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WO2007034843A1 - 多孔質基盤体とその製造方法並びに多孔質基盤体の使用方法 - Google Patents

多孔質基盤体とその製造方法並びに多孔質基盤体の使用方法 Download PDF

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WO2007034843A1
WO2007034843A1 PCT/JP2006/318651 JP2006318651W WO2007034843A1 WO 2007034843 A1 WO2007034843 A1 WO 2007034843A1 JP 2006318651 W JP2006318651 W JP 2006318651W WO 2007034843 A1 WO2007034843 A1 WO 2007034843A1
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WO
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porous
porous substrate
bioabsorbable
cells
substrate according
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Application number
PCT/JP2006/318651
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English (en)
French (fr)
Inventor
Guoping Chen
Tetsuya Tateishi
Junzo Tanaka
Original Assignee
National Institute For Materials Science
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Publication date
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Priority to US11/992,216 priority patent/US8673640B2/en
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    • Y10T156/10—Methods of surface bonding and/or assembly therefor

Definitions

  • Porous substrate Method for producing the same, and method of using the porous substrate
  • the present invention relates to a porous substrate having pores for seeding cells, a method for producing the same, and a method for using the porous substrate. More specifically, the present invention relates to the repair of biological tissues such as bone, cartilage, ligament, skin, blood vessels, spleen, liver, etc. due to diseases or accidents.
  • the present invention relates to a porous substrate that can be seeded with cells that are divided into organs and tissue, a method for producing the same, and a method for using the porous substrate.
  • the third method is to directly embed the porous substrate when it is damaged and induce the invasion of neighboring cells into the porous substrate to induce the formation of a new tissue. Therefore, a porous substrate that induces and promotes the formation of biological tissue and maintains the morphology of the biological tissue plays a very important role.
  • biocompatibility as a property that does not affect the living body and new living tissue are formed.
  • bioresorbability that is decomposed and absorbed, and appropriate mechanical strength are required.
  • bioabsorbable polymers such as polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), a copolymer of lactic acid and darlicolic acid (PLGA), and collagen have been used as such a substrate.
  • PLA polylactic acid
  • PGA polyglycolic acid
  • PLGA copolymer of lactic acid and darlicolic acid
  • collagen have been used as such a substrate.
  • porous materials are often used (for example, JP 2003-10309 A).
  • Osteoarthritis is a disease frequently seen in the field of orthopedics and often causes a high degree of dysfunction.
  • Artificial joint surgery is the mainstream of surgical treatment, but prosthetic joint parts made of current metals and polymer polymers have the same problems of infection, wear, loosening, and damage as described above.
  • tissue transplantation there are still problems of donor shortage and rejection based on immune responses. Due to the existence of such various problems, it is considered that a regenerative medical treatment method is now ideal, and research on cartilage tissue regeneration has been actively conducted.
  • chondrocytes! / As a scaffold for the growth of stem cells that can be separated into chondrocytes, A three-dimensional porous substrate is required as a support for living tissue.
  • the central part and the surface layer of the conventional porous substrate have almost the same porous structure, and the seeded cells do not stay in the porous substrate, and most of them are Passing through gaps and cracks larger than the size of the cell, the surrounding force of the porous material has also leaked. For this reason, it is extremely difficult to efficiently seed chondrocytes or stem cells that can differentiate into chondrocytes on a cultured porous substrate, and an effective cell seeding rate cannot be obtained. These cells cannot be accumulated in a large amount in the cultured porous substrate, which adversely affects the regeneration of the cartilage tissue.
  • the present invention that solves such a conventional problem suppresses cell leakage, allows cells to be seeded with high efficiency, and can adhere even to cells that are difficult to adhere. It is an object to provide a base body, a method for manufacturing the base body, and a method for using the porous substrate.
  • the present invention provides a porous substrate having good biocompatibility and adapted to the regeneration of each tissue in several adjacent tissues, a method for producing the same, and a porous substrate. Providing usage is also an issue.
  • a porous substrate having pores for seeding cells wherein a porous membrane having pores smaller than the cells is disposed on the outer peripheral surface of a porous main body having pores for seeding cells.
  • porous substrate according to any one of (1) to (3), wherein the porous film is a bioabsorbable substance or a non-bioabsorbable substance.
  • porous substrate which is formed by laminating a membrane-like porous body on a substrate.
  • the bioabsorbable substance is at least a bioabsorbable synthetic polymer, a bioabsorbable natural polymer, a cell growth factor, a cell differentiation regulator, and these.
  • porous substrate of the above (10) is laminated by laminating, inclusion, coating, granular or block contact, solid or planar pattern contact, or a combination of two or more thereof. ! /, A porous substrate characterized by
  • each layer constituting the multilayer structure is composed of a porous structure such as composition, porosity, pore size and pore connectivity, and mechanical properties.
  • the main constituent is a bioabsorbable synthetic polymer, a bioabsorbable natural polymer, a cell growth factor, a cell differentiation regulator, And a porous group having at least one selected from the group power of these derivatives.
  • At least one layer of the multilayer structure is composed of a bioabsorbable synthetic polymer, a bioabsorbable natural polymer, a cell.
  • a porous substrate characterized by comprising at least one selected from a growth factor, a cell differentiation controlling factor, and a group force consisting of derivatives thereof.
  • a structure in which the main body is covered with a porous membrane having pores smaller than the size of the cell is adopted, so that cells seeded on the main body spill out to the outside. There is no fear, tissue regeneration can be accelerated, and regenerative cells can be seeded extremely efficiently.
  • the present invention by providing a multilayer structure, it is possible to regenerate a multilayered biological tissue 'organ such as bone, cartilage, ligament, skin, blood vessel, spleen, liver, etc. Therefore, it can be greatly expected to be applied to the treatment of diseases such as cartilage, ligaments, skin, blood vessels, spleen, and liver.
  • FIG. 1 is a view showing a representative example 1 of a cylindrical porous substrate having a multilayer structure covered with a porous film.
  • FIG. 2 is a diagram showing a representative example 2 of a cylindrical porous substrate having a multilayer structure covered with a porous film.
  • FIG. 3 is a diagram showing a representative example 3 of a cylindrical porous substrate having a multilayer structure covered with a porous film.
  • FIG. 4 is a view showing a cylindrical porous substrate having a single porous structure covered with a porous membrane.
  • FIG. 5 is a diagram showing a cubic porous substrate having a single porous structure covered with a porous membrane.
  • FIG. 6 Electron micrographs of the periphery (top) and center (bottom) of a composite porous body with a multilayered structure of collagen sponge ZPLGA—collagen composite sponge formed in a cylindrical frame of polyethylene and nylon mesh.
  • FIG. 7 Electron micrographs of the periphery (upper) and center (lower) of a porous substrate composed of a collagen sponge formed in a cylindrical frame of polyethylene and nylon mesh.
  • FIG. 8 shows a histologically stained photograph of cartilage tissue regenerated by culturing bone marrow-derived mesenchymal stem cells on a porous substrate.
  • A Hematoxylin and eosin staining
  • B afranin-O staining
  • C Toluidine blue staining.
  • the porous substrate capable of supporting and culturing cells in the present invention is composed of a main body and a porous membrane.
  • the porous membrane is smaller than the size of the cell and has pores with dense pores.
  • the porosity of the porous membrane is preferably 10 to 99%, and the most desirable porosity is 30 to 99%.
  • the pore size of the porous membrane is smaller than that of cells, and the most desirable pore size of 0.1-30 / ⁇ ⁇ is 0.45-10 / ⁇ ⁇ . Due to the pores having such a size, when the cell suspension is dripped onto the porous substrate, it becomes possible to reach cells that enter the inside of the porous substrate. Further, the shape of the regenerated tissue can be maintained by such a porous membrane.
  • the material of the porous membrane can be a bioabsorbable polymer or a non-bioabsorbable polymer such as nylon mesh or sponge.
  • bioabsorbable polymer examples include polylactic acid, polydaricolic acid, a copolymer of lactic acid and glycolic acid, poly ⁇ -strength prolatatone, polyesters such as these copolymers, cellulose, and polyalginic acid. Examples thereof include saccharides.
  • non-absorbable polymer examples include nylon, polyethylene, polypropylene, and polystyrene. Among them, the bioabsorbable polymer preferably used in the present invention is, for example, polylactic acid, a copolymer of lactic acid and glycolic acid, poly ⁇ -strength prolatatone, or a copolymer thereof, which is a non-bioabsorbable polymer. Is nylon.
  • the main body is covered with a porous membrane, but the inlet portion for seeding the cells is not covered with the porous membrane.
  • the porous film may have a multilayer structure of two or more layers. In the case of two or more layers, the innermost layer has a porous structure. Any structure may be used, but all layers may have a porous structure.
  • the innermost membrane functions to prevent cell leakage by being in close contact with the main body formed at the center.
  • the main body preferably has a frame-like or cage-like skeleton.
  • the porous substrate of the present invention is configured by disposing a porous film on the outer peripheral surface along the shape of the frame-like or cage-like skeleton.
  • the size and shape of this skeleton can be molded in accordance with the size and shape of tissue such as cartilage tissue to be regenerated.
  • the size and shape of the skeleton are determined in consideration of the thickness and curve of the cartilage tissue to be regenerated.
  • the outer size and shape of the skeleton are the same as the thickness and curve of the regenerated cartilage tissue.
  • the inner size and shape of the skeleton are made the same as the thickness and curve of the cartilage tissue to be regenerated.
  • the inside of these skeletons is filled with a porous body having pores of a size capable of seeding cells.
  • a porous material at least one selected from the group consisting of a bioabsorbable synthetic polymer, a bioabsorbable natural polymer, a cell growth factor, a cell fraction regulator, and a derivative power thereof is used. it can.
  • the porous body has a function of supporting cell adhesion as a scaffold for cell adhesion, and promoting cell proliferation, differentiation, extracellular matrix secretion, and tissue regeneration.
  • This porous body is closely connected to a frame-like or cage-like skeleton on which a membrane having a porous structure is arranged, and the two are not separated in the process of cell seeding and cell culture.
  • bioabsorbable synthetic polymer constituting the porous body examples include polylactic acid, polyglycolic acid, a copolymer of lactic acid and glycolic acid, poly ⁇ -strength prolatatone, and copolymers thereof.
  • polyester examples include polysaccharides such as cellulose and polyalginic acid.
  • the bioabsorbable synthetic polymer preferably used in the present invention is polylactic acid, polydaricolic acid, a copolymer of lactic acid and glycolic acid, poly ⁇ -one strength plutathon, and a copolymer thereof.
  • the bioabsorbable natural polymer constituting the porous body can be used as long as it is naturally occurring or derived from the living body and exhibits biocompatibility.
  • Hyaluronic acid, proteoglycan, Ryodarlican, chondroitin sulfate, gelatin, fibronectin, laminin and the like, and particularly collagen is preferably used.
  • a bioabsorbable natural polymer is superior to a bioabsorbable synthetic polymer in that the porosity and cell seeding rate are higher.
  • bioabsorbable synthetic polymers have higher mechanical strength than bioabsorbable natural polymers. Therefore, the porous substrate of the present invention is appropriately combined with a substrate having an appropriate porosity, cell seeding rate, and mechanical strength by combining a bioabsorbable natural polymer and a bioabsorbable synthetic polymer. can do.
  • the bioabsorbable synthetic polymer may be the innermost layer, and a bioabsorbable natural polymer may be laminated on the innermost layer.
  • the cell growth factor and the cell differentiation control factor constituting the porous body any one can be used as long as it can control the growth and differentiation of cells, but epidermal growth factor (EGF), Insulin, platelet-derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), ⁇ -type transforming growth factor (TGF—j8), osteogenic factor
  • EGF epidermal growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • TGF—j8 ⁇ -type transforming growth factor
  • osteogenic factor One or more selected from a powerful group such as (BMP) and dexamethasone, or derivatives thereof can be used.
  • the pores of the porous body serve as a scaffold for adhesion, proliferation and tissue regeneration of the seeded cells, and the pores are preferably continuous.
  • the size is 1 to: LOOO / z m, preferably about 20 to 400 ⁇ m.
  • the thickness of the porous body may be appropriately determined depending on the use mode of the biocomposite material, but is usually 0.1 to: LOOmm, preferably 0.1 to 50mm. is there.
  • the diameter, width, or depth is usually 0.1 to 100 mm, preferably 0.1 to 50 mm.
  • the porosity is usually 50 to 99.9%, preferably 90 to 99.9%.
  • porous substrate having a multilayer structure of the present invention specifically, for example, for example, (1) porous (mesh, sponge, etc.) of a bioabsorbable polymer or non-bioabsorbable polymer, a porous cylinder (see Fig. 4), or a rectangular parallelepiped or cube (Fig. (2) have a dense porous structure of a bioabsorbable polymer or a non-bioabsorbable polymer on the inner and bottom surfaces of this cylindrical, cuboid or cubic shape.
  • bioabsorbable natural polymer After pasting the film with heat, glue, organic solvent, etc., (3) bioabsorbable natural polymer, cell growth factor, cell sorting factor or their derivatives, at least 1 It is obtained by placing a solution of more than one species, and (4) freeze-drying, and preferably crosslinking by treating with a gaseous or liquid crosslinking agent, heat.
  • the dipping method is effective when the concentration and viscosity of the aqueous solution of a bioabsorbable natural polymer, cell growth factor, cell differentiation factor, or a derivative thereof are low, specifically, the bioabsorbable natural polymer.
  • a porous body of a bioabsorbable polymer or a non-bioabsorbable polymer such as a mesh or a sponge
  • a porous cylindrical body Alternatively, it is performed by immersing a porous cuboid or cube.
  • bioabsorbable polymer or non-bioabsorbable polymer porous body (mesh, sponge, etc.), porous cylindrical body, or porous rectangular parallelepiped or cube It is filled with a low-concentration aqueous solution of a functional natural polymer, a cell growth factor, a cell density regulator, or a derivative thereof.
  • crosslinking agent used in the present invention any conventionally known crosslinking agent can be used.
  • the cross-linking agent that is preferably used is the ability to use aldehydes such as dartalaldehyde, formaldehyde, paraformaldehyde. Particularly preferred is dartalaldehyde.
  • the crosslinking in the present invention is preferably performed using the crosslinking agent in a gaseous state. Specifically, when cross-linking a porous body made of a bioabsorbable natural polymer, the cross-linking agent vapor is saturated for a certain period of time at a constant temperature and in a cross-linking agent vapor saturated with an aqueous solution thereof. Perform cross-linking.
  • the crosslinking temperature may be selected within a range in which the porous body made of the bioabsorbable polymer does not dissolve and vapor of the crosslinking agent can be formed. .
  • the cross-linking time depends on the type of cross-linking agent and the cross-linking temperature, it does not hinder the hydrophilicity and bioabsorbability of the natural polymer porous body, and does not dissolve during biotransplantation. It is desirable to set it within a range where a stable bridge fixing is performed.
  • the cross-linking time is shortened, the cross-linking immobilization becomes insufficient, and there is a possibility that the porous body made of a bioabsorbable natural polymer is dissolved in a living body after transplantation, and the longer the cross-linking time is, the more the cross-linking takes place
  • the cross-linking time is too long, the hydrophilicity becomes low, the seeding density of the osteogenic cells and chondrogenic cells to the scaffold material becomes low, and cell breeding and tissue regeneration are efficiently performed. This is preferable because it causes problems such as a decrease in bioabsorbability.
  • the crosslinking time is about 10 minutes to 12 hours.
  • the porous substrate of the present invention can also be used as a cell scaffolding material, that is, a culture carrier, by seeding various kinds of cells and a seeding cell solution containing cells.
  • cells can be cultured by carrying the cells, and the cells can be transplanted directly to a living body to obtain a regenerative transplant that can be used for medical treatment.
  • the cells to be cultured are not particularly limited.
  • animal-derived, plant-derived and microorganism-derived cells can be cultured, and animal-derived cells are preferred, and mammal-derived cells are particularly preferred.
  • animal-derived cells are preferred, and mammal-derived cells are particularly preferred.
  • mammals can be used as mammals.
  • the cells in the present invention may be cultured cells of any origin other than the above-described cells.
  • cells derived from different species or fused cells of cells and non-cells such as collagen gel membrane, silk thread, nylon mesh, etc. may be used.
  • tissues and organs such as animal liver, heart, kidney, skin, bone, cartilage, bone marrow, blood vessels, and tissues formed derived from these exemplified tissue forces are included. It may be a tissue-derived cell, or may be a primary cell or a cell line.
  • primary cells in animal cells include: -bird embryo derived cells (PSG), rat primary cardiomyocytes, rat primary hepatocytes, mouse primary bone marrow cells, porcine primary hepatocytes, rabbit vascular endothelial cells, human primary cells Navel Examples thereof include blood cord cells, human primary bone marrow hematopoietic cells, human primary nerve cells such as dorsal root ganglion cells (DRG), and the like.
  • PSG -bird embryo derived cells
  • rat primary cardiomyocytes rat primary hepatocytes
  • mouse primary bone marrow cells porcine primary hepatocytes
  • rabbit vascular endothelial cells human primary cells Navel
  • human primary cells Navel examples thereof include blood cord cells, human primary bone marrow hematopoietic cells, human primary nerve cells such as dorsal root ganglion cells (DRG), and the like.
  • DRG dorsal root ganglion cells
  • cell lines for example, Chinese, mustar ovary cell-derived HO cells, human eclampsia-derived HeLa cells, human hepatoma-derived Huh7 cells, HepG2 cells and the like can be exemplified.
  • embryonic stem cells (ES cells) and tissue stem cells obtained from mouse, chicken, pig, human and the like can also be exemplified, and cells differentiated from these ES cells and tissue stem cells can also be exemplified.
  • cells obtained by gene manipulation such as plasmid introduction or virus infection into these cells can also be cultured on the porous substrate of the present invention.
  • the extracellular matrix is degraded by enzymatic treatment of living cartilage tissue with collagenase, trypsin, ribarose, proteinase and the like. Treat, then add serum medium and centrifuge to isolate cartilage cells.
  • the isolated chondrocytes are seeded in a culture flask and cultured in DMEM medium (DMEM serum medium) containing 10% ushi fetal serum, 4500 mgZL glucose, 584 mgZL glutamine, 0.4 mM proline and 50 mgZ L ascorbic acid. To do.
  • the cells can be subcultured 2 to 3 times until the number of cells is sufficient, and the subcultured cells can be collected by trypsin treatment and used as seeding cell solution. .
  • the chondrocytes and stem cells that can be separated into chondrocytes used in the present invention can be prepared by a conventional method.
  • Stem cells that differentiate into chondrocytes are isolated by centrifuging the bone marrow extract by a density gradient centrifugation method using a density gradient medium made of percoll or a normal centrifugation method. These cells are seeded in a culture flask and subcultured 2-3 times until the number of cells is sufficient with DMEM serum medium. The subcultured cells are collected by trypsinization and used as a seeding cell solution.
  • the regenerated transplant of cartilage tissue of the present invention is characterized in that chondrocytes or stem cells that differentiate into chondrocytes are carried on the porous substrate of cells having the above-described porosity. It is said. Since such a regenerative transplant has a cartilage tissue similar to the three-dimensional structure inherent in the living body, it can be used to repair cartilage wounds caused by diseases such as osteoarthritis or accidents. can do. [0045]
  • This method for producing a regenerative graft is obtained by using the porous substrate as described above in order to seed chondrocytes or stem cells that can be differentiated into chondrocytes on the porous substrate of cells having porosity as described above.
  • the cell solution for seeding is added dropwise to the cell seeding surface of the porous substrate (the surface on which the membrane having a small and dense porous structure is attached).
  • the cell concentration of the seeding cell solution is usually 1 X 10 3 cells / mL to 5 X 10 8 cells / mL, preferably 1 X 10 4 cells / mL to 5 X 10 7 cells / mL. Desirably, the volume of the cell fluid is greater than the volume of the porous substrate.
  • the transplant for regenerating cartilage tissue of the present invention is a chondrocyte
  • the cell solution for seeding is added dropwise to the three-dimensional porous material, and then a culture solution is added. Chondrocytes in a three-dimensional porous material are incubated with DMEM serum medium at 37 ° C in a 5% CO atmosphere.
  • the transplant is obtained by culturing and growing in beta.
  • a differentiation step into chondrocytes is further required. After adding a cell solution for seeding stem cells that differentiates into the chondrocytes into the three-dimensional porous material, the cells are added in a DMEM serum medium. After growth for 1-2 weeks, DMEM medium containing 4500mgZL glucose, 584mgZL glutamine, 0.4mM proline and 50mg / L ascorbic acid plus transforming growth factor j8 3 (TGF- ⁇ 3) (differentiation medium) ) For 1 to 2 weeks and differentiate to obtain the transplant.
  • TGF- ⁇ 3 transforming growth factor j8 3
  • the cartilage tissue regeneration graft obtained as described above may be directly transplanted into a living body.
  • the frame portion that is the skeleton of the carrier, that is, the frame-like cage-like portion has a bioabsorbable material force similar to the porous material, or a material force having high adaptability to the living body. It is more preferable.
  • cartilage tissue regenerated on a carrier may be collected from the carrier and transplanted.
  • a method of collecting a frame portion that is a skeleton of the carrier that is, a method of breaking a frame shape or a force cage shape, and a method of collecting a regenerated cartilage tissue with a drill can be considered.
  • the porous substrate having a multilayer structure of the present invention has a porous structure such as composition, porosity, pore size and pore communication, and mechanical properties. Constructed from two or more materials that are recognized as being different, but not substantially the same. It is a porous structure. These two or more materials can preferably take into account one or more of different compositions, porous structures and mechanical properties, differing only in composition and other structures and properties. Porous structures that are the same, or have one or more porous structures such as large porosity or pore connectivity, different mechanical properties, or two or more different properties A porous body having a multilayer structure composed of bodies is included. These two or more types of porous structures are connected to each other to form a multilayer structure.
  • a porous structure such as composition, porosity, pore size and pore communication, and mechanical properties. Constructed from two or more materials that are recognized as being different, but not substantially the same. It is a porous structure. These two or more materials can preferably take into account one or more of
  • connection here may be that layers of different porous structures abut, contact, or be stacked to form a multi-layered structure, or are different porous structures arranged in granular form. It may be a multi-layered structure, such as a pattern, or an arrangement pattern of a planar area, or an inclusion form.
  • porous substrate having a preferred multilayer structure of the present invention can be outlined in, for example, FIG.
  • the first porous body A is, for example, as described above, in one or more types of mesh bodies or porous bodies of bioabsorbable synthetic polymers, that is, mesh mesh or porous body pores.
  • a composite porous body ie, a composite mesh body or a porous body further formed with a porous body containing at least one selected from the group consisting of bioabsorbable natural polymers, cell growth factors, cell differentiation regulators, and derivatives thereof
  • the second and third porous bodies B and C which are composite porous bodies, are also included in one or more types of mesh bodies or porous bodies of bioabsorbable synthetic polymers, that is, mesh networks.
  • a certain ridge further formed a porous body containing at least one selected from the group consisting of a bioabsorbable natural polymer, a cell growth factor, a cell differentiation regulator, and derivatives thereof in the pores of the porous body.
  • Composite porous Body that'll be a composite mesh body or a composite porous body! ⁇ .
  • first, second and third porous bodies are all composite mesh bodies or composite porous bodies, the composition of each component, porosity, pore size, pore connectivity, etc. It is preferable that the porous structure and the mechanical properties differ by one or more.
  • first and second or third porous bodies are composite mesh bodies or composite porous bodies, the composition of each of the first, second and third constituents, the porosity It is preferable that one or more of the porous structure and mechanical properties such as the size and the connectivity of the pores are different.
  • the second and third porous bodies are It is preferable that at least one of the composition of the second and third components, the porous structure such as the porosity and the pore connectivity, and the mechanical properties are different.
  • the mesh body or porous body used in the present invention can be easily seeded with the same or different types of cells in each layer of the porous substrate having the multilayer structure of the present invention. It is used because it is easy to regenerate tissues such as epithelium 'dermis and epithelium' dermis' subcutaneous tissue.
  • the mesh body may be a woven fabric, a knitted fabric, a woven fabric or a non-woven fabric.
  • the porous body can be obtained by a known method such as a foam molding method using a foaming agent, a freeze-drying method, or a porous glaze removal method.
  • a foaming agent is added to a polymer compound to foam the foaming agent, and then the polymer is hardened.
  • the polymer aqueous solution or emulsion may be frozen, then lyophilized and crosslinked. Add water-soluble saccharides or salts to the polymer solution, and after curing, wash away the water-soluble substances with water.
  • the size of the mesh stitch or the pore size of the porous body depends on the required mechanical strength or elasticity or the bone tissue or cartilage tissue depending on the place in the living body to be transplanted. It is determined appropriately in consideration of the regeneration speed of the skin and the like.
  • Fig. 2 and Fig. 3 show examples of a porous substrate having a preferred multilayer structure of the present invention.
  • the first, second, and third porous bodies A, B, and C are one or more types of mesh bodies or porous bodies of bioabsorbable synthetic polymers, that is, mesh bodies of mesh bodies are porous bodies.
  • the method for producing the porous substrate (FIG. 2a) of the present invention preferably includes (1) the porous body of the bioabsorbable synthetic polymer as the first porous body (A). After the porous body of the bioabsorbable synthetic polymer (C), which is the third porous body (C), is stacked on the porous body, (2) the first porous body (A) and the third porous body (C) are laminated.
  • Examples of the method include (3) lyophilization after impregnation with a solution of one or more of these derivatives and the like, and preferably crosslinking by treatment with a gaseous or liquid crosslinking agent.
  • the arrangement of the porous membrane is as described above.
  • the step (1) can be carried out using a bioabsorbable synthetic polymer by a phase separation method, a particle leaching method or a foam molding method.
  • Prepare two kinds of porous agent Z polymer solution by mixing two kinds of porous agents with different diameters in a solution of bioabsorbable synthetic polymer dissolved in organic solvent.
  • One kind of porosifying agent Z on top of the polymer solution.
  • the porous agent in the above step (1) is removed by removing the porosifying agent.
  • the body can be made.
  • bioabsorbable synthetic polymer examples include polylactic acid, polydaricholic acid, a copolymer of lactic acid and dallicolic acid, poly ⁇ -strength prolatatone, a polyester such as these copolymers or cellulose, Examples thereof include polysaccharides such as polyalginic acid.
  • bioabsorbable synthetic polymer which is preferably used in the present invention include polylactic acid, Po polyglycolic acid, copolymers of lactic acid and glycolic acid, poly ⁇ Ichiriki Purorataton a copolymer thereof.
  • Solvents for dissolving the above-mentioned bioabsorbable synthetic polymer include black mouth form, carbon tetrachloride, dioxane, trichloro mouth acetic acid, dimethylformamide, methylene chloride, ethyl acetate, acetone, hexafluoroisopropanol, Examples include dimethylacetamide and hexafluoro-2-propanol.
  • the porosifying agent includes water-soluble sugars such as butu sugar and sugar, sodium chloride, potassium salt potassium, sodium tartrate, sodium citrate, ammonium carbonate, carbonic acid. Examples include particles and crystals of salts such as sodium and sodium bicarbonate.
  • a method for removing the porous agent there may be mentioned a method of immersing in pure water and washing with pure water.
  • step (2) one or more bioabsorbable natural polymers, cell growth factors, cell differentiation factor control factors, or derivatives thereof are mixed and then impregnated. It is done by mixing more than seeds.
  • the porous body of the bioabsorbable synthetic polymer as the third porous body (C) is formed on the porous body of the bioabsorbable synthetic polymer as the first porous body (A).
  • a porous material produced by placing a material can be treated with an aqueous solution of the bioabsorbable natural polymer, a cell growth factor, a cell differentiation regulator, or a derivative thereof. There are various treatment methods, but the dipping method is preferably employed.
  • the dipping method can be performed by the method described above.
  • the coating method is effective when a soaking method in which the concentration and viscosity of an aqueous solution of bioabsorbable natural high molecule, cell growth factor, and cell differentiation control factor is high cannot be applied. This is done by applying a high-concentration aqueous solution of cell growth factor and cell density regulator to a bioabsorbable synthetic polymer mesh body.
  • the form is as follows: (1) the first porous body (A) on the porous body of the bioabsorbable synthetic polymer; A porous body of a bioabsorbable synthetic polymer that is the second porous body (B) is laminated, and further a porous body of the bioabsorbable synthetic polymer that is the third porous body (B).
  • a bioabsorbable synthetic polymer can be used to produce by a phase separation method, a particle leaching method or a foam molding method.
  • porous agent Z polymer solution Prepare 3 types of porous agent Z polymer solution by mixing 3 types of porous agents with different diameters in a solution of bioabsorbable synthetic polymer in organic solvent.
  • One type of porous agent Z polymer solution was placed on top of another type of porous agent Z polymer solution, and then another type of porous agent Z polymer solution was placed and dried. Thereafter, the porous material in the above step (1) can be produced by removing the porous agent.
  • Steps (2) and (3) are the same as in the case of FIG. 2a.
  • the preferred method for producing the porous substrate is as follows: (1) After producing the porous body of the bioabsorbable synthetic polymer as the first porous body (A), (2) After attaching and impregnating a solution of one or more kinds of bioabsorbable natural polymers, cell growth factors, cell differentiation control factors, or derivatives thereof constituting the secondary structure, (3) After placing an aqueous solution of a bioabsorbable natural polymer, a cell growth factor, a cell differentiation regulator, or a derivative thereof on this, and (4) freezing Examples are a method of crosslinking by drying and preferably treating with a gaseous or liquid crosslinking agent. The arrangement of the porous membrane is as described above.
  • a bioabsorbable synthetic polymer can be used to produce the polymer by a phase separation method, a particle leaching method (particulate-leaching), or a foam molding method.
  • a porous agent is added to a solution in which a bioabsorbable synthetic polymer is dissolved in an organic solvent, mixed and dried, and then the porous agent is removed to remove the porous agent in the above step (1).
  • the body can be made.
  • step (2) for example, one or more bioabsorbable natural polymers, cell growth factors, cell differentiation controlling factors, or derivatives thereof are mixed and then impregnated. It is done by mixing the above.
  • step (3) at least one kind of bioabsorbable natural polymer, cell growth factor, cell differentiation regulator, or derivative thereof is mixed and then the concentration in step (3) is high. Add more gently onto the first porous body (A) with a solution of one or more of absorptive natural polymer, cell growth factor, cytosolic regulator, or derivatives thereof, Or apply.
  • Bioabsorbable natural polymer, cell growth factor, cell differentiation control The weight concentration of one or more of the factors or their derivatives is 0.05 to 3%. The most desirable concentration is 0.1-2%.
  • FIG. 3b As a preferred embodiment of the method for producing the structure (Fig. 3b), (1) after producing a porous body of a bioabsorbable synthetic polymer as the first porous body (A), (2 ) After adhering and impregnating a solution of one or more types of bioabsorbable natural polymers, cell growth factors, cell division factors, or derivatives thereof constituting the secondary structure, (3) After placing a solution of one or more kinds such as an aqueous solution of a bioabsorbable polymer having a high concentration, a cell growth factor, a cell differentiation controlling factor, or a derivative thereof on this, further (4 ) After placing a solution of one or more of a bioabsorbable natural polymer aqueous solution, a cell growth factor, a cell differentiation regulator or a derivative thereof on this, and (5) lyophilized, preferably Examples thereof include a method of crosslinking by treating with a gaseous or liquid crosslinking agent.
  • the arrangement of the porous membrane is as described above.
  • a bioabsorbable synthetic polymer can be used to produce the polymer by a phase separation method, a particle-leaching method, or a foam molding method.
  • Bioabsorbable synthesis Porous agent is added to a solution prepared by dissolving a polymer in an organic solvent, mixed, dried, and then the porous agent in the above step (1) is removed by removing the porous agent.
  • the body can be made.
  • step (2) one or more bioabsorbable natural polymers, cell growth factors, cell differentiation control factors or derivatives thereof are mixed and then impregnated, or each one or more It is done by mixing things.
  • step (3) at least one kind of bioabsorbable natural polymer, cell growth factor, cell differentiation controlling factor or derivative thereof having a high concentration is mixed and then the bioabsorbable in step (2) above.
  • the weight concentration of one or more mixed solutions is 0.1 to 5%. The most desirable concentration is 0.3-5%.
  • step (4) one or more bioabsorbable natural polymers, cell growth factors, cell differentiation control factors or derivatives thereof are mixed, and then the concentration in step (3) above is increased. High! ,Living More gently added to the first porous body (A) to which a solution of one or more kinds such as a body-absorbable natural polymer, a cell growth factor, a cell differentiation controlling factor, or a derivative thereof is attached, or Can be applied.
  • the weight concentration of one or more kinds of bioabsorbable natural polymer, cell growth factor, cytosolic factor, or derivatives thereof is 0.05 to 3%. The most desirable concentration is 0.1-2%.
  • a bioabsorbable polymer PLGA
  • a bioabsorbable polymer PLGA
  • a bioabsorbable polymer PLGA
  • a bioabsorbable polymer PLGA
  • a bioabsorbable polymer PLGA
  • a bioabsorbable polymer PLGA
  • PLGA bioabsorbable polymer
  • a multi-layered PLGA-collagen composite sponge Z collagen sponge composed of a type I collagen composite sponge (PLG A-collagen composite sponge) and porcine skin-derived pepsin solubilized type I collagen sponge A solid was prepared.
  • a nylon mesh having pores with a diameter of 2 ⁇ m was attached to the bottom and inner surfaces of a polyethylene cylinder frame having an inner diameter of 1 ⁇ 2 mm by heat to prepare a frame shape as a skeleton of the porous substrate.
  • the prepared skeleton was washed with alkaline water, rinsed with ultrapure water, and then dried.
  • Sodium chloride particles having a diameter of 355 to 425 ⁇ m were sieved with a sieve having a diameter of 55 ⁇ m and 425 ⁇ m.
  • Copolymer of lactic acid and glycolic acid (75:25) PLGA was dissolved in black mouth form to prepare a 15 (wZv)% solution.
  • the prepared material was crosslinked with glutaraldehyde vapor saturated with 25 wt% aqueous dartalaldehyde at 37 ° C for 4 hours, and then washed 5 times with distilled water. Further, after being treated with a 0.1 M aqueous glycine solution for 24 hours, it was washed 20 times with distilled water. This is frozen at 80 ° C for 12 hours and lyophilized under vacuum (0.2 Torr) for 24 hours to form a collagen sponge in the PLGA sponge on the polyethylene cylinder frame and nylon mesh skeleton.
  • a PLGA-collagen composite sponge Z collagen sponge having a hierarchical structure in which a collagen sponge was formed at one end of the PLG ponge was prepared.
  • the obtained PLGA-collagen composite sponge Z collagen sponge having a hierarchical structure was coated with gold, and the structure was observed with a scanning electron microscope (SEM). An electron micrograph is shown in Fig. 6.
  • a porous material was prepared by introducing a sponge of ushi type I atelocollagen, a bioabsorbable natural polymer, into a frame made of a polyethylene cylinder frame and nylon mesh.
  • a nylon mesh having pores with a diameter of 2 ⁇ m was attached to the bottom and inner surfaces of a polyethylene cylinder frame having an inner diameter of 1 ⁇ 2 mm by heat to produce a frame as a skeleton of the porous substrate.
  • the prepared skeleton was washed with alkaline water, rinsed with ultrapure water, and then dried.
  • the prepared skeleton was dipped in porcine skin-derived pepsin solubilized type I collagen acidic aqueous solution, vacuum reduced to such an extent that the aqueous solution did not freeze, bubbles in the skeleton were removed, and the collagen aqueous solution was filled.
  • the skeleton filled with collagen aqueous solution was frozen at -80 ° C for 6 hours. Next, this frozen material was freeze-dried for 48 hours under vacuum and reduced pressure (0.2 Torr) to produce an uncrosslinked scaffold material in which a collagen sponge was formed in the skeleton.
  • the obtained uncrosslinked scaffold material was crosslinked at 37 ° C with dartalaldehyde vapor saturated with 25 wt% dartalaldehyde aqueous solution for 4 hours, and then washed 10 times with a phosphate buffer. Further, it was immersed in a 0.1 M glycine aqueous solution for 4 hours, washed 10 times with a phosphate buffer, then washed 3 times with distilled water, and frozen at ⁇ 80 ° C. for 12 hours. This was freeze-dried for 24 hours under vacuum and reduced pressure (0.2 Torr) to obtain a porous substrate of cells according to the present invention as a scaffold material.
  • the obtained porous substrate was coated with gold, and their structure was observed with a scanning electron microscope (SEM). An electron micrograph is shown in Fig. 7.
  • Example 2 Using the porous body prepared in Example 2, a regenerated transplant of cartilage tissue carrying mesenchymal stem cells derived from human bone marrow was reconstructed.
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells purchased from Cambrex (CambrexBioScienceWalkersville, Inc.) were purchased from Cambrex (CambrexBioScienceWalkersville.Inc.). Subculture twice in a medium supplemented with fetal serum, penicillin Z-streptomycin, and L-glutamine at 37 ° C in a 5% CO atmosphere.
  • the bone marrow cells that had been subcultured twice were detached and collected with 0.025% trypsin Z0. 01% EDTA / PBS ( ⁇ ) to prepare a 1.5 ⁇ 10 6 cell S / mL bone marrow cell solution.
  • 1000 1 cell solution was added dropwise to the three-dimensional porous material sterilized with ethylene oxide gas, and the cells were seeded. After seeding, the liquid leaking out of the porous substrate was collected, and the number of cells was counted. As a result, the seeding efficiency of the seeded cells was 95.2 ⁇ 1.0%, which was very high.
  • the porous substrate of the cells seeded with the cells was transferred to a T75 culture flask, put in 50 mL of MSC growth medium, and cultured for 1 week while shaking.
  • the medium is serum-free, antibiotics, 4500 mg / L glucose, 584 mg / L glutamine, 0.4 mM proline and 50 mg / L ascorbic acid, ⁇ dexamethasone, 10 ng / mL TGF including j8 3
  • the cartilage tissue was regenerated by culturing for another 4 weeks instead of the DMEM-containing medium.
  • FIG. 8 shows photographs of the results of HE (hematoxylin and eosin) staining, Safranin-O staining and toluidine blue staining of the regenerated tissue. Circular cells, Safranin-O staining and toluidine blue staining are shown. Sexual extracellular matrix could be confirmed.
  • HE hematoxylin and eosin

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Abstract

　本発明の多孔質基盤体は、細胞の播種用孔を有し、細胞の播種用孔を有する多孔質な主体の外周面に前記細胞よりも小さい孔からなる多孔質膜を配設してなることを特徴とする。これにより、細胞の漏れを抑制し、細胞を高効率に播種でき、さらに接着しにくい細胞でも接着することのできる多孔質基盤体が提供される。

Description

明 細 書
多孔質基盤体とその製造方法並びに多孔質基盤体の使用方法 技術分野
[0001] 本発明は、細胞の播種用孔を有する多孔質基盤体とその製造方法並びに多孔質 基盤体の使用方法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、疾患や事故など の原因で損傷、失った骨や軟骨、靭帯、皮膚、血管、脾臓、肝臓等の生体組織'臓 器を修復するために、それらの生体組織 ·臓器に分ィ匕して組織ィ匕する細胞を播種で きる多孔質基盤体とその製造方法並びに多孔質基盤体の使用方法に関するもので ある。
背景技術
[0002] 従来、事故や病気などの原因で損傷を受けたり、失われたりした軟骨や皮膚、骨、 靭帯、皮膚、血管、脾臓、肝臓等の生体組織'臓器を修復、治療する方法は、例えば 、人工臓器や臓器移植等による治療法が知られている。しかしながら、人工臓器の場 合では、機能が不十分、人工物による磨耗 '緩み'破損などの問題点がある。また、 組織移植の場合では、ドナーの不足という問題に加え、ドナーが他人の場合、免疫 応答に基づく拒絶反応という問題もある。
[0003] このような種々の問題点の存在により、現在では、再生医工学的な手法による治療 法は理想的であると考えられ、患者自身の細胞を多孔質基盤体中で培養し、移植す る組織を新たに再生する研究が盛んに行われている。具体的には、まず第 1には、 生体外で生体の細胞を増殖させ、生体細胞や組織の足場とする多孔質基盤体に播 種し、生体外で培養し、生体組織が形成された後、生体内に移植する方法である。 第 2には、生体細胞を多孔質基盤体に播種し、生体内に埋め込み、生体内で生体糸且 織の再生を誘導する方法である。そして第 3には、直接に多孔質基盤体を損傷したと ころに埋め込み、隣の細胞の多孔質基盤体への侵入を誘導し、新しい組織の形成を 誘導する方法である。そのため、生体組織の形成を誘導、促進し、生体組織の形態 を維持する多孔質基盤体は非常に重要な役割を果たして 、る。この多孔質基盤体 には、生体に影響を及ぼさない性質としての生体適合性や、新しい生体組織が形成 すると共に分解，吸収される生体吸収性や、適当な機械強度などが要求されている。
[0004] 従来、このような基盤体として、ポリ乳酸 (PLA)や、ポリグリコール酸 (PGA)や、乳 酸とダリコール酸との共重合体 (PLGA)、やコラーゲンなどの生体吸収性高分子の 多孔質材料がよく用いられている（例えば、特開 2003— 10309号公報)。
[0005] また、生体吸収性高分子の多孔質材料を用いて細胞を培養する場合には、細胞を 播種し、材料に接着させなければならないが、患者力 採取される細胞の数は限ら れており、得られた貴重な細胞を全部多孔質基盤体に播種し、接着させることが最も 望ましいことを考えると、接着しやすい細胞と、接着しにくい細胞に関係なぐ全ての 種類の細胞を多孔質基盤体に播種し、接着させることは非常に重要である。
[0006] し力しながら、これらの生体吸収性高分子の多孔質材料に細胞を播種する際、多 孔質材料の周りから、細胞の漏れが激しぐまた多孔質材料の空隙率が低ぐ細胞を 高効率に播種することができない。さらに、接着しにくい細胞の場合では、ほとんど材 料に接着できず、組織'臓器の再生に悪影響を与えている。
[0007] また、変形性関節症は整形外科分野にぉ 、て高頻度見られる疾患で、しばしば高 度の機能障害をきたす。人工関節手術が外科的治療の主流であるが、現在の金属 や高分子ポリマーを材料とする人工関節部分は、上記と同様、感染 ·磨耗 ·緩み '破 損といった問題を有する。組織移植の場合、やはりドナー不足、免疫応答に基づく拒 絶反応という問題がある。このような種々の問題点の存在により、現在では、再生医 工学的な手法による治療法は理想的であると考えられ、軟骨組織の再生に関する研 究も盛んに行われて 、る。
[0008] 再生医工学的な手法により軟骨糸且織を再生するためには、軟骨細胞ある!/、は軟骨 細胞に分ィ匕し得る幹細胞が増殖するための足場として、また、形成している生体組織 の支持体としての三次元的な多孔質基盤体が必要である。
[0009] し力しながら、従来の多孔質基盤体の中心部と表面層はほとんど同様な多孔質構 造を有し、播種した細胞が多孔質基盤体の中に留まらず、その大部分は細胞のサイ ズより大きい隙間、割れ目を通過し、多孔性物質の周囲力も漏れてしまっている。そ のため、軟骨細胞あるいは軟骨細胞に分化しうる幹細胞を効率がよく培養多孔質基 盤体に播種することが極めて困難であり、このため、有効な細胞の播種率が得られず 、これら細胞を大量に培養多孔質基盤体に集積することができないため、軟骨組織 の再生に悪影響を与えて 、る。
[0010] また、これまでは、隣接する異なる組織であっても、これを全く同じ多孔質基盤体で 再生しているため、異なる組織が複合、積層化されている生体の組織や臓器におけ る隣接構造とは異質な環境下にあるといえる。隣接する組織を同時に再生するため には、それぞれの組織再生に適した材料、構造を有する多孔質基盤体を利用するこ とも望ましい。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] そこで、このような従来の問題点を解決すベぐ本発明は、細胞の漏れを抑制し、細 胞を高効率に播種でき、さらに接着しにくい細胞でも接着することのできる多孔質基 盤体とその製造方法並びに多孔質基盤体の使用方法を提供することを課題としてい る。
また、本発明は、良好な生体親和性を有し、隣接する幾つかの組織におけるそれ ぞれの組織の再生に適合するようにできる多孔質基盤体とその製造方法並びに多 孔質基盤体の使用方法を提供することをも課題として ヽる。
課題を解決するための手段
[0012] 本発明によれば、前記の課題を解決するために下記の技術的手段が提供される。
(1)細胞の播種用孔を有する多孔質基盤体であって、細胞の播種用孔を有する多 孔質な主体の外周面に前記細胞よりも小さい孔カ なる多孔質膜を配設してなること を特徴とする多孔質基盤体。
(2)上記第（1)の多孔質基盤体において、その主体が、フレーム状の骨格を有する ことを特徴とする多孔質基盤体。
(3)上記（1)の多孔質基盤体において、その主体が、カゴ状の骨格を有することを特 徴とする多孔質基盤体。
(4)上記（1)から（3)のいずれかの多孔質基盤体において、その多孔質膜は、生体 吸収性物質又は生体非吸収性物質であることを特徴とする多孔質基盤体。
(5)上記（1)から (4)のいずれかの多孔質基盤体において、その多孔質膜上に、さら に膜状多孔質体を積層してなることを特徴とする多孔質基盤体。
(6)上記 (5)の多孔質基盤体にぉ 、て、その膜状多孔質体が複数層繰り返して配設 され、多層化されていることを特徴とする多孔質基盤体。
(7)上記（3)の多孔質基盤体において、そのカゴ状主体中に、さらに多孔質物質を 充填してなることを特徴とする多孔質基盤体。
(8)上記 (7)の多孔質基盤体において、その多孔質物質は、生体吸収性物質である ことを特徴とする多孔質基盤体。
(9)上記 (4)又は (8)の多孔質基盤体において、その生体吸収性物質は、少なくとも 生体吸収性合成高分子、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御 因子およびこれらの誘導体力 なる群より選ばれる少なくとも 1種よりなることを特徴と する多孔質基盤体。
(10)上記（1)力も (8)の 、ずれかの多孔質基盤体にぉ 、て、互いに異なる性質を有 する層からなる複層構造を有することを特徴とする多孔質基盤体。
(11)上記（10)の多孔質基盤体において、積層、包接、被覆、粒状もしくは塊状の 接触、立体もしくは平面域のパターン接触、あるいはこれらの 2種以上の組合せによ り積層化されて!/、ることを特徴とする多孔質基盤体。
(12)上記（10)又は（11)の多孔質基盤体において、複層構造を構成する各層は、 組成、空隙率ゃ孔の大きさや孔の連通性などの多孔質構造、および力学的性質のう ちの少なくとも 1種が互いに異なることを特徴とする多孔質基盤体。
(13)上記（1)から（12)のいずれかの多孔質基盤体において、その主体が、生体吸 収性合成高分子、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子、お よびこれらの誘導体力 なる群力 選ばれる少なくとも 1種よりなることを特徴とする多 孔質基盤体。
( 14)上記（ 10)から（ 12)の 、ずれかの多孔質基盤体にぉ 、て、複層構造の少くとも 1層は、生体吸収性合成高分子、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分 化制御因子、およびこれらの誘導体力 なる群力 選ばれる少なくとも 1種よりなるこ とを特徴とする多孔質基盤体。
( 15)上記（ 1)から（ 14)の 、ずれかの多孔質基盤体の製造方法であって、主体に骨 格構造を有するものを用い、当該骨格構造の表面に多孔質膜を積層することを特徴 とする多孔質基盤体の製造方法。
(16)上記（1)から（14)のいずれかの多孔質基盤体の使用方法であって、その主体 内に、軟骨細胞または軟骨細胞に分化する幹細胞を担持させることを特徴する多孔 質基盤体の使用方法。
発明の効果
[0013] 本発明によれば、細胞の大きさより小さ!/、孔を有する多孔質膜にて主体が覆われ た構成を採用して ヽるので、主体に播種された細胞が外部にこぼれ出す虞がなくな り、組織の再生を早めることができ、極めて効率的に再生細胞の播種を行うことが可 能となる。
[0014] また、本発明によれば、複層構造を持たせることにより、骨や軟骨、靭帯、皮膚、血 管、脾臓、肝臓等の複層化した生体組織'臓器を再生することが可能となり、軟骨、 靭帯、皮膚、血管、脾臓、肝臓等などの疾患の治療への応用を大きく期待することが できる。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]多孔質膜により覆われる多層構造を有する円柱状の多孔質基盤体の代表例 1 を示す図である。
[図 2]多孔質膜により覆われる多層構造を有する円柱状の多孔質基盤体の代表例 2 を示す図である。
[図 3]多孔質膜により覆われる多層構造を有する円柱状の多孔質基盤体の代表例 3 を示す図である。
[図 4]多孔質膜により覆われる単一な多孔質構造を有する円柱状の多孔質基盤体を 示す図である。
[図 5]多孔質膜により覆われる単一な多孔質構造を有する立方体状の多孔質基盤体 を示す図である。
[図 6]ポリエチレンとナイロンメッシュのシリンダー状フレーム中に形成したコラーゲン スポンジ ZPLGA—コラーゲン複合スポンジの多層構造を有する複合多孔質体の周 縁部 (上)と中心部（下)の電顕写真を示す図である。 [図 7]ポリエチレンとナイロンメッシュのシリンダー状フレーム中に形成したコラーゲン スポンジにより構成した多孔質基盤体の周縁部（上）と中心部（下)の電顕写真を示 す図である。
[図 8]骨髄由来の間葉系幹細胞を多孔質基盤体で培養し、再生した軟骨組織の組 織学的な染色写真を示す図である。 A：へマトォキシリンとェォシン染色、 B: afranin —O染色、 C：トルイジンブルー染色。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明における細胞を担持して培養することのできる多孔質基盤体は、主体と多孔 質膜より構成される。
[0017] 多孔質膜は、細胞のサイズよりも小さ!、ポアサイズの緻密な孔を有する。多孔質膜 の空隙率は、 10〜99%が好ましぐ最も望ましい空隙率は 30〜99%である。多孔 質膜のポアサイズは、細胞より小さいサイズである 0. 1〜30 /ζ πιが好ましぐ最も望ま しいポアサイズは 0. 45〜10 /ζ πιである。このようなサイズの孔により、細胞懸濁液を 多孔質基盤体に滴下するとその内部に侵入させる細胞に至ることができるようになる 。また、このような多孔質膜により再生組織の形状を維持することもできる。
[0018] 多孔質膜の材料は、生体吸収性高分子、あるいはナイロンメッシュやスポンジ等の 生体非吸収性高分子とすることができる。
生体吸収性高分子としては、たとえば、ポリ乳酸、ポリダリコール酸、乳酸とグリコー ル酸の共重合体、ポリ ε一力プロラタトン、これらの共重合体などのポリエステルあ るいはセルロース、ポリアルギン酸などの多糖類等を挙げることができる。生体非吸 収性高分子としては、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなどを挙げ ることができる。中でも、本発明において好ましく使用される生体吸収性高分子は、た とえば、ポリ乳酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリ ε一力プロラタトン、これら の共重合体で、生体非吸収高分子は、ナイロンである。
[0019] 本発明において、主体を多孔質膜で覆うが、細胞を播種するための入口部分は多 孔質膜で覆わないようにする。多孔質膜は一層でもよぐ二層以上の多層構造として もよい。また、二層以上とした場合には、最内側の一層が多孔質構造を有するもので あればよいが、すべての層が多孔質構造を有する構造であってもよい。最内側の膜 は、中心部に形成する主体と密接することで細胞の漏れを防ぐために機能する。
[0020] 本発明の多孔質基盤体において、主体は、フレーム状またはカゴ状の骨格を有す ることが好ましい。本発明の多孔質基盤体は、このフレーム状またはカゴ状の骨格の 形状に沿って、その外周面に多孔質膜を配設して構成される。この骨格の大きさおよ び形状は、再生する軟骨組織等の組織の大きさおよび形状と合わせる形で成型する ことができる。たとえば、この骨格の大きさおよび形状は、再生する軟骨組織の厚み、 カーブ等を考慮して決定される。
[0021] 生体吸収性材料で骨格を調製する場合には、骨格の外側の大きさと形状は再生す る軟骨組織の厚み、カーブと同じとする。生体非吸収性材料で骨格を調製する場合 には、骨格の内側の大きさと形状を再生する軟骨組織の厚み、カーブと同じにする。 このようにすることにより、再生による形状異常が発生しにくぐ欠損する以前の形状 に近 、形状で再生することが可能となる。
[0022] また、これら骨格の内部は、細胞を播種できる大きさの孔を有する多孔質体で満た すようにする。この多孔質体としては、生体吸収性合成高分子、生体吸収性天然高 分子、細胞成長因子、細胞分ィヒ制御因子およびこれらの誘導体力 なる群より選ば れた少なくとも 1種類以上を用いることができる。
[0023] 多孔質体には、細胞が接着するための足場として、細胞の接着を支持し、細胞の 増殖、分化、細胞外マトリックス分泌、組織再生を促進する機能を持たせるようにする 。この多孔質体は、多孔質構造を有する膜が配設されたフレーム状、あるいは、カゴ 状の骨格と密接に繋がって、細胞播種、細胞培養の過程で両者は離れることがない
[0024] この多孔質体を構成する生体吸収性合成高分子としては、たとえば、ポリ乳酸、ポリ グリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリ ε一力プロラタトン、これらの共 重合体などのポリエステルある 、はセルロース、ポリアルギン酸などの多糖類等を挙 げることができる。中でも、本発明において好ましく使用される生体吸収性合成高分 子は、ポリ乳酸、ポリダリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリ ε一力プ 口ラタトン、これらの共重合体である。 [0025] この多孔質体を構成する生体吸収性天然高分子は、自然に存在する、あるいは生 体に由来するもので、生体親和性を示すものであれば、いずれも使用できる力 コラ 一ゲン、ヒアルロン酸、プロティォグリカン、了ダリカン、コンドロイチン硫酸、ゼラチン、 フイブロネクチン、およびラミニンなど力もなる群より選ばれた 1種以上のもの、特にコ ラーゲンが好ましく使用される。コラーゲンには I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VIII、 IX、 X型 などのものがあるが、本発明においては、これらのいずれも使用でき、またこれらの誘 導体を使用してもよい。
[0026] 一般に、生体吸収性天然高分子は生体吸収性合成高分子よりも空隙率および細 胞播種率が高ぐこの点で優れている。その一方で、生体吸収性合成高分子は生体 吸収性天然高分子よりも機械的な強度が高い。従って、本発明の多孔質基盤体は、 適宜に、生体吸収性天然高分子と生体吸収性合成高分子を組み合わせることで、 適切な空隙率、細胞播種率および機械的強度を備えた基盤体とすることができる。 たとえば、生体吸収性合成高分子を最内側の一層とし、これに生体吸収性天然高分 子を積層する等の構成とすることができる。
[0027] 多孔質体を構成する細胞成長因子と細胞分ィ匕制御因子としては、細胞の成長、分 化を制御できるものであれば、いずれも使用できるが、上皮細胞成長因子 (EGF)、 インシュリン、血小板由来増殖因子 (PDGF)、繊維芽細胞増殖因子 (FGF)、肝細胞 増殖因子 (HGF)、血管内皮増殖因子 (VEGF)、 β型形質転換増殖因子 (TGF— j8 )、骨形成因子 (BMP)、デキサメタゾンなど力 なる群より選ばれた 1種以上のも の、あるいはこれらの誘導体を用いることができる。
[0028] 多孔質体の細孔は、播種細胞の接着、増殖及び組織再生の足場とするものであり 、細孔は連続していることが好ましい。その大きさは 1〜： LOOO /z m 好ましくは 20〜4 00 μ m程度とするのがよい。
[0029] また、本発明にお 、ては、多孔質体の厚みは、生体複合材料の使用態様によって 適宜定めればよいが、通常 0. 1〜： LOOmm、好ましくは 0. l〜50mmである。直径、 あるいは横幅、奥行きは、通常 0. 1~ 100mm,好ましくは 0. l〜50mmである。そ の空隙率は、通常 50〜99. 9%、好ましくは 90〜99. 9%である。
[0030] 本発明の複層構造を有する多孔質基盤体の作製方法としては、具体的には、例え ば、（1)生体吸収性高分子、あるいは生体非吸収性高分子の多孔質 (メッシュ、スポ ンジなど）、あるいは多孔質の円筒状（図 4参照）、あるいは、直方体状ないし立方体 状（図 5参照）のものを作製した後、（2)この円筒状、あるいは直方体状ないし立方体 状のものの内側と底面に生体吸収性高分子、あるいは生体非吸収性高分子の緻密 な多孔質構造を有する膜を熱や糊、有機溶媒などで貼り付けた後、（3)生体吸収性 天然高分子、細胞成長因子、細胞分ィ匕制御因子あるいはそれらの誘導体など力もな る群より選ばれた少なくとも 1種以上のものの溶液を載せた後、そして、（4)凍結乾燥 し、好ましくはガス状ないし液状の架橋剤、熱で処理することにより架橋することで得 られる。
[0031] 上記工程 (3)における生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因 子またはこれらの誘導体の水溶液での処理方法としては、種々のものがあるが、浸漬 法が好ましく採用される。
浸漬法は、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはこ れらの誘導体の水溶液の濃度や粘度が低い場合に有効であり、具体的には、生体 吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはこれらの誘導体の低 濃度水溶液に生体吸収性高分子、あるいは生体非吸収性高分子の多孔質体 (メッ シュ、スポンジなど）、あるいは多孔質円筒状体、あるいは多孔質直方体ないし立方 体を浸漬することにより行われる。減圧脱気処理することにより、生体吸収性高分子、 あるいは生体非吸収性高分子の多孔質体 (メッシュ、スポンジなど）、あるいは多孔質 円筒状体、あるいは多孔質直方体ないし立方体の中を生体吸収性天然高分子、細 胞成長因子、細胞分ィヒ制御因子またはこれらの誘導体の低濃度水溶液で満たす。
[0032] 本発明で用いられる架橋剤としては、従来公知のものがいず何れも使用できる。好 ましく使用される架橋剤は、ダルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデ ヒドのようなアルデヒド類を用いることができる力 特に好まし 、のはダルタルアルデヒ ドである。
[0033] 本発明における架橋化は、前記架橋剤をガス状にして用いるのが好ましい。具体 的には、生体吸収性天然高分子よりなる多孔質体を架橋するに際し、一定温度で一 定濃度の架橋剤またはその水溶液で飽和した架橋剤蒸気の雰囲気下で一定時間 架橋を行う。
[0034] 架橋温度は、生体吸収性高分子よりなる多孔質体が溶解せず、且つ架橋剤の蒸 気が形成できる範囲内で選定すればよぐ通常、 20〜50°Cに設定される。
[0035] 架橋時間は、架橋剤の種類や架橋温度にもよるが、上記天然高分子多孔質体の 親水性や生体吸収性を阻害せず、かつ生体移植時にこのものが溶解しな 、ような架 橋固定ィ匕が行われる範囲に設定するのが望ましい。
[0036] 架橋時間が短くなると、架橋固定化が不十分となり、移植後生体内で生体吸収性 天然高分子よりなる多孔質体が短時間で溶解する恐れがあり、また架橋時間が長い ほど架橋化が進むが、架橋時間があまり長過ぎると、親水性が低くなり、骨形成性細 胞、軟骨形成性細胞の足場材料に対する播種密度が低くなり、細胞の贈殖および組 織再生が効率よく行われないほか、生体吸収性も低下する等の問題点を生じるので 好ましくな 、。好ま 、架橋時間は 10分〜 12時間程度である。
[0037] そして、本発明の多孔質基盤体は、各種の細胞や細胞を含む播種用細胞液を播 種することで、細胞の足場材料、すなわち培養担体として使用することもできる。また 、細胞を担持させて培養することで、細胞を組織ィ匕することができ、これを生体へ直 接移植して、医療に活用できる再生移植体とすることもできる。
[0038] ここで、本発明にお 、て培養対象となる細胞は、特に制限されるものではな 、。たと えば、動物由来、植物由来および微生物由来の細胞を培養することができ、中でも 動物由来の細胞が好ましぐ特に哺乳類由来の細胞が好ましい。たとえば、哺乳類と しては、ヒト、ゥシ、サル、ィヌ、ヒッジ、ャギ、ラット、マウス、ゥサギ等が使用できる。
[0039] もちろん、本発明における細胞としては、上記の由来の細胞だけでなぐいかなる 由来の培養細胞でもよい。たとえば、異種由来の細胞同士、あるいは、細胞とコラー ゲンゲル膜、繭糸、ナイロンメッシュ等の非細胞との融合細胞でもよい。もちろん、そ のほかにも、動物の肝臓、心臓、腎臓、皮膚、骨、軟骨、骨髄、血管等の組織や器官 、これら例示した組織力ゝら派生して形成された組織等をはじめとする組織由来の細胞 でもよぐさらには、初代細胞や株化細胞でもよい。さらにまた、たとえば、動物細胞 における初代細胞としては、 -ヮトリ胚由来細胞 (PSG)、ラット初代心筋細胞、ラット 初代肝細胞、マウス初代骨髄細胞、ブタ初代肝細胞、ゥシ血管内皮細胞、ヒト初代臍 帯血細胞、ヒト初代骨髄造血細胞、後根神経節細胞 (DRG)等のヒト初代神経細胞 等が例示できる。
[0040] さらにまた、株化細胞としては、例えば、チャイニーズノ、ムスター卵巣細胞由来の C HO細胞、ヒト子宫ガン由来の HeLa細胞、ヒト肝ガン由来の Huh7細胞や HepG2細 胞等が例示できる。さらに、マウス、ニヮトリ、ブタ、ヒト等力も得られた胚性幹細胞 (E S細胞)や組織幹細胞も例示でき、これら ES細胞や組織幹細胞から分化した細胞も 例示できる。また、これら細胞にプラスミド導入やウィルス感染等の遺伝子操作により 得られた細胞もこの本発明の多孔質基盤体で培養することができる。
[0041] 播種用細胞液の調製としては、具体的には、例えば、軟骨細胞の場合には、生体 軟骨組織をコラーゲナーゼ、トリプシン、リバラーゼ、プロティナーゼ等の酵素処理に より、細胞外マトリックスを分解処理し、次いで血清培地を添加し、遠心して、軟骨細 胞を単離する。単離した軟骨細胞を培養フラスコに播き、 10%ゥシ胎児血清、 4500 mgZLのグルコース、 584mgZLのグルタミン、 0. 4mMのプロリンおよび 50mgZ Lのァスコルビン酸を含有する DMEM培地（DMEM血清培地）で培養する。十分な 細胞数になるまで、 2〜3回継代培養し、この継代培養した細胞をトリプシン処理によ り回収し、播種用細胞液とし、これを播種することで、培養することができる。
[0042] 本発明にお 、て用いる軟骨細胞および軟骨細胞に分ィ匕し得る幹細胞は常法により 生体組織力 調製することができる。
[0043] また、軟骨細胞に分化する幹細胞は、骨髄抽出液をパーコール (percoll)からなる 密度勾配媒体を用いた密度勾配遠心法、あるいは通常の遠心法により遠心して単 離する。これらの細胞を培養フラスコに播き、 DMEM血清培地で十分な細胞数とな るまで、 2〜3回継代培養する。継代培養した細胞をトリプシン処理により回収し、播 種用細胞液とする。
[0044] さらに、本発明の軟骨組織の再生移植体は、上記のとおりの多孔性を有する細胞 の多孔質基盤体に、軟骨細胞または軟骨細胞に分化する幹細胞を担持させてなるこ とを特徴としている。このような再生移植体は、生体本来が有する三次元構造に類似 した軟骨組織を有しているため、これを変形性関節症などの疾患や事故などの原因 による軟骨創傷を修復するために利用することができる。 [0045] この再生移植体の作製方法は、上記のとおりの多孔性を有する細胞の多孔質基盤 体に、軟骨細胞あるいは軟骨細胞に分化し得る幹細胞を播種するには、上記多孔質 基盤体を培養液で濡らしておき、この多孔質基盤体の細胞播種面 (小さ 、孔の緻密 な多孔質構造を有する膜が付 ヽて ヽな 、面）に上記播種用細胞液を滴加する。
[0046] 上記播種用細胞液の細胞濃度は、通常 1 X 103cells/mL〜5 X 108cells/mL、 好ましくは 1 X 104cells/mL〜5 X 107cells/mL、播種する細胞液の容量は多孔 質基盤体の体積以上であることが望ま 、。
[0047] 本発明の軟骨組織を再生するための移植体は、軟骨細胞の場合、上記三次元多 孔性物質に上記播種用細胞液を滴加した後、さらに、培養液を添加し、該三次元多 孔性物質中の軟骨細胞を DMEM血清培地で、 37°C、 5%CO雰囲気下のインキュ
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ベータにぉ 、て培養増殖させることにより、当該移植体を得る。
[0048] 幹細胞の場合は、さらに軟骨細胞への分化工程が必要であり、上記三次元多孔性 物質に上記軟骨細胞に分化する幹細胞の播種用細胞液を滴加した後、 DMEM血 清培地で 1〜2週間培養増殖させた後、 4500mgZLグルコース、 584mgZLグルタ ミン、 0. 4mMプロリンおよび 50mg/Lァスコルビン酸に加え、トランスフォーミング 増殖因子 j8 3 (TGF— β 3)を含有する DMEM培地（分化培地）で 1〜2週間培養 し、分化させて当該移植体を得る。
[0049] そして、このようにして得られた軟骨組織の再生移植体は、そのまま生体に移植す ればよい。このとき、担体の骨格である枠部分、すなわち、フレーム状ゃカゴ状の部 分が、上記多孔性物質と同様に生体吸収性物質力もなる、もしくは、生体との高い適 応性を有する材質力 なることで、より好ましい。
[0050] また、移植前の作業として、担体に再生した軟骨組織を担体から採取し、これを移 植してもよい。採取方法としては、担体の骨格である枠部分、すなわち、フレーム状ま たは力ゴ状を壊して採取する方法や、ドリルで再生軟骨組織を採取する方法が考慮 することができる。
[0051] 本発明の複層構造を有する多孔質基盤体は、組成、空隙率ゃ孔の大きさゃ孔の 連通性などの多孔質構造、力学的性質等の 、ずれかの点にぉ 、て互いに相違して 、実質的に同一ではなく異なるものであると認められる二種類以上の材料で構築され る多孔質構造体である。これらの二種類以上の材料は、好適には、組成、多孔質構 造および力学的性質のうちの一つ以上が異なるものを考慮することができ、組成だけ が異なってほかの構造や性質が同じであったり、空隙率ゃ孔の大きなや孔の連通性 などの多孔質構造の一つ以上が異なったり、力学性質のみ違ったり、あるいはこれら の性質が二つ以上異なったりである多孔質構造体で構成される複層構造を有する多 孔質体が含まれている。これらの 2種類以上の多孔質構造体が互いに繋がって複層 構造が形成されている。ここでの繋がりは、異なる多孔質構造体の層が当接、接触、 あるいは積層されて複層構造が形成されるようにしてもょ 、し、ある 、は異なる多孔 質構造体が粒状の配置パターン、あるいは平面エリアの配置パターンとして、さらに は包接形態等として複層構造化されて 、るようにしてもょ 、。
[0052] そして、本発明においては、異なる二種以上の多孔質構造体は、それぞれが、隣 接した状態の組織の各々の再生に適合したものとして定めることが考慮される。
[0053] 本発明の好ましい複層構造を有する多孔質基盤体は、たとえば図 1にその概要を ί列示することができる。
[0054] すなわち、互いに繋がって積層化されている第一の多孔質体 Αと第二の多孔質体 B、そして第三の多孔質体 Cの 2種あるいは 3種の組合せにより構成される。そして周 囲には多孔質膜が配設される。第一の多孔質体 Aは、たとえば上記のように、生体吸 収性合成高分子の 1種類以上のメッシュ体あるいは多孔質体の中に、すなわちメッシ ュ体の網目あるいは多孔質体の孔内に、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、 細胞分化制御因子、およびこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも 1種を 含む多孔質体をさらに形成した複合多孔質体、すなわち複合メッシュ体あるいは複 合多孔質体であってよぐ第二と第三の多孔質体 B、 Cも、生体吸収性合成高分子の 1種類以上のメッシュ体あるいは多孔質体の中に、すなわちメッシュ体の網目ある ヽ は多孔質体の孔内に、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子 、およびこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも 1種を含む多孔質体をさら に形成した複合多孔質体、すなわち複合メッシュ体あるいは複合多孔質体でもよ!ヽ。 第一、第二と第三の多孔質体はすべて、複合メッシュ体あるいは複合多孔質体であ る場合では、それぞれの構成成分の組成、空隙率ゃ孔の大きさや孔の連通性などの 多孔質構造、力学的性質が一つ以上異なることが好ましい。第一と第二、あるいは第 三の多孔質体は複合メッシュ体あるいは複合多孔質体である場合には、第一と第二 、あるいは第三のそれぞれの構成成分の組成、空隙率ゃ孔の大きさや孔の連通性 などの多孔質構造、力学的性質が一つ以上異なることが好ましい。第二と第三の多 孔質体は生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、及び細胞分化制御因子またはそ の誘導体からなる群から選ばれる少なくとも 1種を含む多孔質体の場合では、第二と 第三のそれぞれの構成成分の組成、空隙率ゃ孔の大きさや孔の連通性などの多孔 質構造、力学的性質が一つ以上異なることが好ましい。
[0055] 本発明に用いられるメッシュ体あるいは多孔質体は、主として本発明の複層構造を 有する多孔質基盤体のそれぞれの層に同じ、あるいは違う種類細胞を播種しやすく 、隣接した軟骨'骨、上皮'真皮、上皮'真皮'皮下組織などの組織を再生しやすいこ とから用いられる。メッシュ体は、織物、編物、織布又は不織布等力もなるものでよい 。また、多孔質体は、発泡剤を利用する発泡成形法、凍結乾燥法、あるいは多孔質 ィ匕剤除去法等周知の方法により得ることができる。この多孔質体の発泡成型法にお いては、高分子化合物に発泡剤を添加し発泡剤を発泡させた後、上記高分子を硬 ィ匕させる。高分子の水溶液、或いは乳濁液を凍結した後、凍結乾燥し、架橋処理す ればよい。高分子溶液中に、水溶性の糖類あるいは塩類を添加し、硬化後、該水溶 性物質を水で洗浄除去すればょ 、。
[0056] メッシュの編目の大きさあるいは多孔質体の孔の大きさ、および空隙率は大きくな ればなるほど、機械的強度は低下するものの、播種細胞は多孔質体の細孔に保持さ れるので、多孔質体における播種細胞数を増大でき、骨組織、軟骨組織、皮膚など の組織の再生が効率的になる。
[0057] したがって、そのメッシュの編目の大きさあるいは多孔質体の孔の大きさは、移植さ れる生体内の場所等に応じて、求められる機械強度あるいは弾力性、あるいは骨組 織や軟骨組織や皮膚などの再生速度等を勘案して適宜定められる。
[0058] 本発明の好ましい複層構造を有する多孔質基盤体の例を示したものが図 2、図 3で ある。第一と第二と第三の多孔質体 A、 B、 Cは生体吸収性合成高分子の 1種類以上 のメッシュ体あるいは多孔質体の中に、すなわちメッシュ体の網目ある 、は多孔質体 の孔内に、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子、およびこ れらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも 1種を含む多孔質体をさらに形成し た複合多孔質体、すなわち複合メッシュ体あるいは複合多孔質体であることが好まし い。
[0059] ここで、たとえば本発明の多孔質基盤体（図 2a)の作製方法の好ま 、形態として は、（1)第一の多孔質体 (A)である生体吸収性合成高分子の多孔質体の上に第三 の多孔質体 (C)である生体吸収性合成高分子の多孔質体を載せて積層化した後、 ( 2)第一の多孔質体 (A)と第三の多孔質体 (C)の中にそれぞれ第四の多孔質体 (D) と第六の多孔質体 (F)を構成する生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分 化制御因子、あるいはそれらの誘導体などの 1種以上のものの溶液を含浸させた後 に、（3)凍結乾燥し、好ましくはガス状ないし液状の架橋剤で処理して架橋する方法 が例示される。なお、多孔質膜の配設については上述したとおりである。
[0060] 上記工程（1)においては、生体吸収性合成高分子を用いて、相分離法や粒子溶 出法 (particulate-leaching)や発泡成形法によって実施することができる。生体吸収 性合成高分子を有機溶媒に溶カゝした溶液に直径が異なる 2種類の多孔質化剤とそ れぞれ混ぜて、 2種類の多孔質化剤 Z高分子溶液を調整し、 1種類の多孔質化剤 Z 高分子溶液の上にも 1種類の多孔質化剤 Z高分子溶液をなせて乾燥した後、多孔 質化剤を除去することにより、上記工程（1)の多孔質体を作製できる。
[0061] 上記の生体吸収性合成高分子としては、前述したポリ乳酸、ポリダリコール酸、乳 酸とダリコール酸の共重合体、ポリ ε一力プロラタトン、これらの共重合体などのポ リエステル或いはセルロース、ポリアルギン酸などの多糖類等を挙げることができる。 中でも、本発明において好ましく使用される生体吸収性合成高分子は、ポリ乳酸、ポ リグリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリ ε一力プロラタトン、これらの 共重合体である。
[0062] 上記の生体吸収性合成高分子を溶かす溶媒には、クロ口ホルム、四塩化炭素、ジ ォキサン、トリクロ口酢酸、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、酢酸ェチル、アセトン 、へキサフルォロイソプロパノール、ジメチルァセトアミド、へキサフルオロー 2—プロ パノールなどが挙げられる。 [0063] また、上記の多孔質化剤としては、ブトゥ糖、砂糖などの水溶性の糖質や、塩化ナト リウム、塩ィ匕カリウム、酒石酸ナトリウム、クェン酸ナトリウム、炭酸アンモ-ゥム、炭酸 ナトリウム、重炭酸ナトリウムなどの塩の粒子、結晶が挙げられる。
[0064] そして、上記の多孔質化剤を除去する方法として、純水に浸漬し、純水による洗浄 法が挙げられる。
[0065] 上記の工程 (2)においては、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分ィ匕 制御因子或いはそれらの誘導体などは 1種以上混ぜてから、含浸せしめる力 あるい はそれぞれ 1種以上のものを混ぜて行われる。
この工程 (2)では、第一の多孔質体 (A)である生体吸収性合成高分子の多孔質体 の上に第三の多孔質体 (C)である生体吸収性合成高分子の多孔質体を載せて作製 した多孔質体を前記生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子ま たはこれらの誘導体の水溶液で処理することができる。処理方法としては種々のもの があるが、浸漬法ゃ塗布法が好ましく採用される。
[0066] 浸漬法については上述した方法で行うことができる。塗布法は、生体吸収性天然高 分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子の水溶液の濃度や粘度が高ぐ浸漬法が 適用できないときに有効であり、具体的には、生体吸収性天然高分子、細胞成長因 子、細胞分ィヒ制御因子の高濃度水溶液を生体吸収性合成高分子メッシュ体に塗布 すること〖こより行われる。
[0067] 多孔質基盤体 (図 2b)の作製方法の好ま U、形態としては、 (1)第一の多孔質体（ A)である生体吸収性合成高分子の多孔質体の上に第二の多孔質体 (B)である生 体吸収性合成高分子の多孔質体を積層し、その上にさらに第三の多孔質体 (B)で ある生体吸収性合成高分子の多孔質体を積層した後に、（2)第一の多孔質体 ( と 第二の多孔質体 (B)と第三の多孔質体 (C)の中にそれぞれ第四の多孔質体 (D)、 第五の多孔質体 (E)と第六の多孔質体 (F)を構成する生体吸収性天然高分子、細 胞成長因子、細胞分ィ匕制御因子、あるいはそれらの誘導体などの 1種以上のものの 溶液を含浸させた後に、（3)凍結乾燥し、好ましくはガス状ないし液状の架橋剤で処 理することにより架橋する方法を例示することができる。なお、多孔質膜の配設につ V、ては上述したとおりである。 [0068] 上記工程（1)においては、生体吸収性合成高分子を用いて、相分離法や粒子溶 出法 (particulate-leaching)や発泡成形法によって作製することができる。生体吸収 性合成高分子を有機溶媒に溶カゝした溶液に直径が異なる 3種類の多孔質化剤とそ れぞれ混ぜて、 3種類の多孔質化剤 Z高分子溶液を調整し、 1種類の多孔質化剤 Z 高分子溶液の上に別種類の多孔質化剤 Z高分子溶液 1種類を載せた後、さらにも 1 種類の多孔質化剤 Z高分子溶液を載せて、乾燥した後、多孔質化剤を除去すること により、上記工程（1)の多孔質体を作製できる。
上記工程（2)と（3)は上記図 2aの場合と同様である。
[0069] 多孔質基盤体 (図 3a)の作製方法の好ま 、形態としては、 (1)第一の多孔質体（ A)である生体吸収性合成高分子の多孔質体を作製した後に、 (2) 2次構造体を構 成する生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子、あるいはそれ らの誘導体などの 1種以上のものの溶液を付着、含浸せしめた後、続いて、（3)この 上に生体吸収性天然高分子の水溶液、細胞成長因子、細胞分化制御因子、あるい はそれらの誘導体などの 1種以上のものの溶液を載せた後、そして、（4)凍結乾燥し 、好ましくはガス状ないし液状の架橋剤で処理することにより架橋する方法が例示さ れる。なお、多孔質膜の配設については上述したとおりである。
[0070] 上記工程（1)においては、生体吸収性合成高分子を用いて、相分離法や粒子溶 出法 (particulate-leaching)や発泡成形法によって作製することができる。生体吸収 性合成高分子を有機溶媒に溶カゝした溶液に多孔質化剤を添加して混合し、乾燥し た後、多孔質化剤を除去することにより、上記工程（1)の多孔質体を作製できる。
[0071] 工程 (2)においては、たとえば、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分 化制御因子或いはそれらの誘導体などは 1種以上混ぜてから、含浸せしめる力 ある いはそれぞれ 1種以上のものを混ぜて行われる。
[0072] 工程 (3)においては、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因 子、あるいはそれらの誘導体などは 1種以上混ぜてから、上記工程（3)の濃度が高い 生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分ィ匕制御因子、あるいはそれらの誘 導体などの 1種以上のものの溶液を付けた第一の多孔質体 (A)の上にさらに静かに 添加、あるいは塗布する。生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御 因子或いはそれらの誘導体などは 1種以上の混合液の重量濃度は 0. 05〜3%であ る。もっとも望ましい濃度は 0. 1〜2%である。
[0073] 構造体 (図 3b)の作製方法の好ましい形態としては、（1)第一の多孔質体 (A)であ る生体吸収性合成高分子の多孔質体を作製した後に、 (2) 2次構造体を構成する生 体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分ィ匕制御因子、あるいはそれらの誘導 体などの 1種以上のものの溶液を付着、含浸せしめた後、続いて、（3)この上に濃度 が高い生体吸収性天然高分子の水溶液、細胞成長因子、細胞分化制御因子、ある いはそれらの誘導体などの 1種以上のものの溶液を載せた後、さらに (4)この上に生 体吸収性天然高分子の水溶液、細胞成長因子、細胞分化制御因子或いはそれらの 誘導体などの 1種以上のものの溶液を載せた後、そして、（5)凍結乾燥し、好ましくは ガス状ないし液状の架橋剤で処理することにより架橋する方法が例示される。なお、 多孔質膜の配設については上述したとおりである。
[0074] 工程（1)においては、生体吸収性合成高分子を用いて、相分離法や粒子溶出法（ particulate-leaching)や発泡成形法によって作製することができる。生体吸収性合成 高分子を有機溶媒に溶カゝした溶液に多孔質化剤を添加して混合し、乾燥した後、多 孔質化剤を除去することにより、上記工程（1)の多孔質体を作製できる。
[0075] 工程 (2)においては、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因 子或いはそれらの誘導体などは 1種以上混ぜてから、含浸せしめる力 あるいはそれ ぞれ 1種以上のものを混ぜて行われる。
[0076] 工程 (3)においては、濃度が高い生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分 化制御因子或いはそれらの誘導体などは 1種以上混ぜてから、上記工程（2)の生体 吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子或いはそれらの誘導体など の 1種以上のものの溶液を付着、含浸せしめた第一の多孔質体 (A)の上に添加、あ るいは塗布することができる。生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制 御因、あるいはそれらの誘導体などは 1種以上の混合液の重量濃度は 0. 1〜5%で ある。もっとも望ましい濃度は 0. 3〜5%である。
[0077] 工程 (4)にお 、ては、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因 子或いはそれらの誘導体などは 1種以上混ぜてから、上記工程 (3)の濃度が高！、生 体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因、あるいはそれらの誘導体 などの 1種以上のものの溶液を付着させた第 1多孔質体 (A)の上にさらに静かに添 カロ、あるいは塗布することができる。生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞 分ィ匕制御因子、あるいはそれらの誘導体などは 1種以上の混合液の重量濃度は 0. 05〜3%である。もっとも望ましい濃度は 0. 1〜2%である。
実施例
[0078] 以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。もちろん以下の例によって発明 が限定されることはない。
[0079] [実施例 1]
例として、ポリエチレンシリンダーフレームとナイロンメッシュで作ったフレーム中に 生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体 (PLGA)と生体吸収性天 然高分子であるブタ皮膚由来ペプシン可溶化 I型コラーゲンとの複合スポンジ (PLG A—コラーゲン複合スポンジ)部分とブタ皮膚由来ペプシン可溶化 I型コラーゲンスポ ンジ部分より構成され、階層構造を有する PLGA—コラーゲン複合スポンジ Zコラー ゲンスポンジを導入した多孔質体を調製した。
[0080] 内径力 ½mmのポリエチレンシリンダーフレームの底面と内側面に直径が 2 μ mのポ ァを有するナイロンメッシュを熱で貼付し、多孔質基盤体の骨格としてのフレーム状を 作製した。作製した骨格をアルカリ水で洗浄し、超純水でリンスした後、乾燥処理を 行った。
[0081] 口径カ 55 μ mと 425 μ mの篩で直径が 355〜425 μ mの塩化ナトリウムの粒子を ふる 、分けた。乳酸とグリコール酸（75： 25)との共重合体 PLGAをクロ口ホルムに溶 かし、 15(wZv) %の溶液を調製した。
[0082] PLGAのクロ口ホルム溶液をアルミニウム鍋に入れ、直径力 355〜425 μ mの塩ィ匕 ナトリウムの粒子（PLGAの量の 9倍）をこの溶液に入れ、よく混ぜた後、空気中で 48 時間乾燥した。乾燥後、内径が 6. Ommのコルクポーラ一により直径が 6. Ommの塩 化ナトリウム ZPLGAの円柱体をドリルした。塩ィ匕ナトリウム ZPLGA円柱体を蒸留水 に入れ、 2時間ごとに蒸留水を交換し、 4日間洗浄を行った。このようにして、孔の大 きさ力 55〜425 μ mで空隙率が 90%の PLGA^ポンジ円柱体を得た。 [0083] PLGAスポンジ円柱体を空気中で 24時間乾燥した後、さらに真空状態で 12時間 乾燥した。その後、 PLGAスポンジ円柱体を 1. Owt%のブタ皮膚由来ペプシン可溶 ィ匕 I型コラーゲン酸性水溶液 (pH = 3. 0)に浸漬し、真空して PLGAスポンジの孔の 中にブタ皮膚由来ペプシン可溶化 I型コラーゲン水溶液を占めさせた。そして、ブタ 皮膚由来ペプシン可溶化 I型コラーゲン水溶液で満たした PLGAスポンジ円柱体を 作製したポリエチレンシリンダーフレームとナイロンメッシュの骨格に入れ、上の端に さらに 1. Owt%のブタ I型ァテロコラーゲン酸性水溶液を入れて、—80°Cで 12時間 凍ホ し 7こ。
[0084] 凍結した後、真空減圧下 (0. 2Torr)で 24時間凍結乾燥し、ポリエチレンシリンダ 一フレームとナイロンメッシュの骨格に PLGAスポンジの中にコラーゲンスポンジを开 成すると共に PLGA^ポンジの一端にコラーゲンスポンジを形成した。
[0085] 作製した材料を 37°Cで、 25wt%のダルタルアルデヒド水溶液で飽和したグルタル アルデヒド蒸気で 4時間架橋処理した後、蒸留水で 5回洗浄した。さらに、 0. 1Mのグ リシン水溶液で 24時間処理した後、蒸留水で 20回洗浄した。これを— 80°Cで 12時 間凍結し、真空減圧下 (0. 2Torr)で 24時間凍結乾燥することにより、ポリエチレン シリンダーフレームとナイロンメッシュの骨格に PLGAスポンジの中にコラーゲンスポ ンジを形成すると共に PLG ポンジの一端にコラーゲンスポンジを形成した階層構 造を有する PLGA—コラーゲン複合スポンジ Zコラーゲンスポンジを調製した。得ら れた階層構造を有する PLGA—コラーゲン複合スポンジ Zコラーゲンスポンジを金 でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡 (SEM)で観察した。電顕写真 を図 6に示す。
[0086] [実施例 2]
例として、ポリエチレンシリンダーフレームとナイロンメッシュで作ったフレーム中に 生体吸収性天然高分子であるゥシ I型ァテロコラーゲンのスポンジを導入した多孔質 体を調製した。
[0087] 内径力 ½mmのポリエチレンシリンダーフレームの底面と内側面に直径が 2 μ mのポ ァを有するナイロンメッシュを熱で貼付し、多孔質基盤体の骨格としてのフレームを作 製した。作製した骨格をアルカリ水で洗浄し、超純水ですすいだ後、乾燥した。 [0088] 作製した骨格をブタ皮膚由来ペプシン可溶化 I型コラーゲン酸性水溶液に浸漬し、 水溶液が氷らない程度の真空減圧し、骨格中の泡を抜き、コラーゲン水溶液で満た した。コラーゲン水溶液で満たした骨格を— 80°Cで 6時間凍結した。次にこの凍結物 を、真空減圧下 (0. 2Torr)で 48時間凍結乾燥し、骨格中にコラーゲンスポンジを形 成した未架橋足場材料を製造した。
[0089] 得られた未架橋足場材料を 37°Cで、 25wt%のダルタルアルデヒド水溶液で飽和 したダルタルアルデヒド蒸気で 4時間架橋処理した後、リン酸緩衝液で 10回洗浄した 。さらに、 0. 1Mグリシン水溶液に 4時間浸漬し、リン酸緩衝液で 10回洗浄した後、 蒸留水で 3回洗浄し、— 80°Cで 12時間凍結した。これを真空減圧下 (0. 2Torr)で 2 4時間凍結乾燥し、足場材料として、本発明における細胞の多孔質基盤体を得た。
[0090] 得られた多孔質基盤体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡 ( SEM)で観察した。電顕写真を図 7に示す。
[0091] [実施例 3]
実施例 2で調整した多孔質体を用いて、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を担持させ てなる軟骨組織の再生移植体の再構築を行った。
[0092] Cambrex (CambrexBioScienceWalkersville,Inc.)社から購入したヒト骨髄由来の間 葉系幹細胞を、 Cambrex (CambrexBioScienceWalkersville.Inc.)社より購入した増殖 培地（間葉系幹細胞用基礎培地に、 10%ゥシ胎児血清とペニシリン Zストレプトマイ シン、 L—グルタミンを添カ卩した培地で、 37°C、 5%CO雰囲気下で 2回継代培養し
2
た。 2回継代培養した骨髄細胞を 0. 025%トリプシン Z0. 01%EDTA/PBS (-) で剥離'採集し、 1. 5 X 106cellS/mL骨髄細胞液を調製した。次に、酸化エチレン ガスで滅菌した上記三次元多孔質材に 1000 1細胞液を滴加し、細胞を播種した。 播種後、多孔質基盤体の外に漏れた液を回収し、細胞の数を数えた。その結果、播 種した細胞の播種効率は 95. 2± 1. 0%で非常に高力つた。その後、細胞を播種し た細胞の多孔質基盤体を T75培養フラスコに移して、 50mLの MSC増殖培地を入 れて、揺らしながら、 1週間培養した。 1週間培養後、培地を血清が含まない、抗生物 質、 4500mg/Lのグルコース、 584mg/Lのグルタミン、 0. 4mMのプロリンおよび 50mg/Lのァスコルビン酸、 ΙΟΟηΜのデキサメタゾン、 10ng/mLの TGF j8 3を含 有する DMEM分ィ匕培地に変えて、さらに 4週間培養し、軟骨組織を再生した。 再生した組織を HE (へマトォキシリンとェォシン)染色、 Safranin— O染色とトルイ ジンブルー染色を行った結果の写真を示したものが図 8であり、円形細胞と Safrani n— O染色とトルィジンブルー染色性細胞外マトリックスが確認することができた。

Claims

請求の範囲
[I] 細胞の播種用孔を有する多孔質基盤体であって、細胞の播種用孔を有する多孔 質な主体の外周面に前記細胞よりも小さい孔カ なる多孔質膜を配設してなることを 特徴とする多孔質基盤体。
[2] 請求項 1に記載の多孔質基盤体にぉ 、て、その主体が、フレーム状の骨格を有す ることを特徴とする多孔質基盤体。
[3] 請求項 1に記載の多孔質基盤体にぉ 、て、その主体が、カゴ状の骨格を有すること を特徴とする多孔質基盤体。
[4] 請求項 1から 3の 、ずれかに一項に記載の多孔質基盤体にぉ 、て、その多孔質膜 は、生体吸収性物質又は生体非吸収性物質であることを特徴とする多孔質基盤体。
[5] 請求項 1から 4の 、ずれか一項に記載の多孔質基盤体にぉ 、て、その多孔質膜上 に、さらに膜状多孔質体を積層してなることを特徴とする多孔質基盤体。
[6] 請求項 5に記載の多孔質基盤体において、その膜状多孔質体が複数層繰り返して 配設され、多層化されて!/ヽることを特徴とする多孔質基盤体。
[7] 請求項 3に記載の多孔質基盤体において、そのカゴ状主体中に、さらに多孔質物 質を充填してなることを特徴とする多孔質基盤体。
[8] 請求項 7に記載の多孔質基盤体において、その多孔質物質は、生体吸収性物質 であることを特徴とする多孔質基盤体。
[9] 請求項 4又は 8に記載の多孔質基盤体にぉ 、て、その生体吸収性物質は、少なく とも生体吸収性合成高分子、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制 御因子およびこれらの誘導体力 なる群より選ばれる少なくとも 1種よりなることを特徴 とする多孔質基盤体。
[10] 請求項 1から 8のいずれか一項に記載の多孔質基盤体において、互いに異なる性 質を有する層からなる複層構造を有することを特徴とする多孔質基盤体。
[II] 請求項 10に記載の多孔質基盤体において、積層、包接、被覆、粒状もしくは塊状 の接触、立体もしくは平面域のパターン接触、あるいはこれらの 2種以上の組合せに より積層化されていることを特徴とする多孔質基盤体。
[12] 請求項 10又は 11に記載の多孔質基盤体において、複層構造を構成する各層は、 組成、空隙率ゃ孔の大きさや孔の連通性などの多孔質構造、および力学的性質のう ちの少なくとも 1種が互いに異なることを特徴とする多孔質基盤体。
[13] 請求項 1から 12のいずれか一項に記載の多孔質基盤体において、その主体が、生 体吸収性合成高分子、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因 子、およびこれらの誘導体力 なる群力 選ばれる少なくとも 1種よりなることを特徴と する多孔質基盤体。
[14] 請求項 10から 12のいずれか一項に記載の多孔質基盤体において、複層構造の 少くとも 1層は、生体吸収性合成高分子、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、 細胞分化制御因子、およびこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも 1種より なることを特徴とする多孔質基盤体。
[15] 請求項 1から 14のいずれか一項に記載の多孔質基盤体の製造方法であって、主 体に骨格構造を有するものを用い、当該骨格構造の表面に多孔質膜を積層すること を特徴とする多孔質基盤体の製造方法。
[16] 請求項 1から 14のいずれか一項に記載の多孔質基盤体の使用方法であって、そ の主体内に、軟骨細胞または軟骨細胞に分化する幹細胞を担持させることを特徴す る多孔質基盤体の使用方法。
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