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WO2008017752A2 - Extrait d ' eucalyptus, son procede de preparation et ses utilisations therapeutiques - Google Patents

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WO2008017752A2
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macrocarpal
eucalyptus
extract
isobutyl
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Christel Fiorini-Puybaret
Bernard Fabre
Cécile CHAUVIN
Philippe Joulia
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Pierre Fabre Medicament
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Definitions

  • the present invention relates to the use of an extract of Eucalyptus for the preparation of a medicament or a food supplement for the treatment and / or prevention of diseases or pathologies resulting from a disorder of the recapture of neuromediators dopamine, serotonin and / or norepinephrine.
  • said extract is enriched in at least 1 of the compounds of formula (I) or any of its diastereoisomeric forms:
  • R2 represents an isobutyl group, isobutyl ⁇ -or ⁇ -isobutyl.
  • the present invention also relates to the use of at least 1 of the compounds of formula (I) above for the preparation of a medicament or dietary supplement for the treatment and / or prevention of diseases or pathologies arising from a disorder of recapture of said neuromediators.
  • Eucalyptus belong to the family Myrtaceae and find the origin of their name in the characteristic shape of their flowers. Indeed, the word Eucalyptus means "well covered” alluding to the operculum (formed of welded petals) styling stamens of flowers. These are generally tall and tall trees that can reach 80 to 100 m in their home country (Australia), from 3 to 20 m in more temperate climates. Their bark, smooth, is detached in long bands of pale to greyish color. They are usually characterized by leaf dimorphism.
  • the young leaves are oval-oblong, glaucous green, circled in blue, hugging and sessile while the older leaves are sickle-shaped, greyish green, pendulous, petiole twisted and vertically oriented (equivalence of both sides).
  • the flower buds are formed of a chalice, in the form of a quadrangular pyramid, capped with a lid that rises during flowering, revealing numerous stamens with long white filaments and yellow anthers.
  • Fruits are 2 to 2.5 cm in diameter capsules with black or brown seeds.
  • three species are mainly used in the European pharmacopoeia: Eucalyptus globulus Labill, YE.
  • Eucalyptus leaves are traditionally used orally and locally to treat conditions of the respiratory system (bronchitis, inflammation of the throat, stuffy nose, cold ...) or in application to treat injuries, skin ulcers. ..
  • Eucalyptus essential oil and eucalyptol (or 1,8-cineole) are used in many preparations to treat respiratory diseases because of their antiseptic, mucolytic and expectorant activities.
  • the essential oil is used as a repellent and in veterinary medicine.
  • Eucalyptus essential oil The known pharmacological properties of Eucalyptus essential oil are to date: antimicrobial, expectorant and bicicidal properties (WICHTL M. and ANTON R., 1999 - Therapeutic Plants - 177-179), anti-inflammatory and anti-asthmatic (JUERGENS et al, 2003 - Anti-inflammatory activity of 1,8-cineol (eucalyptol) in bronchial asthma: double-bind placebo controlled trial - Respir Med., 97 (3), 250- 256), anti-diabetic (SWANSTON et al, 1990 - Traditional plant treatments for diabetes, Studies in normal and streptozotocin diabetics rats - Diabetologia, 33 (8), 462-464), antihistamines (IKAWATI Z.
  • the Applicant has demonstrated the use of an extract of Eucalyptus for the preparation of a drug or dietary supplement for the treatment and / or prevention of diseases or pathologies arising from a disorder recapture of neuromediators.
  • the field of the present invention is therefore an Eucalyptus extract for which valuable pharmacological properties have been observed and thus new therapeutic uses envisaged.
  • the present invention does not relate to the essential oil of Eucalyptus as such, for which an abundant bibliography had been found.
  • the drug or dietary supplement is intended to treat and / or prevent pathologies, resulting from a disorder of the recapture of neuromediators, chosen from the group:
  • the treatment and / or prevention of said diseases or pathologies consists of an inhibition of the reuptake of neuromediators.
  • neuromediators means dopamine and / or serotonin and / or norepinephrine.
  • Eucalyptus is intended to mean the species preferably belonging to the subgenus Eudesmia, Symphomyrtus and Corymbia and more particularly the following species: Eucalyptus glohulus L., Eucalyptus pulverulenta Sims, Eucalyptus kartzoffiana LAS Johnson 1 Blaxell, Eucalyptus macrocarpa Hook., Eucalyptus cinerea F.
  • the Eucalyptus extract is obtained from the leaves, flowers, fruits, stems or trunk of Eucalyptus; and preferentially Eucalyptus leaves.
  • the Eucalyptus extract used according to the present invention is characterized in that it comprises at least one compound of formula (I) or any of its diastereoisomeric forms.
  • Said formula (I) includes among others 4 compounds of the macrocarpal family; these are: macrocarpal A: (5 - ((1R) -1 - ((11S, 7R) -7-hydroxy-3,3,7,11-tetramethyltricyclo (6.3.0.0 (2,4)) undec-11-yl) -3-methylbutyl) -2,4,6-trihydroxybenzene-1,3-dicarbaldehyde) in which R1 forms with the carbon to which
  • group R 2 represents a ⁇ -isobutyl
  • the mass fraction of macrocarpal A in the Eucalyptus extract according to the present invention is greater than or equal to 0.1% and strictly less than 3%.
  • R2 represents an ⁇ -isobutyl
  • the mass fraction of macrocarpal B in the Eucalyptus extract according to the present invention is greater than or equal to 0.1% and strictly less than 3% .
  • the mass fraction of macrocarpal C in the Eucalyptus extract according to the present invention is greater than or equal to 0.1% and strictly less than 3%.
  • the mass fraction of macrocarpal G in the Eucalyptus extract according to the present invention is greater than or equal to 0.1% and strictly less than 5% .
  • Said extract of Eucalyptus is obtained by an extraction process made from conventional steps known to those skilled in the art.
  • the leaves, flowers, fruits, stems or trunk of Eucalyptus (Eucalyptus sp.) Or a mixture of these parts are crushed and then extracted with an organic solvent which may be an alkane (pentane, hexane, heptane, octane, cyclohexane ), an ether oxide (tetrahydrofuran, dioxane, diethyl ether), an ester (ethyl acetate, isopropyl acetate), an alcohol (methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, octanol), a ketone (methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone). ), a halogenated hydrocarbon (chloroform, dichloromethane) or a mixture of water and
  • the extraction is carried out in a plant / solvent ratio of between about 1/1 and about 1/20 and can be repeated 2 to 3 times.
  • the temperature of the extraction solvent may be equal to ambient temperature or higher, up to the boiling temperature of the solvent involved.
  • the contact time of the plant with the solvent is from about 30 minutes to about 72 hours.
  • a solid / liquid separation is then carried out, the plant being separated from the solvent by filtration or centrifugation.
  • the filtrate obtained can either be dried directly by total evaporation of the extraction solvent and constitute the final extract; be more or less concentrated.
  • a mixed extraction solvent hydro-alcoholic mixture for example
  • the concentration continues until evaporation of the organic solvent present.
  • a quantity of water is added to the concentrate obtained.
  • a liquid-liquid purification step is carried out by adding to the aqueous phase an immiscible solvent which may be an alkane (hexane for example), an ether ether (diethyl ether for example), an ester (ethyl acetate by for example), an alcohol (butanol for example), a ketone (methyl ethyl ketone for example) or a halogenated hydrocarbon (chloroform for example).
  • an immiscible solvent which may be an alkane (hexane for example), an ether ether (diethyl ether for example), an ester (ethyl acetate by for example), an alcohol (butanol for example), a ketone (methyl ethyl ketone for example) or a halogenated hydrocarbon (chloroform for example).
  • an immiscible solvent which may be an alkane (hexane for example), an ether ether (diethyl ether for example),
  • Drying of the final extract is carried out by lyophilization or by more conventional drying means known to those skilled in the art (nebulization, oven, etc.).
  • the drying temperatures do not exceed about 60 ° C.
  • the extract may be stabilized by addition of an antioxidant such as ascorbic acid, citric acid in amounts of between about 0.05 and about 1 g per 100 g of solids.
  • a most remarkable point of the present invention lies in the fact that the pharmacological properties of inhibition of the reuptake of the neuromediators of the extract of Eucalyptus are all the more interesting that said extract is enriched in at least 1 of the compounds of formula (I) or any of its diastereoisomeric forms.
  • said Eucalyptus extract is preferably enriched in at least 1 compound of the formula (I).
  • Eucalyptus extract enriched in macrocarpal A means an extract of Eucalyptus whose macrocarpal A mass fraction is greater than or equal to 3% and strictly less than 90%, preferably greater than or equal to at 3% and less than 50%, more preferably greater than or equal to 3% and less than 40% and even more preferably greater than or equal to 3% and less than 20%.
  • Eucalyptus extract enriched in macrocarpal B means an extract of Eucalyptus whose mass fraction in macrocarpal B superior or equal to 3% and strictly less than 90%, preferably greater than or equal to 3% and less than 50%, more preferably greater than or equal to 3% and less than 40% and even more preferably greater than or equal to 3% and lower at 20%.
  • Eucalyptus extract enriched in macrocarpal C means an extract of eucalyptus whose mass fraction in macrocarpal C is greater than or equal to 3% and strictly less than 90%, preferably greater than or equal to at 3% and less than 50%, more preferably greater than or equal to 3% and less than 40% and even more preferably greater than or equal to 3% and less than 20%.
  • Eucalyptus extract enriched in macrocarpal G means an extract of Eucalyptus whose macrocarpal G mass fraction is greater than or equal to 5% and strictly less than 90%, preferably greater than or equal to at 5% and less than 50%, more preferably greater than or equal to 5% and less than 40% and even more preferably greater than or equal to 5% and less than 20%.
  • the Applicant has shown the influence of an Eucalyptus extract on the reuptake of dopamine and / or norepinephrine and / or serotonin.
  • said extract is particularly useful for the preparation of a medicament or dietary supplement intended to treat and / or prevent numerous conditions or pathologies resulting from a dopamine defect. and / or serotonin and / or norepinephrine.
  • a dopamine defect and / or serotonin and / or norepinephrine.
  • - neurological diseases, conditions or disorders such as neurodegenerative diseases (Alzheimer's disease, Huntington's chorea, Parkinson's disease, stroke, head trauma), amyotrophic lateral sclerosis, senile dementia, frontotemporal dementia , vascular dementia, migraine, neuropathic pain of central origin;
  • - psychiatric diseases, conditions or disorders such as depression (endogenous, resistant, reactive or iatrogenic), depressive state, schizophrenia, bipolar disorder, generalized anxiety, stress-related illnesses, panic attacks , obsessive-compulsive disorder, post-traumatic stress disorder, attention deficit and hyperactivity disorder, eating disorders (including bulimia, anorexia), phobia (including agoraphobia), autism;
  • somatic disorders such as chronic fatigue syndrome, fibromyalgia, irritable bowel syndrome, gastroesophageal reflux, loss of libido, erectile dysfunction, urinary incontinence.
  • the drug or the food supplement according to the invention is advantageously intended to induce withdrawal from nicotine, alcohol, opiates, cannabinoids, psychostimulants and prevent relapse in abstinent subjects.
  • the drug or the food supplement according to the invention is advantageously used as a substitution treatment for addictive substances and for preventing and / or treating depressive syndrome associated with withdrawal.
  • the Applicant here specifies, in a non-restrictive manner, a few Bibliographical references that recall the link between pathologies and their treatment using a triple dopamine and / or serotonin and / or norepinephrine reuptake inhibitor. An example of each "group" was noted.
  • the Eucalyptus extract according to the present invention can therefore be advantageously used in the treatment of these neurological diseases.
  • Depression is a common pathology of mood, characterized by feelings of intense sadness, pessimistic thoughts, self-deprecation, often accompanied by loss of drive, enthusiasm and libido.
  • the inability to feel pleasure from normally pleasant experiences, also known as anhedonia, is also considered a common symptom in depression.
  • Depression is currently treated with selective serotonin reuptake inhibitors such as fluoxetine, citalopram or paroxetine, selective norepinephrine reuptake inhibitors such as reboxetine, or mixed serotonin and norepinephrine reuptake inhibitors such as milnacipran. or venlafaxine.
  • Functional disorders also called somatotropic disorders, are disorders that concern the major physiological functions, and that would not be due to organic lesions but to the way organs function (liver, heart ). Functional somatic disorders may be the cause of later disease.
  • flbromyalgia is a disorder associating diffuse pain or localized, chronic fatigue, depressive symptoms, memory and concentration problems (DS Rooks, Curr Opin Rheumatol 2007, 19, 111).
  • the symptoms of fibromyalgia are treated with mixed norepinephrine / serotonin reuptake inhibitors (Vitton O., Hum Psychopharmacol 2004, 19 Suppl 1: S27).
  • the addition of a component promoting dopaminergic tone, as in Eucalyptus extract according to the present invention is advantageous for the preparation of a drug or dietary supplement for treating and / or preventing somatic functional disorders.
  • said medicament is in an oral or injectable form.
  • the oral form is chosen from the group consisting of a tablet, capsule, capsule, liquid preparations such as syrups, oral solutions or powders for oral suspensions.
  • said dietary supplement (or nutraceutical or dietary) is packaged in the form of doses, namely the forms of presentation such as capsules, lozenges, tablets, pills and other similar forms, as well as powder sachets. , ampoules of liquid, vials with droppers and other similar forms of liquid or powder preparations intended to be taken in measured units of small quantities.
  • results obtained from an extract of Eucalyptus enriched in at least one compound of formula (I) or any of its diastereoisomeric forms according to the present invention show that the benefits of the present invention can be extended to any composition based on at least one compound of formula (I) or any of its diastereoisomeric forms, whether it is obtained chemically, biochemically or from a plant extract.
  • the present invention therefore also relates to the use of at least one compound of formula (I) or any of its diastereoisomeric forms for the preparation of a medicament or dietary supplement for the treatment and / or prevention of diseases or neurological, psychiatric and related disorders, functional somatic syndromes and addictive substance dependence arising from a disorder of neurotransmitter recapture.
  • the treatment and / or prevention of said diseases or pathologies consists of an inhibition of the reuptake of neuromediators. Due to its pharmacological properties as a reuptake inhibitor of these neuromediators, the compounds of formula (I) and its diastereomeric forms are particularly useful for the preparation of a medicament or dietary supplement intended to treat and / or prevent numerous affections. or pathologies resulting from a deficiency of dopamine and / or serotonin and / or norepinephrine.
  • neurodegenerative diseases Alzheimer's disease, Huntington's chorea, Parkinson's disease, stroke, head trauma
  • amyotrophic lateral sclerosis senile dementia
  • frontotemporal dementia vascular dementia
  • migraine neuropathic pain of central origin.
  • - psychiatric diseases, conditions or disorders such as depression (endogenous, resistant, reactive or iatrogenic), depressive state, schizophrenia, bipolar disorder, generalized anxiety, stress-related illnesses, panic attacks obsessive-compulsive disorders, post-traumatic stress disorder, attention deficit and hyperactivity disorder, eating disorders (including bulimia, anorexia), phobia (including agoraphobia), autism;
  • somatic disorders such as chronic fatigue syndrome, fibromyalgia, irritable bowel syndrome, gastroesophageal reflux, loss of libido, erectile dysfunction, urinary incontinence.
  • the drug or the food supplement according to the invention is advantageously intended to induce withdrawal from nicotine, alcohol, opiates, cannabinoids, psychostimulants and prevent relapse in abstinent subjects.
  • the drug or the food supplement according to the invention is advantageously used as a substitution treatment for addictive substances and for preventing and / or treating depressive syndrome associated with withdrawal.
  • the present invention relates to the use of Macrocarpal A, Macrocarpal B, Macrocarpal C and / or Macrocarpal G for the preparation of a medicament or dietary supplement for the treatment and / or prevention of neurological conditions or pathologies. , psychiatric and related disorders, functional somatic syndromes and addictive substance dependence arising from a dopamine reuptake disorder and / or serotonin and / or norepinephrine.
  • said medicament is in an oral or injectable form.
  • the compounds of formula (I) and its diastereoisomeric forms according to the present invention can be obtained by purification of a plant extract or by chemical or biochemical synthesis as described in Total Synthesis of (-) - Macrocarpal C.
  • Said compounds can be isolated from "the eucalyptus extract” or "the extract enriched in at least one macrocarpal of formula (I)".
  • the techniques for its purification are conventional chromatographic techniques for the skilled person.
  • the extracts were fractionated on preparative column having as stationary phase a reversed phase, preferably Symetry Shield ®, 5 .mu.m (Waters) and mobile phase, acetonitrile / water / trifluoroacetic acid in the proportions 95/5 / 0.1%.
  • the purity of the compound of formula (I) of such a fraction is greater than or equal to 90%.
  • the purity of macrocarpal A, macrocarpal B, macrocarpal C and / or macrocarpal G of such a fraction is greater than or equal to 90%.
  • macrocarpal A and / or macrocarpal B and / or macrocarpal C and / or macrocarpal G are used for the preparation of a medicament or food supplement for treating and / or prevent overweight or obesity.
  • the present invention also relates to an extract enriched with Eucalyptus characterized in that it contains at least 1 compound of formula (I) or any of its diastereoisomeric forms:
  • R1 forms with the carbon to which it is attached a group
  • ⁇ CH 3 ⁇ CH 3 cC CH 3 C CH 2
  • a 0H group, 0H or 0H and R2 represents an isobutyl group, ⁇ -isobutyl or ⁇ -isobutyl, and in that the mass fraction of Macrocarpal A is greater than or equal to 3% and strictly less than 90%, preferably greater than or equal to 3% and less than 50%, more preferably greater than or equal to 3% and less than 40% and even more preferably greater than or equal to 3% and less than 20% .
  • the mass fraction of macrocarpal B is greater than or equal to 3% and strictly less than 90%, preferably greater than or equal to 3% and less than 50%, more preferably greater than or equal to 3% and less than 40% and even more preferentially greater than or equal to 3% and less than 20%.
  • the mass fraction of macrocarpal C is greater than or equal to 3% and strictly less than 90%, preferably greater than or equal to 3% and less than 50%, more preferably greater than or equal to 3% and less than 40% and even more preferably greater than or equal to 3% and less than 20%.
  • the mass fraction of macrocarpal G is greater than or equal to 5% and strictly less than 90%, preferably greater than or equal to 5% and less than 50%, more preferably greater than or equal to 5% and less than 40% and even more preferably greater than or equal to 5% and less than 20%.
  • the present invention relates to the use of said enriched Eucalyptus extract as a medicament or dietary supplement.
  • the present invention finally relates to a process for the preparation of such an extract enriched with Eucalyptus.
  • the process for obtaining said extract consists of the following steps: - crushing of leaves and / or flowers and / or fruits and / or stems and / or trunk of Eucalyptus at least one extraction with an organic solvent or a mixture of water and organic solvent (s) miscible (s) water.
  • the extraction is carried out in a plant / solvent ratio of between about 1/1 and about 1/20 and can be repeated 2 to 3 times.
  • the temperature of the extraction solvent may be equal to ambient temperature or higher, up to the boiling temperature of the solvent involved.
  • the contact time of the plant with the solvent is from about 30 minutes to about 72 hours.
  • the solvent is selected from the group consisting of an alkane (pentane, hexane, heptane, octane, cyclohexane), an ether oxide
  • the extraction solvent is dichloromethane or isopropyl acetate.
  • the filtrate is dried and then dissolved in a solvent immiscible with water.
  • Solid / liquid separation by techniques known to those skilled in the art.
  • one or more liquid-liquid extractions are carried out by adding a base, preferably sodium carbonate (Na 2 CO 3 ).
  • the combined basic aqueous phases are acidified by addition of acid, preferably hydrochloric acid (HCl) and then extracted by one to several liquid-liquid extractions carried out with a solvent immiscible with water.
  • acidification leads to a pH of about 1.
  • the combined organic phases can be dried over sodium sulphate and then concentrated in vacuo at a temperature ranging from room temperature to boiling point.
  • the concentrate is dried by conventional drying means (nebulization, oven ...) at temperatures not exceeding 60 ° C. preferably and constitutes the extract enriched in macrocarpal G.
  • This extract can be stabilized by the addition of a antioxidant such as ascorbic acid or citric acid in amounts of between 0.05 to 1 g per 100 g of solids.
  • the eucalyptus extract or the Eucalyptus extract said "enriched in at least one compound of the formula (I) or any of its diastereoisomeric forms" is also obtained by an extraction process using a supercritical fluid as extraction solvent.
  • a supercritical fluid as extraction solvent.
  • the leaves, flowers, fruits, stems or trunk of Eucalyptus (Eucalyptus sp.) Or a mixture of these parts are crushed or not, then extracted with a supercritical fluid that may be carbon dioxide.
  • a first extraction with supercritical CO2 is carried out under the following conditions: the temperature of the fluid is between about 40 ° C. and about 80 ° C., and preferably between about 40 ° C. and about 60 ° C.; its pressure is between about 80 bar and about 250 bar, and preferably between about 100 bar and about 200 bar; the extraction time is between about 1 hour and about 6 hours; the flow rate of the fluid will be adapted by the skilled person depending on the amount of material to be extracted and the size of the autoclave used.
  • the CO2 flow rate used in the process according to the present invention is between 2 to 15 kg / hour, advantageously 8 to 12 kg / hour; * for a quantity of plant between 200 and 1000 grams, preferably about 500 grams, "and for an autoclave with a capacity of between 2 and 10 liters, preferably with a capacity of about 5 liters.
  • an organic co-solvent the family of alcohols (including ethanol), ether ethers, esters or a mixture of two or more of these solvents.
  • the plant thus extracted can then be subjected to a second extraction optionally.
  • the extraction fluid is preferably supercritical CO2 with or without co-solvent.
  • the operating conditions are: the temperature of the fluid is between about 40 ° C. and about 80 ° C., and preferably between about 40 ° C. and about 60 ° C.; its pressure is between about 80 bar and about 250 bar, and preferably between about 100 bar and about 200 bar; the flow rate of the fluid is between 2 to 15 kg / hour, advantageously 8 to 12 kg / hour;
  • the extraction is carried out in a plant / cosolvent mass ratio of between about 1 / 0.1 and 1/5.
  • This second extraction step can be renewed if necessary.
  • the extraction time is between about 1 hour and about 3 hours per additional extraction step.
  • the resulting extract is then evaporated.
  • the final extract is dried by lyophilization or by more conventional drying means known to those skilled in the art (nebulization, oven, ). Preferably, the drying temperatures do not exceed about 60 ° C.
  • the extract may be stabilized by addition of an antioxidant such as ascorbic acid, citric acid in amounts of between about 0.05 and about 1 g per 100 g of solids.
  • the leaves of Eucalyptus globulus are crushed and then extracted with 5 volumes of ethanol at room temperature.
  • the contact time of the plant with the solvent is 48 hours.
  • the plant is separated from the solvent by filtration.
  • the filtrate obtained is dried under vacuum at a temperature of 60 ° C.
  • the extract thus obtained will be used for the in vitro tests presented in Example 5.
  • the extract obtained contains about 0.65 g of macrocarpal A, about 0.7 g of macrocarpal
  • EXAMPLE 2 Preparation of an extract of Eucalyptus globulus Eucalyptus globulus leaves are ground and then extracted 3 times under reflux with 5 volumes of 50% v / v ethanol. The contact time of the plant with the solvent is about 1 hour. The plant is separated from the solvent by filtration. The filtrate obtained is concentrated to 0.5 volume. The liquid-liquid purification is carried out by adding dichloromethane. Three liquid-liquid extractions are carried out. The organic phases are combined and dried over sodium sulfate. The final extract is dried at 60 ° C. under vacuum.
  • the extract obtained contains about 1.3 g of macrocarpal A, about 1.4 g of macrocarpal B, about 0.8 g of macrocarpal C, and about 2 g of macrocarpal G per 100 g of dry extract.
  • the leaves of Eucalyptus globulus are crushed and then extracted at reflux 2 times with 5 volumes of ethanol-water mixture 50% v / v for about 1 hour.
  • the plant is separated from the solvent by filtration.
  • the filtrate obtained is concentrated and then stabilized by the addition of 0.1 g per 100 g of citric acid solids.
  • the concentrate is frozen and dried by lyophilization.
  • the extract obtained contains approximately 0.3 g of macrocarpal A, approximately 0.35 g of macrocarpal B, approximately 0.2 g of macrocarpal C and approximately 0.5 g of macrocarpal G per 100 g of dry extract.
  • Example 4 537 g of Eucalyptus leaves are crushed and placed in an autoclave. They are extracted for 4 hours by supercritical CO2 at 40 ° C., 150 bar, with a flow rate of 10 kg / h.
  • the leaves thus extracted are subjected to a second extraction with a supercritical CO2 / ethanol mixture at 150 bar, 50 ° C. 1 volume of ethanol is used per 1 weight of plant. It is thus extracted during 2 h, then the sheets are dried by passing CO 2 alone under the same operating conditions for 30 minutes.
  • the principle is as follows: the synapses from rat brains are incubated for 15 min at 37 ° C. with
  • the samples are rapidly filtered under vacuum through glass fiber filters (GB / B, Packard) and rinsed twice with ice-cold incubation buffer to remove [ 3 H] -serotonin free.
  • the filters are dried and the retained radioactivity is measured by a scintillation counter (Topcount, Packard) using a scintillation cocktail (Microscint O 5 Packard).
  • the synaptic medium synaptic medium (synapses of rat striatum) is incubated for 15 min at 37 ° C with 0.1 ⁇ Ci [ 3 H] -DA in the presence or absence (control) of the Eucalyptus gulobulus extract prepared according to Example 1 or GBR 12909 (reference) in the buffer solution (see recapture of serotonin).
  • Basal activity is determined by incubating the same mixture for 15 min at 37 ° C in the presence of 10 ⁇ M GBR 12909 to block reuptake.
  • the samples are rapidly filtered under vacuum through glass fiber filters (GB / B, Packard) and rinsed twice with ice-cold incubation buffer to remove [ 3 H] -dopamine free.
  • the filters are dried and the radioactivity retained is measured by a scintillation counter (Topcount, Packard) using a scintillation cocktail (Microscint O, Packard).
  • Basal activity is determined by incubating the same mixture for 20 min at 37 ° C in the presence of 10 ⁇ M protriptylline to block reuptake.
  • the samples are rapidly filtered under vacuum through fiberglass filters (GBfB, Packard) and rinsed twice with ice-cold incubation buffer to remove free [ 3 H] -NE.
  • the filters are dried and the radioactivity retained is measured by a scintillation counter (Topcount, Packard) using a scintillation cocktail (Microscint O, Packard).
  • the results are expressed as a percentage of reuptake inhibition of the neuromediator evaluated (see Table 1).
  • Table 1 Evaluation of Eucalyptus globulus leaf extract on the reuptake of serotonin, dopamine and norepinephrine. Significant inhibition of the reuptake of serotonin and dopamine at 10 ⁇ g / ml and the three neurotransmitters at 100 ⁇ g / ml are observed.
  • the leaves of Eucalyptus globulus are crushed and then extracted with 5 volumes of dichloromethane. The extraction is carried out twice at reflux for 1 hour. This is followed by filtration under vacuum. The combined filtrates are concentrated to 2 volumes.
  • Three liquid-liquid extractions are carried out by adding a volume of sodium carbonate (Na 2 CO 3 ) at 0.1 M.
  • the combined basic aqueous phases are acidified by the addition of hydrochloric acid
  • the enriched extract is fractionated on a preparative column having as stationary phase a reversed phase Symmetry Shield ®, 5 .mu.m (Waters) and mobile phase, acetonitrile / water / trifluoroacetic acid in the proportions 95/5 / 0.1% .
  • the macrocarpal G purity of the fraction obtained is about 97%.
  • Table 2 Comparison of the activity of a "macrocarpal G-enriched extract", a “macrocarpal G-free extract” and a macrocarpal G-enriched fraction on serotonin reuptake.
  • Example 7 Determination of the 50% inhibitory concentration (IC 50 ) of macrocarpal A, macrocarpal B, macrocarpal C and macrocarpal G on the reuptake of neuromediators compared with that of hyperforin.
  • Example 5 The protocols followed are those of Example 5. They were repeated for different concentrations of macrocarpal A, B, C and G and hyperforin.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un extrait d'Eucalyptus pour la préparation d'un médicament ou d'un complément alimentaire destiné au traitement et/ou à la prévention des affections ou pathologies découlant d'un désordre de la recapture de neuromédiateurs. La présente invention concerne également un nouvel extrait enrichi d'Eucalyptus caractérisé en ce qu'il contient au moins 1 composé de formule (I) ou l'une quelconque de ses formes diastéréoisomères dans laquelle Rl forme avec le carbone auquel il est rattaché un groupement C=CH2, un groupement formule (II) et R2 re résente un rou ement isobut le,α-isobutyle ou β-isobutyle; ainsi que son procédé de préparation.

Description

NOUVEL EXTRAIT D'EUCALYPTUS, SON PROCEDE DE PREPARATION ET SES UTILISATIONS THERAPEUTIQUES.
La présente invention concerne l'utilisation d'un extrait d'Eucalyptus pour la préparation d'un médicament ou d'un complément alimentaire destiné au traitement et/ou à la prévention des affections ou pathologies découlant d'un désordre de la recapture des neuromédiateurs suivants : dopamine, sérotonine et/ou noradrénaline. Préférentiellement ledit extrait est enrichi en au moins 1 des composés de la formule (I) ou l'une quelconque de ses formes diastéréoisomères :
Figure imgf000002_0001
dans laquelle Rl forme avec le carbone auquel il est rattaché un groupement C=CH2, un
^CH3 CH3 cCCH3 groupement OH , ' O wH • ou OH et R2 représente un groupement isobutyle, α-isobutyle ou β-isobutyle.
La présente invention concerne également l'utilisation d'au moins 1 des composés de la formule (I) ci-dessus pour la préparation d'un médicament ou d'un complément alimentaire destiné au traitement et/ou à la prévention des affections ou pathologies découlant d'un désordre de la recapture desdits neuromédiateurs.
Il existe de nombreuses espèces d'Eucalyptus (plus de 600), la plupart native d'Australie et de Tasmanie, un petit nombre de la Nouvelle Guinée et de l'Est de la
Malaisie. Les Eucalyptus appartiennent à la famille des Myrtacées et trouvent l'origine de leur nom dans la forme caractéristique de leurs fleurs. En effet, le mot Eucalyptus signifie « bien couvert » faisant allusion à l'opercule (formés des pétales soudés) coiffant les étamines des fleurs. Ce sont généralement de beaux et grands arbres pouvant atteindre 80 à 100 m de hauteur dans leur pays d'origine (Australie), de 3 à 20 m sous des climats plus tempérés. Leur écorce, lisse, se détache en de longues bandes de couleur pâle à grisâtre. Ils sont généralement caractérisés par un dimorphisme foliaire. Dans le cas de l'Eucalyptus globulus Labill, les jeunes feuilles sont ovales-oblongues, vert glauque, cerclées de bleu, embrassantes et sessiles tandis que les feuilles âgées sont falciformes, vert-grisâtre, pendantes, à pétiole tordu et orientées verticalement (équivalence des deux faces). Les boutons floraux sont formés d'un calice, en forme de pyramide quadrangulaire, coiffé d'un opercule qui se soulève lors de la floraison laissant apparaître de nombreuses étamines à longs filets blancs et à anthères jaunes. Les fruits sont des capsules de 2 à 2,5 cm de diamètre renfermant des graines noires ou brunâtres. En phytothérapie, trois espèces sont principalement utilisées dans la pharmacopée européenne : l'Eucalyptus globulus Labill, YE. polybractea R.T. Baker et YEucalyptus smithii R.T. Baker. On utilise les feuilles des rameaux les plus âgés (falciformes et pétiolées), l'huile essentielle et l'eucalyptol qui est issu de cette dernière.
Les feuilles d'Eucalyptus sont traditionnellement utilisées par voies orale et locale pour traiter les affections du système respiratoire (bronchite, inflammation de la gorge, nez bouché, rhume...) ou en application pour soigner les blessures, les ulcères de la peau ... L'huile essentielle d'Eucalyptus et l'eucalyptol (ou 1,8-cinéole) entrent dans de nombreuses préparations destinées à traiter les affections des voies respiratoires en raison de leurs activités antiseptique, mucolytique et expectorante. L'huile essentielle est utilisée comme répellent et en médecine vétérinaire.
Les propriétés pharmacologiques connues de l'huile essentielle d'Eucalyptus sont à ce jour : les propriétés antimicrobienne, expectorante et béchique (WICHTL M. et ANTON R., 1999 - Plantes thérapeutiques - 177-179), anti-inflammatoire et anti-asthmatique (JUERGENS et al, 2003 - Anti-inflammatory activity of 1,8-cineol (eucalyptol) in bronchial asthma : a double-bind placebo controlled trial - Respir. Med., 97 (3), 250- 256), anti-diabétique (SWANSTON et al, 1990 - Traditional plant treatments for diabètes. Studies in normal and streptozotocin diabetics rats - Diabetologia, 33 (8), 462- 464), anti-histaminique (IKAWATI Z. and al., 2001 - Screening of several Indonesian medecinal plants for their inhibitory effect on histamine release from RBL-2H3cells - J. EthnopharmacoL, 75 (2-3), 248-256), anticancéreuse (TAKASAKI et al, 2000 - Cancer chemopreventive activity of euglobal-Gl from leaves of Eucalyptus grandis - Cancer LetL, 155 (1) : 61-65), antivirale (TAKASAKI et al, 1990 - Structures of euglobal-Gl, - G2 and G3 from Eucalyptus grandis, three new inhibitors of Epstein virus activation — Chem. Pharm. Bull. 38 (5), 1444-1446) et anti-VIH (WICHTL M. et ANTON R., 1999 - Plantes thérapeutiques - 177-179). De façon inattendue et surprenante, la demanderesse a mis en évidence l'utilisation d'un extrait d'Eucalyptus pour la préparation d'un médicament ou complément alimentaire destiné au traitement et/ou à la prévention des affections ou pathologies découlant d'un désordre de la recapture de neuromédiateurs. Le domaine de la présente invention est donc un extrait d'Eucalyptus pour lequel des propriétés pharmacologiques intéressantes ont été observées et ainsi de nouvelles utilisations en thérapeutique envisagées. La présente invention ne concerne pas l'huile essentielle d'Eucalyptus en tant que telle, pour laquelle une bibliographie abondante avait été relevée. De façon avantageuse, le médicament ou complément alimentaire est destiné à traiter et/ou prévenir des pathologies, découlant d'un désordre de la recapture de neuromédiateurs, choisies dans le groupe :
- des maladies, affections ou troubles neurologiques,
- des maladies, affections ou troubles psychiatriques, - des troubles de la mémoire, de l'attention et de la vigilance associés aux maladies, affections ou troubles neurologiques et psychiatriques, des troubles somatiques fonctionnels,
- la dépendance aux substances addictives.
De façon préférée, le traitement et/ou la prévention desdites affections ou pathologies consiste en une inhibition de la recapture des neuromédiateurs.
Au sens de la présente invention, on entend par « neuromédiateurs » : la dopamine et/ou la sérotonine et/ou la noradrénaline.
Par « Eucalyptus », on entend au sens de la présente invention les espèces appartenant de préférence aux sous-genres Eudesmia, Symphomyrtus et Corymbia et plus particulièrement les espèces suivantes : Eucalyptus glohulus L., Eucalyptus pulverulenta Sims, Eucalyptus kartzoffiana L. A. S. Johnson 1 Blaxell, Eucalyptus macrocarpa Hook., Eucalyptus cinerea F. Muell.ex Benth., Eucalyptus dorrigoensis (Blakely) L.A.S. Johnson 1 K. D. HiIl, Eucalyptus leptopoda Benth., Eucalyptus occidentalis Endl., Eucalyptus viridis R. T. Baker, Eucalyptus polybractea R.T. Baker et Eucalyptus smithii R.T. Baker. Ces exemples illustrent la présente invention sans toutefois en limiter la portée. De façon avantageuse, l'extrait d'Eucalyptus est obtenu à partir des feuilles, fleurs, fruits, tiges ou du tronc d'Eucalyptus ; et préférentiellement des feuilles d'Eucalyptus.
Avantageusement, l'extrait d'Eucalyptus utilisé selon la présente invention est caractérisé en ce qu'il comprend au moins un composé de la formule (I) ou l'une quelconque de ses formes diastéréoisomères.
Ladite formule (I) englobe entre autres 4 composés de la famille des macrocarpal ; il s'agit : - du macrocarpal A : (5-((lR)-l-((llS,7R)-7-hydroxy-3,3,7,ll- tetramethyltricyclo(6.3.0.0(2,4))undec-ll-yl)-3-methylbutyl)-2,4,6- trihydroxybenzene-l,3-dicarbaldehyde) dans lequel Rl forme avec le carbone auquel
^CH3 il est rattaché le groupement OH et R2 représente un β-isobutyle.
Figure imgf000005_0001
Formule brute : C28H4OO6
Masse moléculaire : 472 g/mol
Avantageusement, la fraction massique du macrocarpal A dans l'extrait d'Eucalyptus selon la présente invention est supérieur ou égal à 0,1% et strictement inférieur à 3%.
- du macrocarpal B : (5-((lS)-l-((l lS,7R)-7-hydroxy-333,7,l l- tetramethyltricyclo(6.3.0.0(2,4))undec-ll-yl)-3-methylbutyl)-2,4,6- trihydroxybenzene-l,3-dicarbaldehyde) dans lequel Rl forme avec le carbone auquel
il est rattaché le groupement OH et R2 représente un α-isobutyle.
Figure imgf000006_0001
Formule brute : C28H40O6 Masse moléculaire : 472 g/mol Avantageusement, la fraction massique du macrocarpal B dans l'extrait d'Eucalyptus selon la présente invention est supérieur ou égal à 0,1% et strictement inférieur à 3%.
du macrocarpal C : (5-((lR)-l-((llS)-3,3,l l-trimethyl-7- methylenetricyclo(6.3.0.0(2,4))undec- 11 -yl)-3-methylbutyl)-2 ,4,6- trihydroxybenzene-l,3-dicarbaldehyde) dans lequel Rl forme avec le carbone auquel il est rattaché le groupement C=CH2 et R2 représente un β-isobutyle.
Figure imgf000006_0002
Formule brute : C28H38O5 Masse moléculaire : 454 g/mol
Avantageusement, la fraction massique du macrocarpal C dans l'extrait d'Eucalyptus selon la présente invention est supérieur ou égal à 0,1% et strictement inférieur à 3%.
- du macrocarpal G : (5-(l-(3,3,ll-trimethyl-7-methylenetricyclo(6.3.0.0(2,4))undec- ll-yl)-3-methylbutyl)-2,4,6-trihydroxybenzene-l,3-dicarbaldehyde) dans lequel Rl forme avec le carbone auquel il est rattaché un groupement C=CH2 et R2 représente un isobutyle
Figure imgf000007_0001
Formule brute : C28H38O5 Masse moléculaire : 454 g/mol Avantageusement, la fraction massique du macrocarpal G dans l'extrait d'Eucalyptus selon la présente invention est supérieur ou égal à 0,1% et strictement inférieur à 5%.
Ledit extrait d'Eucalyptus est obtenu par un procédé d'extraction réalisé à partir d'étapes classiques connues de l'homme du métier. Les feuilles, les fleurs, les fruits, les tiges ou le tronc d'Eucalyptus (Eucalyptus sp.) ou un mélange de ces parties sont broyées puis extraites avec un solvant organique pouvant être un alcane (pentane, hexane, heptane, octane, cyclohexane), un éther oxyde (tétrahydrofurane, dioxane, diéthyl éther), un ester (acétate d'éthyle, acétate d'isopropyle), un alcool (méthanol, éthanol, propanol, isopropanol, butanol, octanol), une cétone (méthyléthylcétone, méthylisobutylcétone), un hydrocarbure halogène (chloroforme, dichlorométhane) ou un mélange d'eau et de solvant(s) organique(s) miscible(s) à l'eau (un mélange hydro-alcoolique par exemple).
L'extraction est réalisée dans un ratio plante/solvant compris entre environ 1/1 et environ 1/20 et peut être renouvelée 2 à 3 fois. La température du solvant d'extraction peut être égale à la température ambiante ou supérieure, pouvant atteindre la température d'ébullition du solvant engagé. Le temps de contact de la plante avec le solvant est compris entre environ 30 min et environ 72 heures.
On procède ensuite à une séparation solide/liquide, la plante étant séparée du solvant par filtration ou centrifugation. Le filtrat obtenu peut être soit : mis à sec directement par évaporation totale du solvant d'extraction et constituer l'extrait final ; soit plus ou moins concentré. Dans le cas d'un solvant d'extraction mixte (mélange hydro-alcoolique par exemple) la concentration se poursuit jusqu'à l'évaporation du solvant organique présent. Dans le cas d'un solvant organique, une quantité d'eau est additionnée au concentrât obtenu. Une étape de purification liquide-liquide est réalisée en additionnant à la phase aqueuse un solvant non miscible pouvant être un alcane (de l'hexane par exemple), un éther oxyde (diéthyl éther par exemple), un ester (acétate d'éthyle par exemple), un alcool (butanol par exemple), une cétone (méthyléthylcétone par exemple) ou un hydrocarbure halogène (chloroforme par exemple). Une, deux ou trois extractions liquide-liquide sont réalisées. Les phases organiques réunies peuvent être séchées sur sulfate de sodium avant la mise à sec. Les solutions obtenues sont concentrées sous vide et à une température comprise entre la température ambiante et la température d'ébullition.
Le séchage de l'extrait final est réalisé par lyophilisation ou par des moyens de séchage plus classiques connus de l'homme du métier (nébulisation, étuve ...).
Préférentiellement, les températures de séchage ne dépassent pas 60°C environ. L'extrait peut être stabilisé par addition d'un antioxydant comme par exemple l'acide ascorbique, l'acide citrique à des quantités comprises entre environ 0,05 et environ 1 g pour 100 g d'extrait sec.
Un point tout à fait remarquable de la présente invention réside dans le fait que les propriétés pharmacologiques d'inhibition de la recapture des neuromédiateurs de l'extrait d'Eucalyptus sont d'autant plus intéressantes que ledit extrait est enrichi en au moins 1 des composés de formule (I) ou l'une quelconque de ses formes diastéréoisomères .
Ainsi, ledit extrait d'Eucalyptus est préférentiellement enrichi en au moins 1 composé de la formule (I).
Par « extrait d'Eucalyptus enrichi en macrocarpal A », on entend au sens de la présente invention un extrait d'Eucalyptus dont la fraction massique en macrocarpal A est supérieure ou égale à 3 % et strictement inférieure à 90 %, préférentiellement supérieure ou égale à 3 % et inférieure à 50 %, plus préférentiellement supérieure ou égale à 3 % et inférieure à 40 % et encore plus préférentiellement supérieure ou égale à 3 % et inférieure à 20 %.
Par « extrait d'Eucalyptus enrichi en macrocarpal B », on entend au sens de la présente invention un extrait d'Eucalyptus dont la fraction massique en macrocarpal B supérieure ou égale à 3 % et strictement inférieure à 90 %, préférentiellement supérieure ou égale à 3 % et inférieure à 50 %, plus préférentiellement supérieure ou égale à 3 % et inférieure à 40 % et encore plus préférentiellement supérieure ou égale à 3 % et inférieure à 20 %.
Par « extrait d'Eucalyptus enrichi en macrocarpal C », on entend au sens de la présente invention un extrait d'Eucalyptus dont la fraction massique en macrocarpal C est supérieure ou égale à 3 % et strictement inférieure à 90 %, préférentiellement supérieure ou égale à 3 % et inférieure à 50 %, plus préférentiellement supérieure ou égale à 3 % et inférieure à 40 % et encore plus préférentiellement supérieure ou égale à 3 % et inférieure à 20 %.
Par « extrait d'Eucalyptus enrichi en macrocarpal G », on entend au sens de la présente invention un extrait d'Eucalyptus dont la fraction massique en macrocarpal G est supérieure ou égale à 5 % et strictement inférieure à 90 %, préférentiellement supérieure ou égale à 5 % et inférieure à 50 %, plus préférentiellement supérieure ou égale à 5 % et inférieure à 40 % et encore plus préférentiellement supérieure ou égale à 5 % et inférieure à 20 %.
La demanderesse a montré l'influence d'un extrait d'Eucalyptus sur la recapture de la dopamine et/ou de la noradrénaline et/ou de la sérotonine.
De par ses propriétés pharmacologiques d'inhibiteur de la recapture de ces neuromédiateurs, ledit extrait est particulièrement utile à la préparation d'un médicament ou complément alimentaire destiné à traiter et/ou à prévenir de nombreuses affections ou pathologies résultant d'un défaut de dopamine et/ou sérotonine et/ou noradrénaline. Parmi les affections ou pathologies pouvant être traitées et/ou prévenues à l'aide d'un extrait d'Eucalyptus selon la présente invention, il convient de citer à titre d'exemples illustratifs et non limitatifs
- les maladies, affections ou troubles neurologiques : telles que les maladies neurodégénératives (maladie d'Alzheimer, Chorée de Huntington, maladie de Parkinson, accidents vasculaires cérébraux, traumatisme crânien), la sclérose latérale amyotrophique, les démences séniles, les démences fronto-temporales, les démences vasculaires, la migraine, les douleurs neuropathiques d'origine centrale ; - les maladies, affections ou troubles psychiatriques : telles que la dépression (endogène, résistante, réactive ou iatrogène), l'état dépressif, la schizophrénie, le trouble bipolaire, l'anxiété généralisée, les maladies liées au stress, les attaques de panique, les troubles obsessionnels compulsifs, les syndromes de stress post- traumatiques, les troubles de l'attention et de Phyperactivité, les troubles de conduites alimentaires (notamment la boulimie, l'anorexie), la phobie (notamment l'agoraphobie), l'autisme ;
- les troubles de la mémoire, de l'attention et de la vigilance associés aux maladies, affections ou troubles neurologiques et psychiatriques ;
- les troubles somatiques fonctionnels : tels que le syndrome de fatigue chronique, la fibromyalgie, le syndrome du colon irritable, les reflux gastro-oesophagiens, la perte de la libido, les troubles de l'érection, les incontinences urinaires.
- la dépendance aux substances addictives : notamment la nicotine, l'alcool, les opiacées, les cannabinoïdes, les psychostimulants. En effet, le médicament ou le complément alimentaire selon l'invention est avantageusement destiné à induire un sevrage à la nicotine, à l'alcool, aux opiacées, aux cannabinoïdes, aux psychostimulants et à prévenir la rechute chez des sujets abstinents. Le médicament ou le complément alimentaire selon l'invention est avantageusement utilisé comme traitement de substitution aux substances addictives et pour prévenir et/ou traiter le syndrome dépressif associé au sevrage.
L'homme du métier pourra reconnaître d'autres pathologies dont le traitement nécessite une telle inhibition.
La Demanderesse précise ici, de façon non restrictive, quelques références bibliographiques qui rappellent le lien entre des pathologies et leur traitement à l'aide d'un inhibiteur triple de recapture de dopamine et/ou sérotonine et/ou noradrénaline. Un exemple de chaque « groupe » a été relevé.
La dopamine, la sérotonine et la noradrénaline concourent au développement et à la survie des neurones (Lauder J.M., Trends Neurosci, 1993, 16; 233). Certaines pathologies neurologiques comme la maladie de Parkinson (Hornykiewicz O., Adv Cytopharmacol. 1971, 1; 369) résulte d'une déficience en dopamine; des inhibiteurs de monoamine oxydases, qui augmentent les taux de dopamine, sérotonine et noradrénaline sont utilisés pour traiter la maladie de Parkinson et d'autres affections neurologiques (Ebadi M., Curr Drug Targets. 2006, 7; 1513). L'extrait d'Eucalyptus selon la présente invention peut donc être avantageusement utilisé dans le traitement de ces maladies neurologiques.
La dépression est une pathologie fréquente de l'humeur, caractérisée par des sentiments de la tristesse intense, de pensées pessimistes, d'auto-dépréciation, souvent accompagnée de la perte d'allant, d'enthousiasme et de libido. L'incapacité de ressentir du plaisir d'expériences normalement agréables, également connue sous le nom d'anhédonie, est également considérée comme un symptôme fréquent dans la dépression. La dépression est actuellement traitée par des inhibiteurs sélectifs de la recapture de sérotonine, tels que fluoxétine, citalopram ou paroxétine, des inhibiteurs sélectifs de la recapture de noradrénaline tels que réboxétine, ou encore des inhibiteurs mixtes de la recapture de sérotonine et noradrénaline tels que milnacipran ou venlafaxine. Cependant, un rôle important a été attribué aux neurones dopaminergiques projetant à une région de cerveau appelée le noyau accumbens, dans le plaisir et la motivation (Koob G.F. Sem. Neurosci. 1992, 4, 139 ; Salamone J.D. Behav. Brain Res. 1994, 61, 117). Les symptômes de la dépression peuvent donc être avantageusement traités par un inhibiteur de la recapture de la dopamine, de la sérotonine et de la noradrénaline tel que l'extrait d'Eucalyptus selon la présente invention.
L'absorption de substances addictives dont la nicotine augmente les taux extracellulaires de dopamine dans le striatum ventral chez l'animal (Di Chiara G et Imperato A., Proc Natl Acad Sci U S A. 1988, 85 ; 5274) et l'homme (Brody et al., Am J Psychiatry, 2004, 161 ; 1211). Le sevrage tabagique peut s'accompagner d'un syndrome dépressif (Wilhelm K et al., Drug Alcohol Rev, 2006, 25 ; 97). L'extrait d'Eucalyptus selon la présente invention peut donc être avantageusement utilisé comme traitement de substitution aux substances addictives, telles que la nicotine, et pour prévenir ou traiter le syndrome dépressif associé au sevrage. Les troubles fonctionnels, encore appelés somatotropes, sont des troubles qui concernent les grandes fonctions physiologiques, et qui ne seraient pas dus à des lésions organiques mais à la manière de fonctionner des organes (foie, coeur...). Les troubles somatiques fonctionnels peuvent être à l'origine d'une maladie qui se déclarera ultérieurement. Parmi ces troubles, la flbromyalgie est un trouble associant douleurs diffuses ou localisées, fatigue chronique, symptômes dépressifs, troubles de mémoire et de concentration (Rooks DS., Curr Opin Rheumatol. 2007, 19; 111). Les symptômes de la fibromyalgie sont traités par des inhibiteurs de recapture mixtes noradrénaline/sérotonine (Vitton O., Hum Psychopharmacol. 2004, 19 Suppl 1:S27). L'addition d'une composante favorisant le tonus dopaminergique, comme dans l'extrait d'Eucalyptus selon la présente invention est avantageux pour la préparation d'un médicament ou complément alimentaire destiné à traiter et/ou prévenir les troubles somatiques fonctionnels.
De façon avantageuse, ledit médicament se présente sous une forme orale ou injectable.
Avantageusement, la forme orale est choisie parmi le groupe composé de comprimé, gélule, capsule, des préparations liquides telles que des sirops, des solutions buvables ou des poudres pour suspensions buvables.
De façon avantageuse, ledit complément alimentaire (ou nutraceutique ou diététique) est conditionné sous forme de doses, à savoir les formes de présentation telles que les gélules, les pastilles, les comprimés, les pilules et autres formes similaires, ainsi que les sachets de poudre, les ampoules de liquide, les flacons munis d'un compte- gouttes et les autres formes analogues de préparations liquides ou en poudre destinées à être prises en unités mesurées de faible quantité.
Les résultats obtenus à partir d'un extrait d'Eucalyptus enrichi en au moins un composé de formule (I) ou l'une quelconque de ses formes diastéréoisomères selon la présente invention montrent que les bénéfices de la présente invention peuvent être étendus à toute composition à base d'au moins un composé de formule (I) ou l'une quelconque de ses formes diastéréosiomères, que celui-ci soit obtenu par voie chimique, biochimique ou à partir d'un extrait végétal.
La présente invention concerne donc également l'utilisation d'au moins un composé de formule (I) ou l'une quelconque de ses formes diastéréosiomères pour la préparation d'un médicament ou complément alimentaire destiné au traitement et/ou à la prévention des affections ou pathologies neurologiques, psychiatriques et troubles associés, des syndromes somatiques fonctionnels et des dépendances aux substances addictives, découlant d'un désordre de la recapture des neuromédiateurs. De façon préférée, le traitement et/ou prévention desdites affections ou pathologies consiste en une inhibition de la recapture de neuromédiateurs. De par ses propriétés pharmacologiques d'inhibiteur de la recapture de ces neuromédiateurs, les composés de formule (I) et ses formes diastéréoisomères sont particulièrement utiles à la préparation d'un médicament ou complément alimentaire destiné à traiter et/ou à prévenir de nombreuses affections ou pathologies résultant d'un défaut de dopamine et/ou sérotonine et/ou noradrénaline.
Parmi les affections ou pathologies pouvant être traitées et/ou prévenues à l'aide desdits composés selon la présente invention, il convient de citer à titre d'exemples illustratifs et non limitatifs
- les maladies, affections ou troubles neurologiques : telles que les maladies neurodégénératives (maladie d'Alzheimer, Chorée de Huntington, maladie de Parkinson, accidents vasculaires cérébraux, traumatisme crânien), la sclérose latérale amyotrophique, les démences séniles, les démences fronto-temporales, les démences vasculaires, la migraine, les douleurs neuropathiques d'origine centrale.
- les maladies, affections ou troubles psychiatriques : telles que la dépression (endogène, résistante, réactive ou iatrogène), l'état dépressif, la schizophrénie, le trouble bipolaire, l'anxiété généralisée, les maladies liées au stress, les attaques de panique, les troubles obsessionnels compulsifs, les syndromes de stress post- traumatiques, les troubles de l'attention et de l'hyperactivité, les troubles de conduites alimentaires (notamment la boulimie, l'anorexie), la phobie (notamment l'agoraphobie), l'autisme ;
- les troubles de la mémoire, de l'attention et de la vigilance associés aux maladies, affections ou troubles neurologiques et psychiatriques ;
- les troubles somatiques fonctionnels : tels que le syndrome de fatigue chronique, la fibromyalgie, le syndrome du colon irritable, les reflux gastro-oesophagiens, la perte de la libido, les troubles de l'érection, les incontinences urinaires.
- la dépendance aux substances addictives : notamment la nicotine, l'alcool, les opiacées, les cannabinoïdes, les psychostimulants. En effet, le médicament ou le complément alimentaire selon l'invention est avantageusement destiné à induire un sevrage à la nicotine, à l'alcool, aux opiacées, aux cannabinoïdes, aux psychostimulants et à prévenir la rechute chez des sujets abstinents. Le médicament ou le complément alimentaire selon l'invention est avantageusement utilisé comme traitement de substitution aux substances addictives et pour prévenir et/ou traiter le syndrome dépressif associé au sevrage.
L'homme du métier pourra reconnaître d'autres pathologies dont le traitement nécessite une telle inhibition.
Avantageusement, la présente invention concerne l'utilisation de macrocarpal A, macrocarpal B, macrocarpal C et/ou macrocarpal G pour la préparation d'un médicament ou d'un complément alimentaire destiné au traitement et/ou à la prévention des affections ou pathologies neurologiques, psychiatriques et troubles associés, des syndromes somatiques fonctionnels et des dépendances aux substances addictives, découlant d'un désordre de la recapture de la dopamine et/ou de la sérotonine et/ou de la noradrénaline.
Des tests réalisés avec les composés de formule (I) et ses formes diastéréoisomères ont montré que ces composés agissent sur l'inhibition de la recapture de la dopamine et/ou de la sérotonine et/ou de la noradrénaline.
De façon avantageuse, ledit médicament se présente sous une forme orale ou injectable.
Les composés de formule (I) et ses formes diastéréoisomères selon la présente invention peuvent être obtenus par purification d'un extrait végétal ou par synthèse chimique ou biochimique tel que décrit dans Total Synthesis of (-)-Macrocarpal C. Stereoselective Coupling Reaction with a Novel Hexasubstituted Benzène Cr(CO)3 Complex as a Biomimetic Chiral Benzyl Cation Equivalent / Tanaka, Tetsuaki ; Mikamiyama, Hidenori ; Maeda, Kimiya ; Iwata, Chuzo ; In, Yasuko ; Ishida, Toshimasa / Journal of Organic Chemistry (1998), 63(26), 9782-9793.
Lesdits composés peuvent être isolés de « l'extrait d'eucalyptus » ou de « l'extrait enrichi en au moins un macrocarpal de formule (I) ». Les techniques permettant sa purification sont des techniques chromatographiques classiques pour l'homme de métier. Les extraits sont fractionnés sur colonne préparative ayant pour phase stationnaire une phase inverse, de préférence Symetry Shield®, 5μm (Waters) et pour phase mobile, un mélange acétonitrile / eau / acide trifluoroacétique dans les proportions 95 /5 /0,1%. La pureté en composé de formule (I) d'une telle fraction est supérieure ou égale à 90%. Préférentiellement, la pureté en macrocarpal A, macrocarpal B, macrocarpal C et/ou macrocarpal G d'une telle fraction est supérieure ou égale à 90%.
Selon la présente invention, on peut raisonnablement envisager que le macrocarpal A et/ou le macrocarpal B et/ou le macrocarpal C et/ou le macrocarpal G soient utilisés pour la préparation d'un médicament ou d'un complément alimentaire destiné à traiter et/ou prévenir le surpoids ou l'obésité.
La présente invention concerne également un extrait enrichi d'Eucalyptus caractérisé en ce qu'il contient au moins 1 composé de formule (I) ou l'une quelconque de ses formes diastéréoisomères :
Figure imgf000015_0001
dans laquelle Rl forme avec le carbone auquel il est rattaché un groupement
^CH3 ^CH3 cCCH3 C=CH2, un groupement 0H , 0H ou 0H et R2 représente un groupement isobutyle, α-isobutyle ou β-isobutyle et en ce que: la fraction massique du macrocarpal A est supérieure ou égale à 3% et strictement inférieure à 90%, préférentiellement supérieure ou égale à 3 % et inférieure à 50 %, plus préférentiellement supérieure ou égale à 3 % et inférieure à 40 % et encore plus préférentiellement supérieure ou égale à 3 % et inférieure à 20 %. la fraction massique du macrocarpal B est supérieure ou égale à 3% et strictement inférieure à 90%, préférentiellement supérieure ou égale à 3 % et inférieure à 50 %, plus préférentiellement supérieure ou égale à 3 % et inférieure à 40 % et encore plus préférentiellement supérieure ou égale à 3 % et inférieure à 20 %. la fraction massique du macrocarpal C est supérieure ou égale à 3% et strictement inférieure à 90%, préférentiellement supérieure ou égale à 3 % et inférieure à 50 %, plus préférentiellement supérieure ou égale à 3 % et inférieure à 40 % et encore plus préférentiellement supérieure ou égale à 3 % et inférieure à 20 %. et la fraction massique du macrocarpal G est supérieure ou égale à 5% et strictement inférieure à 90%, préférentiellement supérieure ou égale à 5 % et inférieure à 50 %, plus préférentiellement supérieure ou égale à 5 % et inférieure à 40 % et encore plus préférentiellement supérieure ou égale à 5 % et inférieure à 20 %.
De façon préférée, la présente invention concerne l'utilisation dudit extrait enrichi d'Eucalyptus comme médicament ou complément alimentaire.
La présente invention concerne enfin un procédé de préparation d'un tel extrait enrichi d'Eucalyptus.
Le procédé d'obtention dudit extrait consiste en les étapes suivantes : - broyage de feuilles et/ou de fleurs et/ou de fruits et/ou de tiges et/ou de tronc d'Eucalyptus au moins une extraction avec un solvant organique ou un mélange d'eau et de solvant(s) organique(s) miscible(s) à l'eau. L'extraction est réalisée dans un ratio plante/solvant compris entre environ 1/1 et environ 1/20 et peut être renouvelée 2 à 3 fois. La température du solvant d'extraction peut être égale à la température ambiante ou supérieure, pouvant atteindre la température d'ébullition du solvant engagé. Le temps de contact de la plante avec le solvant est compris entre environ 30 min et environ 72 heures. De façon préférée, le solvant est choisi dans le groupe composé un alcane (pentane, hexane, heptane, octane, cyclohexane), un éther oxyde
(tétrahydrofurane, dioxane, diéthyl éther), un ester (acétate d'éthyle, acétate d'isopropyle), un alcool (méthanol, éthanol, propanol, isopropanol, butanol, octanol), une cétone (méthyléthylcétone, méthylisobutylcétone), un hydrocarbure halogène (chloroforme, dichlorométhane) ou un mélange d'eau et de solvants organiques miscibles à l'eau (un mélange hydro-alcoolique par exemple).
Préférentiellement, le solvant d'extraction est du dichlorométhane ou de l'acétate d'isopropyle. Dans le cas d'un solvant d'extraction miscible avec de l'eau, le filtrat est mis à sec puis dissous dans un solvant non miscible à l'eau.
Dans le cas d'un solvant non miscible avec l'eau, le filtrat est concentré.
Séparation solide/liquide par des techniques connues de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation préférée de l'invention, une ou plusieurs extractions liquide- liquide sont réalisées par addition d'une base, préférentiellement du carbonate de sodium (Na2CO3). Les phases aqueuses basiques réunies sont acidifiées par addition d'acide, préférentiellement l'acide chlorhydrique (HCl) puis extraites par une à plusieurs extractions liquide-liquide réalisées avec un solvant non miscible avec de l'eau. Avantageusement, l'acidification conduit à l'obtention d'un pH environ égal à 1.
Les phases organiques réunies peuvent être séchées sur sulfate de sodium puis concentrées sous vide à une température variant de la température ambiante à celle d'ébullition.
Le concentrât est séché par des moyens de séchage classiques (nébulisation, étuve ...) à des températures ne dépassant pas 6O0C de préférence et constitue l'extrait enrichi en macrocarpal G. Cet extrait peut être stabilisé par addition d'un, antioxydant comme par exemple l'acide ascorbique ou l'acide citrique à des quantités comprises entre 0,05 à 1 g pour 100 g d'extrait sec.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'extrait d'eucalyptus ou l'extrait d'Eucalyptus dit « enrichi en au moins un composé de la formule (I) ou l'une quelconque de ses formes diastéréoisomères » est également obtenu par un procédé d'extraction utilisant un fluide supercritique comme solvant d'extraction. Les feuilles, les fleurs, les fruits, les tiges ou le tronc d'Eucalyptus (Eucalyptus sp.) ou un mélange de ces parties sont broyées ou non, puis extraites avec un fluide supercritique pouvant être du dioxyde de carbone.
Une première extraction par du CO2 supercritique, préférentiellement, est réalisée dans les conditions suivantes: - la température du fluide est comprise entre environ 40°C et environ 8O0C, et préférentiellement entre environ 40°c et environ 600C ; sa pression est comprise entre environ 80 bars et environ 250 bars, et préférentiellement entre environ 100 bars et environ 200 bars ; la durée d'extraction est comprise entre 1 heure environ et 6 heures environ ; le débit du fluide sera adapté par l'Homme du Métier en fonction de la quantité de matière à extraire et de la taille de l'autoclave utilisé. De façon préférée, le débit de C02 utilisé dans le procédé selon la présente invention est compris entre 2 à 15 kg / heure, avantageusement 8 à 12 kg / heure ; * pour une quantité de plante comprise entre 200 et 1000 grammes, préférentiellement 500 grammes environ, " et pour un autoclave de capacité comprise entre 2 et 10 litres, préférentiellement de capacité de 5 litres environ.
Lors de cette première étape d'extraction, il est possible d'ajouter un co-solvant organique, de la famille des alcools (dont l'éthanol), des éthers oxyde, des esters ou un mélange de deux ou plusieurs de ces solvants.
La plante ainsi extraite peut ensuite être soumise à une deuxième extraction de façon optionnelle. Le fluide d'extraction est, préférentiellement, le CO2 supercritique avec ou sans co-solvant. Les conditions opératoires sont : - la température du fluide est comprise entre environ 400C et environ 80°C, et préférentiellement entre environ 40°c et environ 6O0C ; sa pression est comprise entre environ 80 bars et environ 250 bars, et préférentiellement entre environ 100 bars et environ 200 bars ; le débit du fluide est compris entre 2 à 15 kg / heure, avantageusement 8 à 12 kg /heure ;
" pour une quantité de plante comprise entre 200 et 1000 grammes, préférentiellement 500 grammes environ, " et pour un autoclave de capacité comprise entre 2 et 10 litres, préférentiellement de capacité de 5 litres environ. Avantageusement, l'extraction est réalisée dans un ratio massique plante/co- solvant compris entre environ 1/0,1 et 1/5.
Cette deuxième étape d'extraction peut être renouvelée si nécessaire. La durée d'extraction est comprise entre environ 1 heure et environ 3 heures par étape d'extraction additionnelle. On procède ensuite à l'évaporation de l'extrait obtenu.
L'Homme du Métier adaptera les conditions opératoires de ce procédé par fluide supercritique pour obtenir un extrait d'Eucalyptus plus ou moins enrichi. Le séchage de l'extrait final est réalisé par lyophilisation ou par des moyens de séchage plus classiques connus de l'homme du métier (nébulisation, étuve, ...). Préférentiellement, les températures de séchage ne dépassent pas 60°C environ. L'extrait peut être stabilisé par addition d'un antioxydant comme par exemple l'acide ascorbique, l'acide citrique à des quantités comprises entre environ 0,05 et environ 1 g pour 100 g d'extrait sec.
L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants, qui toutefois n'en limitent pas la portée.
Exemple 1 : Préparation d'un extrait d 'Eucalyptus globulus
Les feuilles d'Eucalyptus globulus sont broyées puis extraites avec 5 volumes d'éthanol à température ambiante. Le temps de contact de la plante avec le solvant est de 48 heures.
La plante est séparée du solvant par filtration.
Le filtrat obtenu est séché sous vide à une température de 60°C. L'extrait ainsi obtenu sera utilisé pour les tests in vitro présentés à l'exemple 5.
L'extrait obtenu contient environ 0,65 g de macrocarpal A, environ 0,7 g de macrocarpal
B, environ 0,4 g de macrocarpal C et environ 1 g de macrocarpal G pour 100g d'extrait sec.
Exemple 2 : Préparation d'un extrait d'Eucalyptus globulus Les feuilles d'Eucalyptus globulus sont broyées puis extraites 3 fois à reflux avec 5 volumes d'éthanol 50% v/v. Le temps de contact de la plante avec le solvant est d' 1 heure environ. La plante est séparée du solvant par filtration. Le filtrat obtenu est concentré jusqu'à 0,5 volume. La purification liquide-liquide est réalisée en additionnant du dichlorométhane. Trois extractions liquide-liquide sont réalisées. Les phases organiques sont réunies et séchées sur sulfate de sodium. Le séchage de l'extrait final est réalisé à 60°C sous vide.
L'extrait obtenu contient environ 1,3 g de macrocarpal A, environ 1,4 g de macrocarpal B, environ 0,8 g de macrocarpal C, et environ 2 g de macrocarpal G pour 100g d'extrait sec.
Exemple 3 : Préparation d'un extrait d'Eucalyptus globulus
Les feuilles d'Eucalyptus globulus sont broyées puis extraites à reflux 2 fois avec 5 volumes du mélange éthanol-eau 50% v/v pendant 1 heure environ. La plante est séparée du solvant par filtration.
Le filtrat obtenu est concentré puis stabilisé par l'addition de 0,1 g pour 100 g d'extrait sec d'acide citrique.
Le concentrât est congelé puis séché par lyophilisation. L'extrait obtenu contient environ 0,3 g de macrocarpal A, environ 0,35 g de macrocarpal B, environ 0,2 g de macrocarpal C et environ 0,5 g de macrocarpal G pour 100g d'extrait sec.
Exemple 4: 537 g de feuilles d'Eucalyptus sont broyées, puis placées dans un autoclave. Elles sont extraites durant 4 heures par du CO2 supercritique à 400C, 150 bar, avec un débit de 10 kg/h.
Les feuilles ainsi extraites sont soumises à une deuxième extraction par un mélange CO2 supercritique /éthanol à 150 bar, 5O0C. On engage 1 volume d'éthanol pour 1 poids de plante. On extrait ainsi pendant 2hl5, puis on sèche les feuilles par passage de CO2 seul dans les mêmes conditions opératoires, pendant 30 minutes.
On récupère 273,7 g d'extrait que l'on sèche par évaporation du solvant. On obtient ainsi 27,9g d'un extrait contenant 6,85 g de Macrocarpal G pour 100g d'extrait sec.
Exemple 5 : Evaluation de l'extrait de feuilles d'Eucalyptus globulus sur la recapture de la sérotonine, dopamine et noradrénaline.
Les tests de capture ont été réalisés in vitro sur des synapses de rats. 1) Evaluation de la recapture de la sérotonine (ou 5-HT)
Le protocole utilisé pour cette évaluation est celui décrit dans Perovic , S. and Muller W.E.G., 1995 - Pharmacological profile of hypericum extract : effect on serotonin uptake by postsynaptic receptors, Arzneim-Forsch. Drug Res., 45 : 1145-1148.
Le principe en est le suivant : les synapses issues de cerveaux de rat sont mises à incuber pendant 15 min à 370C avec
0,1 μCi [3H] -sérotonine en présence ou en absence (contrôle) de l'extrait d'Eucalyptus globulus préparé selon l'exemple 1 ou de l'imipramine (référence) dans un tampon contenant 118 mM de NaCl, 5mM de KCl, 2.5 mM MgSO4, 1.2mM de NaH2PO4, 25 mM de NaHCO3, 11 mM de glucose, 10 μM d'EGTA et 50 μM d'acide ascorbique (PH=7.4). L'activité basale est déterminée en incubant le même mélange pendant 15 min à 370C en présence de 10 μM d'imipramine pour bloquer la recapture.
A la suite de l'incubation, les échantillons sont filtrés rapidement sous vide à travers des filtres en fibre de verre (GB/B, Packard) et rincés deux fois avec du tampon d'incubation glacé pour éliminer la [3H]-sérotonine libre. Les filtres sont séchés et la radioactivité retenue est mesurée par un compteur de scintillation (Topcount, Packard) en utilisant un cocktail de scintillation (Microscint O5 Packard).
Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de recapture de la[ H]-sérotonine du contrôle (cf. tableau 1). 2) Evaluation de la recapture de la dopamine (ou DA)
Le protocole utilisé pour cette évaluation est celui décrit dans Janowsky A. Berger P., Vocci F., Labarca R., Skolnick P., and Paul S.M., 1996 - Charcaterization of sodium- dependent [3H]GBR- 12935 binding in brain : a radioligand for sélective labelling of the dopamine transport complex, J. Neurochem., 46, 1272-1276. Le principe en est le suivant : le milieu synaptique (synapses de striatum de rat) est mis à incuber pendant 15 min à 37°C avec 0,1 μCi [3H]-DA en présence ou en absence (contrôle) de l'extrait ^Eucalyptus gïobulus préparé selon l'exemple 1 ou de GBR 12909 (référence) dans la solution tampon (cf. recapture de la sérotonine). L'activité basale est déterminée en incubant le même mélange pendant 15 min à 37°C en présence de 10 μM de GBR 12909 pour bloquer la recapture.
A la suite de l'incubation, les échantillons sont filtrés rapidement sous vide à travers des filtres en fibre de verre (GB/B, Packard) et rincés deux fois avec du tampon d'incubation glacé pour éliminer la [3H]-dopamine libre. Les filtres sont séchés et la radioactivité retenue est mesurée par un compteur de scintillation (Topcount, Packard) en utilisant un cocktail de scintillation (Microscint O, Packard).
Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de recapture de la [3H]-dopamine du contrôle (cf. tableau 1).
3) Evaluation de la recapture de la noradrénaline (ou NE) Le protocole utilisé pour cette évaluation est celui décrit dans Perovic , S. and Muller W.E.G., 1995 - Pharmacological profile of hypericum extract : effect on serotonin uptake by postsynaptic receptors, Arzneim-Forsch. Drug Res., 45 : 1145-1148. Le principe en est le suivant : le milieu synaptique (synapses d'hypothalamus de rat) est mis à incuber pendant 20 min à 370C avec 0,1 μCi [3H]-NE en présence ou en absence (contrôle) de l'extrait d'Eucalyptus gïobuîus préparé selon l'exemple 1 ou de la protriptylline (référence) dans la solution tampon (cf. recapture de la sérotonine).
L'activité basale est déterminée en incubant le même mélange pendant 20 min à 37°C en présence de 10 μM de protriptylline pour bloquer la recapture.
A la suite de l'incubation, les échantillons sont filtrés rapidement sous vide à travers des filtres en fibre de verre (GBfB, Packard) et rincés deux fois avec du tampon d'incubation glacé pour éliminer la [3H]-NE libre. Les filtres sont séchés et la radioactivité retenue est mesurée par un compteur de scintillation (Topcount, Packard) en utilisant un cocktail de scintillation (Microscint O, Packard).
Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de recapture de la [ H]- noradrénaline du contrôle (Cf. tableau 1). 4) Résultats :
Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de recapture du neuromédiateur évalué (cf. tableau 1).
Figure imgf000022_0001
Tableau 1 : Evaluation de l'extrait de feuilles d'Eucalyptus globulus sur la recapture de la sérotonine, dopamine et noradrénaline. On observe une inhibition significative de la recapture de la sérotonine et de la dopamine à 10 μg/ml et des trois neurotransmetteurs à 100 μg/ml.
Exemple 6 : Evaluation d'un extrait d'Eucalyptus enrichi en macrocarpal G vs extrait d'Eucalyptus sans macrocarpal G et vs macrocarpal G pur
Les feuilles d'Eucalyptus globulus sont broyées puis extraites par 5 volumes de dichlorométhane. L'extraction est réalisée deux fois à reflux pendant 1 heure. On procède ensuite à une filtration sous vide. Les filtrats réunis sont concentrés jusqu'à 2 volumes.
Trois extractions liquide-liquide sont réalisées par addition d'un volume de carbonate de sodium (Na2CO3)à 0,1 M.
La phase dichlorométhane épuisée est conservée. Après séchage sur sulfate de sodium, concentration et mise à sec sous vide à 60°C, le résidu obtenu constitue « l'extrait appauvri en macrocarpal » (la fraction massique de macrocarpal G étant inférieure à 0,1
%).
Les phases aqueuses basiques réunies sont acidifiées par addition d'acide chlorhydrique
(HCl) 1 M jusqu'à l'obtention d'un pH environ égal à 1 puis extraites par 3 extractions liquide-liquide avec du dichlorométhane. Les phases organiques sont séchées sur sulfate de sodium puis concentrées et mises à sec sous vide à 600C maximum. Le résidu sec obtenu constitue « l'extrait enrichi en macrocarpal G ». Ce dernier renferme une fraction massique de macrocarpal G de 7%.
L'extrait enrichi est fractionné sur une colonne préparative ayant pour phase stationnaire une phase inverse, Symetry Shield®, 5μm (Waters) et pour phase mobile, un mélange acétonitrile / eau / acide trifluoroacétique dans les proportions 95 /5 /0,1%.
La pureté en macrocarpal G de la fraction obtenue est d'environ 97%.
Le protocole ensuite utilisé est identique à celui de l'exemple 5 en ce qui concerne l'évaluation de la recapture de la sérotonine. Les résultats obtenus sont répertoriés dans le tableau 2 ci-après.
Figure imgf000024_0001
Tableau 2 : Comparaison de l'activité d'un « extrait enrichi en macrocarpal G », d'un « extrait sans macrocarpal G » et d'une fraction enrichie en macrocarpal G sur la recapture de sérotonine.
On observe que le pourcentage d'inhibition de recapture de la sérotonine est d'autant plus significatif que la teneur en macrocarpal G est élevée.
Exemple 7 : Détermination de la concentration inhibitrice à 50% (CI50) du macrocarpal A, du macrocarpal B, du macrocarpal C et du macrocarpal G sur la recapture des neuromédiateurs comparativement à celle de l'hyperforine.
Les protocoles suivis sont ceux de l'exemple 5. Ils ont été répétés pour différentes concentrations en macrocarpal A, B, C et G et en hyperforine.
Les courbes d'inhibition obtenues ont permis d'obtenir les valeurs CI50 ci-après :
Figure imgf000025_0001
Tableau 3 : Détermination de la concentration inhibitrice à 50% (CI50) du macrocarpal A, du macrocarpal B, du macrocarpal C et du macrocarpal G et de l'hyperforine sur la recapture de la sérotonine, de la noradrénaline et de la dopamine
Ces résultats ont permis de mettre en évidence que les 4 composés sont porteurs de l'activité d'inhibition de la recapture de neuromédiateurs. De plus, on observe que les niveaux d'activité de ces 4 composés sont d'ordre équivalent.

Claims

9e; -REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un extrait d'Eucalyptus pour la préparation d'un médicament ou d'un complément alimentaire destiné au traitement et/ou à la prévention des affections ou pathologies neurologiques, psychiatriques et troubles associés, des syndromes somatiques fonctionnels et des dépendances aux substances addictives, découlant d'un désordre de la recapture de la dopamine et/ou de la sérotonine et/ou de la noradrénaline.
2. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que le traitement et/ou la prévention desdites affections ou pathologies neurologiques, psychiatriques et troubles associés, des syndromes somatiques fonctionnels et des dépendances aux substances addictives consiste en une inhibition de la recapture de la dopamine et/ou de la sérotonine et/ou de la noradrénaline.
3. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit extrait d'Eucalyptus comprend au moins un composé de formule (I) ou l'une quelconque de ses formes diastéréoisomères :
Figure imgf000026_0001
dans laquelle Rl forme avec le carbone auquel il est rattaché un groupement
C .CH, >CH3 cCCH3
C=CH2, un groupement ^" , ^π ou wπ et R2 représente un groupement isobutyle, α-isobutyle ou β-isobutyle.
4. Utilisation selon la revendication 3 caractérisée en ce que le composé de formule
(I) est le macrocarpal A (5-((lR)-l-((llS,7R)-7-hydroxy-3,3,7,ll- tetramethyltricyclo(6.3.0.0(2,4))undec-l l-yl)-3-methylbutyl)-2,4,6- trihydroxybenzene-l,3-dicarbaldehyde) dans lequel Rl forme avec le carbone c^CH3 auquel il est rattaché le groupement et R2 représente un β-isobutyle ; et que sa fraction massique dans l'extrait d'Eucalyptus est supérieure ou égale à 0,1% et strictement inférieure à 3%.
5. Utilisation selon la revendication 3 caractérisée en ce que le composé de formule
(I) est le macrocarpal B (5-((lS)-l-((llS,7R)-7-hydroxy-3,357,ll- tetramethyltricyclo(6.3.0.0(2,4))undec-ll-yl)-3-methylbutyl)-2,4,6- trihydroxybenzene-l,3-dicarbaldehyde) dans lequel Rl forme avec le carbone
^CH3 auquel il est rattaché le groupement ΩH et R2 représente un α-isobutyle ; et que sa fraction massique dans l'extrait d'Eucalyptus est supérieure ou égale à
0,1% et strictement inférieure à 3%.
6. Utilisation selon la revendication 3 caractérisée en ce que le composé de formule (I) est le macrocarpal C (5-((lR)-l-((llS)-3,3,l l-trimethyl-7- methylenetricyclo(6.3.0.0(2,4))undec-l l-yl)-3-methylbutyl)-2 ,4,6- trihydroxybenzene-l,3-dicarbaldehyde) dans lequel Rl forme avec le carbone auquel il est rattaché le groupement C=CH2 et R2 représente un β-isobutyle ; et que sa fraction massique dans l'extrait d'Eucalyptus est supérieure ou égale à 0,1% et strictement inférieure à 3%.
7. Utilisation selon la revendication 3 caractérisée en ce que le composé de formule
(I) est le macrocarpal G (5-(l-(3,3,ll-trimethyl-7- methylenetricyclo(6.3.0.0(2,4))undec-ll-yl)-3-methylbutyl)-2,4,6- trihydroxybenzene-l,3-dicarbaldehyde) dans lequel Rl forme avec le carbone auquel il est rattaché un groupement C=CH2 et R2 représente un isobutyle ; et que sa fraction massique dans l'extrait d'Eucalyptus est supérieure ou égale à 0,1% et strictement inférieure à 5%.
8. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit extrait d'Eucalyptus est enrichi en au moins 1 composé de formule (I) telle que définie à la revendication 3.
9. Utilisation selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'extrait d'Eucalyptus est enrichi en macrocarpal A, ledit extrait enrichi en macrocarpal A contenant une fraction massique de macrocarpal A supérieure ou égale à 3% et strictement inférieure à 90%.
10. Utilisation selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'extrait d'Eucalyptus est enrichi en macrocarpal B, ledit extrait enrichi en macrocarpal B contenant une fraction massique de macrocarpal B supérieure ou égale à 3% et strictement inférieure à 90%.
11. Utilisation selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'extrait d'Eucalyptus est enrichi en macrocarpal C, ledit extrait enrichi en macrocarpal C contenant une fraction massique de macrocarpal C supérieure ou égale à 3% et strictement inférieure à 90%.
12. Utilisation selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'extrait d'Eucalyptus est enrichi en macrocarpal G, ledit extrait enrichi en macrocarpal G contenant une fraction massique de macrocarpal G supérieure ou égale à 5% et strictement inférieure à 90%.
13. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'extrait est issu d'un
Eucalyptus choisi parmi les espèces appartenant aux sous-genres Eudesmia, Symphomyrtus et Corymbia et les espèces suivantes : Eucalyptus globulus L., Eucalyptus pulverulenta Sims, Eucalyptus kartzoffiana L. A. S. Johnson 1 Blaxell, Eucalyptus macrocarpa Hook., Eucalyptus cinerea F. Muell.ex Benth.,
Eucalyptus dorrigoensis (Blakely) L.A.S. Johnson 1 K. D. HiIl, Eucalyptus leptopoda Benth., Eucalyptus occidentalis Endl., Eucalyptus viridis R. T. Baker, Eucalyptus polybractea RT. Baker et Eucalyptus smithii R.T. Baker.
14. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'extrait d'Eucalyptus est choisi parmi le groupe composé d'un extrait de feuilles, de fleurs, de fruits, de tiges et de tronc d'Eucalyptus.
15. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que la pathologie ou l'affection neurologique, psychiatrique ou trouble associé, le syndrome somatique fonctionnel ou la dépendance aux substances addictives est sélectionnée dans le groupe comprenant : les maladies neurologiques telles que les maladies neurodégénératives (maladie d'Alzheimer, Chorée de Huntington, maladie de Parkinson, accidents vasculaires cérébraux, traumatisme crânien), la sclérose latérale amyotrophique, les démences séniles, les démences fronto-temporales, les démences vasculaires, la migraine, les douleurs neuropathiques d'origine centrale.
- les maladies psychiatriques telles que la dépression (endogène, résistante, réactive ou iatrogène), l'état dépressif, la schizophrénie, le trouble bipolaire, l'anxiété généralisée, les maladies liées au stress, les attaques de panique, les troubles obsessionnels compulsifs, les syndromes de stress post-traumatiques, les troubles de l'attention et de l'hyperactivité, les troubles de conduites alimentaires (notamment la boulimie, l'anorexie), la phobie (notamment l'agoraphobie), l'autisme;
les troubles de la mémoire, de l'attention, et de la vigilance associés aux pathologies neurologiques ou troubles psychiatriques ;
les syndromes somatiques fonctionnels tels que le syndrome de fatigue chronique, la fibromyalgie, le syndrome du colon irritable, les reflux gastro-oesophagiens, la perte de la libido, les troubles de l'érection, les incontinences urinaires.
les dépendances aux substances addictives notamment à la nicotine, à l'alcool, aux opiacées, aux cannabinoïdes, aux psychostimulants.
16. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que le médicament est sous forme orale ou injectable.
17. Utilisation d'au moins un composé de formule (I) ou l'une quelconque de ses formes diastéréoisomères :
Figure imgf000030_0001
dans laquelle Rl forme avec le carbone auquel il est rattaché un groupement
Figure imgf000030_0002
et R2 représente un groupement isobutyle, α-isobutyle ou β-isobutyle; pour la préparation d'un médicament ou d'un complément alimentaire destiné au traitement et/ou à la prévention des affections ou pathologies neurologiques, psychiatriques et troubles associés, des syndromes somatiques fonctionnels et des dépendances aux substances addictives, découlant d'un désordre de la recapture de la dopamine et/ou de la sérotonine et/ou de la noradrénaline.
18. Utilisation selon la revendication 17 caractérisée en ce que le traitement et/ou la prévention desdites affections ou pathologies neurologiques, psychiatriques et troubles associés, des syndromes somatiques fonctionnels et des dépendances aux substances addictives, consiste en une inhibition de la recapture de la dopamine et/ou de la sérotonine et/ou de la noradrénaline.
19. Utilisation selon la revendication 17 caractérisée en ce que le composé de formule (I) est :
- le macrocarpal A (5-((lR)-l-((llS,7R)-7-hydroxy-3,3,7,ll- tetramethyltricyclo(6.3.0.0(2,4))undec-ll-yl)-3-methylbutyl)-2,4,6- trihydroxybenzene-l,3-dicarbaldehyde) dans lequel Rl forme avec le
carbone auquel il est rattaché le groupement
Figure imgf000030_0003
et R2 représente un β-isobutyle , - le macrocarpal B (5-((lS)-l-((llS,7R)-7-hydroxy-3,3,7,l l- tetramethyltricyclo(6.3.0.0(2,4))undec-l l-yl)-3-methylbutyl)-2,4,6- trihydroxybenzene-l,3-dicarbaldehyde) dans lequel Rl forme avec le ^CH3 carbone auquel il est rattaché le groupement OH et R2 représente un α-isobutyle,
- le macrocarpal C (5-((lR)-l-((llS)-3,3,ll-trimethyl-7- methylenetricyclo(6.3.0.0(2,4))undec-ll-yl)-3-methylbutyl)-2,4,6- trihydroxybenzene-l,3-dicarbaldehyde) dans lequel Rl forme avec le carbone auquel il est rattaché le groupement C=CH2 et R2 représente un β-isobutyle ;
- ou le macrocarpal G (5-(l-(3,3,l l-trimethyl-7- methylenetricyclo(6.3.0.0(2,4))undec-ll-yl)-3-methylbutyl)-2,4,6- trihydroxybenzene-l,3-dicarbaldehyde) dans lequel Rl forme avec le carbone auquel il est rattaché un groupement C=CH2 et R2 représente un isobutyle.
20. Utilisation selon la revendication 17 caractérisée en ce que le macrocarpal A, le macrocarpal B, le macrocarpal C ou le macrocarpal G est obtenu par synthèse chimique, biochimique ou à partir d'un extrait végétal.
21. Utilisation selon la revendication 17 caractérisée en ce que la pathologie ou l'affection neurologique, psychiatrique ou trouble associé, le syndrome somatique fonctionnel ou la dépendance aux substances addictives est sélectionnée dans le groupe comprenant : les maladies neurologiques telles que les maladies neurodégénératives (maladie d'Alzheimer, Chorée de Huntington, maladie de Parkinson, accidents vasculaires cérébraux, traumatisme crânien), la sclérose latérale amyotrophique, les démences séniles, les démences fronto-temporales, les démences vasculaires, la migraine, les douleurs neuropathiques d'origine centrale.
les maladies psychiatriques telles que la dépression (endogène, résistante, réactive ou iatrogène), l'état dépressif, la schizophrénie, le trouble bipolaire, l'anxiété généralisée, les maladies liées au stress, les attaques de panique, les troubles obsessionnels compulsifs, les syndromes de stress post-traumatiques, les troubles de l'attention et de l'hyperactivité, les troubles de conduites alimentaires (notamment la boulimie, l'anorexie), la phobie (notamment l'agoraphobie), l'autisme;
les troubles de la mémoire, de l'attention, et de la vigilance associés aux pathologies neurologiques ou troubles psychiatriques ;
les syndromes somatiques fonctionnels tels que le syndrome de fatigue chronique, la fibromyalgie, le syndrome du colon irritable, les reflux gastro-oesophagiens, la perte de la libido, les troubles de l'érection, les incontinences urinaires.
les dépendances aux substances addictives notamment la nicotine, l'alcool, les opiacées, les cannabinoïdes, les psychostimulants
22. Utilisation selon la revendication 17 caractérisée en ce que le médicament est sous forme orale ou injectable.
23. Extrait d'Eucalyptus caractérisé en ce qu'il contient au moins 1 composé de formule (I) ou l'une quelconque de ses formes diastéréoisomères :
Figure imgf000032_0001
dans laquelle Rl forme avec le carbone auquel il est rattaché un groupement
^CH3 ^CH3 cCCH3
C=CH2, un groupement ^ , 0H ou ^*"1 et R2 représente un groupement isobutyle, α-isobutyle ou β-isobutyle et en ce que: - la fraction massique du macrocarpal A (5-((lR)-l-((llS,7R)-7-hydroxy-
3,3,7,1 l-tetramethyltricyclo(6.3.0.0(2,4))undec-ll-yl)-3-methylbutyl)- 2,4,6-trihydroxybenzene-l,3-dicarbaldehyde) dans lequel Rl forme avec
^CH3 le carbone auquel il est rattaché le groupement OH et R2 représente un β-isobutyle, est supérieure ou égale à 3% et strictement inférieure à
90%, la fraction massique du macrocarpal B (5-((lS)-l-((llS,7R)-7-hydroxy-
3,3,7,ll-tetramethyltricyclo(6.3.0.0(2,4))undec-ll-yl)-3-methylbutyl)-
2,4,6-trihydroxybenzene-l,3-dicarbaldehyde) dans lequel Rl forme avec
,CH3
C le carbone auquel il est rattaché le groupement OH et R2 représente un α-isobutyle, est supérieure ou égale à 3% et strictement inférieure à
90%, la fraction massique du macrocarpal C (5-((lR)-l-((l lS)-3,3,l l- trimethyl-7-methylenetricyclo(6.3.0.0(2,4))undec-l l-yl)-3-methylbutyl)-
2,4,6-trihydroxybenzene-l,3-dicarbaldehyde) dans lequel Rl forme avec le carbone auquel il est rattaché le groupement C=CH2 et R2 représente un β-isobutyle, est supérieure ou égale à 3% et strictement inférieure à
90%, - et la fraction massique du macrocarpal G (5-(l-(3,3,l l-trimethyl-7- methylenetricyclo(6.3.0.0(2,4))undec-ll-yl)-3-methylbutyl)-254,6- trihydroxybenzene-l,3-dicarbaldehyde) dans lequel Rl forme avec le carbone auquel il est rattaché un groupement C=CH2 et R2 représente un isobutyle est supérieure ou égale à 5% et strictement inférieure à 90%.
24. Procédé de préparation de l'extrait selon la revendication 23 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : broyage de feuilles et/ou de fleurs et/ou de fruits et/ou de tiges et/ou de tronc d'Eucalyptus ; - au moins une extraction par un fluide supercritique avec ou sans co-solvant, récupération de l'extrait et éventuellement séchage de l'extrait, ou au moins une extraction avec un solvant organique ou un mélange d'eau et de solvants organiques miscibles à l'eau, séparation solide/liquide et enrichissement du filtrat.
25. Procédé selon la revendication 24 caractérisé en ce que le solvant organique est du dichlorométhane ou de l'acétate d'isopropyle.
26. Procédé selon la revendication 24 caractérisé en ce que l'étape d'enrichissement correspond en au moins une extraction liquide/liquide par ajout d'une base, une acidification puis d'au moins une extraction liquide/liquide par un solvant non miscible à l'eau.
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