WO2007013352A1

WO2007013352A1 - Hla-a24分子結合性副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチドを含有する医薬組成物

Info

Publication number: WO2007013352A1
Application number: PCT/JP2006/314412
Authority: WO
Inventors: Kyogo Itoh; Mamoru Harada
Original assignee: Kurume University
Priority date: 2005-07-29
Filing date: 2006-07-20
Publication date: 2007-02-01
Also published as: JP2008260689A

Abstract

　本発明は、HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性T細胞に認識されうる副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチドを含む、癌（但し前立腺癌を除く）を処置または予防するための医薬組成物を提供する。

Description

明細書

HLA-A24分子結合性副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチドを含有する医薬組成物

技術分野

[0001] 本発明は、 HLA-A24分子結合性副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチドを含有する、癌、特に胃癌、腎癌、大腸癌または子宮頸癌を処置または予防するための医薬組成物に関する。

背景技術

[0002] 初期段階の癌患者の多くにとって外科的切除と化学療法は有効な治療方法である。し力しながら現在利用可能な治療方法は、再発時や進行期の癌にはそれほど有効ではない。遠隔転移を有する癌患者の予後は非常に悪ぐそのような患者のための新、治療方法の提供が急務である。現在検討されてヽる方法の 1つが特異的免疫療法であり、なかでもペプチド基盤ワクチンは、癌に対する全身性免疫のための簡便かつ魅力的な方法を提供すると考えられる。

[0003] 副甲状腺ホルモン関連蛋白（PTH-rP)は、副甲状腺ホルモン（PTH)と構造的に類似することからそのように名付けられた（非特許文献 1)。 PTH-rPは、悪性高カルシゥム血症に関与すると考えられている（非特許文献 2)。さらに PTH-rPは、初期前立腺癌の 90%に発現し、かつ骨転移の発症に重要な分子であることが知られている（非特許文献 3、 4)。それゆえこの分子は、骨転移を有する癌患者に対する免疫療法的治療において有望な標的分子と考えられている (非特許文献 3)。本発明者らは、 HL A-A24または HLA-A2分子陽性前立腺癌患者に対するペプチド基盤免疫療法に利用可能な PTH-rP由来ペプチドを同定している（特許文献 1、非特許文献 5、 6)。

[0004] 特許文献 1：国際公開第 2005Z116056号パンフレット

非特許文献 1 : Kemp, B.E., Moseley, J. M., Rodda, C. P., et al., Parathyroid hormon e- related protein of malignancy: active synthetic fragments. Science 1987; 238(4833 ): 1568-70.

非特許文献 2 : Guise, T.A., Parathyroid hormone-related protein and bone metastas es. Cancer 1997; 80(8 Suppl): 1572—80.

非特許文献 3 : Francini, G., Scardino, A., Kosmatopoulos, K., et al., High-affinity H LA- A(*)02.01 peptides from parathyroid hormone-related protein generate in vitro and in vivo antitumor CTL response without autoimmune side effects. J Immunol 200 2; 169(9): 4840-9.

非特許文献 4 : Deftos, L.J., Barken, I., Burton, D. W.， R.M. Hoffman, and J. Geller, Direct evidence that PTHrP expression promotes prostate cancer progression in bo ne. Biochem Biophys Res Commun 2005; 327(2): 468—72.

非特許文献 5 :Yao, A., Harada, M., Matsueda, S., et al., Identification of parathyroi d hormone-related protein-derived peptides immunogenic in human histocompatibilit y leukocyte antigen- A24+ prostate cancer patients. Br J Cancer 2004; 91(2): 287-9 6.

非特許文献 6 :Yao, A., Harada, M., Matsueda, S., et al., New epitope peptides deriv ed from parathyroid hormone-related protein which have the capacity to induce pros tate cancer-reactive cytotoxic T lymphocytes in HLA— A2+ prostate cancer patients . Prostate 2005; 62(3): 233—42.

非特許文献 7 : Hida, N., Maeda, Y., Katagiri, K., et al" A new culture protocol to d etect peptide— specific cytotoxic T lymphocyte precursors in the circulation. Cancar Immunol Immunother 2002; 51: 219 - 28.

[0005] 上記各文献の内容は、引用により本明細書の一部を構成する。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 本発明は、前立腺癌だけでなく各種の癌タイプの患者に対するペプチド基盤免疫療法に利用可能な、 PTH-rP由来ペプチドを含有する医薬組成物を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0007] 本発明は、 HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチド、特に配列番号 1または 2に示すアミノ酸配列力なるペプチドを含む、癌 (但し前立腺癌を除く）を処置または予防するための医薬組成物を提供する。

[0008] また、本発明は、副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチドの誘導体を含む、癌 (伹し前立腺癌を除く）を処置または予防するための医薬組成物であって、該誘導体が配列番号 1または 2に示すアミノ酸配列において 1または 2個のアミノ酸の置換、欠失および Zまたは付加が導入されたアミノ酸配列からなり、かつ HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる医薬組成物を提供する。

[0009] また、本発明は、 HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチドを発現するベクターを含む、癌 (但し前立腺癌を除く）を処置または予防するための医薬組成物を提供する。

[0010] また、本発明は、 HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチド、特に配列番号 1または 2に示すアミノ酸配列からなるペプチドの、癌 (但し前立腺癌を除く）を処置または予防するための医薬組成物の製造のための使用を提供する。さらに、本発明は、 HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチド、特に配列番号 1または 2に示すアミノ酸配列力なるペプチドを患者に投与することを含む、癌 (但し前立腺癌を除く）を処置または予防する方法を提供する。

[0011] また、本発明は、 HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチドと、 HLA-A24分子陽性癌患者 (但し前立腺癌患者を除く）より採取された末梢血単核細胞とを接触させることを含む、癌反応性細胞傷害性 T細胞を誘導する方法、および該方法を実施するためのキットを提供する。

[0012] また、本発明は、 HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチドを、 HLA-A24分子陽性癌患者 (但し前立腺癌患者を除く）に由来する抗原提示能を有する細胞に取り込ませること、または該ぺプチドを発現するベクターを導入することを含む、癌反応性細胞傷害性 T細胞を誘導可能な抗原提示細胞を調製する方法、および該方法を実施するためのキットを提供する。

発明の効果 [0013] 本発明により、 PTH-rP由来ペプチドを用いる各種癌タイプの HLA-A24分子陽性癌患者の特異的免疫療法が可能となった。 HLA-A24アレルは日本人の 60%、コ一力サス人の 20%およびアフリカ人の 12%に見られることから、本発明は、多数の癌患者における癌の処置または予防に有用である。

図面の簡単な説明

[0014] [図 1]図 1は、各種癌細胞株における PTH-rP mRNAの発現を示す。（a)胃癌、（b)子宫頸癌、（c)肺癌、（d)乳癌、（e)腎癌および (£)大腸癌細胞株が示される。 PC (陽性対照）は LNCaP (前立腺癌細胞株)、 NC (陰性対照）は健常人由来 PBMCである。ほとんどの癌細胞株にぉ、て PTH-rP mRNAが発現して!/、ることがわかった。

[図 2A]図 2Aは、各種癌細胞株における PTH-rPタンパク質の細胞内分布を示す。 (a) SKG-I (子宮頸癌)、 (b)QG56 (肺癌)、 (c)R-27 (乳癌)および (d)MAMIYA (腎癌）細胞について示す。白破線で囲まれた部分が細胞の核を表し、その周囲の白抜き部分が抗 PTHrP抗体で染色された部分を表す。 PTH-rPタンパク質は、細胞質に点状に分布していることがわかった。

[図 2B]図 2Bは、各種癌細胞株の細胞内 PTH-rPタンパク質発現をフローサイトメトリ一解析によって調べた結果を示す。 (a)MKN-45 (胃癌)、（b)SKG- 1 (子宮頸癌）、 (c)Q G56 (肺癌）、 (d)R-27 (乳癌）、 (e)KUR-ll (腎癌）、 (DMAMIYA (腎癌)、および (g)CO LO201 (大腸癌）細胞について示す。

[図 3]図 3は、各種癌タイプの癌患者由来 PBMCからの癌反応性 CTLの誘導を示す。グラフ中、黒丸は PTH- rP陽性/ HLA- A24分子陽性標的細胞を、白丸は PTH- rP陽性 /HLA-A24陰性標的細胞を示す。癌患者 PBMC由来の CD8陽性 T細胞は、 PTH-rP 陽性/ HLA-A24分子陽性癌細胞に対して高いレベルの細胞傷害活性を示した。

[図 4A]図 4Aは、 PTH-rP陽性/ HLA-A24分子陽性癌細胞に対する CD8陽性 T細胞依存的細胞傷害活性を示す。 PTH-rP陽性/ HLA-A24分子陽性癌細胞に対する細胞傷害活性は、抗 HLAクラス Iモノクローナル抗体 (mAb)によって有意に抑制された 1S 抗 HLAクラス II mAbまたは抗 CD14 mAbによっては抑制されなかった。

[図 4B]図 4Bは、 PTH-rP陽性/ HLA-A24分子陽性癌細胞に対する PTH-rPペプチド特異的細胞傷害活性を示すグラフである。 PTH-rP陽性/ HLA-A24分子陽性癌細胞に対する細胞傷害活性は、対応 PTH-rPペプチドをパルスした C1R-A24細胞により有意に抑制された力 HIVペプチドをパルスした C1R-A24細胞によっては抑制されなかった。

発明を実施するための最良の形態

[0015] 本発明において「副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチド」、「PTH-rP由来ぺプチド」または「PTH-rPペプチド」とは、副甲状腺ホルモン関連蛋白 (PTH-rP)のアミノ酸配列の一部からなるペプチドを意味する。本発明にお、て用いられる PTH-rP由来べプチドは、 HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうるペプチドである。

[0016] 「HLA-A24分子に結合できる」とは、 PTH-rP由来ペプチドが HLA-A24分子と複合体を形成し細胞表面に提示されうることを意味する。一般に HLA分子に結合するぺプチドのアミノ酸配列には HLAの型に依存する規則性があり、その規則性にしたがうアミノ酸配列を結合モチーフと呼ぶ。 HLA-A24分子に対する結合モチーフとは、 N末端から第 2番目のアミノ酸がチロシンまたはフエ-ルァラニンであり、 C末端アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、またはフエ-ルァラニンである配列をいう。 HLA-A24分子結合モチーフを有するペプチドの HLA-A24分子に対する結合は、 Bioinformatics and Molecular Analysis Section (NIH, Bethesda, MD)等のコンピューター解析により決定することができる（Parker KC, et al.， J. Immunol, 152: 163-175, 1994)。

[0017] 「細胞傷害性 T細胞 (CTL)に認識されうる」とは、 PTH-rP由来ペプチドがペプチド特異的 CTLを誘導する能力を有することを意味する。ペプチド特異的 CTL誘導能は、例えば、末梢血単核細胞（PBMC)を PTH-rP由来ペプチドで刺激し、そのペプチド刺激 PBMCが対応ペプチドをパルスした抗原提示細胞に反応してサイト力イン (例えば IFN- γ )を産生するかを ELISA法等により測定して調べることができる。また、 ⁵¹Cr 放出測定法等により、誘導された CTLの細胞傷害活性を確認することができる。 CTL による認識性を考慮すると、 PTH-rP由来ペプチドのアミノ酸残基数は 8〜14個の範囲内であることが好ましぐより好ましくは 8〜： L 1個、特に好ましくは 9または 10個である。

[0018] 本発明に特に好適に使用される PTH-rP由来ペプチドは、配列番号 1 (RYLTQETN KV、 PTH-rP 102-111ペプチド）および配列番号 2 (KVETYKEQPL、 PTH- rP 110-1 19ペプチド）に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。

[0019] 本発明において、 PTH-rP由来ペプチドの誘導体とは、 PTH-rP由来ペプチドのアミノ酸配列において 1または 2個のアミノ酸の置換、欠失および Zまたは付加が導入されたアミノ酸配列からなり、かつ HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうるペプチドを意味する。誘導体が所望の性質を有するか否かは、前述の方法により調べることができる。

[0020] アミノ酸の置換は、ペプチドの性質を変化させな、観点から、同族アミノ酸 (極性ァミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電ァミノおよび芳香族アミノ酸等）の間で行うことが好ましい。アミノ酸の欠失および付加は、誘導体のアミノ酸残基数が 8〜： L 1個となるように行うことが好ま、。

[0021] また、アミノ酸の置換、欠失および Zまたは付加は、 HLA分子結合モチーフ上許容されるものが好ましい。すなわち、アミノ酸の置換、欠失および Zまたは付加は、誘導体のアミノ酸配列の N末端から第 2番目のアミノ酸がチロシンまたはフエ-ルァラニンであり、 C末端アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、またはフエ-ルァラニンとなるように行うことが好ましい。

[0022] 本発明に特に好適な誘導体は、配列番号 1のアミノ酸配列の N末端から第 2番目のアミノ酸をフエ-ルァラニンで置換し、および/または C末端アミノ酸をイソロイシン、口イシン、またはフエ-ルァラニンで置換したアミノ酸配列からなる誘導体、および配列番号 2のアミノ酸配列の N末端から第 2番目のアミノ酸をチロシンまたはフエ二ルァラニンで置換し、および/または C末端アミノ酸をイソロイシンまたはフエ-ルァラニンで置換したアミノ酸配列力なる誘導体である。

[0023] PTH-rP由来ペプチドおよびその誘導体を構成するアミノ酸は、天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログであってよぐアミノ酸アナログとしては、アミノ酸の N-ァシルイ匕物、 0-ァシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等が挙げられる。 PTH-r P由来ペプチドおよびその誘導体は、機能を著しく損なわない限りにおいてその構成アミノ酸またはカルボキシル基などが修飾されていてもよい。修飾は、 N末端や遊離のァミノ基にホルミル基、ァセチル基、 t-ブトキシカルボ二ル基等を結合するものや、 C末端や遊離のカルボキシル基にメチル基、ェチル基、 t-ブチル基、ベンジル基等を結合するものが挙げられる。

[0024] PTH-rP由来ペプチドおよびその誘導体は、通常のペプチド合成により製造することができる。そのような方法として、例えば、 Peptide Synthesis, Interscience, New Yor k, 1966 ; The Proteins, Vol2, Academic Press Inc., New York, 1976 ;ペプチド合成、丸善 (株)、 1975 ;ペプチド合成の基礎と実験、丸善 (株)、 1985 ;医薬品の開発続第十四卷 'ペプチド合成、広川書店、 1991)などに記載されている方法が挙げられる。

[0025] 本発明は、 PTH-rP由来ペプチドまたはその誘導体のアミノ酸配列を含み、細胞内で断片化されて前記ペプチドまたは誘導体を HLA分子との複合体として提供することができるポリペプチドを使用することも包含する。 PTH-rP由来ペプチドまたはその誘導体を提供できる限り、ポリペプチドのアミノ酸残基数およびアミノ酸配列は任意である。

[0026] 本発明の医薬組成物は、 1種類の PTH-rP由来ペプチドまたはその誘導体を含むものであってもよく、 2種類以上の PTH-rP由来ペプチドまたはその誘導体を含んでも良い。また、本明細書に開示される PTH-rP由来ペプチドおよび Zまたは誘導体を、他の癌抗原ペプチドと組み合わせて含んでも良、。癌患者の CTLは相異なる癌抗原ペプチドを認識する細胞の集合なので、複数種類の癌抗原ペプチドまたはその誘導体を組み合わせて使用するとさらに効果的である。

[0027] 本発明の医薬組成物は、 PTH-rP由来ペプチドまたはその誘導体に加えて、医薬上許容される担体などを含むことができる。担体としては、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が使用できる。本発明の医薬組成物は、リボソーム製剤、直径数 mのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤であってもよい。また、免疫応答が効果的に成立するように、従来力ワクチン投与に用いられることが知られているアジュバントとともに投与することもできる。投与方法は、例えば皮内投与または皮下投与である。

[0028] 本発明の医薬組成物は、癌ワクチンとして使用可能である。投与量は、疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により適宜調整されうるが、通常医薬組成物中のぺプチドの量として 0. OOOlmg〜： L000mg、好ましくは 0. OOOlmg〜： L00mg、より好ましくは 0. OOlmg〜： LOmg、 0. 01〜： LOmg、 0. l〜5mgまたは 0. 5〜3mgである。これを数日、数週または数ケ月に 1回、 1〜3年間継続して投与することが好ましい。

[0029] 本発明の医薬組成物は、 PTH-rP発現癌細胞を特異的に傷害する CTLを効率的に増殖させ、癌を処置または予防することができる。本発明の医薬組成物は、癌が、胃癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、肺癌および乳癌からなる群、特に胃癌、腎癌、大腸癌および子宮頸癌からなる群より選択される場合に好適である。

[0030] PTH-rPは、骨芽細胞の受容体に結合して骨の形成と再吸収を刺激する因子である。癌細胞が産生した PTH-rPは、癌に伴う高カルシウム血症や転移性骨病変に関与すると考えられている。それゆえ、 PTH-rP発現癌細胞を特異的に傷害する CTLを増殖させうる本発明の医薬組成物は、骨転移を伴う癌に特に有用である。また、本発明の医薬組成物は、 PTH-rP発現癌細胞の傷害を促進することから、骨転移の予防にも有効である。

[0031] 本発明の医薬組成物は、癌の転移性骨病変を処置または予防するためにも用いることができる。「転移性骨病変」とは、癌細胞の骨への転移により骨に生じる破壊的または増殖的変化を意味する。本発明の医薬組成物は、 PTH-rP発現癌細胞の傷害を促進することにより、癌細胞の骨への転移を予防し、転移性骨病変の形成および進行を抑制する。

[0032] 本発明はまた、 HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる PTH- rP由来ペプチドまたはその誘導体を発現するベクターを含む、癌を処置または予防するための医薬組成物を提供する。前記ベクターが抗原提示細胞内で発現すると、 HLA-A24拘束性に特異的 CTLを誘導可能な PTH-rP由来ペプチドまたは誘導体が HLA-A24分子と複合体を形成して細胞表面に提示される。この抗原提示細胞は、 P TH-rP発現癌細胞を傷害する CTLを効率的に増殖させることができる。当該医薬組成物は、癌の転移性骨病変を処置または予防するために使用することもできる。当該医薬組成物は、胃癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、肺癌および乳癌からなる群、特に胃癌、腎癌、大腸癌および子宮頸癌力なる群より選択される癌に好適に用いられる。発現される PTH-rP由来ペプチドは、配列番号 1または 2に示すアミノ酸配列力なることが好ましい。 [0033] ベクターとしては、各種プラスミドおよびウィルスベクター、例えばアデノウイルス、ァデノ関連ウィルス、レトロウイルス、ワクシニアウィルス等が挙げられる（Liu M, Acres B, Balloul JM, Bizouarne N, Paul b, bios P, Squiban P. ene— based vaccines and imm unotherapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A 101 Suppl, 14567—71, 2004)。ベクターの調製方法は当業界にて周知である（Molecular Cloning: A laboraroy manual, 2nd e dn. New York, Cold Spring Harbor Laboratory)。

[0034] 本発明のベクター含有医薬組成物は、患者体内の抗原提示細胞において PTH-rP 由来ペプチドまたはその誘導体を発現させるため患者に投与することができる。あるいは、前記医薬組成物を用いて、患者体外において例えば患者由来の榭状細胞に前記ペプチドまたは誘導体を発現させ、その細胞を患者に戻しても良い。これらの方法は当業界において周知である（Hrouda D, Dalgleish AG. Gene therapy for prostat e cancer. Gene Ther 3: 845-52, 1996)。

[0035] 本発明のベクター含有医薬組成物の投与量は、疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により変化する力 DNA量として 0.1 μ g〜100mg、好ましくは 1 μ g〜50mgである。投与方法には、静脈注射、皮下投与、皮内投与等が挙げられる。

[0036] 本発明の CTL誘導方法は、 PTH-rPを発現する HLA-A24分子陽性癌細胞を特異的に傷害する CTLを提供するものである。本発明において「癌反応性」とは、癌細胞上の PTH-rP由来ペプチドと HLA-A24分子との複合体を認識し、その細胞を傷害しうる性質を有することを意味する。好ましい態様として、癌は、胃癌、腎癌、大腸癌、子宫頸癌、肺癌および乳癌からなる群、特に胃癌、腎癌、大腸癌および子宮頸癌からなる群より選択される。 CTLの誘導は、例えば、 HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる PTH-rP由来ペプチドの存在下、 in vitroで HLA-A24分子陽性癌患者力も採取された PBMCを培養することにより行う。本方法は、 PBMCを採取した患者体内に誘導した CTLを戻して癌細胞を傷害する養子免疫療法に有用である。

[0037] 本発明の CTL誘導キットは、前記 CTL誘導方法を実施するために用いられる。本発明のキットは、 HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる PTH-rP 由来ペプチドまたはその誘導体を 1または 2種類以上含み、さらに適当な緩衝液や培地などを含んでもよい。 [0038] 本発明の抗原提示細胞調製方法は、 PTH-rPを発現する HLA-A24分子陽性癌細胞を傷害する CTLを誘導するための抗原提示細胞を提供するものである。本方法は、癌が胃癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、肺癌および乳癌からなる群、特に胃癌、腎癌、大腸癌および子宮頸癌からなる群より選択される場合に好適である。抗原提示細胞の調製は、例えば、 HLA-A24分子陽性癌患者由来の抗原提示能を有する細胞を、 HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる PTH-rP由来ペプチドとともに培養し、そのペプチドを細胞表面の HLA-A24分子に結合および提示させることにより行う。あるいはそのようなペプチドを発現可能なベクターを、 HLA-A24分子陽性癌患者由来の抗原提示能を有する細胞に導入し発現させてもよい。 PTH-rP由来ペプチドは、配列番号 1または 2に示すアミノ酸配列からなるものが好適である。抗原提示能を有する細胞は例えば榭状細胞であり、患者より採取した PBMCから培養プレート接着細胞を分離し、その細胞を IL-4および GM-CSFの存在下で約 1週間培養すること〖こより得ることができる。本発明の方法により調製された抗原提示細胞は、その細胞表面に提示するペプチドまたは誘導体と HLA分子との複合体を特異的に認識する CTLを誘導することができるので、患者に投与すると患者体内で PTH-rPを発現する HLA-A24分子陽性癌細胞を傷害する CTLの誘導を促進することができる。

[0039] 本発明の抗原提示細胞調製キットは、前記抗原提示細胞調製方法を行うために用いられる。本発明のキットは、 HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる PTH-rP由来ペプチドまたはその誘導体を 1または 2種類以上含み、さらに適当な緩衝液や培地などを含むこともできる。

[0040] 本発明はさらに、 HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる PTH -rP由来ペプチドまたはその誘導体の、癌 (但し前立腺癌を除く）を処置または予防するための医薬組成物の製造ための使用を提供する。また、本発明は、 HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる PTH-rP由来ペプチドまたはその誘導体を患者に投与することを含む、癌 (但し前立腺癌を除く）を処置または予防する方法を提供する。

[0041] 本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する力本発明はいかなる意味にお!ヽてもこれら実施例により制限されるものではな!/、。実施例

[0042] I.材料と方法

細胞株

MKN-7, MKN- 28および MKN- 45 (胃腺癌)； RERF- LC- AIおよび QG56 (月巿扁平上皮癌)； 11-18、 1-87、 LK87および LC- 1 (肺腺癌)； R- 27および CRL1500 (乳癌)； KUR -11、 RC30- 14、 Caki- 1、 MAMIYAおよび VMRC- RCW (腎細胞癌);および COLO201 、 COLO205, COLO320および SW480 (大腸腺癌)細胞は、 10% FCS含有 RPMI- 164 0にて培養した。 MDA- MB- 231 (乳癌)； HCT116 (大腸腺癌)； SKG- 1、 SKG- II、 OMC -1および SKG-IIIb (子宮頸部扁平上皮癌)； SKG-IIIaおよび OMC-4 (子宮頸部腺癌 );および OMC-3 (卵巣癌)細胞は、 10% FCS含有 DMEMにて培養した。 KWS (胃腺癌 ), MCF-7および YMB-1-E (乳癌)および SW620 (大腸腺癌)細胞は、 10% FCS含有 E MEMにて、 37°C、 5% CO加湿環境下で培養した。

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[0043] RT-PCR

RNAzol (商標） B (Tel-Test Inc., Friendswood, TX, USA)を用いて、癌細胞株からトータル RNA (Total RNA)を単離した。 Superscript (商標） Preamplification System fo r First Strand cDNA Synthesis (Invitrogen)を用いて cDNAを調製し、それを PTH- rP については 5，-1^丁1^^丁1^^じじ 1^丁〇 1^〇-3，（センス、配列番号 3)および 5 ，- TGTCCTTGGAAGGTCTCTGC- 3，（アンチセンス、配列番号 4)を、 β -ァクチンについては 5，-011^〇じ〇〇〇じ〇じ〇丁〇じ-3，（センス、配列番号 5)および 5，- CGT ACATGGCTGGGGTGTTG-3' (アンチセンス、配列番号 6)をプライマーとして用いて増幅した。 Taq DNAポリメラーゼを使用し、 DNAサーマルサイクラ一 (iCycler, Bio-Ra d Laboratories, Hercules, CA, USA)で、 95°C1分、 60°C1分、 72°C1分、 30サイクル、の PCRを行った。 PCR産物は、 2%ァガロースゲルにおける電気泳動により分離した。 β -ァクチン mRNAについての RT-PCRは、解析に使用した RNAの質を評価するために行った。

[0044] 免疫蛍光顕微鏡解析

35- mm培養ディッシュ上の細胞を TBS (10 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl)ですすぎ、 3.7 %ホルムアルデヒドを室温で 5分間処置して固定し、 TBSで洗浄し、その後 3% BSAを 15分間処置してブロックした。マウス抗 PTH-rPモノクローナル抗体 (mAb) (1:10 0希釈， Ab-1; Oncogene Research Products)を室温で 1時間処置して細胞を染色した。 TBSで洗浄した後、フルォレセインイソチオシァネート (FITC)結合抗マウスィムノグロブリン G (IgG) (1:200希釈； Molecular Probes)で細胞を染色し、ョードプロビジゥム (PI)で対比染色した。染色細胞に 1, 4-ジァザビシクロ- [2, 2, 2]-オクタン/グリセロールをのせ、共焦点レーザー走査顕微鏡 (Fluoview; Olympus)により観察した。

[0045] フローサイトメトリー解析

PTH-rPタンパク質の発現を調べるため、トリプシン処理して細胞を回収し、 10% FC S-RPMIで再懸濁し、次いで 3%ホルムアルデヒド中で固定した。固定後、細胞を PBS で 3回洗浄し、 2.5 /z g/mlのゥサギポリクローナル抗 PTH-rP抗体 (1:75希釈， H-137; S anta Cruz, CA, USA)と室温で 1時間インキュベートした。ゥサギ免疫前血清を対照として使用した。 PBSで洗浄した後、 FITC結合抗ゥサギ IgG (1:150希釈； Molecular Pro bes)を室温で 1時間処置して細胞を染色した。フローサイトメトリーは EPICSフローサイトメーター（Beckman Coulter, Tokyo, Japan)〖こより行い、データは EXP032解析ソフトウェア (Beckman Coulter)により解析した。

[0046] 患者由来 PBMCの調製

本試験開始前に試験に参加した 18人の癌患者から書面による同意を得た。これら患者はいずれもヒト免疫不全ウィルス（HIV)には感染していな力つた。各被験者から末梢血 20mlを採取し、 FicoU- Conray密度勾配遠心法により PBMCを調製した。癌患者および健常人の PBMC上の HLA-A24分子の発現はフローサイトメトリーにより測定した。

[0047] ペプチド

ペプチドは全て純度 90%を超えるものであり、 Biologica Co. (名古屋)より購入した。 HLA- A24結合モチーフを有する、 PTH- rP由来ペプチド (PTH- rP 102-111: RYLTQ ETNKV (配列番号 1)および PTH- rP 110-119: KVETYKEQPL (配列番号 2) )、インフルェンザ (Flu)ウィルス由来ペプチド (RFYIQMCYEL (配列番号 7)、 EBV由来ぺプチド (TYGPVFMCL (配列番号 8) )および HIV由来ペプチド（HIVペプチドとも!/、う） (RYLR QQLLGI (配列番号 9))を使用した。ペプチドは全て DMSOにて用量 10 mg/mlに溶解した

[0048] PBMC中のペプチド反応性 CTLの検出

PBMC中のペプチド反応性 CTLの検出は、既報の方法に従い行った (非特許文献 7)。説明すると、 U底 96ウェルマイク口カルチャープレート (Nunc, Roskilde, Denmark) にて培養培地 200 μ 1の容量で PBMC (1 X 10⁵細胞/ゥエル)を各ペプチド 10 μ g/mlとともにインキュベートした。培養培地は、 45 % RPMI-1640, 45 % AIM-V培地 (Gibco B RL)、 10 % FCS、 100 U/mlインターロイキン (IL)- 2および 0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液 (Gibco, BRL)より構成された。 3日毎に培養培地の半分を除去し、対応ぺプチド (20 μ g/ml)を含有する新しい培地と置き換えた。培養 15日目に培養細胞を 4ゥェルに分け、そのうち 2ゥエルは PTH- rPペプチドをパルスした C1R- A24細胞（Dr. M. Ta kiguchi, Kumamoto University, Japan)に対して、他の 2ゥエルは HIV由来ペプチドをパルスした C1R-A24細胞に対して使用した。 18時間インキュベートした後、上清を回収し、 IFN- γのレベルを ELISAにより測定した。

[0049] 細胞傷害性試験

細胞傷害性試験を行うのに充分な数の細胞を得るため、 PTH-rPペプチドで in vitro 刺激をした PBMCを、丸底 96ゥエルプレートにて 100 U/ml IL-2とともにさらに約 10日間培養した。細胞傷害性試験の直前に、 CD8 Positive Isolation Kit (Dynal, Oslo, N orway)を用いて CD8陽性 T細胞を単離した。そして、 6時間⁵¹ Cr放出試験により、精製 CD8陽性 T細胞を腫瘍細胞に対する細胞傷害活性につヽて試験した。 96丸底ゥエルプレートにおいて、各ゥエルにつき 2000個の⁵¹ Cr-標識細胞を各種エフェクター細胞 Z標的細胞の比率で培養した。抗体による阻害実験では、試験開始時に抗 HLAクラス I mAb (W6/32:マウス IgG2a) (BioLegend, C amino Santa Fe, SanDiego, CA, USA) 、抗 HLAクラス II (HLA-DR) mAb (L243:マウス IgG2a) (熊本大学西村泰治先生より供与)、または抗 CD14 mAb (H14:マウス IgG2a) (久留米大学免疫学講座にて榭立）を 20 g/mlの用量にて添カ卩した。

[0050] コールド標的細胞阻害試験

PTH-rPペプチド反応性 CTLの特異性は、コールド標的細胞阻害試験により確認した。説明すると、丸底 96ゥエルプレートにおいて、 ⁵¹Cr-標識標的細胞 (2 X 10³細胞/ ゥエル)と CTL (4 X 10⁴細胞/ゥエル)とを、 2 X 10⁴細胞のコールド標的細胞とともに培養した。 HIVペプチドまたは対応 PTH-rPペプチドの!/、ずれかを前もってパルスした C1R-A24細胞をコールド標的細胞として使用した。 ⁵¹Cr-標識標的細胞には、癌タイプを合わせた癌細胞株を使用した。

[0051] 統計

データの統計学的有意差は両側スチューデント t検定により検討した。 0.05未満の P値（ * )を統計学的に有意であると判断した。

[0052] II.結果

1.各種癌細胞株における PTH-rPの発現

はじめに、胃癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、肺癌および乳癌細胞株における PTH-r Pの mRNA発現レベルを半定量的 RT-PCR解析により調べた（図 1)。細胞株によって発現レベルは異なるものの、試験したほとんどの癌細胞株において PTH-rP mRNAが発現していることがわ力つた。いくつかの細胞株においては、陽性対照（PC)として使用した前立腺癌細胞株である LNCaPよりも発現が高力つた。

[0053] 次に、 PTH-rPタンパク質の発現を確認するため免疫細胞化学的解析を行った（図 2A)。 PTH-rPは、 SKG-I (子宮頸部扁平上皮癌)（図 2A— a)、 QG56 (肺扁平上皮癌 ) (図 2A— b)および MAMIYA (腎細胞癌)（図 2A— d)細胞にぉヽては細胞質全体に点状に発現していた。一方、 RT-PCR解析で PTH-rP mRNAの発現が弱かった R-27 ( 乳癌)細胞（図 1 d)にお、ては発現レベルが非常に低力つた（図 2A— c)。

[0054] さらに、細胞内染色のフローサイトメトリー解析によって PTH-rPタンパク質の発現を調べた（図 2B)。 PTH- rPタンパク質の発現は、 MKN- 45 (胃腺癌）（図 2B— a)、 SKG- 1 (子宮頸部扁平上皮癌)（図 2B— b)、 QG56 (肺扁平上皮癌)（図 2B— c)、および KU R-11並びに MAMIYA (腎細胞癌）（図 2B— eおよび f)細胞においては高かった。し力しながら、 R-27 (乳癌)（図 2B d)および COLO201 (大腸腺癌)（図 2B— g)細胞は、ほんの低いレベルでしか PTH-rP発現を示さないか、あるいは PTH-rP発現が陰性であった。

[0055] これらタンパク質発現解析によって得られた結果は、 PT-PCR解析によって得られた結果と一致する。 2.各種癌タイプの HLA-A24分子陽性患者に由来する PTH-rPペプチド反応性 CTL の誘導

本発明者らは以前、 HLA-A24分子陽性前立腺癌患者の PBMCからペプチド特異的な前立腺癌反応性 CTLを誘導することができる 2種類の PTH-rP由来ペプチド、 PT H-rP 102-111および PTH-rP 110-119を同定した（非特許文献 5)。これらペプチドが各種癌タイプの患者において PTH-rPペプチド特異的 CTLが誘導できる力否かについて検討するため、患者の PBMCを in vitroにおいていずれかの PTH-rPペプチドで刺激し、次、でそのペプチド刺激 PBMCが対応 PTH-rPペプチドまたは HIVぺプチドを前もってパルスした C1R-A24細胞に応答して IFN- γを産生するかについて調べた (表 1)。本実験では、 Fluウィルスおよび EBV由来ペプチドを対照として使用した。 H IVペプチドに応答し産生された IFN- γをバックグラウンドとして差し引き、最良の応答が見られた結果を示す (表 1)。ペプチド特異的 CTLの誘導の成功は、有意な値 (Pく 0.05、両側スチューデント t検定による）が観察された場合に陽性であると判断した。

[表 1]

HLA- A24分子陽性癌患者由来の PTH-rPぺプチド剌激 PBMCの反応性

'串¾·老ペプチド

PTH-rP 102-111 PTH-rP 110^119 Flu EBV

IFN-y 産生 (pg/ml)

腎癌

# 1 67 122 139 110

#2 86 0 43 1588

#3 3 33 16Z 199

#4 20 226 318 648

#5 0 0 58 79 pj 2/5 2/5 4/5 5/5

6 25 22 74

#7 0 378 439 23

#8 7.8 6 0

#9 78 3 23 4011

# 10 525 0 0 25

2/5 2/5 1/5 2/5 大腸癌

# 11 11 92 6 27

# 12 184 44 11 163

# 13 7 81 232 0

# 14 ²⁵ 25 670 22 合計 1/4 2/4 2/4 1/4 子宮頸痛

# 15 160 71 292 27

#16 0 88 0 0

# 17 153 82 432 567

# 18 0 0 37 31

2/4 3/4 2/4 1/4 値は 2つのゥエルの平均を示す。 HIVペプチドに応答した IFN- r産生を差し引いてある。有意な値（両側スチュ一デント t検定にて Pく 0.05)に下線を付す。

PTH-rP 102-111ペプチドは、 5人の腎癌患者のうち 2人、 5人の胃癌患者のうち 2人、 4人の大腸癌患者のうち 1人、および 4人の子宫頸癌患者のうち 2人において、ぺプチド反応性 CTLを誘導することがわかった。 PTH-rP 110-119ペプチドもまた、 5人の腎癌患者のうち 2人、 5人の胃癌患者のうち 2人、 4人の大腸癌患者のうち 2人、 4人の子宮頸癌患者のうち 3人にお、て、ペプチド反応性 CTLを誘導した。

[0058] 以上の結果は、これら PTH-rPペプチド力様々な癌タイプの患者の PBMCからぺプチド反応性 CTLを誘導できることを示して、る。

[0059] 3.癌患者由来 PTH-rPペプチド反応性 CTLの癌細胞に対する細胞傷害活性

次に、癌患者力も誘導された PTH-rPペプチド反応性 CTLが、癌細胞に対して細胞傷害活性を示し得るかについて検討した。 RT-PCRの結果（図 1)に基づき、以下の癌細胞株を細胞傷害活性試験の標的細胞として使用した： KUR-11および RC30-14 (腎細胞癌)； MKN- 45および MKN- 28 (胃腺癌）； COLO320および COLO205 (大腸腺癌）； SKG-I並および OMC-1 (子宮頸部扁平上皮癌)。以下の細胞株は HLA-A24 分子の表面発現が陽性であった： KUR- 11、 MKN- 45、 COLO320および SKG- 1；— 方以下の細胞株は HLA-A24分子の表面発現は陰性であった： RC30-14、 MKN-28 、 COLO205および OMC- 1 (データ非提示)。上記 2で顕著なレベルの IFN- γを産生した 5人の患者由来の PBMC (表 1、 Pt #1 (胃癌）、 Pt #6 (腎癌）、 Pt #12 (大腸癌）、 Pt #13 (大腸癌）および Pt #15 (子宮頸癌)）を、前述の培養プロトコールに従い示した P TH-rPペプチドで繰り返し刺激した。そして、試験の直前にこれら細胞力も CD8陽性 T細胞を単離した。

[0060] PTH-rP 102-111ペプチドまたは PTH-rP 110-119ペプチドで刺激した CD8陽性 T 細胞は、 PTH- rP陽性/ HLA- A24分子陽性癌細胞 (KUR- 11、 MKN- 45、 COLO320および SKG-I)に対して、 PTH-rP陽性/ HLA-A24陰性癌細胞 (RC30-14、 MKN-28, CO LO205および OMC- 1)および PTH-rP陰性/ HLA-A24分子陽性 PHA誘導 T芽球化細胞に対してよりも、高ヽレベルの細胞傷害活性を示した（図 3)。

[0061] PTH-rP陽性/ HLA-A24分子陽性癌細胞に対する細胞傷害活性は、抗 HLAクラス I mAbの添カ卩によって有意に抑制された力抗 HLAクラス II mAbまたは対照として使用した抗 CD14 mAbの添カ卩によっては抑制されなかった（図 4A)。

[0062] さらに、 PTH-rP陽性/ HLA-A24分子陽性癌細胞に対する細胞傷害活性は、対応 P TH-rPペプチドをパルスした C 1 R-A24細胞をコールド標的細胞として添加すると有意に抑制された力この抑制は HIVペプチドをパルスした C1R-A24細胞の添カ卩によっては観察されな力つた（図 4B)。 [0063] 以上の結果は、これら PTH-rPペプチドにより誘導された各種癌タイプの患者に由来の CTLが、対応する癌細胞を傷害しうることを示す。また、本実験で観察された細胞傷害活性は主に HLAクラス I拘束性 PTH-rPペプチド特異的 CD8陽性 T細胞によることを示す。

[0064] 4.まとめ

以上より、 PTH-rP由来ペプチド、特に PTH-rP 102-111ペプチドおよび PTH-rP 11 0-119ペプチドが、前立腺癌だけでなく各種癌タイプの癌患者に対するペプチド基盤免疫療法において有用であることが示された。

Claims

請求の範囲

[1] HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチドを含む、癌 (但し前立腺癌を除く）を処置または予防するための医薬組成物。

[2] ペプチドが配列番号 1または 2に示すアミノ酸配列からなる、請求項 1記載の医薬組成物。

[3] 副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチドの誘導体を含む、癌 (但し前立腺癌を除く）を処置または予防するための医薬糸且成物であって、該誘導体が配列番号 1または 2に示すアミノ酸配列において 1または 2個のアミノ酸の置換、欠失および Ζまたは付加が導入されたアミノ酸配列からなり、かつ HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 Τ 細胞に認識されうる医薬組成物。

[4] 誘導体が、配列番号 1のアミノ酸配列の Ν末端から第 2番目のアミノ酸をフエニルァラニンで置換し、および/または C末端アミノ酸をイソロイシン、ロイシン、またはフエ- ルァラニンで置換したアミノ酸配列、または配列番号 2のアミノ酸配列の Ν末端力第 2番目のアミノ酸をチロシンまたはフエ-ルァラニンで置換し、および/または C末端アミノ酸をイソロイシンまたはフエ-ルァラニンで置換したアミノ酸配列力もなる、請求項 3記載の医薬組成物。

[5] 癌が胃癌、腎癌、大腸癌および子宮頸癌からなる群より選択される、請求項 1から 4 のいずれかに記載の医薬組成物。

[6] 癌が骨転移性である、請求項 1から 5のいずれかに記載の医薬組成物。

[7] 癌の転移性骨病変を処置または予防するためのものである、請求項 1から 6のいずれかに記載の医薬組成物。

[8] HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 Τ細胞に認識されうる副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチドを発現するベクターを含む、癌 (但し前立腺癌を除く）を処置または予防するための医薬組成物。

[9] ペプチドが配列番号 1または 2に示すアミノ酸配列からなる、請求項 8記載の医薬組成物。

[10] HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 Τ細胞に認識されうる副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチドの、癌 (但し前立腺癌を除く）を処置または予防するための医薬の製造のための使用。

[11] ペプチドが配列番号 1または 2に示すアミノ酸配列からなる、請求項 10記載の使用

[12] HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチドを患者に投与することを含む、癌 (但し前立腺癌を除く）を処置または予防する方法。

[13] ペプチドが配列番号 1または 2に示すアミノ酸配列からなる、請求項 12記載の方法

[14] HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチドと、 HLA-A24分子陽性癌患者 (但し前立腺癌患者を除く)より採取された末梢血単核細胞とを接触させることを含む、癌反応性細胞傷害性 T細胞を誘導する方法。

[15] HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチドを含む、癌 (但し前立腺癌を除く）反応性細胞傷害性 T細胞を誘導するためのキット。

[16] HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチドを、 HLA-A24分子陽性癌患者 (但し前立腺癌患者を除く）に由来する抗原提示能を有する細胞に取り込ませること、または該ペプチドを発現するべクタ一を導入することを含む、癌反応性細胞傷害性 T細胞を誘導可能な抗原提示細胞を調製する方法。

[17] HLA-A24分子に結合でき、細胞傷害性 T細胞に認識されうる副甲状腺ホルモン関連蛋白由来ペプチドまたは該ペプチドを発現するベクターを含む、癌 (但し前立腺癌を除く）反応性細胞傷害性 T細胞を誘導可能な抗原提示細胞を調製するためのキッ