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WO2008017598A2 - Citrusal-duftstoffrezeptoren und verwendung von myrac-aldehydderivaten zur steigerung der geisselschlagfrequenz eines spermiums - Google Patents

Citrusal-duftstoffrezeptoren und verwendung von myrac-aldehydderivaten zur steigerung der geisselschlagfrequenz eines spermiums Download PDF

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WO2008017598A2
WO2008017598A2 PCT/EP2007/057801 EP2007057801W WO2008017598A2 WO 2008017598 A2 WO2008017598 A2 WO 2008017598A2 EP 2007057801 W EP2007057801 W EP 2007057801W WO 2008017598 A2 WO2008017598 A2 WO 2008017598A2
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fragrance
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Symrise Gmbh & Co. Kg
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Definitions

  • the invention relates to the field of olfactory receptors, the medication affecting the condition and the biosensors.
  • fragrance receptor gene For example, seven years elapsed between the first functional description of a fragrance receptor gene and its corresponding fragrance ligand (Zhao et al., Functional expression of a mammalian odorant receptor, Science 279 (1998), 237-242). Until now, only two human fragrance receptor genes have been able to associate corresponding fragrances with fragrance receptors:
  • fragrance receptor genes in heterologous systems has not been reliably achieved despite constant efforts of the experts (Mombaerts, loc. Cit.). Furthermore, it is still not possible to make predictions about which substances can act as agonists or antagonists on the basis of the DNA sequence or the receptor amino acid sequence. For example, findings are based on Can hardly be transferred to other species because sperm cells are susceptible to random gene expression and fragrance receptor genes found in sperm can be difficult to associate with the remaining fragrance receptor gene families (Vanderhaeghen et al, Specific repertoire of olfactory receptor genes in the male germ cells of several mammalian species; Genomics 39 (1997), 239-246).
  • an expression system comprising a cell expressing an OR7A5 fragrance receptor or fragrance receptor having an amino acid sequence homology of at least 70% to the amino acid sequence of the transmembrane domains III to VI of the OR7A5 fragrance receptor
  • the fragrance receptor is heterologous with respect to the cell or
  • the starting point here was the nucleic acid sequence published under the name OR7A5 (EMBL accession number BC104809, see Strausberg et al., Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences; Proc. Natl. Acad 99 (26): 16899-16903 (2002)) of the receptor-encoding gene (gene sequence) of a human perfume receptor.
  • OR7A5 EBL accession number BC104809, see Strausberg et al., Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences; Proc. Natl. Acad 99 (26): 16899-16903 (2002)
  • OR19-17 for nomenclature see Ben-Arie et al., Human Molecular Genetics (1994), 229-235).
  • the receptor belongs to the class of proteins described at the outset, which belong to the superclass of G protein-coupled proteins with seven putative transmembrane domains.
  • a fusion protein according to the invention is also a fragrance receptor having an amino acid sequence homology of at least 70% to the amino acid sequence of the transmembrane domains III to VI of the OR7A5 fragrance receptor.
  • Transmembrane domain III begins at amino acid 99 and transmembrane domain VI ends at amino acid 259 of the complete OR7A5 protein.
  • Particular preference is given to those proteins which have a protein segment having an amino acid sequence homology of more than 70%, preferably 90% and particularly preferably 5, 4, 3, 2 or 1 amino acids, difference to a protein segment consisting of the transmembrane domains III to VI of the OR7A5 fragrance formulation.
  • the amino acid sequence homology may conveniently be calculated using the EMBOSS: water program (Algorithm of Smith and Waterman (1981), Identification of common molecular subsequences, J. Mol. Biol. 147: 195-197) (gap open penalty: 10.0 Gap extension penalty: 0.5, Blosum62 matrix).
  • the program calculates a similarity percentage, which is the measure of homology.
  • a "similarity" percentage value of 80% therefore means a sequence homology of 80% for the purposes of this invention.
  • a fusion protein is additionally indicated a) comprising the transmembrane domains III to VI of the OR7A5 fragrance receptor or a protein segment having an amino acid sequence homology of more than 70%, preferably 90% and particularly preferably 5, 4, 3, 2 or 1 amino acids difference to the protein segment consisting of the transmembrane domains III to VI of the OR7A5 fragrance receptor.
  • fusion protein according to the invention facilitates the production of an expression system according to the invention.
  • this description refers to a receptor or receptor according to the invention, this is the OR7A5 receptor, a fragrance receptor having an amino acid sequence homology of at least 70% to the amino acid sequence of the transmembrane domains III to VI of the OR7A5 fragrance receptor or a fusion protein according to the invention of the type described above unless otherwise clearly stated in the context of the text.
  • the receptor is expressed as a heterologous protein in a host cell - also below more - it is possible that the transcription and / or translation of certain nucleic acid codons or codon sequences proceeds more efficiently than the transcription and / or translation of other codons or codon sequences. This may result in a preference for certain amino acids and / or amino acid sequences. It is now preferred that some or all of the amino acids of the receptor, for which there is no preference of the host cell, are replaced by those amino acids for which there is a preference of the host cell. Further, it may be advantageous to remove a protease cleavage site by an amino acid substitution, deletion or insertion.
  • the receptor is a fusion protein further comprising one or more further protein sections.
  • these may be, in particular, signal peptides such as the "5HT 3 sequence” (cf. CH Wetzel et al., Journal of Neuroscience 19, 7426-7433 (1999)), which facilitates transport and functional incorporation into the cell membrane.
  • signal peptides such as the "5HT 3 sequence” (cf. CH Wetzel et al., Journal of Neuroscience 19, 7426-7433 (1999)), which facilitates transport and functional incorporation into the cell membrane.
  • other signal peptides may also be used in particular those which control or facilitate an intra- and / or intercellular transport of the fusion protein.
  • R 1 and R 2 independently of one another denote H or CH 3 ,
  • X is H, CH 3 , OCH 3 or OC 2 H 5 and
  • the group -C (O) X is bonded to one of the carbon atoms which is linked to the radical R 1 or R 2 .
  • a fusion protein according to the invention is a receptor which is suitable for binding specifically to a compound of formula (I).
  • the receptor binds a substance or specifically binds a substance to the receptor if, when applied to several molecules of the receptor, the substance is at low concentrations, preferably at concentrations less than 1 mM, more preferably at concentrations less than or equal to 1 mM, in particular preferred at Concentrations less than or equal to 100 ⁇ M, most likely binds again and again in the same area of the receptor.
  • the result of such a specific binding may be a - preferably reversible - conformational change of the receptor which is not substantially limited only to the site of binding.
  • an agonist in the context of the invention is understood as meaning a substance which, by virtue of its specific binding to the receptor, triggers a chemical reaction which exceeds this mere bond.
  • receptors are not chemically abrupt next to other cell constituents, but are in operative association with other parts of at least one signal transduction cascade, such as that mediated by G proteins.
  • Specific binding of an agonist converts such receptors from an inactive to an active state, usually accompanied by a conformational change of the receptor that is not substantially limited to the site of agonist binding, and is manifested in turn on of the signal transduction cascade, recognizable, for example an increase in the cytosolic concentration of Ca 2+ , cAMP, cGMP and / or inositol triphosphate or the change in the ATP / ADP ratio.
  • the conformational change of the receptor, and also the turning on of the signal transduction cascade is a chemical reaction beyond the mere binding of the agonist.
  • agonists based on the receptor are, in particular, the compounds of the formula (I).
  • an antagonist is a substance which, although specifically bound by a receptor, makes the specific binding of an agonist to the receptor more difficult.
  • the specific binding of the antagonist unlike an agonist, does not lead to the activation of one
  • Signal transduction cascade when the receptor is part of such by the specific binding of an agonist switched signal transduction cascade.
  • one may be by the specific binding of an agonist caused conformational change of the receptor in the specific binding of an antagonist.
  • the compounds of the formula (I) can be obtained via a Diels-Alder reaction of a 1,3-diene of the formula (II) and an ⁇ , ⁇ -unsaturated carbonyl compound of the formula (III), such as the following reaction scheme to clarify:
  • the starting material of the formula (II) is preferably myrcene (7-methyl-3-methylene-1,6-octadiene) (the dashed line in the formulas (I) and (II) then being a double bond).
  • the compounds of the formula C, D and F (ie those for which the dotted line represents a single bond in formula (I)) can be prepared, for example, by partial hydrogenation from the compounds of the formula A, B and E (ie those for which Formula (I) the dashed line represents a double bond) are synthesized.
  • compounds of the formulas A1 and A2 or B1 and B2 can be converted into compounds of the formulas C1 and C2 or D1 and D2 by means of partial hydrogenation (if appropriate using a protective group for the carbonyl function, for example an acetalization or ketalization) (see also US Pat Angew Chem. 2000, 1 12, 3106-3188).
  • the compounds of the formula (I), in particular the compounds of the formulas A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2, F1 and F2 and in particular those mentioned above as newly designated substances of the formula (I) are given according to the invention as fragrances. They are suitable for specific binding to a receptor as described above, in particular to a fusion protein according to the invention and for triggering a signal transduction cascade as described above. It has also been found, as explained in more detail below, that compounds of the formula (I) can increase the Ca 2+ concentration in a cell expressing the receptor described and increase the flagellum frequency of a sperm.
  • the invention therefore also provides for the use of a compound of the formula (I), in particular of the compounds of the formulas A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2, F1 and F2 and, in particular, the substances described above as new of formula (I)
  • Fragrance receptor having an amino acid sequence homology of at least 70% to the amino acid sequence of the transmembrane domains III to VI of the OR7A5 fragrance receptor or expressed a fusion protein according to the invention
  • a vector comprising a nucleic acid portion encoding a receptor according to any one of the previous aspects of the invention, that is, a vector comprising a nucleic acid portion encoding a) an OR7A5 fragrance receptor or b) a Fragrance receptor having an amino acid sequence homology of at least 70% to the amino acid sequence of transmembrane domains III to VI of the OR7A5 fragrance receptor or c) a fusion protein of the invention.
  • a vector makes it easier to clone a nucleic acid encoding the receptor of the invention.
  • the vector may also be a so-called suicide vector, particularly one which allows for the integration of the receptor-encoding nucleic acid portion into the genome of the host cell.
  • the vector is an expression vector.
  • Suitable host cells are in particular those from Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Xenopus / aews oocytes and human HEK293 cells as well as CHO (Chinese Hamster Ovary), COS (African Green Monkey Kidney), BHK (Syrian Baby Hamster Kidney) and PC12 - (Rat adrenal phenochromocytoma) cells, with HEK293 cells being particularly preferred.
  • the expression system according to the invention comprises, as indicated above, a cell which overexpresses a receptor according to the invention.
  • "overexpressing” means any process in which the receptor is present beyond the maximum achievable gene expression level for the respective host cell under natural conditions.
  • the receptor may in particular also be a heterologous receptor for the host cell. If the host cell concerned does not normally produce a receptor according to the invention, overexpression in the meaning of the invention already takes place when it (for the first time) ever produces such a receptor.
  • those host cells which, in addition to the functional expression of the receptor, also provide the elements necessary for a signal transduction cascade influenced by the receptor through the binding of an agonist.
  • the host cell is a mammalian cell, wherein the host cell may in particular also be a degenerate mammalian cell.
  • a mammalian cell wherein the host cell may in particular also be a degenerate mammalian cell.
  • An example of this is the human embryonic kidney cell-derived cell line HEK293 (see Graham et al., J. Gen. Virol. (1977): 59-72).
  • a complex is specified, wherein the complex comprises a fusion protein according to the invention, as well as specifically bound thereto, a compound of the formula (I), in particular of the formula A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2 , E1, E2, F1 or F2.
  • Such a complex is particularly advantageous for studying the interactions between the receptor and an agonist and / or a possible antagonist.
  • the antagonist may be reversible or irreversible.
  • the receptor When the receptor is in operative association with a signal transduction cascade, the production of such a complex of receptor and agonist enables the activation or activation of the corresponding signal transduction cascade.
  • the production of a receptor-antagonist complex makes it possible to prevent the activation of the signal transduction cascade even in the presence of the agonist.
  • a complex of receptor and agonist or antagonist are described below.
  • a biosensor comprising
  • the biosensor comprises a cell expressing a receptor according to the invention, ie a) an OR7A5 fragrance receptor or b) a fragrance receptor having an amino acid sequence homology of at least 70% to the amino acid sequence of the transmembrane domains III to VI of the OR7A5 fragrance receptor .or or c) expresses a fusion protein according to the invention, and in which the receptor is in active connection with a signal transduction cascade.
  • a receptor-agonist complex is prepared as just described. This may result in a not limited essentially only to the site of binding of the agonist limited conformational change of the receptor.
  • the receptor triggers the signal transduction cascade after binding of the agonist. This in turn generates a measurable signal, for example in the form of an increase in the cytosolic Ca 2+ concentration.
  • a second messenger such as cAMP, cGMP, IP 3 and the like.
  • One skilled in the art can readily select a suitable substance for detecting this binding, the concentration or conformation of which changes according to the specific binding of the agonist to the receptor, based on the signal transduction cascade influenced by the specific binding of an agonist.
  • Such a biosensor is particularly advantageous for finding additional receptors.
  • the skilled person will first Provide an expression system in which the putative receptor is functionally expressed. Suspected agonists are applied to the expression system and an optionally triggered thereby signal of the biosensor is measured. If a substance triggers a biosensor signal and this signal does not also occur in the natural cells of the expression system (ie, cells that have not been changed to an expression system), the expression system will actually express a receptor for that substance.
  • a probe for detecting a nucleic acid encoding a portion of a receptor of the invention is suitably a nucleic acid, in particular an RNA or a, preferably single-stranded, DNA, wherein the nucleic acid can hybridize with a nucleic acid which codes for a portion of a receptor according to the invention.
  • Preferred probes have the sequence SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 or SEQ ID NO. 4 or a 12-30, preferably 15-20 amino acids long section of the sequences SEQ ID NO 3 or SEQ ID NO 4 ..
  • the nucleic acid is connected to a detectable label, for example with a fluorescence, luminescence, color coding, a radioactive label or an enzyme that catalyzes the formation of a detectable reaction product.
  • a detectable label for example with a fluorescence, luminescence, color coding, a radioactive label or an enzyme that catalyzes the formation of a detectable reaction product.
  • the probe can also be coupled to a solid, for example to metal particles such as magnetic beads (optionally via a linker).
  • the invention teaches to use a nucleic acid, preferably a probe as previously described, to detect a nucleic acid encoding a fragment of a receptor.
  • a nucleic acid preferably a probe as previously described
  • further receptors with the same or similar amino acid sequence as the receptor according to the invention can be found.
  • the probe is contacted under preferably stringent hybridization conditions with nucleic acids of a cell to be assayed to allow hybridization of the probe to a corresponding host nucleic acid, if any corresponding nucleic acid is present.
  • the less stringent the hybridization conditions the less similar can be the nucleic acids that hybridize to the probe.
  • the nucleic acids hybridized with the probe are purified and sequenced.
  • nucleic acids coding for a fragment of a receptor it is sufficient to bring these nucleic acids into contact with the probe, preferably under stringent hybridization conditions, in order to hybridize the probe to the corresponding probe
  • the nucleic acid to be detected by the probe is immobilized on a solid support, for example in a gel or on a nylon filter.
  • hybridizing the probe to the nucleic acid to be detected is readily detectable by also binding the probe - mediated by the nucleic acid to be detected - to the solid support and substantially not washing off the solid support when performing a wash step.
  • Those skilled in such detection methods are known as Southern or Northern Blot.
  • a receptor according to the invention for detecting and / or specifically binding a compound of the formula (I), in particular of the formula A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2, F1 or F2.
  • a particularly preferred use of a compound of the formula (I), in particular of the formula A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2, F1 or F2, is to influence the flagellum frequency of a sperm. It has been found that even sperm receptors according to the first Aspect of the invention express and chemokinetic reactions that can be triggered by the binding of a compound of formula (I), in particular myracaldehyde.
  • the addition of an antagonist to sperm leads to the effects described - with constant agonist concentration - either not or not to the usual extent.
  • the one or more compound (s) of the formula (I) can be present in particular as a pharmaceutically acceptable salt of the particular compound of the formula (I).
  • a drug is understood to be any agent used for the prevention, diagnosis or treatment of a physical condition of a human and / or animal.
  • Medicaments in the sense according to the invention can therefore be, in particular, medicaments according to ⁇ 1 of the Medicinal Products Act, but also medical products according to ⁇ 3 of the Medical Devices Act, in their version valid on August 1, 2002.
  • a drug utilizes the benefits achievable with the use of agonists and antagonists described above.
  • the medicament suitably comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the medicament may also comprise a precursor of the agonist or antagonist, which is converted into an agonist or antagonist in the human and / or animal body.
  • an antagonist - preferably an antagonist irreversibly inhibiting the receptor - in or on the human body, preferably in the vagina, uterus and / or fallopian tube, there to sperm optionally present there orientation to complicate an ovum that may be present.
  • This can be done by an intravaginal preparation from which the antagonist is released.
  • a condom with an antagonist - again preferably an irreversible -, for example, to impregnate or coat, so that the antagonist is released when used properly the condom.
  • a contraceptive drug it may be particularly advantageous to release one or more agonists - optionally in combination with other substances - in the fallopian tube and / or uterus to accelerate spermatozoa with a low flagellum frequency.
  • an antagonist against the specific binding of an agonist of the formula (I), in particular the A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2, F1 or F2, in particular with X H to influence odor perception ability of a human and / or an animal.
  • an antagonist makes it possible in a simple manner to raise the odor perception threshold for one or more agonists in humans and / or animals, so that the agonist concerned is less easily smelled. This may be particularly useful in cases where an agonist develops a disturbing odor, but can only be removed with disproportionate effort from the air or other carrier medium.
  • a method for producing a fusion protein or expression system according to the invention, a method is disclosed which comprises the steps:
  • a method for detecting a compound of the formula (I), in particular the A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2, F1 or F2, in particular where X H, in a sample, the method comprising the steps of:
  • the receptor may be provided in the form of an expression system in which the receptor is operatively linked to a signal transduction cascade.
  • a specific binding of the compound of formula (I) to the receptor can be checked by switching on the relevant signal transduction cascade, while the specific binding of the antagonist can be checked by the absence of such switching on the signal transduction cascade in the presence of a compound of formula (I).
  • an expression system can also be simulated artificially by assembling the receptor and the other components of the signal transduction cascade in vitro.
  • the receptor may also be present as a purified protein bound to the surface of a solid support, particularly a metal surface.
  • a physical surface property may change. This may, for example, be the change in surface plasmon resonance, as may be determined in a Biacore process.
  • the receptor and / or a compound of the formula (I) and / or an antagonist with a fluorescent dye and the change brought about by the specific binding of the compound of the formula (I) and / or of the antagonist to the receptor to determine the fluorescence.
  • the receptor may be present as a fusion protein with a green fluorescent p / Ote / n (GFP) portion, so that the fluorescence of the fusion protein or the GFP portion of the fusion protein upon specific binding of a compound of formula (I) and / or an antagonist changes accordingly.
  • FRET assays fluorescence resonance energy transfer assays
  • the receptor may also be present as a fusion protein with a luciferase moiety, such that the luminescence of the fusion protein or luciferase moiety of the fusion protein changes upon specific binding of an agonist and / or an antagonist ("BRET assay").
  • a method for detecting the antagonist in a sample comprising the following steps: a) providing a receptor according to the invention, in particular an OR7A5 receptor, a fragrance receptor having an amino acid sequence homology of at least 70% to the amino acid sequence of the transmembrane domains III to VI of the OR7A5 fragrance receptor or a novel
  • steps b) and c) can be carried out simultaneously or in any order one after the other, provided that step c) is carried out before or simultaneously with step d).
  • step d) is carried out before or simultaneously with step d.
  • the receptor according to the invention is first provided.
  • the person skilled in the art can make use of the possibilities described above for a method according to the invention for detecting an agonist, in particular a compound of the formula (I), and / or antagonists.
  • the receptor is brought into contact with the optionally antagonist-containing sample.
  • conditions are set under which an antagonist could specifically bind to the receptor, if it is present in the sample.
  • the receptor is contacted with an agonist.
  • the conditions are adjusted so that the agonist can specifically bind to the receptor if no antagonist has specifically bound to the receptor.
  • the receptor is first contacted with the agonist and then with the sample optionally containing the antagonist. In this case, it can be concluded from the decrease in the extent to which the agonist is specifically bound to the receptor, the presence of the antagonist and optionally also its concentration in the sample to be examined.
  • Fig. 1 shows the specific activation of HEK293 cells by myracaldehyde.
  • Example 1 Specific activation of HEK293 cells by myracaldehyde
  • HEK293 cells were transiently transfected with a vector encoding OR7A5.
  • the gene for OR7A5 with primers SEQ ID NO. 1 and SEQ ID NO: 2 amplified with the restriction nuclease EcoR V digested and cloned the fragment obtained in the corresponding interface of the vector pCDNA3 (Invitrogen, USA).
  • transfection protocol used in this and the following examples corresponds to that of WO 2004/033496 A1, whose contents, in particular its examples 3 to 13, in so far referenced.
  • HEK293 cells were maintained under standard conditions in DMEM (Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, CoId Spring Harbor 1982) with 10% fetal calf serum, 100 U / ml penicillin and streptomycin, and 2 mM L-glutamine. Transfection was by calcium phosphate precipitation. About 1 h before the start of transfection, the medium was replaced with 2 ml of fresh DMEM. For transfection, 100 to 200 ⁇ l of the transfection reagent were added.
  • FIG. 1 shows a representative illustration of a Ca 2+ distribution in the transfected HEK293 cells.
  • HEK293 cells were transfected with a vector encoding OR7A5. About 5% of the transfected cells showed a significant increase in intracellular calcium content after addition of myracaldehyde.
  • HEK293 cells were transfected as described in Example 1 with vectors encoding OR7A5 or OR1 D2. The transfected cells were examined for their response to various substances.
  • FIG. 2 shows in panel a that the effect of myracaldehyde (“Myrac”) is not reduced by prior administration of n-undecanal, instead There is still a significant increase in the intracellular Ca 2+ content when administering myracaldehyde.
  • Myrac myracaldehyde
  • the responses of sperm to myracaldehyde and was measured (a) by computer-assisted video motion analysis (CAVMA) to detect changes in swimming velocity (sperm activation), and (b) in a flat capillary assay for proximal chemotaxis to examine a source of diffusion material.
  • CAVMA computer-assisted video motion analysis
  • Bioassay data were analyzed statistically by one-way analysis of variance (ANOVA) using a post hoc Scheffe test (R.W. Day and G. P. Quinn, E.col. Monogr. 59, 433-463 (1989)). Bonferroni correction was used to adjust the ⁇ levels for multiple comparisons.
  • Chambers with four separate compartments were used to study sperm chemotaxis, using the capillary method of Adler (Adler, Science 153, 708-716 (1966); Adler, Journal of General Microbiology 74, 77-91 (1984); 1973)). Each compartment consisted of two wells connected by a channel. The sperm samples (10 6 cells / ml) were each presented in the wells. A flat 6 ⁇ L microcapillary tube (Drummond Scientific Co.) containing either test or control solution was introduced into the channel with its two ends contacting the fresh sperm suspensions within the two wells.
  • the spermatozoa responded to myracaldehyde (see Figure 3) in a dose-dependent manner by increasing the speed of swimming
  • FIG. 3 graphically depicts these results, the values averaging and standard deviation being taken from FIGS.
  • Raw data are calculated regression lines. From a concentration of

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Abstract

Die Erfindung betrifft das Gebiet der olfaktorischen Rezeptoren, der empfängnisbeeinflussenden Medikamente und der Biosensoren.

Description

Citrusal-Duftstoffrezeptoren
Die Erfindung betrifft das Gebiet der olfaktorischen Rezeptoren, der empfängnisbeeinflussenden Medikamente und der Biosensoren.
Seit der Entdeckung der für olfaktorische Rezeptoren (Duftstoffrezeptoren) codierenden DNA-Sequenzen (Gene) sind zahlreiche Aspekte im Zusammenhang mit diesen Rezeptoren noch immer ungeklärt. Zwar kann der Fachmann mit einiger Sicherheit anhand charakteristischer Merkmale - beispielsweise Zugehörigkeit zur Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren, Hypervariabilität in den Transmembran-Domänen III, IV, V und VI - zwischen DNA-Sequenzen von Duftstoffrezeptoren und solchen Sequenzen, die nicht für einen Duftstoffrezeptor codieren, unterscheiden. Damit ist jedoch noch nichts substantiell über die Regulation der Duftstoffrezeptor-Expression bekannt; insbesondere ist unbekannt, in welchem Gewebe und in welcher Stärke ein vermutetes Duftstoffrezeptor-Gen exprimiert wird; ferner ist nicht vorhersagbar, welche Substanzen an den von diesem Gen codierten Duftstoffrezeptor spezifisch binden können, sei es als Agonist (Aktivator) oder als Antagonist (Inhibitor). Duftstoffrezeptor-Gene von Vertebraten lassen sich zwar durch degenerierte PCR (Polymerase-Kettenreaktion) verhältnismäßig leicht subklonieren (Mombaerts, Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors, Nat. Rev. Neurosci. 5(2004), 263-278). Es hat sich jedoch bisher als sehr schwierig herausgestellt, einem isolierten Duftstoffrezeptor einen zugehörigen, von dem Rezeptor nachweisbaren Duftstoff (Liganden) zuzuordnen. Beispielsweise vergingen sieben Jahre zwischen der ersten funktionalen Beschreibung eines Duftstoffrezeptor-Gens und der Angabe seines zugehörigen Duftstoff-Liganden (Zhao et al., Functional expression of a mammalian odorant receptor; Science 279(1998), 237-242). Bisher ist erst bei zwei menschlichen Duftstoffrezeptor-Genen eine Zuordnung entsprechender Duftstoffe zu Duftstoffrezeptoren gelungen:
Wetzel et al (The Journal of Neuroscience, 1999: 7426-7433) beschreiben die funktionelle Expression des menschlichen hOR17-40 Rezeptor-Proteins. Es konnten nur zwei als Agonisten wirkende Substanzen bestimmt werden, nämlich Helional und Heliotropylaceton. Diese Substanzen lösen eine Aktivierung des Rezeptors aus, die sich in einer vorübergehenden Erhöhung des cytosolischen Ca2+-Spiegels niederschlägt, wenn der Rezeptor funktionell in HEK293-Zellen exprimiert wird. Antagonisten, also Substanzen, die eine Rezeptor-Aktivierung durch einen oder mehrere Agonisten spezifisch und reversibel verhindern können, wurden nicht gefunden. Spehr et al (Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm Chemotaxis; Science 299(2003), 2054-2058) wiederum konnten die Bindung von Bourgeonal an einen weiteren menschlichen Duftstoffrezeptor (hOR17-4) und die antagonistische Wirkung von n-Undecanal auf diese Ligandenbindung nachweisen.
Die funktionelle Expression von Duftstoffrezeptor-Genen in heterologen Systemen ist jedoch trotz ständigen Bemühens der Fachwelt bisher nicht zuverlässig gelungen (Mombaerts, a.a.O.). Ferner ist es nach wie vor nicht möglich, anhand der DNA-Sequenz bzw. der Rezeptor-Aminosäuresequenz Vorhersagen darüber zu treffen, welche Substanzen als Agonisten oder Antagonisten wirken können. Beispielsweise sind Befunde, die anhand von Testikulargeweben von Mäusen gewonnen wurden, kaum auf andere Spezies übertragbar, da Spermazellen anfällig für zufällige Genexpression sind und in Spermien gefundene Duftstoffrezeptor-Gene schwer den übrigen Duftstoffrezeptor-Genfamilien zugeordnet werden können (Vanderhaeghen et al, Specific repertoire of olfactory receptor genes in the male germ cells of several mammalian species; Genomics 39 (1997), 239-246).
Es besteht daher ein großer Bedarf, weitere Duftstoffrezeptoren zu finden, funktionell zu exprimieren und die jeweils wirksamen Agonisten und Antagonisten zu bestimmen.
Erfindungsgemäß wird deshalb ein Expressionssystem angegeben umfassend eine Zelle, die einen OR7A5- Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5- Duftstoffrezeptors exprimiert, wobei
a) der Duftstoffrezeptor heterolog in Bezug auf die Zelle ist oder
b) der Duftstoffrezeptor in der Zelle überexprimiert wird.
Ausgangspunkt hierbei war die unter der Bezeichnung OR7A5 veröffentlichte Nucleinsäuresequenz (EMBL Accession-Nummer BC104809; vgl. Strausberg et al., Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences; Proc. Natl. Acad. Sei. U. S.A. 99(26):16899-16903 (2002)) des für den Rezeptor codierenden Gens (Gensequenz) eines menschlichen Duftstoffrezeptors. Eine synonyme Bezeichnung ist OR19-17 (wegen der Nomenklatur siehe Ben-Arie et al., Human Molecular Genetics (1994), 229-235). Der Rezeptor gehört zu der eingangs beschriebenen Klasse von Proteinen, die zur Superklasse der G-Protein-gekoppelten Proteine mit sieben vermuteten Transmembrandomänen gehören. Da nunmehr die funktionelle Expression dieses Rezeptors erstmals gelungen ist, wurde es auch möglich, Substanzen zu finden, die als Agonist oder Antagonist spezifisch an den Rezeptor binden können; hierzu unten mehr. Der Fachmann erkennt, dass auch ein Protein, das einen Proteinabschnitt mit einer von der Sequenz von OR7A5 abweichenden Aminosäuresequenz besitzt, ein Duftstoffrezeptor mit der im weiteren Verlauf beschriebenen Duftstoff- Ligandenspezifität sein kann. Die Erfolgsaussichten, einen funktionalen Rezeptor zu erhalten, insbesondere einen Duftstoffrezeptor, ist in der Gruppe der Proteine mit einem Abschnitt mit homologer Aminosäuresequenz zu OR7A5 höher als in der Gruppe der Proteine ohne oder mit nur geringer Homologie zur Sequenz dieses Duftstoffrezeptors. Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein ist dementsprechend auch ein Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure- Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftst.offrezept.ors. Die Transmembrandomäne III beginnt bei Aminosäure 99 und die Transmembrandomäne VI endet bei Aminosäure 259 des vollständigen OR7A5- Proteins. Besonders bevorzugt sind dabei solche Proteine, die einen Proteinabschnitt mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von mehr als 70 %, vorzugsweise von 90% und besonders bevorzugt von 5, 4, 3, 2 oder 1 Aminosäuren Unterschied zu einem Proteinabschnitt bestehend aus den Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftst.offrezept.ors besitzen. Die Aminosäure-Sequenzhomologie kann zweckmäßigerweise mit Hilfe des EMBOSS:water-Programms (Algorithmus von Smith und Waterman (1981 ), Identification of common molecular subsequences, J. Mol. Biol. 147:195-197) berechnet werden (Gap open penalty: 10.0; Gap extension penalty: 0.5; Blosum62-Matrix). Das Programm berechnet einen "Similarity"-Prozentwert, dieser ist das Maß der Homologie. Ein "Similarity"-Prozentwert von 80% bedeutet also im Sinne dieser Erfindung eine Sequenzhomologie von 80%.
Erfindungsgemäß wird zudem ein Fusionsprotein angegeben a) umfassend die Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftst.offrezept.ors oder einen Proteinabschnitt mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von mehr als 70 %, vorzugsweise von 90% und besonders bevorzugt von 5, 4, 3, 2 oder 1 Aminosäuren Unterschied zu dem Proteinabschnitt bestehend aus den Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftst.offrezept.ors, wobei b) der Abschnitt gemäß a) zwischen den Transmembrandomänen I und VI hOR17-40 (Wetzel et al., s.o.) angeordnet ist und zwischen der Transmembrandomäne I aus hOR17-40 und der Transmembrandomäne III gemäß a) eine weitere funktionale Transmembrandomäne angeordnet ist. Zum Herstellen und zur Verwendung solcher Fusionsproteine wird sich der Fachmann insbesondere an der Beschreibung der WO 2004-033496A1 orientieren, deren Inhalt in soweit in Bezug genommen wird. Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein erleichtert insbesondere das Herstellen eines erfindungsgemäßen Expressionssystems.
Soweit in dieser Beschreibung von einem Rezeptor oder erfindungsgemäßen Rezeptor gesprochen wird, ist damit der OR7A5-Rezeptor, ein Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5- Duftstoffrezeptors oder ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein der oben beschriebenen Art gemeint, soweit nicht im jeweiligen Textzusammenhang klar ein anderes angegeben ist.
Wird der Rezeptor als heterologes Protein in einer Wirtszelle exprimiert - auch hierzu unten mehr -, so ist es möglich, dass die Transkription und/oder Translation bestimmter Nucleinsäure-Codons bzw. Codon-Abfolgen effizienter vonstatten geht als die Transkription und/oder Translation anderer Codons bzw. Codon-Abfolgen. Hieraus kann sich eine Präferenz für bestimmte Aminosäuren und/oder Aminosäureabfolgen ergeben. Es ist nunmehr bevorzugt, wenn einige oder alle Aminosäuren des Rezeptors, für die keine Präferenz der Wirtszelle besteht, durch solche Aminosäuren ersetzt sind, für die eine Präferenz der Wirtszelle besteht. Ferner kann es vorteilhaft sein, eine Protease-Schnittstelle durch einen Aminosäureaustausch, -deletion oder -insertion zu entfernen.
Vorzugsweise ist der Rezeptor ein Fusionsprotein, das ferner einen oder mehrere weitere Proteinabschnitte umfasst. Hierbei kann es sich insbesondere um Signalpeptide wie die "5HT3-Sequenz" (vergleiche C. H. Wetzel et al., Journal of Neuroscience 19, 7426-7433 (1999)) handeln, die den Transport und den funktionellen Einbau in die Zellmembran erleichtert. Anstelle oder neben der "5HT3-Sequenz" können jedoch auch andere Signalpeptide verwendet werden, insbesondere solche, die einen intra- und/oder interzellulären Transport des Fusionsproteins steuern oder erleichtern.
Es hat sich nunmehr herausgestellt, dass der Rezeptor spezifisch an Verbindungen der nachfolgenden Formel (I) bindet:
Figure imgf000007_0001
(I)
wobei
R1 und R2 unabhängig voneinander H oder CH3 bedeuten,
X gleich H, CH3, OCH3 oder OC2H5 bedeutet und
die in der Formel (I) eingezeichnete gestrichelte Linie entweder eine Einfachoder eine Doppelbindung bedeutet und
die Gruppe -C(O)X an eines der Kohlenstoffatome gebunden ist, die mit dem Rest R1 bzw. R2 verknüpft ist.
Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein ist dementsprechend ein Rezeptor, der geeignet ist zum spezifischen Binden an eine Verbindung der Formel (I).
Unter einer spezifischen Bindung im Sinne dieser Erfindung wird eine Bindung verstanden, die - vereinfacht gesagt - nach einer Art Schlüssel-Schloss-Prinzip funktioniert. Insbesondere bindet der Rezeptor eine Substanz bzw. bindet eine Substanz an den Rezeptor dann spezifisch, wenn die Substanz bei Applikation auf mehrere Moleküle des Rezeptors bei niedrigen Konzentrationen, vorzugsweise bei Konzentrationen kleiner als 1 O mM besonders bevorzugt bei Konzentrationen kleiner oder gleich 1 mM, insbesondere bevorzugt bei Konzentrationen kleiner oder gleich 100 μM, mit großer Wahrscheinlichkeit immer wieder im gleichen Bereich des Rezeptors bindet. Das Ergebnis einer solchen spezifischen Bindung kann insbesondere eine - vorzugsweise reversible - nicht im wesentlichen lediglich auf den Ort der Bindung begrenzte Konformationsänderung des Rezeptors sein.
Ferner wird unter einem Agonisten im Sinne der Erfindung eine Substanz verstanden, die durch ihre spezifische Bindung an den Rezeptor eine über diese bloße Bindung hinausgehende chemische Reaktion auslöst. In ihrem natürlichen Umfeld stehen Rezeptoren nicht chemisch unvermittelt neben anderen Zellbestandteilen, sondern stehen in Wirkverbindung mit weiteren Teilen zumindest einer Signaltransduktionskaskade, wie sie beispielsweise durch G- Proteine vermittelt wird. Durch das spezifische Binden eines Agonisten werden solche Rezeptoren von einem inaktiven in einen aktiven Zustand überführt, dies geht gewöhnlich einher mit einer nicht im wesentlichen auf den Ort der Agonisten-Bindung begrenzten Konformationsänderung des Rezeptors und schlägt sich in einem Einschalten der Signaltransduktionskaskade nieder, erkennbar beispielsweise an einem Anstieg der cytosolischen Konzentration von Ca2+, cAMP, cGMP und/oder Inositol-Triphosphat oder der Änderung des ATP/ADP-Quotienten. Die Konformationsänderung des Rezeptors, und auch das Einschalten der Signaltransduktionskaskade, ist eine über die bloße Bindung des Agonisten hinausgehende chemische Reaktion. Agonisten im Sinne dieser Erfindung bezogen auf den Rezeptor sind insbesondere die Verbindungen der Formel (I).
Im Sinne der Erfindung ist ein Antagonist eine Substanz, die zwar spezifisch von einem Rezeptor gebunden wird, jedoch das spezifische Binden eines Agonisten an den Rezeptor erschwert. Das spezifische Binden des Antagonisten führt, anders als bei einem Agonisten, nicht zum Einschalten einer
Signaltransduktionskaskade, wenn der Rezeptor Teil einer solchen, durch das spezifische Binden eines Agonisten eingeschalteten Signaltransduktionskaskade ist. Insbesondere kann eine durch das spezifische Binden eines Agonisten hervorgerufene Konformationsänderung des Rezeptors beim spezifischen Binden eines Antagonisten ausbleiben.
Insbesondere wurde eine Bindung des Rezeptors an die Verbindungen der Formeln A (umfassend A1 und A2), Formeln B (umfassend B1 und B2), Formeln C (umfassend C1 und C2), Formeln D (umfassend D1 und D2), Formeln E (umfassend E1 und E2) und Formeln F (umfassend F1 und F2) gefunden:
Figure imgf000009_0001
A1 A2
Figure imgf000009_0002
B1 B2
Figure imgf000009_0003
C1 C2
Figure imgf000010_0001
D1 D2
Figure imgf000010_0002
E1 E2
und
Figure imgf000010_0003
F1 F2
wobei jeweils X die oben genannte Bedeutung hat.
Bevorzugt sind dabei die Verbindungen der Formeln B1 und B2 und deren Mischungen, insbesondere solche Verbindungen der Formeln B1 und B2, in denen X jeweils H bedeutet. Besonders bevorzugt ist die Verbindung der Formel B1 mit X=H. Neu sind folgende Substanzen:
Verbindungen der Formel A2, in der X = OC2H5 bedeutet,
Verbindungen der Formel B2, in der X = OC2H5 bedeutet,
Verbindungen der Formel C1 , in denen X = CH3, OCH3 oder OC2H5 bedeutet,
Verbindungen der Formel C2, in denen X = CH3, OCH3 oder OC2H5 bedeutet,
Verbindungen der Formel D1 , in denen X = CH3 oder OC2H5 bedeutet,
Verbindungen der Formel D2, in denen X = CH3, OCH3 oder OC2H5 bedeutet,
Verbindungen der Formel E1 , in denen X = OCH3 oder OC2H5 bedeutet,
Verbindungen der Formel E2, in denen X = OCH3 oder OC2H5 bedeutet,
Verbindungen der Formel F1 , in denen X = H, CH3, OCH3 oder OC2H5 bedeutet,
Verbindungen der Formel F2, in denen X = H, CH3, OCH3 oder OC2H5 bedeutet.
In Anlehnung an US 2,842,598 können die Verbindungen der Formel (I) über eine Diels-Alder Reaktion eines 1 ,3-Diens der Formel (II) und einer α,ß- ungestättigten Carbonylverbindung der Formel (III) erhalten werden, wie das folgende Reaktionsschema verdeutlichen mag:
Figure imgf000011_0001
(H) (Hi) wobei die gestrichelte Linie, R1, R2 und X jeweils die oben angegebene Bedeutung haben.
Als Edukt der Formel (II) wird vorzugsweise Myrcen (7-Methyl-3-methylen-1 ,6- octadien) eingesetzt (die gestrichelte Linie in den Formeln (I) und (II) steht dann für eine Doppelbindung).
Als Edukte der Formel (III) werden vorzugsweise Acrolein, Methacrolein oder Crotonaldehyd eingesetzt, wobei die Edukte der Formel (III) auch in-situ generiert werden können.
Die Verbindungen der Formel C, D und F (d.h. solche, für die in Formel (I) die gestrichelte Linie eine Einfachbindung bedeutet), können beispielsweise mittels partieller Hydrierung aus den Verbindungen der Formel A, B und E (d.h. solche, für die in Formel (I) die gestrichelte Linie eine Doppelbindung bedeutet) synthetisiert werden. Beispielsweise können Verbindungen der Formeln A1 und A2 bzw. B1 und B2 mittels partieller Hydrierung (gegebenenfalls unter Anwendung einer Schutzgruppe für die Carbonylfunktion, wie beispielsweise einer Acetalisierung oder Ketalisierung) in Verbindungen der Formeln C1 und C2 bzw. D1 und D2 überführt werden (siehe auch Angew. Chem. 2000, 1 12, 3106- 3138).
Verbindungen der Formel A1 und A2, in denen X jeweils H bedeutet, sind kommerziell erhältlich, beispielsweise unter dem Namen Precyclemone B.
Verbindungen der Formel B1 und B2, in denen X jeweils H bedeutet, sind kommerziell erhältlich, beispielsweise unter dem Namen Vertomugal, Myrac aldehyde oder Citrusal.
Verbindungen der Formel C1 und C2, in denen X jeweils H bedeutet, sind kommerziell erhältlich, beispielsweise unter dem Namen Vernaldehyd.
Die Verbindungen der Formel (I), insbesondere die Verbindungen der Formeln A1 , A2, B1 , B2, C1 , C2, D1 , D2, E1 , E2, F1 und F2 und namentlich die oben als neu bezeichneten Substanzen der Formel (I), werden erfindungsgemäß angegeben als Duftstoffe. Sie sind geeignet zum spezifischen Binden an einen Rezeptor wie oben beschrieben, insbesondere an ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein und zum Auslösen einer Signaltransduktionskaskade wie oben beschrieben. Ferner hat sich gezeigt, wie unten näher ausgeführt wird, dass Verbindungen der Formel (I) die Ca2+-Konzentration in einer den beschriebenen Rezeptor exprimierenden Zelle steigern und die Geißelschlagfrequenz eines Spermiums erhöhen können.
Erfindungsgemäß wird deshalb auch die Verwendung einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der Verbindungen der Formeln A1 , A2, B1 , B2, C1 , C2, D1 , D2, E1 , E2, F1 und F2 und namentlich der oben als neu bezeichneten Substanzen der Formel (I), gelehrt
a) zum Binden an und/oder zum Aktivieren eines OR7A5-Duftst.offrezept.ors oder eines Duftstoffrezeptors mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftst.offrezept.ors oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins,
b) zum Auslösen oder Erhöhen der Bildung von Cycloadenosinmonophosphat und/oder zum Auslösen eines Einstroms oder Erhöhen der Konzentration an Ca2+ in einer Zelle, die einen OR7A5-Duftstoffrezeptor oder einen
Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftst.offrezept.ors oder ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein exprimiert,
c) zum Steigern der Geißelschlagfrequenz eines Spermiums,
d) zum Herstellen eines Arzneimittels zum Behandeln einer niedrigen Spermiengeißelschlagfrequenz.
Zum Herstellen eines erfindungsgemäßen Expressionssystems ist es zweckmäßig, ein Gen für den Rezeptor durch einen Vektor in eine Wirtszelle einzuführen. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird deshalb ein Vektor angegeben, der einen Nucleinsäure-Abschnitt umfasst, der für einen Rezeptor nach einem der vorherigen Aspekte der Erfindung codiert, also ein Vektor umfassend einen Nucleinsäureabschnitt codierend für a) einen OR7A5- Duftstoffrezeptor oder b) einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure- Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftst.offrezept.ors oder c) ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein. Ein solcher Vektor erleichtert es, eine für den erfindungsgemäßen Rezeptor codierende Nucleinsäure zu klonieren. Der Vektor kann auch ein sogenannter suicide-Vektor sein, insbesondere ein solcher, der die Integration des für den Rezeptor codierenden Nucleinsäure-Abschnitts in das Genom der Wirtszelle ermöglicht.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Vektor ein Expressionsvektor. Solche Vektoren ermöglichen die Transkription und Translation des im Vektor enthaltenen, für den erfindungsgemäßen Rezeptor codierenden Nucleinsäureabschnitts, wenn der Vektor in eine geeignete Wirtszelle eingebracht wird. Geeignete Wirtszellen sind insbesondere solche aus Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Xenopus /aews-Oocyten und menschliche HEK293-Zellen sowie CHO- (Chinese Hamster Ovary), COS- (Afrikan Green Monkey Kidney), BHK- (Syrian Baby Hamster Kidney) und PC12- (Rat Adrenal Phenochromocytoma) - Zellen, wobei HEK293-Zellen besonders bevorzugt sind.
Das erfindungsgemäße Expressionssystem umfasst wie eingangs angegeben eine Zelle, die einen erfindungsgemäßen Rezeptor überexprimiert. Unter "überexprimieren" wird dabei jeder Vorgang verstanden, in dessen Folge der Rezeptor über das für die jeweilige Wirtszelle unter natürlichen Bedingungen maximal erreichbare Genexpressionsniveau hinausgehend vorliegt. Dabei kann der Rezeptor insbesondere auch ein für die Wirtszelle heterologer Rezeptor sein. Stellt die betreffende Wirtszelle normalerweise keinen erfindungsgemäßen Rezeptor her, so findet eine Überexpression im Sinne der Erfindung bereits dann statt, wenn sie (erstmals) überhaupt einen solchen Rezeptor herstellt. Besonders bevorzugt sind dabei solche Wirtszellen, die neben der funktionellen Expression des Rezeptors auch die für eine vom Rezeptor durch die Bindung eines Agonisten beeinflusste Signaltransduktionskaskade notwendigen Elemente bereitstellen.
Zweckmäßigerweise handelt es sich bei der Wirtszelle um eine Säugerzelle, wobei die Wirtszelle insbesondere auch eine entartete Säugerzelle sein kann. Ein Beispiel hierfür ist die auf humane embryonale Nierenzellen zurückgehende Zellinie HEK293 (s. Graham et ai, J. Gen. Virol. (1977): 59-72).
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Komplex angegeben, wobei der Komplex ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, sowie daran spezifisch gebunden, eine Verbindung der Formel (I) umfasst, insbesondere der Formel A1 , A2, B1 , B2, C1 , C2, D1 , D2, E1 , E2, F1 oder F2.
Ein solcher Komplex ist besonders vorteilhaft dazu geeignet, die Wechselwirkungen zwischen dem Rezeptor und einem Agonisten und/oder einem möglichen Antagonisten zu untersuchen. Dabei kann es sich bei dem Antagonisten um einen reversiblen oder irreversiblen handeln. Wenn der Rezeptor mit einer Signaltransduktionskaskade in Wirkverbindung steht, so ermöglicht das Herstellen eines solchen Komplexes aus Rezeptor und Agonist das Einschalten oder Aktivieren der entsprechenden Signaltransduktionskaskade. Das Herstellen eines Rezeptor-Antagonisten- Komplexes ermöglicht es in diesem Fall, das Einschalten der Signaltransduktionskaskade auch bei Vorliegen des Agonisten zu verhindern. Weitere vorteilhafte Anwendungsmöglichkeiten eines Komplexes aus Rezeptor und Agonist oder Antagonist sind unten beschrieben. Besonders bevorzugt sind dabei die Komplexe aus einem erfindungsgemäßen Rezeptor und Myracaldehyd (Verbindung der Formel B1 mit X=H). Diese bilden sich schon bei geringen Konzentrationen an Myracaldehyd.
Insbesondere wird gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Biosensor angegeben, umfassend
a) einen erfindungsgemäßen Rezeptor und b) Mittel zum Nachweisen einer Bindung einer Verbindung der Formel (I) an den Rezeptor, vorzugsweise einer Verbindung der Formel A1 , A2, B1 , B2, C1 , C2, D1 , D2, E1 , E2, F1 oder F2.
Der Fachmann kann die zum Nachweisen der Bindung des Agonisten, insbesondere einer Verbindung der Formel (I) und insbesondere der Formel A1 , A2, B1 , B2, C1 , C2, D1 , D2, E1 , E2, F1 oder F2, an den Rezeptor geeigneten Mittel je nach der Art des gewählten Rezeptors leicht auswählen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Biosensor eine Zelle, die einen erfindungsgemäßen Rezeptor exprimiert, also a) einen OR7A5-Duftstoffrezeptor oder b) einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftst.offrezept.ors oder c) ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein exprimiert, und in der der Rezeptor in Wirkverbindung mit einer Signaltransduktionskaskade steht. Durch das spezifische Binden des Agonisten an den Rezeptor wird ein Rezeptor-Agonist-Komplex wie soeben beschrieben hergestellt. Dabei kann es zu einer nicht im wesentlichen lediglich auf den Ort der Bindung des Agonisten begrenzten Konformationsänderung des Rezeptors kommen. Durch diese Konformationsänderung oder auf andere Weise löst der Rezeptor nach der Bindung des Agonisten die Signaltransduktionskaskade aus. Diese wiederum erzeugt ein messbares Signal, beispielsweise in Form einer Erhöhung der cytosolischen Ca2+-Konzentration. Anstelle der cytosolischen Ca2+- Konzentration kann auch der Konzentrationsanstieg oder der Konzentrationsabfall einer anderen Substanz, insbesondere eines second messegers wie cAMP, cGMP, IP3 und dergleichen gemessen werden. Der Fachmann kann anhand der vom Rezeptor durch die spezifische Bindung eines Agonisten beeinflusste Signaltransduktionskaskade leicht eine geeignete Substanz zum Nachweisen dieser Bindung auswählen, deren Konzentration oder Konformation sich entsprechend der spezifischen Bindung des Agonisten an den Rezeptor ändert.
Ein solcher Biosensor ist insbesondere vorteilhaft dazu geeignet, weitere Rezeptoren zu suchen. Dazu wird der Fachmann zunächst ein Expressionssystem bereitstellen, in dem der vermutete Rezeptor funktionell exprimiert wird. Auf das Expressionssystem werden vermutete Agonisten appliziert und eine gegebenenfalls hierdurch ausgelöstes Signal des Biosensors gemessen. Wenn eine Substanz ein Biosensor-Signal auslöst und dieses Signal nicht auch in den natürlichen Zellen des Expressionssystems (also Zellen, die nicht zu einem Expressionssystem verändert wurden) auftritt, so wird vom Expressionssystem tatsächlich ein Rezeptor für diese Substanz exprimiert.
Ebenfalls wird erfindungsgemäß eine Sonde zum Nachweisen einer Nucleinsäure angegeben, die für einen Abschnitt eines erfindungsgemäßen Rezeptors codiert. Eine solche Sonde ist zweckmäßigerweise eine Nucleinsäure, insbesondere eine RNA oder eine, vorzugsweise einzelsträngige, DNA, wobei die Nucleinsäure mit einer Nucleinsäure hybridisieren kann, die für einen Abschnitt eines erfindungsgemäßen Rezeptors codiert. Bevorzugte Sonden besitzen die Sequenz SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 4 oder eines 12 - 30 , vorzugsweise 15 - 20 Aminosäuren langen Ausschnitt der Sequenzen SEQ ID NO 3 oder SEQ ID NO 4.. Die Nucleinsäure ist verbunden mit einer nachweisbaren Markierung, beispielsweise mit einer Fluoreszenz-, Lumineszenz-, Farbmarkierung, einer radioaktiven Markierung oder einem Enzym, das die Bildung eines nachweisbaren Reaktionsprodukts katalysiert. Anstelle einer solchen nachweisbaren Markierung kann die Sonde auch an einen Feststoff, beispielsweise an Metallpartikel wie magnetische Beads, gekoppelt sein (gegebenenfalls über einen Linker).
In diesem Zusammenhang wird erfindungsgemäß gelehrt, eine Nucleinsäure, vorzugsweise eine Sonde wie zuvor beschrieben, zum Nachweisen einer Nucleinsäure, die für ein Fragment eines Rezeptors codiert, zu verwenden. So können zum einen weitere Rezeptoren mit gleicher oder ähnlicher Aminosäuresequenz wie der erfindungsgemäße Rezeptor gefunden werden. Dabei wird die Sonde unter vorzugsweise stringenten Hybridisierungsbedingungen mit Nucleinsäuren einer zu untersuchenden Zelle in Kontakt gebracht, um ein Hybridisieren der Sonde an eine dieser entsprechenden Wirts-Nucleinsäure zu ermöglichen, falls eine solche entsprechende Nucleinsäure vorliegt. Je weniger stringent die Hybridisierungsbedingnungen sind, desto weniger ähnlich können die Nucleinsäuren sein, die mit der Sonde hybridisieren. Nach dem Hybridisieren werden die mit der Sonde hybridisierten Nucleinsäuren aufgereinigt und sequenziert.
Soll mit der Sonde nur die Anwesenheit von Nucleinsäuren, die für ein Fragment eines Rezeptors codieren, nachgewiesen werden, so reicht es aus, diese Nucleinsäuren - vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen - mit der Sonde in Kontakt zu bringen, um ein Hybridisieren der Sonde an die entsprechende Nucleinsäure zu ermöglichen, wenn eine solche entsprechende Nucleinsäure vorliegt. Dabei ist es zweckmäßig, wenn die Nucleinsäure, die mit der Sonde nachgewiesen werden soll, an einem festen Träger immobilisiert ist, beispielsweise in einem Gel oder auf einem Nylonfilter. In diesem Fall ist das Hybridisieren der Sonde an die nachzuweisende Nucleinsäure leicht dadurch nachweisbar, dass die Sonde - vermittelt durch die nachzuweisende Nucleinsäure - ebenfalls an den festen Träger gebunden ist und bei Durchführen eines Waschschrittes im wesentlichen nicht vom festen Träger abgewaschen wird. Dem Fachmann sind derartige Nachweisverfahren als Southern- oder Northern-Blot bekannt.
Primer zum Amplifizieren einer für OR7A5 codierenden Nucleinsäure sind mit den Sequenzen SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2 angegeben.
Zudem wird erfindungsgemäß angegeben, einen erfindungsgemäßen Rezeptor zu verwenden zum Nachweisen und/oder spezifischen Binden einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der Formel A1 , A2, B1 , B2, C1 , C2, D1 , D2, E1 , E2, F1 oder F2. Dadurch werden die oben beschriebenen Komplexe erzeugt, die die oben genannten Vorteile besitzen.
Eine besonders bevorzugte Verwendung einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der Formel A1 , A2, B1 , B2, C1 , C2, D1 , D2, E1 , E2, F1 oder F2 besteht darin, die Geißelschlagfrequenz eines Spermiums zu beeinflussen. Es hat sich herausgestellt, dass auch Spermien Rezeptoren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung exprimieren und chemokinetische Reaktionen zeigen, die durch die Bindung einer Verbindung der Formel (I), insbesondere Myracaldehyd, ausgelöst werden können. Die Agonisten, also Verbindungen der Formel (I), insbesondere der A1 , A2, B1 , B2, C1 , C2, D1 , D2, E1 , E2, F1 oder F2, insbesondere mit X=H, können daher auch dazu verwendet werden, die Schwimmgeschwindigkeit von Spermien zu erhöhen. Die Zugabe eines Antagonisten zu Spermien führt dazu, dass die beschriebenen Effekte - bei gleichbleibender Agonistenkonzentration - entweder nicht oder nicht in dem sonst üblichen Maße eintreten.
Dementsprechend wird erfindungsgemäß auch ein Arzneimittel angegeben, insbesondere ein Kontrazeptivum oder empfängnisförderndes Arzneimittel, umfassend als Agonist eine oder mehrere Verbindungen der Formel (I), insbesondere der A1 , A2, B1 , B2, C1 , C2, D1 , D2, E1 , E2, F1 oder F2, insbesondere mit X=H, in einer pharmazeutisch wirksamen Menge, insbesondere in einer kontrazeptiven oder empfängnisfördernden Menge. Die eine oder mehrere Verbindung(en) der Formel (I) können dabei insbesondere als pharmazeutisch verträgliches Salz der jeweiligen Verbindung der Formel (I) vorliegen. Unter einem Arzneimittel wird dabei jedes Mittel verstanden, das zur Vorbeugung, Diagnose oder zur Behandlung eines körperlichen Zustandes eines Menschen und/oder Tieres eingesetzt wird. Arzneimittel im erfindungsgemäßen Sinne können daher insbesondere Arzneimittel gemäß § 1 des Arzneimittelgesetzes sein, aber auch Medizinprodukte gemäß § 3 des Medizinproduktegesetzes, jeweils in ihrer am 01. August 2002 geltenden Fassung. Ein solches Arzneimittel nutzt die mit der oben beschriebenen Verwendung von Agonisten und Antagonisten erzielbaren Vorteile. Neben den Agonisten und/oder dem Antagonisten umfasst das Arzneimittel zweckmäßigerweise einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Anstelle des Agonisten oder Antagonisten selbst kann das Arzneimittel auch eine Vorstufe des Agonisten bzw. Antagonisten umfassen, die im menschlichen und/oder tierischen Körper zu einem Agonist bzw. Antagonist umgesetzt wird. Bei einem kontrazeptiv wirkenden Arzneimitteln kann es besonders zweckmäßig sein, einen Antagonisten - bevorzugt einen den Rezeptor irreversibel hemmenden Antagonisten - im oder auf dem menschlichen Körper, vorzugsweise in der Scheide, dem Uterus und/oder dem Eileiter freizusetzen, um dort gegebenenfalls vorhandenen Spermien die Orientierung hin zu einer gegebenenfalls vorhandenen Eizelle zu erschweren. Dies kann durch ein Intravaginalpräparat erfolgen, aus dem der Antagonist freigesetzt wird. Ebenfalls möglich ist es, ein Präservativ mit einem Antagonisten - wiederum bevorzugt einem irreversiblen - zu versehen, beispielsweise zu imprägnieren oder zu beschichten, so dass der Antagonist bei bestimmungsgemäßer Verwendung des Präservativs freigesetzt wird.
Bei einem empfängnisfördernden Arzneimittel kann es insbesondere vorteilhaft sein, einen oder mehrere Agonisten - gegebenenfalls in Kombination mit weiteren Substanzen - im Eileiter und/oder Uterus freizusetzen, um Spermien mit einer niedrigen Geißelschlagfrequenz zu beschleunigen.
Ferner wird erfindungsgemäß ein Antagonist gegen das spezifische Binden eines Agonisten der Formel (I), insbesondere der A1 , A2, B1 , B2, C1 , C2, D1 , D2, E1 , E2, F1 oder F2, insbesondere mit X=H zum Beeinflussen der Geruchswahrnehmungsfähigkeit eines Menschen und/oder eines Tieres verwendet. Die Verwendung eines Antagonisten ermöglicht es auf einfache Weise, die Geruchswahrnehmungsschwelle für einen oder mehrere Agonisten bei Mensch und/oder Tier anzuheben, so dass der betreffende Agonist weniger leicht gerochen wird. Dies kann insbesondere in den Fällen sinnvoll sein, in denen ein Agonist einen störenden Geruch entwickelt, jedoch nur mit unverhältnismäßig hohem Aufwand aus der Luft oder einem anderen Trägermedium entfernt werden kann.
Zum Herstellen eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins oder Expressionssystems wird ein Verfahren angegeben, das die Schritte umfasst:
a) Einbringen eines erfindungsgemäßen Vektors in eine Zelle, und b) Einstellen von Bedingungen, so dass der Nucleinsäureabschnitt des Vektors, der für den Rezeptor codiert, in der Zelle exprimiert wird.
Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich, ein erfindungsgemäßes Expressionssystem und damit den erfindungsgemäßen Rezeptor und gegebenenfalls auch einen erfindungsgemäßen Biosensor herzustellen. Der erfindungsgemäße Rezeptor kann aus den Zellen des Expressionssystems weiter aufgereinigt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren angegeben zum Nachweisen einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der A1 , A2, B1 , B2, C1 , C2, D1 , D2, E1 , E2, F1 oder F2, insbesondere mit X=H, in einer Probe, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
a) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Rezeptors, insbesondere eines OR7A5-Rezeptors, eines Duftstoffrezeptor smit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur
Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftst.offrezept.ors oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins,
b) Inkontaktbringen des Rezeptors mit der zu untersuchenden Probe und Einstellen von Bedingungen, bei denen eine gegebenenfalls in der Probe enthaltene Verbindung der Formel (I) spezifisch an den Rezeptor bindet, und
c) Überprüfen, ob eine Verbindung der Formel (I) eine spezifische Bindung mit dem Rezeptor eingegangen ist.
Der Rezeptor kann insbesondere in Form eines Expressionssystems bereitgestellt werden, in dem der Rezeptor in Wirkverbindung mit einer Signaltransduktionskaskade steht. In diesem Fall kann eine spezifische Bindung der Verbindung der Formel (I) an den Rezeptor durch das Einschalten der betreffenden Signaltransduktionskaskade überprüft werden, während das spezifische Binden des Antagonisten durch das Ausbleiben eines solchen Einschaltens der Signaltransduktionskaskade bei Anwesenheit einerVerbindung der Formel (I) überprüft werden kann. Ein solches Expressionssystem kann jedoch auch künstlich nachgebildet werden, indem der Rezeptor und die übrigen Bestandteile der Signaltransduktionskaskade in vitro zusammengestellt werden.
Der Rezeptor kann jedoch auch als aufgereinigtes Protein vorliegen, das an die Oberfläche eines festen Trägers, insbesondere einer Metalloberfläche, gebunden ist. In diesem Fall kann sich durch das spezifische Binden einer Verbindung der Formel (I) und/oder eines Antagonisten an den Rezeptor eine physikalische Oberflächeneigenschaft ändern. Dies kann beispielsweise die Änderung der Oberflächen-Plasmon-Resonanz sein, wie sie in einem Biacore-Verfahren bestimmt werden kann.
Ebenfalls möglich ist es, den Rezeptor und/oder eine Verbindung der Formel (I) und/oder einen Antagonisten mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu versehen und die durch die spezifische Bindung der Verbindung der Formel (I) und/oder des Antagonisten an den Rezeptor hervorgerufene Änderung der Fluoreszenz zu bestimmen.
Insbesondere kann der Rezeptor als Fusionsprotein mit einem green fluorescent p/Ote/n-(GFP-)-Anteil vorliegen, so dass sich die Fluoreszenz des Fusionsproteins bzw. des GFP-Anteils des Fusionsproteins bei spezifischer Bindung einer Verbindung der Formel (I) und/oder eines Antagonisten entsprechend ändert. Dem Fachmann sind solche Untersuchungsverfahren unter der Bezeichnung "FRET-Assays" {Fluorescence resonance energy transfer assays) bekannt. Auf vergleichbare Weisekann der Rezeptor auch als Fusionsprotein mit einem Luciferase-Anteil vorliegen, so dass sich die Lumineszenz des Fusionsproteins bzw. des Luciferase-Anteils des Fusionsproteins bei spezifischer Bindung eines Agonisten und/oder eines Antagonisten ändert ("BRET-Assay").
Dabei ist insbesondere ein Verfahren zum Nachweisen des Antagonisten in einer Probe bevorzugt, das folgende Schritte umfasst: a) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Rezeptors, insbesondere eines OR7A5-Rezeptors, eines Duftstoffrezeptors mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftstoffrezeptors oder eines erfindungsgemäßen
Fusionsproteins,
b) Inkontaktbringen des Rezeptors mit der zu untersuchenden Probe und Einstellen von Bedingungen, bei denen ein gegebenenfalls in der Probe enthaltener Antagonist spezifisch an den Rezeptor bindet,
c) Inkontaktbringen des Rezeptors mit einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der A1 , A2, B1 , B2, C1 , C2, D1 , D2, E1 , E2, F1 oder F2, insbesondere mit X=H, um der Verbindung ein spezifisches Binden an den Rezeptor zu ermöglichen, falls kein Antagonist spezifisch an den Rezeptor gebunden ist, und
d) Überprüfen, ob die Verbindung der Formel (I) und/oder ein Antagonist eine spezifische Bindung mit dem Rezeptor eingegangen ist.
Der Fachmann erkennt, dass die Schritte b) und c) gleichzeitig oder in einer beliebigen Reihenfolge nacheinander durchgeführt werden können, vorausgesetzt, dass Schritt c) vor oder gleichzeitig mit Schritt d) durchgeführt wird. Insbesondere können folgende Verfahrensausführungen zweckmäßig sein:
In einer bevorzugten Ausführungsform wird zunächst der erfindungsgemäße Rezeptor bereitgestellt. Hierzu kann sich der Fachmann der Möglichkeiten bedienen, die oben für ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Nachweisen eines Agonisten, insbesondere einer Verbindung der Formel (I), und/oder Antagonisten beschrieben wurden. Anschließend wird der Rezeptor mit der gegebenenfalls antagonistenhaltigen Probe in Kontakt gebracht. Dabei werden solche Bedingungen eingestellt, unter denen ein Antagonist spezifisch an den Rezeptor binden könnte, so er denn in der Probe vorhanden ist. Nach dem Inkontaktbringen mit dem Antagonisten wird der Rezeptor mit einem Agonisten in Kontakt gebracht. Hierbei werden die Bedingungen so eingestellt, dass der Agonist an den Rezeptor spezifisch binden kann, wenn kein Antagonist an den Rezeptor spezifisch gebunden hat. Abschließend wird überprüft, ob der Agonist an den Rezeptor spezifisch gebunden hat. Dies kann beispielsweise dadurch geschehen, dass das Einschalten einer Signaltransduktionskaskade überprüft wird, mit der der Rezeptor in Wirkverbindung steht. Wenn der Agonist an den Rezeptor gebunden hat, dann liegt der Antagonist wahrscheinlich nicht in einer Konzentration in der zu untersuchenden Probe vor, bei der er das spezifische Binden des Agonisten verhindern könnte. Insbesondere kann es möglich sein, das Maß der Agonistenbindung an den Rezeptor zu bestimmen und hieraus - gegebenenfalls nach einer entsprechenden Kalibrierung - auf die Konzentration des Antagonisten in der zu untersuchenden Probe zu schließen.
In einer bevorzugten Abwandlung des Verfahrens wird der Rezeptor zuerst mit dem Agonisten und anschließend mit der den Antagonisten gegebenenfalls enthaltenden Probe in Kontakt gebracht. In diesem Fall kann aus der Abnahme des Maßes, in dem der Agonist spezifisch an den Rezeptor gebunden ist, auf die Anwesenheit des Antagonisten und gegebenenfalls auch auf dessen Konzentration in der zu untersuchenden Probe geschlossen werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Figuren und der Beispiele näher erläutert, ohne dass diese den Schutzbereich der Patentansprüche einschränken sollen.
Fig. 1 zeigt die spezifische Aktivierung von HEK293-Zellen durch Myracaldehyd.
Beispiel 1 : Spezifische Aktivierung von HEK293-Zellen durch Myracaldehyd
HEK293-Zellen wurden transient mit einem Vektor transfiziert, der für OR7A5 codierte Zum Herstellen des Vektors wurde das Gen für OR7A5 mit den Primern SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO: 2 amplifiziert, mit der Restriktionsnuklease EcoR V verdaut und das erhaltene Fragment in die entsprechende Schnittstelle des Vektors pCDNA3 (Invitrogen, USA) kloniert.
Das verwendete Transfektionsprotokoll in diesem und den folgenden Beispielen entspricht dem der WO 2004/033496 A1 , auf deren Inhalt, insbesondere auf deren Beispiele 3 bis 13, in soweit verwiesen wird.
HEK293-Zellen unter Standardbedinungen in DMEM (Sambrook et al.,Molecular cloning: A laboratory manual; CoId Spring Harbour 1982) mit 10% fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin und Streptomycin und 2 mM L-Glutamin gehalten. Die Transfektion erfolgte durch Calciumphosphat-Präzipitation. Etwa 1 h vor Beginn der Transfektion wurde das Medium durch 2 ml frisches DMEM ersetzt. Zur Transfektion wurden 100 bis 200 μl des Transfektionsreagens zugegeben. Nach 24 h wurden die Zellen mit frischem PBS++ (2.7 mM KCl, 1 ,5 mM KH2PO4, 137 mM NaCI, 8,1 mM Na2HPO4, 0,9 mM CaCI2, 0,48 mM MgCI2, pH 7,3-7,5) gewaschen und erneut mit frischem DMEM kultiviert. Zur Calcium-Darstellung wurde das DMEM drei Tage nach der Transfektion durch übliche Ringer-Lösung ausgetauscht. Als Indikator der Calcium-Konzentration wurde Fura2 (Molecular Probes) nach Anleitung des Herstellers verwendet.
Figur 1 zeigt eine repräsentative Abbildung einer Ca2+-Verteilung in den transfizierten HEK293-Zellen. HEK293-Zellen wurden mit einem Vektor transfiziert, der für OR7A5 codiert. Etwa 5% der transfizierten Zellen zeigten eine signifikante Zunahme des intrazellulären Calciumgehalts nach Zugabe von Myracaldehyd.
Beispiel 2: Spezifität von Spermien-Duftstoffrezeptoren
HEK293-Zellen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben mit Vektoren transfiziert, die für OR7A5 oder OR1 D2 codierten. Die transfizierten Zellen wurden auf ihre Reaktion auf verschiedene Substanzen hin untersucht.
Figur 2 zeigt in Teilbild a, dass die Wirkung von Myracaldehyd ("Myrac") nicht durch vorherige Verabreichung von n-Undecanal verringert wird, stattdessen kommt es nach wie vor bei Verabreichung von Myracaldehyd zu einer vorüebrgehenden signifikanten Erhöhung des intrazellulären Ca2+-Gehalts.
In den Teilbildern b und c der Figur 2 ist gezeigt, dass 0R1 D2-transfizierte Zellen mit einer Erhöhung des intrazellulären Ca2+-Gehalts nur bei Verabreichung von Bourgeonal reagieren, nicht aber bei Verabreichung von Myracaldehyd. Die Wirkung von Bourgeonal kann zudem durch vorherige oder gleichzeitige Verabreichung von n-Undecanal verringert werden. Zu den Wirkungen von n- Undecanal auf OR1 D2 findet der Fachmann nähere Informationen in der WO 2004/033496A1 , deren Inhalt in soweit in Bezug genommen wird.
Die stärkste Erhöhung des intrazellulären Ca2+-Gehalts von OR7A5- transfizierten HEK293-Zellen wurde erhalten bei Verabreichung von Myracaldehyd, PI-21788 (Verbindung der Formel A1 mit X=H) und Vernaldehyd.
Beispiel 3: Beeinflussung des Verhaltens von Spermien
Die Reaktion von Spermien auf Myracaldehyd wurde untersucht wie in Beispiel 17 der WO 2004/033496A1 für Bourgeonal beschrieben, wobei jedoch frische Spermaproben statt gefrorener Spermaproben verwendet wurden..
Die Reaktionen von Sperma auf Myracaldehyd und wurde (a) durch computer- assisted video motion analysis (CAVMA) gemessen, um Veränderungen in der Schwimmgeschwindigkeit (Spermaaktivierung) zu detektieren, und (b) in einem flat capillary-Assay um eine Chemotaxis in der Nähe einer Diffusionsmaterialquelle zu untersuchen. Für jede Test- oder Kontroll- Behandlung wurden fünf wiederholte Experimente unter Verwendung von Sperma der fünf Spender durchgeführt. Die Daten der Bioassays wurden statistisch durch Ein-Weg-Varianzanalyse (ANOVA) unter Verwendung eines post-hoc Scheffe-Tests (R. W. Day and G. P. Quinn, Ecol. Monogr. 59, 433-463 (1989)) analysiert. Eine Bonferroni-Korrektur wurde zum Angleichen der α-Levels für multiple Vergleiche verwendet.
Zur Untersuchung der Spermien-Aktivierung wurden Bioassays für die Schwimmgeschwindigkeit bei 37 0C durchgeführt. Spermien wurden sanft einer Kontroll- oder Testlösung einheitlicher Konzentration zugefügt. Die Bilder von Spermien (3,0 x 103 Zellen/ml) wurden dann unter Verwendung einer Videokamera (NEC Modell Tl 23A), die auf einem Olympus IX70-Lichtmikroskop montiert war, bei 90-facher Vergrößerung aufgenommen. Um mögliche Artefakte durch Reibungskräfte zu minimieren, besaß die Kamera eine 100 μm Feldtiefe und fokussierte auf eine Region, die annäherend 2 mm von der nächsten Oberfläche entfernt war. Videobilder von Spermien wurden mit 30 Bildern/Sekunde digitalisiert und über 10-Sekundenintervalle unter Verwendung eines CAVMA-Systemes (Motion Analysis Corporation, Modell VP 320, Expert Vision und Benutzter-Software), verbunden mit einer Sun SPARC 2 Computer- Arbeitsstation bearbeitet (J. A. Riffell, P. J. Krug, R. K. Zimmer, Journal of Experimental Biology 205, 1439-1450 (2002)). Die Schwimmgeschwindigkeit wurde auf einer Bild-zu-Bild-Basis bestimmt und danach über jeden einzelnen zurückgelegten Weg gemittelt. Um zu vermeiden, sich horizontal anstatt vertikal bewegende Zellen zu messen, wurden kurze Wege mit weniger als 11 Bildern verworfen, bei denen sich die Spermien um mehr als 20 % in ihrer scheinbaren Größe veränderten.
Zur Untersuchung der Spermien-Chemotaxis wurden Kammern mit vier getrennten Kompartimenten verwendet, wobei die Kapillar-Methode von Adler (J. Adler, Science 153, 708-716 (1966); J. Adler, Journal of General Microbiology 74, 77-91 (1973)) modifiziert wurde. Jedes Kompartiment bestand aus zwei durch einen Kanal verbundenen Vertiefungen. Die Spermienproben (106 Zellen/ml) wurden jeweils in den Vertiefungen vorgelegt. Ein flaches 6 μl- Mikrokapillarröhrchen (Drummond Scientific Co.), das entweder Test- oder Kontrolllösung enthielt, wurde in den Kanal eingeführt, wobei seine beiden Enden die frischen Spermien-Suspensionen innerhalb der zwei Vertiefungen berührten. Nach vier Stunden Inkubation bei 37 0C wurden die Inhalte jeder Kapillare in die Vertiefung eines Toxoplasmose-Objektträgers transferiert, hitzefixiert und mit 0,1 Acridin-Orange 1 Minute lang gefärbt. Zellzählungen wurden dann unter Verwendung eines Olympus-BH2-Mikroskopes, das für Phasenkontrast- und Epifluoreszenz-Applikationen ausgerüstet war (J. A. Riffell, P. J. Krug, R. K. Zimmer, Journal of Experimental Biology 205, 1439-1450 (2002); C. C. Gee and R. K. Zimmer-Faust, Journal of Experimental Biology 200, 3185-3192 (1997)), bei 67-facher Vergrößerung durchgeführt.
Zur Bestimmung der Chemoattraktion von Spermien wurde 10"6, 10"7, 10"8 oder 10"9 M Myracaldehyd getestet. Während der Durchführung der Chemotaxis- Bioassays wurde das Spermienverhalten innerhalb eines Bereiches von 300 μm vor jeder Kapillarspitze 30 Sekunden lang auf Video aufgenommen. Die Videoaufnahme begann 10 bis 15 Minuten nach dem Experimentbeginn, um die Bildung eines chemischen Gradienten zu ermöglichen. Die Spermien- Orientierung zum Gradienten hin wurde unter Verwendung von CAVMA quantifiziert. Durch Anwendung zirkulärer Statistiken wurde die mittlere Vektorlänge (r) und die Schwimmrichtung berechnet, um das Bewegungsmuster der untersuchten Spermien zu beschreiben. Der Winkel der Spermienorientierung wurde in Bezug auf einen Ursprung angegeben, der als die kürzeste Verbindung zwischen jeder individuellen Zelle und der Kapillarenspitze (0°) definiert wurde. Um zu bestimmen, ob die Zellbewegung innerhalb des chemischen Gradienten nicht-zufällig war, wurde jede mittlere Ausrichtung mit einer uniformen zirkulären Verteilung unter Verwendung eines unimodalen Rayleigh-Tests (J. H. Zar, Biostatistical Analysis (1984)) verglichen.
Die Spermien reagierten (vgl. Figur 3) auf Myracaldehyd in einer Dosis- abhängigen Weise, indem sie erhöhte Schwimmgeschwindigkeiten und
Chemotaxis in Kapillar-Assays zeigten. Die Figur 3 stellt diese Ergebnisse graphisch dar, wobei die Werte Mittelwerte und Standartabweichung mit aus den
Rohdaten berechneten Regressionsgeraden sind. Ab einer Konzentration von
10 nM erhöhte Myracaldehyd die Schwimmgeschwindigkeit von Spermien. Weiterhin zeigte Myracaldehyd für Spermien einen chemotaktischen Effekt.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer Substanz der Formel (I)
Figure imgf000029_0001
(I)
wobei
R1 und R2 unabhängig voneinander H oder CH3 bedeuten,
X gleich H, CH3, OCH3 oder OC2H5 bedeutet und
die in der Formel (I) eingezeichnete gestrichelte Linie entweder eine Einfachoder eine Doppelbindung bedeutet und
die Gruppe -C(O)X an eines der Kohlenstoffatome gebunden ist, die mit dem Rest R1 bzw. R2 verknüpft ist
a) zum Binden an und/oder zum Aktivieren eines OR7A5- Duftstoffrezeptors oder eines Duftstoffrezeptors mit einer Aminosäure- Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftst.offrezept.ors,
b) zum Auslösen oder Erhöhen der Bildung von Cycloadenosinmonophosphat und/oder zum Auslösen eines Einstroms oder Erhöhen der Konzentration an Ca2+ in einer Zelle, die einen OR7A5- Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure- Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftst.offrezept.ors exprimiert,
c) zum Steigern der Geißelschlagfrequenz eines Spermiums, d) zum Herstellen eines Arzneimittels zum Behandeln einer niedrigen Spermiengeißelschlagfrequenz.
2. Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Figure imgf000030_0001
A2 wobei X= OC2H5 ist,
Figure imgf000030_0002
B2 wobei X= OC2H5 ist,
Figure imgf000030_0003
C1 C2 wobei X=CH3, OCH3 oder OC2H5 ist;
Figure imgf000031_0001
D1 D2
wobei, wenn die Verbindung die Formel D1 hat, X=CH3 oder OC2H5 ist, und, wenn die Verbindung die Formel D2 hat, X=CH3, OCH3 oder OC2H5;
Figure imgf000031_0002
E1 E2
wobei X= OCH3 oder OC2H5 ist;
und
Figure imgf000031_0003
F1 F2
wobei X=H, CH3, OCH3 oder OC2H5 ist;
3. Expressionssystem umfassend eine Zelle, die einen OR7A5- Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure- Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftst.offrezept.ors exprimiert, wobei
a) der Duftstoffrezeptor heterolog in bezug auf die Zelle ist oder
b) der Duftstoffrezeptor in der Zelle überexprimiert wird.
4. Expressionssystem nach Anspruch 3, wobei die Zelle eine gegebenenfalls entartete Säugerzelle ist.
5. Vektor umfassend einen Nucleinsäureabschnitt codierend für einen OR7A5-Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure- Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftst.offrezept.ors.
6. Nucleinsäure bestehend aus oder umfassend die Sequenz SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2 oder SEQ ID NO 4.
7. Verwendung einer Nucleinsäure gemäß Anspruch 6 oder einer Nucleinsäure der Sequenz SEQ ID NO 3 zum Nachweisen eines Nucleinsäureabschnitts codierend für einen OR7A5-Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5- Duftstoffrezeptors.
8. Biosensor zum Nachweisen einer Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1 , umfassend
a) ein Expressionssystem nach einem der Ansprüche 3 oder 4, und
b) Mittel zum Nachweisen einer Bindung der Verbindung der Formel (I) an den besagten Duftstoffrezeptor des Expressionssystems.
9. Arzneimittel umfassend eine oder mehrere Verbindungen der Formel (I) gemäß Anspruch 1 oder eines Salzes der jeweiligen Verbindung, in einer pharmazeutisch wirksamen Menge.
10. Verwendung eines OR7A5-Duftstoffrezeptors oder eines Duftstoffrezeptors mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur
Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5- Duftstoffrezeptors zum Nachweisen und/oder zum Binden an eine Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1.
11. Verfahren zum Nachweisen einer Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1 , umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen eines Expressionssystems nach einem der Ansprüche 3 bis 4,
b) Inkontaktbringen des Expressionssystems mit einer Probe, die gegebenenfalls eine besagte Verbindung der Formel (I) enthält, und
c) Überprüfen, ob die Verbindung der Formel (I) an den besagten Duftstoffrezeptor des Expressionssystems gebunden hat.
12. Verfahren zum Nachweisen eines Antagonisten eines OR7A5- Duftstoffrezeptors oder eines Duftstoffrezeptors mit einer Aminosäure- Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR7A5-Duftst.offrezept.ors, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen des erfindungsgemäßen Rezeptors,
b) Inkontaktbringen des Rezeptors mit der zu untersuchenden Probe und Einstellen von Bedingungen, bei denen ein gegebenenfalls in der Probe enthaltener Antagonist spezifisch an den Rezeptor bindet,
c) Inkontaktbringen des Rezeptors mit einer Verbindung der Formel (I) ,um der Verbindung ein spezifisches Binden an den Rezeptor zu ermöglichen, falls kein Antagonist spezifisch an den Rezeptor gebunden ist, und
Überprüfen, ob die Verbindung der Formel (I) und/oder ein Antagonist eine spezifische Bindung mit dem Rezeptor eingegangen ist.
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