WO2008006865A1 - Verfahren zur isolierung viraler nukleinsäuren - Google Patents
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- WO2008006865A1 WO2008006865A1 PCT/EP2007/057131 EP2007057131W WO2008006865A1 WO 2008006865 A1 WO2008006865 A1 WO 2008006865A1 EP 2007057131 W EP2007057131 W EP 2007057131W WO 2008006865 A1 WO2008006865 A1 WO 2008006865A1
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Definitions
- the invention relates to a method for fast, simple and highly sensitive isolation of viral nucleic acids.
- US Pat. No. 5,234,809 describes a process for isolating nucleic acids from nucleic acid-containing starting materials by incubating the starting material with a chaotropic buffer and a DNA-binding solid phase.
- the then binding solid phase consists of silicate mineral particles, which are> 50 nm.
- the chaotropic buffers realize both the lysis of the starting material and the binding of the nucleic acids to the solid phase.
- the method is well suited for isolating nucleic acids from small sample quantities and finds its practical application especially in the field of isolation of viral nucleic acids.
- the method described in the patent has a number of disadvantages.
- the method realizes efficient isolation and possibly also separation of nucleic acids / nucleic acid mixtures and is easy and quick to carry out.
- the improvement over the patent cited above is achieved by the addition of an alcohol to the initial lysis buffer. This step makes it possible to increase the efficiency of the extraction process, which also allows sensitive nucleic acid targets to be isolated from a clinical sample.
- Another method of separating and isolating single-stranded and double-stranded nucleic acids is disclosed in the patent EP 1 146049 A2.
- the method is based on the treatment of a source containing nucleic acids with at least one mineral carrier material in the form:
- the single-stranded nucleic acid is isolated by adjusting the treatment conditions by an aqueous mixture of chaotropic salts and lower aliphatic alcohols, such that subsequently predominantly the single-stranded nucleic acid is adsorbed to a mineral carrier, the double-stranded nucleic acid, however, not adsorbed.
- the bound single-stranded nucleic acid is subsequently washed and finally eluted from the support by means of a low salt buffer.
- the double-stranded nucleic acid is isolated by adjusting the treatment conditions by a mixture of alkaline earth ion-complexing substances without lower aliphatic alcohols, such that subsequently predominantly the double-stranded nucleic acid is adsorbed to a mineral carrier, the single-stranded
- nucleic acid however, not adsorbed.
- the bound double-stranded nucleic acid is subsequently washed and finally eluted from the support by means of a low salt buffer.
- the double-stranded nucleic acid is isolated by adjusting the treatment conditions by the presence of a sarcosinate but without lower aliphatic alcohols, such that subsequently predominantly the double-stranded nucleic acid is adsorbed to a mineral carrier, the single-stranded nucleic acid, however, does not adsorb.
- the bound double-stranded nucleic acid is subsequently washed and finally eluted from the support by means of a low salt buffer.
- the double-stranded or single-stranded nucleic acids is isolated by adjusting the treatment conditions by an aqueous mixture of chaotropic salts and lower aliphatic alcohols, such that both nucleic acid fractions adsorb to a mineral carrier.
- the separation of the nucleic acids takes place by a selective elution.
- the double-stranded nucleic acid is detached from the carrier material by means of a solution of reduced ionic strength and lower aliphatic alcohols.
- the remaining single-stranded nucleic acid is subsequently washed and finally detached from the carrier material by means of a low-salt buffer.
- the single-stranded nucleic acid can be selectively eluted from the support material by means of a solution containing alkaline earth metal complexing substances and / or sarcosinates.
- the now remaining double-stranded nucleic acid is subsequently washed again and finally detached from the carrier material by means of a low-salt buffer.
- a lysis buffer which contains 5% Triton and no reference to an alcohol.
- a buffer is used, which is composed of 6M guanidine hydrochloride, 1OmM Tris HCl and 20% Triton X-100. This buffer is added to the biological sample. This is followed by the addition of proteinase K. It is then followed by incubation at 70 0 C.
- this buffer in combination with the proteinase K fulfills the function of a lysis buffer.
- a further component is added to the batch (eg isopropanol, acetonitrile, DMSO or methyl ethyl ketone), which is a water-miscible, non-organic, organic component.
- N-methyl-2-pyrrolidone or, alternatively, isopropanol is used as the "non-acidic" organic component.
- this also concerns the isolation of DNA by means of the binding of the nucleic acid to magnetic particles.
- the addition of N-methyl-2-pyrrolidone shows similar yields as the addition of isopropanol.
- Example 4 uses a lysis buffer, which in turn after lysis of the sample, the addition of a binding conditioner (gamma-butyl lactone, propylene carbonate or turn N-methyl-2-pyrrolidone) takes place.
- a binding conditioner gamma-butyl lactone, propylene carbonate or turn N-methyl-2-pyrrolidone
- the detergent component which is listed in EP 1 524317 Al (Triton X-100), is only part of the lysis buffer. However, there is no indication that this component mediates binding of DNA or RNA. According to the patent specification, this is realized by the additional addition of the non-acidic organic components according to the invention. It turns out that the lysis buffer is not able to realize isolation of nucleic acids. For the isolation of DNA or RNA, the listed organic component must be added.
- the components listed in EP 1 524317 Al are also highly toxic (eg DMSO) and represent a significant hazard.
- the invention was based on the object to eliminate the disadvantages mentioned in the prior art.
- the object of the invention could be solved in a surprising manner.
- the method is characterized by claim 1 with its alternative methods.
- the dependent claims 2 to 8 relate to specific embodiments of the method according to the invention.
- an alternative method has been provided, which allows to quickly, easily and inexpensively isolate nucleic acids from a sample containing nucleic acid, with the necessary solutions for the selective binding of nucleic acids - with the exception of detergents - no further water-miscible non-acidic organic components , such as alcohol, acetonitrile, DMSO or methyl ethyl ketone.
- the method makes it possible to isolate DNA (double-stranded nucleic acid) and RNA (single-stranded nucleic acid) from a starting sample at the same time and thus does not cause separation of nucleic acid mixtures.
- the method is able to isolate highly sensitive viral nucleic acids from diagnostically relevant biological samples.
- EDTA and sodium citrate as salts of organic acids do not belong to the water-miscible non-acidic organic components.
- the inventive method is based on the lysis of a biological sample with known lysis buffers.
- the lysis buffers contain, for example, known chaotropic salts of high ionic strengths or combinations of chaotropic salts of high ionic strengths with a sarcosinate and optionally further additives. These buffer systems allow in their known function the digestion and denaturation of a biological sample and also cause inactivation of endogenous RNases. This is especially important with regard to the isolation of RNA.
- lysis buffers which are a combination of chaotropic salts and other salts and which, if appropriate, also contain detergents and optionally further additives in support of the lysis process, with the chaotropic salts not requiring any high ionic strengths known per se.
- proteolytic enzymes eg proteinase K
- the binding conditions for binding the nucleic acids contained in the sample are then adjusted to a mineral carrier material.
- a nonionic detergent such as. Tween-20, Tween-80 or Triton X-100 in a high concentration.
- the addition of the detergent is the essential step. Setting an acidic pH is advantageous.
- the detergent completely replaces the function of adding a previously necessary alcoholic component.
- the lysis mixture which is mixed with the detergent, is subsequently brought into contact with a carrier, preferably a mineral carrier or surface-functionalized magnetic particles or iron oxide particles, whereby the nucleic acids to be isolated are adsorbed to the mineral carrier.
- the mineral carrier is subsequently washed with known washing buffers and final, in turn, detached from the mineral material by means of water or a low salt buffer.
- the detergent component required for the binding of the nucleic acids can also be present as a mixture of detergent with further salts and optionally further additives.
- optimal binding conditions in the combination of salt / detergent can always be achieved without this having an effect on the initial use of an efficient lyophil buffer.
- a lysis buffer for initial sample digestion are used, which has only a low salt concentration (which would not be sufficient to provide in combination with a detergent efficient binding of the nucleic acids to be isolated).
- a binding buffer is then added to the reaction mixture which has a nonionic detergent of high concentration and, in addition, a high salt concentration. This then sets the binding conditions that efficiently mediate quantitative isolation of the viral nucleic acids. It is always crucial that the binding buffer based on a high concentration of nonionic detergents also provides the further components which enable an efficient binding of the nucleic acids to be isolated.
- the method is thus completely alternative to the described methods which require an alcohol or other substances such as acetonitrile, DMSO or methyl ethyl ketone for efficient attachment of nucleic acids to mineral support materials. It moreover permits the parallel isolation of double-stranded and single-stranded nucleic acids from a biological sample without separating the double-stranded and single-stranded nucleic acids.
- a decisive advantage is that a high degree of flexibility is achieved with regard to the selection of the lysis buffer.
- well-known, efficiently acting lysis buffer including proteolytic enzymes can be used.
- the adjustment of the binding conditions for nucleic acids for their adsorption to a mineral carrier material is always carried out after the lysis of the starting material by the addition of the binding buffer according to the invention, containing a high concentration of a nonionic detergent and optionally containing further additives.
- the invention allows for the first time the parallel isolation of double-stranded and single-stranded nucleic acids from a nucleic acid-containing sample, wherein the nucleic acid-containing sample with a buffer consisting of either a salt solution of chaotropic salts or a salt solution of chaotropic salts of low ionic strength (less than 100 mM) and others nonchaotropic salts, and optionally other additives such as detergents (SDS, sarcosinate, LDS), proteolytic enzymes, complexing compounds (EDTA, EGTA) is incubated under these conditions, a digestion of the biological sample is carried out so that the nucleic acids in the buffer be released
- binding buffer consisting of:
- a mineral material carrier
- concentration of detergent for binding the nucleic acids is 5 - 50%; preferably 10 -30% in the final mixture of lysis buffer / binding buffer.
- the mineral material is subsequently washed with washing buffer and the nucleic acids by means of water or low salt buffer from the mineral material again dissolves.
- kits for carrying out the method according to the invention which is described in claims 9 to 11.
- the inventive use is that nonionic detergents in a concentration of 5 - 50%; preferably 10 -30%, in the absence of alcohol, for parallel isolation of single and double-stranded nucleic acids from samples containing these substances without separating the double- and single-stranded nucleic acids by binding the total nucleic acids to a solid support.
- the invention is particularly advantageous in the isolation of viral nucleic acids.
- Two blood plasma samples were spiked with HIV viruses and HBV viruses and used for the isolation of the viral nucleic acid.
- 150 ⁇ l of the sample was transferred to a 1.5 ml reaction vessel.
- the sample was subsequently added with 450 ⁇ l of a lysis buffer (4 M guanidine thiocyanate, 80 mM trisodium citrate dihydrate) and vortexed for 10 s. Subsequently, the sample was incubated at room temperature for 10 min. After lysis and denaturation of the starting sample, 600 ⁇ l of a binding buffer (30% Tween-20, 5 mM EDTA, 20 mM trisodium citrate dihydrate) was added and the sample completely mixed.
- a binding buffer (30% Tween-20, 5 mM EDTA, 20 mM trisodium citrate dihydrate
- the binding buffer is adjusted to an acidic pH, for example by means of an acetate buffer.
- the batch was subsequently centrifuged over a filter column which contained a commercially available glass fiber filter paper (Whatman).
- the filter column was subsequently washed with alcoholic wash buffers. Centrifuged briefly to dry the filter material.
- the elution of the bound viral nucleic acid was carried out by the addition of 50 ⁇ l RNAse free water.
- the isolated nucleic acid was then analyzed for specific virus detection of HIV or HBV by means of real-time PCR. The detection of viral nucleic acids was successful.
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur parallelen Isolierung doppel- und einzelsträngiger Nukleinsäuren aus diese Stoffe enthaltenden Proben, ohne die doppel- und einzelsträngiger Nukleinsäuren zu trennen, bei dem die Proben mit bekannten Lysepuffern (hoher Salzkonzentrationen oder niedriger Salzkonzentrationen oder mit proteolytischen Enzymen) versetzt werden, wobei die nukleinsäurehaltige Probe vor deren Lyse oder die bereits lysierte oder homogenisierte Probe mit einem sauren Bindungspuffer, der mindestens ein nichtionisches Detergenz in hoher Konzentration enthält, so eingestellt wird, dass die Gesamtnukleinsäure an einen festen Träger adsorbiert wird.
Description
VERFAHREN ZUR ISOLIERUNG VIRALER NUKLEINSÄUREN
Beschreibung
[0001] Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen, einfachen und hochsensitiven Isolierung viraler Nukleinsäuren.
[0002] Die Untersuchung diagnostisch relevanter biologischer Proben (Serum, Plasma, Blut, Liquor, Tupferproben, Organabriebe etc.) zum Nachweis infektiöser Erreger gewinnt immer mehr an Bedeutung. Virusinfektionen wie HIV, HCV oder HBV breiten sich weltweit immer stärker aus. Darüber hinaus erfordert das massenhafte Auftreten neuartiger Viruserkrankungen (z.B. Vogelgrippe) ein schnelles und flexibles Reagieren für den sensitiven diagnostischen Virusnachweis. Neue Testverfahren auf Basis der Verwendung sensitiver Amplifikationstechniken wie Real Time-PCR ermöglichen einen hocheffizienten Virusnachweis und werden immer stärker als diagnostische Instrumentarien eingesetzt. Dem Schritt der molekularen Probenvorbereitung in der Form der Isolierung der nachzuweisenden Nukleinsäuren kommt immer größere Bedeutung zu. [0003] Die Sensitivität des Testsystems wird durch den Prozess der Isolierung der Nukleinsäure maßgeblich beeinflusst.
[0004] Es existieren eine Reihe von Extraktionsverfahren, welche die Isolierung viraler Nukleinsäuren ermöglichen. Das Patent US 5,234,809 beschreibt einen Prozess zur Isolierung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigen Ausgangsmaterialien durch Inkubation des Ausgangsmaterials mit einem chaotropen Puffer und einer DNA-bindenden festen Phase. Die dann bindende feste Phase besteht dabei aus silikatischen mineralischen Partikeln, welche > 50 nm sind. Die chaotropen Puffer realisieren sowohl die Lyse des Ausgangsmaterials als auch die Bindung der Nukleinsäuren an die feste Phase. Das Verfahren ist gut geeignet , um Nukleinsäuren aus kleinen Probenmengen zu isolieren und findet speziell im Bereich der Isolierung viraler Nukleinsäuren seine praktische Anwendung. Allerdings zeigt sich in der praktischen Anwendung, das dass in der Patentschrift beschriebene Verfahren eine Reihe von Nachteilen mit sich bringt. Die Verwendung von partikulären Systemen für die Anbindung der zu isolierenden Nukleinsäuren ist prinzipiell sehr umständlich zu handhaben. Darüber hinaus zeigt sich, dass die Nutzung von Puffern auf der Basis der Verwendung chaotroper Salze in Bezug auf eine notwendige hochsensitive Virusdetektion oftmals nicht ausreicht.
[0005] Weitere Verfahren beschreiben die chromatographische Reinigung und Trennung von Nukleinsäuregemischen aus einer Lösung, die eine hohe Salzkonzentration und eine hohe Alkoholkonzentration aufweist. [0006] Die Lösung wird wiederum mit einem Trägermaterial zur Anbindung der Nukleinsäuren in Kontakt gebracht, nachfolgend wird das Trägermaterial mit an sich bekannten alkoholischen Waschpuffern gewaschen und die gebundene Nukleinsäure final mittels Wasser oder einem Niedrigsalzpuffer wieder vom Trägermaterial abgelöst.
[0007] Das Verfahren realisiert eine effiziente Isolierung und ggf. auch Trennung von Nukleinsäuren/Nukleinsäuregemischen und ist einfach und schnell in der Durchführung. Die Verbesserung gegenüber der oben zitierten Patentschrift wird durch die Zugabe eines Alkohols zum initialen Lysepuffer erreicht. Dieser Schritt ermöglicht eine Effizienzsteigerung des Extraktionsprozesses, welche es gestattet, auch sensitiv Nukleinsäure- Targets aus einer klinischen Probe zu isolieren. Ein weiteres Verfahren der Trennung und Isolierung von einzelsträngigen und doppelsträngigen Nukleinsäuren wird in der Patentschrift EP 1 146049 A2 offenbart.
[0008] Das Verfahren basiert auf der Behandlung einer Nukleinsäuren enthaltenden Quelle mit mindestens einem mineralischen Trägermaterial in der Form das:
1. die einzelsträngige Nukleinsäure isoliert wird, indem man die Behandlungsbedingungen durch ein wässriges Gemisch von chaotropen Salzen und niederen aliphatischen Alkoholen einstellt, derart, dass nachfolgend vorrangig die einzelsträngige Nukleinsäure an einen mineralischen Träger adsorbiert wird, die doppelsträngige Nukleinsäure dagegen nicht adsorbiert. Die gebundene einzelsträngige Nukleinsäure wird nachfolgend gewaschen und final mittels eines Niedrigsalzpuffers vom Trägermaterial eluiert.
2. die doppelsträngige Nukleinsäure isoliert wird, indem man die Behandlungsbedingungen durch ein Gemisch von Erdalkali-Ionen komplexierenden Substanzen ohne niedere aliphatische Alkohole einstellt, derart , dass nachfolgend vorrangig die doppelsträngige Nukleinsäure an einen mineralischen Träger adsorbiert wird, die einzelsträngige
Nukleinsäure dagegen nicht adsorbiert. Die gebundene doppelsträngige Nukleinsäure wird nachfolgend gewaschen und final mittels eines Niedrigsalzpuffers vom Trägermaterial eluiert.
3. die doppelsträngige Nukleinsäure isoliert wird, in dem man die Behandlungsbedingungen durch die Anwesenheit eines Sarkosinats aber ohne niedere aliphatische Alkohole einstellt, derart , dass nachfolgend vorrangig die doppelsträngige Nukleinsäure an einen mineralischen Träger adsorbiert wird, die einzelsträngige Nukleinsäure dagegen nicht adsorbiert. Die gebundene doppelsträngige Nukleinsäure wird nachfolgend gewaschen und final mittels eines Niedrigsalzpuffers vom Trägermaterial eluiert.
4. die doppelsträngige oder einzelsträngige Nukleinsäuren isoliert wird, in dem man die Behandlungsbedingungen durch ein wässriges Gemisch von chaotropen Salzen und niederen aliphatischen Alkoholen einstellt, derart, dass beide Nukleinsäurefraktionen an einen mineralischen Träger adsorbieren. Die Trennung der Nukleinsäuren erfolgt durch eine selektive Elution. Dabei wird die doppelsträngige Nukleinsäure mittels einer Lösung verminderter Ionenstärke und niederen aliphatischen Alkoholen vom Trägermaterial abgelöst. Die verbleibende einzelsträngige Nukleinsäure wird nachfolgend gewaschen und final mittels eines Niedrigsalzpuffers vom Trägermaterial abgelöst.
[0009] Alternativ dazu kann die einzelsträngige Nukleinsäure mittels einer Lösung, welche Erdalkali-Ionen komplexierende Substanzen und/oder Sarkosinate enthält, selektiv vom Trägermaterial eluiert werden. Die nunmehr verbleibende doppelsträngige Nukleinsäure wird nachfolgend wiederum gewaschen und final mittels eines Niedrigsalzpuffers vom Trägermaterial abgelöst.
[0010] Das Verfahren ist wiederum einfach in der Durchführung und kann DNA oder RNA aus biologischen Proben isolieren. Auch wenn sich das Patent auf die Trennung von Nukleinsäuregemischen bezieht, wird dem Fachmann beim Lesen des Unteranspruches 4 klar, das wiederum, wie oben beschrieben, durch die Kombination einer Salzlösung mit einem Alkohol, die Anbindung von Nukleinsäuren an ein mineralisches Material realisiert wird. Entscheidend für den Schritt der Anbindung von Nukleinsäuren an mineralische Materialien ist dabei wiederum die Existenz eines Alkohols in den für den Extraktionsprozess eingesetzten Puffern. Damit weist der Stand der Technik darauf hin, das eine Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Proben unter Verwendung von chaotropen Salzen allein funktioniert, das Verfahren aber erst durch die Zugabe eines Alkohols (d.h. eine Kombination aus einer salzhaltigen Lösung mit einem aliphatischen Alkohol ) wirklich effizient wird.
[0011] In der europäischen Patentanmeldung EP 1 524317 Al wird u.a. ein Lysepuffer beschrieben, der 5% Triton und keinen Hinweis auf einen Alkohol enthält. Im Beispiel 1 wird ein Puffer eingesetzt, der sich aus 6M Guanindinhydrochlorid, 1OmM Tris HCl und 20% Triton X-100 zusammensetzt. Dieser Puffer wird der biologischen Probe zugegeben. Danach erfolgt noch die Zugabe von Proteinase K. Es erfolgt anschließend eine Inkubation bei 700C. Es ist offensichtlich, dass dieser Puffer damit in Kombination mit der Proteinase K die Funktion eines Lysepuffers erfüllt. Nach der Lyse wird dem Ansatz eine weitere Komponente zugesetzt (z.B. Isopropanol, Acetonitril, DMSO oder Methyethylketon), wobei es sich um eine wassermischbare nichtsaure organische Komponente handelt. In einem weiteren Beispiel wird als "non-acidic" organische Komponente auch N-methyl-2-pyrrolidon bzw. alternativ dazu Isopropanol eingesetzt. Dies betrifft, wie Beispiel 3 ausführt, auch die Isolierung von DNA mittels der Anbindung der Nukleinsäure an magnetische Partikel. Auch hier zeigt die Zugabe von N- methyl-2-pyrrolidon ähnliche Ausbeuten wie die Zugabe von Isopropanol. Auch das Beispiel 4 bedient sich eines Lysepuffers, wobei wiederum nach Lyse der Probe die Zugabe eines Bindungs-Konditionierers (Gammabutyllakton, Propylenkarbonat oder wiederum N-methyl-2- pyrrolidon) erfolgt. Die Detergenzkomponente, welche in EP 1 524317 Al aufgeführt ist (Triton- X-100), ist nur Bestandteil des Lysepuffers. Es gibt aber keinerlei Hinweis darauf, dass diese Komponente die Anbindung von DNA oder RNA vermittelt. Gemäß der Patentbeschreibung wird dies durch die zusätzliche Zugabe der erfindungsgemäßen nichtsauren organischen Komponenten realisiert. Es zeigt sich, dass der Lysepuffer nicht in der Lage ist, eine Isolierung von Nukleinsäuren zu realisieren. Für die Isolierung von DNA oder RNA muss die aufgeführte organische Komponente zugegeben werden. Die in EP 1 524317 Al aufgeführten Komponenten sind darüber hinaus auch hochtoxisch (z.B. DMSO) und stellen eine erhebliches Gefahrenpotential dar.
[0012] Der Erfindung lag die Aufgabe zu Grunde, die Nachteile, die im Stand der Technik genannt wurden, zu beseitigen.
[0013] Die erfindungsgemäße Aufgabe konnte in überraschender Weise einfach gelöst werden. Das Verfahren ist durch den Patentanspruch 1 mit seinen Verfahrensalternativen charakterisiert. Die Unteransprüche 2 bis 8 betreffen spezifische Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens.
[0014] Erfindungsgemäß wurde ein alternatives Verfahren bereitgestellt, welches es erlaubt, schnell, einfach und preiswert Nukleinsäuren aus einer Nukleinsäure enthaltenden Probe zu isolieren, wobei die für die selektive Anbindung der Nukleinsäuren notwendigen Lösungen - mit Ausnahme von Detergenzien - keine weiteren wassermischbaren nichtsauren organischen Komponenten, wie z.B. Alkohol, Acetonitril, DMSO oder Methyethylketon, enthalten. Dabei gestattet das Verfahren, gleichzeitig und damit keine Trennung von Nukleinsäuregemischen bewirkend, DNA (doppelsträngige Nukleinsäure) und RNA (einzelsträngige Nukleinsäure) aus einer Ausgangsprobe zu isolieren. Insbesondere ist das Verfahren in der Lage, hochsensitiv virale Nukleinsäuren aus diagnostisch relevanten biologischen Proben zu isolieren.
[0015] Hierbei sei bemerkt, dass z.B. EDTA und Natriumeitrat als Salze organischer Säuren nicht zu den wassermischbaren nichtsauren organischen Komponenten zählen.
[0016] Überraschender Weise kann eine hocheffiziente Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe auch auf einem ganz anderen Weg, als im Stand der Technik beschrieben, erreicht werden, wobei gänzlich auf die dafür bisher notwendige essentielle Komponente Alkohol verzichtet wird.
[0017] Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Lyse einer biologischen Probe mit an sich bekannten Lysepuffern. Die Lysepuffer enthalten z.B. bekannte chaotrope Salze hoher Ionenstärken oder Kombinationen von chaotropen Salzen hoher Ionenstärken mit einem Sarkosinat und ggf. weiteren Zusätzen. Diese Puffersysteme erlauben in ihrer bekannten Funktion den Aufschluss und eine Denaturierung einer biologischen Probe und bewirken auch eine Inaktivierung endogener RNasen. Dies ist insbesondere in Hinblick auf die Isolierung von RNA wesentlich. Es können auch Lysepuffer verwendet werden, welche eine Kombination von chaotropen Salzen und anderen Salzen darstellen und welche zur Unterstützung des Lyseprozesses ggf. noch Detergenzien und ggf. weitere Zusätze enthalten, wobei bei den chaotropen Salzen keine an sich bekannten hohen Ionenstärken benötigt werden. Eine solche Kombination erlaubt dann eine effiziente Einbeziehung proteolytischer Enzyme (z.B. Proteinase K) für einen wirksamen Aufschluss des Ausgangsmaterials.
[0018] Nach Lyse des Ausgangsmaterials werden dann die Bindungsbedingungen zur Anbindung der in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren an ein mineralisches Trägermaterial eingestellt.
[0019] Dies erfolgt im erfindungsgemäßen Verfahren nicht durch die Zugabe eines Alkohols, sondern überraschender Weise durch Zugabe eines nichtionischen Detergenzes, wie z.B. Tween-20, Tween-80 oder Triton X-100 in einer hohen Konzentration. Die Zugabe des Detergenzes ist dabei der essentielle Schritt. Das Einstellen eines sauren pH- Wertes ist vorteilhaft. Das Detergenz ersetzt erfindungsgemäß komplett die Funktion der Zugabe einer bisher dazu notwendigen alkoholischen Komponente. Der Lyseansatz, welcher mit dem Detergenz gemischt wird, wird nachfolgend mit einem Träger, vorzugsweise ein mineralischer Träger oder oberflächenfunktionalisierte Magnetpartikel oder Eisenoxydpartikel, in Kontakt gebracht, wodurch die zu isolierenden Nukleinsäuren an den mineralischen Träger adsorbieren. Der mineralische Träger wird nachfolgend mit an sich bekannten Waschpuffern gewaschen und final wiederum mittels Wasser oder einem Niedrigsalzpuffer vom mineralischen Material abgelöst. Die für die Anbindung der Nukleinsäuren benötigte Detergenz-Komponente kann darüber hinaus auch als ein Gemisch von Detergenz mit weiteren Salzen und ggf. weiteren Zusätzen vorliegen. Damit können immer jeweils optimale Bindungsbedingungen in der Kombination von Salz/Detergenz erreicht werden, ohne das dies auf die initiale Nutzung eines effizienten Lyepuffers einen Einfluss hat. So kann z.B. ein Lysepuffer zum initialen Probenaufschluss eingesetzt werden, welcher nur eine geringe Salzkonzentration aufweist (welche nicht ausreichend wäre, um in der Kombination mit einem Detergenz eine effiziente Anbindung der zu isolierenden Nukleinsäuren zu vermitteln). Nach Probenaufschluss wird dem Reaktionsansatz dann ein Bindungspuffer zugegeben, welcher ein nichtionisches Detergenz hoher Konzentration sowie zusätzlich eine hohe Salzkonzentration aufweist. Damit werden dann die Bindungsbedingungen eingestellt, die eine quantitative Isolierung der viralen Nukleinsäuren effizient vermitteln. Entscheidend ist immer, dass über den Bindungspuffer auf der Basis einer hohen Konzentration nichtionischer Detergenzien auch die weiteren Komponenten bereitgestellt werden, welche eine effiziente Anbindung der zu isolierenden Nukleinsäuren ermöglichen.
[0020] Das Verfahren ist damit komplett alternativ zu den beschriebenen Verfahren, welche für eine effiziente Anbindung von Nukleinsäuren an mineralische Trägermaterialien einen Alkohol oder andere Substanzen wie Acetonitril, DMSO oder Methyethylketon benötigen. Es
erlaubt darüber hinaus die parallele Isolierung doppelsträngiger und einzelsträngige Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe, ohne die doppelsträngige und einzelsträngige Nukleinsäuren zu trennen. Darüber hinaus besteht ein entscheidender Vorteil auch darin, dass in Bezug auf die Auswahl des Lysepuffers eine hohe Flexibilität erreicht wird. Damit können auch an sich bekannte, effizient wirkende Lysepuffer einschließlich proteolytischer Enzyme verwendet werden. Die Einstellung der Bindungsbedingungen für Nukleinsäuren für deren Adsorption an ein mineralisches Trägermaterial erfolgt immer nach der Lyse des Ausgangsmaterials durch die Zugabe des erfindungsgemäßen Bindungspuffers, enthaltend eine hohe Konzentration eines nichtionischen Detergenzes und ggf. enthaltend weitere Zusätzen.
[0021] Die Erfindung ermöglicht erstmals die parallele Isolierung doppelsträngiger und einzelsträngiger Nukleinsäuren aus einer nukleinsäurehaltigen Probe, wobei die nukleinsäureenthaltende Probe mit einem Puffer, der entweder aus einer Salzlösung aus chaotropen Salzen oder einer Salzlösung aus chaotropen Salzen geringer Ionenstärke (kleiner 100 mM) und anderen nichtchaotropen Salzen besteht, sowie ggf. weiteren Zusätzen wie Detergenzien (SDS, Sarkosinat, LDS), proteolytischen Enzymen, komplexierenden Verbindungen (EDTA, EGTA), inkubiert wird, unter diesen Bedingungen ein Aufschluss der biologischen Probe erfolgt, so dass die Nukleinsäuren in den Puffer freigesetzt werden,
[0022] Erfindungsgemäß werden durch die Zugabe eines Bindungspuffers bestehend aus:
a) einem nichtionischen Detergenz oder b) einem Gemisch eines nichtionischen Detergenzes mit Wasser oder c) einem Gemisch eines nichtionischen Detergenzes mit einer Salzlösung
[0023] und ggf. weiteren Zusätzen, aber ohne andere wassermischbare nichtsaure organische Komponenten wie Alkohol, Bedingungen eingestellt, die es ermöglichen, sowohl doppelsträngige als auch einzelsträngige Nukleinsäuren an ein mineralisches Material (Träger) zu adsorbieren. Die Konzentration an Detergenz zur Anbindung der Nukleinsäuren beträgt 5 - 50 %; vorzugsweise 10 -30 % im finalen Gemisch von Lysepuffer/Bindungspuffer.
[0024] Das mineralische Material nachfolgend mit Waschpuffer wäscht und die Nukleinsäuren mittels Wasser oder Niedrigsalzpuffer vom mineralischen Material wieder ablöst.
[0025] Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist eine Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, der in den Ansprüchen 9 bis 11 beschrieben wird.
[0026] Die erfindungsgemäße Verwendung besteht darin, dass nichtionische Detergenzien in einer Konzentration von 5 - 50 %; vorzugsweise 10 -30 %, in Abwesenheit von Alkohol, zur parallelen Isolierung einzel- und doppelsträngiger Nukleinsäuren aus diese Stoffe enthaltenden Proben, ohne die doppel- und einzelsträngiger Nukleinsäuren zu trennen, durch Bindung der Gesamtnukleinsäuren an einen festen Träger, eingesetzt werden. Die Erfindung ist besonders vorteilhaft bei der Isolierung von viralen Nukleinsäuren.
[0027] Das Verfahren soll nachfolgend anhand eines Beispiels beschrieben werden, ohne auf dieses Beispiel beschränkt zu werden.
Ausführungsbeispiel
Beispiel: Isolierung viraler Nukleinsäuren aus Blutplasma
[0028] Zwei Blutplasma-Proben wurden mit HIV Viren und HBV Viren gespiked und für die Isolierung der viralen Nukleinsäure eingesetzt. 150 μl der Probe wurden in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt. Die Probe wurde nachfolgend mit 450 μl eines Lysepuffers (4 M Guanidinthiocyanat, 80 mM tri-Natriumcitrat-Dihydrat) versetzt und 10 s gevortext. Anschließend wurde die Probe bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert. Nach der Lyse und Denaturierung der Ausgangsprobe wurden 600 μl eines Bindungspuffers (30% Tween-20, 5 mM EDTA, 20 mM tri-Natriumcitrat-Dihydrat) zugegeben und die Probe vollständig durchmischt. Vorteilhafterweise stellt man den Bindungspuffer auf einen sauren pH- Wert ein, z.B. mittels eines Acetat-Puffers. Der Ansatz wurde nachfolgend über eine Filtersäule, welche ein kommerziell verfügbares Glasfaser-Filterpapier (Fa. Whatmann) enthielt, zentrifugiert. Die Filtersäule wurde nachfolgend mit alkoholischen Waschpuffern gewaschen. Danach kurz zentrifugiert, um das Filtermaterial zu trocknen. Die Elution der gebundenen viralen Nukleinsäure erfolgte mittels der Zugabe von 50 μl RNAse freiem Wasser.
[0029] Die isolierte Nukleinsäure wurde dann zum spezifischen Virusnachweis von HIV bzw. HBV mittels Real-Time PCR analysiert. Der Nachweis der viralen Nukleinsäuren war erfolgreich.
Ergebnisse:
Claims
1. Verfahren zur parallelen Isolierung doppel- und einzelsträngiger Nukleinsäuren aus diese Stoffe enthaltenden Proben, ohne die doppel- und einzelsträngiger Nukleinsäuren zu trennen, wobei die Proben mit bekannten Lysepuffern (hoher Salzkonzentrationen oder niedriger
Salzkonzentrationen oder mit proteolytischen Enzymen) versetzt werden, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) die nukleinsäurehaltige Probe (vor deren Lyse) oder die bereits lysierte oder homogenisierte Probe wird mit einem Bindungspuffer, der mindestens ein nichtionisches Detergenz in hoher Konzentration und (mit Ausnahme des Detergenz) keine weiteren wassermischbare nichtsaure organische Komponente enthält, so eingestellt, dass die Gesamtnukleinsäure an einen festen Träger adsorbiert wird b) Entfernen des Trägers mit der adsorbierten Gesamtnukleinsäure c) Waschen und Eluieren der adsorbierten Gesamtnukleinsäure nach bekannten Verfahren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Bindungspuffer auf einen sauren pH- Wert eingestellt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den doppel- und einzelsträngiger Nukleinsäuren um virale Nukleinsäuren handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei bekannten Lysepuffern niedriger Salzkonzentrationen (kleiner als 10OmM) das nichtionischen Detergenz zusätzlich eine Salzlösung hoher Konzentration (größer IM) enthält.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Detergenz- Konzentration zur Anbindung der Nukleinsäuren 5 - 50 %; vorzugsweise 10 -30 %, im finalen Gemisch von Lysepuffer/Bindungspuffer beträgt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Detergenz Tween-20, Tween- 80 oder Triton X-100 eingesetzt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Bindungspuffer zusätzlich a) SDS, Sarkosinat, LDS und / oder b) komplexierende Verbindungen, insbesondere EDTA oder EGTA, enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als fester Träger ein mineralischer Träger oder magnetische Eisenoxidpartikel, vorzugsweise mit modifizierten Oberflächen, eingesetzt werden..
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Träger Bestandteil einer Mini-Zentrifugationssäule ist.
10. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend
• bekannte Lysepuffer
• einen sauren Bindungspuffer, der ein Detergenz zur Anbindung der Nukleinsäuren enthält • mindestens einen festen Träger
• bekannte Wasch- und Elutionspuffer.
11. Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich eine Salzlösung größer IM umfasst.
12. Kit nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich a) SDS, Sarkosinat, LDS und / oder b) komplexierende Verbindungen, insbesondere EDTA oder EGTA, enthält.
13. Verwendung von nichtionischen Detergenzien in einer Konzentration von 5 - 50 %; vorzugsweise 10 -30 %, in Abwesenheit von Alkohol, zur parallelen Isolierung einzel- und doppelsträngiger Nukleinsäuren aus diese Stoffe enthaltenden Proben, ohne die doppel- und einzelsträngiger Nukleinsäuren zu trennen, durch Bindung der Gesamtnukleinsäuren an einen festen Träger.
14. Verwendung nach Anspruch 13 zur Isolierung von viralen Nukleinsäuren.
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