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WO2007037429A1 - 新規組換え型ヒトｃ型肝炎ウイルス様粒子とその産生方法 - Google Patents

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WO2007037429A1
WO2007037429A1 PCT/JP2006/319573 JP2006319573W WO2007037429A1 WO 2007037429 A1 WO2007037429 A1 WO 2007037429A1 JP 2006319573 W JP2006319573 W JP 2006319573W WO 2007037429 A1 WO2007037429 A1 WO 2007037429A1
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strain
virus
protein
hcv
hepatitis
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PCT/JP2006/319573
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Jun-Ichi Tanabe
Saburo Sone
Takaji Wakita
Koji Ishii
Ryosuke Suzuki
Tetsuro Suzuki
Tatsuo Miyamura
Original Assignee
Japan As Represented By Director-General Of National Institute Of Infectious Diseases
Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research
Toray Industries, Inc.
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Publication date
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    • C12N2770/24252—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Definitions

  • Novel recombinant human hepatitis c virus-like particles and production method thereof Novel recombinant human hepatitis c virus-like particles and production method thereof
  • the present invention relates to a human recombinant hepatitis C virus-like particle and a production method thereof.
  • the physicochemical methods include calcium phosphate coprecipitation method, DEAE dextran method, lipofection method, microinjection method, and electoral position method.
  • a biological method there is a method using a viral vector.
  • the viral vector method is a method of introducing a gene by utilizing a cell entry mechanism possessed by a virus, that is, infectivity.
  • Virus-derived structural proteins are present on the surface of recombinant virus particles produced using viral vectors, and receptors present on the cell surface. It has a mechanism for infecting cells through the cell and efficiently introducing genes. Therefore, recombinant virus particles prepared using such viral vectors are not only used for the purpose of introducing genes into animal cells to produce target gene-expressing cells, but also for gene therapy, transgenic animal production, etc. It can be used for any purpose.
  • Virus vectors are classified into three categories: retrovirus vectors, DNA virus vectors, and RNA virus vectors.
  • Retroviruses have plus-strand RNA as a genome.
  • This RNA has typical eukaryotic mRNA properties, ie, methylated 5, end-capped structure 3, and poly A consisting of about 200 bases at the end! /.
  • this RNA is converted to DNA by the reverse transcriptase of the virus.
  • the integrated DNA is called a provirus.
  • a repeat sequence (LTR) is generated at both ends of the provirus, and viral RNA is synthesized by the promoter in it. The synthesized RNA translates the viral protein, and the genome-size RNA is incorporated into the virus particle and becomes a child particle and released outside the cell.
  • RNA structure necessary for producing virus particles is the LTR at both ends, the primer binding site surrounded by it, the knocking signal, and the polypurine signal. These are essential cis factors. On the other hand, if a viral protein is supplied in an infected cell where the gene encoding the viral protein is not essential as a cis factor, replication and particle production will be performed normally.
  • a vector into which a gene of interest to be expressed is inserted instead of a gene such as gag, po 1, or env encoded by the retrovirus (referred to as a retrovirus vector)
  • a retrovirus vector When this vector is introduced into a cell (usually called a packaging cell) supplied with a viral protein, a retroviral particle incorporating a foreign gene is produced (Non-patent Document 1).
  • retroviruses examples include mouse leukemia virus, feline leukemia virus, baboon C-type oncovirus, human immunodeficiency virus, and adult T cell leukemia virus. Furthermore, those reported as recombinant retrovirus vectors include those based on murine leukemia virus (Non-patent document 1) and those based on human immunodeficiency virus (Non-patent document 2). Etc.
  • a system for the production of recombinant retroviruses consists of two components: the genetic information to be introduced (target foreign gene) and the elements necessary for packaging and integration of the viral genome. It also works with retroviral vectors (recombinant retroviral DNA) that retain all of them in cis and retroviral packaging cells that provide viral proteins encoded by the gag, pol and env genes. Recombinant retroviral particles cannot be released only by packaging cells into which a recombinant vector expressing gag, pol and env genes has been introduced.
  • the gag, pol and env proteins are trans Must be located in trans. Therefore, by introducing a retroviral vector into a packaging cell into which a recombinant vector that expresses the gag, pol, and env genes has been introduced, a recombinant retrovirus that retains the genetic information contained in the vector can be produced. . If these viruses are then used to infect cells, retroviral vectors will integrate into the cell's chromosomal genome according to the natural retroviral life cycle.
  • the retroviral vector method is a system created for the purpose of efficiently integrating specific DNA into the host chromosome genome, and the insertion position of the target gene cannot be predicted. The possibility of damage, activation of nearby genes, overexpression of target foreign genes, or suppression of expression cannot be denied.
  • the development of a transient expression system using a DNA virus vector that can be used as an extrachromosomal gene was advanced.
  • a DNA virus vector is a vector derived from a DNA virus.
  • a DNA virus retains DNA as genetic information in a virus particle, and its DNA replication is a self-form of DNA, and a host-derived DNA-dependent DNA replication enzyme is at least part of the catalyst. This is done by repeating the process of generating a complementary strand.
  • DNA viral vectors that can be used as extrachromosomal genes include adenoviral vectors.
  • Human adenovirus has approximately 36kb of linear double-stranded DNA as its genome, and the region contained in it is large in early genes El, E2, E3, E4 and late genes LI, L2, L3, L4, L5 Separated. The early genes are mainly involved in virus replication, and the late genes are involved in the synthesis of viral structural proteins such as force psid.
  • Adenovirus vector used for gene transfer One is an early gene E1 region (divided into E1A and E1B, and all adenovirus promoters are activated by E1A) (target gene) ) Cells and proliferate in 293 cells, which are cell lines that can supply E1A to trans (293 cells express E1A).
  • Non-patent Document 4 genes can be introduced into both non-proliferating cells and proliferating cells. Therefore, this method is suitable for in vivo gene transfer.
  • One of the disadvantages of this vector is that the gene expression period is generally short (weekly). This is because the adenovirus genome exists only in the extrachromosomal region (episosome), and no replication or amplification is performed.
  • the second disadvantage is that adenoviruses currently in common use cause non-specific inflammatory responses and enhance the cellular immune response against the vector itself. There are concerns about the difficulty of administration (Non-patent Document 5).
  • RNA viruses are duplicated by repeating the process of generating complementary strands by using self RNA as a cage and catalyzing self-derived RNA-dependent RNA replication enzymes.
  • RNA viruses are divided into (-) strand RNA viruses and (+) strand RNA viruses.
  • a typical (-) strand RNA virus is influenza virus.
  • the influenza virus genome is a virus consisting of eight segmented negative-strand RNAs.
  • viral RNA polymerase cleaves host cell mRNA from the 5 'end cap structure at a portion of more than 10 nucleotides, and uses it as a primer to extend the RNA strand (plus strand).
  • Viral proteins are translated from this plus-strand RNA.
  • RNA that is completely complementary to the viral RNA is synthesized, and this is used as a cocoon to amplify the progeny viral RNA.
  • the viral RNA is then packaged with viral proteins into viral particles.
  • RNA polymerase II system promoter such as CMV or CAG promoter
  • the viral RNA is expressed by a cap structure and polyA.
  • the promoter RNA polymerase type I promoter such as rRNA gene If expressed in a child promoter, viral RNA is packaged together with viral proteins in the cell to form viral particles (Non-patent Document 6).
  • the amount of virus produced is not shown, and the production power has been established as a technology that can be fully utilized.
  • Sindbis virus and hepatitis C virus are viruses classified as (+) strand RNA viruses.
  • the (+) strand RNA virus has a genomic RNA that simultaneously functions as a messenger RNA (hereinafter referred to as “mRNA”), and can produce proteins necessary for replication and particle formation depending on the translation function of the host cell. it can.
  • mRNA messenger RNA
  • the genomic RNA of the (+) strand RNA virus itself has the ability to propagate.
  • a virus vector derived from Sindbis virus has a genomic RNA in which a structural gene region related to a viral structure is deleted, and a viral transcriptional replication protein gene group remains,
  • the basic structure is RNA that has a desired foreign gene connected downstream of the transcription promoter.
  • RNA or cDNA that can transcribe the RNA is introduced into the cell, autonomous replication of the RNA vector containing the foreign gene and transcription of the foreign gene downstream of the transcription promoter occur, and the desired foreign gene product Is expressed in cells.
  • a cDNA unit (helper) that expresses the structural gene and a cDNA unit that expresses the above RNA vector coexist in the packaging cell to produce a complex that has infectivity but does not have the ability to propagate.
  • Sindbis virus uses a 67-kilodalton high-affinity laminin receptor (LAMR) as a receptor and infects nerve cells with high efficiency. Is attracting attention as a system for gene-specific gene introduction (Non-patent Document 8). However, Sindbis virus infection has been shown to induce apoptosis in host cells (Non-patent Document 9), and there is concern about toxicity.
  • LAMR high-affinity laminin receptor
  • the genome of hepatitis C virus is a single-stranded RNA (+) chain consisting of about 9600 nucleotides.
  • This genomic RNA consists of a 5 ′ untranslated region (also referred to as 5′NTR or 5′UTR), a translated region composed of a structural region and a nonstructural region, and a 3 ′ untranslated region (3′NTR or 3 ′ (Also referred to as UTR).
  • the structural region encodes a structural protein of HCV
  • the nonstructural region encodes a plurality of nonstructural proteins.
  • HCV structural proteins Core, El, E2, and p7 and non-structural proteins (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, and NS5B) are a series of polyproteins from the translation region. After being translated, they are released and produced by limited degradation by proteases.
  • Core is the core protein and E1 and E2 are envelope proteins.
  • Non-structural proteins are proteins involved in the virus's own replication.
  • NS2 is metaprotease activity
  • NS3 is serine protease activity (1/3 of the N-terminal side) and helicase activity (3 minutes of C-terminal side). 2).
  • NS4A is a cofactor for NS3 protease activity
  • NS5B has been reported to have RNA-dependent RNA polymerase activity.
  • HCV is classified into a number of types according to genotype or serotype.
  • HCV is genotype la, genotype lb, genotype 2a, genotype 2b, and gene type 3a. These are classified into 6 types, genotype 3b, and each type is further classified into several subtypes. And about the multiple genotypes of HCV, the base sequence of the full length of the genome is also determined (nonpatent literatures 10-13).
  • HCV particles are captured by sulfate polysaccharides on the cell surface, bind to high-affinity receptors via envelope proteins, and are taken up into endosomes by endocytosis. Subsequently, the viral membrane and endosomal membrane fuse, and the nucleocapsid enters the cytoplasm. Translation of the naked viral genome is initiated by IRES. Translation and protein cleavage occur on the endoplasmic reticulum membrane. The core protein, E1 and E2 proteins, and viral RNA replicated in the endoplasmic reticulum assemble to form viral particles. After that, it buds into the endoplasmic reticulum cavity. It is believed that the budding particles pass through the Golgi apparatus and are released outside the cell.
  • HCV subgenomic RNA replicons have been prepared as RNA having autonomous replication ability derived from HCV (Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Documents 14 to 16). It became possible to analyze the replication mechanism of HCV. These HCV subgenomic RNA replicons are downstream of HCV IRES in the 5 'untranslated region of HCV genomic RNA The structural protein was replaced with the neomycin resistance gene and EMCV-IRES linked downstream. This RNA replicon was proved to replicate autonomously in Huh7 cells when introduced into human hepatoma cells Huh7 and cultured in the presence of neomycin.
  • Patent Document 3 proposes the production of HCV virus particles using the full-length HCV genome for the use of recombinant HCV as a gene therapy vector! No. 2002-171978
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-17187
  • Patent Document 3 International Publication WO2004Z104198
  • Non-patent literature l Mann, R. et al, Cell, 33 (1983) pl53-59
  • Non-Patent Document 2 Simada, T et al., J Clin Invest. 88 (1991) pi 043-47
  • Non-Patent Document 3 Betta, A et al "Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 (1994) p8802- 06
  • Non-Patent Document 4 Burden, S & Yarden, Y., Neuron, 18 (1997) p847-55
  • Non-Patent Document 5 Crystal, R.G Science, 270, (1995) p404-10
  • Non-Patent Document 6 Neumann, G. & Kawaoka, Y., Virology 287 (2001) p243- 50
  • Non-Patent Document 7 Berglund, P et al., Biotechnology, 11 (1993) p916-920
  • Non-Patent Document 8 Wang, K.S et al., J. Virol. 66 (1992) p4992- 5001
  • Non-Patent Document 9 Levine, B. et al., Nature, 361 (1993) p739-42
  • Non-Patent Document 10 Simmonds, P. et al., Hepatology, 10 (1994) pl321-24
  • Non-Patent Document ll Choo, Q.L et al "Science, 244 (1989) p359-362
  • Non-Patent Document 12 Okamoto, H et al "J. Gen. Virol, 73 (1992) p673- 79
  • Non-Patent Document 13 Mori, S. et al "Biochem. Biophis. Res. Commun. 183 (1992) p334-4
  • Non-Patent Document 14 Blight et al., Science, 290 (2000) pl972-74
  • Non-Patent Document 15 Friebe et al., J. Virol, 75 (2001) pl2047-57
  • Non-Patent Document 16 Kato, T. et al., Gastroenterology, 125 (2003) pl808-17 Disclosure of the invention
  • HCV has not actually been developed as a viral vector such as retrovirus, adenovirus, influenza virus, and Sindbis virus. If such H
  • CV vectors are developed, it will be possible to introduce genes specifically into cells of tissues such as the liver. In that case, in order to ensure a higher degree of safety, it is desirable that the HCV vector infects cells but does not propagate.
  • An object of the present invention is to develop recombinant hepatitis C virus (HCV) -like particles that can be used as vectors as described above. Another object is to provide a method for efficiently producing the HCV-like particles.
  • HCV hepatitis C virus
  • the present inventors tried to produce recombinant HCV-like particles in cultured cells that are considered industrially useful in terms of safety, convenience, and applicability.
  • the HCV genome was divided into a vector that expresses HCV structural proteins and a vector that contains genes involved in replication.
  • the latter vector can contain a desired foreign gene and / or an internal ribosome entry site (IRES).
  • IRS internal ribosome entry site
  • the present inventors constructed a vector in which a DNA comprising a desired foreign gene, IRES sequence, and a gene related to HCV replication is cloned downstream of the T7 promoter, and in vitro using T7 polymerase.
  • An HCV subgenomic RNA replicon containing the foreign gene sequence was synthesized. This RNA replicon was introduced into cultured animal cells, and the HCV subgenomic RNA replicon was replicated to obtain a cell line.
  • the present inventors have found that the recombinant HCV-like particles produced by the method of the present invention are infected, and that the cells infected with the recombinant HCV do not produce offspring virus particles, and are not easily transmitted. Na I confirmed. Due to these characteristics, the recombinant HCV particles of the present invention can be used as a vector for introducing a foreign gene or for gene therapy.
  • the present invention is a method for producing recombinant hepatitis C virus particles
  • Recombinant C-type produced by introducing a vector expressing Core protein, E1 protein, E2 protein and p7 protein derived from the same or different hepatitis C virus strain as above (0), culturing the cell, and The method is provided comprising recovering hepatitis virus particles.
  • the (0 and GO hepatitis C virus strains are independently a group consisting of the virus strains of the gene types la, lb, 2a, 2b, 3a and 3b. Power At least one strain selected.
  • the hepatitis C virus strains of (0 and (ii) are independently selected from at least one selected from the group strength of the virus strains of genotype lb and 2a. Is a stock.
  • the (0 hepatitis C virus strain) is a virus strain of genotype lb.
  • the genotype lb virus strain is a conl strain or a derivative thereof.
  • the GO hepatitis C virus strain is a genotype 2a virus strain.
  • the genotype 2a virus strain is a JFHI strain or a derivative thereof.
  • the RNA levicon is at least one internal ribozo. It may further include a genome binding site (IRES) sequence.
  • IFN genome binding site
  • the RNA replicon can further comprise at least one foreign gene.
  • the IRES and the foreign gene can be located between the 5 'untranslated region and the NS3.
  • the cell is an animal cell.
  • the animal cell is a mammalian cell.
  • the expression vector is a viral vector.
  • the viral vector is a vaccine virus vector.
  • Recombinant hepatitis C virus particles produced and recovered by the above method of the present invention are further infected with HCV sensitive cells such as hepatocytes or lymphoid cells to propagate virus particles. Can do.
  • HCV sensitive cells such as hepatocytes or lymphoid cells to propagate virus particles. Can do.
  • the present invention includes such steps.
  • the present invention is also produced in the second aspect by the method of the present invention described above.
  • the present invention also provides recombinant hepatitis C virus particles that are infectious but have no propagation power.
  • the recombinant hepatitis C virus particle is introduced with a foreign gene so that it can be expressed.
  • the recombinant hepatitis C virus particle is a vector.
  • a method for producing recombinant hepatitis C virus particles comprising:
  • the method comprises the steps of: introducing a virus vector, culturing the cell, and recovering the produced recombinant hepatitis C virus particles.
  • a suitable recombinant hepatitis C virus particle is produced by the above-mentioned preferred method.
  • the present invention further includes the following [1] to [2].
  • a method for producing recombinant hepatitis C virus-like particles comprising:
  • the hepatitis C virus strain having the genotype lb of (i) is a conl strain.
  • the (i) genotype 2a hepatitis C virus strain is JFH1 strain U.
  • the hepatitis C virus strain of genotype la in (ii) is H77c strain, 1 strain, H strain and HC-J1 strain.
  • the hepatitis C virus strain having the genotype lb of (ii) is a J1 strain, a conl strain, or a TH strain.
  • J strain, JT strain, and BK strain are also preferable.
  • the hepatitis C virus strain of genotype 2a of (ii) is a JFH1 strain, an HC-J6 strain,
  • JCH1 strain and J6CF strain are also preferable.
  • the genotype 3a hepatitis C virus strain of (ii) above is the NZL1 strain or the K3a / 650 strain.
  • the genotype 3b hepatitis C virus strain of (ii) is a Tr strain.
  • the vector of (ii) is a cuticular virus vector or an EF-1a promoter-containing vector.
  • the RNA replicon further comprises at least one internal ribosome binding site (IRES) sequence and Z or at least one foreign gene.
  • IRS internal ribosome binding site
  • the IRES sequence and the Z or foreign gene are preferably located between the 5 'untranslated region and the NS3 protein coding sequence.
  • the cell is preferably an animal cell.
  • Huh7 cells as animal cells
  • H-marked G2 cells or cell lines derived from those cell forces are more preferred.
  • a non-transmissible recombinant infectious HCV-like particle packaged with HCV subgenomic RNA containing a desired foreign gene and a method for producing the same.
  • Such recombinant infectious HCV-like particles have the advantage of lack of transmissibility and are particularly used for gene transfer (eg, gene therapy) to liver or lymphoid cells or tissues. Or has the advantage that it can be used as a viral vector for the production of transgenic animals and even as an attenuated vaccine.
  • FIG. 1 is a schematic view of an embodiment of the present invention, and shows a production process of recombinant HCV-like particles.
  • FIG. 2 shows the structure of cDNA of HCV genomic RNA and HCV subgenomic RNA.
  • the upper row is pFHl prepared from HCV genotype 2a, and the middle row is pSGR-JFHl.
  • the lower row is I389 / NS3-3 ′ / wt prepared from HCV genotype lb.
  • the symbols in the figure are as follows.
  • T7 T7 RNA promoter. 5'UTR: 5 'untranslated region.
  • Core Core protein.
  • El, E2 Envelope protein.
  • p7 p7 protein.
  • NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B nonstructural proteins.
  • 3'UTR 3 'untranslated region.
  • Age I, Pme I, Xba I cleavage sites for restriction enzymes
  • EMCV IRES Internal ribosome binding site of encephalomyocarditis virus.
  • FIG. 3 shows a map of a vector for expressing the HCV structural protein of the present invention.
  • the upper row is a plasmid clone pGAGC-p7JFHl created by inserting the JFH structural region gene downstream of the CAG promoter
  • the lower row is the JFH structural region gene downstream of the Elon Gation Factor 1 ⁇ promoter sequence.
  • 2 shows the structure of the plasmid clone ⁇ F4C-p7JFHl produced in the above manner. The symbols in the figure are as follows.
  • CAG CAG promoter 1
  • pA polyA-attached sequence
  • EcoRI restriction enzyme EcoRI cleavage site
  • EF-1 a Elongation factor 1 ⁇ promoter
  • BGH pA ushi growth factor poly-attached sequence.
  • Figure 4 shows the HCV structural gene inserted into the vectors pDIsHJFHst, pDIsH77st ⁇ pDIsJlst, pDIsJl (c) / JFH (El—p7) st and pDIsJFH (c) / Jl (El-p7) st! The map of is shown. Differences in the virus strains from which they are derived are shown in the shaded area.
  • FIG. 5 shows that HCV replicon RNA in each fraction obtained by introducing pEF4C-p7JFHl into a replicon-retaining cell line IH4.1 and fractionating the cell culture supernatant (sup) with a sucrose density gradient. It is a graph (B) which shows the quantity (A) and the quantity of HCV Core protein. Mouth: Experiment 1, ⁇ : Experiment 2 0
  • Fig. 6 shows that each of the fractions obtained by infecting the replicon-carrying cell line 5-15 with the viral virus vector DIsJFHst and fractionating the cell culture supernatant (sup) with a sucrose density gradient (horizontal It is a graph which shows the quantity (vertical axis) of HCV Core protein in (axis). The black circles show the results using the HCV Core (Core) protein, and the black squares show the results using the NP40-treated culture supernatant. Experiment 1 shows the results of untreated only ( Figure 6A), and Experiment 2 shows the results of untreated and NP40 treatment ( Figure 6B).
  • RNA levicon refers to RNA having autonomous replication ability produced by modifying the HCV virus genome.
  • Autonomous replication ability refers to autonomous reproduction of nucleic acid copies in cells like plasmid DNA.
  • infectious refers to the ability to introduce a nucleic acid or the like inside a virus into a cell by retaining the ability to adhere to a cell and membrane fusion ability. Point to.
  • Recombinant hepatitis C virus means a virus that has qualitatively / quantitatively altered the properties of the original HCV virus by genetic recombination technology. Viruses that have the ability to express foreign genes other than those that do not, viruses that lack the ability to replicate the virus genome, etc., in a broad sense, between the same virus types or subtypes. It also includes viruses that have been genetically modified.
  • Propagation or “propagation force” refers to an infectious particle or a compound equivalent thereto after the nucleic acid is replicated after the nucleic acid is introduced into the cell by infection or an artificial technique. It means the ability to form the body and propagate to other cells.
  • Core is the core structural protein of HVC.
  • E1 and E2 are both envelope structural proteins.
  • NS refers to a non-structural protein of HCV and is a protein involved in the replication of the virus itself.
  • “NS2” has meta-oral protease activity.
  • “NS3” has serine protease activity (1/3 on the N-terminal side) and helicase activity (2/3 on the C-terminal side).
  • “NS4A” is a cofactor for the protease activity of NS3.
  • the function of “NS4B” is not clear.
  • NS5A is considered to have an activity to control the signal transduction of host cells.
  • NS5B has RNA-dependent RNA polymerase activity.
  • IRES sequence means an internal ribosome binding site capable of binding a ribosome inside RNA to initiate translation.
  • Be able to express refers to a state in which a target gene can be transcribed and translated by a regulatory sequence such as a promoter or an enzyme.
  • a regulatory sequence such as a promoter or an enzyme.
  • the wild-type HCV genome consists of a single-stranded RNA of about 9.6 kb in length that encodes a precursor protein of about 3,000 amino acids.
  • the HCV genome consists of 5 'untranslated region (5'UTR), Core, El, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B, 3' untranslated region (3'UTR). ing .
  • the HCV subgenomic RNA replicon used in the method of the present invention includes a modified RNA composed in the order of 5 ′ untranslated region, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B, 3 ′ untranslated region. This RNA replicon is introduced into a specific cell so that it can replicate under the action of a regulatory factor such as a promoter.
  • the RNA replicon may further include a foreign gene and / or an IRES sequence.
  • the foreign gene and the IRES sequence can preferably be located in the order of the foreign gene and the IRES sequence between the 5 ′ untranslated region and the NS3 coding sequence.
  • IRES sequences include, but are not limited to: EMCV IRES (internal ribosome binding site of encephalomyocarditis virus), FMDV IRES, HCV IRES, etc. 1S EMCV IRES and HCV IRES force is preferred over S, and EMCV IRES is most preferred.
  • a gene exhibiting drug resistance that is, this gene is a gene that enables selection of cells, and cells having the gene become resistant to the drug
  • a reporter gene ie, this gene is a marker gene encoding a gene product that is an indicator of gene expression
  • Genes encoding enzymes that catalyze luminescent or color reactions such as luciferase, green fluorescent protein (GFP), ⁇ -galactosidase
  • target genes for gene therapy or therapeutic nucleic acids such as mammals including humans
  • Nucleic acids for treatment of proteins such as enzymes, cytokines, chemokines, hormones, antibodies, immunoregulatory molecules, tumor suppressor proteins, growth factors, membrane proteins and vas
  • HCV subgenomic RNA replicons include pSGR-JFHl (middle of Fig. 2), I / N
  • HCV subgenomic RNA replicons are For example, it is produced using the method described in Kato, T. et al. Gastroenterology, 2003 125: 1808-1817, International Publication WO 2004/104198 (Patent Document 3), etc. be able to.
  • HCV is classified into 6 types: genotype la, genotype lb, genotype 2a, genotype 2b, genotype 3a, and genotype 3b. Each of these types is classified into several subtypes.
  • genotype la genotype la
  • genotype lb genotype 2a
  • genotype 2b genotype 3a
  • genotype 3b genotype 3b
  • each of these types is classified into several subtypes.
  • the base sequence of the entire genome has also been determined (Simmonds, P. et al., Hepatology, 10 (1994) pl321-1324, and Choo, QL et al "Science, 244 (1989) p359-362, Okamoto, H et al "J. Gen. Virol, 73 (1992) p673-679, Mori, S. et al” Biochem. Biophys. Res. Commun. 183 (1992) p334- 342, International Publication WO 2004/104198) 0
  • HCV strains of genotype la include H77c strain (H77 strain consensus sequence: GenBank accession number AF011751), 1 strain (GenBank accession number M62321), H strain (GenBank Cession number M67463) and HC-J1 strain (GenBank accession number D 10749) are known.
  • the HCV strains of genotype lb include J1 strain (GenBank accession number D89815), conl strain (GenBank accession number AJ238799, sometimes referred to as Con-1 strain), TH strain (Wakita, T. et al. al "J. Biol.
  • J strain (GenBank accession number D90208), JT strain (GenBank accession number D 01171), BK strain (GenBank The HCV strains of genotype 2a include JFH1 strain (GenBank accession number AB047639, sometimes referred to as JFH-1 strain), HC-J6 strain (GenBank (Accession number D00944), JCH1 strain (GenBank accession number AB047640), J6CF strain (GenBank accession number AF177036), etc.
  • HC-J8 strain (genotype 2b HCV strain ( GenBank Accession No.
  • HCV strains with genotype 3a are NZL1 strains (GenBank Accession No. No. D17763), K3a / 650 strain (GenBank accession number D28917), 452 strain (GenBank accession number DQ437509), E-bl strain (Chan, S. et al., J. Gen. Virol, 73 pl l31-1141 (1992)) and Tr strains (Chayama, K. et al., J. Gen. Virol, 75 p3623-3628 (1994)) are known as genotype 3b HCV strains.
  • a list of GenBank accession numbers has already been reported for other strains (Tokita, T. et al., J. Gen. Vir ol. 79, 1847—1857,1998, Columbia J. & Colina R. Virolgy Journal, 3, 1-8, 2006).
  • the elements constituting the HCV subgenomic RNA replicon used in the present invention can be replicated in cells.
  • an HCV subgenomic RNA replicon can be constructed, it may be derived from any of the above genotypes or strains of those subtypes.
  • the present invention is a method for producing recombinant hepatitis C virus-like particles that are infectious but not transmissible.
  • the RNA of the present invention Preferably, the replicon does not contain genes encoding each of the HCV structural proteins (Core, El, E2 and p7).
  • Each of the above elements may be derived from the same HCV strain or may take the form of a hybrid (chimera) derived from two or more different HCV strains.
  • Preferred HCV strains are at least one strain selected for the strength of HCV strains of genotype lb and 2a, more preferably conl strains that are HCV strains of genotype lb, or HCV strains of genotype 2a JFHI stock.
  • the HCV strain in the present invention is an isolated strain obtained by spontaneously or artificially mutating a conl strain or JFHI strain as a parent strain, for example, and at least the genotype is changed from that of the parent strain. Even if it is a stock (derived stock). Even if the phenotypic trait is the same as the parent strain, it is different! / Take it! /, But prefer the same strain traits U ,.
  • HCV subgenomic RNA replicons include sequences encoding 5 'untranslated region, NS3 protein, NS4A protein, NS4B protein, NS5A protein derived from HCV strain genomes other than JFH1 strain (genotype 2a) and HCV subgenomic RNA replicon consisting of NS5B protein coding sequence and 3 'untranslated region of JFH1 strain; 5' untranslated region of JFH1 strain, NS3 protein, NS4A protein, NS4B protein, NS5A protein, NS5B protein HCV subgenomic RNA replicon consisting of an untranslated region and 3, an HCV-conl strain (genotype lb, GenBank accession number AJ238799, Lohmann.V.
  • HCV subgenomic RNA consisting of 5 'untranslated region, NS3 protein, NS4A protein, NS4B protein, NS5A protein and NS5B protein coding sequence and 3' untranslated region Silicon, and the like.
  • the desired foreign gene and the IRES distribution are located between the 5 'untranslated region of these HCV subgenomic RNA replicons and the NS3 protein coding sequence. It may contain columns.
  • the 5 'untranslated region that can be used as a constituent element of the HCV subgenomic RNA replicon in the present invention is represented by nucleotide numbers 1 to 340 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10. Yes, and the region coding for Core protein strength p7 protein (Core, El, E2, p7) is base number 341 to 2779, from NS3 protein to 3 'untranslated region (NS3, The region encoding NS4A, NS4B, NS5A, NS5B, 3'UTR) has base numbers 3431 to 9678. By comparing with the sequence of each region derived from this JFH1 strain, each region can be identified even in genomic cDNA derived from other HCV strains.
  • HCV subgenomic RNA replicon synthesis was performed by DNA-dependent RNA polymerase using a vector in which DNA complementary to the HCV subgenomic RNA was cloned downstream of a promoter that transcribes RNA from the DNA sequence. can do.
  • the T7 promoter which includes T7, T3, SP6, etc., is suitable as a promoter that transcribes RNA from a DNA sequence, and HCV subgenomic RNA can be synthesized by T7 polymerase.
  • the cell is most preferably an animal cell, for example, a mammalian cell preferred by vertebrate cells such as fish, reptiles, amphibians, birds and mammalian cells.
  • the cells include liver, cervix, fetal kidney-derived normal cells, tumor cells, and established cell lines thereof, such as cells such as Huh7, HepG2, IMY-N9, HeLa, and HEK293 ( Date, T. et al "J. Biol. Chem., 279, p.22371-22376, (2004), Ito, T. et al, Hepatology 34, p.56 6-572, (2001)) preferably Huh7 HepG2 or clones derived from these cells.
  • Another method for replicating the HCV subgenomic RNA in cultured cells is a system using HCV cDNA without using an RNA replicon.
  • HCV cDNA When HCV cDNA is expressed with an RNA polymerase type II promoter, a CAP structure is added to the 5 'end of the transcribed RNA, and a poly A chain is added to the 3' end.
  • HCV genomic RNA replication does not occur.
  • Heller et al. Ligated ribozyme sequences to the 5 'and 3' ends of the HCV genome, transcribed with RNA polymerase II in the cell, and then cleaved with ribozyme.
  • a DNA vector was prepared that could synthesize HCV RNA intracellularly with a cap and poly A (Heller T et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 102, p. 2579-2583, 2005). By introducing this vector into a cell, a cell that replicates the HCV subgenomic RNA replicon can be obtained.
  • the complementary DNA of the HCV subgenomic RNA is cloned into an RNA polymerase I promoter / terminator-type vector and the vector is introduced into a cell that allows HCV growth, Cells that replicate the HCV subgenomic RNA replicon can be obtained.
  • pHH21 Neuronal Biolistics et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (1999) p9345-9350
  • pHH21 is a vector comprising a human RNA polymerase ⁇ promoter as a promoter and a mouse RNA polymerase I terminator as a terminator.
  • the restriction enzyme BsmBI recognition sequence was added to the 5 'end and 3' end of the cDNA for the HCV subgenomic replicon RNA using PCR, digested with BsmBI, and the HCV genome was inserted into the BsmBI site of pHH21.
  • the terminator can be linked to the HCV genome without any extra nucleotide sequence.
  • Intracellular introduction of a vector such as an HCV subgenomic RNA replicon or a vector that expresses an HCV subgenomic RNA replicon can be performed using any technique known to those skilled in the art. Examples of such introduction methods include an electoral position method, a particle gun method, a lipofusion method, a calcium phosphate method, a microinjection method, a DEAE dextran method, and the like.
  • a cell in which the HCV subgenomic RNA replicon that is useful in the present invention is replicated in the cell can be produced.
  • Such RNA levicons are Since it autonomously replicates continuously in the cell, it is maintained in a certain amount even in the cell undergoing RNA degradation. Therefore, a cell into which a HCV subgenomic RNA replicon or a vector that expresses an HCV subgenomic RNA replicon according to the present invention as described above is introduced into the cell can retain the RNA replicon.
  • the “cell retaining an RNA replicon” means that the RNA replicon is present in the cell continuously in a significant amount, not transiently, due to its autonomous replication ability.
  • a virus-like particle in which the HCV subgenomic RNA replicon is packaged by introducing and expressing the HCV structural protein expression vector described below into a cell carrying the HCV subgenomic RNA replicon of the present invention. Can be produced.
  • an HCV structural protein by expressing an HCV structural protein gene in a cell that holds an HCV subgenomic RNA replicon.
  • the HCV structural protein consists of Core, El, E2, and p7.
  • the genes encoding these proteins for supplying HCV structural proteins are not limited to HCV genotypes, and each of the genes may be derived from the same HCV strain, or two or more A hybrid (chimera) form may be derived from different HCV strains.
  • the origin of the HCV structural protein gene may be at least one virus strain selected from la, lb, 2a, 2b, 3a and 3b HCV strains, but preferred HCV strains are la, 2a, It is at least one virus strain selected from the group consisting of 3a and 3b, and a more preferred HCV strain is at least one virus strain whose genotype 1b and 2a HCV strain power is also selected. .
  • H77c strain, 1 strain, H strain and HC-J1 strain of genotype la, J1 strain, conl strain, TH strain, J strain, JT strain and BK strain of genotype lb, or genotype 2a are at least one type of virus strain that can be selected for its strength, such as JFH1 strain, HC-J6 strain, JCH1 strain and J6CF strain. More preferably, H77 strain of genotype la, J1 strain of genotype lb or JFH1 strain of genotype 2a, most preferably JFH1 strain (GenBank accession number AB047639, Kato, T. et al., Gastroenterology, 125 (2003 ) pl808-1817).
  • cells preferably animal cells
  • any method can be used as long as it can be expressed in mammalian cells.
  • the preferred V ⁇ method is a method using an expression vector incorporating the above gene.
  • an HCV structural protein expression vector (preferably an expression vector containing an HCV structural protein gene in a form that can be expressed under the control of a promoter) is used to supply the HCV structural protein. Then, the HCV subgenomic RNA replicon described in 2 above is introduced and expressed.
  • CDM8 pEFl / Myc-Hisl, 2,3, pEF4 / Myc-Hisl, 2,3, pc DNA3.1, pREP4, pCEP (all from Invitrogen), pC neo (Promega) ).
  • Pc DNA5 / TO Invitrogen containing a promoter whose expression can be regulated by tetracycline can also be used.
  • the promoter can be expressed in animal cells, the cytomegalovirus IE (immediate early) promoter, SV40 early or late promoter, metamouthone promoter, retrovirus promoter, heat shock promoter SR a promoter, Elon Gation Factor 1a promoter, albumin promoter and the like.
  • examples of usable vectors include virus vectors. Any viral vector can be used as long as it can infect animal cells and express a desired foreign gene. Preferred examples include a retrovirus vector, an adenovirus vector, a Sindbis virus vector, and a cuticle virus vector. In particular, vaccine vectors can express large amounts of gene products (Elroy-Stein, 0., et al, Pro Natl. Acad. Sci. USA, 86 (1989) p6126- 6130). A virus vector is preferred.
  • the HCV structural protein expression vector used in the method of the present invention contains, as an HCV structural protein gene, a Core protein gene, an E1 protein gene, an E2 protein gene, and a p7 protein gene in a state that can be expressed in a host cell. I prefer it.
  • HCV structural protein expression vectors that are relevant to the present invention include the Core protein gene, the E1 protein gene, the E2 protein gene, and the p7 protein gene under the control of a promoter that allows expression of the inserted gene. It is a vector.
  • the Core protein gene, E1 protein gene, E2 protein gene, and p7 It is possible to use a vector containing an elongation factor 1 ⁇ promoter in which a protein gene is inserted under the control of the elongation factor 1a (EF-1 ⁇ ) promoter as a particularly suitable HCV structural protein expression vector.
  • the vector containing an elongation factor 1 ⁇ promoter refers to the promoter arrangement of the elongation gene 1 ⁇ gene IJ (EF-1 ⁇ promoter; Mizushima et. Al, Nucleic Acids Res., 1990, 18, 5322) in such an arrangement that the gene under its control can be expressed in the host cell. Examples are pEFl / Myc-Hisl, 2,3, pEF4 / Myc-Hisl, 2,3 (V, both are Invitrogen).
  • HCV structural protein expression vector useful for the present invention includes a core protein gene, an E1 protein gene, an E2 protein gene, and a p7 protein gene in an expressible state. It is a viral vector (a recombinant vector virus vector).
  • a viral vector a recombinant vector virus vector
  • a recombinant virus vector such as DIs strain, WR strain, IBTd strain (Meis, RJ & Condit, RC. Virol. 182, 442-454, (1992)
  • a strain can be preferably used.
  • the method for producing the recombinant viral vector is also described in detail in the examples below.
  • the above HCV structural protein gene is cloned under the control of the ⁇ -quinoless promoter such as p.7.5 in the ⁇ -quinoline 'transfer vector, and the transfer vector is further infected with ⁇ -virus.
  • the target recombinant vector virus vector is introduced by electroporation or the like, cultured to produce virus particles, and more preferably, the virus is selected and purified. Can be manufactured.
  • Such a virus vector can be prepared in the form of recombinant virus-like particles.
  • HCV The structural proteins of HCV (Core, El, E2, p7) and nonstructural proteins (NS3, NS4A, NS4B, NS5A, and NS5B) are translated as a continuous polyprotein, and then converted by protease. As these proteins are released and produced upon limited degradation, it is desirable to express these HCV structural proteins as a series of polyproproteins of Core, El, E2, and p7. Can be expressed in separate expression vectors.
  • Confirmation can be detected by reacting a protein extracted from a cell culture medium or cell shell with an antibody against a structural protein (International Publication WO 2004/104198) o [0110] Specifically, for example, cell force is also detected.
  • the extracted protein sample is fractionated by SDS-polyamide gel electrophoresis and blotted on a nitrocellulose membrane, and anti-HCV protein antibody (for example, anti-core specific antibody or hepatitis C patient force is also collected. The antiserum) is reacted, and the antibody is detected (Western plot method).
  • cells expressing HCV protein can be immunostained, and the expression and subcellular localization of these proteins can be confirmed.
  • a virus in which an HCV subgenomic RNA replicon is packaged with a structural protein in the cell by supplying a vector that expresses the HCV structural protein into the cell holding the HCV subgenomic RNA replicon.
  • HCV subgenomic RNA replicon To knock an HCV subgenomic RNA replicon from a cell replicating the HCV subgenomic RNA replicon into a viral particle, a structural protein (Core, El, E2, p7) expression vector is introduced into the cell and expressed. That's fine.
  • HCV subgenomic RNA may be introduced into cells in which structural proteins (Core, El, E2, p7) are stably expressed.
  • Examples of such an introduction method include known methods such as an electopore position method, a particle gun method, a lipofusion method, a calcium phosphate method, a microinjection method, and a DEAE dextran method.
  • HCV-like particle production Cells can produce recombinant virus-like particles.
  • the produced recombinant HCV-like particles have infectivity and the ability to replicate HCV subgenomic RNA.
  • the infected cells cannot produce offspring virus particles, they do not have propagating properties. Therefore, recombinant HCV-like particles can be produced in a cell culture system by culturing the recombinant HCV particle-producing cells of the present invention.
  • HCV-like particles can be obtained by culturing recombinant HCV-like particle-producing cells and recovering virus-like particles produced in the culture (preferably culture medium).
  • the virus-like particles can be recovered, for example, by a technique such as the above-described culture fluid sucrose density gradient centrifugation.
  • the ability of the recombinant HCV-like particle producing cell of the present invention to produce virus particles may be confirmed according to any virus detection method known to those skilled in the art. For example, fractionating a cell culture medium that seems to be producing virus-like particles using a sucrose density gradient, and measuring the density of each fraction and the HCV core protein concentration or HCV replicon RNA concentration of each fraction Therefore, it can be judged by the power that matches the specific gravity of HCV that has been conventionally known. In addition, the density power of the fraction in which the peak of the core protein is detected is 0.25% NP40 (Polyoxyethylene (9) Octylphenyl Ether)). If the density of the fraction is light, it can be determined that the cell has the ability to produce virus-like particles.
  • NP40 Polyoxyethylene (9) Octylphenyl Ether
  • virus-like particle of the recombinant HCV-like particle-producing cell has infectivity is detected by detecting the phenotype of the foreign gene present in the HCV subgenomic RNA packaged in the virus particle. That's fine.
  • the foreign gene is a drug resistance gene
  • HCV-permissive cells are inoculated with the virus particles, and are usually cultured for 2 to 3 weeks in the presence of the drug, and drug resistant clones are counted. Can be evaluated.
  • an extract of the infected cells preferably a sample in the supernatant of the infected cell culture Whether or not HCV structural protein is present can be determined by the Western blot method described above.
  • the recombinant HCV-like virus particles produced by the method of the present invention have the ability to infect cells (preferably HCV-permissive cells).
  • Recombinant including culturing recombinant HCV-like particle producing cells and infecting other cells (preferably HCV-permissive cells) with virus-like particles in the resulting culture (preferably culture medium)
  • a method for producing hepatitis C virus-infected cells is also provided.
  • HCV-permissive cells are sensitive to HCV genomic RNA replication and / or HCV. It is a cell having the ability to stain, but is not limited thereto.
  • hepatocytes include primary liver cells, Huh7 cells, HepG2 cells, IMY-N9 cells, HeLa cells, etc., and lymphoid cells include Molt4 cells, HPB-Ma cells, and Daudi cells.
  • the powers that can be mentioned are not limited to these.
  • the recombinant HCV-like particle of the present invention produced by the method of the present invention has the above HCV strain (genotype la, lb, 2a, 2b, 3a and 3b, preferably lb and 2a force selected) on its RNA genome.
  • HCV strain gene la, lb, 2a, 2b, 3a and 3b, preferably lb and 2a force selected
  • It has a feature of including a base sequence including a base sequence to be encoded and a 3 ′ untranslated region.
  • HCV-like particles produced in recombinant HCV-like particle-producing cells by the method of the present invention are infected with cells (for example, the HCV-permissive cells exemplified above), the infected cells Among them, there is an interesting feature that no force virions that replicate the HCV subgenomic RNA as described above are formed.
  • the recombinant HCV-like particle of the present invention has an HCV subgenome R packaged therein.
  • HC V-like virus particle of the present invention By inserting a desired foreign gene into the NA levicon, it can be used as a vector for gene transfer Z expression.
  • the recombinant HC V-like virus particle of the present invention containing such a foreign gene produces an HC V subgenomic RNA replicon in which the foreign gene is inserted between the 5 ′ untranslated region and the IRES sequence, It can be produced by packaging by the method of the present invention. Since HCV particles produced in recombinant HCV particle-producing cells have no propagation power, they can also be used as vectors for gene transfer targeting, for example, liver or lymphoid cells or tissues.
  • the HCV subgenomic RNA packaged in the virus particle by the virus particle production method of the present invention is not integrated into the chromosome genome in HCV-permissive cells infected by the virus-like particle of the present invention. So normal gene is lost by gene insertion There is an advantage in that it is not possible to activate a wounded or inserted gene in the vicinity.
  • the vector of the present invention can be used for introduction of a foreign gene, for example, for gene therapy or production of a transgenic animal.
  • Foreign genes (or foreign nucleic acids) introduced into HCV subgenomic RNA replicons and packaged into virus particles include proteins derived from mammals including humans, such as various proteins related to diseases, such as enzymes and sites. Blocks or suppresses the translation of proteins, polypeptides or peptides encoding proteins, proteins such as force-in, chemokines, hormones, antibodies, immunoregulatory molecules, tumor suppressor proteins, growth factors, membrane proteins and vasoactive proteins
  • the ability to include therapeutic nucleic acids such as antisense RNA and siRNA is not particularly limited.
  • Target HCV sensitive cells or tissues are mammalian cells or tissues, preferably human cells or tissues, eg, human liver and lymphoid cells or tissues.
  • the vector of the present invention is allowed to act on target cells or tissues under in vivo, in vitro or ex vivo conditions.
  • the vector of the present invention can be used for human therapy such as gene therapy and cancer (eg liver cancer, lymphoma, etc.).
  • plasmid pJFHl was cleaved with restriction enzymes Agel and Clal, and a sequence extending from the 5'NTR to the Core region derived from pJFH1 and a neomycin resistance gene derived from pRSV5NEO were obtained by PCR amplification.
  • a fragment that had been ligated and cleaved with restriction enzymes Agel and Pmel, and a fragment that had been ligated by PCR amplification of the sequence from EMC V IRES to NS3 region and cleaved with restriction enzymes Pmel and Clal were inserted and ligated.
  • pSGR-JFHl was cleaved with the restriction enzyme Xbal. Then, 10-20 ⁇ g of each of these Xbal cleaved fragments was further processed by incubation with 30 units of Mung Bean Nuclease (total reaction volume 50 1) at 30 ° C. for 30 minutes.
  • Mung Bean Nuclease is an enzyme that catalyzes a reaction that selectively degrades a single-stranded portion in double-stranded DNA.
  • RNA synthesis is performed using the above Xbal cleaved fragment as it is as a cage, a replicon RNA in which 4 bases of CTGA, which is part of the Xbal recognition sequence, are added to the 3 'end is synthesized. . Therefore, in this example, the Xbal cleavage fragment was treated with Mung Bean Nuclease to remove the 4 bases of CTGA from the Xbal cleavage fragment force. After this, the Mbean Bean Nuclease-treated solution containing the Xbal cleaved fragment is purified by purifying the Xbal cleaved fragment from which CTGA's 4 bases have been removed by protein removal according to the usual method. DNA.
  • RNA was synthesized in vitro from this caged DNA using T7 RNA polymerase.
  • Ambion MEGAscript was used for this RNA synthesis.
  • a reaction solution (20 ⁇ l) containing 0.5 to 1.0 g of the vertical DNA was reacted according to the manufacturer's instructions.
  • RNA extraction with acidic phenol was performed to remove the cage DNA.
  • RNA RNA
  • replicon RNA total cellular RNA extracted from Huh7 cells
  • the mixed RNA was introduced into Huh7 cells by the electroporation method.
  • Huh7 cells that had been subjected to electopore position treatment were seeded in a culture dish and cultured for 16 to 24 hours, and then G418 (neomycin) was added to the culture dish at various concentrations. Then change the culture medium twice a week. The culture was continued. A colony of viable cells was cloned from the culture dish after 21 days of the culture and the culture was continued. Multiple clones of cell clones could be established by such colony cloning.
  • One cell line carrying the HCV subgenomic RNA replicon was named 1H4.1.
  • HCV subgenomic RNA replicon (GenBank accession number: AJ242654) prepared from the full-length genomic cDNA derived from the HCV genotype lb Con-1 strain by the same method as above (GenBank accession number: AJ242654; I / NS3 in the lower part of Fig. 2) -3 '/ wt) was introduced into the Huh7 cell line,
  • Structural region gene of JFH1 strain (GenBank accession number AB047639) (Kato T. et al., J. Med. Viol. 2001, 64: 334-339) isolated from fulminant hepatitis (base sequence numbers 249 to 2781) The region containing was amplified by PCR. A fragment containing the structural gene obtained by digesting this DNA fragment with Nhel and EcoRI was purified by agarose gel electrophoresis, and blunt-ended with DNA polymerase. This blunt-ended cDNA was inserted downstream of the CAG promoter sequence (CAG) in the plasmid vector.
  • CAG promoter sequence CAG
  • a cDNA containing a structural region gene obtained by digestion with Nhel and EcoRI was used as an elongation factor 1 ⁇ gene promoter sequence (EF-1 ⁇ promoter; Mizushima et. Al., Nucleic Acids Res. , 1990, 18, 5322), pEF4 / Myc-His (Invitrogen) Spel and EcoRI.
  • the resulting plasmids were named pCAGC-p7JFHl and pEF4C-p7JFHl (Fig. 3).
  • pEF4C-p7JFHl shown in the upper part of Fig. 3 is digested with restriction enzymes BamHI and EcoRI, and Core protein, E1 protein The regions encoding E2 protein and p7 protein were separated by agarose gel electrophoresis. Next, this fragment is the target alien site. It was ligated to pDIsgptmH5 designed to insert the XGPRT gene together with the gene (Ohnishi, K. et al "Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005) p88-94, Ishii, K.
  • This pDIsgptmH5 incorporates the Escherichia coli xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (XGPRT) gene under the control of the cuticular virus p7.5 promoter inserted into the cloning site of the pUc / DIs vector. It is a transfer vector (Ishii, K. et al., Virology 302 (2002) p.433-444). The resulting vector was named pDIsJFHst.
  • XGPRT Escherichia coli xanthine-guanine phosphoribosyltransferase
  • a vector containing the structural gene of the H77c strain and capable of expressing the protein encoded by it was produced by the following method. First, using a clone of the H77c strain HCV genomic cDNA (GenBank Accession No. AF011751) as a saddle, add 10 X buffer 5 ⁇ 1, 2.5 mM to the LA-PCR kit (Takara Bio Inc.). 1 ⁇ l each of 5 ⁇ ⁇ , 10 ⁇ row number 1) and ⁇ 77 reverse (AAGAGCTCTCATAACCCGACAAGAACAACGCCGC C: SEQ ID NO: 2) was added to the dNTP mixture, and finally deionized water was added to make the total amount 49 ⁇ 1.
  • PCR reaction was performed under the conditions of 25 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 5 minutes. When a portion of this PCR product was electrophoresed on an agarose gel, an amplification product of about 2.5 kb was confirmed.
  • a PCR reaction 1 was used to perform a ligation reaction in which the amplified product was ligated into a plasmid vector.
  • E. coli was transformed according to a conventional method, and plasmid DNA was prepared from the resulting transformant.
  • the DNA fragment inserted into this plasmid DNA was digested with a restriction enzyme that can be excised, and subjected to agarose gel electrophoresis to confirm that a DNA fragment of about 2.5 kb was inserted into the plasmid DNA.
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment was determined by a conventional method.
  • the determined base sequence was consistent with the sequences from 271 to 2819 of the base sequence of GenBank accession number AF011751.
  • This plasmid DNA was then digested with Bglll and Sacl, subjected to agarose electrophoresis, and a DNA fragment containing the structural gene region of the H77c strain was isolated, and the cuticular virus transfer vector pDIsgptmH5 (Ohnishi, K. et al., Jap. J. Inf ect. Dis. 58 (2005) p88-94, Ishii, K. et al., Virology 302 (2002) p433-444). The resulting vector was named pDIsH77st.
  • J1 strain HCV genomic cDNA (GenBank accession number D89815) cloned as a template, attached to LA-PCR kit (Takara Bio Inc.), and 10 X buffer solution 5 ⁇ 1, 2.5 mM dNTP mix 5 1, 10 M primer
  • this PCR product 21 was used to perform a ligation reaction in which the amplified product was ligated into a plasmid vector.
  • E. coli was transformed according to a conventional method, and plasmid DNA was prepared from the obtained transformant.
  • the DNA fragment inserted into the plasmid DNA was digested with a restriction enzyme that can be excised, and subjected to agarose gel electrophoresis, confirming that a DNA fragment of about 2.5 kb was inserted into the plasmid DNA! .
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment was determined by a conventional method.
  • the determined base sequence was identical to the base sequence of GenBank accession number D89815 up to 271st to 2819th.
  • This plasmid DNA was then extinguished with Bglll and Sad, subjected to agarose electrophoresis, a DNA fragment containing the structural gene region of J1 strain was isolated, and the Kuchi virus transfer vector pDIsgptmH5 (Ohnishi, K. et al , Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005) p88-94, Ishii, K. et al., Virology 302 (2002) p.433-444). The resulting vector was named pDIsJlst.
  • a vector containing a chimeric structural gene sequence consisting of the Core gene derived from the J1 strain and the El, E2, and p7 genes derived from the JFH1 strain and capable of expressing the protein encoded by them is obtained by the following method. It was made with.
  • a vector obtained by cloning the HCV genomic cDNA (GenBank accession number D89815) of the J1 strain is Primer H77 / J1 forward (SEQ ID NO: 1) and J1 / JFH1 that were supplied with the A-PCR kit (Takara Bio Inc.) revers
  • AACAGGACAG SEQ ID NO: 4
  • deionized water was added to make the total amount to 49 ⁇ 1.
  • 1 ⁇ l of Takara LA Taq Takara LA Taq (Takara Bio Inc.) was added, and PCR was performed. The PCR reaction was performed under 25 cycles under the condition of 98 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 5 minutes.
  • JFH1 reverse (AAGAGCTCTCAATCAATATCAACAAACCCACGCCT: SEQ ID NO: 6) each was added in an amount of 1 ⁇ l, and finally deionized water was added to make the total amount 49 ⁇ l.
  • 1 ⁇ l of Takara LA Taq (Takara Bio Inc.) was added and PCR was performed. The PCR reaction was performed under the conditions of 25 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 5 minutes. Purify each amplified fragment, dissolve in 1 H 0, and dilute 1 ⁇ 1 each 100-fold.
  • Each 1 ⁇ 1 was mixed into one. Using this mixed solution as a template, LA-PCR was performed for 5 cycles under the above conditions without adding primers. Thereafter, primers H77 / J1 forward (SEQ ID NO: 1) and JFH1 reverse (SEQ ID NO: 6) were added, and LA-PCR was further performed for 10 cycles to purify the amplified chimeric DNA fragment. This fragment was cloned into a plasmid vector, and the base sequence of the DNA fragment was determined. As a result, it was confirmed that the DNA fragment was a chimeric structural gene sequence consisting of the Core gene derived from the J1 strain and the El, E2, and p7 genes derived from the JFH1 strain.
  • this plasmid was digested with Bglll and Sad and the fragment obtained was digested with the viral virus transfer vector pDIsgptmH5 (Ohnishi, K. et al, Jap. J. Infect. Dis. 58
  • a vector containing a chimeric structural gene sequence consisting of the Core gene derived from the JFH1 strain and the El, E2, and p7 genes derived from the J1 strain and capable of expressing the proteins encoded by these genes is described below. It was produced by the following method. First, in order to amplify the Core gene of JFH1 strain, the HCV genomic cDNA (GenBank accession number AB047639) of JFH1 strain was used as a template and attached to the LA-PCR kit (Takara Bio Inc.).
  • a vector obtained by cloning the HCV genomic cDNA (GenBank accession number D89815) of the J1 strain is used as a cocoon-type kit, and the LA-PCR kit (Takara Bio Inc.) is used. Attached, 10X buffer 5 ⁇ 1, 2.5 mM dNTP mix 5 1, 10 M primer
  • CAACGTGTCCGGGATATACC: SEQ ID NO: 9) and Jl reverse (AAGAGCTCTCATA GACCTACAAAAACCCCGCCTCC: SEQ ID NO: 3) were each added at 1 ⁇ 1, and finally deionized water was added to make the total amount at 49 ⁇ 1.
  • 1 ⁇ l of Takara LA Taq was added and PCR was performed. The PCR reaction was performed under conditions of 25 cycles, with one cycle consisting of 98 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 5 minutes. Purify each amplified fragment, dissolve in 50 1 H 0,
  • Each 1 ⁇ 1 was diluted 100 times and each 1 ⁇ 1 was mixed together. Using this mixed solution as a template, 5 cycles of LA-PCR were carried out under the above-mentioned conditions without preparing primers. Thereafter, primers JFH1 forward (SEQ ID NO: 7) and J 1 reverse (SEQ ID NO: 3) were added, and LA-PCR was performed for 10 cycles to purify the amplified chimeric DNA fragment. This fragment was cloned into a plasmid vector and the base sequence of the DNA fragment was determined. As a result, it was confirmed that the DNA fragment was a chimeric structural gene sequence consisting of the Core gene derived from the JFH1 strain and the El, E2, and p7 genes derived from the J1 strain.
  • this plasmid was digested with Bglll and Sad and the fragment obtained was digested with the cuticle virus transfer vector pDIsgptmH5 (Ohnishi, K. et al, Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005) p88-94, Ishii, K. et al., Virology 302 (2002) p433-444).
  • the resulting vector was named pDIsJFH (c) / Jl (El-p7) st.
  • Recombinant viral virus vector DIs strains having the above vectors were prepared and selected as follows, for example.
  • the cell suspension was centrifuged at 200 Orpm for 3 minutes, and the cells were collected and suspended in 1 PBS. 10 g of the above transfer vector was dissolved in this cell suspension, and electroporation was performed by applying a voltage once at 250 v, 500 FD in a 0.4 cm cuvette using Gene Pulser II (Bio Rad). Cells are suspended in 2 ml of DMEM containing 10% FCS, seeded in a 35 mm dish, and cultured for 7 days at 37 ° C and 5% CO.
  • Infected cells were collected together with the medium, freeze-dried 3 times and sonicated for 2 minutes, then diluted 10, 100, and 1000 times with the same medium. 10 6 cells are seeded in a 35 mm dish, and MPA, xantine and hypoxantin are added to the medium (DMEM containing 10% FCS) at 25 ⁇ g / ml, 250 ⁇ g / ml, 15 After addition of ⁇ g / ml and incubation, the above diluted cell solution was inoculated.
  • DMEM containing 10% FCS medium
  • the formed plaque was picked up with a Pasteur pipette, suspended in DMEM containing 200 ⁇ 1 10% FCS, and sonicated for 2 minutes to release the virus from the agar.
  • This culture solution was diluted 10, 100, and 1000 times with the same medium, and the plaque passage procedure similar to the above was repeated two more times to purify the recombinant virus, and then scaled up by infecting CEF cells. .
  • pDIsJFHst pDIsH77st
  • pDIsJlst pDIsJl (c) / JFH (El—p7) st
  • pDIsJ The virus vectors (recombinant virus-like particles) prepared from FH (c) / Jl (El-p7) st were used as DIsJFHst, DIsH77st, DIsJlst, DIsJl (c) / JFH (El—p7) st ⁇ DIsJFH (c ) / Jl (El—p7) st.
  • HCV structural protein expression vector into levulin-bearing cells and production of structural proteins in cows.
  • ribofetasion of HCV structural protein expression vector pCAGC-p7JFHl or pEF4C-p7JFHl prepared in Example 2 was used. It was introduced into levulin-contained cells by the method or the like.
  • the viral vectors DIsJFHst, DIsH77st, DIsJlst, DIsJl (c) / JFH (El-p7) st or DIsJFH (c) / Jl (El-p7) st that express the HCV structural protein prepared in Example 2 are replicon-carrying cells. Infected with.
  • pEF4C-p7JFHl was introduced into replicon-retaining cells IH4.1 by the ribofusion method.
  • HCV Core protein could be detected in the culture supernatant by Western blotting. Therefore, after culturing the replicon-retaining cell IH4.1 into which pEF4C-p7JFHl was introduced for 4 days, the culture solution (8 ml) was collected, centrifuged at 8,000 g for 60 minutes at 4 ° C, and the culture supernatant was collected. It was. Next, the supernatant was centrifuged at 25,000 rpm for 4 hours at 4 ° C.
  • sucrose density gradient is 60% (weight / weight) sucrose solution (dissolved in 50 mM Tris pH7.5 / 0.1M NaCl / lmM EDTA) 2ml, 50% sucrose solution lml, 40% sucrose
  • the solution was prepared by overlaying 1 ml of a solution, 1 ml of a 30% sucrose solution, 1 ml of a 20% sucrose solution, and 1 ml of a 10% sucrose solution on a centrifuge tube.
  • HCV Core protein was measured using the ortho HCV antigen IRMA test (Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol., 37 (1999) pl 802-1808). Quantification of HCV replicon RNA was according to Takeuchi (Takeuchi et al., Gastroenterol ogy 116 (1999) p.636-642). As shown in Figure 5, in both experiments, the replicon RNA and Core protein peaks were both in fraction 8 and were consistent. The density of this fraction was approximately 1.17 g / ml, consistent with the reported density of HCV particles. This showed that virus particles were produced.
  • the supernatant was centrifuged at 25,000 rpm for 4 hours at 4 ° C in a SW20 rotor (Beckman), and 8 ml of cell culture broth was added to a buffer containing 1 ml of 0.2% NP40 and a buffer containing no NP40. Suspended in one. After incubation at 4 ° C for 20 minutes, the sample was overlaid on a 10-60% sucrose density gradient prepared in a tube for SW41E rotor (Beckman), and centrifuged at 35,000 rpm for 16 hours at 4 ° C.
  • sucrose density gradient is 60% (weight / weight) sucrose solution (dissolved in 50mM Tris pH7.5 / 0.1M NaCl / lmM EDTA) 2ml, 50% sucrose solution lml, 40% sucrose It was prepared by layering sugar solution lml, 30% sucrose solution lml, 20% sucrose solution lml, 10% sucrose solution lml on a centrifuge tube.
  • HCV Core protein was measured using the ortho HCV antigen IRMA test (Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol., 37 (1999) p. 1802-1808).
  • the replicon-retaining cell line 5-15 was added to viral vectors DIsJlst, DIsJl (c) / JFH (El- p7) st or DIsJFH (c) / Jl (El-p7) st was infected in the same manner as described above. After infection, 8 ml of the supernatant cultured for 4 days was concentrated with an ultrafiltration membrane and fractionated by the sucrose density gradient centrifugation method described above. The density of each fraction and the HCV Core protein concentration were quantified.
  • HCV Core protein From the density distribution pattern of HCV Core protein, it was produced in culture supernatants infected with DIsJlst, DIsJl (c) / JFH (El-p7) st, or DIs JFH (c) / Jl (El-p7) st It was shown to contain virus-like particles.
  • the recombinant HCV particles produced in the above examples have a neo gene as a drug resistance marker. Therefore, in order to confirm whether or not the particles obtained in Example 3 are infectious, it is necessary to infect Huh7 cells with these particles and examine whether G418 (neomycin) resistant colonies can be obtained.
  • the culture supernatant obtained by infecting DIsJFHst with a levulin-contained cell line 5-15 and culturing for 4 days was concentrated 30-fold with an ultrafiltration membrane (cut off 1 X 10 5 Da), and Huh7 cells Infected with. After infection, G418 was added to the culture dish at lmg / ml. Thereafter, the culture medium was changed twice a week, and the culture was continued with the force S. After culturing for 21 days from the time of seeding, viable cells were stained with crystal violet. As a result, colony formation was confirmed.
  • a non-transmissible recombinant infectious HCV-like particle packaged with an HCV subgenomic RNA containing a desired foreign gene and a method for producing the same.
  • Such recombinant infectious HCV-like particles have the advantage of lack of transmissibility, so they can be used in vivo in mammals, particularly human liver and lymphoid cells or yarns and tissues.
  • it can be used for gene therapy via ex vivo gene transfer, or it can be used as a viral vector for producing a transgenic animal, and further as an attenuated vaccine.
  • sequences of SEQ ID Nos: 1 to 9 represent primers.

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Abstract

　本発明は、（i）Ｃ型肝炎ウイルス株に由来するゲノムRNA上の、5'非翻訳領域と、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質及びNS5Bタンパク質をコードする塩基配列と、3'非翻訳領域とを含む塩基配列を含むRNAレプリコンを自律複製する細胞に、（ii）上記（i）と同じ又は異なるＣ型肝炎ウイルス株由来のCoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質及びp7タンパク質を発現するベクターを導入し、該細胞を培養し、産生されたウイルス様粒子を回収することを含む組換え型Ｃ型肝炎ウイルス様粒子を産生する方法、並びにこの方法によって産生される組換え型Ｃ型肝炎ウイルス粒子に関する。

Description

新規組換え型ヒト c型肝炎ウィルス様粒子とその産生方法
技術分野
[0001] 本発明は、ヒト組換え型 C型肝炎ウィルス様粒子とその産生方法に関する。
背景技術
[0002] 動物細胞に遺伝子を導入する方法として、物理化学的方法と生物学的方法に大別 される。物理化学的方法として、リン酸カルシウム共沈殿法、 DEAEデキストラン法、リ ポフエクシヨン法、マイクロインジェクション法、エレクト口ポレーシヨン法などがある。一 方、生物学的方法として、ウィルスベクターを用いる方法がある。
[0003] ウィルスベクター法とは、ウィルスが持っている細胞進入機構、すなわち感染能を 利用して遺伝子を導入する方法である。
[0004] ウィルスベクター用いて作製された組換え型ウィルス粒子の表面には、ウィルス由 来の構造蛋白質 (ヌクレオキヤプシドやエンベロープ蛋白質等)が存在しており、細 胞表面に存在する受容体を介して細胞に感染し、効率よく遺伝子を導入する機構を 有している。したがって、このようなウィルスベクターを用いて作製された組換え型ウイ ルス粒子は、動物細胞に遺伝子を導入し目的遺伝子発現細胞を作製する目的のみ ならず、遺伝子治療、トランスジエニック動物作製等の目的に使用することが可能で ある。
[0005] ウィルスベクターは、レトロウイルスベクター、 DNAウィルスベクター、 RNAウィルスべ クタ一の 3者に分類され、由来するウィルスの種類によって導入できる遺伝子の長さ、 細胞の染色体ゲノムに遺伝子を組込む力どうか、分裂細胞のみか非分裂細胞にも遺 伝子を導入できるか、感染できる細胞の種類、細胞への毒性、遺伝子導入効率など に関して特徴がある。
[0006] レトロウイルスはプラス鎖の RNAをゲノムとして持っている。この RNAは典型的な真 核細胞の mRNAの性質、すなわちメチルイ匕された 5，末端キャップ構造と 3，末端には 約 200塩基からなるポリ Aを持って!/、る。感染した細胞内でこの RNAはウィルスの持つ 逆転写酵素の働きで、 DNAに変換される。さらにウィルスがコードする酵素の作用に より宿主のゲノム DNAに組み込まれる。組み込まれた DNAをプロウィルスと呼ぶが、 プロウィルスの両端には繰り返し配列（LTR)が生じ、その中にあるプロモーターにより ウィルスの RNAが合成される。合成された RNAからはウィルスタンパク質が翻訳される と共に、ゲノムサイズの RNAはウィルス粒子に組み込まれ、子粒子となり細胞外に放 出される。
[0007] ウィルス粒子を産生するのに必要な RNAの構造は両端の LTRとそれに囲まれるプ ライマー結合部位、ノ ッケージングシグナル及びポリプリンシグナルである。これらは シス因子として必須である。一方、ウィルスタンパク質をコードする遺伝子はシス因子 として必須ではなぐ感染細胞の中でウィルスタンパク質が供給されれば複製と粒子 産生は正常に行われる。
[0008] 従って、組換え型レトロウイルスを産生する場合、レトロウイルスがコードする gag、 po 1、 envなどの遺伝子を除き、その代わり発現させたい目的遺伝子を挿入したベクター (レトロウイルスベクターと呼ぶ）を作製しておき、このベクターをウィルスタンパク質が 供給された細胞 (通常パッケージング細胞と呼ぶ）に導入すれば外来遺伝子を組み 込んだレトロウイルス粒子が作製される (非特許文献 1)。
[0009] レトロウイルスとしては、例えばマウス白血病ウィルス、ネコ白血病ウィルス、ヒヒ C型 オンコウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、成人 T細胞白血病ウィルス等を例示すること ができる。さらには、組換え型レトロウイルスベクターとして報告されているものには、 マウス白血病ウィルスを基本としたもの（非特許文献 1)、また、ヒト免疫不全ウィルス を基本としたもの (非特許文献 2)等が挙げられる。
[0010] 組換え型レトロウイルスの産生のためのシステムは、 2つの構成単位、すなわち、導 入しょうとする遺伝情報（目的とする外来遺伝子）とウィルスゲノムのパッケージング及 び組込みに必要な要素の全てとをシスに（in cis)保持するレトロウイルスベクター（組 換え型レトロウイルス DNA)と、 gag、 pol及び env遺伝子によってコードされるウィルスタ ンパク質を提供するレトロウイルスパッケージング細胞と力もなる。 gag, pol及び env遺 伝子を発現する組換えベクターを導入されたパッケージング細胞のみでは組換え型 レトロウイルス粒子を放出することができな 、。
[0011] 組換え型レトロウイルス粒子を産生するには、 gag、 pol及び envタンパク質がトランス に（in trans)位置する必要がある。したがって、 gag、 pol及び env遺伝子を発現する組 換えベクターを導入されたパッケージング細胞に、レトロウイルスベクターを導入する ことで、前記ベクターに含まれる遺伝情報を保持する組換えレトロウイルスが作製でき る。次に、これらのウィルスを用いて細胞を感染させれば、その細胞内で、レトロウイ ルスベクターは天然のレトロウイルス生活環に従って細胞の染色体ゲノムに組込まれ るだろう。
[0012] レトロウイルスベクター法はこのように、特定の DNAを効率よく宿主の染色体ゲノム に組込むことを目的に作出されたシステムである力 目的遺伝子の挿入位置が予想 できないため、挿入により正常遺伝子が損傷を受けたり、挿入された近辺の遺伝子を 活性ィヒしたり、 目的とする外来遺伝子が過剰発現したり発現が抑制されたりする可能 性を否定できない。この問題点を克服するために、染色体外遺伝子として利用できる DNAウィルスベクターを利用した一時的（transient)な発現系の開発が進められた。
[0013] DNAウィルスベクターは、 DNAウィルスに由来するベクターである。 DNAウィルスは 、ウィルス粒子内に DNAを遺伝情報として保持するものであり、その DNAの複製は、 自己の DNAを铸型とし、宿主由来の DNA依存性 DNA複製酵素を触媒の少なくとも一 部とすることにより、相補鎖を生成するという過程の繰り返しによりなされる。染色体外 遺伝子として利用できる DNAウィルスベクターとして、例えばアデノウイルスベクター が挙げられる。
[0014] ヒトアデノウイルスは約 36kbの線状 2本鎖 DNAをゲノムとして持ち、それに含まれる 領域は初期遺伝子 El、 E2、 E3、 E4と後期遺伝子の LI、 L2、 L3、 L4、 L5に大別される 。初期遺伝子は、主にウィルスの複製に、後期遺伝子は力プシドなどウィルスの構造 タンパク質の合成に関与する。遺伝子導入用として用いられるアデノウイルスベクタ 一は、初期遺伝子である E1領域 (E1Aと E1Bとに分けられ、 E1Aによりすベてのアデノ ウィルスプロモーターが活性化される）を所望する外来遺伝子（目的遺伝子）に置き 換え、 E1Aをトランスに供給できる細胞株である 293細胞（293細胞は E1Aを発現して いる）などで増殖させる。 El A領域を欠損したアデノウイルスベクターは、 E1Aを発現 して ヽな 、通常の細胞では増殖できな 、。 E3領域はウィルスの増殖には必須でな!ヽ ため、外来遺伝子の挿入サイズの増大化を目的に除かれることが多い。アデノウィル スは野生型のゲノムサイズの 105%までのゲノムを力プシド内にパッケージングすること ができるため、 E1及び E3領域を欠損させることで、最大約 8. lkbまでの外来遺伝子を 挿入することができる (非特許文献 3)。
[0015] アデノウイルスベクターでは、非増殖細胞と増殖細胞の両方に遺伝子を導入するこ とができる（非特許文献 4)。このことから、この方法は in vivo遺伝子導入法に適して いる。本ベクターの欠点の一つとして、遺伝子の発現期間が一般的に短い（週単位） ことがあげられる。これは、アデノウイルスのゲノムが染色体外の領域（ェピゾーム）に 限定して存在し、複製'増幅も行われないためである。 2つめの欠点として、現在一般 的に使用されているアデノウイルスは非特異的な炎症反応を引き起こし、ベクター自 身に対する細胞性免疫応答をも増強されることから、遺伝子治療においては、連続 的な投与が困難な点が懸念される (非特許文献 5)。
[0016] RNAウィルスを基本としたウィルスベクターが開発されつつある。 RNAウィルスの複 製は、自己の RNAを铸型とし、自己由来の RNA依存性 RNA複製酵素を触媒とするこ とにより、相補鎖を生成するという過程の繰り返しによりなされる。
[0017] RNAウィルスは（-)鎖 RNAウィルスと（+ )鎖 RNAウィルスとに別けられる。代表的な（ -)鎖 RNAウィルスとして、インフルエンザウイルスが挙げられる。インフルエンザウィル スゲノムは 8本の分節マイナス鎖 RNAからなるウィルスである。インフルエンザウイルス が感染すると、インフルエンザ粒子中のタンパク質によって、遺伝子の転写が開始す る。まず、ウィルス RNAポリメラーゼは、宿主細胞の mRNAを 5'末端キャップ構造から 十数ヌクレオチドの部分で切断し、プライマーとして利用し、 RNA鎖 (プラス鎖）を伸長 する。このプラス鎖 RNAからウィルスタンパク質が翻訳される。複製過程では、ウィル スの RNAに完全に相補的な RNAが合成され、これを铸型として、子孫のウィルス RNA が増幅される。その後、ウィルス RNAはウィルス蛋白とともにパッケージングされウイ ルス粒子となる。
[0018] 従って、細胞培養系でインフルエンザウイルスを生産する場合、インフルエンザウイ ルスがコードするタンパク質を RNAポリメラーゼ II系のプロモーター、たとえば、 CMV や CAGプロモーターで発現させると共に、ウィルス RNAをキャップ構造及びポリ Aが 付かな 、プロモーターである RNAポリメラーゼ I型のプロモーター、たとえば rRNA遺伝 子のプロモーターで発現すれば、細胞中でウィルス RNAはウィルス蛋白とともにパッ ケージングされウィルス粒子となる（非特許文献 6)。しかし、生産されるウィルス量が 示されておらず、生産面力 十分に利用できる技術として確立して 、な 、。
[0019] ( + )鎖 RNAウィルスに分類されるウィルスとして、シンドビスウィルスや C型肝炎ウイ ルスがある。（+ )鎖 RNAウィルスが有するゲノム RNAは、同時にメッセンジャー RNA( 以下「mRNA」と称する）としても機能し、複製や粒子形成に必要な蛋白質を宿主細胞 の翻訳機能に依存して生産することができる。言い換えれば、（+ )鎖 RNAウィルスが 有するゲノム RNA自体が伝播力を有する。
[0020] シンドビスウィルス (Sindbis virus)に由来するウィルスベクターは、ゲノム RNAのうち、 ウィルス構造体に関わる構造遺伝子領域を欠失させ、ウィルスの転写複製蛋白質遺 伝子群を残したものと、転写プロモーター下流に所望の外来性遺伝子を接続した RN Aを基本的な構造として!/、る。このような RNA又は該 RNAを転写せしめうる cDNAを細 胞内に導入すると、外来遺伝子を含む RNAベクターの自律複製と転写プロモーター 下流の外来性遺伝子の転写とが起こり、 目的とする外来性遺伝子産物が細胞内に 発現する。さらに、構造遺伝子を発現する cDNAユニット (ヘルパー）と、上記の RNA ベクターを発現する cDNAユニットとをパッケージング細胞内で共存させることにより、 感染能を有するが、伝播力を有しない複合体を作製することができる (非特許文献 7)
[0021] シンドビスウィルスは、受容体として 67キロダルトンの高親和性ラミニン受容体 (High -affinity laminin receptor, LAMR)を使用し、神経細胞に高い効率で感染することか ら、シンドビスウィルスベクターは、神経特異的に遺伝子を導入するシステムとして注 目されている（非特許文献 8)。しかし、シンドビスウィルスの感染は、宿主細胞におけ るアポトーシスを誘導することが示されており (非特許文献 9)、毒性が懸念される。
[0022] C型肝炎ウィルス (HCV)のゲノムは、約 9600ヌクレオチドからなる (+)鎖の一本鎖 R NAである。このゲノム RNAは、 5'非翻訳領域 (5'NTR又は 5'UTRとも表記する）、構造 領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、及び 3'非翻訳領域 (3'NTR又は 3'UT Rとも表記する）力もなる。その構造領域には HCVの構造タンパク質がコードされてお り、非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされている。 [0023] このような HCVの構造タンパク質（Core、 El、 E2、及び p7)と非構造タンパク質（NS2 、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、及び NS5B)は、翻訳領域から一続きのポリプロテインと して翻訳された後、プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、生成される。これら の構造タンパク質及び非構造タンパク質 (すなわち、 HCVのウィルスタンパク質)のう ち、 Coreはコアタンパク質であり、 E1及び E2はエンベロープタンパク質である。非構 造タンパク質はウィルス自身の複製に関与するタンパク質であり、 NS2はメタ口プロテ ァーゼ活性、 NS3はセリンプロテアーゼ活性 (N末端側の 3分の 1)とへリカーゼ活性（ C末端側の 3分の 2)を有することが知られている。さらに、 NS4Aは NS3のプロテア一 ゼ活性に対するコファクターであり、 NS5Bは RNA依存 RNAポリメラーゼ活性を有する ことも報告されている。
[0024] HCVは遺伝子型又は血清型により多数の型に分類されることが分かってきた。現在 主流の HCV遺伝子型分類法である、 Simmondsらによる HCV株の塩基配列を用いた 系統解析法では、 HCVは遺伝子型 la、遺伝子型 lb、遺伝子型 2a、遺伝子型 2b、遺 伝子型 3a、遺伝子型 3bの 6タイプに分類され、さらにそれら各タイプがいくつかのサ ブタイプに分類される。そして、 HCVの複数の遺伝子型についてはそのゲノム全長の 塩基配列も決定されている (非特許文献 10〜13)。
[0025] HCV粒子は細胞表面の硫酸多糖類に捕捉され、エンベロープタンパク質を介して 親和性の高い受容体と結合し、エンドサイト一シスによりエンドソーム内に取り込まれ る。その後、ウィルス膜とエンドソーム膜が融合し、ヌクレオキヤプシドが細胞質に進 入する。裸になったウィルスゲノムは IRESによって翻訳を開始する。小胞体膜上で翻 訳とタンパク質の開裂が起こる。コアタンパク質、 E1及び E2タンパク質と、小胞体で複 製されたウィルス RNAとが集合し、ウィルス粒子が形成される。その後、小胞体腔へ 出芽する。出芽した粒子はゴルジ装置を通過して細胞外に放出されると考えられて いる。
[0026] 最近になって、 HCV由来の自律複製能を有する RNAとして、 HCVサブゲノム RNAレ プリコンが作製されたことにより（特許文献 1、 2及び非特許文献 14〜16)、培養細胞 を用いて HCVの複製機構を解析することが可能となった。これらの HCVサブゲノム R NAレプリコンは、 HCVゲノム RNAの 5'非翻訳領域中の HCV IRESの下流に存在する 構造タンパク質を、ネオマイシン耐性遺伝子及びその下流に連結した EMCV-IRESに よって置換したものである。この RNAレプリコンは、ヒト肝癌細胞 Huh7に導入してネオ マイシン存在下で培養することにより、 Huh7細胞内で自律複製することが証明された 。さらに一部の HCVサブゲノム RNAレプリコンは、 Huh7に限らずヒト子宫頸部癌細胞 HeLa、ヒト肝癌細胞 HepG2などの細胞内でも自律複製することが証明された (特許文 献 3)。さらに、特許文献 2には、遺伝子治療用のベクターとしての組換え型 HCVの使 用につ 、て、 HCV全長ゲノムを利用した HCVウィルス粒子の産生が提案されて!、る 特許文献 1:特開 2002- 171978号公報
特許文献 2:特開 2001-17187号公報
特許文献 3:国際公開 WO2004Z104198
非特許文献 l:Mann, R. et al, Cell, 33 (1983) pl53- 59
非特許文献 2:Simada, T et al., J Clin Invest.88 (1991) pi 043-47
非特許文献 3:Betta, A et al" Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 (1994) p8802- 06 非特許文献 4: Burden, S & Yarden, Y.， Neuron, 18 (1997) p847- 55
非特許文献 5: Crystal, R.G Science, 270, (1995) p404- 10
非特許文献 6: Neumann, G. & Kawaoka, Y.， Virology 287 (2001) p243- 50 非特許文献 7:Berglund, P et al., Biotechnology, 11 (1993) p916- 920
非特許文献 8: Wang, K.S et al., J. Virol.66 (1992) p4992- 5001
非特許文献 9:Levine, B. et al.、 Nature, 361 (1993) p739- 42
非特許文献 10:Simmonds, P. et al., Hepatology, 10 (1994) pl321- 24
非特許文献 ll:Choo, Q.L et al" Science, 244 (1989) p359- 362
非特許文献 12:Okamoto, H et al" J. Gen. Virol, 73(1992) p673- 79
非特許文献 13:Mori, S. et al" Biochem. Biophis. Res. Commun.183 (1992) p334- 4
2
非特許文献 14: Blight et al., Science, 290 (2000) pl972-74
非特許文献 15:Friebe et al., J. Virol, 75 (2001) pl2047-57
非特許文献 16:Kato, T. et al., Gastroenterology, 125 (2003) pl808- 17 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0027] HCVは、レトロウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、シンドビスウィル スのようなウィルスベクターとしての開発が実際には行われていない。もしそのような H
CVベクターが開発されるならば、肝臓などの組織の細胞に特異的に遺伝子を導入 することが可能となるだろう。その場合、より高度の安全性を確保するために、 HCVベ クタ一は、細胞に感染するが伝搬性がな 、ことが望ま 、。
[0028] 本発明の目的は、上記のようなベクターとして使用可能な組換え型 C型肝炎ウィル ス (HCV)様粒子を開発することである。また、該 HCV様粒子を効率よく産生する方法 を提供することである。
課題を解決するための手段
[0029] 本発明者らは、安全性、利便性、応用性の点から、産業上有用であると考えられる 組換え型 HCV様粒子を培養細胞で産生させることを試みた。まず、 HCVのゲノムを、 HCV構造タンパク質を発現するベクターと、複製に関係する遺伝子を含むベクターと に分割した。後者のベクターには、所望の外来遺伝子及び/又は内部リボゾーム結 合部位（Internal Ribosome Entry Site; IRES)を含むことができる。
[0030] 本発明者らは、所望の外来遺伝子、 IRES配列、 HCVの複製に関係する遺伝子から なる DNAを T7プロモーターの下流にクローン化したベクターを構築し、 T7ポリメラー ゼを用いて in vitroで外来遺伝子配列を含有する HCVサブゲノム RNAレプリコンを合 成した。この RNAレプリコンを培養動物細胞に導入し、該 HCVサブゲノム RNAレプリコ ンが複製されて 、る細胞株を得た。
[0031] 次に HCV構造タンパク質を高発現するベクターを、高い効率で該細胞株に導入で きる系を見出して、種々の遺伝子型の HCVサブゲノム RNAレプリコンを保持する細胞 に導入した。その結果、細胞内で HCV構造タンパク質を発現させることで、該 HCVサ ブゲノム RNAレプリコンをウィルス粒子にパッケージングすることができる組合せを見 出すことに成功した。
[0032] さらに本発明者らは、本発明の方法で産生された組換え型 HCV様粒子が感染する こと及び該組換え型 HCVが感染した細胞は子ウィルス粒子を産生せず、伝播性がな いことを確認した。このような特性のために、本発明の組換え型 HCV粒子は、外来遺 伝子導入のための、或いは遺伝子治療のための、ベクターとして使用することが可能 である。
[0033] すなわち、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
[0034] 本発明は、その第 1の態様において、組換え型 C型肝炎ウィルス粒子を産生する方 法であって、
(i) C型肝炎ウィルス株に由来するゲノム RNA上の、 5'非翻訳領域と、 NS3タンパク質 、 NS4Aタンパク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタンパク質及び NS5Bタンパク質をコード する塩基配列と、 3'非翻訳領域とを含む塩基配列を含む RNAレブリコンを保持する 細胞に、
(ii)上記 (0と同じ又は異なる C型肝炎ウィルス株由来の Coreタンパク質、 E1タンパク 質、 E2タンパク質及び p7タンパク質を発現するベクターを導入し、該細胞を培養し、 産生した組換え型 C型肝炎ウィルス粒子を回収することを含む、前記方法を提供す る。
[0035] その一の実施形態にぉ 、て、前記 (0及び GOの C型肝炎ウィルス株は、独立に、遺 伝子型 la, lb, 2a, 2b, 3a及び 3bのウィルス株力 なる群力 選択される少なくとも 1種 の株である。
[0036] 別の実施形態にお!ヽて、前記 (0及び (ii)の C型肝炎ウィルス株は、独立に、遺伝子 型 lb及び 2aのウィルス株力 なる群力 選択される少なくとも 1種の株である。
[0037] さらに別の実施形態において、前記 (0の C型肝炎ウィルス株は、遺伝子型 lbのウイ ルス株である。
[0038] 好適実施形態によれば、前記遺伝子型 lbのウィルス株は conl株又はその派生株 である。
[0039] 別の実施形態にお!、て、前記 GOの C型肝炎ウィルス株は、遺伝子型 2aのウィルス 株である。
[0040] 好適実施形態によれば、前記遺伝子型 2aのウィルス株は JFHI株又はその派生株 である。
[0041] さらに別の実施形態において、前記 RNAレブリコンは、少なくとも 1つの内部リボゾ ーム結合部位 (IRES)配列をさらに含むことができる。
[0042] 別の実施形態において、前記 RNAレブリコンは、少なくとも 1つの外来遺伝子をさら に含むことができる。
[0043] 好適実施形態によれば、前記 IRES及び前記外来遺伝子は、前記 5'非翻訳領域と 前記 NS3との間に位置することができる。
[0044] さらに別の実施形態において、前記細胞は動物細胞である。
[0045] 好適実施形態によれば、前記動物細胞は哺乳動物細胞である。
[0046] 前記哺乳動物細胞として、 Huh7、 HepG2及びそれらの細胞力 派生した株化細胞 を f列示することができる。
[0047] さらに別の実施形態において、前記発現ベクターはウィルスベクターである。
[0048] 好適実施形態によれば、前記ウィルスベクターはワクチニァウィルスベクターである
[0049] 本発明の上記方法で産生 ·回収された組換え型 C型肝炎ウィルス粒子をさらに、肝 臓細胞又はリンパ球系細胞などの HCV感受性細胞に感染させて、ウィルス粒子を増 殖させることができる。本発明は、このような工程も包含する。
[0050] 本発明はまた、第 2の態様において、上に記載の本発明の方法によって産生される
、かつ感染性を有しているが伝搬力のない、ことを特徴とする組換え型 C型肝炎ウイ ルス粒子を提供する。
[0051] その一の実施形態にお!、て、前記組換え型 C型肝炎ウィルス粒子には、発現可能 に外来遺伝子が導入されて 、る。
[0052] 別の実施形態において、前記組換え型 C型肝炎ウィルス粒子はベクターである。
[0053] 本発明にお 、て、組換え型 C型肝炎ウィルス粒子の産生のための好適な方法の 1 つは、
組換え型 C型肝炎ウィルス粒子を産生する方法であって、
(i) C型肝炎ウィルス conl株由来のゲノム RNA上の、 5'非翻訳領域と、 NS3タンパク質 、 NS4Aタンパク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタンパク質及び NS5Bタンパク質をコード する塩基配列と、 3'非翻訳領域とを少なくとも含む塩基配列からなる RNAレブリコン、 或!ヽは少なくとも 1つの外来遺伝子及び/又は少なくとも 1つの IRES配列をさらに含む 前記 RNAレブリコンを自律複製する細胞に、 (ii) C型肝炎ウィルスが JFH1株由来であ つて、該 C型肝炎ウィルスの Coreタンパク質、 E1タンパク質、 E2タンパク質及び p7タン ノ ク質を発現するヮクチ-ァウィルスベクターを導入し、該細胞を培養し、産生した組 換え型 C型肝炎ウィルス粒子を回収することを含む、前記方法からなる。
[0054] また、本発明にお ヽて、好適な組換え型 C型肝炎ウィルス粒子は、上記の好適な方 法によって産生されるものである。
[0055] 本発明は、さらに、以下の [1]〜[2]を包含する。
[0056] [1] 組換え型 C型肝炎ウィルス様粒子を産生する方法であって、
(i)遺伝子型 la、 lb、 2a、 2b、 3a及び 3bの C型肝炎ウィルス株力 なる群力 選択され る少なくとも 1種類のウィルス株に由来するゲノム RNA上の、 5'非翻訳領域と、 NS3タ ンパク質、 NS4Aタンパク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタンパク質及び NS5Bタンパク質 をコードする塩基配列と、 3'非翻訳領域とを含む塩基配列を含む RNAレブリコンを保 持する細胞に、
(ii)遺伝子型 la、 lb、 2a、 2b、 3a及び 3bの C型肝炎ウィルス株力 なる群力 選択され る少なくとも 1種類のウィルス株であって上記 (i)と同じ又は異なる C型肝炎ウィルス株 由来の Coreタンパク質、 E1タンパク質、 E2タンパク質及び p7タンパク質を発現するべ クタ一を導入し、
該細胞を培養し、産生されたウィルス様粒子を回収することを含む、前記方法。
[0057] この方法にお!、ては、前記（i)の遺伝子型 lbの C型肝炎ウィルス株が conl株であり
、前記 (i)の遺伝子型 2aの C型肝炎ウィルス株が JFH1株であることが好ま U、。
[0058] またこの方法では、前記 (ii)の遺伝子型 laの C型肝炎ウィルス株が H77c株、 1株、 H 株、及び HC-J1株であることも好ましい。
[0059] この方法では、前記 (ii)の遺伝子型 lbの C型肝炎ウィルス株が J1株、 conl株、 TH株
、 J株、 JT株、及び BK株であることも好ましい。
[0060] この方法では、前記 (ii)の遺伝子型 2aの C型肝炎ウィルス株が JFH1株、 HC-J6株、
JCH1株、及び J6CF株であることも好ましい。
[0061] この方法では、前記（ii)の遺伝子型 3aの C型肝炎ウィルス株が NZL1株、 K3a/650株
、 452株、及び E-bl株であることも好ましい。 [0062] この方法では、前記 (ii)の遺伝子型 3bの C型肝炎ウィルス株が Tr株であることも好 ましい。
[0063] さらにこの方法では、前記（ii)のベクターがヮクチ-ァウィルスベクター又は EF-1 a プロモーター含有ベクターであることが好まし 、。
[0064] さらにこの方法では、前記 RNAレプリコンは、少なくとも 1つの内部リボゾーム結合部 位 (IRES)配列及び Z又は少なくとも 1つの外来遺伝子をさらに含むことが好ましい。
[0065] その IRES配列及び Z又は外来遺伝子は、前記 5'非翻訳領域と前記 NS3タンパク質 コード配列との間に位置することが好適である。
[0066] 本方法では、前記細胞は好ましくは動物細胞である。動物細胞としては、 Huh7細胞
、 H印 G2細胞又はそれらの細胞力も派生した株化細胞がより好ま 、。
[0067] [2] 上記 [1]の方法によって産生される、感染性を有しているが伝搬力を有しない組 換え型 C型肝炎ウィルス様粒子。
発明の効果
[0068] 本発明によって、所望の外来遺伝子を含む HCVサブゲノム RNAをパッケージングし た伝搬性のない組換え型感染性 HCV様粒子とその製造方法を提供することが可能 となった。このような組換え型感染性 HCV様粒子は、伝播性が欠如しているという利 点を有するために、特に肝臓やリンパ球系の細胞又は組織への遺伝子導入 (例えば 、遺伝子治療）に使用することができるし、或いはトランスジエニック動物を作製するた めのウィルスベクターとして、さらには弱毒化ワクチンとして使用できる、という利点を もつ。
図面の簡単な説明
[0069] [図 1]図 1は本発明の実施形態の概略図であり、組換え型 HCV様粒子の製造工程を 示す。 a) : HCVサブゲノム RNAレプリコンが導入された Huh7細胞中では、 HCVサブゲ ノム RNAレプリコンが複製される。ウィルス粒子は産生されない。 b) : HCV構造タンパ ク質発現ベクターがさらに導入された a)の細胞中では、発現された HCV構造タンパク 質を利用して HCVサブゲノム RNAレプリコンがパッケージングされたウィルス様粒子 が産生される。 c) : b)で産生されたウィルス様粒子が感染した細胞中では、 HCVサブ ゲノム RNAレプリコンの複製は起こる力 ウィルス子粒子は産生されない。 [図 2]図 2は HCVゲノム RNA及び HCVサブゲノム RNAの cDNAの構造図を示す。上段 が HCV遺伝子型 2aから作製した pFHl、中段が pSGR-JFHlである。下段が HCV遺伝 子型 lbから作製した I389/NS3-3 ' /wtである。図中の記号は以下のとおりである。 T7: T7 RNAプロモーター。 5'UTR: 5'非翻訳領域。コア： Coreタンパク質。 El、 E2:ェンべ ロープタンパク質。 p7: p7タンパク質。 NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 NS5B:非構造 タンパク質。 3'UTR: 3'非翻訳領域。 Age I、 Pme I、 Xba I:制限酵素 Age I、 Pme I及び Xba Iの切断部位。 EMCV IRES :脳心筋炎ウィルスの内部リボゾーム結合部位。
[図 3]図 3は本発明の HCV構造タンパク質を発現するためのベクターのマップを示す 。具体的には、上段が CAGプロモーターの下流に JFH構造領域遺伝子を挿入して作 製したプラスミドクローン pGAGC-p7JFHl、下段がェロンゲーシヨンファクター 1 αプロ モーター配列の下流に JFH構造領域遺伝子を挿入して作製したプラスミドクローン ρΕ F4C- p7JFHlの構造を示す。図中の記号は下記の通りである。 CAG : CAGプロモータ 一、 pA:ポリ A付カ卩配列、 EcoRI :制限酵素 EcoRIの切断部位、 EF- 1 a：ェロンゲーシ ヨンファクター 1 αプロモーター、 BGH pA:ゥシ成長因子ポリ Α付カ卩配列。
[図 4]図 4はベクター pDIsHJFHst、 pDIsH77stゝ pDIsJlst、 pDIsJl(c)/JFH(El— p7)st及 び pDIsJFH(c)/Jl(El- p7)stに挿入されて!、る HCV構造遺伝子のマップを示す。由来 するウィルス株の違いを、枠内の網掛けで示している。
[図 5]図 5はレプリコン保持細胞株 IH4.1に pEF4C- p7JFHlを導入させ、その細胞の培 養上清 (sup)をショ糖密度勾配により分画した各画分における、 HCVレブリコン RNA の量 (A)及び HCV Coreタンパク質の量を示すグラフ (B)である。口：実験 1,♦:実験 20
[図 6]図 6はレプリコン保持細胞株 5- 15にヮクチ-ァウィルスベクターである DIsJFHst を感染させ、その細胞の培養上清 (sup)をショ糖密度勾配により分画した各画分 (横 軸）における、 HCV Coreタンパク質の量 (縦軸）を示すグラフである。黒塗りの円は H CV Core (Core)タンパク質、黒塗りの四角は NP40処理した培養上清を用いた結果を 示す。実験 1は未処理のみの結果（図 6A)、実験 2は未処理と NP40処理の結果（図 6 B)を示す。
発明を実施するための最良の形態 [0070] 1.定義
本明細書中で使用される用語は以下の意味を有する。
[0071] 「RNAレブリコン」とは、 HCVウィルスゲノムを改変して作製される自律複製能を有す る RNAを指す。
[0072] 「自律複製能」とは、プラスミド DNAのように細胞内で自律的に核酸のコピーを再生
(すなわち複製)することができる能力をいう。
[0073] 「感染能」又は「感染性」とは、細胞への接着能及び膜融合能等を保持して 、ること により、細胞内にウィルス内部の核酸等を導入することのできる能力を指す。
[0074] 「組換え型 C型肝炎ウィルス」とは、本来の HCVウィルスの持つ性質を遺伝子組換 え技術により質的/量的に変化させたウィルスを意味し、例えば本来のウィルスが発 現する以外の外来遺伝子を発現する能力を持つウィルス、本来のウィルスが持つ伝 搬性ゃウィルスゲノムの複製能を欠損させたウィルス等が挙げられ、広義には、同じ ウィルスのタイプ間又はサブタイプ間で遺伝子を組換えたウィルスも含むものとする。
[0075] 「伝搬性」又は「伝搬力」とは、感染や人工的な手法で核酸が細胞内に導入された 後、細胞内に存在する該核酸が複製後、感染性粒子又はそれに準ずる複合体を形 成し、別の細胞に伝播することのできる能力を意味する。
[0076] 「Core」は、 HVCのコア構造タンパク質である。
[0077] 「E1」及び「E2」は、ともにエンベロープ構造タンパク質である。
[0078] 「NS」は、 HCVの非構造タンパク質を指し、ウィルス自身の複製に関与するタンパク 質である。「NS2」はメタ口プロテアーゼ活性を有する。「NS3」はセリンプロテアーゼ活 性 (N末端側の 3分の 1)とへリカーゼ活性 (C末端側の 3分の 2)を有する。「NS4A」は NS3のプロテアーゼ活性に対するコファクターである。「NS4B」は機能が明らかでない 。 「NS5A」は宿主細胞の情報伝達を制御する活性を有すると考えられている。「NS5B 」は RNA依存 RNAポリメラーゼ活性を有する。
[0079] 「IRES配列」とは、 RNAの内部にリボゾームを結合させて翻訳を開始させることが可 能な内部リボゾーム結合部位を意味する。
[0080] 「発現可能に」とは、プロモーター、ェンノヽンサ一などの調節配列によって目的遺伝 子の転写 ·翻訳が可能な状態を指す。 [0081] 2. HCVサブゲノム RNAレプリコン保持細胞
野生型の HCVゲノムは、約 3,000アミノ酸の前駆体タンパク質をコードする約 9.6kb 長の一本鎖 RNAよりなる。 HCVゲノムは 5'非翻訳領域（5'UTR)、 Core、 El、 E2、 p7、 N S2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 NS5B、 3'非翻訳領域（3'UTR)の順で構成されている 。本発明の方法で使用される HCVサブゲノム RNAレプリコンは、 5'非翻訳領域、 NS3 、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 NS5B、 3'非翻訳領域の順に構成された改変 RNAを含む。こ の RNAレプリコンは、プロモーターなどの調節因子の作用下で複製可能に特定の細 胞に導入される。
[0082] RNAレプリコンにはさらに、外来遺伝子及び/又は IRES配列が含まれてもよい。外来 遺伝子及び IRES配列は、好ましくは、 5'非翻訳領域と NS3コード配列との間に外来遺 伝子、 IRES配列の順に位置することができる。
[0083] IRES配列の好適な例としては、以下に限定するものではな!/、が EMCV IRES (脳心 筋炎ウィルスの内部リボゾーム結合部位）、 FMDV IRES, HCV IRES等が挙げられる 1S EMCV IRES及び HCV IRES力 Sより好ましく、 EMCV IRESが最も好ましい。
[0084] 外来遺伝子として、薬剤耐性を示す遺伝子 (すなわち、この遺伝子は細胞の選択を 可能にする遺伝子であり、該遺伝子を有する細胞はその薬剤に対して耐性をもつよ うになる。）、例えばネオマイシン、ノヽィグロマイシン、ピューロマイシン、ゼォシン、ブ ラストサイジン、チミジンキナーゼ、カナマイシンなどをコードする遺伝子；レポーター 遺伝子 (すなわち、この遺伝子は遺伝子発現の指標となる遺伝子産物をコードする マーカー遺伝子である。）、例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質 (GFP)、 β - ガラクトシダーゼなどの発光反応や呈色反応を触媒する酵素をコードする遺伝子；さ らには、遺伝子治療用の標的遺伝子又は治療用核酸、例えばヒトを含む哺乳動物に おいて治療を要する疾患の治療に役立つ種々のタンパク質、例えば酵素、サイトカイ ン、ケィモカイン、ホルモン、抗体、免疫調節分子、腫瘍抑制タンパク質、成長因子、 膜タンパク質及び血管作動性タンパク質をコードする遺伝子、アンチセンス RNA、 siR NAなどの治療用核酸などが用いられる。
[0085] HCVサブゲノム RNAレプリコンの具体的な例として、 pSGR-JFHl (図 2中段）、 I /N
389
S3-3'/wt (図 2下段）などが挙げられる。このような HCVサブゲノム RNAレプリコンは、 例えば本発明者らの刊行物である Kato, T. et al. Gastroenterology, 2003 125:1808- 1817、国際公開 WO 2004/104198 (特許文献 3)などに記載される方法を使用して作 製することができる。
[0086] HCV株の塩基配列を用いた系統解析法では、 HCVは遺伝子型 la、遺伝子型 lb、 遺伝子型 2a、遺伝子型 2b、遺伝子型 3a、遺伝子型 3bの 6タイプに分類され、さらにそ れら各タイプがいくつかのサブタイプに分類される。そして、 HCVの複数の遺伝子型 についてはそのゲノム全長の塩基配列も決定されている（Simmonds, P. et al., Hepat ology, 10 (1994) pl321- 1324、及び Choo, Q.L et al" Science, 244 (1989) p359- 362, Okamoto, H et al" J. Gen. Virol, 73(1992) p673- 679、 Mori, S. et al" Biochem. Bi ophis. Res. Commun. 183 (1992) p334- 342、国際公開 WO 2004/104198) 0
[0087] 具体的には、遺伝子型 laの HCV株としては、 H77c株（H77株のコンセンサス配列： GenBankァクセッション番号 AF011751)、 1株（GenBankァクセッション番号 M62321)、 H株（GenBankァクセッション番号 M67463)、 HC- J1株（GenBankァクセッション番号 D 10749)などが知られている。また遺伝子型 lbの HCV株としては、 J1株（GenBankァク セッション番号 D89815)、 conl株（GenBankァクセッション番号 AJ238799、 Con- 1株と 称することもある）、 TH株（Wakita, T. et al" J. Biol. Chem., (1994) 269, p.14205-142 10)、 J株（GenBankァクセッション番号 D90208)、 JT株 (GenBankァクセッション番号 D 01171)、 BK株（GenBankァクセッション番号 M58335)などが知られている。遺伝子型 2 aの HCV株としては、 JFH1株（GenBankァクセッション番号 AB047639、 JFH-1株と称 することもある）、 HC- J6株（GenBankァクセッション番号 D00944)、 JCH1株 (GenBank ァクセッション番号 AB047640)、 J6CF株（GenBankァクセッション番号 AF177036)など が知られている。さらに遺伝子型 2bの HCV株としては、 HC-J8株（GenBankァクセッシ ヨン番号 D01221)などが、遺伝子型 3aの HCV株としては NZL1株（GenBankァクセッシ ヨン番号 D17763)、 K3a/650株（GenBankァクセッション番号 D28917)、 452株（GenBan kァクセッション番号 DQ437509)、 E- bl株（Chan, S. et al., J. Gen. Virol, 73 pl l31- 1141 (1992))などが、遺伝子型 3bの HCV株としては Tr株（Chayama, K. et al., J. Gen . Virol, 75 p3623-3628 (1994))などが知られている。また、その他の株についても既 に GenBankァクセッション番号のリストが報告されている（Tokita, T. et al., J. Gen. Vir ol. 79, 1847—1857,1998、 Cristina J. & Colina R. Virolgy Journal, 3, 1—8, 2006)。
[0088] 本発明に使用される HCVサブゲノム RNAレプリコンを構成するエレメント（すなわち 、 5'非翻訳領域、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 NS5B及び 3'非翻訳領域）は、細胞内で 複製可能であるように HCVサブゲノム RNAレプリコンを構成できる限り、上記のいず れの遺伝子型又はそれらのサブタイプの株に由来してもよい。なお、本発明は感染 性を有するが伝搬性を有しない組換え型 C型肝炎ウィルス様粒子を産生する方法で あり、産生されたウィルス様粒子の伝搬性を欠如させるために、本発明の RNAレプリ コンは HCVの構造タンパク質（Core、 El、 E2及び p7)のそれぞれをコードする遺伝子 を含まないことが好ましい。
[0089] 上記エレメントの各々は、同一の HCV株に由来してもよいし、 2以上の異なる HCV 株に由来する混成 (キメラ）の形態をとつてもよい。好ましい HCV株は、遺伝子型 lb及 び 2aの HCV株力 なる群力 選択される少なくとも 1種の株、より好ましくは遺伝子型 lbの HCV株である conl株、或いは遺伝子型 2aの HCV株である JFHI株である。なお、 本発明における HCV株は、例えば親株としての conl株又は JFHI株において自然に 又は人為的に突然変異が生じて得られた単離株であって、少なくとも遺伝子型が親 株のものから変化して 、る株 (派生株)であってもよ 、。このとき表現型形質は親株と 同じであっても異なって！/、てもよ！/、が、形質的に同じ株が好ま U、。
[0090] HCVサブゲノム RNAレプリコンの例は、 JFH1株（遺伝子型 2a)以外の HCV株ゲノム 由来の、 5'非翻訳領域、 NS3タンパク質、 NS4Aタンパク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタ ンパク質をコードする配列及び JFH1株の NS5Bタンパク質をコードする配列及び 3 '非 翻訳領域からなる HCVサブゲノム RNAレプリコン; JFH1株の 5'非翻訳領域、 NS3タン パク質、 NS4Aタンパク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタンパク質、 NS5Bタンパク質をコー ドする配列及び 3，非翻訳領域からなる HCVサブゲノム RNAレプリコン； HCV-conl株（ 遺伝子型 lb、 GenBankァクセッション番号 AJ238799、 Lohmann.V. et al, Science 28 5 (1999) p 110- 113)の 5'非翻訳領域、 NS3タンパク質、 NS4Aタンパク質、 NS4Bタンパ ク質、 NS5Aタンパク質及び NS5Bタンパク質をコードする配列及び 3'非翻訳領域から なる HCVサブゲノム RNAレプリコンなどである。また、これら HCVサブゲノム RNAレプリ コンの 5'非翻訳領域と NS3タンパク質コード配列の間に所望の外来遺伝子と IRES配 列を含有してもよい。
[0091] HCVゲノム RNA上の 5'非翻訳領域、構造タンパク質（Core、 El、 E2及び p7)、非構 造タンパク質（NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、及び NS5B)、 3'非翻訳領域、並びに その他の部位は、例えば遺伝子型 2aの HCV JFH1株 (特開 2002-171978号公報）の ゲノム RNAに対応する全長ゲノム cDNA配列（GenBankァクセッション番号 AB047639 、 Kato, T. et al.， Gastroenterology, 125 (2003) p.1808- 1817 ;配列番号 10。コードさ れるアミノ酸配列も配列番号 11に示す)を基準として規定することができる。
[0092] 一例として、 JFH1株由来の全長ゲノム cDNAについて、本発明において HCVサブ ゲノム RNAレブリコンの構成要素として用いられうる 5'非翻訳領域は、配列番号 10の 塩基配列における塩基番号 1〜340であり、また Core (コア）タンパク質力 p7タンパク 質まで（Core、 El、 E2、 p7)をコードする領域は、塩基番号 341〜2779であり、 NS3タン パク質から 3'非翻訳領域まで（NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 NS5B、 3'UTR)をコードす る領域は塩基番号 3431〜9678である。この JFH1株由来の各領域の配列との比較に より、他の HCV株由来のゲノム cDNAにつ 、ても各領域を特定することができる。
[0093] HCVサブゲノム RNAレプリコンを得るために、 DNA配列から RNAを転写するプロモ 一ターの下流に該 HCVサブゲノム RNAの相補的な DNAをクローン化したベクターを 用いて、 DNA依存的 RNAポリメラーゼにより合成することができる。 DNA配列から RNA を転写するプロモーターとして、 T7, T3, SP6などが挙げられる力 T7プロモーターが 好適であり、 T7ポリメラーゼにより HCVサブゲノム RNAを合成することができる。このよ うして合成された HCVサブゲノム RNAを HCVの増殖を許容する細胞に導入すること で、該 HCVサブゲノム RNAレブリコンを自律複製する細胞を作製することができる。
[0094] 細胞としては、動物細胞、例えば魚類、爬虫類、両生類、鳥類及び哺乳動物細胞 などの脊椎動物細胞が好ましぐ哺乳動物細胞が最も好ましい。さらに例示すると、 細胞には、肝臓、子宮頸、胎児腎由来の正常細胞、腫瘍細胞、それらの株化細胞な どが含まれ、例えば Huh7, HepG2, IMY- N9, HeLa, HEK293などの細胞（Date, T. et al" J. Biol. Chem., 279, p.22371-22376, (2004)、 Ito, T. et al, Hepatology 34, p.56 6-572, (2001))好ましくは Huh7、 HepG2又はこれらの細胞から派生するクローンが挙 げられる。 [0095] 培養細胞で該 HCVサブゲノム RNAを複製させる別の方法として、 RNAレプリコンを 使用せず、 HCV cDNAを利用した系を挙げることができる。 HCV cDNAを RNAポリメラ ーゼ II型のプロモーターで発現させると、転写された RNAの 5'末端には CAP構造が、 3'末端にはポリ A鎖が付加され、リボゾームにてタンパク質合成の铸型として利用さ れてしまい、 HCVゲノム RNAの複製が起こらない。この問題を解決するために、 Helle rらは、 HCVゲノムの 5'末端と 3'末端にリボザィム配列を連結し、細胞内で RNAポリメ ラーゼ IIにて転写された後、リボザィムで切断させることにより、キャップとポリ Aが付カロ して 、な 、HCV RNAを細胞内で合成ができるような DNAベクターを作製した（Heller T et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 102, p.2579- 2583, 2005)。このベクターを細胞 内に導入することで、 HCVサブゲノム RNAレブリコンを複製する細胞を得ることができ る。
[0096] さらに別の方法として、該 HCVサブゲノム RNAの相補的な DNAを RNAポリメラーゼ I プロモーター/ターミネータ一系のベクターにクローン化し、該ベクターを HCVの増殖 を許容する細胞に導入することで、該 HCVサブゲノム RNAレブリコンを複製する細胞 を得ることができる。より具体的には、 pHH21 (Neumann G. et al., Proc. Natl. Acad. S ci. USA, 96 (1999) p9345- 9350)を使用できる。 pHH21は、プロモーターにヒト RNAポ リメラーゼ〖プロモーター、ターミネータ一にマウス RNAポリメラーゼ Iターミネータ一から なるベクターである。 HCVサブゲノムレプリコン RNAに対する cDNAの 5 '端及び 3 '端 に、 PCRを用いて制限酵素 BsmBI認識配列をそれぞれ付加した後、 BsmBIで消化し、 pHH21の BsmBI部位に HCVゲノムを挿入すると、プロモーター/ターミネータ一と HC Vゲノムの間に余分な塩基配列を含むことなく連結できる。
[0097] HCVサブゲノム RNAレプリコン、又は HCVサブゲノム RNAレプリコンを発現するべク ター等を始めとするベクターの細胞内導入は、当業者に公知の任意の技術を使用し て行うことができる。そのような導入方法としては、例えば、エレクト口ポレーシヨン、パ 一ティクルガン法、リポフエクシヨン法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法 、 DEAEデキストラン法等が挙げられる。
[0098] 本発明では、以上の記載に従 、、本発明に力かる HCVサブゲノム RNAレプリコンを 細胞内で複製している細胞を作製することができる。そのような RNAレブリコンは、当 該細胞中で持続的に自律複製して ヽるため、 RNA分解を受ける細胞内でもある程度 の量で維持される。従って、上記のように本発明に力かる HCVサブゲノム RNAレプリ コン、又は HCVサブゲノム RNAレプリコンを発現するベクター等が細胞内導入された 細胞は、その RNAレプリコンを保持することができる。本発明において「RNAレプリコ ンを保持する細胞」とは、当該 RNAレブリコンが、その自律複製能により、有意な量で 一過性でなく持続的に細胞内に存在していることを意味する。
[0099] 本発明の方法では、本発明の HCVサブゲノム RNAレプリコンを保持する細胞に後 述する HCV構造タンパク質発現ベクターを導入し発現させることにより、 HCVサブゲ ノム RNAレプリコンがパッケージングされたウィルス様粒子を産生させることができる。
[0100] 3. HCV構诰タンパク皙発現ベクターの構築
本発明の方法にぉ 、ては、 HCVサブゲノム RNAレプリコンを保持する細胞内で HC V構造タンパク質遺伝子を発現させて、 HCV構造タンパク質を供給することが好まし い。
[0101] HCV構造タンパク質は Core、 El、 E2、 p7からなる。 HCV構造タンパク質を供給する ためのこれらのタンパク質をコードする遺伝子は、 HCVの遺伝子型に限定されるもの ではなぐ該遺伝子の各々は、同一の HCV株に由来してもよいし、或いは 2以上の異 なる HCV株に由来して混成 (キメラ）の形態をとつてもよい。 HCV構造タンパク質遺伝 子の由来としては、 la、 lb、 2a、 2b、 3a及び 3bの HCV株から選択される少なくとも 1種 類のウィルス株であればよいが、好ましい HCV株は、 la、 2a、 3a及び 3bからなる群か ら選択される少なくとも 1種類のウィルス株であり、より好ましい HCV株は、遺伝子型 1 b及び 2aの HCV株力もなる群力も選択される少なくとも 1種類のウィルス株である。さら に好ましくは遺伝子型 laの H77c株、 1株、 H株及び HC-J1株など、遺伝子型 lbの J1株 、 conl株、 TH株、 J株、 JT株及び BK株など、または遺伝子型 2aの JFH1株、 HC- J6株 、JCH1株及び J6CF株など力もなる群力も選択される少なくとも 1種類のウィルス株で ある。さらに好ましくは遺伝子型 laの H77株、遺伝子型 lbの J1株または遺伝子型 2aの JFH1株、最も好ましくは JFH1株（GenBankァクセッション番号 AB047639、 Kato, T. et al.， Gastroenterology, 125 (2003) pl808- 1817)である。
[0102] これらのタンパク質を発現させる方法として、細胞、好ましくは動物細胞、より好まし くは哺乳動物細胞で発現できる方法であれば 、ずれの方法であってもよ 、。好まし Vヽ方法は、上記遺伝子を組み込んだ発現ベクターを使用する方法である。
[0103] 本発明の好適な方法においては、 HCV構造タンパク質を供給するために、 HCV構 造タンパク質発現ベクター (好ましくは、 HCV構造タンパク質遺伝子をプロモーター 制御下に発現されうる形で含む発現ベクター）を、上記 2に記載した HCVサブゲノム R NAレブリコンを保持する細胞に導入し、発現させる。
[0104] 発現させるベクターとして、 CDM8、 pEFl/Myc- Hisl,2,3、 pEF4/Myc- Hisl,2,3、 pc DNA3.1、 pREP4、 pCEP (いずれもインビトロジェン社)、 pC neo (プロメガ社）などが挙 げられる。テトラサイクリンでプロモーターの発現を調整できるプロモーターを含む pc DNA5/TO (インビトロゲン社)も使用できる。プロモーターとしては、動物細胞中で発 現できるものであればよぐサイトメガロウィルスの IE(immediate early)プロモーター、 S V40初期又は後期プロモーター、メタ口チォネインプロモーター、レトロウイルスプロモ 一ター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター、ェロンゲーシヨンファクター 1 aプロモーター、アルブミンプロモーター等があげられる。
[0105] さらに、利用可能なベクターとしてウィルスベクターを挙げることができる。動物細胞 に感染して、所望の外来遺伝子を発現させることが出来るウィルスベクターであれば よいが、好ましくは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、シンドビスウィル スベクター、ヮクチ-ァウィルスベクターが挙げられ、特にワクチ-ァウィルスベクター は大量の遺伝子産物を発現することができることから（Elroy-Stein, 0., et al, Pro Natl. Acad. Sci. USA, 86 (1989) p6126- 6130)、ヮクチ-ァウィルスベクターが好適で ある。
[0106] 本発明の方法で用いる HCV構造タンパク質発現ベクターは、 HCV構造タンパク質 遺伝子として、 Coreタンパク質遺伝子、 E1タンパク質遺伝子、 E2タンパク質遺伝子、 及び p7タンパク質遺伝子を、宿主細胞内で発現されうる状態で含むことが好ま ヽ。 本発明に力かるそのような HCV構造タンパク質発現ベクターの例は、 Coreタンパク質 遺伝子、 E1タンパク質遺伝子、 E2タンパク質遺伝子、及び p7タンパク質遺伝子を、挿 入遺伝子の発現を可能にするプロモーターの制御下に含むベクターである。本発明 では、 Coreタンパク質遺伝子、 E1タンパク質遺伝子、 E2タンパク質遺伝子、及び p7タ ンパク質遺伝子を、ェロンゲーシヨンファクター 1 a (EF-1 α )プロモーターの制御下 に挿入した、ェロンゲーシヨンファクター 1 αプロモーター含有ベクターを、特に好適 な HCV構造タンパク質発現ベクターとして用いることができる。ここで「ェロンゲーショ ンファクター 1 αプロモーター含有ベクター」とは、ェロンゲーシヨンファクター 1 α遺伝 子のプロモーター配歹 IJ (EF-1 αプロモーター； Mizushima et. al, Nucleic Acids Res., 1990, 18, 5322)を、その制御下にある遺伝子を宿主細胞内で発現させることができ るような配置で含有するベクターを意味する。例としては、 pEFl/Myc-Hisl,2,3、 pEF 4/Myc-Hisl,2,3 (V、ずれもインビトロジェン社）がある。
[0107] 本発明に力かる HCV構造タンパク質発現ベクターの別の好適な例は、 Coreタンパ ク質遺伝子、 E1タンパク質遺伝子、 E2タンパク質遺伝子、及び p7タンパク質遺伝子を 発現可能な状態で含む、ヮクチ-ァウィルスベクター (組換え型ヮクチ-ァウィルスべ クタ一）である。組換え型ヮクチ-ァウィルスベクターの作製には、例えば、 DIs株、 W R株、 IBTd株（Meis, RJ & Condit, RC. Virol. 182, 442-454, (1992))などのヮクチ-ァ ウィルス株を好適に使用することができる。組換え型ヮクチ-ァウィルスベクターの作 製方法については、後述の実施例にも詳述されている。簡単に説明すると、ヮクチ- ァゥイノレス'トランスファーベクター中の p.7.5などのヮクチ-ァゥイノレスプロモーターの 制御下に上記 HCV構造タンパク質遺伝子をクローユングし、さらにそのトランスファー ベクターを、ヮクチ-ァウィルスを感染させた細胞に電気穿孔法等により導入し、その 細胞を培養してウィルス粒子を産生させ、さら〖こ好ましくはそのウィルスを選抜し純ィ匕 することにより、 目的の組換え型ヮクチ-ァウィルスベクターを製造することができる。 このようなヮクチ-ァウィルスベクターは、組換えウィルス様粒子の形態で調製するこ とがでさる。
[0108] HCVの構造タンパク質（Core、 El、 E2、 p7)と非構造タンパク質（NS3、 NS4A、 NS4B 、 NS5A、及び NS5B)は、翻訳領域力 一続きのポリプロテインとして翻訳された後、 プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、生成されるので、これら HCV構造タンパ ク質を発現させる場合、 Core, El、 E2、 p7の一続きのポリプロプロテインとして発現さ せるのが望まし 、が、これらのタンパク質を別々の発現ベクターで発現させてもょ 、。
[0109] 構造タンパク質発現ベクターを導入した細胞が構造タンパク質を発現して!/ヽるかの 確認は、細胞培養液若しくは細胞カゝら抽出したタンパク質を構造タンパク質に対する 抗体と反応させることによって検出することができる（国際公開 WO 2004/104198) o [0110] 具体的には、例えば、細胞力も抽出したタンパク質試料を SDS-ポリアミドゲル電気 泳動にて分画後、ニトロセルロース膜にブロッテイングし、それに対して抗 HCVタンパ ク質抗体 (例えば、抗コア特異的抗体、又は C型肝炎患者力も採取した抗血清)を反 応させ、さらにその抗体を検出する（ウェスタンプロット法)ことによって行うことができ る。
[0111] 或いは、同様の抗体を用いて、 HCVタンパク質を発現している細胞を免疫染色し、 これらのタンパク質の発現と細胞内局在を確認することができる。
[0112] 4. HCVサブゲノム RNAレプリコンの粒子へのパッケージング
本発明の方法では、 HCVサブゲノム RNAレプリコンを保持する細胞内に、 HCV構 造タンパク質を発現するベクターを供給することにより、その細胞内で、 HCVサブゲノ ム RNAレプリコンが構造タンパク質によってパッケージングされたウィルス様粒子を産 生させる。
[0113] HCVサブゲノム RNAレプリコンを複製している細胞の HCVサブゲノム RNAレプリコン をウィルス粒子にノ ッケージングするには、該細胞に構造タンパク質 (Core、 El、 E2、 p7)発現ベクターを導入し発現させればよい。あるいは、構造タンパク質 (Core、 El、 E2、 p7)を安定的に発現させた細胞に HCVサブゲノム RNAを導入してもよい。
[0114] そのような導入方法としては、例えば、エレクト口ポレーシヨン、パーティクルガン法、 リポフエクシヨン法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、 DEAEデキストラ ン法などの公知の方法が挙げられる。
[0115] 5.組換え型 HCVウィルス様粒子の産牛.
上記のようにして作製される、 HCVサブゲノム RNAレプリコンを保持する細胞にお!ヽ て HCV構造タンパク質 (Core、 El、 E2、 p7)遺伝子を導入し発現させた細胞 (組換え 型 HCV様粒子産生細胞）は、組換え型ウィルス様粒子を産生することができる。産生 された組換え型 HCV様粒子は感染能をもち、 HCVサブゲノム RNAを複製する能力を もつが、感染細胞で子ウィルス粒子を産生できないので、結果として伝搬性 (伝搬力 )を持たない。 [0116] 従って、本発明の組換え型 HCV粒子産生細胞を培養することにより、組換え型 HC V様粒子を細胞培養系にて作製することができる。好ましくは、組換え型 HCV様粒子 産生細胞を培養し、その培養物 (好ましくは培養液）中に産生されたウィルス様粒子 を回収することにより、 HCV様粒子を取得できる。ウィルス様粒子は、例えば前記培 養液力 ショ糖密度勾配遠心分離などの手法によって回収することができる。
[0117] 本発明の組換え型 HCV様粒子産生細胞のウィルス粒子産生能は、当業者に公知 の任意のウィルス検出法に従って確認すればよい。例えば、ウィルス様粒子を産生し ていると思われる細胞の培養液をショ糖密度勾配により分画し、各分画の密度とその 分画の HCVコアタンパク質濃度あるいは HCVレプリコン RNA濃度を測定することによ り、従来知られている HCVの比重と一致する力否かで判断できる。さらに、コアタンパ ク質のピークが検出される画分の密度力 0.25% NP40 (ポリオキシエチレン (9)ォクチ ルフエ-ルエーテル [Polyoxyethylene(9)Octylphenyl Ether])で処理してから分画した 場合の同画分の密度と比較して軽い場合には、該細胞はウィルス様粒子産生能を 有すると判定することができる。
[0118] また、組換え型 HCV様粒子産生細胞のウィルス様粒子が感染能を持つカゝ否かは、 該ウィルス粒子にパッケージングされた HCVサブゲノム RNAに存在する外来遺伝子 の表現型を検出すればよい。例えば、外来遺伝子が薬剤抵抗性の遺伝子であれば 、 HCV許容性細胞に、該ウィルス粒子を接種し、該薬剤存在下で、通常 2〜3週間培 養し、薬剤抵抗性のクローンをカウントすることで評価できる。
[0119] さらに組換え型 HCV様粒子産生細胞のウィルス様粒子が感染細胞で子ウィルス粒 子を生産しないことを確認するには、感染細胞の抽出物、好ましくは感染細胞培養 上清中の試料に HCV構造タンパク質が存在するか否かを上述した、ウェスタンブロッ ト法等により判断できる。
[0120] 本発明の方法で産生される組換え型 HCV様ウィルス粒子は、細胞 (好ましくは HCV 許容性細胞)への感染能を有する。組換え型 HCV様粒子産生細胞を培養し、得られ た培養物 (好ましくは、培養液）中のウィルス様粒子を他の細胞 (好ましくは HCV許容 性細胞）に感染させることを含む、組換え型 C型肝炎ウィルス感染細胞の製造方法も 提供する。ここで、 HCV許容細胞とは、 HCVゲノム RNAの複製能及び/又は HCVに感 染する能力を有する細胞であり、これらに限定されるものではない。具体的には、肝 臓細胞としては初代肝臓細胞や、 Huh7細胞、 HepG2細胞、 IMY-N9細胞、 HeLa細胞 、などが挙げられ、リンパ球系細胞としては Molt4細胞、 HPB- Ma細胞、 Daudi細胞な どが挙げられる力 これらに限定されるものではない。
[0121] なお、理解し易 、ように、上記 2節から 5節で説明した組換え型 HCV様粒子の産生 工程を、慨説的に図 1に例示した。
[0122] 6.遣伝子導入用ベクター
本発明の方法で産生された本発明の組換え型 HCV様粒子は、その RNAゲノム上 に、上記 HCV株（遺伝子型 la, lb, 2a, 2b, 3a及び 3b、好ましくは lb及び 2a力 選択さ れる少なくとも 1種類のウィルス株、例えば遺伝子型 lbの conl株又は遺伝子型 2aの J FHl株）由来の、 5'非翻訳領域と、 NS3タンパク質、 NS4Aタンパク質、 NS4Bタンパク質 、 NS5Aタンパク質及び NS5Bタンパク質をコードする塩基配列と、 3'非翻訳領域とを含 む塩基配列を含む、という特徴を有する。
[0123] これにカ卩えて、本発明の方法で組換え型 HCV様粒子産生細胞において産生され た HCV様粒子を細胞 (例えば、上記例示の HCV許容性細胞）に感染させると、その 感染細胞中では上記のような HCVサブゲノム RNAが複製される力 子ウィルス粒子 は形成されない、という興味深い特徴を有する。
[0124] 本発明の組換え型 HCV様粒子には、それにパッケージングされる HCVサブゲノム R
NAレブリコンに所望の外来遺伝子を挿入することにより、遺伝子導入 Z発現用のベ クタ一として用いることができる。そのような外来遺伝子を含む本発明の組換え型 HC V様ウィルス粒子は、該外来遺伝子を 5'非翻訳領域と IRES配列との間に挿入した HC Vサブゲノム RNAレプリコンを作製し、それを上記の本発明の方法でパッケージング することによって、作製することができる。組換え型 HCV粒子産生細胞において産生 された HCV粒子は伝搬力がな 、ので、例えば肝臓やリンパ球系細胞又は組織をタ 一ゲットとした遺伝子導入のためのベクターとしても使用可能である。
[0125] 本発明のウィルス粒子産生の方法でウィルス粒子中にパッケージングした HCVサ ブゲノム RNAは、本発明のウィルス様粒子によって感染された HCV許容性細胞内で は染色体ゲノムに組み込まれることがないので遺伝子の挿入により正常遺伝子が損 傷を受けたり挿入された近辺の遺伝子を活性ィ匕したりすることがなぐ有利である。
[0126] 上記の特性のために、本発明のベクターは、外来遺伝子を導入して、例えば遺伝 子治療やトランスジエニック動物の作製のために使用することができる。
[0127] HCVサブゲノム RNAレプリコンに導入してウィルス粒子にパッケージングされる外来 遺伝子 (又は外来核酸）としては、ヒトを含む哺乳動物由来のタンパク質、例えば疾 患に関わる種々のタンパク質、例えば酵素、サイト力イン、ケィモカイン、ホルモン、抗 体、免疫調節分子、腫瘍抑制タンパク質、成長因子、膜タンパク質及び血管作動性 タンパク質などのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードする遺伝子、タンパ ク質の翻訳を阻止若しくは抑制するアンチセンス RNA、 siRNAなどの治療用核酸など が挙げられる力 特に限定されるものではない。
[0128] 標的 HCV感受性細胞又は組織は、哺乳動物細胞又は組織、好ましくはヒト細胞又 は組織、例えばヒト肝臓及びリンパ球系の細胞又は組織である。標的細胞又は組織 に対し、本発明のベクターを、 in vivo, in vitro或いは ex vivo条件下で作用させる。好 ましくは、ヒトの治療、例えば遺伝子治療、癌 (例えば肝臓癌、リンパ腫など)の治療な どのために、本発明のベクターを使用することができる。
[0129] 本明細書は本願の優先権主張の基礎とする日本国特許出願 2005-287825号の明 細書及び Z又は図面に記載される内容を包含する。
[0130] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願の全体が参照により本明 細書に組み入れられるものとする。
実施例
[0131] 以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。しかし、これらの実施例 は説明のためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
[0132] (実施例 1)
レブリコン保持細朐の作製
劇症肝炎の患者力 分離した C型肝炎ウィルスである JFH-1株 (遺伝子型 2a)のゲ ノム全長 cDNAを含む DNA (JFH- 1クローン： GenBankァクセッション番号 AB047639) を PUC19プラスミド中の T7プロモーターの下流に挿入した pJFHlから、構造領域と非 構造領域の一部を、ネオマイシン耐性遺伝子 (neo；ネオマイシンホスホトランスフェラ ーゼ遺伝子とも称する）及び EMCV-IRES (脳心筋炎ウィルスの内部リボゾーム結合 部位)で置換して、プラスミド DNA pSGR-JFHlを構築した（図 2の中段)。この構築手 順は、既報（Lohmann et al.， Science, (1999) 285, p. 110-113)に従った。
[0133] 具体的には、プラスミド pJFHlを制限酵素 Agel及び Clalで切断し、その切断部位に p JFH1由来の 5'NTRから Core領域におよぶ配列と pRSV5NEO由来のネオマイシン耐 性遺伝子とを PCR増幅により結合し制限酵素 Agelと Pmelで切断した断片、及び EMC V IRESから NS3領域におよぶ配列を PCR増幅により結合し制限酵素 Pmelと Clalで切 断した断片を、挿入し連結した。
[0134] 次に、 pSGR-JFHlを制限酵素 Xbalで切断した。次いで、これらの Xbal切断断片の それぞれ 10〜20 μ gを、 Mung Bean Nuclease 20ユニット（総反応液量 50 1)を用い て 30°Cで 30分間インキュベートして、さらに処理した。 Mung Bean Nucleaseは、二本 鎖 DNA中の一本鎖部分を選択的に分解する反応を触媒する酵素である。通常、上 記 Xbal切断断片をそのまま铸型として用いて RNA合成を行うと、 Xbalの認識配列の 一部である CTGAの 4塩基が 3'末端に余分に付加されたレプリコン RNAが合成されて しまう。そこで本実施例では、 Xbal切断断片を Mung Bean Nucleaseで処理することに より、 Xbal切断断片力も CTGAの 4塩基を除去した。この後、 Xbal切断断片を含む Mu ng Bean Nuclease処理後の溶液について、通常法に従ったタンパク質除去処理によ り、 CTGAの 4塩基が除去された Xbal切断断片を精製して、これを铸型 DNAとした。
[0135] 次に、この铸型 DNAから、 T7 RNAポリメラーゼを用いて RNAを in vitro合成した。こ の RNA合成には Ambion社の MEGAscriptを用いた。铸型 DNAを 0.5〜1.0 g含む反 応液 20 μ 1を製造業者の使用説明書に従って反応させた。
[0136] RNA合成終了後、反応溶液に DNase (2ユニット）を添加して 37°Cで 15分間反応させ た後、さらに酸性フエノールによる RNA抽出を行って、铸型 DNAを除去した。
[0137] この RNA (レプリコン RNA) 0.01ng〜10 μ gを Huh7細胞から抽出したトータル細胞性 R NAと混合して、 RNA総量が 10 gとなるように調整した。次いで、その混合 RNAをエレ タトロポレーシヨン法により Huh7細胞に導入した。エレクト口ポレーシヨン処理を行った Huh7細胞を培養ディッシュに播種し、 16時間から 24時間培養した後に、培養ディッシ ュに G418 (ネオマイシン)を様々な濃度で添加した。その後、週に 2回培養液を交換し ながら培養を継続した。上記の培養 21日後の培養ディッシュから生存細胞のコロニー をクローンィ匕し、培養を継続した。このようなコロニーのクロー-ングにより、細胞クロ ーンを複数株榭立することができた。 HCVサブゲノム RNAレプリコンを保有する一つ の細胞株を 1H4.1と名付けた。
[0138] また、 HCV遺伝子型 lbの Con-1株由来のゲノム全長 cDNAから上記と同様な方法 で作製された HCVサブゲノム RNAレプリコン（GenBankァクセッション番号: AJ242654 ；図 2の下段の I /NS3-3'/wt)が Huh7細胞株に導入されて作製された、該 RNAレプ
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リコンを保持している細胞株である 5- 15細胞（Lohmann et al., Science, (1999) 285, p . 110-113)も実験に使用した。
[0139] (実施例 2)
構浩タンパク皙発現ベクターの作製
1)構;告タンパク皙 現プラスミドベクター
劇症肝炎から分離した JFH1株（GenBankァクセッション番号 AB047639) (Kato T. et al., J. Med. Viol. 2001, 64:334-339)の構造領域遺伝子（塩基配列番号 249〜2781) を含む領域を PCRで増幅した。この DNA断片を Nhelと EcoRIで消化して得られる構造 遺伝子を含む断片をァガロースゲル電気泳動で精製し、 DNAポリメラーゼにて平滑 末端とした。この平滑末端化した cDNAをプラスミドベクター中の CAGプロモーター配 列（CAG)の下流に挿入した。同様に、前記 Nhelと EcoRIで消化して得られた構造領 域遺伝子を含む cDNAを、ェロンゲーシヨンファクター 1 α遺伝子プロモーター配列（E F—1 αプロモーター； Mizushima et. al., Nucleic Acids Res., 1990, 18, 5322)を持つ ベクターである pEF4/Myc- His (インビトロジェン社）の Spelと EcoRI間に挿入した。その 結果得られたプラスミドをそれぞれ pCAGC-p7JFHl、 pEF4C- p7JFHlと命名した（図 3
) o
[0140] 2)構造タンパク質を発現する組換えワクチニァウィルスベクター
JFH1株の構造遺伝子を含有し、それがコードするタンパク質を発現可能なベクター を作製するために、まず図 3上段に示した pEF4C- p7JFHlを制限酵素 BamHIと EcoRI で消化し、 Coreタンパク質、 E1タンパク質、 E2タンパク質及び p7タンパク質をコードす る領域をァガロースゲル電気泳動にて分取した。次にこの断片を、 目的とする外来遺 伝子と共に XGPRT遺伝子が挿入されるように設計されたヮクチ-ァウィルストランスフ ァーベクター pDIsgptmH5に連結した（Ohnishi, K. et al" Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005 ) p88- 94、 Ishii, K. et al" Virology 302 (2002) p.433- 444)。この pDIsgptmH5は、 pUc /DIsベクターのクロー-ングサイトに挿入されたヮクチ-ァウィルス p7.5プロモーター の制御下に大腸菌（Escherichia coli)のキサンチンーグァニンホスホリボシルトランス フェラーゼ (XGPRT)遺伝子が組み込まれたトランスファーベクターである（Ishii, K. et al. , Virology 302 (2002) p.433- 444)。得られたベクターを pDIsJFHstと名付けた。
[0141] H77c株の構造遺伝子を含有し、それがコードするタンパク質を発現可能であるべク ターを、以下の方法で作製した。まず H77c株の HCVゲノム cDNA (GenBankァクセッ シヨン番号 AF011751)をクローン化したベクターを铸型として、 LA-PCRキット（タカラ バイオ社）に添付されていた、 10 X緩衝液を 5 μ 1、 2.5mM dNTP混合液を 5 μ \, 10 μ 列番号 1)及び Η77 reverse (AAGAGCTCTCATAACCCGACAAGAACAACGCCGC C：配列番号 2)をそれぞれ 1 μ 1加え、最終的に脱イオン水を加え全量を 49 μ 1とした。 次に Takara LA Taq (タカラバイオ社）を 1 μ 1カ卩えてから、 PCR反応を行った。 PCR反 応は、 98°C20秒、 68°C5分からなる工程を 1サイクルとして 25サイクルの条件で行った 。この PCR産物の一部についてァガロースゲルにて電気泳動を行ったところ、約 2.5k bの増幅産物が確認された。
[0142] そこで、この PCR産物 1を用いて、増幅産物をプラスミドベクター中に連結するラ ィゲーシヨン反応を行った。このライゲーシヨン反応物を用いて常法に従 、大腸菌を 形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミド DNAを調製した。このプラスミド DNA に挿入された DNA断片を切り出すことのできる制限酵素で消化し、ァガロースゲル電 気泳動に供して、そのプラスミド DNAに約 2.5kbの DNA断片が挿入されていることを確 認した。挿入されている DNA断片の塩基配列は常法により決定した。その結果決定 された塩基配列は、 GenBankァクセッション番号 AF011751の塩基配列の 271番から 2 819番までの配列と一致していた。次いでこのプラスミド DNAを、 Bglllと Saclで消化し、 ァガロース電気泳動に供して、 H77c株の構造遺伝子領域を含む DNA断片を単離し 、ヮクチ-ァウィルストランスファーベクター pDIsgptmH5 (Ohnishi, K. et al. , Jap. J. Inf ect. Dis. 58 (2005) p88- 94、 Ishii, K. et al.， Virology 302 (2002) p433- 444)に連結し た。その結果得られたベクターを pDIsH77stと名付けた。
[0143] JI株の構造遺伝子を含有し、それがコードするタンパク質を発現可能であるべクタ 一を、以下の方法で作製した。 J1株の HCVゲノム cDNA(GenBankァクセッション番号 D89815)をクローン化したベクターを铸型として、 LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添 付されて 、た、 10 X緩衝液を 5 μ 1、 2.5mM dNTP混合液を 5 1、 10 Mのプライマー
Jl reverse (AAGAGCTCTCATAGACCTACAAAAACCCCGCCTCC：配列番号 3)を それぞれ 1 μ 1加え、最終的に脱イオン水をカ卩ぇ全量を 49 1とした。次に Takara LA T aq (タカラノィォ社)を 1 μ 1カ卩えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 98°C20秒、 6 8°C5分からなる工程を 1サイクルとして 25サイクルの条件で行った。この PCR産物の一 部についてァガロースゲルにて電気泳動を行ったところ、約 2.5kbの増幅産物が確認 された。そこで、この PCR産物 2 1を用いて、増幅産物をプラスミドベクター中に連結 するライゲーシヨン反応を行った。このライゲーシヨン反応物を用いて常法に従い大 腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミド DNAを調製した。このプラスミ ド DNAに挿入された DNA断片を切り出すことのできる制限酵素で消化し、ァガロース ゲル電気泳動に供して、そのプラスミド DNAに約 2.5kbの DNA断片が挿入されて!、る ことを確認した。挿入されている DNA断片の塩基配列は常法により決定した。その結 果決定された塩基配列は、 GenBankァクセッション番号 D89815の塩基配列の 271番 力 2819番までの配列と一致していた。次いでこのプラスミド DNAを、 Bglllと Sadで消 化し、ァガロース電気泳動に供して、 J 1株の構造遺伝子領域を含む DNA断片を単離 し、ヮクチ-ァウィルストランスファーベクター pDIsgptmH5 (Ohnishi, K. et al.， Jap. J. I nfect. Dis. 58 (2005) p88- 94、 Ishii, K. et al.， Virology 302 (2002) p.433- 444)に連 結した。その結果得られたベクターを pDIsJlstと名付けた。
[0144] J1株由来の Core遺伝子と JFH1株由来の El、 E2、 p7遺伝子とからなるキメラ構造遺 伝子配列を含有し、それらがコードするタンパク質を発現可能であるベクターを、以 下の方法で作製した。まず J1株の Core遺伝子を増幅するために、 J1株の HCVゲノム c DNA (GenBankァクセッション番号 D89815)をクローン化したベクターを铸型として、 L A- PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、 10 X緩衝液を 5 μ 1、 2.5mM dNTP 混合液を 5 1、 10 Μのプライマー H77/J1 forward (配列番号 1)及び J1/JFH1 revers
AACAGGACAG :配列番号 4)をそれぞれ 1 μ 1加え、最終的に脱イオン水を加え全量 を 49 μ 1とした。次に Takara LA Taq (タカラバイオ社）を 1 μ 1カ卩えてから、 PCR反応を 行った。 PCR反応は、 98°C20秒、 68°C5分力 なる工程を 1サイクルとして 25サイクル の条件で行った。 JFH1株の El、 E2、 p7遺伝子を増幅するために、 JFH1株の HCVゲ ノム cDNA (GenBankァクセッション番号 AB047639)をクローン化したベクターを铸型と して、 LA-PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、 10 X緩衝液を 5 μ 1、 2.5mM dNTP混合液を 5 1、 10 Μのプライマー J1/JFH1 forward (CTGTCCTGTTTGACCA
)及び JFH1 reverse (AAGAGCTCTCAATCAATATCAACAAACCCACGCCT：配列 番号 6)をそれぞれ 1 μ 1加え、最終的に脱イオン水を加え全量を 49 μ 1とした。次に Tak ara LA Taq (タカラバイオ社）を 1 μ 1カ卩えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 98 °C20秒、 68°C5分力 なる工程を 1サイクルとして 25サイクルの条件で行った。得られ たそれぞれの増幅断片を精製し、 1の H 0に溶かし、それぞれ 1 μ 1を 100倍希釈
2
して各 1 μ 1を 1つに混合した。この混合液をテンプレートとし、プライマーを加えずに 上記の条件で LA-PCRを 5サイクル行った。その後、プライマー H77/J1 forward (配列 番号 1)及び JFH1 reverse (配列番号 6)を添カ卩し、さらに LA-PCRを 10サイクル行い、 増幅したキメラ DNA断片を精製した。この断片をプラスミドベクターにクローンィ匕し、そ の DNA断片の塩基配列を決定した。その結果、その DNA断片が、 J1株由来の Core 遺伝子と JFH1株由来の El、 E2、 p7遺伝子とからなるキメラ構造遺伝子配列であること が確認された。次にこのプラスミドを Bglllと Sadで消化して得られる断片をヮクチ-ァ ウィルストランスファーベクター pDIsgptmH5 (Ohnishi, K. et al, Jap. J. Infect. Dis. 58
(2005) p88- 94、 Ishii, K. et al., Virology 302 (2002) p433- 444)に連結した。その結 果得られたベクターを pDIsJl(c)/JFHl(El- p7)stと名付けた。
JFH1株由来の Core遺伝子と J1株由来の El、 E2、 p7遺伝子とからなるキメラ構造遺 伝子配列を含有し、それらがコードするタンパク質を発現可能であるベクターを、以 下の方法で作製した。まず JFH1株の Core遺伝子を増幅するために、 JFH1株の HCV ゲノム cDNA (GenBankァクセッション番号 AB047639)をクローン化したベクターを铸 型として、 LA- PCRキット（タカラバイオ社）に添付されていた、 10 X緩衝液を 5 1、 2.5 mM dNTP混合液を 5 1、 10 Μのプライマー JFH1 forward (AAAGATCTGCGAAAG GCCTTGTGGTACTGC：配列番号 7)及び JFH1/J1 reverse (GGTATATCCCGGAC 号 8)をそれぞれ 1 μ 1加え、最終的に脱イオン水を加え全量を 49 μ 1とした。次に Takar a LA Taq (タカラバイオ社）を 1 μ 1カ卩えてから、 PCR反応を行った。 PCR反応は、 98°C2 0秒、 68°C5分力 なる工程を 1サイクルとして 25サイクルの条件で行った。 J1株の El、 E2、 p7遺伝子を増幅するために、 J1株の HCVゲノム cDNA (GenBankァクセッション番 号 D89815)をクローン化したベクターを铸型として、 LA-PCRキット（タカラバイオ社）に 添付されて 、た、 10 X緩衝液を 5 μ 1、 2.5mM dNTP混合液を 5 1、 10 Mのプライマ
CAACGTGTCCGGGATATACC：配列番号 9)及び Jl reverse (AAGAGCTCTCATA GACCTACAAAAACCCCGCCTCC :配列番号 3)をそれぞれ 1 μ 1加え、最終的に脱 イオン水を加え全量を 49 μ 1とした。次に Takara LA Taqを 1 μ 1カ卩えてから、 PCR反応 を行った。 PCR反応は、 98°C20秒、 68°C5分力 なる工程を 1サイクルとして 25サイク ルの条件で行った。得られたそれぞれの増幅断片を精製し、 50 1の H 0に溶かし、
2
それぞれ 1 μ 1を 100倍希釈して各 1 μ 1を 1つに混合した。この混合液をテンプレートと し、プライマーをカ卩えずに上記の条件で LA-PCRを 5サイクル行った。その後、プライ マー JFH1 forward (配列番号 7)及び J 1 reverse (配列番号 3)を添カ卩し、さらに LA- PC Rを 10サイクル行い、増幅したキメラ DNA断片を精製した。この断片をプラスミドベクタ 一にクローン化し、その DNA断片の塩基配列を決定した。その結果、その DNA断片 が、 JFH1株由来の Core遺伝子と J1株由来の El、 E2、 p7遺伝子とからなるキメラ構造 遺伝子配列であることが確認された。次にこのプラスミドを Bglllと Sadで消化して得ら れる断片をヮクチ-ァウィルストランスファーベクター pDIsgptmH5 (Ohnishi, K. et al, Jap. J. Infect. Dis. 58 (2005) p88- 94、 Ishii, K. et al., Virology 302 (2002) p433- 444 )に連結した。その結果得られたベクターを pDIsJFH(c)/Jl(El- p7)stと名付けた。 [0146] 上記のようにして作製したベクター pDIsJFHst、 pDIsH77st、 pDIsJlst、 pDIsJl(c)/JF H(E1- p7)st、及び pDIsJFH(c)/Jl(El- p7)stに挿入されている HCV構造遺伝子配列（ キメラ構造遺伝子配列）のマップを図 4に示した。
[0147] 上記の各ベクターを有する組換え型ヮクチ-ァウィルスベクター DIs株は、例えば、 以下のように作製し、選択した。
[0148] ヮクチ-ァウィルス DIs株約 106 plu (plaque forming unit)を含む 500 μ 1のウィルス液 を、 CEF (chick embryo fibroblast)細胞約 107個が播かれた 80mmシャーレに接種し、 1 5分ごとに 8回震盪することによりウィルスを細胞に感染させた。その後、 1mlの 10%FCS (fetal calf serum)を含む DMEM (Dalbecco- modified Eagle培地）を加え、 37。C、 5%CO 条件下にて 2時間培養した。培地を取り除き、 PBS (phosphate-buffered serine)で洗
2
浄して力 0.05%トリプシン溶液 0.5mlをカ卩え、細胞を遊離させた後、細胞懸濁液を 200 Orpmで 3分遠心して細胞を回収し、 1の PBSに懸濁した。この細胞懸濁液に上記 トランスファーベクター 10 gを溶解し、 Gene Pulser II (Bio Rad社）を用いて 0.4cmキュ ベット中、 250v、 500 FDで 1回電圧をかけ電気穿孔法を行った。細胞を 10%FCSを 含む DMEM 2mlに懸濁し、 35mmシャーレに播いて 37°C、 5%CO条件下にて 7日間培
2
養した。感染細胞を培地とともに回収し、凍結乾燥を 3回、超音波処理を 2分行った 後、同じ培地で 10、 100、 1000倍希釈した。 35mmシャーレに 106個の細胞を播き、培 地（10%FCSを含む DMEM)に MPA、キサンチン（xantine)、ヒポキサンチン（hypoxantin e)をそれぞれ 25 μ g/ml、 250 μ g/ml、 15 μ g/ml添カ卩してー晚培養した後、上記の希 釈細胞液を接種した。 15分ごとに 8回震盪することによりウィルスを細胞に感染させ、 希釈細胞液を除いてから、 1%軟寒天添加培地（10%FCSを含む DMEM、 MPA、キサ ンチン、ヒポキサンチンを含む） 2mlを加え、固化させてから 37°C、 5%CO条件下にて 7
2
日間培養した。形成されたプラーク部分をパスツールピペットでピックアップし、 200 ^ 1の 10%FCSを含む DMEMに懸濁し、 2分間超音波処理を行ってウィルスを寒天より放 出させた。この培養液を同じ培地で 10、 100、 1000倍希釈し、上記と同様のプラークァ ッセィ操作をさらに 2回繰り返して組換えウィルスを純ィ匕した後、 CEF細胞に感染させ てスケールアップを行った。
[0149] 以上のようにして pDIsJFHst、 pDIsH77st、 pDIsJlst、 pDIsJl(c)/JFH(El— p7)st、 pDIsJ FH(c)/Jl(El- p7)stからそれぞれ作製されたウィルスベクター (組換えウィルス様粒子 )を、 DIsJFHst、 DIsH77st, DIsJlst、 DIsJl(c)/JFH(El— p7)stゝ DIsJFH(c)/Jl(El— p7)st と名づけた。
[0150] (実施例 3)
レブリコン保持細胞への構造蛋白質発現ベクター導入と構造タンパク質の産牛. レブリコン保持細胞で HCV構造タンパク質を発現させるため、実施例 2で作製した HCV構造タンパク質発現ベクター pCAGC- p7JFHl又は pEF4C- p7JFHlをリボフエタ シヨン法等によりレブリコン保持細胞に導入した。さらに実施例 2で作製した HCV構造 タンパク質を発現するウィルスベクター DIsJFHst、 DIsH77st、 DIsJlst、 DIsJl(c)/JFH( El- p7)st又は DIsJFH(c)/Jl(El- p7)stをレプリコン保持細胞に感染させた。
[0151] ί)構;告タンパク皙 現プラスミドベクターの 人
pCAGC- p7JFHlをリポフエクシヨン法にてレプリコン保持細胞 5-15に導入後、 8mlの 培養液にて培養を続け、 4日後に培養上清を回収し、 HCV Coreタンパク質の測定を 行ったが、検出限界以下であった。
[0152] 一方、 pEF4C- p7JFHlをリボフヱクシヨン法にてレプリコン保持細胞 IH4.1に導入した 。その結果、ウェスタンブロット法で、その培養上清に、 HCV Coreタンパク質を検出 することができた。そこで、 pEF4C- p7JFHlを導入したレプリコン保持細胞 IH4.1を 4日 間培養後、培養液 (8ml)を回収し、 8,000gで 60分間、 4°Cにて間遠心し、培養上清を 集めた。次にこの上清を SW20ローター（ベックマン）にて 25,000rpm、 4時間、 4°Cにて 遠心し、ペレットを lmlのバッファーにサスペンドした。サンプルを SW41Eローター（ベ ックマン)用のチューブで作製した 10〜60%ショ糖密度勾配に重層し、 35,000回転で 1 6時間 4°Cにて遠心した。 10〜60%ショ糖密度勾配は、 60% (重量/重量)ショ糖溶液 (50 mM Tris pH7.5/0.1M NaCl/lmM EDTAに溶解） 2ml、 50%ショ糖溶液 lml、 40%ショ糖 溶液 lml、 30%ショ糖溶液 lml、 20%ショ糖溶液 lml、 10%ショ糖溶液 lmlを遠心チューブ に重層することにより調製した。
[0153] 遠心終了後、チューブの底力 0.5mlずつ画分を回収した。各画分の密度、 HCV C oreタンパク質濃度及び RNA濃度を定量した。 HCV Coreタンパク質の測定はォーソ HCV抗原 IRMAテストを用いて行った（Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol., 37(1999) p.l 802-1808)。 HCVのレプリコン RNAの定量は Takeuchi (Takeuchi et al., Gastroenterol ogy 116 (1999) p.636- 642)に従った。図 5に示すように、 2回の実験で、レプリコン RN Aと Coreタンパク質のピークはいずれも画分 8にあり両者は一致した。この画分の密 度は約 1.17g/mlであり、報告されている HCV粒子の密度と一致した。このことからウイ ルス粒子が産生されたことが示された。
[0154] 2) HCV構造タンパク質発現組換え卑』ワクチニァウィルスベクターの導入
レプリコン保持細胞株 5- 15を 10cmのディッシュに 2 X 106個播き、翌日、 0.5pfo (plaqu e forming units) /cellの DIsJFHstをレプリコン保持細胞株に感染させた。 8mlの培養液 にて培養を続けた。 4日間培養後、培養液を回収し、 8,000gで 60分間、 4°Cにて遠心 し、培養上清^^めた。次にこの上清を SW20ローター（ベックマン）にて 25,000rpm、 4 時間、 4°Cにて遠心し、細胞培養液 8ml分のペレットを lmlの 0.2%の NP40を含有バッフ ァー及び不含バッファ一にて懸濁した。 4°Cにて 20分間インキュベーションし、サンプ ルを SW41Eローター（ベックマン）用のチューブで作製した 10〜60%ショ糖密度勾配に 重層し、 35,000回転で 16時間 4°Cにて遠心した。 10〜60%ショ糖密度勾配は、 60% (重 量/重量）ショ糖溶液（50mM Tris pH7.5/0.1M NaCl/lmM EDTAに溶解） 2ml、 50%シ ョ糖溶液 lml、 40%ショ糖溶液 lml、 30%ショ糖溶液 lml、 20%ショ糖溶液 lml、 10%ショ糖 溶液 lmlを遠心チューブに重層することで作製した。
[0155] 遠心終了後、チューブの底力 画分を 0.5mlずつ回収した。各画分の密度、 HCV C oreタンパク質濃度を定量した。 HCV Coreタンパク質の測定はォーソ HCV抗原 IRMA テストを用いて行った（Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol., 37(1999) p.1802- 1808)。
[0156] 2回の独立した実験結果を図 6に示した。 NP40非処理群（PBS処理)では、コアタン パク質を含有する粒子の密度（density)が 1.16g/ml (画分 7)、 NP40処理した群では、 コアタンパク質を含有する粒子の密度が 1.21g/ml (画分 9)となった。このことは、脂質 を含み比重の軽 、表面膜が NP40によりウィルス粒子力も剥離して、ウィルス様構造 を保持していない核酸と Coreタンパク質のみの Core粒子となり、比重が重くなつたも のと考えられた。このことから、本実験系で、完全なウィルス粒子が産生されたことが 示唆された。
[0157] さらに、レプリコン保持細胞株 5- 15に、ウィルスベクター DIsJlst、 DIsJl(c)/JFH(El- p7)st、又は DIsJFH(c)/Jl(El-p7)stを、それぞれ上記と同様にして感染させた。感染 後、 4日間培養した上清 8mlを限外濾過膜にて濃縮し、上記に記載したショ糖密度勾 配遠心法にて分画した。各画分の密度、 HCV Coreタンパク質濃度を定量した。 HCV Coreタンパク質の密度分布パターンから、 DIsJlst、 DIsJl(c)/JFH(El- p7)st、又は DIs JFH(c)/Jl(El-p7)stを感染させた培養上清には産生されたウィルス様粒子が含まれ ることが示された。
[0158] (実施例 4)
組椽ぇ型 HCV様粒子の感染能の確認
上記実施例で作製した組換え型 HCV粒子は図 1に示すように、薬剤耐性マーカー として neo遺伝子を持っている。したがって、実施例 3で得られた粒子に感染能がある かを確認するためには、本粒子を Huh7細胞に感染させ、 G418 (ネオマイシン)耐性コ ロニーが得られるかを調べればょ 、。
[0159] レブリコン保持細胞株 5- 15に DIsJFHstを感染させて 4日間培養して得た培養上清 を限外濾過膜 (cut off 1 X 105 Da)にて 30倍に濃縮し、 Huh7細胞に感染させた。感染 後、培養ディッシュに G418を lmg/mlで添加した。その後、週に 2回培養液を交換しな 力 Sら培養を継続した。播種時から 21日間培養した後、クリスタルバイオレットで生存細 胞を染色した。その結果、コロニー形成が確認できた。
[0160] 感染細胞中に HCV構造タンパク質が検出されなければ、感染細胞では子粒子が 産生されていないことになる。従って、本実験で形成されたコロニーを増殖させ、その 細胞抽出液を調製した。次いで、これらの抽出液中のタンパク質を SDS-PAGE及びゥ エスタンプロット法により解析した。解析にあたって、 Core遺伝子を含む発現プラスミ ド DNAを Huh7細胞に一過性にトランスフエクシヨンして得られた細胞抽出液を陽性対 照とした。さらに、トランスフエクシヨンしていない Huh7細胞力 得られた細胞抽出液を 陰性対照とした。それぞれの細胞クローン力 抽出した試料を SDS-PAGEを行った後 、 PVDF膜（Immobilon- P ,Millipore社製）にブロッテイングし、抗 Core特異的抗体（ク ローン 2H9抗体）とこれらの抗体を認識する HRP標識 2次抗体を用いて、 ECL (アマシ ャムフアルマシア社）にて細胞内で翻訳された Coreタンパク質を分析した結果、感染 細胞にコアタンパク質を検出できな力つた。従って、感染細胞では子ウィルス粒子は 生産されていないと判断した。このことは、本発明の方法で作製した組換え HCV様粒 子は、ー且他の細胞に感染した後はさらに粒子として再産生されず、従って他の細 胞にそれ以上感染を広げる能力（伝搬力）を持たないことを意味している。
産業上の利用可能性
[0161] 本発明によって、所望の外来遺伝子を含む HCVサブゲノム RNAをパッケージングし た伝搬性のない組換え型感染性 HCV様粒子とその製造方法を提供することが可能 となった。このような組換え型感染性 HCV様粒子は、伝搬性が欠如しているという利 点を有するために、哺乳動物、特にヒトの肝臓やリンパ球系の細胞又は糸且織への in V ivo又は ex vivo遺伝子導入を介する遺伝子治療に使用することができるし、或いはト ランスジェニック動物を作製するためのウィルスベクターとして、さらには弱毒化ヮクチ ンとして使用することができる。
配列表フリーテキスト
[0162] 配列番号 1〜9の配列はプライマーを示す。

Claims

請求の範囲
[1] 組換え型 c型肝炎ウィルス様粒子を産生する方法であって、
(i)遺伝子型 la、 lb、 2a、 2b、 3a及び 3bの C型肝炎ウィルス株力 なる群力 選択され る少なくとも 1種類のウィルス株に由来するゲノム RNA上の、 5'非翻訳領域と、 NS3タ ンパク質、 NS4Aタンパク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタンパク質及び NS5Bタンパク質 をコードする塩基配列と、 3'非翻訳領域とを含む塩基配列を含む RNAレブリコンを保 持する細胞に、
(ii)遺伝子型 la、 lb、 2a、 2b、 3a及び 3bの C型肝炎ウィルス株力 なる群力 選択され る少なくとも 1種類のウィルス株であって上記 (i)と同じ又は異なる C型肝炎ウィルス株 由来の Coreタンパク質、 E1タンパク質、 E2タンパク質及び p7タンパク質を発現するべ クタ一を導入し、
該細胞を培養し、産生されたウィルス様粒子を回収することを含む、前記方法。
[2] 前記 (i)の遺伝子型 lbの C型肝炎ウィルス株が conl株であり、前記 (i)の遺伝子型 2 aの C型肝炎ウィルス株が JFH1株である、請求項 1に記載の方法。
[3] 前記 (ii)の遺伝子型 laの C型肝炎ウィルス株が H77c株、 1株、 H株、及び HC-J1株 である、請求項 1に記載の方法。
[4] 前記 (ii)の遺伝子型 lbの C型肝炎ウィルス株が J1株、 conl株、 TH株、 J株、 JT株、 及び BK株である、請求項 1に記載の方法。
[5] 前記 (ii)の遺伝子型 2aの C型肝炎ウィルス株が JFH1株、 HC-J6株、 JCH1株、及び J
6CF株である、請求項 1に記載の方法。
[6] 前記（ii)の遺伝子型 3aの C型肝炎ウィルス株が NZL1株、 K3a/650株、 452株、及び
E-bl株である、請求項 1に記載の方法。
[7] 前記 (ii)の遺伝子型 3bの C型肝炎ウィルス株が Tr株である、請求項 1に記載の方法
[8] 前記（ii)のベクターがヮクチ-ァウィルスベクターまたは EF-1 aプロモーター含有 ベクターである、請求項 1に記載の方法。
[9] 前記 RNAレプリコンカ 少なくとも 1つの内部リボゾーム結合部位（IRES)配列及び
Z又は少なくとも 1つの外来遺伝子をさらに含む、請求項 1に記載の方法。
[10] 前記 IRES配列及び Z又は外来遺伝子が、前記 5'非翻訳領域と前記 NS3タンパク質 コード配列との間に位置する、請求項 1に記載の方法。
[11] 前記細胞が動物細胞である、請求項 1に記載の方法。
[12] 前記動物細胞が、 Huh7細胞、 HepG2細胞またはそれらの細胞力 派生した株化細 胞である、請求項 11に記載の方法。
[13] 請求項 1に記載の方法によって産生される、感染性を有しているが伝搬力を有しな
V、組換え型 C型肝炎ウィルス様粒子。
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