+

WO2008013067A1 - Vecteur de chromosome artificiel humain (cah), et substance pharmaceutique à base de cellules humaines contenant un vecteur de chromosome artificiel humain (cah) - Google Patents

Vecteur de chromosome artificiel humain (cah), et substance pharmaceutique à base de cellules humaines contenant un vecteur de chromosome artificiel humain (cah) Download PDF

Info

Publication number
WO2008013067A1
WO2008013067A1 PCT/JP2007/063944 JP2007063944W WO2008013067A1 WO 2008013067 A1 WO2008013067 A1 WO 2008013067A1 JP 2007063944 W JP2007063944 W JP 2007063944W WO 2008013067 A1 WO2008013067 A1 WO 2008013067A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
human chromosome
human
chromosome
fragment
sequence
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/063944
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Minoru Kakeda
Kazuma Tomizuka
Mitsuo Oshimura
Yasuhiro Kazuki
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. filed Critical Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.
Priority to EP07768413.2A priority Critical patent/EP2048229B1/en
Priority to CA002658204A priority patent/CA2658204A1/en
Priority to CN200780033077.7A priority patent/CN101535474B/zh
Priority to JP2008526726A priority patent/JP5345391B2/ja
Priority to AU2007277863A priority patent/AU2007277863A1/en
Priority to US12/307,879 priority patent/US8809045B2/en
Publication of WO2008013067A1 publication Critical patent/WO2008013067A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
    • A01K2217/206—Animal model comprising tissue-specific expression system, e.g. tissue specific expression of transgene, of Cre recombinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
    • C12N2800/208—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of mammalian origin, e.g. minichromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Definitions

  • the present invention provides a human artificial chromosome (HAC) vector having a centromeric and subtelomeric sequence derived from a human chromosome and a telomeric sequence, and a human cell medicine or human cell having the HAC vector.
  • the resulting human cells are useful as gene therapy and regenerative medicine.
  • the present invention also provides a method for producing human cells having the HAC vector, the HAC vector, and a method for producing the same. Furthermore, the present invention provides a method for producing a therapeutic protein using the above HA vector.
  • transgenes in the case of episomes.
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • YAC yeast artificial chromosomes
  • viruses that are widely used for gene transfer into mammalian cells are transgenes in the case of episomes.
  • the point of transient expression is that when it is integrated into the host cell chromosome (integration), the host chromosome gene is destroyed, the number of copies of the transgene is not controlled, and the transgene is inactivated.
  • the problem is that it is affected by the control sequences on the host chromosome.
  • the present inventor's research group started a novel HAC that allows easy introduction of foreign DNA from which chromosome 21 has been clarified and unnecessary genes are removed using human chromosome 21 as a starting material.
  • a (2 1 HAC) vector system was constructed (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
  • the 21 HAC vector can be autonomously replicated / distributed using mammalian cells containing human as a host and is stably maintained, and a gene with a constant copy number can be introduced without destroying the host chromosome. It showed that there is.
  • 2 1 HA C vector introduced with the therapeutic acupuncture gene human erythropoietin can be transferred to human normal primary fibroblasts, E PO can be expressed over a long period of time, its expression level is suppressed to about 11 000 in CHO cells, and normal primary cultured fibroblasts transfected with HAC from a single colony up to 3.8 X 10 7 cells Until amplification Have been shown to be retained at 65.5-90.9% after passage 6 or 9 under non-selective conditions (Patent Document 1 and Non-Patent Document 2).
  • the exvivo EPO-supplemented gene therapy model in baboons is a capsule subcutaneous transplantation of primary cultured baboon MS C s (0.8 8 to 6.6 X 10 6 cells Zkg) introduced with hEPO gene using a retrovirus vector.
  • a retrovirus vector has been reported to increase blood EPO concentration and anemia recovery (Non-patent Document 3) Force For gene therapy, further improvement in the expression level per cell is required.
  • One means to solve the above problem is to construct a HAC vector having functional telomeres using a highly stable human chromosome as the human chromosome that is the basic skeleton of the vector.
  • Non-patent Document 4 There are examples of using insulators on HAC to eliminate the effects of chromatin structure and control sequences (Non-patent Documents 23), but the verification of the effects of control sequences on chromatin has not been verified. It does not manipulate the array. In addition, there has been no study on improving the stability of the HAC vector by telomeric sequence manipulation, such as addition of telomer sequence by telomerase and recovery of telomere length on HAC.
  • Non-Patent Document 22 When introducing a foreign gene, introduction of a drug resistance gene is commonly used to select transgenic cells. In many cases, drug resistance genes are placed on the same vector in parallel with the target foreign gene. It is known that when multiple gene expression units are arranged in parallel, they interfere with each other and the expression level of foreign genes decreases. Conventionally, in the construction of high-expression production cells, in order to improve the expression level, for example, the drug resistance gene is divided as eXon and expressed through splicing to reduce the drug resistance performance. Although highly expressing cells have been selected (Non-Patent Document 22), there has been no report that the expression of foreign genes has been remarkably improved by removing the drug resistance gene itself.
  • Telomeres are repetitive sequences located at the ends of chromosomes and are conserved in a wide range of species from yeast to mammalian cells including humans. In normal human cells, (TTAGGG) repeats are 15 to 0. Covers a length of 4 kb. Telomeres shorten with the progress of cell division, and the appearance and increase of abnormal chromosomes (fusion, omission, fragmentation, aneuploidy, etc.) are observed as the telomere length decreases, thus protecting and maintaining chromosome stability (Non-Patent Documents 10 and 11). From the above, it is considered that the stability of the dye is improved by having a sufficiently long functional telomere structure.
  • telomere length can be artificially extended by forced expression of telomerase or by deletion of telomere binding protein (POT ⁇ TRF 2) (Non-patent Documents 12 and 13). These Although this method demonstrated an increase in the number of divisions and prolongation of life in normal human cultured cells and human cell lines, it is still unclear whether chromosomal stability can be restored or improved. Furthermore, in immortalized cells, when the telomeres that had been shortened and increased in endogenous telomerase activity after Crisis were extended and maintained to a certain length, the frequency of abnormal chromosomes maintained without increasing or decreasing (non-patent literature) 1 4) There are examples, but in this case as well, chromosomal stability has not been restored or improved.
  • Subtelomers are located adjacent to the centromeric side of the telomer (TTAGGG) n repeat sequence at the end of the chromosome, and have a chromosomal region spanning about 300 to 500 kb with segmented / overlapping domains and (TTAGGG) n-like repeat sequences. Point to. It is known that translocation and recombination are likely to occur at high frequency within subtemes on the same chromosome or between subtelomeres on different chromosomes due to the high homozygosity of the segmental / duplicate domain structure. Patent documents 15 to 17).
  • the length of the subtelomeres in the long arm of chromosome 1 is 4 99 kb as a segmental overlapping region, and there is an unidentified sequence of 20 kb or less between the telomeric sequence of (TTAGGG) n and the above subtelomeric region.
  • TTAGGG telomeric sequence of (TTAGGG) n and the above subtelomeric region.
  • the functions of subtelomeres are suggested to include repair and maintenance of telomeres in the absence of telomerase by promoting recombination using high homology, adaptation to new environments due to plasticity of subtelomeres, induction of disease-induced translocation and deletion.
  • the details are not yet clear.
  • telomere position effect TPE
  • TPE telomere position effect
  • Patent Document 1 WO 2004 03 03 38 No. 5 pamphlet
  • Patent Document 2 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2006-94849
  • Non-patent literature 1 Katoh et al., Biochera Biophys Res Commun; 321: 280-290, 2004
  • Non-patent literature 2 Kakeda et al., Gene Therapy; 12: 852-856, 2005
  • Non-patent literature 3 Bartholomew A et al., Hum Gene Ther; 12: 1527-1541, 2001
  • Non-patent literature 4 Smogorzewska A et al., Anuu. Rev. Biochem., 73, ⁇ 177-208, 2004
  • Non-Patent Document 5 Tomizuka et al., Nature Genet. (USA), Vol. 16, p. 133-143, 1997
  • Non-Patent Document 6 Tomizuka et al., PNAS (USA), Vol. 97, p. 722-727, 2000
  • Non-Patent Document 7 Kuroiwa et al., Nature Biotech. (USA), Vol. 18, p. 1086-1090, 2000
  • Non-Patent Document 8 Kuroiwa et al., Nature Biotech. (USA), VIII, p. 889-894, 2002
  • Non-Patent Document 9 Mil ls et al., Hura. Mol. Genet. (UK), Vol. 8, p. 751-761, 1999 Non-Patent Document 1 0 Smogorzewska A et al., Anuu. Rev. Biochem., Vol. 73, p. 177-208, 2004
  • Non-Patent Document 1 Ning Y et al., Hura Mol Genet., 12th, p. 1329-1336, 2003
  • Non-patent Document 1 2 Crisrofari C et al., EMB0 J, 25th, p. 565-574, 2006
  • Non-Patent Document 1 3 Smogorzewska A et al., Anuu. Rev. Biochem., 73, p. 177-208, 2004
  • Non-Patent Document 1 4 Counter CM et al., EMB0 J, Vol. 11, p. 1921- 1929, 1992
  • Non-Patent Document 1 5 Mefford HC et al., Nat Rev Genet., Vol. 3, p. 91-102, 2002
  • Non-patent literature 1 6 Riethraan H et al., Chromosome Res., Vol. 13, p. 505-515, 2005
  • Non-patent literature 1 7 Linardopoulou EV et al., Nature, Vol. 437, p. 94-100, 2005
  • Non-patent Reference 1 8 Riethman H et al., Genome Res., 14th, p. 18-28, 2004
  • Non-patent literature 1 9 Tham WH et al., Oncogene, 21st, p. 512-521, 2002
  • Non-Patent Document 2 3 Otsuki et al., Biochem Biophys Res Commun; 329: 1018-1025, 2005 Disclosure of Invention
  • the present invention relates to a human artificial chromosome (HA) that is stably retained in a cell and capable of highly expressing a foreign gene. c) To provide vectors and methods for their production. Another object of the present invention is to provide a human cell drug useful for gene therapy and regenerative medicine and a method for producing the same. A further object of the present invention is to provide a method for producing a therapeutic protein.
  • HA human artificial chromosome
  • the present inventors have focused on the telomeric sequence and the subunit sequence existing in the human chromosome, and the human artificial artificial segment containing the telomeric sequence and the subunit sequence at the end of the artificial chromosome. An attempt was made to construct a chromosome vector.
  • hEPO human erythropoietin
  • the HAC vector 1 achieved an approximately 4-fold increase in hEPO expression in normal human fibroblasts compared to the case where only the telomere sequence was present at the long arm deletion end.
  • the basic chromosomal and exogenous gene (hE PO) introduction positions are the same in addition to the subtelomeric sequence at the deleted end of the long arm in the structure. It was thought to have been caused by modifying human chromosome 14 to have the deleted long arm end.
  • the presence of the subtelomeric sequence in the human artificial chromosome vector not only increases the expression of foreign genes or DNA, but also stabilizes the vector in transduced cells and improves the offspring transmission rate. Has also been found to have a positive effect. Such an effect was observed not only in the human chromosome 14 artificial chromosome vector but also in the human artificial chromosome (HAC) vector similarly produced from human chromosome 21.
  • HAC human artificial chromosome
  • the present inventor has conducted earnest research with the object of constructing a chromosome vector that highly expresses a transgene and is stably maintained in normal human cells or human cell lines. .
  • multiple gene expression units may interfere with each other and attenuate the expression of units located downstream in the transcription direction (Proudfoot NJ et al., Nature, 332) , P. 562-565, 1986, Kadesch T et al., Mol Cell Biol, Vol. 6, ⁇ 2593-2601, 1986).
  • a C vector (W 02994/03 1 385) has a neo resistance gene expression unit adjacent to the downstream of the hE PO gene expression unit. Therefore, as a method for improving hEPO gene expression, it is conceivable to remove the neo-resistant gene expression unit adjacent to the downstream of the hEPO gene expression unit from the HAC vector. That is, a modified chromosome obtained by deleting most of the known genes from the long arm of the human chromosome is obtained, and the 1 o XP sequence, the FRT sequence, and the hCMV promoter are site-specifically located near the long arm on this modified chromosome.
  • the hEPO gene is introduced into the modified chromosome as a foreign gene using the Cre / 1 o XP system, and the neo resistance gene expression unit is removed using the FLP e / FRT system. Furthermore, when transferred into normal human primary cultured fibroblasts carrying the modified chromosomes introduced with hEPO, for example, in the case of the 14 HAC vector of the present invention, an average of 18.5 compared to the conventional 21 HAC vector. A 2-fold improvement in hEPO expression was confirmed (Fig. 2 1). From these findings, the present inventors have found that the above-mentioned object (or problem) can be achieved by a HAC vector from which a resistance gene expression unit has been deleted, and have completed the present invention.
  • the present invention is a human chromosome fragment from which the distal long arm and / or the distal short arm is deleted, comprising a centromere derived from the human chromosome, the deleted long arm and A human chromosome fragment comprising a telomeric sequence and a Z or subtelomeric sequence (preferably a subtelomeric sequence derived from a human chromosome) added or bound to the distal end of the short arm.
  • a human chromosome fragment from which the distal long arm and / or the distal short arm is deleted, comprising a centromere derived from the human chromosome, the deleted long arm and A human chromosome fragment comprising a telomeric sequence and a Z or subtelomeric sequence (preferably a subtelomeric sequence derived from a human chromosome) added or bound to the distal end of the short arm.
  • the present invention is a human chromosome fragment in which the distal long arm and / or the distal short arm are deleted, comprising: (i,) a centromere derived from human 14 chromosome, (ii) A human artificial chromosome (HAC) vector characterized by comprising a human chromosome 14 fragment containing a telomeric sequence and (iii) a subtelomeric sequence is provided.
  • HAC human artificial chromosome
  • the present invention also provides, in another embodiment, a human chromosome fragment from which the distal long arm and / or the distal short arm are deleted, comprising: (i) a centromere derived from human 21st chromosome, (ii) There is provided a human artificial chromosome (HAC) vector characterized by comprising a telomeric sequence and (iii) a human chromosome 21 fragment containing a subtelomeric sequence.
  • HAC human artificial chromosome
  • the HAC vector according to the present invention does not contain a naturally occurring human chromosome fragment or a naturally occurring human chromosome fragment, but it has the above characteristics and is artificially generated. When isolated, it is intended to be encompassed by the present invention.
  • the HAC vector may include (iV) a foreign DNA (or foreign gene or nucleic acid) inserted into a specific site.
  • the size of the human chromosome fragment is usually about 1 Mb or more, such as about 1 Mb or more and about 19 Mb or less, preferably about 18 Mb or less, More preferably, it is about 17 Mb or less.
  • this size is not particularly limited to the above range, and the type of human chromosome, the long arm proximal that remains in the chromosome fragment after removing the long arm distal or short arm distal from the human chromosome Or the length of the short arm proximal or short arm.
  • the human chromosome fragment has a long arm distal end of the human chromosome deleted and includes a strong long arm proximal and short arm, or a human chromosome short arm far.
  • the position is deleted and the proximal short arm is included, or the distal long arm and distal short arm of the human chromosome are both deleted and the proximal long arm and proximal short arm are included. Can do.
  • the long arm distal and / or short arm distal of the human chromosome fragment is the base sequence of the target cleavage region, for example, the online genome sequence of the US National Center for Biotechnology information (NCBI). Designing the target ⁇ S ⁇ ⁇ (one targeting vector) using the salt omeselfi lj of Human Genome Resources, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/) It can be used to disconnect and delete.
  • the distal long arm of the human chromosome fragment is deleted within the q 11 region or the q 11 region from the human chromosome long arm.
  • the distal short arm of a human chromosome fragment is a human chromosome short. It is deleted in the p 1 1 region of the arm or in the p 1 2 region from the p 1 1 region.
  • the distal long arm of human chromosome 14 is deleted, for example, in the 14 q region, preferably in the 14 q 11 region, more preferably in AL 39 156 or from AL 3 9 1 1 56 At a proximal position, specifically, between AL 39 1 1 56 and CR 38 36 5 9, more preferably between AL 5 1 2 3 1 0 and CR 38 36 5 9, Preferably between AL 92 960 1 and CR 3836 5 9, more preferably between AL 5 89 1 82 and CR 38 36 59, more preferably between AL 58 9 74 3 and CR 38.
  • distal short arm of human chromosome 14 is deleted, for example, in the 14 p region, preferably deleted from the 14 p 11 region to the 14 p 12 region, more preferably 14 p 1 1. 1 region to 1 4 pl l. Deleted within 2 region, more preferably 1
  • the distal long arm of human 21 is located within the 2 1 q region, preferably within the 2 1 qll region, more preferably from the 2 1 q 1 1. 1 region to 2 1 ql l.
  • the deletion position is, for example, closer to NT—0 1 1 5 1 2 of 2 1 q 1 1.1, preferably closer to AL 1 6 202 in the region containing NT—0 1 1 5 1 2 More preferably proximal to AP 00 1 6 5 7 or AP 00 1 6 5 7 in the AL 1 6 202 containing region.
  • the distal short arm of human chromosome 21 is deleted, for example, in the 2 1 p region, preferably deleted from the 2 1 pll .1 region to the 2 1 pl l. 2 region, and more preferably Or 2 lp 1 1. 1 is deleted in the area, more preferably at the position of AL 1 63 20 1.
  • the telomere sequence is a base sequence having a repetitive sequence such as TTAGGG. Examples of this sequence include artificially synthesized sequences and those derived from the long or short arms of mammals including humans, but are not particularly limited.
  • the telomeric sequence is preferably a telomeric sequence derived from a human chromosome, and more preferably derived from the same chromosome as the subtelomeric sequence.
  • the length of the telomeric sequence is about 0.4 to 50 kb, preferably about 0.4 to 25 kb, more preferably about 0.4 to 15 kb. It is.
  • the subtelomeric sequence is a subtelomer sequence derived from the long or short arm of a human chromosome, and is derived from any human chromosome, for example, human chromosome 14 or human 21 chromosome 1 'body. It is a subtelomeric sequence derived from.
  • the human chromosome fragment is derived from the long arm of the human chromosome at the site where the distal long arm is deleted from the human chromosome, the same as or different from the human chromosome, preferably the same. Of subtelomeric sequences.
  • the length of the subtelomeric sequence is about 1 to 500 kb, preferably about 1 to 300 kb, more preferably about 1 to 100 kb, More preferably, it is about 5-60 kb, More preferably, it is 5-40 kb, More preferably, it is about 25-60 kb, More preferably, it is about 25-40 kb.
  • human 14 or 21 chromosome fragment is a telomeric sequence derived from the long arm of human chromosome 14 or 21 in the long arm distal site deleted as described above, respectively. And a subtelomeric sequence.
  • the subtelomeric sequence from human chromosome 14 is a sequence from a site within the 14q32 region of human chromosome 14 to the 14q-te1 region.
  • it is a sequence from the 14 q 32.33 region of human chromosome 14 to the 14 q-te 1 region, more preferably AB 0 1 94 3 9 and AB 0 1 943 8 of human chromosome 14.
  • AB 0 1 9437 to the 14 q-te 1 region particularly preferably the sequence from AB 0 1 943 7 to 14 q_te 1 region of human chromosome 14.
  • the subtelomere sequence and the telomeric sequence derived from human 21 chromosome 1 are the telomeric ends within 2 1 q 2 2.3 region to 2 1 qte 1 region of human 21 chromosome 1. Sequence and telomeric sequence.
  • the subtelomeric sequence is preferably a sequence from any site in the 2 1 qte 1 region of human chromosome 21 to the telomeric end, more preferably NT_0 1 1 in the 2 1 q-te 1 region. 5 1 Sequence from 5 to telomere end.
  • the human artificial chromosome vector according to the present invention may further comprise a recognition site for at least one site-specific recombinase in the human chromosome fragment. For example, recognition of site-specific recombinase in the long arm and / or short arm of human chromosome fragment The site is inserted.
  • the recognition site for the site-specific recombinase is inserted closer to the centromere (ie, “proximal”) than the deletion site (or deletion position) of the long or short arm of the human chromosome.
  • the recognition site for the site-specific recombinase is within the 14 q region, preferably within the 14 q 1 1 region proximal to the long arm of human chromosome 14. More preferably, between AL 3 9 1 1 56 and CR 38 3659, more preferably between AL 5 1 23 1 0 and CR 3836 5 9, more preferably AL 9 296 0 1 proximal to the deletion position.
  • the recognition site for the site-specific recombinase is located in the short arm of human chromosome 14, for example in the 14p region, more preferably proximal to the short arm of human chromosome 14. 1.
  • the site-specific recombinase recognition site is preferably 2 1 q 1 1. in the 21 q region, preferably proximal to the long arm of human 21 chromosome. From region 1 to 2 1 q 1 1. 2 proximal to the deletion position in region 2, eg, 2 — 1 1 1 5 1 2 region, preferably NT — 0 1 1 5 1 2 Within the AL 1 6 202 region of the containing region, more preferably AP 00 1 6 within the AL 1 6 202 containing region
  • the recognition site for the site-specific recombinase is located on the short arm of human 2 chromosome 1, for example within the 2 1 p region, preferably from 2 1 p 1 1.1 region 2 1 p 1 1.
  • the site-specific recombinase is a Cre enzyme and the recognition site for the site-specific recombinase is a 1 oxP sequence.
  • the site-specific recombinase is the FLP e enzyme, and the site-specific recombinase recognition site is FRT. Is an array.
  • a human artificial chromosome vector comprises a human chromosome fragment containing at least two types of site-specific recombinase recognition sites, for example, At least two types of site-specific recombination enzyme recognition sites are inserted into the long and proximal short arms of the human chromosome.
  • site-specific recombination enzyme recognition sites are used for introduction of foreign genes, and another type of site-specific recombination enzyme / recognition site is no longer required.
  • the plurality of site-specific recombination enzyme recognition sites are inserted on the centromeric side (proximal) with respect to the deletion site of the long or short arm of the human chromosome, as described above.
  • the recognition site of the site-specific recombinase is the same as described above, that is, in the 14 q region, preferably 1 located in the vicinity of the long arm of human chromosome 14.
  • the recognition site for the site-specific recombinase is located in the short arm of human chromosome 14, for example within the 14p region, more preferably proximal to the short arm of human chromosome 14. 14 p 1 1 region to 14 p 1 2 region, and more preferably, inserted into the 14 p 1 1 region proximal to the short arm of human chromosome 14 proximal to the deleted position.
  • the recognition site for the site-specific recombinase is preferably 2 1 q 1 1 in the 2 1 q region, preferably proximal to the long arm of human 21 chromosome. From region 1 to 2 1 q 1 1. Proximal to the deletion position in region 2, eg, 2 1 q 1 1. 1 in NT— 0 1 1 5 1 2 region, preferably NT— 0 1 1 5 1 2 Within the region containing AL 1 6 202, more preferably AP 00 1 6 within the region containing AL 1 6 20 2
  • the recognition site of the site-specific recombinase is located on the short arm of human 21 chromosome 1, for example within the 2 1 p region, preferably the 2 1 p 1 1.1 region. To 2 1 p 1 1. In region 2, more preferably in human 2 chromosome 1 near the short arm 2 lp 1 1.1 region, more preferably at a position closer to AL 1 6 320 1 than the deleted position Is done.
  • the site-specific recombinant enzyme is a Cre enzyme and a Z or FLPE enzyme
  • the site-specific recombinant enzyme recognition site is a 1 o XP sequence and / or an FRT sequence.
  • the present invention provides a cell carrying the human artificial chromosome (HAC) vector.
  • HAC human artificial chromosome
  • Such cells include mammalian cells, preferably human cells (eg embryonic and somatic stem cells, somatic cells, normal somatic cells, epithelial cells, neuronal cells, fibroblasts, benign or malignant tumor cells, endothelial cells, Dermal cells, basal cells, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, stromal cells, bone marrow cells, blood cells, fat cells, bone cells, chondrocytes, hair cells, liver cells, pancreatic cells, kidney cells, amniotic cells, visual cells, Auditory cells, olfactory cells), Chinese hamster ovary (CHO) cells, 3T3 cells, BHK cells, 293 cells, A9 cells, etc. can be used. '
  • the present invention in its third aspect, provides a method for producing a human artificial chromosome (HAC) vector comprising the following steps:
  • step (d) A step of adding a subtelomer sequence to the part of the long arm and / or short arm to be deleted.
  • telomeric sequence and the subtelomeric sequence are made as one sequence, add the above sequence to the ⁇ position of the deleted long arm and / or short arm using step (c) and step (d) as one step. can do.
  • a cell having high homologous recombination efficiency is used as a cell holding the human chromosome or human chromosome fragment.
  • the cells with high homologous recombination efficiency are derived from chicken DT40 cells.
  • deletion of the distal long arm and / or the distal short arm of the human chromosome or human chromosome fragment is performed using a site-specific recombinant enzyme. I can. For example, using site-specific recombinase, human chromosome or human chromosome The distal long arm and / or distal short arm of the fragment can be deleted by substitution with telomeric and / or subtelomeric sequences.
  • the long arm distance of human chromosome 14 or human chromosome 14 fragment is deleted in the 14 q region, preferably the 14 q 1 1 region to the 14 q 12 region, and the short arm Distal is removed in the 14 p 1 2 region.
  • the long arm distal end of human chromosome 14 or human chromosome 14 fragment is located at a position closer to AL 3 9 1 1 56 or AL 39 1 1 5 6 Specifically, between AL 3 9 1 1 56 and CR 3 836 5 9, more preferably between AL 5 1 23 1 0 and CR 38 36 5 9, more preferably AL 9 2960 1 to CR 3 Between 8365 9, more preferably between AL 58 9 1 82 and CR 38 36 59, more preferably between AL 58 9 743 and CR 3836 5 9, more preferably between AL 929602 and CR 38 36 5 9 More preferably between AL 5 1 26 24 and CR 38 36 5 9, more preferably between CR 3836 5 7 and CR 3836 59, more preferably between CR 38 3 6 59 and CR 3 8365 9 Delete between.
  • the short arm distance of human chromosome 14 is deleted, for example, in the 14p region, preferably deleted from the 14p11 region to the 14p12 region, more preferably 14p1 1. Delete from 1 region to 14 pll. 2 region, more preferably 14 p 1 1.1 Delete within region, more preferably any one selected from the group consisting of RNR 2 and PAB PCP 2 Or delete at position 1.
  • the long arm distal end of human 2 chromosome 1 or human 2 chromosome 1 fragment is 2 1 q region, preferably 2 1 q 1 1.1 region to 2 1 q 1 1.2 region And the short arm distal is removed from the 2 1 pll .1 region to the 2 1 qll .2 region ⁇ .
  • the distal long arm of human 2 chromosome 1 or human 2 fragment is within the region containing, for example, 2 1 qll.
  • NT— 0 1 1 5 1 preferably NT— 0 1 1 5 Delete within the region containing AL 1 6 2 02 in the region containing 1 2, more preferably at AP 00 1 6 5 7 in the region containing AL 1 6 202 or proximal to AP 00 1 6 5 7 .
  • the distal short arm of human chromosome 1 is moved, for example, in the 2 1 p region, preferably in the 2 1 p 1 1.1 region to the 2 1 p 1 1.2 region, more preferably 2 1 p 1 1. Delete within the region, more preferably at the position AL 1 6 3 20 1.
  • deletion of the distal long arm and the distal Z or distal short arm of the human chromosome or human chromosome fragment is replaced with a telomeric sequence.
  • the telomere sequence can be added to the human chromosomal fragment by deletion.
  • deletion of the distal long arm and the distal distal arm of the human chromosome or human chromosome fragment is carried out by deleting the telomeric sequence and the subtelomere derived from the human chromosome.
  • the telomeric sequence and the subtelomeric sequence can be added to the human chromosome fragment by deleting by substitution with the sequence.
  • the subtelomeric sequences derived from the human chromosome are not limited to human chromosomes, but are preferably derived from human chromosomes 14 and 21, for example.
  • steps (b) and (c) at least two sites in the long arm and / or the short arm of the human chromosome or human chromosome fragment are cut by cutting the long chromosome.
  • the distal arm and / or distal short arm can be deleted, and telomere sequences can be added to the deleted long arm and Z or short arm sites.
  • steps (b) to (d) by cutting at least two locations on the long chromosome distal and Z or distal short arm of the human chromosome or human chromosome fragment,
  • the long arm distal and Z or distal short arm are deleted, and the telomer and subtelomer sequences derived from the human chromosome or human chromosome fragment are added to the deleted long arm and Z or short arm sites.
  • the telomeric sequence and the subtelomeric sequence are sequences from a site within the 14 q 3 2 region of human chromosome 14 to the 14 q_te 1 region. More preferably, it is a sequence from the 14 q 3 2.3 3 region to the 14 q-te 1 region of human chromosome 14.
  • the subtelomeric and telomeric sequences derived from human 21 chromosome 1 are within the 2 1 q 2 2.3 region to 2 1 q -te 1 region of human 21 chromosome 1.
  • the subtelomeric sequence is preferably a sequence from any site in the 2 1 q-te 1 region of human chromosome 1 to the telomeric end, more preferably NT-0 in the 2 1 q -te 1 region. 1 1 5 1 5 to the end of the telomere.
  • a site-specific recombination system such as the Cre-1O XP system or the FLP e-FRT system.
  • the long arm distal end in the long arm q 11 region or q 11 -q 12 region of the human chromosome or human chromosome fragment In the deleted long arm, the telomeric sequence and subtelomeric sequence of the human chromosome or human chromosome fragment, for example, in the case of human chromosome 14, for example 14 from the site in the 14 q 3 2 region. Telomere sequence and subtelomeric sequence up to q-te 1 region, and in the case of human 21 chromosome, for example, telomer sequence and subtegome sequence from 2 1 q 22.3 region to 2 1 q-te 1 region Appends an array. .
  • Deletion of the distal long arm of the human chromosome or human chromosome fragment can be achieved by, for example, inserting site-specific recombination enzyme recognition sites at the distal and proximal long arms, and then performing site-specific recombination. This is done by deleting between recognition sites.
  • the recognition site for the site-specific recombinase is the long arm distal to the 14 q 3 2 region distal to the long arm of human chromosome 14 or human chromosome 14 fragment. Inserted proximal to the proximal 14 4 q 1 1 region, more preferably distal to the long arm AB 0 1 943 7 and proximal to the long arm proximal AL 3 9 1 1 56 Is done.
  • the recognition site for the site-specific recombinase is from the 21q22 region distal to the long arm of human 21 chromosome or human 21 chromosome fragment.
  • Distal and proximal to the 2 1 q 1 1 region proximal to the long arm more preferably distal to the long arm distal 2 1 q 2 .3, eg, NT— 0 1 1 5 1 5 And proximal to the long arm proximal 2 1 qll. 2, for example distal to NT— 0 1 1 5 1 2, preferably distal to AL 1 6 202, for example NT— 0 1 1 5 1 5, more preferably AP 00 1 6 5 7, or distal to AP 00 1 6 5 7, respectively.
  • the site-specific recombinase is a Cre enzyme and the recognition site for the site-specific recombinase is a 1 o XP sequence.
  • the site-specific recombinase is the FLPe enzyme and the recognition site for the site-specific recombinase is the FRT sequence.
  • the deletion of the distal end of the short arm of the human chromosome or human chromosome fragment may be performed by, for example, inserting a recognition site for a site-specific recombinase at the distal and proximal positions of the short arm, and by site-specific recombination. This is done by deleting between the two recognition sites.
  • the recognition site for the site-specific recombinase is the distal short arm of the human chromosome or human chromosome fragment, eg, distal to the short arm p region, preferably within the p 11 region.
  • the recognition site of the distal part of the short arm is, for example, more distal than in the 14 p region, preferably from 14 p 1 1 region to more distal than in the 14 p 1 2 region, more preferably from the 14 p 1 1 region ⁇ Distal, and short arm proximal 14 p 1 1 region to 14 p 1 2 region more proximal, preferably 1 4 p 1 1 region more proximal, more preferably 1 4 p 1 1. 1 region to 14 pll. 2 region, more proximal, more preferably 14 p 1 1.
  • the recognition site of the site-specific recombinase is distal to, for example, the 21 p region of the short arm of human 21 chromosome. Preferably from 2 1 p 1 1.1 region to 2 1 pll.
  • the site-specific recombinase is a Cre enzyme and the recognition site for the site-specific recombinase is a 1 o XP sequence.
  • the site-specific recombinase is the FLPe enzyme and the recognition site for the site-specific recombinase is the FRT sequence.
  • the method for producing an HAC vector according to the present invention comprises the steps of: (e) inserting a recognition site for at least one site-specific recombinase into a human chromosome or human chromosome fragment. May be included.
  • the site-specific recombinase in step (e), is a Cre enzyme, and the recognition site for the site-specific recombinase is a 1 o XP sequence.
  • the site-specific recombinase in step (e), is FLPe enzyme.
  • the site-specific recombinase recognition site is an FRT sequence.
  • the recognition site for the site-specific recombinase is, for example, the deleted position in AL 39 1 1 56 of human chromosome 14 or human chromosome 4 fragment or closer to AL 3 9 1 1 56. More preferably, it can be inserted at a position proximal to the deletion position in the 14 p 12 region region proximal to the short arm of human chromosome 14 or human chromosome 14 fragment.
  • the recognition site of the site-specific recombination enzyme is, for example, in the 14 q region ⁇ , preferably in the 14 q 11 region of the human 14th chromosome or 14th segment of the human chromosome 14 proximal to the long arm. Proximal to the removal position, more preferably AL 3 9 1 1 56, more preferably AL
  • the recognition site of the site-specific recombinase is, for example, the deletion position or A P 00 1 in A P 00 1 6 5 7 of human 21 chromosome or human chromosome 1 fragment.
  • the present invention in its fourth aspect, provides a human artificial chromosome (HAC) vector obtained by the above production method.
  • HAC human artificial chromosome
  • the present invention further provides, in a fifth aspect thereof, a method for producing a human artificial chromosome vector containing foreign DNA, which comprises the following steps:
  • the foreign DN includes the following steps:
  • a method for producing a human artificial chromosome vector containing A is provided:
  • step (f) A step of removing a drug resistance gene on the human chromosome or human chromosome fragment in the presence of a different type of site-specific recombinase from that used in step (e).
  • the human chromosomes are human chromosome 14 and human 21 chromosome.
  • the at least two site-specific recombinases and their recognition sites are the Cre enzyme and 1 o XP sequence, and the FLPE enzyme and FRET sequence.
  • the drug resistance gene is a neomycin resistance gene.
  • the insertion position of the foreign DNA that is, the insertion position of the site-specific recombinase is the same as the insertion position of the aforementioned site-specific recombinase.
  • proximal to long arm proximal 2 1 q 1 1.2, preferably proximal to 2 1 q 1 1.1, more preferably closer to AL 1 6 202
  • the deletion position of AP 00 1 6 5 7 (GenB ank registration number) proximal to the long arm, or proximal to the deletion position of AP 00 1 6 5 7 or human 2
  • the proximal position of the deletion position in the 2 1 pll. 2 region near the short arm is mentioned, but it is not particularly limited to this position.
  • the insertion position of exogenous DNA is about 1 to 500 kb, preferably about 1 to 300 kb, more preferably about 1 to 500 kb from the telomeric sequence at the end of the human chromosome fragment. 100 kb, more preferably about 5 to 60 kb, more preferably 5 to 40 kb, still more preferably about 25 to 60 kb, and even more preferably about 25 to 40 kb. kb.
  • the present invention includes a foreign DNA obtained by the above production method.
  • This is a human artificial chromosome vector.
  • the present invention provides a cell that retains a human artificial chromosome vector containing foreign DNA.
  • Such cells include mammalian cells, preferably human cells (eg embryonic and somatic stem cells, somatic cells, normal somatic cells, epithelial cells, neuronal cells, fibroblasts, benign or malignant tumor cells, endothelial cells).
  • Dermal cells basal cells, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, stromal cells, bone marrow cells, blood cells, fat cells, bone cells, chondrocytes, hair cells, liver cells, pancreatic cells, kidney cells, amniotic cells, Visual cells, auditory cells, olfactory cells), Chinese hamster ovary (CHO) cells, 3 T 3 cells, BHK cells, 293 cells, A 9 cells, etc. can be used.
  • CHO Chinese hamster ovary
  • exogenous DN A is not limited to the following, for example, erythropoietin (EPO), thrombopoietin (TPO), blood coagulation factor, von Willebrand factor (vWF), dystrophin, dopamine synthesis Enzyme, insulin, insulin-like growth factor (IGF), insulin-like growth factor binding protein (IGFBP), antibody, telomerase, granulocyte colony stimulating factor, granulocyte 'macrophage colony stimulating factor, immunity Globulin, growth hormone, interleukin 2, interleukin 3, interleukin 4, interleukin 5, interleukin 6, interleukin 7, interleukin 8, interleukin 9, interleukin 10, interleukin '1 1, Interloykin 1 2, Interleukin 1 5, CD 40 Regan , Interferon, aden
  • BMP List genes that code for (BMP), activin, transforming growth factor (TGF), wint (Wnt), earspondin (R spondin), monoclonal antibodies, oligoclonal antibodies, and polyclonal antibodies. Can do.
  • the present invention also provides, in its tenth embodiment, a method for introducing foreign DNA into a recipient cell, comprising the following steps:
  • the recipient cell is an animal cell, preferably a mammalian cell.
  • the recipient cells may be multipotent cells such as embryonic stem cells (ES cells), stromal stem cells and tissue stem / progenitor cells.
  • the present invention in its first aspect, provides a method for producing a cell expressing foreign DNA, comprising the following steps:
  • the recipient cell is an animal cell, preferably a mammalian cell. It is.
  • the recipient cells may be pluripotent cells such as embryonic stem cells (ES cells), stromal stem cells and tissue stem Z precursor cells.
  • the present invention still further provides, in the first and second embodiments, a method for producing a protein, comprising the following steps:
  • the protein includes, for example, erythroboyetin (EPO), thrombopoietin (TPO), blood coagulation factor, eighth factor, ninth factor, von Willebrand factor (vWF), Dystrophin, donomin synthase, insulin, insulin-like growth factor (IGF), insulin-like growth factor binding protein (IGF BP), antibody, telomerase, granulocyte colony stimulating factor, granulocyte .macrophage colony stimulating factor, immunoglobulin , Growth hormone, interleukin 2, interleukin 3, interleukin 4, interleukin 5, interleukin 6, interleukin 7, interleukin 8, interleukin 9, interleukin 10, inter ⁇ dikin 1 1, Interleukin 1 2, Interleukin 1 5 , CD40 ligand, interferon, adenosine deaminase, ⁇ -1 antitrypsin, ornithine transcarbamylase, purine nucleotide
  • EPO erythro
  • human artificial chromosome vector or “HAC vector” refers to an artificial chromosome prepared based on a human chromosome.
  • human chromosome refers to a complex of natural DNA and protein derived from human cells. There are 23 normal human chromosomes (24 males) (ie, autosomes 1 to 22 and sex chromosomes X and Y) 46, each about It is known to contain DN A with a length of 50-300 Mb. “Hitochromosome fragment” refers to a partial fragment of a chromosome that can be stably replicated and distributed as an independent chromosome, and the size of the fragment is usually 1 Mb or more, but it may be less.
  • long arm and short arm with respect to the chromosome refer to the arms (arms) on both sides of the centromere on the chromosome, and the long arm (q) and short arm (p) depending on the length. It is called.
  • distal long arm and proximal long arm refer to a region on the long arm far from the centromere (ie, the telomere side) and a region close to the centromere (near Means).
  • the long arm distal is the telomeric side than AL 3 5 9 2 1 8 and the long arm proximal is the centromeric side than AL 3 9 1 1 56
  • the long arm distal is telomeric than 2 1 q 22.2
  • the long arm proximal is 2 1 q 1 1.2.
  • “short arm distal” and “short arm proximal” mean a region on the short arm far from the centromere (distal) and a region close to the centromere (proximal).
  • Chromosome 4 is Sakai Sakaika s at Riboso one circle RNA region.
  • site-specific recombinase and “recognition site of site-specific recombinase” refer to a specific recognition site when an enzyme recognizes a specific recognition site. It is a term used for a phenomenon that causes recombination, and refers to an enzyme that causes recombination specifically for the site and a site recognized by the enzyme.
  • telomer sequence j refers to a sequence having a repetitive sequence of TTAG GG (TTAGGG) n.
  • the length of the telomere sequence is about 0.4 to 50 kb, preferably about 0. 4 to 25 kb, more preferably about 0.4 to 15 kb.
  • the telomeric sequence may be chemically synthesized or artificially generated, or may be derived from a chromosome.
  • the “subtelomer sequence” is located adjacent to the centromeric side of a repetitive sequence of telomeres (TTA GGG) n at the end of a chromosome in a eukaryotic cell, and is a segment / duplicate domain or (T TAGGG) n-like It refers to a chromosomal region spanning about 300-500 kb with a repeat sequence of.
  • the subtelomeric sequence may be the whole or a part of the subtelomeric sequence derived from an arbitrary chromosome, or may be a combination of multiple subtelomeric sequences derived from an arbitrary chromosome, or a subtelomeric sequence derived from an arbitrary chromosome. Other sequences may be added to the main sequence. In the present invention, for example, a telomere sequence or a subtelomeric sequence can be added by telomere truncation using site-specific recombination.
  • foreign DNA refers to DNA introduced from the outside to the target cell, and genes and other genes that are desired to be expressed for substance production, disease treatment, functional modification or functional analysis, etc.
  • DNA encoding the functional sequence eg, promoter sequence, etc., and may be the same or different.
  • cell refers to a cell derived from an organism or tissue.
  • somatic cells normal somatic cells, germ cells, somatic stem cells, tumor cells, immortalized cell lines, embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells), embryonic tumor cells (EC cells), It means a sperm-derived stem cell (GS cell) and the like, which may be the same or different, and may be the above-mentioned cell (human cell) derived from human.
  • donor cell and “receptor cell” refer to a cell (donor cell) that first holds the human artificial chromosome vector when transferred or introduced, and This refers to the cell (receptor cell) into which the cell is transferred.
  • FIG. 1 shows an overview of the construction of a HAC vector derived from human chromosome 14.
  • “14A” is the HAC vector with the long arm distal of chromosome 14 deleted and telomere sequence added
  • “14N” is the long arm distal of chromosome 14 deleted.
  • “14 g N” is the long arm distal end of human 14 chromosome deleted, and the telomeric sequence and This represents an overview of a HAC vector containing about 60 Kb of subtelomeric sequence derived from human chromosome 14.
  • tel indicates the telomere side
  • cen indicates the centromere side
  • Puro represents the puromycin gene
  • Te1 sequence represents the telomeric sequence
  • black arrow in the sequence represents the repeat sequence.
  • FIG. 3 shows the results of PCR analysis of pTE L p u ro -t 1 vector introduction into human chromosome 14 q.
  • FIG. 4 shows alleles generated by introduction of the pTE L puro-t1 vector into human chromosome 14q.
  • FIG. 5 shows the results of Southern analysis of DT40 hybrid cells introduced with pTEL puro-t1 vector into human chromosome 14q.
  • FIG. 6 shows the results of FI SH analysis of DT40 hybrid cells introduced with pTE L puro-t1 vector into human chromosome 14q.
  • FIG. 7 shows the structure of the t 1 p SF 1 vector with ⁇ and 3 ′ neo sequences.
  • O ri represents the replication origin
  • a pr represents the ampicillin resistance gene
  • SV 40 p A represents SV 40.
  • poly A
  • FIG. 8 shows the results of PCR analysis for introducing a t 1 p SF 1 vector into 14 A ⁇ q HAC.
  • FIG. 9 shows the alleles resulting from the introduction of the t 1 p SF 1 vector into 14 ⁇ qHAC.
  • FIG. 10 shows the results of a Southern analysis of DT40 hybrid cells into which t 1 p SF 1 vector has been introduced into 14AA q HAC.
  • Figure 11 shows the results of Southern analysis of CHO hybrid cells transfected with 14 ⁇ q HAC vector.
  • Figure 12 shows the results of FISH analysis of CHO hybrid cells transfected with 14 ⁇ q HAC vectors.
  • Figure 1 28 An ISH image is shown, and
  • FIG. 12B shows the karyotype of the 14 ⁇ qHAC vector.
  • Figure 13 shows unselected conditions for 14 A qHAC vectors (14 AAA qHAC, 14 N ⁇ qHAC (G), 14 gNA qHAC (g)), and 2 1 ⁇ q HA C vectors in CHO hybrid cells. The results of long-term stability analysis are shown below.
  • FIG. 14 shows the allele of 14 HAC vector generated by hEPO gene transfer.
  • hEPO represents the human erythropoietin gene and CMV represents the cytomegalovirus promoter.
  • Figure 15 shows h E PO gene transfer 14 ⁇ q HAC vector transfer CHO hybrid cell size The results of the analysis are shown.
  • FIG. 16 shows hEPO gene expression in hEPO-1 4AAqHAC vector-retaining CHO hybrid cells.
  • Fig. 17 shows the results of FISH analysis of C HO hybrid cells carrying hEPO-1 4 ⁇ q HA C vector.
  • Fig. 17A shows the FISH image
  • Fig. 17B shows the karyotype of the hE PO_ 14AA qHAC vector.
  • Fig. 18 shows the results of long-term expression / stability analysis of hEPO-1 14 ⁇ qHAC vector in CHO hybrid cells.
  • Figure 19 shows the results of Southern analysis of normal fibroblasts transfected with hEPO — 14 AZN / g ⁇ q HAC vector.
  • A hEPO—14 4 ⁇ qHAC
  • B hEPO—14N ⁇ qHAC
  • C hEPO—14 gN ⁇ qHAC.
  • FIG. 20 shows the results of analysis of h E PO—14 ⁇ q HAC vector-transfected human normal fibroblasts: FISH.
  • Fig. 20A shows the FISH image
  • Fig. 20B shows the karyotype of the hEPO-14A ⁇ qH AC vector.
  • FIG. 21 shows hEPO gene expression in normal fibroblast HF L-1 transfected with hEPO-1 4A / N / gN ⁇ qHAC vector.
  • FIG. 22 shows the structure of the human chromosome 14 long arm distal telomere side 1 o XP sequence insertion vector p 1 o X p PGK—14 q t e 1.
  • FIG. 23 shows the allele resulting from the introduction of the p 1 o X p P GK-1 4 q te 1 vector into human chromosome 14 q.
  • FIG. 24 shows the results of PCR analysis of ploxp PGK—14qtel vector introduction into human chromosome 14q.
  • FIG. 25 shows the results of Southern analysis of DT40 hybrid cells introduced with ploxpPGK-1 4qtel vector into human chromosome 14q.
  • FIG. 26 shows the structure of the human chromosome 14 long arm proximal centromere side 1 o XP sequence insertion vector p 1 o X PHYGORZn 1.
  • FIG. 27 shows an allele generated by introduction of the p 1 x PHYGOR / n 1 vector into human chromosome 14 q.
  • FIG. 28 shows the results of PCR analysis for introduction of the p 1 x PHYGOR / n 1 vector into human chromosome 14 q.
  • Figure 29 shows p 1 ox PHYGOR / n 1 and p 1 oxp PGK on human chromosome 14 q — 14 qte 1 vector introduction
  • Fig. 30 shows chromosome alleles (Fig. 30 A: G / n 1; Fig. 30 B: g / n 1) generated by human chromosome 14 q distal deletion by Cre-lox P site-specific recombination reaction. .
  • FIG. 31 shows the results of Southern analysis of 14 N ⁇ q HAC-retaining DT 40 hybrid cells.
  • FIG. 32 shows the results of FISH analysis of 14 ⁇ qHAC-retaining DT40 hybrid cells.
  • FIG. 32 A shows the F I S image in G 94 n 56 cells
  • FIG. 32 B shows the G 94 ⁇ 56 ⁇ 25 cells.
  • FIG. 33 shows the structure of the pS F l (G + n l) vector for l o x P and 3 ′ n e o sequence insertion.
  • Figure 34 shows the introduction of p SF 1 (G + nl) or G np SF 1— FRT vector (A) into 14 q ⁇ qHAC, and p SF l (g + nl) into 14 g N ⁇ q HAC.
  • gnp SF 1 Indicates an allele resulting from the introduction of an FRT vector (B).
  • FIG. 35 shows the results of Southern analysis of DT40 hybrid cells introduced with p.S F 1 (G + n 1) vector into 14 N ⁇ q HAC. '
  • FIG. 36 shows the results of Southern analysis of CHO hybrid cells transfected with 14 ⁇ q H AC vector.
  • Figure 37 shows the results of FISH analysis of CHO hybrid cells transfected with 14 N ⁇ q HAC vector.
  • Fig. 37A shows the FISH image
  • Fig. 37B shows the karyotype of the 14 ⁇ qHAC vector.
  • FIG. 38 shows the results of a Southern analysis of a 14E ⁇ qHAC vector-transferred CHO hybrid cell transfected with hEPO gene.
  • Fig. 39 shows the results of FISH analysis of CHO hybrid cells that retain 1 ⁇ ⁇ ⁇ _ 14 ⁇ q HA C vector.
  • Figure 39A shows the FI SH image
  • Figure 39B shows the karyotype of the hE PO-14AA qHAC vector.
  • FIG. 40 shows hEPO gene expression in a C H O hybrid cell retaining one hEPO-1 14 ⁇ q H A C vector.
  • Figure 41 shows the results of long-term expression and stability analysis of hEPO-14— ⁇ qHAC vector in CHO hybrid cells.
  • FIG. 42 shows the results of FISH analysis of normal fibroblasts transfected with hE PO-14NA qHAC vector.
  • FIG. 42A shows the F I SH image
  • FIG. 42B shows the karyotype of the h E PO—14 ⁇ qH AC vector.
  • FIG. 43 shows long-term hEPO gene expression in normal fibroblasts transfected with hEPO-1 4 ⁇ qHAC vector.
  • FIG. 44 shows the structure of vector 1 p XP X P GK—1 4 qte 1—2 vector for human 1 chromosome 4 long arm distal telomere side 1 o XP sequence insertion.
  • FIG. 45 shows the allele resulting from the introduction of ploxpPGK—14qtel-2 vector into human chromosome 14q.
  • FIG. 46 shows the results of PCR analysis of p 1 o X p PGK — 14 q te 1 — 2 vector introduction into human chromosome 14 q.
  • FIG. 47 shows the results of Southern analysis of DT40 hybrid cells transfected with ploxpPGK—14qtel_2 vectors into human chromosome 14q.
  • FIG. 48 shows the results of Southern analysis of DT 40 hybrid cells introduced with p 1 o x PHYGOR / n 1 and p 1 o x p P GK-1 4 q te 1-2 vectors into human chromosome 14 q.
  • FIG. 49 shows the results of Southern analysis of DT40 hybrid cells retaining 14 g ⁇ qHAC.
  • FIG. 50 shows the results of F I SH analysis of 14 gNA?
  • Figure 5 OA shows the FI SH image, and
  • Figure 508 shows the karyotype of the 14 g NA q HA C vector.
  • FIG. 51 shows the structure of the pSF1 (g + n1) vector for insertion of 1o XP and 3'neo sequences.
  • FIG. 52 shows the results of Southern analysis of pT F 1 (g + n 1) vector-introduced DT40 hybrid cells into 14 g ⁇ qHAC.
  • Figure 53 shows the results of Southern analysis of CHO hybrid cells transfected with 14 g NA q HAC vector.
  • FIG. 54 shows the results of FISH analysis of CHO hybrid cells transfected with 14 g NA q HAC vector.
  • Figure 54 A shows the FI SH image
  • Figure 54 B shows the karyotype of the 14 gNA qHAC vector o
  • FIG. 55 shows the results of Southern analysis of CHO hybrid cells transfected with hE PO gene introduced 14 g N ⁇ qHAC vector.
  • FIG. 56 shows the result of FISH analysis of hE PO-1 4 g NAqHAC vector-retained CHO hybrid cells.
  • FIG. 56A shows the F I SH image
  • FIG. 56B shows the karyotype of the hE PO—14 gNA qH AC vector. .
  • FIG. 57 shows hE P O gene expression in h E P 0 — 14 g N ⁇ q H A C vector-carrying C H O hybrid cells.
  • Fig. 58 shows the results of long-term expression and stability analysis of hE PO-1 4 g NA q H AC vector in CHO hybrid cells.
  • Figure 59 shows the results of FISH analysis of normal fibroblasts transfected with hE PO-1 4 g NA q HAC vector.
  • Fig. 59 A shows the FISH image
  • Fig. 59 B shows the karyotype of the hEPO-14gNAqHAC vector.
  • FIG. 61 shows the alcohol produced by introduction of the t 1 p SF 1-FRT vector into 14 ⁇ qHAC.
  • Figure 62 shows the results of Southern analysis of DT40 hybrid cells introduced with t1pSF1_FRT vector into 14 ⁇ qHAC.
  • Figure 63 shows the results of Southern analysis of C H O hybrid cells transferred with 14 ⁇ q F—HAC vector.
  • FIG. 64 shows the results of FISH analysis of CAA hybrid cells transferred with 14AAq F—HAC vector.
  • FIG. 65 shows the 14 ⁇ q F—HAC vector allele resulting from hE PO gene transfer. '
  • FIG. 66 shows the result of Southern analysis of C H O hybrid cells transfected with hEPO gene-transferred 14 A ⁇ qF—HAC vector.
  • FIG. 67 shows the result of F I SH analysis of C H O hybrid cells carrying hEPO — 14AAq F — H A C vector.
  • Figure 6 7 A shows the FI SH image
  • Figure 6 7 B shows the karyotype of the h E PO— 14AA q F — HAC vector.
  • Figure 68 shows alleles on the 14AA q F—HAC vector resulting from the removal of the neo resistant gene unit.
  • FIG. 69 shows the result of Southern analysis of C H O hybrid cells retaining one hE PO—14AAqAneo—HAC vector.
  • FIG. 70 shows the results of F I SH analysis of C H O hybrid cells carrying hE PO—14AAqAneo—HAC vector.
  • Fig. 70A shows the F I S H image
  • Fig. 70 B shows the karyotype of the h E PO— 14A ⁇ q ⁇ neo— H A C vector.
  • Figure 71 shows the results of Southern analysis of normal fibroblasts carrying hEPO — 14AAqAneo—HAC vector.
  • FIGS. 72A and B show the results of FI SH analysis of normal fibroblasts carrying hEPO—14AAqAneo—HAC vector.
  • FIG. 73 shows the structure of the vector 011 SF 1-FRT for introducing 11-sequence arrangement.
  • FIG. 74 shows the results of Southern analysis of DT 40 hybrid cells introduced with G ⁇ pSF 1-F RT vector into 14 ⁇ q HAC.
  • FIG. 75 shows the structure of an FRT sequence introduction vector gn p S F 1—FRT.
  • FIG. 76 shows the results of Southern analysis of DT 40 hybrid cells into which gnpSF1-FRT vector was introduced into 14 g NA q HAC. .
  • Figure 77 shows the construction of the 21 HAC vector.
  • the upper diagram shows the procedure for producing 2 1 ⁇ q HAC by telomere truncation, and the lower diagram shows the procedure for producing 2 1 ⁇ qHAC using the lack of C re _ 1 o x P.
  • FIG. 78 shows an outline of a method for inserting a 1 o x P sequence in the long arm A P 00 1 6 5 7 on human chromosome 1.
  • FIG. 79 shows an outline of a method for performing site-specific cleavage in the long arm A P 00 1 6 5 7 on human 21 chromosome.
  • Figure 80 shows a pS F 1 (FRT) — C vector for insertion of 1 o XP and 3'neo and F RT sequences. '
  • FIG. 8 1 shows the allele resulting from the introduction of the p SF 1 (FRT) _C vector into 2 1 A ⁇ q HAC.
  • 5 ′ HPRT represents 5 ′ hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase
  • Hyg represents the hygromycin gene
  • T k represents the thymidine kinase gene.
  • FRT represents the FLP recombinase target
  • B S represents the blasticidin resistance gene
  • Ap r represents the ampicillin resistance gene.
  • FIG. 82 shows removal of the neo resistant gene unit by FLP-FRT.
  • FIG. 83 shows an outline of the method for inserting the 1 o x P sequence in the long arm NT-0 1 1 5 1 5 on human 2 chromosome 1.
  • Fig. 84 shows an allele on human chromosome 21 from which the long arm resulting from the introduction of the Cre vector has been deleted.
  • Figure 8 5 is 1 0 ? PSF 1 (F RT) — D vector for insertion of 3 ′ neo and F RT sequences.
  • FIG. 86 shows the inactivation resulting from the introduction of the p SF 1 (FRT) _D vector into 2 1 N ⁇ q HAC.
  • FIG. 87 is a graph showing the time course of in vivo efficacy of EPO.
  • Fig. 87 A shows red blood cell (RBC) count
  • Fig. 87 B shows hemoglobin (HGB) count
  • Fig. 87 C shows hematocrit (HCT) value.
  • Figure 88 shows an outline of the PCR analysis results for the EGF P-14HAC vector.
  • Figure 88A shows the structure of the EGFP-1 4HAC vector obtained by introducing the EGFP (enhanced green fluorescent protein) gene into human chromosome 14 vector.
  • Figure 89 shows the relationship between the fragment size and the position on the vector when Southern blot analysis was performed when pLNlI RE SEGF P was introduced into the CHO hybrid cell line (+) or not (1). Indicates.
  • Figure 90 shows the retention of HA C in PCR in chimeric mice made from various ES clones carrying EG FP—14 ⁇ q—HAC vector or EG FP—14 N ⁇ q—HA C vector. The result of the determination is shown.
  • the present invention relates to a human artificial chromosome vector (hereinafter also referred to as “the present HAC vector 1”), which is prepared based on the human chromosome, and has a long arm distal and / or a short arm. It is characterized in that it contains a human chromosomal fragment from which the ⁇ fi position has been deleted and which contains a telomeric and subtelomeric sequence, in particular a subtelomeric sequence.
  • the type of human chromosome is not particularly limited, and is selected from the group consisting of human chromosome 1 to chromosome 22, chromosome X and chromosome Y. Further, in the present invention, mutations such as polymorphisms in the human chromosome are within an acceptable range.
  • human chromosome 14 and human chromosome 21 are exemplified, and the production of a human artificial chromosome vector from these human chromosomes or human chromosome fragments is shown. The methods, means, and the like to be applied to other human chromosomes in the same manner make it possible to produce the human artificial chromosome vector of the present invention.
  • HAC human artificial chromosome
  • This HAC vector is prepared based on the human chromosome as described above.
  • the production of this HAC vector includes the following steps (a) to (c):
  • the method may further comprise the step of inserting at least one site-specific recombination enzyme recognition site into the human chromosome or human chromosome fragment.
  • the order of the steps (b), (c) and (d) and the order of the steps (b), (c), (d) and (e) are not particularly limited. .
  • a cell carrying a human chromosome for example, all human autosomes including human chromosome 14 and human 21
  • Such cells are preferably those that retain only the human chromosome or a fragment thereof and have a high homologous recombination rate for subsequent manipulations. Therefore, in the present invention, firstly, cells satisfying these conditions are prepared.
  • a cell having a human chromosome is selected from a known mouse A 9 hybrid cell library that has a single human chromosome, and the chromosome has a high homologous recombination rate. It can produce by transferring to.
  • the mouse A9 hybrid cell library holds a human single chromosome labeled with a drug resistance gene.
  • WO 00/10083 Tanabe, H. et al. (Chromosome Res., 8: 319). -334, 2000).
  • mouse A 9 hybrid cells carrying human chromosome 14 are registered as J CRB 2 2 1 4 (Hygro 14) in the Japanese Collection of Research Bioresources (J CRB). Detailed information and culture methods are also available.
  • the human chromosome retained in the mouse A9 hybrid cell obtained as described above is transferred to a cell having a high homologous recombination rate.
  • a cell with a high homologous recombination rate means that the cell
  • cells that have a high frequency of homologous recombination are used. Examples of such cells include chicken DT 40 cells (Dieken et al., Nature Genetics, 12: 174-182, 1996), mouse ES cells (Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, Yodosha, 1995).
  • Chromosome transfer can be carried out according to chromosome transfer methods known in the art.
  • chromosome transfer methods known in the art.
  • Koi et al. Koi et al.
  • This technique involves isolating microcells induced by drugs that inhibit spindle formation in certain cells, and fusing them with recipient cells to introduce a small number of chromosomes. See, for example, WO 9 7/0 76 71 and WO 00/1 0383 for specific procedures for transferring human chromosomes using this microcell method.
  • cells retaining the human chromosome can be prepared.
  • SC 20 a cell that retains a partially fragmented chromosome, for example, a partial fragment of human chromosome 14 (SC 20), instead of the full-length human chromosome (SC 20).
  • SC 20 has been reported to lack many parts of the long and distal long arm of human chromosome 14 (Tomizuka et al., PNAS, 97: 722-727, 2000; Kuroiwa et al., Nature Biotech. (USA), Vol. 18, p. 1086-1090, 2000).
  • SC 20 is a region containing AL 1 3 722 9 (Gen Bank registration number) from the telomeric sequence of human chromosome 14 long arm, and further centromeric AL 1 2 1 6 1 2 (G en Ban registration number) to AL 1 5 78 58 (G en Ban registration number) from telomeric side to 24 to 26 kb. Also, the region between AL 1 37229 (G en Ban registration number) and AL 1 2 1 6 1 2 (G en Ban registration number), and the telomeric side of AL 1 5 78 58 (G en Ban registration number) The region between centromera and 24–26 kb is deleted. On the other hand, the short arm region of human chromosome 14 is retained in SC20.
  • AL 1 3 722 9 Gene Bank registration number
  • SC 20 contains multiple genes in the chromosome 14 4 14 3 region, but by reducing SC 20 using the method described herein, various cell types can be obtained. Thus, it is possible to obtain an HAC vector that is stably maintained and does not contain extra genes.
  • the chicken DT-40 cells (SC 20) retaining the SC 20 chromosomal fragment are the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st East, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki, Japan 1st Central 6) No. FERM B P-7 583 has been deposited internationally on May 9, 2001.
  • the long arm distal and the Z or distal short arm of the chromosome or chromosome fragment are deleted in the cell holding the human chromosome or human chromosome fragment.
  • Chromosome deletion can be performed by a method known in the art, for example, using a site-specific recombinant enzyme system.
  • addition of a telomeric sequence and a subtelomer sequence are added to the site of the long arm and / or the short arm from which the chromosome or chromosome fragment is deleted. This can be done using the system.
  • site-specific recombinase system is well known in the art, and for example, a site-specific recombinase and its recognition site exemplified in the step (e) described later can be used.
  • site-directed recombinant enzyme is Ri C r e enzyme der
  • recognition site for site-directed recombinant enzyme is 1 ox P sequence.
  • the site-specific recombinase is an FLPe enzyme
  • the recognition site for the site-specific recombinase is an FRT sequence.
  • steps (b) to (d) is not particularly limited.
  • a telomere sequence and a subunit sequence may be added.
  • a subtelomer sequence may be inserted, or by substitution with a telomere sequence and subtelomer sequence, the long arm distal and Alternatively, the distal short arm may be deleted.
  • Deletion of the distal long arm and / or distal short arm usually results in the size of the resulting human chromosomal fragment including the telomeric and subtelomeric sequences usually about 1 Mb or more, for example, 'about 1 Mb or more about 19 Mb.
  • the reaction is carried out so that the pressure is about 18 Mb or less, more preferably about 17 Mb or less.
  • the telomeric sequence added to the long arm and / or short arm site of the human chromosome fragment may be any as long as it consists of a base sequence having a repetitive sequence such as TTAGGG.
  • the telomeric sequence may be chemically synthesized, for example, based on the TTAGGG repeat sequence, Alternatively, it can be prepared from an arbitrary chromosome (eg, human chromosome) using a known method.
  • the length of the added telomere sequence is about 0.4 to 50 kb, preferably about 0.4 to 25 kb, and more preferably about 0.4 to 15 kb.
  • the subtelomeric sequence added to the long arm and Z or short arm sites of the human chromosome fragment is a subtelomeric sequence derived from a mammalian chromosome, preferably a subtelomeric sequence derived from a human chromosome, more preferably a human normal.
  • Subtelomeric sequences derived from chromosomes for example, human chromosome 14 or human 21.
  • any chromosomal long-arm and Z- or short-armed subtelomeric sequences can be used.
  • the length of the added subtelomeric sequence is about 1 to 500 kb, preferably about 1 to 300 kb, more preferably about 1 to 100 kb, more preferably about 5 to 60 kb. More preferably, it is 5-40 kb, More preferably, it is about 25-6 O kb, More preferably, it is about 25-40 kb.
  • the subtelomeric sequence to be used may be the entire subtelomeric region existing in an arbitrary human chromosome or a part thereof. In the present HAC vector, it is preferable to use a part of the subtelomeric sequence of about 5 to 60 kb in consideration of intracellular stability and the like.
  • Subtelomeric sequences can be obtained from any human chromosome using known techniques, such as the use of site-specific recombinase systems.
  • the human chromosome fragment is the same as or different from the human chromosome, preferably the same, derived from the long arm of the human chromosome, added or bound to the site where the distal long arm of the human chromosome has been deleted.
  • the human chromosome fragment is the same as or different from the human chromosome, preferably the same, derived from the long arm of the human chromosome, added or bound to the site where the distal long arm of the human chromosome has been deleted.
  • the human dye 14 chromophoric fragment comprises a telomeric sequence and the length of chromosome 14 of human 14 added or linked to the site where the long arm of human chromosome 14 has been deleted. Contains subtelomeric sequences from arms.
  • the subtelomeric sequence derived from human chromosome 14 is, for example, the distal part of human chromosome 14 from the 14 q 3 2 region (ie, the region up to the 14 q—te 1 region).
  • Human 1 Chromosome 1 4 q 3 2. 3 3 region, or human Chromosome 14 between AB 0 1 9439 to AB 0 1 94 3 7, AB 0 1 9438 force, et al. AB 0 1 943 7 Preferably at a position distal to the position at AB 0 1 94 3 7 It is a buttelomer sequence.
  • the human 2 chromosome 1 fragment comprises a telomeric sequence and human 2 chromosome 1 added or joined to the site where the distal long arm of human 2 chromosome 1 has been deleted.
  • the subtelomeric sequence derived from human chromosome 1 is, for example, the region farther from the 2 1 q 22.3 region of human 2 chromosome 1, for example NT_0 1 1 5 1 5 in the 2 1 q—te 1 region.
  • the telomere end means the end of the telomere that continues from the chromosome and has the same meaning as the end of the chromosome (the end of the chromosome).
  • the telomeric sequence naturally includes the telomeric end.
  • deletion of the distal long arm and / or the distal short arm of the human chromosome or a fragment thereof may be performed by substitution with the telomeric sequence described in WOO 0/100383. This can be done by Similarly, deletion of the distal long arm and the distal short arm of the human chromosome or a fragment thereof can be performed by substitution with a telomeric sequence. That is, in steps (b) and (), by replacing the long arm distal position and the Z or short arm distal position of the human chromosome or fragment thereof with the telomeric sequence, the telomeric sequence is placed at the long arm and / or short arm site. Append.
  • a specific procedure for removing the distal long arm and / or the distal short arm is, for example, by constructing a targeting vector retaining a telomeric sequence in a cell retaining a human chromosome, and performing homologous recombination on the chromosome. After obtaining a clone with a telomeric sequence inserted at the desired position of the gene, it is possible to obtain a deletion mutant by telomere truncation (Itzhaki et al., Nature Genet., 2nd, p283). -See p287, 1992, and Brown et al., PNAS, 93, p7125-7130, 1996).
  • the desired position of the chromosome is the cleavage position of the distal long arm or distal short arm to be deleted, and the telomeric sequence is replaced by insertion by homologous recombination at this position, and the long arm distal or The distal short arm is removed (telomere transpiration).
  • the desired position can be appropriately set by designing the target sequence when constructing the targeting vector.
  • Human 1 Long arm of chromosome 4 Within the 14 q region, preferably within the 14 q 1 1 region, more preferably AL 3 9 1 1 56 to ⁇ 1 ⁇ 38 36 5 9 (G en Bank registration number)
  • the distal long arm can be cut and deleted in the region where the target sequence is set.
  • the target sequence design is such that the long arm of human chromosome 14 is deleted at AL 3 9 1 1 56 or at a position proximal to AL 39 1 1 5 6 Specifically, between AL 3 9 1 1 56 to C 38 36 5 9, more preferably between 5 1 23 1 0 to CR 3836 5 9, more preferably between AL 9 2960 1 to CR 38 36 5 9 More preferably between AL 589 1 8 2 and CR 38 36 5 9, more preferably between AL 58 9 743 and CR 38 36 59, more preferably between AL 9 29602 and CR 3 836 59, more preferably Is performed based on the base sequence of AL 5 1 2 624 to CR 38 36 59, more preferably CR 3 836 57 to CR 38 36 59, and more preferably CR 38 3 6 59.
  • human 14 when deleting the distal part of the short arm, human 14 is located within the 14 p region on chromosome 4, preferably 14 p 11 region to 14 p 12 region, preferably 14 p 11 region. More preferably, RNR 2, more preferably PAB P CP 2 (US National Center for Biotechnology Information (NCBI) online genome database)
  • NBI National Center for Biotechnology Information
  • the target sequence can be designed.
  • sequence information of human chromosome 14 the nucleotide sequence of the entire long arm excluding the Sen fore domain is published in the above database (see also Fig. 1).
  • the design of the target sequence is not limited to the above-described region, and those skilled in the art can appropriately design so as to produce a desired HA C vector.
  • a target sequence is designed based on the base sequence of AL 1 5 7858, and the telomere side of the target sequence. By making telomere truncation occur in the region, it is possible to cut and delete the distal long arm in the region where the target sequence is set.
  • the target sequence can be designed.
  • the design of the target sequence is not limited to the above-described region, and those skilled in the art can appropriately design so as to produce a desired HAC vector.
  • the human arm or the fragment of the long arm and / or the short arm Deletion is due to deletion between the recognition sites of two site-specific recombinases, as described, for example, in Zheng B. et al., Mol Cell Biol., Vol. 20, p648- P 655, 2000.
  • Deletion of the distal long arm and / or the distal short arm is preferably carried out so as to leave the subtelomeric sequence derived from the human chromosome or fragment thereof as a basic skeleton and add the telomeric sequence.
  • steps (b) and (c) at least two sites in the long arm and / or the short arm of the human chromosome or human chromosome fragment are cleaved and deleted.
  • the long arm distal and / or the short arm distal can be deleted, and a telomere sequence can be added to the deleted long arm and / or short arm site.
  • the human chromosome or fragment thereof is cleaved and deleted at least two sites on the distal and long distal sides of the long arm, so that the human chromosome or
  • a telomeric sequence or telomeric sequence and a subtelomeric sequence derived from the human chromosome are added to the deleted long arm and Z or short arm sites.
  • Specific procedures for deleting the distal long arm and / or the distal short arm include, for example, retaining the recognition site for the site-specific recombinase in cells that retain the human chromosome or human chromosome fragment. After constructing a targeting vector and obtaining a clone with the site-specific recombination enzyme recognition site inserted at the desired position on the chromosome by homologous recombination, the clone was deleted by recombination with the site-specific recombination enzyme. It is to obtain a mutant.
  • the desired position of the chromosome is the long arm distal and long arm proximal or short arm distal and short arm proximal cutting position to be deleted, and site-specific sequence homologous recombination at this position. Is replaced and inserted, and the distal long arm or distal distal arm is deleted.
  • the desired position can be appropriately set by designing the target sequence when constructing the targeting vector.
  • deletion of the distal part of the long arm of the human chromosome or a fragment thereof inserts recognition sites for site-specific recombination enzymes at the distal and proximal ends of the long arm, and these two recognition sites by site-specific recombination. This is done by deleting the gap.
  • the deletion of the distal long arm and / or the distal short arm is carried out so as to leave a telomeric sequence or a telomeric sequence and a subtelomeric sequence derived from the chromosome of the starting material as a basic skeleton.
  • deletion of the long arm distant of human chromosome 14 inserts at least two site-specific recombination enzyme recognition sites in the distal and proximal long arms, and two sites by site-specific recombination. This is done by deleting between recognition sites.
  • the recognition site for the site-specific recombinase is 14 1 3 q 1 1 distal to the long arm distal 14 4 3 region of human 14 More proximal to the region, more preferably human 1 AB 4 1 7 4 3 7 distal to the long arm and proximal to the long arm AL 3 9 1 1 5 Inserted more proximally than 6.
  • the deletion of the distal end of the short arm of human chromosome 14 is performed by inserting site-specific recombination enzyme recognition sites at the distal and proximal positions of the short arm, and by site-specific recombination. This is done by deleting between recognition sites.
  • the recognition site for the site-specific recombinase is the distal end of the short arm of human chromosome 14, for example, more distally than in the 14 p region, preferably from within the 14 p 1 2 region.
  • the recognition site of the site-specific recombinase is, for example, the deletion position in AP 0 0 1 6 5 7 or closer to AP 0 0 1 6 5 7 of chromosome 21 or human 21 fragment. And more preferably at a position proximal to the deletion position in the 2 1 p 1 1-P 12 region proximal to the short arm of human 21 chromosome 1 or human 21 chromosome fragment. be able to.
  • a human chromosome fragment in which the long arm distal and Z or distal short arm are deleted is formed so as to leave a telomeric sequence or a telomeric sequence and a subtelomeric sequence, and a cell that retains it is obtained.
  • the telomere sequence, the transcript sequence and the subunit sequence at the end of the human chromosome fragment expression and Z or stability in the cell can be achieved.
  • a human chromosome fragment from which the long arm distal and Z or distal short arm are deleted is formed, and a cell that retains it is obtained.
  • cell stability can be achieved.
  • the functions of the cells that hold this HAC vector and the cells into which this HAC vector described later is introduced. 'Chromosomal regions that are estimated to have adverse effects can be removed so as not to adversely affect growth. .
  • a site-specific recombinase recognition site is inserted into the human chromosome or human chromosome fragment.
  • This step (e) may be performed either before, during or after the above steps (b), (c) and (d), and their order is particularly limited. Not. That is, in the human chromosome or human chromosome fragment, the long-arm distal and / or long-arm distal is deleted, and the recognition site of the site-specific recombinase is added after adding the telomere sequence and subtelomer sequence.
  • the long arm distal and the long arm distal may be deleted, and the telomere sequence and the subtelomer sequence may be added, or the long arm distal and / or the long arm distal
  • a recognition site for the site-specific recombinase may be inserted, and then the transcript sequence and subtelomeric sequence may be added.
  • an enzyme recognizes a specific recognition site and specifically causes DNA recombination at the recognition site.
  • an enzyme and recognition site system is known.
  • the type is not particularly limited to the following example.
  • Cre / 1 o XP system is known as such a system (see, for example, Sauer, B. et al., PNAS, 85: 5166-5170, 1988).
  • Cre is a 38 KD protein derived from butteriophage P1 and belongs to the recombinase Int (integrase) family. This enzyme recognizes the approximately 34 bp recognition site 1 o XP sequence and causes DNA recombination specifically at this site.
  • a known gene recombination technique such as homologous recombination can be used.
  • a person skilled in the art can appropriately set the insertion position of the recognition site of the site-specific recombinase in consideration of the position of a gene that is not essential. For example, a site for recognizing a site-specific recombination enzyme is inserted at an arbitrary position on the human chromosome in the vicinity of the long arm or the short arm.
  • insertion position for example, for human chromosome 14, AL 3 9 1 1 5 6 (G en Bank registration number ) In the vicinity of the deletion position in FIG. 1 or in the 14 p 12 region in the vicinity of the short arm of human chromosome 14 but the deletion position is not particularly limited.
  • human chromosome 1 it is more proximal to the long arm proximal 2 1 q 1 1.2, preferably proximal to 2 1 qll 1, preferably proximal to AL 1 6 202, more preferably Is the deleted position in AP 00 1 6 5 7 (G en Bank registration number) proximal to the long arm, or proximal to AP 00 1 6 5 7 or on the short arm of human 2 chromosome 1, preferably the short arm Proximal 2 1 p 1 1.2, etc. Although it is mentioned, it is not specifically limited to this position.
  • the site-specific recombination enzyme recognition site can be used as a foreign DNA insertion position described later. Therefore, for such insertion position, for example, for human No. 4 dye, AL 3 9 1 1 56 (G en B ank registration number) proximal to the deletion position, or on the short arm of human 14th chromosome, preferably proximal to the deletion position in the 14p12 region of proximal short arm However, it is not particularly limited to this position.
  • proximal to long arm proximal 2 1 q 1 1.2 preferably proximal to 2 1 q 1 1.1, preferably closer to AL 1 6202 Position, more preferably the deletion position in AP 00 1 65 7 (G en Bank registration number) proximal to the long arm or proximal to AP 00 1 65 7 or on the short arm of human 21 chromosome, preferably The proximal position of the short arm is 2 1 p 1 1.2.
  • the proximal position of the deletion position in the 2 1 p 2 region is mentioned, but it is not particularly limited to this position.
  • One or more types of the recognition sites exemplified above may be inserted, or a plurality of recognition sites of different systems may be inserted.
  • this HAC vector has a recognition site for a site-specific recombination enzyme, foreign DNA can be introduced site-specifically. Since the position can be determined, the introduction position of the foreign DNA is constant, and the position effect can be avoided. In addition, foreign DNA can be introduced easily. In addition, multiple foreign DNAs can be inserted sequentially by inserting multiple recognition sites of different systems.
  • Unnecessary genes can be deleted or deleted using the recognition site of another type of site-specific recombinase.
  • This HAC vector prepared by modifying the human chromosome as described above is generally used for constructing vectors for promoters, drug resistance genes, etc., in addition to site-specific recombination enzyme recognition sites. Sequence or element may be inserted. Insulators (see, for example, JP-A-2006-948494), cytoskeletal attachment region (MA), human or other species of genome, etc. and / or cell function control and / or Tissue function control and / or ontogeny control and Z or biological function control An array or element related to the control may be inserted.
  • genes that control cell life such as telomerase, and suicide genes such as Z or thymidine kinase, and genes related to control of gene expression, cell function, tissue function, ontogeny control, and biological function control. May be inserted.
  • Such sequences and / or elements and / or genes can be inserted into the desired location of the HAC vector using homologous recombination methods as described above.
  • the inventor subcultured cells containing the HAC vector prepared as described above in a medium containing a selective drug over a long period of time.
  • this HAC vector one is stably maintained in the host cell (for example, CHO cells), and its stability is significantly higher than the conventional 21 HAC vector. It was.
  • in subculture not only was the HAC vector missing, but it was confirmed that the number of copies of the introduced HAC vector remained stable without excessive increase or decrease.
  • the vicinity refers to a region of about 1 to 500 kb from the telomere end to the centromere side, preferably about 1 to 300 kb, more preferably about 1 to 100 kb, The length is preferably about 5 to 60 kb, more preferably 5 to 40 kb, still more preferably about 2.5 to 60 kb, and still more preferably about 25 to 40 kb.
  • the foreign DNA can be introduced into the HAC vector by performing the step (f) of inserting the foreign DNA in the presence of a site-specific recombinase.
  • This step (f) is performed after step (e) described above, but the order of steps (b), (c) and (d) is not particularly limited, and steps (b), ( It can be done before c) and (d), during these steps or after these steps. Therefore, it should be noted that the order of steps (b) to (f) is not limited to the order described in the specification.
  • Foreign DNA refers to DNA that is introduced from the outside into the target cell and encodes genes and other functional sequences. Introduced in the present invention The foreign DNA is not particularly limited as long as it encodes a gene desired to be expressed for substance production, disease treatment and functional modification or functional analysis, and other functional sequences. Other functional sequences refer to sequences that function for gene expression, such as promoters, enhancers, signal sequences, and the like.
  • Foreign DNA can be introduced using a site-specific recombinase system.
  • a targeting vector carrying a 1 o XP sequence, which is a recognition site for the Cre enzyme, and foreign DNA is constructed.
  • the region sandwiched between the ⁇ sequence and the telomere sequence, and the above target Exogenous DNA can be inserted into this HAC vector by site-specific recombination with a ting vector (Kuroiwa et al., Nature Biotech., 18: 1086-1090, 2000).
  • the site-specific recombination enzyme recognition site can be used as the foreign DNA insertion position.
  • insertion position for example, for human chromosome 14, AL 39 1 1 56 (G en Bank registration number) proximal to the long arm proximal 14 q 11, more preferably the long arm proximal In the 14p12 region in the 14p12 region of the short arm of the human chromosome 14 or preferably on the short arm of human chromosome 14, preferably at this position. It is not limited.
  • human chromosome 1 it is proximal to 2 1 q 1 1.2 near the long arm, preferably proximal to 2 1 qll.
  • proximal to AL 1 6 202 Preferably the deleted position in AP 00 1 6 5 7 (G en Bank registration number) proximal to the long arm or proximal to AP 00 1 6 5 7 or on the short arm of human 2 chromosome 1, preferably Examples include the proximal position of the deletion in the 2 1 p 1 1.2 region of the proximal short arm, but are not particularly limited to this position.
  • the drug resistance gene expression unit that has become unnecessary from this HAC vector can be removed.
  • the above C re-1 o XP system When removing the Neo-resistant gene unit existing downstream of the introduced foreign gene expression unit, downstream of the foreign gene expression unit on the targeting vector holding the foreign DNA and above this HAC vector A construct is constructed in which a recognition site (FRT sequence) of a different type from 1 o XP is introduced downstream of the Neo resistance gene unit.
  • FRT sequence recognition site
  • the FLP e enzyme can be expressed in the cell to excise and remove the Neo-resistant gene unit region flanked by FRT sequences by site-specific recombination. (For example, see Figure 60).
  • the removal of the drug resistance gene as described above is not limited to human chromosomes 14 and 21, but can be carried out in the production of a human chromosome vector based on any human chromosome. Conceivable. Therefore, the present invention relates to a method for producing a human artificial chromosome vector containing foreign DNA comprising the following steps:
  • step (f) A step of removing a drug resistance gene on the human chromosome or human chromosome fragment in the presence of a different type of site-specific recombinase from that used in step (e).
  • the human artificial chromosome vector containing exogenous DN A prepared according to the above method has the drug resistance gene removed, and as a result, the exogenous DN A can be highly expressed (for example, related to human chromosome 14 vector). (See Figure 21).
  • tissue-specific isoforms are expressed when there are multiple promoters for one gene and transcription start sites are different, or when splicing causes variations.
  • Cloned cDNA is only one of multiple transcript variants derived from a single gene.
  • a gene region containing regulatory sequences is introduced as genomic DNA. It is desirable to do.
  • the use of this HAC vector is suitable for this purpose.
  • genomic DNA was isolated as a BAC clone and sequenced. For this reason, in public databases (such as G en B a n k), nucleotide sequences are also registered in BAC units.
  • One method of gene function analysis is the production of transgenic mice. By inserting BAC using this HAC vector as a platform, gene expression can always be analyzed under the same insertion site conditions.
  • Many BAC vectors have 1 o XP sequences, so if a system for negative selection of insertion into this HAC vector is used, a BAC with a known base sequence can be easily added to this HAC vector in a cassette format. It is thought that it can enter.
  • Site-specific recombination causes an insertion reaction in the case of linear chromosomes and circular inserts (foreign DNA), but between linear chromosomes.
  • a reciprocal translocation reaction occurs.
  • the introduction of foreign DNA into the HAC vector uses positive selection based on the reconstitution of drug resistance genes as an index (recombinant positive). See WOO 0/1 03 8 3 for sorting).
  • an insert insert in which foreign DNA has been inserted
  • negative selection such as thymidine kinase / ganciclovir system.
  • the inserted circular DNA only needs to contain the recognition site for the site-specific recombinase.
  • Genome Pro Since the BAC library used in the project contains 1 o XP sequences, genomic clones with known sequences can be easily inserted into this HAC vector if such a negative selection system can be established. become.
  • the 1 o XP sequence preferably used in the present invention is a wild type sequence derived from P1 phage, and the insertion reaction of the circular inserter into the 1 ox P sequence on the HAC vector by Cre enzyme is reversible. .
  • a constitutive insert was obtained by transiently expressing the Cre enzyme and selecting site-specific recombinants using the acquisition of drug resistance as an indicator. .
  • the Cre enzyme is expressed again, a reverse reaction (cyclic insert excision) may occur, making it difficult to further modify the HAC vector, such as inserting an insert secondarily.
  • the insertion position of the foreign DNA is determined as the recognition site (for example, 1 o XP site) of the site-specific recombinase previously introduced on the host chromosome.
  • a report of a transgenic mouse that introduces the target DN A unit from a plasmid vector by a specific recombination reaction eg C re-1 o XP system
  • C re-1 o XP system a specific recombination reaction
  • multiple copies of the same and / or different target gene expression units are connected in parallel and introduced into a predetermined position (for example, 1 ox P site) on the HAC vector.
  • Copy number-dependent expression control can be performed without mutating chromosomes.
  • multiple copies of a target gene can be introduced into a desired cell as foreign DNA, and the target gene can be expressed in the cell in a copy number-dependent manner.
  • the transgenic animal produced by using it it is possible to achieve the copy number-dependent expression of the target gene, which has been difficult in the past, without receiving the position effect.
  • These vectors can be transferred to other cells from cells carrying this HAC vector or this HAC vector containing foreign DNA.
  • the cells to be transferred to are not particularly limited, and examples thereof include animal cells (mammalian cells).
  • animal cells mammalian cells
  • it is preferable to use Chinese hamster ovary (CHO) cells which are known to be able to transfer human chromosomes in an intact state (see WOOO 0/100383).
  • CHO cells are known to efficiently form microcells (eg, Koi et al., SCIENCE 260: 361-364, 1993), which makes it possible to transfer the HAC vector from CHO cells to other cells (C HO It is also possible to transfer to other cells.
  • the HA C vector can also be transferred to a multipotent cell.
  • the “multipotent cell” means a cell that can be differentiated into a specific cell or tissue by a predetermined operation.
  • ES cells embryonic stem cells
  • Examples include embryonic proliferating cells (EG cells), embryonic tumor cells (EC cells), and sperm-derived stem cells (GS cells).
  • growth factors eg transforming growth factor; TGF
  • TGF transforming growth factor
  • chondrocytes or adipocytes by culturing in an induction medium supplemented with, specifically, somatic stem cells (eg, mesenchymal cells) are included.
  • somatic stem cells eg, mesenchymal cells
  • embryonic stem cell is also referred to as an ES cell, and means a cultured cell derived from an early embryo characterized by being able to proliferate while maintaining undifferentiated (totipotent) .
  • embryonic stem cells are established so that cells of the inner cell mass, which are undifferentiated stem cells existing in the blastocyst in the early embryo of the animal, are cultured and continue to proliferate while remaining undifferentiated.
  • Cell line The term “embryonic germ cell” is also referred to as an EG cell, and means a cultured cell derived from a primordial germ cell, characterized by having approximately the same ability as the embryonic stem cell.
  • Embryonic germ cells are cultured for several days to several weeks after fertilization, for example, in the case of mice, or in some cases, primordial germ cells obtained from embryos that have passed about 8.5 days, and continue to proliferate while remaining undifferentiated. Is a cell line established in this way.
  • normal cells instead of immortalized cells
  • HF L human normal fibroblasts
  • the method of the present invention enables the transfer of a human chromosome 14-derived fragment or a human chromosome-derived HAC vector to normal human somatic cells other than fibroblasts.
  • the human chromosome-derived HAC vector produced according to the method of the present invention can be transferred to normal human somatic cells without being restricted to the human chromosome. .
  • Transfer of HAC vectors into cells can be performed using the microcell method.
  • the microcell method can be performed as described in the section “1. Production of human artificial chromosome (HAC) vector” above.
  • the transfer of the HAC vector into the cells can be performed using the somatic cell nuclear transfer method.
  • the somatic cell nuclear transfer method can be performed as described in Kuroiwa Y et al. Natute Biotech, Vol. 20, p889-894, 2002.
  • the cells that initially prepared the human chromosome or chromosomal fragment are transferred to the human chromosome before, during, or after the step.
  • the human chromosome HAC vector
  • the human chromosome can be transferred to other cells.
  • the purpose of the present invention is to provide a basic tool called vector and its utilization technology. It is expected to have a ripple effect in a very wide range of fields from industry to industry. (I) maintained independently without being inserted into the host chromosome (no concern for host gene mutation or canceration), (ii) stably maintained for a long time with a certain copy number (overexpression, (Iii) There is no restriction on the length of DN A that can be introduced (a gene containing a DNA element that guarantees normal expression control can be introduced simultaneously). It is envisioned that the features of this HAC vector enable many things that were impossible with conventional vectors.
  • this HAC vector includes, but are not limited to, (i) a vector for analysis of gene function in animal cultured cells, (ii) a vector for human disease gene therapy, (iii) ) Vectors for gene transfer into human organ stem cells, embryonic stem cells (ES cells), (iV) Vectors for gene transfer animal production (eg, human disease model animal production, specific gene humans combined with KO animals) G)) is possible.
  • a vector for analysis of gene function in animal cultured cells e.g., a vector for human disease gene therapy, (iii) ) Vectors for gene transfer into human organ stem cells, embryonic stem cells (ES cells), (iV) Vectors for gene transfer animal production (eg, human disease model animal production, specific gene humans combined with KO animals) G)
  • ES cells embryonic stem cells
  • Vectors for gene transfer animal production eg, human disease model animal production, specific gene humans combined with KO animals
  • This HAC vector can introduce foreign DNA into cells or transfer a HAC vector with foreign DNA inserted into other cells, so that foreign DNA can be introduced into desired recipient cells.
  • Introduction of foreign DNA into recipient cells includes, for example, the following steps:
  • Steps (a) to (f) can be performed as described above, and the order in which the steps are performed is not limited to this.
  • the chromosome or fragment thereof is transferred from the donor cell holding the human chromosome or human chromosome fragment to the recipient cell using the microcell method.
  • the human chromosome or fragment thereof to be transferred can be the one before or during modification of the chromosome or fragment in steps (b) to (f). Therefore, for example, before inserting the foreign DNA into the human chromosome or a fragment thereof in step (f), from the donor cell holding the human chromosome or a fragment thereof to the recipient cell using the microcell method. Fragments may be transferred.
  • step (f) is performed in the recipient cell, and the recipient chromosome can be held in the recipient chromosome by inserting the foreign chromosome inserted into the recipient chromosome.
  • steps (f) to (h) is not limited to the above order.
  • the microcell method can be performed as described in the section “1. Production of human artificial chromosome (HAC) vector” above.
  • the recipient cells used here are not particularly limited, but animal cells, particularly mammalian cells (eg, mouse cells, human cells, etc.) are preferred.
  • cells having multipotency as described above such as embryonic stem cells (ES cells), stromal stem cells and tissue stem progenitor cells, can also be used as recipient cells.
  • step (i) it is confirmed whether or not foreign DNA has been introduced (transferred) into the recipient cell.
  • This confirmation can be performed by a method known in the art. For example, introduction of foreign DNA can be confirmed by Southern blot analysis using a probe corresponding to the restriction enzyme site of the foreign DNA. .
  • this HAC vector can be used to insert foreign DNA in cells or transfer a HAC vector with foreign DNA inserted into other cells.
  • You can also Production of cells that express foreign DNA includes, for example, the following steps:
  • Steps (a) to (h) can be performed as described above, and the order in which the steps are performed is not limited to this.
  • step (i) the expression of foreign DNA is confirmed in the recipient cell, and a cell that expresses foreign DNA is selected. Confirmation of the expression of foreign DNA can be carried out by methods known in the art, such as the Northern 'prot method using a probe corresponding to foreign DNA. Alternatively, expression of foreign DNA can be confirmed by detecting a protein encoded by foreign DNA using an antibody against the protein and a means capable of detecting the activity of the protein.
  • Protein production includes, for example, the following steps:
  • telomere sequence to the part of the long arm and / or short arm to be deleted;
  • a subtelomer sequence to the deleted long arm and Z or short arm sites;
  • Steps (a) to (h) can be performed as described above, and the order in which the steps are performed is not limited to this.
  • the recipient cells fused in step (h) are cultured in a medium.
  • the culture medium for culturing the recipient cells contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc., and any medium can be used as long as the recipient cells can be cultured efficiently.
  • a person skilled in the art can select a suitable medium and prepare a medium with appropriate modifications if necessary.
  • aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture, temperature, pH, culture period, etc. are appropriately set.
  • “Culture” means not only culture supernatant but also cultured cells or disrupted cells.
  • the protein is extracted by ultrasonic disruption treatment, grinding treatment, pressure disruption, etc., by a conventional method. Add protease inhibitors if necessary.
  • the culture solution itself can be used. Then, this solution is filtered, centrifuged, etc. to remove the solid part, and if necessary, the nucleic acid is removed by prototamine treatment.
  • the protein solution is subjected to various types of chromatography, electrophoresis, etc. to obtain a purified enzyme preparation. For example, gel filtration using ion chromatography, ultragel or biogel, ion exchange chromatography, polyacrylamide gel, electrophoresis, affinity chromatography, reverse phase chromatography, etc.
  • a purified target protein can be obtained by appropriately selecting the fractionation method to be used or combining them.
  • the culture method and the purification method are examples, and are not limited thereto.
  • the protein to be produced is not particularly limited as long as it is a protein that is desired to be produced.
  • E PO erythropoietin
  • TPO thrombopoietin
  • VWF Von Willebrand factor
  • Dist mouth fin Dopamine synthase, Insulin, Insulin-like growth factor (IGF), Insulin-like growth factor binding protein (IGFBP), Antibody, Telomerase, Granulocyte colony stimulation Factor, granulocyte / macrophage colony stimulating factor, immunoglobulin, growth hormone, interleukin 2, interleukin 3, interleukin 4, interleukin 5, interleukin 6, interleukin 7, interleukin 8, interleukin 9 , Interleukin 1 0, interleukin 1 1, Interleukin 1 2, Interleukin 1 5, CD 40 Ligand, Interferone, Adenosine Deaminase, ⁇ -1 Antitrypsin, Ornithine Trans Power Lub
  • BMP activin
  • TGF transforming growth factor
  • Wnt wint
  • R_spondin earspondin
  • monoclonal antibody oligoclonal antibody
  • polyclonal antibody oligoclonal antibody
  • this HAC vector can be used to analyze gene functions.
  • RNA interference is a technique that suppresses target gene expression by expressing double-stranded RNA (dsRNA) consisting of a sequence complementary to a part of the base sequence that encodes the target gene.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • siRNA short interfering RNA
  • conditional expression or tissue-specific physiological functions can be analyzed by using the expression induction system or genomic region for gene expression control.
  • the HAC vector prepared by the method of the present invention can be used as a vector for gene transfer into embryonic stem (ES) cells or mesenchymal stem cells (MSC).
  • ES embryonic stem
  • MSC mesenchymal stem cells
  • the HAC vector is stably maintained also in the tissue cells induced to differentiate from the HAC vector-transferred ES cells prepared by the method of the present invention.
  • HAC vectors can be used as vectors for gene transfer into tissue stem / progenitor cells, such as pluripotent stem Z progenitor cells derived from bone marrow, blood, nerve, muscle, liver, kidney, skin, inner ear, etc. is there.
  • stem cells and neural stem cells are collected from living tissue and cultured, not only stem cells Since progenitor cells and mature cells differentiated from stem cells are also amplified at the same time, they are not suitable for clinical use (Takayuki Okano, Experimental Medicine, 1 9-15 15 Special Issue: 80-90, 200 1, Yodosha ).
  • factors involved in maintaining pluripotency include transcription factors such as activated S tat '3, Oct-3 / 4, and Nanog (Niwa et al., Genes Dev., 12: 2048-2060, 1998; Matsuda et al., EMB0, 18: 426 to 4269, 1999; Niwa et al., Nature Genet., 24: 372-376, 2000; Mitsui. Et al., Cell, 113: 631-642, 2003; Chambers et al. Cell, 113: 643–655, 2003) by creating a HAC vector into which DNA encoding DNA has been introduced and transferring it to stem cells. It can be used to amplify.
  • transcription factors such as activated S tat '3, Oct-3 / 4, and Nanog
  • control of the expression level of the molecules involved is an important factor in controlling the differentiation of stem cells.
  • the expression level is maintained when the physiological expression level is 100%, but the undifferentiated state is maintained. It differentiates into ectoderm, and at more than 150%, it differentiates into primitive endoderm (Niwa et al., Nature Genet., 24: 372-376, 2000).
  • a gene expression ONZOFF induction system for example, expression induction system by tetracycline
  • the expression level can be controlled.
  • the pluripotency retention state and the differentiation induction state can be switched.
  • a gene expression ONZOFF induction system for example, an expression induction system using tetracycline
  • a plurality of differentiation inducers for example, an expression induction system using tetracycline
  • the pluripotency retention state and the differentiation induction state can be switched.
  • the transplanted cells or donor-derived regenerated tissue functions as a part of the recipient individual over a long period of time (preferably a lifetime). Therefore, it is desirable to avoid as much as possible the operation that causes a cause (eg, gene mutation) that induces a deviation in physiological control such as canceration in donor cells.
  • this HAC vector can exist independently of the host chromosome, gene transfer can be performed without mutating the host chromosome.
  • the target molecule can be stably expressed over a long period of time because it can stably exist in human cells.
  • a HAC vector is prepared by introducing DNA fused with a target gene under a genomic sequence containing a genomic region or a tissue-specific expression control region that is physiologically expressed in a differentiated tissue.
  • stem cell transfected with the above-mentioned HAC vector it is possible to express the target molecule in a regenerated tissue in a physiological tissue-specific manner.
  • the HAC vector may be unnecessary if expression of the transgene is not required.
  • the clones that have lost HAC vectors after induction of differentiation are not particularly limited, but for example, by selecting drug resistance in selective culture as an indicator, it is possible to eliminate unnecessary HAC vectors. .
  • the gene of culture additive can be introduced into a culture support feeder cell by the conventional method, but mutation / position effect due to random insertion into the host chromosome, expression inactivation, and downstream by paralleling multiple copy expression units It is considered difficult to control and supply the desired level of expression for all factors due to decreased gene expression.
  • An HAC vector in which all (or part of) DNAs encoding these necessary factors have been introduced by the method of the present invention and transferred to a culture support feeder cell is added to a recombinant protein later. All necessary factors can be easily replenished by simple co-culture. In addition, conditional expression control of these factors is possible by using a gene expression induction system.
  • Gene cell therapy strategies using HAC vector include (i) supplementation of primary deficient enzymes and proteins, (ii) symptomatic treatment of supplementing secondary decreased metabolites, (Iii) New to cells ⁇ ! To enhance cell survival (for example, in tissue regeneration using modified cells, the HAC vector introduces a physiological / tissue-specific gene by introducing a genome) It is possible to control child expression. This can also avoid side effects such as dysfunction due to overexpression or insufficient expression. ), (I V) a method of eliminating a disorder of a degenerative disease that progresses in the form of a Ginoffunction (for example, GDNF replacement therapy in Parkinson's disease).
  • this HAC vector can be used as a vector for treating human diseases, and a drug for administering the cells to a patient after transferring the HAC vector into which foreign DNA for treatment has been introduced. It can be prepared as a composition and gene therapy using this HAC vector. Further, such a human disease treatment vector can be used not only for treatment of a disease but also for prevention of the disease.
  • normal somatic cells are known to proliferate and divide after a certain number of divisions and eventually die, that is, to age (Ide Toshinori, Experimental Medicine, 1 6-18 1 Special Issue: 1 8-24, 1 9 98, Yodosha).
  • Ide Toshinori Experimental Medicine, 1 6-18 1 Special Issue: 1 8-24, 1 9 98, Yodosha.
  • the therapeutic cells be maintained for a period of time, preferably throughout the lifetime of the affected person.
  • telomerase a repair enzyme of repetitive sequence telomeres at the end of chromosomes, can suppress the shortening of the themes observed during cell senescence and prolong cell life by overexpression in normal cells.
  • telomerase has also been shown to not cause immortalization or canceration even when overexpressed in cells (Maikai Hiroshi, Experimental Medicine, 16–18 No. 18: 25-30, 1 9 98, Yodosha, Jiang et al., Nature Gent., 21: 111-114, 1999).
  • telomere human telomerase
  • the life span of the HAC-transfected cell is prolonged, immortalized or cancerous. It is possible to maintain the therapeutic effect for a long period of time without making it.
  • Conditional or tissue-specific Z physiological telomerase expression is possible by using an expression induction system or a genomic region for gene expression control.
  • the production of autoantibodies upon administration is an obstacle (Li et al., Blood, 98: 3241-3248, 2001).
  • the HAC vector introduced with the genome encoding the target protein prepared by the method of the present invention is transferred to human cells, for example, normal human cells of the production tissue, and then transferred to the patient. Transplant. By expressing and supplying the target protein physiologically / tissue-specifically from the HAC vector in the patient, autoantibody production in the patient can be suppressed.
  • tissue-specific microphone PRNA mi RNA
  • transgenes in specific tissues-cells Can suppress the generation of autoantibodies against transgenes and avoid immune responses.
  • donor lymphocyte infusion therapy As a treatment for relapsed leukemia, donor lymphocyte infusion therapy (Kolb et al., Blood, 76: 2462) applied transplanted lymphocytes to attack leukemia cells as tumor-specific cytotoxic T cells by graft-versus-leukemia response. -2465, 1990) is known.
  • graft-versus-host disease in which transplanted cells attack and damage recipient tissues, is one countermeasure.
  • Donna lymphocytes have been removed by sex suicide gene transfer and drug administration (Onodera et al., Genomic Medicine, 3: 45, 2 0 0 3, Medical Review). In the case of the above method, there remains a risk of mutating the chromosomes of donor lymphocytes.
  • the H A C vector produced by the method of the present invention can be used as a vector for gene transfer in immune gene cell therapy that does not mutate the host chromosome.
  • treatment for the purpose of promoting antitumor activity for example, immune activation therapy with CD40 ligand in lymphoma (Kato et al., Genomic Medicine, 3 ⁇ : 53, 2003, Medical Review) and gene vaccines It can also be used as a vector for gene transfer in therapy.
  • the HAC vector prepared by the method of the present invention a genomic region that encodes the target antibody isolated from the hybridoma that produces the target antibody is introduced.
  • the HAC vector is introduced into patient hematopoietic stem cells or B cells. It is possible to replenish and supply complete human antibodies by controlling physiological expression by re-transplanting to the patient after transfer. In addition, the above can reduce the number of regular visits and improve the patient's QOL.
  • Hemophilia A is a cognate recessive hereditary bleeding disorder caused by a blood coagulation factor 8 mutation
  • hemophilia B is a blood coagulation factor 9 mutation.
  • Replacement therapy with the administration of factor 8 or 9 concentrates is effective as a treatment, but post-hemorrhage administration may cause serious symptoms, possible contamination with concentrated agents, autoantibodies with repeated administration
  • There are many problems such as the occurrence of (active neutralizing antibodies), the patient's QOL due to preparation for dealing with bleeding at all times, and high medical costs, and the solution by gene therapy is expected.
  • Clinical gene therapy research using conventional vectors has been conducted, but sufficient expression cannot be sustained for a long period of time, resulting in no significant therapeutic effect.
  • AAV adeno-associated virus
  • vector genes are detected in the semen of subjects and the risk of gene transfer into germ cells has been pointed out (Mochizuki et al. , Genomic Medicine, 3:25, 2003, Medical Review).
  • the gene encoding factor 8 is about 1.5 Mb for the full-length genome and about 7 kb for cDNA.
  • non-viral vectors and adenoviral vectors full-length cDNA can be introduced, but the expression level decreases, and in the case of AAV vectors, the introduced DNA size is limited to about 4.9 kb or less, so that the full-length gene is introduced. The inability to do so is an issue.
  • the method of the present invention it is possible to prepare a HAC vector into which DNA encoding blood coagulation factor 8 or factor 9 has been introduced.
  • the method of administration to the patient is not particularly limited, but the HAC vector can be supplemented by, for example, transferring it to human cells and then transplanting it into the affected person.
  • the method of administration to the patient is not particularly limited, the HAC vector into which the above-mentioned blood coagulation factor 8 or factor 9 genomic region has been introduced is transferred to, for example, a human cell and then affected by the cell.
  • the factor can be supplemented by physiological tissue-specific expression.
  • SID X-linked severe combined immunodeficiency
  • SCID Severe combined immunodeficiency disease
  • SCID is an innate disorder of humoral and cellular immunity. About half of SCID is X-linked X-SCID, and it is known that the cause is a mutation in the common ⁇ chain shared by the receptors of the interleukin-2 family.
  • As a treatment hematopoietic stem cell transplantation is performed, but recovery of humoral immunity is insufficient, and regular administration of immunoglobulin is required. Therefore, a solution by gene cell therapy in which a common chain is introduced into hematopoietic stem cells and transplanted is expected.
  • the method of the present invention it is possible to prepare an HAC vector into which DNA that codes a common strand is introduced.
  • the above HAC vector as a gene introduction vector, it is possible to avoid the risk of mutation of vector sequence into the host chromosome.
  • the administration method to the patient is not particularly limited, the above-mentioned HAC vector is transferred to a human cell (for example, a normal hematopoietic stem cell derived from human bone marrow) and transplanted to a diseased person to obtain a physiological system. It is possible to complement the defective function of the common ⁇ chain by tissue-specific expression.
  • Dischenne muscular dystrophy is an X-linked recessive monogenic disease caused by a deficiency in dystrophin due to mutations in the dystrophin gene (Hoffman et al., Cell, 51: 919-928, 1987). ).
  • dystrophin is a cytoskeletal protein, supplementation by direct administration is impossible, and gene therapy is expected.
  • the dystrophin gene spans about 2.3 Mb for the full-length genome and 14 kb for cDNA.
  • full-length cDNA can be introduced, but the reduction of the expression level is a challenge (Liu et al., Mol. Ther., 4:45, 2001; DelloRusso et al., Proc Natl). Acad Sci USA, 99: 12979-12984, 2002).
  • the introduced DNA size is limited to about 4.9 kb or less, so the full-length gene cannot be introduced, and an immune reaction is caused in a gene introduction experiment into skeletal muscle, resulting in decreased expression of the transgene product. (Yuasa et al., Gene Therapy, 9: 1576-1588, 2002).
  • the method of the present invention it is possible to produce a HAC solid that has introduced a genomic region encoding a dyst mouth fin.
  • the method of administration to the patient is not particularly limited, the above-mentioned HAC vector is transferred into human cells (for example, but not limited to autologous normal human myoblasts), and is transferred to affected patients. By transplanting, dystrophin supplementation by physiological tissue-specific expression can be performed.
  • E-4 Although the target disease is not particularly limited, for example, the following single gene diseases: ⁇ -1 antitrypsin deficiency, cystic fibrosis (CFTR), chronic granulomatosis, Familial hypercholesterolemia, Fanko 12 anemia, Gaucher disease, Hunter syndrome, ornitine trans-forced ruvalamylase deficiency, prins nucleotide phosphorylase deficiency, AD A— SC ID, leukocyte adhesion deficiency, C ana van disease, brain In the atrophy of beam, Fabry disease, amyotrophic lateral sclerosis, lysosome disease, von Willebrand disease, thalassemia, etc.
  • CFTR cystic fibrosis
  • Familial hypercholesterolemia Fanko 12 anemia
  • Gaucher disease Gaucher disease
  • Hunter syndrome ornitine trans-forced ruvalamylase deficiency
  • prins nucleotide phosphorylase deficiency
  • the method is not particularly limited, it is possible to supplement and complement the defective molecule by, for example, transferring it to a human cell and transplanting it into a patient.
  • NBI National Center for Biotechnology Information
  • TPO Thrombopoietin
  • the HAC vector into which the TPO genome is introduced by the method of the present invention is prepared and the administration method to a patient is not particularly limited, it is transferred to a human cell, for example, a cell of a production tissue, and is physiologically tissue-specific. It is possible to suppress the production of autoantibodies by expressing and supplying TPO. In addition, the above can reduce the number of regular visits and improve the patient's QOL.
  • EPO Erythropoietin
  • F-2 Erythropoietin
  • EPO Erythropoietin
  • HA C vector is transferred to human normal fibroblasts and transplanted into a patient to express and supply EPO in the patient. Is possible.
  • the HAC vector into which the EPO genomic region is introduced is prepared by the method of the present invention, and the administration method to the patient is not particularly limited, but it is transferred to human cells, for example, cells of the production tissue. It is possible to express and supply EPO in a physiological tissue-specific manner. In addition, the number of regular visits can be reduced and patient QOL can be improved.
  • Parkinson's disease is a neurological disorder in which motor function is impaired by progressive degeneration of dopamine-synthesizing cells in the substantia nigra substantia nigra.
  • One of the treatments is L-DO PA administration for the purpose of replacing deficient dopamine, but there are problems such as a decrease in drug efficacy in moderate or higher symptoms and QOL restriction / dose reduction of patients due to side effects. Exists. These issues are caused by the fact that dopamine concentrations are not constant in the linear body and that the administered L-DO PA acts outside the linear body, and therefore, a constant physiological expression of dopamine in the linear body is required. (Takeda et al., Medical Science Digest, 29:20, 2003, New Science, Inc.).
  • a HAC vector into which an enzyme group involved in dopamine synthesis or a GDNF genomic region has been introduced can be produced.
  • the administration method to the patient is not particularly limited, the above H ⁇ C vector is transferred to a human cell (eg, normal human neural stem / precursor cell) and transplanted to the affected person. It is possible to supplement the introduced gene product by physiological tissue-specific expression.
  • Insulin-dependent diabetes mellitus is being treated with recombinant protein preparations. Chronic illness requires regular hospital visits and is an obstacle to patient quality of life. In addition, the production of recombinant protein preparations is very costly, resulting in high medical costs. Insulin blood levels are not optimal, so too much or too little can cause side effects and sometimes life-threatening. In addition, research on gene therapy has been carried out, but control of insulin concentration in the body has become an issue (Moriya et al., Protein Nucleic Acid Enzyme, 40 ⁇ : 2764, 1959, Kyoritsu Publishing).
  • the HAC vector into which the insulin genome is introduced by the method of the present invention is prepared and the administration method to the patient is not particularly limited, it is transferred to a human cell, for example, a cell of a production tissue, and is physiologically tissue-specific. It can be expressed and supplied to ... In addition, the above can reduce the number of regular visits and improve the patient's QOL.
  • the target disease is not particularly limited.
  • brain tumor peripheral artery disease (ischemia, etc.), chronic indirect rheumatism, arterial restenosis, elbow tunnel syndrome, coronary artery disease, Alzheimer's disease, ulcer , Pelvic fractures, renal diseases, malignant tumors, etc.
  • HAC betaters containing genes encoding substances thought to be necessary for disease healing are produced, and the method of administration to patients is particularly limited
  • Non-human animal having transgenic animal production vector and HAC vector The HAC vector produced by the method of the present invention can be used as a transgenic animal production vector.
  • the foreign gene is The present HAC vector can be transferred to mouse embryonic stem cells to produce chimeric individuals.
  • the transferred foreign gene can be functionally expressed in the individual, and the present HAC vector containing the foreign gene can be stably maintained in the chimeric individual and transmitted to the next generation via the germline.
  • this HAC vector containing a foreign gene can be used to create a cloned susceptor by somatic cell nuclear transfer in accordance with the method of Kuroiwa et al. Function can be expressed in an individual.
  • an animal having the HAC of the present invention can be obtained by a known method (for example, International Publications WO 9 7/0 76 71 1, WO 03/04 1 49 5 and WO 03/09 78 filed by the present applicant).
  • the animal species is not particularly limited, but preferably includes mammals, and particularly preferably rabbits, goats, pigs, sheep, dogs, rats, mice, monkeys, and the like.
  • telomere type 14HAC or “14 ⁇ qHAC”
  • telomere type 14HAC or “14 ⁇ qHAC”
  • telomere's short subtelomer type HAC or “14NA qHAC”
  • telomeric sequence and a subtelomeric sequence of about 60 Kb derived from human chromosome 14 are added to the distal long arm.
  • a human HAC vector hereinafter referred to as a recognition site for site-specific recombinase.
  • Telomeres / long subtelomer type HAC or “l 4 g NA qHAC” were prepared, and their stability and expression of introduced foreign genes were confirmed.
  • telomere type 21 HAC or “2 l AA qHACj”
  • telomere type 21 HAC or “2 l AA qHACj”
  • telomere / subtelomer type HAC in which a recognition site for a site-specific recombinase was inserted was prepared.
  • telomere truncation vector p TE L puro t 1 construction human 1 telomere truncation vector (targeting vector) to remove the long arm of chromosome 4 is p TE L puro (Kuroiwa et al., Nature Biotech. (USA), Vol. 18, p. 1086-1090, 2000) was used.
  • a target sequence for telomere truncation vector insertion was designed from the base sequence of the long arm of chromosome 14 (registration number AL 3 9 1 1 56) obtained from the Gen B ank database.
  • the sequence of a primer oligonucleotide to which a restriction enzyme recognition sequence has been added for PCR amplification is shown below:
  • 10657F 5'-CAAGTTTGGTGACTCGAGGAAGAT (SEQ ID NO: 3).
  • Genomic DNA was extracted using (Gentra System). This genomic DNA was used as a saddle type, and the recombination target sequence was amplified by PCR using the above primers. About 0.1 ⁇ g of genomic DNA was used as a saddle type, and in accordance with Innis et al. (PCR Experiment Manual, HBJ Press, 1991), the thermal cycler was Gene Am p 9 700 (Applied Biosystems) was used for PCR.
  • Taq polymerase is LA T aq (Takara Shuzo).
  • the reaction conditions are 94 ° C for 1 minute, denaturation 98 ° C for 5 seconds, annealing / extension 72 ° C for 10 minutes for 3 cycles, denaturation 98 ° C for 5 seconds.
  • Amplification product of 2.9 kb by 7791 FNhelZl 0680R was amplified by restriction enzyme N he I and X ho I to 3.9 kb by 10657 F (Xho I) / 14620Rb amH I
  • the product was digested with restriction enzymes Xho I and BamHI (Roche), and the DNA fragments having protruding ends were separated and purified by agarose gel electrophoresis. This was cloned into pTEL puro plasmid, X ba I-BamH I size.
  • the final pTEL puro—t 1 construct is approximately 12.8 kb.
  • Figures 2 and 3 show telomere truncation vectors, target sequences, and chromosome alleles generated by homologous recombination.
  • DT 40 hybrid cells retaining human chromosome 14 were prepared by the microcell method using the above A 9 c 1.1-14 c hr cells retaining the chromosome as chromosome donor cells.
  • D T 40 a chromosome recipient cell, is registered with the Japanese Collection of Research Bioresources (J CRB) as registration number J CRB 2221 and is available. The following outlines the preparation method.
  • microcells were prepared from about 1 ⁇ 10 8 A 9 cll-14 chr cells. 2) A9 cll -14 chr cells cultured to 12% cell culture density (about 80% saturation) in 12 5 cm 2 centrifuge flasks (NUNC) Micronuclei were induced by culturing for 48 hours in the culture medium (20% urchin fetal serum; FBS, 0.8 mg / m 1 G418, D MEM). In the examples, DMEM manufactured by Nissan Pharmaceutical was used.
  • cytochalasin B 10 ⁇ g / m 1, sigma in DMEM
  • DMEM serum-free medium
  • SWI NNEX-25 SWI NNEX-25 equipped with filters (Watman) with pore sizes of 8 ⁇ m, 5 / zm, 3 / zm. did.
  • the purified microcell was resuspended in DMEM 6 ml.
  • DT40 cells were cultured in RPM 1 1640 medium containing 10% FBS, 1% CS (baby sera), 0. ImM 2-ME, and then washed twice with DMEM. Seven 1 X i 0 were resuspended in DMEM5m1. The microcell suspension was centrifuged at room temperature and 1 500 rpm for 5 minutes, and after DT40 cell suspension was layered on this, it was centrifuged at room temperature and 1 500 rpm for 5 minutes to remove the supernatant. Fusion treatment was carried out with polyethylene glycol (PEG) 1: 1.4 solution (Tomizuka et al., Nature Genet. (USA), Vol. 16, p.133-143, 1997) for 90 seconds.
  • PEG polyethylene glycol
  • RPM I 1640 culture medium manufactured by Invitrogen
  • FBS fetal bovine serum
  • C h S fetal bovine serum
  • ME 2-mercaptoethanol
  • Region present on human chromosomes 1 and 4 by PCR analysis NEK 2 P; -LOC 1 2 2 72 7, AL 3 90 7 98, AL 1 2 1 8 20, AL 1 5 78 58, AL 1 3 7 1 90, AL 1 3 7229, I GHMC, IGHV 3, and AB 0 1 94 3 7 were confirmed, and fluorescence in situ hybridization using the human specific probe Cot 1 (Gibco BRL) ( FI SH analysis confirmed and obtained clones DT 40 (-14) 1-2 and DT40 (-14) 2-4, which retain one copy of human chromosome 14.
  • p TE L puro-tl construct was linearized by digestion with the restriction enzyme S rf I and introduced into DT 40 hybrid cells carrying human chromosome 14.
  • Puromycin Puromycin (Puroraycin dihydrochloride, Sigma) was added to a final concentration of 0.3 ⁇ gZm 1 after 24 hours, and resistant colonies appeared after 2 to 3 weeks.
  • DT40 (-1 4) 1-2 a total of 2 76 drug-resistant colonies from 2 transfections
  • DT40 (-1 4) 2-4 a total of 294 drug resistances from 4 transfections. Colonies were isolated and expanded for further analysis.
  • Fig. 3 the position of the gene or genomic region primer oligonucleotide designed based on the nucleotide sequence obtained from the Gen Bank database is shown in Fig. 3 (the primer is indicated by an arrow in the figure), and the sequence is shown below:
  • NEK2PR 5'-TCTTTGCTCTTCTGCAACCA (SEQ ID NO: 10)
  • L0C122727F 5 '-CGATCAGAATGGGAAACCAG (SEQ ID NO: 1 1)
  • L0C122727R 5 '-TTGTCGCTGGAATTTGTTGA (SEQ ID NO: 1 2)
  • IGHV3F 5'- AGTGAGATAAGCAGTGGATG (SEQ ID NO: 15)
  • IGHV3R 5 '-CTTGTGCTACTCCCATCACT (SEQ ID NO: 16)
  • the primer for the S T S marker D 14 S 282 was a known one.
  • PCR amplification (Innis et al., Supra) was carried out on a total of 7 species of the above 6 genes or genomic regions and the D 14 S 272 marker using approximately 0.1 X g of genomic DNA as a saddle type.
  • T aq polymerase is EXT aq (Takara Shuzo). The reaction conditions are 94 ° C for 5 minutes, denaturation 94 ° C for 15 seconds, annealing at 56 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 30 seconds for 35 cycles. It was.
  • Southern blot analysis was performed as a screen for selecting homologous recombinants.
  • a probe was set within the target sequence for homologous recombination (Fig. 4).
  • the probe was a pair of oligonucleotide primers shown below, and A9 cl l-14 c hr cell genomic DNA carrying human chromosome 14 was amplified by PCR, isolated and purified:
  • Non-recombinant was 1 1. l k b, and a total of 6 homologous recombinants were confirmed from 6 candidates. '
  • FI SH analysis was performed according to the method described by Matsubara et al. (FI SH Experimental Protocol, Shujunsha, 1 94), and PGK — puro fragment labeled with human-specific Cot 1 (Invitrogen) and FI TC. Prepared by excising from TE L puro vector) was used as a probe.
  • two FITC signals were detected at the end of the long arm of shortened human chromosome 14 and the shortened human chromosome 14 stained with Cot 1.
  • a typical F I SH image is shown in Figures 6a and b.
  • the white arrow indicates the full-length human chromosome 14 before telomere attraction
  • Fig. 6b the white arrow indicates the human chromosome 14 fragment from which the long arm is distant. From the relative size of the host DT 40 cell relative to the chromosome, it was confirmed that human chromosome 14 was shortened.
  • the 6 puromycin-resistant strains (1 2 t 9 7, 1 2 tl 34, 1 2 tl 5 9, 1 2 t 20 1, 1 2 t 225, and 24 t 8) It was confirmed that it retains an artificial chromosome (14AA qHAC) with a telomeric sequence at the end, shortened by deleting the number arm with its long arm.
  • pSFl 3 Vector 1 contains the restriction enzyme Xhol (Roche) and Sail (from the CMV / B sd (Invitrogen)) to the Xhol site of the pSFl plasmid.
  • SNESPF1 inker AS GGCCGGCCTTAATTAAGCCCGGGCGATATCGCTAGCGTAGAC (SEQ ID NO: 1 7 9)
  • the final construct size is about 13.4 kb.
  • Targeting vectors, target sequences, and chromosomal alleles resulting from homologous recombination are shown in FIGS.
  • the construct thus obtained is referred to as a tlp p Fl vector.
  • the cells prepared by the mouth-opening were suspended in RPMI 1 640 medium containing 10% FBS, l% Ch S, 0.1 mM 2 — ME, and 96 Seeded 2.0 plate of hole plate (Falcon). 2 Blasticidin to reach a final concentration of 8 ⁇ g / m 1 after 4 hours
  • the presence of two target sequences on the 5 'and 3' sides was detected by the PCR method using the genomic DNA of a blasticidin resistant strain as a cocoon type.
  • Two target sequences (indicated as S a 1 I-S a 1 I sequence and P ac I -F se I sequence in Fig. 7), respectively, are sandwiched between these oligonucleotides on the chromosome and on the targeting vector, respectively.
  • a primer pair was designed. The position is indicated by an arrow in FIG. The sequence is shown below:
  • AL39 48691F 5 '-GCAGTGACAGAAGTCCATGTTGAACTGTAC (SEQ ID NO: 2 3)
  • ApallongFwl 5 '-CACAGCAACCACAGTGCTTCTTGATGAG (SEQ ID NO: 24)
  • ApallongRvl 5 '-TCCAGAAGTGTTGGTAAACAGCCCACAA (SEQ ID NO: 25)
  • the T a q polymerase was LA T a q (Takara Shuzo), and the reaction conditions were as follows. 5 'genome analysis; 94 ° C after 1 minute, denaturation 98 ° C for 5 seconds, false extension 7 2 ° C, 10 minutes for 3 cycles, denaturation 98 ° C for 5 seconds, false extension at 70 ° C Two cycles of 10 minutes, denaturation 98 ° C for 5 seconds, ringing / extension 68 ° C 25 minutes for 10 minutes, elongation 72 ° C for 10 minutes.
  • AL39 46181F 5 '-AAGACACCAGGGAGTAACCT (SEQ ID NO: 2 7)
  • genomic DNA extracted from 12 strains obtained in the primary screening was screened with restriction enzymes Stu I and Roschno, and Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 1994), Southern blot analysis was performed. The signal that the probe labeled with 32 P was hyper-purified was detected with an image analyzer Typhoon 92 10 (Molecular Dynamics). Representative results are shown in FIG.
  • the restriction enzyme fragment length predicted from the nucleotide sequence is 24.6 kb for the homologous recombinant and 18.2 kb for the wild type (non-recombinant) for both the 5'genome and 3'genome analyzes. It is. A total of 7 homologous recombinants were confirmed from 2 to 2 blasticidin resistant strains.
  • microcells were prepared from about 1 0 nine DT 40 hybrid cells.
  • Cell density is 60 DT40 hybrid cells cultured to ⁇ 70% saturation are cultured in a culture solution containing colcemid (0.05 / ig gm Invitrogen) (10% FBS, 1% Ch S, 0.1 mM 2-Merca)
  • colcemid 0.05 / ig gm Invitrogen
  • Micronuclei were induced by culturing for 13 to 18 hours in putethanol, RPM I 16 40).
  • Cells were collected by centrifugation, resuspended in serum-free DMEM, and seeded into two 25 cm 2 centrifuge flasks (Nunks) previously coated with poly-L-lysine.
  • the presence of 2 target sequences on the 5 'and 3' sides was detected by the PCR method using the genomic DNA of the blasticidin resistant strain as a saddle type.
  • the method was performed according to Example 1 (2-3) above. Twenty out of 22 blastcidin-resistant CHO cells obtained gave an amplification product of the size expected from the nucleotide sequence (5 'genome approximately 5 kb and 3' genome approximately 2 kb). confirmed.
  • F I SH analysis was performed using human-specific C o t 1 (Invitrogen) as a probe according to the method described by Matsubara et al. (F I SH experimental protocol, Shujunsha, 11994).
  • F I SH experimental protocol Shujunsha, 11994.
  • a total of 8 strains (1 2 t 9 7 S 1-derived strain; _ 1, 1 2 t 9 7 S 38-derived 4 strains; _ 3, — 6 , — 8, 1, 9, 1 2 t 1 34 S 2 origin 3 strains; 1, 3, 5, 1 6), normal karyotype and most of the observed mitotic images, 1 copy of 14 ⁇ stained with Cot 1 q HAC vector was detected.
  • FIGS. 12A and B A typical F I SH image and the karyotype of the 14 ⁇ q H AC vector are shown in FIGS. 12A and B, respectively. From the above experiments (3-1) to (3-4), it was confirmed that the resulting 8 blasticidin-resistant CHO strains retained the 14 A ⁇ q HAC vector.
  • Example 2
  • CHO cell line For CHO cell line, inoculate 5.0 x 10 5 cells in a 10 cm dish, count cells cultured to a cell density of 80-90% saturation, and re-add 5.0 x 1 0 5 cells to 1 The seeds were sown on a 0 cm diameter dish and continued until passage 10. The cell doubling number was calculated by counting the number of cells at each passage. Ji? For 10 cell lines, cells were collected after passage 10, and chromosome samples for FISH were prepared.
  • “2 1 A qHAC” is the HAC vector derived from human 21 chromosome (WO 2004/03 1 385 pamphlet) and “14AA qHAC” is the HAC vector prepared in Examples 1 and 2.
  • ⁇ 14NA qHAC (G) '' is the result of the HAC vector prepared in Examples 6 and 7, and ⁇ 14 g NA qHAC (g) '' is the result of the HAC vector prepared in Examples 12 and 13. Indicates.
  • the 14 ⁇ qHAC vector was stably maintained in C H O cells after long-term subculture. Observation of metaphase chromosome images revealed 1 to 2 signals per cell.
  • the 14 ⁇ qHAC vector constructed in Example 1 is inserted into the hEPO gene expression unit. Specifically, hEPO expression plasmids containing 1 o XP sequences were prepared, and the recombination enzyme was transiently expressed to artificially perform site-specific recombination between 1 o XP sequences. Insert into the chromosome. Selection of recombinant inserts was based on the acquisition of G4 18 resistance (reconstruction of promoter-division type neo-resistance gene expression unit). An outline is shown in Fig. 14. CHO hybrid cells (t 7 S 1 carrying the 14 1 ⁇ qHAC vector prepared in Example 1
  • H o PO expression containing 1 o XP sequence Plasmid p LN l— EPO (Kakeda et al., Gene Therapy; 12: 852— 856, 2005) 10 ⁇ g and Cre enzyme expression vector p BS 1 8 5 (Lifetech) in the presence of 10 ⁇ g
  • the electric mouth position was performed using Gene Pulser II (Bio-Rad).
  • a 450 V capacitor was applied at 450 V and discharged using an electroporation cell with a distance between electrodes of 4 mm.
  • the electroporated cells were seeded in five 48-well tissue culture plastic dishes (Falcon) containing F 12 medium (Invitrogen) supplemented with 10% FBS. Two days later, the medium was replaced with a medium containing 0.8 g / ml G4 18 (GENETICIN, Invitrogen). After 2 to 3 weeks, 4 1 8 resistant colonies appeared, 1 1 3 in total (6 derived from t 7 S 1—1, 70 derived from t 7 S 38—6, derived from t 7 S 38—8 3 7 ) Colonies were isolated and expanded for further analysis.
  • the selection of the hE PO gene expression unit recombinant insert was carried out by determining whether or not it was inserted into the 1 o XP sequence site on the 14 ⁇ qH AC vector on the p LN 1-E PO vector and the 1 o XP sequence site.
  • the primers SVpANp 1 and Neo Rp 2 designed on the ⁇ HAC vector, and the inserted hEPO gene were transferred to the M 13 RV and Neo R p 2 primers on the plasmid vector p BS 226. This was confirmed by PCR amplification.
  • the primer sequence and PCR were according to the method of Kakeda et al. (Kakeda et al., Gen Therapy; 12: 852-856, 2005).
  • hEPO gene expression in the culture supernatant was quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method).
  • F I SH analysis was performed according to the method described by Matsubara et al. (F I SH experimental protocol, Shujunsha, 1 994) using human-specific C o t 1 (Invitrogen) as a probe.
  • F I SH experimental protocol Shujunsha, 1 994
  • human-specific C o t 1 Invitrogen
  • Example 3 Three CH 2 O 3 hybrid cells obtained in Example 3 (t7S38-6E25, t7S38-6E34, t7S38-8.E5) were used.
  • the non-selective culture medium was F 12 medium containing 10% FBS, and the selective culture medium was added with 8 ⁇ g / m 1 of blasticidin.
  • CHO cell line For CHO cell line, inoculate 5.0 x 10 5 cells in a 10 cm dish, count cells cultured to a cell density of 80-90% saturation, and re-add 5.0 x 1 0 5 cells to 1 The seeds were sown on a 0 cm diameter dish and continued until passage 10. The number of cells was counted at each passage to calculate the population doubling number. 110 cells were recovered after 10 passages, and hEPO gene expression and FISH analysis were performed.
  • hEPO gene was quantified by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method) for hEPO protein produced in the culture supernatant.
  • the three CHO hybrid cells carrying the h E P 0-1 4 ⁇ qH AC vector that had been subcultured for a long time in the above (1) were performed according to the method of Example 3 (2).
  • Figure 18 shows the average of the results of experiments performed in duplicate.
  • Clones 6E25, 6E34 and 8E5 shown in FIG. 18 represent t7S38-6E25, t7S38-6E34 and t7S38-8E5, respectively. .
  • hEPO- 14 ⁇ q HAC vector was stably maintained in CHO cells after long-term subculture. Observation of metaphase chromosome images revealed 1 to 2 signals per cell.
  • the hEPO-14A ⁇ q HAC vector was found to be stably maintained in non-selective culture conditions in CHO cells after long-term subculture. It was clarified that the number of copies of each sample was maintained and that the expression of hEPO gene was maintained.
  • chromosome donor cells Among the CHO cell lines carrying the hEPO—14 4 ⁇ q HAC vector obtained in Example 3 as chromosome donor cells, clones with high micronucleation ability (t 7 S 3 8— 6 E 2 5, t 7 S 3 8-6 E 3 4 and t 7 S 3 8— 8 E 5) were used.
  • a chromosome recipient cell human normal fibroblast HF L-1 (obtained from RIKEN Cell Materials Development Office, registration number RCB 0 5 2 1) was used.
  • microcells were prepared from about 10 7 t 7 S 3 8 — 6 E 2 5 or t 7 S 3 8 — 8 E 5 cells.
  • the cells were cultured in a culture solution (20% FBS, 0.8 mg / m 1 G 4 18, F 1 2) containing colcemid (0.1 ⁇ gZm 1, Invitrogen) for 3 days. Induced. After removing the medium, fill the centrifuge flask with a solution of cytochalasin B (10 / ig / ml in Sigma, Sigma) that has been kept warm (37 ° C) in advance.
  • Lasco was inserted and centrifuged at 34 ° C, 8, 00 rpm for 1 hour.
  • the microcell is suspended and collected in serum-free medium (DMEM), and SW I NNE X—25 (Millipore) equipped with a filter (Watman) with a pore size of 8 / m, 5 ⁇ m, 3 / zm is used. And purified by filtration.
  • the purified microcell was resuspended in 2 ml DMEM containing 50 ⁇ g Zm 1 phytohemagglutinin P (Difco).
  • HFL 1 cell cultured to 90% saturation 25 cm 2 Culture flask (Falcon) 2 purified micronuclei cells were added to 2 tubes and allowed to stand at 37 ° C for 15 minutes, then 4 5 % Polyethylene glycol 1 5 0 0 (PEG 1 5 0 0, F) Fusion was carried out with DMEM solution containing 10% DMSO (Sigma) for 1 minute. After culturing in DMEM medium containing 20% FBS for 24 hours, the cells were dispersed by trypsin treatment and seeded on two 48-well plastic plates for tissue culture (Falcon) coated with collagen I. One day later, the medium was replaced with selective medium (20% FBS, DMEM) containing blasticidin (3 gZm l).
  • the selective culture was performed for about 4 weeks.
  • the emerged drug-resistant colonies were isolated for further analysis.
  • 1 micro-nuclear cell fusion from 28 times (t 7 S 38— 6 E 25; 1 3 times, t 7 S 38-6 E 34; 2 times, t 7 S 38— 8 E 5; 1 3 times) (T 7 S 38-6 E 2 5 origin; 56, t 7 S 38-6 E 34 origin; 26, t 7 S 38-8 E 5; 56) were obtained.
  • the chromosome donor cells and the t 7 S 38 — 6 E 25 cells were used.
  • the cells were hereinafter referred to as t 25 H cells, and the cells obtained using the cells were hereinafter referred to as t 5 H cells.
  • the human chromosome was assigned to the STS marker D 2. It confirmed by PCR amplification using the primer of S1334 according to the method of Kakeda et al. (Kakeda et al., Gene Therapy; 12: 852-856, 2005). In addition, the presence or absence of contamination of chromosome-donated CHO cells was confirmed by PCR amplification using CHO furin gene-specific primers furin 3'subF and furin EX 6-28R. The designed primer sequences are shown below:
  • furinS 'subF 5'-ACTCAGAGATCCACTGCACCAGGATCCAAGGGAGG (SEQ ID NO: 3 1) furinEx6-28R_short CTACACCACAGACACCATTGTTGGCTACTGCTGCC (SEQ ID NO: 32) 32 cycles were performed.
  • amplification of about 1.0 kbp with primers SVpANp 1 and Neo R p 2, D 2 S 1 3 Amplification of about 0.6 kbp by 34 primers and no amplification by furin 3, sub F and furin E x 6—28 R are expected.
  • the expected amplification in 7 (t 5H3, 4, 2 6, 2, 27, 28, 29, t 25 H 2) from the 38 blastcidin resistant strains obtained in (1-1) above was achieved. confirmed.
  • FI SH analysis was performed according to the method described by Matsubara et al. (FI SH Experimental Protocol, Shujunsha, 1994). Human 14th and 22nd chromosome specific ⁇ -satellite DNA probes (Q-Biogene, Funakoshi) ) was used. Analysis of 3 of the blasticidin resistant strains (t 5H3, 26, 28) revealed that 3 strains (t 5H3, 26, 28) were normal karyotypes and most of the observed mitosis 1 Signals were detected at four locations in the paired human chromosomes 14 and 22 centromeric region and at one location from one copy of the 14 ⁇ q HAC vector. The results are shown in Figure 2 OA and B.
  • hEPO gene was quantified by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method) for hEPO protein produced in the culture supernatant.
  • Each of the 4 blasticidin-resistant HF L_ 1 cell lines carrying the hE PO-14 ⁇ qHAC vector isolated in (1) above contains approximately 10 5 cells each containing blastcidin (3 ⁇ g / m 1).
  • a selective medium (20% FBS, DMEM) was seeded in a plastic petri dish (Falcon) for 24-well tissue culture coated with collagen I in 1 ml. After reaching confluence, the cells were cultured for 7 days, replaced with fresh medium, and further cultured for 24 hours. The supernatant was collected and the number of cells was counted.
  • hEPO in the culture supernatant was quantified using the hE PO ELI SA kit (Quantikik IVD Human EP0 I unoassay, R & D system). Figure the results 2 1 “1 4A- HACJ item”.
  • XP sequence insertion vector includes K pn I * (site crushing sequence) -S in the plox Pu p BSD (WO 00/1 0 38 3) K pn I site rfl -P acl -Pm l I—plox P up B SD-PGK with a Kp nl linker inserted was used.
  • the base sequence of the above-mentioned Kp n I * -S r f I—Pac l—Pm l l—Kp n l linker is shown below:
  • IGHV7-81FW 5 '-GCCATGTCCTCAGCCTTTAG (SEQ ID NO: 40)
  • IGHV7-81RV 5'- CTGGAGCATCCTCTTCTTGG (SEQ ID NO: 4 1)
  • T aq polymerase is LA T aq (Takara Shuzo)
  • reaction conditions are 94 ° C for 1 minute, 94 ° C for 30 seconds, annealing 60 ° C for 30 seconds, elongation 7 2
  • the test was carried out at 30 ° C for 30 cycles and an extension of 70 ° C for 10 minutes.
  • KS linker S 5 '-[Phosp] CCCGCATG (SEQ ID NO: 43)
  • KS linker AS 5 '-[PhospjCGGGGTAC (SEQ ID NO: 44)
  • the 3 'region (cen side) 4.0 kb is digested with restriction enzyme Eco RI from pUC 18 containing the Tel target sequence (total of about 9.5 kb). After subcloning, digestion with restriction enzyme Hind III, blunt-ended, and further digestion with restriction enzyme BamHI and purification, p 5 o containing the 5 'region (te 1 side) 4.4 kb It was cloned into the N he I— Eco RV site of the XP up BSD—PGK vector. The final p 1 o x p PGK-1 4 q t e 1 construct size is about 15.7 kb.
  • the plo x p PGK—14qtel vector is shown in FIG. 22, and the target sequence and the chromosomal allele resulting from homologous recombination are shown in FIG.
  • p 1 o X p PGK-1 4 The qtel construct is linearized by digestion with the restriction enzyme S rf I to make DN A, and DT 4 holds human chromosome 14. ⁇ Hybrid cells were introduced into DT40 (# 14) 2-4. Selective culture was performed with blasticidin (final concentration 8 ug Z ml), and drug-resistant colonies appeared after 2-3 weeks. A total of 480 blasticidin-resistant colonies were isolated from two transfections and grown for further analysis.
  • PGK longRvl 5'- ACTTCCTGACTAGGGGAGGAGTAGAAGGTG (SEQ ID NO: 46)
  • Bsd longRv2 5 '-AGTGGGCAGTTTACCGTAAATACTCCACCC (SEQ ID NO: 4 7)
  • the restriction enzyme fragment length predicted from the nucleotide sequence is 14.0 kb for the homologous recombinant in the 5 'target sequence
  • wild type Non-recombinant
  • 3 'target sequence is 7.4 kb for homologous recombinant
  • 9.0 kb for wild-type (non-recombinant) from 3 candidate strains
  • a total of 2 strains (24G8, 24G94) homologous recombinants were confirmed.
  • 1 o XP sequence insertion vector (targeting vector 1) includes F sel * (sequence that crushes the site) at the F sel site of plox P d own PURO (WO 00Z10383).
  • F sel * sequence that crushes the site
  • Loxpdownhyg fsel S 5 '-CCCACGTGTTAATTAAGCCCGGGCATCCGG (SEQ ID NO: 53)
  • Loxpdownhyg fsel AS 5 '-ATGCCCGGGCTTAATTAACACGTGGGCCGG (SEQ ID NO: 54)
  • the primer oligonucleotide sequence with restriction enzyme recognition sequence for PCR amplification is shown below:
  • the reaction conditions for the 5 'target sequence are 94 ° C min followed by denaturation 98 ° C 5 sec, annealing / extension 72 ° C 10 min 3 cycles, denaturation 98 ° C 5 sec, annealing Z extension 70 ° C. for 10 minutes for 2 cycles, denaturation at 98 ° C. for 5 seconds, annealing at 68 ° C. for 10 minutes for 30 cycles and extension at 70 ° C. for 10 minutes.
  • the reaction conditions for the 3'-side target sequence are 94 ° C for 1 minute, denaturation 98 ° C for 5 seconds, annealing / extension 7 3 cycles at 2 ° C for 6 minutes, denaturation 98 ° C for 5 seconds, annealing / extension 70 Two cycles of ° C 6 min, denaturation 98 ° C 5 sec, annealing / extension 68 ° C 6 min 30 cycles, extension 70 ° C 10 min.
  • the 2.0-kb amplified product for the 3'-side target sequence was digested with FseI and PacI and cloned into the FseI-Pacl site of the p1OxPdownPURO-HYG vector.
  • the 5 ′ target sequence 5.
  • O kb amplification product was digested with the restriction enzyme S a 1 I, and p 1 ox P d own PURO—HYG vector S a having the above target sequence of 2.0 Kb. 1 Cloned to I site.
  • the final size of p 1 o X PHYGOR / n 1 is about 16.1 kb.
  • FIG. 26 shows the p 1 O X PHYGOR / n 1 vector
  • FIG. 27 shows the target sequence and the chromosomal allele resulting from homologous recombination.
  • oligonucleotide primer pairs were designed on the chromosome and the targeting vector, respectively. The position is indicated by an arrow in FIG. The sequence is shown below:
  • HygpAFl 5 '-CGTCTGTGGCTGCCAAACAC (SEQ ID NO: 6 1)
  • AL39 56194R 5 '-TAGTCTCTCTGGATGAATATCAGCAAAACT (SEQ ID NO: 6 2)
  • AL39 46181F 5 '-AAGACACCAGGGAGTAACCT (SEQ ID NO: 6 3)
  • AL39 56451F 5 '-GGAATAGGGATTAGGAAATG (distribution number 6 5)
  • Example 1 the C re expression vector pCAGGS—Cre was applied to the 24 G 8 n 7 and 24 G 94 nl 8 and 24G 94 n 56 cells obtained in Example 6 (2). Introduced. Selective culture was performed with hygromycin (final concentration 1.2 5 mgZml), and drug-resistant colonies appeared after 2 to 3 weeks.
  • a deletion between the second 1 o XP sequences of the hygromycin resistant strain genomic DNA was confirmed by PCR.
  • a pair of oligonucleotide primers was designed on the chromosome and on the targeting vector, taking into account the 1 o XP sequence remaining after the long arm distal deletion. The position is indicated by an arrow in Figure 3 OA. The sequence is shown below:
  • D PGK Fwl 5 '-GGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTC (SEQ ID NO: 6 7)
  • T aq polymerase is E x T aq (Takara Shuzo).
  • the reaction conditions are 94 ° C for 1 minute, denaturation 94 ° C for 15 seconds, annealing 60 ° C for 30 seconds, extension 72 ° C for 1 minute for 3 5 cycles I went there. If the distal long arm is deleted due to a deletion between the LoXP sequences, an amplification of approximately 0.8 kb is expected.
  • amplification products that can be predicted were obtained in 16 out of 54 strains resistant to hygromycin derived from the above 24 G 8 n 7 cells, and in all 20 pools derived from 24 G 94 n 18 and 24 G 94 n 56 cells. confirmed.
  • Genomic DNA was extracted from 16 pools derived from 24 G 8 n 7 cells and 20 pools derived from 24 G 94 n 18 cells and 10 pools derived from 24 G 94 n 56 cells obtained in the first screening Example 6 ( Same as 1-4). Restriction enzyme (Roche) digestion was performed with B st E I I (5 'side) or Stu I (3' side). A typical result is shown in FIG. The restriction enzyme fragment length predicted from the nucleotide sequence is 7.6 kb for the recombinant in the 5 ′ target sequence, 14.
  • FI SH analysis was performed in human specific Co t 1 (Invitrogen) and Example 6 (1-1) according to the method described in Matsubara et al. (FI SH experimental protocol, Shujunsha, 1994).
  • An approximately 4.2 kb 5 ′ target sequence fragment which was digested with the restriction enzyme Hind II from the ploxp PGK-14 qtel vector prepared, excised and purified, was used as a probe.
  • 4 clones derived from 24 G 8 n 7 cells (GS n TA c ZZc SZd lZ d 4) and 4 pools derived from 24 G 94 n 56 cells (G94 n 56 Ap 2 l /) obtained in (3-3) above.
  • the 3 'target sequence was designed from the base sequence of the long arm of human chromosome 14 (registration number AL 3 9 1 1 56) obtained from the Gen Bank database.
  • the primer oligonucleotide sequence for PCR amplification is shown below:
  • the 3 ′ target sequence was amplified by PCR using genomic DNA extracted from A 9 c 11-14 c.hr cells carrying human chromosome 14 as a cocoon. This approximately 5.0 kb DNA fragment is converted into the restriction enzyme F s e I
  • oligonucleotide primer pairs were designed on the chromosome and on the targeting vector, respectively. The position is indicated by an arrow in FIG. The sequence is shown below: 550F: 5 '-CATTCATGGTAGTCATTGGTGCTGTTCTCC (SEQ ID NO: 7 1)
  • ApallongFwl 5 '-CACAGCAACCACAGTGCTTCTTGATGAG (SEQ ID NO: 72)
  • ApallongRvl 5 '-TCCAGAAGTGTTGGTAAACAGCCCACAA (SEQ ID NO: 73)
  • 12 strains should provide amplification products of the size predicted from the nucleotide sequence (5 'genome approximately 4.5 kb and 3' genome approximately 5. O kb). (G 94 n 56 A p 2 lZp 2 5 / p 28Zp 30 origin; 2/1 / 2/2, total 7 strains, G 8 n 7 ⁇ c 2Z c 5 origin; 1/4, total 5 strains ).
  • Restriction fragment length predicted from the nucleotide sequence is 19.8 kb homologous recombinant in 5 'genome analysis, 7.6 kb in wild type (non-recombinant), 3' genomic The homologous recombinant is 19.8 kb, and the wild type (non-recombinant) is 8.8 kb. A total of 5 homologous recombinants were confirmed from 2 to 2 blastcidin resistance candidates.
  • the cloning site (1 ox P and 3 'neo sequence) inserted 1 4 N ⁇ q 5 DT 40 hybrid cells carrying HAC vector (G 94 n 56 A p 2 1 S 39, G 94 n 56 A p 2 5 S61, G94n56Ap28S7,8, G8n7Ac2S202, G8n7Ac5S90).
  • G 94 n 56 ⁇ p 2 1 S 3 9, G 94 n 56 A p 25 S 6 1, G 8 n 7 ⁇ c 2 S 202, G 8 n 7 A c 5 S 90 (hereinafter G 4 S 3 9, G4 S 61, G 8 S 202, and G 8 S 90) were advanced to the next step.
  • a total of 92 strains (G4 S 6 1) from 8 (G4 S 39; 2 times, G4 S 6 1; 2 times, G8 S 2 2; 2 times, G 8 S 90; 2 times) micronucleus cell fusion Blastocidin-resistant CHO strains of origin 19 strains, G4 S 39 derived 23 strains, G 8 S 90 derived 22 strains, G8 S 202 derived 28 strains) were obtained.
  • the presence of 2 target sequences on the 5 'and 3' sides was detected by the PCR method using the genomic DNA of the blasticidin resistant strain as a saddle.
  • the method was performed according to Example 6 (4- 3).
  • a primer for detecting atri] 3-actin was designed from the base sequence of the atri] 3-actin gene (Registration No. X00 1 8 2) obtained from the GenBank database to check for contamination of DT40 cells.
  • the primer oligonucleotide sequence for PCR amplification is shown below:
  • Ggbeta-actinl933F 5 'one TCCGTTGGAGTTGATCCTTC (SEQ ID NO: 7 7)
  • Ggbeta-actin2536R 5 '-ACATGACACAGCAAGGAACG (SEQ ID NO: 78)
  • T aq polymerase is E x T aq (Takara Shuzo). Reaction conditions are 94 ° C for 1 minute, denaturation 94 ° C for 15 seconds, annealing 56 ° C for 30 seconds, extension 72 ° C for 30 seconds for 3 5 cycles I went there.
  • Example 6 Southern blot analysis was performed in the same manner as in Example 6 (4-4) to confirm the structure of the transferred 14 ⁇ qHAC vector. A typical result is shown in FIG. Restriction fragment length predicted from the nucleotide sequence is 19.8 kb for homologous recombinants by 5 'genomic analysis, 7.6 kb for wild type (non-recombinant), 3' genomic analysis The homologous recombinant is 19.8 kb, and the wild type (non-recombinant) is 8.8 kb.
  • F I SH analysis was performed according to the method described by Matsubara et al. (F I SH experimental protocol, Shujunsha, 1 994) using human-specific C o t 1 (Invitrogen) as a probe.
  • F I SH experimental protocol Shujunsha, 1 994
  • human-specific C o t 1 Invitrogen
  • 23 blasticidin-resistant CHO strains 7 strains derived from G4 S 61, 1 strain derived from G4 S 39, 1 strain derived from G8 S 202, 4 strains derived from G 8 S 90
  • a total of 9 Strain G 4 S 6 1—1, 6, 8, 9, 1 1, 1 2, G4 S 3 9—1 3, G 8 S 90—2, 4)
  • Force Normal karyotype and most of the observed division images 1 copy of 1 4 N ⁇ q H AC vector stained with Cot 1 was detected.
  • a typical F I SH image and the karyotype of a 14 ⁇ qHAC vector are shown in Figs.
  • CHO cell lines (G4 S 39-13, G4 S 6 1 — 1) carrying the 14 ⁇ qHAC vector described in Example 6 were used.
  • the non-selective culture medium was F 12 medium containing 10% FBS, and the selective culture medium was supplemented with 8 ⁇ g / m 1 of blasticidin.
  • CHO cell line is seeded with 5.0 X 10 5 cells in a 10 cm diameter dish.
  • the cells that had been seeded and cultured to a cell density of about 80 to 90% saturation were counted, and 5.0 ⁇ 10 5 cells were seeded again in a 10 cm-diameter dish, and the procedure was continued until passage 10.
  • the population doubling number was calculated by counting the number of cells at each passage.
  • CHO cell line cells were collected after passage 10, and chromosome samples for FI SH were prepared.
  • the 14 ⁇ qHAC vector was stably maintained in CHO cells until after passage 10.
  • observation of metaphase chromosome images revealed one or two signals per cell.
  • the 14 N ⁇ q HAC vector is stably maintained in non-selective culture conditions in CHO cells, and the copy number per cell is maintained. It became clear.
  • This capsule was transplanted into the left dorsal skin of I g ⁇ — / — J quat mouse under abatin anesthesia, and blood was collected orbitally over time after transplantation, and the erythrocyte count in the peripheral blood was converted to hemoglobin 'AD VIA 1 Measured by 20 (Bayer Medical).
  • a control-only group without capsules was performed as a control group. The results are shown in Figure 87. 'From 2 weeks after transplantation, the erythrocyte count and hemoglobin increased in the cell capsule transplant group, and the above increase was maintained up to 44 weeks. As described above, long-term in vivo EPO efficacy by EPO-1 14 AHAC-retaining CHO cell transplantation was shown.
  • EPO introduced in Example 19 below 14 Human fibroblasts carrying AA q A neo HAC vector HF L _1 cell clone selected from t ⁇ 6 3 H t ⁇ 6 3 H 15 Or HF L-1 cell clone t ⁇ 4 7 H 2 7, 3 0, 3 7 prepared in the same manner as t ⁇ 6 3 HI 5 cannot be produced due to B cell deficiency after encapsulation in immune cell blocking capsule Supplied from the above HFL-1 clone by analyzing the value of red blood cells, hemoglobin, and hematoma's in the peripheral blood. was evaluated in vivo. If the above three values rise in the cell capsule transplanted group compared to the control group, it can be judged that there is a medicinal effect.
  • This capsule is cultured on a 6-well plate in DMEM—20% FBS medium at 37 ° C 6.5% CO 2 for 2-6 weeks. 0 or 1 0 ng / m 1) The culture medium was further cultivated by changing the medium.
  • I g ⁇ -/-Knockout mice were transplanted into the left dorsal skin, and orbital blood was collected over time after transplantation, and the number of red blood cells in the peripheral blood, hemoglobin, and hematocrit value. Is measured by AD VIA 1 20 (Bayer Medical).
  • a 14 H AC vector into which EGFP has been introduced was prepared, transferred to mouse ES cells by the microcell method, and then a chimeric mouse was created and crossed. The HAC retention rate in the cells was analyzed.
  • Plasmid p LN 1—I RE S—EGF P in which the EGF P gene is placed under the control of the CAG promoter is prepared, and 14 A ⁇ q—HAC and 14 N ⁇ q— are prepared in the CHO cells using the Cre-1 o XP system. An EGFP gene expression unit was introduced onto the HAC vector.
  • pLNl_PGK—EGFP Prior to the preparation of pLN1-IRES-EGFP, pLNl_PGK—EGFP was prepared. This was done in two steps. First, the first step is to replace the CM V promoter in the C MV-5 ′ neo region of pLN l—EPO (Ka keda et al. Gene Th erapy; 1 2: 8 5 2— 8 56, 2005) with the PGK promoter. The plasmid pLNl-PGKE PO prepared in this way was smoothed after digestion with Sa1I, and the EPO expression unit was removed by EcoRI deletion.
  • step 2 is the step of digesting step 1 with S a 1 I 1 B a mH I p CAGGS—Cre (Araki et al., PNAS, 92, 1 6 0— 1 64, 1 99 5)
  • S a 1 I 1 B a mH I p CAGGS—Cre (Araki et al., PNAS, 92, 1 6 0— 1 64, 1 99 5)
  • the first half of the CAG promoter prepared by ail-Xbal digestion and the first half of the CAG promoter prepared by PCR amplification and XbaI-BamHI digestion using pCAGGS-Cre as a saddle were introduced simultaneously.
  • the primer sequences used in PCR are shown below.
  • pCAGGSCre 2362F 5 '-TTCGGCTTCTGGCGTGTGAC (SEQ ID NO: 1 52)
  • pCAG Rl BamHI 5′-CGGGATCCCGTGGCGGCGGGTAATTCTTTGCCAAA (SEQ ID NO: 1 53)
  • p LN 1—I RE S—EGFP was prepared.
  • p LN l (1: 3 15 6 (13 et 06 ne Th erapy; 1 2: 8 5 2— 8 5 6, 2005) was digested with Eco RI—N co I, CMV promoter and S v 40 po 1 y A was removed, where p LN l— PGK— a fragment containing CAG promoter and EGF P prepared by ECO RI— Not I digestion of EGF P, and I from pc DNA3.0 (Invitrogen) An IRES fragment prepared by digestion of NotI-coI was simultaneously introduced into a DNA fragment obtained by PCR-amplifying the RES sequence in a saddle type, and the primer sequence used in PCR is shown below.
  • EGFP-IRESFwl 5 '-AAGCGGCCGCGACTCTAGGGATCCGCCCTCTCCCTCCC (SEQ ID NO: 1 54)
  • FGFP-IRESRvl 5'-GACACCATGGTTGTGGCCATATTATCATCGTG (SEQ ID NO: 1 55)
  • the final pLN1—IRES—EGF P construct size is about 5.7 kb.
  • EGF P gene expression unit recombination inserts was performed by determining whether or not it was inserted into the 1 o XP sequence site on the 14 ⁇ q—HAC and 14 N ⁇ q—HAC vectors. Confirmed by PCR amplification with primers EGF P 3 74 F and Neo R p 2 designed on pLNl—IRES—EGF P vector and 14 ⁇ q HAC and 14 Nq q—HAC vector. An outline is shown in FIG.
  • EGFP 374F 5 '-GCATCGACTTCAAGGAGGAC (SEQ ID NO: 1 56)
  • Neo Rp2 5 'one CCTGCAGTTCATTCAGGG (SEQ ID NO: 1 5 7)
  • amplification of about 1.2 kbp is expected with primers EGF P 3 74 F and Neo Rp 2.
  • a total of 80 strains (40 strains derived from t7S38-6, 40 strains derived from G4S3 9-13) are expected from the G4 18 resistant CHO hybrid cells obtained in (1-2) above. Amplification was confirmed. Based on the above, it was confirmed that the above-mentioned 80 G4 18 resistant CHO hybrid cell lines were EG FP gene-expressing unit recombination media into the 1 o XP sequence.
  • the restriction enzyme fragment length estimated by EcoRI digestion from the nucleotide sequence is 7.5 kb including the EGFP expression unit. The outline is shown in FIG.
  • F I SH analysis was performed using human-specific C o t 1 (Invitrogen) as a probe according to the method described by Matsubara et al. (F I SH experimental protocol, Shujunsha, 11994).
  • G 4 18 resistant CHO hybrid cells obtained in (1-4) above, 15 strains (8 strains derived from t 7 S 38-6, 7 strains derived from G4 S 39-1 3) were analyzed.
  • the obtained G 4 1 8 resistant 11 strain is a normal karyotype CHO cell carrying the EGF P 1 14 ⁇ q—HAC vector (t 6 EG I—2, 6, 9, 1, 1, 24, 30) and EGF P—14 ⁇ q—normal nucleus carrying the HAC vector Type C HO cells (G 13 EG I—1, 5, 15, 15, 17, 20).
  • ⁇ PCR analysis was carried out using the methods described in (7-4) (1-3) above to select clones for EGF P-14— ⁇ q HAC and EGF P_14 ⁇ qHAC vector transfer.
  • the expected amplification was confirmed in all the G 4 18 resistant mouse ES hybrid colonies isolated in (2-1) above. From the above, it was confirmed that the G 4 18-resistant mouse ES hybrid cells 12 strains carry the EGFP-14A ⁇ qHAC and EGFP-14 P ⁇ qHAC vectors.
  • the FI SH analysis was performed using a human-specific Cot 1 (Invitrogen) as a probe according to the method described by Matsubara et al.
  • Eight strains of G 4 18-resistant mouse ES hybrid cells obtained in (1-4) above (1-til, 2-til, 3-til, 4-til, 3 2-G1, 33-t24, 34-t 24, 3 5-t 24) were analyzed.
  • 1 copy of EGF P—14 A q HA C and EG FP— 14 ⁇ q— HA C vector was detected.
  • the hEPO gene expression unit is inserted into the 14 ⁇ qHAC vector constructed in Example 6.
  • An hEPO expression plasmid containing 1 o XP sequence is prepared, and the Cre recombinase is transiently expressed to insert into an artificial chromosome by site-specific recombination between 1 o XP sequences.
  • the selection of recombinant inserts was based on the acquisition of G4 18 resistance (reconstruction of promoter-breaking type neo resistance gene expression unit).
  • CHO hybrid cells retaining the 14 6 ⁇ qHAC vector prepared in Example 6 (G4 S 6 1—1, 9, G4 S 39 — 1, 3, G 8 S 9
  • h EPO gene expression unit Recombinant inserts are selected on the 14 ⁇ qHAC vector.
  • 1 0 Indicates whether or not the XP sequence site was inserted.
  • 1 o Primer SVp AN p 1 designed on p LN 1—E PO vector and 14 4 ⁇ q H AC vector so as to sandwich the XP sequence site.
  • the Neo R p 2 and the inserted hEPO gene were confirmed by PCR amplification with M 13 RV and Neo R p 2 primers on the plasmid vector pBS226.
  • Primer sequences and PCR were according to the method of Kakeda et al. (Kakeda et al., Gene Therapy; 12: 852-856, 2005). In the case of recombinant inserts, amplification of about 1.
  • G 4 1 8 resistance candidate CHO hybrid cell count obtained in (1 1 2) 1 30 strains (G4 S 6 1-1 derived 36 strains, G4 S 6 1-9 derived 40 strains, G4 S 39-1 3 reasons 35 strains, G8 S 90-4 derived 19 strains), total 60 strains (G4 S 6 1-1 derived 13 strains, G4 S 6 1_9 derived 18 strains, G4 S 3.9-13 derived) 1 9 strains and 10 strains derived from G 8 S 90-4) were confirmed.
  • F I SH analysis was performed using a human-specific C o t 1 (Invitrogen) as a probe according to the method described in Matsubara et al. 23 strains of the G 4 18 resistant CHO hybrid cells obtained in (1-3) above were analyzed. As a result, a total of 15 shares (G4 S 6 1— 1 E 6, 9, G4 S 6 1— 9 E 28, 34, 3 5, 6 5, G4 S 39— 1 3 E 3, 4, 5, 1 6, 5 5, 6 1, 7 1, G8 S 90_4 E 1 6 and 18)), and most copies of the mitotic image are normal karyotype and 1 copy of h E stained with Cot 1 PO—14 4 ⁇ q HAC vector was detected. A typical F I SH image is shown in Fig.
  • the above G 4 18 resistant CHO hybrid cells 15 obtained from the above experiments (1-1) to (1-4) are the normal karyotype C that carries the ⁇ ⁇ ⁇ _ 14 ⁇ q HAC vector. ⁇ ⁇ It was confirmed to be a sputum cell.
  • hEPO gene was quantified by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) produced in the culture supernatant.
  • G 4 1 8 resistant CHO hybrid cells carrying the hE PO-1 4 ⁇ qHAC vector isolated in (1-3) above (G 4 S 6 1—1 E origin 1 1 strain, G4 S 6 1— 9 E origin 1 6 strains, G4 S 3 9-13 derived 1 9 strains, G 8 S 90-4 derived 5 strains)
  • FBS hole tissue culture plastic petri dish
  • hEPO in the culture supernatant was quantified using the hEPO ELISA kit (Quantikine IVD Human EP0 Immunoassay, R & D System). The results of experiments conducted in duplicate Average values are shown in FIG. From the above results, the expression of hEPO was confirmed in all G4 18 resistant CHO hybrid cells carrying the hEPO-1 4 ⁇ q HAC vector.
  • hEPO ELISA kit Quantikine IVD Human EP0 Immunoassay, R & D System
  • hEPO gene was quantified by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method) for hEPO protein produced in the culture supernatant.
  • ELISA method enzyme-linked immunosorbent assay
  • FI SH solution was performed using a human-specific Cot 1 (Invitrogen) as a probe according to the method described by Matsubara et al. (FI SH experimental protocol, Shujunsha, 11994). Cell population doubling numbers and HAC retention were calculated as the average of duplicate results. The results for the above four strains are shown in Table 4 and Figure 41. Table 4: Stability of hEP0-14NA HAC vector in CH0 cells
  • the hE PO—14 ⁇ qH AC vector was stably maintained in CHO cells until after passage 10. Observation of metaphase chromosome images revealed 1 or 2 signals per cell. .
  • the hEPO-14N ⁇ q HAC vector was stably maintained in non-selective culture conditions in CHO cells after long-term subculture. It was revealed that the copy number was maintained and that the expression of the hEPO gene was maintained.
  • hE PO — 14 N A q HAC vector expression of hE P O gene in normal human fibroblasts (1) Preparation of hE PO-14 ⁇ q HAC vector-transfected normal human fibroblasts
  • CHO cell lines that retain the hEPO—14N ⁇ qHAC vector obtained in Example 9 as chromosome donor cells clones with high micronucleation ability (G4 S 6 1—1 E 6, G 4 S 3 9-1 3 E 4, 55, G 8 S 90— 4 E 1 6) were used.
  • As the chromosome recipient cell human normal fibroblast HF L-1 (obtained from RIKEN Cell Materials Development Office, registration number RCB 05 2 1) was used. Micronuclear fusion was performed in the same manner as in Example 5 (1) above. After about 4 weeks of selective culture, drug-resistant colonies that emerged were isolated and analyzed further. 3 47 drug-resistant colonies were obtained from 2 (8 x 4 strains each) micronucleus cell fusions.
  • G 16 H cells cells obtained using G 4 S 6 1-1 E 6 cells as chromosome donor cells.
  • the cells obtained using 90-4 E 16 cells are hereinafter referred to as G 16 H cells.
  • hE PO_ 14 ⁇ q Determine whether the HAC is strong enough to hold the cluster, using the primers SV p AN p 1 and Neo R p 2 in Example 3 (1-2) to identify the human chromosome as an STS marker. It was confirmed by PCR amplification using the primer of D 2 S 1 334 according to the method of Kakeda et al. (Kakeda et al., Gene Therapy; 12: 852-856, 2005). In addition, the presence or absence of contamination of chromosome-donated CHO cells was confirmed by PCR amplification using CHO furin gene-specific primers furin 3, 3 11 1) and £ 11: 1.11 E x 6-28R. The method was performed in the same manner as in Example 5 (1-2).
  • a total of 17 strains (G 6H; 2 strains, G4 H; 4 strains, G 55H; 6 strains, G 16 H; (5 strains) confirmed the expected amplification. From the above, it was confirmed that the above-mentioned blasticidin-resistant strain 17 was an HF L — 1 cell carrying hEPO-14— ⁇ qHAC betater.
  • FI SH analysis was performed according to the method described in Matsubara et al. (FI SH Experimental Protocol, Shujunsha, 1 994), and human 14th and 2nd chromosome specific ⁇ -satellite DNA probes. (Q-biogene, Funakoshi).
  • FI SH Experimental Protocol Shujunsha, 1 994
  • human 14th and 2nd chromosome specific ⁇ -satellite DNA probes Q-biogene, Funakoshi
  • G4H 2, G 1 6H 17 and G 55H7 three blasticidin resistant strains
  • a total of 3 strains of normal karyotype and most of the observed mitotic images showed a pair of host cell-derived pairs.
  • Signals were detected at four sites in the human chromosome 14 and 22 centromeric region and one site from one copy of the 14 ⁇ q HAC vector. The results are shown in FIGS. 42A and B. .
  • hEPO gene was quantified by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method) for the hEPO protein produced in the culture supernatant.
  • hEPO in the culture supernatant was quantified using the hEPO ELI SA kit (Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R & D system). The results are shown in the item “1 4N—HAC” in Figure 21.
  • Example 10 Using 4 HF L-1 cells (G4H 2, G 1 6H 17, G 1 6 H2 1, G 5 5H7) carrying the hEPO-1 4 N ⁇ q HAC vector obtained in 0 did.
  • Non-selective media is DM containing 20% FBS It was an EM medium, and 3 ⁇ g Zm 1 of blasticidin was added to the selective medium.
  • ⁇ 3 X 10 5 cells are seeded in collagen-I-coated T-25 flask (Falcon), cultured until the cell density is about 90% saturation, and 1-3 X 10 5 cells are seeded again 6 ⁇ 1 This was done until passage 0. The population doubling number was calculated by counting the number of cells at each passage. In addition, cells were collected before and after the 5th and 10th passages, and hEPO gene expression analysis and FISH analysis were performed.
  • hEPO gene was quantified by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method) for hEPO protein produced in the culture supernatant.
  • a 1 o XP sequence was inserted by homologous recombination into the distal and proximal long arms so that the HAC vector contains the telomeric sequence and the approximately 60 kb subtelomeric region at the end of human chromosome 14.
  • a site-specific recombination reaction by excision and deletion of the region between two 1 oxP sequences to construct a long arm distal deletion artificial chromosome (14 gNA qHAC) vector.
  • XP Sequence Insertion Vector contains Example 6 (1-1) Plox Pu p BSD—PGK was used. From the nucleotide sequence of the long arm of human chromosome 1 (registration number AB 0 1 943 7) obtained from the Gen Bank database, the target sequences of the two locations of ploxp PG K-14 qte 1 — 2 vector insertion Designed.
  • the primer oligonucleotide sequence with restriction enzyme recognition sequence for PCR amplification is shown below:
  • Example 1 AB01 47EcoRV: 5'-CGATATCGATGCTAAGAGATGCCCTAAGAAATCC (SEQ ID NO: 84)
  • the genomic DNA of mouse A 9 hybrid cell (A9 cll-14 chr) carrying human chromosome 14 is selected.
  • the two 5 ′ and 3 ′ recombination target sequences were amplified by the PCR method using the above primers.
  • T aq Polymerase uses LAT aq (Takara Shuzo).
  • reaction conditions with AB 0 1 42 S pe IF w / AB 0 1 47 Eco RV are 94 ° C for 1 minute, denaturation 98 ° C 5 seconds, annealing extension 72 ° C 8 minutes, 3 cycles, denaturation 9 8 Two cycles of ° C for 5 seconds, annealing / extension at 70 ° C for 8 minutes, denaturation 98 ° C for 5 seconds, annealing at extension of 68 ° C for 8 minutes for 30 cycles and extension at 70 ° C for 10 minutes.
  • the 3.0 kb amplification product by AB 0 1 42 S pe IF w / AB 0 1 45 R was digested with S pe I—BamH I, and AB 0 1 45 F / AB 0 1 4 7 Eco
  • the 2.0 kb amplification product by RV was digested with BamH I—E co RV, and the above 2 fragments were subcloned once into p B 1 uescript vector, and then digested with Spe I—E co RV, P 1 ox P up BSD with a target sequence of 0 Kb—P GK vector N he I -E co RV site.
  • the final ploxp PGK — 1 4 atel — 2 construct size is approximately 1 2.1 kb. 44 and 45 show the p 1 oxp PGK-14 qte 1 — 2 vector single target sequence and the chromosomal allele resulting from homologous recombination.
  • Example 1 In accordance with the method of Example 1 (1-2), p 1 o X p PGK— 14 qtel — 2 construct is converted to linearized DNA by digestion with restriction enzyme S rf I, and human chromosome 14 is retained. D The cells were introduced into Ding 40 hybrid cells 13 Ding 40 (-14) 1-2 and DT40 (-14) 2-4. Selective culture was performed with blasticidin (final concentration 8 ug / m 1), and drug-resistant colonies appeared after 2-3 weeks. For DT40 (-1 4) 1—2, a total of 1 7 38 blasticidin-resistant colonies from 6 transfections. For DT 40 (-14) 2—4, 4 transfections. A total of 6 18 blasticidin-resistant colonies were isolated and expanded for further analysis.
  • PGKlongRv2 5 '-ACTTCCTGACTAGGGGAGGAGTAGAAGGTG (SEQ ID NO: 86)
  • BsdlongRv2 5 '-AGTGGGCAGTTTACCGTAAATACTCCACCC (SEQ ID NO: 8 7)
  • genomic DNA extracted from the blasticidin-resistant strain obtained in the primary screening was digested with restriction enzyme (5 'side) Sac I or B st EII (3' side) (Roche). Southern plot analysis was performed by the method described by Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & i> ons, Inc., 1994). The hybridized signal of the labeled probe was detected with an image analyzer Typhoon 9 2 1 0 (Molequila-Dynamics). A typical result is shown in FIG.
  • the restriction enzyme fragment length predicted from the nucleotide sequence is 7.2 kb for the homologous recombinant in the 5 'target sequence, 4.8 kb for the wild type (non-recombinant), and for the 3' target sequence. 21.8 kb for homologous recombinants, 18.61 ⁇ 13 for wild type (non-recombinant).
  • Three homologous recombinants 24 gl 5, 24 g 67, 24 g 91) were confirmed.
  • Example 6 The p 1 o X PHYGOR / n 1 construct prepared in Example 6 (2-1) was converted to linearized DNA by digestion with restriction enzyme S rf I, and p prepared in Example 13 (1-4).
  • 1 oxp PGK-14 qte 1-2 was introduced into DT 40 hybrid cells 1 2 g 5, 24 g 15 and 24 g 6 7 carrying the chromosome 14. The method was the same as in Example 1 (1-2). After selective culture for 2-3 weeks, puromycin-resistant colonies appeared. A total of 252 puromycin-resistant colonies (78 from 12 g 5, 28 from 24 gl 5, 1 from 24 g 6 7) were isolated from a total of 6 transfections, 2 times each. Subsequent analysis was performed.
  • Example 1 the Cre expression vector pCAGGSC re was introduced into the g 5 n 8 and g 7 n 9 cells obtained in Example 1 2 (2).
  • Selective culture was performed with hygromycin (final concentration 1.25 mgZm 1), and drug-resistant colonies appeared after 2 to 3 weeks.
  • hygromycin final concentration 1.25 mgZm 1
  • the deletion between two 1 o XP sequences was confirmed by PCR using genomic DNA of a hygromycin resistant strain as a saddle type. The method was performed according to Example 6 (3-2). Oligonucleotide primer pairs were designed on the chromosome and on the targeting vector, taking in the 1 o XP sequence remaining after the long arm distal deletion. The position is indicated by an arrow in FIG. As a result, amplification products were identified to be expected in 1 2 strains of the hygromycin-resistant strains 1 6 strain (g 5 n 8 from seven strains, g 7 n 9 - derived 5 strains).
  • Southern blot analysis was performed to confirm and select the structure of the long arm distal deletion.
  • Long arm The position of the target sequence, chromosomal allele and probe resulting from the positional deletion is shown in FIG. 30B.
  • Probes (g 2 — 5 ′ (i) and N 3 ′ (i)) were set outside the two target sequences on the 5 ′ and 3 ′ sides of homologous recombination (FIG. 30B).
  • Genomic DNA was extracted from 9 hygromycin-resistant strains (5 strains derived from g5n8 cells and 4 strains derived from g7n9 cells) obtained in Example 13 (3-2) above. 1-4) and (2 4).
  • FI SH analysis was performed using a human-specific Cot 1 (Invitrogen) as a probe according to the method described by Matsubara et al. (FI SH experimental protocol, Shujunsha, 1 994).
  • One copy of the signal stained with Cot 1 was detected in most of the images.
  • the karyotypes of typical FI SH images and HAC vectors are shown in Fig. 5 OA and B, respectively.
  • the 3 'target sequence was designed from the base sequence of human chromosome 14 (proximal number AL 39 1 1 56) obtained from the Gen Bank database.
  • the primer oligonucleotide sequence for PCR amplification is shown below:
  • 58830RlongSrfI 5 '-GATGCCCGGGCCAATAGCCAGTCAATCGAGAAACCAAGCCC (SEQ ID NO: 94)
  • the 5 ′ target sequence was digested with sail and S rf I (Roche) from the ploxp PGK—14 qtel 2 vector, separated and purified by agarose gel electrophoresis, and then p SF l3 plasmid S a 1 I-S rf Cloned at site I.
  • the 3 ′ target sequence was amplified by PCR using genomic pNA extracted from A 9 cll-14 chr cells carrying human chromosome 14 as a saddle type.
  • T aq Polymerase uses LAT aq (Takara Shuzo), Mg SO
  • reaction conditions are 94 ° C for 1 minute, denaturation 98 ° C for 5 seconds, annealing / extension 72 ° C for 8 minutes for 3 cycles, denaturation 98 ° C for 5 seconds
  • Annealing extension was performed at 70 ° C for 8 minutes for 2 cycles, denaturation 98 ° C for 5 seconds, annealing / extension at 68 ° C for 8 minutes for 30 cycles, and elongation at 72 ° C for 10 minutes.
  • oligonucleotide primer pairs were designed on the chromosome and the targeting vector, respectively. The position is indicated by an arrow in FIG. 34B.
  • the sequence of the 5'-side target sequence detection primer is shown below:
  • AB01 37931F 5 '-AGCGGTACTGAGAGGCAATCTTTCATGGGC (Career number 9 5)
  • ApaIlongFw2 5 '-ACCAAATATCCTGCTCAAACTGTAACCC (SEQ ID NO: 9 6)
  • the method was performed according to Example 13 (4-1).
  • the reaction conditions for detecting the 5 'target sequence are 94 ° C min, denaturation 98 ° C 5 sec, annealing Z extension 72 ° C 6 min 3 cycles, denaturation 98 ° C 5 sec, annealing Z extension 70 ° C 6 min 2 cycles, denaturation 98 ° C 5 sec
  • Annealing Z elongation 68 ° C for 6 minutes was performed for 30 cycles, elongation 72 ° C for 10 minutes.
  • the restriction enzyme fragment length predicted from the nucleotide sequence is 11.8 kb for homologous recombination and 4.6 kb for wild-type (non-recombinant) in the 5 'genome target sequence, 3'
  • the genome-side target sequence is 15.8 kb for homologous recombinants and 8.8 kb for wild-type (non-recombinant).
  • a total of 9 homologous recombinants were confirmed from the above and 13 drug resistance candidate strains. Based on the above experiments (4-1) to (4-4), the 14 g N ⁇ q HAC vector containing the homozygous recombination of the claw-ung site (1 ox P and 3 'neo sequence) is retained.
  • DT 40 hybrid cells total 9 strains (g 5 n 8 a c 3 sl 3, g 5 n 8 a dls 3, 4, 6, 8, 9, 10, g 67 nl 9 a cls 9, 21) were obtained. Among these, two strains of g5n8Ac3sl3 and g67nl9Acls9 were advanced to the next step.
  • blasticidin-resistant CHO strains 32 strains derived from g 5 n8 ⁇ c 3 s 13 and 23 strains derived from g 67 nl 9 A cls 9) were obtained from the four fusions of micronucleated cells. (5-2) PCR analysis
  • the presence of two target sequences on the 5 'and 3' sides was detected by the PCR method using the genomic DNA of a blasticidin resistant strain as a saddle type.
  • the method was performed according to Example 6 (5-2).
  • 52 strains 29 strains derived from g5n8 ⁇ c3s13, 29 strains derived from g6nn99 ⁇ c1s9)) were Providing amplification products of expected size (5 'genome approx. 2. O kb and 3' g phenome approx. 5.
  • Example 12 Southern blot analysis was performed in the same manner as in Example 12 (4-4) to confirm the structure of the transferred 14 g ⁇ qH AC vector. Typical results are shown in Figure 53.
  • the restriction enzyme fragment length predicted from the nucleotide sequence is 11.8 kb for homologous recombinants and 4.6 kb for wild-type (non-recombinant) 5 'genome target sequences, and 3' genome
  • the side target sequence is 15.8 kb for homologous recombinants and 8.8 kb for wild type (non-recombinant).
  • FI SH analysis was performed using a human-specific Cot 1 (Invitrogen) as a probe according to the method described by Matsubara et al. (FI SH experimental protocol, Shujunsha, 1 994).
  • FI SH experimental protocol Shujunsha, 1 994
  • a total of 5 strains g 5 n 8 2 strains of A c 3 sl 3 _ 9, 1 2: hereinafter referred to as g 5 S 1 3—9 and g 5 S 1 3 _ 1 2, g 6 7 nl 9 A c 1 s 9-1 1, 1 2 , 1 7 strains: g 7 S 9— 1 1, g 7 S 9— 1 2, g 7 S 9-1 7)
  • Force S, normal karyotype and most of the observed split images One copy of 1 4 gNA q H AC vector stained with 1 was
  • the 14 g NA q HAC vector was stably maintained in CHO cells until after passage 10. Observation of metaphase chromosome images revealed 1 or 2 signals per cell.
  • the hEPO gene expression unit is inserted into the 14 gNA q HAC vector constructed in Example 7.
  • a hEPO expression plasmid containing 1 o XP sequence is prepared, and Cre recombinase is transiently expressed to insert into the artificial chromosome by site-specific recombination between 1 o XP sequences. Selection of recombinant inserts was based on the acquisition of G4 18 resistance (reconstruction of a promoter-interrupted neo resistance gene expression unit).
  • C HO cells g 5 S 1 3-1 2 and g 7 S 9-1 1 1
  • carrying the 14 g N ⁇ q HAC vector prepared in Example 1 3. And the hEPO gene expression unit was inserted.
  • the selection of the hE PO gene expression recombination insert was performed by checking whether or not it was inserted into the 1 o XP sequence site on the 14 gNA q HAC vector, p LN 1 _ E Primers designed on the PO vector and 14 gNA q HAC vector, and the inserted hEPO gene with the SV p AN p 1 and Neo R p 2 and the inserted EPO gene, plasmid vector — M 1 3 RV on BS 2 26 And by Neo R p 2 primer, it was confirmed by the increase in PCR. Primer sequences and PCR were according to the method of Kakeda et al. (Kakeda et al., Gene Therapy; 12: 852-856, 2005).
  • F I SH analysis was performed using human-specific C o t 1 (Invitrogen) as a probe according to the method described by Matsubara et al. (F I SH experimental protocol, Shujunsha, 11994).
  • Matsubara et al. F I SH experimental protocol, Shujunsha, 11994.
  • G 4 18 resistant CHO hybrid cells obtained in (1_3) above 17 strains were analyzed.
  • hEPO gene was quantified by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method) for hEPO protein produced in the culture supernatant.
  • h E PO— 14 g NA q In order to confirm the stability of HAC vector in CHO cells, long-term subculture was performed under non-selective conditions. Three CHO hybrid cells obtained in Example 15 (g 5 S 1 3-1 2 E 2 3 and g 7 S 9-1 1 E 2 8, 6 2) were used. The non-selective medium was F 1 2 medium containing 10% FBS, and 0.8 mg / m 1 of G 4 18 was added to the selective medium. CHO cell line 5. 0 X 1 0 5 cells were seeded in 1 0 cm-diameter dish, again 5.
  • hEPO gene was quantified by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method) for hEPO protein produced in the culture supernatant.
  • H CPO-1 4 g NA q 3 C HO hybrid cells carrying the HAC vector were subcultured for a long time in (1) above, and about 10 5 cells were added with 10% FBS.
  • h EPOELISA kit containing 2 ml of F1 2 medium containing G 4 18 was seeded. After reaching confluence, replace with 2 ml of F 1 medium supplemented with 10% FBS, incubate for 7 days, replace with lm 1 of F 1 medium supplemented with 10% FBS, and incubate for another 24 hours. The
  • HEPO in the culture supernatant was quantified by (Quantikine IVD Human EP0 Immunoassay, R & D system).
  • Figure 58 shows the average of the results of experiments performed in duplicate.
  • FI SH analysis was performed using a human-specific Cot 1 (Invitrogen) as a probe according to the method described by Matsubara et al. (FI SH experimental protocol, Shujunsha, 11994). Cell population doubling numbers and HAC retention were calculated as the average of duplicate results. The results for the above three strains are shown in Table 6 and Figure 58. Table 6: Stable life of hEPO—14 NA HAC betater in CHO Itoda S-pack
  • hEPO-1 4 g ⁇ q HA C vector was stably maintained in CHO cells until after passage 10.
  • observation of metaphase chromosome images revealed 1 to 2 signals per cell.
  • hEPO-14 g N ⁇ q HAC vector is stably maintained in non-selective culture conditions in CHO cells after long-term subculture. It was revealed that the copy number was maintained and that the expression of the hEPO gene was maintained.
  • hE PO- 1 4 g NA q HAC vector-specific hEPO gene expression in normal human fibroblasts
  • Chromosome-receptor cells include human normal fibroblasts H F L-1 (obtained from RIKEN Cell Materials Development Office, registration number R CB 0 5
  • micronuclear fusion was performed in the same manner as in Example 5 (1) above. After about 4 weeks of selective culture, drug-resistant colonies that emerged were isolated and analyzed further. From 24 micronucleated cell fusions 5 1 (from g 5 S 1 3— 1 2 E 23, 3 from g 7 S 9— 1 1 E 28, 2 from g 7 S 9_ ll E 6 2 26) drug-resistant colonies were obtained. Among the above colonies, cells obtained using g5S13_12E23 cells as chromosome donor cells were obtained using g23H cells and g7S9-11E28 cells. Cells with g 28H cells, g 7 S 9— 1 1 The cells obtained using E62 cells are hereinafter referred to as g62H cells.
  • h EPO— 1 4 g N ⁇ q Whether or not the HAC vector is retained is determined using the primers SV p AN p 1 and Neo R p 2 of Example 3 (1—2) to transfer the human chromosome to the STS. It was confirmed by PCR amplification according to the method of Kakeda et al. (Kakeda et al., Gene Therapy; 12: 852-856, 2005) using the primer of the marker D 2 S 1 3 34. In addition, the presence or absence of contamination of the chromosome-donated CHO cells was confirmed by PCR amplification using CHO f urin gene-specific primers f u r iin 3 'sub F and f uRin E x 6-28R.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

明 細 書 ヒ ト人工染色体 （HAC) ベクター及び
ヒ ト人工染色体 （HAC) ベクターを有するヒ ト細胞医薬 技術分野
本発明は、 ヒ ト染色体由来のセントロメァ及びサブテロメァ配列とテロメァ配列を保 持するヒ ト人工染色体 （HAC) ベクター、 並びに該 HACベクターを有するヒ ト細胞 医薬若しくはヒ ト細胞を提供する。 得られるヒ ト細胞 （医薬品） は、 遺伝子治療及び再 生医療医薬品として有用である。 また本発明は、 上記 HACベクターを有するヒ ト細胞 の作製方法、 上記 HACベクター及びその作製方法を提供する。 更に本発明により Γ上 記 H ACベクターによる治療用タンパク質製造方法を提供する。 背景技術 - HACベクター
哺乳動物細胞への遺伝子導入において汎用されるプラスミ ド、 コスミ ド、 細菌人工染 色体 （BAC)、 酵母人工染色体 （YAC)、 ウィルスなどの従来ベクターは、 ェピソ一 ムの場合には導入遺伝子の発現が一過性である点が、 一方宿主細胞の染色体に組込まれ る （インテグレーション） 場合には宿主染色体の遺伝子を破壊する、 導入遺伝子のコピ 一数が制御されない、 導入遺伝子が不活性化される、 組込まれた宿主染色体上の制御配 列の影響を受ける、 などの点が問題として挙げられる。
これらを解決する一つの方法として、 本発明者の研究グループはヒ ト 2 1番染色体を 出発材料として、 構造が明らかで不要な遺伝子を除去した、 外来 DNAを簡便に導入可 能な新規の HAC(2 1 HAC)ベクター系を構築した（特許文献 1及び非特許文献 1)。 この中で 2 1 HACベクタ一は、 ヒ トを含む哺乳動物細胞を宿主として自律複製/分配 が可能で安定に保持されること、 宿主染色体を破壊することなく一定コピー数の遺伝子 が導入可能であることを示した。 また、 e x V i v oホルモン補充遺伝子治療を意図し たモデルとして治療甩遺伝子ヒ トエリスロポイエチン （h E PO) を導入した 2 1 HA Cベクターをヒ ト正常初代培養繊維芽細胞に移入できること、 E POを長期間持続発現 できること、 その発現量は CHO細胞での約 1 1 000に発現抑制を受けること、 H AC移入正常初代培養繊維芽細胞を単一コロニーから最大 3. 8 X 1 07細胞まで増幅で きること、 非選択条件下で 6又は 9代継代後 65. 5〜90. 9%保持されること、 を 示してきた （特許文献 1及び非特許文献 2)。
一方、 ヒヒにおける e x v i v o E PO補充遺伝子治療モデルでは、 レトロウィル スベクターで h E P O遺伝子導入したヒヒ初代培養 MS C s (0. 8 1〜6. 6 X 1 06 細胞 Zk g) のカプセル皮下移植により血中 E PO濃度上昇、 貧血回復が報告されてい る （非特許文献 3) 力 遺伝子治療のためには、 細胞あたりの更なる発現量向上が求め られる。 またヒ ト正常初代培養繊維芽細胞の分裂限界を考慮すると細胞分裂回数を少な くするのが望ましく、 i n V i v oで効果を発揮できる状態の治療用 HA C移入細胞を 効率よく増幅するためには、 ベクタ一安定性について改善 ·向上する余地が残されてい る。
上記課題を解決する一つの手段は、 ベクターの基本骨格となるヒ ト染色体として安定 性の高いヒ ト染色体を用いて機能的なテロメァを持つ HACベクターを構築することで ある。 '
外来遺伝子の発現は、 挿入された部位周辺のクロマチン構造や制御配列の有無により 影響されることが知られている。 また染色体を安定に維持するには機能的な十分な長さ のテロメァが必要であること （非特許文献 4) が知られている。 HAC上において、 ク ロマチン構造や制御配列の影響排除のためインスレーターを利用した事例 （非特許文献 2 3) はあるが、 クロマチン 造ゃ制御配列の影響排除の検証はなされておらず、 また テロメァ配列を操作するものではない。 また、 HAC上においてテロメラーゼなどによ るテロメァ配列の付加 ·テロメァ長の回復等、 テロメァ配列操作による H ACベクタ一 安定性向上の検討はなされていない。
相同組換え効率の向上 ·
外来遺伝子を導入する際、 遺伝子導入細胞の選別のために薬剤耐性遺伝子の導入が汎 用される。 多くの場合、 薬剤耐性遺伝子は目的の外来遺伝子と並列して同一ベクター上 に配置ざれる。 遺伝子発現ユニッ トが複数並列すると、 それらが互いに干渉し外来遺伝 子の発現量が減弱することが知られている。 従来、 高発現生産系細胞の構築において、 発現量向上のために、 例えば薬剤耐性遺伝子を e X o nとして分断配置しスプライシン グを経て発現させることにより薬剤耐性能を下げることで、 導入外来遺伝子を高発現す る細胞の選別が行われている （非特許文献 22) が、 薬剤耐性遺伝子そのものの除去に より外来遺伝子の発現が顕著に向上した報告はこれまでない。
また、 薬剤耐性遺伝子除去については、 抗体軽鎖 κ遺伝子座に外来遺伝子をノックィ ンする際、 下流に存在する薬剤耐性遺伝子除去により相同組換え効率が向上することが マウス E S細胞において知られている （特許文献 2) が、 これも外来遺伝子発現を向上 するものではない。
ヒ ト染色体の安定性と遺伝子発現
マウス E S細胞の実験では、 導入した染色体断片が大きいほどこれを保持する細胞の キメラ個体中での寄与率が下がることが知られている。 本発明 ¾"の研究グループは、 マ ウス胚幹細胞に抗体遺伝子を含むヒ ト 1 4番、 2番、 22番染色体断片を移入し、 キメ ラ個体が作製できること、 移入された抗体遺伝子が個体中で機能発現すること、 ヒ ト染 色体断片がキメラ個体で安定に保持されること、 生殖系列を経て次世代伝達可能なこと を示した （非特許文献 5及び 6)。 また、 ヒ ト抗体重鎖遺伝子を保持するマウスを作製す る目的で単離されたヒ ト 1 4番染色体由来の自然断片 S C 20及びこれに抗体軽鎖遺伝 子を含むヒ ト 22番染色体領域をクロ一ニングした HACについて、 マウスで 安定性 と生殖系列伝達を確認した （非特許文献 7)。 さらに上記 S C 20由来 HACは、 体細胞 核移植により作出したクロ一ンゥシ個体で安定に保持されること、 移入された抗体遺伝 子が個体中で機能発現することを示してきた （非特許文献 8)。 一方、 上記のヒ ト 1 4番 染色体由来の自然断片及び HACについて、 ヒ ト正常初代培養細胞及びヒ ト細胞株での 安定性及び発現の検討は未だなされていない。 また、 ヒ ト 2 1番染色体を除くその他の ピト染色体由来の自然断片 び HACについても、 ヒ ト正常初代培養細胞及びヒ ト細胞 株での発現 ·安定性の検討は未だ十分になされていない。 ヒ ト X染色体由来のミニ染色 体がヒ ト細胞株で保持された報告 （非特許文献 9) があるが、 このミニ染色体では継代 後に顕著な多コピー化が認められており、一定のコピー数を維持するには至っていない。 テロメァによる発現 ·安定性の制御
テロメァは、 染色体末端に位置する繰り返し配列で、 酵母からヒ トを含む哺乳動物細 胞まで広い生物種で保存されており、 ヒ ト正常細胞の場合、 （TTAGGG) の繰返しが 1 5〜0. 4 k bの長さに及ぶ。 テロメァは、 細胞分裂の進行とともに短縮し、 テロメ ァ長の減少にともなって異常染色体 （融合 ·脱落 ·分断 ·異数化など） の出現 ·増加が 観察されることから、 染色体の保護 ·安定維持に必要と考えられている （非特許文献 1 0及び 1 1)。 以上のことから、 十分な長さの機能的なテロメァ構造を持つことにより染 色体の安定性が向上すると考えられる。
テロメァ長は、 テロメラ一ゼの強制発現により、 或いはテロメァ結合タンパク質 （P OT · TRF 2) の欠失により人為的に伸長できる （非特許文献 1 2及び 1 3)。 これら の方法によりヒ ト正常初代培養細胞及びヒ ト細胞株において分裂回数の増加 ·寿命延長 は実証されたが、 染色体安定性を回復 ·向上できるかについては依然として明らかでな い。 また、 不死化細胞において、 Crisis後に内在性のテロメラーゼ活性が上昇し短縮し たテロメァが一定の長さに伸長 ·維持されると異常染色体の出現頻度は増減せず維持さ れた （非特許文献 1 4) 例はあるが、 この場合も染色体安定性の回復 ·向上には至って いない。
サブテロメァは、 染色体末端のテロメァ （TTAGGG) n繰返し配列のセントロメ ァ側に隣接して位置し、 分節 ·重複ドメインや （TTAGGG) n様の繰返し配列を持 つ、 約 300〜 500 k bにわたる染色体領域を指す。 分節 ·重複ドメイン構造の持つ 高ホモ口ジーのために、 同一染色体上のサブテ口メァ内又は異なる染色体上のサブテロ メァ間において高頻度で転位や組換えが生じやすいことが知られている （非特許文献 1 5〜 1 7)。 ヒ ト 1 4番染色体長腕のサブテロメァ長は、 分節重複領域として 4 9 9 k b が同定され、 また （TTAGGG) nのテロメァ配列と上記サブテロメァ領域との間に 20 k b以下の未同定配列の存在が示唆されでいる （非特許文献 1 8)。 サブテロメァの 機能は、 その高ホモロジ一を利用した組換え促進によるテロメラーゼ非存在下でのテロ メァ修復 ·維持、 サブテロメァの可塑性による新しい環境への適応、 疾患を引き起こす 転位 ·欠損の誘導などが示唆されているが、 その詳細はまだ明らかではない。
テロメァ又はテロメァ及びサブテロノアと遺伝子発現の関係については、 テロメァ配 列のランダム挿入により染色体末端がテ口メァ配列に置換した染色体を'有する細胞にお いて、 テロメァ近位での外来導入遺伝子発現がヘテロクロマチン化によるサイレンシン グ （テロメアポジション効果 （Telomere position effect) ； TPE) をうけることが観 察されている （非特許文献 1 9)。 TPEに関しては、 テロメァ伸長とサイレンシングは 相関性がある （非特許文献 20) とする報告がある。 一方、 内在性のテロメァ領域遺伝 子群の発現については、 継代前後のヒ ト新生児包皮繊維芽細胞において、 遺伝子発現パ ターンとテロメァ長減少及びテロメァ端からの距離は相関性がなかった （非特許文献 2
1)。 以上のように、 テロメァと遺伝子発現の関係についてはこれまで議論が決着されて いない。
特許文献 1 WO 2004ノ 03 1 38 5号パンフレッ ト
特許文献 2 特開 2006— 94849号公報
非特許文献 1 Katohら、 Biochera Biophys Res Commun; 321： 280-290, 2004年 非特許文献 2 Kakeda ら、 Gene Therapy; 12： 852 - 856, 2005年 非特許文献 3 Bartholomew Aら、 Hum Gene Ther ; 12： 1527-1541, 2001年 非特許文献 4 Smogorzewska Aら、 Anuu. Rev. Biochem.、 第 73卷， ρ· 177-208, 2004 年
非特許文献 5 Tomizukaら， Nature Genet. (USA) , 第 16卷， p. 133-143, 1997年 非特許文献 6 Tomizukaら， P. N. A. S. (USA) , 第 97卷， p. 722-727, 2000年 非特許文献 7 Kuroiwaら， Nature Biotech. (USA) ， 第 18卷， p. 1086-1090, 2000 年
非特許文献 8 Kuroiwa ら， Nature Biotech. (USA) ， 第 20卷， p. 889-894, 2002
¥
非特許文献 9 Mil ls ら， Hura. Mol. Genet. (UK) , 第 8巻， p. 751- 761， 1999年 非特許文献 1 0 Smogorzewska Aら、 Anuu. Rev. Biochem. , 第 73卷， p. 177- 208, 2004年
非特許文献 1 1 Ning Yら、 Hura Mol Genet. , 第 12卷、 p. 1329- 1336, 2003年 非特許文献 1 2 Crisrofari Cら、 EMB0 J、 第 25卷、 p. 565- 574, 2006年 非特許文献 1 3 Smogorzewska Aら、 Anuu. Rev. Biochem.、 第 73卷， p. 177-208,. 2004年
非特許文献 1 4 Counter CMら、 EMB0 J、 第 11卷、 p. 1921- 1929, 1992年 非特許文献 1 5 Mefford H. C.ら、 Nat Rev Genet. , 第 3卷、 p. 91- 102， 2002年 非特許文献 1 6 Riethraan Hら、 Chromosome Res.， 第 13卷、 p. 505- 515, 2005年 非特許文献 1 7 Linardopoulou EVら、 Nature, 第 437巻、 p. 94-100， 2005年 非特許文献 1 8 Riethman Hら、 Genome Res.， 第 14卷、 p. 18 - 28, 2004年 非特許文献 1 9 Tham WHら、 Oncogene, 第 21卷， p. 512- 521， 2002年
非特許文献 2 0 Baur JA et al. , Science, 第 292卷、 p. 2075- 2077、 2001年 非特許文献 2 1 Ning Yら、 Hum Mol Genet. , 第 12卷、 p. 1329 - 1336, 2003年 非特許文献 2 2 Barnett Ri> り、 Antibody expression and engineering, Chapter 3、 p. 27 - 40、 American Chemical Society, 1995年
非特許文献 2 3 Otsuki ら、 Biochem Biophys Res Commun； 329： 1018-1025, 2005 年 発明の開示
本発明は、 細胞中で安定に保持され外来遺伝子を高発現可能なヒ ト人工染色体 （H A c) ベクター及びその作製方法の提供を目的とする。 また本発明は、 遺伝子治療及び再 生医療に有用なヒ ト細胞医薬及びその製造方法の提供を目的とする。 更に本発明は、 治 療用タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するために、 ヒ ト染色体に存在するテロメァ配列及び サブテ口メァ配列に着目し、 人工染色体末端にテロメァ配列及びノ又はサブテ口メァ配 列を含むヒ ト人工染色体ベクターの構築を試みた。
その一例として、 ヒ ト 14番染色体の長腕から、 ヒ ト 1 4番染色体のセントロメァ領 域、 テロメァ配列及びサブテロメァ配列の一部を残して既知の遺伝子の殆どを削除し、 長腕近位に 1 o X P配列を部位特異的に挿入した、 改変ヒ ト染色体 （1 4HAC) べク ターを作製した （図 1)。 この 14 HACベクターを保持する CHO雑種細胞を非選択条 件下で長期継代培養すると、 1 4HACベクターは、 殆ど脱落することなく一定コピー 数で保持されること、この 14 H ACベクターの安定性は従来の 2 1 HACベクター（W 02 994/03 1 38 5号） を顕著に上回ること、 を確認した （図 1 3)。 更に C r e / 1 o x Pシステムにより赤血球増殖因子であるヒ トエリスロポイエチン （h E PO) 遺伝子を導入した 14HACベクターを保持する CHO雑種細胞では、 従来の 2 1 HA Cベクターと比べて 2. 5倍の h E POの発現向上を確認した。 更にこの h E PO遺伝 子を導入した 1 4 HACベクターを保持するヒ ト正常初代培養繊維芽細胞において、 従 来の 2 1 HACベクターの 1 1. 7倍の顕著な h E PO発現向上を確認した （図 2 1 )。 更にまた、 上記の作用効果が何に起因するかを調べることを目的として、 テロメァ配 列とヒ ト 1 4番染色体由来のサブテロメァ配列の一部を持つ HACベクターの発現効率 を比較した結果、 該 HACベクタ一は、 テロメァ配列のみを長腕削除末端に持つ場合と 比べて、 ヒ ト正常繊維芽細胞において約 4倍の h E PO発現向上を実現した。 両者は、 その構造において長腕削除末端のサブテロメァ配列の他は基本骨格の染色体、 外来遺伝 子 （hE PO) 導入位置は同じであることから、 上記の顕著な発現上昇は、 サブテロメ ァ配列を、 削除された長腕末端に持つようにヒ ト 1 4番染色体を改変したことによりも たらされたと考えられた。
ヒ ト人工染色体べクタ一におけるサブテロメァ配列の存在は、 外来遺伝子又は外来 D N Aの発現上昇のみならず、 形質導入された細胞内での該ベクターの安定的な保持、 子 孫伝達率の向上などにも正の影響を及ぼすことが判った。 このような作用効果は、 ヒ ト 14 番人工染色体べクタ一だけでなく ヒ ト 2 1番染色体から同様に作製したヒ ト人工染 色体 （HAC) ベクタ一でも観察されたことから、 上記の作用効果は、 ヒ ト 14番及び 2 1番染色体以外の任意のヒ ト染色体から同様に作製された HACベクタ一であっても、 ヒ ト 1 4番及び 2 1番染色体由来の H ACベクターと同様の作用効果を奏することを意 味する。
これらの知見から、ヒ ト染色体に基づいて構築した HACベクタ一により上記目的（又 は課題） を達成することができることを見出し、 本発明を完成するに至った。
さらに、 本発明者は上記課題を解決するために、 ヒ ト正常細胞又はヒ ト細胞株におい て導入遺伝子を高発現し安定に保持される染色体ベクターを構築することを課題として 鋭意研究を行った。 外来遺伝子を導入する際、 遺伝子発現ユニッ トが複数並列すると互 いに干渉して転写方向下流に位置するュニッ トの発現が減弱することが知られている (Proudfoot NJら、 Nature、 第 332卷、 p. 562—565、 1986年、 Kadesch Tら、 Mol Cell Biol, 第 6卷、 ρ· 2593-2601、 1986年）。 上記の h Ε Ρ Ο導入 2 1 H A Cベクタ一 （W 02994/03 1 38 5号） は hE PO遺伝子発現ュニッ トの下流に隣接して n e o 耐性遺伝子発現ユニッ トが存在する。 そこで h E PO遺伝子発現を向上させる方法とし て、 H ACベクター上から h E PO遺伝子発現ュニッ トの下流に隣接する n e o耐性遺 伝子発現ユニッ トを除去することが考えられる。 すなわち、 ヒ ト染色体の長腕から既知 の遺伝子の殆どを削除した改変染色体を得、 この改変染色体上の長腕近位に 1 o X P配 列及び F RT配列と h CMVプロモーターを部位特異的に挿入し、 この改変染色体を保 持する CHO雑種細胞において C r e/ 1 o X Pシステムにより h E PO遺伝子を外来 遺伝子として改変染色体に導入し、 F L P e/FRTシステムにより n e o耐性遺伝子 発現ユニットを除去し、 更にこの h E PO導入改変染色体保持するヒ ト正常初代培養繊 維芽細胞に移入したところ、 例えば本発明の 14 HACベクターの場合、 従来の 2 1 H ACベクターと比べて平均 1 8. 5倍の h E PO発現向上を確認した （図 2 1)。 これら の知見から、 本発明者らは、 耐性遺伝子発現ユニッ トを削除した HACベクターにより 上記目的 （又は課題） を達成することができること'を見出し、 本発明を完成するに至つ た。
すなわち、 本発明の概要は以下の通りである。
本発明は、 その第 1の態様において、 長腕遠位及び/又は短腕遠位が削除されたヒ ト 染色体断片であって、 ヒ ト染色体由来のセントロメァと、 前記の削除された長腕及び/ 又は短腕の遠位末端部位に付加又は結合されたテロメァ配列及び Z又はサブテロメァ配 列 （好ましくはヒ ト染色体由来のサブテロメァ配列） とを含むヒ ト染色体断片を含むこ とを特徴とするヒ ト人工染色体ベクターを提供する。 本発明は、 一実施形態において、 長腕遠位及び/又は短腕遠位が削除されたヒ ト染色 体断片であって、 （ i、） ヒ ト 1 4番染色体由来のセントロメァ、 （ i i ) テロメァ配列、 並びに （ i i i ) サブテロメァ配列を含むヒ ト 1 4番染色体断片を含むことを特徴とす るヒ ト人工染色体 （HAC) ベクターを提供する。
本発明はまた、 別の実施形態において、 長腕遠位及び/又は短腕遠位が削除されたヒ ト染色体断片であって、 （ i ) ヒ ト 2 1番染色体由来のセントロメァ、 （ i i ) テロメァ 配列、 並びに （ i i i ) サブテロメァ配列を含むヒ ト 2 1番染色体断片を含むことを特 徴とするヒ ト人工染色体 （HAC) ベクターを提供する。
本明細書の全体を通して、 本発明に係る HACベクターは、 天然に存在するヒ ト染色 体断片又は自然発生したヒ ト染色体断片を含むものではないが、 それが上記特徴を有し かつ人為的に単離された場合には本発明に包含されるものとする。
また別の実施形態において、 上記 HACベクターは、 （ i V ) 特定の部位に挿入された 外来 DNA (又は外来遺伝子若しくは外来核酸） を含むものであってもよい。
本発明の別の実施形態において、前記ヒ ト染色体断片のサイズは、通常約 1 M b以上、 例えば約 1Mb以上であって約 1 9Mb以下であり、好ましくは約 1 8 M b以下であり、 さらに好ましくは約 1 7Mb以下である。 し力 し、 このサイズは、 上記の範囲に特に限 定されないものとし、 ヒ ト染色体の種類、 ヒ ト染色体から長腕遠位又は短腕遠位を削除 した後に染色体断片に残る長腕近位の長さ、 或いは短腕近位又は短腕の長さ、 などによ つて影響される。
本発明の実施形態によれば、 ヒ ト染色体断片は、 ヒ ト染色体の長腕遠位が削除されて おり力つ長腕近位及ぴ短腕を含むか、 或いはヒ ト染色体の短腕遠位が削除されておりか つ短腕近位を含むか、 或いはヒ ト染色体の長腕遠位及び短腕遠位がともに削除されてお りかつ長腕近位及び短腕近位を含むことができる。
また、 ヒ ト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位は、 標的とする切断領域の塩基 配列、 例えば米国 National Center for Biotechnology information (NCBI)のオンライ ン ゲ ノ ム ァ 一 タ べ 一 ス Human Genome Resources, (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/genome/guide/human/)の塩 酉己歹 ljを にして標的酉 S歹 ϋ (ターゲティングベクタ一） を設計し、 それを用いて切断 '削除することができる。 本発明の別の実施形態によれば、 ヒ ト染色体断片の長腕遠位は、 ヒ ト染色体長腕の q 1 1領域內又は q 1 1領域から q 1 2領域内で削除される。
本発明のさらに別の実施形態によれば、 ヒ ト染色体断片の短腕遠位は、 ヒ ト染色体短 腕の p 1 1領域内又は p 1 1領域から p 1 2領域内で削除される。
例えば、 前記ヒ ト 14番染色体の長腕遠位は、 例えば 14 q領域内、 好ましくは 14 q 1 1領域内において削除され、 より好ましくは AL 39ュ 1 56において又は A L 3 9 1 1 56よりも近位の位置において、 具体的には A L 39 1 1 56〜CR 38 36 5 9の間で削除され、 さらに好ましくは AL 5 1 2 3 1 0〜CR 38 36 5 9の間で、 さ らに好ましくは A L 92 960 1〜CR 3836 5 9の間で、 さらに好ましくは A L 5 89 1 82〜CR 38 36 59の間で、 さらに好ましくは A L 58 9 74 3〜CR 38
3659の間で、 さらに好ましくは AL 929602〜CR 3 8 36 5 9.の間で、 さら に好ましくは AL 5.1 26 24〜CR 3836 59の間で、 さらに好ましくは CR 38 365 7〜CR 3836 5 9の間で、 さらに好ましくは CR 3 8 36 5 9において削除 される。
また、 前記ヒ ト 14番染色体の短腕遠位は、 例えば 14 p領域内において削除され、 好ましくは 14 p 1 1領域から 14 p 1 2領域内において削除され、 さらに好ましくは 14 p 1 1. 1領域から 1 4 p l l. 2領域内において削除され、 さらに好ましくは 1
4 p 1 1. 1領域内において削除され、 さらに好ましくは RNR 2、 PAB PC P 2か らなる群より選択されるいずれか 1の位置において削除される。
また、 別の例として、 ヒ ト 2 1番染色体の長腕遠位は、 例えば 2 1 q領域内、 好ま しくは 2 1 q l l領域内、 より好ましくは 2 1 q 1 1. 1領域から 2 1 q l l. 2領域 内において削除される。 削除位置は、 例えば、 2 1 q 1 1. 1の NT— 0 1 1 5 1 2よ りも近位、好ましくは NT— 0 1 1 5 1 2含有領域内のうち AL 1 6 202よりも近位、 より好ましくは AL 1 6 202含有領域内の A P 00 1 6 5 7又は AP 00 1 6 5 7よ りも近位である。
また、 前記ヒ ト 2 1番染色体の短腕遠位は、 例えば 2 1 p領域内において削除され、 好ましくは 2 1 p l l . 1領域から 2 1 p l l. 2領域内において削除され、 さらに好 ましくは 2 l p 1 1. 1領域内において削除され、 さらに好ましくは AL 1 63 20 1 の位置において削除される。
また、 一実施形態において、 テロメァ配列は TTAGGGなどの繰り返し配列を持つ 塩基配列である。 この配列は人工的に合成された配列及びヒ トを含む哺乳動物の染色体 長腕又は短腕由来のものなどが挙げられるが、 特に限定されない。 テロメァ配列は、 好 ましくはヒ ト染色体由来のテロメァ配列であり、 より好ましくはサブテロメァ配列と同 じ染色体に由来するものである。 本発明の一実施形態において、 前記テロメァ配列の長さは、 約 0. 4〜50 k bであ り、 好ましくは約 0. 4〜 25 k bであり、 さらに好ましくは約 0. 4〜 1 5 k bであ る。
一実施形態において、 サブテロメァ配列は、 ヒ ト染色体の長腕又は短腕由来のサブテ ロメァ配列であり、 任意のヒ ト染色体由来の、 例えばヒ ト 1 4番染色体又はヒ ト 2 1番 染色'体由来のサブテロメァ配列である。 具体的な実施形態において、 上記ヒ ト染色体断 片は、 ヒ ト染色体から長腕遠位が削除された部位に、 該ヒ ト染色体と同じ又は異なる、 好ましくは同じ、 ヒ ト染色体の長腕由来のサブテロメァ配列を含む。
さらなる本発明の別の実施形態において、 前記.サブテロメァ配列の長さは、 約 1〜5 00 k bであり、 好ましくは約 1〜 300 k bであり、 さらに好ましくは約 1〜 1 00 k bであり、さらに好ましくは約 5〜 60 k bであり、さらに好ましくは 5〜40 k b、 さらに好ましくは約 25〜60 k bでありさらに好ましくは約 25〜40 k bである。 好ましい実施形態において、 ヒ ト 1 4番又は 2 1番染色体断片は、 上記のように削除 された長腕遠位の部位にそれぞれヒ ト 14番又は 2 1番染色体の長腕由来のテロメァ配 列及びサブテロメァ配列を含む。
一実施形態において、ヒ ト 1 4番染色体由来のサブテロメァ配列友びテロメァ配列は、 ヒ ト 14番染色体の 14 q 32領域内の部位から 14 q— t e 1領域までの配列である。 好ましくは、 ヒ ト 14番染色体の 14 q 32. 33領域から 14 q— t e 1領域までの 配列であり、 さらに好ましくはヒ ト 1 4番染色体の A B 0 1 94 3 9、 AB 0 1 943 8, AB 0 1 9437のいずれかのマーカーから 1 4 q— t e 1領域までの配列であり、 特に好ましくは、 ヒ ト 14番染色体の A B 0 1 943 7から 14 q_ t e 1領域までの 配列である。
また、 別の実施形態において、 ヒ ト 2 1番染色体由来のサブテロメァ配列及びテロメ ァ配列は、 ヒ ト 2 1番染色体の 2 1 q 2 2. 3領域から 2 1 q-t e 1領域内のテロメァ 末端までの配列及びテロメァ配列である。 サブテロメァ配列は、 好ましくは、 ヒ ト 2 1 番染色体の 2 1 q-t e 1領域内の任意の部位からテロメァ末端までの配列であり、さら に好ましくは 2 1 q- t e 1領域内の NT_0 1 1 5 1 5からテロメァ末端までの配列 である。
さらなる実施形態において、 本発明に係るヒ ト人工染色体べクタ一は、 前記ヒ ト染色 体断片が少なく とも 1つの部位特異的組換え酵素の認識部位をさらに含むことができる。 例えば、 ヒ ト染色体断片の長腕近位及び/又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識 部位が挿入される。
好ましい実施形態においては、 部位特異的組換え酵素の認識部位は、 ヒ ト染色体の長 腕又は短腕の削除部位 （又は削除位置） よりもセントロメァ側 （すなわち、 「近位」） に 揷入される。
例えばヒ ト 14番染色体の場合、. 部位特異的組換え酵素の認識部位は、 1 4 q領域内 において、 好ましくはヒ ト 1 4番染色体の長腕近位の 1 4 q 1 1領域内における前記削 除位置より近位において、さらに好ましくは AL 3 9 1 1 56〜CR 38 3659の間、 さらに好ましくは AL 5 1 23 1 0〜CR 3836 5 9の間、 さらに好ましくは AL 9 296 0 1〜CR 38 36 5 9の間、 さらに好ましくは AL 5 8 9 1 8 2〜CR 38 3 6 59の間、 さらに好ましくは AL 58 9 74 3〜CR 38 36 5 9の間、 さらに好ま しくは し 92 9602〜CR 38 365 9の間、 さらに好ましくは AL 5 1 2624 〜CR 38 36 5 9の間、さらに好ましくは CR 383 6 5 7〜CR 38 36 59の間、 さらに好ましくは CR 3 836 5 9における前記削除位置より近位に挿入される。 また 別の実施形態において、 部位特異的組換え酵素の認識部位は、 ヒ ト 14番染色体の短腕 に、 例えば 14 p镇域内において、 さらに好ましくはヒ ト 1 4番染色体の短腕近位の 1.
4 p 1 1領域から 1 4 p 1 2領域内において、 さらに好ましくはヒ ト 1 4番染色体の短 腕近位の 1 4 p 1 1領域内における前記削除位置より近位に挿入される。
さらに、 例えばヒ ト 2 1番染色体の場合、 部位特異的組換え酵素の認識部位は、 2 1 q領域内において、 好ましくはヒ ト 2 1番染色体の長腕近位の 2 1 q 1 1. 1領域から 2 1 q 1 1. 2領域内における削除位置より近位において、 例えば、 2 1 q 1 1. 1の NT— 0 1 1 5 1 2領域における、 好ましくは NT— 0 1 1 5 1 2含有領域内のうち A L 1 6 202領域における、 より好ましくは AL 1 6 202含有領域内の A P 00 1 6
5 7の削除位置か或いは AP 00 1 6 5 7における削除位置より近位に挿入される。 ま た別の実施形態において、 部位特異的組換え酵素の認識部位は、 ヒ ト 2 1番染色体の短 腕に、 例えば 2 1 p領域内において、 好ましくは 2 1 p 1 1. 1領域から 2 1 p 1 1.
2領域内において、 さらに好ましくはヒ ト 2 1番染色体の短腕近位の 2 1 p 1 1. 1領 域内において、 さらに好ましくは A L 1 63 20 1の位置における前記削除位置より近 位に挿入される。
好ましい実施形態においては、 部位特異的組換え酵素が C r e酵素であり、 部位特異 的組換え酵素の認識部位が 1 o x P配列である。 別の好ましい実施形態においては、 部 位特異的組換え酵素が F L P e酵素であり、 部位特異的組換え酵素の認識部位が FRT 配列である。
本発明の別の実施形態において、 本発明に係るヒ ト人工染色体ベクターは、 少なく と も 2種類の部位特異的組換え酵素の認識部位を含むヒ ト染色体断片を含むものであり、 例えば、 前記ヒ ト染色体の長腕近位及び 又は短腕近位に少なくとも 2種類の部位特異 的組換え酵素の認識部位が挿入されている。 これにより 1種類の部位特異的組換え酵素 ノ認識部位を外来遺伝子の導入に使用し、 別の種類の部位特異的組換え酵素/認識部位 を不要になった薬剤耐性遺伝子発現ュニッ トの除去などに使用することが可能となる。 この場合における部位特異的組換え酵素の複数の認識部位は、 上記と同様に、 ヒ ト染 色体の長腕又は短腕の削除部位よりもセントロメァ側 （近位） に揷入される。
例えばヒ ト 14番染色体の場合、 部位特異的組換え酵素の認識部位は、 上記と同様で あり、 すなわち、 14 q領域内において、 好ましくはヒ ト 14番染色体の長腕近位の 1
4 q 1 1領域内における前記削除位置より近位において、 さらに好ましくは AL 3 9 1 1 56 CR 3836 5 9の間、 さらに好ましくは A L 5 1 23 1 0 CR 3836 5 9の間、 さらに好ましくは A L 9 2960 1 C R 3836 5 9の間、 さらに好ましく は AL 58 9 1 8 2 CR 3836 59の間、 さらに好ましくは AL 58 9 743 C R 38 36 59の間、 さらに好ましくは A L 92 9602 C R 3 8 36 5 9の間、 さ らに好ましくは AL 5 1 26 24 CR 38 36 59の間、 さらに好ましくは CR 38 36 5 7 CR 38 36 5 9の間、 さらに好ましくは CR 38 3 6 5 9における前記削 除位置より近位に挿入される。 また別の実施形態において、 部位特異的組換え酵素の認 識部位は、 ヒ ト 1 4番染色体の短腕に、 例えば 14 p領域内において、 さらに好ましく はヒ 卜 14番染色体の短腕近位の 14 p 1 1領域から 14 p 1 2領域内において、 さら に好ましくはヒ ト 1 4番染色体の短腕近位の 14 p 1 1領域内における前記削除位置よ り近位に挿入される。
さ に、 例えばヒ ト 2 1番染色体の場合、 部位特異的組換え酵素の認識部位は、 2 1 q領域内において、 好ましくはヒ ト 2 1番染色体の長腕近位の 2 1 q 1 1. 1領域から 2 1 q 1 1. 2領域内における削除位置より近位において、 例えば、 2 1 q 1 1. 1の NT— 0 1 1 5 1 2領域における、 好ましぐは NT— 0 1 1 5 1 2含有領域内のうち A L 1 6 202領域における、 より好ましくは AL 1 6 20 2含有領域内の A P 00 1 6
5 7の削除位置か或いは AP 00 1 6 5 7における削除位置より近位に挿入される。 ま た別の実施形態において、 部位特異的組換え酵素の認,識部位は、 ヒ ト 2 1番染色体の短 腕に、 例えば 2 1 p領域内において、 好ましくは 2 1 p 1 1. 1領域から 2 1 p 1 1. 2領域内において、 さらに好ましくはヒ ト 2 1番染色体の短腕近位の 2 l p 1 1. 1領 域內において、 さらに好ましくは A L 1 6 320 1の位置における前記削除位置より近 位に挿入される。
また好ましい実施形態においては、 部位特異的組換え酵素が C r e酵素及び Z又は F L P e酵素であり、 部位特異的組換え酵素の認識部位が 1 o X P配列及び 又は FRT 配列である。
また第 2の態様において、 本発明は、 上記ヒ ト人工染色体 （HAC) ベクターを保持 する細胞を提供する。 かかる細胞としては、 哺乳動物細胞、 好ましくはヒ ト細胞 （例え ば胚性及び体性幹細胞、 体細胞、 正常体細胞、 上皮細胞、 神経細胞、 線維芽細胞、 良性 又は悪性腫瘍細胞、 内皮細胞、 真皮細胞、 基底細胞、 心筋細胞、 骨格筋細胞、 間質細胞、 骨髄細胞、 血球細胞、 脂肪細胞、 骨細胞、 軟骨細胞、 毛細胞、 肝臓細胞、 すい臓細胞、 腎臓細胞、 羊膜細胞、視覚細胞、聴覚細胞、嗅覚細胞）、 チャイニーズハムスター卵巣（C HO) 細胞、 3 T 3細胞、 BHK細胞、 29 3細胞、 A 9細胞などを用いることができ る。 '
また、本発明は、その第 3の態様において、以下のステップを含むヒ ト人工染色体（H AC) ベクターの作製方法を提供する ：
(a) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する細胞を得るステップ ；
(b) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠位及び Z又は短腕遠位を削除する ステップ；
( c ) 削除される長腕及び/又は短腕の部位にテ口メァ配列を付加するステップ；並 びに
( d )削除される長腕及び/又は短腕の部位にサブテロメァ配列を付加するステップ。 . テロメァ配列とサブテロメァ配列を 1つの配列として作製したときには、 ステップ (c) 及びステップ （d) を 1つのステップとして上記配列を、 上記削除された長腕及 び/又は短腕の^位に付加することができる。
本発明の一実施形態において、 ステップ （a) においては、.前記ヒ ト染色体又はヒ ト 染色体断片を保持する細胞として相同組換え効率の高いものを用いる。 好ましい実施形 態においては、 相同組換え効率の高い細胞はニヮ トリ DT 40細胞由来のものである。 また本発明の一実施形態において、 ステップ （b) においては、 ヒ ト染色体又はヒ ト 染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位の削除は、 部位特異的組換え酵素を用いて行 うことができる。 例えば、 部位特異的組換え酵素を用いて、 ヒ ト染色体又はヒ ト染色体' 断片の長腕遠位及び 又は短腕遠位を、 テロメァ配列及び/又はサブテロメァ配列との 置換により削除することができる。
好ましい実施形態においては、 ヒ ト 14番染色体又はヒ ト 1 4番染色体断片の長腕遠 位を 1 4 q領域、 好ましくは 1 4 q 1 1領域から 14 q 1 2領域において削除し、 短腕 遠位を 14 p 1 2領域内において削除する。 またさらに好ましい実施形態においては、 ヒ ト 1 4番染色体又はヒ ト 1 4番染色体断片の長腕遠位を A L 3 9 1 1 56において又 は AL 39 1 1 5 6よりも近位の位置において、 具体的には A L 3 9 1 1 56〜CR 3 836 5 9の間において、 さらに好ましくは AL 5 1 23 1 0〜CR 38 36 5 9の間 で、 さらに好ましくは AL 9 2960 1〜CR 3 8365 9の間で、 さらに好ましくは AL 58 9 1 82〜CR 38 36 59の間で、 さらに好ましくは A L 58 9 743〜C R 3836 5 9の間で、さらに好ましくは AL 929602〜CR 38 36 5 9の間で、 さらに好ましくは AL 5 1 26 24〜CR 38 36 5 9の間で、 さらに好ましくは CR 3836 5 7〜CR 3836 59の間で、 さらに好ましくは CR 38 3 6 59〜CR 3 8365 9の間において削除する。 別の実施形態において、 ヒ ト 14番染色体の短腕遠 位を例えば 14 p領域内において削除し、 好ましくは 14 p 1 1領域から 14 p 1 2領 域内において削除し、 さらに好ましくは 14 p 1 1. 1領域から 1 4 p l l . 2镇域内 において削除し、 さらに好ましくは 1 4 p 1 1. 1領域内において削除し、 さらに好ま しくは RNR 2、 PAB PCP 2からなる群より選択されるいずれか 1の位置において 削除する。
別の実施形態において、 ヒ ト 2 1番染色体又はヒ ト 2 1番染色体断片の長腕遠位を 2 1 q領域、好ましくは 2 1 q 1 1. 1領域から 2 1 q 1 1. 2領域内において削除し、 短腕遠位を 2 1 p l l . 1領域から 2 1 q l l . 2領域內において削除する。 ヒ ト 2 1 番染色体又はヒ ト 2 1番染色体断片の長腕遠位を、 例えば、 2 1 q l l . 1の NT— 0 1 1 5 1 2を含む領域内、 好ましくは NT— 0 1 1 5 1 2含有領域内のうち AL 1 6 2 02を含む領域内、 より好ましくは AL 1 6 202含有領域内の A P 00 1 6 5 7にお いて或いは AP 00 1 6 5 7より近位において削除する。 また、 前記ヒ ト 2 1番染色体 の短腕遠位を、 例えば 2 1 p領域内において、 好ましくは 2 1 p 1 1. 1領域から 2 1 p 1 1. 2領域内において、 さらに好ましくは 2 1 p 1 1. 1領域内において、 さらに 好ましくは AL 1 6 3 20 1の位置において削除する。
. また更に本発明の一実施形態において、 ステップ （b) 及び （c) においては、 ヒ ト 染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠位及び Z又は短腕遠位の削除をテロメァ配列との置 換により削除して、 ヒ ト染色体断片にテロメァ配列を付加することができる。 別の実施 形態において、 ステップ （b ) 及び （c ) においては、 ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片 の長腕遠位及びノ又は短腕遠位の削除をテロメァ配列及びヒ ト染色体由来のサブテロメ ァ配列との置換により削除して、 ヒ ト染色体断片にテロメァ配列及びサブテロメァ配列 を付加することができる。 上記ヒ ト染色体由来のサブテロメァ配列は、 ヒ ト染色体、 限 定するものではないが、 例えばヒ ト 1 4番染色体及びヒ ト 2 1番染色体由来のものであ ることが好ましい。
好ましい実施形態において、 ステップ （b ) 及び （c ) においては、 ヒ ト染色体又は ヒ ト染色体断片の長腕遠位及び 又は短腕遠位に,おける少なくとも 2箇所を切断するこ とにより、 該長腕遠位及び 又は短腕遠位を削除し、 かつ削除された長腕及び Z又は短 腕の部位にテロメァ配列を付加することができる。
別の好ましい実施形態において、 ステップ （b ) 〜 （d ) においては、 ヒ ト染色体又 はヒ ト染色体断片の長腕遠位及び Z又は短腕遠位における少なく とも 2箇所を切断する ことにより、 該長腕遠位及び Z又は短腕遠位を削除し、 かつ削除された長腕及び Z又ほ 短腕の部位に該ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片由来のテロメァ配列及びサブテロメァ配 列を付加する。
また、 好ましい実施形態においては、 テロメァ配列及びサブテロメァ配列は、 ヒ ト 1 4番染色体の 1 4 q 3 2領域内の部位から 1 4 q _ t e 1領域までの配列である。 さら に好ましくは、 ヒ ト 1 4番染色体の 1 4 q 3 2 . 3 3領域から 1 4 q— t e 1領域まで の配列である。
また、 別の好ましい実施形態において、 ヒ ト 2 1番染色体由来のサブテロメァ配列及 びテロメァ配列は、 ヒ ト 2 1番染色体の 2 1 q 2 2 . 3領域から 2 1 q - t e 1領域内の テロメァ末端までの配列及びテロメァ配列である。 サブテロメァ配列は、 好ましくは、 ヒ ト 2 1番染色体の 2 1 q - t e 1領域内の任意の部位からテロメァ末端までの配列で あり、さらに好ましくは 2 1 q - t e 1領域内の N T— 0 1 1 5 1 5からテロメァ末端ま での配列である。
具体的な実施形態において、 部位特異的組換えシステム、 例えば C r e — 1 o X Pシ ステム又は F L P e—F R Tシステムの利用により基本骨格となる出発材料であるヒ ト 染色体由来の天然テ口メァ配列及び/又はサブテ口メァ配列を残すように、 長腕遠位及 び 又は短腕遠位の削除を行う。 例えば、 ステップ （b ) 〜 （d ) において、 ヒ ト染色 体又はヒ ト染色体断片の長腕 q 1 1領域内又は q 1 1 - q 1 2領域内において長腕遠位 を削除して、 削除された長腕に該ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片のテロメァ配列及びサ ブテロメァ配列、 例えばヒ ト 1 4番染色体の場合、 例えば 1 4 q 3 2領域内の部位から 14 q - t e 1領域までのテロメァ配列及びサブテロメァ配列、 またヒ ト 2 1番染色体 の場合、 例えば 2 1 q 22. 3領域内の部位から 2 1 q- t e 1領域までのテロメァ配列 及びサブテ口メァ配列を付加する。.
前記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠位の削除は、 例えば、 長腕遠位及び近位 に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入し、 部位特異的組換えによりこれら 2つの認 識部位間を欠失して行う。
好ましい実施形態においては、 部位特異的組換え酵素の認識部位は、 ヒ ト 1 4番染色 体又はヒ ト 14番染色体断片の長腕遠位の 1 4 q 3 2領域より遠位にかつ長腕近位の 1 4 q 1 1領域より近位に、 更に好ましくはの長腕遠位の A B 0 1 943 7より遠位にか つ長腕近位の AL 3 9 1 1 56より近位に挿入される。 また、 別の好ましい実施形態に おいては、 部位特異的組換え酵素の認識部位は、 ヒ ト 2 1番染色体又はヒ ト 2 1番染色 体断片の長腕遠位の 2 1 q 22領域より遠位にかつ長腕近位の 2 1 q 1 1領域より近位 に、 更に好ましくは長腕遠位の 2 1 q 22. 3より遠位に、 例えば NT— 0 1 1 5 1 5 の位置に、 かつ、 長腕近位の 2 1 q l l . 2より近位に、 例えば NT— 0 1 1 5 1 2よ り遠位に、好ましくは A L 1 6 202より遠位に、例えば NT— 0 1 1 5 1 5の位置に、 より好ましくは A P 00 1 6 5 7の位置に又は A P 00 1 6 5 7より遠位に、 それぞれ 挿入される。
別の好ましい実施形態においては、 部位特異的組換え酵素が C r e酵素であり、 部位 特異的組換え酵素の認識部位が 1 o X P配列である。 さらに好ましい実施形態において は、 部位特異的組換え酵素が F L P e酵素であり、 部位特異的組換え酵素の認識部位が FRT配列である。
さらにまた、 前記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の短腕遠位の削除は、 例えば、 短腕遠 位及び近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入し、 部位特異的組換えによりこれ ら 2つの認識部位間を欠失して行う。 好ましい実施形態においては、 部位特異的組換え 酵素の認識部位は、 ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の短腕遠位の例えば短腕 p領域內ょ り遠位に、 好ましくは p 1 1領域内または p 1 1領域から p 1 2領域内より遠位に、 さ らに好ましくは p 1 1領域内より遠位に、 かつ、 短腕近位の p 1 1領域内または p 1 1 領域から p 1 2領域内より近位に挿入される。
例えば、 ヒ ト 14番染色体又はヒ ト 1 4番染色体断片の場合、 部位特異的組換え酵素 の認識部位は、 短腕遠位の例えば 14 p領域内より遠位に、 好ましくは 1 4 p 1 1領域 から 14 p 1 2領域内より遠位に、 さらに好ましくは 14 p 1 1領域內より遠位に、 か つ、 短腕近位の 1 4 p 1 1領域から 14 p 1 2領域内より近位に、 好ましぐは 1 4 p 1 1領域内より近位に、 さらに好ましくは 1 4 p 1 1. 1領域から 14 p l l . 2領域內 より近位に、 さらに好ましくは 14 p 1 1. 1領域内より近位に、 さらに好ましくは R NR 2、 PAB PCP 2からなる群より選択されるいずれか 1の位置より近位に揷入さ れる。 またヒ ト 2 1番染色体又はヒ ト 2 1番染色体断片の場合、 部位特異的組換え酵素 の認識部位は、 ヒ ト 2 1番染色体の短腕の例えば 2 1 p領域内より遠位に、 好ましくは 2 1 p 1 1. 1領域から 2 1 p l l . 2領域内より遠位に、 さらに好ましくは 2 1 p l 1領域内より遠位に、 かつ、 短腕近位の 2 1 p 1 1領域から 2 1 p 1 2領域内より近位 に、 好ましくは 2 1 p 1 1領域内より近位に、 さらに好ましくは 2 1 p 1 1. 1領域か ら 2 1 p 1 1. 2領域内より近位に、 さらに好ましくは 2 1 p 1 1. 1領域内より近位 に、 さらに好ましくは A L 1 6320 1の位置より近位に挿入される。
また好ましい実施形態においては、 部位特異的組換え酵素が C r e酵素であり、 部位 特異的組換え酵素の認識部位が 1 o X P配列である。 さらに好ましい実施形態において は、 部位特異的組換え酵素が F L P e酵素であり、 部位特異的組換え酵素の認識部位が FRT配列である。
別の実施形態において、 本発明に係る HACベクターの作製方法は、 （e) ヒ ト染色体 又はヒ ト染色体断片に少なく とも 1つの部位特異的組換え酵素の認識部位を揷入するス テツプをざらに含んでもよい。
本発明の一実施形態において、 ステップ （e) においては、 部位特異的組換え酵素が C r e酵素であり、 部位特異的組換え酵素の認識部位が 1 o X P配列である。 別の実施 形態において、 ステップ （e) においては、 部位特異的組換え酵素が F L P e酵素.であ り、 部位特異的組換え酵素の認識部位が FRT配列である。
さらなる実施形態において、 部位特異的組換え酵素の認識部位は、 例えばヒ ト 1 4番 染色体又はヒ ト 1 4番染色体断片の A L 39 1 1 56における前記削除位置又は A L 3 9 1 1 56より近位の位置に、 さらに好ましくはヒ ト 14番染色体又はヒ ト 14番染色 体断片の短腕近位の 14 p 1 2領域內における前記削除位置より近位の位置に挿入する ことができる。
部位特異的組換え酵素の認識部位は、 例えば 1 4 q領域內において、 好ましくはヒ ト 1 4番染色体又はヒ ト 14番染色体断片の長腕近位の 14 q 1 1領域内における前記削 除位置より近位において、 さらに好ましくは AL 3 9 1 1 56、 さらに好ましくは A L
5 1 2 3 1 0、 さちに好ましくは AL 92960 1、 さらに好ましくは A L 589 1 8 2、 さらに好ましくは AL 58 9 74 3、 さらに好ましくは A L 929602、 さらに 好ましくは AL 5 1 26 24、 さらに好ましくは C R 38 36 5 7、 さらに好ましくは CR 38 36 59領域内における前記削除位置より近^ Ϊにおいて、 また例えばヒ ト 1 4 番染色体又はヒ ト 1 4番染色体断片の短腕近位の 1 4 p領域内、 さらに好ましくはヒ ト 1 4番染色体の短腕近位の 14 p 1 2領域内、 さらに好ましくは 1 4 p 1 1領域内、 に おける前記削除位置より近位に挿入することができる。
別の実施形態において、 部位特異的組換え酵素の認識部位は、 例えばヒ ト 2 1番染色 体又はヒ ト 2 1番染色体断片の A P 00 1 6 5 7における前記削除位置又は A P 00 1
6 5 7より近位の位置に、 さらに好ましくはヒ ト 2 1番染色体又はヒ ト 2 1番染色体断 片の短腕近位の 2 1 p 1 1-p 1 2領域内における削除位置より近位の位置に揷入する ことができる。
さらに本発明は、 その第 4の態様において、 上記作製方法により得られる、 ヒ ト人工 染色体 （HAC) ベクターを提供する。
本発明はさらに、その第 5の態様において、以下のステップを含むことを特徴とする、 外来 DNAを含むヒ ト人工染色体ベクターの作製方法を提供する ：
(a) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する細胞を得るステップ；
(b) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠位及び Z又は短腕遠位を削除する ステップ；
(c) 削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメァ配列を付加するステップ；
( d ) 削除される長腕及び Z又は短腕の部位にサブテロメァ配列を付加するステップ (e) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に少なく とも 1つの部位特異的組換え酵素の認 識部位を挿 Vするステップ；並びに
( f ) 部位特異的組換え酵素の存在下にてヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に外来 DN
Aを挿入するステップ。
また本発明の第 6の態様において、 以下のステップを含むことを特徴とする外来 DN
Aを含むヒ ト人工染色体ベクターの作製方法を提供する ：
(a) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する細胞を得るステップ；
(b) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除する ステップ； ( c ) 削除される長腕及び 又は短腕の部位にテ口メァ配列又はテロメァ配列及びサ ブテロメァ配列を付加するステップ；
(d) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に少なく とも 2種類の部位特異的組換え酵素の 認識部位を挿入するステップ；
(e) 部位特異的組換え酵素の存在下にてヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に外来 DN Aを挿入するステップ；並びに
( f ) ステップ （e) で用いたものとは異なる種類の部位特異的組換え酵素の存在下 にてヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片上の薬剤耐性遺伝子を除去するステップ。
好ましい実施形態において、 ヒ ト染色体は、 ヒ ト 14番染色体及びヒ ト 2 1番染色体 である。
一実施形態において、 少なく とも 2種類の部位特異的組換え酵素とその認識部位は、 C r e酵素と 1 o X P配列、 及び F L P e酵素と F R E T配列である。 また一実施形態 において、 薬剤耐性遺伝子はネオマイシン耐性遺伝子である。
上記の第 5及び第 6の態様の一実施形態において、 外来 DNAの挿入位置、 すなわち 部位特異的組換え酵素の挿入位置は、 前述の部位特異的組換え酵素の挿入位置と同じで ある。 例えば、 ヒ ト 14番染色体については、 長腕近位 1 4 q 1 1より近位、 さらに好 ましくは長腕近位の A L 3 9 1 1 56 (G e n B a n k登録番号） における前記削除位 置より近位、 又はヒ ト 1 4番染色体の短腕上、 好ましくは短腕近位の 14 p 1 2領域内 における前記削除位置より近位などが挙げられるが、 この位置に特に限定されない。 ま た、 ヒ ト 2 1番染色体については、 長腕近位の 2 1 q 1 1. 2より近位、 好ましくは 2 1 q 1 1. 1より近位、 より好ましくは AL 1 6 202より近位、 さらに好ましくは長 腕近位の A P 00 1 6 5 7 (G e nB a n k登録番号） の削除位置か又は A P 00 1 6 5 7における削除位置より近位、 或いはヒ ト 2 1番染色体の短腕上、 好ましくは短腕近 位の 2 1 p l l . 2領域内における削除位置より近位などが挙げられるが、 この位置に 特に限定されない。
好ましい実施形態において、 外来 DN Aの挿入位置は、 前記ヒ ト染色体断片端のテロ メァ配列から約 1〜 500 k bであり、 好ましくは約 1〜 300 k bであり、 さらに好 ましくは約 1〜 1 00 k bであり、 さらに好ましくは約 5〜 6 0 k bであり、 さらに好 ましくは 5〜40 k bであり、 さらに好ましくは約 2 5〜60 k bであり、 さらに好ま しくは約 25〜40 k bである。
また第 7の態様において、 本発明は、 上記作製方法により得られる、 外来 DNAを含 むヒ ト人工染色体べクタ一である。
さらに第 8の態様において、 本発明は、 外来 DNAを含むヒ ト人工染色体べクタ一を 保持する細胞を提供する。 かかる細胞としては、哺乳動物細胞、好ましくはヒ ト細胞 （例 えば胚性及び体性幹細胞、 体細胞、 正常体細胞、 上皮細胞、 神経細胞、 線維芽細胞、 良 性又は悪性腫瘍細胞、 内皮細胞、 真皮細胞、 基底細胞、 心筋細胞、 骨格筋細胞、 間質細 胞、 骨髄細胞、 血球細胞、 脂肪細胞、 骨細胞、 軟骨細胞、 毛細胞、 肝臓細胞、 すい臓細 胞、 腎臓細胞、 羊膜細胞、 視覚細胞、 聴覚細胞、 嗅覚細）、 チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞、 3 T 3細胞、 BHK細胞、 2 93細胞、 A 9細胞などを用いることが できる。
本発明はさらに、 その第 9の態様において、 上記 HACベクタ一又は外来 DNAを含 む HACベクターを保持する細胞を含む医薬組成物を提供する。 かかる場合、 外来 DN Aは、 以下のものに限定されないが、 例えばエリスロポイエチン （EPO)、 トロンボポ イエチン （TPO)、 血液凝固因子、 フォンヴィルブランド因子 （vWF)、 ジス トロフ ィン、 ドーパミ ン合成酵素、 インス リ ン、 ィンス リン様増殖因子 （ I GF)、 インス リ ン 様増殖因子結合タンパク質 （ I GFB P)、 抗体、 テロメラーゼ、 顆粒球コロニー刺激因 子、 顆粒球 'マクロファージコロニー刺激因子、 免疫グロブリン、 成長ホルモン、 イン ターロイキン 2、 インタ一ロイキン 3、 インターロイキン 4、 インターロイキン 5、 ィ ンターロイキン 6、 インタ一ロイキン 7、 インターロイキン 8、 インターロイキン 9、 インターロイキン 1 0、 インタ一ロイキン '1 1、 ィ'ンターロイキン 1 2、 インタ一ロイ キン 1 5、 CD 40リガンド、 インターフェロン、 アデノシンデァミナーゼ、 α— 1ァ ンチドリプシン、 オル二チントランス力ルバミラ一ゼ、 プリンヌクレオチドホスホリラ —ゼ、 成長抑制因子 （G I F)、 腫瘍壊死因子 （TNF)、 白血病阻害因子 （L I F)、 ォ ンコスタチン M、 F 1 t 3リガンド （F l t 3 L)、 ス トローマ由来因子 （S D F)、 幹 細胞増殖因子 （SCF)、 繊維芽細胞増殖因子 （FGF)、 上皮増殖因子 （EGF)、 血管 形成誘導因子 （VEGF)、 アンジォポイエチン、 神経成長因子 （NGF)、 骨形成因子
(BMP)、ァクチビン、 トランスフォーミング増殖因子（TGF)、 ウィント （Wn t)、 アールスポンジン （R s p o n d i n)、 モノクロナール抗体、 ォリ ゴクローナル抗体、 及びポリクローナル抗体などをコ一ドする遺伝子を挙げることができる。
また本発明は、 その第 1 0の態様において、 以下のステップを含む、 外来 DNAを受 容細胞に導入する方法を提供する ：
(a) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ； (b) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠位及び 又は短腕遠位を削除する ステップ；
( c ) 削除される長腕及び 又は短腕の部位にテロメァ配列を付加するステップ；
( d)削除される長腕及び 又は短腕の部位にサブテロメァ配列を付加するステップ；
(e) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に少なく とも 1つの部位特異的組換え酵素 の認識部位を揷入するステップ；
( f ) 部位特異的組換え酵素の存在下にて上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に外来 DNAを挿入するステップ；
(g) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製 するステップ；
(h) 上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
( i ) 融合した受容細胞において外来 DNAの導入を確認するステップ。
本発明の一実施形態において、 上記受容細胞は、 動物細胞、 好ましくは哺乳動物細胞 である。 また、上記受容細胞は、多分化能を有する細胞、例えば胚性幹細胞（E S細胞）、 並びに間質系幹細胞及び組織幹/前駆細胞などであってもよい。
さらに本発明は、 その第 1 1の態様において、 以下のステップを含む、 外来 DNAを 発現する細胞の作製方法を提供する ：
(a) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ；
(b) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除する ステップ；
( c ) 削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメァ配列を付加するステップ； ( d )削除される長腕及び/又は短腕の部位にサブテロメァ配列を付加するステップ；
. (e) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入 するステップ；
( f ) 部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に外来 DNAを揷入するステップ；
(g) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製 するステップ；
(h) 上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
( i ) 融合した受容細胞において外来 DNAを発現する細胞を選択するステップ。 本発明の一実施形態において、 上記受容細胞は、 動物細胞、 ましくは哺乳動物細胞 である。 また、上記受容細胞は、多分化能を有する細胞、例えば胚性幹細胞（E S細胞）、 並びに間質系幹細胞及び組織幹 Z前駆細胞などであつてもよい。
またさらに本発明は、 その第 1 2の態様において、 以下のステップを含む、 タンパク 質の製造方法を提供する ：
(a) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ；
(b) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除する ステップ；
( c ) 削除される長腕及び 又は短腕の部位にテ口メァ配列を付加するステップ；
(d)削除される長腕及び 又は短腕の部位にサブテロメァ配列を付加するステップ；
(e) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入 するステップ；
( f ) 部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片にタン パク質をコードする外来 DN Aを揷入するステップ；
(g) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製 するステップ； .
(h) 上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；
( i ) 融合した受容細胞を培地中で培養するステップ；並びに
( j ) 得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップ。
本発明の一実施形態において、 上記タンパク質としては、 例えば、 エリスロボイエチ ン （E PO)、 トロンボポイエチン （TPO)、 血液凝固因子、 第八因子、 第九因子、 フ オンヴィルブランド因子（vWF)、ジストロフィン、 ドーノ ミン合成酵素、インスリン、 インスリン様増殖因子（ I GF)、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ I GF B P)、 抗体、 テロメラーゼ、 顆粒球コロニー刺激因子、 顆粒球 .マクロファージコロニー刺激 因子、 免疫グロブリン、 成長ホルモン、 インターロイキン 2、 インターロイキン 3、 ィ ンタ一ロイキン 4、 インタ一ロイキン 5、 インターロイキン 6、 インターロイキン 7、 インターロイキン 8、 インターロイキン 9、 インターロイキン 1 0、 インター πィキン 1 1、 インターロイキン 1 2、 インターロイキン 1 5、 CD40リガンド、 インターフ ェロン、 アデノシンデァミナーゼ、 α— 1アンチトリプシン、 オル二チントランスカル バミラーゼ、 プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、 成長抑制因子 （G I F)、 腫瘍壊死因 子 （TNF)、 白血病阻害因子 （L I F)、 オンコスタチン M、 F 1 t 3 リガンド （F 1 t 3 L)、 ス トロ一マ由来因子 （SDF)、 幹細胞増殖因子 （SCF)、 繊維芽細胞増殖因 子 （FGF)、 上皮増殖因子 （EGF)、 血管形成誘導因子 （VEGF)、 アンジォポイエ チン、 神経成長因子 （NGF)、 骨形成因子 （BMP)、 ァクチビン、 トランスフォーミ ング増殖因子 （TGF)、 ウィント （Wn t )、 アールスポンジン （R s p o n d i n)、 モノクロナール抗体、 オリゴクローナル抗体、 及びポリクロ一ナル抗体などが挙げられ る。
本発明に関わる用語の定義は以下の通りである。
本明細書中、 「ヒ ト人工染色体ベクター」 又は 「HACベクター」 とは、 ヒ ト染色体に 基づいて作製された人工染色体を指す。
また本明細書中、 「ヒ ト染色体」 とは、 ヒ ト細胞由来の天然の DNAとタンパク質との 複合体を指す。 正常なヒ ト染色体は 23種 （雄は 24種） （すなわち、 常染色体である 1 番染色体から 22番染色体、 並びに、 性染色体である X染色体及ぴ Y染色体） 46本存 在し、それぞれ約 50〜300Mbの長さの DN Aを含むことが知られている。また「ヒ ト染色体断片」 とは、 独立染色体として安定に複製及び分配が可能な染色体の部分断片 を指し、 断片の大きさは通常 1Mb以上だが、 それ以下の場合もある。
本明細書中、 染色体に関して 「長腕」 及び 「短腕」 とは、 染色体上のセントロメァ両 側の腕 （アーム） を指し、 その長さに応じて長腕 （q) 及び短腕 （p) と称される。 ま たヒ ト染色体に関して 「長腕遠位」 及び 「長腕近位」 とは、 長腕上のセントロメァから 遠い位置 （すなわちテロメァ側） にある領域 （遠位） 及びセントロメァに近接する領域 (近位） を意味する。 具体的には、 ヒ ト 1 4番染色体の場合には長腕遠位は A L 3 5 9 2 1 8よりもテロメァ側、 長腕近位は A L 3 9 1 1 56よりもセントロメァ側であり、 ヒ ト 2 1番染色体の場合には長腕遠位は 2 1 q 22. 2よりもテロメァ側であり、 長腕 近位は 2 1 q 1 1. 2である。 さらに 「短腕遠位」 及び 「短腕近位」 とは、 短腕上のセ ントロメァから遠い位置にある領域 （遠位） 及びセントロメァに近接する領域 （近位） を意味する。 例えば、 ヒ ト 1 4番染色体の場合にはリボソ一マル RNA領域において境 界カ sある。
本明細書中、「部位特異的組換え酵素」及び「部位特異的組換え酵素の認識部位」 とは、 ある酵素が特定の認識部位を認識して特異的にその認識部位で DN Aの組換えを起こす 現象に関して用いられる用語であり、 それぞれその部位特異的に組換えを起こす酵素及 び該酵素により認識される部位を指す。
本明細書中、 「テロメァ配列 j とは、 T TAG GGの繰返し配列 （TTAGGG) nを 持つ配列を指す。 テロメァ配列の長さは、約 0. 4〜50 k bであり、好ましくは約 0. 4〜2 5 k bであり、 さらに好ましくは約 0. 4〜 1 5 k bである。 該テロメァ配列は 化学的に合成された又は人工的に生成されたものでも、染色体に由来するものでもよレ、。 本明細書中、 「サブテロメァ配列」 とは、 真核細胞中の染色体末端のテロメァ （TTA GGG) nの繰返し配列のセントロメァ側に隣接して位置し、分節 ·重複ドメインや（T TAGGG) n様の繰返し配列を持つ、 約 300〜 500 k bにわたる染色体領域を指 す。 サブテロメァ配列は、 任意の染色体に由来するサブテロメァ配列の全体若しくは一 部でもよいし、 又は任意の染色体に由来する複数のサブテロメァ配列が結合されたもの でもよいし、 又は任意の染色体に由来するサブテ口メァ配列に他の配列が付加されたも のでもよい。 本発明においては、 例えば部位特異,的組換えを利用したテロメアトランケ ーションゃ転座によるテロメァ配列又はサブテロメァ配列の付加を行いうる。
本明細書中、 「外来 DNA」 とは、 対象とする細胞にとって外部から導入される DNA を指し、 物質生産、 疾患治療及び機能改変又は機能分析などのために発現させることが 望まれる遺伝子及びその他の機能配列 （例えばプロモーター配列） などをコードする D NAを意味し、 同種又は異種のいずれでもよい。
本明細書中、 「細胞」 とは、 生物個体 ·組織に由来する細胞を指す。 例えば、 体細胞、 正常体細胞、生殖細胞、体性幹細胞、腫瘍細胞、不死化細胞株、胚性幹細胞（E S細胞）、 胚性生殖細胞 （EG細胞）、 胚性腫瘍細胞 （EC細胞）、 精子由来幹細胞 （GS細胞） 等 を意味し、 同種又は異種のいずれでもよく、 ヒ ト由来の上記細胞（ヒ ト細胞） でもよい。
'本明細書中、 「供与細胞」 及び 「受容細胞」 とは、 ヒ ト人工染色体ベクターを移入又は 導入する場合に、 最初に該ベクターを保持する細胞 （供与細胞） と、 供与細胞から該べ クタ一が移入される細胞 （受容細胞） を指す。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2006 - 1 88 3 92号の明 細書および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒ ト 14番染色体由来の H ACベクターの構築の概要を示す。図中、 「 14 A」 はヒ ト 1 4番染色体の長腕遠位が削除され、 テロメァ配列が付加された HACベクター を、 「14N」 はヒ ト 1 4番染色体の長腕遠位が削除され、 テロメァ配列及びヒ ト 14番 染色体由来の約 25 k bのサブテロメァ配列を含有する H ACベクターを、 「14 g N」 はヒ ト 1 4番染色体の長腕遠位が削除され、 テロメァ配列及びヒ ト 14番染色体由来の 約 60 Kbのサブテロメァ配列を含有する H ACベクタ一の概要を表す。 図 2は、テロメァドランケーシヨン用ベクター p TE L p u r o - t 1の構造を示す。 図中、 t e lはテロメァ側を、 c e nはセントロメァ側を示す。 また p u r oはピュー ロマイシン遺伝子を示し、 T e 1配列はテロメァ配列を示し、 その配列中の黒矢印は反 復配列を示す。
図 3は、 ヒ ト染色体 14 qへの pTE L p u r o - t 1ベクター導入についての P C R解析の結果を示す。
図 4は、 ヒ ト染色体 14 qへの p TE L p u r o— t 1ベクター導入により生じるァ レルを示す。
図 5は、 ヒ ト染色体 1 4 qへの p TE L p u r o - t 1ベクター導入 DT40雑種細 胞のサザン解析の結果を示す。
図 6は、 ヒ ト染色体 14 qへの pTE L p u r o— t lベクター導入 DT 40雑種細 胞の F I SH解析の結果を示す。 （A) ヒ ト 14番染色体を保持する DT40雑種細胞。
(B) 長腕削除されたヒ ト 14番染色体断片を保持する DT 40雑種細胞。
図 7は、 Ι ο χ Ρ及び 3 ' n e o配列揷入甩 t 1 p S F 1ベクターの構造を示す。 図 中、 O r iは複製開始点、 A p rはアンピシリン耐性遺伝子、 S V 40 p Aは S V 40. ポリ Aをそれぞれ示す。
図 8は、 14 A Δ q HACへの t 1 p S F 1ベクタ一導入についての P C R解析の結 果を示す。
図 9は、 14 ΑΔ qHACへの t 1 p S F 1ベクター導入により生じるアレルを示す。 図 1 0は、 14AA q HACへの t 1 p S F 1ベクター導入 DT 40雑種細胞のサザ ン解析の結果を示す。
図 1 1は、 14 ΑΔ q HACベクター移入 CHO雑種細胞のサザン解析の結果を示す。 図 1 2は、 1 4 ΑΔ q HACベクター移入 CHO雑種細胞の F I SH解析の結果を示 す。図 1 2八は？ I SH像を示し、図 1 2 Bは 14ΑΔ q H A Cベクターの核型を示す。 図 1 3は、 1 4 A qHACベクター （1 4AA qHAC、 14 N Δ qHAC (G)、 1 4 gNA qHAC (g))、 及び 2 1 Δ q HA Cベクターの C HO雑種細胞における非選 択条件下での長期安定性解析の結果を示す。
図 14は、 h E PO遺伝子導入により生じる 1 4 HACベクターのアレルを示す。 図 中、 h E P Oはヒ トエリスロポエチン遺伝子、 CMVはサイ トメガロウィルスプロモー ターを示す。
図 1 5は、 h E PO遺伝子導入 14ΑΔ q H A Cベクター移入 C H O雑種細胞のサザ ン解析の結果を示す。
図 1 6は、 h E PO— 1 4AA q H A Cベクター保持 C H O雑種細胞での h E P O遺 伝子発現を示す。
図 1 7は、 h E PO— 1 4ΑΔ q HA Cベクター保持 C HO雑種細胞の F I S H解析 の結果を示す。 図 1 7 Aは F I S H像を示し、 図 1 7 Bは hE PO_ 14AA qHAC ベクターの核型を示す。
図 1 8は、 h E PO— 1 4ΑΔ q H A Cベクターの C H O雑種細胞での長期発現 ·安 定性解析の結果を示す。
図 1 9は、 h E PO_ 1 4 AZN/g ΝΔ q HACベクター移入ヒ ト正常繊維芽細胞 のサザン解析の結果を示す。 （A) h E PO— 1 4 ΑΔ qHAC ； (B) h E PO— 1 4 N厶 qHAC ; (C) h E P O— 14 g N Δ q HAC。
図 20は、 h E PO— 14ΑΔ q HACベクタ一移入ヒ ト正常繊維芽細胞： F I S H 解析の結果を示す。 図 20 Aは F I SH像を示し、 図 20 Bは h E P O— 14 A Δ q H ACベクタ一の核型を示す。
図 2 1は、 h E PO— 1 4 A/N/ g N Δ qHACベクター移入ヒ ト正常繊維芽細胞 HF L- 1での h E PO遺伝子発現を示す。
図 22は、 ヒ ト 14番染色体長腕遠位テロメァ側 1 o X P配列揷入用ベクター p 1 o X p PGK— 14 q t e 1の構造を示す。
図 23は、 ヒ ト染色体 1 4 qへの p 1 o X p P GK- 1 4 q t e 1ベクタ一導入によ り生じるアレルを示す。
図 24は、 ヒ ト染色体 14 qへの p l o x p PGK— 14 q t e lベクター導入につ いての P C R解析の結果を示す。
図 25は、 ヒ ト染色体 14 qへの p l o x p PGK— 1 4 q t e lベクター導入 DT 40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図 26は、 ヒ ト 14番染色体長腕近位セントロメァ側 1 o X P配列揷入用ベクター p 1 o X PHYGORZn 1の構造を示す。
図 2 7は、 ヒ ト染色体 1 4 qへの p 1 o x PHYGOR/n 1ベクター導入により生 じるアレルを示す。
図 28は、 ヒ ト染色体 14 qへの p 1 o x PHYGOR/n 1ベクター導入について の PC R解析の結果を示す。
図 29は、 ヒ ト染色体 1 4 qへの p 1 o x PHYGOR/n 1及び p 1 o x p PGK — 14 q t e 1ベクター導入 DT 40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。 図 30は、 C r e— l o x P部位特異的組換え反応によるヒ ト染色体 1 4 q遠位削除 で生じる染色体ァレル （図 30 A ： G/n 1 ；図 30 B ： g/n 1 ) を示す。
図 3 1は、 14 N Δ q HAC保持 DT 40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図 32は、 1 4ΝΔ qHAC保持 DT40雑種細胞の F I SH解析の結果を示す。 図
32 Aは G 94 n 56細胞、 図 32 Bは G 94 η 56 Δ ρ 25細胞における F I S Η像 を示す。
図 33は、 l o x P及び 3 ' n e o配列揷入用 p S F l (G + n l) ベクターの構造 を示す。
図 34は、 1 4 ΝΔ qHACへの p S F 1 (G+n l) 又は G n p S F 1— F R Tベ クタ一導入 （A)、 及び 14 g N Δ q HACへの p S F l (g + n l) 又は g n p S F 1 — FRTベクタ一導入 （B) により生じるアレルを示す。
図 35は、 1 4 N Δ q HACへの p. S F 1 (G + n 1 ) ベクター導入 D T 40雑種細 胞のサザン解析の結果を示す。 '
図 36は、 1 4 ΝΔ q H ACベクター移入 CHO雑種細胞のサザン解析の結果を示す。 図 3 7は、 14 N Δ q HACベクター移入 CHO雑種細胞の F I S H解析の結果を示 す。図 3 7 Aは F I SH像を示し、図 3 7 Bは 1 4ΝΔ q H A Cベクターの核型を示す。 図 38は、 hE PO遺伝子導入 14ΝΔ q H A Cベクター移入 C H O雑種細胞のサザ ン解析の結果を示す。
図 3 9は、 1ι Ε ΡΟ_ 14ΑΔ q HA Cベクタ一保持 C HO雑種細胞の F I S H解析 の結果を示す。 図 39 Aは F I SH像を示し、 図 3 9 Bは hE PO— 14AA qHAC ベクターの核型を示す。
図 40は、 hEPO— 1 4ΝΔ q H A Cベクタ一保持 C H O雑種細胞での h E P O遺 伝子発現を示す。
図 4 1は、 h E PO— 14ΝΔ q H A Cベクタ一の C H O雑種細胞での長期発現 .安 定性解析の結果を示す。
図 4 2は、 hE PO— 14NA qHACベクター移入ヒ ト正常繊維芽細胞の F I S H 解析の結果を示す。 図 42 Aは F I SH像を示し、 図 42 Bは h E PO— 1 4ΝΔ qH ACベクターの核型を示す。
図 43は、 h E PO— 1 4 Δ qHACベクター移入ヒ ト正常繊維芽細胞での長期 h E PO遺伝子発現を示す。 図 44は、 ヒ ト 1 4番染色体長腕遠位テロメァ側 1 o X P配列挿入用べクタ一 p 1 o X p P GK— 1 4 q t e 1— 2の構造を示す。
図 45は、 ヒ ト染色体 1 4 qへの p l o x p PGK— 1 4 q t e l— 2ベクター導入 により生じるアレルを示す。
図 46は、 ヒ ト染色体 14 qへの p 1 o X p PGK_ 1 4 q t e 1 — 2ベクター導入 についての P CR解析の結果を示す。
図 47は、 ヒ ト染色体 1 4 qへの p l o x p PGK— 1 4 q t e l _ 2ベクター導入 DT 40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図 48は、 ヒ ト染色体 1 4 qへの p 1 o x PHYGOR/n 1及び p 1 o x p P GK - 1 4 q t e 1— 2ベクター導入 DT 40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図 49は、 14 g ΝΔ qHAC保持 DT40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。 図 50は、 14 gNA ?1八じ保持13丁40雑種細胞の F I SH解析の結果を示す。 図 5 OAは F I SH像を示し、 図 508は14 g NA q HA Cベクターの核型を示す。 図 5 1は、 1 o X P及び 3 ' n e o配列挿入用 p S F 1 ( g + n 1 ) ベクターの構造 を示す。
図 52は、 14 g ΝΔ qHACへの p S F 1 ( g + n 1 ) ベクター導入 D T 40雑種 細胞のサザン解析の結果を示す。 "
図 53は、 14 g NA q HACベクタ一移入 CHO雑種細胞のサザン解析の結果を示 す。
図 54は、 1 4 g NA q HACベクター移入 CHO雑種細胞の F I SH解析の結果を 示す。 図 54 Aは F I SH像を示し、 図 54 Bは 1 4 gNA qHACベクターの核型を 示す o
図 55は、 hE PO遺伝子導入 14 g N Δ qHACベクター移入 CHO雑種細胞のサ ザン解析の結果を示す。
図 56は、 hE PO— 1 4 g NA q H A Cベクター保持 C H O雑種細胞の F I S H解 析の結果を示す。 図 56 Aは F I SH像を示し、 図 56 Bは hE PO— 1 4 gNA qH ACベクターの核型を示す。 .
図 5 7は、 h E P 0_ 1 4 g N Δ q H A Cベクター保持 C H O雑種細胞での h E P O 遺伝子発現を示す。
図 58は、 hE PO— 1 4 g NA q H ACベクターの C H O雑種細胞での長期発現 · 安定性解析の結果を示す。 ' 図 5 9は、 hE PO— 1 4 g NA q HACベクター移入ヒ ト正常繊維芽細胞の F I S H解析の結果を示す。 図 5 9 Aは F I S H像を示し、 図 59 Bは h E PO— 14 g NA q HACベクターの核型を示す。
図 60は、 F L P— FRTによる n e o耐性遺伝子ュニッ トの除去の概要を示す。 図 6 1は、 14 ΑΔ qHACへの t 1 p S F 1—FRTベクター導入により生じるァ レノレを示す。
図 6 2は、 14 ΑΔ qHACへの t 1 p S F 1 _ F R Tベクター導入 D T 40雑種細 胞のサザン解析の結果を示す。
図 6 3は、 14 ΑΔ q F— H A Cベクタ一移入 C H O雑種細胞のサザン解析の結果を 示す。
図 64は、 14AA q F— H A Cベクター移入 C H O雑種細胞の F I S H解析の結果 を示す。
. 図 65は、 hE PO遺伝子導入により生じる 14 ΑΔ q F— HACベクターのアレル を示す。 '
図 6 6は、 h E P O遺伝子導入 14 A Δ q F— H A Cベクター移入 C H O雑種細胞の サザン解析の結果を示す。
図 6 7は、 hEPO_ 1 4AA q F _ H A Cベクター保持 C H O雑種細胞の F I SH 解析の結果を示す。 図 6 7 Aは F I S H像を示し、 図 6 7 Bは h E PO— 14AA q F — HACベクターの核型を示す。
図 68は、 n e o耐性遺伝子ュニッ 卜の除去により生じる 1 4AA q F— HACべク ター上のァレルを示す。
図 6 9は、 hE PO— 1 4AA q A n e o— H A Cベクタ一保持 C H O雑種細胞のサ ザン解析の結果を示す。
図 70は、 hE PO— 14AA q A n e o— H A Cベクター保持 C H O雑種細胞の F I SH解析の結果を示す。 図 70 Aは F I S H像を示し、 図 70 Bは h E PO— 1 4A Δ q Δ n e o— H A Cベクターの核型を示す
図 7 1は、 h E PO_ 1 4AA q A n e o— HACベクタ一保持ヒ ト正常繊維芽細胞 のサザン解析の結果を示す。
図 72 A及び Bは、 h E PO— 14AA q A n e o— HACベクター保持ヒ ト正常繊 維芽細胞の F I SH解析の結果を示す。
図 73は、 11丁配列導入用べクター011 S F 1— FRTの構造を示す。 図 74は、 1 4 Ν Δ q HACへの G η p S F 1— F RTベクター導入 DT 40雑種細 胞のサザン解析の結果を示す。
図 75は、 FRT配列導入用ベクター g n p S F 1— FRTの構造を示す。
図 76は、 1 4 g NA q HACへの g n p S F 1— FRTベクター導入 DT 40雑種 細胞のサザン解析の結果を示す。 .
図 7 7は、 2 1 HACベクターの構築を示す。 上側の図は、 テロメアトランケーショ ンによる 2 1 ΑΔ q HACの作製手順を示し、 また下図は、 C r e _ 1 o x Pによる欠 失を利用した 2 1 ΝΔ qHACの作製手順を示す。
図 78は、 ヒ ト 2 1番染色体上の長腕 A P 00 1 6 5 7において 1 o x P配列を挿入 する方法の概略を示す。
図 79は、 ヒ ト 2 1番染色体上の長腕 A P 00 1 6 5 7において部位特異的切断を行 う方法の概略を示す。
図 80は、 1 o X P及び 3 ' n e o及び F RT配列揷入用 p S F 1 (FRT) — Cベ クタ一を示す。 '
図 8 1は、 2 1 A Δ q HACへの p S F 1 (FRT) _ Cベクター導入により生じる アレルを示す。 図中、 5 ' HPRTは 5 ' ヒポキサンチンーグァニンホスホリボシルト ランスフェラーゼを示し、 Hy gはハイグロマイシン遺伝子を示し、 T kはチミジンキ ナーゼ遺伝子を示す。 FRTは F LPリコンビナーゼターゲッ トを示し、 B Sはブラス トサイジン耐性遺伝子を示し、 Ap rはアンピシリン耐性遺伝子を示す。
図 82は、 F L P— FRTによる n e o耐性遺伝子ユニッ トの除去を示す。
図 83は、 ヒ ト 2 1番染色体上の長腕 NT— 0 1 1 5 1 5において 1 o x P配列を挿 入する方法の概略を示す。
図 84は、 C r eベクタ一導入により生じる長腕が削除されたヒ ト 2 1番染色体上の ァレルを示す。
図 8 5は、 1 0 ？及び3' n e o及び F RT配列挿入用 p S F 1 (F RT) — Dベ クタ一を示す。
図 86は、 2 1 N Δ q HACへの p S F 1 (FRT) _ Dベクター導入により生じる 了レノレを示す。
図 8 7は、 E POのインビボ薬効の経時変化を示すグラフである。 図 8 7 Aは赤血球 (RBC) 数を示し、 図 8 7 Bはへモグロビン （HGB) 数を示し、 図 8 7 Cはへマト クリ ッ ト （HCT) 値を示す。 また、 図中、 菱形は CMV (サイ トメガロウィルスプロ モーター支配下に h E PO遺伝子を導入した 14 ΑΔ qHACベクターを保持する CH O細胞クローン t 7 S 38 - 8 E 5) の平均 （N= 3 ； 28週 N= 2 ； 32週以降 N = 1)、 四角はコントロール （sham operation) の平均 （N= 3 ； 2ひ週、 28週及び 44 週 N=2) をそれぞれ示す。
図 88は、 EGF P— 1 4HACベクタ一の PCR解析結果の概略を示す。 図 88A はヒ ト 14番染色体べクタ"に EGF P (高感度緑色蛍光タンパク質； enhanced green fluorescent protein) 遺伝子を導入して得られた E G F P— 1 4HACベクターの構造 を示す。 図 88 Bは、 1 4 A Δ q— HACベクタ一及びの 1 4 N Δ q— HACベクタ一 のセントロメァ側及びテロメァ側におけるヒ トマーカーの有無を示す。
図 8 9は、 p LN l I RE SEGF Pを C H O雑種細胞株に導入 （+ ) したとき、 又 は非導入 （一） のときの、 サザンプロッ ト解析による断片サイズとベクター上の位置と の関係を示す。
図 90は、 EG F P— 14 ΑΔ q— HACベクタ一又は EG F P— 14 N Δ q— HA Cベクタ一を保持する種々の E Sクローンから作製されたキメラマウスにおける、 HA Cの保持を P CRで判定した結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明は、 ヒ ト人工染色体ベクター （以下、 「本 HACベクタ一」 ともいう） に関する ものであり、 該 HACベクターは、 ヒ ト染色体に基づいて作製され、 長腕遠位及び/又 は短腕 ^fi位が削除され、 かつテロメァ配列及びサブテロメァ配列を含む、 特にサブテロ メァ配列を含む、 ヒ ト染色体断片を含むことを特徴とするものである。
本発明において、 ヒ ト染色体の種類は、 特に限定されないものとし、 ヒ ト 1番染色体 から 2 2番染色体、 X染色体及び Y染色体からなる群から選択される。 また、 本発明に おいて、 ヒ ト染色体中の多型等の変異は許容の範囲内である。 後述の実施例では、 ヒ ト 14番染色体及びヒ ト 2 1番染色体を例示し、 これらのヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片 からのヒ ト人工染色体べクタ一の作製を示すが、 そこに記載される方法、 手段等は、 そ の他のヒ ト染色体にも同様に適用して本発明のヒ ト人工染色体ベクターを作製すること を可能にする。
以下に、 本 HACベクタ一の作製、 ベクターへの外来 DNAの揷入、 及び本 HACベ クタ一の用途について記載する。 1. ヒ ト人工染色体 （HAC) ベクターの作製
本 HACベクターは、 上述したようにヒ ト染色体に基づいて作製する。 本 HACべク ターの作製には、 以下の （a) 〜 （c) のステップが含まれる ：
(a) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する細胞を得るステップ；
(b) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠位及び 又は短腕遠位を削除する ステップ；
(c) 削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメァ配列を付加するステップ；並 びに
( d )削除される長腕及び 又は短腕の部位にサブテロメァ配列を付加するステップ。 また、 本 HACベクターの作製は、 以下のステップ （e) ：
(e) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に少なく とも 1つの部位特異的組換え酵素 の認識部位を挿入するステップを含んでもよい。
. ここで、 上記ステップ （b) と （c) と （d) の順序、 及び上記ステップ （b)、 （c)、 (d) 及び （e) の順序は特に限定されない。 .
ステップ （a) ： ヒ ト染色体を保持する細胞の作製
本 HACベクターの作製においては、 ヒ ト染色体 （例えばヒ ト 14番染色体及びヒ ト 2 1番染色体を含むすべてのヒ ト常染色体） 又はその断片を保持する細胞を用意する。 そのような細胞としては、 ヒ ト染色体又はその断片のみを保持し、 かつその後の操作の ために相同組換え率の高いものが好ましい。 従って本発明においてはまずこれらの条件 を満たすような細胞を作製する。
ヒ ト染色体を保持する細胞は、 例えば、 ヒ ト単一染色体を保持する公知のマウス A 9 雑種細胞ライブラリ一からヒ ト染色体を保持するクローンを選択し、 その染色体を相同 組換え率の高い細胞に移入することにより作製することができる。 マウス A 9雑種細胞 ライブラリ一は、 薬剤耐性遺伝子で標識されたヒ ト単一染色体を保持するものであり、 例えば、 WO 00 / 1 0383号、 Tanabe, H.ら （Chromosome Res. , 8： 319-334, 2000) などに記載されている。 例えばヒ ト 1 4番染色体を保持するマウス A 9雑種細胞は、 Japanese Collection of Research Bioresources 、J CRB) に J CRB 2 2 1 4 (糸田 胞名 A 9 (Hy g r o 14)) として登録されており、 その詳細な情報 ·培養法なども入 手可能である。
上述のようにして入手したマウス A 9雑種細胞に保持されるヒ ト染色体を、 相同組換 え率の高い細胞に移入する。 ここで 「相同組換え率の高い細胞」 とは、 その細胞におい て相同組換え操作を行った際に、 相同組換えの頻度が高い細胞を指し、 そのような細胞 としては、 例えば、 ニヮ トリ DT 40細胞 （Diekenら， Nature Genetics, 12： 174-182, 1996)、 マウス E S細胞 （相沢慎一， バイオマニュアルシリーズ 8 , ジーンターゲティン グ， 羊土社， 1995)、 などが挙げられる。 特に、 操作の簡便性などの点から、 本発明にお いてはニヮ トリ DT 40細胞を利用することが好ましい。
染色体の移入は、 当技術分野で公知の染色体移入法に従って行うことができる。 例え ば、 所望の染色体を 1本だけ導入する手法として、 Koi ら （Koi ら， Jpn. J. Cancer Res. , 80： 413-418, 1973) に記載されているミクロセル法が挙げられる。 この手法は、 ある種 の細胞において紡錘体形成を阻害する薬剤により誘導されるミクロセルを分離し、 これ を受容細胞と融合することにより、 少数の染色体を導入するというものである。 このミ クロセル法を利用してヒ ト染色体を移入する具体的な操作手順に関しては、 例えば WO 9 7/0 76 7 1号及び WO 00/1 038 3号を参照されたい。 以上のようにしてヒ ト染色体を保持する細胞を作製することができる。
あるいは、 本発明においては、 全長のヒ ト染色体ではなく、 部分断片化じた染色体、 例えばヒ ト 14番染色体の部分断片 （SC 20) を保持する細胞を使用することも可能 である （S C 20 ； Tomizukaら， Ρ.Ν. A. S. , 97： 722— 727， 2000年）。 S C 20は、 ヒ ト 14番染色体の長腕遠位及び長腕近位の多くの部分を欠失していることが報告されてい る (Tomizukaら， P. N. A. S. , 97： 722-727, 2000年； Kuroiwaら， Nature Biotech. (USA) , 第 18卷， p.1086-1090, 2000年）。 具体的には、 S C 20は、 ヒ ト 14番染色体長腕の テロメァ配列から A L 1 3 722 9 (G e n B a n k登録番号） を含む領域、 及びこれ よりさらにセントロメァ側の AL 1 2 1 6 1 2 (G e n B a n k登録番号） から AL 1 5 78 58 (G e n B a n k登録番号） のテロメァ側から 24— 26 k bまでを含む領 域を保持している。 また、 AL 1 37229 (G e n B a n k登録番号） と AL 1 2 1 6 1 2 (G e n B a n k登録番号） 間の領域、 及び A L 1 5 78 58 (G e n B a n k 登録番号） のテロメァ側 24— 26 k bからセントロメァ間の領域を欠失している。 一 方、 S C 20においてヒ ト 1 4番染色体の短腕領域は保持されている。 SC 20の問題 点は、 14番染色体 1 4 q 3 2領域の遺伝子を複数含んでいることであるが、 本明細書 に記載された方法で S C 20を縮小化することにより、様々な細胞種で安定に維持され、 かつ余分な遺伝子を含まない HACベクターを得ることができる。 なお、 S C 20染色 体断片を保持するニヮ トリ DT— 40細胞 （S C 20) は、 独立行政法人 産業技術総 合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6 ) に 200 1年 5月 9日付けで国際寄託され、 受託番号 FERM B P- 7 583が与え られている。
ステップ （b) ： ヒ ト染色体の長腕遠位及び/又は短腕遠位の削除
ステップ ( c ) ：テロメァ配列の付加 ·
ステップ （ d ) ： サブテロメァ配列の付加 .
HACベクターの作製においては、 ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する細胞に おいて、 当該染色体又は染色体断片の長腕遠位及び Z又は短腕遠位を削除する。 染色体 の削除は、 当技術分野で公知の方法により行うことができ、 例えば部位特異的組換え酵 素系を利用して行うことができる。 また本 HACベクターの作製においては、 染色体又 は染色体断片の削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメァ配列の付加及びサブテ ロメァ配列を付加するが、 これも例えば部位特異的組換え酵素系を利用して行うことが できる。 部位特異的組換え酵素系の使用は、 当技術分野で周知であり、'例えば後述する ステップ （e) の項に例示される部位特異的組換え酵素とその認識部位を用いることが できる。 例えば好ましい実施形態においては、 部位特異的組換え酵素が C r e酵素であ り、 部位特異的組換え酵素の認識部位が 1 o x P配列である。 別の好ましい実施形態に おいては、 部位特異的組換え酵素が F LP e酵素であり、 部位特異的組換え酵素の認識 部位が FRT配列である。
ステップ （b) 〜 (d) の順序は特に限定されるものではなく、 例えば長腕遠位及び Z又は短腕遠位を削除した後、テロメァ配列及びサブテ口メァ配列を付加してもよいし、 テロメァ配列との置換によって長腕遠位及び 又は短腕遠位を削除した後、 サブテロメ ァ配列を挿入してもよいし、 あるいはテロメァ配列及びサブテロメァ配列との置換によ つて長腕遠位及び 又は短腕遠位を削除してもよい。 これらのステップの順序は、 目的 とする本 HACベクターが最終的に得られるのであれば、 任意の順序でかつ任意に反復 して実施することができる。
長腕遠位及び 又は短腕遠位の削除は、その結果得られるヒ ト染色体断片のサイズが、 テロメァ配列及びサブテロメァ配列を含めて、 通常約 1Mb以上、 例えは'約 1Mb以上 約 1 9 Mb以下となるように、 好ましくは約 1 8Mb以下、 さらに好ましくは約 1 7M b以下となるように行う。
ヒ ト染色体断片の長腕及び/又は短腕の部位に付加されるテロメァ配列は TTAGG Gなどの繰り返し配列を持つ塩基配列からなるものであればいずれでもよい。 テロメァ 配列は、 例えば、 TTAGGGの繰り返し配列に基づいて化学的に合成してもよいし、 あるいは任意の染色体 （例えばヒ ト染色体） から公知の方法を用いて作製すること.もで きる。付加されるテロメァ配列の長さは、約 0. 4〜50 k bであり、好ましくは約 0. 4〜2 5 k bであり、 さらに好ましくは約 0. 4〜 1 5 k bである。
またヒ ト染色体断片の長腕及び Z又は短腕の部位に付加されるサブテロメァ配列は、 哺乳動物染色体由来のサブテロメァ配列、 好ましくはヒ ト染色体由来のサブテロメァ配 列、 より好ましぐはヒ ト常染色体由来のサブテロメァ配列、 例えばヒ ト 14番染色体又 はヒ ト 2 1番染色体由来のサブテロメァ配列である。 ヒ ト染色体由来のサブテロメァ配 列を用いる場合、 任意の染色体の長腕及び Z又は短腕由来のサブテロメァ配列を用いる ことができる。 ヒ ト染色体上のサブテロメァについては、 Linardopoulou EVら、 Nature, 第 437卷、 ρ· 94-100, 2005年、 Riethman Hら、 Chromosome Res. , 第 13卷、 p.505-515, 2005 年、 Mefford H. C. ら、 Nat Rev Genet. , 第 3卷、 p.91- 102, 2002年などの文献に、 その詳 細な構造、 長さなどが記載されており、 当業者であれば、 これらの文献の記載に基づい て好適なサブテ口メァ配列を選択し設計することができる。
付加されるサブテロメァ配列の長さは、 約 1〜500 k bであり、 好ましくは約 1〜 300 k bであり、 さらに好ましくは約 1〜 1 00 k bであり、 さらに好ましくは約 5 〜60 k bであり、 さらに好ましくは 5〜40 k bであり、 さらに好ましくは約 25〜 6 O k bであり、 さらに好ましくは約 25〜40 k bである。 また使用するサブテロメ ァ配列は、 任意のヒ ト染色体に存在するサブテロメァ領域の全体であってもよいし、 そ の一部であってもよい。 本 H ACベクターにおいては、 細胞内での安定性などを考慮し てサブテロメァ配列は約 5〜60 k bの一部を用いることが好ましい。 サブテロメァ配 列は、 任意のヒ ト染色体から公知の手法、 例えば部位特異的組換え酵素系の利用、 を用 いて入手することができる。 好ましくは、 ヒ ト染色体断片は、 ヒ ト染色体の長腕遠位が 削除された部位に付加又は結合された、 該ヒ ト染色体と同じ又は異なる、 好ましくは同 じ、 ヒ ト染色体の長腕由来のサブテロメァ配列を含む。
好ましい実施形態においては、 ヒ ト染 14番色体断片は、 ヒ ト 1 4番染色体の長腕遠 位が削除された部位に付加又は結合された、 テロメァ配列及びヒ ト 1 4番染色体の長腕 由来のサブテロメァ配列を含む。 ヒ ト 14番染色体由来のサブテロメァ配列は、 例えば ヒ ト 1 4番染色体の 14 q 3 2領域より遠位の部分 （すなわち 1 4 q— t e 1領域まで の部分） であり、 具体的には、 ヒ ト 1 4番染色体の 1 4 q 3 2. 3 3領域、 若しくはヒ ト 14番染色体の A B 0 1 9439から AB 0 1 94 3 7の間、 AB 0 1 9438力、ら AB 0 1 943 7の間、 好ましくは AB 0 1 94 3 7における位置より遠位の部分のサ ブテロメァ配列である。
別の好ましい実施形態においては、 ヒ ト 2 1番染色体断片は、 ヒ ト 2 1番染色体の長 腕遠位が削除された部位に付加又は結合された、 テロメァ配列及びヒ ト 2 1番染色体の 長腕由来のサブテロメァ配列を含む。 ヒ ト 2 1番染色体由来のサブテロメァ配列は、 例 えばヒ ト 2 1番染色体の 2 1 q 22. 3領域より遠位の部分、 例えば 2 1 q— t e 1領 域内の NT_0 1 1 5 1 5からテロメァ末端までの配列である。 なお、 テロメァ末端と は染色体から続くテロメァの端の部分をいい、 染色体の末端 （染色体末端） と同じ意味 である。 テロメァ配列はテロメァ末端を当然に含む。
例えば 1つの例として、 ヒ ト染色体又はその断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位の削 除は、 WOO 0/ 1 038 3号に記載されているテロメァ配列との置換 （テロメァトラ ンケ一シヨン） により行うことができる。 また同様にして、 ヒ ト染色体又はその断片の 長腕遠位及びノ又は短腕遠位の削除は、 テロメァ配列との置換によって行うことができ る。 すなわち、 ステップ （b) 及び （ ） において、 ヒ ト染色体又はその断片の長腕遠 位及び Z又は短腕遠位をテロメァ配列と置換することによって、 長腕及び 又は短腕の 部位にテロメァ配列を付加する。 長腕遠位及び 又は短腕遠位を削除するための具体的 な手順は、 例えば、 ヒ ト染色体を保持する細胞において、 テロメァ配列を保持するター ゲティングベクターを構築し、 相同組換えにより染色体上の所望の位置にテロメァ配列 の挿入されたクロ一ンを取得した後、 テロメァトランケーションによる欠失変異体を得 るとレ、うものである （Itzhaki ら、 Nature Genet.，第 2卷、 p283 - p287， 1992年、 及び Brown ら、 P. N. A. S. , 第 93卷、 p7125- 7130， 1996年を参照されたい）。 ここで染色体の 所望の位置とは、 削除対象の長腕遠位又は短腕遠位の切断位置であり、 この位置にテロ メァ配列が相同組換えにより置換'挿入されて、長腕遠位又は短腕遠位が削除される （テ ロメアトランケ一シヨン）。 所望の位置は、 ターゲティングベクターを構築する際に標的 配列の設計により適宜設定することができる。
例えばインタク トなヒ ト 1 4番染色体の長腕配列を削除する場合を例として説明する。 ヒ ト 1 4番染色体の長腕 14 q領域内、 好ましくは 14 q 1 1領域内、 さらに好まし くは AL 3 9 1 1 56から〇1^ 38 36 5 9 (G e n B a n k登録番号） の塩基配列に 基づいて標的配列を設計し、 その標的配列よりもテロメァ側においてテロメァトランケ ーションが起こるようにすることによって、 標的配列を設定した領域において長腕遠位 を切断、 削除することができる。 標的配列の設計は、 ヒ ト 14番染色体の長腕が A L 3 9 1 1 56において又は A L 39 1 1 5 6よりも近位の位置において削除されるように、 具体的には A L 3 9 1 1 56〜C 38 36 5 9の間、 より好ましくは し 5 1 23 1 0〜CR 3836 5 9の間、 さらに好ましくは AL 9 2960 1〜CR 38 36 5 9の 間、 さらに好ましくは AL 589 1 8 2〜CR 38 36 5 9の間、 さらに好ましくは A L 58 9 743〜CR 38 36 59の間、 さらに好ましくは AL 9 29602〜CR 3 836 59の間、 さらに好ましくは AL 5 1 2 624〜CR 38 36 59の間、 さらに 好ましくは CR 3 836 57〜CR 38 36 5 9の間、 さらに好ましくは C R 38 3 6 59の塩基配列に基づいて行われる。 また例えば短腕遠位を削除する場合には、 ヒ ト 1 4番染色体上の例えば 1 4 p領域内、好ましくは 14 p 1 1領域から 14 p 1 2領域內、 好ましくは 14 p 1 1領域内、 さらに好ましくは, RNR 2、 さらに好ましくは PAB P CP 2 (米国 National Center for Biotechnology Information (N C B I ) のオンラ インゲノムデータベース
(http：〃 www. ncbi. nlm. nih. gov/mapview/maps. cgi?0RG=hura&CHR=14&BEG=0.00&ENI)) の塩基配列に基づいて標的配列を設計することができる。 ヒ ト 14番染色体の配列情報 は、 セン小口メァ領域を除く長腕全体について塩基配列が上記のデータベース上に公開 されている （図 1も参照）。 標的配列の設計は、 上述した領域に限定されず、 所望の HA Cベクターを作製するように当業者であれば適宜設計することが可能である。
また例えば、 ヒ ト 1 4番染色体の長腕配列を S C 20よりもさらにセントロメァ側に 削除する場合、 AL 1 5 7858の塩基配列に基づいて標的配列を設計し、 その標的配 列よりもテロメァ側においてテロメァトランケーションが起ごるようにすることによつ て、 標的配列を設定した領域において長腕遠位を切断、 削除することができる。 また例 えば短腕遠位を削除する場合には、 ヒ ト 14番染色体上の 1 4 p領域内、 好ましくは 1 4 p 1 1領域から 14 p 1 2領域内、 さらに好ましくは 1 4 p 1 1領域內、 さらに好ま しくは 14 p l l . 1領域から 14 p l l . 2領域内、 さらに好ましくは 14 p 1 1. 1領域内、 よりさらに好ましくは RNR 2、 さらに好ましくは P AB P C P 2 (米国 National Center for Biotechnology Information (N C B I ) のオンラインゲノムテー タベース
(http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/mapview/maps. cgi?0RG=hum&CHR=14&BEG=0.00&ENI))の 塩基配列に基づいて標的配列を設計することができる。 標的配列の設計は、 上述した領 域に限定されず、 所望の H ACベクターを作製するように当業者であれば適宜設計する ことが可能である。
また別の方法の例として、 ヒ ト染色体又はその断片の長腕遠位及び 又は短腕遠位の 削除は、 例えば Zheng B.ら、 Mol Cell Biol.， 第 20卷、 p648 - P655， 2000年に記載され ているように、 2箇所の部位特異的組換え酵素の認識部位間の欠失により、 前記長腕遠 位及び/又は短腕遠位の削除が基本骨格となる出発材料のヒ ト染色体又はその断片由来 のサブテロメァ配列を残し、 テロメァ配列を付加するように行うことが好ましい。 すな わち、 ステップ （b ) 及び （c ) においては、 ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠 位及び 又は短腕遠位における少なく とも 2箇所を切断 ·欠失させることにより、 該長 腕遠位及び/又は短腕遠位を削除し、 かつ削除された長腕及び 又は短腕の部位にテロ メァ配列を付加することができる。 また、 ステップ （b ) 〜 （d ) において、 ヒ ト染色 体又はその断片の長腕遠位及び 又は短腕遠位上の少なく とも 2箇所を切断 ·欠失させ ることにより、 ヒ ト染色体又はその断片の長腕遠位及び Z又は短腕遠位を削除すると共 に、 削除された長腕及び Z又は短腕の部位にテロメァ配列又はテロメァ配列及び当該ヒ ト染色体由来のサブテロメァ配列を付加する。
. 長腕遠位及び 又は短腕遠位を削除するための具体的な手順は、 例えば、 ヒ ト染色体 又はヒ ト染色体断片を保持する細胞において、 部位特異的組換え酵素の認識部位を保持 するターゲテイングベクターを構築し、 相同組換えにより染色体上の所望の位置に部位 特異的組換え酵素の認識部位の挿入されたクローンを取得した後、 部位特異的組換え酵 素による組換え反応により欠失変異体を得るというものである。 ここで染色体の所望の 位置とは、 削除対象の長腕遠位及び長腕近位又は短腕遠位及び短腕近位の切断位置であ り、 この位置に部位特異的配列が相同組換えにより置換 ·挿入されて、 長腕遠位又は短 腕遠位が削除される。 所望の位置は、 ターゲティングベクタ一を構築する際に標的配列 の設計により適宜設定することができる。
例えば、 前記ヒ ト染色体又はその断片の長腕遠位の削除は、 長腕遠位及び近位に部位 特異的組換え酵素の認識部位を挿入し、 部位特異的組換えによりこれら 2つの認識部位 間を欠失して行う。 また本発明の別の実施形態においては、 前記長腕遠位及び 又は短 腕遠位の削除が基本骨格となる出発材料の染色体由来のテロメァ配列又はテロメァ配列 及びサブテロメァ配列を残すように行われる。 例えば、 前記ヒ ト 1 4番染色体の長腕遠 位の削除は、 長腕遠位及び近位に少なくとも 2つの部位特異的組換え酵素の認識部位を 挿入し、 部位特異的組換えにより 2つの認識部位間を欠失して行う。 好ましい実施形態 においては、 部位特異的組換え酵素の認識部位は、 ヒ ト 1 4番染色体の長腕遠位の 1 4 q 3 2領域より遠位に及び長腕近位の 1 4 q 1 1領域より近位に、 更に好ましくは、 ヒ ト 1 4番染色体の長腕遠位の A B 0 1 9 4 3 7より遠位に及び長腕近位の A L 3 9 1 1 5 6より近位に挿入される。
また例えば、 前記ヒ ト 1 4番染色体の短腕遠位の削除は、 短腕遠位及び近位に部位特 異的組換え酵素の認識部位を挿入し、 部位特異的組換えによりこれら 2つの認識部位間 を欠失して行う。 好ましい実施形態においては、 部位特異的組換え酵素の認識部位は、 ヒ ト 1 4番染色体の短腕遠位の例えば 1 4 p領域内より遠位に、 好ましくは 1 4 p 1 2 領域内より遠位に、 さらに好ましくは 1 4 p 1 1領域内より遠位に挿入され、 かつ短腕 近位の 1 4 p 1 2領域内より近位に、 さらに好ましくは 1 4 p 1 1領域内より近位に、 さらに好ましくは 1 4 p 1 1 . 2領域内より近位に、 さらに好ましくは 1.4 p 1 1 . 1 領域内より近位に、 さらに好ましくは R N R 2、 P A B P C P 2からなる群より選択さ れるいずれか 1の位置より近位に挿入されている。
さらにまた、 部位特異的組換え酵素の認識部位は、 例えばヒ ト 2 1番染色体又はヒ ト 2 1番染色体断片の A P 0 0 1 6 5 7における削除位置又は A P 0 0 1 6 5 7より近位 の位置に、 さらに好ましくはヒ ト 2 1番染色体又はヒ ト 2 1番染色体断片の短腕近位の 2 1 p 1 1 - P 1 2領域内における削除位置より近位の位置に挿入することができる。 上述のようにして、 テロメァ配列又はテロメァ配列及びサブテロメァ配列を残すよう にして長腕遠位及び Z又は短腕遠位を削除したヒ ト染色体断片を形成させ、 それを保持 する細胞が得られる。 このようにテロメァ配列又はテ口メァ配列及びサブテ口メァ配列 をヒ ト染色体断片末端に配置することにより、 細胞における発現及び Z又は安定性を達 成することができる。
更にまた、 上述のようにして、 長腕遠位及び Z又は短腕遠位が削除されたヒ ト染色体 断片を形成させ、 それを保持する細胞が得られる。 このような染色体のサイズの縮小化 により、 細胞における安定性を達成することができる。 また、 本 H A Cベクターを保持 する細胞、 及び後述する本 H A Cベクターが導入される細胞の機能. '増殖などに悪影響 を与えないように、 悪影響を及ぼすと推定される染色体領域を除去することができる。
ステップ （e ) ：部位特異的組換え酵素の認識部位の挿入
本 H A Cベクターの作製においては、 ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に部位特異的組 換え酵素の認識部位を挿入する。 このステップ （e ) は、 上記ステップ （b )、 ( c ) 及 び （d ) の前、 これらのステップの間又はこれらのステップの後のいずれで行ってもよ く、 これらの順番は特に限定されない。 すなわち、 ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片にお いて、 長腕遠位及び/又は長腕遠位を削除し、 テロメァ配列及びサブテロメァ配列を付 加した後で部位特異的組換え酵素の認識部位を揷入してもよいし、 部位特異的組換え酵 素の認識部位を挿入した後で長腕遠位及びノ又は長腕遠位を削除し、 テロメァ配列及び サブテロメァ配列を付加してもよいし、 あるいは長腕遠位及び/又は長腕遠位を削^し た後で部位特異的組換え酵素の認識部位を揷入し、 その後テ口メァ配列及びサブテロメ ァ配列を付加してもよい。
当技術分野においては、 ある酵素が特定の認識部位を認識して特異的にその認識部位 で DNAの組換えを起こす現象が知られており、 本発明においてはそのような酵素及び 認識部位の系を利用するが、 その種類は下記の例に特に限定されない。 例えば、 そのよ うな系としては、 C r e / 1 o X Pシステムが知られている （例えば、 Sauer, B. ら， P.N.A.S.， 85:5166-5170， 1988 を参照されたい）。 C r eはバタテリオファージ P 1由 来の 38 KDのタンパク質であり、 リコンビナーゼの I n t (インテグラーゼ） フアミ リーに属するものである。この酵素は、約 34 b pの認識部位 1 o X P配列を認識して、 この部位で特異的に DNAの組換えを起こす。またこの 1 o X P配列の方向性によって、 2つの 1 o X P配列間 DNAの欠失又は転座が生じることが知られている。 またその他 の、 特異的な配列を認識して組換え反応を起ごす系としては、 出芽酵母由来のレコンビ ナーゼ F L P (Broach ら， Cell, 21 :501-508, 1980)、 ファージ p h i C 3 1由来のィ ンテグラ一ゼ （Thorpeら， P. N. A. S. , 95:5505-5510， 1998) などがあり、 哺乳動物細胞 でもこれらの酵素による DNA組換え反応が起きることが報告されている （Koch ら， Gene, 249： 135-144, 2000； Thyagarajanら， Mol. Cell. Biol.， 21： 3926-3934, 2000)。 ヒ ト染色体に、 上記部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するには、 公知の遺伝子 組換え手法、 例えば相同組換え法を利用することができる。 部位特異的組換え酵素の認 識部位の挿入位置は、 当業者であれば、 必須ではない遺伝子の位置などを考慮して適宜 設定することができる。 例えば、 ヒ ト染色体の長腕近位又は短腕近位の任意の位置に部 位特異的組換え酵素の認識部位を挿入する。 かかる挿入位置としては、 例えば、 ヒ ト 1 4番染色体については長腕近位 14 q 1 1より近位、 さらに好ましくは長腕近位の A L 3 9 1 1 5 6 (G e n B a n k登録番号） における前記削除位置より近位、 又はヒ ト 1 4番染色体の短腕近位の 1 4 p 1 2領域内における前記削除位置より近位などが挙げら れるが、 この位置に特に限定されない。 また、 ヒ ト 2 1番染色体については、 長腕近位 の 2 1 q 1 1. 2より近位、 好ましくは 2 1 q l l . 1より近位、 好ましくは A L 1 6 202より近位、 さらに好ましくは長腕近位の AP 00 1 6 5 7 (G e n B a n k登録 番号） における削除位置又は AP 00 1 6 5 7より近位、 或いはヒ ト 2 1番染色体の短 腕上、 好ましくは短腕近位の 2 1 p 1 1. 2、 領域内における削除位置より近位などが 挙げられるが、 この位置に特に限定されない。
また、 後述する外来 DNAの挿入位置として、 例えば前記部位特異的組換え酵素認識 部位を用いることができる。 従って、 かかる挿入位置としては、 例えば、 ヒ ト 1 4番染 色体については長腕近位 14 q 1 1より近位、 さらに好ましくは長腕近位の A L 3 9 1 1 56 (G e n B a n k登録番号) における前記削除位置より近位、 又はヒ ト 1 4番染 色体の短腕上、 好ましくは短腕近位の 14 p 1 2領域内における前記削除位置より近位 などが挙げられるが、 この位置に特に限定されない。 また、 ヒ ト 2 1番染色体について は、 長腕近位の 2 1 q 1 1. 2より近位、、 好ましくは 2 1 q 1 1. 1より近位、 好まし くは A L 1 6202より近位、 さらに好ましくは長腕近位の AP 00 1 65 7 (G e n B a n k登録番号） における削除位置又は A P 00 1 65 7より近位、 或いはヒ ト 2 1 番染色体の短腕上、 好ましくは短腕近位の 2 1 p 1 1. 2領域内における削除位置より 近位などが挙げられるが、 この位置に特に限定されない。
. その後、 後述する外来 DN Aの導入手法に従ってリポーター遺伝子を導入し、 その発 現を確認することによって、 ヒ ト染色体上に挿入した認識部位の位置の適否を確認する ことができる。
上記例示した認識部位のうち 1種類を 1つ又は複数挿入してもよいし、 あるいは、 異 なる系の認識部位を複数挿入してもよい。 後述するように、 本 HACベクターは、 部位 特異的組換え酵素の認識部位を有するため、 外来 DN Aを部位特異的に導入が可能であ り、 さらに、 認識部位の設定により外来 DN Aの導入位置を決定できるため、 外来 DN Aの導入位置が一定となりポジション効果 （position effect) を回避できる。 また外来 DNAの導入操作も簡便となる。 さらに異なる系の認識部位を複数挿入することによつ て、 複数の外来 DN Aを逐次挿入もできる。 また、 複数種の部位特異的酵素の認識部位 を組み合わせて用いることにより、 1種の部位特異的酵素の認識部位を利用して外来 D N Aを導入した後、 ベクター上に存在する薬剤耐性遺伝子などの不要な遺伝子を別の種 類の部位特異的組換え酵素の認識部位を利用して欠失 ·削除することができる。
上述のようにしてヒ ト染色体を改変して作製した本 H ACベクターには、 部位特異的 組換え酵素の認識部位の他、 プロモーター、 薬剤耐性遺伝子などのベクター構築におい て一般的に揷入される配列又はエレメントが挿入されていてもよい。 またィンスレータ 一（例えば特開 2006— 948494号参照）、細胞骨格接着領域（Matrix attachment region : MAR)、 ヒ ト又はその他の生物種のゲノム領域など、 遺伝子発現制御及び 又 は細胞機能制御及び/又は組織機能制御及び/又は個体発生制御及び Z又は生体機能統 御に関わる配列又はエレメントが揷入されていてもよい。 更にまたテロメラーゼなどの 細胞寿命をコントロールするような遺伝子及び Z又はチミジンキナ一ゼなどの自殺遺伝 子及びノ又は遺伝子発現制御や細胞機能制御や組織機能制御や個体発生制御や生体機能 統御などに関わる遺伝子が挿入されていてもよい。 そのような配列及び/又はエレメン ト及び/又は遺伝子は、 上述したように相同組換え法を利用して本 H ACベクターの所 望の位置に揷入できる。
さらに本発明者は、 上述のように作製した本 HACベクターを保持する細胞を、 選択 薬剤を含まなレ、培地で長期にわたり継代培養し、 経時的に H A Cベクタ一の保持率を F I SH法により検定したところ、 本 HACベクタ,一は宿主細胞 （例えば CHO細胞） に おいて安定に保持されること、 その安定性は、 従来の 2 1 HACベクタ一を顕著に上回 ることを確認できた。 また、 継代培養において、 その HACベクタ一の脱落が少ないこ とのみならず、 導入した H ACベクタ一のコピー数が過度に増減することなく安定に維 持されることを確認できた。
さらにまた、 驚くべきことに、 本 HACべグターを用いることによって、 テロメァ配 列の近傍に外来 DNAを揷入した場合であっても、 従来報告されていたテロメァポジシ ヨン効果 （TPE) による外来遺伝子発現抑制事象を受けることなく、 該外来 DNAを 高発現することができる。 ここで近傍とは、 テロメァ末端からセントロメァ側へ向かつ て約 1〜 500 k bの領域をいい、 好ましくは約 1〜300 k bであり、 さらに好まし くは約 1〜 1 00 k bであり、 さらに好ましくは約 5〜60 k bであり、 さらに好まし くは 5〜40 k bであり、 さらに好ましくは約 2.5〜60 k bであり、 さらに好ましく は約 2 5〜40 k bである。
2. HACベクターへの外来 DNAの導入 （ステップ （ f ))
上記 HACベクターの作製において、 部位特異的組換え酵素の存在下にて外来 DNA を揷入するステップ （ f ) を行うことにより、 本 HACベクターに外来 DNAを導入す ることができる。 このステップ （ f ) は、 上述したステップ （e)、の後に行うものであ るが、 ステップ （b)、 (c) 及び （d) との順序は特に限定されず、 ステップ （b)、 （c) 及び（d)の前、 これらのステップの間又はこれらのステップの後に行うことができる。 従って、 ステップ （b) 〜 ( f ) の順序は明細書に記載する順序に限定されないことに 留意されたい。
外来 DNAとは、 対象とする細胞にとって外部から導入される DNAを指し、 遺伝子 及びその他の機能配列などをコードする D N Aである。 本発明において導入対象となる 外来 DNAとしては、 物質生産、 疾患治療及び機能改変又は機能分析などのために発現 させることが望まれる遺伝子及びその他の機能配列などをコードする D N Aであれば特 に限定されなレ、。その他の機能配列とは、遺伝子が発現するために機能する配列を指し、 例えば、 プロモータ一、 ェンハンサー、 シグナル配列などが挙げられる。
外来 DN Aの導入は、 部位特異的組換え酵素の系を利用して行うことができる。 例え ば、 C r e酵素の認識部位である 1 o X P配列と外来 DN Aを保持するタ一ゲティング ベクターを構築する。 続いて本 HACベクター （ヒ ト 14番染色体断片） を保持する細 胞において、 C r e酵素を細胞内で発現させることにより、 Ι ο χ Ρ配列とテロメァ配 列に挟まれた領域と、 上記ターゲテイングベクターとの部位特異的組換えにより、 外来 DNAを本 HACベクター上に挿入させることができる （黒岩ら， Nature Biotech. , 18:1086-1090, 2000)。
本 HACベクターには、 部位特異的組換え酵素の認識部位 （ 1 o x P配列） を保持す ¾環状 DNAが揷入できる。 このため大腸菌を宿主としたプラスミ ド、 BAC、 P AC や、 酵母を宿主とした環状 YACなど既存のベクターによりクローン化された DNAを 挿入することができる。 またヒ ト染色体に基づいて作製されていることから、 本 HAC ベクターに導入可能な外来 DN Aのサイズの上限は 1 00 k bオーダーまで拡張され、 従来発現実験に用いられてきたプラスミ ドベクタ一に組み込まれた c D N Aだけではな く、 遺伝子の発現制御領域を含むゲノム DN Aも導入可能である。
外来 DNAの挿入位置は、 上述したように、 例えば前記部位特異的組換え酵素認識部 位を用いることができる。 かかる挿入位置としては、 例えば、 ヒ ト 1 4番染色体につい ては長腕近位 14 q 1 1より近位、 さらに好ましくは長腕近位の AL 39 1 1 56 (G e n B a n k登録番号） における前記削除位置より近位、 又はヒ ト 1 4番染色体の短腕 上、 好ましくは短腕近位の 14 p 1 2領域内における前記削除位置より近位などが挙げ られるが、 この位置に特に限定されない。 また、 ヒ ト 2 1番染色体については、 長腕近 位の 2 1 q 1 1. 2より近位、、 好ましくは 2 1 q l l . 1より近位、 好ましくは A L 1 6 202より近位、 さらに好ましくは長腕近位の AP 00 1 6 5 7 (G e n B a n k登 録番号） における削除位置又は AP 00 1 6 5 7より近位、 或いはヒ ト 2 1番染色体の 短腕上、 好ましくは短腕近位の 2 1 p 1 1. 2領域内における削除位置より近位などが 挙げられるが、 この位置に特に限定されない。 また、 複数の部位特異的組換え酵素の認 識部位を利用することにより本 HACベクターから不要になった薬剤耐性遺伝子発現ュ ニッ トゃ DNAエレメント等を除去できる。 例えば、 上記 C r e - 1 o X Pシステムに より導入した外来遺伝子発現ュニット下流に存在する Ne o耐性遺伝子ュ-ッ トを除去 する場合、 上記外来 DNAを保持するターゲッティングベクター上の外来遺伝子発現ュ ニッ トの下流、 及び本 HACベクタ一上の N e o耐性遺伝子ュニッ ト下流に 1 o X Pと は別種類の認識部位 （FRT配列） を導入したコンス トラク トを構築する。 上記に従い 外来 DNAを導入した本 HACベクターを保持する細胞において、 F L P e酵素を細胞 内で発現させることにより FRT配列に挟まれた N e o耐性遺伝子ュニッ ト領域を部位 特異的組換えにより切出し除去できる （例えば図 60参照）。
なお、 上記のような薬剤耐性遺伝子の除去は、 ヒ ト 14番及び 21番染色体に限定さ れることなく、 任意のヒ ト染色体に基づく ヒ ト入ェ染色体ベクターの作製において実施 することができると考えられる。 従って、 本発明は、 以下のステップを含む外来 DNA を含むヒ ト人工染色体ベクターの作製方法に関する ：
(a) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する細胞を得るステップ；
■ (b) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除する ステップ；
( c ) 削除される長腕及び Z又は短腕の部位にテ口メァ配列又はテ口メァ配列及びサ ブテロメァ配列を付加するステップ；
(.(!)·ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に少なく とも 2種類の部位特異的組換え酵素の 認識部位を揷入するステップ；
(e) 部位特異的組換え酵素の存在下にてヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に外来 DN Aを挿入するステップ；並びに
( f ) ステップ （e) で用いたものとは異なる種類の部位特異的組換え酵素の存在下 にてヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片上の薬剤耐性遺伝子を除去するステップ。
. 上記方法に従って作製された外来 DN Aを含むヒ ト人工染色体ベクターは、 薬剤耐性 遺伝子が除去されており、 その結果、 外来 DN Aを高発現することができる （例えばヒ ト 14番染色体ベクターに関する図 21参照）。
従来の c DNA強制発現べクタ一を用いた遺伝子導入法では、 過剰発現による細胞毒 性や増殖抑制などの副作用が生じ、 導入遺伝子を恒常的に発現する細胞株が得られない 例が多い。 この問題点を克服し、 生理的な発現パターンを保ちながらなおかつ発現を人 ェ的に制御するには、 テトラサイクリンなどを利用した遺伝子発現誘導系の適用が望ま しい。 導入可能なインサートサイズが大きく、 一定のコピー数が安定に保持されるとい う本 H ACベクターの特徴はこのような目的に適っている。 組織特異的 生理的な遺伝子発現は、 遺伝子をコードするゲノム領域からの転写、 転 写産物の編集、 核外への輸送、 翻訳の各段階で制御を受ける。 一つの遺伝子に対して複 数のプロモータ一があって転写開始点が異なる、 或いはスプライシングにバリエ一ショ ンが生じることで、 組織特異的なアイソフォームが発現することが知られている。 クロ —ン化 c DNAは一つの遺伝子に由来する複数の転写産物バリアントの 1つにすぎない, 生理的な遺伝子発現を再現するだめには、 ゲノム DN Aとして制御配列を含んだ遺伝子 領域を導入することが望ましい。 本 HACベクターの利用はこのような目的に適うもの である。
ヒ トゲノムプロジェク トでは、 ゲノム DNAは, B ACクローンとして単離され、 塩基 配列が決定された。 このため公開されているデータベース （G e n B a n kなど）では、 塩基配列は B AC単位でも登録されている。 遺伝子機能解析の 1手段としてトランスジ ヱニックマウスの作製がある。 本 H ACベクタ一をプラットフオームとして B ACを揷 入することで、常に挿入部位が同一の条件で遺伝子の発現を解析することが可能になる。 多くの B ACベクターは 1 o X P配列を保持しているため、 本 HACベクターへの挿入 をネガティブ選別する系を用いれば、 塩基配列既知の BACを本 HACベクターにカセ ット形式で簡便に揷入できると考えられる。
上述した以外にも、 本 HACベクタ一^ ·の外来 DNAの導入手法及び導入の利点があ り、 以下にそのいくつかを例示する。
(1) 相互転座による染色体部分断片の導入
部位特異的組換え（例えば C r e酵素による 1 o X P配列間の部位特異的組換え）は、 線状染色体と環状インサート （外来 DNA) の場合は揷入反応が起こるが、 線状染色体 同士では相互転座の反応が起きる。 これを利用すれば環状ィンサートにクローニングで きない Mb単位以上の染色体断片を本 H ACベクターに導入することができる（Kuroiwa ら， Gene Ther. 9:708—712, 2002)。
( 2 ) 挿入体選別法
本明細書の実施例に記載する方法においては、 本 HACベクタ一への外来 DNAの揷 入は、 薬剤耐性遺伝子の再構成を指標とレたポジティブ選別を利用している （組換え体 のポジティブ選別に関しては、 WOO 0/ 1 03 8 3号を参照されたい）。 これに代わつ て、 チミジンキナーゼ /ガンシクロビル系などのネガティブ選別により、 インサート揷 入体 （外来 DNAが挿入されたもの） を得ることも可能である。 この場合、 挿入する環 状 DN Aには部位特異的組換え酵素の認識部位のみが含まれていればよい。 ゲノムプロ ジェク トで用いられた B ACライブラリーは 1 o X P配列を含んでいるので、 このよう' なネガティブ選別の系が確立できれば配列既知のゲノムクローンを本 H A Cベクターに 容易に揷入することが可能になる。
(3 ) 複数ィンサートの揷入
本発明において好ましく用いられる 1 o X P配列は P 1ファージに由来する野生型の 配列であり、 C r e酵素による H ACベクター上の 1 o x P配列への環状ィンサー卜の 挿入反応は可逆的である。 本明細書に記載する実施例においては、 C r e酵素を一過性 に発現させ、 薬剤耐性の獲得を指標に部位特異的な組換え体を選別することにより構成 的な挿入体が得られた。 一度環状インサートが揷入されると、 HACベクタ一上に 2つ の Ι ο χ Ρ配列が残る。 このため再度 C r e酵素を発現させると逆反応 （環状インサー トの切り出し） が起きる可能性もあり、 二次的にインサートを揷入するなどのさらなる HACベクタ一の改変は困難となる。 一方、 塩基置換を行った変異 1 o x P配列の組み 合わせによっては、反応方向及び反応の特異性を限定できるとの報告がある（Hoessら， Nucleic Acids Res. , 14:2287 - 2300, 1986； Araki ら， Nucleic Acids Res. , 25:868-872， 1997 ; Leeら， Gene, 216:55-65， 1998)。 このような変異 1 o x P配列を用いることで、. 上述した逆反応を起こさず、複数の環状インサートを逐次揷入する系も構築可能である。
(4) コピー数依存的発現制御
aグロビン遺伝子トランスジエニックマウスを用いて宿主染色体上にランダムに挿入 された遺伝子のコピー数と mRN A発現量の関係を解析した報告 （Sharpeら、 ProcNatl Acad Sci USA, 90： 11262, 1993) では、 発現量と導入遺伝子コピー数との間に相関は認め られない。 これは、 トランスジエニック動物系統により導入遺伝子の発現量が大きく異 なり、 また導入した遺伝子のコピー数に比例しない発現が起こるポジション効果と呼ば れる現象によるものであると考えられ、 トラン ジェニック動物における遺伝子導入に おいては頻繁に起こる現象である。 また、 導入遺伝子のポジション効果を排除して比較 するため外来 DN Aの揷入位置を予め宿主染色体上に導入した部位特異的組換え酵素の 認識部位 （例えば 1 o X Pサイ ト） に確定し部位特異的組換え反応 （例えば C r e - 1 o X P系） によりプラスミ ドベクターから目的の DN Aュニッ トを導入する トランスジ エニックマウスの報告 （Garrickら、 Nature Genet. , 18:56 - 59, 1998) があるが、 ここ でもコピー数依存的発現制御は実現されていない。
一方、 チロシナーゼゲノム領域を導入した Y ACを用いて作製したトランスジェニッ クマウスにおいて、 導入したゲノム領域のコピー数依存的なチロシナーゼ発現が認めら れたが （Schedl ら、 Nature, 362:258-261， 1993)、 生理的発現制御領域を含むゲノムを 用いる点でポジション効果の影響を受けないと考えられ、 本発明のような生理的制御領 域を含まない人工的な遺伝子発現ュニッ トのみを多コピー化して発現させるものではな い。 また、 备種のェピソ一ムベクタ一は、 宿主染色体と独立に存在し外来 DN A挿入位 置も決まっているが、 細胞内でのベクタ一自身のコビー数を厳密に制御するには至って レヽなレヽ （Morlinoら、 ppl Environ Microbiol. , 65:4808— 4013， 1999 ; Cooperら、 Proc Natl Acad Sci USA. , 94:6450—6455， 1997)。
本発明においては、 同一及び/又は異種の目的遺伝子の発現ュニッ トを多コピー連結 して並列配置し、 HACベクター上の決まった位置 （例えば 1 o x Pサイ ト） に導入す ることにより、 宿主染色体に変異を与えることなくコピー数依存.的発現制御を行なう.こ とができる。 ，
従 て、 本発明の方法により、 外来 DNAとして多コピーの目的遺伝子を所望の細胞 に導入し、 該細胞において該目的遺伝子をコピー数依存的に発現させることが可能であ ると共に、 該細胞を用いて作出したトランスジエニック動物においては、 ポジション効 果を受けることなく従来困難であったコピー数依存的な目的遺伝子の発現を達成するこ とが可能となる。
3. H ACベクターの細胞への移入
本 H ACベクター又は外来 DN Aを含む本 H ACベクターを保持する細胞から、 それ らのベクターをその他の細胞へ移入することができる。 移入先となる細胞は、 特に限定 されるものではないが、 動物細胞 （哺乳動物細胞） などが挙げられる。 本発明において は、 無傷の状態でヒ ト染色体を移入可能であることが知られているチャイニーズハムス ター卵巣 (CHO) 細胞を用いることが好ましい （WOO 0/1 038 3号参照）。 CH O細胞は、効率良く ミクロセルを形成することが知られており （例えば、 Koi ら、 SCIENCE 260:361-364, 1993)、これにより本 H A Cベクタ一を C H O細胞からさらに別の細胞（C HO細胞以外の細胞） へ移入することも可能である。 また、 本発明においては、 本 HA Cベクターを多分化能を有する細胞に移入することも可能である。「多分化能を有する細 胞」 とは、 所定の操作により、 特定の細胞又は組織に分化可能な細胞を意味する。 例え ば、 宿主胚への注入又は集合胚形成などの操作を行うことによって、 キメラ動物の 2種 類以上の細胞又は組織に分化可能な細胞、 具体的には、 胚性幹細胞 （E S細胞）、 胚性生 殖細胞 （EG細胞）、 胚性腫瘍細胞 （EC細胞）、 精子由来幹細胞 （G S細胞） などが含 まれる。 また、 例えば、 増殖因子 （例 ： トランスフォーミング増殖因子； TGF) など を添加した誘導培地における培養により、 骨細胞、 軟骨細胞又は脂肪細胞に分化可能な 細胞、 具体的には、 体性幹細胞 （例： 間葉系間細胞） などが含まれる。
本明細書中で使用される 「胚性幹細胞」 とは、 E S細胞とも称され、 未分化性 （全能 性） を維持したまま増殖可能なことを特徴とする初期胚由来の培養細胞を意味する。 す なわち胚性幹細胞は、 動物初期胚中の胚盤胞の内部に存^ £する未分化幹細胞である内部 細胞塊の細胞を培養し、 未分化状態を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞 株である。 また 「胚性生殖細胞」 とは、 EG細胞とも称され、 上記胚性幹細胞とほぼ同 等の能力を有することを特徴とする始原生殖細胞由来の培養細胞を意味する。 胚性生殖 細胞は、 受精後数日〜数週間、 例えばマウスの場,合には約 8. 5日経過した胚から得た 始原生殖細胞を培養し、 未分化状態を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞 株である。
また、 ヒ トを対象とした遺伝子細胞治療や組織再生治療において材料となる細胞は、 タ'ン化などを避けるための安全性の観点から、 不死化細胞ではなく正常細胞を用いるこ とが望ましいとされている。 本発明においては、 ヒ ト染色体由来 HACベクターのヒ ト 正常繊維芽細胞 （HF L) への移入が可能であることが示された。 また、 本発明の方法 により、 繊維芽細胞以外のヒ ト正常体細胞へのヒ ト 1 4番染色体由来断片又はヒ ト染色 体由来 HACベクターの移入が可能である。 さらに、 本発明の方法に従って作製された ヒ ト染色体由来 HACベクターであれば、 ヒ ト染色体に制限されることなく、 ヒ ト正常 体細胞に移入することが可能である。.
HACベクタ一の細胞への移入は、 ミクロセル法を利用して行うことができる。 ミク ロセル法は、 上記 「 1. ヒ ト人工染色体 （HAC) ベクターの作製」 の項に記載のよう に行うことができる。
また、 H ACベクターの細胞への移入は、 体細胞核移植法を利用して行うことができ る。 体細胞核移植法は、 Kuroiwa Y ら Natute Biotech, 第 20卷、 p889- 894、 2002年 に記載のように行うことができる。
また、 本 HACベクターの細胞への移入について、 最初に用意したヒ ト染色体又は染 色体断片を保持する細胞から、ヒ ト染色体への改変を行うステップの前、ステップの間、 又はステップ後のいずれの段階においてもヒ ト染色体 （HACベクタ一） を他の細胞へ 移入することが可能である。
4. HACベクタ一の用途
本発明の目的は、 ベクターという基本ツールとその利用技術の提供であり、 学術研究 から産業に至る非常に幅広い領域に波及効果をもたらすことが期待される。 （ i ) 宿主染 色体に挿入されず独立して維持される （宿主遺伝子の変異や癌化の懸念がない）、 ( i i ) 一定のコピー数で長期間安定に保持される （過剰発現、 発現消失の懸念がない）、 ( i i i ) 導入可能な DN Aの長さの制限がない （正常な発現制御を保証する DN Aエレメン トを含む遺伝子ゃ複 遺伝子を同時に導入可能である）、という本 H ACベクタ一の特徴 は、 従来のベクターで不可能であった多くのことを可能にすると想像される。 本 HAC ベクターの用途としては、 限定するものではないが主要なものを挙げると、 （ i ) 動物培 養細胞における遺伝子機能解析用べクタ一、 （ i i ) ヒ ト疾患遺伝子治療用ベクター、 （ i i i ) ヒ ト臓器幹細胞、 胚幹細胞 （E S細胞） への遺伝子導入用ベクター、 （ i V) 遺伝 子導入動物作製用ベクター （例： ヒ ト疾患モデル動物作製、 KO動物と組み合わせた特 定遺伝子のヒ ト化）ノよどが考えられる。以下に、本 HACベクターの用途の一例として、
(1) 外来 DNAの受容細胞への導入、 （2) 外来 DNAを発現する細胞の作製、 （3) タンパク質の製造、 （4) 遺伝子機能解析用べクタ一、 （5) 幹細胞への遺伝子導入用べ クタ一、 （6)培養フィーダ一作製用ベクター、 (7) ヒ ト疾患治療用ベクター、及び（8) 遺伝子導入動物作製用ベクターを説明する'。 .
(1) 外来 DNAの受容細胞への導入
本 HACベクターは、 細胞中で外来 DNAを揷入したり、 外来 DNAが挿入された H ACベクターを他の細胞に移入したりできるため、 外来 DN Aを所望の受容細胞に導入 することができる。 外来 DN Aの受容細胞への導入には、 例えば以下のステップが含ま れる ：
(a) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ；
(b) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠位及び 又は短腕遠位を削除する ステップ； ■
( c ) 削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメァ配列を付加するステップ； (d)削除される長腕及び 又は短腕の部位にサブテロメァ配列を付加するステップ；
(e) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に少なく とも 1つの部位特異的組換え酵素 の認識部位を挿入するステップ； 、
( f ) 部位特異的組換え酵素の存在下にて上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に外来 DN Aを挿入するステップ；
(g) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製 するステップ； (h) 上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
( i ) 融合した受容細胞において外来 DN Aの導入を確認するステップ。
ステップ （a) 〜 （ f ) は、 上述したように行うことができ、 ステップを行う順序は これに限定されない。
ステップ （g) 及び （h) においては、 ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する供 与細胞から、 ミクロセル法を利用して受容細胞に当該染色体又はその断片を移入する。 移入対象となるヒ ト染色体又はその断片は、 ステップ （b) 〜 （ f ) における染色体又 はその断片の改変前、 改変ステップの途中、 又は改変後のものとすることができる。 従 つて、 例えばステップ （ f ) においてヒ ト染色体又はその断片に外来 DNAを挿入する 前に、 ヒ ト染色体又はその断片を保持する供与細胞から、 ミクロセル法を利用して受容 細胞に当該染色体又はその断片を移入してもよい。 その後、 ステップ （ f ) の外来 DN Aの挿入操作を受容細胞において行って、 外来 DN Aが挿入されたヒ ト染色体又はその 断片を受容細胞に保持させることもでぎる。 これらのステップは他の順序で行うことも でき、 ステップ （ f ) 〜 （h) の順序は、 上記順序に限定されない。 ' - ミクロセル法は、 上記 「1. ヒ ト人工染色体 （HAC) ベクターの作製」 の項に記載 のように行うことができる。ここで用いる受容細胞は、特に限定されるものではないが、 動物細胞、 特に哺乳動物細胞 （例えばマウス細胞、 ヒ ト細胞など） が好ましい。 また、 上述したような多分化能を有する細胞、 例えば胚性幹細胞 （E S細胞）、 並びに間質系幹 細胞及び組織幹ノ前駆細胞などを受容細胞として用いることも可能である。
続いて、 ステップ （ i ) においては、 受容細胞に外来 DN Aが導入 （移入） されてい るか否かを確認する。 この確認は、 当技術分野で公知の手法により行うことができ、 例 えば、 外来 DNAの制限酵素部位に対応するプローブを用いたサザンブロッ ト解析など により、 外来 DN Aの導入を確認することができる。
本 H ACベクターを用いることにより、 大きなサイズの外来 DN Aを細胞に導入し、 安定に保持させることが可能となる。 '
(2) 外来 DNAを発現する細胞の作製
本 HACベクターは、 上述したように、 細胞中で外来 DNAを挿入したり、 外来 DN Aが挿入された H ACベクターを他の細胞に移入したりできるため、 外来 DN Aを発現 する細胞を作製することもできる。 外来 DNAを発現する細胞の作製には、 例えば以下 のステップが含まれる ：
(a) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ； (b) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠位及び Z又は短腕遠位を削除する ステップ；
(c) 削除される長腕及び/ は短腕の部位にテロメァ配列を付加するステップ；
( d )削除される長腕及び/又は短腕の部位にサブテロメァ配列を付加するステップ；
(e) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入 するステップ； ，
( f ) 都位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に外来 DNAを挿入するステップ；
(g) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製 するステップ；
(h) 上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；並びに
( i ) 融合した受容細胞において外来 DNAを発現する細胞を選択するステップ。 ステップ （a) 〜 （h) は、 上述したように行うことができ ステップを行う順序は これに限定されない。
ステップ （ i ) においては、 受容細胞において外来 DNAの発現を確認し、 外来 DN Aを発現する細胞を選択する。 外来 DN Aの発現の確認は、 当技術分野で公知の手法に より行うことができ、 例えば、 外来 DNAに対応するプローブを用いたノーザン ' プロ ット法などが挙げられる。 あるいは、 外来 DNAによりコードされるタンパク質を、 該 タンパク質に対する抗体、 該タンパク質の活性を検出することができる手段を用いて検 出することにより、 外来 DN Aの発現を確認することも可能である。
本 H ACベクターを用いることにより、 大きなサイズの外来 DN Aを発現する細胞を 作製することが可能となる。
(3) タンパク質の製造
本 HACベクターを利用することにより、 上述したように、 外来 DNAを細胞に導入 することや、 外来 DNAを発現する細胞を作製することができるため、 当該外来 DNA によりコードされるタンパク質を製造することができる。 タンパク質の製造には、 例え ば以下のステップが含まれる ：
(a) ヒ 卜染色体又はヒ ト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ；
(b) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠位及びノ又は短腕遠位を削除する ステップ；
( c ) 削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメァ配列を付加するステップ； ( d )削除される長腕及び Z又は短腕の部位にサブテロメァ配列を付加するステップ； ( e ) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入 するステップ；
( f ) 部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片にタン パク質をコードする外来 D N Aを挿入するステップ；
( g ) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製 するステップ；
( h ) 上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；
( i ) 融合した受容細胞を培地中で培養するス ップ；並びに
( j ) '得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップ。
ステップ （a ) ~ ( h ) は、 上述したように行うことができ、 ステップを行う順序は これに限定されない。
. ステップ （ i ) では、 ステップ （h ) で融合した受容細胞を培地中で培養する。 受容 細胞を培養するための培地は、 炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 上記受容細胞の 培養を効率的に行うことができる培地であれば、 天然培地、 合成培地のいずれを用いて もよく、 当業者であれば適切な培地を選択し、 また必要により適宜修正を加えて培地を 調製することができる。 また、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件、温度、 p H、 培養期間なども適宜設定する。
培養後、 ステップ （ j ) に記載するように、 得られる培養物からタンパク質を採取す る。 「培養物」 とは、 培養上清のほか、 培養細胞又は細胞の破砕物のいずれをも意味する ものである。 培養終了後、 該培養物よりタンパク質を採取するには、 通常のタンパク質 精製手段等を用いて得ることが出来る。 例えば、 細胞内に生産された場合は、 常法によ り細胞を超音波破壊処理、 磨砕処理、 加圧破砕等によりタンパク質を抽出する。 必要に 応じてプロテアーゼ阻害剤を添加する。 また、 培養上清に生産された場合は、 培養液そ のものを用いることが出来る。 そして、 この溶液を濾過、 遠心分離等を行い固形部分を 除去し、 必要によりプロ トタミン処理等により核酸を除去する。
次いで、 これに硫安、 アルコール、 アセトン等を添加して分画し、 沈殿物を採取し、 粗タンパク質溶液を得る。 該タンパク質溶液を各種クロマトグラフィー、 電気泳動等に かけて精製酵素標品を得る。 例えば、 セフアデッタス、 ウルトラゲル若しくはバイオゲ ル等を用いるゲル濾過ぐ イオン交換体クロマトグラフィー、 ポリアクリルアミ ドゲル等 を用いる電気泳動法、 ァフィ二ティクロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィー等を 用いる分画法を適宜選択し、 又はこれらを組合せることにより、 精製された目的のタン パク質を得ることが出来る。 しかし、 上記培養法、 精製法は一例であって、 これに限定 されるものではない。
本発明において、 製造対象となるタンパク質は、 製造が望まれるタンパク質であれば 特に限定されるものではないが、 一例としては、 エリスロポイエチン （E PO)、 トロン ボポイエチン （TPO)、 血液凝固因子、 フォンヴィルブランド因子 （vWF)、 ジス ト 口フィン、 ドーパミン合成酵素、 インスリン、 インスリン様増殖因子 （ I GF)、 インス リン様増殖因子結合タンパク質 （ I GFB P)、 抗体、 テロメラーゼ、 顆粒球コロニー刺 激因子、 顆粒球 ·マクロファージコロニ一刺激因子、 免疫グロブリン、 成長ホルモン、 インターロイキン 2、インタ一ロイキン 3、インターロイキン 4、インタ一ロイキン 5、 インターロイキン 6、インターロイキン 7、インターロイキン 8、インターロイキン 9、 インターロイキン 1 0、 インターロイキン 1 1、 インタ一ロイキン 1 2、 インターロイ キン 1 5、 CD 40リガンド、 ィンターフェ口ン、 アデノシンデァミナーゼ、 α— 1ァ ンチトリプシン、 オル二チントランス力ルバミラーゼ、 プリンヌクレオチドホスホリラ ーゼ、 成長抑制因子 （G I F)、 腫瘍壊死因子 （TNF)、 白血病阻害因子 （L I F)、 ォ ンコスタチン M、 F 1 t 3 リガンド （F l t 3 L)、 ストロ一マ由来因子 （S D F)、 幹 細胞堉殖因子 （S CF)、 繊維芽細胞増殖因子 （FGF)、 上皮増殖因子 （EGF)、 血管 形成誘導因子 （VEGF)、 アンジォポイエチン、 神経成長因子 （NGF)、 骨形成因子
(BMP),ァクチビン、 トランスフォーミング增殖因子（TGF)、 ウィント （Wn t)、 アールスポンジン（R_ s p o n d i n)、モノクロナール抗体、オリゴクロ ナル抗体、 及びポリクローナル抗体などが挙げられる。 このような製造対象のタンパク質をコ一ド する遺伝子 （すなわち外来 DNA) は、 例えば公の遺伝子データベースなどを利用して その配列情報を入手することができる。
(4) 遺伝子機能解析用ベクター
本 HACベクターに挿入した外来 DNAは、 細胞中でコピー数依存的かつ安定的に発 現されるため、 本 H ACベクターは、 遺伝子機能を解析するために利用することができ る。
標的遺伝子をコ一 ドする塩基配列の一部に相補的な配列からなる二本鎖 RN A (double - stranded RNA； d s RNA) を発現させることにより標的遺伝子の発現を抑制 する手法、 RNA干渉が知られている （例えば、 短鎖干渉 RNA ( s i RNA) に関し ては、 Elbashirら、 Nature, 411:494-498, 2001； McCaffreyら、 Nature, 418:38-39， 2002 を参照。 また、 Shinagawa, T.ら、 Genes & Development, 17:1340-1345， 2003も参照）。 d s RNAをコードする DNAを遺伝子発現誘導系とともに H A Cベクター上に導入す ることにより、 標的遺伝子のコンデイショナルな機能抑制が可能である。 また、 遺伝子 発現誘導系に替えてゲノム領域を利用することで組織特異的/生理的な部位での機能抑 制が可能である。 また、 ゲノム中に存在するマイクロ RNA (m i RNA) の機能解析 を行なうことも可能である。
また、 目的分子による作用効果を解析しょうとする場合に、 その目的分子の用量依存 性を指標として解析する手法がある。 この手法において、 本発明に従って目的分子をコ 一ドする遺伝子の発現ュニッ トのコピー数を変えて HACベクタ一上へ導入し、 細胞等
(組織、 個体も含む） に移入することにより、 該細胞等におけるコピー数依存的発現制 御に基づいて用量依存性解析を行なうことが可能である。 また、 遺伝子発現制御のため に発現誘導系ゃゲノム領域を利用することでコンディショナル又は組織特異的ノ生理的 な機能解析が可能である。
(5) 幹細胞への遺伝子導入用ベクター
本発明の方法により作製した HACベクタ一は、 胚性幹 （E S) 細胞又は間葉系幹細 胞 （Mesenchimal Stem Cell； MS C) への遺伝子導入用ベクターとして利用することが できる。 そして上記 HACベクタ一は E S細胞又は MS Cにおいて長期間安定に存在で さる。
また、 本発明の方法により作製した HACベクター移入 E S細胞から分化誘導した組 織細胞においても H ACベクターが安定に保持されると考えられる。
また近年、様々な組織の幹細胞及び骨髄由来の多能性細胞が同定されている（横田ら、 実験医学 （増刊）、 1 9卷 1 5号、 200 1年、 羊土社、 岡野ら、 実験医学 （増刊）、 2 1卷 8号、 2 0 0 3年、 羊土社、 Li ら、 Nature Med. , online:31 August 2003, doi:l0.1038/nm925)o 本発明の方法により作製した H A Cベクターは、 組織幹/前駆細 胞、 例えば骨髄、 血液、 神経、 筋肉、 肝臓、 塍臓、 皮膚、 内耳などに由来する多能性幹 Z前駆細胞、 への遺伝子導入用ベクターとして利用可能である。
さらに、 E S細胞、 MS C、 及び組織幹/前駆細胞のヒ ト臨床応用を考える場合、 治 療処置に必要な量の細胞を増幅し、 所望の分化状態で提供することが求められる。 従来 では、 多分化能を保持したまま幹細胞だけを大量に増幅することは容易ではなく、 課題 の一つとなっている （日野ら、実験医学、 1 9卷 1 5号増刊： 1 0、 200 1、 羊土社）。 例えば、 造血幹細胞や神経幹細胞を生体組織から採取し培養すると、 幹細胞だけでなく 幹細胞から分化した前駆細胞や成熟細胞も同時に増幅されるため、 臨床用途には好まし くない （岡野 榮之、 実験医学、 1 9卷 1 5号増刊 ： 80— 90、 200 1、 羊土社)。 本発明においては、 多分化能保持に関わる因子、 例えばマウス E S細胞では、 活性化 型 S t a t '3, O c t— 3/4、 N a n o gなどの転写因子 （Niwa ら、 Genes Dev. , 12 :2048 - 2060， 1998； Matsudaら、 EMB0 ， 18 :426ト 4269， 1999； Niwaら、 Nature Genet. , 24:372—376， 2000;Mitsui .ら、 Cell, 113:631—642， 2003； Chambers ら、 Cell, 113:643—655， 2003) をコードする DNAを導入した HACベクタ一を作製し幹細胞へ移入することに より、 宿主染色体を変異させ ¾ことなく多分化能を保持しかつ簡便に幹細胞を増幅させ るために利用することが可能である。
また、 幹細胞の分化制御においては、 関与する分子の発現量のコントロールが重要な 要素にな ている。 例えば、 マウス E S細胞における上記 O c t— 3/4による分化制 御においてその発現量が生理的発現レベルを 1 00%とした場合は未分化状態を維持す るが、 50%以下の場合は栄養外胚葉に分化し、 また 1 50%以上では原始内胚葉に分 化する （Niwaら、 Nature Genet. , 24:372-376， 2000)。 このような発現レベルの変化に より分化を制御する場合には、 本発明の方法により作製した H A Cベクターに遺伝子発 現 ONZOFF誘導系 （例えばテトラサイクリンによる発現誘導系） を導入することに より、 厳密な発現量のコントロールが可能となる。
また、 本発明の方法により作製した HACベクタ一に遺伝子発現 ONZOFF誘導系 (例えばテトラサイクリンによる発現誘導系） と複数の分化誘導因子とを組み合わせて 導入することにより、 多分化能保持状態と分化誘導状態を切替えることが可能である。 幹細胞による組織再生を行う場合、移植細胞又はドナー由来の再生組織は、長期間（望 ましくは生涯） にわたりレシピエント個体の一部となり機能する。 それ故に癌化などの 生理的制御の逸脱をドナー細胞に誘発する原因 .（例えば遺伝子変異） を与える操作は極 力避けることが望ましい。 本 HACベクターは、 宿主染色体と独立に存在できることか ら、 遺伝子導入を宿主染色体に変異を与えずに行なうことができる。 また本明細書中実 施例に示すとおり、 ヒ ト細胞中で安定に存在できることから、 長期間にわたり安定に目 的分子を発現することができる。
本発明の方法に従って、 分化させた組織で生理的に発現する遺伝子のゲノム領域又は 組織特異的発現制御領域を含むゲノム配列下に目的の遺伝子を融合した DN Aを導入し た H ACベクターを作製し、上記 H ACベクターを移入した幹細胞を用いることにより、 再生した組織において生理的 組織特異的に目的分子を発現することが可能である。 まだ、 本発明の方法により作製した H ACベクタ一を保持する幹細胞を分化誘導した 後、 導入遺伝子の発現が必要なければ H ACベクタ一は不用となる場合がある。 分化誘 導後に HACベクター脱落クローンを、 方法を特に限定するものではないが例えば選択 培養における薬剤耐性を指標にして選別することにより、. 不用となった H ACベクター を排除することが可能である。
(6) 培養支持フィーダ一細胞作製用ベクター
細胞培養法の一つとして、 培養器底面に付着性細胞を敷き詰めた培養支持フィーダ一 細胞上に目的の細胞を播種し共培養する方法が知られている （日本生化学会編、 新生化 学実験講座 1 4発生分化老化、 19 92年、 東京化学同人）。 例えば造血前駆細胞を増殖 させる場合には、 SCF、 F l t 3 L、 TPO、 I L— 6、 s I L— 6 Rなどの必要な 因子をそれぞれ例えば組換え体タンパク質として準備し、 培養液に添加して培養する (Uedaら、 J Clin Invest. , 105:1013-1021， 2000)。 従来法により培養添加物の遺伝子 を培養支持フィーダ一細胞へ導入することが可能であるが、 宿主染色体へのランダム揷 入による変異 ·ポジション効果、 発現不活化、 多コピー発現ュニッ ト並列による下流遺 伝子発現の減弱などにより、 全ての因子について望みの発現量を制御して供給すること は困難と考えられる。本発明の方法によりこれらの必要因子をコードする DNA全て（又 は一部） を'導入した HACベクターを作製し、 培養支持フィーダ一細胞へ移入すること により、 組換え体タンパク質などを後から加えることなく単なる共培養だけで簡便に必 要な因子を全て補給することが可能である。 また、 遺伝子発現誘導系を利用することで これら因子のコンディショナルな発現制御が可能である。
(7) ヒ ト疾患治療用ベクター
ヒ ト疾患治療用のベクタ一は、 ウィルス性及び非ウィルス性ベクターが従来から各種 研究されているが、 免疫反応の惹起、 導入 DNAサイズの限界、 宿主染色体挿入変異、 低導入効率 ·低発現効率、 発現量制御が困難 （金田 安史、 臨床免疫、 39卷： 55 1 - 558, 2003年、 科学評論社、 小澤 敬也編、 遺伝子治療、 1 99 7年、 羊土社） など、 様々な課題が指摘されている。 いずれのベクターにも共通する課題として、 「望ま しい発現量を、 望ましいタイミングで制御する」 ことが求められている。
HACべグターを用いた遺伝子細胞治療の戦略として、 （ i ) 1次的に欠損している酵 素やタンパク質の補充、（ i i ) 2次的に減少している代謝産物を補充する対症療法、 （ i i i ) 細胞に新^！能を付加し、 細胞の生存を高める方法 （例えば改変細胞を用いる組織 再生において、 HACベクターはゲノムを導入することにより生理的/組織特異的遺伝 子発現制御を行なうことが可能である。 またこれにより過剰発現又は発現不足による機 能障害などの副作用を回避することができる。）、 （ i V ) G a i n o f f u n c t i o nの形で進行する変性疾患の障害をくいとめる方法 （例えばパーキンソン病における GDNF補充治療） などが挙げられる。
すなわち、 本 HACベクターは、 ヒ ト疾患治療用べクタ一として使用することが可能 であり、 治療用の外来 DNAを導入した HACベクターを細胞 移入後、 その細胞を患 者に投与するための医薬組成物として調製すること、 および本 HACベクターを用いた 遺伝子治療が可能である。 また、 かかるヒ ト疾患治療用ベクターは、 疾患の治療のみな らず、 疾患の予防にも使用することが可能である。
適用範囲を特に限定するものではないが、 以下にヒ ト疾患治療用ベクターとしての適 用例を示す。
(A) テロメラ一ゼの利用
遺伝子細胞治療や組織再生治療において材料となる細胞は、 その安全性観点から不死 化細胞ではなく正常細胞を用いることが望ましい。 しかし正常体細胞は、 一定回数分裂 すると増殖 ·分裂が止まりやがて死滅する、 すなわち老化することが知られている （井 出 利憲、 実験医学、 1 6卷 1 8号増刊： 1 8— 24、 1 9 98、 羊土社)。 治療効果を 長期間持続させるために、 治療用細胞は一定期間、 望ましくは罹患者の生涯を通して維 持されることが必須である。 染色体末端に存在する繰返し配列テロメァの修復酵素であ るテロメラーゼは、 正常細胞内で過剰発現させることにより細胞老化時に認められるテ 口メァ短縮を抑制し、細胞の寿命を延長できることが知られている（Bodnarら、 Science, 279:349-352， 1998)。 またテロメラ一ゼは、 細胞内で過剰発現させても不死化又は癌化 を導くものではないことが示されている （真貝 洋ー、 実験医学、 1 6卷 1 8号増刊 ： 25— 30、 1 9 98、 羊土社、 Jiangら、 Nature Gent. , 21:111 - 114， 1999)。 それゆ え、 本発明の方法によりヒ トテロメラーゼ （hTERT) をコードする遺伝子を HAC ベクター上に導入し標的となる細胞へ移入することにより、 HAC移入細胞の寿命を延 長し、 不死化又は癌化させることなく治療効果を長期間持続させることが可能である。 また、 遺伝子発現制御を発現誘導系やゲノム領域を利用することにより、 コンディショ ナル又は組織特異的 Z生理的なテロメラ一ゼ発現が可能である。
(B) 自己抗体生成の抑制
組換え体タンパク質製剤を開発する場合、 投与時の自己抗体 （活性中和抗体） の生成 が障害となっている （Li ら、 Blood, 98:3241-3248, 2001)。 患者への投与方法を特に限 定するものではないが、 本発明の方法により作製した目的タンパク質をコ一ドするゲノ ムを導入した H A Cベクターを、 ヒ ト細胞、 例えば産生組織の正常ヒ ト細胞へ移入後、 これを患者へ移植する。 該患者において H A Cベクターから目的タンパク質を生理的/ 組織特異的に発現 ·供給することにより、 患者における自己抗体生成の抑制が可能であ る。
また、 組織特異的マイク P R N A (m i R N A) 標的部位を導入遺伝子に付加するな どにより （Brown BDら、 Nature Medicine, 第 12卷、 p585- 591、 2006年）、 特定の組織 - 細胞において導入遺伝子を消失させることが可能であり、 導入遺伝子に対する自己抗体 生成の抑制、 免疫応答回避が可能である。
( C ) 免疫遺伝子細胞療法における遺伝子導入用ベクター
再発白血病に対する治療法として、 移植片対白血病反応により移植リンパ球が腫瘍特 異的細胞傷害性 T細胞として白血病細胞を攻撃することを応用したドナーリンパ球輸注 療法 （Kolb ら、 Blood, 76 : 2462 - 2465, 1990) が知られている。 上記療法の副作用とし て、 移植細胞がレシピエント組織を攻撃し障害を与える移植片対宿主病が知られている が、 これに対するひとつの対処法として、 ドナーリンパ球へのレトロウイルスによる薬 剤誘導性の自殺遺伝子導入及び薬剤投与による ドナ一リンパ球の除去が行われている (小野寺ら、 ゲノム医学， 3卷： 4 5， 2 0 0 3， メディカルレヴュー社）。 上記方法の 場合、 ドナーリンパ球の染色体に変異を与える危険性が残る。
本発明の方法により作製した H A Cベクタ一は、 宿主染色体に変異を与えない免疫遺 伝子細胞療法における遺伝子導入用べクタ一として利用することが可能である。 また、 抗腫瘍活性促進を目的とした治療、 例えばリンパ腫における C D 4 0リガンドによる免 疫活性化療法 （加藤ら、 ゲノム医学， 3卷： 5 3， 2 0 0 3 , メディカルレヴュー社） や遺伝子ワクチン療法など、 における遺伝子導入用べクタ一としても利用することが可 能である。
( D ) モノクロナール完全ヒ ト抗体補充
近年ヒ ト抗体産生マウスを利用した、 完全ヒ トモノクロナール抗体医薬品の創製が試 みられている （石田ら、 B i 。ベンチャー、 2卷： 4 4、 2 0 0 2、 羊土社、 Mori ら， Cell Death and Differentiation, in press, 2003, Proceedings or American Association for Cancer Research, Volume 44, 2nd Edition, July 2003, pl285, #6422)。 し力 し、 これを慢性疾患へ適用する場合には、 定期的な T P O投与のため病院への通院が必要と なり患者の Q O Lの障害となることが予測される。 また、 組換え体タンパク質製剤の製 造には多大なコストがかかり、 そめ結果として高額な医療費負担が生じることも課題の 一つとなっている。
本発明の方法により作製した HACベクター上に、 目的の抗体を産生するハイプリ ド 一マから単離した目的抗体をコ一ドするゲノム領域を導入し、 例えば患者造血幹細胞や B細胞へ上記 HACベクタ一を移入後、 患者へ再移植することにより、 完全ヒ ト抗体を 生理的発現制御により補充 '供給することが可能である。 また上記により定期的な通院 治療回数を減らし患者の QOLを向上させることが可能である。
(E) 単一遺伝性疾患における欠損補充
(E- 1 ) 血友病
血友病 Aは、 血液凝固第 8因子の変異、 血友病 Bは血液凝固第 9因子の変異が原因と なって起こる、 伴性劣性遺伝性出血疾患である。 治療法として第 8又は第 9因子濃縮製 剤投与による補充療法が有効であるが、 出血後投与では重篤な合症が生じること、 濃縮 製剤への病原体混入の可能性、 反復投与による自己抗体 （活性中和抗体） の発生、 常時 出血への対処準備による患者 QOLの低下、 高額な医療費など課題は多く、 遺伝子治療 法による解決が期待されている。 従来ベクターによる臨床遺伝子治療研究が行われでい るが、 十分な発現を長期間持続できず有意な治療効果を得るに至っていない。 また、 レ トロウィルス及びアデノ随伴ウィルス （AAV) ベクターを直接投与する臨床研究にお いて被験者の精液中にベクター遺伝子が検出され生殖細胞への遺伝子導入の危険性が指 摘されている （望月ら、 ゲノム医学， 3卷： 25, 2003， メディカルレヴュー社）。 第 8因子をコードする遺伝子は、 全長ゲノムで約 1. 5Mb、 c DNAで約 7 k bにわ たる。 非ウィルスベクタ一やアデノウィルスベクターでは、 全長 c DN Aの導入は可能 であるが発現量の低下が、 また AAVベクタ一では、 導入 DNAサイズが約 4. 9 k b 以下に限られるため全長遺伝子を導入できないことが課題となっている。
本発明の方法により血液凝固第 8因子又は第 9因子をコードする DN Aを導入した H ACベクターを作製することが可能である。 そして、 患者への投与方法を特に限定する ものではないが、 上記 HACベクターを、 例えばヒ ト細胞へ移入後、 罹患者への移植に より補 ¾することが可能である。 また、 患者への投与方法を特に限定するものではない が、 上記血液凝固第 8因子又は第 9因子のゲノム領域を導入した HACベクターを、 例 えばヒ ト細胞へ移入後、 該細胞の罹患者への移植により、 生理的組織特異的発現により 該因子を補充することが可能である。
(E- 2) X— S C I D (X連鎖重症複合免疫不全症） 重症複合免疫不全症 （S C I D) は、 液性及び細胞性免疫が先天的に障害される疾患 である。 S C I Dの約半数が X連鎖の X— S C I Dであり、 その原因はィンターロイキ ン 2ファミ リ一の受容体が共有する共通 γ鎖の変異であることが知られている。 治療法 として、 造血幹細胞移植が行われているが、 液性免疫の回復は不十分で免疫グロブリン の定期的投与が必要となる。 そこで造血幹細胞へ共通 鎖を導入し移植する遺伝子細胞 治療法による解決が期待されている。 1 9 99年からレトロウイルスにより共通 γ鎖を 導入した造血幹細胞移植の臨床研究が行われていたが、 近年フランスにおいて移植細胞 の白血病化が複数例報告された (Hacein-Bey-Abina ら、 N Engl J Med. , 348:255-256, 2003； Marshall ら、 Science, 299： 320, 2003)。 何れのケースも遺伝子導入細胞染色体 中の原ガン遺伝子の一つである LMO 2遺伝子領域にベクター配列挿入変異が認められ、 LMO 2活性化と腫瘍化との関連が疑われている （久米ら、 ゲノム医学， 3卷： 9， 2 003, メディカルレヴュー社）。
• 本発明の方法により共通 鎖をコ一ドする DNAを導入した HACベクタ一を作製す ることが可能である。 そして上記 H ACベクターを遺伝子導入用ベクターに用いること により宿主染色体へのベクター配列挿入変異の危険を回避することが可能である。また、 患者への投与方法を特に限定するものではないが、上記 HACベクターを、 ヒ ト細胞（例 えばヒ ト骨髄由来正常造血幹細胞） へ移入し、 罹患者へ移植することにより、 生理的組 織特異的発現による共通 γ鎖の欠損機能相補を行うことが可能である。
(Ε— 3) ディシェンヌ型筋ジス トロフィー ； DMD
ディシェンヌ型筋ジス トロフィーは、 ジス トロフィン遺伝子の変異によるジス ドロフ インの機能欠損が原因である、 X連鎖劣性単一遺伝子性疾患の一つである（Hoffmanら、 Cell, 51：919-928, 1987)。 DMDの治療は、 ジス トロフィンが細胞骨格タンパク質であ るため直接投与による補充は不可能であり、 遺伝子治療法が期待されている。
ジストロフィン遺伝子は；全長ゲノムで約 2. 3Mb、 c DNAで 14 k bにわたる。 非ウィルスベクターやアデノウィルスベクタ一では、 全長 c DN Aの導入は可能であ が発現量の低下が課題となっている（Liuら、 Mol. Ther. , 4： 45, 2001 ;DelloRussoら， Proc Natl Acad Sci USA, 99:12979-12984, 2002)。 また AAVベクタ一では、 導入 DNAサ ィズが約 4. 9 k b以下に限られるため全長遺伝子を導入できず、 また骨格筋への遺伝 子導入実験において免疫反応が引き起こされ導入遺伝子産物の発現低下が認められた (Yuasa ら、 Gene Therapy, 9:1576- 1588, 2002)、 などの課題が存在する。
遍在的な発現を誘導する CMVプロモーター制御下にジストロフィンミニ遺伝子を導 入しだ AAVベクターによる骨格筋への遺伝子導入実験においては、 免疫反応が引き起 こされ導入遺伝子産物の発現低下が認められたが、 プロモータ一として骨格筋特異的な MCKプロモーターを使用することにより上記免疫応答が改善された （Yuasa ら、 Gene Ther.， 9:1576- 1588， 2002)。 このことから、 ジストロフィンの発現には生理的組織特異 的発現が必要であることが示唆される。
本発明の方法によりジスト口フィンをコードするゲノム領域を導入した HACベタタ 一を作製することが可能である。 そして、 患者への投与方法を特に限定するものではな いが、 上記 H ACベクターを、 ヒ ト細胞 （特に限定するものではないが例えば自家ヒ ト 正常筋芽細胞） へ移入し、 罹患者へ移植することにより、 生理的組織特異的発現による ジストロフィン補充を行うことが可能である。
(E-4) 適用対象疾患を特に限定するものではないが、 例えば以下に示す単一性遺 伝子疾患； α— 1アンチトリプシン欠損症、 嚢胞性繊維症 （CFTR)、 慢性肉芽腫症、 家族性高コレステロール症、 ファンコ一二貧血、 ゴーシェ病、 ハンター症候群、 オル二 チントランス力ルバミラーゼ欠損症、 プリンズクレオチドホスホリラーゼ欠損症、 AD A— SC I D、 白血球接着欠損症、 C a n a V a n病、 脳梁萎縮、 フアブリ一病、 筋萎 縮性側索硬化症、 リソソ ム病、 フォンヴィルブランド病、 サラセミア、 などにおいて、 本発明の方法により原因遺伝子を導入した HACベクターを作製し、 患者への投与方法 を特に限定するものではないが、 例えばヒ ト細胞へ移入して患者へ移植するなどによつ て、 欠損分子の補充 ·相補を行うことが可能である。 なお、 疾患原因遺伝子情報につい ては、 米国 National Center for Biotechnology Information (N C B I ) のオンライ ン文献データベース
P u bMe d (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/ query. fcgi?db=PubMed) 又は 0MIMTM_ Online Mendelian Inheritance in Man™
(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ entrez/ query, f cgi?db=0MIM) を参照されたレヽ。
(F) その他疾患
(F - 1 ) トロンボポイエチン （Thrombopoietin； T P O) は、 血小板産生制御及び 造血幹/前駆細胞の増殖を担う因子であり、 例えば再生不良性貧血などの血液疾患、 化 学療法後の造血回復などへの適用が期待されている。 しかし、 TPO組換え体タンパク 質投与時の活性中和抗体生成が医薬品開発の障害となっている （Li ら、 Blood, 98:3241-3248, 2001)。 従って、 T P Oを慢性疾患へ適用する場合には、 定期的な TP O 投与のため病院への通院が必要となり患者の Q O Lの障害となることが予測される。 ま た、 組換え体タンパク質製剤の製造には多大なコス トがかかり、 その結果として高額な 医療費負担が生じることも課題の一つとなっている。
本発明の方法により TPOゲノムを導入した HACベクターを作製し、 患者への投与 方法を特に限定するものではないが、 ヒ ト細胞、 例えば産生組織の細胞、 へ移入し、 生 理的 組織特異的に T P Oを発現 ·供給することにより、 自己抗体生成を抑制すること が可能である。 また上記により定期的な通院治療回数を減らし、 患者の QOLを向上さ せることが可能である。
(F- 2) エリスロポイエチン （Erythropoietin； E PO) は、 赤血球増殖因子であ り、 例えば糖尿病ゃ腎疾患における腎性貧血などの治療薬として市販されている。 慢性 疾患 （例えば糖尿病による腎性貧血など） では定期的な E PO投与のため病院への通院 が必要であり患者の QOLの障害となっている。 また、 組換え体タンパク質掣剤の製造 には多大なコストがかかり、 その結果として高額な医療費負担が生じることも課題の一 つとなっている。 本発明の実施例 1 4に.示したように、 EPO c DNA導入した HA Cベクターをヒ ト正常繊維芽細胞へ移入し患者へ移植することにより、 該患者において E POを発現 '供給することが可能である。 また、 本発明の方法により、 E POゲノム 領域を導入した HACベクタ一を作製し、 患者への投与方法を特に限定するものではな いが、 ヒ ト細胞、 例えば産生組織の細胞、 へ移入し、 生理的 組織特異的に E POを発 現 -供給することが可能である。 また上記により定期的な通院治療回数を減らし、 患者 の QO Lを向上させることが可能である。
(F— 3) パーキンソン病
パーキンソン病は、 中脳黒質緻密部ドーパミン合成細胞の進行性の変性脱落により運 動機能が障害される神経疾患である。 治療法の一つとして、 欠損したドーパミン補充を 目的とした L— DO P A投与法があるが、 中等以上の症状では薬効が減弱することや副 作用による患者の QOL制限 ·投与量減少などの課題が存在する。 これら課題は、 ドー パミン濃度が線状体内で一定しないこと及び投与した L一 DO P Aが線状体以外で作用 することに起因するため、線状体での一定したドーパミンの生理的発現が求められる（武 田ら、 メディカルサイエンスダイジェス ト、 29卷： 20、 200 3年、 ニュー ' サイ エンス社)。 現在、 ド一パミン合成に関わる酵素 3種類を各々導入した AAVベクターに よる遺伝子治療研究がなされているが、 いずれも生理的発現制御を行うまでには至って いない。 また、 ド一パミン合成細胞の変性脱落抑制を目的と した治療法に GDNF (Grial- cell Derived Neuronal Factor) 投与があるが、 被殻下にカテーテル留置によ る持続投与で効果が認められた （Gill ら、 Nature Med., 9:589-595, 2003) 一方で感染 の危険性や患者の QOL制限などが課題となっている。 AAVベクターによる遺伝子治 療研究により動物モデルで効果が示された （Wang ら、 Gene Ther.， 9:381-389, 2002) が、 こちらも生理的発現制御を行うまでには至っていない。
本発明の方法により、 ドーパミン合成に関わる酵素群又は GDNFゲノム領域を導入 した H ACベクターを作製することが可能である。 そして、 患者への投与方法を特に限 定するものではないが、 上記 H^Cベクタ一を、 ヒ ト細胞 （例えばヒ ト正常神経幹/前 駆細胞） へ移入し、 罹患者へ移植するこどにより、 生理的組織特異的発現による導入遺 伝子産物の補充が可能である。
(F-4) 糖尿病
インスリン依存型糖尿病において、 組換え体タンパク質製剤投与による治療が行われ ている。 慢性疾患では定期的な投与のため病院への通院が必要であり、 患者の QOLの 障害となっている。 また、 組換え体タンパク質製剤の製造には多大なコス トがかかり、 その結果として高額な医療費負担が生じることも課題の一つとなっている。 インスリン の血中濃度は至適範囲がせまいため、 多すぎても少なすぎても副作用が生じ、 時には生 命の危険に至る場合がある。 また、 遺伝子治療の研究がなされているが、 体内における インスリン濃度のコントロールが課題となっている （森谷ら、 蛋白質 核酸 酵素、 4 0卷： 2764、 1 9 95、 共立出版）。
本発明の方法によりインスリンゲノムを導入した HACベクターを作製し、 患者への 投与方法を特に限定するものではないが、 ヒ ト細胞、例えば産生組織の細胞、へ移入し、 生理的 Z組織特異的に発現 ·供給することが可能である.。 また上記により定期的な通院 治療回数を減らし患者の QOLを向上させることが可能である。
(F— 5) 適用対象疾患を特に限定するものではないが、 例えば脳腫瘍、 末梢動脈疾 患 （虚血など）、 慢性間接リュウマチ、 動脈再狭窄、 肘部トンネル症候群、 冠動脈疾患、 アルツハイマー病、 潰瘍、 骨盤骨折、 腎疾患、 悪性腫瘍、 などにおいて、 本発明の方法 に従って、 疾患治癒に必要と考えられる物質をコードする遺伝子を導入した HACベタ ターを作製し、 患者への投与方法を特に限定するものではないが、 例えばヒ ト細胞へ移 入して患者へ移植するなどによって、 欠損分子の補充 ·相補を行うことが可能である。 (8) 遺伝子導入動物作製用ベクターおよび HACベクターを有する非ヒ ト動物 本発明の方法により作製した HACベクタ一は、 遺伝子導入動物作製用ベクターとし て利用可能である。 例えば、 上記非特許文献 5、 6又は 7の方法に従い、 外来遺伝子を 含む本 HACベクターとしてマウス胚性幹細胞に移入しキメラ個体の作製が可能である。 また移入した外来遺伝子を個体中で機能発現させること、 及び上記外来遺伝子を含む本 H ACベクタ一をキメラ個体で安定に保持させ生殖系列を経て次世代伝達させることが 可能である。 また、 さらに外来遺伝子を含む本 HACベクターは、 Ku r o i wa ら （2 002年；上記） の方法に従い、 体細胞核移植によりクローンゥシ個体を作出し、 個体 中で安定に保持させ移入された外来遺伝子を個体中で機能発現させることが可能である。 また、 本願発明の HACを保持する動物を公知の手法 （例えば、 本出願人等による出願 である、 国際公開 WO 9 7/0 76 7 1 , WO 03/04 1 49 5及び WO 03/09 78 1 2に記載される、 胚性幹細胞を使用する方法、 核移植法など） によって作製する こともできる。 動物種としては特に限定はないが、 好ましくは哺乳動物、 特に好ましく はゥシ、 ャギ、 豚、 羊、 犬、 ラット、 マウス、 サル、 などが挙げられる。 実施例
本発明を以下の実施例により具体的に説明するが、 本発明の範囲はこれらの実施例に 限定されるものではない。
なお、 下記実施例 1〜5においては、 ヒ ト 14番染色体の長腕遠位が削除され、 長腕 遠位にテロメァ配列が付加され、 かつ部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されたヒ ト H ACベクター （以下、 「テロメァ型 14HAC」 又は 「1 4 ΑΔ qHAC」 などとい う） を作製し、 その安定性及び導入された外来遺伝子の発現を確認した。
下記実施例 6〜 1 1においては、 ヒ ト 1 4番染色体の長腕遠位が削除され、 長腕遠位 にテロメァ配列及びヒ ト 1 4番染色体に由来する約 2 5 K bのサブテロメァ配列が付加 され、 かつ部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されたヒ ト HACベクター （以下、 「テロメァ '短サブテロメァ型 HAC」 又は 「14NA qHAC」 などという） を作製 し、 その安定性及び導入された外来遺伝子の発現を確認した。
下記実施例 1 2〜 1 7においては、 ヒ ト 14番染色体の長腕遠位が削除され、 長腕遠 位にテロメァ配列及びヒ ト 14番染色体に由来する約 60Kbのサブテロメァ配列が付 加され、かつ部位特異的組換え酵素の認識部位が揷入されたヒ ト H A Cベクター（以下、
「テロメァ ·長サブテロメァ型 HAC」 又は 「l 4 g NA qHAC」 などという） を作 製し、 その安定性及び導入された外来遺伝子の発現を確認した。
下記実施例 1 8〜 22においては、 上記の 3種のヒ ト H ACベクター上の N e o耐性 遺伝子ユニッ トの除去を行った。 下記実施例 23〜25においては、 ヒ ト 2 1番染色体の長腕遠位が削除され、 長腕遠 位にテロメァ配列が付加され、 かつ部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されたヒ ト H ACベクター （以下、 「テロメァ型 2 1 HAC」 又は 「2 l AA qHACj などという） を作製し、 その安定性及び導入された外来遺伝子の発現を確認した。
下記実施例 26〜30においては、 ヒ ト 2 1番染色体の長腕遠位が削除され、 長腕遠 位にテロメァ配列及びヒ ト 2 1番染色体に由来する約 8 Kbのサブテロメァ配列が付加 され、 かつ部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されたヒ ト HACベクタ一 （以下、 「テロメァ ·サブテロメァ型 HAC」 又は 「2 1 ΝΔ qHAC」 などという） を作製し た。 実施例 1
ヒ ト 1 4番染色体長腕遠位の削除によるテロメァ型 1 4HAC ( 14 ΑΔ q HAC) ベ クタ一の作製
(1) テロメア トランケーシヨンによるヒ ト 14番染色体長腕削除
(1— 1) テロメアトランケーシヨン用べクタ一 p TE L p u r o— t 1の構築 ヒ ト 1 4番染色体の長腕遠位を削除するためのテロメァトランケーションベクタ一 (ターゲティングベクター）は、 p TE L p u r o (Kuroiwaら， Nature Biotech. (USA) , 第 18卷， p.1086-1090， 2000年） を用いた。 G e n B a n kデータベースより得だヒ ト 14番染色体長腕遠位の塩基配列 （登録番号 AL 3 9 1 1 56) から、 テロメアトラン ケーシヨンベクター揷入の標的配列を設計した。 これを P CR増幅するための、 制限酵 素認識配列を付加したプライマ一オリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
7791F Nhel： 5' - AGCTAGCTCAACTGGCTCCTGATTTCTCTC (配列番号 1 )
10680R(XhoI) ： 5'- ATCTTCCTCGAGTCACCAAACTTG (配列番号 2 )
10657F(XhoI) ： 5'- CAAGTTTGGTGACTCGAGGAAGAT (配列番号 3 ).
14620R BamHI： 5'- GGGATCCTTTCAAGTGGAAGAGTGAGGTCC (配列番号 4)
ヒ ト' 1 4番染色体を保持するマウス A 9雑種細胞 （A 9 c l l — 1 4 c h r、 Shinoharaら， Hum Mol Genet, 10： 1163-1175， 2001年） を培養し、 細胞から Puregene DNA Isolation kit (Gentra System社） を用いてゲノム D N Aを抽出した。 このゲノム DNAを铸型とし、 上記のプライマーを用いて組換えの標的配列を PCR法により増幅 した。 铸型として約 0. 1 μ gのゲノム DNAを使用し、 Innis ら （PCR実験マニュ アル， HBJ出版局， 1991)に徒い、サ一マルサイクラ一は G e n e Am p 9 700 (Applied Biosystems 社） を使用して P C Rを行った。 Ta qポリメラーゼは LA T a q (宝酒 造） を用い、 反応条件は、 94°C1分の後、 変性 98°C5秒、 アニーリング/伸長 72 °C 10分を 3サイクル、変性 98 °C 5秒、ァニ一リング /伸長 70°C 10分を 2サイクル、 変性 98°C5秒、 ァニーリングノ伸長 68 C10分を 25サイクル、 伸長 72 °C 10分 で行った。 7791 FNh e lZl 0680R (X h o I ) による 2. 9 k bの増幅産 物を制限酵素 N h e I及び X h o Iにて、 10657 F (Xh o I) /14620Rb amH Iによる 3. 9 k bの増幅産物を制限酵素 X h o I及び B a mH I (ロシュ） で 消化して、突出末端をもつ DN A断片をそれぞれァガロースゲル電気泳動により分離し、 精製した。 これを pTEL p u r oプラスミ ドの, X b a I - B a mH Iサイ 卜にクロー ニングした。 最終的な pTEL p u r o— t 1コンス トラク 卜のサイズは約 12. 8 k bである。 テロメアトランケーシヨンベクター、 標的配列、 及び相同組換えにより生じ る染色体ァレルを図 2及び図 3に示した。
(1 -2) ヒ ト 14番染色体保持 DT 40細胞へのテロメァトランケ一ションベクター 導入
ヒ ト 14番染色体を保持する DT 40雑種細胞は、 同染色体を保持する上記 A 9 c 1. 1 - 14 c h r細胞を染色体供与細胞としてミクロセル法により調製した。 染色体受容 細胞である D T 40は Japanese Collection of Research Bioresources (J CRB) に 登録番号 J CRB 2221として登録されており、 入手可能である。 以下に調製法の概 略を記す。
はじめに約 1 X 108個の A 9 c l l - 14 c h r細胞からミクロセルを調製した。 2 5 cm2遠心用フラスコ （ヌンク） 12本に細胞密度が〜 80%飽和程度まで培養した A9 c l l -14 c h r細胞をコルセミ ド （0. 075 / g/m 1 , デメコルシン， 和 光純薬） を含む培養液 （20%ゥシ胎仔血清； F B S, 0. 8 m g/m 1 G418, D MEM) 中で 48時間培養して微小核を誘導した。 実施例において、 DMEMはニッス ィ製薬製のものを用いた。 培地を除いた後、 予め保温 （34°C) しておいたサイ トカラ シン B (DMEM中に 10 μ g/m 1 ,シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、 34°C, 8000 r pm, 1時間の遠心を行った。 ミクロセルを無血清培地 （DMEM) に懸濁 して回収し、 ポアサイズ 8 μ m、 5 /zm、 3 /z mのフィルター （ワッ トマン） を装着し た SWI NNEX— 25 (ミリポア） を用いて濾過精製した。 精製したミクロセルは D MEM6 m 1に再懸濁した。 DT40細胞は、 10%FB S、 1 % C S (仔ゥシ血清）、 0. ImM 2—MEを含む RPM 1 1640培養液にて培養後、 DMEMで 2回洗浄し、 1 X i 07個を DMEM5m 1に再懸濁した。ミクロセル懸濁液を室温、 1 500 r p m， 5分間遠心し、 これに DT40細胞懸濁液を重層後、 室温， 1 500 r pm， 5分間遠 心し上清を取り除いた。 ポリエチレングリコール （PEG) 1 : 1. 4溶液 （Tomizuka ら， Nature Genet. (USA) , 第 16卷， p.133-143， 1997年） で 90秒間融合処理した。 融合細胞を 60 m 1の 1 0 %F B S、 1 %ニヮ トリ血清 （C h S )、 0. l mM 2—メ ルカプトエタノール （ME) を含む R PM I 1 640培養液 （インビトロジェン製） に 懸濁し、 96穴プレートの 6枚に播いて 24時間培養した後、 lmgZm lの G4 1 8 を含む培地で約 2週間選択培養した。 2回のミクロセル融合実験から出現した薬剤耐性 のコロニーを単離した。 PCR解析によりヒ ト 1,4番染色体上に存在する領域 NEK 2 P; -LOC 1 2 2 72 7, AL 3 90 7 98、 AL 1 2 1 8 20, AL 1 5 78 58、 AL 1 3 7 1 90、 AL 1 3 7229、 I GHMC、 I G H V 3、 及び A B 0 1 94 3 7の存在を確認し、 更にヒ ト特異的プローブ C o t 1 (ギブコ BRL) を用いた蛍光 i n s i t uハイブリダィゼーション （F I SH) 解析により 1コピーのヒ ト 14番染色 体を保持するクローン DT 40 (— 14) 1— 2及び DT40 (- 14) 2— 4を確認 し取得した。 . p TE L p u r o - t lコンストラク トを制限酵素 S r f I消化により線状化 DN A とし、 ヒ ト 14番染色体を保持する DT 40雑種細胞に導入した。 1 X 1 07個の DT4 0 (— 14) 1一 2又は DT40 (- 14) 2— 4細胞を 0. 5m lの RPM I培地に 懸濁し、 30 /x g DNA存在下で室温 1 0分間静置した後、 ジーンパルサー I I (バイ オラッド） を用いてエレク トロポレ一ションを行った。 容量 25 μ Fのコンデンサに 5 50Vで印加、 電極間距離 4 mmのエレク トロボレ一シヨンセルを用いて放電した。 室 温 1 0分間静置した後、 エレク十ロポレーシヨンした細胞を、 1 0%FB S、 1 % C h S、 0. 1 mM 2— MEを含む RPM I 1 640培養液に懸濁し、 96穴プレ一ト （フ アルコン） 20枚に播種した。 24時間後に終濃度 0. 3 μ gZm 1 となるようピュー ロマイシン （Puroraycin dihydrochloride, シグマ） を加え、 2〜 3週間後には耐性コロ ニーが出現した。 DT40 (- 1 4) 1— 2では、 2回のトランスフエクシヨンから合 計 2 76の薬剤耐性コロニーを、 また DT40 (- 1 4) 2— 4では 4回のトランスフ ェクションから合計 294の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、 以後の解析を行つ た。
(1 - 3) PCR解析
ピューロマイシン耐性株ゲノム DN Aを铸型としてヒ ト 1 4番染色体上に存在する遺 伝子及び S T Sマ一カー D 1 4 S 2 72及び以下の 6遺伝子又はゲノム領域の存在を P CR法により確認した。 S T Sマーカーのプライマ一オリゴヌクレオチドの配列は米国 National Center for Biotechnology Information のオンラづ ノ、 ラ—タベース Un i S Γ ¾ (http://www.ncbi. nlm. nih. gov/ entrez/ query. fcgi?db=unists) ίこおレヽて閱覧 能 である。 上記の S T Sマーカーの登録番号は U n i S T S ： 45 1 29である。 その他 に G e n B a n kデータベースより入手した塩基配列をもとに設計した遺伝子又はゲノ ム領域プライマーオリゴヌクレオチドの位置を図 3 (図中、 プライマーを矢印で表す） に、 配列を以下に示す：
AL39 5409F： 5' - GCATGCCTTCAATGTGTGAC (配列番号 5 )
AL39 5811R： 5'- CAGCAGAGCCAAGATCCAGT (配列番号 6)
AL39 7258F： 5' - TCCACAGTTTCACCAGCATC (配列番号 7 )
AL39 7656R： 5' - AAGTGGGCGGATAACCTGAG (配列番号 8 )
• NEK2PF： 5'一 CAGCCAGTGTTTTCCTGGAT (配列番号 9 )
NEK2PR： 5'- TCTTTGCTCTTCTGCAACCA (配列番号 1 0)
L0C122727F： 5' - CGATCAGAATGGGAAACCAG (配列番号 1 1)
L0C122727R： 5' - TTGTCGCTGGAATTTGTTGA (配列番号 1 2)
70-5F： 5， - TCACCATGATCGATTGAGTT (配列番号 1 3)
70-5R： 5' - GCATTGCTGGGTCATATGGT (配列番号 14 )
IGHV3F： 5'- AGTGAGATAAGCAGTGGATG (配列番号 1 5)
IGHV3R： 5' - CTTGTGCTACTCCCATCACT (配列番号 1 6 )
なお、 S T Sマーカー D 1 4 S 282のプライマーは公知のものを使用した。
約 0. 1 X gのゲノム DNAを铸型として、 上記 6種の遺伝子又はゲノム領域と D 1 4 S 2 72マーカーの計 7種について PCR増幅 （Innis ら， 前記） を行った。 T a q ポリメラーゼは E X T a q (宝酒造） を用い、反応条件は、 94°C5分の後、変性 94 °C 1 5秒、 アニーリング 5 6 °C 30秒、 伸長 72 °C 30秒を 3 5サイクル行った。 テロメ ァトランケーションにより長腕遠位が削除された場合 NEK 2 P、 LOC 1 2 2 7 2 7、 及び 70- 5を保持し、 AL 3 9 5409— AL 39 58 1 1、 AL 3 9 72 & 8— 3 976 56.D 14 S 2 72マーカー、及び I G H V 3を保持しないことが予想される。 AL 39 7258 - 39 76 56の有無で 1次スクリ一ニングした後、 残りのマーカー 解析を行った。 ピューロマイシン耐性 5 70株のうち 6株 （DT 40 (― 1 4) 1— 2 由来 5クローン、 DT40 (- 14) 2— 4由来 1クローン） において予想される増幅 結果が得られた。
(1—4) サザンプロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリ一二ングとしてサザンブロッ ト解析を行った。 相同組換えの標的配列内にプローブを設定した.（図 4)。 プローブは以下に示すオリゴヌ クレオチドプライマ一対を用い、 ヒ ト 1 4番染色体を保持する A 9 c l l - 14 c h r 細胞ゲノム DNAを铸型として PCRにより増幅、 単離、 精製した ：
AL39 15138F： 5' - TGGCTTGGCATACATTTTGA (配列番号 1 7 )
AL39 15738R： 5' - AGGGAGTTCCTCACACAGGA (配列番号 1 8 )
1次スクリーニングで得た 6株から抽出したゲノム DN A約 5 μ gを制限酵素 S p h
I (ロシュ） により消ィ匕し、 Ausubel ら (Current Protocol s in Mo'lecu丄 ar Biology, john Wiley & Sons, Inc. , 1994) に記された方法でサザンブロッ ト解析を行った。 32Pによ り標識したプローブがハイブリダィズしたシグナルを、 イメージアナライザー T y p h o o n 9 2 1 0 (モレキュラーダイナミクス） により検出した。 代表的な結果を図 5に 示す。 塩基配列から予想される制限酵素断片長は相同組換え体で 1 0. 4 k b、 野生型
(非組換え体） で 1 1. l k bであり、 候補 6株から合計 6株の相同組換え体を確認し た。 '
(1— 5) 蛍光 i n s i t uハイブリダィゼ一シヨン （F I SH) 解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 9 94) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） 及び F I TC標識した PGK — p u r o断片 （p TE L p u r oベクターより切出して調製） をプローブに用いて行 つた。 その結果、 観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒ ト 14番染色体及び C o t 1で染まった短縮したヒ ト 1 4番染色体長腕端に 2個の F I TCシグナルが検出さ れた。 代表的な F I SH像を図 6 a及び bに示す。 図 6 aにおいて白矢印はテロメアト ランケーションを行う前の全長のヒ ト 1 4番染色体を、 図 6 bにおいて白矢印は長腕遠 位を削除したヒ ト 14番染色体断片を示している。 宿主である DT 40細胞の染色体と の相対的な大きさから、 ヒ ト 14番染色体が短縮したことを確認した。
以上より、 得られたピューロマイシン耐性の 6株 （ 1 2 t 9 7、 1 2 t l 34、 1 2 t l 5 9、 1 2 t 20 1 , 1 2 t 225 , 及び 24 t 8) がヒ ト 14番染色体を長腕削 除により短縮した、 テロメァ配列を末端に持つ人工染色体 （ 1 4AA qHAC) を保持 することを確認した。
(2) 1 4 A Δ q HAC長腕近位へのクローユング部位の導入 (2- 1) 1 o x P及び 3 ' n e o配列揷入用 t 1 p S F 1ベクターの構築 実施例 （1— 1) で作製したヒ ト人工染色体 （HAC) に 1 o X P及び 3' n e o配 列を挿入するための基本プラスミ ドには、 p S F l (ライフテック） を用いた。 l o x P及び 3 ' n e o挿入部位であるヒ ト 14番染色体長腕近位の塩基配列は G e n B a n kデータベースより得た （登録番号 A L 39 1 1 56)。 相同組換えの 2つの標的配列増 幅に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
49050F21ongSalI： 5'- GACAGTGTCGACAGTGAGAC.TTGTAGGCTACAAGAAAAGG (配列番号 1 9) 53978Rlong2SalI： 5'- GACAGTGTCGACTCTGATAATGCGGAATGAGTAGGGAGGC (配列番号 20) 54023Flong2FseI： 5' - GATGGCCGGCCTGGTTGGTAAAGATTGCTACACTTACGGCA (配列番号 2 1 ) 56084RlongPacI ： 5'- CTTAATTAACAAGAGCTCTACAACTGTCCATCGAAAC (配列番号 22) ヒ ト 1 4番染色体を保持する A 9 c l l - 14 c h r細胞から抽出したゲノム D N A を铸型として 2つの標的配列を PCRにより増幅した。 約 5 k bの DNA断片制限酵素 S a i l (ロシュ） で、 約 2 k bの DN A断片を F s e I及び P a c I (ロシュ） で消 化し、 突出末端をもつ DNA断片をそれぞれァガロースゲル電気泳動により分離し、 精 製した。 これらを p S F l③プラスミ ドの S a 1 Iないし F s e I— P a c Iサイ トに クローユングした。 pSFl③ベクタ一は、 pSFlプラスミ ドの Xholサイ トに、 相同組換え 体の選別に用いるブラス トサイジン耐性遺伝子を、 p CMV/B s d (インビトロジェ ン） より制限酵素 Xh o l (ロシュ） 及び S a i l (ロシュ） 消化により約 1. 3 k b の断片として切り出し 3' neo配列と逆の転写方向に導入しさらに上記のブラストサイジ ン耐性遺伝子導入 p S F lコンス トラク トを Apal (ロシュ） 消化後平滑末端化した部位 へ SNESPF リンカ一（Sall-Nhel- EcoRV-Srfl - Pacl- Fsel)を導入して構築した。 以下に SNESPFリンカーの DN A配列を示す。
SNESPF1 inker S GTCGACGCTAGCGATATCGCCCGGGCTTAATTAAGGCCGGCC (配列番号 1 78)
SNESPF1 inker AS GGCCGGCCTTAATTAAGCCCGGGCGATATCGCTAGCGTAGAC (配列番号 1 7 9) 最終的なコンストラク トのサイズは約 1 3.4 k bである。タ一ゲティングベクター、 標的配列、 及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図 7〜 9に示した。 なお、 この ようにして得られたコンス トラク トを t l p S F lベクターという。
(2 - 2) 14 A Δ q HAC保持 DT 40細胞への t 1 p S F 1ベクタ一導入 t I p S F lコンス トラク トを制限酵素 S r f I (ロシュ） 消化により線状化し、 長 腕遠位を削除した 1 4 ΑΔ q HACを保持する DT 40雑種細胞に導入した。 1 X 1 07 個の 1 2 t 9 7又は 1 2 t 1 34細胞を 0. 5 m 1の R P M I培地に懸濁し、 30 /z g DNA存在下で室温 1 0分間静置した後、 ジーンパルサー I I (バイオラッド） を用い てエレク ト口ポレーシヨンを行った。 容量 2.5 μ Fのコンデンサに 5 50 Vで印加、 電 極間距離 4 mmのエレク トロポレーシヨンセルを用いて放電した。 室温 1 0分間静置し た後、 エレク ト口ポレーシヨンした細胞を、 1 0%FB S、 l %C h S、 0. 1 mM 2 — MEを含む RPM I 1 640培養液に懸濁し、 96穴プレート （ファルコン） 2.0枚 に播種した。 2 4時間後に終濃度 8 μ g /m 1 となるよ うブラス トサイ ジン
(Blasticidin S Hydrochloride, フナコシ) を加え、 2 3週間後には耐性コロニーが 出現した。 1 2 t 9 7では、 2回のトランスフエクシヨンから合計 5 6の薬剤耐性コロ を、 また 1 2 t 1 34では 1回のトランスフエクションから合計 43個の薬剤耐性 コロニーを単離して増殖させ、 以後の解析を行った。
(2-3) PCR解析
ブラス トサイジン耐性株のゲノム DN Aを铸型として 5 ' 及び 3 ' 側の 2標的配列の 存在を PC R法により検出した。 2つの標的配列 （図 7中、 それぞれ S a 1 I - S a 1 I配列及び P a c I -F s e I配列で示す） に対し、 これらを夾んで染色体上とターゲ ティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマ一対を設計した。 その位置 は図 8中に矢印で示した。 その配列を以下に示す：
AL39 48691F： 5' - GCAGTGACAGAAGTCCATGTTGAACTGTAC (配列番号 2 3 )
ApallongFwl： 5' - CACAGCAACCACAGTGCTTCTTGATGAG (配列番号 24)
ApallongRvl： 5' - TCCAGAAGTGTTGGTAAACAGCCCACAA (配列番号 25)
AL39 56194R： 5' - TAGTCTCTCTGGATGAATATCAGCAAAACT (配列番号 26)
T a qポリメラ一ゼは LA T a q (宝酒造）を用レ、、反応条件は以下のとおり行った。 . 5 ' g e n ome解析； 94 °C 1分の後、 変性 9 8 °C 5秒、 ァ リング 伸長 7 2 °C 1 0分を 3サイクル、変性 98 °C 5秒、ァ リング 伸長 70°C 1 0分を 2サイクル、 変性 98°C5秒、ァ リング /伸長 68°C 1 0分を 25サイクル、伸長 72 °C 1 0分。 3 ' g e n ome解析； 94°C 1分の後、 変性 98°C5秒、 ァニ一リング 伸長 7 2 °C 6分を 3サイクル、 変性 98 °C 5秒、 アニーリング/伸長 70°C 6分を 2サイクル、 変 性 98°C5秒、 アニーリング/伸長 6 8 °C 6分を 30サイクル、 伸長 7 2 °C 1 0分。 P CR反応液には Mg S04 (終濃度 0. 5mM) で添加した。
得られたブラストサイジン耐性 DT 40細胞 9 9株のうち 1 2株が、 塩基配列から予 想されるサイズ （5 ' g e n ome約 5 k b及び 3 ' g e n ome約 2 k b) の増幅産 物を与えることを確認した。 (2-4) サザンブロッ ト解析
相同組換え体を選別するためのスクリーユングとしてサザンブロッ ト解析を行った。 相同組換えの標的配列の外側に N 5 ' ( i ) 及び N 3 ' ( i i ) の 2種類のプローブを設 定した （図 9)。 プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマ一対を用い、 ヒ ト 1 4番染色体を保持する A9 c 1 1 1 4 c h r細胞のゲノム DNAを铸型として PCR により増幅し、 単離、 精製した。
AL39 46181F： 5' - AAGACACCAGGGAGTAACCT (配列番号 2 7)
AL39 46778R： 5' - GCTGAACCACTAAGGGTGAC (配列番号 2 8 )
AL39 56451F： 5' - GGAATAGGGATTAGGAAATG (配列番号 2 9)
AL39 57026R： 5' - ACATGAGGTTTATTTGGTGG (配列番号 3 0)
1次スクリーニングで得た 1 2株から抽出したゲノム DN A約 5 μ gを制限酵素 S t u I 、ロシュノ により 、目ィ匕し、 Ausubel ら (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. , 1994) に記された方法でサザンブロッ ト解析を行った。 32P により標識したプローブがハイプリダイズしだシグナルを、 イメージアナライザ一 T y p h o o n 92 1 0 (モレキュラーダイナミクス） により検出した。 代表的な結果を図 1 0に示す。 塩基配列から予想される制限酵素断片長は、 5 ' g e n ome側解析及び 3 ' g e n ome側解析ともに相同組換え体で 24. 6 k b、 野生型 （非組換え体） で 1 8. 2 k bである。 ブラストサイジン耐性候捕 1 2株から合計 7株の相同組換え体を 確認した。
以上の （2— 1) 〜 （2— 4) の実験により、 相同組換えによりクローニング部位 （ 1 o X P配列） が揷入された 1 4 ΑΔ q HACベクターを保持する DT 40雑種細胞 7株
(1 2 t 9 7 S l、 1 2 t 9 7 S 38、 1 2 t l 34 S l、 1 2 t l 34 S 2、 1 2 t 1 34 S 3、 1 2 t l 34 S 5、 及び 1 2 t l 5 9 S l) を取得した。
(3) CHO細胞への 14 A Δ q HACベクター移入
( 3 - 1 ) ミクロセル法による 14 ΑΔ q H ACベクターの CHO細胞への栘入 染色体供与細胞として、 上記実施例 1 (2) で得られた、 長腕遠位を削除してクロ一 ユング部位 （ Ι ο χ Ρ配列） が挿入された 1 4 ΑΔ q HACベクターを保持する DT 4 0雑種細胞 （1 2 t 9 7 S l、 1 2 t 9 7 S 38、 及び 1 2 t 1 34 S 2) を用いた。 染色体受容細胞としてはチヤ'ィニーズハムスター由来細胞株 C.HO— K 1 (登録番号 J CR B 90 1 8) を用いた。
はじめに約 1 09個の DT 40雑種細胞からミクロセルを調製した。 細胞密度が 6 0 〜70%飽和程度まで培養した DT 4 0雑種細胞をコルセミ ド （0. 0 5 /i gZmし インビトロジェン） を含む培養液 （ 1 0%F B S, 1 %C h S, 0. 1 mM 2—メルカ プトエタノール， R PM I 1 6 4 0) 中で 1 3〜 1 8時間培養して微小核を誘導した。 遠心分離により細胞を回収して無血清 DMEMに再懸濁し、 予めポリ L一リジンでコー ティングした 2 5 c m2遠心用フラスコ （ヌンク） 1 2本に藩種した。 3 7°C 1時間静 置し細胞が付着したのち培養液を除去し、 予め保温 （3 7°C) しておいたサイ ト力ラシ ン B (DMEM中に 1 0 μ gZm 1 , シグマ） 溶液を遠心用フラスコに満たし、 遠心容 器にフラスコを挿入し、 34°C、 8， 0 0 0 r p m、 1時間の遠心を行った。 ミクロセ ルを無血清培地 （DMEM) に懸濁して回収し、 ポアサイズ 8 /z m、 5 / m、 3 mの フィルター （ワッ トマン） を装着した SW I NNEX— 2 5 (ミ リポア） を用いて濾過 精製した後、 5 m 1の DMEMに懸濁した。 ミクロセル懸濁液を室温， 1 5 0 0 r p m, 5分間遠心し、 これに DMEMで 2回洗浄後 5m 1の DMEMに懸濁した約 1 07個の CHO— K 1細胞を重層後、 室温， 1 5.00 r pm, 5分間遠心し上清を取り除いた。 4 5%ポリエチレングリコーノレ 1 5 0 0 (P EG 1 5 0 0、 ロシュ） 1 0%DMS O (シ ダマ） を含む DMEM溶液で 1 2 0秒間融合処理した。 1 2 0 m 1の 1 0 %F B Sを含 む F 1 2培地 （インビトロジヱン） に懸濁し、 4 8穴プレート （ファルコン） 5枚に播 種し、 24〜3 6時間後にブラストサイジン （8 μ g/m 1 ) を含む選択培地 （1 0% F B S, F 1 2) で培養した。 約 2週間の選択培養の後、 出現した薬剤耐性のコロニー を単離し、 以後の解析を行った。 6回の微小核細胞融合から計 2 8株 （1 2 t 9 7 S 1 由来 9株、 1 2 t 9 7 S 3 8由来 1 0株、 1 2 t l 3 4 S 2由来 9株） のブラストサイ ジン耐性 CHO株を得た。
(3 - 2) PCR解析
ブラス トサイジン耐性株のゲノム DNAを铸型として 5 ' 及び 3 ' 側の 2標的配列の 存在を P C R法により検出した。 方法は、 上記実施例 1 (2— 3) に従って行った。 得 られたブラストサイジン耐性 CHO細胞 2 2株のうち 20株が、 塩基配列から予想され るサイズ （5 ' g e n o m e約 5 k b及び 3 ' g e n om e約 2 k b) の増幅産物を与 えることを確認した。
(3 - 3) サザンプロッ ト解析
移入した 1 4 ΑΔ q HACベクターの構造を確認するためサザンブロッ ト解析を実施 例 1 (2— 4) と间様に行った。 代表的な結果を図 1 1に示す。 塩基配列から予想され る制限酵素断片長は、 5 ' g e n om e側解析及び 3 ' g e n o m e側解析ともに相同 組換え体で 24. 6 k b、 野生型 （非組換え体） で 1 8. 2 k bである。 ブラス トサイ ジン耐性候補 20株から合計 1 9株 （1 2 t 9 7 S l由来 6株、 1 2 t 9 7 S 38由来 8株、 1 2 t 1 34 S 2由来 5株） の相同組換え体を確認した。
(3-4) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 9 94) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 ブラストサイジン耐性 CHO株のうち 1 7株について解析した結果、 計 8株 （1 2 t 9 7 S 1由来 1株； _ 1、 1 2 t 9 7 S 38由来 4株； _ 3、 — 6、 — 8、 一 9、 1 2 t 1 34 S 2由来 3株； 一 3、 一 5、 一 6) 、正常核型かつ観察した分裂像のほとんど において C o t 1で染まった 1コピーの 14 ΑΔ q HACベクターが検出された。 代表 的な F I SH像及び 14 ΑΔ q H ACベクターの核型をそれぞれ図 1 2 A及び Bに示す。 以上 （3— 1) から （3— 4) の実験から、 得られたブラス トサイジン耐性 CHO株 8株が 14 A Δ q HACベクターを保持することを確認した。 実施例 2
14 ΑΔ q HACベクタ一の CHO細胞での長期安定性解析
(1) 非選択培養条件下での長期継代培養
14 ΑΔ q HACベクターの CHO細胞における安定性を確認するために、 非選択条 件下で長期継代培養を行った。 実施例 1に記載した CHO細胞株 3株 （1 2 t 9 7 S 3 8- 6, -8, — 9、 以後 1 2 t 7 Sを略して t 7 S 38— 6, — 8, — 9と表記する） を使用した。 非選択培養液は 1 0%FB Sを含む F 1 2培地であり、 選択培養液はこれ にブラストサイジン 8 μ g/m 1を添加した。 CHO細胞株は 5. 0 X 1 05細胞を 1 0 cm径ディッシュに播種し、 細胞密度が 80〜90%飽和程度まで培養した細胞を計数 して再び 5. 0 X 1 05細胞を 1 0 c m径ディッシュに播種し、 1 0継代まで行った。 継 代毎に細胞数を計数して集団倍加数.を算出した。 じ？10細胞株は1 0継代後にそれぞれ 細胞を回収し F I SH用染色体標本を作製した。
(2) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら. (F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 9 94) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 細胞集団倍加数及び HAC保持率は 2連で行った結果の平均値を算出した。 その結果を 表 1及び図 1 3に示す。 表 1 ： AA HACべクターの CH0細胞における安定性
Figure imgf000077_0001
図 1 3において、 「2 1 A qHAC」 はヒ ト 2 1番染色体由来の H A Cベクター （WO 2004/03 1 38 5号パンフレツト） を、 「 14AA qHAC」 は実施例 1及び 2で 作製した HACベクターを、 「14NA qHAC (G)」 は実施例 6及び 7において作製 した HACベクタ一を、 「14 g NA qHAC (g)」 は実施例 1 2及び 1 3において作 製した H ACベクタ一の結果を示す。
14 ΑΔ qHACベクターは、 C H O細胞において長期継代培養後も安定に保持され ていた。 また分裂中期の染色体像を観察したところ、 細胞あたり 1ないし 2個のシグナ ルが検出された。
以上の （ 1) 及び （2) の実験により、 14 ΑΔ q HACベクターは、 CHO細胞に おいて非選択培養条件で安定に保持されること、 また細胞あたりのコピー数は維持され ていることが明らかとなった。 実施例 3
hE PO- 14AA q H A Cベクタ一の C H O雑種細胞での h E P O遺伝子発現解析 (1) hE PO— 1 4 ΑΔ qHACベクタ一の構築
(1— 1) 1 4 ΑΔ qHACベクターへの hE PO遺伝子の導入
実施例 1で構築した 14ΑΔ qHACベクタ一^ · h E P O遺伝子発現ュニットを揷入 する。 具体的には、 1 o X P配列を含む h E PO発現プラスミ ドを準備し、 C r e組換 え酵素を一過性に発現させることで 1 o X P配列間の部位特異的組換え反応により人工 染色体に挿入する。 組換え揷入体の選別は、 G4 1 8耐性の獲得 （プロモーター分断型 の n e o耐性遺伝子発現ュニッ トの再構成） を指標とした。 概略を図 1 4に示す。 実施例 1で作製した 1 4 ΑΔ qHACベクターを保持する CHO雑種細胞 （ t 7 S 1
— 1、 t 7 S 38 _6、 t 7 S 38— 8) をトリプシン処理し、 5 X 1 06細胞を 0. 8 m 1のハンクス平衡塩溶液 （HB S S) に懸濁した。 1 o X P配列を含む h E PO発現 プラスミ ド p LN l— EPO (Kakeda ら、 Gene Therapy; 12: 852— 856， 2005年） 1 0 μ gと C r e酵素発現ベクター p B S 1 8 5 (ライフテック） 1 0 μ gの存在下でジー ンパルサー I I (バイオラッド） を用いてエレク ト口ポレーシヨンを行った。 容量 50 0 μ Fのコンデンサに 450 Vで印加し、 電極間距離 4 mmのエレク トロポレーション セルを用いて放電した。 エレク トロポレーションした細胞を 1 0%F B S添加した F 1 2培地 （インビトロジェン製） を含む 48穴組織培養用プラスチックシャーレ （フアル コン） 5枚に播種した。 2日後に 0. 8 g/m lのG4 1 8 (GENETICIN、 インビトロジ ェン） を含む培地と置き換えた。 2〜 3週間後には 4 1 8耐性コロニーが出現し、 計 1 1 3個 （ t 7 S 1— 1由来 6個、 t 7 S 38— 6由来 70個、 t 7 S 38— 8由来 3 7個） のコロニーを単離して増殖させ、 以後の解析を行った。
(1 - 2) P CR解析
hE PO遺伝子発現ュニット組換え挿入体の選別は、 14ΑΔ qH ACベクター上の 1 o X P配列部位に挿入されたか否かを、 1 o X P配列部位を挟むように p LN 1— E POベクター上及び 14 ΑΔ qHACべクター上に設計したプラィマーSVpANp 1 及び Ne o Rp 2によって、 また挿入された h E PO遺伝子を、 プラスミ ドベクター p B S 226上の M 1 3 R V及び N e o R p 2プライマーによって、 P C R增幅により確 認した。 プライマ一配列及び P C Rは Kakedaらの方法 （Kakedaら、 Gen Therapy; 12： 852-856， 2005 年） に従った。 組換え挿入体の場合は、 プライマー S V p A N p 1及び N e o Rp 2により約 1. O k b p、 プライマー M 1 3 R V友び N e o Rp 2により 約 2. 7 k b pの増幅が予想される。 その結果、 上記 （1— 1) で得た G 4 1 8耐性 C HO雑種細胞から計 6 5株 （ t 7 S 1— 1由来 6株、 t 7 S 38— 6由来 3 7株、 t 7 S 3 8— 8由来 22株） において予想される増幅を確認した。 以上より、 上記の G 4 1 8耐性 CHO雑種細胞 6 5株が 1 o X P配列への h E PO遺伝子発現ュニッ ト組換え揷 入体であることを確認した。
(1 - 3) サザンプロッ ト解析
h E PO— 1 4ΑΔ qH ACベクタ一において h E PO発現ュニッ ト構造が正しく保 持されているか否かを調べるために、 サザンブロッ ト解析を行なった。 方法は、 Kakeda ら （Gene Therapy; 12： 852-856, 2005 年） に従った。 代表的な結果を図 1 5に示す。 塩基配列から予想される X b a'l消化による制限酵素断片長は、 h E PO発現ュニット を含む 5. 5 k bである （図 1 5)。 上記 （1— 2) で得た G4 1 8耐性候補 CHO雑種 細胞 64株から合計 33株 （ t 7 S 1— 1由来 4株、 t 7 S 38— 6由来 1 3株、 t 7 S 38— 8由来 1 6株） において予測されるサイズのバンドを確認した。
(2) 14ΑΔ q HACベクタ一 挿入された h E PO遺伝子の発現
h E P O遺伝子の発現を培養上清中に産生される h E P Oタンパク質を酵素結合免疫 吸着検定法 （E L I SA法） により定量した。
上記実施例 3 (1 - 3) において単離した h E PO— 1 4 ΑΔ qHACベクターを保 持する G4 1 8耐性 CHO雑種細胞 33株を、 約 1 05細胞を 1 0%FB S添加した 0. 8mg/m 1の G4 1 8を含む F 1 2培地 2 m 1をいれた 1 2穴組織培養用プラスチッ クシャーレ （ファルコン） に播種した。 コンフレント到達後、 1 0%FB Sを添加した F 1 2培地 2 m 1に置き換え 2日間培養し、 1 0,%F B Sを添加した F 1 2培地 1 m 1 に置き換えさらに 24時間培養した後、 上清を回収及び細胞数を計数した。 hE Pひ E L I SAキッ ト （Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&D システム） により、 培 養上清中の h E POを定量した。 2連で行った実験結果の平均値を図 1 6に示す。
• 以上の結果から、 上記 h E PO— 14 ΑΔ qHACベクターを保持する G4 1 8耐性 CHO雑種細胞 3 3株全てにおいて h E POめ発現を確認した。 また、 その発現量は長 腕削除型 E PO— 2 1 Δ qHACを上回ることを示した。
(3) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 994) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 上記 （1— 3) で得た G 4 1 8耐性 CHO雑種細胞のうち 1 4株について解析した。 そ の結果、 計 9株 （ t 7 S 1 _ 1由来 3株； E 4 E 5 E 6 t 7 S 3 8— 6由来 3株； E 2 5 E 30 E 34 t 7 S 38— 8由来 3株； E 5 E 7 E 2 1 ) において観 察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつ C o t 1で染まった 1コピーの h E PO - 14 ΑΔ q HACベクターを検出した。 代表的な F I S H像と hE PO— 14A厶 q HACベクターの核型をそれぞれ図 1 7 A及び Bに示す。
以上 （1) の実験から、 得られた G 4 1 8耐性 9株は、 h E PO— 14AA qHAC ベクターを保持する正常核型の C HO細胞であることを確認した。 実施例 4
h E PO- 14 ΑΔ q H A Cベクターの C H O雑種細胞での長期安定性解析
(1) 非選択培養条件下での長期継代培養
h E PO— 1 4AA q H A Cベクターの C H O細胞における安定性を確認するために、 非選 条件下及び選択条件下 （対照群） で長期継代培養を行った。 実施例 3で得た CH O雑種細胞 3株 （ t 7 S 38— 6 E 25、 t 7 S 38— 6 E 34、 t 7 S 38-8. E 5) を使用した。 非選択培養液は 1 0%FB Sを含む F 1 2培地であり、 選択培養液はこれ にブラストサイジン 8 μ g/m 1 を添加した。 CHO細胞株は 5. 0 X 1 05細胞を 1 0 c m径ディッシュに播種し、 細胞密度が 80〜90%飽和程度まで培養した細胞を計数 して再び 5. 0 X 1 05細胞を 1 0 c m径ディッシュに播種し、 1 0継代まで行った。 継 代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。 じ110細胞株は1 0継代後にそれぞれ 細胞を回収し、 h E PO遺伝子の発現及び F I SH解析を つた。
(2) 長期継代培養後の h E PO遺伝子の発現 ，
h E PO遺伝子の発現は、 培養上清中に産生される h E POタンパク質を酵素結合免 疫吸着検定法 （E L I SA法） により定量した。 上記 （1) で長期継代培養した h E P 0- 1 4 ΑΔ qH ACベクタ一を保持する CHO雑種細胞 3株について、 実施例 3 (2) の方法に従って行った。 その結果、 上記 h E PO— 1 4 ΑΔ q H ACベクターを保持す る CHO雑種細胞 3株全てにおいて長期継代培養後も h E POの発現を確認した。 2連 で行った実験結果の平均値を図 1 8に示す。 図 1 8に示すクローン 6 E 25、 6 E 34 及び 8 E 5は、 それぞれ t 7 S 38— 6 E 25、 t 7 S 38- 6 E 34及び t 7 S 38 - 8 E 5を表す。 .
(3) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 9 94) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 細胞集団倍加数及び H A C保持率は 2連で行つた結果の平均値を算出した。 上記 3株に ついてその結果を表 2及び図 1 8に示す。 表 2 ： hEPO- 14AAqHACべクターの CH0細胞における安定性
Figure imgf000080_0001
h E P O- 1 4 Α Δ q HACベクターは、 C H O細胞において長期継代培養後も安定 に保持された。 また分裂中期の染色体像を観察したところ、 細胞あたり 1ないし 2個の シグナルを検出した。
以上の （ 1 ) から （3 ) の実験により、 h E P O— 1 4 A Δ q HACベクターは、 長 期継代培養後の CHO細胞において、 非選択培養条件で安定に保持されること、 細胞あ たりのコピー数が維持されること、 h E P O遺伝子の発現が維持されること、 が明らか となった。 実施例 5
h E P O- 1 4 Α Δ g HACベクタ一のヒ ト正常繊維芽細胞での h E P O遺伝子発現 ( 1 ) h E P O— 1 4 Α Δ q HACベクター移入ヒ ト正常繊維芽細胞の作製 ( 1 - 1 ) 微小核融合法による h E P O_ 1 4 A A q HACベクターのヒ ト正常繊維芽 細胞 HF L— 1への移入
染色体供与細胞として、 実施例 3で得られだ h E P O— 1 4 Α Δ q HACベクターを 保持する CHO細胞株のうち、 微小核形成能が高いクローン （ t 7 S 3 8— 6 E 2 5、 t 7 S 3 8 - 6 E 3 4及び t 7 S 3 8— 8 E 5 ) を用いた。 染色体受容細胞としては、 ヒ ト正常繊維芽細胞 HF L— 1 (理化学研究所細胞材料開発室より入手、 登録番号 R C B 0 5 2 1 ) を用いた。 はじめに約 1 07個の t 7 S 3 8 _ 6 E 2 5又は t 7 S 3 8 _ 8 E 5細胞からミクロセルを調製した。 すなわち、 2 5 c m2遠心用フラスコ （ヌンク） 2 4本に細胞密度が 8 0〜 9 0 %飽和程度まで培養した t 7 S 3 8— 6 E 2 5又は t 7 S 3 8— 8 E 5細胞をコルセミ ド （0. 1 μ gZm 1 , インビトロジェン） を含む培養 液 （2 0 %F B S， 0. 8 m g/m 1 G 4 1 8 , F 1 2 ) 中で 3日間培養して微小核を 誘導した。 培地を除いた後、 予め保温 ( 3 7°C). しておいたサイ トカラシン B (DME M中に 1 0/i g/m l , シグマ） 溶液を遠心用フラスコに満たし、 遠心容器に遠心用フ ラスコを揷入し、 3 4°C, 8 , 0 0 0 r p m, 1時間の遠心を行った。 ミクロセルを無 血清培地 （DMEM) に懸濁して回収し、 ポアサイズ 8 / m、 5 μ m、 3 /z mのフィル ター （ワッ トマン） を装着した SW I NNE X— 2 5 (ミ リポア） を用いて濾過精製し た。 精製したミクロセルは 5 0 μ gZm 1のフィ トヘムァグルチニン P (D i f c o ) を含む DMEM 2 m 1に再懸濁した。 H F L— 1細胞を 9 0 %飽和の状態まで培養した 2 5 c m 2培養用フラスコ （ファルコン） 2本に精製した微小核細胞を加え 3 7 °Cにて 1 5分間静置した後、 4 5 %ポリエチレングリコール 1 5 0 0 (P E G 1 5 0 0 , ロシ ュ） 1 0%DMSO (シグマ） を含む DMEM溶液で 1分間かけて融合した。 20%F B Sを含む DMEM培地にて 24時間培養した後、 トリプシン処理により細胞を分散し、 コラーゲン I コート処理した 48穴組織培養用プラスチックプレート （ファルコン） 2 枚に播種した。 1 日後にブラス トサイジン （3 gZm l ) を含む選択培地 （20%F B S、 DMEM) に置き換えた。 約 4週間の選択培養を行った。 出現した薬剤耐性のコ ロニーを単離し、 以後の解析を行った。 28回 （ t 7 S 38— 6 E 25 ； 1 3回、 t 7 S 38-6 E 34 ； 2回、 t 7 S 38— 8 E 5 ； 1 3回） の微小核細胞融合から 1 38 個 （ t 7 S 38— 6 E 2 5由来； 56個、 t 7 S 38— 6 E 34由来； 26個、 t 7 S 38— 8 E 5 ； 56個） の薬剤耐性コロニーを得た。 上記コロニーのうち、 染色体供与 細胞とレて t 7 S 38 _ 6 E 25細胞を用いて得た.細胞を t 25 H細胞と、 細胞を用い て得た細胞を t 5 H細胞と以下称する。
(1 - 2) PCR解析
. hE PO— 14 ΑΔ qHACベクターを保持するか否かを実施例 3 (1— 2) のプラ イマ一 S V p AN p 1及び N e o R p 2を用いて、ヒ ト染色体を S T Sマーカー D 2 S 1 334のプライマーを用いて Kakedaらの方法（Kakedaら、 Gene Therapy; 12： 852—856， 2005年） に従い PCR増幅により確認した。 また、 染色体供与 CHO細胞の混入の有無 を CHO f u r i n遺伝子特異的プライマ一 f u r i n 3 ' s u b F及び f u r i n E X 6 - 28 Rを用いて P CR増幅により確認した。 設計したプライマー配列を以下に示 す：
furinS' subF： 5' - ACTCAGAGATCCACTGCACCAGGATCCAAGGGAGG (配列番号 3 1) furinEx6-28R_short CTACACCACAGACACCATTGTTGGCTACTGCTGCC (配列番号 32) . 反応条件は、 94 °C 5分の後、 変性 94 °C 20秒、 アニーリング 伸長 68 °C 3分間 を 32サイクル行った。 hE PO— 14ΑΔ q H A Cベクタ一を保持する H F L_ 1細 胞で染色体供与 CHO細胞の混入が無い場合に、 プライマー SVpANp 1及び N e o R p 2により約 1. 0 k b pの増幅、 D 2 S 1 3 34プライマ一により約 0. 6 k b p の増幅、 f u r i n 3， s u b F及び f u r i n E x 6— 2 8 Rによる増幅なし、 が予 想される。 その結果、 上記 （ 1— 1) で得こブラス トサイジンン耐性株 1 38株から計 7株 （ t 5H3、 4、 2 6、 2 7、 28、 29、 t 25 H 2 ) において予想される増幅 が確認された。
以上より、 上記のブラストサイジンン耐性株 6株が h E PO- 1 4 ΑΔ qHACべク ターを保持する HF L— 1細胞であることが確認された。 (1— 3) サザンプロッ ト解析
h E P 0- 1 4 ΑΔ qH ACベクタ一において h E PO発現ュニッ ト構造が正しく保 持されているか否かを調べるために、 上記のブラス トサイジンン耐性株のうち 5株. ( t 5H3、 7、 26、 2 7、 28) についてサザンプロッ ト解析を行なった。方法は、 Kakeda ら （Gene Therapy; 12: 852-856, 2005 年） に従った。 代表的な結果を図 1 9の Aに示 す。 塩基配列から予想される X b a I消化による制限酵素断片長は、 hE PO発現ュニ ットを含む 5. 5 k bである。 その結果、 上記 （ 1— 2) で得た hE PO— 14 A厶 q HACベクターを保持するブラス トサイジンン耐性辟 5株全てにおいて予測されるサイ ズのバンドを確認した。
(1 -4) F I S H解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1994) に記された方 法に従い、ヒ ト 1 4番及び 22番染色体特異的 αサテライ ト DNAプローブ（Q-Biogene、 フナコシ） を用いて行った。 ブラス トサイジン耐性株のうち 3株 （t 5H3、 26、 2 8) について解析した結果、 3株 （ t 5H3、 26、 28) 、 正常核型かつ観察した 分裂像のほとんどにおいて、 宿主細胞由来の 1対のヒ ト 14番及び 2 2番染色体セント ロメァ領域の 4箇所と 1コピーの 14 ΑΔ q HACベクター由来の 1箇所にシグナルが 検出された。 その結果を図 2 OA及び Bに示す。
以上 （1— 1) から （1—4) の実験から、 得られたブラストサイジン耐性株 3株は hE PO— 14ΑΔ q HACベクターを保持する正常核型の HF L— 1細胞であること が確かめられた。
(2) h E PO— 14AA q H A Cベクターを保持する H F L— 1細胞における h E P O遺伝子発現
h E PO遺伝子の発現は、 培養上清中に産生される h E POタンパク質を酵素結合免 疫吸着検定法 （E L I SA法） により定量した。
上記 （1) において単離した hE PO— 14 ΑΔ qHACベクタ一を保持するブラス トサイジン耐性 HF L_ 1細胞 4株について、 それぞれ約 1 05細胞をブラストサイジ ン （3 μ g/m 1 ) を含む選択培地 （20%FB S、 DMEM) 1 m 1 をいれたコラー ゲン I コートした 24穴組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン） に播種した。 コンフレント到達後 7日間培養し、 新しい培地に置き換え更に 24時間培養した後、 上 清を回収及び細胞数を計数した。 hE PO E L I SAキッ ト （Quant ikine IVD Human EP0 I議 unoassay, R&Dシステム） により、 培養上清中の h E P Oを定量した。 その結果を図 2 1の 「1 4A- HACJ の項目に示す。
以上の結果から、 上記 h E PO- 14 ΑΔ qHACベクターを保持する HF L— 1細 胞 3株全てにおいて h E POの発現を確認した。 実施例 6
ヒ ト 14番染色体長腕遠位の削除による 1 4HAC ( 14 ΝΔ q HAC) ベクタ一の構
HACベクターがテ口メァ配列及びヒ ト 1 4番染色体末端の短いサブテロメァ配列 (約 5 k b) を含有するように、 長腕遠位及び近位に 1 o X P配列を相同組換えにより 揷入し、 C r eによる部位特異的組換え反応により 2箇所の 1 o x P配列間の領域を切 出し削除して長腕遠位欠失人工染色体 （14ΝΔ qHAC) ベクターを構築する。 (1) 部位特異的組換え反応によるヒ ト 14番染色体長腕削除
(1一 1) ヒ ト 14番染色体長腕遠位テロメァ側 1 o X P配列揷入用べクタ一 p 1 o X p P GK— 14 q t e 1の構築
1 o X P配列挿入用べクタ一 （ターゲティングベクター） には、 p l o x Pu p B S D (WO 00/ 1 0 38 3号） の K p n Iサイ トに K p n I * (サイ トをつぶす配列） -S r f l -P a c l -Pm l I— Kp n l リ.ンカーを挿入した p l o x P u p B SD 一 P GKを用いた。 上記 K p n I * - S r f I— P a c l—Pm l l— Kp n l リンカ 一の塩基配列を以下に示す：
Loxpupbsd kpnl S 5' - AGCCCGGGCTTAATTAACACGTGGGTAC (配列番号 33 )
Loxpupbsd kpnl AS 5' - CCACGTGTTAATTAAGCCCGGGCTGTAC (配列番号 34 )
G e n B a n kデータベースより得たヒ ト 14番染色体長腕遠位の塩基配列 （登録番 号 AB 0 1 943 7) から、 p l o x p PGK— 14 q t e lベクター挿入の 2箇所の 標的配列を設計した。 この T e 1側標的配列 （合計約 9. 5 k b) は、 以下に示すよう に A 9 # 14ゲノムをテンプレートとして 4断片に分けて PC R増幅した後 pUC 1 8上へクローニングし、 制限酵素消化により 5 ' 及び 3 ' 側標的配列断片を切出して作 製した。
断片 （ i ) ; 0 k b _ 2. 9 k b (5 ' 端に S a 1 Iサイ 卜を付加、 3 ' 端には B a m H Iサイ トが内在する） は、 LA— PCRで増幅後、 制限酵素 S a 1 I及び B a mH I で消化し pUC 1 8の S a 1 I一 B amH Iサイ トへ導入した。 これを PC R増幅する ためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す： AB019437 Okb Fw(Sall) ： 5' - GCGTCGACGCAAGCTTAAATAGTGTTGC (配列番号 3 5) AB019437 2.9kb Rv： 5' - GAGCCAACCAAAGTGGAGAA (配列番号 36 )
断片 （ i i ) ; 2. 3 k b— 5. 4 k b ( 5 ' 端に B a mH Iサイ トが、 3 ' 端に A c c Iサイ トが内在する） は、 LA— PC Rで増幅後、 制限酵素 B a mH I及び A c c I で消化し、 p B l u e s c r i p tの B a mH I— A c c Iサイ トへ導入した。 これを PCR増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
AB019437 2.3kb Fw： 5' _ TCACCATGTTGACCAGGCTA (配列番号 3 7)
A1019437 5.4kb Rv： 5' - AGCTCGAGAGGCACTGAATC (配列番号 38)
断片 （ i i i ) ; 4. 5 k b— 6. 7 k b (5 ' '端に Ac c Iサイ トが、 3 ' 端に Kp n Iサイ トが内在する） は、 LA— PCRで増幅後、 制限酵素 Ac c I及び Kp n Iで 消化し上記断片 （ i i ) を含む p B l u e s c r i p tの A c c I— K p n Iサイ 卜へ 導入した。 これを P CR増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に 示す：
AB019437 4.5kb Fw： 5' - AGGGTCTTCAAAATGCCTGA (配列番号 39)
IGHV7-81FW ： 5' - GCCATGTCCTCAGCCTTTAG (配列番号 4 0 )
断片 （ i v) ; 6. 3 k b - 9. 5 k b (5 ' 端に Kp n Iサイ トが内在し、 3 ' 端に E c o R Iサイ トを付加） は、 LA— PCRで増幅後、 制限酵素 Kp n I及び E c o R Iで消化レ上記断片 （ i ) を含む p UC 1 8の Kp n l— E c oR Iへ導入した。 これ を PC R増幅するた のプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
IGHV7-81RV ： 5'- CTGGAGCATCCTCTTCTTGG (配列番号 4 1)
AB019437 9.5kb Rv (EcoRI) ： 5' - CGGAATTCCGGGAGTGGGTGGCATAAAC (配列番号 4 2) 上記の断片 （ i i ) 及び （ i i i ) を含む p B 1 u e s c r i p tを制限酵素 B a m H I及び K p n Iで消化し、 上記の断片 （ i ) 及び （ i v) を含む p UC 1 8の B a m H I— Kp n Iサイ トへ導入し、 T e 1側標的配列 （合計約 9. 5 k b) をクローニン グした。 PCRは、 実施例 1 (1一 1) の方法に従い、 ヒ ト 1 4番染色体を保持するマ ウス A 9雑種細胞 (A9 c l l - 1 4 c h r) のゲノム DNAを铸型とし、 上記のプラ イマ一を用いて、 T a qポリメラ一ゼは LA T a q (宝酒造） を用い、 反応条件は、 9 4°C1分の後、 変性 94°C 30秒、 ァニーリング 6 0 °C 30秒、 伸長 7 2°C3分を 30 サイクル、 伸長 70 °C 1 0分で行つた。
5 ' 領域 （ t e 1側） 4. 4 k bは上記 T e 1側標的配列 （合計約 9. 5 k b ) を含 む p UC 1 8を制限酵素 S p h I消化により線状化し、 Kp n l— S p h l リンカ一付 加後、 制限酵素 Kp η I及び Ap a Iで消化し、 精製して上記 p 1 o x P u p B SD— PGKベクターの K p n I - A p a Iサイ 卜へクロ一ニングした。 Kp n I— S p h I リンカ一の配列を以下に示す：
KS linker S ： 5' -[Phosp]CCCGCATG (配列番号 43)
KS linker AS： 5' -[PhospjCGGGGTAC (配列番号 44)
また、 3 ' 領域 （ c e n側） 4. 0 k bは、 T e l側標的配列 （合計約 9. 5 k b ) を含む pUC 1 8から制限酵素 E c o R I消化し p B l u e s c r i p tの E c o R I サイ トへサブクローニングした後、 制限酵素 H i n d I I Iで消化後平滑末端化し、 更 に制限酵素 B a mH Iで消化し精製して、 上記 5 ' 領域 （ t e 1側） 4. 4 k bを含む p 1 o X P u p B S D— P GKベクターの N h e I— E c o RVサイ トへクローニング した。 最終的な p 1 o x p PGK- 1 4 q t e 1 コンス トラク トのサイズは約 1 5. 7 k bである。 p l o x p PGK— 14 q t e lベクターを図 22に、 標的配列、 及び相 同組換えにより生じる染色体アレルを図 23に示した。
(1— 2) ヒ ト 1 4番染色体保持 DT 40細胞への長腕遠位テロメァ側 1 o x P配列揷 入用ベクター p 1 o X p P GK— 14 q t e 1ベクター導入
実施例 1 (1— 2) の方法に従い、 p 1 o X p PGK- 1 4 q t e l コンス トラク ト を制限酵素 S r f I消化により線状化 DN Aとし、 ヒ ト 14番染色体を保持する D T 4 〇雑種細胞 DT40 (# 14) 2— 4に導入した。 ブラス トサイジン （終濃度 8 u gZ m l ) で選択培養を行い、 2〜 3週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。 2回のトラ ンスフエクションから合計 480個のブラストサイジン耐性コロニーを単離して増殖さ せ以後の解析を行った。
(1 - 3) PCR解析
ブラス トサイジン耐性株のゲノム DN Aを铸型として 5 ' 及び 3 ' 側の 2標的配列の 存在を実施例 6 (1 - 1) の方法に従い、 PCR法により検出した。 2つの標的配列 （図 2 3中、 それぞれ 5 ' g e n ome及び 3 ' g e n o m eで示す） に対し、 これらを夾 んで染色体上とターゲテイングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマ一対 を設計した。 その位置は図 24に矢印で示した。 その配列を以下に示す：
#14qtel 550F： 5'- CATTCATGGTAGTCATTGGTGCTGTTCTCC (配列番号 45)
PGK longRvl : 5'- ACTTCCTGACTAGGGGAGGAGTAGAAGGTG (配列番号 46)
Bsd longRv2： 5' - AGTGGGCAGTTTACCGTAAATACTCCACCC (配列番号 4 7 )
#14qtel 9640R： 5' _ TATGGAAATCTGAGATGTGCCCAGCCTCAG (配列番号 48) 上記ブラストサイジン耐性 480株のうち 3株において 5 ' 及び 3 ' 側の 2標的配列 の存在を確認した。
(1 -4) サザンプロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリ一ニングとしてサザンプロッ ト解析を行った。 相同組換えの 5' 及び 3 ' 側の 2標的配列外側にプロ ブ （ I GH 5 ' 及び I GH 3 ') を設定した （図 23)。 プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用レ、、 ヒ ト 14番染色体を保持する A 9 c l l - 14 c h r細胞ゲノム DN Aを铸型として P CRにより増幅、 単離、 精製した ：
-14qtel 5'probelFw： 5， - GTGGGTCCTGAGGAGAACAA (配列番号 4 9)
-14qtel 5'probelRv： 5' - TTCTTCTCACCTCCATTGGC (配列番号 50)
-14qtel 3'probelFw： 5' - CCTAAAGCACATACAGCAGC (配列番号 5 1)
-14qtel 3' probelRv： 5' - TCTCCAGGGGAAATCCAATC (配列番号 5 2 )
1次スクリーニングで得た 3株から抽出したゲノム DNA約 5 μ gを制限酵素 B s t E I I (5 ' 側） 又は B a mH I ( 3 ' 側） により （ロシュ） により消化し、 Ausubel b (し urrent Protocols in Molecular Biology, John Wi丄 ey'& Sons, Inc. , 1994) (こ e された方法でサザンブロッ ト解析を行った。 標識したプローブがハイブリダィズしたシ グナルを、 イメージアナライザー Ty p h o o n 92 1 0 (モレキュラーダイナミクス） により検出した。 代表的な結果を図 2 5に示す。 塩基配列から予想される制限酵素断片 長は、 5 ' 側標的配列では相同組換え体で 14. 0 k b、 野生型 （非組換え体） で 1 0. 6 k bであり、 3 ' 側標的配列では相同組換え体で 7. 4 k b、 野生型 （非組換え体） で 9. 0 k bであり、 候補 3株から合計 2株 （24G 8、 24 G 94) の相同組換え体 を確認した。
(2) ヒ ト 14番染色体長腕近位セントロメァ側への 1 o X P配列挿入
(2— 1) ヒ ト 14番染色体長腕近位セントロメァ側 1 o X P配列揷入用べクタ一 p 1
0 X PHYGOR/n 1の構築
1 o X P配列揷入用ベクター （ターゲティングベクタ一） には、 p l o x P d own PURO (WO 00Z10383号） の F s e lサイ トに F s e l * (サイ トをつぶす ような配列） 一 Pm l I—P a c I _S r f I _F s e I リンカーを挿入した p 1 o x P d own PURO— HYGを用いた。 上記 F s e l *— Pm l l—P a c l— S r f
1—F s e I リンカ一の塩基配列を以下に示す：
Loxpdownhyg fsel S： 5' -CCCACGTGTTAATTAAGCCCGGGCATCCGG (配列番号 53 ) Loxpdownhyg fsel AS： 5' -ATGCCCGGGCTTAATTAACACGTGGGCCGG (配列番号 54 ) G e n B a n kデータベースより得たヒ ト 14番染色体長腕遠位の塩基配列 （登録番 号 AL 39 1 1 56) から、 p l o x PHYGOR/n 1ベクター挿入用の 2箇所の標 的配列を設計した。 これを PC R増幅するための、 制限酵素認識配列を付加したプライ マーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
5， 側標的配列用 ：
49050F21ongSalI： 5'- GACAGTGTCGACAGTGAGACTTGTAGGCTACAAGAAAAGG (配列番号 5 5) 53978R21ong2SalI： 5' - GACAGTGTCGACTCTGATAATGCGGAATGAGTAGGGAGGC (酉己歹 IJ番号 5 6 ) 3 ' 側標的配列用 ：
54023FlongFseI： 5' - AGGCCGGCCGTTGGTAAAGATTGCTACACTTACGGCA (配列番号 5 7 ) 56084RlongPacI： 5' - CTTAATTAACAAGAGCTCTACAACTGTCCATCGAAAC (配列番号 58 ) 実施例 1 (1一 1) の方法に従い、 ヒ ト 14番染色体を保持するマウス A 9雑種細胞 (A9 c l l - 1 4 c h r) のゲノム DN Aを铸型とし、 上記のプライマーを用いて 5 ' 及び 3 ' 側の 2つの組換え標的配列を PCR法により増幅した。 T a qポリメラーゼは L A T a q (宝酒造） を用いた。 5 ' 側標的配列用の反応条件は、 94°Cl分の後、 変 性 98°C5秒、 アニーリング/伸長 72 °C1 0分を 3サイクル、 変性 98 °C 5秒、 ァニ —リング Z伸長 70°C 1 0分を 2サイクル、変性 9 8 °C 5秒、ァニ一リングノ伸長 68 °C 1 0分を 30サイクル、 伸長 70°C1 0分で行った。 また、 3 ' 側標的配列用の反応条 件は、 94°C1分の後、変性 98°C5秒、ァニーリング /伸長 7 2°C6分を 3サイクル、 変性 98 °C 5秒、 アニーリング/伸長 70°C 6分を 2サイクル、 変性 98 °C 5秒、 ァニ 一リング/伸長 68 °C 6分を 30サイクル、 伸長 70 °C 1 0分で行った。 3 ' 側標的配 列用 2. 0 k bの增幅産物は、 F s e I及び P a c I消化し p 1 o x P d own PUR O— HYGベクターの F s e l— P a c lサイ トへクローニングした。 また、 5 ' 側標 的配列 5. O k bの増幅産物は、 制限酵素 S a 1 Iで消化し、 上記の 2. 0Kbの標的 配列を持つ p 1 o x P d own PURO— HYGベクターの S a 1 Iサイ トへクローニ ングした。 最終的な p 1 o X PHYGOR/n 1ユンストラク トのサイズは約 1 6. 1 k bである。 p 1 o X PHYGOR/n 1ベクターを図 26に、 標的配列、 及び相同組 換えにより生じる染色体アレルを図 2 7に示した。
(2- 2) p 1 o X p P GK- 14 q t e 1を導入したヒ ト 14番染色体保持 DT 40 細胞への長腕近位セントロメァ側 1 o X P配列挿入用べクタ一 p 1 o X PHYGOR/ n 1ベクタ一導人 実； ίί例 1 (1— 2) の方法に従い、 ρ 1 ο X PHYGORZn 1コンストラク トを制 限酵素 S r f I消化により線状化 DNAとし、 実施例 7 (1 -4) で作製した p i o x p PGK- 14 q t e 1 を導入したヒ ト 14番染色体を保持する D T 40雑種細胞 24 G 8及び 24 G 94に導入した。 ピューロマイシン （終濃度 0. 3 u g m I ) で選択 培養を行い、 2〜 3週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。 6回のトランスフエクシ ヨンから合計 2 30個 （24G 8由来 50個、 24 G 94由来 1 80個） のピューロマ イシン耐性コロニーを単離して増殖させ以後の解析を行った。
(2- 3) PCR解析
ピューロマイシン耐性株のゲノム DN Aを铸型として 5 ' 及び 3 ' 側の 2標的配列の 存在を実施例 6 (2— 1) の方法に従い、 PCR法により検出した。 2つの標的配列 （図 2 7中、 それぞれ 5 ' g e n ome及び 3' g e n o m eで示す） に対し、 これらを夾 んで染色体上とターゲテイングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマ一対 を設計した。 その位置は図 28中に矢印で示した。 その配列を以下に示す：
AL39 48691F： 5'- GCAGTGACAGAAGTCCATGTTGAACTGTAC (配列番号 5 9)
Puro275R： 5' - GACGTGCTACTTCCATTTGTCACGTCCT (配列番号 60)
HygpAFl ： 5' - CGTCTGTGGCTGCCAAACAC (配列番号 6 1)
AL39 56194R： 5' - TAGTCTCTCTGGATGAATATCAGCAAAACT (配列番号 6 2)
上記ブラス トサイジン耐性 2 30株のうち 34株 （24 G 8由来 1 4株、 24 G 94 由来 20株） において 5 ' 及び 3 ' 側の 2標的配列の存在を確認した。
(2-4) サザンブロッ ト解析
相同組換え体を選別するためのスクリ一二ングとしてサザンブロッ ト解析を行った。 相同組換えの 5' 及び 3' 側の 2標的配列外側にプローブ （N 5 ' ( i ) 及び N3 ' ( i )) を設定した （図 2 7)。 プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用レ、、 ヒ ト 1 4番染色体を保持する A 9 c l l— 14 c h r細胞ゲノム D N Aを铸型として P CRにより増幅、 単離、 精製した ：
AL39 46181F： 5' - AAGACACCAGGGAGTAACCT (配列番号 6 3)
AL39 46778R： 5' - GCTGAACCACTAAGGGTGAC (配列番号 64)
AL39 56451F： 5' - GGAATAGGGATTAGGAAATG (配歹リ番号 6 5)
AL39 57026R： 5' - ACATGAGGTTTATTTGGTGG (配列番号 6 6)
1次スクリーユングで得た 34株から抽出したゲノム DN A約 5 β gを制限酵素 S t u I (ロシュ） により消化し、 実施例 6 (1 -4) と同様に行った。 代表的な結果を図 29に示す。 塩基配列から予想される制限酵素断片長は、 5 ' 側標的配列では相同組換 え体で 1 2. 5 k b、 野生型 （非組換え体） で 1 8. 2 k bであり、 3 ' 側標的配列で は相同組換え体で 1 0. 2 k b、 野生型 （非組換え体） で 1 8. 2 k bであり、 候補 3 4株から合計 2 2株 .（24 G 8由来 14株、 24 G 94由来 8株） の相同組換え体を確 認した。 これらのうち、 24 G 8由来のクローン 24 G 8 n 7及び 24 G 94由来のク ローン 24 G 94 n 1 8及び 24 G 94 n 56を次のステップ （3) へ進めた。
(3) C r e - 1 o x P部位特異的組換え反応による長腕遠位の削除
(3 - 1) 長腕遠位及び近位へ 1 o X P配列挿入したヒ ト 1 4番染色体保持 D T 40雑 種細胞への C r e発現ベクターの導入
実施例 1 (1— 2) の方法に従い、 . C r e発現ベクター p CAGGS— C r eを実施 例 6 (2) で取得した 24 G 8 n 7及び 24 G 94 n l 8及び 24G 94 n 56細胞に 導入した。 ハイグロマイシン （終濃度 1. 2 5mgZm l ) で選択培養を行い、 2〜3 週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。
24 G 8 n 7細胞においては、 2回のトランス 7ェクションから合計 54個のハイグ 口マイシン耐性コロニーを単離して増殖させ以後の解析を行った。 24G 94 n l 8及 び 24 G 94 n 5 6細胞においては、 1 0クロ一ンを 1プールにまとめ、 それぞれ 20 プールを増殖させ以後の解析を行った。
(3- 2) PCR解析
ハイグロマイシン耐性株のゲノム DN Aを铸型として 2つめ 1 o X P配列間の欠失を PCR法により確認した。 長腕遠位欠失後に残った 1 o X P配列を夾んで染色体上とタ ーゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマ一対を設計した。 その 位置は図 3 OA中に矢印で示した。 その配列を以下に示す：
B. D PGK Fwl： 5' - GGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTC (配列番号 6 7)
B.D Hyg Rvl： 5' - ATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTG (配列番号 6 8)
T a qポリメラーゼは E x T a q (宝酒造） を用い、 反応条件は、 94°C1分の後、 変性 94 °C 1 5秒、 アニーリング 60 °C 30秒、 伸長 72 °C 1分を 3 5サイクルで行つ た。 L o X P配列間の欠失により長腕遠位が削除された場合、 約 0. 8 k bの増幅が予 測される。 その結果、 上記 24 G 8 n 7細胞由来のハイグロマイシン耐性 54株のうち 1 6株において、 また 24 G 94 n 1 8及び 24 G 94 n 56細胞由来の各 20プール 全てにおいて予測きれる増幅産物を確認した。
(3 - 3) サザンプロッ ト解析 長腕遠位欠失体を構造確認及び選別するためにサザンプロッ ト解析を行った。 長腕遠 位欠失により生じる標的配列、 染色体アレル及びプローブの位置を図 3 OA及び図 30 Bに示した。 相同組換えの 5'及び 3'側の 2標的配列外側にプローブ （I GH5' ( i ) 及び N3' ( i )) を設定した。 '
1次スクリ一ニングで得た 24 G 8 n 7細胞由来の 16株及び 24 G 94 n 18細胞 由来の 20プール及び 24 G 94 n 56細胞由来の 10プールからゲノム D N Aを抽出 し実施例 6 (1—4) と同様に行った。 制限酵素 （ロシュ） 消化は、 B s t E I I (5 ' 側） 又は S t u I (3 ' 側） により行った。 代表的な結果を図 31に示す。 塩基配列か ら予想される制限酵素断片長は、 5' 側標的配列では相伺組換え体で 7. 6 k b、 野生 型 （非組換え体） で 14. O k bであり、 3' 側標的配列では相.同組換え体で 8. 3 k b、 野生型 （非組換え体） で 10. 2 k bである。 その結果、 24G8 n 7細胞由来の 12株及び 24 G 94 n 56細胞由来の 10プールにおいて長腕遠位欠失体を確認した。 (3-4) F I S H解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコ一ル， 秀潤社， 1994) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 Co t 1 (インビトロジェン） 及び実施例 6 (1— 1) で作 製した p l o x p PGK— 14 q t e lベクターから制限酵素 H i n d I Iにより消化、 切出し精製した約 4. 2 k bの 5' 標的配列断片をプローブに用いて行った。 上記 （3 -3) で取得した 24 G 8 n 7細胞由来の 4クローン （GS n T A c ZZc SZd lZ d 4) 及び 24 G 94 n 56細胞由来の 4プール （G94 n 56 A p 2 l/p 25Zp 28/p 30) について解析した結果、 全てにおいて正常核型かつ観察した分裂像のほ とんどにおいて Co t 1で染まった 1コピーのシグナルと短縮された長腕の末端に 2個 のシグナルを検出した。 代表的な F I SH像を図 32 A及び Bに示す。
以上 （3— 1) から （3— 4) の実験から、 得られたハイグロマイシン耐性 DT 40 雑種細胞は、 テロメァを残して長腕遠位を削除したヒ ト 14番染色体断片 （14N厶 q HAC) を保持することを確認した。
(4) 1.4 ΝΔ qH AC長腕近位へのクローユング部位の導入
(4— 1 ) 1 o X P及び 3 ' n e o配列挿入用 p S F (G + n 1 ) ベクターの構築 上記実施例 6 (3) で作製したヒ ト人工染色体 （HAC) に Ι ο χ Ρ及び 3' n e o 配列を挿入するための基本プラスミ ドには、 実施例 1 (2_ 1) で作製した p SF l③ を用いた。 1 o X P及び 3 ' n e o挿入部位である相同組換えの 5 ' 側標的配列は上記 実施例 7 ( 1 - 1 ) で取得した p l o x p PGK_ 14 q t e lベクターで用いた配列 から、 3 '標的配列は G e n B a n kデータベースより得たヒ ト 14番染色体長腕近位 の塩基配列 （登録番号 AL 3 9 1 1 56) から設計した。 これを P C R増幅するための プライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
54023Flong2FseI： 5' - GATGGCCGGCCTGGTTGGTAAAGATTGCTACACTTACGGCA (配列番号 6 9) 58830RlongSrfI： 5' - GATGCCCGGGCCAATAGCCAGTCAATCGAGAAACCAAGCCC (配列番号 70) 5 ' 側標的配列は、 p l o x p PGK_ 1 4 q t e lべクターから X b a I及び S n a B I (ロシュ） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動により分離し精製後、 p S F l③ プラスミ ドの Nh e I— S a 1 I Iサイ トにクローニングした。また 3 '側標的配列は、 ヒ ト 1 4番染色体を保持する A 9 c 1 1 - 14 c.h r細胞から抽出したゲノム D N Aを 铸型として P CRにより増幅した。 この約 5. 0 k bの DNA断片を制限酵素 F s e I
(ロシュ） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動により分離し精製後、 上記 5' .標的配列 を挿入した p S F 1③プラスミ ドの F s e Iサイ トにクロ一ニングした。 最終的な p S F 1 (G+ n 1 ) コンス トラク トのサイズは約 1 5. O k bある。 ターゲティングべク ターを図 3 3に、 標的配列、 及び相同組換え より生じる染色体アレルを図 34 Aに示 した。 -
(4- 2) 14ΝΔ qHAC保持 DT40細胞への p S F (G + n 1 ) ベクター導入 p S F (G+n l) コンス トラク トを制限酵素 S r f I (ロシュ） 消化により線状化 し、 長腕遠位を削除した 1 4ΝΔ qHACを保持する DT 40雑種細胞 6種 （G 94 n 56 Δ ρ 2 1 p 25Zp 28Zp 30、G 8 n 7 A c 2/c 5)にそれぞれ導入した。 方法は、 実施例 1 (2— 2) に従って行った。 2〜3週間後にはブラス トサイジン耐性 コロニーが出現した。 G 94 n 56 A p 2 l/p 25Zp 28/p 30では、 各 2回の トランスフエクシヨンから合計 32 1個 （それぞれ 1 1 7/1 53 46 7個） の薬 剤耐性コロニーを、 また G 8 n 7 Δ c 2/ c 5では各 1回のトランスフエクションから 合計 1 9 1個 （それぞれ 96 9 5個） の薬剤耐性コロニーを単離し、 以後の解析を行 つた。 . '
(4- 3) PCR解析
上記ブラストサイジン耐性株のゲノム DN Aを铸型として 5 ' 及び 3 ' 側の 2標的配 列の存在を PC R法により検出した。 2つの標的配列 （図 34中、 それぞれ 5' g e n o me及び 3 ' g e n omeで示す） に対し、 これらを夾んで染色体上とターゲティン グベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマ一対を設計した。 その位置は図 3 4中に矢印で示した。 その配列を以下に示す： 550F： 5' - CATTCATGGTAGTCATTGGTGCTGTTCTCC (配列番号 7 1)
ApallongFwl： 5' - CACAGCAACCACAGTGCTTCTTGATGAG (配列番号 72)
ApallongRvl ： 5' - TCCAGAAGTGTTGGTAAACAGCCCACAA (配列番号 73)
58950R： 5' - AAGCAGAGCTACCATGCACTGTAGGATAAG (配列番号 74)
T a qポリメラーゼは L A T a q (宝酒造）を用い、 P C R反応液には M g S O 4 (終 濃度 0. 5mM) で添加した。 反応条件は 94 °C 1分の後、 変性 98 °C 5秒、 ァニーリ ング /伸長 72 °C 8分を 3サイクル、 変性 98 °C 5秒、 アニーリ ング Z伸長 70 °C 8分 を 2サイクル、 変性 98 °C 5秒、 アニーリング 伸長 68 °C 8分を 30サイクル、 伸長 72 °C 1 0分で行った。
得られたブラス トサイジン耐性株のうち 1 2株が、 塩基配列から予想されるサイズ (5 ' g e n ome約 4. 5 k b及ぴ 3 ' g e n ome約 5. O k b) の増幅産物を与 えることを確認した （G 94 n 56 A p 2 lZp 2 5/p 28Zp 30由来； 2/1/ 2/2、 計 7株、 G 8 n 7 Δ c 2Z c 5由来； 1/4、 計 5株）。
(4— 4) サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためサザンプロッ ト解析を行った。 プローブは、 相同組換え の標的配列の外側に I GH 5 ' ( i ) (実施例 6 (1 -4)) 及び 3 ' 側の標的配列外側に プローブ N 3' ( i i ) を設定した （図 34)。 N 3 ' ( i i ) プロ一ブは以下に示すオリ ゴヌクレオチドプライマ一対を用い、 ヒ ト 14番染色体を保持する A9 c 1 1— 14 c h r細胞ゲノム DN Aを铸型として PC Rにより増幅、 単離、 精製した：
AL39 60781F： 5， - TCAAGGACTGTGAGCCTCCT (配列番号 75)
AL39 61387R： 5' - TGCACTGAAAGCCAATTGAA (配列番号 76)
1次スクリーニングで得た 1 2株から抽出したゲノム DNA約 5 μ gを制限酵素 B s t E I I (ロシュ) により f冃ィ匕し、 Ausubel り (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. , 1994) に記された方法でサザンブロッ ト解析を行った。 32P により標識したプローブがハイブリダィズしたシグナルを、 イメージアナライザー Ty p h o o n 92 1 0 (モレキュラーダイナミクス） により検出した。 代表的な結果を図 35に示す。 塩基配列から予想される制限酵素断片長は、 5 ' g e n o m e側解析で相 同組換え体 1 9. 8 k b、 野生型 （非組換え体） で 7. 6 k b、 3 ' g e n ome側解 祈で相同組換え体 1 9. 8 k b、 野生型 （非組換え体） で 8. 8 k bである。 ブラスト サイジン耐性候補 1 2株から合計 5株の相同組換え体を確認した。
以上の （4— 1) 〜 （4— 4) の実験により、 相同組換えによりクローユング部位 （ 1 o x P及び 3 ' n e o配列） が揷入された 1 4 N Δ q H A Cベクターを保持する D T 4 0雑種細胞 5株 （G 94 n 56 A p 2 1 S 39、 G 94 n 56 A p 2 5 S 6 1、 G 94 n 56 A p 28 S 7、 8、 G 8 n 7 A c 2 S 202、 G 8 n 7 A c 5 S 90) を取得し た。 このうち、 G 94 n 56厶 p 2 1 S 3 9、 G 94 n 56 A p 25 S 6 1、 G 8 n 7 厶 c 2 S 202, G 8 n 7 A c 5 S 90 (以下 G 4 S 3 9、 G4 S 6 1、 G 8 S 202、 G 8 S 90と略称する） の 4株を次のステップへ進めた。
(5) CHO細胞への 14 N Δ q HACベクター移入
( 5 - 1 ) ミクロセル法による 1 4 N Δ q H ACベクターの CHO細胞への移入 染色体供与細胞として、 上記実施例 6 (4) で得られた、 長腕遠位を削除してクロ一 ユング部位 （ 1 o X P及び 3 ' n e o配列） が揷入された 1 4 N Δ q H A Cベクターを 保持する DT40雑種細胞 （G4 S 39、 G4 S 6 1、 G8 S 202、 G 8 S 90) を それぞれ用いた。 染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株 CHO— K 1 (登録番号 J CRB 90 1 8) を甩いた。 方法は、 実施例 1 (3— 1) に従って行 つた。 約 2週間の選択培養の後、 出現したブヲス トサイジン耐性コロニーを単離し、 以 後の解析を行った。 8回 （G4 S 39 ； 2回、 G4 S 6 1 ； 2回、 G8 S 2ひ 2 ； 2回、. G 8 S 90 ； 2回） の微小核細胞融合から計 92株 （G4 S 6 1由来 1 9株、 G4 S 3 9由来 23株、 G 8 S 90由来 2 2株、 G8 S 202由来 28株） のブラス トサイジン 耐性 CHO株を得た。
(5 - 2) PCR解析
ブラストサイジン耐性株のゲノム DNAを铸型として 5 ' 及び 3 ' 側の 2標的配列の 存在を PC R法により検出した。 方法は、 実施例 6 (4- 3) に従って行った。 また D T 40細胞の混入チェックのためトリ ]3ァクチン検出用プライマーを G e n B a n kデ ータベースより得たトリ ]3ァクチン遺伝子の塩基配列 （登録番号 X00 1 8 2) から設 計した。 これを PCR増幅するためめプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示 す：
Ggbeta- actinl933F： 5' 一 TCCGTTGGAGTTGATCCTTC (配列番号 7 7)
Ggbeta-actin2536R： 5' - ACATGACACAGCAAGGAACG (配列番号 78)
T a qポリメラーゼは E x T a q (宝酒造） を用い、反応条件は、 94 °C 1分の後、 変性 94°C 1 5秒、 ァニーリング 56°C30秒、 伸長 72 °C 30秒を 3 5サイクルで行 つた。 得られたブラス トサイジン耐性 CHO細胞株のうち 6 7株 （G4 S 6 1由来 1 5 株、 G 4 S 39由来 2 3株、 G 8 S 90由来 20株、 G8 S 202由来 9株） において、 塩基配列から予想されるサイズ （ 5 ' g e n ome約 4. 5 k b及び 3 ' g e n o m e 約 5. 0 k b)の増幅産物を与えること及び DT 40細胞の混入が無いことを確認した。
(5- 3) サザンプロッ ト解析
移入した 14ΝΔ qHACベクターの構造を確認するためサザンプロッ ト解析を実施 例 6 (4-4) と同様に行った。 代表的な結果を図 36に示す。 .塩基配列から予想され る制限酵素断片長は、 5' g e n ome側解析で相同組換え体 1 9. 8 k b、 野生型 （非 組換え体） で 7. 6 k b、 3 ' g e n ome側解析で相同組換え体 1 9. 8 k b、 野生 型 （非組換え体） で 8. 8 k bである。 ブラス トサイジン耐性候補 74株 （G4 S 6 1 由来 14株、 G4 S 3 9由来 1 6株、 G 8 S 90由来 20株、 G 8 S 202由来 24株） から合計 5 2株 （G 4 S 6 1由来 14株、 G 4 S 3 9由来 1 6株、 G 8 S 90由来 1.5 株、 G8 S 202由来 7株） の相同組換え体を確認した。
(5— 4) F I S H解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 994) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 ブラストサイジン耐性 CHO株のうち 23株 （G4 S 6 1由来 7株、 G4 S 39由来 1 1株、 G8 S 20 2由来 1株、 G 8 S 90由来 4株） について解析した結果、 計 9株 （G 4 S 6 1— 1、 6、 8、 9、 1 1、 1 2、 G4 S 3 9— 1 3、 G 8 S 90— 2, 4) 力 正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて C o t 1で染まった 1コピーの 1 4 N 厶 q H ACベクターが検出された。 代表的な F I SH像と 1 4ΝΔ qHACベクタ一の 核型をそれぞれ図 3 7 A及び Bに示す。
以上 （5— 1) から （5— 4) の実験から、 得られたブラス トサイジン耐性 CHO株 9株は 1 4ΝΔ qHACベクターを保持することが確かめられた。 実施例 7
( 7 - 1 ) 1 4 N A q HACベクターの CHO雑種細胞での長期安定性解析
(1) 非選択培養条件下での長期継代培養
14 N Δ q HACベクターの CHO雑種細胞における安定性を確認するために、 非選 択条件下で長期継代培養を行った。 実施例 6に記載した 14ΝΔ qHACベクターを保 持する CHO細胞株 2株 （G4 S 39— 1 3、 G4 S 6 1 _ 1) を使用した。 非選択培 養液は 1 0%FB Sを含 F 1 2培地であり、 選択培養液はこれにブラストサイジン 8 μ g/m 1 を添加した。 CHO細胞株は 5. 0 X 1 05細胞を 1 0 c m径ディッシュに播 種し、細胞密度が 80〜90%飽和程度まで培養した細胞を計数して再び 5. 0 X 1 05 細胞を 1 0 cm径ディッシュに播種し、 1 0継代まで行った。 継代毎に細胞数を計数し て集団倍加数を算出した。 CHO細胞株は 1 0継代後にそれぞれ細胞を回収し F I SH 用染色体標本を作製した。
(2) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 9 94) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 細胞集団倍加数及び H AC保持率は 2連で行った結果の平均値を算出した。 上記 2株に ついてその結果を表 3及び図 1 3に示す。 図 1 3,においては、 「 1 4 A qHAC (G)」 の項目に示す。 表 3 ： 14NA HACベクターの CHO細胞における安定性
Figure imgf000096_0001
14 ΝΔ qHACベクタ一は、 CHO細胞において 1 0継代後までの時点で安定に保 持されていた。 また分裂中期の染色体像を観察したところ、 細胞あたり 1ないし 2個の シグナルが検出された。
以上の ( 1 ) 及び （2) の実験により、 14 N Δ q HACベクタ一は、 CHO細胞に おいて非選択培養条件で安定に保持されること、 また細胞あたりのコピー数は維持され ていることが明らかとなった。
(7- 2) E PO導入 1 4 ΑΔ q H A Cベクター保持 C HO細胞移植によるインビボ E PO薬効
実施例 3で作製した、 E PO導入 1 4 ΑΔ q HACベクターを保持する CHO細胞ク ローン t 7 S 38- 8 E 5を免疫細胞遮断カプセルへ封入後、 B細胞欠損により抗体産 生できない I g /x—/—ノックアウトマウス（Tomizuka, K. , et al. , PNAS, 97, 722-727,
2000) 皮下へ移植し、 末梢血中の赤血球数 ·へモグロビン ·へマトク.リ ツ トの値を解析 することにより t 7 S 38— 8 E 5細胞から供給される E P Oのインビボでの薬効評価 を行った。 上記 3つの値が細胞カプセル移植群において対照群と比べ上昇すれば E P O 薬効肴りと判断できる。
5 ? 0導入1 4 Α Δ q HACベクター保持 CHO細胞クローン t 7 S 3 8— 8 E 5を 実施例 3の方法に従って培養し、 1 X 1 06個を免疫細胞遮断カプセル T h e r a C y t e 1 mm u n o 1 s o l a t 1 o n 4 0 μ 1 a e v i c 'e ( 丄' h e r a し y t e I n c . , I r v i n e , C A) へ添付のプロ トコ一ルに従って封入した。 この カプセルを I g μ — /— Jックァゥトマウス左背皮下へアバチン麻酔下で移植し、 移植 後経時的に眼窩採血して末梢血中の赤血球数 ·へモグロビン 'へマトクリ ツ ト値を AD V I A 1 2 0 (バイエルメディカル社） により測定レた。 対照群としてカプセルなしの 手術のみの群を実施した。 その結果を図 8 7に示す。 ' 移植後 2週から細胞カプセル移植群において赤血球数 ·へモグロビン 'へマトクリ ツ ト値が上昇し、 最大 4 4週まで上記の上昇した値が維持された。 以上により、 . E P O— 1 4 AHAC保持 CHO細胞移植による長期のインビボ E P O薬効が示ざれた。
( 7— 3 ) E P O導入 1 4 H ACベクター保持ヒ ト正常線維芽細胞移植によるインビボ E P O薬効
下記実施例 1 9で作製した、 E P O導入 1 4 A A q A n e o HACベクターを保持す るヒ ト正常線維芽細胞 HF L _ 1細胞クローン t Δ 6 3 Hから選択した t Δ 6 3 H 1 5、 または t Δ 6 3 H I 5と同様の方法で作製した HF L— 1細胞クローン t Δ 4 7 H 2 7， 3 0， 3 7を免疫細胞遮断カプセルへ封入後、 B細胞欠損により抗体産生できない I g μ一 ーノックァゥトマウス皮下へ移植し、 末梢血中の赤血球数 ·へモグロビン ·へマ トク'リ ツ トの値を解析することにより、 上記 H F L— 1クローンから供給される Ε Ρ Ο のインビボでの薬効評価を行った。 上記 3つの値が細胞カプセル移植群において対照群 と比べて上昇すれば Ε Ρ Ο薬効有りと判断できる。
Ε Ρ Ο導入 1 4—HAC保持 HF L— 1細胞クローン t Δ 6 3 Η 1 5、 または t A 4 7 H 2 7 , 3 0 , 3 7を下記実施例 1 9の方法に従って培養,し、 1 0 6個の上記細胞を コラーゲン I ビーズ （KOKE N) とともに免疫細胞遮断カプセル T h e r a C y t e i mm u n o i s o l a t i o n 4 0 1 d e v i c e ( iT h e r a し y t e I n c . , I r v i n e , ' C A) へ添付のプロ トコールに従って封入した。 なお、 細胞 とビーズは準備したカプセルへ 1 m 1 シリンジ （テルモ） にシリコン封入用アダプター を装着してカプセルポート （封入口） へ接続しカプセル内へ入れた。 このカプセルを 6 ゥ工ルプレートにて DMEM— 2 0 % F B S培地を用いて 3 7°C 6. 5 % C O 2で 2 〜 6週間培養後、移植 2 日前および移植当日にヒ ト b F G F ( 0または 1 0 n g /m 1 ) 入り培地に交換して更に培養した。 上記 （7— 2) と同様にして I g μ—/—ノックァ ゥトマウス左背皮下へ移植し、 移植後経時的に眼窩採血して末梢血中の赤血球数 ·へモ グロビン .へマトクリ ット値を AD V I A 1 20 (バイエルメディカル社） により測定 する。
上記のように、 E PO— 14HACを保持するヒ ト正常線維芽細胞移植によって長期 インビボ E PO薬効を確認 '実施することができる。
( 7 - 4 ) 14HACベクターのマウスにおける子孫伝達
14 HACベクターのインビボにおける安定性および子孫伝達を検証するために、 E G F Pを導入した 14 H ACベクターを作製し、 マウス E S細胞へミクロセル法により 移入後、 キメラマウスを作製 ·交配して、 マウス体細胞における HAC保持率を解析し た。
(1) EGF P— 1 4HACベクターの構築
CAGプロモーター支配下に EGF P遺伝子を配置したプラスミ ド p LN 1— I RE S— EGF Pを作製し、 CHO細胞において C r e - 1 o X Pシステムにより 14 A厶 q— HAC及び 14 N Δ q— HACベクター上へ E G F P遺伝子発現ュニットを導入し た。
(1— 1) EGF P発現プラスミ ド p LN 1 I RE S— EGF Pの作製
p LN 1 - I RE S-EGF P作製に先立って、 p LN l _PGK— EGF Pを作製 した。 これは、 2ステップで行った。 まずステップ 1は、 p LN l— E PO (Ka k e d a ら G e n e Th e r a p y ； 1 2 : 8 5 2— 8 56, 2005年） の C MV- 5 ' n e o領域の CM Vプロモーターを P G Kプロモーターに置き換えて作製し たプラスミ ド p LN l—PGKE POを S a 1 I消化後平滑化し、 さらに E c o R I消 化により E PO発現ユニッ トを除去した。 ここへ p EGF P— N l (クロンテック） を A f 1 I I消化後平滑化、 さらに E c o R I消化により調製した EGF P— S v 40 p o 1 y Aュニッ トを導入した。 次のステップ 2は、 ステップ 1を S a 1 I一 B a mH I 消化したところへ、 p CAGGS— C r e (A r a k i ら、 PNAS， 92, 1 6 0— 1 64, 1 99 5) を S a i l— Xb a l消化により調製した C A Gプロモータ 一前半部分と、 p CAGGS— C r eを铸型にして P C R増幅と X b a I— B amH I 消化により調製した C AGプロモータ一後半部分を同時に導入した。 以下に P C Rで用 いたプライマー配列を示す。
pCAGGSCre 2362F： 5' - TTCGGCTTCTGGCGTGTGAC (配列番号 1 52 ) pCAG Rl BamHI : 5' - CGGGATCCCGTGGCGGCGGGTAATTCTTTGCCAAA (配列番号 1 53) 次に、 p LN 1— I RE S— EGF Pを作製しだ。 p LN l (1： 3 15 6 (13 ら06 n e Th e r a p y ； 1 2 : 8 5 2— 8 5 6, 2005年） を E c o R I— N c o I消化し、 CMVプロモーター及び S v 40 p o 1 y Aを除去した。 ここへ、 p L N l— PGK— EGF Pの E c o R I— No t I消化により調製した C A Gプロモータ 一及び EGF Pを含む断片と、 p c DNA3. 0 (インビトロジェン） 由来の I RE S 配列を铸型にして P CR増幅した DNA断片を N o t I - c o I消化により調製した I RE S断片を同時に導入した。 以下に P CRで用いたプライマ一配列を示す。
EGFP-IRESFwl： 5' - AAGCGGCCGCGACTCTAGGGATCCGCCCTCTCCCTCCC (配列番号 1 54) FGFP-IRESRvl： 5' - GACACCATGGTTGTGGCCATATTATCATCGTG (配列番号 1 55)
最終的な p LN 1— I RE S— EGF Pコンス トラク トのサイズは約 5. 7 k bであ る。
(1 - 2) 14 A Δ qHACベクタ一への EGF P遺伝子発現ュニットの導入
1 4 A Δ 91"1八じ及び14ΝΔ q H ACベクターへ EG F P配列を含む EGF P遺伝 子発現ュニットを揷入する。 1 o X P配列を含む EG F P発現プラスミ ド p LN 1— I RE S— EGF Pを準備し、 C r e組換え酵素を一過性に発現させることで 1 o x P配 列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入する。 組換え挿入体の選別は、 G 4 1 8耐性の獲得 （プロモーター分断型の n e o耐性遺伝子発現ュニッ トの再構成） を 指標とした。 14 ΑΔ qHACベクタ を保持する CHO細胞 t 7 S 38一 6及び 1 4 N厶 qHACベクタ一を保持する CHO細胞 G4 S 39— 1 3 (実施例 8 ) を用いて、 実施例 3または 8の方法に従って行った。 2〜 3週間後には G 4 1 8耐性コロニーが出 現し、 計 80個 （l t 7 S 38— 6由来 40個、 G4 S 39— 1 3由来 40個） のコロ 二一を単離して増殖させ、 以後の解析を行った。
(1 - 3) PCR解析
EGF P遺伝子発現ュニット組換え挿入体の選別は、 1 4ΑΔ q— HAC及び 1 4N 厶 q—HACベクター上の 1 o X P配列部位に挿入されたか否かを、 1 o x P配列部位 を挟むように p LN l— I RE S— EGF Pベクター上及び 14 ΑΔ q HAC及び 14 N厶 q— HACベクター上に設計したプライマー EGF P 3 74 Fおよび N e o R p 2によって、 PCR増幅により確認した。 概略を図 88に示した。
EGFP 374F： 5' - GCATCGACTTCAAGGAGGAC (配列番号 1 56)
Neo Rp2： 5' 一 CCTGCAGTTCATTCAGGG (配列番号 1 5 7) 組^え挿入体の場合は、 プライマー EGF P 3 74 Fおよび N e o Rp 2によ り約 1. 2 k b pの増幅が予想される。 その結果、 上記 （ 1— 2) で得た G 4 1 8耐性 CHO雑種細胞から計 80株 （ t 7 S 38— 6由来 40株、 G4 S 3 9— 1 3由来 40 株） において予想される増幅が確認された。 以上より、 上記の G4 1 8耐性 CHO雑種 細胞計 80株が 1 o X P配列への EG F P遺伝子発現ュニッ ト組換え揮入体であること を確認した。
(1—4) サザンブロッ ト解析
EGF P— 1 4 ΑΔ q— HAC及び EG F P— 1 4 N Δ q—H ACベグタ一において EG F P発現ュニッ ト構造が正しく保持されてい,るか否かを調べるために、 サザンプロ ット解析を行なった。 方法は、 Kakeda ら （Gene Therapy; 12： 852-856, 2005年） に従 つた。 プローブは、 EGF Pコード領域の塩基配列 78〜3 9 5番目の 3 1 8 b pを P CR増幅して作製した。 用いたプライマー配列を以下に示す。
EGFP-78F ACGTAAACGGCCACAAGTTC (配列番号 1 58)
EGFP-395R GTCCTCCTTGAAGTCGATGC (配列番号 1 5 9)
塩基配列から予想される E c o R I消化による制限酵素断片長は、 EG F P発現ュニ ッ トを含む 7. 5 k bである。 概略を図 89に示した。
上記 （1一 3) で得た G 4 1 8耐性候補 CHO雑種細胞 80株から合計 70株 （t 7 S 38— 6由来 34株、 G 4 S 39 _ 1 3由来 36株） において予測されるサイズのバ ンドを確認した。
( 1 - 5) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 9 94) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 上記 （1— 4) で得た G 4 1 8耐性 CHO雑種細胞のうち 1 5株 （ t 7 S 38— 6由来 8株、 G4 S 3 9— 1 3由来 7株） について解析した。 その結果、 計 1 1株 （ t 7 S 3 8— 6由来 6株； t 6 EG I _ 2， 6， 9， 1 1 , 24, 30、 G4 S 39— 1 3由 来 5株； G 1 3 EG I— 1， 5， 1 5, 1 7, 20) において、 観察した分裂像のほと んどにおいて正常核型かつ C o t 1で染まった 1コピーの EG F P_ 1 4 ΑΔ q HAC 及び E GF P - 1 4 N Δ q一 HACベクターを検出した。
以上 （1— 1) から （1— 5) の実験から、 得られた G 4 1 8耐性 1 1株は EGF P 一 1 4 ΑΔ q— HACベクターを保持する正常核型の CHO細胞（ t 6 EG I— 2, 6， 9, 1 1, 24, 30) 及び EGF P— 14 ΝΔ q— HACベクターを保持する正常核 型の C HO細胞 （G 1 3 EG I— 1， 5， 1 5， 1 7， 20) であることを確認した。
(2) EGF P — 1 4 A Δ q HAC又は E G F P— 14 N Δ q HACベクター移入マ ウス E S細胞の作製
(2- 1) マウス E S細胞 TT 2 Fへの EGF P — 14HACベクター移入 上記 （ 1 ) で作製した CHOクローシ t 6 EG I— 1 1， t 6 E G I - 24 , G 1 3 EG I— 1 , G 1 3 E G.I - 5 (以下それぞれ t 1 1， t 24 , G 1 , G 5と記す） を HA C ドナー細胞として、 ミクロセル法により （Tomizuka ら， Nature Genetics, 16， 133—143, 1997) EGF P _ 1 4 Α Δ q— H A Cベクタ一又は E G F P — 14ΝΔ q— HACベクターをマウス E S細胞 TT 2 Fへ移入した。 その結果、 1〜 2週間後には G4 1 8耐性コロニーが出現し、計 1 2個のコロニーを単離して増殖させ、 以後の解析を行った。
(2- 2) PCR解析
■ 上記 （7— 4) (1 - 3) の方法により EGF P— 14ΑΔ q HAC及び EGF P_ 1 4ΝΔ qHACベクター移入クローン選別のだめに PCR解析を行った。 その結果、 上 記 （2— 1) で単離した G 4 1 8耐性マウス E S雑種コロニー全てにおいて予想される 増幅が確認された。 以上より、 上記の G 4 1 8耐性マウス E S雑種細胞 1 2株が EG F P - 14 A Δ qHAC及び EGF P— 14ΝΔ q HA Cベクターを保持することを確認 した。
(2- 3) サザンプロット解析
EGF P— 14 ΑΔ q—HAC及び EGF P— 1 4 Ν Δ q _ H A Cベクターにおいて EGF P発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、 上記 （7_ 4) (1 -4) と同様にしてサザンプロット解析を行なった。 その結果、 上記 （2— 2) で得た G4 1 8耐性候補マウス E S雑種細胞 1 2株から合計 1 1株において予測される サイズのバンドを確認した。
(2-4) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコ一ル， 秀潤社， 1 9 94) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 上記 （ 1— 4 ) で得た G 4 1 8耐性マウス E S雑種細胞のうち 8株 （1— t i l , 2 — t i l, 3— t i l， 4— t i l, 3 2 -G 1 , 33 - t 24 , 34 - t 24, 3 5 - t 24 ) について解析した。 その結果、 計 6株において、 観察した分裂 像のほとんどにおいて正常核型かつ C o t 1で染まった 1コピーの EGF P— 14 A厶 q HA C及び EG F P— 14 ΝΔ q— HA Cベクタ一を検出した。
以上 （2— 1) から （2— 4) の実験より、 得られた G 4 1 8耐性マウス E S雑種細 胞 5株 （1— t l l， 2 - t 1 1 , 3 - t 1 1 , 3 3 - t 24 , 34 - t 24) は GF P— 1 4A厶 q— HAC及び E GF P— 14N厶 q _ H A Cベクタ一を保持す る正常核型のマウス E S細胞であることを確認した。
(3) キメラマウスにおける 14 HACベクタ一の保持率
(2) で得られた EG F P— 1 4 HACを保持する G 4 1 8耐性マウス E S雑種細胞 を用レヽて、 、 f om i z u k aら, N a t u r e G e n e t i c s , 1 6, 1 ύ 3— 14 3, 1 99 7) の方法に従って行い、 ，キメラマウスを取得した。 キメラマウ スにおける 14 HACベクター保持を確認するために上記 （7— 4) (2— 2) の 方法 及び下記のプライマーセッ トを用いて P CR解析を行った （概略は図 88)。
① CR383659 CR38— 73435F GCAAAACAATAACTGTTGTT (配列番号 1 60) CR38 74060R CATTTATCTTCTCTGGCTTA (配列番号 1 6 1)
② AL512320 NEK2PFw CAGCCAGTGTTTTCCTGGAT (配列番号 1 6 2) NEK2PRv TCTTTGCTCTTCTGCAACCA (配列番号 1 6 3)
③ AL39 1156-1 AL39— 56451F GGAATAGGGATTAGGAAATG (配列番号 1 64) AL39 57026R ACATGAGGTTTATTTGGTGG (配列番号 1 6 5)
©AL39 1156-2 AL39_46181F AAGACACCAGGGAGTAACCT (配列番号 1 6 6) AL39 46778R GCTGAACCACTAAGGGTGAC (配列番号 1 6 7)
©AL39 5409 AL39_5409F GCATGCCTTCAATGTGTGAC (配列番号 1 68) AL39 5811R CAGCAGAGCCAAGATCCAGT (配列番号 1 6 9)
Tel側
©AB019437-1 IGHV3-79Fw GTGCCCTCTGCTCTCAGACT (配列番号 1 7 Q ) IGHV3 - 79Rv TGAGCTGGGTTTCACAGTTG (配列番号 1 7 1) ② AB019437- 2 IGHV7-81Fw GCCATGTCCTCAGCCTTTAG (配列番号 1 7 2)
IGH7-81Rv CTGGAGCATCCTCTTCTTGG (配列番号 1 73)
③ AB019437-3 IGHVIII-82FW GGTCTTGTCCTTGGCTTTCA (配列番号 1 74)
IGHIII-82RV ATGGAGTCAGAGGGGGAAAC (配列番号 1 75)
©AB019437- 4 AB01 tol.5kbFw GACCATGACCCCACCTCTAA (配列番号 1 76)
AB01 Otol.5kbRv GGTGGGATGGAAGAGTCAGA (配列番号 1 7 7 ) その結果、 得られたキメラマウスにおいて予想される増幅を確認した。 まとめを図 9 0に示す。 以上より、 上記のキメラマウス体細胞において EG F P — 14AA q _H AC及び EGF P— 1 4 Ν Δ q— H A Cベクタ一が保持されていることを確認した。
(4) EGF P— 14ΑΔ q— HAC及び EGF P— 14N厶 q_HACベクターの子 孫伝達 '
上記 （3) で得られたキメラマウス （雌） と C 5 7 B L 6マウス （雄） とを交配し、 . EGF P— 14ΑΔ q HAC及び EGF P— 14ΝΔ q HA Cベクターの子孫伝達を検 証した。 方法は上記 （7— 4) (3) と同様に PC R解析を行い、 H ACの保持を指標に 評価した。 その結果、 EGF P— 14 ΑΔ qHACベクターは、 F 1マウスにおいて 4 6. 6 % (N = 1 33)、 F 2マウスにおいて 36. 9 % (N= 84) で、 EGF P— 1 4 N Δ q HACベクターは、 F 1マウスにおいて 59. 4 % (N= 79) の個体におい てにおいて予想される増幅を確認した。 以上より、 EGF P_ 14 ΑΔ q HAC及び E GF P— 14NA q H A Cベクターの子孫伝達を確認した。
さらに、 上記で得られた EGF P— 14 ΑΔ qHACベクタ一を保持する F 1マウス
(雄） と （雌） とを交配し、 仔マウス尾線維芽細胞を採取培養後、 カルノア固定し、 F I SH解析を松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 994) に記された方法 に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 その結 果、 尾線維芽細胞中に 2コピーの EGF P— 14 ΑΔ q H A Cベクターを保持する個体 を確認した。 実施例 8
hEPO— 14N厶 q H A Cベクターの C H O雑種細胞での h E P O遺伝子発現解析 ( 1 )■ h E P O— 14 N Δ q HACベクタ一の構築
(1— 1) 1 4ΝΔ qHACベクターへの h EPO遺伝子の導入
実施例 6で構築した 14 ΝΔ qHACベクターへ h E PO遺伝子発現ュニットを揷入 する。 1 o X P配列を含む h E PO発現プラスミ ドを準備し、 C r e組換え酵素を一過 性に発現させることで 1 o X P配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に揷入 する。 組換え挿入体の選別は、 G4 1 8耐性の獲得 （プロモーター分断型の n e o耐性 遺伝子発現ユニットの再構成） を指標とした。 実施例 6で作製した 14 ΝΔ qHACベ クタ一を保持する CHO雑種細胞 （G4 S 6 1— 1、 9、 G4 S 39 _ 1 3、 G 8 S 9
0 - 4) を用いて、 実施例 3 (1— 1) と同様にして h E PO遺伝子発現ユニットの揷 入を行った。 2〜 3週間後には G 4 1 8耐性コロニーが出現し、 計 24 6個 （G4 S 6
1— 1由来 6 1個、 G4 S 6 1— 9由来 75個、 G4 S 39— 1 3由来 73個、 G 8 S
90— 4由来 3 7個） のコロニーを単離して増殖させ、 以後の解析を行った。
(1 - 2) PCR解析
h E PO遺伝子発現ユニッ ト組換え挿入体の選別は、 14ΝΔ qHACベクター上の
1 0 X P配列部位に揷入されたか否かを、 1 o X P配列部位を挟むように p LN 1— E POベクタ一上及び 1 4ΝΔ q H ACベクタ一上に設計したプライマー SVp AN p 1 及び N e o R p 2によって、 また挿入された h E P O遺伝子を、 プラスミ ドベクター p B S 2 26上の M 1 3 R V及び N e o R p 2プライマ一によって、 P C R増幅により確 認した。 プライマー配列及び P C Rは Kakedaらの方法 （Kakedaら、 Gene Therapy; 12： 852-856, 2005 年） に従った。 組換え揷入体の場合は、 プライマ一 SVp AN p 1及び N e o R p 2により約 1. O k b p、 プライマー M 1 3 R V及び N e o R p 2により 約 2. 7 k b pの増幅が予想される。 その結果、 上記 （1— 1) で得た G 4 1 8耐性 C HO雑種細胞から計 1 1 6株（G4 S 6 1— 1由来 3 1株、 G4 S 6 1— 9由来 34株、 G4 S 3 9- 1 3由来 3 5株、 G 8 S 90— 4由来.1 6株において予想される増幅が確 認された。 以上より、 上記の G 4 1 8耐性 CHO雑種細胞 1 1 6株が 1 o X P配列への hE PO遺伝子発現ュニッ ト組換え揷入体であることが確認された。
(1 - 3) サザンプロット解析
hE PO— 14ΝΔ qHACベクターにおいて h E PO発現ュニッ ト構造が正しく保 持されているか否かを調べるために、 サザンプロッ ト解析を行なった。 方法は、 Kakeda ら （Gene Therapy; 12： 852-856, 2005 年） に従った。 代表的な結果を図 38に示す。 塩基配列から予想される X b a I消化による制限酵素断片長は、 hE PO発現ユニッ ト を含む 5. 5 k bである。 上記 （ 1一 2) で得た G 4 1 8耐性候補 CHO雑種細胞計 1 30株 （G4 S 6 1— 1由来 36株、 G4 S 6 1— 9由来 40株、 G4 S 39— 1 3由 来 35株、 G8 S 90— 4由来 1 9株） から、 計 6 0株 （G4 S 6 1— 1由来 1 3株、 G4 S 6 1 _ 9由来1 8株、 G4 S 3.9— 1 3由来 1 9株、 G 8 S 90— 4由来 1 0株） において予測されるサイズのバンドを確認した。
(1 -4) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコ一ル， 秀潤社， 1 994) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 上記 （ 1— 3) で得た G 4 1 8耐性 CHO雑種細胞のうち 23株について解析した。 そ の結果、 計 1 5株 （G4 S 6 1— 1 E 6、 9、 G4 S 6 1— 9 E 28、 34、 3 5、 6 5、 G4 S 39— 1 3 E 3、 4、 5、 1 6、 5 5、 6 1、 7 1、 G8 S 90_4 E 1 6、 1 8と以下称する） において、 観察し こ分裂像のほとんどにおいて正常核型かつ C o t 1で染まった 1コピーの h E PO— 1 4ΝΔ q H A Cベクターを検出した。 代表的な F I SH像を図 39 Aに、また核型を図 39 B及び図 4 1に示す。図 4 1に示す 1 3 E 4、 1 3 E 5 5、 1 E 6及び 4 E 1 6は、 それぞれ G 4 S 39 _ 1 3 E 4、 G 4 S 3 9 - 1 3 E 56、 G4 S 6 1 - 1 E 6及び G 8 S 90— 4 E 1 6を表す。
以上 （1— 1) から （1— 4) の実験から得られた上記の G 4 1 8耐性 CHO雑種細 胞 1 5株は、 ι Ε ΡΟ_ 14ΝΔ q H A Cベクタ一を保持する正常核型の C Η Ο細胞で あることを確認した。
(2) 14 N Δ q HACベクタ一へ挿入された h E P O遺伝子の発現
h E PO遺伝子の発現は、 培養上清中に産生される h E POタンパク質を酵素結合免 疫吸着検定法 （E L I S A法） により定量した。
上記 （1—3) において単離した hE PO— 1 4ΝΔ qHACベクタ一を保持する G 4 1 8耐性 CHO雑種細胞 48株 （G 4 S 6 1— 1 E由来 1 1株、 G4 S 6 1— 9 E由 来 1 6株、 G4 S 3 9— 1 3由来 1 9株、 G 8 S 90— 4由来 5株） を、 約 1 05細胞 を 1 0%F B S添加した 0. 8mg/m 1の G4 1 8を含む F 1 2培地 2m 1をいれた 1 2穴組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン） に播瑋した。 コンフレント到達 後、 1 0%FB Sを添加した F 1 2培地 2 m 1に置き換え 2日間培養し、 1 0%FB S を添加した F l 2培地 1 m 1に置き換えさらに 24時間培養した後、 上清を回収及び細 胞数を計数した。 hE PO E L I S Aキット （Quantikine IVD Human EP0 Immunoassay, R&D システム） により、 培養上清中の h E POを定量した。 2連で行った実験結果の平 均値を図 4 0に示す。 以上の結果から、 上記 h E PO— 1 4 ΝΔ q HACベクタ一を保 持する G4 1 8耐性 CHO雑種細胞全てにおいて h E POの発現を確認した。 実施例 9
h E PQ- 1 4 N A q H A Cベクターの C H O細胞での長期安定性解析
( 1 ) 非選択培養条件下での長期継代培養
h E PO— 1 4 Ν Δ q HACベクタ一の CHO雑種細胞における安定性を確認するた めに、 非選択条件下で長期継代培養を行った。 実施例 8で得た CHO雑種細胞 4株 （G 4 S 6 1— 1 E 6、 G 4 S 3 9— 1 3 E 4、 5 5、 G 8 S 9 0— 4 E 1 6) を使用した。 非選択培養液は 1 0%F B Sを含む F 1 2培地であり、 選択培養液はこれに 0. 8m g / 1の G 4 1 8を添加した。 CHO細胞株は 5. 0 X 1 05細胞を 1 0 c m径ディッシ ュに播種し、 細胞密度が 8 0〜 9 0%飽和程度まで培養した細胞を計数して再び 5. 0 X 1 05細胞を 1 0 c m径ディッシュに播種し、 1 0継代まで行った。継代毎に細胞数を 計数して集団倍加数を算出した。 （：1¾0細胞株は1 0継代後にそれぞれ細胞を回収し、 h E PO遺伝子の発現及び F I SH解析を行った。
(2) 長期継代培養後の h E PO遺伝子の発現
h E P O遺伝子の発現は、 培養上清中に産生される h E P Oタンパク質を酵素結合免 疫吸着検定法 （E L I S A法） により定量した。 上記 G 4 S 6 1— 1 E 6、 G 4 S 3 9 _ 1 3 E 4、 5 5、 G 8 S'9 0 _ 4 E 1 6株について実施例 8 (2) の方法に従って 2 連で行った実験結果の平均値を図 4 1に示す。 以上より、 上記 h E PO— 1 4 N A q H A Cベクターを保持する C H O雑種細胞 4株全てにおいて長期継代培養後も h E P Oの 発現を確認した。
(3) F I SH解析
F I SH解^は、 松原ら （F I SH実験プロ トコ一ル， 秀潤社， 1 9 94) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 細胞集団倍加数及び H A C保持率は 2連で行った結果の平均値を算出した。 上記 4株に ついてその結果を表 4及び図 4 1に示す。 表 4 ： hEP0-14NA HACベクターの CH0細胞における安定性
Figure imgf000107_0001
hE PO— 1 4ΝΔ qH ACベクタ一は、 C HO細胞において 1 0継代後まで安定に 保持されていた。 また分裂中期の染色体像を観察したところ、 細胞あたり 1ないし 2個 のシグナルが検出された。 .
以上の （1) から （3) の実験により、 h E P O— 14 N Δ q HACベクターは、 長 期継代培養後の CHO細胞において、 非選択培養条件で安定に保持されること、 細胞 たりのコピー数が維持されること、 h E PO遺伝子の発現が維持されること、 が明らか となった。 実施例 1 0
hE PO— 14 N A q HACベクターのヒ ト正常繊維芽細胞での h E P O遺伝子発現 (1) hE PO- 14ΝΔ q HACベクター移入ヒ ト正常繊維芽細胞の作製
( 1 - 1 ) ミクロセル法による h EPO— 1 4ΝΔ q HACベクターのヒ ト正常繊維芽 細胞 HF L - 1への移入
染色体供与細胞として、 実施例 9で得られた h E PO— 14 N Δ qHACベクタ一を 保持する CHO細胞株のうち、 微小核形成能が高いクローン （G4 S 6 1— 1 E 6、 G 4 S 3 9 - 1 3 E 4, 55、 G 8 S 90— 4 E 1 6) を用いた。 染色体受容細胞として は、 ヒ ト正常繊維芽細胞 HF L— 1 (理化学研究所細胞材料開発室より入手、 登録番号 R C B 05 2 1 ) を用いた。 微小核融合は上記実施例 5 (1) と同様に行った。 約 4週 間の選択培養の後、 出現した薬剤耐性のコロニーを単離し以後の解析を行った。 3 2回 (各 8回 X 4株） の微小核細胞融合から 4 7個の薬剤耐性コロニーを得た。 上記コロニ —のうち、 染色体供与細胞として G 4 S 6 1 - 1 E 6細胞を用いて得た細胞を G 6 H細 胞と、 G4 S 39— 1 3 E 4細胞を用いて得た細胞を G 4 H細胞と、 G4 S 39— 1 3 E 55細胞を用いて得た細胞を G 55 H細胞と、 G 8 S 90— 4 E 1 6細胞を用いて得 た細胞を G 1 6 H細胞と、 以下称する。
(1 - 2) PCR解析
hE PO_ 14 ΝΔ qHACベ、クタ一を保持する力否かを実施例 3 (1— 2) のプラ イマ一 S V p AN p 1及び N e o R p 2を用いて、ヒ ト染色体を S T Sマーカ一 D 2 S 1 334のプライマーを用いて Kakedaらの方法（Kakedaら、 Gene Therapy； 12： 852-856， 2005年） に従い PC R増幅により確認した。 また、 染色体供与 CHO細胞の混入の有無 を CHO f u r i n遺伝子特異的プライマー f u r i n 3， 3 11 1) 及び£ 11 1： 1. 11 E x 6— 28 Rを用いて P CR増幅により確認した。 方法は上記実施例 5 (1— 2) と 同様に行った。
hE PO— 14ΝΔ qHACベクターを保持する HF L— 1細胞で染色体供与 CHO 細胞の混入が無い場合に、 プライマー S Vp ANp 1及び Ne o R p 2により約 1. 0 k b の増幅、 D 2 S 1 3 34プライマーにより約 0. 6 k b pの増幅、 f u r i n 3 ' s u b F及び f u r i nE x 6 _ 28 Rによる増幅なし、 が予想される。 その結果、 上 記 （1— 1) で得たブラストサイジン耐性株 4 7株から計 1 7株 （G 6H ； 2株、 G4 H ； 4株、 G 55H ; 6株、 G 1 6 H； 5株） において予想される増幅が確認された。 以上より、 上記のブラストサイジン耐性株 1 7株が h E PO— 14 ΝΔ qHACベタ ターを保持する HF L_ 1細胞であることが確認された。
(1— 3) サザンブロット解析
hE PO— 14ΝΔ qHACベクタ一において h E PO発現ュニッ ト構造が正しく保 持されているか否かを調べるために、 上記のブラストサイジン耐性株のうち 1 3株につ いてサザンブロッ ト解析を行なった。 方法は、 Kakedaら （Gene Therapy; 12： 852-856, 2005年） に従った。 代表的な結果を図 1 9の Bに示す。 塩基配列から予想される Xb a I消化による制限酵素断片長は、 h E PO発現ユニッ トを含む 5. 5 k bである。 その 結果、 上記 く 1— 2) で得た h E PO— 14 N Δ q H ACベクターを保持するブラス ト サイジン耐性株 9株 （G4H2、 4、 5、 G 6H3、 G 1 6H 1 7、 2 1、 23、 G 5 5H7、 9) において予測されるサイズのバンドを確認した。
(1 -4) F I S H解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコ一ル， 秀潤社， 1 994) に記され た方法に従い、 ヒ ト 1 4番及び 2 2番染色体特異的 αサテライ ト DNAプローブ (Q- biogene、 フナコシ） を用いて行った。 ブラス トサイジン耐性株のうち 3株 （G4H 2、 G 1 6H 1 7、 G 55H7) について解析した結果、 計 3株が、 正常核型かつ観察 した分裂像のほとんどにおいて、 宿主細胞由来の 1対のヒ ト 14番及び 22番染色体セ ントロメァ領域の 4箇所と 1コピーの 1 4 ΝΔ q HACベクター由来の 1箇所にシグナ ルが検出された。 その結果を図 42 A及び Bに示す。 .
以上 （1 _ 1) から （1一 4) の実験から、 得られたブラストサイジン耐性株 3株は h E PO- 14 ΝΔ q H A Cベクターを保持する正常核型の H F L— 1細胞であること が確かめられた。
(2) h E PO— 14ΝΔ q H A Cベクターを保持する H F L - 1細胞における h E P O遺伝子発現
h E PO遺伝子の発現は、 培養上清中に産生される hEPOタンパク質を酵素結合免 疫吸着検定法 （E L I SA法） により定量した。
. 上記 （1) において単離した h EPO— 14ΝΔ qHACベクターを保持するブラス トサイジン耐性 HF L- 1細胞 9株 （G4H2、 4、 5、 G 6H3、 G 1 6H 1 7、 2 1、 2 3、 G 5 5H7、 9) について、 それぞれ約 1 05細胞をブラス トサイジン （3 μ gZm 1 ) を含む選択培地 （20%F B S、 DMEM) 1 m 1をいれたコラーゲン I コ トした 24穴組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン） に播種した。 コンフ レント到達後 7日間培養し、 新しい培地に置き換え更に 24時間培養した後、 上清を回 収及び細胞数を計数した。 h E PO E L I SAキッ ト （Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&Dシステム） により、 培養上清中の h E P Oを定量した。 その結果を図 2 1の 「1 4N— HAC」 の項目に示す。
以上の結果から、 上記 h Ε ΡΟ— 1 4 ΝΔ q HACベクターを保持する HF L_ 1細 胞全てにおいて h E POの発現を確認した。 実施例 1 1
h E PO- 14NA q HACベクターのヒ ト正常繊維芽細胞での長期 E P O発現
(1) 非選択培養条件下での長期継代培養
h E PO- 14NA q HACベクターのヒ ト正常繊維芽細胞 HF L_ 1における安定 性を確認するために、 非選択条件下で長期継代培養を行った。 実施例 1 0で得た h E P O— 1 4 N Δ q HACベクター.を保持する HF L— 1細胞 4株 （G4H 2、 G 1 6H 1 7、 G 1 6 H2 1、 G 5 5H7) を使用した。 非選択培養液は 20 % F B Sを含む DM EM培地であり、 選択培養液はこれにブラス トサイジン 3 μ gZm 1 を添加した。 h E PO- 1 4 ΝΔ q HACベクターを保持する HF L— 1細胞株ほ:！〜 3 X 1 05細胞を コラーゲン一 I コートした T— 25フラスコ （ファルコン） に播種し、細胞密度が 90% 飽和程度まで培養し、再び 1〜3 X 1 05細胞を播種し 6〜 1 0継代まで行った。継代毎 に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。また、 5及び 1 0継代前後に細胞を回収し、 h E PO遺伝子発現解析及び F I SH解析を行った。
(2) 長期継代培養後の hE PO遺伝子の発現
h E PO遺伝子の発現は、 培養上清中に産生される h E POタンパク質を酵素結合免 疫吸着検定法 （E L I SA法） により定量した。 ，
上記 （1) で長期継代培養した hEPO— 14 ΝΔ qHACベクターを保持する HF L - 1細胞 4株を、 約 1 04細胞にて 20 % F B Sを含む DMEM培地 2 m 1 をいれた コラーゲン一 I コート 24穴組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン） に播種し た。 コンフレント到達後 7日間培養し、 新しい培地 1 m 1に置き換えさらに 24時間培 養した後、 上清を回収及び細胞数を計数した。 hE PO EL I SAキッ ト （Quantikine IVD Human EP0 Immunoassay, R&Dシステム） により、 培養上清中の h E P Oを定量した。. 2連で行った実験結果の平均値を図 43に示す。
以上の結果から、 上記 h E PO- 14 Ν Δ q HACベクターを保持する HF L_ 1細 胞 4株全てにおいて長期継代培養後も hE POの発現を確認した。
以上の実験により、 h E PO— 14 N Δ q HACベクターは、 長期継代培養後の HF L— 1細胞において、 hE PO遺伝子の発現が維持されること、 が明らかとなった。 実施例 1 2
サブテロメァ領域を含む 14HAC ( 14 g ΝΔ q HAC) ベクタ一の構築
H ACベクターがテロメァ配列及びヒ ト 1 4番染色体末端の約 60 k bのサブテロメ ァ領域を含有するように、長腕遠位及び近位に 1 o X P配列を相同組換えにより挿入し、 C r eによる部位特異的組換え反応により 2箇所の 1 o x P配列間の領域を切出し削除 して長腕遠位欠失人工染色体 （14 gNA qHAC) ベクターを構築する。
(1) 部位特異的組換え反応によるヒ ト 1 4番染色体長腕削除
( 1— 1 ) ヒ ト 1 4番染色体長腕遠位テ口メァ側 1 o. X P配列揷入用ベクター p 1 o X p P GK— 14 q t e 1— 2.の構築
1 o X P配列挿入用ベクター （ターゲティングベクター） には、 実施例 6 (1— 1) の p l o x Pu p B S D— P GKを用いた。 G e n B a n kデータベースより得たヒ ト 1 4番染色体長腕遠位の塩基配列 （登録番号 A B 0 1 943 7) から、 p l o x p PG K- 14 q t e 1 — 2ベクター挿入の 2箇所の標的配列を設計した。 これを PCR増幅 するための、 制限酵素認識配列を付加したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下 に示す：
AB01 38KpnIFw： 5'- AGGTACCTTAGAGACTTTGTGAGGCTTATCGGCT (配列番号 79)
AB01 40ApaIRv： 5'- AGGGCCCTAGTTAGATCTGGCAAGCCTAAAGCTG (配列番号 80)
AB01 42SpeIFw： 5'- GACTAGTCGCTTGAGTCGTCATCATCAGATGAGT (配列番号 8 1)
AB01 45R： 5' -AGGAGGATCCTTTATTGAGTGCAC (配 番号 8 2)
AB01 45F ： 5' - GTGCACTCAATAAAGGATCCTCCT (配列番号 8 3 )
AB01 47EcoRV： 5' - CGATATCGATGCTAAGAGATGCCCTAAGAAATCC (配列番号 84 ) 実施例 1 (1一 1) の方法に従い、 ヒ ト 14番染色体を保持するマウス A 9雑種細胞 (A9 c l l - 14 c h r) のゲノム DN Aを铸型とし、 上記のプライマーを用いて 5 ' 及び 3 ' 側の 2つの組換え標的配列を PC R法により増幅した。 T a qポリメラ一ゼは L A T a q (宝酒造） を用レ、、 AB 0 1 38 K p n I F w/AB 0 1 40 A p a I F wによる反応条件は、 94°C 1分の後、 変性 98°C5秒、 アニーリングノ伸長 72 °C 6 分を 3サイクル、 変性 98 °C 5秒、 アニーリング 伸長 70°C 6分を 2サイクル、 変性 9 8°C5秒、 ァニーリング /伸長 6 8°C6分を 30サイクル、 伸長 70 °C 1 0分で行つ た。 また、 AB 0 1 42 S p e I F w/AB 0 1 47 E c o R Vによる反応条件は、 94°C 1分の後、 変性 98°C5秒、 アニーリング 伸長 72°C8分を 3サイクル、 変性 9 8°C5秒、 アニーリング/伸長 70°C 8分を 2サイクル、 変性 98 °C 5秒、 ァニーリ ング 伸長 68 °C 8分を 30サイクル、 伸長 70 °C 1 0分で行つた。 AB 0 1 38 K p n I F w/AB 0 1 40 A p a I F wによる 2, 0 k bの増幅産物は、 制限酵素 K ρ η I及び A p a Iにて消化し、 p 1 o x P u p B S D— PGKベクターの K p n I— A p a Iサイ トへクローニングした。 また、 AB 0 1 42 S p e I F w/AB 0 1 45 R による 3. 0 k bの増幅産物を S p e I— B a mH I消化し、 また AB 0 1 45 F/A B 0 1 4 7 E c o RVによる 2. 0 k bの増幅産物を B a mH I— E c o R V消化し、 上記の 2フラグメントを一度 p B 1 u e s c r i p tベクタ一にサブクローニングした 後 S p e I— E c o R V消化し、 上記の 2. 0Kbの標的配列を持つ p 1 o x P u p B S D— P GKベクターの N h e I -E c o R Vサイ トへク口一ユングした。 最終的な p l o x p PGK— 1 4 a t e l — 2コンス トラク トのサイズは約 1 2. 1 k bである。 p 1 o x p PGK- 14 q t e 1 — 2ベクタ一標的配列、 及び相同組換えにより生じる 染色体アレルを図 44及び図 45に示した。
(1 - 2) ヒ ト 1 4番染色体保持 DT 40雑種細胞への長腕遠位テロメァ側 1 o X P配 列揷入用べクタ一 p 1 o X p PGK- 14 q t e 1 - 2ベクター導入
実施例 1 (1— 2) の方法に従い、 p 1 o X p PGK— 14 q t e l — 2コンス トラ ク トを制限酵素 S r f I消化により線状化 DNAとし、 ヒ ト 14番染色体を保持する D 丁40雑種細胞13丁40 (- 14) 1— 2及び DT40 (— 14) 2— 4に導入した。 ブラストサイジン （終濃度 8 u g/m 1 ) で選択培養を行い、 2〜 3週間後には薬剤耐 性コロニーが出現した。 DT40 (- 1 4) 1— 2の場合は、 6回のトランスフエクシ ヨンから合計 1 7 38個のブラス トサイジン耐性コロニーを DT 40 (- 14) 2— 4 の場合は、 4回のトランスフエクションから合計 6 1 8個のブラス トサイジン耐性コロ 二一を単離して増殖させ以後の解析を行った。
(1— 3) PCR解析
ブラス トサイジン耐性株のゲノム DNAを铸型として 5' 及び 3 ' 側の 2標的配列の 存在を実施例 1 2 ( 1 - 1 ) の方法に従い、 PCR法により検出した。 2つの標的配列 (図 45中、 それぞれ 5 ' g e n ome及び 3 ' g e n o m eで示す） に対し、 これら を夾んで染色体上とターゲテイングべクタ一上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマ 一対を設計した。 その位置は図 46中に矢印で示した。 その配列を以下に示す： . AB01 37774F： 5'- TATGGAGGAATGGCAGAGGGTGACACAGGC (配列番号 85)
PGKlongRv2： 5' - ACTTCCTGACTAGGGGAGGAGTAGAAGGTG (配列番号 86)
BsdlongRv2： 5' - AGTGGGCAGTTTACCGTAAATACTCCACCC (配列番号 8 7 )
AB01 47441R： 5，- CTCTTGAAGAATCTGAGCCATCTGTATGCC (配列番号 88)
上記 DT40 (- 1 4) 1一 2由来のブラス トサイジン耐性 1 7 38株のうち 2株に おいて、 DT40 (- 14) 2— 4由来のブラス トサイジン耐性 6 1 8株のうち 5株に おいて 5' 及び 3 ' 側の 2標的配列の存在を確認した。
(1 -4) サザンプロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーユングとしてサザンプロット解析を行った。 相同組換えの 5 ' 及び 3' 側の 2標的配列外側にプローブ （g 2— 5' 及び g 2_ 3 ') を設定した （図 4 5)。 プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマ一対を用い、 ヒ ト 14番染色体を保持する A9 c l l - 14 c h r細胞ゲノム D N Aを铸型として P CRにより増幅、 単離、 精製した： AB01 37kbKpnIFw： 5' - AGGTACCCTGTCTATTATGACCAGCATGGC (配列番号 8 9)
ΆΒΟΙ 38kbKpnIRv： 5' - AGGTACCAGCCGATAAGCCTCACAAAGTCT (配列番号 90)
AB01 56561F： 5' - CTGAAAATTTATCTGCGTGA (配列番号 9 1)
AB01 57054R： 5' - AGAAGGAGGGTCCTTTGCAT (配列番号 9 2)
1次スクリーニングで得たブラストサイジン耐性株から抽出したゲノム DNA約 1 0 μ gを制限酵素 （5 ' 側） S a c I又は B s t E I I (3 ' 側） により （ロシュ） によ り消化し、 Ausubel ら (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & i>ons, Inc. , 1994) に記された方法でサザンプロッ ト解析を行つだ。 標識したプローブがハイブ リダイズしたシグナルを、 イメージアナライザー T y p h o o n 9 2 1 0 (モレキユラ —ダイナミクス） により検出した。 代表的な結果を図 47に示す。 塩基配列から予想さ れる制限酵素断片長は、 5 ' 側標的配列では相同組換え体で 7. 2 k b、 野生型 （非組 換え体） で 4. 8 k bであり、 3 ' 側標的配列では相同組換え体で 2 1. 8 k b、 野生 型 （非組換え体） で 1 8. 61^ 13でぁる。 0丁40 (— 14) 1— 2由来の候補株 2株 から合計 1株 （1 2 g 5) の相同組換え体を、 DT40 (— 1 4) 2— 4由来の候補株 5株から合計 3株（24 g l 5、 24 g 6 7、 24 g 9 1) の相同組換え体を確認した。. (2) ヒ ト 14番染色体長腕近位セントロメァ側への 1 o X P配列揷入
(2— 1) p 1 o X p PGK- 1 4 q t e 1を導入したヒ ト 14番染色体保持 DT 40 細胞への長腕近位セントロメァ側 1 o X P配列揷入用ベクター p 1 o X PHYGOR/ n 1ベクター導入 '
実施例 6 (2 - 1 ) で作製した p 1 o X PHYGOR/n 1コンス トラク トを制限酵 素 S r f I消化により線状化 DNAとし、 実施例 1 3 (1—4) で作製した p 1 o x p PGK- 14 q t e 1— 2を導入したヒ ト 14番染色体を保持する D T 40雑種細胞 1 2 g 5及び 24 g 1 5及び 24 g 6 7に導入した。 方法は、 実施例 1 (1— 2) のに従 つた。 2〜 3週間の選択培養後、 ピュ一ロマイシン耐性コロニーが出現した。 各 2回、 計 6回のトランスフエクシヨンから合計 252個 （1 2 g 5由来 78個、 24 g l 5由 来 1 28個、 24 g 6 7由来 46個） のピューロマイシン耐性コロニーを単離して以後 の解析を行った。
(2- 2) PCR解析
上記 （2— 1) で取得したピューロマイシン耐性株のゲノム DNAを铸型として 5 ' 及び 3 ' 側の 2標的配列の存在を実施例 7 (2- 1) の方法に従い、 PCR法により検 出した。 2つの標的配列 （図 2 7中、 それぞれ 5 ' g e n ome及び 3 ' g e n ome で示す） に対し、 これらを夾んで染色体上とタ一ゲティングベクタ一上にそれぞれオリ ゴヌクレオチドプライマ一対を設計した。 その位置は図 28中に矢印で示した。 上記ピ ュ一口マイシン耐性から 39株 （1 2 g 5由来 1 3株、 24 g l 5由来 24株、 24 g 6 7由来 2株） において 5 ' 及び 3 ' 側の 2標的配列の存在を確認した。
(2- 3) サザンプロッ ト解析
相同組換え体を選別するためのスクリ一ユングとしてサザンプロッ ト解析を行った。 方法は実施例 6 (2 -4) に従った。 代表的な結果を図 48に示す。 塩基配列から予想 される制限酵素断片長は、 5' 側標的配列では相同組換え体で 1 2. 5 k b、 野生型 （非 組換え体） で 1 8. 2 k bであり、 3 ' 側標的配列では桷同組換え体で 1 0. 2 k b、 野生型 （非組換え体） で 1 8. 2 k bであり、 上記 （2— 2) で取得した候補株のうち 25株から合計 23株 （ 1 2 g 5由来 1 1株、 24 g l 5由来 1 0株、 24 g 6 7由来 2株） の相同組換え体を確認した。 これらのうち、 24 g 1 5由来のクロ一ン 24 g 1 5 n 28 (以下 g 5 n 8と称する）及び 24 g 6 7由来のクローン 24 g 6 7 n l 9 (以 下 g 7 n 9と称する） を次のステップ （3) ベ進めた。
(3) C r e - 1 o X P部位特異的組換え反応による長腕遠位の削除
(3 - 1) 長腕遠位及び近位へ 1 o X P配列挿入したヒ ト 14番染色体保持 DT 40雑 種細胞への C r e発.現ベクターの導入
実施例 1 (1— 2) の方法に従い、 C r e発現ベクター p CAGGSC r eを実施例 1 2 (2) で取得した g 5 n 8及び g 7 n 9細胞に導入した。 ハイグロマイシン （終濃 度 1. 2 5mgZm 1 )で選択培養を行い 2〜 3週間後に薬剤耐性コロニーが出現した。 各 2回、 計 4回のトランスフエクションから合計 1 6個 （g 5 n 8由来 1 1個、 g 7 n 9由来 5個） のハイグロマイシン耐性コロニーを単離して以後の解析を行った。
(3— 2) P CR解析
ハイグロマイシン耐性株のゲノム DNAを铸型として 2つの 1 o X P配列間の欠失を PCR法により確認した。 方法は、 実施例 6 (3 - 2) に従って行った。 長腕遠位欠失 後に残った 1 o X P配列を夾んで染色体上とターゲテイングベクター上にそれぞれオリ ゴヌクレオチドプライマー対を設計した。 その位置は図 28中に矢印で示した。 その結 果、 上記ハイグロマイシン耐性株 1 6株のうち 1 2株 （g 5 n 8由来 7株、 g 7 n 9由 来 5株） において予測される増幅産物を確認した。
(3— 3) サザンプロット解析
長腕遠位欠失体を構造確認及び選別するためにサザンブロッ ト解析を行った。 長腕遠 位欠失により生じる標的配列、 染色体アレル及びプローブの位置を図 30 Bに示した。 相同組換えの 5' 及び 3' 側の 2標的配列外側にプローブ （g 2_ 5 ' ( i ) 及び N 3' ( i )) を設定した （図 30 B)。 上記実施例 1 3 (3 - 2) で得たハイグロマイシン耐 性株 9株 （g 5 n 8細胞由来 5株及び g 7 n 9細胞由来 4株） からゲノム DNAを抽出 し実施例 1 3 ( 1 -4) 及び （2 4) と同様に行った。 制限酵素 （ロシュ） 消化は、 S a c I (5' .側） 又は3 1； 11 1 (3 ' 側） により行った。 代表的な結果を図 4 9に示 す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、 5 '側標的配列では相同組換え体で 9. 2 k b、 野生型 （非組換え体） で 7. 2 k bであり、 3 ' 側標的配列では相同組換え体 で 8. 3 k b、 野生型 （非組換え体） で 1 0. 2,k bである。 その結果、 合計 5株 （g 5 n 8細胞由来 3株及び g 7 n 9細胞由来 2株） において長腕遠位欠失体を確認した。 (3-4) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコ一ル， 秀潤社， 1 994) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 上記 （ 3— 3 ) で取得した 5株 （g 5 n8 A c 3ZA d lZA d 4、 g 7.n 9 Δ c 1 / 厶 c 3) について解析した結果、 全てにおいて正常核型かつ観察した分裂像のほとんど において C o t 1で染まった 1コピーのシグナルを検出した。 代表的な F I SH像及び H ACベクターの核型をそれぞれ図 5 OA及び Bに示す。
以上 （3— 1) から （3— 4) の実験から、 得られたハイグロマイシン耐性 DT 40 雑種細胞は、 天然テロメァを残して長腕遠位を削除したヒ ト 1 4番染色体断片 （14 g NA qHAC) を保持することを確認した。
(4) 14 g ΝΔ q HAC長腕近位へのクローニング部位の導入
(4— 1) 1 o X P及び 3， n e o配列挿入用 p S F (g + n 1) ベクタ一の構築 上記実施例 1 2 (3) で作製したヒ ト人工染色体 （HAC) に 1 o X P及び 3 ' n e o配列を揷入するための基本プラスミ ドには、 実施例 1 (2— 1) で作製した p S F l ③を用いた。 Ι ο χ Ρ及び 3 ' n e o揷入部位である相同組換えの 5 ' 側標的配列は上 記実施例 1 2 ( 1 - 1 ) で取得した p 1 o X p PGK- 14 q t e 1 2ベクターで用い た配列から、 3 ' 標的配列は G e n B a n kデータベースより得たヒ ト 14番染色体長 腕近位の塩基配列 （登録番号 A L 39 1 1 56) から設計した。 これを PC R増幅する ためのプライマ一オリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
54023Flong2Fsel： 5' - GATGGCCGGCCTGGTTGGTAAAGATTGCTACACTTACGGCA (配列番号 9 3)
58830RlongSrfI： 5' - GATGCCCGGGCCAATAGCCAGTCAATCGAGAAACCAAGCCC (配列番号 94 ) 5 ' 側標的配列は、 p l o x p PGK— 14 q t e l 2ベクターから S a i l及び S r f I (ロシュ） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動により分離し精製後、 p SF l③ プラスミ ドの S a 1 I - S r f Iサイ トにクローニングした。 また 3' 側標的配列は、 ヒ ト 14番染色体を保持する A 9 c l l - 14 c h r細胞から抽出したゲノム p N Aを 铸型として PC Rにより増幅した。. T a qポリメラ一ゼは L A T a q (宝酒造）を用い、 Mg S O
4 (終濃度 0. 5mM) を添加し、 反応条件は 94 °C1分の後、 変性 98 °C 5秒、 ァニ 一リング/伸長 72 °C 8分を 3サイクル、 変性 98 °C 5秒、 アニーリングノ伸長 70 °C 8分を 2サイクル、 変性 98 °C 5秒、 アニーリング/伸長 68 °C 8分を 30サイクル、 伸長 72°C 10分で行った。 この約 5. 0 k bの DNA断片を制限酵素 F s e I及ぴ S r f I (ロシュ） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動により分離し精製後、 上記 5' 標 的配列を揷入した p S F 1③プラスミ ドの F s e I— S r f Iサイ トにクローニングし た。 最終的な p SF l (g + n 1) コンストラク トのサイズは約 13. 2 k bである。 タ一ゲティングベクター、 標的配列、 及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図 5 1及び図 34 Bに示した。
(4-2) 14 g N Δ q HAC保持 DT 40細胞への p S F ( g + n 1 ) ベクタ一導入 p.SF (g + n 1) コンス トラク トを制限酵素 S r f I (ロシュ） 消化により線状化 し、 長腕遠位を削除した 14 ΝΔ qHACを保持する DT 40雑種細胞 3種 （g 5 n 8 厶 c 3ZA d l, g 7 n 9 Δ c 1) にそれぞれ導入した。 方法は、 実施例 1 (2— 2) に従って行った。 2〜3週間後にはブラストサイジン耐性コロニーが出現した。 3回の トランスフエクションから合計 154個 （g 5 n 8 A c 3 ； 99個、 g 5 n 8 A d l ； 34個、 g 7 n 9 A c l ; 21個） の薬剤耐性コロニーを単離し、以後の解析を行った。
(4— 3) PCR解析
上記ブラストサイジン耐性株のゲノム DN Aを铸型として 5' 及び 3' 側の 2標的配 列の存在を PCR法により検出した。 2つの標的配列に対し、 これらを夾んで染色体上 とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマ一対を設計した。 その位置は図 34 B中に矢印で示した。 5 ' 側標的配列検出用プライマ一の配列を以下 に示す：
AB01 37931F： 5' - AGCGGTACTGAGAGGCAATCTTTCATGGGC (配歹 ϋ番号 9 5)
ApaIlongFw2： 5' - ACCAAATATCCTGCTCAAACTGTAACCC (配列番号 9 6)
方法は、 実施例 13 ( 4 - 1 ) に従って行った。 5' 側標的配列検出用の反応条件は 94°Cl分の後、 変性 98 °C 5秒、 アニーリング Z伸長 72 °C 6分を 3サイクル、 変性 98°C5秒、 アニーリング Z伸長 70°C 6分を 2サイクル、 変性 98 °C 5秒、 ァニーリ ング Z伸長 68 °C 6分を 30サイクル、 伸長 72°C 10分で行った。 得られたブラス ト サイジン耐性株のうち、 1 3株 （g 5 n 8 A c 3 ; 3株、 g 5 n 8 A d l ; 8株、 g 7 n 9 Δ c 1 ； 2株） 力 塩基配列から予想されるサイズ （5 ' g e n ome約 2. O k b及び 3' g e n ome約 5. 0 k b ) の増幅産物を与えることを確認した。
(4— 4) サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためサザンプロッ ト解析を行った。 プローブは、 相同組換え の標的配列の外側に g 2 _ 5 ' ( i ) (実施例 12, (1—4)) 及び N 3 ' ( i i ) (実施例 6 (4-4)) を設定した （図 34B)。 実施例 12 (4-3) で得た薬剤耐性候補株か らゲノム DNAを抽出し実施例 12 (1 -4) と同様に行った。 制限酵素 （ロシュ） 消 化は、 S p h I (5 ' 側） 又は B s t E I I (3 ' 側） により行った。 代表的な結果を 図 52に示す。 塩基配列から予想される制限酵素断片長は、 5' g e n ome側標的配 列では相同組換え体で 1 1. 8 k b、 野生型 （非組換え体） で 4. 6 k bであり、 3' g e n ome側標的配列では相同組換え体で 15. 8 k b、野生型（非組換え体） で 8.. 8 k bである。 上記や薬剤耐性候補株 13株から合計 9株の相同組換え体を確認した。 以上の （4— 1) 〜 （4— 4) の実験により、 相同組換えによりクロ一ユング部位 （1 o x P及び 3' n e o配列） が挿入された 14 g N Δ q H A Cベクタ一を保持する D T 40雑種細胞合計 9株 （g 5 n 8 A c 3 s l 3、 g 5 n 8 A d l s 3、 4、 6、 8、 9、 10、 g 67 n l 9 A c l s 9、 21) を取得した。 このうち、 g 5 n 8 A c 3 s l 3 及び g 67 n l 9 A c l s 9の 2株を次のステップへ進めた。
(5) CHO細胞への 14 g ΝΔ q HACベクター移入
(5 - 1 ) ミクロセル法による 14 g N Δ q H A Cベクターの C H O細胞への移入 染色体供与細胞として、 上記実施例 12 (4) で得られた、 長腕遠位を削除してクロ 一二ング部位 （ 1 o X P及ぴ 3 ' n e。配列） が挿入された 14 g N Δ q HACべクタ 一を保持する DT 40雑種細胞 （g 5 n 8 A c 3 s l 3及び g 67 n l 9 A c l s 9) をそれぞれ用いた。 染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株 CHO -K 1 (登録番号 J CRB 9018) を用いた。 方法は、 実施例 1 (3_ 1) に従って 行った。 約 2週間の選択培養の後、 出現したブラス トサイジン耐性コロニーを単離し、 以後の解析を行った。 4回の微小核細胞融合から計 55株 （g 5 n 8 Δ c 3 s 13由来 32株、 g 67 n l 9 A c l s 9由来 23株）のブラストサイジン耐性 CHO株を得た。 (5- 2) P CR解析
ブラス トサイジン耐性株のゲノム DNAを铸型として 5 ' 及び 3 ' 側の 2標的配列の 存在を PC R法により検出した。 方法は、 実施例 6 (5- 2) に従って行った。 得られ たブラストサイジン耐性 CHOのうち 5 2株 （g 5 n 8 Δ c 3 s 1 3由来 29株、 g 6 7 n 1 9 Δ c 1 s 9由来 2 3株）） が、 塩基配列から予想されるサイズ （5 ' g e n o m e約 2. O k b及び 3 ' g fe n ome約 5. Q k b ) の増幅産物を与えること及び D T
40細胞の混入が無いことを確認した。
(5 - 3) サザンプロッ ト解析
移入した 14 g ΝΔ qH ACベクターの構造を,確認するためサザンブロッ ト解析を実 施例 1 2 (4— 4) と同様に行った。 代表的な結果を図 5 3に示す。 塩基配列から予想 される制限酵素断片長は、 5 ' g e n ome側標的配列では相同組換え体で 1 1. 8 k b、 野生型 （非組換え体） で 4. 6 k bであり、 3 ' g e n o m e側標的配列では相同 組換え体で 1 5. 8 k b、 野生型 （非組換え体） で 8. 8 k bである。 上記ブラストサ ィジン耐性候補株 36株から合計 35株 （g 5 n 8 A c 3 s l 3由来 1 7株、 g 6 7 n 1 9 Δ c 1 s 9由来 1 8株） の相同組換え体を確認した。 図 5 3及び 54において、 「g
5 S 1 3」 及び 「g 7 S 9」 は、 それぞれ g 5 n 8 A c 3 s l 3由来株及び g 6 7 n 1 9厶. c 1 s 9由来を表す。
(5-4) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 994) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 ブラストサイジン耐性 CHO株のうち 1 5株 （g 5 n 8 A c 3 s l 3由来 6株、 g 6 7 n l 9 A c l s 9由来 9株） について解析した結果、 計 5株 （g 5 n 8 A c 3 s l 3 _ 9, 1 2の 2株：以下 g 5 S 1 3— 9、 g 5 S 1 3 _ 1 2と称する、 g 6 7 n l 9 A c 1 s 9 - 1 1 , 1 2, 1 7の 3株：以下 g 7 S 9— 1 1、 g 7 S 9— 1 2、 g 7 S 9 - 1 7と称する） 力 S、 正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて C o t 1で染まつ た 1コピーの 1 4 gNA q H ACベクタ一が検出された。 代表的な F 1,3^1像及び1 4 g N Δ q HACベクタ一の核型をそれぞれ図 54 A及び Bに示す。
以上 （5— 1) から （5— 4) の実験から、 得られたブラス トサイジン耐性 CHO株 5株は、 正常核型かつ 1コピーの 14 g N Δ q H A Cべグターを保持することが確かめ られた。 実施例 1 3
1 4 g ΝΔ q HACベクターの CHO雑種細胞での長期安定性解析
( 1 ) 非選択培養条件下での長期継代培養
1 4 g NA q HACベクタ一の CHO細胞における安定性を確認するために、 非選択 条件下で長期継代培養を行った。 実施例 7に記載した 1 4 g Ν Δ q HACベクタ一を保 持する CHO細胞株 2株 g 5 S 1 3— 9、 g 5 S 1 3 - 1 2を使用した。 非選択培養液 は 1 0%F B Sを含む F 1 2培地であり、 選択培養液はこれにブラストサイジン 8 μ g /m 1 を添加した。 CHO細胞株は 5. 0 X 1 05細胞を 1 0 c m径ディッシュに播種し、 細胞密度が 8 0〜9 0%飽和程度まで培養した細胞を計数して再び 5. 0 X 1 05細胞を 1 0 c m径ディッシュに播種し、 1 0継代まで行った。 継代毎に細胞数を計数して集団 倍加数を算出した。 CHO細胞株は 1 0継代後にそれぞれ細胞を回収し F I SH用染色 体標本を作製した。
(2) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 9 94) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 - 細胞集団倍力 [Ϊ数及び H A C保持率は 2連で行った結果の平均値を算出した。 上記 2株に ついてその結果を表 5及び図 1 3に示す。 図 1 3においては、 1 4 g A q HAC (g) の項目に示す。
表 5 ： 14 A HACべクターの CH0細胞における安定' 14
Figure imgf000119_0001
1 4 g NA q HACベクターは、 CHO細胞において 1 0継代後までの時点で安定に 保持されていた。 また分裂中期の染色体像を観察したところ、 細胞あたり 1ないし 2個 のシグナルが検出された。
以上の （1 ) 及び （2) の実験により、 1 4 g NA q HACベクタ一は、 CHO細胞 において非選択培養条件で安定に保持されること、 また細胞あたりのコピー数は維持さ れていることが明らかとなった。 実施例 14
hE PO— 1 4 gNA q H A Cベクターの C H O細胞での h E P O遺伝子発現解析
(1) h E P 0_ 14 g N Δ q HACベクタ一の構築
(1— 1) 14 g N Δ q HACベクターへの hE P O遺伝子の導入
実施例 7で構築した 1 4 gNA q HACベクターへ h E PO遺伝子発現ュニッ トを挿 入する。 1 o X P配列を含む h E PO発現プラスミ ドを準備し、 C r e組換え酵素を一 過性に発現させることで 1 o X P配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿 入する。 組換え挿入体の選別は、 G4 1 8耐性の獲得 （プロモータ一分断型の n e o耐 性遺伝子発現ュニットの再構成） を指標とした。 実施例 1 3で作製した 14 g N Δ q H A Cベクターを保持する C HO細胞（g 5 S 1 3 - 1 2及び g 7 S 9 - 1 1)を用いて、. 実施例 3 ( 1— 1) と同様にして h E PO遺伝子発現ユニッ トの挿入を行った。 2〜3 週間後には G 4 1 8耐性コロニーが出現し、計 1 6 9個（g 5 S 1 3— 1 2由来 7 7個、 g 7 S 9 - 1 1由籴 92個） のコロニーを単離して増殖させ、 以後の解析を行った。 (1 - 2) P CR解析
hE PO遺伝子発現ュニッ ト組換え挿入体の選別は、 1 4 gNA q HACベクタ一上 の 1 o X P配列部位に挿入されたか否かを、 1 o X P配列部位を挟むように p LN 1 _ E POベクタ一上及び 14 gNA q HACベクタ一上に設計したプライマー SV p AN p 1及び N e o R p 2によって、 また挿入された h E P O遺伝子を、 プラスミ ドベクタ — B S 2 26上の M 1 3 R V及び N e o R p 2プライマ一によって、 P CR增幅によ り確認した。 プライマー配列及び PCRは Kakedaらの方法 （Kakedaら、 Gene Therapy; 12： 852-856, 2005 年） に従った。 組換え揷入体の場合は、 プライマ一 SVpANp l 及び N e o R p 2により約 1. O k b p、 プライマー M 1 3 R V及び N e o R p 2に より約 2. 7 k b pの増幅が予想される。 その結果、 上記 （1— 1) で得た G4 1 8耐 性 CHO雑種細胞から計 6 9株 （g 5 S 1 3— 1 2由来 32株、 g 7 S 9— 1 1由来 3 7株) において予想される増幅が確認された。
以上より、 上記の G 4 1 8耐性 CHO雑種細胞 6 9株が 1 o x P配列への h E P O遺 伝子発現ュニッ ト組換え挿入体であることが確認された。
(1 - 3) サザンプロット解析
hE PO_ 1 4 gNA q HACベクタ一において hE PO発現ュニット構造が正しく 保持されているが否かを調べるために、サザンプロット解析を行なった。方法は、 Kakeda ら （Gene Therapy; 12： 852-856, 2005 年） に従った。 代表的な結果を図 55に示す。 塩基酉己列から予想される X b a I消化による制限酵素断片長は、 h E PO発現ユニッ ト を含む 5. 5 k bである。 上記 （1— 2) で得た G 4 1 8耐性候捕 CHO雑種細胞計 6 5株 （g 5 S 1 3— 1 2由来 2 4株、 g 7 S 9— 1 1由来 4 1株） から計 3 2株 （g 5 S I 3— 1 2由来 1 0株、 g 7 S 9— 1 1由来 2 2株） において予測されるサイズのバ ンドを確認した。
( 1 - 4) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 9 94) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 上記 （1 _ 3) で得た G 4 1 8耐性 CHO雑種細胞のうち 1 7株について解析した。 そ の結果、 計 5株 （g 5 S 1 3— 1 2由来 1株；以下 g 5 S 1 3 - 1 2 E 2 3と称する、 g 7 S 9 _ 1 1由来 4株；以下 g 7 S 9— 1 1 E 2 8 , 4 8， 5 7， 6 2と称する） に おいて、 観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつ C o t 1で染まった 1コピー の h E PO— 1 4 g N Δ q HACベクターを検出した。 代表的な F I SH像及び h E P O— 1 4 g N Δ q HACベクターの核型をそれぞれ図 5 6 A及び Bに示す。
以上 （1— 1 ) から （1一 4) の実験から、 得られた G 4 1 8耐性 5株は、 h E PO - 1 4 g N Δ q HACベクタ一を保持する正常核型の CHO細胞であることを確認した。 (2) 1 4 g NA q HACベクターへ挿入された h E PO遺伝子の発現
h E PO遺伝子の発現は、 培養上清中に産生される h E P Oタンパク質を酵素結合免 疫吸着検定法 （E L I SA法） により定量した。
上記 1 ) において単離しサザン解析で h E PO遺伝子発現ュニッ トの存在及び構造を 確認した h E PO- 1 4 g NA q HACベクターを保持する G 4 1 8耐性 CHO雑種細 胞 2 8株を、 約 1 05細胞を 1 0 %F B S添加した 0. 8 m g m 1 の G 4 1 8を含む F 1 2培地 2m 1 をいれた 1 2穴組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン） に播 種しだ。 コンフレント到達後、 1 0%F B Sを添加した F 1 2培地 2 m 1に置き換え 7 日間培養し、 1 0%F B Sを添加した F 1 2培地 1 m 1に置き換えさらに 24時間培養 した後、上清を回収及び細胞数を計数した。 h E PO E L I SAキッ ト（Quantikine IVD Human EP0 Immunoassay, R&Dシステム） により、 培養上清中の h E P Oを定量した。 2 連で行った実験結果の平均値を図 5 7に示す。
以上の結果から、 上記 h E PO— 1 4 8 Ν Δ q HACベクタ一を保持する G 4 1 8耐 性 CHO雑種細胞 2 8株全てにおいて h E POの発現を確認した。 実施例 1 5
h E PO— 1 4 g N A q H A Cベクターの C H O細胞での長期安定性解析
( 1 ) 非選択培養条件下での長期継代培養
h E PO— 1 4 g NA q HACベクタ一の CHO細胞における安定性を確認するため に、 非選択条件下で長期継代培養を行った。 実施例 1 5で得た CHO雑種細胞 3株 （g 5 S 1 3— 1 2 E 2 3、 g 7 S 9— 1 1 E 2 8, 6 2) を使用した。 非選択培養液は 1 0 % F B Sを含む F 1 2培地であり、 選択培養液はこれに 0. 8 m g/m 1 の G 4 1 8 を添加した。 CHO細胞株は 5. 0 X 1 05細胞を 1 0 c m径ディッシュに播種し、 細胞 密度が 8 0〜9 0%飽和程度まで培養した細胞を計数して再び 5. 0 X 1 05細胞を 1 0 c m径ディッシュに播種し、 1 0継代まで行った。 継代毎に細胞数を計数して集団倍加 数を算出した。 CHO細胞株は 1 0継代後にそれぞれ細胞を回収し、 h E PO遺伝子の 発現及び F I SH解析を行った。
. ( 2 ) .長期継代培養後の h E P O遺伝子の発現
h E PO遺伝子の発現は、 培養上清中に産生される h E POタンパク質を酵素結合免 疫吸着検定法 （E L I SA法） により定量した。
上記 （1 ) で長期継代培養した h E PO— 1 4 g N A q HACベクタ一を保持する C HO雑種細胞 3株を、 約 1 05細胞を 1 0%F B S添加した 0. 8 g 1の G 4 1 8を含む F 1 2培地 2m 1 をいれた 1 2穴組織培養用プラスチックシャーレ （フアルコ ン） に播種した。 コンフレント到達後、 1 0%F B Sを添加した F 1 2培地 2 m 1に置 き換え 7日間培養し、 1 0%F B Sを添加した F 1 2培地 l m 1 に置き換えさらに 24 時間培養した後、 上清を回収及び細胞数を計数した。 h E P O E L I S Aキッ ト
(Quantikine IVD Human EP0 Immunoassay, R&D システム） により、 培養上清中の h E POを定量した。 2連で行った実験結果の平均値を図 5 8に示す。
以上の結果から、 上記 h E PO— 1 4 g ΝΔ q HACベクターを保持する CHO雑種 細胞 3株全てにおいて長期継代培養後も h E POの発現を確認した。
(3) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 9 94) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 細胞集団倍加数及び H A C保持率は 2連で行った結果の平均値を算出した。 上記 3株に ついてその結果を表 6及び図 5 8に示す。 表 6 ： hEPO— 14 NA HACベタターの CHO糸田 S包における安定十生
Figure imgf000123_0001
h E PO- 1 4 g ΝΔ q HA Cベクターは、 CHO細胞において 1 0継代後まで安定 に保持されていた。 また分裂中期の染色体像 観察したところ、 細胞あたり 1ないし 2 個のシグナルが検出された。
以上の （ 1) から （3) の実験により、 h E P O— 14 g N Δ q HACベクターは、 長期継代培養後の CHO細胞において、 非選択培養条件で安定に保持されること、 細胞 あたりのコピー数が維持されること、 h E PO遺伝子の発現が維持されること、 が明ら かとなつた。 実施例 1 6
hE PO- 1 4 g NA q HACベクタ一のヒ ト正常繊維芽細胞での h E P O遺伝子発現
(1) hE PO- 1 4 gNA q HACベクター移入ヒ ト正常繊維芽細胞の作製
( 1一 1 ) ミクロセル法による h EPO— 1 4 gNA qHACベクターのヒ ト正常繊維 芽細胞 HF L— 1への移入
染色体供与細胞として、 実施例 1 5で得られた h E PO— 14 g N Δ qHACベクタ 一を保持する CHO雑種細胞株のうち、 微小核形成能が高いクローン （g 5 S 1 3— l
2 E 2 3、 g 7 S 9— 1 1 E 28, 6 2) を用いた。 染色体受容細胞としては、 ヒ ト正 常繊維芽細胞 H F L- 1 (理化学研究所細胞材料開発室より入手、 登録番号 R CB 0 5
2 1) を用いた。 微小核融合は上記実施例 5 (1) と同様に行った。 約 4週間の選択培 養の後、 出現した薬剤耐性のコロニーを単離し以後の解析を行った。 24回の微小核細 胞融合から 5 1個 （g 5 S 1 3— 1 2 E 23由来 3個、 g 7 S 9— 1 1 E 28由来 2 2 個、 g 7 S 9_ l l E 6 2由来 26個） の薬剤耐性コロニーを得た。 上記コロニーのう ち、 染色体供与細胞として g 5 S 1 3 _ 1 2 E 2 3細胞を用いて得た細胞を g 23 H細 胞と、 g 7 S 9— 1 1 E 28細胞を用いて得た細胞を g 28H細胞と、 g 7 S 9— 1 1 E 62細胞を用いて得た細胞を g 6 2H細胞と以下称する。
(1 - 2) PCR解析
h E P O— 1 4 g N Δ q HACベクタ一を保持するか否かを実施例 3 (1— 2) のプ ライマー S V p AN p 1及び N e o R p 2を用いて、ヒ ト染色体を S T Sマ一カー D 2 S 1 3 34のプライマーを用いて Kakeda らの方法 （Kakeda ら、 Gene Therapy; 12： 852-856, 2005 年） に従い P C R増幅により確認した。 また、 染色体供与 CHO細胞の 混入の有無を CHO f u r i n遺伝子特異的プライマー f u r i n 3 ' s u b F及び f u r i n E x 6— 28 Rを用いて PCR増幅により確認した。 方法は上記実施例 5 ( 1 -2) と同様に行った。 h E PO— 14 gNA q.HACベクターを保持する HF L— 1 細胞で染色体供与 CHO細胞の混入が無い場合に、 プライマー SVpANp 1及び N e o R p 2により約 1. 0 k b pの増幅、 D 2 S 1 3 34プライマーにより約 0. 6 k b pの増幅、 f u r i n 3 ' s u b F及び f u r i n E x 6 _ 28 Rによる増幅なし、 が 予想される。 その結果、 上記 （ 1— 1) で得たブラス トサ ジン耐性株 50株から計 6 株 （g 23H l、 2、 3、 g 28H 1 8、 22、 g 62 H 26 ) において予想される增 幅が確認された。
以上より、 上記のブラス トサイジン耐性株 6株が h E PO_ 14 gNA q HACベタ ターを保持する HF L— 1細胞であることが確認された。 '
(1 - 3) サザンプロット解析
hEPO- 1 4 g NA q HACベクターにおいて h E PO発現ュニッ ト構造が正しく 保持されているか否かを調べるために、 上記のブラストサイジン耐性株 6株のうち 4株
(g 23H l、 3、 g 28H 1 8、 g 62 H 26 ) についてサザンブロッ ト解析を行な つた。 方法は、 Kakeda ら （Gene Therapy; 12： 852-856, 2005年） に従った。 代表的な 結果を図 1 9の Cに示す。 塩基配列から予想される Xb a I消化による制限酵素断片長 は、 h E PO発現ユニットを含む 5. 5 k bである。 その結果、 上記 （1— 2) で得た hE PO- 14 gNA q HACベクタ一を保持するブラストサイジン耐性株 3株 （g 2 3H 1、 3、 g 62H 26) において予測されるサイズのバンドを確認した。
(1 -4) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 994) に記され た方法に従い、 ヒ ト 1 4番及び 2 2番染色体特異的 αサテライ ト DNAプローブ
(Q-biogene、 フナコシ） を用いて行った。 ブラス トサイジン耐性株 3株 （g 2 3H l, 3、 g 6 2H26) について解析した結果、 2株 （g 23H 3、 g 6 2 H 26) 力 正 常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて、 宿主細胞由来の 1対のヒ ト 14番及び 22番染色体セントロメァ領域の 4箇所と 1コピーの 1 4 g NA qHACベクタ一由来 の 1箇所にシグナルが検出された。 その結果を図 5 9 A及び Bに示す。
以上 （1— 1) から （1—4) の実験から、 得られたブラストサイジン耐性株 2株は hE PO— 14 gNA qH ACベクターを保持する正常核型の HF L— 1細胞であるこ とが確かめられた。
(2) hE PO— 14 g NA q H A Cベクターを保持する H F L— 1細胞における h E PO遺伝子発現
hE PO遺伝子の発現は、 培養上清中に産生される hE POタンパク質を酵素結合免 疫吸着検定法 （E L I S A法） により定量した。
上記 （1) において単離しサザン解析で h E PO発現ユニッ ト構造を確認した h E P 0- 1 4 g ΝΔ q HACベクターを保持するブラストサイジン耐性 HF L— 1細胞 3株 について、 それぞれ約 1 05細胞をブラス トサイジン （3 / gZm l ) を含む選択培地 (20%FB S、 DMEM) 1 m 1をいれたコラーゲン I コートした 24穴組織培養用 プラスチックシャーレ （ファルコン） に播種した。 コンフレント到達後 7日間培養し、. 新しい培地に置き換え更に 24時間培養した後、 上清を回収及び細胞数を計数した。 h E P Q 'E L I SAキッ 卜 （Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, 腦システム） に より、 培養上清中の h E P Oを定量した。 その結果を図 2 1の 「 1 4 g N— HAC」 の 項目に示す。
以上の結果から、 上記 hE PO— 1 4 g ΝΔ q HACベクターを保持する正常核型の H F L - 1細胞 3株全てにおいて h E POの発現を確認した。 実施例 1 7
hEPO- 14 g ΝΔ q HACベクターのヒ ト正常繊維芽細胞での長期安定性解析
(1) 非選択培養条件下での長期継代培養
hE PO— 1 4 gNA q HACベクターのヒ ト正常繊維芽細胞 HF L_ 1における安 定性を確認するために、 非選択条件下で長期継代培養を行った。 実施例 1 6で得た hE PO_ 1 4 gNA qHACベクタ一を保持する HF L_ 1細胞 3株 （g 23H l、 g 2 3H3、 g 62H26) を使用した。 非選択培養液は 20 % F B Sを含む DME M培地 であり、 選択培養液はこれにブラストサイジン 3 μ g/m 1 を添加した。 h E PO— 1 4 g N Δ q HACベクターを保持する HF L— 1細胞株は：！〜 3 X 1 05細胞をコラー ゲン一 I コートした T一 2 5フラスコ （ファルコン） に播種し、 細胞密度が 90%飽和 程度まで培養し、再び 1 3 X 1 05細胞を播種し 5 1 0継代まで行った。継代毎に細 胞数を計数して集団倍加数を算出した。 また、 5継代前後及び 1 0継代後に細胞を回収 し、 h Ε ΡΟ遺伝子発現解析及び F I SH解析を行った。
(2) 長期継代培養後の hE PO遺伝子の発現
h E PO遺伝子の発現は、 培養上清中に産生される h E POタンパク質を酵素結合免 疫吸着検定法 （E L I SA法） により定量した。
上記 （1) で長期継代培養した hE PO— 1 4 gNA qHACベクタ一を保持する H F L- 1細胞 2株 g 23H 1 g 6 2H26を、，約 1 04細胞にて 20%F B Sを含む DMEM培地 2 m 1をいれたコラーゲン— I コート 24穴又は 48穴組織培養用プラス チックシャーレ （ファルコン) に播種した。 コンフレント到達後 7日間培養し、 新しい 培地に置き換えさらに 24時間培養した後、 上清を回収及び細胞数を計数した。 hE P O E L I SAキット （Quantikine IVD Human EP0 Immunoassay, 励システム） により、 培養上清中の h E POを定量した。 2連で行った実験結果の平均値を図 43に示す。 以上の結果から、 上記 h E PO- 1 4 gNA q H A Cベクターを保持する H F L _ 1 細胞 2株全てにおいて長期継代培養後も h E POの発現を確認した。
以上の実験により、 hE PO— 14 gNA q HACベクターは、 長期継代培養後の H F L— 1細胞において、 h E PO遺伝子の発現が維持されること、 が明らかとなった。 実施例 1 8
e o耐性遺伝子ュニッ ト除去 h E PO— 1 4AA q A n e o—HACベクターの構築 14 Α Δ q— HACベクター上及び ρ LN 1/E POプラスミ ド上の h E PO発現ュ ニット下流に F RT配列を揷入し、 h E PO— 1 4 A Δ q _ H A Cベクタ一上から F R
T/F L P e部位特異的組換えシステムにより N e o耐性遺伝子発現ュニットを除去す る。 その概略を図 60に示す。
(1) 14 ΑΔ qH ACクロ一ユング部位への F RT配列の導入
( 1一 1 ) F RT配列導入用べクタ一 t 1 p S F 1 _F RTの構築
実施例 1で構築した 1 4 ΑΔ qHACのクローニング部位へ FRT配列を揷入するた めに、 ？1 丁配列を含むォリゴ01^八を合成し、 実施例 1 (2— 1) で構築した t i p
S Fベクタ クロ一ユングした。 合成した F RT配列を含むオリゴ DNA配列を以下 に示す： FRT linkers：
GCTAGCGGCCGGCCTGGACTAGTCCA (配列番号 97)
FRT linkerAS:
CGCGTGGCCGGCCTGGACTAGTCCA (配列番号 98)
上記の FRT配列を含むオリゴ DNAをァ二一リングにより 2本鎖化した後、 制限酵 素 F s e Iで力ッ トし、 t 1 p S Fベクタ一 F s e Iサイ トへクローニングした。 最終 的な t 1 p S F 1—FRTコンストラク トのサイズは約 1 3. 5 k bである。 ターゲテ イングベクター、 標的配列、 及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図 6 1に示し た。 . .
(1 - 2) 14 ΑΔ q HAC保持 DT 40細胞への t 1 p S F 1— F RTベクター導入
. t 1 p S F 1— FRTコンストラク トを制限酵素 S r f I (ロシュ） 消化により線状 化し、 長腕遠位を削除した 14 ΑΔ q HACを保持する DT 40雑種細胞にエレク ト口 ポレーシヨンにより導入した。 方法は、 実施例 1 (2— 2) に従って行った。 2〜3週 間後にはブラス トサイジン耐性コロニーが出現した。 1 2 t 9 7 s Fでは、 1回のトラ ンスフエクションから合計 1 2個の薬剤耐性コロニーを、 また 1 2 t l 34 s Fでは 1 回のトランスフヱクションから合計 94個の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、 以 後の解析を行った。
(1— 3) PC R解析
ブラストサイジン耐性株のゲノム DNAを铸型として 5 ' 及び 3 ' 側の 2標的配列の 存在を PC R法により検出した。 2つの標的配列 （図 6 1中、 それぞれ 5 ' g e n om e及び 3' g e n omeで示す） の存在を解析した。 方法は、 実施例 ( 2 _ 3 ) に従 つて行った。
得られたブラストサイジン耐性 DT 40細胞、 1 2 t 9 7 S F由来 1 2株のうち 3株 が、 1 2 t 1 34 S F由来 94株のうち 2株が、 塩基配列から予想されるサイズ （5 ' g e n ome約 5 k b及び 3 ' g e n ome約 2 k b) の増幅産物を与えることを確認 した。
(1 -4) サザンプロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリ一ユングとしてサザンプロッ ト解析を行った。 5 ' 及び 3 ' 側の 2箇所の相同組換え標的配列の存在を実施例 1 (2— 4) の方法に従 つて解析した。 代表的な結果を図 62に示す。 塩基配列から予想される制限酵素断片長 は、 5 ' g e n o m e側解析及び 3 ' g e n o m e側解析ともに相同組換え体で 24. 6 k b、 野生型 （非組換え体） で 1 8. 2 k bである。 ブラス トサイジン耐性候補、 1 2 t 9 7 S F由来 3株のうち 2株 （1 2 t 9 7 S F l、 1 2) 力；、 1 2 t l 34 s F 2 株のうち 2株 （1 2 t l 34 S F 6、 2 1) の相同組換え体を確認した。
以上の （ 1— 1) 〜 （1—4) の実験により、 相同組換えによりクローニング部位に FRT配列が挿入された 1 4 ΑΔ q F— HACベクターを保持する DT 40雑種細胞 1 2 t 9 7 S F 2株 （一 1、 1 2)、 1 2 t l 34 S F 2株 （一 6、 2 1) を取得した。 (2) CHO細胞への 14 ΑΔ q F— HACベクタ一移入
(2— 1) ミクロセル法による 14ΑΔ q F _ H A Cベクターの C H O細胞への移入 染色体供与細胞として、 上記実施例 1 8 (1) で得られた、 長腕遠位を削除してクロ —ニング部位に F RT配列が揷入された 14 ΑΔ q F— HA Cベクターを保持する D T 40雑種細胞 （1 2 t 9 7 s F l、 1 2 t 9 7 s F 1 2、 1 2 t l 34 s F 2 1) を用 いだ。 染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株 CHO K 1 (登録 番号 J CRB 90 1 8) を用いた。 ミクロセル法による 1 4 ΑΔ q F—HACベクタ の CHO細胞への移入は、 実施例 1 (3) に従って行った。
約 2週間の選択培養の後、 出現したブラストサイジン耐性のコロニーを単離し、 以後 の解析を行った。 3株 X 2回の微小核細胞融合から計 36株 （1 2 t 9 7 s F l由来 2 5株、 1 2 t 9 7 s F 1 2由来 3株、 1 2 t l 34 s F 2 1由来 8株） のブラストサイ ジン耐性 CHO株を得た。
( 2 - 2 ) PCR解析
ブラストサイジン耐性 CHO株のゲノム DNAを铸型として、 14AA q F_HAC ベクタ一を保持すること、 及ぴ DT40の混入がないことを確認する目的で、 NEK2 P ( + ), I GH V 3 (-) 及び G g b e t a -a c t i n (―) の存在を PC R法によ り検出した。 方法は、 実施例 1 (1一 3) 及び実施例 6 (5 - 2) に従った。 予測され る検出パターンは、 NEK2 P (十）、 I GHV 3 (-) 及び G g b e t a - a c t i n
(一） である。 得られたブラストサイジン耐性 CHO株 3 6株のうち 3 3株 （1 2 t 9 7 s F l由来 23株、 1 2 t 9 7 s F 1 2由来 3株、 1 2 t 1 34 s F 2 1由来 7株） が、 塩基配列から予想される増幅産物を与えることを確認した。
(2 - 3) サザンプロッ ト解析
移入した 14 ΑΔ q F—HACベクターの構造を確認するためサザンブロット解析を 実施例 1 (2-4) と同様に行った。 代表的な結果を図 6 3に示す。 塩基配列から予想 される制限酵素断片長は、 5 ' g e n ome側解析及び 3 ' g e n ome側解析ともに 相同組換え体で 24. 6 k b、 野生型 （非組換え体） で 1 8. 2 k bである。 ブラス ト サイジン耐性候補 CHO株 2 7株から合計 26株 （1 2 t 9 7 s F l由来 20株、 1 2 t 9 7 s F 1 2由来 2株、 1 2 t 1 34 s F 2 1由来 4株）の相同組換え体を確認した。
(2-4) F I S H解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 994) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 ブラストサイジン耐性 CHO株のうち 1 4株 （l,2 t 9 7 s f l由来 1 1株、 1 2 t 9 7 s F 1 2由来 1株、 1 2 t 1 34 s F 2 1由来 2株） について解析した結果、 計 6株
( 1 2 t 9 7 s F 1由来 5株、 1 2 t 9 7 s F 1 2由来 0株、 1 2 t l 34 s F 2 1由 来 1株） 1S 正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて C o t 1で染まった 1コ ピーの 14 ΑΔ q F— HACベクターが検出された。 代表的な結果を図 64に示す。 以上 （2— 1) から （2_4) の実験から、 得られたブラス トサイジン耐性 CHO株 6株 （ 1 2 t 9 7 s F l— 2、 5、 8、 1 7、 2 1及び 1 2 t l 34 s F 2 1— 2) は N e o耐性遺伝子ュニット除去用 14 ΑΔ q F _ H A Cベクターを保持することを確認 した。 これらのうち、 1 2 t 9 7 s F 1 _ 5及び 1 2 t 1 34 s F 2 1— 2 (以下 F 1 一 5及び F 2 1 - 2と称する） を以下の実験に用いた。
(3) hE PO— 14 ΑΔ q F—HACベクターの構築
( 3 - 1 ) h E PO発現プラスミ ド p LN l— E P Oへの F RT配列の導入
h E PO発現プラスミ ド p LN 1—E PO (Kakedaら、 Gene Therapy; 12： 852-856， 2005年） へ実施例 1 8 ( 1— 1) で用いた F RT配列を含む合成オリゴ DN Aを挿入す る。
上記の F RT配列を含むオリゴ DNA FRT l i n k e r Sと FRT 1 i n k e r ASをァニーリングにより 2本鎖化し制限酵素 S p e Iで消化した後、 p LN 1 E P Oベクタ一から制限酵素 X b a I消化により n e o耐性遺伝子ドライブ用の CMVプロ モ一ターを除去した後の. X b a Iサイ トへクローニングした。 更に上記 n e o耐性遺伝 子ドライブ用 CMVプロモータ一を導入したリンカ一内の Nh e Iサイ トへ再導入した。 最終的な P LN 1— E POFコンストラク トのサイズは約 4. 9 k bである。
(3- 2) 14 A A q F _ H A Cベクタ一への h E P O遺伝子の導入
1 4 ΑΔ q F— HACベクタ一へ F RT配列を含む h E P O遺伝子発現ュニッ トを挿 入する。 1 o x P及び F RT配列を含む h E P O発現プラスミ ド p LN l— E POFを 準備し、 C r e組換え酵素を一過性に発現させることで 1 o x P配列間の部位特異的組 換え反応により人工染色体に挿入する。組換え揷入体の選別は、 G4 1 8耐性の獲得（プ 口モータ一分断型の n e o耐性遺伝子発現ュニッ トの再構成） を指標とした。 その概略 を図 65に示す。 実施例 1 8 (2). で作製した 1 4 ΑΔ q F— HACベクターを保持す る CHO細胞 （F 1— 5及び F 2 1— 2) を用いて、 実施例 3 (1— 1) の方法に従つ て行った。 2〜3週間後には G4 1 8耐性コロニーが出現し、 計 9 2個 （F 1— 5由来 4 5個及び F 2 1— 2由来 4 7個、 以下それぞれ 5 E F及ぴ 2 E F細胞と称する） のコ ロニーを単離して増殖させ、 以後の解析を行った。
(3— 3)+ PCR解析
hEPO遺伝子発現ュニッ ト組換え挿入体の選別は、 1 4 ΑΔ q F HACベクター上 の 1 o X P配列部位に揷入されたか否かを、 1 o X P配列部位を挟むように p LN 1 - E P OFベクタ一上及び 14 A Δ q F HA Cベクタ一上に設計したプライマー S V p A N p 1及び N e o R p 2によって、 また挿入された h E P O遺伝子を、 プラスミ ドべク ター P B S 226上の M 1 3 R V及び N e o R p 2プライマ一によって、 P CR増幅に より確認した。プライマ一配列及び P CRは Kakedaらの方法（Kakedaら、 Gene Therapy; 12： 852-856, 2005 年） に従った。 組換え挿入体の場合は、 プライマ一 SVpANp 1 及び Ne o R p 2により約 1. O k b p、 プライマー M 1 3 R V及び N e o R p 2に より約 2. 7 k b pの増幅が予想される。 その結果、 上記 （3— 2) で得た G 4 1 8耐 性 CHO雑種細胞から計 5 1株 （5 EF細胞 23株、 2 EF細胞 28株） において予想 される増幅が確認された。 以上より、 上記の G4 1 8耐性 CHO雑種細胞計 5 1株が 1 o X P配列への h E PO遺伝子発現ュニッ ト組換え揷入体であることを確認した。
(3— 4) サザンブロット解析
hE PO- 1 4AA q F— H A Cベクターにおいて h E P O発現ュニッ ト構造が正し く保持されているか否かを調べるために、 サザンプロッ ト解析を行なった。 方法は、 Kakedaち （Gene Therapy; 12： 852-856， 2005年） に従った。 代表的な結果を図 6 6に 示す。 塩基配列から予想される X b a I消化による制限酵素断片長は、 h E PO発現ュ ニッ トを含む 5. 5 k bである。 上記 （3— 2) で得た G 4 1 8耐性候補 CHO雑種細 胞 6 5株から合計 2 3株 （5 EF細胞 8株、 2 EF細胞 1 5株） において予測されるサ ィズのバンドを確認した。
(3 - 5) F I S H解析 F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 994) に記され た方法に従い、 ヒ小特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 上記 （3— 4) で得た G 418耐性 CHO雑種細胞のうち 16株 （F 1— 5由来 5株、 F 21—2由来 1 1株） について解析した。 その結果、 計 2株 （5 E F_ 1、 2EF— 36) において、 観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつ C o t 1で染まった 1コピーの hEPO— 14 ΑΔ q HACベクターを検出した。 代表的な結果を図 67 A 及び Bに示す。
以上 （3— 1 ) から （3— 5) の実験かち、 得られた G 418耐性 2株は、 hEPO - 14 ΑΔ q F— HACベクターを保持する正常核型の CHO細胞であることを確認し た。
(4) hEPO— 14AA q F— H A Cベクタ一の C H O細胞での h E P O遺伝子発現 h E PO遺伝子の発現は、 培養上清中に産生される h E POタンパク質を酵素結合免 疫吸着検定法 （EL I SA法） により定量した。
上記 1 ) において単離した h E PO- 14AA q F HACベクターを保持する G 41 8耐性 CHO雑種細胞 2株 （5 EF_ 1、 2EF— 36) を、 約 105細胞を 10 %F B S添加した 0. 8mgZm 1の G418を含む F 12培地 2m 1をいれた 12穴組織 培養用プラスチックシャーレ （ファルコン） に播種した。 コンフレント到達後、 10% FB Sを添加した F 12培地 2 m 1に置き換え 23間培養し、 10%FB Sを添加した F 12培地 lm 1に置き換えさらに 24時間培養した後、 上清を回収及び細胞数を計数 した。 hEPO EL I SAキッ卜 (Quantikine IVD Human EP0 Immunoassay, R&D.シス テム） により、 培養上清中の h E POを定量した。 2連で行った実験結果の平均値を表 7に示す。 表 7
Figure imgf000131_0001
以上の結果から、 上記 hE PO- 14 ΑΔ q FHACベクターを保持する G 418耐 性 CHO雑種細胞 4株全てにおいて h E POの発現を確認した。
(5) hEPO— 14AA q F _ H A Cベクターからの N e o耐性遺伝子ュニット除去 (5— 1) FLP e発現ベクター pOG44 FLP eの構築 P 0G44ベクタ一 （インビトロジェン) 上の F L P遺伝子配列を F L P e遺伝子配 列 （Buchholz, F.ら、 Nature Biotech. (USA) , 第 1 6卷、 ρ657-662) へ L 33 S、 L 70 F、 Y 1 08N、 S 294 Pの 4箇所に P CR法により変異を導入して改変した。 まず F L P (D4、 L 70) →F L P w t (D4G、 L 70 F) を作製し、 続いて F L P (D4、 L 70) と F L Pw t (G4、 F 70) 両方を用いて F L P e (D 4 · F 7 0/L 33 S, Y 1 08N、 S 294 P) を作製した。 P CRは、 L A T a qポリメラ ーゼ （宝酒造） を用い、 反応条件は、 94°C 1分の後、 変性 98 °C 30秒、 ァニ一リン グ 60 °C 30秒、 伸長 72 °C 30秒を 3 5サイクルで行った。
ァミノ酸配列置換 D 4 G及び L 70 Fのため、 ，塩基配列置換 A 14 G及び G 2 1 0 C を pOG44ベクターを铸型として行った。 P CR法により行った用いたオリゴヌクレ ォチドプライマ一の配列を以下に示す：
FLPFw (A14G)Ps： 5' - AACTGCAGCCCAAGCTTCCACCATGCCACAATTTGG (配列番号 99) FLPRv (G210C)Ps： 5' -AACTGCAGTGACTTGTTGACAATATCGAAACTCAGC (配列番号 1 00) p OG44ベクターから P s t I消化により F L P遺伝子配列を切り出した後、 P s t I消化した上記 PCR増幅断片に入れ替えた （p OG44_F L Pw t (D4G、 L 70 F))。
次にァミノ酸配列置換 S 294 Pのため塩基配列置換 T 880 Cを pOG44べクタ 一を铸型 ί:して PCR法により行った。 用いたオリゴヌクレオ^ドプライマ一の配列を 以下に示す：
FLPFw (T880C)Hd： 5' - CAAAGCTTTGAAGAAAAATGCGCCTTATCC (配列番号 1 0 1)
FLPRv Ns ： 5' - GATCATATGCATAGTACCGAGAAACTAGTG (配列番号 1 02) p OG 44ベクターから E c o R V-N s i I領域を除去した後、 p OG 44ベタタ 一由来の DN A断片 （E c o RV— H i n d i I I ： 0. 5 k b) と H i n d i I I及 び N s i I消化した上記 P CR増幅断片をクローニングした（p OG44 _F L P e (D 4 · S 294 P)。
更にァミノ酸配列置換 L 3 3 S及び Y 1 08 Nのため塩基配列置換 T 1 09 C及び T 32 2 Aを PCR法により行った。 用いたオリゴヌクレオチドプライマ一の配列を以下 に示す：
FLPFw (T109C) ： 5' - GACCTTCAGGTGAGAAAATAGCATCATGTG (配列番号 1 03)
FLPRv (T322A) Ev： 5' - GTGATATCAGATTGATGTTTTTGTCCATTG (配列番号 1 04)
FLPFw (33-81) Bs36： 5' -ACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGGAAAGGTTTGAAAGACCTTCA (配列 番号 1 05)
上記 p OG44— F L P w t (D4 G、 L 70 F) ベクターを铸型として、 .プライマ — F L PFw (T 1 09 C) — F LPRv (T 3 22 A) E vを用いて P C Rにより塩 基置換を行い、 更に.この PC R産物を铸型にしてプライマー F LP Fw (3 3-8 1) B s 36— F L PRv (T 322 A) E vを用いて 5 '末端に制限酵素 B s u 36 Iサ ィ トを付加した。増幅した DN A断片を制限酵素 B s u 3 6 I及び E c o RVで消化し、 p OG44— F L P e (D 4 · S 294 P) ベクタ一の B s u 36 I— E c o R V領域 と入れ替えた （pOG44— F LP e (D4 ' F 70/L 3 3 S、 Y 1 08N、 S 29 4 P)。 以上により p OG 44 F L P eを取得した。
(5- 2) F LP eによる N e o耐性遺伝子ユニット除去
上記実施例 2 3 (3) で作製した h E PO_ 1 4 ΑΔ q F— HACベクタ一を保持す る CHO細胞中で F L P e組換え酵素を一過性に発現させることで FRT配列間の部位 特異的組換え反応により人工染色体から N e o耐性遺伝子ュニッ トを切出し除去する。 組換え挿入体の選別は、 N e o耐性遺伝子ュニットの欠失を指標とした。 ·
実施例 1 8 (3) で作製した h E PO— 1 4 ΑΔ q F— HACベクターを保持する C HO細胞 （ 5 E F_ 1及び 2 1 E F— 36) をトリプシン処理し、 5 X 1 06細胞を 0. 8 m lのハンクス平衡塩溶液 （HB S S) に懸濁した。 20〜： L 00 μ gの F L P e酵 素発現ベクター p OG 44 F L P e存在下でジーンパルサー I I (バイオラッド） を用 いてエレク トロポレーションを行った。 容量 500 μ Fのコンデンサに 4 50 Vで印加 し、 電極間距離 4mmのエレク トロポレーシヨンセルを用いて放電した。 エレク トロポ レーシヨンした細胞を 1 0 %FB Sを添加した F 1 2培地 （インビトロジェン製） を含 む 96穴組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン） 8枚（ 1細胞/ゥエルで 4枚、 0. 1細胞 ウエルで 4枚） に播種した。 2〜3週間後ブラス トサイジン耐性コロニー が出現し、 計 1 4 9個 （5 EF— 1由来 82個、 2 1 EF— 36由来 6 7個） のコロニ 一を単離して、 以後の解析を行った。
(5— 3) PCR解析
hE PO- 14 ΑΔ q F— H A Cベクター上から N e o耐性遺伝子ュニッ ト除去され ているか否かを調べるため、 p LN 1—EPOFベクター上及び相同組換え領域上にプ ライマーを設計し （図 6 8) PCR増幅により確認した。 オリゴヌクレオチドプライマ 一配列を以下に示す：
SV40 polyA Npl (SvpANpl) ： 5' -CGGGATCCCTCGAGCGAGACATGATAAGATACATTGATG (配列番 号 1 06 )
AL39 54169R： 5 ' -GATTTTCCACATACGTTCCCAAGCCACTCC (配列番号 1 0 7)
T a qポリメラ一ゼは LA T a q (宝酒造） を用い、 反応条件は、 94°C 1分の後、 変性 98°C5秒、 ァニーリング Z伸長 72°C4. 5分を 3サイクル、 変性 98°C5秒、 アニーリング/伸長 70°C4. 5分を 2サイクル、 変性 98°C5秒、 アニーリング Z伸 長 6 8°C4. 5分を 2 5サイクル、 伸長 7 2°C 1 0分で行った。 N e o耐性遺伝子ュニ ッ ト除去がされている場合は、プライマー S V p AN p 1及び AL 39 54 1 6 9 Fに より約 0. 4 k b pの増幅が予想される。 その結果、 上記 （5— 2) で得た B s d耐性 CHO雑種細胞から計 66株 （5 EF— l由来3,4株、 2 1 E F _ 36由来 32株） に おいて予想される増幅が確認された。 以上より、 上記の B s d耐性 CHO雑種細胞計.6 6株が Ne o耐性遺伝子ュニット除去されていることが確認された。
(5-4) サザンブロット解析
■ h EPO- 1 4AA q F— H A Cベクター上から N e o耐性遺伝子ュニット除去され ているか否かを調べるために、サザンブロッ ト解析を行なった。方法は、 Kakedaら （Gene Therapy; 12： 852-856， 2005年） に従った。 代表的な結果を図 6 9に示す。 塩基配列か ら予想される E c o R I消化による制限酵素断片長は、 N e o耐性遺伝子ュニッ トが除 去され h E PO発現ユニットのみの場合 3. 8 k b、 N e o耐性遺伝子ユニッ ト及び h E PO発現ユニット両方を含む場合 6. 6 k bである。 上記実施例 23 (5-2) で得 た候補 CHO雑種細胞 66株（5 EF— 1由来 34株、 2 1 EF— 2由来 32株）から、 合計 36株 （5 E F_ 1由来 1 8株、 2 EF— 2由来 1 8株） において予測されるサイ ズのバンドを検出した。 以上より、 上記 CHO雑種細胞 36株において、 N e o耐性遺 伝子ュニッ ト除去を確認した。 N e o耐性遺伝子ュニットが除去された h E PO_ 1 4 A Δ q F— HACベクタ一を以下 h E PO— l 4AA q A n e o—HACベクタ一と称 する。
(5— 5) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 9 94) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 上記 （5— 3) で得た候補 CHO雑種細胞のうち 5 E F— 1由来の 8株について解析し た。 その結果、 計 2株 （5 EF 1 A 3 8、 5 E F 1 Δ 6 3) において、 観察した分裂像 のほとんどにおいて正常核型かつ C o t 1で染まった 1コピーの h E PO— 14A厶 q 厶 n e o— HACベクターを検出した。 代表的な F I SH像及び h E PO— 1 4A厶 q 厶 n e ο— HACベクターの核型をそれぞれ図 70 A及び Bに示す。
以上 （5— 1) から （5— 5) の実験から、 得られた上記 CHO雑種細胞 2株は、 h E PO- 1 4 ΑΔ q Δ n e ο— Η A Cベクターを保持する正常核型の C Η Ο雑種細胞で あることを確認した。
(6) N e o耐性遺伝子ュニット除去 h E PO- 1 4 ΑΔ q Δ n e o— HACベクター の CHO細胞での h E PO遺伝子発現
h E PO遺伝子の発現は、 培養上清中に産生される h E POタンパク質を酵素結合免 疫吸着検定法 （E L I S A法） により定量した。
上記実施例 2 3 (5) において単離した hEP,0— 14 ΑΔ q Δ n e oHACベクタ 一を保持する CHO雑種細胞 2株 （5 EF 1 A 3 8、 5 E F 1 Δ 6 3 ) を、 約 1 05細 胞を 1 0%FB S添加した 0. 8mg m 1の G4 1 8を含む F 1 2培地 2 m 1をいれ た 1 2穴組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン） に播種した。 コンフレント到 達後、 1 0%FB Sを添加した F 1 2培地 2 m 1に置き換え 2日間培養し、 1 0%F B Sを添加した F 1 2培地 1 m 1に置き換えさらに 24時間培養した後、 上清を回収及び 細胞数を計数した o h E P O EL I SAキッ 卜（Q腿 tikine IVD H丽 n EP0 Immunoassay, R&D システム） により、 '培養上清中の h E POを定量した。 2連で行った実験結果の平 均値を表 8に示す。
表 8
Figure imgf000135_0001
以上の結果から、 上記 h E PO- 1 4AA q A n e o H A Cベクターを保持する C H O雑種細胞 2株において h E POの発現を確認した。 実施例 1 9
N e o耐性遺伝子ュニッ ト除去 h E PO- 14AA q A n e o HACベクタ一のヒ ト正 常繊維芽細胞での h E P O遺伝子発現
(1) hE PO- 1 4AA q A n e o HACベクター移入ヒ ト正常繊維芽細胞の作製 ( 1— 1) ミクロセル法による h E PO— 1 4 ΑΔ q HACベクタ一のヒ ト正常繊維芽 細胞 HF L— 1への移入.
染色体供与細胞として、 実施例 1 8で得られた h E PO— 1 4AA q A n e oHAC ベクターを保持する C HO雑種細胞株 5 EF 1 Δ 38及び 5 EF 1 Δ 6 3を用いた。 染 色体受容細胞としては、 ヒ ト正常繊維芽細胞 HF L— 1 (理化学研究所細胞材料開発室 より入手、 登録番号 RCB 052 1) を用いた。 方法は、 実施例 5 ( 1 - 1) に従った。 約 2〜4週間の選択培養を行い、 出現したブラストサイジン耐性のコロニーを単離し、 以後の解析を行った。 6回の微小核細胞融合 （5 EF 1 A 38で 2回、 5 EF 1 A 6 3 で 4回） から 5 6個の薬剤而ォ性コロニー （ 5 E F 1 Δ 38から 8クロ一ン、 5 EF 1 厶 6 3から 4 8クローン） を得た。 上記コロニーのうち、 染色体供与細胞として 5 EF 1 厶 3 8及び 5 E F 1 Δ 6 3を用いて得た細胞をそれぞれ以下 t Δ 38 H細胞及び t厶 6 3H細胞と称する。 ，
(1— 2) PCR解析
h E PO- 14ΑΔ ς Δ η β ο H A Cベクタ一を保持するか否かを実施例 3 ( 1 - 2) のプライマ一 SVpANp 1及び N e o R p 2を用いて、ヒ ト染色体を S T Sマーカー D 2 S 1 3 34のプライマーを用いて Kakedaらの方法 （Kakedaら、 Gene Therapy; 12: 852-856, 2005 年） に従い P C R増幅により確認した。 また、 染色体供与 CHO細胞の 混入の有無を CHO f u r i n遺伝子特異的プライマー f u r i n 3 ' s u b F及び £ u r i nE x 6— 28 Rを用いて PCR増幅により確認した。 設計したプライマー配列 を以下に示す：
furin3， subF： 5' - ACTCAGAGATCCACTGCACCAGGATCCAAGGGAGG (配列番号 1 08 ) furinEx6-28R： 5' - CCGCTCGAGCGGCTACACCACAGACACCATTGTTGGCTACTGCTGCC (配列番号 1 09)
反応条件は、 94 °C 5分の後、 変性 94 °C 20秒、 アニーリング Z伸長 6 8 °C 3分間 を 3 2サイクル行った。 hE PO— 1 4AA q A n e o H A Cベクタ一を保持する H F L一 1細胞で染色体供与 CHO細胞の混入が無い場合に、 プライマー S Vp ANp 1及 び N e o 尺 2にょり約 1. O k b pの増幅、 D 2 S 1 3 34プライマ一により約 0. 6 k b pの増幅、 f u r i n 3 ' s u b F及び f u r i n E x 6— 28 Rによる増幅な し、 が予想される。 その結果、 上記 （ 1— 1) で得たブラス トサイジンン耐性株 56株 から計 3 9株 （ t Δ 38 H4株、 t Δ 6 3 H 35株） において予想される予測されるサ ィズのバンドを確認した。
以上より、 上記のブラストサイジンン耐性株 39株が h E PO— 14AA q A n e o HA Cベクターを保持する HF L- 1細胞であることが確認された。
(1— 3) サザンブロッ ト解析 hE PO— 1 4AA q A n e o HA Cベクタ一において h E PO発現ュニッ ト構造が 正しく保持されているか否かを調べるために、 上記のブラストサイジンン耐性株 39株 のうち 3.1株 （ t A 38H ; 3株、 ΐ Δ 6 3Η ; 28株） についてサザンブロット解析 を行なった。 方法は、 Kakeda ら （Gene Therapy; 12: 852-856, 2005年） に従った。 代 表的な結果を図 7 1に示す。 塩基配列から予想される Xb a I消化による制限酵素断片 長は、 h E PO発現ユニットを含む 5. 5 k bである。 その結果、 上記 （ 1— 2) で得 た hE PO— 1 4AA q A n e o H A Cベクターを保持するブラストサイジンン耐性株 28株 （ t A 3 8H ; 3株、 ΐ Δ 6 3Η ; 25株） 予測されるサイズのバンドを確認し た。
(1 -4) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 9 94) に記され た方法に従い、 ヒ ト 1 4番及び 2 2番染色体特異的 αサテライ ト DNAプローブ
(Q-biogene, フナコシ） を用いて行った。 上記 （1— 3) で得たブラス トサイジン耐性 株のうち 8株について解析した結果、 計 8株が、 正常核型かつ観察した分裂像のほとん どにおいて、 宿主細胞由来の 1対のヒ ト 1 4番及び 22番染色体セントロメァ領域の 4 箇所と 1コピーの 1 4AA q A n e o HACベクター由来の 1箇所にシグナルが検出さ れた。 その結果を図 7 2 A及び Bに示す。
以上 （1— 1) から （ 1—4) の実験から、 得られたブラス トサイジン耐性株 8株は hE PO— 14AA q A n e o HACベクターを保持する正常核型の H F L— 1細胞で あることが確かめられた。 -
(2) N e o耐性遺伝子ュニット除去 hE PO— 1 4AA q A n e o HACベクターの H F L— 1細胞での h E P O遺伝子発現
hEPO遺伝子の発現は、 培養上清中に産生される- hE POタンパク質を酵素結合免 疫吸着検定法 （E L I SA法） により定量した。
上記 （1) で長期継代培養した hE PO— 1 4 ΑΔ qHACベクターを保持する HF L - 1細胞 29株 （ t A 38H4株、 t A 6 3H28株） を、 約 1 04細胞にて 20 % FB Sを含む DMEM培地 l m 1 をいれたコラーゲン一 I コート 24穴組織培養用プラ スチックシャーレ （ファルコン） に播種した。 コンフレント到達後 7日間培養し、 新し い培地 lm 1に置き換えさらに 24時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。 hE PO E L I S'Aキッ ト （Quantikine . IVD Human EP0 Immunoassay, R&Dシステム） により、 培養上清中の h E POを定量した。 2連で行った実験結果の平均値を図 2 1の 「14AA n e o— HAC」 の項目に示す。
以上の結果から、 上記 h E PO— 1 4AA q A n e o H A Cベクターを保持する H F L— 1細胞 29株 （ ΐ Δ 3 8Η 3株、 t A 6 3H26株） おいて h E P Oの発現を確認 した。. 実施例 20
hE PO_ 14AA q A n e o H ACベクターのヒ ト正常繊維芽細胞での長期 E P O発 現解析
(1) 非選択培養条件下での長期継代培養 .
hE PO— 1 4AA q A n e oHACベクターのヒ ト正常繊維芽細胞 HF L— 1にお ける安定性を確認するために、 非選択条件下で長期継代培養を行った。 実施例 23で得 た hE PO— 14AA q A n e o H A Cベクターを保持する H F L— 1細胞 1 1株 （ t Δ 38Η3株、 ΐ Δ 6 3Η8株） を使甩した。 非選^培養液は 20 % F B Sを含む DM EM培地であり、 選択培養液はこれにブラス卜サイジン 3 / gZm 1を添加した。 h E PO— 14AA q A n e o H A Cベクターを保持する H F L— 1細胞株は 1〜 3 X 1 0 5細胞をコラーゲン一 I コートした T一 25フラスコ （ファルコン） に播種し、 細胞密 度が 90%飽和程度まで培養し、 再ぴ 1〜3 X 1 05細胞を播種し 1 0継代まで行った。 継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。 また、 5継代前後及び 1 0継代後に 細胞を回収し、 h Ε ΡΟ遺伝子発現解析及び F I SH解析を行った。
(2) 長期継代培養後の hE PO遺伝子の発現
h E PO遺伝子の発現は、 培養上清中に産生される h E POタンパク質を酵素結合免 疫吸着検定法 （E L I SA法） により定量した。
上記 （1) で長期継代培養した hEPO— 14 ΑΔ qHACベクタ一を保持する HF L - 1細胞 9株を、 約 1 04細胞にて 20%F B Sを含む DMEM培地 1 m 1 をいれた コラーゲン一 I コート 24穴組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン） に播種し た。 コンフレント到達後 7日間培養し、 新しい培地 1 m 1に置き換えさらに 24時間培 養した後、 上清を回収及び細胞数を計数した。 hE PO E L I SAキット （Quantikine IVD Human EP0 Immunoassay, R&Dシステム） により、 培養上清中の h E P Oを定量した。 2連で行った実験結果の平均値を図 43の 「14AA n e o」 の項目に示す。
以上の結果から、 上記 h E PO— 1 4AA q A n e o H A Cベクターを保持する H F L _ 1細胞 8株において長期継代培養後も h E P Oの発現を確認した。 以上の実験により、 h E PO— l 4AA q A n e o HACベクターは、 長期継代培養 後の HF L— 1細胞において、 非選択培養条件で安定に保持されること、 細胞あたりの コピー数が維持されること、 h E PO遺伝子の発現が維持されること、 が明らかとなつ た。 ， 実施例 2 1
e o耐性遺伝子ュニット除去 1 4ΝΔ q HACベクタ一の構築
( 1 ) 1 4 ΝΔ qHACクローニング部位への FRT配列の導入
(1— 1) FRT配列導入用ベクター Gn p S F,l—FRTの構築
実施例 1 8で構築した t 1 p S F 1— F RTベクターを S c a I— E c o RV消化し FRT配列を含む 7. 4 k bのDNA断片へ、 実施例 6で構築した p S F 1 (G + n l) ベクタ一を S c a l— B g l l l— E c o RV消化して得た S c a I— B g 1 I I 7. O k bと B g l l l— E c o RV 0. 55 k bの D N A断片を導入して F R T配列を含 む Gn p S F I— FRTベクタ一を作製した。 概略を図 7 3に示す。 最終的な Gn p S F l—FRTコンス トラク トのサイズは約 1 5. O k bである。 ターゲテイングべクタ 一、標的配列、 及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図 34 Aに示した。
(1— 2) 14 N Δ q HAC保持 DT 40細胞への G n p S F I (FRT) ベクター導 入
Gn p S F l (FRT) コンス トラク トを制限酵素 S r f Γ (ロシュ） 消化により線 状化し、 長腕遠位を削除した 1 4ΝΔ qHACを保持する DT 40雑種細胞にエレク ト 口ポレーシヨンにより導入した。 方法は、 実施例 1 (2— 2) に従って行った。 2〜3 週間後にはブラストサイジン耐性コロニーが出現した。 G4 n 6 A p 25では、 2回の 小ランスフエクションから合計 240個の薬剤耐性コロニーを単離して、 以後の解析を 行った。
(1 - 3) PCR解析
ブラストサイジン耐性株のゲノム DN Aを铸型として 5 ' 及び 3 ' 側の 2標的配列の 存在を PC R法により検出した。 2つの標的配列 （図 34 A中、 それぞれ 5 ' g e n o m e及び 3 ' g e n om eで示す） の存在を解析した。 方法は、 実施例 7 (4- 3) に 従って行った。
得られたブラストサイジン耐性 DT 40細胞、 G4 n 6 A p 25 s F 96株のうち 5 2株が、 配列から予想されるサイズ （5' g e n ome約 5 k b及び 3 ' g e n ome 約 2 k' b) の増幅産物を与えることを確認した。
(1 -4) サザンプロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリ一二ングとしてサザンプロッ ト解析を行った。 5 ' 及び 3 ' 側の 2箇所の相同組換え標的配列の存在を実施例 1 (2— 4) の方法に従 つて解析した。 代表的な結果を図 74に示す。
塩基配列から予想される制限酵素断片長は、 5' g e n om e側解析では相同組換え 体で 1 9. 8 k b、 野生型 （非組換え体） で 7. 6 k b、 3 ' g e n ome側解析では 相同組換え体で 1 9. 8 k b、 野生型 （非組換え体） で 8. 8 k bである。 ブラストサ ィジン耐性候補、 G4 n 6 A p 25 s F 1 8株のうち 1 6株の相同組換え体を確認した。 以上の （1— 1) 〜 （1—4) の実験により、 相同組換えによりクローニング部位に FRT配列が揷入された 1 4ΝΔ q F— H A Cベクターを保持する D T 40雑種細胞 G 4 n 6 A p 2 5 s F 1 6株を取得した。 実施例 22
N e o耐性遺伝子ュニット除去 14 βΝΔ q H ACベクタ一の構築
(1) 14 gNA qHACクローニング部位への F R T配列の導入
(1— 1) FRT配列導入用べクタ一g n p SF—FRTの構築
実施例 1 8で構築した t 1 p S F 1— FRTベクターを S c a I _E c o RV消化し FRT配列を含む 7. 4 k bのDNA断片へ、 実施例 6で構築した p S F 1 (g + n l) ベクタ一を S c a I及び H i n d I I I及び E c o RV消化して得た S c a I— H i n d I I I 5. 4 k bと H i n d l l l—E c o RV O. 45 k bの DNA断片を導入 して FRT配列を含む g n p S F I— F R Tベクターを作製した。概略を図 75に示す。 最終的な g n p S F 1— FRTコンス トラク トのサイズは約 1 3. 3 k bである。 ター ゲティングベクター、 標的配列、 及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図 34 B に示した。
(1 - 2) 14 N Δ q HAC保持 DT 40細胞への g n p S F (FRT) ベクター導入 g n p S F l (FRT) コンス トラク トを制限酵素 S r f I (ロシュ） 消化により線 状化し、 長腕遠位を削除した 1 4 ΝΔ qHACを保持する DT 40雑種細胞にエレク ト ロボレ一シヨンにより導入した。 方法は、 実施例 1 (2— 2) に従って行った。 2〜3 週間後にはブラストサイジン耐性コロニーが出現した。 g 5 n 7 A c 3では、 2回のト ランスフエクシヨンから合計 1 1 6個の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、 以後の 解析を行った。
(1 - 3) PCR解析
ブラス トサイジン耐性株のゲノム DNAを铸型として 5 ' 及び 3 ' 側の 2標的配列の 存在を P CR法により検出した。 2つの標的配列 （図 34 B中、 それぞれ 5 ' g e n o me及び 3 ' g e n omeで示す) の存在を解析した。 方法は、 実施例 7 (4— 3) に 従って TTつた。
得られたブラストサイジン耐性 DT 40細胞、 g 5 n 7 A c 3 s F 1 1 6株のうち 5 4株が、 配列から予想されるサイズ （5 ' g e n ome約 5 k b及び 3 ' g e n ome 約 2 k b) の増幅産物を与えることを確認した。 ，
(1— 4) サザンプロッ ト解析
相同組換え体を選別するためのス.クリ一ニングとしてサザンブロット解析を行った。 5 ' 及び 3' 側の 2箇所の相同組換え標的配列の存在を実施例 1 (2— 4) の方法に従 つて解析した。 代表的な結果を図 76に示す。 '
. 塩基配列から予想される制限酵素断片長は、 5' g e n o me側解析では相同組換え 体で 1 1. 8 k b、 野生型 （非組換え体） で 4. 6 k b、 3 ' g e n ome側解析では 相同祖換え体で 1 5. 6 k b、 野生型 （非組換え体） で 8. 8 k bである。 ブラス トサ ィジン耐性候補、 g 5 n 7 A c 3 s F 36株のうち 4株の相同組換え体を確認した。 以上の （1— 1) 〜 （1— 4) の実験により、 相同組換えによりクローニング部位に FRT配列が挿入された 14ΝΔ q F— H A Cベクターを保持する D T 40雑種細胞 g 5 n 7 A c 3 s F 4株を取得した。 実施例 23
ヒ ト 2 1番染色体長腕遠位の削除による 2 1 HAC (2 1 ΑΔ q HAC) ベクターの作 製
(1) H ACベクタ一におけるヒ ト 2 1番染色体の長腕近位へのクロ一ユング部位 （H PRT再構築型） の導入
(1— 1) 1 o X P及び 5 ' HPRT配列揷入用 k kベクターの構築
ヒ ト 2 1番染色体の長腕近位に 1 o X P配列を挿入するための基本プラスミ ドには V 9 0 1 (L e x i c o n g e n e t i c s) を用いた。 1 o x P揷入部位であるヒ ト 2 1番染色体近位の t>NA配列は G e n B a n kデータベースより得た （AP 00 1 6 5 7)。相同組換えの 2つの標的配列の増幅に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列 を以下に示す：
# 2 1 CEN< 1 > 1 L ： acctggaatttcctaccatcccccataa (配歹 IJ番号 1 1 0 )
# 2 1し 丄 1 R ： atctctccagagggacagcatcataccc 目己歹 ij番"^ 1 1 1)
# 2 1 C E N< 2 > 1 L ： cctgcaagttatgaccactggggatttt (酉己歹 lj番号 1 1 2)
# 2 1 CENく 2 > 1 R ： ctgcagtgagccgagatcataccactgt (配列番号 1 1 3)
MC 1—TK配列を、 V 8 30 (L e x i c o n g e n e t i c s) から R s r l I (NEB) により切り出し、 V90 1プラスミ ドの制限酵素 H i n d I I Iの認識部 位にクローニングした （V90 1 T_ 1)。 次にヒ ト 2 1番染色体を保持するマウス Α9. 雑種細胞（Α 9く 2 1— 2 >、 S h i n o h a r a ら， Hum Mo 1 G e n e t, 1 0 : 1 1 6 3， 200 1年） を培養し、 細胞から P u r e g e n e DNA I s o l a t i o n k i t (G e n t r a S y s t e m社） を用いてゲノム DNAを 抽出した。 このゲノム DNAを铸型とし、 上記のプライマーを用いて組換えの標的配列 を PCR法により増幅した。 反応条件は 9 5 °C 2分の後、 変性 95 °C 1 5秒、 ァニ一リ ング 68 °C 4分を 30サイクル行った。 配列番号 1 1 0— 1 1 1で増幅した D N A断片 (相同領域 1) を制限酵素 E c o R I (二ツボンジーン） と B g l I I (二ッポンジ一 ン） で、 配列番号 1 1 2— 1 1 3で増幅した DN A断片 （相同領域 2) を Xh o I I (プ 口メガ） で消化して、 ァガロースゲルにより分離し精製後、 V 90 1プラスミ ドの E c o R I と B amH Iないし B g l I Iサイ トにクローニングした。 さらに V 90 1プラ スミ ドの A s c I と K p n Iサイ トに A s c l と Kp n lにより切り出した 5 ' HPR Τ- 1 ο X Ρ—ハイグロマイシン （h y g r o m y s i n) をクローニングした。 5 ' HPRT— 1 o X P—ハイグロマイシンは V 820 (L e x i c o n g e n e t i c s ) の X b a Iサイ トにオリゴ合成した 1 o X P配列と PGKハイグロマイシン （h y g r o) 配列 （L y o n s I博士から分与） をクローニングすることで作製した。 最 終的な 1 o x P挿入コンス トラク トのサイズは 1 3. 5 k bである （k kベクターとす る）。 ターグティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを 図 78に示す。
(1 - 2) ヒ ト 2 1番染色体を保持する DT 40細胞への k kベクタ一導入
ヒ ト 2 1番染色体を保持する DT 40雑種細胞は、 同染色体を保持する上記 A 9 < 2 1 一 2〉細胞を染色体供与細胞としてミクロセル法により調製した。 染色体受容細胞であ る DT40は J a jp a n e s e C o l l e c t i o n o f R e s e a r c h B i o r e s o u r c e s ( J CRB) に登録番号 J CRB 2 2 2 1 として登録されてお り、 入手可能である。 以下に調製法の概略を記す。
はじめに約 1 X 1 08個の A 9 < 2 1 - 2 >細胞からミクロセルを調製した。 25 cm 2遠心用フラスコ （ヌンク） 1 2本に細胞密度が〜 80%飽和程度まで培養した A 9 < 2 1— 2 >細胞をコルセミ ド （0. 0 75 /X gZm 1， デメコルシン， 和光純薬） を含 む培養液 （20% ゥシ胎仔血清.； F B S, 0. 8 m g/m 1 G 4 1 8 , DM EM) 中で 48時間培養して微小核を誘導した。 本実施例において、 DMEMは二ッスィ製薬 製のものを用いた。 培地を除いた後、 予め保温 （34°C) しておいたサイ トカラシン B (DMEM中に 1 0 / gZm 1 , シグマ） 溶液を遠心用フラスコに満たし、 34°C， 8 000 r p m, 1時間の遠心を行った。 ミクロセルを無血清培地 （DMEM) に懸濁し て回収し、 ポアサイズ 8 μιη、 5 /zm、 3 / mのフィルター （ワッ トマン） を装着した SW I NNEX- 25 (ミ リポア） を用いて濾過精製した。 精製したミクロセルは DM EM6m lに再懸濁した。 DT40細胞は、 1 0%FB S、 1 % C S , 0. 1 mM 2 — MEを含む R PM 1 1 640培養液にて培養後、 DMEMで 2回洗浄し、 1 X 1 07 個を DMEM5 m 1に再懸濁した。 ミクロセル懸濁液を室温， 1 500 r p m， 5分間 遠心し、 これに DT40細胞懸濁液を重層後、 室温， 1 500 r pm， 5分間遠心し上 清を取り除いた。 ポリエチレングリコール （PEG) 1 : 1. 4溶液 （T om i z u k a ら， Na t u r e G e n e t. (USA), 第 1 6卷， p. 1 3 3— 143, 1 99 7年） で 90秒間融合処理した。 融合細胞を 60 m' 1の 1 0 % F B S、 1 %ニヮ トリ血 清 （C h S), 0. 1 mM 2 _メルカプトエタノール （ME) を含む R PM I 1 640 培養液 . (インビトロジヱン製） に懸濁し、 96穴プレートの 6枚に播いて 24時間培養 した後、 1. 5mgZm 1の G4 1 8を含む培地で約 2週間選択培養した。 2回のミク ロセル融合実験から出現した薬剤耐性のコロニーを単離した。 PCR解析によりヒ ト 2 1番染色体上に存在する領域 CBR， AP P, TTC 3, PC P 4の存在を確認し、 更にヒ ト特異的プローブ C o t 1 (ギブコ B R L) を用いた蛍光 i n s i t uハイブ リダイゼーション （F I SH) 解析により 1コピーのヒ ト 2 1番染色体を保持するクロ —ン DT 40 (2 1— 2— 3) を確認し取得した。
次に k kベクタ一を制限酵素 N o t I (T a k a r a) 消化により線状化し、 長腕遠位 を削除したヒ ト 2 1番染色体を保持するを保持する DT 40雑種細胞に導入した。 1 X 1 07個の DT40 (2 1— 2— 3) 細胞を 0. 5 m 1の R P M I培地に懸濁し、 30 μ g 01^八存在下で室温1 0分間静置した後、 ジーンパルサ一 I I (バイオラッド） を用いてエレク トロポレ一ションを行った。 容量 25 μ Fのコンデンサに 5 5.0 Vで印 加、 電極間距離 4mmのエレク ト πポレーシヨンセルを用いて放電した。 室温 1 0分間 静置した後、 エレク トロボレ一シヨンした細胞を、 1 0%F B S、 1 % C h S , 0. 1 mM 2一 MEを含む R PM I 1 640培養液に懸濁し、 96穴プレート （ファルコン） 20枚に播種した。 24時間後に終濃度 1. 5mgZm 1 となるようハイグロマイシン B (Hy g r omy c i n B、 WAKO) を加え、 2〜 3週間後には耐性コロニーが 出現した。 20回のトランスフエクションで得た合計 23 7個のコロニーを単離し増殖 させ、 以後の解析を行った （クローン名 ： DT40 (k k))。
(1 - 3) PCR解析
組換え体を選別するためハイグロマイシン耐性株のゲノム DNAを铸型として 5 ' およ び 3 ' 側の 2標的配列の存在を以下のプライマーを用いて PCR法により検出した。 そ のプライマ一の位置は図 78に示した。 その配列を以下に示す。
# 2 1 CEN< 1 > 2 L : 5 - aaatgcatcaccattctcccagttaccc .(目己歹(|番" "1 1 4) P G K r 1 ： 5' - ggagatgaggaagaggagaaca (配歹 'J番" 1 1 5)
# 2 1 CENく 2〉 2R : 5, - cctgttctatggttccagcctcacattg (配列番号 1 1 6 ) hygF： 5' - GAATTCAGCGAGAGCCTGAC (配列番号 1 1 7)
T a qポリメラ一ゼは L A T a q (宝酒造） を用い、 反応条件は以下のとおり行つ た。 5 ' g e n ome解析 （配列番号 1 1 4— 1 1 5) ; 94 °C 1分の後、 変性 98 °C 5 秒、 アニーリング/伸長 72 °C 1 0分を 3サイクル、 変性 98 °C 5秒、 アニーリング Z 伸長 70°C1 0分を 2サイクル、 変性 98°C5秒、 アニーリング 伸長 6 8 °C 5分を 2 5サイクル、 伸長 7 2°C 1 0分。 3' g e n o m e解析 （配列番号 1 1 6— 1 1 7 ) ; 9 4°C 1分の後、 変性 9 8 °C 5秒、 アニーリング Z伸長 72 °C 6分を 3サイクル、 変性 9 8°C5秒、 アニーリング/伸長 70°C 6分を 2サイクル、 変性 98 °C 5秒、 ァニーリン グ 伸長 68°C7分を 30サイクル、 伸長 7 2°C 1 0分。 ？じ1¾反応液には1^8 S O 4
(終濃度 0. 5mM) で添加した。 部位特異的に組換えが起こったクローンでのみ、 5 ' 側では 4. 5 k bのバンドが検出され、 3 ' 側では 6. 5 k bのバンドが検出された。 ネガティブコントロールの DT 40および DT 40 (2 1— 2— 3) ではバンドは検出 されなかった。 その頻度は 237クローン中 46個で組換え頻度は約 20%であった。
(1 -4) サザンプロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンプロット解析を行った。 プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマ一対を用い、 ヒ ト 2 1番染色体を保 持する A9 < 2 1 - 2 >細胞のゲノム DNAを铸型として PCRにより増幅し、 単離、 精製した。 相同組換えの標的配列の外側に 5 ' p r o b e - 1 (配列番号 1 1 8— 1 1 9) および 3 ' p r o b e— 1 0 (配列番号 1 20— 1 2 1) の 2種類のプロ一ブを設 定した （図 78)。
21qA5-lL： 5 - caggcaactgtaacacagtggtaggta (酉己列番亏 1 1 8)
2丄 qAo - 1R： 5 - aacagtagagcaatttcaggcaggtc (酉己列番号 1 1 9)
21qA3— 3し： 5 - cgcagcttttagctgaactaaggaga (酉己歹リ番"^ 1 20；
21qA3-3R： 5 - gtgacacagggatactctgtccaaaa (配列番"^ 1 2 1；
1次スクリ一ユングで得たうちの 1 2株から抽出したゲノム DN A約 5 μ gを制限酵 素 S p h I (ロシュ） により消化し、 Au s u b e l ら （Cu r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y, J o h n W i l e y & S o n s , I n c ., 1 9 94) に記された方法でサザンブロッ ト解析を行った。 32 Pにより標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、 イメージアナライザ一 T y D h o o n 9 2 1 0 (モレキュラーダイナミクス） により検出した。 塩基配列から予 想される制限酵素断片長は、 5 ' g e n ome側解析においては相同組換え体で 6. 1 k b、 3 ' g e n o m e側解析においては相同組換え体で 6. 0 k b、 野生型 （非組換 え体） では 5' g e n ome側解析および 3 ' g e n ome側解析ともに 1 1. 5 k b である。 解析した 1 2株の全てにおいて相同組換え体を確認した。
(1 - 5) 蛍光 i n s i t uハイブリダィゼーション （F I SH) 解析
F I SH解析は松原ら （F I SH実験プロ トコール、秀潤社、 1 9 94) に従い行った。 上記 （1—4) で組換えを確認したクローンのうち 6クローンをヒ ト c o t— 1 DNA およびハイグロマイシン （k kベクタ一より切出して調製） をプローブにして F I SH 解析を行ったところ、 ヒ ト 2 1番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座すること なく、 長腕近位にハイグロマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に 組換えが起こったことが確 められた。
以上の （1-1) 〜 （1-5) により相同組換えによりヒ ト 2 1番染色体近位 A P 00 1 6 5 7に 5， -HPRT- 1 o x P-h y g r o— TKを揷入することが確認できた。
(2) テロメァトランケーシヨンによるヒ ト 2 1番染色体長腕削除
(2— 1 ) テロメァトランケ一ション用べクタ一 p TE L h i s D_2 1 qの構築 ヒ ト 2 1番染色体の長腕遠位を削除するためのテロメァ トランケーションベクタ一
(ターゲティングベクタ一） は、 pTELhisD (Kuroi a ら， Nature Biotech. (USA) , 第 18卷， p.1086- 1090, 2000年） を用いた。 G e n B a n kデータベースより得たヒ ト 2 1番染色体長腕遠位の塩基配列 （登録番号 A P 0 0 1 6 5 7 ) から、 テロメアトランケ —シヨンべクタ一挿入の標的配列を設計した。 これを P C R増幅するための、 プライマ 一オリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
q 1 L ： 5 -. ggagcaacaggacctctcattccttgtt '(酉己タ-1 J番号 1 2 2 )
q 1 R ： 5 - ccaatgtcaggcactcctgctctaaatg (gii列番号 1 2 3 ;
ヒ ト 2 1番染色体を保持するマウス A 9雑種細胞 （A 9 < 2 1 — 2 >、 S h i n o h a r aら， H u m M o 1 G e n e t , 1 0 : 1 1 6 3， 2 0 0 1年） を培 養し、 細胞から P u r e g e n e DN A I s o l a t i o n k i t (G e n t r a S y s t e m社）を用いてゲノム DNAを抽出しだ。このゲノム DNAを铸型とし、 上記のプライマーを用いて組換えの標的配列を P C R法により増幅した。 铸型として約
0. 1 μ gのゲノム DNAを使用し、 I n n i s ら （P C R実験マニュアル， H B J出 版局， 1 9 9 1 ) に従い、 サーマルサイクラ一は G e n e Am p 9 7 0 0 (A p p 1 i e d B i o s y s t e m s社） を使用して P C Rを行った。 T a qポリメラーゼは L A T a' q (宝酒造） を用い、 反応条件は、 9 4°C 1分の後、 変性 9 8 °C 5秒、 ァニー リング/伸長 7 2°C 1 0分を 3サイクル、 変性 9 8 °C 5秒、 ァニ一リングン伸長 7 0 °C
1 0分を 2サイクル、 変性 9 8°C 5秒、 ァニーリング Z伸長 6 8 DC 1 0分を 2 5サイク ル、 伸長 7 2°C 1 0分で行った。 7. 0 k bの増幅産物を制限酵素 B a mH I (ロシュ） で消化して、 突出末端をもつ DNA断片をァガロースゲル電気泳動により分離し、 精製 した。 これを p T E L h i s Dプラスミ ドの B a mH Iサイ ドにクローニングした。 最 終的な p T E L h i s D— 2 1 qコンス トラク トのサイズは約 1 4. 4 k bである。 テ ロメアトランケーシヨンベクター、 標的配列、 及び相同組換えにより生じる染色体ァレ ルを図 7 9に示した。
( 2 - 2 ) ヒ ト 2 1番染色体保持 DT 4 0細胞へのテロメァトランケーションベクタ一 導入
p T E L h i s D_ 2 1 qコンス トラク トを制限酵素 S r f I消化により線状化 DNA とし、 実施例 2 3 ( 1 ) で作製した長腕近位に 1 o X Pを導入したヒ ト 2 1番染色体を 保持する D T 4 0雑種細胞に導入した。 1 X 1 07個の13丁4 0 ( k k 1 3 9)細胞を0. 5 m 1の R PM I培地に懸濁し、 3 0 g D N A存在下で室温 1 0分間静置した後、 ジーンパルサー I I (バイオラッド） を用いてエレク ト口ポレーシヨンを行った。 容量 2 5 μ Fのコンデンサに 5 5 0 Vで印加、 電極間距離 4 mmのエレク トロポレ一ション セルを用いて放電した。室温 1 0分間静置した後、エレク トロポレーションした細胞を、 1 0 %F B S、 1 % C h S , 0. I mM 2— M Eを含む R P M I 1 6 4 0培養液に懸 濁し、 9 6穴プレート （ファノレコン） 2 0枚に播種した。 2 4時間後に終濃度 0. 5 μ g /m 1 となるようヒスチジノール （L— H i s t i d i n o l d i h y d r o c h l o r i d e , シグマ） を加え、 2〜3週間後には耐性コロニーが出現した。 5回のト ランスフエクションから合計 1 0 5の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、 以後の解 .析を行った。
( 2— 3 ) P C R解析
ヒスチジノール耐性株ゲノム DN Aを铸型としてヒ ト 21番染色体上に存在する遺伝子 のゲノム領域の存在を P C R法により確認した。 ゲノム領域プライマ一オリゴヌクレオ チドの配列を以下に示す：
C B R— L ： 5' - gatcctcctgaatgcctg (配列番号 1 2 4 )
C B R— R : 5' - gtaaatgccctttggacc (配列番号 12 5 )
A P P—し ： 0 - ctgggcaatagagcaagacc (酉己列番号 1 2 6 )
A P P— R : 5' - acccatattatctatggacaattga (酉己列番号 1 2 7 )
T T C d— L : 5 - tggacaaatataaggcatgttca (酉 G列番号 12 8 )
TT C 3 -R : 5， - gtcaccttcctctgcctttg (配列番号 12 9)
P C P 4 - L : 5' - gaattcactcatcgtaacttcattt (配歹 IJ番号 1 3 0)
P C P 4— : 5 - ccttgtaggaaggtatagacaatgg (sci列番 131)
約 0. 1 gのゲノム DNAを铸型として、 上記 4種のゲノム領域について P C R増 幅 （ I n n i s ら， 前記） を行った。 T a qポリメラーゼは E x T a q (宝酒造） を 用い、 反応条件は、 9 4 °C 5分の後、 変性 9 4 °C 1 5秒、 アニーリング 6 0 °C 3 0秒、 伸長 7 2°C 3 0秒を 3 5サイクル行った。 テロメァトランケーションにより長腕遠位が 削除された場合、 上記 4種のプライマーでは検出されないことが予想される。 次に上記 プライマーで検出されなかった 1 0クローンについて以下のプライマーを用いて部位特 異的相同組換えが起こっているかを確認した。 そのプライマーの位置を図 7 9に示す。 配列は以下のとおりである。
q ■¾ L ： 5 一 ctgcaatctttacctccctggttcaagc (¾c歹 lj番号 1 3 2 )
S K 2 ά ： 5 - ggccgctctagaactagtggatc (酉己列番 1 3 3；
1 0クローンのうち部位特異的に組換えが起こった 2クローンでのみ 7. 5 k bのバ ンドが検出された。 ネガティブコントロールの D T 4 0、 DT 4 0 ( 2 1 — 2— 3 ) で はバンドは検出されなかった。 (2-4) 蛍光 i n s i t uハイブリダィゼーション （F I SH) 解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 9 94) に記され た方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t l (インビトロジェン） および F I TC標識した h i s D断片 （pTE L h i s Dベクターより切出して調製） をプローブに用いて行った。 その結果、 観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒ ト 2 1番染色体および C o t 1で染まった短縮したヒ ト 2 1番染色体長腕端に 2個の F I TC.シグナルが検出された, 宿主である DT 40細胞の染色体との相対的な大きさから、 ヒ ト 2 1番染色体が短縮し たことを確認した。
以上より、 得られたヒスチジノール耐性の 2株がヒ ト 2 1番染色体を長腕削除
(3) 2 1 ΑΔ q HAC長腕近位へのクローユング部位 （ n e o再構築型） の導入 (3— 1) Ι ο χ Ρ及び 3 ' n e o及び F RT配列揷入用 p S F 1 (FRT) .— Cべク ターの構築
実施例 23 (2) で作製したヒ ト人工染色体 （HAC) に 1 o X P及び 3 ' n e o及び FRT配列を揷入するための基本プラスミ ドには、 実施例 1 8 (1) で作製した t 1 p S F 1 (FRT) を用いた。 Ι ο χ Ρ及び 3' n e o及び F R T配列挿入部位であるヒ ト 2 1番染色体長腕近位の塩基配列は G e n B a n kデータベースより得た （登録番号 A P 00 1 6 5 7)。相同組換えの 2つの標的配列増幅に用いたプライマ一オリゴヌクレ ォチドの配列を以下に示す：
AP001657-55852F— Pad： 5' - gcgTTAATTAAaccgattaactgttcttttccagta (配列番号 1 34) AP001657-59245R_NheI： 5' - gcGCTAGCgAAGTCAAAAGAAGTAACTTCTTTCTCT (配歹 U番号 1 3 5) AP001657- 59828F一 Sail： 5' - gacagtGTCGACaagtcaaaagaagtaacttctatc (配歹 ϋ番号 1 36) AP001657- 62657R— Srfl： 5' - gatGCCCGGGCGTTTCCATGAAGGATATTAATCAGT (配列番号 1 3 7) ヒ ト 2 1番染色体を保持する A9 < 2 1 - 2 >細胞から抽出したゲノム DNAを铸型 として 2つの標的配列を PC Rにより増幅した。 配列番号 1 34— 1 3 5で増幅した約 3. 4 k bの DNA断片 （相同領域 1) を P a c Iおよび Nh e I (ロシュ） で消化し、 配列番号 1 36— 1 3 7で増幅した約 2. 8 k bのDNA断片 （相同領域 2) を制限酵 素 S a l Iおよび S r f I (ロシュ） で消化し、 突出末端をもつ D N A断片をそれぞれ ァガロースゲル電気泳動により分離し、 精製した。 次に制限酵素消化した相同領域 1の DNA断片と Nh e Iおよび S c a Iで消化した t 1 p S F 1 (FRT)プラスミ ド（実 施例 1 8 ( 1 ) で作製） と実施例 1 ( 2 _ 1 ) で作製した p S F l③を S e a lおよび P a c Iで消化した 3つの DNA断片を 3フラグメントライゲーションした。 このべク タ一を S a 1 Iおよび S r f Iにより消化し、 制限酵素消化した相同領域 2をクロー- ングし、 p SF l (F RT) —Cとした。 最終的な p S F 1 (FRT) — Cコンス トラ タ トのサイズは約 1 2. 6 k bである。 ターゲティングベクター、 標的配列、 及び相同 組換えにより生じる染色体アレルを図 80および図 8 1に示した。
(3-2) 2 1 A Δ q HAC保持 DT 40細胞への p S F 1 (FRT) — Cベクター導 入 、
p S F l (FRT) —Cコンス トラク トを制限酵素 S r f I (ロシュ） 消化により線状 化し、 長腕遠位を削除した 2 1 ΑΔ qHACを保持する DT 40雑種細胞に導入した。 1 1 07個の0丁40 (k k q 79) 細胞を◦. 5m 1の RPM I培地に懸濁し、 30 U g DNA存在下で室温 1 0分間静置した後、 ジーンパルサー I I (バイオラッ ド） を用いてエレク トロポレーシヨンを行った。 容量 2 5 μ Fのコンデンサに 5 50 Vで印 加、 電極間距離 4 mmのエレク トロポレーシヨンセルを用いて放電した。 室温 1 0分間 静置した後、 エレク ト口ポレーシヨンレた細胞を、 1 0%F B S、 1 % C h S , 0. 1 mM 2— MEを含む RPM I 1 640培養液に懸濁し、 9 6穴プレート （ファルコン） 20枚に播種した。 24時間後に終濃度 8 μ gZm 1 となるようブラス トサイジン （B l a s t i c i d i n S Hy d r o c h l o r i d e、 フナコシ） を力 Dえ、 2〜 3 週間後には耐性コロニーが出現した。 4回のトランスフエクションから合計 5 1個の薬 剤耐性コロニーを単離して増殖させ、 以後の解析を行った。
(3- 3) PCR解析
ブラストサイジン耐性株のゲノム DNAを铸型として 5 ' および 3 ' 側の 2標的配列の 存在を PC R法により検出した。 2つの標的配列 （図 8 1中、 それぞれ 5 ' g e n om e及び 3 ' g e n omeで示す） に対し、 これらを夾んで染色体上とタ一ゲティングべ クタ一上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマ一対を設計した。 その位置は図 8 1中 に矢印で示した。 その配列を以下に示す：
b s d F ： 5 - caacagcatccccatctctg (gc列番" 1 38)
bsdR： 5' - gctcaagatgcccctgttct (配列番号 1 39)
配列番号 1 38— 1 1 6 (5， genome)、 配列番号 1 3 9— 1 14 (3' genome) の組み 合わせで PCRを行った。
T a qポリメラーゼは LA T a q (宝酒造） を用い、 反応条件は以下のとおり行つ た。 94°C 1分の後、 変性 98 °C 5秒、 アニーリング Z伸長 72 °C 6分を 3サイクル、 変性 98 °C 5秒、 アニーリング Z伸長 70°C 6分を 2サイクル、 変性 98 °C 5秒、 ァニ —リング /伸長 68°C7分を 30サイクル、 伸長 7 2°C 1 0分。 ？〇11反応液には1^8 S04 (終濃度 0. 5mM) で添加した。
得られたブラストサイジン耐性 DT 40細胞 5 1株のうち 2 3株が、 塩基配列から予想 されるサイズ （5 ' g e n ome約 6. 7 k b及び 3 ' g e n ome約 6. l k b) の 増幅産物を与えることを確認した。 ·
(3 -4) サザンプロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリ一ユングとしてサザンプロッ ト解析を行った。 プローブは実施例 1 (1—4) で角いた 5 ' p r o b e— 1および 3， p r o b e— l 0を用いた。
1次スクリーニングで得たうちの 6株から抽出したゲノム DNA約 5 μ gを制限酵素 S p h I (ロシュ） により消ィ匕し、 Au s u b e 1 ら （Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.， 1994) に記された方法でサザンブロッ ト解析を行つ た。 32Pにより標識したプローブがハイブリダィズしたシグナルを、 イメージアナライ ザ一 T y p h o o n 92 1 0 (モレキュラーダイナミクス） により検出した。 塩基配列 から予想される制限酵素断片長は、 5' g e n om e側解析においては相同組換え体で 7. 8 k b、 DT 40 (k k q 79) (非組換え体） で 6. l k b、 3 ' g e n ome側 解析においては相同組換え体で 9. 5 k b、DT40 (k k q 79) (非組換え体）で 6 · 0 k bである。 解析した 6株全てにおいて相同組換え体を確認した。
(3 - 5) 蛍光 i n s i t uハイブリダイゼーション （F I S H) 解析
F I SH解析は松原ら （F I SH実験プロ トコ一ノレ、秀潤社、 1 994) に従い行った。 上記 （3— 4) で組換えを確認した 6クローンをヒ ト c o t - 1 DN Aおよびブラスト サイジン (p CMV/B s dベクターより切出して調製） をプローブにして F I SH解 析を行ったところ、 ヒ ト 2 1番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することな く、 長腕近位にブラストサイジン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組 換えが起こったことが確かめられた。
以上の （3— 1)〜（3— 5) の実験により、 相同組換えによりクローニング部位 （ 1 o x P配列） 及び 3 ' n e o及び FRT配列が挿入された 2 1 ΑΔ qHACベクターを 保持する DT40雑種細胞 6株 （DT40 (2 1 q AHAC) - 2 , 1 3, 1 6， 29， 3 9， 5 1) を取得した。
(4) CHO細胞への 2 1 A Δ q HACベクター移入
(4一 1 ) ミクロセル法による 2 1 ΑΔ q H A Cベクターの C H O細胞への移入 染色体供与細胞として、 上記実施例 23 (3) で得られた、 長腕遠位を削除してクロ —ニング部位 （ 1 o X P及び 3 ' 0 6 0及び？尺丁配列） が挿入された 2 1 ΑΔ q HA Cベクターを保持する DT 40雑種細胞 （DT40 ( 2 1 q AHAC) - 2 , 3 9， 5 1) を用いた。 染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株 CHO— K 1 (登録番号 J CRB 90 1 8). を用いた。
はじめに約 1 09個の13丁40雑種細胞からミクロセルを調製した。 細胞密度が 6 0 〜 70%飽和程度まで培養した DT 40雑種細胞をコルセミ ド （0. 05 /z gZm l , インビトロジェン） を含む培養液 （ 1 0 % F B S， 1 % C h S , 0. 1 mM 2—メル カプトエタノール， RPMI.1 640)中で 1 3〜1 8時間培養して微小核を誘導した。 遠心分離により細胞を回収して無血清 DMEMに再懸濁し、 予めポリ L—リジンでコー ティングした 2 5 c m2遠心用フラスコ （ヌンク） 1 2本に藩種した。 3 7°C1時間静 置し細胞が付着したのち培養液を除去し、 予め保温 （3 7°C) しておいたサイ ト力ラシ ン B (DMEM中に 1 0 μ g/m 1 , シグマ） 溶液を遠心用フラスコに満たし、 遠心容 器にフラスコを挿入し、 34°C、 8, 000 r pm、 1時間の遠心を行った。 ミクロセ ルを無血清培地 （DMEM) に懸濁して回収し、 ポアサイズ 8 m、 5 μ m, 3 mの フィルター （ワッ トマン） を装着した SW I NNEX— 2 5 (ミ リポア） を用いて濾過 精製した後、 5 m 1の DMEMに懸濁した。 ミクロセル懸濁液を室温， 1 500 r p m， 5 分間遠心し、 これに DMEMで 2回洗浄後 5m 1の DMEMに懸濁した約 1 07個の CHO— K 1細胞を重層後、 室温， 1 500 r pm, 5分間遠心し上清を取り除いた。 45%ポ リエチレングリ コール 1 500 (PEG 1 500, ロシュ） 1 0%DMSO (シグマ） を含む DMEM溶液で 1 20秒間融合処理した。 1 20m lの 1 0%FB Sを含む F 1 2培地 （インビトロジェン） に懸濁し、 48穴プレート （ファルコン） 5枚に播種し、 24〜36時間後にブラス トサイジン（8 μ g/m 1 ) を含む選択培地（1 0%FB S， F 1 2)で培養した。約 2週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、 以後の解析を行った。 3回の微小核細胞融合から計 1 6株 （DT40 (2 1 q AHAC) — 2由来 8株， DT40 ( 2 1 q AHAC) — 3 9由来 3株， DT40 ( 2 1 q A HAC) — 5 1由来 5株） のブラス トサイジン耐性 CHO株を得た。
(4- 2) PCR解析
ブラストサイジン耐性株のゲノム DNAを铸型として 5' および 3 ' 側の 2標的配列の 存在を PCR法により検出した。 方法は、 上記実施例 1 (3— 3) に従って行った。 得 られたブラス トサイジン耐性 CHO細胞 1 6株のうち 1 1株が、 塩基配列から予想され るサイズ （5' g e n ome約 6 · 7 k b及び 3 ' g e n ome約 6. l k b) の増幅 産物を与えることを確認した。
(4 - 3) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 9 94) に記された 方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 ブ ラス トサイジン耐性 CHO株のうち 1 0株について解析した結果、 計 3株 （CHO ( 2 1 q A-HAC) — 5, 6, 1 7) 、 正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおい て C o t 1で染まった 1コピーの 2 1 ΑΔ qHACベクターが検出された。
以上 （4— 1) から （4— 3) の実験から、 得られたブラス トサイジン耐性 CHO株 3株が 2 1 ΑΔ qHACベクタ一を保持することを確認した。 実施例 24
2 1 ΑΔ q HA Cベクターの CHO細胞での長期安定性解析
(1) 非選択培養条件下での長期継代培養
2 1 ΑΔ qHACベクターの CHO細胞における安定性を確認するために、 非選択条 件下で長期継代培養を行った。 実施例 1に記載した CHO細胞株 3株 （CHO (2 1 q A-HAC) — 5， 6， 1 7) を使用した。 非選択培養液は 1 0 % F B Sを含む F 1 2 培地であり、 選択培養液はこれにブラストサイジン 8 g/m 1 を添加した。 CHO細 胞株は 5. 0 X 1 05細胞を 1 0 cm径ディッシュに播種し、細胞密度が 80〜90 %飽 和程度まで培養した細胞を計数して再び 5.0 X 1 05钾胞を 1 0 cm径ディッシュに播 種し、 1 0継代まで行った。 継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。 CHO 細胞株は 1 0継代後にそれぞれ細胞を回収し F I SH用染色体標本を作製した。
(2) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 994) に記された 方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 そ の結果を表 9に示す。 表 9 ： 21AAqHAC^クタ一の CHO細胞における安定性
HAC 細胞集団 HAC保持率 (%)
継代数 薬剤選択なし 薬剤選択あり
CH0(21qA-HAC)-5 培養開始時 - 98
1 0 96 94
CH0(21qA-HAC) _6 培養開始時 一 100
1 0 90 96
CH0(21qA-HAC)-17 培養開始時 - 100
1 0 94 98
21Αδ qhacベクタ一は、 CH0細胞において長期継代培養後も安定に保持されていた。 ま た分裂中期の染色体像を観察したところ、 細胞あたり 1ないし 2個のシグナルが検出さ れた。
実施例.2で示した図 1 3より、 W02004/0313 パンフレツ トで開示した 21 δ qhacの CH0 細胞における HAC保持率 （％) は、 培養開始'時では、 「薬剤選択あり」 の場合で 86%、 7 週倍用語では、「薬剤選択なし」の場合は 66.0%、「薬剤選択あり」の場合は 86.0%である。 したがって、 本願発明の 21番染色体由来の新規 HACベクター 21Αδ qhacは、 長期培養に おいてもほぼ脱落が見られず、 従来の HACベクターに比べ顕著に安定な HACベクターで あることがわかった。
以上の （1) 及び （2) の実験により、 21AS qhacベクターは、 CH0細胞において非選 択培養条件で安定に保持されること、 また細胞あたりのコピー数は維持されていること が明らかとなった。 ' 実施例 25
Hepo-21A6 qhacベクタ一の CH0雑種細胞での hepo遺伝子発現解析
(1) hepo— 21AS qhacベクターの構築
( 1— 1) 21A δ qhacベクタ一への hepo遺伝子の導入
実施例 23で構築した 21A 6 qhacベクターへ hepo遺伝子発現ュニッ トを挿入する。 Loxp 配列を含む hepo発現プラスミ ドを準備し、 C r e組換え酵素を一過性に発現させること で 1 o X p配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入する。 組換え揷入体 の選別は、 G4 1 8耐性の獲得 （プロモーター分断型の neo耐性遺伝子発現ュニットの 再構成） を指標とした。 概略を図 7 7に示す。
実施例 1 で作製 した 21A δ qhac ベタ タ 一を保持する C H O雑種細胞
(CH0(21qa-HAC)-5, 6) をトリプシン処理し、 5 1 06細胞を0. 8 m l のハンクス平 衡塩溶液 （HB S S) に懸濁した。 L o X p配列を含む hepo発現プラスミ ド p 1 n 1 — E P O (Kakeda ら、 Gene Therapy; 12： 852-856, 2005年） 1 0 gと C r e酵素発現 ベクタ一 p b s i 8 5 (ライフテック） 1 0 μ gの存在下でジーンパルサー II (バイオ ラッド） を用いてエレク トロポレーションを行った。 容量 5 0 0 μ Fのコンデンサに 4 5 0 Vで印加し、 電極間距離 4 mmのエレク トロポレーシヨンセルを用いて放電した。 エレク トロポレ ションした細胞を 1 0 %F B S添加した F 1 2培地 （インビトロジェ ン製） を含む 4 8穴組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン） 5 枚に播種した。 2 日後に 0. 8 g/m lのG 4 1 8 (GENETICIN、 インビトロジェン） を含む培地と置き 換えた。 2〜 3週間後には G418耐性コロニーが出現し、 計 48個 （CH0(21qa- HAC)- 5由 来 20個、 CH0(21qa- HAC)-6由来 28個） のコロニーを単離して増殖させ、 以後の解析を 行った。
( 1 - 2 ) PCR解析
Hepo遺伝子発現ユニット組換え揷入体の選別は、 21Αδ qhacベクター上の 1 o x p配 列部位に挿入されたか否かを、 1 o X p配列部位を挟むように plnl - EP0ベクタ一上及び 21A5 qhacベクター上に設計したプライマ一 svpanplおよび Neo Rp2によって、 また挿入 された hepo遺伝子を、 プラスミ ドベクター p b s 2 2 6上の M13RVおよび Neo Rp2プラ イマ一によつて、 P C R増幅により確認した。 プライマー配列および PCRは Kakedaちの 方法 （Kakeda ら、 Gene Therapy; 12： 852-856, 2005年） に従った。 組換え挿入体の場 合は、 プライマ一 svpanplおよび NeoRp2により約 1. O k b p、 プライマー M13RVおよ び Neo Rp2により約 2.7kbpの増幅が予想される。 その結果、 上記 （ 1一 1 ) 得た G418 耐性 CH0雑種細胞のうち計 40株において予想される増幅を確認した。 以上より、 上記の G418耐性 CH0雑種細胞 40株が 1 o x p配列への hepo遺伝子発現ュニッ ト組換え挿入体 であることを確認した。
( 1 - 3 ) サザンプロッ ト解析
Hepo - 21A δ qhacベクターにおいて hepo発現ュニッ ト構造が正しく保持されているか 否かを調べるために、サザンブロッ ト解析を行なった。方法は、 Kakedaら（Gene Therapy； 12： 852-856, 2005年） に従った。 塩基配列から予想される xbai消化による制限酵素断 片長は、 hepo 発現ユニッ トを含む 5. 5 k bである （図 14)。 上記 （1 — 2 ) で得た G418 耐性候捕 CHO 雑種細胞のうちの 6 株について解析を行った結果、 合計 3株 (CH0(21qahace-13, 14, 37) において予測されるサイズのバンドを確認した。
(2) 21ASqhacベクタ一へ挿入された hepo遺伝子の発現
Hepo遺伝子の発現を培養上清中に産生される hepo タンパク質を酵素結合免疫吸着検 定法 （EL I S A法） により定量した。
上記実施例 103 ( 1 _ 3) において単離した hepo-21AS qhacベクタ一を保持する G 4 1 8耐性 CH0雑種細胞 6株を、 約 1 05細胞を 1 0%F B S添加した 0.8mgZm 1の G 4 1 8を含む F 1 2培地 2m 1をいれた 12穴組織培養用プラスチックシャーレ （フアル コン） に播種した。 コンフレント到達後、. 1 0%F B Sを添加した F 1 2培地 2m 1に 置き換え 2日間培養し、 1 0%FB Sを添加した F 1 2培地 l m lに置き換えさらに 2 4時間培養した後、 上清を回収および細胞数を計数した。 Hepo ELISA キッ ト (Quantikine IVD Human EP0 Immunoassay, R&D システム） により、 培養上清中の h E POを定量した。
以上の結果から、 上記 h E PO— 2 1 ΑΔ qH ACベクターを保持する G 4 1 8耐性 CHO雑種細胞 6株全てにおいて h E POの発現を確認した。 .
(3) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 994) に記された 方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 上 記 （1一 3) で得た G 4 1 8耐性 CHO雑種細胞のうち 6株について解析した。 その結 果、 計 5株において観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつ C o t 1で染まつ た 1コピーの hE Pひ _2 1 ΑΔ qH ACベクターを検出した。
以上 （ 1 ) の実験から、 得ちれた G 4 1 8耐性 5株は、 h E PO— 2 l AA q HAC ベクターを保持する正常核型の CHO細胞であることを確認した。 実施例 26
hE PO— 2 1 ΑΔ q H A Cベクターの C H O雑種細胞での長期安定性解析
(1) 非選択培養条件下での長期継代培養
h E P O - 2 1 ΑΔ q HACベクターの CHO細胞における安定性を確認するために、 非選択条件下および選択条件下 （対照群） で長期継代培養を行った。 実施例 2 5で得た CHO雑種細胞 2株 （CHO (2 1 q A-HACE) - 1 3, 1 4) を使用した。 非選 択培養液は 1 0%FB Sを含む F 1 2培地であり、 選択培養液はこれに 0. 8 g m l の G 4 1 8を添加した。 C HO細胞株は 5. 0 X 1 05細胞を 1 0 c m径ディッシュに播 種し、細胞密度が 80〜90%飽和程度まで培養した細胞を計数して再び 5. 0 X 1 05 細胞を 1 0 cm径ディッシュに播種し、 1 0継代まで行った。 継代毎に細胞数を計数し て集団倍加数を算出した。 CHO細胞株は 1 0継代後にそれぞれ細胞を回収し、 h E P O遺伝子の発現および F I SH解析を行った。
(2) 長期継代培養後の h E PO遺伝子の発現
h E PO遺伝子の発現は、 培養上清中に産生される h E POタンパク質を酵素結合免疫 吸着検定法 （E L I SA法） により定量した。 上記 （1) で長期継代培養した h E PO — 2 1 ΑΔ qHACベクターを保持する CHO雑種細胞 2株について、 実施例 3 (2) の方法に従って行った。 その結果、 上記 h E PO— 2 1 ΑΔ q HACベクターを保持す る CHO雑種細胞 2株全てにおいて長期継代培養後も h E POの発現を確認した。
(3) F I S H解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 994) に記された 方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 細 胞集団倍加数および H A C保持率は 2連で行った結果の平均値を算出した。 上記 2株に ついてその結果を表 1 0に示す。 表 10： hEPO - 21AAqHACベクタ一の CH0細胞における安定性
Figure imgf000156_0001
h E PO- 2 1 ΑΔ qHACベクターは、 C H O細胞において長期継代培養後も安定 に保持された。 また分裂中期の染色体像を観察したところ、 細胞あたり 1ないし 2個の シグナルを検出した。
以上の （1) から （3) の実験により、 h E PO— 2 1 ΑΔ qHACベクターは、 長 期継代培養後の CHO細胞において、 非選択培養条件で安定に保持されること、 細胞あ たりのコピー数が維持されること、 hE PO遺伝子の発現が維持されること、 が明らか となった。 実施例 2 7
N e o耐性遺伝子ュニット除去 h E PO— 2 1 ΑΔ ο Δ η β ο—H ACベクターの構築 2 1 Α Δ q _Η ACベクター上及び ρ LN 1 / E P O Fプラスミ ド （実施例 1 8 (3) にて作製） 上の h Ε ΡΟ発現ユニット下流には F RT配列が挿入されている。 h E PO — 2 1 ΑΔ q—HACベクター上から F RT/F L P e部位特異的組換えシステムによ り N e o耐性遺伝子発現ユニッ トを除去する。 その概略を図 8 2に示す。
(1) hE PO- 2 l AA q _ H A Cベクターからの N e o耐性遺伝子ュニッ ト除去
(1— 1) F L P eによる N e o耐性遺伝子ユニッ ト除去
上記実施例 25で作製した h E PO- 2 1 AA q F _H A Cベクタ一を保持する C HO 細胞中で実施例 1 8 (5-1) で作製した F L P e組換え酵素を一過性に発現させること で FRT配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体から N e o耐性遺伝子ュニッ トを切出し除去する。 組換え挿入体の選別は、 N e o耐性遺伝子ュニッ トの欠失を指標 とした。
h E PO— 2 1 A Δ q— HACベクターを保持する CHO細胞 （CHO (2 1 q A- H A C E ) — 1 3及び CHO ( 2 1 q A-HAC E) — 1 4) をトリプシン処理し、 5 X 1 06細胞を0. 8m 1のハンクス平衡塩溶液 （HB S S) に懸濁した。 20〜： L 00 ； z gの F L P e酵素発現ベクター p OG 44 F L P e存在下でジーンパルサー I I (バ ィォラッド） を用いてエレク トロボレ一シヨンを行った。 容量 500 / Fのコンデンサ に 4 50 Vで印加し、 電極間距離 4 mmのエレク トロポレーションセルを用いて放電し た。 エレク トロポレーションした細胞を 1 0%F B Sを添加した F 1 2培地 （インビト ロジェン製） を含む 96穴組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン） 8枚（1 c e 1 1 /w e 1 1で 4枚、 0. 1 c e l l /w e 1 1で 4枚） に播種した。 2〜 3週 間後ブラストサイジン耐性コロニーが出現し、 計 1 20個 （CHO (2 1 q A-HAC E) — 1 3由来 6 0個、 CHO ( 2 1 q A-HAC E) — 14由来 60個） のコロニー を単離し、 同じクローンを 24we l 1プレート 2連にまき、 一方はブラストサイジン で、 一方は G4 1 8とブラス トサイジンで培養した。 04 1 8を加ぇた 6 1 1で死滅 したクローンは n e o遺伝子が欠失していると考えられる。 G4 1 8で死滅したクロー ンは 1 20個中 1 2クローン （CHO ( 2 1 q A-HAC E) — 1 3由来 3個、 CHO ( 2 1 q A-HAC E) — 14由来 9個） であった。 このクローンを用いて、 以後の解 析を行った。
(1 - 2) PCR解析
h E P O - 2 1 A Δ q _HACベクタ一上から N e o耐性遺伝子ュニッ ト除去されてい るか否かを調べるため、 p LN 1 _E P OFベクタ一上及び 2 l AA qHACベクタ一 上に設計したプライマー S V p AN p 1および N e o R p 2によって、 また挿入され た h E P O遺伝子を、 プラスミ ドベクター p B S 2 2 6上の M 1 3 R Vおよび N e o R p 2プライマーによって確認した。 プライマー配列および P CRは K a k e d aらの 方法 （Ka k e d a ら、 G e n e Th e r a p y ； 1 2 : 8 5 2— 8 56， 2 005年） に従った。 N e oカセットを含む組換え挿入体の場合は、 プライマー SVp ANp lぉょびN e o 2にょり約 1. 0 k b p、 プライマー M 1 3 R Vおよび N e o R p 2により約 2. 7 k b pの増幅が予想される。 一方、 N e o耐性遺伝子ュニ ッ トが除去されていれば、 上記 2種類のプライマーでは増幅産物はみられない。 その結 果、 上記 （1一 1) で得た G4 1 8非耐性 CHO雑種細胞計 1 2株のうち計 1 0株にお いて予想される増幅産物がみられないことを確認した。 以上より、 上記の B s d耐性か つ G4 1 8非耐性 CHO雑種細胞計 1 0株が N e o耐性遺伝子ュニット除去されている ことが確認された。
(1 - 3) サザンプロット解析
h E PO- 2 1 ΑΔ q— HACベクター上から N e o耐性遺伝子ュニッ ト除去されて いるか否かを調べるために、 サザンブロッ ト解析を行なった。 方法は、 Ka k e d a ら
(G e n e Th e r a p y ； 1 2 : 8 52— 856, 2005年） に従った。 塩基配列から予想される E c o R I消化による制限酵素断片長は、 Ne o耐性遺伝子ュ ニッ トが除去され h E PO発現ユニッ トのみの場合 4. 9 k b、 N e o耐性遺伝子ュニ ッ ト及び h EPO発現ユニッ ト両方を含む場合 7. 6 k bである。 上記実施例 2 7 ( 1 - 1) で得た候補 CHO雑種細胞 1 2株 （CHO (2 1 q A— HACE) - 1 3由来 3 株、 CHO (2 1 q A-HACE) — 1 4由来 9株） から、 合計 1 0株 （CHO (2 1 q A-HAC E) — 1 3由来 2株、 CHO (2 1 q A-HAC E) 一 1 4由来 8株） に おいて予測されるサイズのバンドを検出した。 以上より、 上記 CHO雑種細胞 1 0株に おいて、 N e o耐性遺伝子ユニッ ト除去を確認した。 N e o耐性遺伝子ユニットが除去 された h E PO- 2 1 ΑΔ q F— HA Cベクターを以下 h E PO— 2 1 AA q A n e o — HACベクタ一と称する。
(1—4 ) F I SH解析 F I SH解析は、 松原ら （F I S H実験プロ トコール， 秀潤社， 1 9 94) に記された 方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 上 記 （5— 3) で得た候補 CHO雑種細胞のうち 1 0株について解析した。 その結果、 計 4株 （CHO (2 1 q AHAC E A) — 4 , 8 , 1 0， 1 1 ) において、 観察した分裂 像のほとんどにおいて正常核型かつ C o t 1で染まった 1コピーの h E PO- 2 1 A厶 q厶 n e o— HACベクターを検出した。
以上 （1— 1 ) から （1—4) の実験から、 得られた上記 CHO雑種細胞 4株は、 h E PO- 2 1 ΑΔ q Δ n e o— HACベクターを保持する芷常核型の C HO雑種細胞で あることを確認した。 実施例 2 8
C r e - 1 o x Pを用いてヒ ト 2 1番染色体長腕遠位を削除した 2 1 HAC (2 1 N厶 g HAC) ベクタ一の構築
HACベクターがテロメァ配列及びヒ ト 2 1番染色体末端の短いサブテロメァは配列 (約 8 k b) を含有するように、 長腕遠位及び近位に 1 o X P配列を相同組換えにより. 揷入し、 C r eによる部位特異的組換え反応により 2箇所の 1 o x P配列間の領域を切 出し削除して長腕遠位欠失人工染色体 （2 1 NA q HAC) ベクターを構築する。
( 1 ) 部位特異的組換え反応によるヒ ト 2 1番染色体長腕削除
( 1 - 1 ) ヒ ト 2 1番染色体長腕遠位テロメァ側 1 o X P配列揷入用ベクター NTの構 築
1 o X P配列を揷入するための基本プラスミ ドには V 9 0 1 (L e x i c o n g e n e t i c s を用レヽた。 V 8 3 0 (.L e x i c o n g e n e t i c s ) 力 ら R s r l I (NE B) により MC 1—TK配列を切り出したのち V 9 0 1プラスミ ドの制限酵素 B a mH Iの認識部位にクローニングした （クローン名 ： V 9 0 1 T— 2)。 L o x P揷 入部位であるヒ ト 2 1番染色体遠位の塩基配列は G e n B a n kデータベースより得た (NT— 0 1 1 5 1 5)。相同組み換えの 2つの標的配列の増幅に用いたプライ.マーオリ ゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
#21NT1L: 5' - gaatgtcccccattgtcacttcatgttc (酉己歹 lj番号 1 40)
#21NT1R: 5' - ggcaa¾cttagtccagttgggaaactgatgggttcat (kl歹1 J番号 1 4 1 )
#21NT3L: 5' - g c¾aattcggattgagagacacacatagctggtca (酉じ歹 lj番号 1 4 2 )
#21NT3R: 5' - ggc£aattctgtcaacctgccagttctcaggagttt (配列番号 1 4 3 ) ヒ ト 2 1番染色体を保持する A9く 2 1 - 2 >細胞から抽出したゲノム DN Aを铸型 にして標的配列を PCRにより増幅した。 上記のプライマーを用いて、 T a qポリメラ —ゼば LA T a q (宝酒造） を用い、反応条件は 9 5 °C 2分の後、 変性 95 °C 1 5秒、 アニーリング 6 8°C4分を 30サイクル行った。 それぞれを制限酵素 E c o R I (ニッ ボンジーン） ないし H i n d I I I (二ツボンジーン） で消化して、 ァガロースゲルに より分離し精製後、 V 90 1 T— 2プラスミ ドの E c o R Iないし H i n d I I Iサイ トにクローニングした。 さらに V 90 1 T- 2プラスミ ドの A s c I と K p n Iサイ ト に A s c I と Kp n Iにより切り出した 3 ' HPRT_ l o x P_B Sをクローニング した。 3 ' HPRT— 1 o x P— B Sは V 820 , (L e x i c o n g e n e t i c s) の Xb a lサイ トにオリゴ合成した 1 o X P配列と C M V _ B S配列 （ィンビトロジェ ン） をクロ一ユングすることで作製した。 最終的な 1 o X P挿入コンス トラク トのサイ ズは 1 3 k bである。 ターゲテイングべクタ一、 標的配列、 及び相同組み換えにより生 じる染色体アレルを図 83に示した。
(1 - 2) 長腕近位 1 o X P挿入済みヒ ト 2 1番染色体を保持する DT 40細胞への長 腕遠位テロメァ側 1 o x P配列挿入用 NTベクター導入
実施例 1 (1 _ 2) の方法に従い、 NTコンストラク トを制限酵素 N o t I消化により 線状化 DN Aとし、 実施例 23 (1) で作製した長腕近位 1 o X P挿入済みヒ ト 2 1番 染色体を保持する DT40雑種細胞 DT40 (k k 1 39) に導入した。 ブラス トサイ ジン （終濃度 8 u gZm l ) で選択培養を行い、 2〜 3週間後には薬剤耐性コロニーが 出現した。 2回のトランスフエクションから合計 1 2個のブラストサイジン耐性コロニ 一を単離して増殖させ以後の解析を行った。
(1 - 3) PCR解析
ブラス トサイジン耐性株のゲノム DN Aを铸型として 5' および 3 ' 側の 2標的配列の 存在を実施例 6 (1 - 1) の方法に従い、 PCR法により検出した。 2つの標的配列 （図 83中、 それぞれ 5 ' g e n ome及び 3 ' g e n omeで示す） に対し、 これらを夾 んで染色体 Jiとターゲテイングべクタ一上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマ一対 を設計した。 その位置は図 83に矢印で示した。 その配列を以下に示す：
#21NT1L： 5'- CATTCATGGTAGTCATTGGTGCTGTTCTCC (配列番号 144)
S21NT7R： 5' - ACTTCCTGACTAGGGGAGGAGTAGAAGGTG (配列番号 14 5)
P C Rは配列番号 1 38— 145 ( 3 ' g e n ome)、配列番号 1 39— 144 ( 5 ' g e n ome) の組み合わせで行った。 上記ブラストサイジン耐性 1 2株のうち 5株において 5 ' および 3 ' 側の 2標的配列の 存在を確認した。
(1 -4) サザンプロッ ト解析
相同組換え体を選別するためのスクリ ングとしてサザンブロッ ト解析を行った。 相同組換えの 3 ' 側の標的配列内側にプローブを設定した （図 83)。 プローブは以下に 示すオリゴヌクレオチドプライマ一対を用い、 ヒ ト 2 1番染色体を保持する A 9 < 2 1 _ 2 >細胞ゲノム DNAを铸型として PCRにより增幅、 単離、 精製した （3 ' p r o b e - 6とする）。
2 qN3一 2L 5 - ctggaagacactgagataaccatgacc, (酉 ci夕〕J番号 4 oノ
21qN3-2R 5' - ctgagaagttccacaatagcctgtctc (配列番号 14.7 )
1次スクリーニングで得た 5株から抽出したゲノム DN A約 5 μ gを制限酵素 Kp η I (ロシュ） によりにより消 ί匕し、 Au s u b e l ら （Cu r r e n t P r o t o c p i s 1 n Mo l e c u l a r B i o l o g y, J o h n W i l e y & S o n s , I n c ., 1 994 ) に記された方法でサザンプロッ ト解析を行った。 標識 したプローブがハイブリダィズしたシグナルを、 イメージアナライザー Ty p.h o o n 92 1 0 (モレキュラーダイナミクス） により検出した。 塩基配列から予想される制限 酵素断片長は、 相同組換え体で 7. 6 k b、 野生型 （非組換え体） で 23 k bであり、 候補 5株から合計 2株 （DT40 (k kNT) — 7, 1 1) の相同組換え体を確認した。 これらの 2クローンを用いて次のステップ （3) へ進めた。
(2) 長腕近位および遠位へ 1 o X Pを導入したヒ ト 2 1番染色体の CHO細胞への移 入
(2— 1) ミクロセル法による改変ヒ ト 2 1番染色体の CHO細胞への移入
染色体供与細胞として、 上記実施例 28 (1) で得られた、 長腕近位および遠位へ 1 o X Pを導入したヒ ト 2 1番染色体を保持する DT 40雑種細胞 （DT 40 (k k NT) - 7, 1 1) を用いた„ 染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株 C HO h p r t欠損細胞 （ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、 登録番号 J CR B 02 1 8) を用いた。
はじめに約 1 09個の DT 40雑種細胞からミクロセルを調製した。 細胞密度が 60 70%飽和程度まで培養した DT 40雑種細胞をコルセミ ド （0. 05 μ g/m 1 , インビトロジェン) を含む培養液 （ 1 0 % F B S , 1 % C h S , 0. 1 mM 2—メル カプトエタノール， R PM I 1 640)中で 1 3 1 8時間培養して微小核を誘導した。 遠心分離により細胞を回収して無血清 DMEMに再懸濁し、 予めポリ Lーリジンでコー ティングした 2 5 c m2遠心用フラスコ （ヌンク） 1 2本に藩種した。 3 7で 1時間静 置し細胞が付着したのち培養液を除去し、 予め保温 （3 7°C) しておいたサイ トカラシ ン B (DMEM中に 1 0 μ gZm 1 , シグマ） 溶液を遠心用フラスコに満たし、 遠心容 器にフラスコを挿入し、 34°C、 8， 000 r p m、 1時間の遠心を行った。 ミクロセ ルを無血清培地 （DMEM) に懸濁して回収し、 ポアサイズ 8 μΐη、 5 /z m、 3 μ mの フィルター （ワッ トマン） を装着した SW I NNEX— 2 5 (ミリポア） を用いて濾過 精製した後、 5m 1の DMEMに懸濁した。 ミクロセル懸溻液を室温， 1 500 r p m, 5分間遠心し、 これに DMEMで 2回洗浄後 5 m 1の DMEMに懸濁した約 1 07個の CHO h p r t _ —細胞を重層後、 室温， 1 500 r pm， 5分間遠心し上清を取り 除いた。 45%ポリエチレングリコール 1 500 (PEG 1 500、 ロシュ） 1 0%D MS O (シグマ） を含む DMEM溶液で 1 20秒間融合処理した。 1 2 Om lの 1 0% FB Sを含む F 1 2培地 （インビトロジヱン） に懸濁し、 48穴プレ一ト （ファルコン） 5枚に播種し、 24〜36時間後にブラストザィジン （8 / g/m l ) を含む選択培地
( 1 0 % F B S , F 1 2) で培養した。 約 2週間の選択培養の後、 出現した薬剤耐性の コロニーを単離し、 以後の解析を行った。 2回の微小核細胞融合から計 1 0株 （DT4 0 (k k NT) — 7由来 5株， DT40 (k k NT) — 1 1由来 5株） のブラストサ ィジン耐性 CHOh p r tーノ—株を得た。
(2-2) PCR解析
ブラストサイジン耐性株ゲノム DN Aを铸型としてヒ ト 2 1番染色体上に存在する遺伝 子のゲノム領域の存在を実施例 23 (1-3) および実施例 28 (1-3) 記載の P C R 法により確認した。 解析した 1 0クローン全てにおいて増幅産物が確認できた。
(2-3) 蛍光 i n s i t uハイブリダィゼ一.ション （F I SH) 解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 9 94) に記された 方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 上 記 （2— 2) で取得したうちの 6クロ一ンについて解析した結果、 全てにおいて正常核 型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて C o t 1で染まった 1コピーのシグナルを検 出した。
(3) C r e - 1 o x P部位特異的組換え反応による長腕遠位の削除
(3 - 1) 長腕遠位及び近位へ 1 o X P配列挿入したヒ ト 2 1番染色体保持 CHO雑種 細胞への C r e発現ベクターの導入 実施例 1 (1— 2) の方法に従い、 C r e発現べクタ一 p CAGGS— C r eを実施例 28 (2) で取得した CHO (k k NT) ー 1及びじ110 (k k NT) — 5及び CHO (k k NT) _ 6細胞に導入した。 HAT (S I GMA, 終濃度 1 x ) で選択培養を 行い、 2〜3週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。
3回のトランスフエクションから合計 1 2個の HAT耐性コロニーを単離して増殖させ 以後の解析を行った。
(3 -2) PCR解析
HAT耐性株のゲノム DNAを铸型として 2つの 1 o x P配列間の欠失を P C R法に より確認した。 長腕遠位欠失後に残った 1 o X P,配列を夾んで染色体上とターゲティン グベクタ一上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマ一対を設計した。 その位置は図 8 4中に矢印で示した。 その配列を以下に示す：
Trans L1 ： 5' - TGGAGGCCATAAACAAGAAGAC (酉己列番号 148)
Trans R1: 5， - CCCCTTGACCCAGAAATTCCA (配列番号 149 )
TAQポリメラーゼは EXTAQ (宝酒造） を用い、 反応条件は、 94°C1分の後、 変性 94°C 15秒、 アニーリング 60°C30秒、 伸長 72 °C1分を 35サイクルで行った。 L0XP配列間 の欠失により長腕遠位が削除された場合'、 約 350Bの増幅が予測される。 また配列番号 14.8— 145、 配列番号 1 14— 1 49、 配列番号 1 1 4— 14 5の組み合わせでは 5.7KB, 6.3KB, 12KBの増幅が予測される。 TAQポリメラーゼは LA TAQ (宝酒造） を用い、 反応条件は以下のとおり行った。 配列番号 148— 145、 配列番号 1 14 _ 149の 解析； 94°C1分の後、 変性 98 °C 5秒、 アニーリング 伸長 72°C10分を 3サイクル、 変性 98°C5秒、 ァニ一リング /伸長 70°C10分を 2サイクル、 変性 98°C5秒、 ァニー リング 伸長 68°C6分を 25サイクル、 伸長 72°C10分。 配列番号 1 14— 145の解 析； 94°C1分の後、 変性 98 °C 5秒、 アニーリング 伸長 72°C 6分を 3サイクル、 変 性 98°C5秒、 ァニ一リング 伸長 70°C10分を 2サイクル、 変性 98 °C 5秒、 ァニ一リ ング /伸長 68°C 6分を 30サイクル、伸長 72°C10分。 P CR反応液には MG S O 4 (終 濃度 0. 5M ) で添加した。
その結果、上記 HAT耐性 12株のうち 6株において上記組み合わせのプライマーでの予測 される増幅産物を確認した。
(3 _ 3) サザンブロット解析
長腕遠位欠失体を構造確認及び選別するためにサザンブロッ ト解析を行った。 長腕遠位 欠失により生じる標的配列、 染色体アレル及びプローブの位置を図 84に示した。 相同 組換えの 5' 側プローブは実施例 1 ( 1-4) 記載の 5' PROBE- 1を 3' 側プローブは実施 例 28 (1-4)記載の 3' PROBE- 6を用いた。
1次スクリーニング (PCR)で得た候補 6 クローンからゲノム DN A約 5 MGを制限酵 素 KPNI (口シュ） により消化し、 AUSUBELら (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. , 1994) に記された方法でサザンブロッ ト解析を行った。 32P により標識したプローブがハイブリダィズしたシグナルを、 イメージアナライザー Ty p h o o n 9 2 1 0 (モレキュラーダイナミクス） により検出した。 塩基配列から予想 される制限酵素断片長は、 5 ' 側標的配列では相同組換え体で 1 6. 5 k b、 組換え前 のクローンで 1 2 k bであり、 3 ' 側標的配歹 ljでは相同組換え体で 1 6. 5 k b、 組換 え前のクローンで 7. 6 k bである。 その結果、 6株全てにおいて長腕遠位欠失体を確 した
(3-4) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 9 94) に記された 方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 上 記 （3— 3) で取得した 6クローンについて解析した結果、 4クローンにおいて正常核 型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて長腕遠位を削除したヒ ト 2 1番染色体断片が C o t 1で染まっており、 1コピーのシグナルを検出した。
以上 （3— 1) から （3— 4) の実験から、 得られた HAT耐性 CHO雑種細胞は、 テロメァおよひ'サブテロメァを残して長腕遠位を削除したヒ ト 2 1番染色体断片 （2 1 NA qHAC) を保持することを確認した。 実施例 2 9
2 1 N A q HACベクタ一の CHO雑種細胞での長期安定性解析
(1) 非選択培養条件下での長期継代培養
2 1 N Δ q HACベクタ一の CHO雑種細胞における安定性を確認するために、 非選 択条件下で長期継代培養を行った。 実施例 28に記載した 2 I NA qHACベクターを 保持する CHO細胞株 2株 （CHO (2 1 q N - H A C ) 1 7, 1 8) を使用した。 非 選択培養液は 1 0%F B Sを含むF 1 2培地であり、 選択培養液はこれに 1 xHATを 添加した。 CHO細胞株は 5. 0 X 1 05細胞を 1 0 cm径ディッシュに播種し、 細胞密 度が 80〜90%飽和程度まで培養した細胞を計数して再び 5.0 X 1 05細胞を 1 0 c m径ディッシュに播種し、 1 0継代まで行った。 継代毎に細胞数を計数して集団倍加数 を算出した。 C HO細胞株は 1 0継代後にそれぞれ細胞を回収し F I SH用染色体標本 を作製した。
(2) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコ一ル， 秀潤社， 1 994) に記された 方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行った。 細 胞集団倍加数および H A C保持率は 2連で行った結果の平均値を算出した。 上記 2株に ついてその結果を表 1 1に示す。 表 1 1 ： 21NAqHACベクターの CH0細胞における安定性
Figure imgf000165_0001
2 1 N Δ q HACベクターは、 CHO細胞において 1 0継代後までの時点で安定に保 持されていた。 また分裂中期の染色体像を観察したところ、 細胞あたり 1ないし 2個の シグナルが検出された。
以上の （1) 及び （2) の実験により、 2 I NA qHACベクタ一は、 CHO細胞に おいて非選択培養条件で安定に保持されること、 また細胞あたりのコピー数は維持され ていることが明らかとなった。 実施例 30
h E P 0- 2 1 A q H A Cベクタ一の C H O雑種細胞での h E PO遺伝子発現解析 (1) 2 1 N Δ q HAC長腕近位へのクローユング部位の導入
(1— 1) Ι ο χ Ρ及び 3， n e o及び FRT配列揷入用 p S F 1 (FRT) — Dべク ターの構築
ヒ ト人工染色体 （2 1 ΝΔ q HAC) に 1 o x P及び 3' n e o及び FRT配列を挿入 するための基本プラスミ ドには、 実施例 1 8 (1) で作製した t l p S F l (FRT) を用いた。 Ι ο χ Ρ及び 3 ' n e o及び FRT配列挿入部位であるヒ ト 2 1番染色体長 腕近位の塩基配列は G e n B a n kデータべ一スより得た （登録番号 NT— 0 1 1 5 1 5 )。相同組換えの 2つの標的配列増幅に用いたプライマ一オリゴヌクレオチドの配列を 以下に示す：
謂 11515 - 3429039F— Sail： 5' - gacagtGTCGACcggattgagagacacacatagctg (配歹 IJ番号 1 5 0)
NT011515- 3431553R— Srfl ： 5'- gatGCCCGGGCCTGTCAACCTGCCAGTTCTCAGGAG (配列番号 1 5 1)
ヒ ト 2 1番染色体を保持する A 9 < 2 1— 2 >細胞から抽出したゲノム DNAを铸型 として 2つの標的配列を PC Rにより増幅した。 配列番号 1 34— 1 35で増幅した約 3. 4 k bの DNA断片 （相同領域 1) を P a c Iおよび Nh e I (ロシュ） で消化し、 配列番号 1 50— 1 5 1で増幅した約 2. O k bの DNA断片 （相同領域 4) を制限酵 素 S a 1 Iおよび S r f I (ロシュ） で消化し、 突出末端をもつ D N A断片をそれぞれ ァガロースゲル電気泳動により分離し、 精製した。 次に制限酵素消化した相同領域 1の DNA断片と Nh e Iおよび S c a Iで消化した t 1 p S F 1 (FRT)プラスミ ド（実 施例 1 8 (1) で作製） と実施例 1 (2— 1) で作製した p S F 1③を S c a Iおよび P a c Iで消化したの 3つの DNA断片を 3フラグメントライゲ一ションした。 このべ クタ一を S a 1 Iおよび S r f Iにより消化し、 制限酵素消化した相同領域 4をクロー ニングし、 p S F l (FRT) —Dとした。 最終的な p S F 1 (FRT) — Dコンス ト ラタ トのサイズは約 1 1. 8 k bである。 ターグティングベクター、 標的配列、 及び相 同組換えにより生じる染色体アレルを図 85および図 86に示した。
( 1 - 2 ) 長腕近位および遠位へ 1 o X Pを導入したヒ ト 2 1番染色体の h p r t欠損 40細胞への移入
長腕近位および遠位へ 1 o X Pを導入したヒ ト 2 1番染色体を保持する h p r t欠損 D T 40雑種細胞は、 同染色体を保持する実施例 28 (2) で作製した CHO (k kNT) 6細胞を染色体供与細胞としてミクロセル法により調製した。 染色体受容細胞である h p r t欠損 DT40は DT4032株 (Fukagawa et al. Nucleic Acids Research, 1996) を用いた。 以下に調製法の概略を記す。
はじめに約 1 X 1 08個の CH0(kkNT)6 細胞からミクロセルを調製した。 25 c m2遠 心用フラスコ （ヌンク） 1 2本に細胞密度が〜 80%飽和程度まで挎養した CH0(kkNT)6 細胞をコルセミ ド （0. 1 μ gZm 1 , デメコルシン， 和光純薬） を含む培養液 （20% ゥシ胎仔血清； FB S, 0. 8mg/m 1 G 4 1 8 , F12) 中で 72時間培養して微小 核を誘導した。 本実施例において、 DMEMは二ッスィ製薬製のものを用いた。 培地を 除いた後、 予め保温 （34°C) しておいたサイ トカラシン B (DMEM中に 1 0 μ gZ m l , シグマ） 溶液を遠心用フラスコに満たし、 34°C, 8 0 0 0 r pm, 1時間の遠 心を行った。 ミクロセルを無血清培地 （DMEM) に懸濁して回収し、 ポアサイズ 8 /1 m、 5 /x m、 3 μ mのフィルター （ワッ トマン） を装着した S W I N N E X— 2 5 (ミ リポア） を用いて濾過精製した。 精製したミクロセルは DMEM6 m 1に再懸濁した。 DT 4 032 細胞は、 1 0%F B S、 1 % C S , 0. 1 mM 2 _MEを含むR PM I 1 640培養液にて培養後、 DMEMで 2回洗浄し、 1 X 1 07個を DMEM 5 m 1に再懸 濁した。 ミクロセル懸濁液を室温， 1 5 0 0 r p,m, 5分間遠心し、 これに DT 4 032 細胞懸濁液を重層後、 室温， 1 5 00 r pm， 5分間遠心し上清を取り除いた。 ポリエ チレングリ コール （P EG) 1:1.4溶液 （Tomizukaら， Nature Genet. (USA), 第 16卷， p.133-143, 1997 年） で 9 0秒間融合処理した。 融合細胞を 6 0 m 1 の 1 0 % F B S、 .1 %ニヮトリ血清 （C h S), 0. 1 mM 2—メルカプトエタノール （ME) を含む R PM I 1 64 0培養液 （インビトロジェン製） に懸濁し、 9 6穴プレートの 6枚に播ぃ て 24時間培養した後、 l m gZm 1 の G 4 1 8を含む培地で約 2週間選択培養した。. 2回のミクロセル融合実験から出現した薬剤耐性のコロニーを単離した。 G418耐性株ゲ ノム DN Aを铸型としてヒ ト 21 番染色体上に存在する遺伝子のゲノム領域の存在を実 施例 2 8 (2-2) 記載の P CR法により確認し、 更にヒ ト特異的プローブ C o t 1 (ギ ブコ B R L) を用いた蛍光 i n s i t uハイブリダイゼーション （F I SH) 解析に より 1 コピーのヒ ト 2 1番染色体を保持するクローン DT 4 0 3 2 (KKNT) 8, 9 を確認し取得した。
( 1-3) C r e - 1 o X P部位特異的組換え反応による長腕遠位の削除
( 1-3— 1 )長腕遠位及び近位へ 1 o X P配列挿入したヒ ト 2 1番染色体保持 DT 4 0 3 2雑種細胞への C r e発現ベクターの導入
実施例 1 ( 1一 2) の方法に従い、 C r e発現ベクター p C AGG S— C r eを実施例 30 ( 1-2) で取得した DT 40 3 2 (k k NT) _ 8及び DT 4 0 3 2 (k k'NT) _ 9細胞に導入した。 HAT (S I GMA, 終濃度 1 x ) で選択培養を行い、 2〜3 週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。
4回のトランスフエクションから合計 4 3個の HAT耐性コロニーを単離して増殖させ 以後の解析を行った。
( 1-3 - 2) P CR解析 HAT耐性株のゲノム DN Aを铸型として 2つの 1 o X P配列間の欠失を実施例 30
(3-2) と同様に PCR法により確認した。
その結果、 上記 HAT耐性 43株のうち 40株において上記組み合わせのプライマーで の予測される増幅産物を確認した。
(1-3— 3) サザンプロッ ト解析
1次スクリーニング （PCR) で得た候補のうちの 25クローンからゲノム DNAを 抽出し実施例 30 (3-3) と同様にサザンプロッ ト解析を行った。 その結果、 25クロ —ン中 5株おいて長腕遠位欠失体を確認した。
(1-3 -4) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコ一ル， 秀潤社， 1 9 94) に記された 方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジヱン） をプローブに用いて行った。 上 記 （1-3— 3) で取得した 5クローンについて解析した結果、 4クローンにおいて正常 核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて長腕遠位を削除したヒ ト 2 1番染色体断片 が C o t .1で染まっており、 1コピーのシグナルを検出した。
以上 （1-3— 1) から （1-3— 4) の実験から、 得られた HAT耐性 DT 403 2 雑種細胞は、 テロメァおよびサブテロメァを残して長腕遠位を削除したヒ ト 2 1番染色 体断片 （2 1 NA qHAC) を保持することを確認した。
(1-4) 2 1 N Δ q HAC保持 DT 403 2細胞への p S F 1 (FRT) — Dベクタ一 導入
p S F l (FRT) —Dコンス トラクトを制限酵素 S r f I (ロシュ） 消化により線状 化し、 長腕遠位を削除した 2 1 N Δ q HACを保持する DT 4032雑種細胞 3種 （D T 4032 (k kNTC) 1 5， 1 7, 22 ) にそれぞれ導入した。 方法は、 実施例 1
(2 - 2) に従って行った。 2〜3週間後にはブラストサイジン耐性コロニーが出現し た。 DT4032 (k k TC) 1 5では、 各 2回のトランスフエクシヨンから合計 1 25個の薬剤耐性コロニーを、 DT 4032 (k kNTC) 1 7では、 各 2回のトラン スフ'ェクシヨンから合計 1 1 ◦個の薬剤耐性コロニーを、 また DT403 2 (k k NT C) 2 2では各 2回のトランスフエクションから合計 1 24個の薬剤耐性コロニーを単 離し、 以後の解析を行った。
(1-5) PCR解析
上記ブラストサイジン耐性株のゲノム DN Aを铸型として 5 ' および 3 ' 側の 2標的配 列の存在を配列番号 1 1 4— 1 3 9のプライマーセッ トおよび配列番号 1 45— 1 38 のプライマーセッ トを用いた PCR法により検出できる。 その位置は図 86中に矢印で 示す。 T a qポリメラーゼは LA T a q (宝酒造） を用い、 PCR反応液には Mg S 04 (終濃度 0. 5mM) で添加した。 反応条件は 94 °C 1分の後、 変性 98 °C 5秒、 アニーリング Z伸長 7 2°C8分を 3サイクル、 変性 98°C5秒、 アニーリング 伸長 7 0°C8分を 2サイクル、 変性 98 °C 5秒、 アニーリング Z伸長 68 °C 8分を 30サイク ル、 伸長 72 °C 1 0分で行うことができる。
(1-6) サザンブロッ ト解析
長腕遠位欠失体を構造確認及び選別するためにサザンプロッ ト解析を行うことができ る。 長腕遠位欠失により生じる標的配列、 染色体アレル及びプローブの位置を図 86に 示す。 相同組換えの 5 ' 側プローブは実施例 23 (1-4) 記載の 5 ' p r o b e _ lを 3 ' 側プローブは実施例 28 (1-4) 記載の 3 ' p r o b e— 6を用いる。
1次スクリーニング （PCR) で得た株から抽出したゲノム DNA約 5 /X gを制限酵 ¾K ρ η I (ロシュ) により消ィ匕し、 A u. s u b e 1 ら (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. , 1994) に記された方法でサザンブロッ ト解析を行う ことができる。 32Pにより標識したプローブがハイブリダィズしたシグナルを、 ィメー ジアナライザー T y p h o o n 92 1 0 (モレキュラーダイナミクス） により検出でき る。 塩基配列から予想される制限酵素断片長は、 5 ' 側標的配列では相同組換え体で 1 l k b、 組換え前のクローンで 1 6. 5 k bであり、 3 ' 側標的配列では相同組換え体 で 6. 2 k b、 組換え前のクローンで 1 6. 5 k bである。
以上の （1-1) 〜 （1-6) の実験により、 相同組換えによりクローユング部位 （ 1 o x P及び 3' n e o及び FRT配列） が挿入された 2 1 N Δ q H A Cベクターを保持 する DT403 2雑種細胞を取得できる。
(2) CHO細胞への 2 1 N Δ q HACベクター移入
(2— 1) ミクロセル法による 2 1 ΝΔ q H ACベクターの CHO細胞への移入 染色体供与細胞として、 上記実施例 30 (2) で得られた、 長腕遠位を削除してクロ 一二ング部位 （ 1 o X P及び 3 ' n e o及び F RT配列） が挿入された 2 1 N Δ q HA Cベクターを保持する DT 403 2雑種細胞をそれぞれ用いる。 染色体受容細胞として はチャイニーズハムスター由来細胞株 CHO— K 1 (登録番号 J CRB 90 1 8) を用 いる。 方法ほ、 実施例 1 (3— 1) に従って行うことができる
(2- 2) PCR解析
ブラストサイジン耐性株のゲノム DNAを铸型として 5 ' および 3 ' 側の 2標的配列の 存在 PCR法により検出できる。 方法は、 実施例 30 (1-5) に従う。 塩基配列から 予想されるサイズ （5' g e n ome約 7. 5 k b及び 3 ' g e n ome約 5· 3 k b) の増幅産物を与えることを確認できる。
( 2 - 3 ) サザンブロッ ト解析
移入した 2 1 N Δ q HACベクタ一の構造を確認するためサザンブロッ ト解析を実施 例 30 (1-6)と同様に行ケことが出来る。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、 5 ' 側標的配列では相同組換え体で 1 1 k b、 組換え前のクローンで 1 6. 5 k bであ り、 3， 側標的配列では相同組換え体で 6. 2 k b、 組換え前のクローンで 1 6. 5 k bである。 （2— 4) F I SH解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 9 94) に記された 方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェ ） をプローブに用いて行うことが できる '
以上 （2— 1) から （2— 4) の実験から、 得られたプラス トサイジン耐性 CHO株 は 2 1 ΝΔ qH ACベクターを保持することを確認できる。 '
(3) h E PO— 2 1 ΝΔ q HACベクターの構築
(3— 1) 2 1 ΝΔ qHACベクタ一への hEPO遺伝子の導入
実施例 30 (2) で構築した 2 1 ΝΔ qHACベクターへ hE PO遺伝子発現ユニッ ト を挿入する。 1 o X P配列を含む h E PO発現プラスミ ドを準備し、 C r e組換え酵素 を一過性に発現させることで 1 o X P配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体 に挿入する。 組換え揷入体の選別は、 G4 1 8耐性の獲得 （プロモーター分断型の n e o耐性遺伝子発現ユニッ トの再構成） を指標とした。 実施例 30 (2) で作製した 2 1 N厶 qHACベクタ一を保持する CHO雑種細胞を用いて、 実施例 3 (1 - 1) と同様 にして h E PO遺伝子発現ュニッ トの挿入を行った。 2〜 3週間後には G 4 1 8耐性の コロニ一を単離して増殖させることができる。
(3- 2) P CR解析
hE PO遺伝子発現ュニッ ト組換え挿入体の選別は、 2 1 ΝΔ qHACベクター上の 1 o X P配列部位に挿入されたか否かを、 1 o X P配列部位を挟むように p LN 1— E P Oベクタ一上及び 1 4ΝΔ q H ACベクター上に設計したプライマー SVp AN p 1お よび N e o R p 2によって、 また挿入された h E PO遺伝子を、 プラスミ ドベクター p B S 226上の 1V11 3 R Vおよび N e 0 R p 2プライマーによって、 PCR増幅に より確認できる。 プライマー配列および PC Rは K a k e d a らの方法 （K a k e d a ら、 G e n e T h e r a p y ; 1 2 : 8 5 2 - 8 5 6 , 2 00 5年） に従う。 組換え挿入体の場合は、 プライマー S V p AN p 1および N e o R p 2により約 1. 0 k b p、 プライマー M 1 3 R Vおよび N e o R p 2により約 2. 7 k b pの増幅が 予想される。 以上より、 上記の G 4 1 8耐性 CHO雑種細胞が 1 o X P配列への h E P O遺伝子発現ュニッ ト組換え挿入体であることが確認できる。
(3 - 3) サザンプロット解析
h E P 0- 2 1 Ν Δ q HACベクターにおいて h E PO発現ュニッ ト構造が正しく保 持されているか否かを調べるために、サザンプロッ ト解析を行うことができる。方法は、 K a k e d aら （G e n e T h e r a p y ； ,1 2 : 8 5 2— 8 5 6 , 2 0 0 5 年） に従った。 塩基配列から予想される X b a I消化による制限酵素断片長は、 h E P O発現ユニッ トを含む 5. 5 k bである。 （3— 4) F I S H解析
F I SH解析は、 松原ら （F I SH実験プロ トコール， 秀潤社， 1 9 94) に記された 方法に従い、 ヒ ト特異的 C o t 1 (インビトロジェン） をプローブに用いて行うことが できる。 以上 （3— 1 ) から （3— 4) の実験から得られた上記の G 4 1 8耐性 CHO 雑種細胞 * *株は、 h E PO— 2 1 ΝΔ q H A Cベクターを保持する正常核型の C H O 細胞であることを確認できる。
(4) 2 1 ΝΔ q HACベクタ一へ揷入された h E PO遺伝子の発現
h E PO遺伝子の発現は、 培養上清中に産生される h E POタンパク質を酵素結合免疫 吸着検定法 （E L I S A法） により定量できる。
上記 （3) において単離した h E PO- 2 1 Ν Δ q HA Cベクターを保持する G 4 1 8耐性 CHO雑種細胞を、 約 1 05細胞を 1 0 % F B S添加した 0. 8 g m 1の G 4 1 8を含む F 1 2培地 2m 1をいれた 1 2穴組織培養用プラスチックシャーレ （ファ ルコン） に播種し、 コンフレント到達後、 1 0%F B Sを添加した F 1 2培地 2 m 1に 置き換え 2日間培養し、 1 0%F B Sを添加した F 1 2培地 1 m 1に置き換えさらに 2 4時間培養した後、 上清を回収および細胞数を計数できる。 h E PO E L I SAキッ ト (Q u a n t i k i n e I V D Hum a n E PO I mmu n o a s s a y , R&Dシステム） により、 培養上清中の h E POを定量できる上記 h E PO_ 2 1 N厶 q HACベグタ一を保持する G 4 1 8耐性 C HO雑種細胞において h E P Oの発現を確 認できる。 産業上の利用可能性 本^明により、 ヒ ト人工染色体 （HAC) ベクタ一及びその作製方法が提供される。 かかる HACベクターは、 細胞において安定に保持され、 かつ挿入された外来 DNAを 高発現可能なものである。 従つて、 かかる HACベクターは、 遺伝子発現解析、 遺伝子 治療、 遺伝子導入、 タンパク質製造などの多様な用途に有用である。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として本明細 書にとり入れるものとする。 配列表フリーテキス ト
配列番号 1〜 109 ：合成オリゴヌクレオチド，
配列番号 1 10〜 1 17 ： プライマー
配列番号 1 18〜： I 21 ： プローブ
配列番号 122〜 177 ： プライマー
. 配列番号 178〜 179 : リンカ一

Claims

請求の範囲
1. 長腕遠位及び 又は短腕遠位が削除されたヒ ト染色体断片であって、
( i ) ヒ ト染色体由来のセントロメァ、
( i i ) テロメァ配列、
( i i i ) サブテロメァ配列、 並びに
( i V ) 外来 DNA
を含むヒ ト染色体断片を含むことを特徴とするヒ ト人工染色体 （HAC) ベクタ一。
2. テロメァ配列及びサブテ口メァ配列が哺,乳動物染色体の長腕又は短腕由来であ る、 請求項 1記載の HACベクター。
3. テロメァ配列及びサブテロメァ配列がヒ ト染色体の長腕又は短腕由来である、 請求項 1記載の H ACベクター。
. 4. サブテロメァ配列がヒ ト染色体の長腕由来である、 請求項 1記載の HACべク ター。 '
5. ヒ ト染色体断片が、 ヒ ト染色体から長腕遠位が削除された部位に、 該ヒ ト染色 体と同じ又は異なるヒ ト染色体の長腕由来のサブテロメァ配列を含む、 請求項 1記載の HACベクタ一。
6. テロメァ配列及びサブテロメァ配列がヒ ト 14番染色体の 14 q 32領域内の 部位から 1 4 q— t e 1領域までの配列である、 請求項 1記載の H A Cベクター。
7. テロメァ配列及びサブテロメァ配列がヒ ト 2 1番染色体の 2 1 q 22. 3領域 內の部位から 2 1 q— t e 1領域までの配列である、 請求項 1記載の H A Cベクター。
8. サブテロメァ配列が約 1〜500 k bである、請求項 1記載の HACベクタ一。
9. サブテロメァ配列が約 5〜60 k bである、 請求項 8記載の HACベクター。
1 0. ヒ ト染色体断片が約 1 9Mb以下のサイズである、 請求項 1記載の HAC クタ一。
1 1. 外来 DNAが、 タンパク質をコードする外来 DNAである、 請求項 1記載の HACベクタ一。
1 2. 外来 DNAが、 前記ヒ ト染色体断片において前記長腕遠位又は短腕遠位の削 除位置より近位の部位に揷入される、 請求項 1記載の H ACベクタ一。
1 3. 外来 DNAがテロメァ配列から 1〜 500 k bの領域に挿入された請求項 1 記載の HACベクタ一
1 4. ヒ ト染色体断片が、ヒ ト 14番染色体断片又はヒ ト 2 1番染色体断片である、 請求項 1に記載の H ACベクタ一。
1 5. ' ヒ ト染色体断片が、 ヒ ト染色体の長腕遠位が削除されておりかつ長腕近位及 び短腕を含む、 請求項 1又は 14記載の HACベクター。
1 6. ヒ ト染色体断片が、 ヒ ト染色体の短腕遠位が削除されておりかつ短腕近位を 含む、 請求項 1又は 1 4記載の HACベクター。
1 7. ヒ ト染色体断片が、 ヒ ト染色体の長腕遠位及び短腕遠位がともに削除されて おりかつ長腕近位及び短腕近位を含む、 請求項 1又は 1 4記載の H ACベクター。
1 8. ヒ ト染色体断片の長腕遠位がヒ ト染色体長腕の q 1 1領域内又は q 1 1領域 から q 1 2領域内で削除されている、 請求項 1又は 14記載の HACベクター。
1 9. ヒ ト染色体断片がヒ ト 14番染色体断片であり、 かつ、 ヒ ト 1 4番染色体断 片の長腕遠位がヒ ト 14番染色体の A L 39 1 1 56において又は A L 39 1 1 56よ りも近位の位置において削除されている、 請求項 1又は 1 4記載の HACベクタ一。
20. ヒ ト染色体断片がヒ ト 2 1番染色体断片であり、 かつ、 ヒ ト 2 1番染色体断 片の長腕遠位がヒ ト 2 1番染色体の A P 00 1 6 5 7において又は A P 00 1 65 7よ りも近位の位置において削除されている、 請求項 1又は 14記載の HACベクター。
2 1. ヒ ト染色体断片の短腕遠位がヒ ト染色体短腕の p 1 1領域内又は p 1 1領域 から p 1 2領域內で削除されている、 請求項 1又は 1 4記載の HACベクタ一。
22. ヒ ト染色体断片が、
( i V ) 少なくとも 1つの部位特異的組換え酵素の認識部位
をさらに含む、 請求項 1記載の HACベクタ一。
23. ヒ ト染色体断片が少なく とも 2種類の部位特異的組換え酵素の認識部位を含 む、 請求項 22記載の HACベクタ一。
24. 部位特異的組換え酵素の認識部位が、 ヒ ト染色体断片の長腕近位及び 又は 短腕近位に挿入されている、 請求項 22又は 23記載の HACベクター。
25. 部位特異的組換え酵素が C r e酵素であり、 部位特異的組換え酵素の認識部 位が 1 o X P配列である、 請求項 22又は 23記載の HACベクター。
26. 部位特異的組換え酵素が F L P e酵素であり、 部位特異的組換え酵素の認識 部位が FRT配列である、 請求項 22又は 2 3記載の HACベクター。
27. 請求項:！〜 26のいずれか 1項に記載の H ACベクタ一を有する細胞。
28. ヒ ト人工染色体 （HAC) ベクタ一の作製方法であって、 以下のステップ： (a) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する細胞を得るステップ；
(b) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠位及び 又は短腕遠位を削除するス テツプ；
(c ) 削除される長腕及び 又は短腕の部位にテロメァ配列を付加するステップ；並び に
( d ) 削除される長腕及び 又は短腕の部位にサブテロメァ配列を付加するステップ を含む、 上記作製方法。
29. ステップ （b) において、 ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠位及び/ 又は短腕遠位の削除を部位特異的組換え酵素を用いて行うものである、 請求項 28記载 の方法。
30. ステップ （b) 及び （c) において、 ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕 遠位及び Z又は短腕遠位をテロメァ配列との置換により削除して、 該ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片にテロメァ配列を付加する、 請求項 28記載の方法。
3 1. ステップ （b) 及び （c) において、 ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕 遠位及び/又は短腕遠位における少なく とも 2箇所を切断することにより、 該長腕遠位 及びノ又は短腕遠位を削除し、 かつ削除された長腕及び Z又は短腕の部位にテロメァ配 列を付加する、 請求項 28記載の方法。
3 2. ステップ （b) 〜 （d) において、 ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠 位及び/又は短腕遠位における少なく とも 2箇所を切断することにより、 該長腕遠位及 び 又は短腕遠位を削除し、 かつ削除された長腕及びノ又は短腕の部位に該ヒ ト染色体 又はヒ ト番染色体断片由来のテロメァ配列及びサブテロメァ配列を付加する、 請求項 2 8記載の方法。
3 3. , テロメァ配列及びサブテロメァ配列がヒ ト 14番染色体の 1 4 q 32領域内 の部位から 14 q— t e 1領域までの配列である、 請求項 28記載の方法。
34. テロメァ配列及びサブテロメァ配列がヒ ト 2 1番染色体の 2 1 q 22. 3領 域内の部位から 2 1 q - t e 1領域までの配列である、 請求項 28記载の方法。
3 5. ステップ （b) において、 ヒ ト染色体又はヒ ド染色体断片の長腕遠位を長腕 q 1 1領域内又は q 1 1領域から q 1 2領域内で削除する、 請求項 28記載の方法。
3 6. ステップ （b) において、 ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片がヒ ト 14番染色 体又はヒ ト 14番染色体断片であり、 かつヒ ト 1 4番染色体又はヒ ト 1 4番染色体断片 の長腕遠位をヒ ト 1 4番染色体の AL 3 9 1 1 56において又は AL 39 1 1 56より も近位の位置において削除する、 請求項 28記載の方法。
3 7. ステップ （b) 〜 （d) において、 ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片がヒ ト 1 4番染色体又はヒ ト 1 4番染色体断片であり、 かつヒ ト 14番染色体又はヒ ト 14番染 色体断片の 14 q 1 1領域において長腕遠位を削除して、 削除された長腕遠位の部位に 該ヒ ト 14番染色体又はヒ ト 14番染色体断片の 1 4 q 32領域内の部位から 14 q— t e 1領域までのテロメァ配列及びサブテロメァ配列を付加する、 請求項 28記載の方 法。
38. ステップ （b) において、 ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片がヒ ト 2 1番染色 体又はヒ ト 2 1番染色体断片であり、 かつヒ ト 2 1番染色体又はヒ ト 2 1番染色体断片 の長腕遠位をヒ ト 2 1番染色体の A P 00 1 6 5 7において又は A P 00 1.65 7より も近位の位置において削除する、 請求項 28記載の方法。
39. ステップ （b) 〜 （d) において、 ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片がヒ ト 2 .1番染色体又はヒ ト 2 1番染色体断片であり、 かつヒ ト 2 1番染色体又はヒ ト 2 1番染 色体断片の 2 1 q 1 1領域において長腕遠位を削除して、 削除された長腕遠位の部位に 該ヒ ト 2 1番染色体又はヒ ト 2 1番染色体断片の 2 1 q 22. 3領域内の部位から 2 1 q - t e 1領域までのテロメァ配列及びサブテロメァ配列を付加する、 請求項 28記載 の方法。
40. (e) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に少なく とも 1つの部位特異的組換え 酵素の認識部位を揷入するステップ
をさらに含む、 請求項 28記載の方法。
4 1. ステップ （e) において、 部位特異的組換え酵素が C r e酵素であり、 部位 特異的組換え酵素の認識部位が 1 o X P配列である、 請求項 40記載の方法。
42. ステップ （e) において、 部位特異的組換え酵素が F L P e酵素であり、 部 位特異的組換え酵素の認識部位が FRT配列である、 請求項 40記載の方法。
4 3. ステップ （e) において、 ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片がヒ ト 14番染色 体又はヒ ト 14番染色体断片であり、 かつ部位特異的組換え酵素の認識部位をヒ ト 1 4 番染色体又はヒ ト 1 4番染色体断片の長腕の A L 3 9 1 1 5 6に又は AL 39 1 1 56 における削除位置よりも近位の位置に揷入する、 請求 ¾40記載の方法。
44. ステップ （e) において、 ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片がヒ ト 2 1番染色 体又はヒ ト 2 1番染色体断片であり、 かつ部位特異的組換え酵素の認識部位をヒ ト 2 1 番染色体又はヒ ト 2 1番染色体断片の長腕の AP 00 1 6 5 7に又は A P 00 1 6 5 7 における削除位置よりも近位の位置に挿入する、 請求項 40記載の方法。
4 5. 請求項 28〜44のいずれか 1項に記載の方法により得られる、 請求項 1記 載のヒ ト人工染色体 （HAC) ベクタ一。
46. 請求項 45記載の HACベクターを保持する細胞。
4 7. 外来 DNAを含むヒ ト人工染色体 （HAC) ベクターの作製方法であって、 以下のステップ：
(a) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する細胞を得るステップ；
(b) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠位及びノ又は短腕遠位を削除するス テツプ； .
( c ) 削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメァ配列を付加するステップ； ( d ) 削除される長腕及び/又は短腕の部位にサブテ口メァ配列を付加するステップ (e) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に少なくとも 1つの部位特異的組換え酵素の認識 部位を挿入するステップ；並びに
( f ) 部位特異的組換え酵素の存在下にてヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に外来 DN A を挿入するステップ . を含む、 上記方法。
4.8. 外来 DNAを含むヒ ト人工染色体べクタ一 （HAC) の作製方法であって、 以下のステップ：
(a) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する細胞を得るステップ；
(b) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠位及び 又は短腕遠位を削除するス ' テツプ；
( c ) 削除される長腕及び 又は短腕の部位にテロメァ配列又はテ口メァ配列及びサブ テロメァ配列を付加するステップ；
(d) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に少なくとも 2種類の部位特異的組換え酵素の認 識部位を揷入するステップ；
(e) 部位特異的組換え酵素の存在下にてヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に外来 DN A を挿入するステップ；並びに
( f ) ステップ （e) で用いたものとは異なる種類の部位特異的組換え酵素の存在下に てヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片上の薬剤耐性遺伝子を除去するステップ
を含む、 上記方法。
4 9. ヒ ト染色体がヒ ト 14番染色体又はヒ ト 2 1番染色体である、 請求項 4 7又 は 48記載の方法。
50. 薬剤耐性遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子である、 請求項 48記載の方法。 5 1. 請求項 4 7又は 48記載の方法により得られる、 請求項 1記載の外来 DNA を含む HACベクター。
52. 請求項 5 1記載の外来 DNAを含む HACベクタ一を保持する細胞。
5 3. ヒ ト細胞である、 請求項 2 7又は 5 2記載の細胞。
54. ヒ ト細胞がヒ ト体細胞である請求項 5 3記載の細胞。
55. チャイニーズハムスター卵巣 （CHO) 細胞である、 請求項 2 7又は 52記 載の細胞。
56. 請求項 1〜 26のいずれか 1項に記載の H ACベクター、 又は請求項 4 7又 は 48記載の方法により得られる外来 DNAを含む HACベクターを保持する細胞を含 む医薬組成物。
5 7. 外来 DNA力 、エリスロポイエチン（E PO)、 トロンボポイエチン（TPO)、 血液凝固因子、 フォンヴィルブランド因子 （vWF)、 ジストロフィン、 ドーパミン合成 酵素、 インスリン、 インスリン様増殖因子 （ I GF)、 インスリン様増殖因子結合タンパ ク質 （ I GFB P)、 抗体、 テロメラーゼ、 顆粒球コロニー刺激因子、 顆粒球 ·マクロフ ァージコロニー刺激因子、 免疫グロブリン、 成長ホルモン、 インターロイキン 2、 イン ターロイキン 3、 インターロイキン 4、 インタ一ロイキン 5、 インターロイキン 6、 ィ ンタ一ロイキン 7、インターロイキン '8、インターロイキン 9、·インターロイキン 1 0、 インターロイキン 1 1、 インターロイキン 1 2、 インタ一ロイキン 1 5、 CD40リガ ンド、 インターフェロン、 アデノシンデァミナ一ゼ、 α— 1アンチトリプシン、 オル二 チントランス力ルバミラーゼ、 プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、 成長抑制因子 （G I F)、 腫瘍壊死因子 （TNF)、 白血病阻害因子 （L I F)、 オンコスタチン M、 F 1 t 3 リガンド （F 1 t 3 L)、 ストロ一マ由来因子 （SDF)、 幹細胞増殖因子 （S CF)、 繊維芽細胞増殖因子（FGF)、上皮増殖因子（EGF)、血管形成誘導因子（VEGF)、 アンジォポイエチン、 神経成長因子 （NGF)、 骨形成因子 （BMP)、 ァクチビン、 ト ランスフォ一ミング増殖因子 （TGF)、 ウィント （Wn t) アールスポンジン （R s p o n d i n)、 モノクロナール抗体、 オリゴクローナル抗体、 及ぴポリク口ーナル抗体か らなる群より選択される少なく とも 1つのタンパク質をコードするものである、 請求項 56記載の医薬組成物。
58. タンパク質の製造方法であって、 以下のステップ： (a) ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ；
(b) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片の長腕遠位及び 又は短腕遠位を削除するス テツプ；
( c ) 削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメァ配列を付加するステップ；
(d) 削除される長腕及び /又は短腕の部位にサブテロメァ配列を付加するステップ；
(e) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片に部位特異的組換え酵素の認識部位を揷入す るステップ；
( f ) 部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片にタンパ ク質をコードする外来 DN Aを揷入するステップ；
(g) 上記ヒ ト染色体又はヒ ト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製す るステップ；
(h) 上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ；
( i ) 融合した受容細胞を培地中で培養するステップ；並びに
) 得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップ ' を含む、 上記方法。
59. ヒ ト染色体がヒ ト 14番染色体又はヒ ト 2 1番染色体である、 請求項 58記 載の方法。
60. 請求項 1〜26のいずれか 1項に記載の H ACベクターを有する非ヒ ト動物。 6 1. 請求項 1〜26のいずれか 1項に記載の H ACベクターを用いて所望の疾患 を治療する方法。
PCT/JP2007/063944 2006-07-07 2007-07-06 Vecteur de chromosome artificiel humain (cah), et substance pharmaceutique à base de cellules humaines contenant un vecteur de chromosome artificiel humain (cah) WO2008013067A1 (fr)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07768413.2A EP2048229B1 (en) 2006-07-07 2007-07-06 Human artificial chromosome (hac) vector, and human cell pharmaceutical comprising human artificial chromosome (hac) vector
CA002658204A CA2658204A1 (en) 2006-07-07 2007-07-06 Human artificial chromosome (hac) vector and human cell medicine comprising same
CN200780033077.7A CN101535474B (zh) 2006-07-07 2007-07-06 人类人工染色体(hac)载体和包含它的人类细胞药物
JP2008526726A JP5345391B2 (ja) 2006-07-07 2007-07-06 ヒト人工染色体（ｈａｃ）ベクター及びヒト人工染色体（ｈａｃ）ベクターを有するヒト細胞医薬
AU2007277863A AU2007277863A1 (en) 2006-07-07 2007-07-06 Human artificial chromosome (HAC) vector, and human cell pharmaceutical comprising human artificial chromosome (HAC) vector
US12/307,879 US8809045B2 (en) 2006-07-07 2007-07-06 Human artificial chromosome (HAC) vector and human cell medicine comprising same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006188392 2006-07-07
JP2006-188392 2006-07-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2008013067A1 true WO2008013067A1 (fr) 2008-01-31

Family

ID=38981380

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/063944 WO2008013067A1 (fr) 2006-07-07 2007-07-06 Vecteur de chromosome artificiel humain (cah), et substance pharmaceutique à base de cellules humaines contenant un vecteur de chromosome artificiel humain (cah)

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8809045B2 (ja)
EP (1) EP2048229B1 (ja)
JP (1) JP5345391B2 (ja)
KR (1) KR20090036581A (ja)
CN (1) CN101535474B (ja)
AU (1) AU2007277863A1 (ja)
CA (1) CA2658204A1 (ja)
TW (1) TW200817512A (ja)
WO (1) WO2008013067A1 (ja)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010038904A1 (ja) * 2008-09-30 2010-04-08 国立大学法人鳥取大学 外来性核初期化因子またはそれをコードするｄｎａを含まない人工多能性幹細胞およびその作製方法
WO2011062207A1 (ja) 2009-11-17 2011-05-26 協和発酵キリン株式会社 ヒト人工染色体ベクター
WO2011083870A1 (ja) * 2010-01-06 2011-07-14 国立大学法人鳥取大学 マウス人工染色体ベクター
JP2011522540A (ja) * 2008-06-04 2011-08-04 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド 非ウイルスアプローチを用いたｉＰＳ細胞の産生のための方法
JP2012511307A (ja) * 2008-11-28 2012-05-24 オーストリア ヴィルトシャフツゼルヴィース ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 人工染色体ベクター
US9175268B2 (en) 2008-08-12 2015-11-03 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for the production of iPS cells
US9499786B2 (en) 2007-03-23 2016-11-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Enriched population of human pluripotent cells with Oct-4 and Sox2 integrated into their genome
WO2019088257A1 (ja) * 2017-11-02 2019-05-09 国立大学法人鳥取大学 哺乳類人工染色体ベクターを利用するタンパク質の高生産方法
WO2019177163A1 (ja) * 2018-03-16 2019-09-19 国立大学法人鳥取大学 マウス人工染色体ベクター及びその使用
WO2020075822A1 (ja) 2018-10-10 2020-04-16 国立大学法人鳥取大学 外来染色体を含むヒト人工多能性幹細胞の製造方法
WO2020075823A1 (ja) 2018-10-10 2020-04-16 国立大学法人鳥取大学 微小核細胞融合法による目的ｄｎａを含む動物細胞の作製方法
WO2023090372A1 (ja) 2021-11-16 2023-05-25 学校法人東京薬科大学 プロモーター活性化配列、そのプロモーター活性化配列を含む発現ベクター、及びその発現ベクターを含む哺乳動物細胞

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
WO2012075340A2 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Alderbio Holdings Llc Anti-ngf compositions and use thereof
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
CN106318965B (zh) * 2015-06-26 2019-05-07 深圳华大生命科学研究院 人工半合成染色体的整合方法及含有完整合成染色体的微生物
CN112626116B (zh) * 2019-10-08 2022-11-15 黄菁 定点整合大片段外源dna的方法
GB202014751D0 (en) * 2020-09-18 2020-11-04 Lightbio Ltd Targeting vector

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997007671A1 (fr) 1995-08-29 1997-03-06 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Animal chimerique et procede de constitution
WO2000010383A1 (en) 1998-08-21 2000-03-02 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Method for modifying chromosomes
WO2003041495A1 (fr) 2001-11-15 2003-05-22 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Animal chimerique
WO2003097812A2 (en) 2002-05-17 2003-11-27 Hematech, Llc Transgenic ungulates capable of human antibody production
WO2004031385A1 (ja) 2002-10-04 2004-04-15 Kirin Beer Kabushiki Kaisha ヒト人工染色体（ｈａｃ）ベクター
JP2006094849A (ja) 2004-08-30 2006-04-13 Kirin Brewery Co Ltd 相同組換え効率が向上した分化多能性細胞及びその利用
JP2006188392A (ja) 2005-01-06 2006-07-20 Sumitomo Metal Mining Co Ltd 酸化物焼結体、透明導電性薄膜およびその実装素子

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997007671A1 (fr) 1995-08-29 1997-03-06 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Animal chimerique et procede de constitution
WO2000010383A1 (en) 1998-08-21 2000-03-02 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Method for modifying chromosomes
WO2003041495A1 (fr) 2001-11-15 2003-05-22 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Animal chimerique
WO2003097812A2 (en) 2002-05-17 2003-11-27 Hematech, Llc Transgenic ungulates capable of human antibody production
WO2004031385A1 (ja) 2002-10-04 2004-04-15 Kirin Beer Kabushiki Kaisha ヒト人工染色体（ｈａｃ）ベクター
JP2006094849A (ja) 2004-08-30 2006-04-13 Kirin Brewery Co Ltd 相同組換え効率が向上した分化多能性細胞及びその利用
JP2006188392A (ja) 2005-01-06 2006-07-20 Sumitomo Metal Mining Co Ltd 酸化物焼結体、透明導電性薄膜およびその実装素子

Non-Patent Citations (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Development, differentiation, and aging", 1992, TOKYO KAGAKU DOZIN CO., LTD.
"Gene therapy", 1997, YODOSHA, CO., LTD.
"Proceedings of American Association for Cancer Research", vol. 44, July 2003, pages: 1285
ARAKI ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 25, 1997, pages 868 - 872
ARAKI ET AL., PNAS, vol. 92, 1995, pages 160 - 164
AUSUBEL ET AL.: "Current Protocols in Molecular Biology", 1994, JOHN WILEY & SONS, INC.
BARNETT, R.S. ET AL.: "Antibody expression and engineering", 1995, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, pages: 27 - 40
BARTHOLOMEW, A. ET AL., HUM GENE THER, vol. 12, 2001, pages 1527 - 1541
BAUR JA ET AL., SCIENCE, vol. 292, 2001, pages 2075 - 2077
BODNAR ET AL., SCIENCE, vol. 279, 1998, pages 349 - 352
BROACH ET AL., CELL, vol. 21, 1980, pages 501 - 508
BROWN ET AL., P. N. A. S., vol. 93, 1996, pages 7125 - 7130
BROWN, B. D. ET AL., NATURE MEDICINE, vol. 12, 2006, pages 585 - 591
BUCHHOLZ, F. ET AL., NATURE BIOTECH. (USA), vol. 16, pages 657 - 662
CHAMBERS ET AL., CELL, vol. 113, 2003, pages 643 - 655
COOPER ET AL., PROC NATL ACAD SCI U.S.A., vol. 94, 1997, pages 6450 - 6455
COUNTER, C. M. ET AL., EMBO J, vol. 11, 1992, pages 1921 - 1929
CRISROFARI, C. ET AL., EMBO J, vol. 25, 2006, pages 565 - 574
DELLORUSSO ET AL., PROC NATL ACAD SCI, U.S.A., vol. 99, 2002, pages 12979 - 12984
DIEKEN ET AL., NATURE GENETICS, vol. 12, 1996, pages 174 - 182
ELBASHIR ET AL., NATURE, vol. 411, 2001, pages 494 - 498
FUKAGAWA ET AL., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 1996
GARRICK ET AL., NATURE GENET., vol. 18, 1998, pages 56 - 59
GILL ET AL., NATURE MED., vol. 9, 2003, pages 589 - 595
HACEIN-BEY-ABINA ET AL., N ENGL J MED., vol. 348, 2003, pages 255 - 256
HIDEYUKI OKANO: "Experimental Medicine", vol. 19, 2001, YODOSHA CO., LTD., pages: 80 - 90
HINO ET AL.: "Experimental Medicine", vol. 19, 2001, YODOSHA CO., LTD., pages: 10
HOESS ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 14, 1986, pages 2287 - 2300
HOFFMAN ET AL., CELL, vol. 51, 1987, pages 919 - 928
INNIS ET AL.: "PCR Experimental Mannual", 1991, HBJ PRESS
ISHIDA ET AL.: "Bioventure", vol. 2, 2002, YODOSHA, CO., LTD., pages: 44
ITZHAKI ET AL., NATURE GENET., vol. 2, 1992
JIANG ET AL., NATURE GENT., vol. 21, 1999, pages 111 - 114
KADESCH, T. ET AL., MOL CELL BIOL, vol. 6, 1986, pages 2593 - 2601
KAKEDA ET AL., GENE THERAPY, vol. 12, 2005, pages 852 - 856
KAKEDA ET AL., GENE THERAPY, vol. 12, pages 852 - 856
KATO ET AL.: "Genomic Medicine", MEDICAL REVIEW, vol. 3, 2003, pages 53
KATOH ET AL., BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN, vol. 321, 2004, pages 280 - 290
KOCH ET AL., GENE, vol. 249, 2000, pages 135 - 144
KOI ET AL., JPN. J. CANCER RES., vol. 80, 1973, pages 413 - 418
KOI ET AL., SCIENCE, vol. 260, 1993, pages 361 - 364
KOLB ET AL., BLOOD, vol. 76, 1990, pages 2462 - 2465
KUME ET AL.: "Genomic Medicine", MEDICAL REVIEW, vol. 3, 2003, pages 9
KUROIWA ET AL., GENE THER., vol. 9, 2002, pages 708 - 712
KUROIWA ET AL., NATURE BIOTECH., U.S.A., vol. 18, 2000, pages 1086 - 1090
KUROIWA ET AL., NATURE BIOTECH., U.S.A., vol. 20, 2002, pages 889 - 894
KUROIWA ET AL., NATURE BIOTECH., vol. 18, 2000, pages 1086 - 1090
KUROIWA, Y. ET AL., NATUTE BIOTECH, vol. 20, 2002, pages 889 - 894
LEE ET AL., GENE, vol. 216, 1998, pages 55 - 65
LI ET AL., BLOOD, vol. 98, 2001, pages 3241 - 3248
LI ET AL., NATURE MED., 31 August 2003 (2003-08-31), Retrieved from the Internet <URL:doi:10.1038/nm925>
LINARDOPOULOU, E. V ET AL., NATURE, vol. 437, 2005, pages 94 - 100
LINARDOPOULOU, E.V ET AL., NATURE, vol. 437, 2005, pages 94 - 100
LIU ET AL., MOL. THER., vol. 4, 2001, pages 45
MARSHALL ET AL., SCIENCE, vol. 299, 2003, pages 320
MATSUBARA ET AL.: "FISH Experimental Protocol", 1994, SHUJUNSHA CO. LTD.
MATSUDA ET AL., EMBO J., vol. 18, 1999, pages 4261 - 4269
MCCAFFREY ET AL., NATURE, vol. 418, 2002, pages 38 - 39
MEFFORD, H. C. ET AL., NAT REV GENET., vol. 3, 2002, pages 91 - 102
MEFFORD, H.C. ET AL., NAT REV GENET., vol. 3, 2002, pages 91 - 102
MILLS ET AL., HUM. MOL. GENET., U.K., vol. 8, 1999, pages 751 - 761
MITSUI ET AL., CELL, vol. 113, 2003, pages 631 - 642
MOCHIZUKI ET AL.: "Genomic Medicine", MEDICAL REVIEW, vol. 3, 2003, pages 25
MORI ET AL., CELL DEATH AND DIFFERENTIATION, 2003
MORITANI ET AL.: "Protein, Nucleic Acid, and Enzyme", vol. 40, 1995, KYORITSU SHUPPAN CO., LTD, pages: 2764
MORLINO ET AL., PPL ENVIRON MICROBIOL., vol. 65, 1999, pages 4808 - 4013
NING Y ET AL., HUM MOL GENET., vol. 12, 2003, pages 1329 - 1336
NING, Y. ET AL., HUM MOL GENET., vol. 12, 2003, pages 1329 - 1336
NIWA ET AL., GENES DEV., vol. 12, 1998, pages 2048 - 2060
NIWA ET AL., NATURE GENET., vol. 24, 2000, pages 372 - 376
OKANO ET AL.: "Experimental Medicine", vol. 21, 2003, YODOSHA CO., LTD.
ONODERA ET AL.: "Genomic Medicine", MEDICAL REVIEW, vol. 3, 2003, pages 45
OTSUKI ET AL., BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN, vol. 329, 2005, pages 1018 - 1025
PROUDFOOT, N.J. ET AL., NATURE, vol. 332, 1986, pages 562 - 565
REN X. ET AL.: "Human artificial chromosome vectors meet stem cells: new prospects for gene delivery", STEM CELL REV., vol. 2, no. 1, March 2006 (2006-03-01), pages 43 - 50, XP003020733 *
RIETHMAN H ET AL., GENOME RES., vol. 14, 2004, pages 18 - 28
RIETHMAN, H ET AL., CHROMOSOME RES., vol. 13, 2005, pages 505 - 515
RIETHMAN, H. ET AL., CHROMOSOME RES., vol. 13, 2005, pages 505 - 515
SAUER, B. ET AL., P. N. A. S., vol. 85, 1988, pages 5166 - 5170
SCHEDL ET AL., NATURE, vol. 362, 1993, pages 258 - 261
SHARPE ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 90, 1993, pages 11262
SHINAGAWA, T. ET AL., GENES & DEVELOPMENT, vol. 17, 2003, pages 1340 - 1345
SHINICHI AIZAWA, BIOMANUAL SERIES 8 GENE TARGETING, 1995
SHINOHARA ET AL., HUM MOL GENET, vol. 10, 2001, pages 1163
SHINOHARA ET AL., HUM MOL GENET, vol. 10, 2001, pages 1163 - 1175
SMOGORZEWSKA, A. ET AL., ANUU. REV. BIOCHEM., vol. 73, 2004, pages 177 - 208
TAKEDA ET AL.: "Medical Science Digest", NEW SCIENCES, vol. 29, 2003, pages 20
TANABE, H. ET AL., CHROMOSOME RES., vol. 8, 2000, pages 319 - 334
THAM WH ET AL., ONCOGENE, vol. 21, 2002, pages 512 - 521
THORPE ET AL., P. N. A. S., vol. 95, 1998, pages 5505 - 5510
THYAGARAJAN ET AL., MOL. CELL. BIOL., vol. 21, 2000, pages 3926 - 3934
TOMIZUKA ET AL., NATURE GENET., U.S.A., vol. 16, 1997, pages 133 - 143
TOMIZUKA ET AL., NATURE GENETICS, vol. 16, 1997, pages 133 - 143
TOMIZUKA ET AL., P. N. A. S., U.S.A., vol. 97, 2000, pages 722 - 727
TOMIZUKA ET AL., P. N. A. S., vol. 97, 2000, pages 722 - 727
TOMIZUKA ET AL., P.N.A.S., U.S.A., vol. 97, 2000, pages 722 - 727
TOMIZUKA, K. ET AL., PNAS, vol. 97, 2000, pages 722 - 727
TOSHINORI IDE: "Experimental Medicine", vol. 16, 1998, YODOSHA, CO., LTD., pages: 18 - 24
UEDA ET AL., J CLIN INVEST., vol. 105, 2000, pages 1013 - 1021
VISSEL B. ET AL.: "Four distinct alpha satellite subfamilies shared by human chromosomes 13, 14 and 21", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 19, no. 2, 25 January 1991 (1991-01-25), pages 271 - 277, XP003020734 *
WANG ET AL., GENE THER., vol. 9, 2002, pages 381 - 389
YASUFUMI KANEDA: "Clinical Immunology", vol. 39, 2003, KAGAKU-HYORONSHA CO., LTD., pages: 551 - 558
YOICHI SHINKAI: "Experimental Medicine", vol. 16, 1998, YODOSHA CO., LTD., pages: 25 - 30
YOKOTA ET AL.: "Experimental Medicine", vol. 19, 2001, YODOSHA CO., LTD.
YUASA ET AL., GENE THER., vol. 9, 2002, pages 1576 - 1588
YUASA ET AL., GENE THERAPY, vol. 9, 2002, pages 1576 - 1588
ZHENG B. ET AL., MOL CELL BIOL., vol. 20, 2000, pages 648 - 655

Cited By (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9499786B2 (en) 2007-03-23 2016-11-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Enriched population of human pluripotent cells with Oct-4 and Sox2 integrated into their genome
US11898162B2 (en) 2007-03-23 2024-02-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Reprogramming somatic cells into pluripotent cells using a vector encoding Oct4 and Sox2
US10106772B2 (en) 2007-03-23 2018-10-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Somatic cell reprogramming
JP2011522540A (ja) * 2008-06-04 2011-08-04 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド 非ウイルスアプローチを用いたｉＰＳ細胞の産生のための方法
US9644184B2 (en) 2008-06-04 2017-05-09 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for the production of IPS cells using Epstein-Barr (EBV)-based reprogramming vectors
US9328332B2 (en) 2008-06-04 2016-05-03 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for the production of IPS cells using non-viral approach
US9175268B2 (en) 2008-08-12 2015-11-03 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for the production of iPS cells
WO2010038904A1 (ja) * 2008-09-30 2010-04-08 国立大学法人鳥取大学 外来性核初期化因子またはそれをコードするｄｎａを含まない人工多能性幹細胞およびその作製方法
JP2012511307A (ja) * 2008-11-28 2012-05-24 オーストリア ヴィルトシャフツゼルヴィース ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 人工染色体ベクター
WO2011062207A1 (ja) 2009-11-17 2011-05-26 協和発酵キリン株式会社 ヒト人工染色体ベクター
WO2011062206A1 (ja) 2009-11-17 2011-05-26 協和発酵キリン株式会社 ヒト人工染色体ベクター
JPWO2011083870A1 (ja) * 2010-01-06 2013-05-16 国立大学法人鳥取大学 マウス人工染色体ベクター
US8940533B2 (en) 2010-01-06 2015-01-27 National University Corporation Tottori University Mouse artificial chromosome vector
US9775331B2 (en) 2010-01-06 2017-10-03 National University Corporation Tottori University Rodent comprising mouse artificial chromosome vector
JP5557217B2 (ja) * 2010-01-06 2014-07-23 国立大学法人鳥取大学 マウス人工染色体ベクター
WO2011083870A1 (ja) * 2010-01-06 2011-07-14 国立大学法人鳥取大学 マウス人工染色体ベクター
WO2019088257A1 (ja) * 2017-11-02 2019-05-09 国立大学法人鳥取大学 哺乳類人工染色体ベクターを利用するタンパク質の高生産方法
JPWO2019088257A1 (ja) * 2017-11-02 2021-01-14 国立大学法人鳥取大学 哺乳類人工染色体ベクターを利用するタンパク質の高生産方法
JP7202573B2 (ja) 2017-11-02 2023-01-12 国立大学法人鳥取大学 哺乳類人工染色体ベクターを利用するタンパク質の高生産方法
WO2019177163A1 (ja) * 2018-03-16 2019-09-19 国立大学法人鳥取大学 マウス人工染色体ベクター及びその使用
JPWO2019177163A1 (ja) * 2018-03-16 2020-08-20 国立大学法人鳥取大学 マウス人工染色体ベクター及びその使用
WO2020075822A1 (ja) 2018-10-10 2020-04-16 国立大学法人鳥取大学 外来染色体を含むヒト人工多能性幹細胞の製造方法
WO2020075823A1 (ja) 2018-10-10 2020-04-16 国立大学法人鳥取大学 微小核細胞融合法による目的ｄｎａを含む動物細胞の作製方法
WO2023090372A1 (ja) 2021-11-16 2023-05-25 学校法人東京薬科大学 プロモーター活性化配列、そのプロモーター活性化配列を含む発現ベクター、及びその発現ベクターを含む哺乳動物細胞

Also Published As

Publication number Publication date
EP2048229A4 (en) 2011-08-24
CN101535474B (zh) 2014-10-29
JPWO2008013067A1 (ja) 2009-12-17
EP2048229B1 (en) 2016-02-17
JP5345391B2 (ja) 2013-11-20
KR20090036581A (ko) 2009-04-14
US8809045B2 (en) 2014-08-19
US20100011454A1 (en) 2010-01-14
AU2007277863A1 (en) 2008-01-31
TW200817512A (en) 2008-04-16
EP2048229A1 (en) 2009-04-15
CN101535474A (zh) 2009-09-16
CA2658204A1 (en) 2008-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2008013067A1 (fr) Vecteur de chromosome artificiel humain (cah), et substance pharmaceutique à base de cellules humaines contenant un vecteur de chromosome artificiel humain (cah)
JP5175814B2 (ja) ヒト人工染色体（ｈａｃ）ベクター
JPH10500570A (ja) 相同組換えに効果的なｄｎａ構築物及びその利用
KR20120099300A (ko) 마우스 인공염색체 벡터
EA034039B1 (ru) Клетка-хозяин, способная к сайт-специфической интеграции, способ ее получения и применение
JP4525863B1 (ja) 高生産性細胞の樹立のための発現ベクター及び高生産性細胞
US11492614B2 (en) Stem loop RNA mediated transport of mitochondria genome editing molecules (endonucleases) into the mitochondria
JP2007259871A (ja) 細胞周期を仲介する組成物および方法
WO2001011951A1 (en) Mouse having human cytochrome p450 transferred therein
JP4293990B2 (ja) 哺乳類人工染色体
CN103080321A (zh) 具有提高外源基因表达活性的dna元件
JP2009201518A (ja) Ｌｃａｔ欠損症の遺伝子治療用細胞並びにこれを産生するのに用いられる複製欠損性レトロウイルスベクター及びプラスミド
US10717991B2 (en) Transgenic pig which simultaneously expresses HO-1 gene and TNFR1-Fc gene, and comprises knocked-out GGTA1 gene, and use thereof
JP2001231403A (ja) 改変された外来染色体あるいはその断片を保持する非ヒト動物
US10253330B2 (en) CLDN5 mini-promoters

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200780033077.7

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07768413

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008526726

Country of ref document: JP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2658204

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007277863

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007768413

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020097002553

Country of ref document: KR

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: RU

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2007277863

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20070706

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12307879

Country of ref document: US

点击 这是indexloc提供的php浏览器服务，不要输入任何密码和下载