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WO2007018152A1 - IgA抗体の選択的産生からIgA及びIgG両抗体産生への切換えを可能にする抗原薬物ビークルとこれを用いる経鼻・粘膜ワクチン - Google Patents

IgA抗体の選択的産生からIgA及びIgG両抗体産生への切換えを可能にする抗原薬物ビークルとこれを用いる経鼻・粘膜ワクチン Download PDF

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WO2007018152A1
WO2007018152A1 PCT/JP2006/315515 JP2006315515W WO2007018152A1 WO 2007018152 A1 WO2007018152 A1 WO 2007018152A1 JP 2006315515 W JP2006315515 W JP 2006315515W WO 2007018152 A1 WO2007018152 A1 WO 2007018152A1
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vaccine
vehicle
antigen
iga
seq
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Hiroshi Kido
Dai Mizuno
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The University Of Tokushima
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    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • Antigen drug vehicle that enables switching from selective production of IgA antibody to production of both IgA and IgG antibodies, and nasal mucosal vaccine using the same
  • the present invention relates to an antigen drug (AD) vehicle that enables nasal, transmucosal and transdermal administration, a method for inducing mucosal immunity and humoral immunity using the same, and more particularly, selective use of IgA antibodies.
  • AD antigen drug
  • the present invention relates to an AD vehicle that enables switching from the induction of production to the induction of both IgA and IgG antibody production, nasal vaccine, mucosal vaccine, and allergy treatment and prevention agent using the same.
  • Vaccination routes are subcutaneous and intramuscular, whereas natural infection routes such as bacteria and viruses are mucous membranes such as the nasal cavity, trachea and intestinal tract. Different from the above inoculation route. It is hoped that infection will be protected by the inoculation route in line with the actual condition of the natural infection, especially the mucosal infection by vaccine administration via the mucosa.
  • Ig G immunoglobulin G
  • IgA antibody secretory immunoglobulin A responsible for mucosal immunity
  • IgA antibody secretory immunoglobulin A responsible for mucosal immunity
  • IgG antibodies are highly specific for antigens, have a narrow spectrum of protection against infection, and are almost ineffective at protecting against antigen-mutated pathogens, whereas secretory IgA antibodies are cross-immune, ie cross-reactive. Because of its neutralizing activity, it also protects against infections against mutant antigens that have a wider spectrum of protection.
  • (1) Increasing the vaccine antigen An attempt has been made to increase the vaccine antigen to be inoculated subcutaneously or intramuscularly, and to increase the amount of IgG and IgA antibodies produced in the mucosa. For example, attempts have been made to increase the amount of antibody production by adding and mixing neuraminidase of the viral membrane protein to a conventional inactive influenza vaccine, or to add and mix MF59 as an adjuvant. However, there are inconveniences such as pain and increased side reactions.
  • Intranasal inactivated vaccine In order to protect against infection with secreted IgA antibody, which is considered to be the most effective, a method in which a liquid split antigen was directly inoculated into the nasal was tried, but the production of IgA was low. It has been pointed out. Therefore, in order to increase IgA antibody production ability, cholera toxin is added to and mixed with split antigen as an adjuvant to try to increase mucosal immune response, that is, IgA antibody production ability. Since it is not guaranteed, it has not been put into practical use.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 a split-type nasal / inactivated influenza vaccine [Berna Biotech (Shi S) 'Brand name Nasalflu] power It was approved in Switzerland as the world's first nasal influenza vaccine and was sold in October 2000. However, clinical use was discontinued in February 2004 because Bell Palsy was detected in 25.2% of the vaccinated group (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • the active ingredient of the vaccine is a live virus, it has a high invasion ability into cells and excellent immunization initialization, but since mild influenza symptoms occur sporadically, infection with influenza tends to increase the severity. It can be used for high-risk humans and the elderly; however, there are drawbacks such as the effectiveness of influenza virus antigens against frequent continuous drift and discontinuous mutation (shift) is unknown.
  • Immune adjuvant is a general term for substances that have regulatory activities such as enhancement and suppression of immune response, and substances related to administration forms for the purpose of sustained release and storage of antigens in the inoculum. And substances that are intended to enhance or suppress the immune response.
  • adjuvants for administration forms for example, vaccines and toxoids using aluminum phosphate, myoban, etc. have already been put into practical use.
  • the practical use of adjuvants to strengthen and improve the immune response has not been known yet.
  • Patent Document 2 JP-A-3-135923
  • Patent Document 3 Japanese Patent Publication No. 10-500102
  • Patent Document 4 Japanese Translation of Special Publication 2001-523729
  • Patent Document 5 Special Table 2002-50452
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-116385
  • Patent Document 7 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-50452
  • Patent Document 8 PCT publication WO00 / 20039 pamphlet Non-patent literature l: New Engl. J. Med., 350, 896-903, 2004
  • Non-Patent Document 2 New Engl. J. Med., 350, 860-861, 2004
  • Non-Patent Document 3 Cleve.Clin.J.Med., 70th, 801-806, 2003
  • Non-Patent Document 4 Am.J.Respir.Cell Mol.BioL, 24th, 452-458, 2001
  • Non-Patent Document 5 AdV / Ances Drug Delivery Rev., 51st, 81-96, 2001
  • Non-patent 6 V / Accine, 21st, 3706-3712, 2003
  • Non-Patent Document 7 Infection and Immunity, Vol. 71, 4780-4788, 2003
  • Non-Patent Document 8 J. neonatal Nursing, Vol. 10, pp. 2-11, 2004
  • Non-Patent Document 9 Biology of the Neonate, 74th (suppll), 9-14, 1998
  • the present invention provides, as means for solving the above problems, an AD vehicle that enables nasal, transmucosal and transdermal administration, a method for inducing mucosal immunity and humoral immunity using the AD vehicle, and more specifically, Provides AD vehicle that enables the switch from selective production of IgA antibody to induction of both IgA and IgG antibody production, nasal vaccine, mucosal vaccine, and allergy treatment and prevention agent using this .
  • AD vehicle provided by the present invention ⁇
  • the general purpose brings about the realization and widespread use of mucosal vaccines for various infectious diseases, allergy prevention and treatment agents, and transmucosal transdermal administration of drugs.
  • nasal or mucosal vaccine is an immunization means that matches the actual condition of natural infection, it exerts a remarkably superior protective effect against infection compared to conventional vaccines.
  • AD Vehicle-induced nasal mucosa IgA and IgG lead to inactivation of allergens and allow desensitization.
  • the application of AD vehicles to a wide variety of drugs enhances and promotes the preventive and therapeutic effects of transmucosal and transdermal administration of drugs.
  • the present invention greatly improves the medical 'health' hygiene of the entire civilization and becomes a long-awaited gospel for workers in the medical / health's health field of the world.
  • FIG. 1 The effect of the amount of surfataten (a type of AD vehicle) added to 0.2 g of a certain amount of vaccine (dry weight) on the production of both anti-influenza IgA and IgG antibodies in the nasal mucosa
  • the amount of antibody is a quantitative value by ELISA
  • n 8 to 12
  • mean value SD significance level for the surfactaten-free vaccine (0 g) administration group by t-test
  • + is p ⁇ 0.08
  • ++ is p ⁇ 0.05
  • +++ is p ⁇ 0.01
  • * is the significance level for the vaccine administered with surfatate 0.1 ⁇ g, p is 0.01.
  • FIG. 2 Variation power of surfataten added to 0.2 g of quantitative vaccine (dry weight) Alveolar mucosae It is a diagram showing the effect on production of both anti-influenza IgA and IgG antibodies in the mucosa.
  • FIG. 3 Variation power of surfactaten added to 0.2 g of a quantitative vaccine (dry weight).
  • FIG. 4 Control group (no vaccine administration), vaccine administration group (AD vehicle-free vaccine), artificial synthetic surfatatant (a type of synthetic AD vehicle) -added vaccine administration group, and surfacten-added vaccine administration group
  • FIG. 3 is a graph showing the production amounts of anti-influenza IgA and IgG antibodies in nasal lavage fluid of group mice.
  • the mouth is the amount of IgA produced
  • the country is the amount of IgG produced
  • the amount of antibody is the quantitative value by ELISA
  • the number of mice in the vaccine administration group n 4
  • t Significance level for the AD vehicle-free vaccine administration group by test + indicates p ⁇ 0.01, and ++ indicates p ⁇ 0.05.
  • FIG. 4 is a diagram showing the production amounts of anti-influenza IgA and IgG antibodies in the alveolar lavage fluid of mice in each group of vaccines administered with an engineered surfatatant (a type of synthetic AD vehicle) and surfacten-added vaccines .
  • FIG. 3 is a view showing the production amounts of anti-influenza IgA and IgG antibodies in blood (serum) of group mice.
  • AD vehicle Antigen and drug vehicle (hereinafter referred to as “AD vehicle”) is a fat and oil designed and designed to enable transmucosal and transdermal administration of antigens and drugs. A complex with a protein The AD vehicle consists of (a) and Z or (b) and (c):
  • Pulmonary surfatatant protein B or a fragment thereof an artificial fragment obtained by genetic engineering or peptide synthesis other than natural fragments obtained by proteolytic enzymes, one or more amino acids constituting such fragments are substituted and Z Or deleted mutant fragments etc.
  • Lung Surfactant Protein C or a fragment thereof an artificial fragment obtained by genetic engineering or peptide synthesis other than natural fragments obtained by proteolytic enzymes, one or more of the amino acids constituting such fragments are substituted and Z Or deleted mutant fragments, etc.
  • Lipids such as phospholipids and fatty acids.
  • the shape structure of the AD vehicle is a membrane shape (sheet-like or rolling lipid membrane) having a spine-like or spike-like polypeptide chain on the surface, and the end of the hydrophobic region of a plurality of polypeptide chains. It is a force that is inserted into a lipid membrane and planted in a snoak-like manner, and is different from conventional lipid vesicles (ribosomes). If a desired antigen, drug, etc. coexists, contacts, captures, adsorbs or binds to the AD vehicle according to the present invention (if it is placed), the antigen, drug, etc. Mucosal administration and transdermal administration are possible. In other words, the vehicle is a vehicle that enables transmucosal and transdermal administration of antigens, drugs, and the like.
  • Pulmonary surfactant Pulmonary surfactant has been put into practical use since 1987 for the treatment of respiratory distress syndrome (RDS) and is currently used for pulmonary surfactants derived from humans, urchins, pigs, etc.
  • Non-patent Document 8 pulmonary and porcine-derived lung surfactants are commercially available and commonly used.
  • Synthetic peptide preparations containing an active domain for RDS treatment are also commercially available, and the design development and synthesis of SP-B and SP-C analogs are also in progress (Non-patent Document 9).
  • composition and composition of pulmonary surfatatant is as follows: about 90% by weight lipid (phosphatidylcholine 67.3%, phosphatidylglycerol 19.3%, phosphatidylserine 3.2%, other free fatty acids, etc.) and about 10% by weight % Protein (surfactant protein A, B, C and D; hereinafter abbreviated as “SP-A”, “SP-B”, “SP-C” and “SP-D”, respectively) is there.
  • the molecular weight is 26-38 kDa for SP-A, 5-8 kDa for B, 4-5 kDa for C, and 3 kDa for D force.
  • SP-A and D are hydrophilic (water-soluble) and lectin-like (membrane associated).
  • SP-B and C are hydrophobic (lipid-soluble) and lipid-binding, and have an ability to fit into a phospholipid membrane and a surface-active effect.
  • Pulmonary surfatatant protein genes derived from humans, ushi, pigs, etc. are known, for example, the human SP-B gene DNA in GenBank / NCBI (http: ⁇ www.ncbi.nlm.nih.gov/) The accession number of the full-length base sequence is J02761, that of human SP-C (and SP-C1) is J0 3890.
  • the coding regions (CDR) of human SP-B and C obtained from NCBI and the amino acid sequence encoded by them are described below.
  • SEQ ID NO: 1 CDR base sequence of human SP-B gene DNA
  • SEQ ID NO: 2 human SP-B full-length amino acid sequence decoded from SEQ ID NO: 1;
  • SEQ ID NO: 3 CDR base sequence of human SP-C gene DNA
  • SEQ ID NO: 4 human SP-C full-length amino acid sequence decoded from SEQ ID NO: 3;
  • SEQ ID NO: 5 CDR base sequence of SP-C1 occupying on human SP-C gene DNA; and
  • SEQ ID NO: 6 human SP-C1 full-length amino acid sequence decoded from SEQ ID NO: 5.
  • SP-B is 80 (or 79 or 81) amino acid residues from the 201st to the 280th (also reported as 279 or 281) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It exists as a molecule consisting of SP-C exists as a molecule consisting of 35 amino acid residues from No. 24 to No. 58 in SEQ ID NO: 4 or 6.
  • Protein or peptide used in this invention Preparation and manufacture of AD vehicle according to this invention SP-B and SP derived from mammals such as humans, horses, horses, hidges, pigs, whales, and dolphins
  • a combination of -C and a combination of SP-B and SP-C1 can be used, respectively.
  • the human-derived protein having the full-length amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 2, 4, and 6 above, the combination of SP-B and SP-C, and the combination of SP-B and SP-C1 , Each can be used.
  • the hydrophobic (lipid-soluble) region of SP-B and SP-C based on the hydrophobicity value of Kyte-Doolittle and a fragment containing the region, at least one amino acid of such a fragment peptide is substituted and Z or deleted Mutated fragments etc. can also be used.
  • a natural peptide having the amino acid sequence ability shown in SEQ ID NOs: 7 to 20 shown below is a peptide obtained by genetic engineering or chemical synthesis, a longer chain peptide containing these peptides, and force Mutants in which at least one amino acid of the peptide is substituted and Z or deleted, synthetic analogs, and the like can be used.
  • the amino acid numbers are indicated by ordinal numbers sequentially assigned in the C-terminal direction (left force right direction of the described sequence), with Met occupying the N-terminus of each sequence being the first amino acid.
  • the polypeptide contained in the amino acid sequence from No. 201 to No. 280 of SEQ ID NO: 2 uses, for example, the “SP-B (l-80) fragment” with the 201st Phe as the first. ".
  • the same SP-C fragment is described as “SP-C (l-35) fragment”, for example, with the 24th Phe in SEQ ID NO: 4 as the first.
  • SEQ ID NO: 7 amino acid sequence Nos. 214 to 225 of SEQ ID NO: 2 (SP-B fragment);
  • SEQ ID NO: 8 amino acid sequence of Nos. 226 to 275 of SEQ ID NO: 2 (SP-B fragment);
  • SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 4 and 6, amino acid sequence Nos. 29-58 (SP-C fragment);
  • SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 2, amino acid sequence No. 1-20 (SP-B fragment) );
  • SEQ ID NO: 11 Amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 from No. 102 to No. 110 (SP-B fragment); SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 2 No. 119 c No. 127 amino acid sequence (SP-B fragment); SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 2 No. 136 c No. 142 amino acid sequence (SP-B fragment); SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 2 No. 171 C No. 186 amino acid sequence (SP-B fragment); SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 2 No. 201 C No. 280 amino acid sequence (SP-B (l-80) fragment) SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 2, No. 300, No.
  • SEQ ID NO: 27 SP-CL [Synthetic SP-C (7-28) fragment]:
  • SEQ ID NO: 28 SP-C33 (SP-C type synthetic peptide);
  • SEQ ID NO: 29 SP-C (FFI) [a synthetic peptide obtained by substituting the 28th to 29th amino acid residues CC for FF and the 56th amino acid residue M to I for a SP-C (25-58) fragment]; as well as
  • SEQ ID NO: 30 SP-C (KLS) (a hybrid (fusion) type synthetic peptide mimicking SP-B and SP-C)
  • SP-C KLS
  • SP-C a hybrid (fusion) type synthetic peptide mimicking SP-B and SP-C
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 2, 7, 8, 10 to SP-B consisting of the amino acid sequence described in 24 and at least one selected from the group strength thereof, and Z or
  • SP-B consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 4, 6, 9, 20, 25 and 26
  • a combination of C (and SP-C1) and at least one selected from fragments thereof, that is, the above (a) group alone, (b) group alone, and (a) and (b) a combination of both groups are used.
  • they may be mixed or Each can be a fusion protein (fusion peptide).
  • Lipids used in the present invention As phospholipids, it is desirable to use phospholipids contained in lung surfatatant, such as phosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, phosphatidylserine, and the like.
  • diacylglycose phosphoglycerols phosphatidyl glycerols, dilauroyl phosphatidyl glycerols, dimyristoyl phosphatidyl glycerol, dipalmitoyl phosphatidyl glycerol, distearoyl phosphatidyl glycerol, phosphatidyl inositol, phosphatidyl ethanolamine, phosphatidic acid, sufingo Myelin or the like can be used.
  • the fatty acid lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, palmitoleic acid, oleic acid and the like can be used.
  • lipids derived from aquatic animals such as whales, tuna and dolphins whose lungs are actively expanded can be used.
  • Pulmonary surfatatant preparations reported for RDS treatment are approved by the relevant authorities, and hydrophobic or lipophilic SP-B And other known pulmonary surfactants containing SP-C and phospholipid, for example, trade name Sa ⁇ faguan (; irfacten, Infasurf ⁇ and urosurf ⁇ Humansurf ⁇ Exosurf ⁇ Alveof act, Surfacxin, etc. can be used as AD vehicles.
  • This invention is in the intense and severe whirl of the background art described above, and is based on the outstanding insight and analysis ability of the leading inventor who has gone through over 10 years of trial and error, deep academic experience, and novel ideas. And based on the following amazing discoveries:
  • the combination of SP-B and SP-C and a phospholipid, or a lipid such as this is used as an influenza virus' split antigen, which has been used as a safe and inactive vaccine antigen.
  • a phospholipid or a lipid such as this
  • an influenza virus' split antigen which has been used as a safe and inactive vaccine antigen.
  • synthetic peptide of both SP-B and SP-C fragments including soluble region (effective region) and lipid membrane complex (AD vehicle) high safety of split antigen is maintained.
  • split antigen alone can selectively induce IgA production with sufficiently enhanced and supplemented activation of antigen-presenting cells, which is inferior to live vaccines.
  • the leading inventor has conducted extensive research to elucidate the mechanism of influenza onset, treatment and prevention.
  • pulmonary surfatatant adsorbs the tryptase clara, an HA processing protease in the respiratory tract that restricts the influenza virus membrane protein hemadalchun (HA) to express viral membrane fusion activity and infectivity.
  • HA hemadalchun
  • lung surfatatants selectively activated mucosal antigen-presenting cells to activate immunity against viral antigens, and secreted Ig A It was found that IgG induction was not caused, but induction of IgG was caused. Furthermore, SP-B and SP-C, together with lipid components, are important as active ingredients for enhancing mucosal immunity in pulmonary surfactants. We identified the effective region of these protein components and verified the effectiveness of enhancing mucosal immunity.
  • the above pulmonary surfactant is a physiologically active substance in the living body, and (a) has the property of adsorbing a specific biological substance [Kido et al., FEBS Lett., 322 (29), 115-119, 1992 ], (B) Alveolar type II cells and Clara cells are secreted and selectively taken up into macrophages for metabolism (Akira Suwabe, J.Jpn.Med.Soc.Biol.Interface, 33, 10-13, 2002), and (c) repeated research focusing on the uptake and metabolism of related cells such as antigen-presenting cells (rod cells).
  • rod cells antigen-presenting cells
  • SP-B 214-225 Leu He Lys Arg He Gin Ala Met He Pro Lys Gly (SEQ ID NO: 7); and SP-B 257-266: Leu Leu Asp Thr Leu Leu Gly Arg Met Leu (SEQ ID NO: 8).
  • the active ingredient region of SP-C or the mucosal immunity-inducing active domain is a peptide consisting of the following amino acid sequences:
  • SP-C 29-58 Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu lie Val Val Val Val Val Leu lie Val Val Val He Val Gly Ala Leu Leu Met Gly Leu (SEQ ID NO: 9).
  • the active ingredient of pulmonary surfatatant induces increased expression of MHC Class II, CD40, and B7-2 in antigen-presenting rod cells and presents antigen to T lymphocytes
  • 81 was induced to promote the class switch to IgA-producing B lymphocytes.
  • the nasal mucosal vaccine immune function prepared by mixing a split influenza virus vaccine antigen with an AD vehicle has a switch that converts from selective induction of IgA production to induction of both IgA and Ig G production. This is the amount of AD vehicle (V) and vaccine It was found that the weight ratio of raw material (A) depends on V / A. However, when nasally inoculating a relatively large amount of vaccine antigen (15 mg / Kg or more), both mucosal immunity IgA and systemic immunity IgG are induced regardless of the V / A ratio.
  • the first purpose is to establish a mucosal immunization method.
  • the “AD vehicle” By providing and utilizing the “AD vehicle”, it is possible to achieve the selective induction of antigen-specific IgA production, an effective substance for mucosal immunity, and the nasal mucosal vaccine that induces both IgA and IgG production. Establish and induce effective mucosal immunity (without side effects).
  • the second objective is to improve the quality of AD vehicle safety 'effectiveness' homogeneity by using synthetic peptides.
  • SP-B mucosal immunity-inducing activity domain consisting of the aforementioned amino acid sequences of SP-B 214-225 and SP-B 257-266
  • SP-C mucosal immune activity-activating domain SP -C 29-58 (which also has the amino acid sequence capability), synthetic analogs thereof, and long-chain synthetic peptides containing these amino acid sequences as a part of the peptide and the pulmonary surfactant lipid component.
  • AD vehicle can be used as an inactive vaccine for respiratory tract virus, such as influenza, SARS, measles
  • Inactivated vaccines such as rubella, mumbus, etc.
  • inactivated vaccines such as rota, polio and other inactivated vaccines for enteric infection viruses, and these subcutaneous vaccines are used as mucosal vaccines. Convert to
  • the fourth objective is the use of AD vehicles for inactive vaccines against viral infections other than the respiratory tract and intestinal tract, such as AIDS, hepatitis B, hepatitis C, etc. Is to provide a simple method.
  • the fifth objective is to provide methods that can use AD vehicles for DNA vaccines, live vaccines, and prevention and treatment of allergies.
  • the sixth purpose is to provide an AD vehicle that can be used for transcutaneous inoculation (application, application, etc.) as an immunization route capable of inducing IgA other than mucosa.
  • the seventh purpose is not only for drug delivery systems and pharmaceuticals, but also for agriculture, fishing, etc.
  • the purpose is to pave the way for applications and applications of AD vehicles.
  • AD vehicle proposed by the present invention differs in performance and action from the adjuvants conventionally used in immunology as follows:
  • Conventional adjuvants are usually inoculated subcutaneously or intramuscularly, causing a local inflammatory reaction, attracting antigen-presenting cells and B- and T-lymphocytes, and using foreign substances that demonstrate their ability as active ingredients. Furthermore, in order to maintain an inflammatory response over a long period of time, mineral oil and metal salts that cause slow release and storage of antigen are used in combination.
  • a conventional mucosal vaccine adjuvant is, as described above, foreign substances such as Escherichia coli heat-labile toxin and cholera toxin, which may cause harmful effects and side effects.
  • the AD vehicle according to the present invention does not cause a local inflammatory reaction.
  • the active component in the lung surfatatant or its active domain is limited, and the low-molecular peptide containing the domain region is also used.
  • An effective mucosal vaccine has been realized. It is therefore extremely safe and non-invasive.
  • Lung Surfactant Protein B fragments thereof and synthetic structures mimicking these functional structures
  • Z or Lung Surfactant Protein C fragments thereof and this Antigen drug (AD) that is a complex consisting of at least one protein selected from synthetic peptides mimicking functional structures such as (B group) and at least one lipid group selected from lipids (group C)
  • the mucosal vaccine obtained by coexisting, contacting, capturing or adsorbing an antigen that induces mucosal immunity IgA in a vehicle, the weight of the dry mass (V) of the vehicle and the dry mass (A) of the antigen.
  • a mucosal vaccine that induces production of both IgA and IgG antibodies, wherein the ratio V / A is adjusted to exceed about 1.
  • antigen refers to a highly purified antigen for vaccines, about 90% or more of antigens derived from pathogens such as viruses, bacteria, and molds, toxins, inactivated antigens, toxoids, and the like. It means epitopes and the like, and allergens, allergen epitopes, proteins, glycoproteins, macromolecular carbohydrates and nucleic acids, etc., having a purity of about 90% or more.
  • AD vehicle includes the following group A (pulmonary sulfatatant protein B, natural fragments and synthetic peptides derived from or derived from protein B), and group Z or B (pulmonary surfatatant protein C, Natural fragments and synthetic peptides derived from or derived from protein C) and at least one group selected from group C (lipid group such as phospholipid and fatty acid), that is, each group of groups A and C At least one total force selected at least one type, or each group power of Group B and Group C At least two types selected at least one type, or at least one from each of Group A, Group B, and Group C There are a total of at least three complex materials selected:
  • polypeptide consisting of an acid sequence (the amino acid number is the N-terminal Met as the first amino acid, which is sequentially attached in the C-terminal direction), and possesses at least one of the above amino acid sequences as an active domain
  • Polypeptides polypeptides in which at least one amino acid of each of the above amino acid sequences is substituted and Z or deleted, synthetic peptides or analogs mimicking these functional structures, depending on their sugars or sugar chains Modifications etc., for example, synthetic SP-C (7-28) fragment SP-CL (SEQ ID NO: 27), SP-C type synthetic peptide SP-C33, SP-C (25-58) fragments 28-29 Synthetic peptide SP-C (FFI) (SEQ ID NO: 29), in which amino acid residue CysCys is replaced with PhePhe and amino acid residue Met is replaced with lie,
  • Phospholipids such as phosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, phosphatidylethanolamine, phosphatidic acid, fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, etc. Lipids.
  • IgA antibody production is selected, characterized in that the weight ratio V / A between the vehicle amount (V) and antigen amount (A) described in (1) above is adjusted to about 1 or less.
  • the group (A) described in (1) above is the protein power of each amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 2, 7, 8, 10-19, 21-24, 26, and 30 (1) or ( Mucosal vaccine according to 2)
  • the antigen (A) of (1) and (2) is an allergen, an allergen epitope, or an allergen-derived antigen.
  • AD vehicle composition (1) AD vehicle composition:
  • Group A pulmonary surfatatant protein B and natural and synthetic polypeptides derived from or caused by protein B
  • group Z or B derived from or derived from pulmonary surfatatant protein C and protein C
  • a mixer for example, a box mixer (for example, the trade name Vortex Mixer).
  • lipid in group C for example, a mixture of phosphatidylcholine 71 mg, phosphatidylglycerol 21 mg, and phosphatidylserine 4 mg can be adopted (the total amount of lipids is 96 mg).
  • SP-A and SP-D have been removed and the inclusion of SP-B and SP-C has been reported for pulmonary surfactant preparations for the treatment of RDS, such as Surfacten, artificially synthesized Surfactin (Surfacxin), etc. If you use The suspension prepared according to the instructions can be used as it is as an AD vehicle solution.
  • AD vaccine solution by adding it to the vaccine stock solution so that V / A becomes the desired value.
  • V / A l
  • the added amount of AD vehicle (50 mg / ml) solution prepared in (2) above Is 50 ⁇ ⁇ .
  • a homogenizer, mixer, shaker, stirrer, etc. can be used for uniform mixing.
  • An antigen is an allergen having a purity of about 90% or more highly purified for vaccines, such as bacteria-derived antigens, virus antigens, toxoids, etc. , Protein, glycoprotein, macromolecular carbohydrate and nucleic acid.
  • vaccines such as bacteria-derived antigens, virus antigens, toxoids, etc. , Protein, glycoprotein, macromolecular carbohydrate and nucleic acid.
  • measured values can be used, or calculated values of antigen purity, specific activity, molecular weight, antigen-antibody reaction and the like can be used.
  • V value in the calculation of the weight ratio V / A is that lipid or phospholipid occupies about 90% by weight or more of AD vehicle in normal preparation. Therefore, lipid amount or phospholipid is used instead of AD vehicle amount. Mass can be used.
  • the dry weight (A) of the antigen in the mucosal vaccine of the present invention is about 0.1 to about 50 ⁇ g / kg, preferably about 0.3 to about 30 / z g / Kg.
  • the V / A for preferentially and selectively inducing IgA antibody production is preferably about 0.1 to about 1.0.
  • V / A for inducing the production of both IgA and IgG antibodies can be in the range of about 1.0 to about 100, preferably about 20 to about 50.
  • Reference example 1 AD vehicle preparation and preparation:
  • a lung surfatatant used as an AD vehicle exemplified below: a preparation prepared from bovine lung by the method of Howood et al. (Biochemistry, 24, 184-190, 1985). The ability to remove the water-soluble protein components SP-A and SD-D by extraction with 1-butanol or reduced to below the detection limit (Haasman HP et al., J. Biol.
  • phospholipids such as phosphatidylcholine dipalmitoylphosphatidylcholine as a whole 40% by weight or more, phosphatidylglycerol about 10-about 30% by weight, phosphatidylserine about 2-about 5% by weight, About 1.0% to about 20% by weight of palmitic acid
  • lipids that are chosen to be isotropic, and the lipophilic (hydrophobic) protein derived from pulmonary surfatatant, the effective region of SP-B and Z or SP-C or Synthetic peptides containing the effective region, for example Effective region of human SP-C (amino acid sequence Nos.
  • Synthetic peptide comprising FGIPCC PVHLKRLLIVWVWLIVWIVGALLMGL is contained in about 0.1-about 12% by weight, respectively.
  • ⁇ -propiolatone was hydrolyzed by incubating at 37 ° C. for 1.5 hours.
  • Tween80 [Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Japan)] is added and mixed with this so that the final concentration becomes 0.1% by weight.
  • jetyl ether [Wako] Junyaku Co., Ltd. (Japan)] was added and mixed, and then mixed by inversion at 4 ° C for 2 hours. This solution was centrifuged at 2,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was collected and collected.
  • the split influenza vaccine stock solution obtained in Experimental Example 1 and the AD vehicle preparation described in Reference Example 1 were mixed and used.
  • the AD vehicle was suspended in PBS (phosphate buffer saline) to a concentration necessary for vaccine administration, and then homogenized by sonication at room temperature for 5 minutes.
  • 0.1 g of the above vaccine stock solution (dry weight) is added to 0.1 g of AD vehicle (dry weight), mixed with a vortex mixer, and then allowed to stand at room temperature for 1 hour to induce IgA.
  • a nasal mucosal vaccine was prepared.
  • a nasal / mucosal vaccine for induction of both IgA and IgG was prepared in the same manner as described above.
  • the protein content of nasal lavage fluid, lung lavage fluid and serum was measured using BCA Protein Assay Reagent Kit [Peirce (USA)] (Anal. Biochem., 150, 76-85, 1985) 0 wavelength 562 nm
  • the absorbance of was measured using SPECTRA Max PLUS 384 (Molecular Devices Corporation (USA)).
  • IgA and IgG antibodies were purified and prepared as follows for use as quantification standards or standards in ELISA.
  • Recombinant E. coli expression Protein G Sepharose 4B column [Zymed Laboratories Inc. (USA)] was used for affinity chromatography to purify the IgG fraction from the alveolar lavage fluid of influenza vaccine-administered and influenza virus-infected mice.
  • an anti-mouse IgA goat IgG antibody [Sigma (USA)] was bound to a BrCN-activated Sepharose 4B column [Amersham Bioscience (USA)], and this was used from the Protein G fraction.
  • the IgA fraction was purified by fifty chromatography.
  • influenza virus chromatography was performed by antigen affinity chromatography in which the inactivated split influenza vaccine antigen used for immunization was bound to BrCN-active Sepharose column.
  • IgA and IgG antibodies specific for each were purified and prepared.
  • a binding reaction was performed using 0.1 MN aHCO / 0.5 M NaCl buffer (pH 8.5), and the free ligand was 0.
  • ELISA The contents of anti-influenza virus IgA and IgG antibodies in nasal lavage fluid, alveolar lavage fluid and serum were quantified by ELISA.
  • ELISA was performed using a Mouse ELISA quantitatin kit [Bethyl Laboratories (USA)].
  • 96 ⁇ l Nunc Imunoplate [Nalgen Nun clnternational (USA)] each vaccine with 1 ⁇ g of vaccine and urine serum albumin [BS A; Sigma (USA)] 1 1 g / ml PBS solution
  • the solidification reaction was carried out at 4 ° C.
  • the vaccine solution was removed by rinsing three times with a washing solution (50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 0.05 wt% Tween 20, pH 8.0). Each well was supplemented with 200 mM 50 mM Tris-HCL buffer (pH 8.0) containing 0.15 M NaCl and 1 wt% BS A, and a blocking reaction was performed at room temperature for 1 hour.
  • a washing solution 50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 0.05 wt% Tween 20, pH 8.0.
  • nasal washing solution diluted to an appropriate amount with a sample binding buffer (50 mM Tris, 0.15 M NaCl, 0.05 wt% Tween 20, 1 wt% BSA, pH 8.0), After adding 100 parts of lung lavage fluid or serum, the mixture was reacted at room temperature for 2 hours.
  • Antibody mouse IgA goat IgG antibody or IgG—Horse radish peroxidase (Be thyl Laboratories Inc. (USA) was used as a secondary antibody, and TMB Micowell Peroxidase Subsatrate System [Kiregaard & Perry Laboratoties, Inc. (Made in USA) was used for color reaction.
  • 100 1 2 M H SO [Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Japan)]
  • the absorbance at 450 nm was measured with SPECTRA MAX PLUS 384.
  • SPECTRA MAX PLUS 384 As a standard reagent (antibody) for quantification, use the lung lavage fluid obtained in Experimental Example 7. Using these purified 'anti-influenza viruses IgA and IgG, the absorbance was measured in the same manner as described above, and these measured values were used as standards.
  • a mucosal vaccine was prepared by sonicating the mixture of this and the influenza inactivated vaccine obtained in Experimental Example 1.
  • Surfataten was suspended in PBS to the concentration required for each vaccine administration at the time of use, and a uniform suspension was obtained by sonication at room temperature for 1 minute.
  • the above surfataten suspension should be adjusted to 0 (no addition), 0.02, 0.1, 0.2, 1.0 and 2.0 ⁇ g in phospholipid amount. After mixing with a vortex mixer, the mixture was sonicated at room temperature for 3 minutes. Each vaccine solution was incubated at room temperature for 1 hour before administration.
  • each vaccine solution is diluted with PBS to a dry vaccine equivalent weight of 0.1 ⁇ / ⁇ ⁇ solution, and these are administered to both nasal cavities of BALB / c mice for the first immunization. did.
  • secondary immunization was performed in the same manner as the first immunization, and nasal lavage fluid, alveolar lavage fluid, and serum were collected from each mouse 2 weeks later, and prepared for anti-influenza IgA and IgG. Used for quantification.
  • level + indicates p ⁇ 0.08, ++ indicates p ⁇ 0.05, +++ indicates p ⁇ 0.01, and * indicates a significant level for the surfatate 0.1 ⁇ g supplemented group, p indicates 0.01.
  • the amount of surfataten was 1.0 to 2.0 g (hereinafter referred to as “high dose” group)
  • the amount of anti-influenza IgG produced in the nasal cavity and alveolar mucosa increased depending on the amount of surfataten (Fig. 1 and Figure 2).
  • blood IgG production was significantly enhanced in the group using 2.0 g of surfataten ( Figure 3).
  • the IgA production in this high dose group was not significantly enhanced compared to that in the above low dose group, and no enhancement of mucosal immunity in the low dose group was observed (FIGS. 1 and 2). ).
  • V / A weight ratio of dry vaccine dose
  • IgA was produced when V / A was about 1.0 or less;
  • the phospholipid amount (weight) in the AD vehicle was used as the V value in the above V / A calculation. However, since 90% by weight or more of the components of the AD vehicle according to the present invention is usually phospholipids, in adjusting the weight ratio V / A in carrying out the present invention, phosphorus is used as the V value. It was judged that not only the lipid amount but also the lipid amount (including phospholipids) or AD vehicle amount (dry weight) could be adopted.
  • FGIPCCPV a synthetic peptide of the effective region of human-type SP-C (SEQ ID NO: 20) with a purity of 95% or more HLKRLLIVWVWLIVWIVGALLMGL [synthesized by Greiner Bio-One (Germany)] was ordered and purchased. Suspend this in CM buffer (buffer mixture of black mouth form Z ethanol at a volume ratio of 2: 1) so that the amount of protein is 10 mg / ml. To prepare an artificial AD vehicle (artificial human-type lung surfactant).
  • CM buffer buffer mixture of black mouth form Z ethanol at a volume ratio of 2: 1
  • the artificial dry AD vehicle described above was suspended in PBS to a phospholipid concentration of 30 mg / ml, and sonicated at room temperature for 1 minute to make a uniform suspension.
  • the above-mentioned human dietary factor or Surfactaten (described in Example 1) was added to the phospholipid content as a positive control of the immune induction effect.
  • the solution was added to a concentration of 2.0 ⁇ g, mixed with a vortex mixer, and then sonicated at room temperature for 3 minutes.
  • the resulting nasal mucosal vaccine was incubated for 1 hour prior to administration.
  • the vaccine solution was diluted with PBS to a vaccine 0.1 g / 1 solution.
  • Each BALB / c mouse was immunized in the same manner as described in Example 1, and each mouse 2 weeks after the second immunization.
  • Nasal lavage fluid, alveolar lavage fluid, and serum were collected and prepared from the mouse and used for quantification of anti-influenza IgA and IgG.
  • the mouth represents IgA production
  • the country represents IgG production
  • the number of mice in the vaccine administration group n 4
  • the significance level is AD vehicle-free Significance level for the vaccinated group, + indicates p 0.01 and ++ indicates p 0.05.
  • the amount of IgG produced in the human dietary datatant mixed vaccine administration group was significantly enhanced in the same manner as that in the positive control surferaten mixed vaccine administration group.
  • IgA production was a detected force. The production amount was not significantly different from that in the AD vehicle-free vaccine group. However, this IgA production was not significantly different from that of the surfactaten mixed vaccine administration group, so the IgA production-inducing ability of the human dietary factor mixed vaccine was compared to that of the positive control surfataten mixed vaccine. It was evaluated to be close to that (Figure 5).
  • Influenza split vaccines A / -Eu York / 55/2004 (H3N2), A / -Eucaredonia / 20/99 ( ⁇ 1 ⁇ 1), B / Shanghai / 361/2002 from the Institute for Microbial Diseases, Osaka University obtained.
  • Synthetic Surfactant Preparation Base DPPC (dipalmitoylphosphatidylcholine) is from Wako Pure Chemicals, Inc. Sigma, E-PG (egg-phosphatidylglycerol) is from Avanti, Sigma, PA (palmitic acid) was obtained from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
  • E-PG egg-phosphatidylglycerol
  • PA palmitic acid
  • Synthetic peptides were also obtained from Grain Company and Hayashi Hayashisei. Synthetic peptides are SP-B (l-25) (SEQ ID NO: 21), SP-B (20-60) (SEQ ID NO: 22), SP-B (64-80) (SEQ ID NO: 23), SP- B (l-60) (SEQ ID NO: 24), SP-C (1-19) (SEQ ID NO: 25), synthetic peptide KL-4 (SEQ ID NO: 26), SP -CL (7-28) (SEQ ID NO: 27), SP-C33 (SEQ ID NO: 28), SP-C (FFI) (SEQ ID NO: 29), SP-C (KLS) (SEQ ID NO: 30)
  • Protein and phospholipid measurement kit BCA TM Protein Assay Kit was purchased from PIERCE, and Phospholipid C test kit was purchased from Wako Pure Chemicals.
  • the synthetic peptide was dissolved in an appropriate solvent. However, the poorly soluble synthetic peptide was dissolved in TFA at a concentration of 5-20 mg / ml.
  • a 10% aqueous ethanol solution was added to the dried product, and the pH was adjusted to 6-7 with N-NaOH aqueous solution, followed by heating at 42-45 ° C for 3-10 minutes. After cooling, the concentration was adjusted to 1-10 mg PL / ml, and 1-5 mg PL equivalents were dispensed and lyophilized.
  • the resulting lyophilized product ie, a synthetic AD vehicle, was suspended in physiological saline and used for a vaccine binding test.
  • AD vehicle synthetic surfactant: synthetic AD vehicle ST
  • SSF-14 synthetic AD vehicle ST
  • Synthetic peptides SP-B (64-80) and SP-C (1-35) were separated and dissolved in TFA at a concentration of 5 mg / mL.
  • the three lipid mixtures were added to a synthetic peptide dissolved in TFA so that the concentration of the lipids was 0.6% with respect to the phospholipids of the three lipid mixtures. Thereafter, the same operation as described above was performed to prepare SSF-41.
  • the physiological saline solution was pipetted into ST to a concentration of 30 mg / mL to obtain a suspension.
  • 7 L of the suspension was placed in an Eppendorf tube, and 382 ⁇ L of physiological saline was further added.
  • Ultrasonication was performed using a Digital SONIFIER 250D (Branson) for 1 minute under ice cooling. I managed.
  • 11 ⁇ L of vaccine solution (A / -eucaledonia / 20/99 (991 ⁇ 1), 1.78 mg Prot / mL) was added and sonicated for 3 minutes under ice cooling. Then, it was left at room temperature for 2 hours, and gently mixed by inversion 3-5 times every 30 minutes.
  • the AD vehicle ST-vaccine mixture was centrifuged at 4-5 ° C, 20,000 Xg for 15 minutes using a High Speed Refrigated microcentrifoge (Tomy MX-301). A 25 ⁇ L aliquot was taken from the obtained supernatant, and the amount of vaccine was determined as protein amount using a BCA TM Protein Assay Kit.
  • the binding rate of the three vaccines ( ⁇ / New York, ⁇ / New Caledonia and B / Shanghai) to AD vehicle ST at this time was 60-70%.
  • a synthetic AD vehicle SSF-14, SSF-30, or SSF-24 was used in place of the AD vehicle ST of (1).
  • the vaccine was A / New Caledonia.
  • Synthetic AD vehicle concentration (phospholipid equivalent measured using phospholipid C test ⁇ Co (Wako Pure Chemicals, 433-36201)) 2.5 mg / mL and vaccine concentration 0.05 mg / mL, the ratio of which is 50: 1
  • the results are shown in Table 1.
  • the binding rate of the vaccine to SSF-14 was less than 60%.
  • the binding rate of SSF-24 and SSF-30 was over 90%.
  • the binding rate of SSF-43 and vaccine ( ⁇ / New Caledonia) was measured.
  • Synthetic AD vehicle concentration 0.5 mg / mL and vaccine concentration 0.05 mg / mL, the ratio is 10: 1, the liquid volume is 0.4 mL scale, and the binding test is performed according to the above (1) It was.
  • the binding test was performed in the same manner as described above.
  • the binding rate of the vaccine to each of the synthetic surfatatants was 60% or more.
  • lymphoid tissue in the human nasal cavity and larynx is a lymphoid tissue mainly composed of tonsils and Waldeyer's ring, which also has adenoidal lymphoid strength, and animals with relatively similar lymphoid tissue are pigs. Therefore, based on the AD vehicle results obtained in mice, the AD vehicle effect was verified using mi-pigs as a preclinical experiment assuming human clinical trials. Methods and side effects were examined.
  • Miniature pigs after weaning 1-2 power months (body weight: 2.2-6.6 Kg) were used.
  • a split antigen of ⁇ / New Caledonia / 20/99 ( ⁇ 1 ⁇ 1) was used.
  • BCA TM Protein Assay Kit was purchased from PIERCE and others, and phospholipid C test kit was purchased from Wako Pure Chemical.
  • Vaccination, blood collection, and nasal mucus were performed under anesthesia.
  • the body weight of minipigs was measured in advance, and mixed anesthesia of Dmitor (Meiji Seika Co., Ltd.) and Dolcam Injection (Asteras Pharmaceutical Co., Ltd.) was performed. Blood was collected from the whole sinus.
  • To collect nasal mucus wipe the inside of the left and right nasal cavities twice with a sterile cotton swab and then soak in 2 ml of physiological saline. Squeezed out. A part of the nasal mucus was promptly diagnosed for cytopathology and examined for the presence of an inflammatory reaction in the nasal cavity.
  • Body weight and body temperature were measured once a week, and health status was patroled and recorded twice a day.
  • the measurement was performed according to the measurement of antigen-specific antibody titer in mice, and the enzyme antibody method (ELISA) using anti-pig IgA and IgG secondary antibodies was performed.
  • ELISA enzyme antibody method
  • a split antigen of influenza A / -Eucaledonia / 20/99 ( ⁇ 1 ⁇ 1) is conjugated to AD vehicle ST, suspended in 100 1 saline, and minipigs (MBS system) that have no abnormalities in normal pathogen testing. ), And the production of specific antibodies (IgA, IgG) against the vaccine was measured.
  • booster administration was performed in the same manner as the first administration, and the measurement was terminated after 2 weeks.
  • the amount of antigen was determined for 5 groups of 0.3 ⁇ g / Kg ⁇ 1.5 ⁇ g / Kg ⁇ 4.5 ⁇ g / Kg ⁇ 15 ⁇ g / Kg and 30 g / Kg.
  • the antibody titer was measured by measuring nasal mucus to evaluate the local mucosal immune system and antibody production in the blood to evaluate the systemic immune system.
  • the IgA antibody titer and IgG antibody titer of the vaccine-specific antibody specified here are how many times the sample is diluted based on the average of the measured values that the nasal mucus and blood before the vaccine administration react with the vaccine antigen. Once released, measure the force that results in the pre-vaccination value and use that dilution to determine the antigen-specific IgA IgG antibody titer.
  • IgA antibody titer In antibody production in nasal mucus, IgA antibody titer was 5-8 times higher than IgG antibody titer, and IgA was predominantly produced. There was no significant difference in the increasing trend of IgA antibody titer and IgG antibody titer depending on the antigen amount. The production of both antibodies in nasal mucus was mild at the first dose and markedly increased at the booster dose. However, IgG in nasal mucus showed about a 10-fold increase, even though split influenza antigen alone was low after booster administration.
  • IgG was predominantly induced in the blood whose IgG antibody titer was 1 to 1.6 times higher than the IgA antibody titer.
  • both antibodies increased to 100-200 antibody titer, and booster administration increased the antibody titer by 4 times for both IgG and IgA.
  • booster administration increased the antibody titer by 4 times for both IgG and IgA.
  • IgG in the blood also increased by a factor of about 10 times, although it was low after booster administration.
  • the "AD vehicle” enables safe administration or inoculation of any vaccine antigen, toxoid, allergen, drug, etc., transmucosally, transdermally, and the like. Then, by adjusting the weight ratio V / A between the AD vehicle amount (V) and the substance to be placed thereon, for example, the antigen amount (A), the antibody production induction function of the “AD vehicle” can be adjusted. That is, “AD vehicle” induces IgA production preferentially and selectively when V / A is about 1 or less, and induces both IgA and IgG production when V / A is adjusted to exceed 1.
  • AD vehicles are widely used as vehicles for active ingredients such as nasal mucosal vaccine, allergy therapeutic agent / preventive agent, etc. Can be used and used in industrial fields such as 'Veterinary Medicine' and Marine Products.

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Abstract

　安全かつ有効な経鼻・不活化・粘膜ワクチンの実用化、従来の不活化ワクチン・トキソイド・アレルゲン等にIgAとIgG両抗体の産生能を付与する技術、アレルギーの予防と治療手段等の確立を課題として、経鼻、経粘膜及び経皮投与を可能にする抗原薬物ビークル（ADビークル）、これを用いる粘膜免疫と体液性免疫とを同時に誘導する不活化ワクチンおよびその製造技術、IgA抗体の選択的産生の誘導からIgA及びIgG両抗体産生の誘導への切換えを可能にするADビークル、これを用いる経鼻ワクチン、粘膜ワクチン、アレルギーの治療剤・予防剤等を提供する。

Description

明 細 書
IgA抗体の選択的産生から IgA及び IgG両抗体産生への切換えを可能に する抗原薬物ビークルとこれを用いる経鼻'粘膜ワクチン
技術分野
[0001] この発明は、経鼻、経粘膜及び経皮投与を可能にする抗原薬物 (AD)ビークル、こ れを用いる粘膜免疫及び体液性免疫の誘導方法、更に詳しくは、 IgA抗体の選択的 産生の誘導から IgA及び IgG両抗体産生の誘導への切換えを可能にする ADビークル 、これを用いる経鼻ワクチン、粘膜ワクチン、アレルギーの治療と予防剤等に関するも のである。
背景技術
[0002] 従来の不活ィ匕ワクチンやトキソイド等には次の欠点が知られて 、る：
(1)自然感染ルートでの乏しい感染防御：ワクチン接種ルートが皮下、筋肉内等であ るのに対し、細菌やウィルス等の自然感染ルートは、例えば鼻腔、気管、腸管等の粘 膜であり、上記接種ルートとは異なる。自然感染の実態に即した接種ルートによる感 染防御、特に粘膜経由のワクチン投与よる粘膜での感染防御の実現が望まれる。
(2)低 、粘膜免疫性：ワクチン被接種者にお！、ては、主に免疫グロブリン G (以下「Ig G」又は「IgG抗体」と略記する)が血中に産生され、体液性免疫が誘導される。しかし 、粘膜免疫を担う分泌型免疫グロブリン A (以下「IgA」又は「IgA抗体」と略記する）は 、ほとんど産生されず、粘膜免疫の成立は期待できない。尚、 IgA抗体の必要性と有 効性は次の通りである: IgA抗体は、飛沫や空気による鼻腔、気管等の呼吸器への感 染、また、経口による腸管への感染の門戸である粘膜での感染防御、即ち、粘膜免 疫を担っており、臨床免疫上、極めて重要な役割を演じている。更に、 IgG抗体が、 抗原に対する特異性が高ぐ感染防御スペクトルが狭隘で、抗原変異した病原体の 感染防御にはほとんど無効であるのに対し、分泌型 IgA抗体は、交差免疫性、即ち、 交差中和活性があるので、それだけ感染防御スペクトルの幅が広ぐ変異抗原に対 する感染をも防御する。
(3)追加接種の必要性と重なる費用：初回免疫の 1回接種だけでは産生される IgG抗 体が低ぐ確実な効果が期待できないため、その後の IgG抗体保有状況に基づき、更 に 1回以上の追加接種、いわゆるブースター接種により血中 IgG抗体価を高める必要 がある。そのため、経費や労力を繰り返し要する上に、ブースター接種の機会に恵ま れた高齢者、成人及び学童では効果が認められるが、その機会を逸し易い低年齢、 特に 2歳以下の乳幼児では効果なしのケースが散見される。
[0003] 以上につき換言すれば、従来の不活ィ匕ワクチンやトキソイド等は、被接種者にぉ ヽ て主に血中 IgG抗体の産生を誘導し、体液性免疫を高める作用効果をもたらし、その 有効性は確認されている。しかし、 IgA抗体産生ないしは粘膜免疫の誘導能が低い ため、自然感染を防御するに十分な機能と効果には限界がある。かかる現状から、 従来ワクチンの欠点を解消するため、現在までに多種多様な側面から多くの試みが なされている。例えば、ワクチン抗原の質的又は量的改良、不活ィ匕ワクチンに代わる 生ワクチンの試作、新しい接種ルートや粘膜ワクチン等の開発、体液性免疫の高進と その持続をもたらすアジュバントのスクリーニング、粘膜免疫アジュバントの開発に特 定した試行等々。しかし、未だ安全かつ有効な粘膜ワクチンの開発は達成されてい ない。
[0004] 以下、粘膜ワクチンの開発につき、説明する：
(1)ワクチン抗原の増量:皮下又は筋肉内接種するワクチン抗原を増量し、粘膜に分 泌される IgG及び IgA抗体量を増カロさせる試みがされている。例えば、従来の不活ィ匕 インフルエンザワクチンに該ウィルス膜蛋白のノイラミニダーゼを添加混合して抗体 産生量を増加させたり、アジュバントとして MF59を添加混合する方法等が試みられて いる。しかし、これには痛みを生じ、副反応が強くなる等の不都合が見られる。
(2)経鼻投与型の不活化ワクチン：最も有効と考えられる分泌型 IgA抗体による感染 防御のため、液状のスプリット抗原を経鼻に直接接種する方法が試みられたが、 IgA 産生量の低いことが指摘されている。そこで IgA抗体産生能を上げるため、スプリット 抗原にアジュバントとしてコレラ毒素を添加混合し、粘膜免疫応答、即ち、 IgA抗体産 生能を上げる試みがなされて 、るが、アジュバントとしての毒素の安全性が保証され ていない現状から、実用化には至っていない。また、大腸菌易熱性毒素をアジュバン トに用 、たスプリット型の経鼻 ·不活化インフルエンザワクチン [Berna Biotech社 (スィ ス)製'商品名 Nasalflu]力 世界初の経鼻インフルエンザワクチンとしてスイスで認可 され 2000年 10月カゝら販売されていた。しかし、該ワクチン被接種群において、ベル麻 痺が 25.2%の被接種者で検出されたため、 2004年 2月に臨床使用が中止された (非特 許文献 1及び 2)。
(3)鼻腔内接種が可能な低温馴化株を用いる生ワクチン:低温馴化インフルエンザ ウィルス（2つの A型株と 1つの B型株の合計 3株の混合、いずれの株もリアソータント )を鼻腔内に接種する生ワクチン [Medlmmune V/Accines社（米国）製 ·商品名 FluMis t]が米国で 2003年 6月に認可 *販売されてはいる（非特許文献 3)。尚、これ等の低温 馴化株ウィルスの増殖の最適温度は 25°Cであり、 37°C (B型株）又は 39°C (A型株） ではほとんど増殖しない。しかし、低温馴化親株の弱毒のメカニズムが明らかでなく 毒性復帰の危険性は否定できない。更に、ワクチンの有効成分が生きたウィルスの ため、細胞内への侵入力が高く免疫の初期化には優れているが、軽度のインフルェ ンザ症状が散発するので、インフルエンザに感染すると重症化しやす 、ハイリスクの ヒトゃ高齢者等には使えな 、；インフルエンザウイルス抗原の頻繁な連続変異 (drift) や不連続変異 (shift)に対する有効性は不明等の欠点が見られる。
(4)その他のワクチン：ヮクチ-ァウィルスをウィルスベクターとしたベクターワクチン や、リバースジエネテイクスによる弱毒生ワクチン、 DNAや cDNAそのものを有効成分 として用いる DNAワクチン等の開発が実験的に進められてはいるが実用化には至つ ていない。
更に、以下、免疫アジュバントの開発につき、説明する：
(1)免疫アジュバント:免疫アジュバントは、免疫応答の強化や抑制等の調節活性を 有する物質の総称であり、被接種体内での抗原の徐放ゃ貯留等を目的とした投与形 態に係る物質と、免疫応答の高進や抑制等を図るための物質に 2大別される。これ 等のうち、前者、投与形態のためのアジュバントとしては、例えばリン酸アルミニウム、 ミヨウバン等を用いるワクチンやトキソイドが既に実用化されている。しかし、後者、免 疫応答の強化 ·高進を図るためのアジュバントの実用化は、未だ知られていない。例 えば、細菌由来の BCG生菌、 BCG-CWS,エンドトキシン、グルカン等、合成されたム ラミルジペプチド、レノ ミソール、ポリ I ポリ C、べスタチン等、また、サイト力イン類の インターフェロン、 TNF、 CSF等が公知である力 関節炎、慢性関節リウマチ、高 γグ ロブリン血症、貧血等のアジュバント病、効果が不十分等々の理由により、これ等の 実用化には安全性と有効性の保証が必要だと思量される。また、広く体液性免疫の 誘導強化を図るため、高等動物由来の肺サーファタタント ·プロテイン Βをアジュバン トとして用いる技術 (特許文献 1及び非特許文献 4)が公知であるが、その実用化は 未だ知られていない。
(2)粘膜免疫用アジュバントの開発:例えば、百日咳毒素 Βオリゴマー (特許文献 2) 、コレラ毒素 (特許文献 3)、大腸菌の易熱性ェンテロトキシン Βサブユニット LTB (特 許文献 4)、デンプン粒子 (特許文献 5)、コレラトキシン Β鎖タンパク質 CTB (特許文献 6)、ベロ毒素 1の Βサブユニット（特許文献 7)、オリゴヌクレオチド (特許文献 8)、イン ターロイキン 12 (非特許文献 7)、キトサン (非特許文献 5)、ナイセリア属菌の可溶化' 外皮膜タンパク質 (非特許文献 6)等々、多種多様に開発されてはいるが、未だ実用 ィ匕には至っていない。
以上の通り、皮下や筋肉内等へ接種する従来ワクチンから、ウィルスの自然感染ル ートである粘膜において IgA抗体の産生を誘導する粘膜ワクチンへの切り替えの必要 性は、広くかつ深く認識されている。特に、 21世紀における次世代ワクチンとしては、 IgA抗体の産生、局所免疫あるいは粘膜免疫を誘導する、いわゆる粘膜ワクチンの開 発と実用化が全世界で待望されてはいるが、未だ達成されていない。その理由は、 Ig A抗体産生、局所免疫な!/、しは粘膜免疫を誘導する機能をワクチンに付与するため の安全かつ有効なアジュバントが特定.確立されていないことにあると思量される。 特許文献 1：特表 2002-521460号公報
特許文献 2：特開平 3-135923号公報
特許文献 3：特表平 10-500102号公報
特許文献 4：特表 2001-523729号公報
特許文献 5：特表 2002-50452号公報
特許文献 6：特開 2003-116385号公報
特許文献 7：特開 2003-50452号公報
特許文献 8： PCT公表 WO00/20039号パンフレット 非特許文献 l : New Engl.J.Med.,第 350卷、 896-903頁、 2004年
非特許文献 2 : New Engl.J.Med.,第 350卷、 860-861頁、 2004年
非特許文献 3 : Cleve.Clin.J.Med.、第 70卷、 801-806頁、 2003年
非特許文献 4 :Am.J.Respir.Cell Mol.BioL,第 24卷、 452-458、 2001年
非特許文献 5 :AdV/Ances Drug Delivery Rev.,第 51卷、 81- 96頁、 2001年 非特許文献 6 :V/Accine、第 21卷、 3706-3712、 2003年
非特許文献 7 : Infection and Immunity,第 71卷、 4780- 4788頁、 2003年
非特許文献 8 : J. neonatal Nursing,第 10卷、 2- 11頁、 2004年
非特許文献 9 : Biology of the Neonate,第 74卷 (suppll)、 9- 14頁、 1998年
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 従来の不活ィ匕ワクチン、トキソイド、アレルゲン等に、 IgA抗体の産生、局所免疫ある いは粘膜免疫を誘導する機能のみならず、 IgG抗体の産生あるいは体液性免疫を誘 導する機能をも併せて付与する。そのための安全かつ有効な技術、従来の体液性免 疫誘導ワクチンから、安全かつ有効な粘膜免疫及び体液性免疫の両者誘導ワクチン への変換技術、アレルギーの予防と治療手段等の確立。
課題を解決するための手段
[0008] この発明は、上記課題を解決するための手段として、経鼻、経粘膜及び経皮投与 を可能にする ADビークル、これを用いる粘膜免疫及び体液性免疫の誘導方法、更 に詳しくは、 IgA抗体の選択的産生の誘導から IgA及び IgG両抗体産生の誘導への切 換えを可能にする ADビークル、これを用いる経鼻ワクチン、粘膜ワクチン、アレルギ 一の治療と予防剤等を提供する。
発明の効果
[0009] この発明が提供する ADビークルの適用 ·汎用により、多種多様な感染症に対する 粘膜ワクチン、アレルギーの予防と治療剤、及び薬剤の経粘膜'経皮投与の実現と 普及をもたらす。経鼻あるいは粘膜ワクチンは、自然感染の実態に即した免疫手段 であるので、従来ワクチンに比し、著しく優れた感染防御効果を発揮する。また、 AD ビークルが誘導する鼻腔粘膜 IgA及び IgGは、そこでのアレルゲンの失活をもたらし、 減感作を可能にする。更に、多種多様な薬剤への ADビークルの適用は、薬物の経 粘膜投与及び経皮投与による予防'治療効果を強化かつ促進させる。
[0010] その結果、この発明は、人類全体の医療 '保健'衛生を多大に向上させると共に、 世界の医療 ·保健'衛生分野の従事者には待望の福音になる。併せて、従来及び未 来のワクチンやトキソイド等を含む生物学的製剤、更に多種多様な薬物に広ぐ注射 に比べ簡便な経粘膜投与及び経皮投与が可能な機能と性能を付加する手段を与え る。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]一定量のワクチン（乾燥重量) 0.2 gに添加するサーファタテン (ADビークルの 一種)の変量が、鼻腔粘膜での抗インフルエンザ IgA及び IgG両抗体の産生量に及ぼ す影響を示す図である。尚、以下の図 1〜3において、抗体量は ELISAによる定量値 、 n = 8〜12、平均値士 SD、 t検定によるサーファタテン無添加ワクチン (0 g)投与群 に対する有意水準、 +は p〈0.08、 ++は p〈0.05、 +++は p〈0.01、また、 *はサーファタテ ン 0.1 μ g添加ワクチン投与群に対する有意水準、 pく 0.01をそれぞれ示す。
[図 2]—定量のワクチン (乾燥重量) 0.2 gに添加するサーファタテンの変量力 肺胞 粘膜での抗インフルエンザ IgA及び IgG両抗体の産生量に及ぼす影響を示す図であ る。
[図 3]—定量のワクチン（乾燥重量) 0.2 gに添加するサーファタテンの変量力 血中 での抗インフルエンザ IgA及び IgG両抗体の産生量に及ぼす影響を示す図である。
[図 4]対照群 (ワクチン投与なし）、ワクチン投与群 (ADビークル無添加ワクチン）、人 工合成サーファタタント（合成 ADビークルの一種）添加ワクチン投与群、及びサーフ ァクテン添加ワクチン投与群の各群マウスの鼻腔洗浄液中の抗インフルエンザ IgA及 び IgG各抗体の産生量を示す図である。 尚、以下の図 4〜6において、口は IgA産生 量、國は IgG産生量、抗体量は ELISAによる定量値、ワクチン投与群のマウス数 n = 4 、平均値士 SD (標準偏差）、 t検定による ADビークル無添加ワクチン投与群に対する 有意水準、 +は p〈0.01、また、 ++は p〈0.05をそれぞれ示す。
[図 5]対照群 (ワクチン投与なし）、ワクチン投与群 (ADビークル無添加ワクチン）、人 工合成サーファタタント（合成 ADビークルの一種）添加ワクチン投与群、及びサーフ ァクテン添加ワクチン投与群の各群マウスの肺胞洗浄液中の抗インフルエンザ IgA及 び IgG各抗体の産生量を示す図である。
[図 6]対照群 (ワクチン投与なし）、ワクチン投与群 (ADビークル無添加ワクチン）、人 工合成サーファタタント（合成 ADビークルの一種）添加ワクチン投与群、及びサーフ ァクテン添加ワクチン投与群の各群マウスの血中（血清中）の抗インフルエンザ IgA及 び IgG各抗体の産生量を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 以下、この発明及び本願明細書で用いる用語を説明し定義づける。
(用語及び抗原薬物 (AD)ビークル構成成分の説明）
(1)ADビークル：該ビークル（Antigen and Drug Vehicle,以下、「ADビークル」は、抗 原や薬物等の経粘膜投与及び経皮投与が可能になるよう設計 (デザイン)された、脂 質とタンパク質との複合体 (コンプレックス）である。 ADビークルは、次の（a)及び Z又 は (b)及び (c)からなる：
(a)肺サーファタタントプロテイン B又はその断片 (タンパク質分解酵素により得られる 天然断片だけではなぐ遺伝工学やペプチド合成により得られる人工断片、かかる断 片を構成するアミノ酸の 1個以上が置換及び Z又は欠失した変異断片等々をも含む )；
(b)肺サーファタタントプロテイン C又はその断片 (タンパク質分解酵素により得られる 天然断片だけではなぐ遺伝工学やペプチド合成により得られる人工断片、かかる断 片を構成するアミノ酸の 1個以上が置換及び Z又は欠失した変異断片等々をも含む ) ;及び
(c)リン脂質や脂肪酸等の脂質。
[0013] ADビークルの形状構造は、表面に棘状あるいはスパイク状のポリペプチド鎖を保 有の膜状 (シート状又はローリング状の脂質膜)であり、複数のポリペプチド鎖の疎水 領域末端を、脂質膜に嵌入させスノイク状に植鎖した力 ちになっており、従来の脂 質小胞（リボソーム）とは異なる。この発明に係る ADビークルに所望の抗原や薬物等 を共存、接触、捕捉、吸着又は結合させれば (乗せれば)、力かる抗原や薬物等の経 粘膜投与及び経皮投与が可能になる。換言すれば、該ビークルは、抗原や薬物等 の経粘膜投与及び経皮投与を可能にする、これ等の乗り物である。
[0014] 尚、 ADビークルの構成成分、該ビークルの調製 '製造に用いるタンパク質、ポリべ プチドあるいはペプチドと脂質、即ち、肺サーファタタント由来の SP-B、 SP-C,これ等 の断片、かかる断片ペプチドの少なくとも 1個のアミノ酸が置換及び Z又は欠失した 変異断片等々、及びリン脂質、脂肪酸等の脂質の詳細については、後述される。 (2)肺サーファクタント：肺サーファクタントは、呼吸窮迫症候群（RDS : Respiratory Di stress Syndrome)の治療に 1987年から実用化され、現在、ヒト、ゥシ、ブタ等に由来す る肺サーファタタントについての報告や、中でもゥシ、ブタ由来肺サーファクタントに ついては製剤が市販、常用化されている（非特許文献 8)。また、 RDS治療に係る活 性ドメインを含む合成ペプチド製剤も市販され、更に、 SP- Bや SP- Cアナログのデザィ ン開発や合成も進められている (非特許文献 9)。
[0015] 肺サーファタタントの組成と構成は通りである：約 90重量％の脂質（ホスファチジルコ リン 67.3%、ホスファチジルグリセロール 19.3%、ホスファチジルセリン 3.2%、その他の遊 離脂肪酸等）と、約 10重量％のタンパク質 (サーファタタントプロテイン A、 B、 C及び D; 以下「SP-A」、「SP-B」、「SP-C」及び「SP-D」とそれぞれ略記する）力 なる複合体で ある。分子量は SP- Aが 26- 38kDa、 Bが 5- 8kDa、 Cが 4- 5kDa、及び D力 3kDaである。 SP-Aと Dは親水性 (水溶性)かつレクチン様 (膜ァソシエイテッド)。 SP-Bと Cは、疎水 性 (脂溶性)かつ脂質結合性で、リン脂質膜への嵌入能及び界面活性作用を有する 。ヒト、ゥシ、ブタ等に由来の肺サーファタタントプロテイン遺伝子は公知であり、例え ば、 GenBank/NCBI(http：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/)におけるヒト SP-B遺伝子 DNAの 完全長塩基配列のァクセッション番号は J02761、ヒト SP-C (及び SP-C1)のそれは、 J0 3890である。以下、この NCBIより得たヒト SP-B及び Cのコーディング領域（CDR)とそ れがコードするアミノ酸配列を記載する。
配列番号 1：ヒト SP-B遺伝子 DNAの CDR塩基配列；
配列番号 2：配列番号 1から解読されたヒト SP-B完全長アミノ酸配列；
配列番号 3：ヒト SP-C遺伝子 DNAの CDR塩基配列；
配列番号 4：配列番号 3から解読されたヒト SP-C完全長アミノ酸配列； 配列番号 5：ヒト SP-C遺伝子 DNA上に占める SP-C1の CDR塩基配列；及び 配列番号 6：配列番号 5から解読されたヒト SP-C1完全長アミノ酸配列。
尚、生体内では、 SP-Bは配列番号 2のアミノ酸配列における第 201番〜第 280番（ 第 279番または第 281番との報告もある）までの 80 (または 79もしくは 81)アミノ酸残基 からなる分子として存在する。また SP-Cは配列番号 4または 6における第 24番〜第 58 番までの 35アミノ酸残基からなる分子として存在する。
(3)この発明で用いるタンパク質あるいはペプチド：この発明に係る ADビークルの調 製 ·製造には、ヒト、ゥシ、ゥマ、ヒッジ、ブタ、クジラ、ィルカ等の哺乳類由来の SP-Bと SP-Cとの組合せ、及び SP-Bと SP-C1との組合せをそれぞれ用いることができる。例え ば、上記の配列番号 2、 4及び 6にそれぞれ記載の完全長アミノ酸配列力 なるヒト由 来タンパク質、 SP-Bと SP-Cとの組合せ、及び SP-Bと SP-C1との組合せを、それぞれ 用いることができる。更に、例えば Kyte-Doolittleの疎水性値に基づく SP-B及び SP-C の疎水性 (脂溶性)領域及び該領域を含む断片、かかる断片ペプチドの少なくとも 1 個のアミノ酸が置換及び Z又は欠失した変異断片等々をも用いることができる。例え ば、以下に示す配列番号 7〜20に記載のアミノ酸配列力 なる天然ペプチドある 、 は遺伝子工学やィ匕学合成により得られるペプチド、これ等のペプチドを含むこれより 長鎖のペプチド、及び力かるペプチドの少なくとも 1個のアミノ酸が置換及び Z又は 欠失した変異体や合成アナログ等々を使用できる。尚、アミノ酸番号は、各配列の N 末端を占める Metを第 1番アミノ酸とし、これより C末端方向（記載配列の左力 右方 向）に順に付された序数で表示されている。また、 SP-B断片については、配列番号 2 の第 201番〜 280番のアミノ酸配列に含まれるポリペプチドは、第 201番目 Pheを第 1番 として、例えば「SP-B(l-80)断片」と記載する。同じぐ SP-C断片については、配列番 号 4の第 24番目 Pheを第 1番として例えば「SP-C(l-35)断片」と記載する。
配列番号 7：配列番号 2の第 214番〜第 225番のアミノ酸配列（SP-B断片）； 配列番号 8：配列番号 2の第 226番〜第 275番のアミノ酸配列（SP-B断片）； 配列番号 9：配列番号 4及び 6の第 29番〜第 58番のアミノ酸配列（SP-C断片）； 配列番号 10：配列番号 2の第 1番〜第 20番のアミノ酸配列（SP-B断片）；
配列番号 11：配列番号 2の第 102番〜第 110番のアミノ酸配列（SP-B断片）； 配列番号 12 配列番号 2の第 119番ハ第 127番のアミノ酸配列（SP-B断片）； 配列番号 13 配列番号 2の第 136番ハ第 142番のアミノ酸配列（SP-B断片）； 配列番号 14配列番号 2の第 171番ハ第 186番のアミノ酸配列（SP-B断片）； 配列番号 15 配列番号 2の第 201番ハ第 280番のアミノ酸配列（SP-B(l-80)断片）； 配列番号 16 配列番号 2の第 300番ハ第 307番のアミノ酸配列（SP-B断片）； 配列番号 17 配列番号 2の第 317番ハ第 330番のアミノ酸配列（SP-B断片）； 配列番号 18 配列番号 2の第 344番ハ第 351番のアミノ酸配列（SP-B断片）； 配列番号 19 配列番号 2の第 358番ハ第 381番のアミノ酸配列（SP-B断片）； 配列番号 20 配列番号 4及び 6の第 24番〜第 58番のアミノ酸配列（SP-C(l-35)断片) 配列番号 21 配列番号 2の第 201番ハ第 225番のアミノ酸配列（SP- B(l- 25)断片）； 配列番号 22 配列番号 2の第 220番ハ第 260番のアミノ酸配列（SP-B(20-60)断片）； 配列番号 23 配列番号 2の第 264番ハ第 280番のアミノ酸配列（SP-B(64-80)断片）； 配列番号 24配列番号 2の第 201番ハ第 260番のアミノ酸配列（SP-B(l-60)断片）； 配列番号 25：配列番号 4及び 6の第 24番〜第 42番のアミノ酸配列（SP-C(1-19)断片） 配列番号 26： KL-4 (SP-Bに模倣の合成ペプチド）：
配列番号 27： SP- CL [合成 SP- C(7- 28)断片]：
配列番号 28： SP-C33 (SP-C型の合成ペプチド）；
配列番号 29： SP-C(FFI) [SP-C(25-58)断片の第 28〜29番アミノ酸残基 CCを FFに、 56 番アミノ酸残基 Mを Iにそれぞれ置換した合成ペプチド]；及び
配列番号 30： SP-C(KLS) (SP- Bと SP- Cに模倣のハイブリッド (融合)型合成ペプチド） 尚、この発明によれば、（a)配列番号 2、 7、 8、 10〜24に記載のアミノ酸配列から なる SP-Bとその断片群力 選ばれる少なくとも 1種、及び Z又は (b)配列番号 4、 6、 9、 20、 25及び 26に記載のアミノ酸配列からなると SP-C (及び SP-C1)とその断片群 から選ばれる少なくとも 1種との組合せ、即ち、上記 (a)群単独、（b)群単独、及び (a) と（b)両群の組合せを用いることができる。また、上記の SP_B、 SP-C,またはそれらの 断片の 2以上の組合せを選択する場合には、それぞれを混合してもよぐあるいはそ れぞれを融合タンパク質 (融合ペプチド）としてもよ 、。
(4)本発明で用いる脂質：リン脂質としては、肺サーファタタントが含有するリン脂質、 例えばホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリ ン等の使用が望ましい。その他、ジァシルグリセ口ホスホグリセロール、ホスファチジ ルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジ ルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチ ジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールァミン、ホス ファチジン酸、スフインゴミエリン等を用いることができる。また、脂肪酸としては、ラウリ ル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、パルミトォレイン酸、ォレイン酸等を 用いることができる。更に、肺の膨張が活発なクジラ、マグロ、ィルカ等の水棲動物に 由来の脂質を用いることができる。
(5) RDS治療用として報告された肺サーファタタント製剤：この発明によれば、 RDS治 療剤としての安全性と有効性が関係当局により認可され、かつ、疎水性あるいは脂 溶性の SP-B及び SP-C並びにリン脂質を含有する既報の肺サーファクタント、例えば 、商品名サ ~~ファグアン (； irfactenノ、 Infasurfゝ し urosurfゝ Humansurfゝ Exosurfゝ Alveof act, Surfacxin等を ADビークルとして用いることができる。尚、 SP- Bと SP- C以外に、親 水性あるいは水溶性の SP-A及び SP-Dを含有する巿販製剤では、例えば 1ーブタノ ールでこれ等の水溶性タンパク質 SP-Aと SP-Dとを抽出し、これ等を検出限界以下に まで除去した後、使用に供する。また、 ADビークルの調製における使用濃度の調整 を考慮すると、液状製剤に比べ、乾燥製剤の使用が望ましい。
この発明は、前述した背景技術の激しく厳しい渦中にあって、 10余年にも及ぶ試 行錯誤を重ねた筆頭発明者の卓抜した観察力と解析力、そして深い学識経験と斬 新な着想によるものであり、次の驚くべき発見に基づく：
(1)従来のアジュバントが炎症を惹起して抗原提示能を増強するのに対し、本来、肺 や消化管粘膜が分泌の界面活性物質である肺サーファタタントの 4種のタンパク質有 効成分、 SP-A、 B、 C及び Dから、 Aと Dとを除去した SP-B及び SP-Cの組合せとリン脂 質との複合体、あるいはこれ等の脂溶性領域 (有効領域)を含む SP-Bと SP-C両断片 の合成ペプチドの組合せと脂質膜との複合体 (前述した ADビークル）に、ウィルス抗 原を共存又は接触又は捕捉又は吸着させると、炎症を惹起することなく鼻腔粘膜の 抗原提示細胞が活性化され、ウィルス抗原が該細胞内に効率よく取り込まれると共に
、粘膜や血液中での IgG産生の誘導を起こすことなぐ粘膜の抗ウィルス IgA産生が効 果的かつ優先的に誘導されることを発見した。
(2)また、従来力も安全な不活ィ匕ワクチン抗原として使用されているインフルエンザゥ ィルス'スプリット抗原に、 SP- Bと SP- Cの組合せとリン脂質との複合体、あるいはこれ 等の脂溶性領域 (有効領域)を含む SP-Bと SP-C両断片の合成ペプチドの組合せと 脂質膜との複合体 (ADビークル)を添加混合することにより、スプリット抗原の高い安 全性を保持しながら、しカゝもスプリット抗原単独では生ワクチンに比べて劣る抗原提 示細胞の活性化が十分に増強され補われた状態で、 IgA産生の選択的誘導が実現 されることを発見した。
(3)更に、スプリット型インフルエンザウイルスワクチン抗原を ADビークルに乗せること により調製した経鼻 ·粘膜ワクチンの免疫誘導能に係る解析の結果、 IgA産生の選択 的誘導は、 ADビークル乾燥質量 (V;尚、脂質又はリン脂質が通常 ADビークル乾燥 質量の約 90重量％以上を占めるので、 V値には脂質重量又はリン脂質重量を当て ることができる）とワクチン抗原乾燥重量 (A)との重量比 V/Aに依存し、 V/Aが 1以下 のとき、 IgA産生が選択的に誘導され、他方、 V/Aが 1を超えると IgAと IgG両産生が誘 導されるという実に驚くべき発見をした。
尚、上記の発見に至る経緯は、次の通りである：
(1)筆頭発明者は、インフルエンザ発症機序と治療、予防法を解明するべく鋭意研 究を重ねてきた。その過程で、インフルエンザウイルス膜蛋白質のへマダルチュン（ HA)を限定分解してウィルスの膜融合活性と感染能を発現させる気道の HAプロセ シングプロテアーゼのトリプターゼクララを肺サーファタタントが吸着して不活性ィ匕し、 結果としてウィルスの増殖サイクルを阻止することを解明した。
(2)引き続く研究の結果、肺サーファタタントには上記の作用以外に、選択的に粘膜 の抗原提示細胞を活性ィ匕してウィルス抗原に対する免疫能を活性ィ匕して、分泌型 Ig Aの誘導を引き起こすが IgGの誘導は起こさな 、ことを見 、だした。さらに肺サーファ クタント中の粘膜免疫増強有効成分として、 SP-B、 SP-Cが脂質成分と共に重要であ ることを明らかにし、これら蛋白成分の有効領域の特定と、粘膜免疫増強の有効性を 検証した。
(3)更に、上述したように気道粘膜の生体防御物質とウィルス感染防御の観点から研 究を進め、体内に分泌されている肺サーファタタントが生体内由来の粘膜免疫アジュ バントとして選択的 IgA産生の誘導に関与していることを証明した。
(4)上記の肺サーファクタントが本来生体内の生理的作用物質で、 (a)特定の生体 物質を吸着する性質のあること [Kidoら、 FEBS Lett., 322(29), 115-119, 1992]、 (b) 肺胞 II型細胞やクララ細胞力 分泌された後、選択的にマクロファージ一に取り込ま れて代謝されること（諫訪部彰、 J.Jpn.Med.Soc.Biol.Interface, 33, 10-13, 2002)、更 に（c)その類縁細胞、例えば抗原提示細胞 (榭状細胞）に取り込まれて代謝されるこ とに注目し研究を重ねた。
[0017] その結果、肺サーファタタントの蛋白成分の中で、 SP-B、 SP-C及び脂質成分だけ で、選択的に IgA産生を誘導する粘膜ワクチンの「ADビークル」として機能すること、 更に、 SP- Bの有効成分領域ある 、は粘膜免疫誘導活性ドメインが次のアミノ酸配列 力 なるペプチドであることを明らかにした：
SP-B 214-225 : Leu He Lys Arg He Gin Ala Met He Pro Lys Gly (配列番号 7)；及び SP-B 257-266 : Leu Leu Asp Thr Leu Leu Gly Arg Met Leu (配列番号 8)。
[0018] 併せて、 SP-Cの有効成分領域あるいは粘膜免疫誘導活性ドメインが次のアミノ酸 配列からなるペプチドであることを明らかにした：
SP-C 29-58 : Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu lie Val Val Val Val Val Val Leu lie Val Val Val He Val Gly Ala Leu Leu Met Gly Leu (配列番号 9)。
(5)選択的 IgA誘導の機序として、肺サーファタタントの有効成分は、抗原提示榭状 細胞の MHC ClassII、 CD40、及び B7-2の発現増加を誘導して T リンパ球への抗原 提示を効果的に実行する以外に、粘膜局所のサイト力イン TGF- |8 1を誘導して IgA産 生 B リンパ球へのクラススィッチを促進して 、ることを明らかにした。
(6)スプリット型インフルエンザウイルスワクチン抗原と ADビークルとの混合により調製 した経鼻 ·粘膜ワクチンによる免疫機能には、 IgA産生の選択的誘導から、 IgA及び Ig G両産生の誘導へ変換するスィッチが存在し、これが ADビークル量 (V)とワクチン抗 原量 (A)の重量比 V/Aに依存するという知見を得た。但し、比較的多量のワクチン抗 原（15 mg/Kg 以上）を経鼻接種する場合は、 V/A量比にかかわらず粘膜免疫の IgA と全身免疫の IgGは共に誘導される。
以上の発見とその経緯に基づき完成された本発明の目的は次の通りである：
(1)第一の目的は、粘膜免疫方法の確立である。「ADビークル」の提供とその活用に より、粘膜免疫の有効物質である抗原特異的 IgA産生の選択的誘導、及び IgAと IgG 両産生を誘導する経鼻'粘膜ワクチンを実現すると共に、安全かつ有効な (副作用の な 、)粘膜免疫の誘導とその方法を確立する。
(2)第二の目的は、合成ペプチドの使用による、 ADビークルの安全性 '有効性'均質 性に係る品質の向上にある。 SP-Bの粘膜免疫誘導活性ドメイン (前述 SP-B 214-225 及び SP-B 257-266の各アミノ酸配列からなる）の合成ペプチド、及び SP-Cの粘膜免 疫活性導活性ドメイン (前記 SP-C 29-58のアミノ酸配列力もなる）の合成ペプチド、こ れ等の合成アナログ、更に、これ等のアミノ酸配列を部分として含む長鎖の合成ぺプ チド等々と、肺サーファクタント脂質成分との間で調製される複合体 (ADビークル)を 提供し、 ADビークルの品質を向上させる。
(3)第三の目的は、従来ワクチンの皮下接種力も経粘膜投与への転換にある。 ADビ 一クルを、気道感染ウィルスの不活ィ匕ワクチン、例えばインフルエンザ、 SARS、麻疹
、風疹、ムンブス等の不活ィ匕ワクチン、更に、腸管感染ウィルスの不活ィ匕ワクチン、例 えばロタ、ポリオ等の不活ィ匕ワクチンに利用し、これ等の皮下接種ワクチンを粘膜ワク チンに変換する。
(4)第四の目的は、気道、腸管以外の粘膜経由ウィルス感染に対する不活ィ匕ヮクチ ン、例えばエイズ、 B型肝炎、 C型肝炎等の不活ィ匕ワクチンにおいて、 ADビークルの 利用可能な方法を提供することである。
(5)第五の目的は、 DNAワクチン、生ワクチン、アレルギーの予防や治療等について も、 ADビークルの利用可能な方法を提供することである。
(6)第六の目的は、粘膜以外の IgAを誘導可能な免疫ルートとして、経皮接種 (塗布 や貼付等）において、 ADビークルの利用可能な方法を提供することにある。
(7)第七の目的は、ドラッグデリバリーシステムや製薬のみならず、農業、漁業等々へ の ADビークルの用途と応用の道を開くことにある。
[0019] 尚、本発明が提案する ADビークルは、従来免疫学で使用されているアジュバントと は、次の通り性能と作用を異にする：
従来アジュバントは、通常、皮下あるいは筋肉内接種され、局所の炎症反応を引き 起こし、抗原提示細胞や B—や T—リンパ球を引き寄せ、その能力を発揮する異物を 有効成分としている。更に、長時間にわたる炎症反応を維持するため、抗原の徐放 や貯留を惹起する鉱油や金属塩が併用されている。また、従来の粘膜ワクチン 'アジ ュバントとして知られているものは、前述した通り、大腸菌易熱生毒素やコレラ毒素等 の異物であり、為害作用や副作用の生じる危険性がある。
[0020] これに対し、本発明に係る ADビークルは、局所の炎症反応を引き起こさない。更に 、生体成分由来である上に、肺サーファタタントの中の活性成分あるいはその活性ド メインが限定されて ヽると共に、カゝかるドメインゃ該ドメイン領域を含む低分子べプチ ドを使い、効果的な粘膜ワクチンを実現している。従って、極めて安全であり、かつ非 侵襲的である。
この発明によれば、次（1)〜（8)が、それぞれ提供される：
(1)肺サーファタタントプロテイン B、その断片及びこれ等の機能構造に模倣の合成 ペプチド (A群）から選ばれる少なくとも 1種のタンパク質、及び Z又は肺サーファクタ ントプロテイン C、その断片及びこれ等の機能構造に模倣の合成ペプチド (B群)から 選ばれる少なくとも 1種のタンパク質、並びに脂質類 (C群)から選ばれる少なくとも 1 種の脂質カゝらなる複合体である抗原薬物 (AD)ビークルに、粘膜免疫 IgAを誘導する 量の抗原を共存、接触、捕捉又は吸着させることにより得られる粘膜ワクチンにおい て、上記ビークルの乾燥質量 (V)と上記抗原の乾燥質量 (A)との重量比 V/Aが約 1 を超えるよう調整されて 、ることを特徴とする、 IgAと IgGの両抗体の産生を誘導する粘 膜ワクチン。
[0021] 尚、「抗原」とは、ワクチン用に高度精製された純度が約 90%以上のウィルス、細菌 、カビ等の病原体に由来の抗原、毒素、不活化抗原、トキソイド、これ等の合成ェピト ープ領域等、更に、純度が約 90%以上のアレルゲン、アレルゲンェピトープ、タンパ ク質、糖タンパク質、高分子の糖質や核酸等を意味する。 また、「ADビークル」は、次の A群（肺サ一ファタタントプロテイン B、該プロテイン B に由来あるいは起因する天然断片及び合成ペプチド群）、及び Z又は B群 (肺サー ファタタントプロテイン C、該プロテイン Cに由来あるいは起因する天然断片及び合成 ペプチド群)、及び C群 (リン脂質、脂肪酸等の脂質群)の各群から少なくとも 1種ずつ 選ばれる、即ち、 A群と C群の各群力も少なくとも 1種ずつ選ばれる合計少なくとも 2 種、又は B群と C群の各群力 少なくとも 1種ずつ選ばれる合計少なくとも 2種、又は A 群及び B群並びに C群の各群から少なくとも 1種ずつ選ばれる合計少なくとも 3種の 物質力 なる複合体である：
< A群 >肺サーファタタントプロテイン B、及び配列番号 2に記載のアミノ酸配列から なるポリペプチド (アミノ酸番号は、 N末端の Metを第 1番アミノ酸とし、これより C末端 方向に順次付されて 、る)第 1番から第 381番 (配列番号 2)とその断片：第 214番から 第 225番 (配列番号 7)、第 257番から第 266番 (配列番号 8)、第 1番から第 20番 (配列 番号 10)、第 102番力 第 110番 (配列番号 11)、第 119番力 第 127番 (配列番号 12)、 第 136番力 第 142番 (配列番号 13)、第 171番力 第 185番 (配列番号 14)、第 201番 から第 280番 (配列番号 15)、第 300番から第 307番 (配列番号 16)、第 317番から第 330 番 (配列番号 17)、第 344番から第 351番 (配列番号 18)、第 358番から第 381番 (配列 番号 19)、第 201番から第 225番 (配列番号 21)、第 220番から第 260番 (配列番号 22)、 第 264番から第 280番（配列番号 23)、第 201番から第 260番（配列番号 24)、上記のァ ミノ酸配列の少なくとも 1つの配列を活性ドメインとして保有するポリペプチド、上記の 各アミノ酸配列の少なくとも 1個のアミノ酸が置換及び Z又は欠失したポリペプチド、 これ等の機能構造に模倣の合成ペプチドあるいは合成アナログ、これ等の糖又は糖 鎖による修飾体等、例えば、 SP-Bに模倣の合成ペプチド KL-4 (配列番号 26)、 SP-B と SP-Cとのハイブリッド (融合)型合成ペプチド (配列番号 30)等。
< B群 >肺サーファタタントプロテイン C、及び配列番号 4に記載の次のアミノ酸配列 力もなるポリペプチド (アミノ酸番号は、 N末端の Metを第 1番アミノ酸とし、これより C 末端方向に順次付されている）：第 1番から第 197番 (配列番号 4)、第 1番から第 191 番 (配列番号 6)、第 29番から第 58番 (配列番号 9)、第 24番から第 58番 (配列番号 20) 、第 24番力 第 42番 (配列番号 25)、配列番号 6に記載の第 1番力 第 191番のァミノ 酸配列からなるポリペプチド (アミノ酸番号は、 N末端の Metを第 1番アミノ酸とし、これ より C末端方向に順次付されている）、上記のアミノ酸配列の少なくとも 1つの配列を 活性ドメインとして保有するポリペプチド、上記の各アミノ酸配列の少なくとも 1個のァ ミノ酸が置換及び Z又は欠失したポリペプチド、これ等の機能構造に模倣の合成べ プチドあるいは合成アナログ、これ等の糖又は糖鎖による修飾体等、例えば、合成 SP - C(7- 28)断片 SP- CL (配列番号 27)、 SP- C型合成ペプチド SP- C33、 SP- C(25- 58)断 片の第 28〜29番アミノ酸残基 CysCysを PhePheに、 56番アミノ酸残基 Metを lieにそれ ぞれ置換した合成ペプチド SP-C(FFI) (配列番号 29)、上述 A群と重複の SP-Bと SP-C とのハイブリッド (融合)型合成ペプチド (配列番号 30)等。
く C群〉ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセ リン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルェタノ ールァミン、ホスファチジン酸等のリン脂質、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、 ステアリン酸、ォレイン酸等の脂肪酸等々の脂質。
( 2)上記（ 1 )に記載のビークル量 (V)と抗原量 ( A)との重量比 V/Aが約 1以下になる よう調整されていることを特徴とする、 IgA抗体産生を選択的に誘導する粘膜ワクチン
(3)上記（1)に記載の A群が、配列番号 2、 7、 8、 10〜19、 21〜24、 26、及び 30に 記載の各アミノ酸配列のタンパク質力 なる前記（1)又は（2)に記載の粘膜ワクチン
(4)上記（1)に記載の B群力 配列番号 4、 6、 9、 20、 25、及び 27〜30に記載の各 アミノ酸配列のタンパク質力もなる前記（1)、 (2)又は（3)に記載の粘膜ワクチン。
(5)上記（1)に記載の C群力 ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリ ン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、 ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミ チン酸、ステアリン酸、及びォレイン酸の各脂質力 なる前記（1)〜 (4)のいずれか に記載の粘膜ワクチン。
(6)前記の抗原 (A)が伝染病病原体に由来の不活化抗原又は無毒化毒素である前 記（1)又は（2)に記載の粘膜ワクチン。 (7)前記（1)及び（2)の抗原 (A)がアレルゲン、アレルゲンェピトープ、又はアレルゲ ン由来抗原であるアレルギーの予防剤又は治療剤。
(8)前記（1)及び（2)のビークル量 (V)と抗原量 (A)との重量比 V/Aが約 1であること を、 IgA抗体の選択的産生と IgAと IgG両抗体産生との間の変換スィッチとして用いる ことを特徴とする粘膜免疫誘導方法。
以下、この発明の実施態様につき説明する。
(1) ADビークルの組成：
前述した A群 (肺サーファタタントプロテイン B及び該プロテイン Bに由来あるいは起 因する天然及び合成ポリペプチド群）、及び Z又は B群 (肺サーファタタントプロティ ン C及び該プロテイン Cに由来あるいは起因する天然及び合成ポリペプチド群)及び C群 (リン脂質、脂肪酸等の脂質群)の 3群の乾燥重量％は、次の通りである: A群は 約 0.1〜約 6.0重量％、 B群は約 0.1〜約 6.0重量％、及び C群は約 88〜約 99.8重量％で ある。抗原薬物ビークルの調製では、重量％において、八群％ + 群+じ群％ = 100 %、又は八群％ +じ群％ = 100%、又は B群 +じ群％ = 100%になるよう調整する。
(2) ADビークルの調製例（A、 B及び Cの 3群の使用例）：
以下に調製手順を例示する。例えば、 A群を 2 mg、 B群を 2 mg、及び C群を 96 mg それぞれ秤取し(重量％にて八群％ + 群+じ群％ = 100%)、これ等を5 mlの等張 液、例えば生理的食塩水やリン酸緩衝液 (PBS)中に均一に懸濁させる。得られた懸 濁液は、抗原薬物ビークル（100 mg/5 ml)液として使用に供する。該ビークルは、使 用時にその都度、調製する。尚、懸濁には、超音波、ホモジナイザー、ミキサー、振 盪器等を用いることができる。
[0023] 超音波は過剰処理による液の変性 (粘性の増カロ）をもたらし易 、ので、ミキサー、例 えばボックスミキサー（例えば商品名 Vortex Mixer)の使用が望ましい。
[0024] 尚、 C群の脂質 96 mgの内訳については、例えば、ホスファチジルコリン 71 mg、ホス ファチジルグリセロール 21 mg、及びホスファチジルセリン 4 mgの混合等を採用するこ とができる（脂質量の合計は 96 mg)。また、 SP-Aと SP-Dが除去され、 SP-Bと SP-Cの 含有が報告されている RDS治療用の肺サーファクタント製剤、例えば、サーファタテン (Surfacten)、人工合成製剤サーファタシン (Surfacxin)等を用いる場合には、その使 用書に従って調製した懸濁液をそのまま、 ADビークル液として使用に供することがで きる。
(3)粘膜ワクチンの調製：ワクチン中の抗原量 (A)に対する ADビークル量 (V)の乾燥 重量比 V/Aが所望の値になるよう、ワクチン原液に ADビークル液を添加混合し調製 する。例えば、抗原含有量が 50 mg/mlのワクチン原液 50 μ 1に対し、重量比 V/A= l を採用すると、上記（2)で調製した ADビークル (50 mg/ml)液の添加混合量は 50 μ \ である。尚、均一に混合するには、ホモジナイザー、ミキサー、振盪器、攪拌器等を 用!/、ることができる。
[0025] 抗原とは、ワクチン用に高度精製された純度が約 90%以上の細菌由来抗原、ウィル ス抗原、トキソイド等、更に、スギ花粉やダニ等に由来の純度が約 90%以上のアレルゲ ン、タンパク質、糖タンパク質、高分子の糖質や核酸等を意味する。抗原質量の Α値 には、実測値を用いるか、あるいは抗原の純度、比活性、分子量、抗原抗体反応等 力 の計算値を用いることができる。
[0026] 重量比 V/Aの算出における V値には、通常の調製では ADビークルの約 90重量％以 上を脂質又はリン脂質が占めるので、 ADビークル量の代わりに、脂質量又はリン脂 質量を用いることができる。
[0027] 本発明の粘膜ワクチンにおける抗原の乾燥重量 (A)は約 0.1〜約 50 μ g/kg、好ま しくは約 0.3〜約 30 /z g/Kgである。このような抗原量において、 IgA抗体産生を優先 的かつ選択的に誘導するための V/Aは、約 0.1〜約 1.0が望ましい。また、 IgA及び Ig G両抗体産生を誘導するための V/Aは、約 1.0〜約 100、好ましくは約 20〜約 50の範 囲を採用できる。
[0028] また、以上のとおりの V/Aにおいて、抗原の約 60%以上力ADビークルに結合し、そ れによって得られた粘膜免疫ワクチンは IgA抗体産生及び Zまたは IgG抗体産生を効 率的に誘導することができる。
以下、参考例、実験例及び実施例を上げ、この発明の構成と効果につき、具体的 に説明する。但し、この発明は、これ等の具体例、説明及び記載にのみ限定されるわ けではない。
参考例 1 ADビークルの調製と標品：
本発明にお 、て ADビークルとして用いる肺サーファタタントの調製と標品にっき以 下、例示する：牛の肺より Howoodらの方法（Biochemistry, 24、 184-190、 1985)により 調製された標品；該標品を 1ーブタノールで抽出して水溶性蛋白成分 SP-A及び SD- Dを除去する力 あるいは検出限界以下にまで減じた標品（Haasman H.P.ら、 J.Biol. Chem., 262, 13977-13880, 1987)；ホスファチジルコリンゃジパルミトイルホスファチジ ルコリン等のリン脂質を全体として 40重量％以上、ホスファチジルグリセロールを約 10- 約 30重量％、ホスファチジルセリンを約 2-約 5重量％、パルミチン酸を約 1.0-約 20重量％ 等力も選ばれる 2種以上の脂質、及び肺サーファタタント由来の脂溶性 (疎水性)タン パク質、 SP-B及び Z又は SP-Cの有効領域又は該有効領域を含む合成ペプチド、例 えば、ヒト SP-Cの有効領域（配列番号 20に記載の第 24-58番アミノ酸配列） FGIPCC PVHLKRLLIVWVWLIVWIVGALLMGLからなる合成ペプチドを約 0.1-約 12重量％ 、それぞれ含有し、上記組成の合計力 S100重量％になるよう調整した標品；巿販あるい は公知の肺サーファクタント、例えば、商品名サーファタテン（Surfacten)、インフアサ ~~フ (Infasurf)、
キュー口サーフ（Curosurf)、ヒューマンサーフ（Humansurf)、ェキソサーフ（Exosurf)、 ァルビオファクト（Alveofact)、サーフアキシン（Surfaxin)等である。
実験例 1
スプリット型インフルエンザワクチンの作成：
A型インフルエンザウイルス Aichi/68/2/H3N2株を接種した発育鶏卵由来浮遊液 [ lxl08 PFU (Plaque Forming Unit) ] (川崎医科大学.微生物学教室 大内正信教授か ら供与）を用い、以下の操作でスプリット型インフルエンザワクチンを作成した。 0.004 M PBS [タカラバイオ株式会社（日本)製])で一晩透析したウィルス浮遊液に β—プ 口ピオラタトン [和光純薬株式会社（日本)製]を 0.05容量 %、最終濃度が 8 ηΜになるよ うに添加混合し、氷浴中で 18時間インキュベートし、ウィルスを不活ィ匕した。次いで、 3 7°Cで 1.5時間インキュベートすることにより、 β プロピオラタトンを加水分解させた。 加水分解が終了の後、これに最終濃度が 0.1重量％になるよう Tween80 [和光純薬株 式会社（日本)製]を添加混合し、更に、該 Tween80と等量のジェチルエーテル [和光 純薬株式会社（日本)製]を添加混合の後、 4°Cで 2時間、転倒混和した。この液を 2,0 00rpm、 5分間、遠心分離し、その上澄を採取'回収した。次いで、 Automatic Environ mental Seed V/Ac System [SaV/Ant Instrument,INC (米国）製]を用い、上澄からジ ェチルエーテルを除去した後、これを Millex 0.45 μ mフィルター [Millipore (米国）製] で除菌濾過し、不活化スプリット型インフルエンザワクチン原液として用いた。
実験例 2
経鼻'粘膜ワクチンの調製：
実験例 1で得たスプリット型インフルエンザワクチン原液と参考例 1に記載の ADビー クル標品とを混合して用いた。先ず、 ADビークルをワクチン投与に必要な濃度になる よう PBS (phosphate buffer saline)で懸濁の後、室温、 5分間の超音波処理により均一 な懸濁液とした。この懸濁液に ADビークル（乾燥重量) 0.1 gに対し上記ワクチン原 液 (乾燥重量) 0.1 gを添加し、ボルテックスミキサーで混合の後、室温で 1時間、静 置することにより IgA誘導用の経鼻 ·粘膜ワクチンを調製した。また、 ADビークル (乾燥 重量） 1.0 gに対し前記ワクチン原液 (乾燥重量) 0.1 μ gを添加の後、上記と同様に して IgA及び IgG両誘導用の経鼻 ·粘膜ワクチンを調製した。
実験例 3
動物実験：
6週齢、メス BALB/cマウス [日本エスエルシー株式会社（日本)から購入]を用いた 。全ての動物実験は、徳島大学医学部実験動物センターの感染動物舎 (P2レベル） 内で、徳島大学医学部動物実験委員会のガイドラインに従って行われた。
実験例 4
経鼻投与：
ワククチンの経鼻投与にぉ 、ては，実験例 2で得たワクチン (乾燥重量)濃度が 0.1 μ g/ 1になるよう PBSで希釈の後、これをエーテル麻酔したマウスの両鼻腔に各々 1 1づっ、合計 2 μ ΐΖマウス、点鼻することにより投与した。対照群には同量 (2 1)の PBSを点鼻投与した。初回免疫力も 4週後に同様の点鼻により 2次免疫を行い、該 2 次免疫から 2週間目の各マウスにつき、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液及び血清をそれぞ れ調製し、これ等を検体として前記ワクチン株ウィルスに特異的な IgA及び IgG両抗体 の測定に供した。
実験例 5
マウス鼻腔洗浄液 ·肺胞洗浄液 ·血清の調製：
ワクチン投与マウスをペントバルビタール麻酔下で開腹開胸の後、気管を切開しァ トム静脈カテーテル節付 3Fr [アトムメディカル株式会社（日本)製]を肺へ挿入して生 理食塩水 1 mlを注入し、その液を回収した。これを 3回繰り返すことにより採取した液 、合計 3 mlを肺胞洗浄液として用いた。肺洗浄液を採取の後、切開した気管から鼻 腔方向へアトム静脈カテーテルを挿入して lmlの生理食塩水を注入し、鼻からの流 出液を採取した。この液を鼻腔洗浄液として用いた。更に、心臓力も採血の後、これ を 5,000rpm、 10分間、遠心分離し、その上澄を採取し、血清とした。
実験例 6
タンパク質の定量：
鼻腔洗浄液、肺洗浄液及び血清のタンパク質含有量を BCA Protein Assay Reagen t Kit[Peirce社（米国）製]を用いて測定した (Anal.Biochem., 150, 76-85, 1985) 0波 長 562 nmの吸光度は SPECTRA Max PLUS 384 (Molecular Devices Corporation (米 国)製)を用いて測定した。
実験例 7
インフルエンザウイルスに対する特異的な IgA及び IgG両抗体の精製：
ELISAにおける定量の標準あるいは基準として用いるために、上記 IgA及び IgG両 抗体を次の通り精製'調製した。組換え大腸菌発現 Protein Gセファロース 4Bカラム [ Zymed Laboratories Inc. (米国）製]を用いるァフィ-ティークロマトグラフィーにより、 インフルエンザワクチン投与およびインフルエンザウイルス感染マウスの肺胞洗浄液 から IgG画分を精製した。また、抗マウス IgAャギ IgG抗体 [Sigma社 (米国）製]を BrCN 活性化セファロース 4Bカラム [Amersham Bioscience社（米国）製]に結合させ、 Protei n Gの素通り画分から、これを用いたァフィユティークロマトグラフィーにより IgA画分を 精製した。これ等の IgA及び IgG画分からウィルス特異抗体を精製するため、免疫に 用いた不活化スプリット型インフルエンザワクチン抗原を BrCN活性ィ匕セファロースカ ラムに結合させた抗原ァフィ二ティークロマトグラフィーにより、インフルエンザウィル スに特異的な IgA及び IgG抗体をそれぞれ精製'調製した。尚、リガンドとしてのスプリ ット型インフルエンザウイルス抗原タンパク質のカラムへのカップリングには、 0.1 M N aHCO /0.5 M NaCl緩衝液 (pH 8.5)を用いて結合反応を行い、フリーのリガンドは 0.
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1 M酢酸 /0.5 M NaCKpH 8.5)を用いて除去した後、 PBS (pH 7.5)にて中和した。各 ァフィ-ティクロマトグラフィーは PBS (pH 7.5)によりァフィ-ティ結合反応およびフリ 一の抗体の除去を行った後、 glycine-HCl緩衝液 (pH 2.8)により特異抗体を溶出さ せた。溶出された画分は直ちに 0.5 M Tris-HCl緩衝液 (pH 9.0)により中和の後、 Mill iQ水にて透析の後、凍結乾燥した。これ等の IgA及び IgGは、使用時に PBSで溶解し 、 ELISAの標準試薬 (抗体)として用いた。
実験例 8
抗インフルエンザウイルス IgA及び IgG抗体の定量：
鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液及び血清中の抗インフルエンザウイルス IgA及び IgG抗体 の含有量は、 ELISAにより定量した。 ELISAは、 Mouse ELISA quantitatin kit[Bethyl Laboratories社（米国）製]を用いて行った。 96ゥエル Nuncィムノプレート [Nalgen Nun clnternational社（米国）製]の各ゥヱルにワクチン 1 μ g、及びゥシ血清アルブミン [BS A; Sigma社 (米国）製] 1 g/mlの PBS溶液を 100 1添カ卩の後、 4°Cでー晚、固層化 反応を行った。その後、洗浄液（50 mM Tris、 0.14 M NaCl、 0.05重量％ Tween 20、 p H 8.0)で 3回すすぎ、ワクチン液を除去した。各ゥエルに 0.15 M NaCl及び 1重量％ BS Aを含む 50 mM Tris- HCL緩衝液（pH 8.0)を 200 1添カ卩し、室温で 1時間ブロッキン グ反応を行った。各ゥ ルを上記洗浄液で 3回すすいだ後、サンプル結合緩衝液 (5 0 mM Tris, 0.15 M NaCl, 0.05重量％ Tween 20、 1重量％ BSA、 pH 8.0)にて適量に 希釈した鼻腔洗浄液、肺洗浄液、又は血清を 100 添加混合の後、室温で 2時間 反応させた。抗体マウス IgAャギ IgG抗体又は IgG—西洋ヮサビペルォキシダーゼ（Be thyl Laboratories Inc. (米国）製）を二次抗体として用い、 TMB Micowell Peroxidase S ubsatrate System [Kir egaard & Perry Laboratoties、 Inc. (米国)製]を用 ヽ飞発色反 応を行った。次いで、各ゥエルに 100 1の 2 M H SO [和光純薬株式会社（日本)製]
2 4
を添カ卩することにより反応を停止させた後、 450 nmの吸光度を SPECTRA MAX PLUS 384で測定した。定量のための標準試薬 (抗体)として、実験例 7で得た肺洗浄液か らの精製'抗インフルエンザウイルス IgA及び IgGを用い、上記と同様にして吸光度を 測定し、これ等の測定値を標準に用いた。
実施例 1
(1)経鼻'粘膜ワクチンの調製：
「ADビークル」としてサーファタテン [三菱ゥエルファーマ社（日本)製]を用い、これと 実験例 1で得たインフルエンザ不活ィ匕ワクチンとの混合物を超音波処理することによ り粘膜ワクチンを調製した。サーファタテンは使用時に各ワクチン投与に必要な濃度 になるよう PBSに懸濁し、室温、 1分間の超音波処理により均一な懸濁液とした。次い で、ワクチン（乾燥ワクチン量) 0.2 /z gに対し、上記サーファタテン懸濁液をそのリン 脂質量で 0 (無添加）、 0.02、 0.1、 0.2、 1.0及び 2.0 μ gの各濃度になるよう添カ卩し、ボ ルテックスミキサーで混合の後、室温で 3分間、超音波処理した。各ワクチン液とも投 与前に室温で 1時間インキュベートした。
(2)マウス免疫：
ワクチンの経鼻投与においては各ワクチン液を乾燥ワクチン相当重量 0.1 μ §/ μ \ 溶液になるように PBSで希釈の後、これ等を BALB/cマウスの両鼻腔に投与することに より初回免疫した。その 4週間後に初回免疫と同様の方法にて 2次免疫を行い、 2次 免疫 2週間後の各マウスから鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液及び血清をそれぞれ採取 '調 製し、抗インフルエンザ IgA及び IgGの定量に用いた。
(3)免疫効果の判定：
上記の鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液及び血清中（各調製は実験例 5に記載)の抗イン フルェンザ IgA及び IgG両レベルを ELISAで定量する（その要領は実験例 8に記載）と 共に、その有意差検定 (t検定)の結果に基づき、「ADビークル」としてのサーファタテ ンが経鼻ワクチンによる粘膜免疫及び Z又は体液性免疫の誘導に及ぼす影響と効 果を評価した。
ワクチンに添加混合するサーファタテンの量が 0.2 g以下（以下「低ドーズ」群と表 記する）では、鼻腔及び肺胞粘膜の抗インフルエンザ IgA産生量はサーファタテン量 に依存して増加した（図 1及び図 2)。しかし、この低ドーズ群の IgG産生量にはサーフ ァクテンの増量に伴う増強は見られず、また、血中抗体、 IgA及び IgGの産生は共に 誘導されなかった（図 3)。
[0030] 尚、図 1〜3において、各ワクチン投与群のマウス数 n=8〜12、平均値士 SD (標準偏 差)、有意水準は、サーファタテン無添加ワクチン (0 g)投与群に対する有意水準、 +は p〈0.08、 ++は p〈0.05、 +++は p〈0.01、また、 *はサーファタテン 0.1 μ g添カ卩ヮクチ ン投与群に対する有意水準、 pく 0.01をそれぞれ示す。
[0031] これに対し、サーファタテンの量が 1.0から 2.0 g (以下「高ドーズ」群と表記する）で は、鼻腔及び肺胞粘膜の抗インフルエンザ IgG産生量がサーファタテン量に依存し 増加した（図 1及び図 2)。また、血中の IgG産生量も 2.0 gのサーファタテンを用い た群では有意に増強された（図 3)。尚、この高ドーズ群の IgA産生量には、上記の低 ドーズ群のそれに比べ有意な増強は検出されず、低ドーズ群の粘膜免疫効果の高 進は見られなかった（図 1及び図 2)。
(4)「IgA産生」から「IgA及び IgG両産生」への切換えスィッチの特定：
上述した結果は、乾燥ワクチン重量 (0.2 μ g)と、サーファタテン (ADビークル）中のリ ン脂質の変量 (0〜2.0 g)との相関であるので、上記の切換えスィッチは、 ADビーク ル中のリン脂質量 Z乾燥ワクチン量の重量比（以下「V/A」と表記する）として、次の 通り算出かつ特定された：
(a) V/Aが約 1.0以下のとき、 IgAが産生された；
(b) V/Aが約 1.0を超えるとき、 IgA及び IgGの両者が産生された;及び
(c)「IgA産生」から「IgA及び IgG両産生」への切換えスィッチは、 V/Aが約 1付近にあ ると特定された。
[0032] 尚、上記 V/A算出での V値には、 ADビークル中のリン脂質量 (重量）が用いられた 。しかし、本発明に係る ADビークルの構成成分のうち、通常、 90重量 %以上がリン脂 質であるので、本発明を実施する上での重量比 V/Aの調節には、 V値としてリン脂質 量だけではなぐ脂質量 (リン脂質を含む)、又は ADビークル量 (乾燥重量)をも採用 できると判断された。
実施例 2
(1)ヒト型肺サーファクタントタンパク質の合成：
純度 95%以上のヒト型 SP-Cの有効領域（配列番号 20)の合成ペプチド、 FGIPCCPV HLKRLLIVWVWLIVWIVGALLMGL [Greiner Bio- One社（ドイツ）が合成]を注文 '購入した。これをタンパク量として 10 mg/mlになるよう CM緩衝液（クロ口ホルム Zエタ ノールを容量比 2 : 1にて混合の緩衝液）に懸濁し、合成 SP-C懸濁液として、後述さ れる人工 ADビークル (人工ヒト型肺サーファクタント）の調製に供した。
(2)合成 ADビークルの調製：
肺サーファクタントとしての構造および機能を有する人エサ一ファタタントの調製は 、 Takeiらの方法（Biol.Pharm.Bull., 1996, 19, 1247- 1253)により行った。即ち、 dipalmi toylphosphatidylcholine [和光純薬（日本）製]、 phosphatidylglycerol及びパルミチン 酸を 75:25: 10 (重量比）にて混合して、リン脂質量として 10 mg/mlの濃度になるように CM混合液 (クロ口ホルム Zメタノールの容量比が 2:1の混合液）に懸濁し、脂質成分 懸濁液とした。
前述の SP-C懸濁液に、同容量のトリフルォロ酢酸 (TFA)を添加混合し完全に溶解 した。次いで、 SP-C量が脂質成分中のリン脂質重量で 2 % (w/w)となるよう SP-C溶解 液に上記の脂質成分懸濁液を添加混合の後、ロータリーエバボレー夕一を用いて 40 °Cで乾固した。これをリン脂質 10 mg/mlとなるように、 10%エタノール液に再懸濁し、 4 5°Cの水浴中で 15分間、振とう混和した。これを凍結乾燥の後、人工の乾燥ヒト型肺 サーファタタント (合成 ADビークル）として- 30-4°Cで保存した。
(3)経鼻'粘膜ワクチンの調製：
上述の人工の乾燥 ADビークルは、リン脂質 30 mg/mlとなるように PBSに懸濁し、室 温、 1分間の超音波処理により均一な懸濁液とした。これに実験例 1で得たワクチン（ 乾燥重量で) 0.2 /z gに対し、上記の人エサ一ファクタント、又は免疫誘導効果の陽 性コントロールとしてサーファタテン (実施例 1に記載)を、リン脂質量に換算して 2.0 μ gになるように添加し、ボルテックスミキサーで混合の後、室温にて 3分間、超音波 処理した。得られた経鼻'粘膜ワクチンは投与前に 1時間、インキュベートした。ヮクチ ンの経鼻投与においては、ワクチン液をワクチン 0.1 g/ 1溶液になるように PBSで 希釈して用いた。
(4)マウス免疫：
実施例 1の記載と同様にして各 BALB/cマウスを免疫し、 2次免疫 2週間後の各マウ スから鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液及び血清をそれぞれ採取'調製し、抗インフルェン ザ IgA及び IgGの定量に用いた。
(5)免疫効果の判定：
実施例 1の記載と同様して抗インフルエンザ IgA及び IgG両レベルを ELISAで定量 すると共に、その有意差検定の結果に基づき、経鼻 ·粘膜ワクチンにおける「ADビー クル」として、合成 PS-Cを含有の人工ヒト肺サーファタタント (合成 ADビークル）が粘 膜免疫及び Z又は体液性免疫の誘導に及ぼす影響と効果を評価した。
[0034] 鼻洗浄液では、人エサ一ファタタント混合ワクチン投与群の IgA産生量は、陽性コン トロールのサーファタテン混合ワクチン投与群のそれとほぼ同一レベルにまで有意に 増強された。併せて、 ADビークル無添加ワクチンの群では検出されな力つた IgG産生 も検出された (図 4)。
[0035] 尚、図 4〜6において、口は IgA産生量、國は IgG産生量、ワクチン投与群のマウス 数 n=4、平均値士 SD (標準偏差）、有意水準は、 ADビークル無添加ワクチン投与群に 対する有意水準、 +は pく 0.01、また、 ++は pく 0.05をそれぞれ示す。
[0036] 肺洗浄液では、人エサ一ファタタント混合ワクチン投与群の IgG産生量は、陽性コン トロールのサーファタテン混合ワクチン投与群のそれと同様に有意に増強された。ま た、 IgA産生は検出された力 その産生量には ADビークル無添加ワクチン投与群の それとの間で有意差は見られなかった。しかし、この IgA産生量には、サーファタテン 混合ワクチン投与群のそれとの間においても有意差は見られな力つたので、人エサ 一ファクタント混合ワクチンの IgA産生誘導能は、陽性コントロールのサーファタテン 混合ワクチンのそれに近似していると評価された（図 5)。
[0037] 血中では、人エサ一ファクタント混合ワクチン投与群の IgG産生量は、陽性コント口 一ルのサ一ファタテン混合ワクチン投与群のそれとほぼ同一レベルにまで有意に増 強された（図 6)。
[0038] 以上の結果に基づき、人工合成サーファタタントは、ゥシ由来のサーファタテンと同 様に、粘膜及び体液性の両免疫の誘導能を有すると判定された。
実施例 3
1. s¾料 人工肺サーファクタント製剤： Surfacten (ST)は三菱ゥエルファーマ社より購入した。
[0039] インフルエンザスプリットワクチン: A/-ユーヨーク/ 55/2004(H3N2)、 A/-ユーカレド ニァ /20/99(Η1Ν1)、 B/上海/ 361/2002はそれぞれ財団法人大阪大学微生物病研究 会より入手した。
[0040] 合成サーファタタント調製基材： DPPC (dipalmitoylphosphatidylcholine)は和光純薬 株式会社な 、し Sigma社から、 E- PG (egg-phosphatidylglycerol)は Avanti社な 、し Sig ma社から、 PA (palmitic acid)は和光純薬株式会社から入手した。
[0041] 合成ペプチドはグライナ一社および林ィ匕成など力も入手した。なお、合成ペプチド は、 SP- B(l- 25) (配列番号 21)、 SP- B(20- 60) (配列番号 22)、 SP- B(64- 80) (配列番号 23)、 SP-B(l-60) (配列番号 24)、 SP-C(1-19) (配列番号 25)、呼吸障害治療薬として 開発な 、し研究中の合成ペプチド KL-4 (配列番号 26)、 SP-CL(7-28) (配列番号 27) 、 SP-C33 (配列番号 28)、 SP-C(FFI) (配列番号 29)、 SP-C(KLS) (配列番号 30)である
[0042] タンパク質およびリン脂質測定キット： BCA™ Protein Assay Kitは PIERCE社力ら、リ ン脂質 Cテストヮコ一は和光純薬株式会社から購入した。
2.方法
1)合成 ADビークルの調製
合成ペプチドは適当な溶媒で溶解した。ただし、難溶性合成ペプチドは TFAに 5-2 0 mg/mlの濃度に溶解した。クロ口ホルム:メタノール (2 : 1、 v/v) (CM)混液に溶解し た DPPC、 e-PGおよび PA脂質混合物 (75:25:10 ;w/w/w) (以下 3種脂質混合液と ヽぅ )を TFAで溶解した合成ペプチド（リン脂質 (PL)に対して 0.6- 2.0% (モル) )に添加混 合した。その混合液を減圧濃縮機で減圧乾固した。その乾固物に 10%エタノール水 溶液を加え、 N- NaOH水溶液で pHを 6-7に調整した後、 42-45°C、 3-10分間の加温 処理した。冷却後、 1-10 mg PL/mlの濃度にし、 1-5 mg PL相当量をそれぞれ分注し 、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物すなわち合成 ADビークルを生理食塩液に懸 濁して、ワクチンとの結合試験に使用した。
[0043] 具体的には、以下の ADビークル（合成サーファクタント：合成 ADビークル ST)を作 成した。 (1)合成 ADビークル SSF- 14の調製
合成ペプチド SP- B(l- 25)を 0.27 mg分取し、 TFAに 5 mg/mlの濃度に溶解した。 CM 混液に溶解した 3種脂質混合物を TFAで溶解した合成ペプチドに脂質混合物のリン 脂質に対して 0.6% (モル)のなるように添加し、その混合液を減圧濃縮機で減圧乾固 した。その乾固物に 10%エタノール水溶液をカ卩え、 N- NaOH水溶液で pHを 6-7に調 整した後、 42-45°Cで 3分間の加温処理した。放冷後、リン脂質濃度として 2 mg /mL にし、 1-5 mgPL相当量づつ、 1.5 mL容マイクロチューブに分注し、凍結乾燥して、 SS F- 14を調製した。
(2)合成 ADビークル SSF- 28、 SSF- 30、 SSF- 24、 SSF- 43の調製
前記と同様に、合成ペプチド SP-B(l-60)を用いて SSF-28を、 SP-B(20-60)を用いて SSF- 30を、 SP- B (64- 80)を用いて SSF—24を、 SP- C(l- 19)を用いて SSF- 43をそれぞ れ調製した。
(3)合成 ADビークル SSF-44から SSF-48の調製
前記と同様に、 KL- 4を用いて SSF- 45、 SP- CL(7- 27)を用いて SSF- 44、 SP- C33を用 いて SSF- 46、 SP- C(FFI)を用いて SSF- 47、 SP- C(KLS)を用いて SSF- 48をそれぞれ調 製した。
(4) SP- Bと SP- Cを含有する合成 ADビークル SSF- 41の調製
合成ペプチド SP- B(64- 80)および SP- C(l— 35)を分取し、 TFAに 5 mg/mLの濃度に 溶解した。 3種脂質混合物を TFAで溶解した合成ペプチドに 3種脂質混合物のリン脂 質に対して 0.6%モルになるように添加した。その後、前記と同様の操作を行い、 SSF- 41を調製した。
2) ADビークル並びに合成 ADビークルとワクチンとの結合試験
(1)ADビークノレサーファタタント（ADビークル ST)とワクチンの結合試験
ADビークル濃度 0.5 mg/mLおよび Vac濃度 0.05 mg/mL,それらの比は 10 : 1、液量 0.4 mLスケールで懸濁試験を行った。
STに 30 mg/mL濃度になるように生理食塩液をカ卩ぇピぺティングし、懸濁液を得た。 次いで、その懸濁液 7 Lをエツペンドルフチューブに取り、さらに生理食塩液を、 38 2 μ Lを加え、 Digital SONIFIER 250D (Branson)を用いて、氷冷下 1分間、超音波処 理した。次いで、ワクチン溶液 (A/-ユーカレドニア/ 20/99(Η1Ν1)、 1.78mgProt/mL )を 11 μ L加え、氷冷下 3分間超音波処理した。その後、室温に 2時間放置し、その間 30分間ごとに、緩や力に 3-5回の転倒混和した。
[0045] その ADビークル ST-ワクチン混合液を High Speed Refrigated micro centrifoge (Tom y MX- 301)を使用して、 4-5°C、 20,000 X g、 15分間遠心した。得られた上清から 25 μ L分取し、ワクチン量をタンパク質量として BCA™ Protein Assay Kitで測定した。
[0046] この時の ADビークル STへの 3種のワクチン (Α/ニユーヨーク、 Α/ニユーカレドニアお よび B/上海）の結合率は 60- 70%であった。
(2) SP-B断片を含有する合成 ADビークルとワクチンの結合試験
前記 (1)の ADビークル STの代わりに、合成 ADビークル SSF- 14、 SSF- 30、 SSF- 24を 用いた。また、ワクチンは A/ニューカレドニアを用いた。
[0047] 合成 ADビークル濃度（リン脂質 Cテストヮコー（和光純薬、 433— 36201)を用いて測 定したリン脂質換算） 2.5 mg/mLおよびワクチン濃度 0.05 mg/mL,それらの比は 50 : 1
、液量 0.4 mLスケールで、前記 (1)に準じて結合試験を行った。
[0048] 結果を表 1に示した。 SSF-14へのワクチンの結合率は 60%弱であった力 SSF-24 および SSF-30の結合率は、 90%以上であった。
(3) SP-C断片を含有する合成 ADビークルとワクチンの結合試験
SSF- 43とワクチン (Α/ニユーカレドニア）の結合率を測定した。
[0049] 合成 ADビークル濃度（リン脂質換算） 0.5 mg/mLおよびワクチン濃度 0.05 mg/mL, それらの比は 10 : 1、液量 0.4 mLスケールで、前記 (1)に準じて結合試験を行った。
[0050] 結果を表 2に示した。ワクチンの SSF-43への結合率は約 80%であった。
(4)合成 ADビークル SSF-28と各種ワクチンの結合試験
合成サ ADビークルとして SSF- 28を、ワクチンとして Α/ニユーカレドニア/ 20/99(Η1Ν 1)、 Α/ニユーヨーク/ 55/2004(H3N2)および B/上海/ 361/2002を使用し、両者の結合 試験も行った。
[0051] その結果、表 3で示すように、 SSF-28への各ワクチンの結合率は 60%以上であった (4)合成 ADビークル SSF-44から SSF-48とワクチンの結合試験 合成 ADビークルとして、 SSF-45、 SSF-44、 SSF-46、 SSF-47および SSF-48を使用し
、前記と同様に結合試験を行った。
[0052] 表 2に示すように、それぞれ合成サーファタタントへのワクチンの結合率は 60%以上 であった。
[0053] [表 1] 合成ペプチドを含有する合成 ADビークルと
インフルエンザワクチンの結合試験
合成 ADビークル ペプチド 結合率 (%)
SSF-1 4 SP-BC1 -25) 57.0
SSF-30 SP-B(20-60) 91 .3
SSF-24 SP-B(64-80) 91 .3
SP-B(64-80)
SSF-41 85.1
+SP - C(1一 35)
[0054] [表 2] 表 2 合成ペプチドを含有する合成 ADビークルと
インフルエンザワクチンの結合試験
合成 ADビークル ペプチド 結合率 (%)
SSF-43 SP-CC1 -19) 78.9
SSF-45 KL-4 64.8
SSF-44 SP-CLC7-28) 72.8
SSF-46 SP-C33 76.2
SSF-47 SP-C(FFI) 86.9
SSF-48 SP - C(Kし S) 66.3
[0055] [表 3] 表 3 各種インフルエンザワクチンと
合成 ADビークル SSF- 28の結合試験
インフ;！レエンザ 合成 ADビーク
ペプチド 結合率 (%) ワクチン ル
A/ニューヨーク 64.4
A/ニューカレドニア SSF-28 SP-B(1 -60) 83.0
BZ上海 87.9 実施例 4
鼻粘膜リンパ組織は動物種によって大きな差があり、マウスやラットの鼻腔粘膜には 腸の Peyer's patchesに相当するリンパ組織が多数存在している力 ヒトの鼻腔粘膜に これに相当するリンパ組織は見られず、従ってマウスやラットの経鼻粘膜ワクチンの 実験結果がヒトに直接そのままあてはまるとは言えない。ヒトの鼻腔、喉頭部のリンパ 組織は、扁桃腺、アデノイドのリンパ組織力も成る Waldeyer's ringが中心的なリンパ 組織で、この組織に比較的類似したリンパ組織を持つ動物はブタである。そこでマウ スで得られた ADビークルの結果を基に、ヒトでの治験を想定した前臨床実験としてミ -ブタを用いて ADビークル効果を検証して、治験での ADビークルの投与量、投与方 法、副作用の検討を行った。
1)試料および方法
(1)ミニブタ
離乳期後のミニブタ: 1-2力月齢 (体重 : 2.2-6.6 Kg)を用いた。ブタが通常感染する 各種ウィルス、細菌、寄生虫等、 22種の検定で異常の無い事の確かめられた個体を 1群 3匹使用した。
(2)ウィルス抗原
Α/ニユーカレドニア/ 20/99(Η1Ν1)のスプリット抗原を使用した。
(3)サーファタタント調製
三菱ゥエルファーマから購入したサーファタテン™ (ADビークル ST)を用いた。
(4)タンパク質およびリン脂質測定キット
BCA™ Protein Assay Kitは PIERCE社力ら、リン脂質 Cテストヮコ一は和光純薬から 購入した。
2)方法
(1)接種方法、検体採取方法
ワクチンの接種、採血、鼻腔粘液は麻酔下で行った。麻酔量を算定するために、前 もってミニブタの体重を測定し、ドミトール（明治製菓 (株)）とドルカム注 (ァステラス製 薬 (株)）の混合麻酔にて行った。採血は全静脈洞より行った。鼻腔粘液の採取は、 左右の鼻腔内部を滅菌綿棒で 2回ずつぬぐい取った後、 2 mlの生理食塩水に浸して 絞り取った。鼻腔粘液の一部は速やかに細胞病理診断を行い、鼻腔内の炎症反応 の有無を検討した。
[0057] 体重、体温、は毎週 1回測定し、健康状況は 1日 2回巡視して記録した。
(2)抗原特異的抗体価の測定
マウスにおける抗原特異的抗体価の測定に準じて行われ、抗ブタ IgA、 IgG2次抗体 を用いた酵素抗体法 (ELISA)で行った。
3)結果
インフルエンザ A/-ユーカレドニア/ 20/99(Η1Ν1)のスプリット抗原を、 ADビークル S Tに結合させ、これを 100 1の生理食塩水に懸濁し、通常の病原体検査で異常の無 いミニブタ (MBS系）に点鼻投与して、ワクチンに対する特異抗体 (IgA、 IgG)の産生 量を測定した。
[0058] 投与は初回投与の 4週後に初回と同様の方法でブースター投与を行い、その後 2 週間後に測定を終了した。抗原量は、 0.3 μ g/Kgゝ 1.5 μ g/Kgゝ 4.5 μ g/Kgゝ 15 μ g/ Kg、 30 g/Kgの 5群について行った。抗体価の測定は、局所の粘膜免疫系を評価 するために鼻腔粘液と、全身免疫系を評価するために血液中の抗体産生量を測定 した。
[0059] その結果、スプリットインフルエンザ抗原単独を 0.3-30 μ g/Kg体重経鼻投与しても ワクチン投与前の鼻腔粘液と血液中の IgA、 IgG値をほとんど変えないか、僅かに増 加させても有効な感染防御抗体濃度 (抗原特異的 IgG、 IgAで 40抗体価以上)にまで 増加することは無かった。このスプリットインフルエンザ抗原に、アジュバントとしてそ の重量比の 10倍量の ADビークル STをカ卩え、両者を結合させた懸濁液を経鼻投与す ると、鼻腔粘液では特に IgA特異抗体が、血液中では特に IgG特異抗体が、投与した 抗原量 (0.3- 30 mg/Kg)に依存して著明に誘導された。特に抗原量 §〜30 g/K g体重では投与した抗原量に依存して 200〜800抗体価にまで抗原特異抗体は誘導 され、 ADビークル STの極めて効果的なアジュバント効果が証明された。なお、ここで 規定するワクチン特異抗体の IgA抗体価、 IgG抗体価とは、ワクチン投与前の鼻腔粘 液や血液がワクチン抗原と反応して示す測定値の平均を基準として、検体を何倍希 釈したらワクチン投与前の値になる力を測定し、その希釈値を持って抗原特異的 IgA 、 IgG抗体価とした。
[0060] 鼻腔粘液中の抗体産生においては、 IgA抗体価が IgG抗体価の 5— 8倍高く IgAが 優位に産生されていた。なお抗原量に依存した IgA抗体価、 IgG抗体価の増加傾向 には大きな差は見られな力つた。鼻腔粘液中の両抗体の産生は、初回投与では軽 度で、ブースター投与で著明な増加を示した。但し、鼻腔粘液中の IgGにおいては、 スプリットインフルエンザ抗原単独でもブースター投与後に低いながらも約 10倍の増 加を見た。
[0061] 一方、血液中の抗体産生においては、 IgG抗体価が IgA抗体価の 1-1.6倍高ぐ血 液においては、 IgGが優位に誘導されていた。し力も初回免疫でいずれの抗体も 100 -200抗体価にまで増加を示し、ブースター投与でその抗体価は IgG、 IgAで共にさら に 4倍に増加した。スプリットインフルエンザ抗原単独では、血液中の IgGにおいても 、ブースター投与後に低いながらも約 10倍の増加を見た。
[0062] なお、 、ずれの検体にぉ 、ても、鼻腔の炎症反応として炎症性細胞の浸潤は観察 されなかった。
産業上の利用可能性
[0063] この発明に係る「ADビークル」は、任意のワクチン用抗原、トキソイド、アレルゲン、 薬剤等の経粘膜、経皮等による安全な投与あるいは接種を可能にする。そして、 AD ビークル量 (V)とそれに乗せる物質、例えば、抗原量 (A)との間の重量比 V/Aを調 整することにより、「ADビークル」の抗体産生誘導機能を調節できる。即ち、「ADビー クル」は、 V/Aが約 1以下では IgA産生を優先的かつ選択的に誘導し、 V/Aが 1を超え るよう調整すると IgA及び IgG両産生を誘導する。但し、比較的多量のワクチン抗原（1 5 mg/Kg 以上）を経鼻接種する場合は、 V/A量比にかかわらず粘膜免疫の IgAと全 身免疫の IgGは共に誘導される。従って、 ADビークルは、経鼻'粘膜ワクチン、アレル ギ一の治療剤 ·予防剤等の有効成分の乗り物ある 、はデリバリーや輸送の手段とし て広く有用であり、ワクチンやアレルギー治療等に係る医薬品'獣医薬'水産薬等の 産業分野で活用 ·利用できる。

Claims

請求の範囲
[1] 肺サーファタタントプロテイン B、その断片及びこれ等の機能構造に模倣の合成ぺプ チド (A群)から選ばれる少なくとも 1種のタンパク質、及び Z又は肺サーファタタント プロテインおその断片及びこれ等の機能構造に模倣の合成ペプチド (B群)力ゝら選 ばれる少なくとも 1種のタンパク質、並びに脂質類 (C群)力 選ばれる少なくとも 1種 の脂質カゝらなる複合体である抗原薬物 (AD)ビークルに、粘膜免疫 IgAを誘導する量 の抗原を共存、接触、捕捉又は吸着させることにより得られる粘膜ワクチンにおいて、 上記ビークルの乾燥質量 (V)と上記抗原の乾燥質量 (A)との重量比 V/Aが約 1を超 えるよう調整されていることを特徴とする、 IgAと IgGの両抗体の産生を誘導する粘膜ヮ クチン。
[2] 請求項 1に記載のビークル量 (V)と抗原量 (A)との重量比 V/Aが約 1以下になるよう 調整されていることを特徴とする、 IgA抗体産生を選択的に誘導する粘膜ワクチン。
[3] 請求項 1に記載の A群力 配列番号 2、 7、 8、 10〜19、 21〜24、 26、及び 30に記 載の各アミノ酸配列のタンパク質力もなる請求項 1又は 2に記載の粘膜ワクチン。
[4] 請求項 1に記載の B群力 配列番号 4、 6、 9、 20、 25、及び 27〜30に記載の各アミ ノ酸配列のタンパク質力もなる請求項 1、 2又は 3に記載の粘膜ワクチン。
[5] 請求項 1に記載の C群力 ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、 ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホス ファチジルエタノールァミン、ホスファチジン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン 酸、ステアリン酸、及びォレイン酸の各脂質力 なる請求項 1〜4のいずれかに記載 の粘膜ワクチン。
[6] 前記の抗原 (A)が伝染病病原体に由来の不活化抗原又は無毒化毒素である請求 項 1又は 2に記載の粘膜ワクチン。
[7] 前記の抗原 (A)がアレルゲン、アレルゲンェピトープ、又はアレルゲン由来抗原であ るアレルギーの予防剤又は治療剤。
[8] 請求項 1に記載のビークル量 (V)と抗原量 (A)との重量比 V/Aが約 1であることを、 Ig
A抗体の選択的産生と IgAと IgG両抗体産生との間の変換スィッチとして用いることを 特徴とする粘膜免疫誘導方法。
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