochips and functionalized microparticles which can specifically recognize and bind target structures at the molecular level are state of the art.
  • a biochip is generally a rigid support on the surface of which biologically or chemically active substances, in particular molecules, are immobilized, usually by electrostatic, hydrophobic, hydrophilic and / or covalent binding to the surface molecules of the support.
  • the object of the immobilized biologically or chemically active substances is that they allow the association of bioactive substances from a sample, eg a test solution, with which they are brought into contact.
  • bioactive substances can also be made visible from a solution if they interact or associate with the immobilized biologically active substances, for example peptides, proteins or DNA.
  • a biochip is usually made up of three components:
  • Purpose of the immobilized biologically active substance or substances is then the specific attraction and / or accumulation of bioactive substances or test substances from a test medium, which then on the support surface, usually by a physically active label, e.g. with a dye or a radioactive isotope, or with the aid of a dye- or an enzyme-labeled probe, for example a primer or an antibody, are detectable.
  • a physically active label e.g. with a dye or a radioactive isotope
  • a dye- or an enzyme-labeled probe for example a primer or an antibody
  • the prior art is in particular carriers of glass or plastic, which are coated with a bonding layer of metal or with a bonding layer of surface-bound organic molecules, which allows the immobilization of proteins, peptides, or oligonucleotides on the surface or in the vicinity of the surface.
  • the bonding layer is necessary since the conventional support materials, for example glass or plastic, under normal conditions are hardly chemically reactive or inert and therefore do not permit direct and permanent attachment of the biologically active substance in solution.
  • the coating of the carrier with the bonding layer by a in the Usually complex chemical process, such as a silanization of glass, in which the support surface is covalently coated with molecules, which then allow the immobilization of biologically active substances in a subsequent step.
  • Carriers for the production of so-called 1D biochips generally have a bonding layer of surface molecules with free reactive groups, for example amino, epoxy, aldehyde or maleimide groups. It is also possible, for example, to attach or apply elements, e.g. of gold, for subsequent immobilization.
  • a biologically active substance for example a protein receptor
  • the substance can covalently bind to the functionalized (eg glass) surface via a chemical reaction if the receptor has a suitable chemically functional group which reacts with a free reactive group of molecules of the attachment layer and can form a covalent bond.
  • the bonding layer is additionally provided with a crosslinker or a polypeptide is attached in order subsequently to immobilize the desired biologically active substance specifically.
  • Supports for the production of 2D or 3D biochips have an attachment layer of covalently bound surface molecules, often lipids, longer alkane derivatives, or organic polymers, e.g. formed as hydrogel, which is a mostly non-covalent immobilization of biologically active substances, e.g. of receptors via hydrophobic and / or electrostatic interaction.
  • covalently bound surface molecules often lipids, longer alkane derivatives, or organic polymers, e.g. formed as hydrogel, which is a mostly non-covalent immobilization of biologically active substances, e.g. of receptors via hydrophobic and / or electrostatic interaction.
  • a disadvantage of the prior art is quite generally that the common carriers are first metallized or wet-chemically functionalized with the binding layer which requires labor-intensive and time-consuming steps, eg reaction and washing steps. If, for example, a glass chip or particle is to be silanized for subsequent attachment of peptides or proteins, it is placed in a vessel containing a silanization solution for several hours, which is agitated by stirring, shaking or ultrasound, then washed and dried in an oven. The movement of the molecules in solution is important, inter alia, in order to achieve a uniform bonding layer on the support surface in the chemical reaction between the support and the dissolved molecules, for example alkoxysilane or chlorosilanes.
  • the use of special glass substrate eg quartz glass for high temperature resistance or low impurities, is often required due to the conditions in the production of the bonding layer.
  • a polymerized layer or polymer layer for example of (nitro) cellulose, PVDF or a hydrogel requires expert skill and is expensive.
  • the bonding layer thus prepared is often chemically sensitive and requires a special storage of the carrier, for example under vacuum or inert gas.
  • a disadvantage of the common support materials is further that their surface properties are only partially suitable for many applications.
  • the common carrier material glass for example, is a solidified melt with a rough surface, which can have a detrimental effect on a uniform connection layer and directional connection, for example of microarrays.
  • a microarray is a carrier material on which a large number of biochemical detections or tests are located on the narrowest, usually only fingernail-sized, space. But also biochips with only a few spatially fixed immobilized tests are known and used in practice, for example so-called "low density" biochips. The tests consist of many locally addressed, mostly in circular “spots" on the surface, bound molecules or larger biological components (eg cell organelles or cells).
  • DNA molecules or proteins are selected which can associate specifically with substances from a test solution, the bound substances being subsequently made visible on the surface.
  • substances from a test solution eg serum antibodies or tissue DNA
  • pathogens eg viruses, or tissue changes, eg tumors
  • the biochip sector has experienced a first major upswing in the human genome project. Driven by its impressive results, many start-up companies have entered this market to accelerate and automate gene analysis. Now that human genes are fully sequenced, the focus is on the development of high performance biochips that enable easy readout of biological signals in diagnostics and research.
  • biochips are suitable which enable a simple and defined binding of peptides or proteins. These have the advantage that, in principle, they can visualize all possible substances with which they interact according to the key-lock principle. As a result, for example, significantly more pathogens can be made visible or detectable than is possible with today's DNA chips.
  • Functionalized microparticles which may be formed, for example, as nanoparticles, allow the sensitive detection, labeling and treatment of target structures of a biological or biotechnological system.
  • a biological system are essentially organisms, cell tissues, cells, To understand cell components, DNA, RNA, cDNA, mRNA, cRNA, carbohydrates proteins and / or peptides and structures derived therefrom, under the biotechnological system are all possible arrangements to understand, with the help of properties of biological systems or structures derived therefrom are detectable.
  • a typical microparticle for the targeted and delayed release of active substances in an organism comprises, for example, immobilized lipids or hydrogels with incorporated active substances and covalently linked antibodies via the attachment layer for the detection of the target structure in the organism.
  • Object of the present invention is therefore to provide an efficient and easy to manufacture arrangement with outstanding properties, which is preferably formed and used as a biochip or functionalized particles, based on a substrate and a bonding layer on the substances to be tested easily and directly coupled or immobilized, for detecting target substances or test substances from a sample, a method for producing the arrangement and their use, in particular for detecting and / or detecting bioactive substances from a test medium, preferably DNA, RNA, proteins, peptides, cells , their components and / or viruses from a liquid.
  • This object is achieved by an arrangement according to claim 1, a method for producing the arrangement according to claim 8, and their use according to claim 17.
  • the further claims are preferred embodiments of the invention.
  • the invention in its various aspects and technical features is realized according to the claims and the description given here.
  • the basis of the invention is therefore the unexpected finding that, with a suitable choice of carriers and test substances, no silanization or comparable modification for the subsequent immobilization of the test substances is necessary for the production of devices for detecting substances from a sample, and the use of this finding different way.
  • the invention thus consists in that, instead of the known metallic or organic bonding layers, an inorganic bonding layer is used for the targeted immobilization of substances to be tested or of capture substances.
  • silanization in the sense of the invention is in particular the chemical modification of a substrate, e.g. glass, with silanes or silane derivatives, e.g. as described in the reference in Halliwell & Cass, A factorial analysis of silanization conditions for the immobilization of oligonucleotides on glass surfaces, Anal. Chem. 2001 Jun. 1; 73 (11): 2476-83.
  • the arrangement according to the invention for the specific detection of substances from a sample, in particular for detecting association events comprises a substrate and at least one bonding layer or coupling layer located on the substrate.
  • the substrate comprises a semiconductor or semiconducting material, hereinafter also semiconductor substrate (1, numbers are given here and possibly for clarity) and the bonding layer is an inorganic layer located on the semiconductor substrate, in particular a non-water-soluble solid which is under normal conditions, for example at dryness and room temperature, preferably substantially non-electrically conductive, hereinafter also called inorganic insulator layer (2).
  • Sub-insulating materials are to be understood in exceptional cases, also conductive materials that produce or include a spatial isolation of the semiconductor substrate.
  • Semiconductors according to the invention are in particular all elemental semiconductors, e.g. Silicon or germanium, and all compound semiconductors, e.g. Gallium arsenide, in its various forms or modifications, e.g. by doping, to understand.
  • the semiconductor substrate can be formed in a wide variety of spatial dimensions, for example as a flat chip, voluminous particles or as a semiconductor film or thin-film applied to a solid phase.
  • the inorganic insulator layer is, in particular, the areal extent of a uniform mass of an inorganic insulator lying directly above the semiconductor substrate, i. a substantially non-hydrocarbon compounds containing material which inhibits the flow of electrical charges and its electrical conductivity does not change substantially with changing temperature to understand.
  • a conductive layer which generates or comprises a spatial isolation of the semiconductor substrate to understand.
  • glass is also suitable as the substrate and the bonding layer is formed as a non-organically modified, ie covalently coated with organic molecules, and not metallically modified, eg coated with a gold, glass surface.
  • the figure of Arrangement according to the invention in its various embodiments, in particular with the features described below and in the claims, is analogous in that instead of the semiconductor substrate (1) with the at least one inorganic insulator layer (2) formed thereon, a glass substrate (glass substrate (1)) with at least a glass surface layer (glass surface layer (2)) formed thereon (set), wherein the at least one glass surface layer (2) is not organically or metallically modified, eg, non-silanized, especially untreated or unmodified is.
  • the above and below specified features for the semiconductor substrate and the inorganic insulator layer apply respectively to the glass substrate and the glass surface layer, as well as to the medium (4) and the test substance coupled to the glass surface layer.
  • the object of the invention is as substrate but also a substantially water-insoluble solid or solid, eg plastic, ceramic, stone, wood, cellulose, metal, etc., particularly preferably plastic, suitable, and the bonding layer is as not organically modified, ie covalently coated with organic molecules, and non-metallized, for example, covered with a gold layer, inorganic insulator layer, in particular silicon oxide layer or silicon dioxide layer formed, in particular as a thin film or film with common thin-layer method, eg by vapor deposition or sputtering, is applied to the solid.
  • a substantially water-insoluble solid or solid eg plastic, ceramic, stone, wood, cellulose, metal, etc., particularly preferably plastic, suitable
  • the bonding layer is as not organically modified, ie covalently coated with organic molecules, and non-metallized, for example, covered with a gold layer, inorganic insulator layer, in particular silicon oxide layer or silicon dioxide layer formed, in particular as a thin film or film with common thin-layer method,
  • the shape of the arrangement according to the invention in its different embodiments, in particular with the features described below and in the claims, is analogous such that instead of the semiconductor substrate (1) with the at least one inorganic insulator layer (2) formed thereon a solid (solid (1) ) with at least one silicon oxide layer formed thereon (silicon oxide layer (2)), said at least one silicon oxide layer (2) being non-metallized and / or organically modified or being, for example, non-silanized , in particular untreated or unmodified.
  • the above and below specified features for the semiconductor substrate and the inorganic insulator layer apply respectively to the solid and the glass surface layer, as well as to the medium (4) and the test substance coupled to the glass surface layer.
  • untreated in the context of the invention previously cleaned surfaces, for example by in the Semiconductor manufacturing conventional cleaning methods, such as cleaning in Caro ' shear acid, ethanol, ultrapure water, especially in the ultrasonic bath to understand.
  • the arrangement according to the invention is characterized in that on and / or in the inorganic insulator layer (2) at least one (surface) area or section, also referred to below as area (3), with at least one medium, in particular with a liquid, solid and / or gas, hereinafter also referred to as medium (4), and with at least one organic, in particular bio-organic, substance to be immobilized, also referred to as test substance (5), acted upon or brought into contact, wherein within the at least one applied area (3 ) between the inorganic insulator layer (2) and the at least one test substance (5) is a connection or coupling without silanized intermediate layer.
  • the test substances coupled to the insulator layer (2) in this way are suitable for interacting with one or more test substances from a sample with which the arrangement is or may be brought into contact.
  • a silanized intermediate layer in the sense of the invention is to be understood in particular as a layer formed on the carrier substrate from silane derivatives, in particular wet-chemical, to which a test substance is bound or coupled, as for example in the publication Halliwell & Cass, A factorial analysis of silanization for the immobilization of oligonucleotides on glass surfaces, Anal Chem. 2001 Jun. 1; 73 (11): 2476-83.
  • the term "on and / or in the insulator layer” is to be understood in particular as meaning the parts of the inorganic insulator layer which can come into contact or interact with a medium and / or a test substance, ie, for example, the interface of the isolate layer to the periphery and / or or the molecules accessible to the medium and / or the test substance in the vicinity of or below the surface of the insulator layer If the semiconductor substrate is formed, for example, from a porous material, the term “on and / or in” also refers to the spatial one Regions of the insulator layer arranged within the semiconductor substrate. Under “on and / or in the isolar layer” is under some circumstances but also to understand that the medium and / or the test substance at least partially can penetrate into the semiconductor substrate when it is absorbed by a similar to a sponge of the insulator layer.
  • the arrangement according to the invention has the characteristic property that in the at least one applied area (3) a stable, direct coupling or connection without interlayer, in particular without silanized (eg with alkylsilanes) or polymerized or crosslinked (eg polyvinyl, cellulose) interlayer, is present between the insulator layer (2) and the at least one test substance (5).
  • the arrangement according to the invention is characterized in particular by the fact that the coupling is stable in air and in solution, i. in particular, that the coupled substance also after several hours or several days of washing the arrangement or the area (3) with liquid, e.g. a physiological buffer, still detectably coupled to the insulator layer (2).
  • test substance remains stable for months and longer in air or vacuum on the inorganic insulator layer.
  • Direct coupled means that the test substance or its molecules are attached by direct contact with the molecules of the inorganic insulator layer in region (3), preferably by interaction of a nucleophilic group of the test substance with the surface molecules of the insulator layer are attached, wherein a covalent or electrostatic in particular Compound or interaction is formed or prevails.
  • the test substance (5) coupled to the insulator layer (2) preferably interacts with a test substance, in particular with at least one test substance detectable by radiation and / or ionization, whereby association events are determined by mass spectrometry or by detection of radiation directly on and / or in the insulator layer (2). preferably in the at least one region (3) by means of an external detector detectable detected.
  • a test substance in particular with at least one test substance detectable by radiation and / or ionization, whereby association events are determined by mass spectrometry or by detection of radiation directly on and / or in the insulator layer (2).
  • preferably in the at least one region (3) by means of an external detector detectable detected eg scanners, imagers, IR ellipsometers, scintigraphs or X-ray devices, in particular for the detection of radiation in the wavelength ranges of visible light, UV light or IR, and all common mass spectrometers, eg MALDI or ESI, but is not limited thereto.
  • the advantage of this is that the arrangement usually quickly and easily with already existing Laboratory equipment and with known measuring methods in diagnostics and research can be used.
  • all standard methods and methods for the measurement of biochips or other solid-phase assays for example ELISAs or comparable solid-phase-based assays with dye-labeled molecules
  • all common methods for the detection of enzyme activity are suitable, especially when the enzyme or the enzyme substrate is bound to the applied area (3) and the arrangement is brought into contact with enzyme substrate or enzyme.
  • advantageously labeled (eg with a dye or radioactive isotope) enzyme substrate is coupled. But even a detectable change in solution is detectable when the substrate is dissolved and the enzyme is immobilized.
  • the area (3) is in particular subjected to a concentration or amount of test substance suitable for the detection, since an advantageous characteristic of the arrangement according to the invention is a concentration-dependent coupling of the test substance to the applied area (3), i. that as the concentration of the test substance decreases, decreasing detection signals are also observed, as a result of which, for example, association constants can also be determined.
  • concentration-dependent coupling may be observed due to the saturation of the surface with coupled test substance.
  • concentration-dependent signals or binding data can also be detected if the coupled test substance interacts with the test substance from the solution.
  • the signals detectable on and / or in a region (3), in particular by radiation and / or by mass spectrometric characteristics, from and / or in at least one further region (8) and / or / or detectable detectable signals in the environmental region (10), in particular depending on the coupled test substance.
  • semiconductor substrate (1) all known solids or materials with semiconductor properties are suitable, for example, silicon, titanium oxide or gallium arsenide especially in their different, preferably common, embodiments, such as different dopings.
  • the semiconductor substrate (1) with the insulator layer (2) formed thereon is preferably formed or configured in the usual dimensions of a biochip or a particle, in particular a strange bioparticle, preferably a microparticle or nanoparticle, making it particularly easy to use for conventional methods Biochips or particles can be used.
  • the arrangement is formed as a preferably planar biochip and / or as a 1D, 2D or 3D biochip for the optical or scintigraphic detection of association events by means of an external detector.
  • the semiconductor substrate (1) with the insulator layer (2) formed thereon is formed in the usual dimensions of an object carrier or a slide carrier, since it corresponds to the common standard for biochips in terms of its dimensions.
  • the training in the corresponding dimensions with a porous, structured, in particular lithographically structured surface is suitable.
  • the semiconductor substrate (1) with the insulator layer (2) formed thereon is formed as an oxidized silicon wafer or as a part thereof.
  • Silicon wafers generally have almost perfectly reproducible material properties and also their surface modification, in particular by oxidation, particularly preferably thermal oxidation and / or electrochemical oxidation and / or formation of a natural oxide, is particularly easy and reproducible to produce.
  • the semiconductor substrate (1) as amorphous, polycrystalline silicon or preferably monocrystalline silicon, in particular with a ⁇ 111 ⁇ - or ⁇ 100 ⁇ - or ⁇ 110 ⁇ - preferred orientation, particularly preferably with a ⁇ 111 ⁇ -Vorzugsorienttechnik formed, whereby the carrier material is formed as a nearly perfect and reproducible material.
  • a ⁇ 100 ⁇ preferred orientation of the semiconductor substrate (1) has proven to be particularly suitable for the arrangement according to the invention, with a particularly favorable arrangement being present due to the technical properties and wide distribution of this material, and the manufacturability being further simplified. But other crystalline preference orientations of the silicon are suitable.
  • the semiconductor substrate (1) is at least partially, in particular continuously and / or uniformly doped, preferably p- and / or n-doped, particularly preferably p-doped, in particular with an electrical resistance of ⁇ 100 ohms / cm 2 , preferably ⁇ 20 ohm / cm 2 , more preferably ⁇ 1 ohm / cm 2 , particularly preferably ⁇ 0.1 ohm / cm 2 , since the arrangement thus particularly favorable properties, eg. For the directed coupling of the test substance has.
  • impurities all customary for the doping of semiconductors impurities are suitable for p-doped substrates, in particular boron or phosphorus.
  • the semiconductor substrate (1) is preferably as a silicon wafer or as a part thereof, in particular as a sawn from a silicon wafer or by other fragmentation, eg by scratching and breaking of the wafer or by means of a liquid jet or a laser, chip, educated.
  • This has, inter alia, the advantageous property that the arrangement can be produced particularly accurately in terms of its material properties or dimensions and thus enables particularly well reproducible detection systems.
  • Arrangements according to the invention which can be used as bioparticles are preferably formed by the mechanical comminution of wafer material, for example by means of a ball mill or tribomechanical methods.
  • the semiconductor substrate (1) is formed homogeneously, for example as a completely, ie within its entire dimensions, uniform silicon material, for example as a silicon chip that is not doped consistently or doped with only one kind / species of foreign atoms, thereby also particularly simple uniform carrier properties of the arrangement, in particular over the entire insulator layer (2), which is located on the homogeneous semiconductor substrate, are produced.
  • the semiconductor substrate (1) is formed as a preferably homogeneous semiconductor substrate without doping, the arrangement can be used particularly advantageously for an optical measurement without background or noise.
  • unpolished semiconductor substrates in particular silicon substrates, preferably unpolished silicon wafers or chips formed therefrom, are suitable for various applications since, for example, a particularly simple and uniform incubation of the arrangement surface with a sample, even without the use of a coverslip, or other conventional ones Incubation devices.
  • the semiconductor substrate (1) with the insulator layer (2) formed thereon is formed from at least partially, preferably at least one side, in particular on the side exposed to the test substance, as a polished silicon wafer or a part thereof, then the arrangement is particularly suitable as a biochip with a reflective surface and the associated advantages.
  • the inorganic insulator layer (2) disposed on the semiconductor substrate is preferably formed by chemical reaction from the material of the semiconductor substrate (1), whereby a particularly ordered and fixed bonding layer is provided on the semiconductor substrate (1).
  • the inorganic insulator layer (2) of the arrangement according to the invention is preferably formed as a layer of silicon nitride, silicate, or an inorganic polymer, particularly preferably as silicon dioxide, subsequently also called silicon dioxide layer (7), in particular with or without inclusions of impurities (doping). This has the advantage that the bonding layer can be produced in a particularly simple manner, for example by reaction of a silicon semiconductor substrate (1) with oxygen or nitrogen.
  • the inorganic insulator layer (2) is configured as a silicon dioxide layer (7), especially in the at least one area (3; 8) as a non-natural, preferably dry and / or thermal oxide or as a dry and / or thermal nitride is formed, whereby particularly advantageous material properties, such as a sponge-like formed stable structure, the insulator layer are guaranteed.
  • a silicate layer (7) which is prepared wet-chemically and preferably subsequently dried and which preferably has a porous structure, is particularly suitable for various applications, or the silicon dioxide layer is advantageously natural, eg in air and / or by contact with distilled water formed, formed silicon oxide.
  • the inorganic insulator layer (2) is preferably in the form of a silicon dioxide layer (7) with a thickness of> 10 nm, preferably> 30 nm, in particular 100 nm (+/- 70 nm), particularly preferably 100 nm (+/- 10 nm), whereby particularly favorable properties, for example, for the reflection and amplification of radiation at the boundary layers of the inventive arrangement, are present.
  • the semiconductor substrate (1) is made of a silicon wafer or parts thereof, e.g. With a rectangular or square dimensions (chip) formed so are by the oxide thickness and the optical properties of the insulator layer, for example.
  • a blue or red coloration by wavelength-dependent refraction and / or reflection of light in the corresponding wavelength, adjustable for a variety of Applications of the arrangement are advantageous.
  • electrochemical and preferably thermal oxidation processes are suitable, since by means of which the desired silicon dioxide thickness (oxide thickness) can be produced in a particularly simple and reproducible manner. It is particularly favorable if the semiconductor substrate is formed as a silicon wafer or chip and the insulator layer is produced by conventional thermal oxidation processes.
  • at least one medium (4) in particular a liquid acted upon, preferably at least one solvent, hereinafter also referred to as solvent (9) comprises, or as at least one solvent (9) is formed.
  • liquid preferably a combination of an aqueous and an organic solvent, acts as a mediator for the specific and stable coupling of a test substance to the insulator layer according to the invention.
  • the medium (4) for the application if it comprises at least one solvent (9), which is formed as an aqueous and / or organic solvent, in particular a hydrophilic and / or polar solvent.
  • solvent (9) which is formed as an aqueous and / or organic solvent, in particular a hydrophilic and / or polar solvent.
  • water for example having a neutral pH, is to be understood as aqueous solvent.
  • organic solvent (9) an alcohol, dialkyl acid amide, alkyl halide, pyrollidone, furan, DMSO, acetonitrile, acetone or one of their derivatives is preferably suitable, especially ethanol, DMF 1 dichloromethane, NMP, THF or one of their derivatives.
  • the medium (4) which enables the coupling of the test substances according to the invention preferably comprises water having an acidic, neutral or basic pH and / or an organic solvent having an acidic, neutral or basic pH, an electrolyte and / or a buffer or is formed as such.
  • Particularly suitable is a basic, in particular physiological, pH.
  • the medium (4) is formed as a mixture of aqueous and organic solvents, in particular of an aqueous and an organic solvent, in particular as a mixture of an aqueous solution and an organic solvent, preferably with a deficit of organic solvent.
  • the medium (4) is at least partially electrically conductive, in particular with a conductivity> 0.05 ⁇ S / cm, preferably> 20 ⁇ S / cm, particularly preferably> 1 mS / cm, particularly preferably> 50 mS / cm, in particular if it contains a dissolved solid, preferably the test substance and / or a salt, particularly preferably the test substance and a dissolved salt.
  • the at least one area (3) acted upon by medium (4) and test substance (5) is formed as at least two non-silanized areas / districts (3, 8) on the insulator layer.
  • the at least two regions are to be understood as meaning a plurality of preferably spatially separated regions, which are formed either as a replica, e.g. a plurality of equally applied areas, e.g. two or more at least partially similar arrays, or in each case with different test substances or with different concentrations of a strigsusbeam are applied.
  • the at least two non-silanized regions (3-8) are at least partially formed by an environmental region (10) formed on and / or in the insulator layer (2), i. a preferably not impacted with test substance district of the insulator layer, surrounded.
  • This also ensures a simple delineation of the at least two regions as well as a particularly good comparability and distinctness of the radiation emanating from it or its mass spectrometric properties, in particular if the regions (3; 8) are spots, preferably spatially separated, particularly preferably complete separate, and / or location-addressed spots are formed.
  • the common definition, as it is used, for example, for spot synthesis or (micro) arrays, is to be understood by "spot".
  • the at least two regions (3; 8) are exposed to test substance dissolved at least partially in the at least one medium (4), in particular with a mixture comprising aqueous buffer solution, organic solvent and dissolved test substance.
  • a mixture comprising aqueous buffer solution, organic solvent and dissolved test substance.
  • Solid phase is to be understood in particular as the location-addressed application of a suitable volume of a liquid or solution to a solid phase, the solution being distributed with a circular or stain-like extent on the surface of the solid phase, in particular also hemispherical or in another form in the Insulator layer penetrates.
  • the at least two non-silanized regions (3, 8) are formed as an array, in particular as a microarray and / or low-density array, whereby a particularly good readability and utilization of the arrangement according to the invention is made possible.
  • the environmental region (10) is particularly preferably formed as silicon dioxide, i. as a substantially untreated region of the insulator layer (2) or is modified chemically, in particular with organic molecules, except the test substance.
  • rapid availability or reduction of nonspecific background signals is also particularly easily achieved, preferably if the surrounding area (10) is provided with blocking reagent and / or a nucleophilic compound, preferably with a thiol, e.g. Mercaptoethanol or cysteine is applied.
  • the inorganic insulator layer preferably over its entire areal extent, is cleaned prior to exposure to medium and test substance, eg by bathing in or wetting with an acid or base, for example Caro 's acid (hydrogen peroxide / Sulfuric acid mixture), or an organic solvent, for example ethanol, whereby the surrounding area is formed, for example, as a silicon dioxide with a purified surface.
  • an acid or base for example Caro 's acid (hydrogen peroxide / Sulfuric acid mixture)
  • an organic solvent for example ethanol
  • the test substance or test substances is formed in particular as molecules with at least one nitrogen, sulfur, oxygen, phosphorus, halogen, dye or radioactive isotope, or comprises these, whereby a particularly stable Connection or coupling between the insulator layer and the test substance is made.
  • the at least one organic test substance (5) is formed as at least two different test substances (5, 11), i. in that at least two different test substances or at least two different concentrations of one test substance are preferably spatially separated from the insulator layer and / or the test substance or the at least two different test substances are each arranged as molecules with at least one, preferably edge or terminal, molecule , Nitrogen, sulfur, oxygen, phosphorus, halogen, dye or radioactive isotope are or comprise these.
  • the arrangement is particularly advantageously suitable for location-dependent association with and for the detection of a plurality of different test substances from a sample, or it can be derived from the test substance, e.g. an enzyme, changes caused, e.g. are made visible by enzymatic cleavage of the coupled sample substance, and it is a particularly stable and directed coupling of the test substance to the inorganic bonding layer prepared.
  • the at least one organic test substance (5) preferably terminal, at least one nucleophilic chemical group or function, in particular a thiol, amino, hydroxyl, carboxyl (carboxy), cyano, Nitrile, Si, Se, He, sulfate, sulfide, alkene or alkyne, or phosphine group, or one / e by the interaction with the insulator layer resulting function or remainder, whereby the Stabiltusch the coupling is particularly well ensured, in particular by a thiol function, eg of a cysteine residue or of the residue resulting therefrom by interaction with the insulator layer.
  • a nucleophilic chemical group or function in particular a thiol, amino, hydroxyl, carboxyl (carboxy), cyano, Nitrile, Si, Se, He, sulfate, sulfide, alkene or alkyne, or phosphine group, or one / e by the interaction with
  • the at least one organic test substance (5) is or comprises, as a linker molecule, amino acid, carbohydrate, lipid, dye, drug, biotin, peptide, polypeptide, oligonucleotide, protein, cell compartment, cell or structure derived therefrom, whereby the arrangement is in principle is universally suitable for a wide variety of applications, in particular for detecting all possible bioorganic components or structures (test substances).
  • the at least one organic test substance (5) is particularly preferably formed or contains or contains DNA, RNA, cDNA, mRNA, cRNA, PNA, receptor, ligand, protein A, protein G, streptavidin, antibody or structure derived therefrom, whereby the specificity of the Association or interaction with the bioorganic test substance is particularly well ensured.
  • the test substance (5) is formed as a synthetic, naturally occurring or recombinantly expressed peptide or obtained by enzymatic, acidic or basic cleavage of polypeptides, preferably as a synthetically produced peptide.
  • peptides as test substance have the advantage that they are generally easy to prepare synthetically and in high purity and, similar to whole proteins, may have specific association properties, e.g. when the peptide is an antibody epitope, preferably N- or C-terminal with a cysteine residue.
  • peptides with at least one non-naturally occurring amino acid residue e.g. formed from anthranil or from aminobenzoic acid, are particularly suitable for a wide variety of requirements.
  • the at least one organic test substance (5) is formed as linker molecules with free / unbound chemically reactive groups.
  • linker molecules are In particular, to understand all possible molecules, except with the insulator layer chemically reactive silanes and silane derivatives, which have two different, preferably end and / or laterally arranged in the molecule, different chemically reactive groups or functions, the molecules via a function of the Insulator layer (2) are coupled and functionalized with bioorganic substances if necessary via the other function.
  • test substance is formed, for example, as cysteine
  • this is preferably coupled via the thiol or the radical generated from the thiol by interaction with the insulator layer, its side chain to the insulator layer and can via a subsequent chemical reaction by means of its amino or carboxyl group another Substance or catcher molecules, for example, an amino acid residue or a peptide couple.
  • streptavidin can be coupled to the surface in a subsequent step or has been coupled, for example sandwich arrangements (eg insulator layer-biotin-streptavidin-biotinylated component ) are possible or formed.
  • the linker molecule or substance is at least one crosslinker which, via the one function, is chemically, in particular covalently, conjugated to a bioorganic substance, e.g. an oligonucleotide or a protein, and is coupled by means of the other function, in particular a nucleophilic group, preferably a thiol, to the insulator layer (2).
  • a bioorganic substance e.g. an oligonucleotide or a protein
  • a nucleophilic group preferably a thiol
  • the at least one test substance (5; 8) with the majority of its molecules coupled to the surface is arranged spatially directed on the isolate layer, ie the molecules are uniformly aligned on the surface, or with preferential orientation, in particular depending on the orientation of the the semiconductor substrate.
  • the test substance is designed, for example, as a peptide, protein or oligonucleotide labeled terminally with a nucleophilic group, in particular a thiol
  • the test substance layer is coupled in particular via the thiol group to the attachment layer (2) and is otherwise exposed accessible for interaction with a test substance before, preferably perpendicular or at other suitable angles to the insulator surface.
  • test substances are formed as a plurality of peptides or a plurality of other synthetically produced molecules, in particular oligonucleotides, they are preferably designed uniformly with a preferably terminal or pendant nucleophilic group, eg a thiol, whereby in particular also with several at least partially similar test substances, eg wild-type sequence Mutant, a particularly uniform and directional connection and a good comparability of the results is guaranteed.
  • Another aspect of the invention relates to a simple and efficient method for producing an arrangement for the specific detection of substances from a sample, in particular for producing an arrangement which comprises a carrier substrate and a bonding layer formed on the carrier substrate and a test substance coupled to the bonding layer, preferably for producing the arrangement according to the invention.
  • an inorganic insulator layer formed on a semiconductor substrate with a medium and a test substance leads to the stable and directed binding of the test substance to the insulator layer. This is especially true for oxidized, non-silanized silicon surfaces.
  • At least one, in particular non-silanized, area not covalently coated with organic molecules and not coated with a metal (3) of an inorganic insulator layer (2) formed on a semiconductor substrate (1) is provided with at least one medium (4).
  • the shape or extent of the insulator layer on the surface of the semiconductor substrate may be different as required, and is, for example, as a closed layer, which in particular encloses the entire semiconductor substrate or only a part thereof, in particular only one side thereof as individual areas, eg by lithography, formed.
  • An air-stable coupling or connection is to be understood in particular as meaning that the coupled test substance can still be detected after minutes, hours and / or more than one week, in particular after more than one month, especially after more than one year after production of the arrangement. eg by incubation with a sample coupled to the insulator layer, when the assembly made in accordance with the invention is exposed to room air under normal conditions, e.g. at 23 ° C and atmospheric pressure, or vacuum, or inert gas atmosphere is stored.
  • solution-stable coupling or binding is meant, in particular, that the coupled test substance is detectable even after more than one hour, in particular after more than 12 hours, especially after more than 24 hours, 36 hours, 48 hours or 72 hours, e.g.
  • connection can also be stable under other than normal conditions.
  • a physiological buffer solution e.g. Tris or phosphate buffer
  • medium (4) and test substance (5) are in principle all standard methods or other known methods suitable by means of which a rigid surface with a medium and / or a test substance can be brought into contact, bswp. by incubating, pipetting or spotting or printing on the surface. If, for example, an arrangement is to be produced which has uniform properties over the entire surface of its at least one insulator layer, ie uniformly with the at least one test substance is occupied, the semiconductor substrate with the insulator layer formed thereon, for example.
  • the medium and / or the test substance is incubated such that it is preferably completely wetted with the medium and / or the test substance, for example by Bathing the substrate with the insulator layer formed thereon in a liquid in which the test substance is at least partially dissolved.
  • the medium and / or the test substance is to be applied or functionalized selectively to one or more regions on and / or in the inorganic insulator layer, for example for the production of a low-density chip, then the medium and / or the test substance preferably by means of a nozzle or pipetting device, in particular a pipette or a pipetting, applied to the insulating layer, in particular in spatially separated locations.
  • correspondingly cylindrical arrayers eg contact or piezo printers
  • first the insulator layer over a large area with the at least one medium eg by bathing or wetting the surface, for example.
  • an organic Solvent preferably with an organic solvent and an aqueous solvent, more preferably with an organic solvent and an aqueous solvent and a dissolved solid, which is preferably formed as a common component for buffering aqueous solutions, such as tris or phosphate, or as a salt is and subsequently applied to or in the large area with medium bauftschten area preferably location-addressed different test substances and / or different concentrations or amounts of a test substance, so that a plurality of differently functionalized districts / areas are formed within the large area.
  • aqueous solvent preferably with an organic solvent and an aqueous solvent, more preferably with an organic solvent and an aqueous solvent and a dissolved solid, which is preferably formed as a common component for buffering aqueous solutions, such as tris or phosphate, or as a salt is and subsequently applied to or in the large area with medium bauftschten area preferably location-addressed different test substances and / or different concentrations or amounts
  • the exposure of the insulator layer with medium and / or test substance can be carried out under all possible ambient conditions, and is preferably carried out at room temperature, whereby a particularly simple production of the arrangement according to the invention is ensured.
  • medium and / or test substance at a temperature which is above and in particular below the usual room temperature, for example 23 ° C is suitable, for example, a 4 ° C warm solution of the test substance, whereby even sensitive test substances are particularly easy to and / or in the insulator layer can be coupled.
  • the at least one medium is preferably selected to be formed from molecules and / or solids dissolved therein which, under the conditions chosen in the process, can not chemically react with the insulator layer, i. especially no covalent bond with the inorganic insulator layer, i. as a medium for the application of a silicon dioxide layer, e.g. a mixture with an organic solvent, water and a dissolved salt or a dissolved buffer component is selected.
  • a silicon dioxide layer e.g. a mixture with an organic solvent, water and a dissolved salt or a dissolved buffer component is selected.
  • the method is preferably carried out with three, two or one method step (s), depending on the type of arrangement to be produced.
  • the insulator layer is successively treated with an organic solvent, e.g. DMF, an aqueous liquid, e.g. saline / buffer, and the test substance, e.g. a dissolved peptide, preferably in the order mentioned.
  • the at least one medium (4) comprises three media or components, e.g. DMF and buffer and solvent of the peptide or comprises two media if, for example, the buffer and the solvent of the peptide are identical, and the peptide e.g. is dissolved in the concentration ranges 1 ⁇ M to 1 mM.
  • the insulator layer is treated with an organic solvent, preferably volatile at room temperature, e.g. DCM, and subsequently with an aqueous, i. Water-containing, liquid in which the test substance is at least partially dissolved, e.g. with a buffered solution of a protein, applied.
  • an organic solvent preferably volatile at room temperature, e.g. DCM
  • an aqueous, i. Water-containing, liquid in which the test substance is at least partially dissolved e.g. with a buffered solution of a protein, applied.
  • the insulator layer is charged with a solution in which the test substance is at least partially dissolved.
  • the solution comprises in particular an aqueous solvent, preferably an organic solvent and an aqueous solvent, more preferably an organic solvent and an aqueous solvent and a solid dissolved therein, in particular as a common buffer component, for example tris, or as a salt, for example sodium chloride formed is.
  • a direct coupling which is stable in air and in solutions, in particular without silanized or polymerized or cross-linked (eg polyvinyl, cellulose) interlayer, is formed within the at least one exposed area (3), in particular if a semiconductor substrate (1) is used for the method according to the invention.
  • a coupling or immobilization of the test substance to the insulator layer which is stable in air and in solution, i.
  • the coupled substance is also washed by incubation with liquid, e.g. after one or several hours or one or more days of washing of the arrangement formed by the method or the area (3).
  • a physiological buffer still detectably coupled to the insulator layer (2).
  • the test substance remains stable for months and longer in air or vacuum on the inorganic insulator layer, so that particularly good storage properties are ensured.
  • Direct coupling means that the test substance or its molecules are bound by direct contact with the molecules of the inorganic insulator layer in region (3), preferably by interaction of a nucleophilic group of the test substance, in particular a thiol, with the surface molecules of the insulator layer are connected a covalent or, in particular, electrostatic compound or interaction, in particular between the nucleophilic group of the test substance and the surface molecules of the insulator layer, is formed so that the test substance is stably and detectably coupled to and / or in the insulator layer.
  • a nucleophilic group of the test substance in particular a thiol
  • glass is used or selected accordingly as a substrate and as a bonding layer is a non-organically modified, and not metallically modified, eg coated with a gold layer, formed on the glass surface or boundary layer selected.
  • organically modified is in particular the covalent occupancy of the glass surface with organic (linker) molecules, for example silanes or polymerized or crosslinked polymers (cellulose, PVDF) to understand.
  • the features of the semiconductor substrate and the inorganic insulator layer which are particularly preferred for the method and which are specified above and below apply correspondingly to the glass substrate and the glass surface layer, as well as to the medium (4) and the test substance to be coupled to the glass surface layer.
  • a substrate substantially not soluble in water solid or solid such as a polymer, glass, ceramic, stone, wood, metal, etc., particularly preferably plastic, used or selected and as a bonding layer is a non-organically modified, and not metallically modified, for example, coated with a gold layer, formed on the solid silicon oxide layer, preferably silicon dioxide layer, in particular as a thin film or film with common thin-layer method, eg by vapor deposition or sputtering on the solid is applied, selected.
  • Organically modified is in particular the covalent occupancy of the silicon oxide surface with organic (linker) molecules, for example silanes, or polymerized or crosslinked polymers (eg cellulose, PVDF).
  • the thickness of the deposited layer is particularly preferably formed to be greater than or equal to the wavelength detected for the detection.
  • the features of the semiconductor substrate and the inorganic insulator layer which are particularly preferred for the method and which are particularly preferred for the method apply correspondingly to the solid and the Silicon oxide layer, and for the medium (4) and to be coupled to the silicon oxide layer test substance.
  • a solid substrate (solid substrate (1) ) is set or selected with at least one silicon oxide layer (silicon oxide layer (2)) formed thereon, wherein the at least one silicon oxide layer (2) is not metallized or not organically modified, eg non-silanized or, in particular, untreated or unmodified.
  • the above and below specified features of the semiconductor substrate and the inorganic insulator layer particularly preferred for the method apply correspondingly to the solid substrate and the silicon oxide layer, as well as to the medium (4) and the test substance (5) to be coupled to the glass surface layer.
  • the test substance (5) is in particular coupled to the insulator layer (2) in such a way that it can be probed with at least one test substance preferably detectable by radiation and / or ionization, with which the arrangement formed by the method is determined.
  • association events are detectable detectable by mass spectrometry, by thermal desorption or by detection of radiation directly on and / or in the insulator layer (2) preferably in the at least one region (3) by means of a preferably external detector.
  • the association events are indirectly detectable, for example if the test substance is an enzyme that converts the test substance, or the association events are directly detectable, for example by the presence of the test substance after the association.
  • all possible devices for detecting radiation eg scanners, imagers, IR ellipsometers, scintigraphs or x-ray devices, and all common mass spectrometers, eg MALDI or ESI, are suitable as detectors for detecting the arrangement formed by the method according to the invention.
  • the advantage of this is that the arrangement formed by the method usually fast and easy with already existing laboratory equipment and can be examined with known measuring methods in diagnostics and research.
  • the range (3) is applied in particular with a concentration or amount of test substance suitable for the detection, since an advantageous characteristic of the method according to the invention is the formation of a concentration-dependent coupling of the test substance to and / or in the insulator layer (2) within the applied range ( 3), ie that with decreasing concentration of the selected test substance also subsequently decreasing detection signals are observable.
  • concentration-dependent signals or binding data can also be detected if the coupled test substance optionally subsequently interacts with a test substance from a sample.
  • even low concentrations or quantities of test substance are suitable for producing an arrangement for detecting test substances by means of the method according to the invention.
  • the test substance selected is a dissolved test substance which is present in a concentration of ⁇ 1 M, preferably ⁇ 100 mM, more preferably ⁇ 10 mM in solution.
  • a concentration of the test substance of ⁇ 1 mM, preferably ⁇ 100 ⁇ M, more preferably ⁇ 10 ⁇ M is selected or used for the application.
  • a solution of the test substance in a concentration of ⁇ 1 ⁇ M, preferably ⁇ 100 nM, more preferably ⁇ 10 nM, in particular ⁇ 1 nM, is advantageously suitable for the application, in particular if the test substance has a high affinity for the test substance, wherein, for example, the association between the test and test substance is designed over an association constant Ka> 10 6 / M under physiological conditions.
  • the test substance for example, very large or particularly active, for example formed as a cell,
  • a concentration of the test substance is suitable which is ⁇ 100 pM, preferably ⁇ 10 pM, more preferably ⁇ 1 pM.
  • test substance is applied to the bonding layer (2) in the form of a solution or suspension
  • conventional or conventional volumes of solution are suitable, in particular, as in standard processes or others
  • a volume of test substance solution or suspension in the nanoliter range e.g. 1 nl or less suitable for the production of low
  • Density chips may be capable of microliter volume (e.g., 1 ⁇ l or less).
  • test substance or a concentration in several, in particular at least two, preferably three, more preferably more than three, replicas or replicates on the
  • Insulator layer preferably applied in a localized manner.
  • Detection systems allow, e.g. the parallel measurement of different samples which are locally addressed, e.g. as a pattern or regularly applied to the biochip according to the invention.
  • a dilution series of the coupled test substance on the solid phase is produced by preferably spatially addressed loading of the isolate layer (2) with at least two, preferably at least three, more preferably more than three different concentrations of a test substance.
  • a millimolar or micromolar solution eg with a concentration of 1 mM to 1000 mM, preferably ⁇ 100 mM, more preferably ⁇ 10 mM, or with a concentration of 1 nM to 1000 nM
  • the test substance is selected as the starting solution, and diluted, for example by means of conventional dilution series, eg : 1, 1: 5 or 1:10 dilution steps, and preferably both the starting solution and the diluted solutions / n are local addressed, in particular at different locations or multiply in one place, applied to the attachment layer.
  • the material parameters are preferably selected such that, in particular after incubation of the assembly thus produced with a sample, the on and / or in which one area (3) is distinguishable in particular by signals detectable by radiation and / or by mass spectrometric parameters of signals which act on and / or in a second area, preferably not or with another test substance or with a different concentration of the test substance ( Surrounding area (10) or further area (8)) can be detected if necessary.
  • semiconductor substrate (1) in principle all known solids or materials with semiconductor properties are suitable for the process according to the invention, for example silicon, titanium oxide or gallium arsenide, in particular in their different, preferably conventional, embodiments.
  • an arrangement which can be used as a preferably planar biochip and / or as a 1D, 2D or 3D biochip is made by means of the method according to the invention, which enables an optical or scintigraphic detection of association events by means of an external detector.
  • a semiconductor substrate (1) with the insulator layer (2) formed thereon is preferably selected in the usual dimensions of an object carrier or an object carrier insert, whereby an arrangement corresponding in size to the common standard for biochips is produced.
  • a semiconductor substrate (1) with the insulator layer (2) formed thereon in the dimensions length x width (7.5 +/- 1) cm x (2.5 cm +/- 0.5 cm , preferably exactly 7.5 cm x 2.5 cm with the usual deviations in their production, for example.
  • length x width (7.5 +/- 1) cm x (2.5 cm +/- 0.5 cm , preferably exactly 7.5 cm x 2.5 cm with the usual deviations in their production, for example.
  • a thickness of> 0.3 mm, in particular of 1 mm (+/- 0.7 mm ) preferably exactly 1 mm, selected with the usual production-related deviations, whereby a particularly good handling of the device to be produced is ensured.
  • the semiconductor substrate (1) is particularly preferably a silicon wafer or a part thereof, in particular a saw made of a silicon wafer or by other division, e.g. by scratching and breaking the wafer or by means of a liquid jet or a laser, chip obtained selected.
  • This has u.a. the advantageous property that the arrangement is particularly accurate in their material properties or dimensions produced and thus allows a particularly good reproducibility of the arrangements or detection systems according to the invention.
  • arrangements are to be made which can be used as bioparticles, they are preferably obtained by mechanical comminution of wafer material, e.g. chosen by means of a ball mill or tribomechanical process, particles formed as a semiconductor substrate, but the production is also possible by other dicing methods.
  • a semiconductor substrate (1) with the insulator layer (2) formed thereon, which is formed as an oxidized silicon wafer or as a part thereof, is selected for the method according to the invention.
  • Silicon wafers usually have nearly perfectly reproducible material properties and also their surface modification, in particular by oxidation, is particularly simple, homogeneous and reproducible to produce, whereby a particularly good reproducibility of the process and the arrangement and measurement results produced thereby is ensured.
  • a semiconductor substrate (1) is selected which is in the form of amorphous, polycrystalline silicon or preferably monocrystalline silicon, in particular with a ⁇ 111 ⁇ or ⁇ 100 ⁇ or ⁇ 110 ⁇ preferred orientation, particularly preferably with ⁇ 111 ⁇ .
  • -Vorzugsorienttechnik is formed, whereby an arrangement which is formed on a nearly perfect and reproducible support material can be produced.
  • a ⁇ 100 ⁇ preferred orientation of the semiconductor substrate (1) has proven to be particularly suitable for the method according to the invention, wherein the arrangement is particularly simple and inexpensive to produce by the technical characteristics and wide distribution of this material.
  • other preferred crystalline orientations of the silicon material are also suitable for the process according to the invention.
  • a directed coupling of the test substance has.
  • Suitable impurities of the doped material used are all customary for the doping of semiconductors impurities suitable for p-doped substrates, in particular boron, aluminum, indium and / or gallium, for n-doped substrates phosphorus, arsenic and / or antimony.
  • undoped semiconductor substrate for example silicon, which is preferably particularly pure, for example impurities in the ppm range or below, may also be used, whereby, for example, in the case of optical measurements, a particularly favorable signal-to-noise ratio due to low background signals is reachable.
  • a semiconductor substrate (1) is selected for the method according to the invention, which is preferably completely homogeneously formed, for example a silicon material which is uniform throughout its entire dimensions, for example a silicon which is doped throughout and which is doped with only one species / species of foreign atoms Chip, is used, whereby particularly simple uniform carrier properties of the arrangement, in particular over the entire insulator layer (2) can be produced.
  • Silicon substrates preferably unpolished silicon wafers or formed therefrom
  • Chips chosen or used, since they, for example, a particularly simple and uniform incubation of the assembly surface with a sample, even without
  • an inorganic insulator layer is selected, the surface of which is cleaned prior to exposure to medium and test substance, e.g. by means of an acid or base and / or an organic solvent, in particular using a
  • Ultrasonic bath or a shaker If, for example, an arrangement with particularly favorable, eg flat, surface properties are to be produced, a silicon substrate etched with hydrofluoric acid and subsequently oxidized by Carow's acid is selected as the semiconductor substrate with the insulator layer formed thereon, which is preferably dried in an oven.
  • an inorganic insulator layer which is formed by chemical reaction from the material of the semiconductor substrate (1) is preferably selected, thereby forming a particularly ordered and strong bonding layer on the semiconductor substrate (1 ) can be used for the inventive method.
  • inorganic insulator layer (2) for the process according to the invention is preferably a layer of silicon nitride, silicate or, more preferably, of silicon dioxide, hereinafter also referred to as silicon dioxide layer (7) selected, in particular with or without inclusions of impurities (doping).
  • silicon dioxide layer (7) selected, in particular with or without inclusions of impurities (doping).
  • a silicon dioxide layer (7) is selected as the inorganic insulator layer (2), which is in particular in the at least one region (3; 8) as a non-natural, preferably dry and / or thermal oxide or as a dry and / or thermal nitride is formed, whereby particularly advantageous properties of the manufacturable by the method according to the invention arrangement, eg be ensured by a spongy formed stable structure of the insulator layer.
  • a porous inorganic insulator layer e.g. is formed wet-chemically on or in the semiconductor substrate and then preferably dried in the oven, is particularly suitable as a bonding layer.
  • an inorganic insulator layer (2) which is in the form of a silicon dioxide layer (7) with a thickness or height of> 10 nm, preferably> 30 nm, in particular 100 nm (+/- 70 nm), particularly preferably 100 nm (+/- 10 nm) is formed, whereby particularly favorable properties, for example, for the reflection and amplification of radiation at the boundary layers, the manufacturable arrangement are present.
  • the oxide thickness also includes the optical properties of the insulator layer, for example a blue or red coloration due to reflection of light in the corresponding one Wavelength at the silicon / silicon oxide interface, can be used specifically for various applications of Arrangement of advantage.
  • the oxide thickness of the insulator layer (1) on a silicon wafer (semiconductor substrate (1)) in particular electrochemically and preferably thermally produced oxides are suitable, since by means of which the arrangement is particularly simple and reproducible in their properties, in particular the material properties of the bonding layer , can be produced or used.
  • a silicon wafer or chip with a silicon dioxide layer formed by a conventional thermal oxidation method for example by heating and contacting the wafer with a gas consisting predominantly of oxygen, is selected as the semiconductor substrate with the insulator layer formed thereon.
  • a gas consisting predominantly of oxygen is selected as the semiconductor substrate with the insulator layer formed thereon.
  • an electrochemically formed oxide which is preferably dried in an oven is used as the inorganic insulator layer.
  • a liquid which preferably comprises at least one solvent, also referred to below as solvent (9)
  • solvent (9) preferably comprises at least one solvent, also referred to below as solvent (9)
  • solvent (9) preferably a combination of an aqueous and an organic solvent, acts as a mediator for the specific and stable coupling of the test substance to the insulator layer according to the invention.
  • a medium (4) is selected for the loading, which comprises at least one liquid solvent (9), which is formed as an aqueous and / or organic solvent, in particular as a hydrophilic and / or polar solvent.
  • a liquid solvent (9) which is formed as an aqueous and / or organic solvent, in particular as a hydrophilic and / or polar solvent.
  • water for example having a neutral pH, is to be understood as aqueous solvent.
  • an alcohol, dialkyl acid amide, alkyl halide, pyrollidone, furan, DMSO, acetonitrile, acetone or one of their derivatives is preferably suitable, for example, ethanol, DMF, dichloromethane, NMP, THF or one of their derivatives.
  • the medium (4) chosen for the process according to the invention preferably comprises or is formed as such water having an acidic or basic pH and / or an organic solvent having an acidic or basic pH, an electrolyte and / or a buffer , Particularly suitable is a medium having a basic, in particular physiological, pH value is selected.
  • the medium (4) used is preferably a mixture of aqueous and organic solvents, in particular of an aqueous and an organic solvent, in particular as a mixture of an aqueous solution and an organic solvent, preferably with a deficiency of organic solvent.
  • the use of a percentage only small volume fraction of the organic solvent in the mixture, in particular ⁇ 10%, preferably ⁇ 1%, particularly preferably ⁇ 0.1%, is suitably selected, whereby also the coupling of particularly sensitive to organic solvents test substances, e.g. of proteins or cells.
  • an at least partially electrically conductive medium (4) in particular with a conductivity> 0.05 ⁇ S / cm, preferably> 20 ⁇ S / cm, particularly preferably> 1 mS / cm, particularly preferably> 50 mS / cm, especially if it contains a dissolved solid, preferably the test substance and / or a buffer component and / or a salt, preferably the test substance and a buffer component, particularly preferably the test substance and a dissolved salt.
  • a non-electrically conductive medium may be suitable.
  • At least two non-silanized regions or regions (3; 8) preferably not covertly coated with organic molecules are subjected to at least one medium (4) and in each case at least one test substance on the isolator layer, for example by pipetting suitable, in particular not running into each other (spot) volumes that at least two similar or in particular differently functionalized areas are formed.
  • the at least two areas are in particular a plurality of preferably spatially separated districts to understand that are formed either as a replica, eg several areas, which are acted upon similarly, or in each case with different test substances or with different concentrations of a test substance are applied, wherein a plurality of differently functionalized areas (3; 8) are formed.
  • the application is carried out in such a way, e.g. by pipetting or automated spotting to form at least two non-silanized coupons (3; 8) coupled at least partially or completely to an environmental region (10) formed on and / or in the insulator layer (2), i. a preferably not impacted with test substance district of the insulator layer are surrounded.
  • This also makes possible a simple delimitation of the at least two regions as well as a particularly good comparability and distinctness of the radiation emanating from it or its mass-spectrometrically detectable properties, in particular if the regions (3; 8) act as spots, preferably spatially separated from each other and / or Locally addressed spots are formed.
  • it may also be suitable to use an inorganic insulator layer whose surface has a non-closed silane layer and which in particular is not silanized in the areas in which test substance is coupled.
  • At least two regions (3; 8) are each exposed to a test substance dissolved at least partially in the at least one medium (4), in particular with a mixture comprising aqueous buffer solution, organic solvent and dissolved test substance.
  • a test substance dissolved at least partially in the at least one medium (4), in particular with a mixture comprising aqueous buffer solution, organic solvent and dissolved test substance.
  • the method makes it possible in a particularly simple manner, namely in a single process step, to produce an arrangement for the detectable detection of a plurality of association events, from a semiconductor substrate and an insulator layer formed on the semiconductor substrate.
  • the test substances to be coupled are preferably dissolved in the same medium.
  • the at least two non-silanized regions (3; 8) are produced as an array, in particular as a microarray and / or low-density array, thereby enabling a particularly good readability and utilization of the arrangement according to the invention.
  • arrays according to the invention all common application techniques, eg pipetting, and customary volumes are suitable, which are used in the conventional application of glass carriers with sample substances for producing a biochip array, in particular a low-density or microarray.
  • the surrounding area (10), which preferably completely surrounds at least one and particularly preferably at least two non-silanized areas (3; 8), is preferably formed in such a way that it is not exposed to test substance, and in particular as only medium (4) acted upon or preferably untreated silicon dioxide of the insulator layer (2) remains.
  • the surrounding area (10) is chemically modified, in particular with organic molecules, with the exception of the test substance.
  • rapid usability or reduction of nonspecific background signals is particularly easy to produce, preferably if the surrounding area (10) is provided with blocking reagent and / or a nucleophilic compound, preferably with a thiol, e.g. Mercaptoethanol or cysteine is applied.
  • the passivation of the surrounding area (10) can, however, also be produced, for example, during the subsequent incubation of the arrangement according to the invention with a sample containing blocking reagent or serum.
  • blocking reagent are essentially all commonly used in biotechnology substances for the passivation of surfaces with organic compounds suitable, in particular dissolved milk powder, albumin or protein fragments, with which preferably the test substance is not specifically associated.
  • molecules with at least one nitrogen, sulfur, oxygen, phosphorus, halogen, dye and / or radioactive isotope are selected as the test substance or test substances, or the selected test substance comprises these, whereby a particularly stable connection or coupling between the insulator layer and the test substance is made possible.
  • At least two different test substances (5, 11) are selected as the at least one organic test substance (5), i. that at least two different test substances or at least two different concentrations of a test substance are preferably spatially separated or spatially separated from each other coupled to the insulator layer and / or the test substance or the at least two different test substances each as molecules with at least one, preferably edge or terminal arranged in the molecule, nitrogen, sulfur, oxygen, phosphorus, halogen, dye or radioactive isotope are or include.
  • a device for location-dependent association with and for the detection of a plurality of different test substances from a sample is produced in a particularly simple manner or it can subsequently be prepared from the test substance, e.g. an enzyme, modifications effected, e.g. are made visible by enzymatic cleavage of the coupled sample substance, and / or it is thereby produced a particularly stable and directed coupling of the test substance to the inorganic bonding layer.
  • the at least one selected organic test substance (5) comprises at least one nucleophilic chemical group or function, in particular a thiol, amino, hydroxyl, carboxyl, cyano, nitrile, Si, Se, Te, sulfate, sulfide, alkene or alkyne, or phosphine group, whereby the Stabiltusch the coupling is particularly well ensured, in particular by a thiol function, eg from a cysteine residue.
  • a nucleophilic chemical group or function in particular a thiol, amino, hydroxyl, carboxyl, cyano, nitrile, Si, Se, Te, sulfate, sulfide, alkene or alkyne, or phosphine group
  • oligonucleotides the 5 'or the 3' end of the oligonucleotide sequence.
  • the bioorganic test substance selected as the at least one organic test substance (5) is preferably a linker molecule, amino acid, Carbohydrate, lipid, dye, drug, biotin, peptide, polypeptide, oligonucleotide, protein, cell compartment, cell, or structure derived therefrom or comprising, whereby the arrangement is in principle universal for a variety of applications, in particular for detecting all possible bioorganic components or structures (test substances) can be produced.
  • test substance (s) (5) is particularly suitable, since the process according to the invention is useful i.a. allows the production of peptide and / or protein chips with particularly advantageous properties.
  • the at least one organic test substance (5) is particularly preferably chosen or the test substance contains the DNA, RNA, cDNA, mRNA, cRNA, PNA, receptor, ligand, protein A, protein G, streptavidin, antibody or structure thereof, whereby the Specificity of the association or interaction with the bioorganic test substance is particularly well ensured.
  • Particularly preferred as test substance (5) is a synthetic, naturally occurring or recombinantly expressed or obtained by enzymatic, acidic or basic cleavage of polypeptides peptide, preferably used as a synthetically produced peptide.
  • the at least one organic test substance (5) one or more peptides from preferably L and / or D-amino acid residues and / or glycine and / or ß-alanine, in particular from the genetically encoded amino acids and or their preferably naturally occurring modifications, for example phosphoserine, threonine, or tyrosine, in particular also, for example, with a radioactive or dye marking, chosen, or the Profubststanz includes these.
  • Peptides as a test substance generally have the advantage that they are generally easy to prepare synthetically and in high purity and can have comparable association properties with whole proteins, for example when the peptide is preferably N- or C-terminal with a cysteine residue formed antibody epitope is selected.
  • Synthetic, preferably chromatographically purified, peptides are therefore particularly preferably chosen as the test substance to be coupled in for the method according to the invention.
  • peptides with at least one non-naturally occurring amino acid residue for example formed from anthranil or from aminobenzoic acid, are particularly preferred for a variety of requirements.
  • the at least one organic test substance (5) is selected as linker molecules with free / unbound chemically reactive groups or comprises these.
  • linker molecules in particular all possible molecules, with the exception of silanes, are to be understood which have two different, preferably end and / or side, molecules arranged in the molecule, different chemically reactive groups or functions, the molecules via a function of the insulator layer (2) be coupled and possibly connected via the other function with bio-organic substances.
  • cysteine is chosen as the test substance, it is preferably coupled to the insulator layer via the thiol function of its side chain, and a further substance or capture molecules, e.g. attach an amino acid residue or a peptide.
  • streptavidin may be coupled to the surface, thereby, for example, sandwiching arrangements (e.g., insulator layer-biotin-streptavidin-biotinylated component).
  • sandwiching arrangements e.g., insulator layer-biotin-streptavidin-biotinylated component.
  • the immobilization on the test substance or the linker can also be carried out chemically, covalently and / or by electrostatic or hydrophilic interactions.
  • At least one crosslinker is selected as the linker molecule or the test substance, which is already chemically, in particular covalently, connected via one of its at least two linker functions with a bioorganic substance, eg an oligonucleotide or a protein, and by means of the other function, in particular a nucleophilic one Group, preferably a thiol, is coupled to the insulator layer (2).
  • a bioorganic substance eg an oligonucleotide or a protein
  • a nucleophilic one Group preferably a thiol
  • the method according to the invention particularly preferably arranges the at least one test substance (5; 8) with the majority of its molecules coupled to the surface spatially directed on the isolate layer, i. that the molecules are uniformly aligned, in particular with a preferred orientation, on the surface or are coupled. If, for example, a peptide, protein or oligonucleotide labeled terminally with a nucleophilic group, in particular a thiol, is selected as the test substance, then the test dye layer is coupled in particular via the thiol group to the attachment layer (2) and is otherwise freely accessible for the optionally subsequent interaction with a test substance.
  • peptides or other synthetically produced molecules are preferably selected as the test substance, these are preferably uniform with a nucleophilic group, e.g. a terminal or lateral thiol, whereby in particular even with several at least partially similar test substances, e.g. Wild-type sequence and mutant, a particularly uniform and directed binding and a good comparability of the results is ensured.
  • a nucleophilic group e.g. a terminal or lateral thiol
  • excess medium and / or excess test substance is preferably removed from the surface by washing.
  • volume of the solution containing the test substance are selected which lead to a rapid evaporation of the solvent under normal conditions, for example at room temperature.
  • the excess, uncoupled substances that remain on the assembly after evaporation of the solvent are then subsequently passed through Washing from the surface, preferably with an aqueous liquid, preferably a buffer solution, more preferably water, removed.
  • the exposure to the test substance is preferably below the usual room temperature, preferably ⁇ 23 0 C particularly preferably ⁇ 5 ° C, and optionally with solvent additives, a rapid evaporation of the At least hinder solvent, eg oil, and the surface is washed after exposure to the or at least partially dissolved test substance (s) and before the complete evaporation of the solvent accordingly.
  • the At least hinder solvent eg oil
  • the surface is advantageously washed accordingly.
  • the arrangement is dried after washing or possibly kept moist.
  • a further aspect of the invention relates to the use of the arrangement according to the invention or of the arrangement produced by the method according to the invention for the specific detection of substances from a sample, in particular for the detection of association events.
  • the use according to the invention is characterized in that the arrangement is brought into contact with at least one sample, also referred to below as sample (13), which optionally contains a test substance, also referred to below as test substance (14).
  • the at least / at least one region (3), to which the at least one test substance (5) is coupled is brought into contact with the at least one sample (13), for example by direct application by means of pipetting the sample the at least one region or indirect application of the sample in the vicinity of the region, for example in or on the surrounding region (10), and subsequent distribution or supply to the at least one region (3).
  • all standard methods or other methods are suitable for contacting, by means of which a sample to be tested can be placed on a biochip or fed to a solid-phase-bound test substance, for example by means of customary Lab-on-a-Chip methods.
  • a gas, solid, liquid, and / or a mixture thereof is used as a sample, more preferably a sample containing at least one test substance, e.g. an analyte and / or a control, preferably at a detectable concentration.
  • test substance e.g. an analyte and / or a control, preferably at a detectable concentration.
  • sample (13) a solution, emulsion, and / or suspension which optionally contains microparticles or other undissolved components, preferably containing at least one at least partially dissolved test substance.
  • the sample (13) used is body fluid, preferably urine, blood or serum, mucous tear fluid, sweat, semen, cerospinal fluid and / or a stool sample or the sample contains same.
  • At least two different samples (13; 16) are used as the at least one sample (13), which are preferably placed on the surface of the arrangement in a location-addressed manner, in particular each on a replica of the coupled test substance (s), thereby also having only one arrangement different samples can be examined simultaneously.
  • Particularly suitable according to the invention is the use of a sample containing as test substance an amino acid, a carbohydrate, a lipid, a dye, a drug, biotin, a linker molecule, a peptide, an oligonucleotide, a protein, cell tissue, a cell, a cell constituent, DNA , RNA, cDNA, mRNA, cRNA, PNA, a protein and / or a peptide or structures derived therefrom, or the test substance comprises these, eg a bioparticle.
  • a sample which contains as test substance (14) an antibody, an enzyme, a receptor, a ligand, a protein domain or an antibody epitope, and particularly preferably as IgA, IgG 1 IgE, IgM, kinase, phosphatase or antibody epitope.
  • a sample which contains a test substance (14) which interacts with the test substance (5) coupled in the region (3) without silanized intermediate layer to the insulator layer (2), in particular associated with the test surface (5) or enzymatically altered.
  • Particularly preferred according to the invention is the use of a sample which contains a test substance (13) which interacts verifiably with at least one test substance coupled to and / or in at least one area (3; 8).
  • a sample which contains a test substance (14) which is preferably covalently linked to a radiation-active marker, e.g. a labeled peptide, or subsequently linked, e.g. by incubation with a labeled secondary antibody.
  • a radiation-active marker e.g. a labeled peptide
  • the arrangement preferably the at least one region (3; 8), after contacting the sample by means of an externally or peripherally arranged detector for the detection of radiation, in particular for the detection of radiation in the wavelength ranges of visible light, UV light or IR or for the detection of radioactive radiation, or for the detection of mass spectrometry measurable products or parameters, in particular by means of a scanner, I lean or mass spectrometer read.
  • FIG. 1 shows schematically A and C an example of the state of the art and B and D an example of the arrangement according to the invention (oblique view from above, detail from a biochip, in the case of a microparticle the surface is correspondingly completely / consistently coated with a test substance) ,
  • Figure 1 A On the surface of a carrier substrate (a) of a solidified melt (glass) is a deposited by silanization two-component layer (b and c) of a silane derivative, which is connected via the molecular silicon (b) to the carrier substrate and the organic part (c) of the silane derivative, which has a chemical function or group to which in a subsequent step, one or more test substances (d) are attached in the form of an array.
  • the areas (spots) with test substance (s) are surrounded by the organic layer (c), whose reactive groups are subsequently blocked.
  • FIG. 1B on a semiconductor substrate (s) with the features according to the invention, e.g. on a part of a silicon wafer, an inorganic insulator layer (f) of the present invention, e.g. a silicon dioxide layer, disposed on or in the surface thereof by direct interaction of the surface molecules of the
  • a replica of two identical spots of a test substance is located, on the right side a spot with a lower concentration of the same test substance (front) and a spot of a second test substance (rear) is arranged.
  • the areas (spots) with test substance (s) are surrounded by the inorganic insulator layer, which is optionally subsequently, for example, blocked with a thiol or blocking reagent or in the inventive use, for example by contacting with body fluid.
  • FIG. 1C Schematic cross section through the arrangement (FIG. 1A) in the region of the connected test substance (s).
  • the arrangement comprises a large-area organic layer of silane derivative (c) to which the test substance (s) are attached in a localized manner. Since the organic layer (c) usually has hydrocarbon compounds, there may be troublesome interactions between the organic layer (c) and the test substance (s).
  • FIG. 1 D Schematic cross section through the arrangement according to the invention (FIG. 1B) in the region of the coupled test substance (s).
  • the test substances or the different lateral concentration of a test substance adhere directly to the surface molecules of the inorganic insulator layer (f) on or in the inorganic insulator layer (h).
  • Figure 2 A and D show an example of the inventive arrangement with glass as the carrier substrate according to the further solution of the object of the invention
  • B and E an example of a particular embodiment of the invention
  • C and F each an example of the inventive arrangement with a non-water-soluble solid as a substrate according to the other solution of the object of the invention.
  • FIG. 2A on a glass substrate (a) having the features according to the invention, eg on a glass chip, a glass surface layer (b) according to the invention, which is not organically or metallically modified, is arranged on or in the surface thereof by direct interaction of the surface molecules Insulator layer having a chemical function or group (except silanes and derivatives thereof) of a test substance, for example with a thiol, one or more test substance (s) (c) according to the invention, eg peptide / e with a preferably terminal cysteine residue, are coupled, eg as Array of different test substances and / or different amounts of a test substance, preferably as a replica.
  • a glass substrate having the features according to the invention, eg on a glass chip
  • a glass surface layer (b) according to the invention which is not organically or metallically modified, is arranged on or in the surface thereof by direct interaction of the surface molecules Insulator layer having a chemical function or group (except silanes and derivatives thereof
  • a spot with a lower concentration of the same test substance (front) and a spot of a second test substance (rear) is arranged.
  • the areas (spots) with test substance (s) are surrounded by the glass surface layer (b), which is optionally blocked subsequently, for example with a thiol or blocking reagent or during the use according to the invention, for example by bringing it into contact with body fluid.
  • Figure 2 B On a solid (d), which is formed as a solid according to the further solution of the object according to the invention, in particular with the inventive features, e.g. on a plastic, silicon (e), e.g. by sputtering or sputtering the solid surface with a silane which has been oxidized in the region of its surface, e.g.
  • test substance e.g. Peptide / s with a preferably terminal cysteine residue, e.g. as an array of different test substances and / or different amounts of a test substance, preferably as a replica.
  • test substance on the left side, a replica of two identical spots of a test substance is located, on the right side a spot with a lower concentration of the same test substance (front) and a spot of a second test substance (rear) is arranged.
  • the areas (spots) of test substance (s) are surrounded by the silicon dioxide layer (g), which may be subsequently, e.g. with a thiol or blocking reagent or in the use according to the invention, e.g. by contacting with body fluid, is blocked.
  • FIG. 2C On a solid (i) according to the invention, eg on a plastic, a silicon oxide layer 0), for example by deposition of silicon dioxide (eg from a plasma), is arranged on or in the surface thereof by direct interaction of the surface molecules of the silicon dioxide layer with a chemical function or group (excluding silanes and their derivatives) of a test substance, eg with a thiol, one or more test substance (s) (k) according to of the invention, for example peptide / s with a preferably terminal cysteine residue are coupled, for example as an array of different test substances and / or different amounts of a test substance, preferably as a replica.
  • a test substance (s) (k) for example peptide / s with a preferably terminal cysteine residue are coupled, for example as an array of different test substances and / or different amounts of a test substance, preferably as a replica.
  • a replica of two identical spots of a test substance is located, on the right side a spot with a lower concentration of the same test substance (front) and a spot of a second test substance (rear) is arranged.
  • the areas (spots) with test substance (s) are surrounded by the silicon dioxide layer (j), which is optionally blocked subsequently, for example with a thiol or blocking reagent or during the use according to the invention, for example by bringing it into contact with body fluid.
  • FIG. 2 D Schematic cross-section through the arrangement according to the invention (FIG. 2 A) in the region of the coupled test substance (s).
  • the test substances or the different amounts of a test substance adhere directly to the surface molecules of the glass surface layer (b) on or in the glass surface layer (k).
  • FIG. 2E Schematic cross section through the arrangement according to the invention (FIG. 2B) in the region of the coupled test substance (s).
  • the test substances or the different amounts of a test substance adhere directly to the surface molecules of the silicon dioxide layer (g) on or in the silicon dioxide layer (I).
  • FIG. 2F Schematic cross section through the arrangement according to the invention (FIG. 2C) in the region of the coupled test substance (s).
  • the test substances or the different amounts of a test substance adhere directly to the surface molecules of the silicon dioxide layer (j) on or in the silicon dioxide layer (m).
  • FIG. 3 schematically shows cross sections (corresponding to FIG. 1D) of typical
  • FIG. 1 D The hatching / pattern of the semiconductor substrate, the inorganic insulator layer and the coupled test substance (s) is shown in FIG. 1 D.
  • the roughly hatched area of FIG. 3 AG corresponds to the cross section of the glass substrate or the solid and the finely hatched area / s to the cross section / the glass surface layer (s) or the silicon dioxide layer (s).
  • FIG. 3A shows an arrangement in which the surface of the semiconductor substrate is completely covered with an inorganic insulator layer, preferably uniform thickness / height.
  • Figure 3B shows an arrangement at the two sides of the semiconductor substrate (top and bottom) with an inorganic insulator layer of thickness / height x, e.g. a silicon dioxide layer, are covered and at least two sides with an inorganic insulator layer, e.g. a silicon dioxide layer occupied thickness / height ⁇ x, e.g. an arrangement with a chip that is sawn from a thermally oxidized silicon wafer with an oxide thickness> 4 nm and on whose side surfaces a natural silicon oxide ⁇ 4 nm is formed.
  • an inorganic insulator layer of thickness / height x e.g. a silicon dioxide layer
  • an inorganic insulator layer e.g. a silicon dioxide layer occupied thickness / height ⁇ x
  • FIG. 3C shows an arrangement in which the semiconductor substrate is not completely covered by the inorganic insulator layer, to which at least two test substances or at least two different amounts of a test substance are coupled in a location-addressed manner.
  • FIG. 3 D shows an arrangement in which at least two spatially separated inorganic insulator layers are formed in the surface of the semiconductor substrate to which at least two test substances or at least two different quantities of a test substance are respectively coupled.
  • FIG. 3E shows an arrangement in which at least two spatially separated inorganic insulator layers are formed in the surface of the semiconductor substrate, to each of which one of at least two test substances or in each case a quantity of at least two different amounts of a test substance is coupled Isolator layers are larger (left) and / or identical (right) with the surface exposed to test substance.
  • FIG. 3F shows an arrangement in which at least two spatially separated inorganic insulator layers are formed on the surface of the semiconductor substrate to which at least two test substances or at least two different quantities of a test substance are respectively coupled.
  • FIG. 4 schematically shows special embodiments of the arrangement according to the invention.
  • the hatching / pattern of the semiconductor substrate, the inorganic insulator layer and the coupled test substance (s) is according to FIG. 1 D.
  • Figure 4 A shows a cross-section through an arrangement with recesses in the surface, wherein the test substance (s) on and / or in the depressions, e.g. are formed as hollow cylinders, as hollow cones, as grooves or as a combination thereof.
  • Figure 4B shows a cross-section through an array with continuous recesses in the semiconductor substrate, e.g. are formed as a bore or channels, wherein the test substance (s) are coupled to and / or in the recesses.
  • FIG. 4 C shows a plan view of an arrangement according to FIG. 4 A.
  • FIG. 4D shows a plan view of an arrangement according to FIG. 4B.
  • silicon in various embodiments (monocrystalline silicon with a ⁇ 111 ⁇ , ⁇ 100 ⁇ or ⁇ 110 ⁇ orientation, polycrystalline Silicon or amorphous silicon which was p- (boron) or n- (with phosphorus, antimony or arsenic) or undoped and exhibited electrical resistance depending on the doping, the surface of the silicon atom being atomically smooth, rough, polished, not polished or porous), with either the silicon formed as a wafer or as a part thereof or deposited on different solids (plastic, wood, metals (eg aluminum) or glass).
  • glass substrate according to the other solution of the object of the invention were glass slides and as a solid according to the further solution of the object of the invention were plastic or polymer films used.
  • silicon dioxide was used in various embodiments, which was formed as a native or thermal oxide of different thickness on or from the silicon, as the glass surface layer according to the other solution of the object according to the invention non-organically or metallically modified surfaces of glass slides were used, and As the silicon oxide layer according to the further solution of the object according to the invention, silicon oxide layers deposited on the solid were used.
  • a layer of silicon dioxide with a thickness of> 4 nm, which was formed in particular as a thermally generated oxide has surprisingly proven to be particularly advantageous.
  • the surfaces to be coated with test substances were either contacted successively with an organic solvent and an aqueous solvent or aqueous solution, or were contacted with a mixture with an organic and an aqueous solvent or were untreated.
  • the surfaces treated with liquid were dried.
  • test substances used were in particular peptides, proteins, oligonucleotides or small (molar mass> 75 and ⁇ 2000 g / mol) of organic molecules which were dissolved in water or an aqueous solution, with or without addition of an organic solvent.
  • the solutions of the test substances were applied to the inorganic insulator layer or the glass surface layer or the silicon oxide layer either by means of a pipette, an automatic pipetter or an arrayer, or the respective surface to be coated was wetted or completely bathed with the test substance solution.
  • the surface was successively loaded with the various components of the sandwich arrangement, for example over a large area with thio-biotin and streptavidin, and subsequently localized with biotinylated peptides, proteins or oligonucleotides, eg as an array.
  • Uncoupled test substance was optionally subsequently removed from the surface by washing and / or the non-test substance areas of the surface were removed by blocking reagent, e.g. Blocking buffer and / or a nucleophile, e.g. Thiol, blocked.
  • blocking reagent e.g. Blocking buffer and / or a nucleophile, e.g. Thiol, blocked.
  • Excess blocking reagent was optionally removed from the surface by washing and / or the surface of the assembly was dried.
  • the assembly was incubated with at least one solution containing at least one at least partially dissolved test substance, in particular peptides, proteins, oligonucleotides, cell compartments, cells and / or small (molar mass> 75 and ⁇ 2000 g / mol) organic molecules, wherein the Solution with the test substance was optionally removed from the surface after incubation and / or the surface was washed and / or dried.
  • test substance in particular peptides, proteins, oligonucleotides, cell compartments, cells and / or small (molar mass> 75 and ⁇ 2000 g / mol) organic molecules
  • the assembly was subsequently probed with a dissolved labeled probe, e.g. a dye-labeled secondary antibody, which was optionally subsequently removed from the surface and / or the surface of the arrangement is washed and / or dried.
  • a dissolved labeled probe e.g. a dye-labeled secondary antibody
  • Figure 5 shows, for example, spotting (pipetting by means of a pipetting automat) biotinylated cysteine (ie biotin linked via its carboxyl group as amide to the amino group of L-cysteine) (1 mM, 0.1 mM and 0.01 mM dissolved in sodium phosphate buffer pH 7.4, 1% v / v NMP) on sawn Si wafer (p-doped, boron, 111 orientation, size 75mm x 25mm x 1mm + - 0.1mm, polished side, thermal oxide 1000 A + - 70, spot diameter approx. 1mm).
  • biotinylated cysteine ie biotin linked via its carboxyl group as amide to the amino group of L-cysteine
  • Figure 6 shows, for example, spotted biotinylated cysteine (1 mM, 0.1 mM, 0.01 mM) on sawn Si wafer (p-doped, boron, 111 orientation, size 75mm x 25mm x 1mm + - 0.1mm, unpolished Side, thermal oxide 1000 A + -70, spot diameter approx. 1mm).
  • Figure 7 shows, for example, spotted biotinylated cysteine (1 mM, 0.1 mM, 0.01 mM) on sawn Si wafer (p-doped, boron, 111 orientation, size 75mm x 25mm x 1mm + - 0.1mm), unpolished side, thermal Oxid 1000 A + -70, spot diameter approx. 1 mm, after incubation with HRP-labeled streptavidin and visualization with luminol on a Lumi imager shows signals that are dependent on the concentration of the applied test substance.
  • FIG. 8 shows, for example, spotted biotinylated cysteine (1 mM, 0.1 mM, 0.01 mM) on sawn Si wafers (p-doped, boron, 111 orientation, size 75 mm ⁇ 25 mm ⁇ 1 mm + -0.1 mm), unpolished side, 1mm, after long term test, incubated after 3 months with HRP-labeled streptavidin and visualized with luminol on Lumi-Imager, storage at 25 ° C, 4 ° C and -2O 0 C (from above downward).
  • Figure 9 shows, for example, spotted Tab2 peptides (in 0.1 M TBS buffer, the concentrations 1M, 0.1M, 0.01M) N-terminally extended with cysteine (columns 1-6, columns 7-9 without extension). incubated with antibody sandwich after 30 days, on sawn Si wafer (p-doped, boron, 111 orientation, size 75mm x 25mm x 1mm + - 0.1mm), unpolished side, thermal oxide 1000 A + -70, tapping diameter ca. 1mm, upper image detected on the Lumi imager with HRP-labeled antibody, lower image detected on the Affymetrix scanner with fluorescence-dye-labeled antibody.
  • test substances cyste-biotin, protein (streptavidin), peptide (antibody epitope)
  • test substances cyste-biotin, protein (streptavidin), peptide (antibody epitope)
  • test substances streptavidin, biotin and monoclonal antibody
  • FIG. 11 shows schematically the location-addressed binding of biotin on an inorganic insulator layer on a semiconductor substrate (triangular).
  • a biotin-cysteine solution is pipetted onto the insulator layer and then mixed with
  • Biotin-streptavidin-biotinylated antibody Biotin-streptavidin-biotinylated antibody
  • Figure 12 shows schematically the location-addressed coupling of peptides on an inorganic insulator layer on a semiconductor substrate and the comparison between a cysteine-labeled epitope (Tab2) pipetted in solution and the same unlabeled peptide. Subsequently, it is incubated with primary antibody and screened with HRP-labeled secondary antibody, and the specific binding of molecules and the suitability for immunoassays becomes clear.
  • ab2 cysteine-labeled epitope
  • FIG. 13 schematically shows the location-addressed connection of connection to an inorganic insulator layer formed on a semiconductor substrate.
  • Solutions of HRP-labeled streptavidin in different concentrations are pipetted onto the insulator layer and, after wetting the surface with peroxidase substrate, the chemiluminescence measured, whereby signals become visible, which are dependent on the concentration / amount of the coupled protein.
  • FIG. 14 shows arrangements according to the invention, which are produced as oligonucleotide microarrays and can be used for the detection of oligonucleotides.
  • dye-labeled oligonucleotides with different linkers on oxidized Si wafers p-doped, boron, 111 orientation, thermal oxide 1000 A + -.
  • Si wafers p-doped, boron, 111 orientation, quantitative oxide 1000 A + -70, coupled and read by Affymetrix scanner
  • Group 1 Amino-modified oligo SES, Cy5 labeled + C6-SFB (aldehyde-forming) group of 4: Amino-modified oligo SES, Cy5 labeled + C6-SANH (makes
  • Group 4 amino-modified oligo SMS, Cy5 labeled + C6-SFB (aldehyde-forming) group of 4 5: amino-modified oligo SMS, Cy5 labeled + C6-SANH (makes
  • Group 4 amino-modified oligo ESE, Cy5 labeled + C6-SFB (aldehyde-forming) group of 4 8: amino-modified oligo ESE, Cy5 labeled + C6-SANH (makes
  • Group 4 Amino Modified Oligo MEM 1 Cy5 Labeled + C6-SFB (Aldehyde Ending)
  • Group 4 Amino-modified oligo MEM, Cy5 labeled + C6-SANH (makes hydrazine end)
  • Group 12 amino-modified oligo MEM
  • Cy5 labeled group of four 13 thiol-modified oligo SES
  • Cy5 labeled group of four 14 thiol-modified oligo SMS
  • Cy5 labeled group of four 15 biotin-modified oligo SES
  • Group 18 Water A specific binding of the oligonucleotides and subsequently a specific binding and detection of dissolved oligonucleotides as test substances are shown.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Anordnung und ihre Verwendung zum spezifischen Erfassen von Substanzen aus Proben, insbesondere einen Biochip, auf Basis eines Substrats und einer auf dem Substrat befindlichen Anbindungsschicht. Die Anordnung weist ein Trägersubstrat und eine auf dem Trägersubstrat gebildete Anbindungsschicht und eine an die Anbindungsschicht gekoppelte Prüfsubstanz auf, wobei das Trägersubstrat ein Halbleitersubstrat ist und die Anbindungsschicht mindestens eine auf dem Halbleitersubstrat gebildete anorganische Isolatorschicht ist und wobei auf und/oder in der Isolatorschicht mindestens ein Bereich mit mindestens einem Medium und mit mindestens einer organischen Prüfsubstanz beaufschlagt ist, und in dem mindestens einen beaufschlagten Bereich zwischen der Isolatorschicht und der mindestens einen Prüfsubstanz eine Kopplung besteht, und die an die Isolatorschicht gekoppelte Prüfsubstanz geeignet ist, mit einer Testsubstanz wechselzuwirken. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren für die Herstellung der Anordnung, bei dem mindestens ein Bereich einer auf einem Halbleitersubstrat gebildeten anorganischen Isolatorschicht mit mindestens einem Medium und mit mindestens einer organischen Prüfsubstanz beaufschlagt wird, und es infolge von Wechselwirkungen zwischen der organischen Prüfsubstanz und der anorganischen Isolatorschicht zu einer Kopplung zwischen der organischen Prüfsubstanz und der anorganischen Isolatorschicht kommt, und der Bereich ausgebildet ist, um mit einer Testsubstanz wechselzuwirken und/oder bei Aufbringen einer Testsubstanz mit dieser wechselwirkt.

Description

Anordnung zum Erfassen von Substanzen, Herstellung der Anordnung und ihre Verwendung
Die Erfindung betrifft eine Anordnung zum spezifischen Erfassen von Substanzen aus Proben, insbesondere einen Biochip, auf Basis eines Substrats und einer auf dem Substrat befindlichen Anbindungsschicht, ein Verfahren für die Herstellung der Anordnung sowie ihre Verwendung, insbesondere zum Erfassen von Assoziationsereignissen.
Anwendungsgebiete der Erfindung sind, unter anderen, die Umwelttechnik, die Lebensmitteltechnologie, die pharmazeutische Industrie und die
Lebenswissenschaften: die Biologie, die Biochemie, die Biotechnologie, die Medizin, und die Medizintechnologie.
In der Natur finden Wechselwirkungen von Molekülen oder kleinen Partikeln statt, die mit herkömmlichen Mikroskopen nicht zu beobachten sind. Trotz ihrer geringen
Größe können diese Stoffe Einfluss auf die Gesundheit und das Wohlbefinden des
Menschen nehmen, z. B. bei der Infektion mit einem Virus oder der Mutation eines körpereigenen Gens bzw. des resultierenden Genprodukts. Die Präsenz solcher
Stoffe kann mit Hilfe einer biologisch aktiven Anordnung nachgewiesen oder neutralisiert werden.
Biologisch aktiven Anordnungen, bestehend aus Trägermaterialien und darauf aufgebrachten/immobilisierten organischen Verbindungen, insbesondere biologisch aktiven Substanzen, kommt dabei in der heutigen Biotechnolgie und den sogenannten Life-Sciences eine herausragende Bedeutung zu. Zweck solcher Träger, die zumeist auf Grundlage von nicht wasserlöslichen anorganischen oder organischen Polymeren gebildet sind, ist ganz allgemein die lokale Fixierung bzw. Immobilisierung sowie die Anreicherung bzw. Aufkonzentration biologisch aktiver Substanzen, bspw. von Nachweismolekülen oder von Pharmaka. Dadurch werden auch Oberflächen geschaffen, die für die verschiedensten Anwendungen, z.B. als Nachweissysteme oder als Pharmakon-Lieferanten, einsetzbar sind. Stand der Technik sind dabei insbesondere Biochips und funktionalisierte Mikropartikel (Biopartikel), die spezifisch Zielstrukturen auf molekularer Ebene erkennen und binden können. Ein Biochip ist ganz allgemein ein starrer Träger, auf dessen Oberfläche biologisch oder chemisch aktive Substanzen, insbesondere Moleküle, meist durch elektrostatische, hydrophobe, hydrophile und/oder kovalente Bindung an die Oberflächenmoleküle des Trägers, immobilisiert sind. Die Aufgabe der immobilisierten biologisch oder chemisch aktiven Substanzen ist es, dass sie die Assoziation von bioaktiven Stoffen aus einer Probe, z.B. einer Testlösung, mit der sie in Kontakt gebracht werden, ermöglichen. Dadurch können insbesondere auch bioaktive Stoffe aus einer Lösung sichtbar gemacht werden, wenn diese mit den immobilisierten biologisch aktiven Substanzen, z.B. Peptiden, Proteinen oder DNA wechselwirken bzw. assoziieren.
Ein Biochip ist in der Regel aus drei Komponenten aufgebaut:
1. einem Träger bzw. Trägersubstrat mit meist planarer/ebener Oberfläche, oft in der Form eines Mikroskop-Objektträgers,
2. einer Anbindungsschicht, die sich auf der Trägeroberfläche befindet und
3. biologisch oder chemisch aktiven Substanzen bzw. Prüfsubstanzen die an oder in der Anbindungsschicht immobilisiert sind.
Zweck der immobilisierten biologisch aktiven Substanz bzw. Substanzen ist dann die spezifische Anziehung und/oder Anreicherung von bioaktiven Stoffen bzw. Testsubstanzen aus einem Testmedium, wobei diese dann auf der Trägeroberfläche, meist durch eine physikalisch aktive Markierung, z.B. mit einem Farbstoff oder einem radioaktiven Isotop, oder mit Hilfe einer Farbstoff- oder einer Enzym-markierten Sonde, bspw. eines Primer oder eines Antikörpers, nachweisbar sind.
Stand der Technik sind insbesondere Träger aus Glas oder Kunstoff, die mit einer Anbindungsschicht aus Metall oder mit einer Anbindungsschicht aus Oberflächengebundenen organischen Molekülen beschichtet sind, welche die Immobilisierung von Proteinen, Peptiden, oder Oligonukleotiden an der Oberfläche bzw. in der Nähe der Oberfläche ermöglicht. Die Anbindungsschicht ist notwendig, da die herkömmlichen Trägermaterialien, z.B. Glas oder Kunstoff, unter normalen Bedingungen chemisch kaum reaktiv sind bzw. inert und daher keine direkte und in Lösung dauerhafte Anbindung der biologisch aktiven Substanz erlauben. Die Beschichtung des Trägers mit der Anbindungsschicht erfolgt durch einen in der Regel aufwendigen chemischen Prozess, z.B. einer Silanisierung von Glas, bei dem die Trägeroberfläche kovalent mit Molekülen belegt wird, die dann in einem nachfolgenden Schritt die Immobilisierung von biologisch aktiven Substanzen ermöglichen.
Träger zur Herstellung von sogenannten 1 D-Biochips (xD = x-dimensional) verfügen in der Regel über eine Anbindungsschicht aus Oberflächenmolekülen mit freien reaktiven Gruppen, bspw. Amino-, Epoxy, Aldehyd oder Maleimid -Gruppen. Möglich ist beispielsweise auch eine Anbindung bzw. ein Aufbringen von Elementen, z.B. von Gold, für die nachfolgende Immobilisierung. Wird nun eine biologisch aktive Substanz, bspw. ein Protein-Rezeptor, auf die derart funktionalisierte Oberfläche aufgebracht, so kann die Substanz über eine chemische Reaktion kovalent an die funktionalisierte (z.B. Glas-) Oberfläche binden, wenn der Rezeptor über eine geeignete chemisch funktionelle Gruppe verfügt, die mit einer freien reaktiven Gruppe der Moleküle der Anbindungsschicht reagiert und eine kovalente Bindung ausbilden kann. Üblich ist es auch, dass die Anbindungsschicht zusätzlich noch mit einem Crosslinker versehen wird oder ein Polypeptid angebunden wird, um nachfolgend die gewünschte biologisch aktive Substanz spezifisch zu immobilisieren.
Träger zur Herstellung von 2D- oder 3D-Biochips verfügen über eine Anbindungsschicht aus kovalent gebundenen Oberflächenmolekülen, oftmals Lipiden, längeren Alkanderivaten oder organischen Polymeren, z.B. als Hydrogel gebildet, die eine meist nicht kovalente Immobilisierung von biologisch aktiven Substanzen, z.B. von Rezeptoren über hydrophobe und/oder elektrostatische Wechselwirkung erlauben.
Eine Übersicht über gebräuchliche Biochips wird etwa in der Druckschrift Angenendt P. Drug Discov Today. 2005 Apr 1 ;10(7):503-11 gegeben.
Alle hierin beschriebenen Veröffentlichungen sind hier durch die Bezugnahme in ihrem vollen Umfang eingeschlossen.
Nachteilig am Stand der Technik ist ganz allgemein, dass die gängigen Träger erst metallisiert oder naßchemisch mit der Anbindungschicht funktionalisiert werden müssen, wobei arbeits- und zeitintensive Schritte, z.B. Reaktions- und Waschschritte, notwendig sind. Soll etwa ein Glaschip oder Partikel für eine nachfolgende Anbindung von Peptiden oder Proteinen silanisiert werden, so wird er für mehrere Stunden in ein Gefäß mit einer Silanisierungslösung verbracht, die durch Rühren, Schütteln oder Ultraschall bewegt wird, anschließend gewaschen und in einem Ofen getrocknet. Die Bewegung der Moleküle in Lösung ist dabei u.a. wichtig, um eine gleichmäßige Anbindungschicht auf der Trägeroberfläche bei der chemischen Reaktion zwischen dem Träger und den gelösten Molekülen, z.B. Alkoxysilan oder Chlorsilanen, zu erzielen. Sollen bspw. Biochips oder -partikel mit Glas als Trägersubstrat hergestellt werden, so ist aufgrund der Bedingungen bei der Herstellung der Anbindungsschicht oftmals die Verwendung von besonderem Glassubstrat, z.B. Quarzglas für hohe Temperaturbeständigkeit oder geringe Verunreinigungen, erforderlich. Aber auch die Anbindung einer polymerisierten Schicht bzw. Polymerschicht, z.B. aus (Nitro-)Cellulose, PVDF oder eines Hydrogels erfordert fachmännsches Können und ist aufwendig. Darüber hinaus ist die so hergestellte Anbindungsschicht oftmals chemisch empfindlich und erfordert eine besondere Lagerung des Trägers, z.B. unter Vakuum oder Schutzgas. Nachteilig an den gängigen Trägermaterialien ist weiterhin, dass ihre Oberflächeneigenschaften für viele Anwendungen nur eingeschränkt geeignet sind. Das gängige Trägermaterial Glas bspw. ist eine erstarrte Schmelze mit rauher Oberfläche, die sich nachteilig auf eine gleichmässige Anbindungsschicht und gerichtete Anbindung, z.B. von Microarrays, auswirken kann. Als Microarray wird ein Trägermaterial bezeichnet, auf dem sich eine große Zahl biochemischer Nachweise oder Tests auf engstem, meist nur fingernagelgroßem, Raum befinden. Aber auch Biochips mit nur wenigen ortsadresiert immobilisierten Tests sind bekannt und werden in der Praxis genutzt, bspw. sogenannte „Low density" Biochips. Die Tests bestehen aus vielen ortsadressiert, meist in kreisförmigen „Spots" auf der Oberfläche, gebundenen Molekülen oder größeren biologischen Komponenten (z.B. Zellorganellen oder Zellen). Dabei werden bspw. DNA-Moleküle oder Proteine gewählt, die spezifisch mit Substanzen aus einer Testlösung assoziieren können, wobei die gebundenen Substanzen nachfolgend auf der Oberfläche sichtbar gemacht werden. Aus dem sich ergebenden Muster von detektierten Substanzen auf dem Biochip, z.B. Serum- Antikörpern oder Gewebe-DNA, lässt sich so bspw. auf Pathogene, z.B. Viren, oder Gewebeveränderungen, z.B Tumoren, in der untersuchten Probe schließen. Der Biochip-Sektor hat einen ersten wesentlichen Aufschwung in der Zeit des humanen Genomprojekts erlebt. Angetrieben von dessen beeindruckenden Ergebnissen haben viele Start-Up-Unternehmen diesen Markt zur Beschleunigung und Automatisierung von Genanalysen betreten. Jetzt, da die menschlichen Gene vollständig sequenziert sind, liegt der Fokus auf der Entwicklung von hochleistungsfähigen Biochips, die ein einfaches Auslesen von biologischen Signalen in der Diagnostik und Forschung ermöglichen.
Neben den klassischen DNA-Analysen besteht dabei ein großes Bedürfnis nach Chips, die Genprodukte (Proteine oder Peptide) oder ganze Zellen als biologische Marker nachweisen können. Insbesondere die Routine-Untersuchung von Patienten durch Ärzte und medizinisches Personal wird durch den Einsatz solcher Biochips in der Zukunft erleichtert werden, da sie die gleichzeitige Untersuchung einer Vielzahl von Parametern ermöglichen.
Für einen Nachweis von Pathogenen in Blutserum sind insbesondere Biochips geeignet, die eine einfache und definierte Anbindung von Peptiden oder Proteinen ermöglichen. Diese haben den Vorteil, dass sie im Prinzip alle möglichen Substanzen sichtbar machen können, mit denen sie nach dem Schlüssel-Schloss- Prinzip wechselwirken. Dadurch können beispielsweise auch wesentlich mehr Pathogene sichtbar bzw. nachweisbar gemacht werden, als dies mit den heutigen DNA-Chips möglich ist.
In der Praxis erweist sich jedoch insbesondere das Aufbringen von Proteinen/Peptiden und das Auslesen der jetzigen Generation von Bio-Chips als schwierig, da der gängige Träger für DNA (Glas-Chips) dafür oft nur unzureichende Materialeigenschaften aufweist (Sheridan C. Nature Biotech 23 3-4 (2005)). Sollen bspw. Peptide gerichtet an die Oberfläche gekoppelt werden, so erfordern die dafür üblichen Verfahren einen besonders hohen Aufwand bei geringer Reproduzierbarkeit.
Funktionalisierte Mikropartikel, die z.B. als Nanopartikel gebildet sein können, ermöglichen die sensitive Erkennung, Markierung und Behandelung von Zielstrukturen eines biologischen oder biotechnologischen Systems. Unter dem biologischen System sind dabei im wesentlichen Organismen, Zellgewebe, Zellen, Zellbestandteile, DNA, RNA, cDNA, mRNA, cRNA, Kohlenhydrate Proteine und/oder Peptide sowie davon abgeleitete Strukturen zu verstehen, unter dem biotechnologischen System sind alle mögliche Untersuchungsanordnungen zu verstehen, mit deren Hilfe Eigenschaften von biologischen Systemen oder davon abgeleiteten Strukturen nachweisbar sind.
Stand der Technik ist ein Schichtaufbau von funktionalisierten Mikropartikeln, der dem beschriebenen 3-Komponenten-Aufbau eines Biochips entspricht, und der in der 1 D, 2D oder 3D Ausgestaltung je nach Verwendungszweck variieren kann. Ein typischer Mikropartikel für die gezielte und zeitverzögerte Freisetzung von Wirkstoffen in einem Organismus umfasst bspw. immobilisierte Lipide oder Hydrogele mit eingebrachten Wirkstoffen sowie kovalent, über die Anbindungsschicht, gebundene Antikörper zur Erkennung der Zielstruktur im Organismus.
Da die bestehenden Anordnungen zum Erfassen von Substanzen aus einer Probe, insbesondere Biochips, durch die Vielzahl an Verfahrensschritten zu ihrer Herstellung, insbesondere bei der Aktivierung der Trägeroberflächen, z.B. die aufwändigen Verfahrensschritte bei der Silanisierung, in ihrer Reproduzierbarkeit eingeschränkt sind, besteht großer Bedarf nach Anordnungen, die einfach und zuverlässig herstellbar sind und exakt reproduzierbare Ergebnisse, auch als Peptid- oder Proteinchip, bei ihrer Verwendung ermöglichen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine effiziente und einfach herzustellende Anordnung mit herausragenden Eigenschaften anzugeben, die vorzugsweise als Biochip oder funktionalisierter Partikel gebildet und einsetzbar ist, auf Basis eines Substrats und einer Anbindungsschicht, an der zu prüfende Substanzen einfach und direkt angekoppelt bzw. immobilisiert sind, zum Erfassen von Zielsubstanzen bzw. Testsubstanzen aus einer Probe, ein Verfahren zur Herstellung der Anordnung sowie ihre Verwendung, insbesondere zum Erfassen und/oder dem Nachweis von bioaktiven Stoffen aus einem Testmedium, vorzugsweise von DNA, RNA, Proteinen, Peptiden, Zellen, deren Bestandteilen und/oder Viren aus einer Flüssigkeit. Diese Aufgabe wird durch eine Anordnung gemäß Anspruch 1 , ein Verfahren zur Herstellung der Anordnung gemäß Anspruch 8, sowie ihre Verwendung gemäß Anspruch 17 gelöst. Die weiteren Ansprüche sind bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Die Erfindung in ihren unterschiedlichen Ausgestaltungen und technischen Merkmalen wird entsprechend den Ansprüchen und der hier gegebenen Beschreibung realisiert.
Kernpunkt der Erfindung ist die vollkommen überraschend gefundene Herstellbarkeit von Anordnungen zum Erfassen von Substanzen aus einer Probe, für die keine im Stand der Technik eingesetzten Verfahren zur Aktivierung des Trägers, d.h. chemische oder metallische Modifizierung des Trägermaterials mit organischen Molekülen oder elektrisch leitfähigen Elementen, wobei eine organische oder metallische Anbindungschicht auf dem Träger gebildet wird, z.B. Silanisierung oder Quervernetzung zu Polymeren auf Glasoberflächen oder Abscheiden einer Goldschicht, mehr notwendig sind, sondern die zu immobilisierende bioaktive Substanz (Prüfsubstanz) direkt auf einer Festphase angebunden wird bzw. ist.
Basis der Erfindung ist also die unerwartete Feststellung, dass bei einer geeigneten Wahl von Trägern und Prüfsubstanzen keine Silanisierung oder vergleichbare Modifizierung zur nachfolgenden Immobilisierung der Prüfsubstanzen für die Herstellung von Anordnungen zum Erfassen von Substanzen aus einer Probe mehr notwendig ist, sowie die Nutzung dieser Feststellung auf unterschiedlichste Weise. Im Prinzip besteht die Erfindung also darin, dass anstelle der bekannten metallischen oder organischen Anbindungsschichten eine anorganische Anbindungsschicht zum gezielten Immobilisieren von zu prüfenden Substanzen bzw. von Fängersubstanzen verwendet wird bzw. ist. Unter Silaniserung im Sinne der Erfindung ist insbesondere die chemische Modifizierung eines Substrats, z.B. von Glas, mit Silanen bzw. Silanderivaten zu verstehen, z.B. wie in der Druckschrit Halliwell & Cass, A factorial analyis of silanization conditions for the immobilization of oligonucleotides on glass surfaces, Anal Chem. 2001 Jun 1 ;73(11 ):2476-83 beschrieben.
Die erfindungsgemäße Anordnung zum spezifischen Erfassen von Substanzen aus einer Probe, insbesondere zum Erfassen von Assoziationsereignissen, umfasst ein Substrat und mindestens eine auf dem Substrat befindliche Anbindungsschicht bzw. Ankopplungsschicht. Das Substrat umfasst nach einer Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe einen Halbleiter bzw. Halbleitermaterial, nachfolgend auch Halbleitersubstrat (1 , Zahlen werden hier und ggf. nachfolgend zur besseren Übersichtlichkeit gegeben) genannt, und die Anbindungsschicht ist als eine auf dem Halbleitersubstrat befindliche anorganische Schicht, inbesondere aus einem nicht in Wasser löslichen Feststoff gebildet, die unter Normalbedingungen, z.B. bei Trockenheit und Raumtemperatur, vorzugsweise im wesentlichen nicht elektrisch leitend ist, nachfolgend auch anorganische Isolatorschicht (2) genannt. Unterisolierenden Materialien sind in Ausnahmefällen ebenfalls leitende Materialien, die eine räumliche Isolierung des Halbleitersubstrats erzeugen bzw. umfassen, zu verstehen.
Als Halbleiter sind gemäß der Erfindung insbesondere alle elementaren Halbleiter, z.B. Silizium oder Germanium, und alle Verbindungshalbleiter, z.B. Galliumarsenid, in ihren verschiedenen Ausgestaltungen bzw. Modifizierungen, z.B. durch Dotierung, zu verstehen. Das Halbleitersubstrat kann dabei in den unterschiedlichsten räumlichen Abmessungen gebildet sein, bspw. als flacher Chip, voluminöser Partikel oder als ein/e auf einer festen Phase aufgebrachte/r Halbleiter-Film bzw. - Dünnschicht.
Als anorganische Isolatorschicht ist insbesondere die flächenhafte Ausdehnung einer direkt über dem Halbleitersubstrat liegenden einheitlichen Masse aus einem anorganischen Isolator, d.h. einem im wesentlichen nicht Kohlenwasserstoffverbindungen enthaltenden Material, das den Fluss von elektrischen Ladungen hemmt und seine elektrische Leitfähigkeit bei sich ändernder Temperatur im wesentlichen nicht ändert, zu verstehen. Unter isolierender Schicht ist aber in Ausnahmefällen ebenfalls eine leitende Schicht, die eine räumliche Isolierung des Halbleitersubstrats erzeugt bzw. umfasst, zu verstehen.
Nach einer anderen Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe ist als Substrat aber auch Glas geeignet und die Anbindungsschicht ist als nicht organisch modifizierte, d.h. kovalent mit organischen Molekülen belegte, und nicht metallisch modifizierte, z.B. mit einer Goldschicht belegte, Glasoberfläche gebildet. Die Gestalt der erfindungsgemäßen Anordnung in ihren unterschiedlichen Ausführungsformen, insbesondere mit den nachfolgend und in den Ansprüchen beschriebenen Merkmalen, ist analog derart, dass anstelle des Halbleitersubstrats (1) mit der mindestens einen darauf gebildeten anorganischen Isolatorschicht (2) ein Glassubstrat (Glassubstrat (1)) mit mindestens einer darauf gebildeten Glasoberflächenschicht (Glasoberflächenschicht (2)) (be-)steht bzw. (ein-)gesetzt ist, wobei die mindestens eine Glasoberflächenschicht (2) nicht organisch oder metallisch modifiziert ist, z.B. nicht-silanisiert ist, insbesondere unbehandelt bzw. unmodifiziert ist. Die zuvor und nachfolgend spezifizierten Merkmale für das Halbleitersubstrat und die anorganische Isolatorschicht gelten entsprechend für das Glassubstrat und die Glasoberflächenschicht, sowie für das Medium (4) und die an die Glasoberflächenschicht gekoppelte Prüfsubstanz.
Nach einer weiteren Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe ist als Substrat aber auch ein im wesentlichen nicht in Wasser löslicher Feststoff bzw. Festkörper, z.B. Plastik, Keramik, Stein, Holz, Cellulose, Metall usw., besonders bevorzugt Kunststoff, geeignet, und die Anbindungsschicht ist als nicht organisch modifizierte, d.h. kovalent mit organischen Molekülen belegte, und nicht metallisierte, z.B. mit einer Goldschicht belegte, anorganische Isolatorschicht, insbesondere Siliziumoxischicht bzw. Siliziumdioxid-Schicht, gebildet, die insbesondere als Dünnschicht bzw. Film mit gängigen Dünnschicht-Verfahren, z.B. mittels Bedampfen oder Sputtern, auf dem Feststoff aufgebracht ist. Die Gestalt der erfindungsgemäßen Anordnung in ihren unterschiedlichen Ausführungsformen, insbesondere mit den nachfolgend und in den Ansprüchen beschriebenen Merkmalen, ist analog derart, dass anstelle des Halbleitersubstrats (1) mit der mindestens einen darauf gebildeten anorganischen Isolatorschicht (2) ein Feststoff (Feststoff (1)) mit mindestens einer darauf gebildeten Siliziumoxidschicht (Siliziumoxidschicht (2)) (be-)steht bzw. (ein-)gesetzt ist, wobei die mindestens eine Slliziumoxidschicht (2) nicht metallisiert und/oder organisch modifiziert oder ist, z.B. nicht-silanisiert ist, insbesondere unbehandelt bzw. unmodifiziert ist. Die zuvor und nachfolgend spezifizierten Merkmale für das Halbleitersubstrat und die anorganische Isolatorschicht gelten entsprechend für den Feststoff und die Glasoberflächenschicht, sowie für das Medium (4) und die an die Glasoberflächenschicht gekoppelte Prüfsubstanz. Als unbehandelte im Sinne der Erfindung sind auch zuvor gereinigte Oberflächen, z.B. durch in der Halbleiterfertigung übliche Reinigungsverfahren, wie z.B. Reinigung in Caro 'scher Säure, Ethanol, Reinstwasser, inbesondere im Ultraschallbad zu verstehen.
Die erfindungsgemäße Anordnung ist dadurch gekennzeichnet, dass auf und/oder in der anorganischen Isolatorschicht (2) mindestens ein (Oberflächen-)Bereich bzw. Abschnitt, nachfolgend auch Bereich (3) genannt, mit mindestens einem Medium, insbesondere mit einer Flüssigkeit, Feststoff und/oder Gas, nachfolgend auch Medium (4) genannt, und mit mindestens einer organischen, insbesondere bioorganischen, zu immobilisierenden Substanz, nachfolgend auch Prüfsubstanz (5) genannt, beaufschlagt bzw. in Kontakt gebracht ist, wobei innerhalb des mindestens einen beaufschlagten Bereich (3) zwischen der anorganischen Isolatorschicht (2) und der mindestens einen Prüfsubstanz (5) eine Anbindung bzw. Kopplung ohne silanisierte Zwischenschicht besteht. Gemäß der Erfindung sind die derart an die Isolatorschicht (2) gekoppelten Prüfsubstanzen geeignet, mit einer oder mehreren Testsubstanzen aus einer Probe wechselzuwirken, mit der die Anordnung ggf. in Kontakt gebracht wird bzw. ist.
Unter silanisierter Zwischenschicht im Sinne der Erfindung ist insbesondere eine aus Silanderivaten, insbesondere nasschemisch, gebildete Schicht auf dem Trägersubstrat zu verstehen, an die eine Prüfsubstanz angebunden bzw. gekoppelt ist, wie z.BI in der Druckschrift Halliwell & Cass, A factorial analyis of silanization conditions for the immobilization of oligonucleotides on glass surfaces, Anal Chem. 2001 Jun 1 ;73(11):2476-83 beschrieben ist.
Unter der Bezeichnung „auf und/oder in der Isolatorschicht" sind insbesondere die Teile der anorganischen Isolatorschicht zu verstehen, die mit einem Medium und/oder einer Prüfsubstanz in Kontakt treten bzw. wechselwirken können, also bspw. die Grenzfläche der Isolatoschicht zur Peripherie und/oder die für das Medium und/oder die Prüfsubstanz zugänglichen Moleküle in der Nähe bzw. unterhalb der Oberfläche der Isolatorschicht. Ist das Halbleitersubstrat bspw. aus einem porösen Material gebildet, so bezieht sich die Bezeichnung „auf und/oder in" auch auf die räumlich innerhalb des Halbleitersubstrats angeordneten Bereiche der Isolatorschicht. Unter „auf und/oder in der Isolarschicht" ist unter Umständen aber auch zu verstehen, dass das Medium und/oder die Prüfsubstanz zumindest teilweise in das Halbleitersubstrat eindringen kann, wenn es analog einem Schwamm von der Isolatorschicht aufgesaugt wird.
Die erfindungsgemäße Anordnung hat die charakteristische Eigenschaft, dass in dem mindestens einen beaufschlagten Bereich (3) eine stabile, direkte Kopplung bzw. Anbindung ohne Zwischenschicht, insbesondere ohne silanisierte (z.B. mit Alkylsilanen) oder polymerisierte bzw. quervernetzte (z.B. Polyvinyl, Cellulose) Zwischenschicht, zwischen der Isolatorschicht (2) und der mindestens einen Prüfsubstanz (5) vorliegt. Die erfindungsgemäße Anordnung ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass die Kopplung dabei an Luft und in Lösung stabil ist, d.h. insbesondere, dass die gekoppelte Substanz auch nach mehrstündigem oder mehrtägigen Waschen der Anordnung bzw. des Bereichs (3) mit Flüssigkeit, z.B. einem physiologischen Puffer, noch nachweisbar an die Isolatorschicht (2) gekoppelt bzw. gebunden ist. Vorteilhaft ist insbesondere auch, dass die Prüfsubstanz über Monate und länger stabil in Luft oder Vakuum an der anorganischen Isolatorschiht gekoppelt bleibt. Direkt gekoppelt bedeutet, dass die Prüfsubstanz bzw. deren Moleküle durch direkten Kontakt mit den Molekülen der anorganischen Isolatorschicht im Bereich (3) angebunden sind, vorzugsweise über Wechselwirkung einer nukleophilen Gruppe der Prüfsubstanz mit den Oberflächenmolekülen der Isolatorschicht angebunden sind, wobei eine kovalente oder insbesondere elektrostatische Verbindung bzw. Wechselwirkung ausgebildet ist bzw. vorherrscht.
Die an die Isolatorschicht (2) gekoppelte Prüfsubstanz (5) wechselwirkt vorzugsweise mit einer Testsubstanz, insbesondere mit wenigstens einer durch Strahlung und/oder Ionisierung nachweisbaren Testsubstanz, wodurch Assoziationsereignisse massenspektrometrisch oder durch Detektion von Strahlung direkt auf und/oder in der Isolatorschicht (2) vorzugsweise in dem mindestens einen Bereich (3) mittels eines externen Detektors nachweisbar erfassbar sind. Als Detektoren sind prinzipiell alle möglichen Einrichtungen zur Detektion von Strahlung, z.B. Scanner, Imager, IR-Ellipsometer, Szintigraphen oder Röntgengeräte, insbesondere für die Detektion von Strahlung in den Wellenlängenbereichen von sichtbarem Licht, UV-Licht oder IR, und alle gebräuchlichen Massenspektrometer, z.B. MALDI oder ESI, geeignet, ist aber nicht darauf beschränkt. Vorteilhaft ist hieran, dass die Anordnung in der Regel schnell und einfach mit bereits vorhandener Laborausstattung und mit bekannten Meßmethoden in Diagnostik und Forschung einsetzbar ist. Zur Vermessung der Anordnung sind insbsondere alle Standard- Verfahren und Methoden für die Vermessung von Biochips oder andere Festphasenassays (Z.B. ELISAs oder vergleichbare Festphasen-basierte Assays mit Farbstoff-markierten Molekülen) geeignet. Beispielsweise auch alle gängigen Verfahren zum Nachweis von Enzymaktivität sind geeignet, insbesondere wenn das Enzym oder das Enzymsubstrat an den beaufschlagten Bereich (3) gebunden ist und die Anordnung mit Enzymsubstrat oder Enzym in Kontakt gebracht wird. Ist das Enzymsubstrat an die Festphase bzw. die Isolatorschicht im beaufschlagten Bereich gebunden, so ist vorteilhafterweise markiertes (z.B. mit einem Farbstoff oder radioaktiven Isotop) Enzymsubstrat gekoppelt. Aber auch eine nachweisbare Veränderung in Lösung ist detektierbar, wenn das Substrat gelöst ist und das Enzym immobilisiert ist.
Der Bereich (3) ist insbesondere mit einer für den Nachweis geeigneten Konzentration bzw. Menge an Prüfsubstanz beaufschlagt, da ein vorteilhaftes Charakteristikum der erfindungsgemäßen Anordnung eine konzentrationsabhängige Kopplung der Prüfsubstanz an den beaufschlagten Bereich (3) ist, d.h. dass bei abnehmender Konzentration der Prüfsubstanz auch abnehmende Nachweissignale beobachtet werden, wodurch bspw. auch Assoziationskonstanten bestimmbar sind. Bei hohen Konzentrationen, z.B. > 2 M und 1 M, ist aufgrund der Absättigung der Oberfläche mit angekoppelter Prüfsubstanz ggf. keine konzentrationsabhängige Kopplung zu beobachten. Dadurch sind auch konzentrationsabhängige Signale bzw. Bindungsdaten erfassbar, weηn die gekoppelte Prüfsubstanz mit der Testsubstanz aus der Lösung interagiert.
Vorzugsweise sind, z.B. bei einer Ausbildung der Anordnung als Biochip, die auf und/oder in einem Bereich (3) erfassbaren Signale, insbesondere durch Strahlung und/oder durch massenspektrometrische Kenngrößen, von auf und/oder in einem mindestens weiteren Bereich (8) und/oder auf und/oder in dem Umgebungsbereich (10) erfassbaren Signalen nachweisbar unterscheidbar, insbesondere in Abhängigkeit von der angekoppelten Prüfsubstanz.
Als Halbleitersubstrat (1) sind alle bekannten Feststoffe bzw. Materialien mit Halbleitereigenschaften geeignet, bspw. Silizium, Titanoxid oder Galliumarsenid insbesondere in ihren unterschiedlichen, vorzugsweise gebräuchlichen, Ausgestaltungen, wie z.B. verschiedene Dotierungen.
Vorzugsweise ist das Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) in den üblichen Abmessungen eines Biochips oder eines Partikels, insbesondere eines gebrächlichen Biopartikels, bevorzugt eines Mikropartikels oder Nanopartikels, gebildet oder ausgestaltet, wodurch es besonders einfach für gängige Vefahren zur Verwendung von Biochips oder Partikeln einsetzbar ist.
In besonders geeigneter Weiterbildung der erfindungsgemäßen Anordnung ist die Anordnung als vorzugsweise planarer Biochip und/oder als ein 1 D-, 2D- oder 3D- Biochip, zum optischen oder szintigraphischen Erfassen von Assoziationsereignissen mittels eines externen Detektors gebildet.
Bevorzugt ist es, wenn das Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) in den üblichen Abmessungen eines Objekträgers oder eines Objektträgereinsatzes gebildet ist, da es damit in seinen Abmessungen dem gängigen Standard für Biochips entspricht. Aber auch die Ausbildung i en entsprechenden Abmessungen mit einer porösen, strukturierten, insbesondere lithografisch strukturierten Oberfläche ist geeignet.
Besonders bevorzugt ist das Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) dabei in den Abmessungen Länge x Breite = (7,5 +/- 1) cm x (2,5 cm +/- 0,5 cm, vorzugsweise exakt 7,5 cm x 2,5 cm, mit den gängigen Abweichungen bei der Biochipproduktion, bspw. bei Sägeprozessen, und/oder in einer Dicke von > 0,3 mm, insbesondere von 1 mm (+/- 0,7 mm), vorzugsweise exakt 1 mm, mit üblichen produktionsbedingten Abweichungen gebildet.
Vorteilhafterweise ist das Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) als ein oxidierter Silzium-Wafer oder als ein Teil davon gebildet. Silizium-Wafer haben in der Regel nahezu perfekt reproduzierbare Materialeigenschaften und auch ihre Oberflächenmodifizierung, insbesondere durch Oxidation, besonders bevorzugt thermische Oxidation und/oder elektrochemische Oxidation und/oder Ausbildung eines natürlichen Oxds, ist besonders einfach und reproduzierbar herstellbar. In vorteilhafter Weiterbildung der erfindungsgemäßen Anordnung ist das Halbleitersubstrat (1) als amorphes, polykristallines Silizium oder vorzugsweise einkristallines Silizium, insbesondere mit einer {111}- oder {100}- oder {110}- Vorzugsorientierung, besonders bevorzugt mit einer {111}-Vorzugsorientierung, gebildet, wodurch das Trägermaterial als nahezu perfektes und reproduzierbares Material gebildet ist. Als besonders geeignet hat sich für die erfindungsgemäße Anordnung insbesondere auch eine {100} Vorzugsorientierung des Halbleitersubstrats (1) erwiesen, wobei durch die technischen Eigenschaften und weiten Verbreitung dieses Materials eine besonders günstige Anordnung vorliegt und die Herstellbarkeit nochmals vereinfacht ist. Aber auch andere kristalline Vorzugsorientierungen des Silziums sind geeignet.
Besonders günstig ist es, wenn das Halbleitersubstrat (1) zumindest teilweise, insbesondere durchgängig und/oder gleichmäßig dotiert ist, vorzugsweise p- und/oder n-dotiert ist, besonders bevorzugt p-dotiert, insbesondere mit einem elektrischen Widerstand von < 100 Ohm / cm2, vorzugsweise < 20 Ohm / cm2, besonders bevorzugt < 1 Ohm / cm2, insbesondere bevorzugt < 0,1 Ohm / cm2, da die Anordnung somit besonders günstige Eigenschaften, bspw. für die gerichtete Ankopplung der Prüfsubstanz, aufweist. Als Fremdatome sind alle für die Dotierung von Halbleitern üblichen Fremdatome geeignet, für p-dotierte Substrate insbesondere Bor oder Phosphor.
Das Halbleitersubstrat (1) ist bevorzugt als Silzium-Wafer oder als ein Teil davon, insbesondere als ein aus einem Silzium-Wafer gesägter bzw. durch andere Zerteilung, z.B. durch Anritzen und Zerbrechen des Wafers oder mittels eines Flüssigkeitsstrahls oder eines Lasers, erhaltener Chip, gebildet. Dies hat u.a. die vorteilhafte Eigenschaft, dass die Anordnung besonders exakt in ihren Materialeigenschaften oder Abmessungen herstellbar ist und damit besonders gut reproduzierbare Nachweissysteme ermöglicht. Erfindungsgemäße Anordnungen, die als Biopartikel verwendbar sind, sind bevorzugt durch die mechanische Zerkleinerung von Wafermaterial, z.B. mittels einer Kugelmühle oder tribomechanischer Verfahren, gebildet. Besonders geeignet ist es, wenn das Halbleitersubstrat (1) homogen gebildet ist, bspw. als ein vollständig, d.h. innerhalb seiner gesamten Abmessungen, einheitliches Silziummaterial, z.B. als ein durchgängig nicht oder nur mit einer Art/Sorte von Fremdatomen dotierter Silizium-Chip, wodurch auch besonders einfach einheitliche Trägereigenschaften der Anordnung, insbesondere über die gesamte Isolatorschicht (2), welche sich auf dem homogenen Halbleitersubstrat befindet, hergestellt sind.
Ist das Halbleitersubstrat (1) als vorzugsweise homogenes Halbleitersubstrat ohne Dotierung gebildet, so ist die Anordnung besonders günstig für eine optische Messung ohne Hintergrund bzw. Rauschen einsetzbar.
Für verschiedene Anwendungen sind insbesondere unpolierte Halbleiter-, insbesondere Silizium-Substrate, vorzugsweise unpolierte Silzium-Wafer oder daraus gebildete Chips, geeignet, da sie bspw. eine besonders einfaches und gleichmäßiges Inkubieren der Anordnungsoberfläche mit einer Probe, auch ohne Verwendung eines Deckgläschens oder andere üblicher Inkubationsvorrichtungen, ermöglichen.
Ist das Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) aus einem zumindest teilweise, vorzugsweise auf wenigstens einer Seite, insbesondere auf der mit der Prüfsubstanz beaufschlagten Seite, als polierter Silzium-Wafer oder aus einem Teil davon gebildet, so ist die Anordnung besonders günstig als Biochip mit spiegelnder Oberfläche und den damit verbundenen Vorteilen einsetzbar.
Die anorganische Isolatorschicht (2), die auf dem Halbleiterstrat angeordnet bzw. gebildet ist, ist vorzugsweise durch chemische Reaktion aus dem Material des Halbleitersubstrats (1) erzeugt bzw. gebildet, wodurch eine besonders geordnete und feste Anbindungsschicht auf dem Halbleitersubstrat (1) vorliegt. Die anorganische Isolatorschicht (2) der erfind unsgemäßen Anordnung ist vorzugsweise als eine Schicht aus Siliziumnitrid, Silikat, oder einem anorganischen Polymer, besonders bevorzugt als Siliziumdioxid, nachfolgend auch Siliziumdioxidschicht (7) genannt, insbesondere mit oder ohne Einschlüssen von Fremdatomen (Dotierung) gebildet. Dies hat den Vorteil, dass die Anbindungsschicht besonders einfach, z.B. durch Reaktion eines Silzium-Halbleitersubstrats (1) mit Sauerstoff oder Stickstoff, herstellbar ist. In besonders günstiger Weiterbildung der erfindungsgemäßen Anordnung ist die anorganische Isolatorschicht (2) als eine Siliziumdioxidschicht (7) ausgestaltet, die insbesondere in dem mindestens einen Bereich (3; 8) als nicht-natürliches, vorzugsweise trockenes und/oder thermisches Oxid oder als trockenes und/oder thermisches Nitrid gebildet ist, wodurch besonders vorteilhafte Materialeigenschaften, z.B. eine schwammartig gebildete stabile Struktur, der Isolatorschicht gewährleistet sind. Aber auch eine Silkatschicht (7), die nasschemisch hergestellt und vorzugsweise nachfolgend getrocknet ist und die bevorzugt eine poröse Struktur aufweist, ist für verschiedene Anwendungen besonders geeignet, oder die Siliziumdioxidschicht ist vorteilhafterweise als natürliches, z.B. an Luft und/oder durch Kontakt mit destilliertem Wasser gebildetes, Siliziumoxid ausgebildet.
Vorzugsweise ist die anorganische Isolatorschicht (2) als eine Siliziumdioxidschicht (7) mit einer Dicke bzw. Schichthöhe von > 10 nm, bevorzugt > 30 nm, insbesondere 100 nm (+/- 70 nm), besonders bevorzugt 100 nm (+/- 10 nm) gebildet, wodurch besonders günstige Eigenschaften, bspw. für die Reflexion und Verstärkung von Strahlung an den Grenzschichten der erfindungsgemäßen Anordnung, vorliegen. Ist das Halbleitersubstrat (1) aus einem Siliziumwafer oder aus Teilen davon, z.B. mit rechteckigen oder quadratischen Dimensionen (Chip), gebildet, so sind durch die Oxiddicke auch die optischen Eigenschaften der Isolatorschicht, bspw. eine blaue oder rote Färbung durch wellenlängenabhängige Brechung und/oder Reflexion von Licht in der entsprechenden Wellenlänge, gezielt einstellbar, die für verschiedenste Anwendungen der Anordnung von Vorteil sind. Für die Herstellung einer bestimmten Oxiddicke der Isolatorschicht (1) auf einem Silizium-Wafer (Halbleitersubstrat (1)) sind insbesondere elektrochemische und vorzugsweise thermische Oxidationsverfahren geeignet, da mittels derer die gewünschte Siliziumdioxiddicke (Oxiddicke) besonders einfach und reproduzierbar herstellbar ist. Besonders günstig ist es, wenn das Halbleitersubstrat als Silizium-Wafer oder -Chip gebildet ist und die Isolatorschicht durch gängige thermische Oxidationsverfahren hergestellt ist.
Gemäß der Erfindung ist der Bezirk bzw. Bereich der Isolatorschicht, innerhalb dessen die wenigstens eine organische Prüfsubstanz (z.B. Fängermoleküle), z.B. in verschiedenen Bereichen, gekoppelt ist, mit mindestens einem Medium (4), insbesondere einer Flüssigkeit, beaufschlagt, die vorzugsweise wenigstens ein Lösungsmittel, nachfolgend auch Lösungsmittel (9) genannt, umfasst oder als wenigstens ein Lösungsmittel (9) gebildet ist. Wie vollkommen überraschend festgestellt wurde, wirkt insbesondere Flüssigkeit, vorzugsweise eine Kombination aus einem wässerigen und einem organischen Lösungsmittel, als Mediator für die spezifische und stabile Ankopplung einer Prüfsubstanz an die erfindungsgemäße Isolatorschicht.
Besonders geeignet ist das Medium (4) für die Beaufschlagung, wenn es wenigstens ein Lösungsmittel (9), das als wässeriges und/oder organisches Lösungsmittel, insbesondere ein hydrophiles und/oder polares Lösungsmittel gebildet ist, umfasst. Als wässriges Lösungsmittel ist inbesondere Wasser, z.B. mit einem neutralen pH- Wert, zu verstehen. Als organisches Lösungsmittel (9) ist vorzugsweise ein Alkohol, Dialkylsäureamid, Alkylhalogenid, Pyrollidon, Furan, DMSO, Acetonitril, Aceton oder eines ihrer Derivate geeignet, insbesondere Ethanol, DMF1 Dichlormethan, NMP, THF oder eines ihrer Derivate.
Das Medium (4), das die erfindungsgemäße Ankopplung der Prüfsubstanzen ermöglicht, umfasst vorzugsweise Wasser mit saurem, neutralem oder basischen pH-Wert und/oder ein organisches Lösungsmittel mit saurem, neutralem oder basischen pH-Wert, einen Elektrolyten und/oder einen Puffer oder ist als solche gebildet. Besonders geeignet ist ein basischer, insbesondere physiologischer, pH- Wert. Bevorzugt ist das Medium (4) als ein Gemisch aus wässerigen und organischen Lösungsmitteln, insbesondere aus einem wässerigem und einem organischen Lösungsmittel, insbesondere als Gemisch aus einer wässerigen Lösung und einem organischen Lösungsmittel gebildet, vorzugsweise mit einem Unterschuss an organischem Lösungsmittel. Auch ein prozentual nur geringer Volumenanteil, insbesondere < 10% , bevorzugt < 1%, besonders bevorzugt < 0,1%, an organischem Lösungsmitteln ist ausreichend, wodurch auch die Ankopplung von gegenüber organischen Lösungsmitteln besonders sensitiver Prüfsubstanzen, z.B. von Proteinen, auf einfache Weise gewährleistet ist. Besonders günstig ist es, wenn das Medium (4) zumindest teilweise elektrisch leitend ist, insbesondere mit einem Leitwert > 0,05 μS/cm, vorzugsweise > 20 μS/cm, insbesondere bevorzugt > 1 mS/cm, besonders bevorzugt > 50 mS/cm gebildet ist, insbesondere, wenn es einen gelösten Feststoff, vorzugsweise die Prüfsubstanz und/oder ein Salz beinhaltet, besonders bevorzugt die Prüfsubstanz und ein gelöstes Salz.
In vorteilhafter Weiterbildung der erfindungsgemäßen Anordnung ist der mindestens eine mit Medium (4) und Prüfsubstanz (5) beaufschlagte Bereich (3) als mindestens zwei nicht-silanisierte Bereiche/Bezirke (3; 8) auf der Isolatorschicht gebildet. Unter den mindestens zwei Bereichen sind insbesondere mehrere vorzugsweise räumlich getrennte Bezirke zu verstehen, die entweder als Replika gebildet sind, z.B. mehrere gleichartg beaufschlagte Bereiche, z.B. zwei oder mehr zumindest teilweise gleichartige Arrays, oder jeweils mit unterschiedlichen Prüfsubstanzen oder mit unterscheidlichen Konzentrationen einer Prüfsusbtanz beaufschlagt sind.
Beonders bevorzugt sind die mindestens zwei nicht-silanisierten Bereiche (3^ 8) dabei wenigstens teilweise von einem auf und/oder in der Isolatorschicht (2) gebildeten Umgebungsbereich (10), d.h. einem vorzugsweise nicht mit Prüfsubstanz beaufschlagten Bezirk der Isolatorschicht, umgeben. Dadurch ist auch eine einfache Abgrenzung der wenigstens zwei Bereiche sowie eine besonders gute Vergleichbarkeit und Unterscheidbarkeit der von ihr ausgehenden Strahlung bzw. ihrer massenspektrometrischen Eigenschaften gewährleistet, insbesondere wenn die Bereiche (3; 8) als Spots, vorzugweise als räumlich voneinander getrennte, besonders bevorzugt vollständig voneinander getrennte, und/oder ortsadressierte Spots gebildet sind. Unter „Spot" istinsbesondere die gängige Definition, wie sie bspw. für die Spot-Synthese oder (Micro-)Arrays verwendet wird, zu verstehen.
In besonders günstiger Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Anordnung sind die mindestens zwei Bereiche (3; 8) mit zumindest teilweise in dem mindestens einen Medium (4) gelöster Prüfsubstanz beaufschlagt, insbesondere mit einem Gemisch beinhaltend wässerige Pufferlösung, organisches Lösungsmittel und gelöste Prüfsubstanz. Dies hat die vorteilhafte Eigenschaft, dass die erfindungsgemäße Anordnung besonders einfach, nämlich in einem einzigen Prozessschritt, z.B. Pipettieren bzw. Spotten, aus einem Halbleitersubstrat und einer auf dem Halbleitersubstrat gebildeten Isolatorschicht herstellbar und verwendbar ist. Unter „Spotten" ist insbesondere das ortsadressierte Aufbringen eines geeigneten Volumens einer Flüssigkeit bzw. Lösung auf eine Festphase zu verstehen, wobei sich die Lösung mit einer Kreis- oder Fleckenartigen Ausdehnung auf der Oberfläche der Festphase verteilt, insbesondere auch halbkugelförmig oder in anderer Form in die Isolatorschicht eindringt.
In besonders geeigneter Weiterbildung der erfindungsgemäßen Anordnung sind die wenigstens zwei nicht-silanisierten Bereiche (3; 8) als Array, insbesondere als Microarray und/oder Low-Density-Array gebildet, wodurch eine besonders gute Auslesbarkeit und Ausnutzung der erfindungsgemäßen Anordnung ermöglicht ist.
Der Umgebungsbereich (10), der wenigstens einen und vorzugsweise mindestens zwei nicht-silanisierten Bereiche (3; 8) vollständig umgibt, ist besonders bevorzugt als Siliziumdioxid gebildet, d.h. als ein im wesentlichen unbehandelter Bezirk der Isolatorschicht (2) oder ist chemisch, insbesondere mit organischen Molekülen, ausgenommen die Prüfsubstanz, modifiziert. Damit ist auch eine schnelle Nutzbarkeit oder eine Verringerung unspezifischer Hintergrundsignale besonders einfach hergestellt, vorzugsweise wenn der Umgebungsbereichs (10) mit Blockierungsreagens und/oder einer nukleophilen Verbindung, bevorzugt mit einem Thiol, z.B. Mercaptoethanol oder Cystein beaufschlagt ist.
Besonders geeignet ist für unterschiedliche Anwendungen auch, wenn die anorganische Isolatorschicht, vorzugsweise über ihre gesamte flächenhafte Ausdehnung, vor der Beaufschlagung mit Medium und Prüfsubstanz gereinigt ist, z.B. durch Baden in oder Benetzung mit einer Säure oder Base, bspw. Caro 'scher Säure (Wasserstoffperoxid/Schwefelsäure-Gemisch), oder einem organischen Lösungsmittel, z.B. Ethanol, wodurch der Umgebungsbereich bspw. als Siliziumdioxid mit gereinigter Oberfläche gebildet ist.
In einer besonders geeigneten Weiterbildung der erfindungsgemäßen Anordnung ist die Prüfsubstanz oder Prüfsubstanzen insbesondere als Moleküle mit wenigstens einem Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff, Phosphor-, Halogen-, Farbstoff oder radioaktiven Isotop gebildet, oder umfasst diese, wodurch eine besonders stabile Anbindung bzw. -kopplung zwischen der Isolatorschicht und der Prüfsubstanz hergestellt ist.
Besonders bevorzugt ist die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5) als mindestens zwei unterschiedliche Prüfsubstanzen (5; 11) gebildet, d.h. dass mindestens zwei unterschiedliche Prüfsubstanzen oder mindestens zwei unterschiedliche Konzentrationen von einer Prüfsubstanz vorzugsweise räumlich voneinander getrennt an die Isolatorschicht gekoppelt sind und/oder die Prüfsubstanz bzw. die mindestens zwei unterschiedlichen Prüfsubstanzen jeweils als Moleküle mit wenigstens einem, vorzugsweise rand- bzw. endständig im Molekül angeordneten, Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff, Phosphor-, Halogen-, Farbstoff oder radioaktiven Isotop gebildet sind oder diese umfassen oder aus diesen hervorgegangen sind. Dadurch ist die Anordnung besonders vorteilhaft zur ortsabhängigen Assoziation mit und zum Nachweis von mehreren unterschiedlichen Testsubstanzen aus einer Probe geeignet oder es können von der Testsubstanz, z.B. einem Enzym, bewirkte Veränderungen, z.B. durch enzymatische Spaltung, der angekoppelten Probesubstanz sichtbar gemacht werden, und es ist eine besonders stabile und gerichtete Ankopplung der Prüfsubstanz an die anorganische Anbindungsschicht hergestellt.
In besonders geeigneter Fortbildung der erfindungsgemäßen Anordnung umfasst die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5), vorzugsweise endständig, wenigstens eine nukleophile chemische Gruppe bzw. Funktion, insbesondere eine Thiol-, Amino- , Hydroxyl-, Carboxyl- (Carboxy-), Cyano-, Nitril-, Si-, Se-, He-, Sulfat, Sulfid, Alken- oder Alkin-, oder Phosphan-Gruppe, bzw. ein/e durch die Wechselwirkung mit der Isolatorschicht daraus hervorgegangene/r Funktion bzw. Rest, wodurch die Stabiltät der Kopplung besonders gut gewährleistet ist, insbesondere durch eine Thiolfunktion, z.B. von einem Cysteinrest bzw. der daraus durch Wechselwirkung mit der Isolatorschicht hervorgegenagene Rest. Unter endständig im Sinne der Erfindung ist bei Proteinen oder Peptiden insbesondere der N-Terminus oder der C-Terminus, vorzugsweise die N-terminale oder C-terminale Aminosäureposition, zu verstehen, bei Oligonukleotiden das 5'- oder das 3'-Ende der Oligonukleotidsquenz. Vorzugsweise ist die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5) als Linkermolekül, Aminosäure, Kohlenhydrat, Lipid, Farbstoff, Pharmakon, Biotin, Peptid, Polypeptid, Oligonukleotid, Protein, Zellkompartiment, Zelle oder davon abgeleitete Struktur gebildet oder enthält diese, wodurch die Anordnung im Prinzip universell für die unterschiedlichsten Anwendungen, insbesondere zum Erfassen aller möglichen bioorganischen Komponenten oder Strukturen (Testsubstanzen) geeignet ist.
Besonders bevorzugt ist die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5) als DNA, RNA, cDNA, mRNA, cRNA, PNA, Rezeptor, Ligand, Protein A, Protein G, Streptavidin, Antikörper oder davon abgeleitete Struktur gebildet oder enthält diese, wodurch die Spezifität der Assoziation bzw. Wechselwirkung mit der bioorganischen Testsubstanz besonders gut sichergestellt ist. Insbesondere bevorzugt ist die Prüfsubstanz (5) als synthetisches, natürlich vorkommendes oder rekombinant exprimiertes oder durch enzymatische, saure oder basische Spaltung von Polypeptiden erhaltenens Peptid, vorzugsweise als synthetisch hergestelltes Peptid, gebildet.
In besonders vorteilhafter Weiterbildung der erfindungsgemäßen Anordnung ist die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5) als Peptid aus vorzugsweise L- und/oder D-Aminosäureresten, insbesondere der genetisch kodierten Aminosäuren und/oder deren vorzugsweise natürlich vorkommenden Modifikationen, z.B. Phosphoserin, -threonin, oder -tyrosin, insbesondere auch bspw. radioaktiv markiert, gebildet oder enthält diese. Peptide als Prüfsubstanz haben ganz allgemein den Vorteil, dass sie in der Regel einfach synthetisch und in großer Reinheit herstellbar sind und, mit ganzen Proteinen vergleichbare, spezifische Assoziationseigenschaften aufweisen können, z.B. wenn das Peptid ein Antikörperepitop, vorzugseise N- oder C-terminal mit einem Cysteinrest gebildet, ist. Aber auch Peptide mit wenigstens einem nicht natürlich vorkommenden Aminosäurerest, z.B. aus Anthranil- oder aus Aminobenzoesäure gebildet, sind für verschiedenste Anforderungen besonders geeignet.
In einer anderen vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Anordnung ist die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5) als Linkermoleküle mit freien/ungebundenen chemisch reaktiven Gruppen gebildet. Als Linkermoleküle sind insbesondere alle möglichen Moleküle, ausgenommen mit der Isolatorschicht chemisch reagierende Silane und Silanderivate, zu verstehen, die zwei verschiedene, vorzugsweise end- und/oder seitenständig im Molekül angeordnete, unterschiedlich chemisch reaktive Gruppen bzw. Funktionen aufweisen, wobei die Moleküle über eine Funktion an die Isolatorschicht (2) gekoppelt sind und über die andere Funktion ggf. mit bioorganischen Substanzen funktionalisiert sind. Ist die Prüfsubstanz beispielsweise als Cystein gebildet, so ist dieses vorzugsweise über das Thiol bzw. den aus dem Thiol durch Wechselwirkung mit der Isolatorschicht erzeugten Rest, seiner Seitenkette an die Isolatorschicht gekoppelt und kann über eine nachfolgende chemische Reaktion mittels seiner Amino- oder Carboxylgruppe eine weitere Substanz bzw. Fängermoleküle, z.B. einen Aminosäurerest oder ein Peptid ankoppeln. Ist die Prüfsubstanz z.B. als N-terminal über eine Amidbindung mit Biotin verknüpftes Cystein gebildet, so kann in einem nachfolgenden Schritt Streptavidin an die Oberfläche gekoppelt werden, bzw. ist gekoppelt worden, wodurch bspw. Sandwichanordnungen (z.B. Isolatorschicht-Biotin-Streptavidin- biotinylierte Komponente) möglich oder gebildet sind.
Geeigneterweise ist das Linkermolekül bzw. die Prüfsubstanz wenigstens ein Crosslinker, der über die eine Funktion chemisch, inbesondere kovalent, mit einer bioorganischen Substanz, z.B. einem Oligonukleotid oder einem Protein, verbunden ist und mittels der anderen Funktion, insbesondere einer nukleophilen Gruppe, vorzugsweise einem Thiol, an die Isolatorschicht (2) gekoppelt ist. Silane oder quervernetzte Polymere (z.B. PVDF, Cellulose) sind als Linkermoleküle im Sinne der Erfindung im wesentlichen nicht geeignet, da sie nur mit vergleichsweise hohem Aufwand herstellbar bzw. verwendbar sind.
Besonders bevorzugt ist die mindestens eine Prüfsubstanz (5; 8) mit der Mehrzahl ihrer an die Oberfläche gekoppelten Moleküle räumlich gerichtet auf der Isolatoschicht angeordnet, d.h. dass die Moleküle einheitlich auf der Oberfläche ausgerichtet sind, bzw. mit Vorzugsorientierung, insbesondere abhängig von der Orientierung des Halbleitersubstrats. Ist die Prüfsubstanz beispielsweise als endständig mit einer nukleophilen Gruppe, insbesondere einem Thiol, markiertes Peptid, Protein oder Olgonukleotid ausgebildet, so ist die Prüfsusbtanz insbesondere über die Thiolgruppe an die Anbindungsschicht (2) gekoppelt und liegt ansonsten frei zugänglich für die Wechselwirkung mit einer Testsubstanz vor, vorzugsweise senkrecht oder in anderen geeigneten Winkeln zur Isolatoroberfläche. Sind die Prüfsubstanzen als mehrere Peptide oder mehrere andere synthetisch hergestellte Moleküle, insbesondere Oligonukleotide, gebildet, so sind diese bevorzugt einheitlich mit einer vorzugsweise end- oder seitenständigen nukleophilen Gruppe, z.B. einem Thiol ausgestaltet, wodurch insbesondere auch bei mehreren zumindest teilweise ähnlichen Prüfsubstanzen, z.B. Wildtypsequenz und Mutante, eine besonders einheitliche und gerichtete Anbindung sowie eine gute Vergleichbarkeit der Ergebnissen gewährleistet ist.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein einfaches und effizientes Verfahren zur Herstellung einer Anordnung für das spezifische Erfassen von Substanzen aus einer Probe, insbesondere zum Herstellen einer Anordung, welche ein Trägersubstrat und eine auf dem Trägersubstrat gebildete Anbindungsschicht und eine an die Anbindungsschicht gekoppelte Prüfsubstanz umfasst, vorzugsweise zum Herstellen der erfindungsgemäßen Anordnung. In den Arbeiten, die zu der Erfindung geführt haben, wurde vollkommen überraschend festgestellt, dass die Beaufschlagung einer auf einem Halbleitersubstrat gebildeten anorganischen Isolatorschicht mit einem Medium und einer Prüfsubstanz zur stabilen und gerichteten Anbindung der Prüfsubstanz an die Isolatorschicht führt. Dies insbesondere bei oxidierten, nicht silanisierten Siliziumoberflächen.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird wenigstens ein, insbesondere nicht- silanisierter und nicht mit organischen Molekülen kovalent belegter und nicht mit einem Metall beschichteter Bereich (3) einer auf einem Halbleitersubstrat (1) gebildeten anorganischen Isolatorschicht (2) mit mindestens einem Medium (4), insbesondere mit einem Gas, Feststoff und/oder vorzugsweise Flüssigkeit, und mit mindestens einer organischen Prüfsubstanz (5), insbesondere mit einer eine nukleophile Gruppe, z.B. ein Thiol, umfassenden bioorganischen Substanz, beaufschlagt bzw. in Kontakt gebracht, wodurch infolge von Wechselwirkungen zwischen der organischen Prüfsubstanz (5) und der anorganischen Isolatorschicht (2) eine, insbesondere an Luft und in Flüssigkeiten stabile, Kopplung bzw. Anbindung zwischen der organischen Prüfsubstanz (5) und der anorganischen Isolatorschicht (2) erfolgt bzw. ausgebildet wird und die organische Prüfsubstanz (5) innerhalb des beaufschlagten Bereichs (3), insbesondere ohne silanisierte und/oder ohne organische und/oder ohne metallische Zwischenschicht, an die und/oder in der Isolatorschicht (2) angebunden bzw. gekoppelt bzw. immobilisiert bzw. abgeschieden wird und für eine nachweisbare spezifische Assoziation mit einer Testsubstanz verwendbar ist.
Die Form bzw. Ausdehnung der Isolatorschicht auf der Oberfläche des Halbleitersubstrats kann dabei, je nach Bedarf, unterschiedlich sein, und ist bspw. als geschlossene Schicht, welche insbesondere das gesamte Halbleitersubstrat oder nur einen Teil davon umschließt, insbesondere nur eine Seite davon, oder ist als einzelne Bereiche, z.B. mittels Lithographie, gebildet.
Unter einer an Luft stabilen Kopplung oder Anbindung ist insbesondere zu verstehen, dass die angekoppelte Prüfsubstanz auch noch nach Minuten, Stunden und/oder mehr als einer Woche, insbesondere nach mehr als einem Monat, besonders nach mehr als einem Jahr nach Herstellung der Anordnung nachweisbar, z.B. durch Inkubation mit einer Probe, an die Isolatorschicht gekoppelt ist, wenn die erfindungsgemäß hergestellte Anordnung in dieser Zeit an Raumluft unter Normalbedingungen, z.B. bei 23° C und Normaldruck, oder Vakuum, oder Schutzgasatmosphäre, gelagert wird. Unter einer in Lösung stabilen Kopplung oder Anbindung ist insbesondere zu verstehen, dass die angekoppelte Prüfsubstanz auch noch nach mehr als einer Stunde, insbesondere nach mehr als 12 Stunden, besonders nach mehr als 24 Stunden, 36 Stunden, 48 Stunden oder 72 Stunden nachweisbar, z.B. durch nachfolgende Inkubation mit einer Probe, an die Isolatorschicht gekoppelt ist, wenn die erfindungsgemäß hergestellte Anordnung in dieser Zeit in einer physiologischen Pufferlösung, z.B. Tris- oder Phosphatpuffer, unter Normalbedingungen, z.B. bei 23° C und Normaldruck, aufbewahrt wird. Die Anbindung kann aber auch unter anderen als Normalbedingungen stabil sein.
Für die Beaufschlagung mit Medium (4) und Prüfsubstanz (5) sind prinzipiell alle Standard-Verfahren oder andere bekannten Methoden geeignet, mittels derer eine starre Oberfläche mit einem Medium und/oder einer Prüfsubstanz in Kontakt gebracht werden kann, bswp. mittels Inkubieren, Pipettieren bzw. Spotten oder Bedrucken der Oberfläche. Soll bspw. eine Anordnung hergestellt werden, die über die gesamte Oberfläche ihrer mindestens einen Isolatorschicht einheitliche Eigenschaften aufweist, d.h. gleichmäßig mit der wenigstens einen Prüfsubstanz belegt ist, so wird das Halbleitersubstrat mit der darauf gebildeten Isolatorschicht, bspw. in einem mit Flüssigkeit befüllbaren Gefäß, mit dem Medium und/oder der Prüfsubstanz derart inkubiert, dass es vorzugsweise vollständig mit dem Medium und/oder der Prüfsubstanz benetzt wird, z.B. durch Baden des Substrats mit der darauf gebildeten Isolatorschicht in einer Flüssigkeit, in der die Prüfsubstanz zumindest teilweise gelöst ist. Soll gezielt ein Bereich oder mehrere Bezirke auf und/oder in der anorganischen Isolatorschicht mit dem Medium und/oder der Prüfsubstanz beaufschlagt bzw. funktionalisiert werden, bspw. für die Herstellung eines Low-Density-Chips, so wird das Medium und/oder die Prüfsubstanz bevorzugt mittels einer Düse oder Pipettiervorrichtung, insbesondere einer Pipette oder eines Pipettierautomaten, auf die Isolatoschicht aufgebracht, insbesondere in räumlich voneinander getrennten Orten. Für die Herstellung von Microarrays werden entsprechend gebräuliche Arrayer, z.B. Kontakt- oder Piezo-Printer, verwendet. Für eine besonders gleichmäßige und reproduzierbare Beschichtung bzw. Kopplung der Isolatorschicht mit unterschiedlichen Prüfsubstanzen oder unterschiedlichen Konzentrationen einer Prüfsubstanz, ist auch geeignet, dass zunächst die Isolatorschicht großflächig mit dem wenigstens einem Medium, z.B. durch Baden bzw. Benetzen der Oberfläche, bspw. mit einem organischen Lösungsmittel, bevorzgt mit einem organischen Lösungsmittel und einem wässerigen Lösungsmittel, besonders bevorzugt mit einem organischen Lösungsmittel und einem wässerigen Lösungsmittel und einem gelösten Feststoff, der vorzugsweise als gängige Komponente zum Puffern wässeriger Lösungen, z.B. Tris bzw. Phosphat, oder als Salz gebildet ist, beaufschlagt wird und nachfolgend auf bzw. in dem großflächig mit Medium baufschlagten Bereich vorzugsweise ortsadressiert unterschiedliche Prüfsubstanzen und/oder unterschiedliche Konzentrationen bzw. Mengen einer Prüfsubstanz aufgebracht werden, so dass mehrere unterschiedlich funktionalisierte Bezirke/Bereiche innerhalb des großflächigen Bereichs gebildet werden.
Vorteilhafterweise kann die Beaufschlagung der Isolatorschicht mit Medium und/oder Prüfsubstanz bei allen möglichen Umgebungsbedingungen durchgeführt werden, und wird vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt, wodurch eine besonders einfache Herstellung der erfindungsgemäßen Anordnung gewährleistet ist. Aber auch die Verwendung von Medium und/oder Prüfsubstanz mit einer Temperatur, die über und insbesondere unterhalb der üblichen Raumtemperatur, z.B. 23° C, liegt, ist geeignet, z.B. eine 4° C warme Lösung der Prüfsubstanz, wodurch auch empfindliche Prüfsubstanzen besonders einfach an und/oder in die Isolatorschicht koppelbar sind.
Das wenigstens eine Medium wird bevorzugt derart gewählt, dass es aus Molekülen und/oder darin gelösten Feststoffen gebildet ist, die unter den bei dem Verfahren gewählten Bedingen nicht chemisch mit der Isolatorschicht reagieren können, d.h. insbesondere keine kovalente Bindung mit der anorganischen Isolatorschicht eingehen, d.h. dass als Medium für die Beaufschlagung einer Siliziumdioxidschicht z.B. ein Gemisch mit einem organischen Lösungsmittel, Wasser und einem gelöstem Salz bzw. einer gelösten Pufferkomponente gewählt wird.
Bevorzugt wird das Verfahren, je nach Art der herzustellenden Anordnung, mit drei, zwei oder einem Verfahrensschritt/en durchgeführt, z.B. 1. Die Isolatorschicht wird aufeinanderfolgend mit einem organischen Lösungsmittel, z.B. DMF, einer wässerigen Flüssigkeit, z.B. einer Salzlösung/Puffer, und der Prüfsubstanz, z.B. einem gelösten Peptid, beaufschlagt, vorzugsweise in der genannten Reihenfolge. Das wenigstens eine Medium (4) umfasst dabei drei Medien bzw. Bestandteile, z.B. DMF und Puffer und Lösungsmittel des Peptids oder umfasst zwei Medien, wenn bspw. der Puffer und das Lösungsmittel des Peptids identisch sind, und das Peptid z.B. in den Konzentrationsbereichen 1 μM bis 1 mM gelöst ist.
2. Die Isolatorschicht wird mit einem, vorzugsweise bei Raumtemperatur flüchtigen, organischen Lösungsmittel, z.B. DCM, und nachfolgend mit einer wässerigen, d.h. Wasser beinhaltenden, Flüssigkeit, in der die Prüfsubstanz zumindest teilweise gelöst ist, z.B. mit einer gepufferten Lösung eines Proteins, beaufschlagt.
3. Die Isolatorschicht wird mit einer Lösung, in der die Prüfsubstanz zumindest teilweise gelöst ist, beaufschlagt. Die Lösung umfasst dabei insbesondere ein wässeriges Lösungsmittel, bevorzugt ein organisches Lösungmittel und ein wässeriges Lösungsmittel, besonders bevorzugt ein organisches Lösungsmittel und ein wässeriges Lösungsmittel und einen darin gelösten Feststoff, der insbesondere als gängige Pufferkomponente, z.B. Tris, oder als Salz, z.B. Natriumchlorid, gebildet ist. Solch ein Einschritt-Verfahren, d.h. die gleichzeitige Beaufschlagung der Isolatorschicht mit Medium (4) und Prüfsubstanz (5) ermöglicht eine besonders einfache, schnelle und zuverlässige Herstellung der Anordnung zum Erfassen von Testsubstanzen.
Vorzugsweise wird innerhalb des mindestens einen beaufschlagten Bereichs (3) eine an Luft und in Lösungen stabile, direkte Kopplung, insbesondere ohne silanisierte oder polymerisierte bzw. quervernetzte (z.B. Polyvinyl, Cellulose) Zwischenschicht ausgebildet, insbesondere wenn für das erfindungsgemäße Verfahren ein Halbleitersubstrat (1), eine anorganische Isolatorschicht (2), ein Medium (4) und eine vorzugsweise bioorganische Prüfsubstanz (5) mit den nachfolgend charakterisierten Merkmalen gewählt werden. Bei der Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird, durch Anlagerung bzw. Anreicherung von Molekülen der Prüfsubstanz an die starre Anbindungsschicht, insbesondere eine Kopplung bzw. Immobilisierung der Prüfsubstanz an die Isolatorschicht erhalten bzw. gebildet, die an Luft und in Lösung stabil ist, d.h. dass die gekoppelte Substanz auch nach ein- oder mehrstündigem oder ein- oder mehrtägigem Waschen der mittels des Verfahrens gebildeten Anordnung bzw. des Bereichs (3) durch Inkubation mit Flüssigkeit, z.B. einem physiologischen Puffer, noch nachweisbar an die Isolatorschicht (2) gekoppelt bzw. gebunden ist. Vorteilhaft ist insbesondere auch, dass die Prüfsubstanz über Monate und länger stabil in Luft oder Vakuum an der anorganischen Isolatorschicht gekoppelt bleibt, so dass besonders gute Lagerungseigenschaften gewährleistet werden. Direkt gekoppelt bedeutet, dass die Prüfsubstanz bzw. deren Moleküle durch direkten Kontakt mit den Molekülen der anorganischen Isolatorschicht im Bereich (3) angebunden werden, vorzugsweise über Wechselwirkung einer nukleophilen Gruppe der Prüfsubstanz, insbesondere einem Thiol, mit den Oberflächenmolekülen der Isolatorschicht angebunden werden, wobei eine kovalente oder insbesondere elektrostatische Verbindung oder Wechselwirkung, insbesondere zwischen der nukleophilen Gruppe der Prüfsubstanz und den Oberflächenmolekülen der Isolatorschicht, ausgebildet wird, so dass die Prüfsubstanz stabil und nachweisbar an und/oder in der Isolatorschicht gekoppelt ist.
Nach einer anderen Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe wird entsprechend als Substrat Glas verwendet bzw. gewählt und als Anbindungsschicht wird eine nicht organisch modifizierte, und nicht metallisch modifizierte, z.B. mit einer Goldschicht belegte, auf dem Glas gebildete Glasoberfläche bzw. Grenzschicht gewählt. Unter organisch modifiziert ist dabei insbesondere die kovalente Belegung der Glasoberfläche mit organischen (Linker-) Molekülen, bspw. Silanen oder polymerisierten bzw. quervernetzten Polymeren (Cellulose, PVDF) zu verstehen.
Die Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens in seinen unterschiedlichen Ausführungsformen, insbesondere mit den nachfolgend und in den Ansprüchen beschriebenen Merkmalen, erfolgt analog derart, dass anstelle des Halbleitersubstrats (1) mit der mindestens einen darauf gebildeten anorganischen Isolatorschicht (2) ein Glassubstrat (Glassubstrat (1)) mit mindestens einer darauf gebildeten Glasoberflächenschicht (Glasoberflächenschicht (2)) gesetzt bzw. gewählt wird, wobei die mindestens eine Glasoberflächenschicht (2) nicht organisch oder metallisch modifiziert ist, z.B. nicht-silanisiert ist, insbesondere unbehandelt bzw. unmodifiziert ist. Die zuvor und nachfolgend spezifizierten Merkmale des für das Verfahren besonders bevorzugt gewählten bzw. geeigneten Halbleitersubstrats und der anorganischen Isolatorschicht gelten entsprechend für das Glassubstrat und die Glasoberflächenschicht, sowie für das Medium (4) und die an die Glasoberflächenschicht anzukoppelnde Prüfsubstanz.
Nach einer anderen Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe wird entsprechend als Substrat ein im wesentlichen nicht in Wasser löslicher Feststoff bzw. Festkörper, z.B. ein Polymer, Glas, Keramik, Stein, Holz, Metall usw., besonders bevorzugt Kunststoff, verwendet bzw. gewählt und als Anbindungsschicht wird eine nicht organisch modifizierte, und nicht metallisch modifizierte, z.B. mit einer Goldschicht belegte, auf dem Feststoff gebildete Siliziumoxid-Schicht, vorzugsweise Siliziumdioxid-Schicht, die insbesondere als Dünnschicht bzw. Film mit gängigen Dünnschicht-Verfahren, z.B. mittels Bedampfen oder Sputtern, auf dem Feststoff aufgebracht ist, gewählt. Unter organisch modifiziert ist dabei insbesondere die kovalente Belegung der Siliziumoxidoberfläche mit organischen (Linker-) Molekülen, bspw. Silanen, oder polymerisierten bzw. quervernetzten Polymeren (z.B. Cellulose, PVDF) zu verstehen. Die Dicke der aufgebrachten Schicht ist besonders bevorzugt derart gebildet, dass sie größer oder gleich der Wellenlänge ist, die für den Nachweis detektiert wird. Die zuvor und nachfolgend spezifizierten Merkmale des für das Verfahren besonders bevorzugt gewählten bzw. geeigneten Halbleitersubstrats und der anorganischen Isolatorschicht gelten entsprechend für den Feststoff und die Siliziumoxidschicht, sowie für das Medium (4) und die an die Siliziumoxidschicht anzukoppelnde Prüfsubstanz.
Die Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens in seinen unterschiedlichen Ausführungsformen, insbesondere mit den nachfolgend und in den Ansprüchen beschriebenen Merkmalen, erfolgt analog derart, dass anstelle des Halbleitersubstrats (1) mit der mindestens einen darauf gebildeten anorganischen Isolatorschicht (2) ein Feststoffsubstrat (Feststoffsubstrat (1)) mit mindestens einer darauf gebildeten Siliziumoxidschicht (Siliziumoxidschicht (2)) gesetzt bzw. gewählt wird, wobei die mindestens eine Siliziumoxidschicht (2) nicht metallisiert oder nicht organisch modifiziert ist, z.B. nicht-silanisiert oder, insbesondere unbehandelt bzw. unmodifiziert ist. Die zuvor und nachfolgend spezifizierten Merkmale des für das Verfahren besonders bevorzugt gewählten bzw. geeigneten Halbleitersubstrats und der anorganischen Isolatorschicht gelten entsprechend für das Feststoffsubstrat und die Siliziumoxidschicht, sowie für das Medium (4) und die an die Glasoberflächenschicht anzukoppelnde Prüfsubstanz (5).
Durch die Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahren wird die Prüfsubstanz (5) insbesondere derart an die Isolatorschicht (2) gekoppelt (5), dass sie mit wenigstens einer vorzugsweise durch Strahlung und/oder Ionisierung nachweisbaren Testsubstanz, mit der die durch das Verfahren gebildete Anordnung ggf. nachfolgend beaufschlagt wird, wechselwirkt, wodurch Assoziationsereignisse massenspektrometrisch, durch Thermodesorption oder durch Detektion von Strahlung direkt auf und/oder in der Isolatorschicht (2) vorzugsweise in dem mindestens einen Bereich (3) mittels eines vorzugsweise externen Detektors nachweisbar erfassbar werden. Dabei sind die Assoziationsereignisse indirekt nachweisbar, z.B. wenn die Testsubstanz ein die Prüfsubstanz umsetzendes Enzym ist, oder die Assoziationsereignisse sind direkt nachweisbar, bspw. durch Vorhandensein der Testsubstanz nach der Assoziation. Als Detektoren für den Nachweis der durch das erfindungsgemäße Verfahren gebildeten Anordnung sind prinzipiell alle möglichen Einrichtungen zur Detektion von Strahlung, z.B. Scanner, Imager, IR-Ellipsometer, Szintigraphen oder Röntgengeräte, und alle gebräuchlichen Massenspektrometer, z.B. MALDI oder ESI, geeignet. Vorteilhaft ist hieran, dass die durch das Verfahren gebildete Anordnung in der Regel schnell und einfach mit bereits vorhandener Laborausstattung und mit bekannten Meßmethoden in Diagnostik und Forschung untersuchbar wird. Zum Nachweis bzw. Vermessung der Anordnung, insbesondere nach Inkubation mit einer Testsubstanz, sind alle Standard-Verfahren für die Vermessung von Biochips oder andere Festphasen- basierte Assays zum Vermessen von Partikeln (z.B. ELISAs oder entsprechende bzw. vergleichbare Festphasen-basierte Assays mit Farbstoff-markierten Nachweismolekülen, insbesondere in Miktrotiterplatten) geeignet. Beispielsweise auch alle gängige Verfahren zum Nachweis von Enzymaktivität sind geeignet, wenn Enzym oder Enzymsubstrat an den beaufschlagten Bereich (3) gebunden wird, wobei die Anordnung mit Enzymsubstrat oder Enzym in Kontakt gebracht wird.
Der Bereich (3) wird insbesondere mit einer für den Nachweis geeigneten Konzentration bzw. Menge an Prüfsubstanz beaufschlagt, da ein vorteilhaftes Charakteristikum des erfindungsgemäßen Verfahrens die Ausbildung einer konzentrationsabhängigen Kopplung der Prüfsubstanz an und/oder in der Isolatorschicht (2) innerhalb des beaufschlagten Bereichs (3) ist, d.h. dass bei abnehmender Konzentration der gewählten Prüfsubstanz auch nachfolgend abnehmende Nachweissignale beobachtbar sind. Dadurch werden auch konzentrationsabhängige Signale bzw. Bindungsdaten erfassbar, wenn die gekoppelte Prüfsubstanz ggf. nachfolgend mit einer Testsubstanz aus einer Probe interagiert. Vorteilhafterweise sind auch geringe Konzentrationen bzw. Mengen von Prüfsubstanz geeignet, um mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Anordnung zum Erfassen von Testsubstanzen herzustellen. Geeigneterweise wird als Prüfsubstanz eine gelöste Prüfsubstanz gewählt, die in einer Konzentration < 1 M, bevorzugt < 100 mM, besonders bevorzugt < 10 mM in Lösung vorliegt. In besonders geeigneter Weise wird für die Beaufschlagung eine Konzentration der Prüfsubstanz von < 1 mM, vorzugsweise < 100 μM, besonders bevorzugt < 10 μM gewählt bzw. verwendet. Aber auch eine Lösung der Prüfsubstanz in einer Konzentration von < 1 μM, bevorzugt < 100 nM, besonders bevorzugt < 10 nM, insbesondere < 1 nM ist für die Beaufschlagung in vorteilhafter Weise geeignet, insbesondere wenn die Prüfsusbstanz eine hohe Affinität zu der Testsubstanz aufweist, wobei z.B. die Assoziation zwische Prüf- und Testsubstanz über eine Assoziationskonstante Ka >106 / M unter physiologischn Bedingungen ausgestaltet ist. Ist die Prüfsubstanz bspw. sehr groß oder besonders aktiv, z.B. als Zelle gebildet, so ist auch eine Konzentration der Prüfsubstanz geeignet, die < 100 pM, bevorzugt < 10 pM, besonders bevorzugt < 1 pM ist.
Wird die Prüfsubstanz in Form einer Lösung oder Suspension auf die Anbindungsschicht (2) aufgebracht, so eignen sich insbesondere übliche bzw. gängige Volumina an Lösung, wie sie bei Standardverfahren oder anderen
Methoden zur Herstellung von Biochips oder Biopartikeln verwendet bzw. gewählt werden. Soll mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens bspw. ein Microarray hergestellt werden, so ist ein Volumen an Prüfsubstanz-Lösung bzw. -Suspension im Nanoliterbereich, z.B. 1 nl oder weniger geeignet, für die Herstellung von Low-
Densitiy-Chips kann ein Volumen im Mikroliterbereich (z.B. 1 μl oder weniger) geeignet sein.
Praktischerweise wird bei der Vewendung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Prüfsubstanz oder eine Konzentration in mehreren, insbesondere wenigstens zwei, bevorzugt drei, besonders bevorzugt mehr als drei, Replikas bzw. Replikaten auf die
Isolatorschicht vorzugsweise ortsadressiert aufgebracht. Dazu werden bspw. mehrere vorzugsweise gleiche Volumina einer Lösung mit der zumindest teilweise gelösten Prüfsubstanz an unterschiedlichen Stellen/Positionen bzw. versetzt auf die Isolatorschicht aufgebracht, so dass mehrere gleichartig funktionalisierte Bereiche (3) auf bzw. in der starren Anbindungsschicht (2) gebildet werden, die eine besonders gute Auslesbarkeit der Anordnung, z.B. durch Berechnung des Mittelwerts oder der
Standardabweichung von Signalen, sowie eine Parallelisierung von
Nachweissystemen ermöglichen, z.B. das parallele Vermessen unterschiedlicher Proben, die ortsadressiert bzw. versetzt, z.B. als ein Muster oder regelmäßig, auf den erfindungsgemäßen Biochip aufgebracht werden.
In besonders vorteilhafter Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch vorzugsweise ortsadressierte Beaufschlagung der Isolatoschicht (2) mit wenigstens zwei, bevorzugt wenigstens drei, besonders bevorzugt mehr als drei unterschiedlichen Konzentrationen einer Prüfsubststanz eine Verdünnungsreihe der gekoppelten Prüfsubstanz auf der Festphase hergestellt. Soll beispielsweise eine Verdünnungsanordnung eines Peptids, eines Proteins oder eine Oligonukleotids auf der Festphase hergestellt werden, so wird eine milli- oder mikromolare Lösung, z.B. mit einer Konzentration von 1 mM bis 1000 mM, bevorzugt < 100 mM, besonders bevorzugt < 10 mM, oder mit einer Konzentration von 1 nM bis 1000 nM, der Prüfsubstanz als Ausgangslösung gewählt, und verdünnt, z.B. mittels üblicher Verdünnungsreihen, bspw. in 1 :1 , 1 :5 oder 1 :10 Verdünnungsschritten, und sowohl die Ausgangslösung als auch die verdünnte/n Lösunge/n vorzugsweise ortsadressiert, insbesondere an unterschiedlichen Orten oder mehrfach an einem Ort, auf die Anbindungsschicht aufgebracht.
Für das erfindungsgemäße Verfahren, z.B. zur Herstellung eines Biochips, werden die Materialparameter (Halbleitersubstrat (1), Isolatorschicht (2), Medium (4) und Prüfsubstanzen (5)) vorzugweise derart gewählt, dass, insbesondere nach Inkubation der so hergestellten Anordnung mit einer Probe, die auf und/oder in dem einen Bereich (3) insbesondere durch Strahlung und/oder durch massenspektrometrische Kenngrößen nachweisbaren Signale von Signalen unterscheidbar sind, welche auf und/oder in einem zweiten, vorzugsweise nicht oder mit einer anderen Prüfsubstanz oder mit einer anderen Konzentration der Prüfsubstanz beaufschlagten Bereich (Umgebungsbereich (10) bzw. weiterer Bereich (8)) ggf. erfassbar sind.
Als Halbleitersubstrat (1) sind für das erfindungsgemäße Verfahren prinzipiell alle bekannten Feststoffe bzw. Materialien mit Halbleitereigenschaften geeignet, bspw. Silizium, Titanoxid oder Galliumarsenid insbesondere in ihren unterschiedlichen, vorzugsweise gebräuchlichen, Ausgestaltungen.
Vorzugsweise wird für das erfindungsgemäße Verfahren ein Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) in den üblichen Abmessungen eines Biochips oder eines Partikels, insbesondere eines gebräuchlichen Biopartikels, bevorzugt eines Mikropartikels oder Nanopartikels, gewählt, wodurch die herzustellende Anordnung besonders einfach für gängige Vefahren zur Anwendung von Biochips oder Partikeln einsetzbar wird.
In besonders geeigneter Weiterbildung wird mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens eine als vorzugsweise planarer Biochip und/oder als ein 1 D-, 2D oder 3D- Biochip verwendbare Anordnung hergestellt, die ein optisches oder szintigraphisches Erfassen von Assoziationsereignissen mittels eines externen Detektors ermöglicht. Bevorzugt wird für das erfindungsgemäße Verfahren ein Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) in den üblichen Abmessungen eines Objekträgers oder eines Objektträgereinsatzes gewählt, wodurch eine in ihren Abmessungen dem gängigen Standard für Biochips entsprechende Anordnung hergestellt wird.
Besonders bevorzugt wird für das erfindungsgemäße Verfahren ein Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) in den Abmessungen Länge x Breite = (7,5 +/- 1) cm x (2,5 cm +/- 0,5 cm, vorzugsweise exakt 7,5 cm x 2,5 cm mit den gängigen Abweichungen bei ihrer Produktion, bspw. bei Sägeprozessen, und/oder in einer Dicke von > 0,3 mm, insbesondere von 1 mm (+/- 0,7 mm), vorzugsweise exakt 1 mm, mit den üblichen produktionsbedingten Abweichungen gewählt, wodurch eine besonders gute Handhabbarkeit der herzustellenden Anordnung gewährleistet wird.
Für das erfindungsgemäße Verfahren wird als Halbleitersubstrat (1) besonders bevorzugt ein Silzium-Wafer oder ein Teil davon, insbesondere ein aus einem Silzium-Wafer gesägter bzw. durch andere Zerteilung, z.B. durch Anritzen und Brechen des Wafers oder mittels eines Flüssigkeitsstrahls oder eines Lasers, erhaltener Chip, gewählt. Dies hat u.a. die vorteilhafte Eigenschaft, dass die Anordnung besonders exakt in ihren Materialeigenschaften oder Abmessungen herstellbar ist und damit eine besonders gute Reproduzierbarkeit der erfindungsgemäßen Anordnungen bzw. Nachweissysteme ermöglicht. Sollen mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens Anordnungen hergestellt werden, die als Biopartikel verwendbar sind, werden bevorzugt durch mechanische Zerkleinerung von Wafermaterial, z.B. mittels einer Kugelmühle oder tribomechanischer Verfahren, gebildete Partikel als Halbleitersubstrat gewählt, die Herstellung ist aber auch durch andere Zerteilungsmethoden möglich.
Vorteilhafterweise wird für das erfindungsgemäße Verfahren ein Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) gewählt, das als ein oxidierter Silzium-Wafer oder als ein Teil davon gebildet ist. Silizium-Wafer haben in der Regel nahezu perfekt reproduzierbare Materialeigenschaften und auch ihre Oberflächenmodifizierung, insbesondere durch Oxidation, ist besonders einfach, homogen und reproduzierbar herstellbar, wodurch eine besonders gute Reproduzierbarkeit des Verfahrens bzw. der dadurch hergestellten Anordnung und Meßergebnisse gewährleistet wird.
In vorteilhafter Weiterbildung des erfindungsgemäße Verfahren wird ein Halbleitersubstrat (1) gewählt, das als amorphes, polykristallines Silizium oder vorzugsweise einkristallines Silizium, insbesondere mit einer {111}- oder {100}-oder {110} Vorzugsorientierung, besonders bevorzugt mit einer {111}-Vorzugsorientierung gebildet ist, wodurch eine Anordnung, die auf einem nahezu perfekt und reproduzierbaren Trägermaterial gebildet ist, herstellbar wird. Als besonders geeignet hat sich für das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere auch eine {100} Vorzugsorientierung des Halbleitersubstrats (1) erwiesen, wobei durch die technischen Eigenschaften und weiten Verbreitung dieses Materials die Anordnung besonders einfach und günstig herstellbar ist. Aber auch andere kristalline Vorzugsorientierungen des Silziumsmaterials sind für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet.
Besonders günstig ist es, wenn für das erfindungsgemäße Verfahren ein Halbleitersubstrat (1) gewählt wird, das zumindest teilweise, insbesondere durchgängig und/oder gleichmäßig dotiert ist, vorzugsweise p- und/oder n-dotiert ist, besonders bevorzugt p-dotiert ist, insbesondere mit einem elektrischen Widerstand von < 100 Ohm / cm2, vorzugsweise < 20 Ohm / cm2, besonders bevorzugt < 1 Ohm / cm2, insbesondere bevorzugt < 0,1 Ohm / cm2, < 15 Ohm / cm2, da dann die hergestellte Anordnung somit besonders günstige Eigenschaften, bspw. eine gerichtete Ankopplung der Prüfsubstanz, aufweist. Als Fremdatome des verwendeten dotierten Materials sind alle für die Dotierung von Halbleitern üblichen Fremdatome geeignet, für p-dotierte Substrate insbesondere Bor, Aluminium, Indium und/oder Gallium, für n-dotierte Substrate Phosphor, Arsen und/oder Antimon. Bevorzugt kann für das erfindungswgemäße Verfahren auch undotiertes Halbleitersubstrat, z.B. Silizium, das vorzugsweise besonders rein ist, z.B. Verunreinigungen im ppm-Bereich oder darunter aufweist, verwendet werden, wodurch bspw. bei optischen Messungen ein besonders günstiges Signal-/Rausch- Verhältnis durch niedrige Hintergrundsignale erreichbar ist. Besonders geeignet ist es, wenn für das erfindungsgemäße Verfahren ein Halbleitersubstrat (1) gewählt wird, das vorzugsweise vollständig homogen gebildet ist, z.B. ein innerhalb seiner gesamten Abmessungen einheitliches Silziummaterial, z.B. ein durchgängig nicht dotierter oder lediglich mit einer Art/Sorte von Fremdatomen dotierter Silizium-Chip, verwendet wird, wodurch auch besonders einfach einheitliche Trägereigenschaften der Anordnung, insbesondere über die gesamte Isolatorschicht (2) herstellbar sind.
Für die Herstellung von besonders günstigen Anordnungen werden für das erfindunsgemäße Verfahren vorzugsweise unpolierte Halbleiter-, insbesondere
Silizium-Substrate, vorzugsweise unpolierte Silzium-Wafer oder daraus gebildete
Chips, gewählt bzw. eingesetzt, da sie bspw. ein besonders einfaches und gleichmäßiges Inkubieren der Anordnungsoberfläche mit einer Probe, auch ohne
Verwendung eines Deckgläschens oder anderer üblicher Inkubationsvorrichtungen, ermöglichen.
Wird für das erfindungsgemäße Verfahren als Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) ein wenigstens teilweise, vorzugsweise auf mindestens einer Seite, insbesondere auf der mit der Prüfsubstanz beaufschlagten Seite, polierter Silzium-Wafer oder ein Teil davon, bzw. ein polierter und oxidierter Silizium- Wafer oder ein Teil davon, gewählt, so ist vorteilhafterweise die Anordnung als Biochip mit spiegelnder Oberfläche und den damit verbundenen Vorteilen herstellbar.
Besonders geeignet ist es auch, wenn für das erfindungsgemäße Verfahren eine anorganische Isolatorschicht gewählt wird, deren Oberfläche vor der Beaufschlagung mit Medium und Prüfsubstanz gereinigt ist, z.B. mittels einer Säure oder Base und/oder eines organischen Lösungsmittels, insbesondere unter Verwendung eines
Ultraschallbads oder eines Schüttlers. Soll bspw. eine Anordnung mit besonders günstigen, z.B. ebenen, Oberflächeneigenschaften hergestellt werden, so wird als Halbleitersubstrat mit der darauf gebildeten Isolatorschicht ein mit Flusssäure geätztes und anschließend mittels Carowscher Säure oxidiertes Silziumsubstrat gewählt, welches vorzugsweise in einem Ofen getrocknet ist. Als Anbindungsschicht, die auf dem Halbleitersubstrat angeordnet bzw. gebildet ist, wird vorzugsweise eine anorganische Isolatorschicht gewählt, die durch chemische Reaktion aus dem Material des Halbleitersubstrats (1) erzeugt bzw. gebildet ist, wodurch eine besonders geordnete und feste Anbindungsschicht auf dem Halbleitersubstrat (1 ) für das erfindungsgemäße Verfahren einsetzbar ist.
Als anorganische Isolatorschicht (2) für das erfindungsgemäß Verfahren wird vorzugsweise eine Schicht aus Siliziumnitrid, Silikat oder, besonders bevorzugt, aus Siliziumdioxid, nachfolgend auch als Siliziumdioxidschicht (7) bezeichnet, gewählt, insbesondere mit oder ohne Einschlüssen von Fremdatomen (Dotierung). Dies hat den Vorteil, dass die Anbindungsschicht besonders einfach, z.B. durch Reaktion eines Silzium-Halbleitersubstrats (1) mit Sauerstoff oder Stickstoff, herstellbar ist.
In besonders günstiger Weiterbildung der Erfindung wird als anorganische Isolatorschicht (2) eine Siliziumdioxidschicht (7) gewählt, die insbesondere in dem mindestens einen Bereich (3; 8) als nicht-natürliches, vorzugsweise trockenes und/oder thermisches Oxid oder als trockenes und/oder thermisches Nitrid gebildet ist, wodurch besonders vorteilhafte Eigenschaften der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens herstellbaren Anordnung, z.B. durch eine schwammartig gebildete stabile Struktur der Isolatorschicht, gewährleistbar sind. Aber auch eine poröse anorganische Isolatorschicht, die z.B. nasschemisch auf bzw. in dem Halbleitersubstrat gebildet und anschließend vorzugsweise im Ofen getrocknet ist, ist als Anbindungsschicht besonders geeignet.
Vorzugsweise wird für das erfindungsgemäße Verfahren eine anorganische Isolatorschicht (2) gewählt, die als Siliziumdioxidschicht (7) mit einer Dicke bzw. Höhe von > 10 nm, vorzugsweise > 30 nm, insbesondere 100 nm (+/- 70 nm), besonders bevorzugt 100 nm (+/- 10 nm) gebildet ist, wodurch besonders günstige Eigenschaften, bspw. für die Reflexion und Verstärkung von Strahlung an den Grenzschichten, der herstellbaren Anordnung vorliegen. Wird als Halbleitersubstrat (1) ein Siliziumwafer oder ein Teil davon gewählt, z.B. mit rechteckigen oder quadratischen Dimensionen (Chip), so sind durch die Oxiddicke auch die optischen Eigenschaften der Isolatorschicht, bspw. eine blaue oder rote Färbung durch Reflexion von Licht in der entsprechenden Wellenlänge an der Silizium/Siliziumoxid- Grenzfläche, gezielt verwendbar, die für verschiedenste Anwendungen der Anordnung von Vorteil sind. Für die Verwendung einer bestimmten Oxiddicke der Isolatorschicht (1) auf einem Silizium-Wafer (Halbleitersubstrat (1)) sind insbesondere elektrochemisch und vorzugsweise thermisch hergestellte Oxide geeignet, da mittels derer die Anordnung besonders einfach und reproduzierbar in ihren Eigenschaften, insbsondere den Materialeigenschaften der Anbindungsschicht, herstellbar bzw. verwendbar ist. Besonders günstig ist es, wenn als Halbleitersubtrat mit der darauf gebildeten Isolatorschicht ein Silizium-Wafer oder -Chip mit einer durch ein übliches thermisches Oxidationsverfahren, z.B. durch Erhitzen und Inkontaktbringen des Wafers mit einem überwiegend aus Sauerstoff bestehenden Gas, gebildeten Siliziumdioxidschicht gewählt wird. Bevorzugt wird als anorganische Isolatorschicht aber auch ein elektrochemisch gebildetes Oxid, das vorzugsweise in einem Ofen getrocknet ist, verwendet.
Bevorzugt wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der Bezirk der Isolatorschicht, innerhalb dessen die organische Prüfsubstanz (z.B. Fängermoleküle), z.B. in verschiedenen Bereichen, angekoppelt wird, mit mindestens einem Medium (4), insbesondere einer Flüssigkeit, beaufschlagt, das vorzugsweise wenigstens ein Lösungsmittel, nachfolgend auch Lösungsmittel (9) genannt, umfasst oder als wenigstens ein Lösungsmittel (9) gebildet ist. Wie vollkommen überraschend festgestellt wurde, wirkt insbesondere Flüssigkeit, vorzugsweise eine Kombination aus einem wässerigen und einem organischen Lösungsmittel, als Mediator für die spezifische und stabile Ankopplung der Prüfsubstanz an die erfindungsgemäße Isolatorschicht.
Besonders geeignet wird für das erfindungsgemäße Verfahren ein Medium (4) für die Beaufschlagung gewählt, das wenigstens ein flüssiges Lösungsmittel (9) umfasst, welches als wässeriges und/oder organisches Lösungsmittel, insbesondere als hydrophiles und/oder polares Lösungsmittel gebildet ist. Als wässriges Lösungsmittel ist inbesondere Wasser, z.B. mit einem neutralen pH-Wert, zu verstehen. Als organisches Lösungsmittel (9) ist vorzugsweise ein Alkohol, Dialkylsäureamid, Alkylhalogenid, Pyrollidon, Furan, DMSO, Acetonitril, Aceton oder eines ihrer Derivate geeignet, z.B. Ethanol, DMF, Dichlormethan, NMP, THF oder eines ihrer Derivate. Das Medium (4), das für das erfidungsgemäße Verfahren gewählt wird, umfasst vorzugsweise Wasser mit saurem oder basischen pH-Wert und/oder ein organisches Lösungsmittel mit saurem oder basischen pH-Wert, einen Elektrolyten und/oder einen Puffer oder ist als solche gebildet. Besonders geeignet wird ein Medium mit basischem, insbesondere physiologischen, pH-Wert gewählt.
Bevorzugt wird als Medium (4) ein Gemisch aus wässerigen und organischen Lösungsmitteln, insbesondere aus einem wässerigem und einem organischen Lösungsmittel, insbesondere als Gemisch aus einer wässerigen Lösung und einem organischen Lösungsmittel gewählt, vorzugsweise mit einem Unterschuss an organischem Lösungsmittel. Auch die Verwendung eines prozentual nur geringen Volumenanteils des organischem Lösungsmittels am Gemisch, insbesondere < 10% , bevorzugt < 1%, besonders bevorzugt < 0,1%, wird geeigneterweise gewählt, wodurch auch die Ankopplung von gegenüber organischen Lösungsmitteln besonders sensitiven Prüfsubstanzen, z.B. von Proteinen oder Zellen, gewährleistet ist.
Besonders günstig ist es, wenn für das erfindungsgemäße Verfahren ein zumindest teilweise elektrisch leitendes Medium (4), insbesondere mit einem Leitwert > 0,05 μS/cm, vorzugsweise > 20 μS/cm, insbesondere bevorzugt > 1 mS/cm, besonders bevorzugt > 50 mS/cm, gewählt wird, insbesondere, wenn es einen gelösten Feststoff, vorzugsweise die Prüfsubstanz und/oder eine Pufferkomponente und/oder ein Salz, bevorzugt die Prüfsubstanz und eine Pufferkomponente, besonders bevorzugt die Prüfsubstanz und ein gelöstes Salz, beinhaltet. Aber auch die Verwendung eines nicht elektrisch leitenden Mediums kann geeignet sein.
In vorteilhafter Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden mindestens zwei nicht-silanisierte bzw. nicht mit organischen Molekülen vorzugsweise gezielt kovalent belegte Bereiche/Bezirke (3; 8) auf der Isolatorschicht mit mindestens einem Medium (4) und jeweils mit mindestens einer Prüfsubstanz derart beaufschlagt, bspw. durch Aufpipettieren geeigneter, insbesondere nicht ineinanderlaufender (Spot-)Volumina, dass wenigstens zwei gleichartig oder insbesondere unterschiedlich funktionalisierte Bereiche gebildet werden. Unter den mindestens zwei Bereichen sind insbesondere mehrere vorzugsweise räumlich getrennte Bezirke zu verstehen, die entweder als Replika gebildet werden, z.B. mehrere Bereiche, die gleichartig beaufschlagt werden, oder jeweils mit unterschiedlichen Prüfsubstanzen oder mit unterscheidlichen Konzentrationen einer Prüfsubstanz beaufschlagt werden, wobei mehrere unterschiedlich funktionalisierte Bereiche (3; 8) gebildet werden.
Besonders bevorzugt erfolgt die Beaufschlagung derart, z.B. mittels Pipettieren oder automatisiertem Bespotten, dass mindestens zwei nicht-silanisierte Bereiche (3; 8) mit angekoppelter Prüfsubstanz gebildet werden, die wenigstens teilweise oder vollständig von einem auf und/oder in der Isolatorschicht (2) gebildeten Umgebungsbereich (10), d.h. einem vorzugsweise nicht mit Prüfsubstanz beaufschlagten Bezirk der Isolatorschicht, umgeben sind. Dadurch wird auch eine einfache Abgrenzung der wenigstens zwei Bereiche sowie eine besonders gute Vergleichbarkeit und Unterscheidbarkeit der von ihr ausgehenden Strahlung bzw. ihrer massenspektrometrisch nachweisbaren Eigenschaften ermöglicht, insbesondere wenn die Bereiche (3; 8) als Spots, vorzugweise als räumlich voneinander getrennte und/oder ortsadressierte Spots gebildet werden. Für verschiedene Anwendungen kann es auch geeignet sein, dass eine anorganische Isolatorschicht verwendet wird, deren Oberfläche eine nicht geschlossene Silanschicht aufweist und die insbesondere nicht in den Bereichen, in denen Prüfsubstanz gekoppelt wird, silanisiert ist.
In besonders günstiger Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden mindestens zwei Bereiche (3; 8) jeweils mit einer zumindest teilweise in dem mindestens einen Medium (4) gelösten Prüfsubstanz beaufschlagt, insbesondere mit einem Gemisch beinhaltend wässerige Pufferlösung, organisches Lösungsmittel und gelöste Prüfsubstanz. Dies hat die vorteilhafte Eigenschaft, dass das Verfahren besonders einfach, nämlich in einem einzigen Prozessschritt, die Herstellung einer Anordnung zum nachweisbaren Erfassen von mehreren Assoziationsereignissen, aus einem Halbleitersubstrat und einer auf dem Halbleitersubstrat gebildeten Isolatorschicht ermöglicht. Um besonders einheitliche Ankopplungsbedingungen zu ermöglichen, sind die anzukoppelnden Prüfsubstanzen bevorzugt in dem gleichen Medium gelöst. In besonders vorteilhafter Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die wenigstens zwei nicht-silanisierten Bereiche (3; 8) als Array, insbesondere als Microarray und/oder Low-Density-Array hergestellt, wodurch eine besonders gute Auslesbarkeit und Ausnutzung der erfindungsgemäßen Anordnung ermöglicht wird. Für die Herstellung der erfindungsgemäßen Arrays sind alle gängigen Beaufschlagungstechniken, z.B. Pipettieren, und übliche Volumina geeignet, die bei der herkömmlichen Beaufschlagung von Glasträgern mit Probesubstanzen zur Herstellung eines Biochip-Arrays, insbesondere eines Low-Density-oder Microarrays verwendet werden.
Der Umgebungsbereich (10), der vorzugsweise wenigstens einen und besonders bevorzugt mindestens zwei nicht-silanisierte Bereiche (3; 8) vollständig umgibt, wird bevorzugt derart gebildet, dass er nicht mit Prüfsubstanz beaufschlagt wird, und insbesondere als lediglich mit Medium (4) beaufschlagtes oder vorzugsweise unbehandeltes Siliziumdioxid der Isolatorschicht (2) verbleibt. Für verschiedene Anwendungen ist aber auch geeignet, dass der Umgebungsbereich (10) chemisch, insbesondere mit organischen Molekülen, ausgenommen die Prüfsubstanz, modifiziert wird. Damit ist auch eine schnelle Nutzbarkeit oder eine Verringerung unspezifischer Hintergrundsignale besonders einfach herstellbar, vorzugsweise wenn der Umgebungsbereichs (10) mit Blockierungsreagens und/oder einer nukleophilen Verbindung, bevorzugt mit einem Thiol, z.B. Mercaptoethanol oder Cystein beaufschlagt wird. Die Passivierung des Umgebungsbereichs (10) kann aber auch bspw. bei der nachfolgenden Inkubation der erfindungsgemäßen Anordnung mit einer Probe, die Blockierungsreagens oder Serum, beinhaltet, hergestellt werden. Unter Blockierungsreagens sind im wesentlichen alle in der Biotechnologie gebräuchlichen Substanzen zur Passivierung von Oberflächen mit organischen Verbindungen geeignet, insbesondere gelöstes Milchpulver, Albumin oder Proteinfragmente, mit welchen vorzugsweise die Testsubstanz nicht spezifisch assoziiert.
In einer besonders geeigneten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird/werden als Prüfsubstanz oder Prüfsubstanzen insbesondere Moleküle mit wenigstens einem Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff, Phosphor-, Halogen-, Farbstoff und/oder radioaktiven Isotop gewählt, oder die gewählte Prüfsubstanz umfasst diese, wodurch eine besonders stabile Anbindung bzw. -kopplung zwischen der Isolatorschicht und der Prüfsubstanz ermöglicht wird.
Besonders bevorzugt ist für das erfindungsgemäße Verfahren, wenn als die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5) wenigstens zwei unterschiedliche Prüfsubstanzen (5; 11) gewählt werden, d.h. dass mindestens zwei unterschiedliche Prüfsubstanzen oder mindestens zwei unterschiedliche Konzentrationen von einer Prüfsubstanz vorzugsweise ortsaddressiert bzw. räumlich voneinander getrennt an die Isolatorschicht gekoppelt werden und/oder die Prüfsubstanz bzw. die mindestens zwei unterschiedlichen Prüfsubstanzen jeweils als Moleküle mit wenigstens einem, vorzugsweise rand- bzw. endständig im Molekül angeordneten, Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff, Phosphor-, Halogen-, Farbstoff oder radioaktiven Isotop gebildet sind oder diese umfassen. Dadurch wird auf besonders einfache Weise eine Anordnung zur ortsabhängigen Assoziation mit und zum Nachweis von mehreren unterschiedlichen Testsubstanzen aus einer Probe hergestellt oder es können nachfolgend von der Testsubstanz, z.B. einem Enzym, bewirkte Modifizierungen, z.B. durch enzymatische Spaltung, der angekoppelten Probesubstanz sichtbar gemacht werden, und/oder es wird dadurch auch eine besonders stabile und gerichtete Ankopplung der Prüfsubstanz an die anorganische Anbindungsschicht hergestellt.
In besonders geeigneter Fortbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die mindestens eine gewählte organische Prüfsubstanz (5), vorzugsweise endständig, wenigstens eine nukleophile chemische Gruppe bzw. Funktion, insbesondere eine Thiol-, Amino-, Hydroxyl-, Carboxyl-, Cyano-, Nitril-, Si-, Se-, Te-, Sulfat, Sulfid, Alken- oder Alkin-, oder Phosphan-Gruppe, wodurch die Stabiltät der Kopplung besonders gut gewährleistet wird, insbesondere durch eine Thiolfunktion, z.B. von einem Cysteinrest. Bei Proteinen oder Peptiden wird insbesondere der Amino- Terminus oder der Carboxyl-Terminus, vorzugsweise die N-terminale oder C- terminale Aminosäureposition, als endständig bezeichnet, bei Oligonukleotiden das 5'- oder das 3'-Ende der Oligonukleotidsequenz.
Vorzugsweise wird als die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5) eine biooorganische Prüfsubstanz gewählt, die bevorzugt als Linkermolekül, Aminosäure, Kohlenhydrat, Lipid, Farbstoff, Pharmakon, Biotin, Peptid, Polypeptid, Oligonukleotid, Protein, Zellkompartiment, Zelle oder davon abgeleitete Struktur gebildet ist oder diese umfasst bzw. enthält, wodurch die Anordnung im Prinzip universell für die unterschiedlichsten Anwendungen, insbesondere zum Erfassen aller möglichen bioorganischen Komponenten oder Strukturen (Testsubstanzen) herstellbar ist.
Besonders geeignet ist insbesondere die Verwendung von Peptiden und/oder Proteinen als Prüfsubstanz/en (5), da das erfindungsgemäße Verfahren u.a. die Herstellung von Peptid- und/oder Proteinchips mit besonders vorteilhaften Eigenschaften ermöglicht.
Besonders bevorzugt wird als die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5) DNA, RNA, cDNA, mRNA, cRNA, PNA, Rezeptor, Ligand, Protein A, Protein G, Streptavidin, Antikörper oder davon abgeleitete Struktur gewählt oder die Prüfsubstanz enthält diese, wodurch die Spezifität der Assoziation bzw. Wechselwirkung mit der bioorganischen Testsubstanz besonders gut sichergestellt wird. Insbesondere bevorzugt wird als Prüfsubstanz (5) ein synthetisches, natürlich vorkommendes oder rekombinant exprimiertes oder durch enzymatische, saure oder basische Spaltung von Polypeptiden erhaltenes Peptid, vorzugsweise als synthetisch hergestelltes Peptid, verwendet.
In besonders vorteilhafter Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5) ein Peptid oder mehrere Peptide aus vorzugsweise L- und/oder D-Aminosäureresten und/oder Glycin und/oder ß-Alanin, insbesondere aus den genetisch kodierten Aminosäuren und/oder deren vorzugsweise natürlich vorkommenden Modifikationen, z.B. Phosphoserin, -threonin, oder -tyrosin, insbesondere auch bspw. mit einer radioaktiven oder Farbstoffmarkierung, gewählt, oder die Profsubstanz umfasst diese. Peptide als Prüfsubstanz haben ganz allgemein den Vorteil, dass sie in der Regel einfach synthetisch und in großer Reinheit herstellbar sind und, mit ganzen Proteinen vergleichbare, spezifische Assoziationseigenschaften aufweisen können, z.B. wenn als das Peptid ein vorzugseise N- oder C-terminal mit einem Cysteinrest gebildetes Antikörperepitop gewählt wird. Besonders bevorzugt werden daher synthetische, vorzugsweise chromatographisch aufgereinigte, Peptide als anzukoppelnde Prüfsubstanz für das erfindungsgemäße Verfahren gewählt. Aber auch Peptide mit wenigstens einem nicht natürlich vorkommenden Aminosäurerest, z.B. aus Anthranil- oder aus Aminobenzoesäure gebildet, werden für verschiedenste Anforderungen insbesondere bevorzugt gewählt.
In einer anderen vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5) als Linkermoleküle mit freien/ungebundenen chemisch reaktiven Gruppen gewählt oder umfasst diese. Als Linkermoleküle sind insbesondere alle möglichen Moleküle, ausgenommen Silane, zu verstehen, die zwei verschiedene, vorzugsweise end- und/oder seitenständig im Moleküle angeordnete, unterschiedlich chemisch reaktive Gruppen bzw. Funktionen aufweisen, wobei die Moleküle über eine Funktion an die Isolatorschicht (2) gekoppelt werden und über die andere Funktion ggf. mit bioorganischen Substanzen verbunden werden. Wird als Prüfsubstanz beispielsweise Cystein gewählt, so wird dieses vorzugsweise über die Thiolfunktion seiner Seitenkette an die Isolatorschicht gekoppelt und kann über eine nachfolgende chemische Reaktion mittels seiner Amino- oder Carboxylgruppe eine weitere Substanz bzw. Fängermoleküle, z.B. einen Aminosäurerest oder ein Peptid ankoppeln. Wird als Prüfsubstanz z.B. ein N-terminal über eine Amidbindung mit Biotin verknüpftes Cystein gewählt, so kann in einem nachfolgenden Schritt Streptavidin an die Oberfläche gekoppelt werden, wodurch bspw. Sandwichanordnungen (z.B. Isolatorschicht-Biotin-Streptavidin-biotinylierte Komponente) möglich bzw. gebildet werden. Wird als Prüfsubstanz bzw. Linker ein Lipid gewählt, das vorzugsweise eine nukleophile Gruppe, bevorzugt Thiol, umfasst, so wird der damit beaufschlagte Bereich der Isolatorschicht bspw. für die nachfolgende Immobilisierung zumindest teilweise hydrophober Substanzen, insbesondere eines Transmembranproteins, funktionalisiert. Die Immobilisierung an die Prüfsubstanz bzw. den Linker kann aber auch chemisch, kovalent und/oder durch elektrostatische bzw. hydrophile Wechselwirkungen erfolgen.
Geeigneterweise wird als das Linkermolekül bzw. die Prüfsubstanz wenigstens ein Crosslinker gewählt, der bereits über eine seiner wenigstens zwei Linkerfunktionen chemisch, inbesondere kovalent, mit einer bioorganischen Substanz, z.B. einem Oligonukleotid oder einem Protein, verbunden ist und mittels der anderen Funktion, insbesondere einer nukleophilen Gruppe, vorzugsweise einem Thiol, an die Isolatorschicht (2) gekoppelt wird. Silane oder quervernetzende Polymere (z.B. PVDF, Cellulose) bildende Substanzen sind als Linkermoleküle bzw. Prüfsubstanz im Sinne der Erfindung nicht geeignet, da sie nur mit vergleichsweise hohem Aufwand verwendbar sind.
Besonders bevorzugt wird durch das erfindunsgemäße Verfahren die mindestens eine Prüfsubstanz (5; 8) mit der Mehrzahl ihrer an die Oberfläche gekoppelten Moleküle räumlich gerichtet auf der Isolatoschicht angeordnet, d.h. dass die Moleküle einheitlich, insbesondere mit einer Vorzugsorientierung, auf der Oberfläche ausgerichtet sind bzw. angekoppelt werden. Wird als die Prüfsubstanz beispielsweise ein endständig mit einer nukleophilen Gruppe, insbesondere einem Thiol, markiertes Peptid, Protein oder Oligonukleotid gewählt, so wird die Prüfsusbtanz insbesondere über die Thiolgruppe an die Anbindungsschicht (2) gekoppelt und liegt ansonsten frei zugänglich für die ggf. nachfolgende Wechselwirkung mit einer Testsubstanz vor.
Werden vorzugsweise Peptide oder andere synthetisch hergestellte Moleküle, insbesondere Oligonukleotide, als Prüfsubstanz gewählt, so sind diese vorzugsweise einheitlich mit einer nukleophilen Gruppe, z.B. einem end- oder seitenständigen Thiol ausgestaltet, wodurch insbesondere auch bei mehreren zumindest teilweise ähnlichen Prüfsubstanzen, z.B. Wildtypsequenz und Mutante, eine besonders einheitliche und gerichtete Anbindung sowie eine gute Vergleichbarkeit der Ergebnisse gewährleistet wird.
Um eine für die Verwendung besonders geeignete Anordnung herzustellen, wird nach der Beaufschlagung der Isolatorschicht mit dem mindestens einen Medium und der mindestens einen Prüfsubstanz überschüssiges Medium und/oder überschüssige Prüfsubstanz vorzugsweise durch Waschen von der Oberfläche entfernt.
In der Praxis werden bei der Beaufschlagung der Isolatorschicht Volumina der die Testsubstanz beinhaltenden Lösung gewählt, die zu einem raschen Verdampfen des Lösungsmittels unter Normalbedingungen, z.B. bei Raumtemperatur, führen. Die überschüssigen, nicht gekoppelten Substanzen, die nach Verdampfen des Lösungsmittels auf der Anordnung verbleiben, werden dann nachfolgend durch Waschen von der Oberfläche, vorzugsweise mit einer wässerigen Flüssigkeit, bevorzugt einer Pufferlösung, besonders bevorzugt Wasser, entfernt. Für die Herstellung verschiedenster Anordnungen, z.B. von Biochips mit gegenüber Aggregatsänderungen empfindlichen Proteinen, erfolgt die Beaufschlagung mit der Prüfsubstanz vorzugsweise unterhalb der üblichen Raumtemperatur, bevorzugt < 23 0C besonders bevorzugt < 5°C, und ggf. mit Lösungsmittelzusätzen, die ein rasches Verdampfen des Lösungsmittels zumindest behindern, z.B. Öl, und die Oberfläche wird nach der Beaufschlagung mit der bzw. den zumindest teilweise gelösten Prüfsubstanz/en und vor dem vollständigen Verdampfen des Lösungsmittels entsprechend gewaschen.
Auch nach großflächiger Beaufschlagung der Isolatorschicht, z.B. durch Baden oder Benetzen, mit Medium (4) und/oder Prüfsubstanz (5) wird die Oberfläche vorteilhafterweise entsprechend gewaschen. Für eine besonders einfache Handhabung wird die Anordnung nach dem Waschen getrocknet oder ggf. feucht gehalten.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Anordnung bzw. der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Anordnung für das spezifische Erfassen von Substanzen aus einer Probe, insbesondere für das Erfassen von Assoziationsereignissen. Die erfindungsgemäße Verwendung ist dadurch gekennzeichnet dass die Anordnung mit wenigstens einer Probe, nachfolgend auch Probe (13) genannt, in Kontakt gebracht wird, welche ggf. eine Testsubstanz, nachfolgend auch als Testsubstanz (14) bezeichnet, enthält.
Für die erfindungsgemäße Verwendung sind prinzipiell alle Standardverfahren oder andere Methoden zum Gebrauch eines Biochips, bspw. für einen Immunoassay oder ein Genexpressions-Profiling, geeignet, sowie alle üblichen Verfahren, die zum Gebrauch von Biopartikeln, z.B. für Untersuchungen von Biopartikeln zur Verwendung als Diagnostika, Therapeutika oder Aufreinigungsmittel oder für die Herstellung eines therapeutischen Mittels, angewendet werden.
Dazu wird insbesondere der mindestens/wenigstens eine Bereich (3), an dem die wenigstens eine Prüfsubstanz (5) gekoppelt ist, mit der wenigstens einen Probe (13) in Kontakt gebracht, z.B. durch direktes Aufbringen mittels Pipettieren der Probe auf den wenigstens einen Bereich oder indirektes Aufbringen der Probe in der Nähe des Bereichs, z.B. in bzw. auf dem Umgebungsbereich (10), und nachfolgende Verteilung bzw. Zuführung zu dem wenigstens einen Bereich (3). Für das Inkontaktbringen sind insbesondere alle Standardverfahren oder andere Methoden geeignet, mittels derer eine zu testende Probe auf einen Biochip verbracht bzw. einer Festphasen- gebundenen Prüfsubstanz zugeleitet werden kann, z.B. mittels üblicher Lab-on-a- Chip-Verfahren.
Als Probe wird insbesondere ein Gas, Feststoff, Flüssigkeit, und/oder ein Gemisch daraus, verwendet, besonders bevorzugt wird eine Probe verwendet, die wenigstens eine Testsubstanz beinhaltet, z.B. einen Analyten und/oder eine Kontrolle, vorzugsweise in einer nachweisbaren Konzentration.
Besonders bevorzugt wird als Probe (13) eine Lösung, Emulsion, und/oder Suspension, die ggf. Mikropartikel oder andere nicht gelöste Komponenten beinhaltet, vewendet, vorzugsweise wenigstens eine zumindest teilweise gelöste Testsubstanz beinhaltend.
In vorteilhafter Weiterbildung wird als Probe (13) Körperflüssigkeit, vorzugsweise Urin, Blut oder Serum, Schleim Tränenflüssigkeit, Schweiss, Sperma, cerospinale Flüssigkeit und/oder eine Stuhlprobe verwendet oder die Probe enthält diese.
Besonders bevorzugt wird als die wenigstens eine Probe (13) mindestens zwei unterschiedliche Proben (13; 16) verwendet, die vorzugsweise ortsadressiert auf die Oberfläche der Anordnung gebracht werden, insbesondere jeweils auf ein Replikat der gekoppelten Prüfsubstanz/en, wodurch mit nur einer Anordnung auch unterschiedliche Proben gleichzeitig untersuchbar sind.
Besonders geeignet ist erfindungsgemäß die Verwendung einer Probe, die als Testsubstanz eine Aminosäure, ein Kohlenhydrat, ein Lipid, einen Farbstoff, ein Pharmakon, Biotin, ein Linkermolekül, ein Peptid, ein Oligonukleotid, ein Protein, Zellgewebe, eine Zelle, einen Zellbestandteil, DNA, RNA, cDNA, mRNA, cRNA, PNA, ein Protein und/oder ein Peptid oder davon abgeleitete Strukturen enthält oder die Testsubstanz diese umfasst, z.B. ein Biopartikel ist. Vorzugsweise wird eine Probe verwendet, die als Testsubstanz (14) einen Antikörper, ein Enzym, einen Rezeptor, einen Ligand, eine Proteindomäne oder ein Antikörper-Epitop beinhaltet, und besonders bevorzugt als IgA, IgG1 IgE, IgM, Kinase, Phosphatase oder Antikörperepitop, gebildet ist.
In besonders günstiger Fortbildung wird eine Probe verwendet, die eine Testsubstanz (14) enthält, welche mit der in dem Bereich (3) ohne silanisierte Zwischenschicht an die Isolatorschicht (2) gekoppelten Prüfsubstanz (5) wechselwirkt, insbesondere mit der Prüfsusbtanz (5) assoziiert oder diese enzymatisch verändert.
Besonders bevorzugt ist erfindungsgemäß die Verwendung einer Probe, die eine Testsubstanz (13) beinhaltet, die mit wenigstens einer auf und/oder in dem wenigsten einen Bereich (3; 8) gekoppelten Prüfsubstanz nachweisbar wechselwirkt.
In besonders vorteilhafter Weiterbildung wird eine Probe verwendet, die eine Testsubstanz (14) enthält, die mit einem strahlungsaktiven Marker vorzugsweise kovalent verbunden ist, z.B. ein markiertes Peptid, oder nachfolgend verbunden wird, z.B. durch Inkubation mit einem markierten Sekundärantikörper.
In einer für die Auswertung der Anordnung besonders geeigneten Verwendung, wird nach dem Inkontaktbringen mit der Probe und einer Inkubationszeit, die insbesondere länger bzw. > 1min, bevorzugt > 30 min, besonders bevorzugt > 1 h ist, überschüssiges Probenmaterial vorzugsweise durch Waschen von der Oberfläche entfernt, vorzugsweise durch Waschen mit einer wässerigen Flüssigkeit, bevorzugt mit Wasser, besonders bevorzugt mit einem, insbesondere physiologischen, Puffer. Für ein besonders einfaches Auslesen wird die Anordnung nach dem Waschen getrocknet oder ggf. feucht gehalten.
In besonders günstiger Weiterbildung der erfindungsgemäßen Verwendung wird die Anordnung, vorzugsweise der wenigstens eine Bereich (3; 8), nach dem Inkontaktbringen mit der Probe mittels eines extern bzw. periphär angeordneten Detektors zur Detektion von Strahlung, insbesondere zur Detektion von Strahlung in den Wellenlängenbereichen von sichtbarem Licht, UV-Licht oder IR oder zur Detektion von radioaktiver Strahlung, oder zur Detektion von massenspektrometrisch vermessbaren Produkten bzw. Parametern, insbesondere mittels eines Scanners, I magers oder Massenspektrometers ausgelesen.
Weitere Eigenschaften und vorteilhafte Merkmale der Erfindung sind auch aus den nachfolgend gegebenen Ausführungsbeispielen ersichtlich.
In Figur 1 zeigen schematisch A und C ein Beispiel für den Stand der Technik und B und D ein Beispiel für die erfindungsgemäße Anordnung (Schrägansicht von oben, Ausschnitt aus einem Biochip; bei einem Mikropartikel ist die Oberfläche entsprechend vollständig/durchgängig mit einer Prüfsubstanz belegt).
Figur 1 A: Auf der Oberfläche eines Trägersubstrats (a) aus einer erstarrten Schmelze (Glas) befindet sich eine mittels Silanisierung abgeschiedene Zweikomponentenschicht (b und c) aus einem Silanderivat, das über das molekulare Silizium (b) mit dem Trägersubstrat verbunden ist und dem organischen Teil (c) des Silanderivats, welcher eine chemische Funktion bzw. Gruppe aufweist, an die in einem nachfolgenden Schritt eine oder mehrere Prüfsubstanzen (d) in Form eines Arrays angebunden sind. Die Areale (Spots) mit Prüfsubstanz/en sind von der organischen Schicht (c) umgeben, deren reaktive Gruppen nachfolgend blockiert werden.
Figur 1 B: Auf einem Halbleitersubstrat (e) mit den erfindungsgemäßen Merkmalen, z.B. auf einem Teil eines Silizium Wafers, ist eine erfindungsgemäße anorganische Isolatorschicht (f), z.B. eine Siliziumdioxidschicht, angeordnet, an bzw. in deren Oberfläche durch unmittelbare Wechselwirkung der Oberflächenmoleküle der
Isolatorschicht mit einer chemischen Funktion oder Gruppe (ausgenommen Silane und deren Derivate) einer Prüfsubstanz, z.B. mit einem Thiol, eine oder mehrere Prüfsubstanz/en (g) gemäß der Erfindung, z.B. Peptid/e mit einem vorzugsweise endständigen Cysteinrest, angekoppelt sind, z.B. als Array unterschiedlicher Prüfsubstanzen und/oder unterschiedlicher Mengen einer Prüfsubstanz, vorzugsweise als Replika. Beispielhaft befindet sich auf der linken Seite ein Replika aus zwei identischen Spots einer Prüfsubstanz, auf der rechten Seite ist ein Spot mit einer niedrigeren Konzentration derselben Prüfsubstanz (vorne) sowie ein Spot einer zweiten Prüfsubstanz (hinten) angeordnet. Die Areale (Spots) mit Prüfsubstanz/en sind von der anorganischen Isolatorschicht umgeben, die ggf. nachfolgend, z.B. mit einem Thiol oder Blockierungsreagens oder bei der erfindungsgemäßen Verwendung, z.B. durch Inkontaktbringen mit Körperflüssigkeit, blockiert wird.
Figur 1 C: Schematischer Querschnitt durch die Anordnung (Figur 1 A) im Bereich der angebundenen Prüfsubstanz/en. Die Anordnung umfasst eine großflächige organische Schicht aus Silanderivat (c), an die ortsadressiert die Prüfsubstanz/en (d) angebunden sind. Da die organische Schicht (c) in der Regel Kohlenwasserstoffverbindungen aufweist, kann es zu störenden Wechselwirkungen zwischen der organischen Schicht (c) und der/den Prüfsubstanz/en kommen.
Figur 1 D: Schematischer Querschnitt durch die erfindungsgemäße Anordnung (Figur 1 B) im Bereich der angekoppelten Prüfsubstanz/en. Die Prüfsubstanzen bzw. die unterschiedlichen lateralen Konzentration einer Prüfsubstanz haften direkt an den Oberflächenmolekülen der anorganischen Isolatorschicht (f) auf oder in der anorganischen Isolatorschicht (h).
In Figur 2 zeigen A und D ein Beispiel für die erfindungsgemäße Anordnung mit Glas als Trägersubstrat entsprechend der weiteren Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe, B und E ein Beispiel für eine besondere Ausführungsform der Erfindung, sowie C und F je ein Beispiel für die erfindungsgemäße Anordnung mit einem nicht in Wasser löslichen Feststoff als Substrat entsprechend der anderen Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe.
Figur 2 A: Auf einem Glassubstrat (a) mit den erfindungsgemäßen Merkmalen, z.B. auf einem Glaschip, ist eine erfindungsgemäße Glasoberflächenschicht (b), die nicht organisch oder metallisch modifiziert ist, angeordnet, an bzw. in deren Oberfläche durch unmittelbare Wechselwirkung der Oberflächenmoleküle der Isolatorschicht mit einer chemischen Funktion oder Gruppe (ausgenommen Silane und deren Derivate) einer Prüfsubstanz, z.B. mit einem Thiol, eine oder mehrere Prüfsubstanz/en (c) gemäß der Erfindung, z.B. Peptid/e mit einem vorzugsweise endständigen Cysteinrest, angekoppelt sind, z.B. als Array unterschiedlicher Prüfsubstanzen und/oder unterschiedlicher Mengen einer Prüfsubstanz, vorzugsweise als Replika. Beispielhaft befindet sich auf der linken Seite ein Replika aus zwei identischen Spots einer Prüfsubstanz, auf der rechten Seite ist ein Spot mit einer niedrigeren Konzentration derselben Prüfsubstanz (vorne) sowie ein Spot einer zweiten Prüfsubstanz (hinten) angeordnet. Die Areale (Spots) mit Prüfsubstanz/en sind von der Glasoberflächenschicht (b) umgeben, die ggf. nachfolgend, z.B. mit einem Thiol oder Blockierungsreagens oder bei der erfindungsgemäßen Verwendung, z.B. durch Inkontaktbringen mit Körperflüssigkeit, blockiert wird.
Figur 2 B: Auf einem Feststoff (d), der als Feststoff gemäß der weiteren Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe gebildet ist, insbesondere mit den erfindungsgemäßen Merkmalen, z.B. auf einem Kunststoff, ist Silizium (e), z.B. durch Bedampfung oder Besputtern der Feststoffoberfläche mit einem Silan, abgeschieden, das im Bereich seiner Oberfläche oxidiert ist, z.B. als natürliches Oxid vorliegt, so dass auf dem Feststoff eine Siliziumschicht (f) und eine darauf befindliche Siliziumdioxidschicht (g) angeordnet ist, an bzw. in deren Oberfläche durch unmittelbare Wechselwirkung der Oberflächenmoleküle der Isolatorschicht mit einer chemischen Funktion oder Gruppe (ausgenommen Silane und deren Derivate) einer Prüfsubstanz, z.B. mit einem Thiol, eine oder mehrere Prüfsubstanz/en (h) gemäß der Erfindung, z.B. Peptid/e mit einem vorzugsweise endständigen Cysteinrest, angekoppelt sind, z.B. als Array unterschiedlicher Prüfsubstanzen und/oder unterschiedlicher Mengen einer Prüfsubstanz, vorzugsweise als Replika. Beispielhaft befindet sich auf der linken Seite ein Replika aus zwei identischen Spots einer Prüfsubstanz, auf der rechten Seite ist ein Spot mit einer niedrigeren Konzentration derselben Prüfsubstanz (vorne) sowie ein Spot einer zweiten Prüfsubstanz (hinten) angeordnet. Die Areale (Spots) mit Prüfsubstanz/en sind von der Siliziumdioxidschicht (g) umgeben, die ggf. nachfolgend, z.B. mit einem Thiol oder Blockierungsreagens oder bei der erfindungsgemäßen Verwendung, z.B. durch Inkontaktbringen mit Körperflüssigkeit, blockiert wird.
Figur 2 C: Auf einem erfindungsgemäßen Feststoff (i), z.B. auf einem Kunststoff, ist eine Siliziumoxidschicht 0), z.B. durch Abscheidung von Siliziumdioxid (z.B. aus einem Plasma), angeordnet, an bzw. in deren Oberfläche durch unmittelbare Wechselwirkung der Oberflächenmoleküle der Siliziumdioxidschicht mit einer chemischen Funktion oder Gruppe (ausgenommen Silane und deren Derivate) einer Prüfsubstanz, z.B. mit einem Thiol, eine oder mehrere Prüfsubstanz/en (k) gemäß der Erfindung, z.B. Peptid/e mit einem vorzugsweise endständigen Cysteinrest, angekoppelt sind, z.B. als Array unterschiedlicher Prüfsubstanzen und/oder unterschiedlicher Mengen einer Prüfsubstanz, vorzugsweise als Replika. Beispielhaft befindet sich auf der linken Seite ein Replika aus zwei identischen Spots einer Prüfsubstanz, auf der rechten Seite ist ein Spot mit einer niedrigeren Konzentration derselben Prüfsubstanz (vorne) sowie ein Spot einer zweiten Prüfsubstanz (hinten) angeordnet. Die Areale (Spots) mit Prüfsubstanz/en sind von der Siliziumdioxidschicht (j) umgeben, die ggf. nachfolgend, z.B. mit einem Thiol oder Blockierungsreagens oder bei der erfindungsgemäßen Verwendung, z.B. durch Inkontaktbringen mit Körperflüssigkeit, blockiert wird.
Figur 2 D: Schematischer Querschnitt durch die erfindungsgemäße Anordnung (Fig. 2 A) im Bereich der angekoppelten Prüfsubstanz/en. Die Prüfsubstanzen bzw. die unterschiedlichen Mengen einer Prüfsubstanz haften direkt an den Oberflächenmolekülen der Glasoberflächenschicht (b) auf oder in der Glasoberflächenschicht (k).
Figur 2 E: Schematischer Querschnitt durch die erfindungsgemäße Anordnung (Fig. 2 B) im Bereich der angekoppelten Prüfsubstanz/en. Die Prüfsubstanzen bzw. die unterschiedlichen Mengen einer Prüfsubstanz haften direkt an den Oberflächenmolekülen der Siliziumdioxidschicht (g) auf oder in der Siliziumdioxidschicht (I).
Figur 2 F: Schematischer Querschnitt durch die erfϊndungsgemäße Anordnung (Fig. 2 C) im Bereich der angekoppelten Prüfsubstanz/en. Die Prüfsubstanzen bzw. die unterschiedlichen Mengen einer Prüfsubstanz haften direkt an den Oberflächenmolekülen der Siliziumdioxidschicht (j) auf oder in der Siliziumdioxidschicht (m).
Figur 3 zeigt schematisch Querschnitte (entsprechend Figur 1 D) von typischen
Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Anordnung. Die Schraffierung/Muster des Halbleitersubstrats, der anorganischen Isolatorschicht und der angekoppelten Prüfsubstanz/en ist entsprechend Figur 1 D. Gemäß der anderen und der weiteren Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe (entsprechend den Figuren 2 A oder C) entspricht die grob schraffierte Fläche der Figuren 3 A-G dem Querschnitt des Glassubstrats bzw. des Feststoffs und die fein schraffierte/n Fläche/n dem/den Querschnitt/en der Glasoberflächenschicht/en bzw. der Siliziumdioxidschicht/en.
Figur 3 A zeigt eine Anordnung, bei der die Oberfläche des Halbleitersubstrats vollständig mit einer anorganischen Isolatorschicht, vorzugsweise einheitlicher Dicke/Höhe, belegt ist.
Figur 3 B zeigt eine Anordnung bei der zwei Seiten des Halbleitersubstrats (Oberseite und Unterseite) mit einer anorganischen Isolatorschicht der Dicke/Höhe x, z.B. einer Siliziumdioxidschicht, belegt sind und wenigstens zwei Seiten mit einer anorganischen Isolatorschicht, z.B. einer Siliziumdioxidschicht, der Dicke/Höhe ≤ x belegt sind, z.B. eine Anordnung mit einem Chip der aus einem thermisch oxidierten Silizum-Wafer mit einer Oxiddicke > 4 nm gesägt ist und an dessen Seitenflächen ein natürliches Siliziumoxid ≤ 4 nm gebildet ist.
Figur 3 C zeigt eine Anordnung bei dem das Halbleitersubstrats nicht vollständig mit der anorganischen Isolatorschicht bedeckt ist, an die ortsadressiert wenigstens zwei Prüfsubstanzen bzw. wenigstens zwei unterscheidlche Mengen einer Prüfsubstanz angekoppelt sind.
Figur 3 D zeigt eine Anordnung bei der wenigstens zwei räumlich getrennte anorganische Isolatorschichten in der Oberfläche das Halbleitersubstrats gebildet sind, an die ortsadressiert jeweils wenigstens zwei Prüfsubstanzen bzw. wenigstens zwei unterschiedliche Mengen einer Prüfsubstanz angekoppelt sind.
Figur 3 E zeigt eine Anordnung bei der wenigstens zwei räumlich getrennte anorganische Isolatorschichten in der Oberfläche das Halbleitersubstrats gebildet sind, an die jeweils eine von wenigstens zwei Prüfsubstanzen bzw. jeweils eine Menge von wenigstens zwei unterscheidlichen Mengen einer Prüfsubstanz angekoppelt ist, wobei die Flächen der anorganische Isolatorschichten größer (links) und/oder identisch (rechts) mit der mit Prüfsubstanz beaufschlagten Fläche sind. Figur 3 F zeigt eine Anordnung bei der wenigstens zwei räumlich getrennte anorganische Isolatorschichten auf der Oberfläche des Halbleitersubstrats gebildet sind, an die ortsadressiert jeweils wenigstens zwei Prüfsubstanzen bzw. wenigstens zwei unterschiedliche Mengen einer Prüfsubstanz gekoppelt sind.
Figur 4 zeigt schematisch besondere Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Anordnung. Die Schraffierung/Muster des Halbleitersubstrats, der anorganischen Isolatorschicht und der angekoppelten Prüfsubstanz/en ist entsprechend Figur 1 D. Gemäß der anderen und der weiteren Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe (entsprechend den Figuren 2 A oder C) entspricht die grob schraffierte Fläche der Figuren 3 A-G dem Querschnitt des Glassubstrats bzw. des Feststoffs und die fein schraffierte/n Fläche/n dem/den Querschnitt/en der Glasoberflächenschicht/en bzw. der Siliziumdioxidschicht/en.
Figur 4 A zeigt einen Querschnitt durch eine Anordnung mit Vertiefungen in der Oberfläche, wobei die Prüfsubstanz/en an und/oder in den Vertiefungen, die z.B. als Hohlzylinder, als Hohlkegel, als Nuten oder als eine Kombination daraus gebildet sind, gekoppelt sind.
Figur 4 B zeigt einen Querschnitt durch eine Anordnung mit durchgängigen Aussparungen in dem Halbleitersubstrat, die z.B. als Bohrung oder Kanäle gebildet sind, wobei die Prüfsubstanz/en an und/oder in den Aussparungen, gekoppelt sind.
Figur 4 C zeigt eine Aufsicht auf eine Anordnung gemäß Figur 4 A.
Figur 4 D zeigt eine Aufsicht auf eine Anordnung gemäß Figur 4 B.
Unterschiedlichste Ausführungsformen der Erfindung wurden getestet, die im Folgenden anhand von nicht erschöpfenden Beispielen gemäß den Figuren 5-15 erläutert werden.
Als Halbleitersubstrat wurde Silizium in unterschiedlichen Ausführungsformen (einkristallines Silizium mit einer {111}, {100} oder {110} Orientierung, polykristallines Silizium oder amorphes Silizium, das p- (mit Bor) oder n- (mit Phosphor, Antimon oder Arsen) oder nicht dotiert war und einen elektrischen Widerstand abhängig von der Dotierung aufwies, wobei die Oberfläche des Sililziums atomar glatt, rau, poliert, nicht poliert, oder porös gebildet war) verwendet, wobei das Silizium entweder als Wafer oder als Teil davon gebildet war oder auf unterschiedlichen Feststoffen (Plastik, Holz, Metalle (z.B.Aluminium) oder Glas) abgeschieden war. Als Glassubstrat gemäß der anderen Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe wurden Objektträger aus Glas und als Feststoff gemäß der weiteren Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe wurden Kunststoffträger oder Polymerfolien verwendet.
Als anorganische Isolatorschicht wurde Siliziumdioxid in verschiedenen Ausgestaltungen verwendet, das als natives oder thermisches Oxid unterschiedlicher Dicke auf bzw. aus dem Silizium gebildet war, als Glasoberflächenschicht gemäß der anderen Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe wurden nicht organisch oder metallisch modifizierte Oberflächen von Glas-Objektträgern verwendet, und als Siliziumoxidschicht gemäß der weiteren Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe wurden auf dem Feststoff abgeschiedene Siliziumoxidschichten verwendet. Als anorganische Isolatorschicht für die erfindungsgemäße Anordnung hat sich dabei überraschenderweise eine Schicht aus Siliziumdioxid mit einer Dicke > 4 nm, die insbesondere als thermisch erzeugtes Oxid gebildet war, als besonders vorteilhaft erwiesen.
Die mit Prüfsubstanzen zu beschichtenden Oberflächen wurden entweder aufeinanderfolgend mit einem organischen Lösungsmittel und einem wässerigen Lösungsmittel bzw. wässeriger Lösung in Kontakt gebracht, oder wurden mit einem Gemisch mit einem organischen und einem wässerigen Lösungsmittel in Kontakt gebracht, oder waren nicht behandelt. Für die Herstellung von Arrays wurden die mit Flüssigkeit beaufschlagten Oberflächen getrocknet.
Als Prüfsubstanzen wurden insbesondere Peptide, Proteine, Oligonukleotide oder kleine (Molmasse > 75 und < 2000 g/mol) organische Moleküle verwendet, die gelöst in Wasser oder einer wässerigen Lösung, jeweils mit oder ohne Zusatz eines organischen Lösungsmittles vorlagen. Die Lösungen der Prüfsubstanzen wurden entweder mittels einer Pipette, eines Pipettierautomaten oder eines Arrayers auf die anorgansiche Isolatorschicht oder die Glasoberglächenschicht oder die Siliziumoxidschicht aufgebracht, oder die jeweilige zu beschichtende Oberfläche wurde mit der Lösung der Prüfsubstanz/en benetzt oder vollständig gebadet. Für die Herstellung von Sandwichanordnungen, z.B. Biotin/Streptavidin/biotinylierte Prüfsubstanz, wurde die Oberfläche aufeinanderfolgend mit den verschiedenen Bestandteilen der Sandwichanordnung beaufschlagt, z.B. größflächig mit Thio-Biotin und Streptavidin, und anschließend ortsadressiert mit biotinlyierten Peptiden, Proteinen oder Oligonukleotiden, z.B. als Array.
Überschüssige, d.h. nicht gekoppelte, Prüfsubstanz wurde ggf. nachfolgend durch Waschen von der Oberfläche entfernt und/oder die nicht mit Prüfsubstanz belegten Bereiche der Oberfläche wurden mittels Blockierungsreagenz, z.B. Blockierungspuffer und/oder einem Nukleophil, z.B. Thiol, blockiert.
Überschüssiges Blockierungsreagens wurde ggf. durch Waschen von der Oberfläche entfernt und/oder die Oberfläche der Anordnung getrocknet.
Nachfolgend erfolgte die Inkubation der Anordnung mit wenigstens einer Lösung, die wenigstens eine zumindest teilweise gelöste Testsubstanz enthielt, insbesondere Peptide, Proteine, Oligonukleotide, Zellkompartimente, Zellen und/oder kleine (Molmasse > 75 und < 2000 g/mol) organische Moleküle, wobei die Lösung mit der Testsubstanz ggf. nach der Inkubation von der Oberfläche entfernt wurde und/oder die Oberfläche gewaschen und/oder getrocknet wurde.
Ggf. wurde die Anordnung nachfolgend mit einer gelösten markierten Sonde, z.B. einem Farbstoff-markierten Sekundärantikörper, inkubiert, welcher ggf. im Anschluss von der Oberfläche entfernt wurde und/oder die Oberfläche der Anordnung gewaschen und/oder getrocknet.
Die Auswertung der Anordnungen erfolgte mit Hilfe eines Imagers, eines Scanners oder eines MALDI-Massensprektrometres. Figur 5 zeigt bspw. das Aufspotten (Pipetieren mittels eines Pipettierautomaten) von biotinyliertem Cystein (d.h. Biotin, dass über seine Carboxylgruppe als Amid mit der Aminogruppe von L-Cystein verbunden ist), (1 mM, 0,1 mM und 0,01 mM gelöst in Natriumphosphatpuffer pH 7,4, 1% v/v NMP) auf gesägten Si-Wafer (p-dotiert, Bor, 111 -Orientierung, Größe 75mm x 25mm x 1mm+- 0,1mm, polierte Seite, thermisches Oxid 1000 A+-70, Spotdurchmesser ca. 1mm).
Figur 6 zeigt bspw. aufgespottetes biotinyliertes Cystein (1 mM, 0,1 mM, 0,01 mM) auf gesägtem Si-Wafer (p-dotiert, Bor, 111-Orientierung, Größe 75mm x 25mm x 1mm+- 0,1mm, unpolierte Seite, thermisches Oxid 1000 A+-70, Spotdurchmesser ca. 1mm).
Figur 7 zeigt bspw aufgespottetes biotinyliertes Cystein (1mM, 0,1mM, 0,01mM) auf gesägtem Si-Wafer (p-dotiert, Bor, 111-Orientierung, Größe 75mm x 25mm x 1mm+- 0,1mm), unpolierte Seite, thermisches Oxid 1000 A+-70, Spotdurchmesser ca. 1mm, nach der Inkubation mit HRP-markiertem Streptavidin und Sichtbarmachen mit Luminol an einem Lumi-Imager zeigt Signale, die abhängig von der Konzentration der aufgebrachten Prüfsubstanz sind.
Figur 8 zeigt bspw. aufgespottetes biotinyliertes Cystein (1mM, 0,1mM, 0,01mM) auf gesägten Si-Wafer (p-dotiert, Bor, 111-Orientierung, Größe 75mm x 25mm x 1mm+- 0,1mm), unpolierte Seite, thermisches Oxid 1000 A+-70, Spotdurchmesser ca. 1mm, nach Langzeitest, inkubiert nach 3 Monaten mit HRP-markiertem Streptavidin und Sichtbarmachen mit Luminol am Lumi-Imager, Lagerung bei 25°C, 4°C und -2O0C (von oben nach unten).
Figur 9 zeigt bspw. gespottete Tab2-Peptide (in 0,1 M TBS-Puffer, der Konzentrationen 1M, 0,1 M, 0,01M) N-terminal mit Cystein verlängert (Kolonnen1-6; Kolonnen 7-9 ohne Verlängerung) inkubiert mit Antikörpersandwich nach 30 Tagen, auf gesägten Si-Wafer (p-dotiert, Bor, 111-Orientierung, Größe 75mm x 25mm x 1mm+- 0,1mm), unpolierte Seite, thermisches Oxid 1000 A+-70, Spottdurchmesser ca. 1mm, oberes Bild detektiert am Lumi-Imager mit HRP-markiertem Antikörper, unteres Bild detektiert am Affymetrix Scanner mit Fluoreszensfarbstoff- markiertem Antikörper. Figur 10 zeigt schematisch Beispiele von Prüfsubstanzen (Cystein-Biotin, Protein (Streptavidin), Peptid (Antikörperepitop)), die großflächig an die Oberfläche von quadratischen Silizium-Chips angekoppelt und mittels derer nachfolgend Testsubstanzen (Streptavidin, Biotin und monoklonaler Antikörper) aus einer Testlösung mittels Chemilumineszenz nachgewiesen werden (oben, der nicht leuchtende Chip ist die Negativkontrolle).
Figur 11 zeigt schematisch die ortsadressierte Anbindung von Biotin auf einer anorganischer Isolatorschicht auf einem Halbleitersubstrat (dreieckig). Dazu wird eine Biotin-Cystein-Lösung auf die Isolatorschicht pipettiert und anschließnd mit
HRP-markiertem Streptavidin nachgeweisen. Die Chemolumineszenz-Signale sind identisch mit den
Pipettierungsstellen. Dadurch wird deutlich wie einfach und gezielt die Funktionalisierung der Oberfläche erfolgen kann sowie der weitere Vorteil des Chips, nämlich dass der einfach für die Verwendung für Sandwich-Immobilisierungen (z.B.
Biotin-Streptavidin-biotinylierter Antikörper) nutzbar ist.
Figur 12 zeigt schematisch die ortsadressierte Kopplung von Peptiden auf einer anorganischer Isolatorschicht auf einem Halbleitersubstrat und den Vergleich zwischen einem Cystein-markierten Epitop (Tab2), in Lösung aufpipettiert, und dem gleichen, unmarkierten Peptid. Nachfolgend wird mit Primärantikörper inkubiert und mit HRP-markiertem Sekundärantikörper gescreent, und die spezifische Anbindung von Molekülen sowie die Eignung für Immunoassays wird deutlich.
Figur 13 zeigt schematisch die ortsadressierte Anbindung von Anbindung auf einer auf einem Halbleitersubstrat gebildeten anorganischen Isolatorschicht. Lösungen von HRP-markiertem Streptavidin in unterschiedlichen Konzentrationen werden auf dielsolatorschicht pipettiert und, nach Benetzung der Oberfläche mit Peroxidase-Substrat, die Chemolumineszenz vermessen, wobei Signale sichtbar werden, die abhängig von der Konzentration/Menge des angekoppelten Proteins sind. Somit wird die einfache Herstellung der erfidungsgemäßen Anordnung als Proteinchip durch Funktionalisierung mit Proteinen deutlich sowie die damit verbundenen Vorteile, nämlich dass verschiedenste Parameter messbar und Affinitäten bestimmbar sind.
Figur 14 zeigt erfindungsgemäße Anordnungen, die als Oligonukleotid-Microarrays hergestellt sind und für den Nachweis von Oligonukleotiden nutzbar sind.
A) Dazu werden farbstoffmarkierte Oligonukleotide mit verschieden Linkern auf oxidierten Si-Wafern (p-dotiert, Bor, 111-Orientierung, thermisches Oxid 1000 A+-
70), gekoppelt und mittels eines Affymetrix-Scanners ausgelesen
4ergruppe 1 : Hydrazinmodifiziertes Oligo SES, Cy3 gelabelt + C6-SFB (macht aldehydende)
4ergruppe 2: Hydrazinmodifiziertes Oligo SES, Cy3 gelabelt
4ergruppe 3: Hydrazinmodifiziertes Oligo SMS, Cy3 gelabelt + C6-SFB (macht aldehydende)
4ergruppe 4: Hydrazinmodifiziertes Oligo SMS, Cy3 gelabelt B) Farbstoffmarkierte Oligonukleotide mit verschieden Linkern werden auf oxidierten
Si-Wafern (p-dotiert, Bor, 111-Orientierung,Termisches Oxid 1000 A+-70, gekoppelt und mittels Affymetrix-Scanner ausgelesen
4ergruppe 1 : Aminomodifiziertes Oligo SES, Cy5 gelabelt + C6-SFB (macht aldehydende) 4ergruppe 2: Aminomodifiziertes Oligo SES, Cy5 gelabelt + C6-SANH (macht
Hydrazinende)
4ergruppe 3: Aminomodifiziertes Oligo SES, Cy5 gelabelt
4ergruppe 4: Aminomodifiziertes Oligo SMS, Cy5 gelabelt + C6-SFB (macht aldehydende) 4ergruppe 5: Aminomodifiziertes Oligo SMS, Cy5 gelabelt + C6-SANH (macht
Hydrazinende)
4ergruppe 6: Aminomodifiziertes Oligo SMS, Cy5 gelabelt
4ergruppe 7: Aminomodifiziertes Oligo ESE, Cy5 gelabelt + C6-SFB (macht aldehydende) 4ergruppe 8: Aminomodifiziertes Oligo ESE, Cy5 gelabelt + C6-SANH (macht
Hydrazinende)
4ergruppe 9: Aminomodifiziertes Oligo ESE1 Cy5 gelabelt
4ergruppe 10: Aminomodifiziertes Oligo MEM1 Cy5 gelabelt + C6-SFB (macht aldehydende) 4ergruppe 11 : Aminomodifiziertes Oligo MEM, Cy5 gelabelt + C6-SANH (macht Hydrazinende)
4ergruppe 12: Aminomodifiziertes Oligo MEM, Cy5 gelabelt 4ergruppe 13: Thiolmodifiziertes Oligo SES, Cy5 gelabelt 4ergruppe 14: Thiolmodifiziertes Oligo SMS, Cy5 gelabelt 4ergruppe 15: Biotinmodifiziertes Oligo SES, Cy5
4ergruppe 16: Biotinmodifiziertes Oligo SMS, Cy5
4ergruppe 17: Hazwo-0
4ergruppe 18: Wasser Es zeigt sich eine spezifische Anbindung der Oligonukleotide und nachfolgend eine spezifische Bindung und Nachweis von gelösten Oligonukleotiden als Testsubstanzen.
Alle in der vorangehenden Beschreibung, den nachfolgenden Ansprüchen und den Abbildungen dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.
Diese und andere Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung können vom Durchschnittsfachmann ausgeführt werden, ohne den Umfang und die
Reichweite der vorliegenden Erfindung zu verlassen, die in den beigefügten
Ansprüchen noch genauer dargelegt ist. Zusätzlich dazu sollte es selbstverständlich sein, dass Aspekte der verschiedenen Ausführungen sowohl zur Gänze als auch in
Teilen ausgetauscht werden können. Darüber hinaus wird der Durchschnittsfachmann anerkennen, dass die vorangegangene Beschreibung nur als
Beispiel dient und es nicht beabsichtigt ist, die Erfindung zu beschränken, so wie sie in den Ansprüchen definiert ist.
Nachdem die Erfindung auf diese Weise beschrieben wurde, ist es ersichtlich, dass sie auf viele Arten variiert werden kann. Derartige Variationen sind nicht als Abweichung vom Grundgedanken und Schutzumfang der Erfindung anzusehen, und alle Modifizierungen, wie sie dem Fachmann ersichtlich sind, sollen im Schutzumfang der folgenden Ansprüche enthalten sein.

Claims

Patentansprüche
1. Anordnung zum spezifischen Erfassen von Substanzen aus einer Probe, insbesondere zum Erfassen von Assoziationsereignissen, welche ein Trägersubstrat und eine auf dem Trägersubstrat gebildete
Anbindungsschicht und eine an die Anbindungsschicht gekoppelte Prüfsubstanz aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägersubstrat ein Halbleitersubstrat (1) ist und die Anbindungsschicht mindestens eine auf dem Halbleitersubstrat gebildete anorganische Isolatorschicht
(2) ist, wobei auf und/oder in der Isolatorschicht (2) mindestens ein Bereich (3) mit mindestens einem Medium (4) und mit mindestens einer organischen Prüfsubstanz (5) beaufschlagt ist, und in dem mindestens einen beaufschlagten Bereich (3) zwischen der Isolatorschicht (2) und der mindestens einen Prüfsubstanz (5) eine Kopplung besteht, und die an die Isolatorschicht (2) gekoppelte Prüfsubstanz (5) geeignet ist, mit einer
Testsubstanz wechselzuwirken.
2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
-in dem mindestens einen beaufschlagten Bereich (3) zwischen der Isolatorschicht (2) und der mindestens einen Prüfsubstanz (5) eine direkte Kopplung ohne Zwischenschicht besteht; und/oder
-die an die Isolatorschicht (2) gekoppelte Prüfsubstanz (5) mit wenigstens einer durch Strahlung und/oder Ionisierung nachweisbaren Testsubstanz wechselwirkt, wodurch Assoziationsereignisse massenspektrometrisch oder durch Detektion von Strahlung auf und/oder in der Isolatorschicht (2), vorzugsweise in dem mindestens einen Bereich (3), mittels eines Detektors erfassbar sind.
3. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass -in dem mindestens einen beaufschlagten Bereich (3) zwischen der Isolatorschicht (2) und der mindestens einen Prüfsubstanz (5) eine an Luft und in Flüssigkeiten stabile, direkte Kopplung ohne silanisierte oder polymerisierte bzw. quervernetzte (z.B. Polyvinyl, Cellulose) Zwischenschicht besteht; und/oder -das Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) in den üblichen Abmessungen eines Biochips oder eines Partikels, insbesondere eines Mikropartikels oder Nanopartikels, gebildet ist; und/oder
-das Halbleitersubstrat (1) als amorphes, polykristallines Silizium oder einkristallines Silizium, insbesondere mit einer {111}- oder {100}- oder {110}- Vorzugsorientierung, gebildet ist; und/oder
-die anorganische Isolatorschicht (2) als Siliziumnitrid- oder als Siliziumdioxidschicht (7) gebildet ist; und/oder
-der mindestens eine Bereich (3) als mindestens zwei nicht-silanisierte Bereiche/Bezirke (3; 8) auf der Isolatorschicht gebildet ist, die mit dem mindestens einen Medium (4) und der mindestens einen Prüfsubstanz (5) beaufschlagt sind; und/oder
-das mindestens eine Medium (4) wenigstens ein Lösungsmittel (9) umfasst oder als wenigstens ein Lösungsmittel (9) gebildet ist; und/oder -die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5) als mindestens zwei unterschiedliche Prüfsubstanzen (5; 11) gebildet sind, wobei die Prüfsubstanz oder Prüfsubstanzen insbesondere aus Molekülen mit wenigstens einem Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff, Phosphor-, Halogen-, Farbstoff oder radioaktiven Isotop gebildet sind oder diese umfassen; und/oder -die an die Isolatorschicht (2) gekoppelte Prüfsubstanz (5) mit wenigstens einer durch Strahlung und/oder Ionisierung nachweisbaren Testsubstanz wechselwirkt, wodurch Assoziationsereignisse massenspektrometrisch oder durch Detektion von Strahlung auf und/oder in der Isolatorschicht (2) vorzugsweise in dem mindestens einen Bereich (3) mittels eines extern angeordneten Detektors nachweisbar erfassbar sind; und/oder -die auf und/oder in einem Bereich (3) erfassbaren Signale, vorzugsweise durch Strahlung und/oder durch massenspektrometrische Kenngrößen, von auf und/oder in einem mindestens weiteren Bereich (8) und/oder auf und/oder in dem Umgebungsbereich (10) erfassbaren Signalen unterscheidbar sind.
4. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
- die Anordnung als vorzugsweise planarer Biochip zum optischen oder szintigraphischen Erfassen von Assoziationsereignissen mittels eines externen Detektors gebildet ist; und/oder
-das Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) in den üblichen Abmessungen eines Objekträgers oder eines Objektträgereinsatzes gebildet ist; und/oder
-das Halbleitersubstrat (1) zumindest teilweise p- und/oder n-dotiert ist, insbesondere mit einem elektrischen Widerstand von < 15 Ohm / cm2; und/oder
-die Siliziumdioxidschicht (7) zumindest teilweise, insbesondere in dem mindestens einen Bereich (3; 8) als trockenes und/oder thermisches Oxid oder als trockenes und/oder thermisches Nitrid gebildet ist; und/oder
-die mindestens zwei nicht-silanisierten Bereiche (3; 8) wenigstens teilweise von einem auf und/oder in der Isolatorschicht (2) gebildeten Umgebungsbereich (10) umgeben sind; und/oder
-das Medium (4) elektrisch leitend ist, vorzugsweise mit einem Leitwert von
> 0,05 μS/cm; und/oder
-das wenigstens eine Lösungsmittel (9) als wässeriges und/oder organisches Lösungsmittel, insbesondere als hydrophiles und/oder polares Lösungsmittel gebildet ist; und/oder
-die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5) wenigstens eine nukleophile
Gruppe bzw. Funktion, insbesondere eine Thiol-, Amino-, Hydroxyl-, Carboxyl-,
Cyano-, Nitril-, Si-, Se-, Te-, Sulfat, Sulfid, endständige Alken- oder Alkin-, oder Phosphan-Gruppe, oder ein daraus gebildetes Reaktionsprodukt aufweist.
5. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
-das Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) in den Abmessungen Länge x Breite = (7,5 +/- 1) cm x (2,5 cm +/- 0,5 cm) gebildet ist; und/oder -das Halbleitersubstrat (1) als Silzium-Wafer oder als Teil davon gebildet ist; und/oder -die anorganische Isolatorschicht (2) als eine Siliziumdioxidschicht (7) mit einer Dicke von > 4 nm oder > 5 nm, vorzugsweise > 10 nm, besonders bevorzugt > 30 nm, insbesondere 100 nm (+/- 70 nm) gebildet ist; und/oder
-die wenigstens zwei nicht-silanisierten Bereiche (3; 8) jeweils mit einer anderen Konzentration der mindestens einen Prüfsubstanz (5) oder jeweils mit einer anderen der wenigstens zwei Prüfsubstanzen (5; 11) beaufschlagt sind; und/oder -das Medium (4) Wasser bzw. ein organisches Lösungsmittel mit saurem oder basischen pH-Wert, einen Elektrolyten und/oder einen Puffer umfasst; und/oder -das mindestens eine Lösungsmittel (9) ein organische Lösungsmittel aus Molekülen mit wenigstens einem Stickstoff-, Sauerstoff-, Halogenatom und/oder einer Ringstruktur umfasst oder als ein solches Lösungmittel gebildet ist; und/oder -der Umgebungsbereich (10) die wenigstens zwei nicht-silanisierten Bereiche (3; 8) vollständig umgibt; und/oder -die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5) als Linkermolekül, Aminosäure, Kohlenhydrat, Lipid, Farbstoff, Pharmakon, Biotin, Peptid, Polypeptid, Oligonukleotid, Protein, Zellkompartiment, Zelle oder davon abgeleitete Struktur bzw. Reaktionsprodukt gebildet ist oder diese enthält.
6. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
-das Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) in einer Dicke von > 0,3 mm, insbesondere von 1 mm (+/- 0,7 mm) gebildet ist; und/oder
-das Halbleitersubstrat (1) homogen gebildet ist; und/oder
-die Siliziumdioxidschicht (7) produktionsbedingt eine blaue und/oder rote Färbung aufweist; und/oder
-die wenigstens zwei nicht-silanisierten Bereiche (3; 8) als Spots, insbesondere als räumlich voneinander getrennte und/oder ortsadressierte Spots gebildet sind; und/oder
-das Medium (4) als ein Gemisch aus einem wässerigem und organischen Lösungsmittel gebildet ist; und/oder
-das mindestens eine Lösungsmittel (9) als Alkohol, Dimethylalkylsäureamid,
Alkylhalogenid, Pyrollidon, Furan oder eines ihrer Derivate gebildet ist oder diese enthält; und/oder
-der Umgebungsbereich (10) als Siliziumdioxid gebildet ist und/oder chemisch, insbesondere mit organischen Molekülen, modifiziert ist; und/oder -die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5) als DNA, RNA, cDNA, rnRNA, cRNA, PNA, Rezeptor, Ligand, Protein A, Protein G, Streptavidin, Antikörper oder davon abgeleitete Struktur gebildet ist oder diese enthält.
7. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
-das Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) als ein oxidierter
Silzium-Wafer oder als ein Teil davon gebildet ist; und/oder
-die wenigstens zwei nicht-silanisierten Bereiche (3; 8) als Array, insbesondere als Microarray und/oder Low-Density-Array, gebildet sind; und/oder
-das mindestens eine Lösungsmittel (9) als Ethanol, DMF, Dichlormethan, NMP, THF oder eines ihrer Derivate gebildet ist oder diese enthält; und/oder
-der Umgebungsbereich (10) durch Beaufschlagung mit Blockierungsreagens oder einer nukleophilen Verbindung modifiziert ist; und/oder -die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5) als Peptid aus L- und/oder D-
Aminosäuren, insbesondere Gen-codierten Aminosäuren und/oder deren
Modifikationen, gebildet ist oder diese enthält.
8. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
-das Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) aus einem zumindest teilweise polierten Silzium-Wafer oder aus einem Teil davon gebildet ist; und/oder
-der mindestens eine Bereich (3; 8) mit der mindestens einen Prüfsubstanz (5; 11) , die in dem mindestens einen Medium (4) zumindest teilweise gelöst ist, beaufschlagt ist, insbesondere mit einem Gemisch beinhaltend wässerige Pufferlösung, organisches Lösungsmittel und gelöste Prüfsubstanz; und/oder -der Umgebungsbereich (10) durch Beaufschlagung mit einem Thiol, insbesondere Mercaptoethanol oder Cystein modifiziert ist; und/oder -die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5) als Linkermoleküle mit freien/ungebundene chemisch reaktiven Gruppen gekoppelt ist; und/oder -die mindestens eine Prüfsubstanz (5; 8) im wesentlichen räumlich gerichtet an die lolatorschicht (2) gekoppelt ist.
9. Verfahren zur Herstellung einer Anordnung zum spezifischen Erfassen von Substanzen aus einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Bereich (3) einer auf einem Halbleitersubstrat (1) gebildeten anorganischen Isolatorschicht (2) mit mindestens einem Medium (4) und mit mindestens einer organischen Prüfsubstanz (5) beaufschlagt wird, und es infolge von
Wechselwirkungen zwischen der organischen Prüfsubstanz (5) und der anorganischen Isolatorschicht (2) zu einer Kopplung zwischen der organischen
Prüfsubstanz (5) und der anorganischen Isolatorschicht (2) kommt, und der Bereich
(3) ausgebildet ist, um mit einer Testsubstanz wechselzuwirken und/oder bei Aufbringen einer Testsubstanz mit dieser wechselwirkt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein nicht-silanisierter Bereich (3) mit dem mindestens einen Medium (4) und mit der mindestens einen organischen Prüfsubstanz (5) beaufschlagt wird, so dass die organische Prüfsubstanz im Bereich (3) ohne silanisierte Zwischenschicht an und/oder in der Isolatorschicht (2) gekoppelt wird und für die Wechselwirkung mit einer Testsubstanz einsetzbar ist und/oder in dem mindestens einen beaufschlagten Bereich (3) zwischen der Isolatorschicht (2) und der mindestens einen Prüfsubstanz (5) eine an Luft und in Lösungen stabile direkte Kopplung ohne silanisierte oder polymerisierte/quervemetzte (z.B. Polyvinyl,
Cellulose) Zwischenschicht ausgebildet wird und/oder die an die Isolatorschicht (2) gekoppelte Prüfsubstanz (5) mit wenigstens einer weiteren Prüfsubstanz (12) beaufschlagt wird und es infolge von Wechselwirkungen zwischen der Prüfsubstanz (5) und der weiteren Prüfsubstanz (12) zu einer
Anbindung der weiteren Prüfsubstanz (12) an die Prüfsubstanz (5) kommt , so dass die Prüfsubstanz (5) durch die Anbindung mit der weiteren Prüfsubstanz (12) modifiziert ist und/oder die an die Isolatorschicht (2) gekoppelte Prüfsubstanz (5) mit wenigstens einer durch
Strahlung und/oder Ionisierung nachweisbaren Testsubstanz wechselwirkt, wodurch
Assoziationsereignisse massenspektrometrisch oder durch Detektion von Strahlung auf und/oder in der Isolatorschicht (2) vorzugsweise in dem mindestens einen Bereich (3) mittels eines Detektors erfassbar sind.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9-10, dadurch gekennzeichnet, dass -der mindestens eine Bereich (3) mit mindestens einem Medium (4) und mit mindestens einer organischen Prüfsubstanz (5) direkt beaufschlagt wird; und/oder -ein Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) in den üblichen Abmessungen eines Biochips oder als Partikel, insbesondere in den Abmessungen eines Mikropartikels oder Nanopartikels, verwendet wird; und/oder -als Halbleitersubstrat (1) kristallines Silizium, vorzugsweise amorphes oder polykristallines Silizium oder einkristallines Silizium, insbesondere mit einer [111]- oder [100]- oder [110]-Vorzugsorientierung verwendet wird; und/oder -als anorganische Isolatorschicht (2) eine Siliziumnitrid- oder Siliziumdioxidschicht (7) verwendet wird; und/oder - mindestens zwei nicht-silanisierte Bereiche (3; 8) auf der Isolatorschicht mit dem mindestens einen Medium (4) und der mindestens einen Prüfsubstanz (5) beaufschlagt werden; und/oder
-als Medium (4) wenigstens ein Lösungsmittel (9) oder ein ein Lösungsmittel umfassendes Medium verwendet wird; und/oder -als organischen Prüfsubstanz (5) mindestens zwei Prüfsubstanzen (5; 11) und/oder Moleküle mit wenigstens einem Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff, Phosphor- oder Halogen verwendet werden; und/oder
-die an die Isolatorschicht (2) gekoppelte Prüfsubstanz (5) mit wenigstens einer durch Strahlung und/oder Ionisierung nachweisbaren Testsubstanz wechselwirkt, wodurch Assoziationsereignisse massenspektrometrisch oder durch Detektion von Strahlung auf und/oder in der Isolatorschicht (2) vorzugsweise in dem mindestens einen Bereich (3) mittels eines extern angeordneten Detektors nachweisbar erfassbar sind.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9-11 , dadurch gekennzeichnet, dass
-ein Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) in den üblichen Abmessungen eines Objekträgers oder eines Objektträgereinsatzes verwendet wird; und/oder -ein Halbleitersubstrat (1), das undotiert oder zumindest teilweise p- und/oder n- dotiert ist, insbesondere mit einem elektrischen Widerstand von < 15 Ohm / cm2, verwendet wird; und/oder
-eine Siliziumdioxidschicht (7), die zumindest teilweise, insbesondere in dem mindestens einen Bereich (3; 8) als trockenes und/oder thermisches Oxid oder als trockenes und/oder thermisches Nitrid gebildet ist, verwendet wird; und/oder -die mindestens zwei nicht-silanisierten Bereiche (3; 8) derart, insbesondere ortsaddressiert, mit Prüfsubstanz (5; 11 , 12) beaufschlagt werden, vorzugsweise mit
Hilfe eines Pipettierautomanten, dass sie wenigstens teilweise von einem auf und/oder in der Isolatorschicht (2) gebildeten Umgebungsbereich (10) umgeben sind; und/oder
-als Medium (4) ein elektrisch leitendes Medium, vorzugsweise mit einem Leitwert von > 0,05 μS/cm verwendet wird; und/oder
-das als das wenigstens eine Lösungsmittel (9) ein wässeriges und/oder organisches Lösungsmittel, insbesondere ein hydrophiles und/oder polares Lösungsmittel verwendet wird oder ein Lösungsmittel, das ein wässeriges und/oder organisches
Lösungsmittel, insbesondere ein hydrophiles und/oder polares Lösungsmittel umfasst; und/oder
-eine organische Prüfsubstanz (5) mit wenigstens einer nukleophilen Gruppe bzw. Funktion, insbesondere einer Thiol-, Amino-, Hydroxyl-, Carboxyl-, Cyano-, Nitril-, Si-
, Se-, He-, Sulfat, Sulfid, endständige Alken- oder Alkin-, oder Phosphan-Gruppe verwendet wird; und/oder
-der Bereich (3) zunächst mit dem mindestens einen Medium (4) und nachfolgend mit der mindestens einen Prüfsubstanz (5) beaufschlagt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9-12, dadurch gekennzeichnet, dass
-ein Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) in den
Abmessungen Länge x Breite = (7,5 +/- 1) cm x (2,5 cm +/- 0,5 cm) verwendet wird; und/oder -als Halbleitersubstrat (1) ein Silzium-Wafer oder ein Teil davon verwendet wird; und/oder
-eine Siliziumdioxidschicht (7), insbesondere Siliziumdioxid, mit einer Dicke von > 30 nm, insbesondere 100 nm (+/- 70 nm) verwendet wird; und/oder -die wenigstens zwei nicht-silanisierten Bereiche (3; 8) jeweils mit einer anderen Konzentration der mindestens einen Prüfsubstanz (5) oder jeweils mit einer anderen der wenigstens zwei Prüfsubstanzen (5; 11) beaufschlagt werden; und/oder -als Medium (4) Wasser bzw. ein organisches Lösungsmittel, insbesondere mit saurem oder basischen pH-Wert, ein Elektrolyt und/oder ein Puffer verwendet wird oder ein Medium, das Wasser bzw. ein organisches Lösungsmittel mit saurem oder basischen pH-Wert, einen Elektrolyt und/oder einen Puffer umfasst; und/oder -als Lösungsmittel (9) ein organisches Lösungsmittel aus Molekülen mit wenigstens einem Stickstoff-, Sauerstoff-, Halogenatom und/oder einer Ringstruktur verwendet wird oder ein Lösungsmittel, das ein organische Lösungsmittel aus Molekülen mit wenigstens einem Stickstoff-, Sauerstoff-, Halogenatom und/oder einer Ringstruktur umfasst; und/oder
-die Isolatorschicht (2) räumlich/flächig derart mit dem Medium (4) und der wenigsten einen Prüfsubstanz (5; 11; 12) beaufschlagt wird, dass die durch die Beaufschlagung gebildeten wenigstens zwei Bereiche (3; 8) vollständig von dem vorzugsweise nicht mit Prüfsubstanz beaufschlagten Umgebungsbereich (10) umgeben sind; und/oder
-als die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5) ein Linkermolekül, Aminosäure, Kohlenhydrat, Lipid, Farbstoff, Pharmakon, Biotin, Peptid, Polypeptid, Oligonukleotid, Protein, Zellkompartiment, Zelle oder eine davon abgeleitete Struktur verwendet wird oder eine organische Prüfsubstanz (5) verwendet wird, die wenigstens ein Linkermolekül, Aminosäure, Kohlenhydrat, Lipid, Farbstoff, Pharmakon, Biotin, Peptid, Polypeptid, Oligonukleotid, Protein, Zellkompartiment, Zelle und/oder eine davon abgeleitete Struktur umfasst.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9-13, dadurch gekennzeichnet, dass
-ein Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) in einer Dicke von > 0,3 mm, insbesondere von 1 mm (+/- 0,7 mm) verwendet wird; und/oder -ein homogenes Halbleitersubstrat (1), vorzugsweise amorphes oder einheitlich gebildetes einkristallines oder polykristallines Silizium, verwendet wird; und/oder -eine Siliziumdioxidschicht (7) verwendet wird, die produktionsbedingt eine blaue und/oder rote Färbung aufweist; und/oder
-die Isolatorschicht (2) derart, insbesondere ortsadressiert, vorzugsweise mit Hilfe eines Automaten mit dem Medium (4) und/oder mit der wenigstens einen Prüfsubstanz (5, 11; 12) beaufschlagt wird, dass die wenigstens zwei Bereiche (3; 8) als Spots, insbesondere als räumlich voneinander getrennte und/oder ortsadressierte
Spots gebildet werden; und/oder
-die Isolatorschicht (2) derart mit dem Medium (4) und der wenigsten einen
Prüfsubstanz (5; 11 ; 12) beaufschlagt wird, dass die durch die Beaufschlagung gebildeten wenigstens zwei Bereiche (3; 8) als Spots, insbesondere als räumlich voneinander getrennte und/oder ortsadressierte Spots gebildet werden; und/oder
-als Medium (4) ein Gemisch aus einem wässerigem und organischen Lösungsmittel verwendet wird; und/oder
-als Lösungsmittel (9) ein Alkohol, Dimethylalkylsäureamid, Alkylhalogenid, Pyrollidon, Furan oder eines ihrer Derivate verwendet wird oder das Lösungsmittel
(9) einen Alkohol, ein Dimethylalkylsäureamid, ein Alkylhalogenid, ein Pyrollidon, ein
Furan oder eines ihrer Derivate enthält; und/oder
-der Umgebungsbereich (10), der vorzugsweise als Sillikat gebildet ist, nicht mit dem
Medium (4) und/oder der organischen Prüfsubstanz (5; 11 ; 12) beaufschlagt wird und/oder der Umgebungsbereich (10) chemisch, insbesondere mit organischen
Molekülen, modifiziert wird; und/oder
-als die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5; 11 ; 12) DNA, RNA, cDNA, mRNA, cRNA, PNA, Rezeptor, Ligand, Protein A1 Protein G, Streptavidin, Antikörper oder eine davon abgeleitete Struktur verwendet wird oder die organische Prüfsubstanz DNA, RNA, cDNA, mRNA, cRNA, PNA, Rezeptor, Ligand, Protein A,
Protein G, Streptavidin, Antikörper oder eine davon abgeleitete Struktur enthält.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9-14, dadurch gekennzeichnet, dass
-als Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) ein oxidierter oder nitrierter Silzium-Wafer oder ein Teil davon verwendet wird; und/oder
-die Isolatorschicht (2) derart mit mit dem Medium (4) und der wenigstens einen
Prüfsubstanz (5; 11 ; 12) beaufschlagt wird, dass die wenigstens zwei Bereiche (3; 8) als Array, insbesondere als Microarray und/oder Low-Density-Array gebildet werden; und/oder -als das Lösungsmittel (9) Ethanol, DMF, Dichlormethan, NMP, THF oder eines ihrer
Derivate verwendet wird oder das Lösungsmittel (9) Ethanol, DMF, Dichlormethan,
NMP, THF oder eines ihrer Derivate enthält; und/oder
-der Umgebungsbereich (10) durch Beaufschlagung mit Blockierungsreagens oder einer nukleophilen Verbindung modifiziert wird; und/oder -als die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5; 11 ; 12) Peptide mit L- und/oder D-Aminosäureresten verwendet werden, die insbesondere aus Gen-kodierten Aminosäuren und/oder deren Modifikationen, vorzugsweise nicht-natürlichen Aminosäuren gebildet sind, oder die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5; 11; 12) Peptide mit L- und/oder D-Aminosäureresten enthält, die insbesondere aus Gen-kodierten Aminosäuren und/oder deren Modifikationen, vorzugsweise nichtnatürlichen Aminosäuren gebildet sind.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 9-15, dadurch gekennzeichnet, dass -ein Halbleitersubstrat (1) mit der darauf gebildeten Isolatorschicht (2) aus einem zumindest teilweise polierten Silzium-Wafer oder aus einem Teil davon verwendet wird; und/oder
-der mindestens eine Bereich (3; 8) mit der mindestens einen Prüfsubstanz (5; 11) , die in dem mindestens einen Medium (4) zumindest teilweise gelöst ist, beaufschlagt wird, insbesondere mit einem Gemisch beinhaltend wässerige Pufferlösung, organisches Lösungsmittel und gelöste Prüfsubstanz; und/oder -der Umgebungsbereich (10) durch Beaufschlagung mit einem Thiol, insbesondere Mercaptoethanol oder Cystein modifiziert wird; und/oder -als die mindestens eine organische Prüfsubstanz (5) Linkermoleküle mit nach der Kopplung an die Isolatorschicht freien/ungebundene chemisch reaktiven Gruppen, (z.B. Cystein, Cystein-Biotin) oder Peptide mit einem, vorzugsweise endständigen, Thiol, insbesondere einem Cysteinrest, verwendet werden oder die organische Prüfsubstanz (5) Linkermoleküle mit nach der Kopplung an die Isolatorschicht freien/ungebundene chemisch reaktiven Gruppen oder Peptide mit einem vorzugsweise endständigen Thiol, insbesondere einem Cysteinrest gebildet, enthält; und/oder
-der wenigstens eine beaufschlagte Bereich (3; 8) und/oder der Umgebungsbereich (10) mit wenigstens einer Flüssigkeit, insbesondere einem Lösungmittel und/oder einem Waschpuffer, gewaschen wird; und/oder -eine lithographisch strukturierte Siliziumdioxidschicht verwendet wird.
17. Verwendung einer Anordnung gemäß einem der Ansprüche 1-8, insbesondere hergestellt gemäß einem der Ansprüche 9-16, zum spezifischen Erfassen von Substanzen aus einer Probe, insbesondere zum Erfassen von Assoziationsereignissen, dadurch gekennzeichnet dass die Anordnung mit wenigstens einer Probe (13) in Kontakt gebracht wird, die ggf. eine Testsubstanz (14) enthält.
18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass
-übliche Verfahren zum Gebrauch eines Biochips angewendet werden oder übliche Verfahren zum Gebrauch von Partikeln, insbesondere Mikropartikeln oder Nanopartikeln, angewendet werden; und/oder -der wenigstens eine Bereich (3; 8) der Anordnung mit der wenigstens einen Probe (13) in Kontakt gebracht wird; und/oder
-die Probe (13) die Testsubstanz (14), vorzugsweise in einer nachweisbaren Konzentration, enthält; und/oder -die Testsubstanz (14) als Aminosäure, Kohlenhydrat, Lipid, Farbstoff, Pharmakon, Biotin, Linkermolekül, Peptid, Oligonukleotid, Protein, Zellgewebe, Zelle, Zellbestandteil, DNA, RNA, cDNA, mRNA, cRNA, PNA, Protein und/oder Peptid oder davon abgeleitete Strukturen gebildet ist oder diese enthält; und/oder -die Testsubstanz (14) mit der in dem Bereich (3) an die Isolatorschicht (2) gekoppelten Prüfsubstanz (5) wechselwirkt, insbesondere mit der Prüfsubstanz (5) assoziiert oder diese enzymatisch verändert.
19. Verwendung nach einem der Ansprüche 17-18, dadurch gekennzeichnet, dass -ein Immunoassay oder ein Genexpressions-Profiling durchgeführt wird; und/oder
- das Inkontaktbringen der Probe (13) mit der Anordnung, insbesondere mit den Bereichen (3;8), mittels Pipettieren oder Zuleiten der Probe (13) auf die Anordnung, insbesondere auf die Bereiche (3;8) und/oder den Umgebungsbereich (10) erfolgt; und/oder
-die wenigstens eine Probe (13) als wenigstens zwei unterschiedliche Proben (13;
16) gebildet ist; und/oder -die Probe als Lösung oder Suspension der Testsubstanz gebildet ist; und/oder
-die Testsubstanz (14) als Antikörper, Enzym, Rezeptor, Ligand, Proteindomäne oder
Epitop gebildet ist oder diese enthält, und/oder -wenigstens eine Testsubstanz (13) aus der Probe mit wenigstens einer auf und/oder in dem wenigsten einen Bereich (3; 8) gekoppelten Prüfsubstanz nachweisbar wechselwirkt; und/oder
-die Testsubstanz (14) mit einem strahlungsaktiven Marker (17) verbunden ist oder verbunden wird, und/oder
-die Anordnung, vorzugsweise der wenigstens eine Bereich (3; 8), mit einer Lichtquelle, vorzugsweise einer Lampe oder einem Laser, bestrahlt wird und/oder - die Anordnung, vorzugsweise der wenigstens eine Bereich (3; 8), mit einem bei enzymatischer Umsetzung chemilumineszierenden Enzymsubstrat beaufschlagt wird, und/oder
-die Anordnung, vorzugsweise der wenigstens eine Bereich (3; 8), mittels eines extern angeordneten Detektors zur Detektion von Strahlung, insbesondere mittels eines Detektors zur Detektion von Strahlung in den Wellenlängenbereichen von sichtbarem Licht, UV-Licht oder IR oder zur Detektion von radioaktiver Strahlung, oder mittels eines Detektors zur Detektion von massenspektrometrisch vermessbaren Produkten bzw. Parametern, insbesondere mittels eines Scanners, Imagers, Counters oder Massenspektrometers, ausgelesen wird.
20. Verwendung nach einem der Ansprüche 17-19, dadurch gekennzeichnet, dass -die Probe (13) als Körperflüssigkeit, vorzugsweise Urin, Blut oder Serum, oder als
Stuhlprobe gebildet ist oder diese enthält; und/oder
-die Testsubstanz als IgA, IgG, IgE, IgM, Kinase, Phosphatase oder Antiköperepitop, gebildet ist oder diese enthält, und/oder
-die Testsubstanz (14) über eine markierte Sonde, die vorzugsweise ein synthetisches Peptid oder Polypeptid, eine Proteindomäne, ein Proteinfragment, ein
Protein, insbesondere ein Sekundärantikörper oder Streptavidin, ein Oligonukleotid oder eine in doppelsträngige Oligonkleotide interkalierende Substanz ist, mit dem
Marker (17) verbunden wird, und/oder
-der Marker (17) ein Farbstoff, ein radioaktives Isotop, ein fluoreszierendes Protein, eine Peroxidase oder eine Phosphatase ist.
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