WO2007039069A1 - Verfahren zum nachweis der virenabreicherung für die validierung von filtern und filtrationsprozessen - Google Patents
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- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14051—Methods of production or purification of viral material
Definitions
- the invention relates to a method for the detection of
- the virus suspension obtained is added to a protein solution to be examined and, in a fourth step, the virus-containing protein solution is filtered through the filter to be validated and subsequently the virus depletion is analyzed.
- Virus depletion or virus inactivation e.g. of the
- Validation studies aimed at determining the actual rate of viral clearance of certain technologies are also called “spiking studies" because the product, usually a therapeutic protein solution, is spiked in this study by the respective technology to be validated to be depleted or deactivated to a certain extent.
- the required level of total depletion of all technologies used in the process is determined by a risk assessment by the customer and a final assessment by the respective federal authority, at which the approval or the documents of the virus validation study are submitted.
- Total clearance rates from a complete virus clearance process can range from 12 logio to 24 logio levels and for individual technologies from 3 logio to 7 logio levels.
- the virus is grown by the responsible virus laboratories in suitable cell lines, which are infected with the respective specific viruses and optionally obtained by digestion of the cells and from the cell culture supernatant. These cell cultures are specific to one or more viruses and are obtained from the virus laboratories from certain sources authorized for this purpose.
- the table attached as Figure 1 shows exemplary cell lines used for the culture of viruses used in studies.
- FIG. 2 shows a table of a list of viruses which are used for the process validation of plasma derivatives.
- FIG. 3 shows a table of a list of viruses for use in studies with recombinant proteins.
- the virus concentration from a cell culture supernatant after growth and cell disruption are in the range of 10 ml to 10 9 / ml.
- these virus suspensions are added to the corresponding protein solutions, the addition of the virus suspension being limited to a maximum of 10% by volume (CPMP: “Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses. "February 1996, CPMP / BWP / 268/95).
- virus titers 10 6 / ml up to 10 ml are generally achieved. This solution is then treated with the appropriate virus depletion or virus inactivation technology.
- virus depletion technology size exclusion principle, virus is retained due to its size and the therapeutic protein solution flows through the membrane
- studies use specific volumes of virus-containing protein solution (the protein concentration of the solution is subject to manufacturer's instructions and must be identical to the process scale, typical protein concentrations can range from ⁇ 10 ug / ml to 50 mg / ml solution) filtered through the virus filter.
- the amount of virus-containing solution to be filtered must be identical to the volume of the process filtration. This is achieved by scaling down the process quantities to the laboratory scale of the virus filter. Typical filtration rates range from 4 ml / cm 2 to 60 ml / cm 2 virus filter area.
- the standard detection test is the TCID50 infectivity test, which is included in the cited guidelines is described:
- a disadvantage of the known method is that the addition of virus supernatant, the "spiking", alters the product solution to be tested in such a way that components which are not present on the actual process scale are introduced into the protein solution.
- Another disadvantage for the filtration or, for example, the chromatographic purification within a validation study consists in a considerably poorer filterability of the virus-containing solution or in problems in the chromatography process itself.
- the additionally introduced components can be used for virus quantification (eg ELISA or PCR). influence.
- the spike additive is then reduced to the extent that the solution can be filtered with the given volume over the corresponding area of the virus filter as part of a virus validation study.
- Object of the present invention is therefore to provide a method which avoids the disadvantages mentioned above.
- This object is achieved in conjunction with the preamble of claim 1, characterized in that after the second step, the virus suspension is first processed via a Membranadsorber that bound the viruses to the membrane adsorber and unwanted components are removed using a wash buffer and that the bound viruses of the Membranadsorberflache eluted and in the third Step as a purified, concentrated virus suspension of the protein solution to be examined are added.
- the preparation of the virus suspension i. the binding of the viruses to a membrane adsorber with subsequent purification and elution of the viruses, means that, for example, 100 ml of virus supernatant are concentrated to a few ml of eluate, so that pure and more highly concentrated virus preparations are available.
- the fact that high output titers are achieved in the spike solution or virus suspension, the volume per area determined in the scale-down experiment or small scale of the user can also be achieved in the virus validation study. The above-mentioned disadvantages are thus safely and reliably avoided.
- the membrane adsorber is a microporous anion or cation exchange membrane with pore sizes> 1 ⁇ m. Since diffusion limitation plays virtually no role in membrane chromatography, it is possible to operate with relatively high flow rates.
- the infected cell lines are disrupted by a freezing process (flash freezing) followed by thawing and centrifuged at about 2000 rpm for a period of about 10 minutes.
- the virus suspension obtained in this way is processed via a membrane adsorber with a microporous structure, the negatively charged viruses being bound to positively charged side chains of the membrane adsorber.
- a wash buffer with increased salt concentration less strong binding contaminants can be removed.
- the pure virus can then be eluted with a high molecular weight salt solution and rebuffered for example by a Vivaspin Ultra filtration unit and is then present in highly concentrated form.
- the concentrated and purified virus suspension can then be added to the protein solution to be examined or stored intermediately.
- the virus-containing protein solution is filtered in a known manner through the filter to be validated, and then the virus depletion is analyzed.
- parvoviruses are propagated in a PK13 cell culture.
- the PK13 cells are from the American Type Culture Collection, USA (ATCC No. CRL-6489).
- PK13 cell culture dishes each 175 cm 2 in area, are infected with PPV for this purpose and the viruses are harvested 3 to 5 days later.
- the viruses are in the supernatant of the cells destroyed by the infection and shock freezing. About 40 ml of supernatant are thus obtained from a culture flask.
- a wash buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200-500 mM NaCl
- the purified virus itself is eluted with a high molecular weight saline solution (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.5 M NaCl), buffered by a Vivaspin UF unit and is then approximately 100 times concentrated in 16 ml of buffer of choice or medium.
- the re-determined titre shows a virus concentration of about 3.6 * 10 1 VmI. Both the conventionally prepared virus suspension A and the new suspension B were used for virus filtration experiments.
- a protein-containing solution (polyclonal antibody solution with 4 mg / ml in glycine buffer, pH 4.1) was spiked with different concentrations of virus suspensions A and B in different test runs and via a 5 cm 2 virus filter (Sartorius Virosart CPV virus filter, 20 nm nominal). filtered.
- a 5 cm 2 virus filter (Sartorius Virosart CPV virus filter, 20 nm nominal). filtered.
- the filtration time, the maximum filtration volume with 75% blockage of the filter and the titer reduction of the filter were determined.
- the results are summarized in Figure 4 as an influence of virus preparation on the filterability.
- the table shows significantly improved filterability of the virus suspension B after membrane chromatographic purification. It turns out that despite high spike concentrations with the virus suspension B (5% and more) the capacity of the virus filter is in a range determined for the virus filter without the addition of a virus suspension. This shows to the user the advantages described in practice to a particular extent.
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Abstract
Verfahren zum Nachweis der Virenabreicherung für die Validierung von Filtern, Filtrationsprozessen, physikalischen und chemischen Inaktivierungsmethoden oder von adsorptiven Abreicherungsmethoden unter vorgegebenen Prozessbedingungen, die im Kleinmaßstab nachgestellt werden, wobei: in einem ersten Schritt Viren in geeigneten Zelllinien angezüchtet werden, in einem zweiten Schritt nach einem Zellauf Schluss eine Virusssuspension gewonnen wird, in einem dritten Schritt die gewonnene Virussuspension einer zu untersuchenden Proteinlösung zugesetzt und in einem vierten Schritt die virushaltige Proteinlösung durch den zu validierenden Filter filtriert und anschließend die Virusabreicherung analysiert wird, wobei nach dem zweiten Schritt die Virussuspension zunächst über einen Membranadsorber prozessiert wird, wobei die Viren an den Membranadsorber gebunden und Kontaminationen mit Hilfe eines Waschpuffers entfernt werden und wobei die gebundenen, gereinigten Viren von der Membranadsorberf lache eluiert und in dem dritten Schritt als konzentrierte Virussuspension der zu untersuchenden Proteinlösung zugesetzt werden.
Description
Verfahren zum Nachweis der Virenabreicherung für die Validierung von Filtern und Filtrationsprozessen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der
Virenabreicherung für die Validierung von, Filtrationsprozessen, physikalischen und chemischen
Inaktivierungsmethoden oder von adsorptiven
Abreicherungsmethoden unter vorgegebenen
Prozessbedingungen, die im Kleinmaßstab nachgestellt werden, wobei: - in einem ersten Schritt Viren in geeigneten Zelllinien angezüchtet werden, in einem zweiten Schritt nach einem ZellaufSchluss eine
Virusssuspension gewonnen wird, in einem dritten Schritt die gewonnene Virussuspension einer zu untersuchenden Proteinlösung zugesetzt und in einem vierten Schritt die virushaltige Proteinlösung durch den zu validierenden Filter filtriert und anschließend die Virusabreicherung analysiert wird.
Nach dem Stand der Technik wird ein Nachweis der Abreicherung von Viren durch Filtration und anderen Technologien in Validierungsstudien erbracht. Validierungsstudien werden in der Regel durch qualifizierte Viruslabore durchgeführt, die gemäß der gesetzlichen Forderungen nach GLP (Good Laboratory Practice) arbeiten. Das grundsätzliche Prozedere zum Design und zur Durchführung von Validierungsstudien ist in dem CPMP Dokument der europäischen Behörde EMEA beschrieben (CPMP: „Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the
Inactivation and Removal of Viruses", February 1996 (CPMP/BWP/268/95) ) .
Unter Validierung versteht sich in diesem Zusammenhang das systematische Abprüfen der ausgewählten Technologien zur
Virusabreicherung oder Virusinaktivierung, wie z.B. der
Filtration, im Hinblick auf die Fragestellung, ob diese
Technologie in der Lage ist, unter den gegebenen
Prozessbedingungen des Anwenders, die im Viruslabor im Kleinmaßstab (scale down) nachzustellen sind, Viren in dem
Maß abzureichern oder zu inaktivieren, wie es seitens der
Behörden empfohlen und auch gefordert wird.
Die besonderen Anforderungen an die Auswahl, den Einsatz und die erwarteten Abreicherungsraten (Logarithmische Abreicherungsraten, auch kurz LRV genannt) der Viren sind im ICH-Q5A-Dokument und der EMEA-Richtlinie dargestellt und erläutert. (ICH Q5A. "Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin". Federal Register, Vol. 63, No. 185, 1998) und (CPMP: „Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses" . February 1996, CPMP/BWP/268/95) .
Validierungsstudien mit dem Ziel der Bestimmung der tatsächlichen Virusabreicherungsrate bestimmter Technologien werden auch „Spiking Studien" genannt, weil dem Produkt, in der Regel einer therapeutischen Proteinlösung, im Rahmen dieser Studie Viren zugesetzt (gespiked) werden, die dann von der jeweiligen, zu validierenden Technologie zu einem bestimmten Maße abzureichern oder zu inaktivieren sind.
Über die geforderte Höhe der Gesamtabreicherung aller in dem Prozess eingesetzten Technologien entscheidet eine Risikoabschätzung seitens des Kunden und eine abschließende Beurteilung durch die jeweilige Bundesbehörde, bei der die Zulassung bzw. die Unterlagen der Virus-Validierungsstudie eingereicht werden. Gesamtabreicherungsraten über einen kompletten Virusabreicherungsprozess („Virus Clearance") können in einem Bereich von 12 logio bis 24 logio Stufen liegen und für einzelne Technologien in einem Bereich von 3 logio bis 7 logio Stufen liegen.
Die Anzucht der Viren durch die hierfür zuständigen Viruslabore erfolgt in geeigneten Zelllinien, die mit den jeweiligen spezifischen Viren infiziert werden und ggf. durch Aufschluss der Zellen sowie aus dem Zellkulturüberstand gewonnen werden. Diese Zellkulturen sind für einen Virus oder mehrere Viren spezifisch und werden von den Viruslaboren von bestimmten, hierfür autorisierten Quellen bezogen.
Die als Figur 1 beigefügte Tabelle zeigt exemplarische Zelllinien, die für die Kultivierung von in Studien verwendeten Viren eingesetzt werden.
Figur 2 zeigt eine Tabelle einer Auflistung von Viren, die für die Prozessvalidierung von Plasma-Derivaten Verwendung finden.
Figur 3 zeigt eine Tabelle einer Auflistung von Viren für den Einsatz in Studien mit rekombinanten Proteinen.
Die Viruskonzentration aus einem Zellkulturüberstand nach der Anzucht und dem ZellaufSchluss (beispielsweise durch Schockgefrieren und Wiederauftauen der Lösung) liegen in einem Bereich von lOVml bis 109/ml.
Im Rahmen des „Spiken" werden diese Virussuspensionen den entsprechenden Proteinlösungen zugesetzt, wobei der Zusatz der Virussuspension auf max. 10 Vol.% begrenzt ist. (CPMP: „Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses". February 1996, CPMP/BWP/268/95) .
Nach dem Zusatz der Viren zu dem Produkt werden in der Regel Virustiter von 106/ml bis zu lOVml erreicht. Diese Lösung wird dann mit der entsprechenden Technologie zur Virusabreicherung oder Virusinaktivierung behandelt.
Für die Filtration als Beispieltechnologie zur Virusabreicherung (Größenausschlussprinzip, Virus wird auf Grund seiner Größe zurückgehalten und die therapeutische Proteinlösung fließt durch die Membran hindurch) werden in den Studien bestimmte Volumina an virushaltiger Proteinlösung (die Proteinkonzentration der Lösung unterliegt den Vorgaben des Herstellers und muss identisch zu dem Prozessmaßstab stehen, typische Proteinkonzentrationen können im Bereich von Λ10 μg/ml bis 50 mg/ml Lösung liegen) durch den Virusfilter filtriert.
Die Menge an zu filtrierender virushaltiger Lösung muss identisch zu dem Volumen der Prozessfiltration sein. Diese wird durch das Herunterskalieren der Prozessmengen auf den Labormaßstab des Virusfilters erreicht. Typische Filtrationsmengen liegen in einem Bereich von 4 ml/cm2 bis 60 ml/cm2 Virusfilterfläche.
Nach Filtration der Testlösung durch den zu validierenden
Filter wird die Virusabreicherung analysiert. Der Standard- Nachweistest ist der TCID50-infectivity-Test, der in den
zitierten Richtlinien beschrieben ist:
Kärber G. Beitrag zur kollektiven Behandlung Pharmakologischer Reihenversuche. Arch Exp Path Pharmakol 1931; 162 : 480-483.) - Bundesgesundheitsamt und Paul-Ehrlich-Institut, Bundesamt für Sera und Impfstoffe [PEI] . Bekanntmachung über die Zulassung von Arzneimitteln: Anforderungen an Validierungsstudien zum Nachweis der Virussicherheit von Arzneimitteln aus menschlichem Blut oder Plasma, 1994 May. Vorhanden von: Bundesanzeiger, Nr. 84.
In diesen Dokumenten ist sowohl der Test als auch die Auswertemethodik beschrieben. Neben dem TCID50-Test gibt es ggf. ELISA-Tests und molekularbiologische Methoden (PCR, Polymeraseketten-Reaktion) für den Nachweis von Viren.
Nachteilig bei dem bekannten Verfahren ist, dass die Zugabe von Virusüberstand, das „Spiken", die zu testende Produktlösung dahingehend verändert, dass Bestandteile in die Proteinlösung eingebracht werden, die im tatsächlichen Prozessmaßstab nicht vorhanden sind.
Neben vielen biochemischen Stoffen aus dem „sp^ke" besitzen vor allem Host-Cell-Proteine und Nukleinsäuren, Zellbruchstücke und Anzuchthilfsstoffe wie Kälberserum Nachteile hinsichtlich der Validierungsstudie.
Ein weiterer Nachteil für die Filtration oder beispielsweise die chromatographische Aufreinigung innerhalb einer Validierungsstudie besteht in einer erheblich schlechteren Filtrierbarkeit der virushaltigen Lösung oder aber in Problemen in dem Chromatographieprozess selber. Des Weiteren können die zusätzlich eingebrachten Komponenten (Nukleinsäuren, Kälberserum, Salze) Verfahren zur Virenquantifizierung (z.B. ELISA bzw. PCR)
beeinflussen. Weiterhin gibt es Viren, die sich auf Grund ihrer natürlichen Situation nur bis zu einer bestimmten Konzentration im Zellkulturüberstand anziehen lassen. Wenn dann im Rahmen der Validierungsstudie bis zu 10 % eines solchen Überstandes zugesetzt wird, kommt es regelmäßig zu einer vorzeitigen Verblockung des Filters, so dass die vorgesehene Menge an Volumen pro Flächeneinheit nicht filtriert werden kann. Als unmittelbare Konsequenz dessen wird dann im Rahmen einer Virus-Validierungsstudie der Spike-Zusatz soweit reduziert, dass die Lösung mit dem vorgegebenen Volumen über die entsprechende Fläche des Virusfilters filtriert werden kann.
Dieses kann im Extremfall dazu führen, dass der dynamische Bereich der möglichen Virusabreicherung (Dynamischer Bereich = Ausgangstiter minus Nachweisgrenze) nicht mehr ausreicht, um die gewünschte oder erforderliche Virusabreicherung einer bestimmten Technologie überhaupt zeigen zu können. Wenn dieses der Fall ist, bleibt als einzige Alternative die Wahl einer höheren Filterfläche, was im Prozessmaßstab zu erheblich höheren Filtrationskosten führt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren anzugeben, welches die oben genannten Nachteile vermeidet .
Diese Aufgabe wird in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 1 dadurch gelöst, dass nach dem zweiten Schritt die Virussuspension zunächst über einen Membranadsorber prozessiert wird, dass die Viren an den Membranadsorber gebunden und unerwünschte Bestandteile mit Hilfe eines Waschpuffers entfernt werden und dass die gebundenen Viren von der Membranadsorberflache eluiert und im dritten
Schritt als gereinigte, konzentrierte Virussuspension der zu untersuchenden Proteinlösung zugesetzt werden.
Die Aufbereitung der Virussuspension, d.h. die Bindung der Viren an einen Membranadsorber mit anschließender Reinigung und Eluation der Viren, führt dazu, dass beispielsweise 100 ml Virenüberstand auf wenige ml Eluat konzentriert werden, so dass reine und höher konzentrierte Virenpräparationen zur Verfügung stehen. Dadurch, dass hohe Ausgangstiter in der Spike-Lösung bzw. Virensuspension erzielt werden, können die im Scale-Down-Experiment bzw. Kleinmaßstab des Anwenders ermittelten Volumen pro Flächeninhalt auch in der Virus-Validierungsstudie erreicht werden. Die oben genannten Nachteile werden damit sicher und zuverlässig vermieden.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt der Membranadsorber eine mikroporöse Anionen- oder Kationenaustauschermembran mit Porengrößen > 1 μm dar. Da die Diffusionslimitierung bei der Membranchromatographie praktisch keine Rolle spielt, kann mit relativ hohen Flussraten operiert werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die infizierten Zelllinien durch einen Gefrierprozess (Schockgefrieren) mit anschließendem Auftauen aufgeschlossen und bei ca. 2000 U/min über einen Zeitraum von ca. 10 min zentrifugiert . Die so gewonnene Virussuspension wird über einen Membranadsorber mit mikroporöser Struktur prozessiert, wobei die negativ geladenen Viren an positiv geladene Seitenketten des Membranadsorbers gebunden werden.
Durch Anwendung eines Waschpuffers mit erhöhter Salzkonzentration können weniger stark bindende Kontaminationen entfernt werden. Das reine Virus kann hiernach mit einer hochmolekularen Salzlösung eluiert und beispielsweise durch eine Vivaspin-Ultra-Filtrationseinheit umgepuffert werden und liegt dann in stark konzentrierter Form vor. Die konzentrierte und gereinigte Virussuspension kann dann der zu untersuchenden Proteinlösung zugesetzt oder zwischengelagert werden. In einem Folgeschritt wird die virushaltige Proteinlösung in bekannter Weise durch den zu validierenden Filter filtriert und anschließend die Virusabreicherung analysiert.
Anwendungsbeispiel :
Zur Durchführung einer Virusfiltration werden Parvoviren in einer PK13-Zellkultur vermehrt. Die PK13-Zellen stammen von der American Type Culture Collection, USA (ATCC-No CRL- 6489) . PK13-Zellkulturschalen mit je 175 cm2 Fläche werden hierzu mit PPV infiziert und 3 bis 5 Tage später die Viren abgeerntet. Die Viren befinden sich in dem Überstand der durch die Infektion und Schockgefrierung zerstörten Zellen. Aus einer Kulturflasche werden so ca. 40 ml Überstand gewonnen. 45 Flaschen werden für die Vorbereitung der Virusfiltration mit insgesamt 1800 ml Überstand (erzielt durch Zentrifugation bei 2000 U/min (etwa 800g) ± 100 U/min bei 10 min ± 1 min, die Zellen werden vorher durch eine Gefrier- und Auftauschritt vollständig zerstört) herangezogen. Der Überstand wurde mit 0,45 μm eines Membranfilters vorfiltriert und danach der Titer mit 5,6 * loVml bestimmt.
Hiervon werden nun 300 ml für die Virusfiltration direkt herangezogen (Suspension A) . Für die Aufbereitung der
übrigen 1500 ml (Suspension B) mit dem Membranadsorber wurde das Filtrat des Zellkulturüberstandes auf eine mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 Puffer äquilibrierte Membranadsorbereinheit geladen. Dabei binden die Viren an Liganden auf der porösen Membranstruktur.
Durch Anwendung eines Waschpuffers (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200-500 mM NaCl) mit erhöhter Salzkonzentration können weniger stark bindende Kontaminationen entfernt werden. Das gereinigte Virus selbst wird mit einer hochmolekularen Salzlösung (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.5 M NaCl) eluiert, durch eine Vivaspin-UF-Einheit umgepuffert und liegt dann ca. hundertfach konzentriert in 16 ml Puffer nach Wahl oder Medium vor. Der erneut bestimmte Titer zeigt eine Viruskonzentration von ca. 3,6 * 1O1VmI. Sowohl die herkömmlich hergestellte Virussuspension A als auch die neue Suspension B wurden für Virus-Filtrationsversuche herangezogen .
Hierzu wurde eine proteinhaltige Lösung (polyklonale Antikörperlösung mit 4 mg/ml in Glycinpuffer, pH 4,1) mit verschiedenen Konzentrationen der Virussuspensionen A und B in unterschiedlichen Testläufen gespiked und über einen 5cm2 -Virusfilter (Sartorius Virosart CPV Virusfilter, 20 nm nominal) filtriert. Im Rahmen der Versuchsreihe wurde die Filtrationszeit, das maximale Filtrationsvolumen bei 75%iger Verblockung des Filters und die Titerreduktion des Filters ermittelt.
Die Ergebnisse sind in Figur 4 als Einfluss der Virusaufbereitung auf die Filtrierbarkeit zusammenfasst . Die Tabelle zeigt deutlich verbesserte Filtrierbarkeit der Virussuspension B nach membranchromatographischer Aufreinigung. Es zeigt sich, dass trotz hoher Spike- Konzentrationen mit der Virussuspension B (5 % und mehr)
die Kapazitäten des Virusfilters in einem Bereich liegen, der für den Virusfilter ohne Zusatz einer Virussuspension ermittelt wurde. Hiermit zeigen sich für den Anwender die in der Praxis beschriebenen Vorteile in besonderem Maße.
Claims
1. Verfahren zum Nachweis einer Virenabreicherung für die
Validierung von Filtern, Filtrationsprozessen, physikalischen und chemischen Inaktivierungsmethoden oder von adsorptiven Abreicherungsmethoden unter vorgegebenen Prozessbedingungen, die im Kleinmaßstab nachgestellt werden, wobei: in einem ersten Schritt Viren in Zelllinien angezüchtet werden, in einem zweiten Schritt nach einem ZellaufSchluss eine Virusssuspension gewonnen wird, in einem dritten Schritt die gewonnene Virussuspension einer zu untersuchenden Proteinlösung zugesetzt und in einem vierten Schritt die virushaltige Proteinlösung durch den zu validierenden Filter filtriert und anschließend die Virusabreicherung analysiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem zweiten Schritt die Virussuspension zunächst über einen Membranadsorber prozessiert wird, wobei die Viren an den Membranadsorber gebunden, Kontaminationen mit Hilfe eines Waschpuffers entfernt werden und die gebundenen, gereinigten Viren von der Membranadsorberflache eluiert und in dem dritten Schritt als konzentrierte Virussuspension der zu untersuchenden Proteinlösung zugesetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Membranadsorber eine mikroporöse Anionen- oder
Kationenaustauschermembran mit Porengrößen
> 1 μm verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die infizierten Zelllinien durch einen Gefrierprozess mit anschließendem Auftauen aufgeschlossen und die Virussuspension aus einem
Zellkulturüberstand nach vorangegangener Zentrifugation gewonnen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zentrifugation bei 2000 U/min ± 100 U/min über einen Zeitraum von 10 min ± 1 min erfolgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die negativ geladenen Viren an positiv geladene Seitenketten des Membranadsorbers gebunden werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass beim Bindungsvorgang der isoelektrische Punkt zwischen 3 bis 6 und der pH-Wert zwischen 5,5 und 8 eingestellt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die gebundenen Viren mit wässrigen Puffern mit ansteigendem Salzgehalt im kleinen Volumen von der Membranadsorberflache isoliert wird.
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