WO2007013147A1 - 血管新生阻害剤及び血管退縮剤 - Google Patents

Abstract

　新規な血管新生阻害剤及び血管退縮剤を提供することを目的とし、この目的を達成するために、血管新生阻害剤及び血管退縮剤の有効成分として、Ｎ－β－アラニル－５－Ｓ－グルタチオニル－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン、β－アラニル－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン、５－Ｓ－システイニル－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン等の３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン誘導体又はその薬学的に許容される塩を含有させる。

Description

明 細 書

血管新生阻害剤及び血管退縮剤

技術分野

[0001] 本発明は、血管新生阻害剤及び血管退縮剤に関する。また、本発明は、血管新生 阻害物質のスクリーニング方法に関する。

背景技術

[0002] 血管の形成過程は、胎生初期での「脈管形成 (vasculogenesis)」と、同後期での「血 管新生（angiogenesis)」の二段階に分類される（W. Risau, Nature, 386： 671-674 (19 97)； D. Hanahan, Science, 277： 48-50 (1997))。ここで、「血管新生」とは、特に既存 の血管から新しい血管ネットワーク、すなわち新生血管が形成される現象のことをレ、う

[0003] 脈管形成及び血管新生の両過程に対するレセプター型チロシンキナーゼ (RTK) の関与が示唆されている。脈管形成では、血管内皮増殖因子（vascular endothelial g rowth factor ;VEGF)とそれに対する特異的な細胞膜上受容体 (VEGF Rl , VE GF— R2)が重要な役割を果たしていることが、ノックアウトマウスの実験より証明され ている（F. Shalaby等， Nature, 376： 62-66 (1995) )。また、血管新生では、 RTKタイ プの細胞膜上受容体、「Tie」の関与が想定されている。 Tieには Tie— 1と Tie— 2と が存在するが、マウスを用いたノックアウト実験で脈管形成不全による致死を誘発す ることから、 Tie— 1と Tie _ 2の両分子ともに血管形成における必須の因子であると考 えられている（T. N. Sato等， Nature, 376： 70-74 (1995)； M. C. Puri等， EMBO J" 1 4： 5884-5891 (1995))。

[0004] アンギオポェチン 1 (Ang— 1)は Tie— 2との結合を介して血管内皮細胞に働き かけ、 VEGFにより構築された幼若血管をより成熟な血管へと分化誘導することが知 れており、アンギオポェチン 1の過剰発現動物を用いた実験では、血管が巨大化 し、血管数が増え、血管の分岐が多くなることが観察されている（C. Suri等， Science, 282： 468-471 (1998))。

[0005] アンギオポェチン 2 (Ang— 2)は Ang— 1 /Tie— 2系での生理的な阻害物質で あると考えられており、 Ang_ lと競合的に働き、脈管形成、形態維持等を制御して いると考えられている（P. C. Maisonpierre等， Science, 277： 55-60 (1997))。

以上のように、健康な血管の恒常性を維持するためには複数の因子が関わるため 、 1つの因子の過剰な働きにより、血管の病的増殖、形態異常等が生じる。

[0006] 血管新生は、生体における種々の生理的及び病的状態で認められる。

生理的状態における血管新生は、黄体形成、胎盤形成等の際に認められる。一方 、病的状態における血管新生は、炎症、創傷治癒、腫瘍の増殖等で認められており 、眼科領域においては、例えば、糖尿病性網膜症、後水晶体線維増殖症、角膜移 植に伴う血管新生、緑内症、眼腫瘍、トラコーマ等で、皮膚科領域においては、例え ば、乾せん、化膿性肉芽腫等で、小児科領域においては、例えば、血管腫、線維性 血管腫等で、外科領域においては、例えば、肥大性はん痕、肉芽等で、内科領域に おいては、例えば、リューマチ性関節炎、浮腫性硬化症等で、心臓疾患においては 、例えば、ァテローム性動脈硬化症等で毛細血管の病的増加が認められる。特に、 糖尿病性網膜症及びトラコーマにおける異常な血管新生の増加は、多くの人々を失 明に追いやり、また、リウマチ性関節炎においては、関節での異常な血管新生が関 節中の軟骨の破壊を起こし、多くの人を悩ましている。

[0007] また、血管新生は、各種炎症性疾患 (リウマチ性関節炎、乾癬等）、眼科領域にお ける各種疾患 (糖尿病網膜症、未熟児網膜症、老人性黄斑変性、網膜静脈閉塞症、 後水晶体線維増殖症、角膜移植に伴う血管新生、緑内障、眼腫瘍等）、各種腫瘍等 の発症や進行に深く関与している。特に、角膜疾患においては、 Stevens-Johnson症 候群及びその類縁疾患、眼類天庖瘡及びその類縁疾患、アルカリ、酸、界面活性剤 、各種溶媒、揮発性ガス、その他細胞毒性を示す種々の薬剤等による角膜腐蝕、トラ コーマ、ウィルス感染、フリクテン性角膜炎等の疾患、角膜移植、ソフトコンタクトレン ズ長期装着等により、角膜に血管が新生されることが知られている。元来、血管の存 在しない透明な組織である角膜、眼房、水晶体、硝子体における血管新生は、著し い視力障害を生じるので、 日常生活に支障をきたす重大な問題である。

[0008] 血管新生が関与する疾患には現在十分な治療方法がなぐ特に糖尿病性網膜症 においては、外科的治療法を実施しない限り、新生された血管の退縮は見られず、 新生された血管からの出血による視力障害が問題となっている。

このため、近年、血管新生が関与する疾患に対する予防又は治療薬として、血管 新生阻害作用を有する物質の開発が注目されている。

[0009] これまでに開発された血管新生阻害物質は次のように分類することができる。

( 1 )血管内皮細胞増殖阻害作用を有する物質：フマギリン (fomagillin)， TNP -470 (糸状菌産生物フマギリンのアナログ）（非特許文献 1， 2参照）

(2)血管内皮細胞の管腔形成阻害作用を有する物質: Cochlioquinone A1 (非特許 文献 2参照）

(3)血管内皮細胞の走化性阻害作用を有する物質 (特許文献 2参照）

(4)マトリックスメタ口プロテアーゼ阻害作用を有する物質: MMI270 (非特許文献 3 参照）

(5)プラスミノーゲンァクチべ一ター阻害作用を有する物質:プラスミノーゲンァクチ ベータ一インヒビター 1 (PAI— 1) (非特許文献 4参照）

(6)レセプター型チロシンキナーゼ阻害作用を有する物質： PKC412 (非特許文献 5 参照）

[0010] し力しながら、これらの血管新生阻害物質は、活性が不十分であったり、毒性等の 副作用を有していたりするため、血管新生が関与する疾患の予防又は治療薬として は満足のレ、くものではなぐ優れた血管新生阻害作用を有する物質の開発が望まれ ている。特に、眼科領域では常に視機能の保持を念頭において薬剤を使用しなけれ ばならず、他の眼組織に悪影響を与えない安全な薬剤の開発が期待される。

[0011] 眼科領域においては、角膜移植手術の際の同種移植片拒絶に、角膜の血管新生 が関与していることが知られていることから（Jpn. J. Ophthalmol., 38 (3)， 311-316 (19 94))、角膜移植後に血管新生の阻害を行えば、移植片の拒絶を抑制することが出来 ると考えられている。新生血管を伴う眼疾患のインターフェロンひによる治療の可能 性は、加齢性黄斑変性症（Fung, W. E.， J. ophthalmol., 112， 349 (1991))、血管新生 緑内障（Miller, J.W.等， ophthalmology, 100， 9, (1992))、糖尿病網膜症（Wakelee_L ynch, J. and Banks, P., Diabetes Care, 15, 300, (1992))等で示唆されているが、そ の実際の有用性については未だ不明である。 [0012] 一方、 N_ β—ァラニル _ 5 _ S—グルタチォニル _ 3， 4—ジヒドロキシフエニルァ ラニン（5 - S— GAD)は公知の物質であり（特許文献 3)、 5 - S— GADが抗腫瘍作 用（特許文献 3， 4)、アポトーシス誘導作用（特許文献 5)、破骨細胞形成阻害作用（ 特許文献 5)等を有することが知られてレ、る。

非特許文献 1 :イングバー (Ingber) D等， 「ネイチヤー (Nature)」， 1990年，第 348卷，第 6301号， p.555-557

非特許文献 2 :ジユング (Jung) HJ等， 「バイオオーガニックアンドメディシナルケミスト リー (Bioorganic & Medicinal Chemistry)] , 2003年，第 11卷，第 22号， ρ.4743-4747 非特許文献 3 :ナカムラ (Nakamura) ES等， 「キャンサーサイエンス (Cancer Science)] , 2004年,第 95卷，第 1号， ρ.25-31

非特許文献 4 :ペン (Penn) JS等， 「インべスティゲイティブオフタルモロジ一アンドビ ジユアノレサイエンス (Investigative Ophthalmology and Visual Science)] , 2003年，第 4 4卷， p.5423-5429

非特許文献 5 :ォザキ (Ozaki) H等， 「アメリカンジャーナノレォブパソロジー (American Journal of Pathology)] , 2000年，第 156卷，第 2号， ρ.697-707

特許文献 1：特開平 1 279828号公報

特許文献 2 :特開 2003— 26696号公報

特許文献 3 :特開平 8— 337594号公報

特許文献 4：特開 2001— 213799号公報

特許文献 5：特開 2001— 226283号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0013] 本発明は、新規な血管新生阻害剤及び血管退縮剤を提供することを目的とする。

また、本発明は、新規な血管新生阻害物質のスクリーニング方法を提供することを目 的とする。

課題を解決するための手段

[0014] 上記課題を解決するために、本発明は以下の血管新生阻害剤、血管退縮剤及び 血管新生阻害物質のスクリーニング方法を提供する。

[式中、 R¹は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R²は水素原子又は次式 (Π)： [化 2]

[式中、 R³は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R⁴は水酸基又は任意のァミノ 酸残基を表し、 nは 1又は 2を表す。 ]

で表される基を表す。但し、 R¹及び R²のいずれか一方が水素原子である場合、他方 は水素原子ではない。 ] で表される 3, 4—ジヒドロキシフヱ二ルァラニン誘導体又はその薬学的に許容される 塩を有効成分として含有する血管新生阻害剤。

[0015] (2)前記 3， 4—ジヒドロキシフヱ二ルァラニン誘導体力 N— β—ァラニル一 5_S_ グルタチォニル _3， 4—ジヒドロキシフヱ二ルァラニン、 β—ァラニル _3， 4_ジヒド ロキシフエ二ルァラニン又は 5— S—システィニル _3， 4—ジヒドロキシフエ二ルァラ二 ンである前記（1)記載の血管新生阻害剤。

(3)眼用血管新生阻害剤である前記（1)又は（2)記載の血管新生阻害剤。

(4)角膜用血管新生阻害剤である前記 (3)記載の血管新生阻害剤。

[0016] (5)次式 (I) :

[化 3]

[式中、 R¹は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R²は水素原子又は次式 (Π) [化 4]

[式中、 R³は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R⁴は水酸基又は任意のァミノ 酸残基を表し、 nは 1又は 2を表す。 ]

で表される基を表す。但し、 R¹及び R²のいずれか一方が水素原子である場合、他方 は水素原子ではない。 ]

で表される 3 , 4—ジヒドロキシフヱ二ルァラニン誘導体又はその薬学的に許容される 塩を有効成分として含有する血管退縮剤。

[0017] (6)前記 3 , 4 ジヒドロキシフエ二ルァラニン誘導体力 N— β ァラニルー 5— S— グルタチォニルー 3 , 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン、 β ァラニルー 3 , 4—ジヒド ロキシフエ二ルァラニン又は 5— S—システィ二ルー 3 , 4—ジヒドロキシフエ二ルァラ二 ンである前記（5)記載の血管退縮剤。

(7)眼用血管退縮剤である前記（5)又は（6)記載の血管退縮剤。

(8)角膜用血管退縮剤である前記 (7)記載の血管退縮剤。

[0018] (9)下記工程（a)及び（b)を含む、 N _ J3—ァラニル一 5 _ S _ダルタチォ二ノレ _ 3 , 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン様血管新生阻害物質のスクリーニング方法。

(a)試験物質が、血管退縮作用、血管内皮細胞増殖阻害作用、血管内皮細胞の管 腔形成阻害作用、血管内皮細胞の走化性阻害作用、マトリックスメタ口プロテアーゼ 阻害作用、プラスミノーゲンァクチべ一ター阻害作用及びレセプター型チロシンキナ ーゼ阻害作用を有するか否力を判別する工程 (b)血管退縮作用を有し、かっ血管内皮細胞増殖阻害作用、血管内皮細胞の管腔 形成阻害作用、血管内皮細胞の走化性阻害作用、マトリックスメタ口プロテアーゼ阻 害作用、プラスミノーゲンァクチべ一ター阻害作用及びレセプター型チロシンキナー ゼ阻害作用を有しない物質をスクリーニングする工程

発明の効果

[0019] 本発明によって提供される血管新生阻害剤及び血管退縮剤は、従来の血管新生 阻害剤とは別のメカニズムに基づき血管新生を阻害することができる。

すなわち、従来の血管新生阻害剤は、血管内皮細胞増殖阻害作用、血管内皮細 胞の管腔形成阻害作用、血管内皮細胞の走化性阻害作用、マトリックスメタ口プロテ ァーゼ阻害作用、プラスミノーゲンァクチべ一ター阻害作用、レセプター型チロシン キナーゼ阻害作用等の作用のうち 1種類又は 2種類以上の作用に基づき血管新生 阻害作用を発揮する。これに対して、本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤は、 血管内皮細胞増殖阻害作用、血管内皮細胞の管腔形成阻害作用、血管内皮細胞 の走化性阻害作用、マトリックスメタ口プロテアーゼ阻害作用、プラスミノーゲンァクチ ベータ一阻害作用及びレセプター型チロシンキナーゼ阻害作用のいずれの作用も 有しないにも関わらず、血管退縮作用に基づき血管新生を阻害することができる。し たがって、本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤は、血管内皮細胞の増殖を過 度に抑制することによって生じる創傷治癒の遅延等を惹起するおそれがなぐ長期投 与可能である。

図面の簡単な説明

[0020] [図 1]図 1 (a)は、 5— S— GADの存在下で HUVECを培養した後、細胞数をコール ターカウンタ一法により測定した結果を示す図であり、図 1 (b)は、 5— S— GADの存 在下で HUVECを培養した後、ミトコンドリァ代謝活性を MTT法により測定した結果 を示す図である。

[図 2]図 2は、 5 _S— GADの存在下で HUVECを培養した後、細胞数をコールター カウンタ一法により測定した結果を示す図である。

[図 3]図 3は、 5 _S— GADの存在下で HUVECを培養した後、管腔形成を観察した 結果を示す図である。 [図 4]図 4 (a)は、 5— S— GADの存在下で HUVECを培養した後、細胞外プラスミノ 一ゲンァクチべ一ター活性を測定した結果を示す図であり、図 4 (b)は、 5- S-GA Dの存在下で HUVECを培養した後、細胞付着性プラスミノーゲンァクチベーター活 性を測定した結果を示す図である。

[図 5]図 5は、 5 _S— GADの存在下で HUVECを培養した後、 MMP— 2前駆体及 び MMP— 9前駆体を検出した結果を示す図である。

[図 6]図 6は、 5— S— GADの存在下で HUVECを培養した後、細胞走化性を測定し た結果を示す図である。

[図 7]図 7は、細胞溶解液を 5— S— GADで処理した後、 PKA活性、 PKC活性、 eE F 2K活性及び PTK活性を検出した結果を示す図である。

[図 8]図 8は、膜画分を 5— S— GADで処理した後、 EGF受容体チロシンキナーゼ活 性を測定した結果を示す図である。

[図 9]図 9は、膜画分を 5— S— GADで処理した後、 VEGF受容体チロシンキナーゼ 活性を検出した結果を示す図である。

[図 10]図 10は、兎の角膜上皮細胞を剥離し、硝酸銀で刺激した後、 5— S— GAD投 与群又は対照群において、角膜の外縁から角膜上皮細胞剥離部分に向力う血管の 新生を観察した結果を示す図である。

[図 11]図 11は、マウス背部皮下法により 5 -S - GAD投与後の新生血管数を測定し た結果を示す図である。

[図 12]図 12は、 5— S— GAD投与後の既存の血管の状態（太さ）を示す図である。

[図 13]図 13 (a)は、鶏胚漿尿膜法により 5— S— GAD処理後の血管の状態を観察し た結果を示す図であり、図 13 (b)は同法により血管新生阻害効果の有無を評価した 結果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

R³又は R⁴で表される任意のアミノ酸残基には、いかなる種類のアミノ酸残基も 含まれ、 R¹ R³又は R⁴で表されるアミノ酸残基としては、例えば、 α—アミノ酸残基、 β アミノ酸残基、 γ アミノ酸残基、中性アミノ酸（グリシン、ノくリン、ロイシン等のモ ノアミノモノ力ノレボン酸)残基、酸性アミノ酸（グルタミン酸、ァスパラギン酸等のモノァ ミノジカルボン酸）残基、塩基性アミノ酸（アルギニン、フエ二ルァラニン等のジアミノモ ノカルボン酸)等が挙げられる。なお、 R¹ R³又は R⁴で表される任意のアミノ酸残基 の結合様式はアミド結合である。

[0022] R¹で表されるアミノ酸残基は、好ましくは β—ァラニン残基であり、 R³で表されるアミ ノ酸残基は、好ましくはグルタミン酸残基であり、 R⁴で表されるアミノ酸残基は、好まし くはグリシン残基であり、 ηは好ましくは 1である。

[0023] 式 (I)で表される 3， 4—ジヒドロキシフヱ二ルァラニン誘導体 (ィ匕合物（1) )は、好まし くは、 Ν— β ァラニルー 5— S グルタチォニルー 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラ ニン（5— S— GAD)、 β ァラニルー 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン —AD )又は 5— S システィ二ルー 3 , 4 -ジヒドロキシフエ二ルァラニン（5— S - CD)であ る。なお、化合物（I)が 5— S— GADである場合、 R¹は ;3—ァラニン残基、 R²は式（II )で表される基、 R³はグノレタミン残基、 R⁴はグリシン残基、 nは 1であり、化合物（I)が β—ADである場合、 R¹は ァラニン残基、 R²は水素原子であり、化合物（I)が 5 —S— CDである場合、 R¹は水素原子、 R²は式 (Π)で表される基、 R³は水素原子、 R⁴ は水酸基、 nは 1である。

[0024] 化合物（I)には不斉炭素が存在するが、それらの不斉炭素の立体配置は特に限定 されず、 S 又は R 配置のいずれであってもよい。化合物（I)が 1又は 2個以上の不 斉炭素に基づく異性体として存在する場合、化合物 (I)は、立体化学的に純粋な形 態の任意の異性体（光学異性体、ジァステレオ異性体等）であってもよいし、任意の 異性体の混合物、ラセミ体等であってもよい。

[0025] 化合物（I)の薬学的に許容される塩としては、例えば、酸付加塩、塩基付加塩、アミ ノ酸付加塩等が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫 酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、シユウ酸塩、安息香酸塩、メタンスル ホン酸塩、 ρ_トルエンスルホン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クェン 酸塩、コハク酸塩、乳酸塩等の有機酸塩等が挙げられ、塩基付加塩としては、例え ば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの金属塩、アンモニ ゥム塩、メチルァミン塩、トリェチルァミン塩等のアミン塩が挙げられ、アミノ酸付加塩 としては、例えば、グリシン、フエ二ルァラニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸等の付 加塩が挙げられる。

[0026] 5 - S -GAD, /3 _AD、 5— S— CD等に代表される化合物（I)は、特開平 8 _ 33 7594号公報、特開 2001— 213799、特開 2001— 226283、 Leem JY等， J Biol Ch em, 271, 13573-13577 (1996)、 Ito S等， J Med Chem, 124, 673-677 (1981)、 Natori S ., Molecular Mechanisms of Immune Responses in Insects. London, Chapman&Hall, 245-260 (1998)等に記載された公知の製造方法に準じて製造することができる。

[0027] 化合物（I)は、例えば、 3, 4—ジヒドロキシフヱ二ルァラニン（Dopa)を出発原料とし 、アミノ酸の縮合合成法、酵素処理法、液相ペプチド合成法等を利用して製造するこ とがでさる。

[0028] 化合物（I)の具体的製造方法は次の通りである。

任意のアミノ酸のアミノ基を t—ブトキシカルボニル基 (Boc基）で保護するとともに、 当該アミノ酸のカルボキシル基を N—ヒドロキシスクシンイミド（NHS)で活性エステル 化した後、 Dopaと反応させることにより、 Rが任意のアミノ酸であり、 Rが水素原子で

1 2

ある化合物 (I)を製造することができる。反応混合物からの化合物 (I)の精製は、例え ば、反応混合物に 1N塩酸を添加し、酸性条件下、酢酸ェチルを用いて抽出処理を 行った後、酢酸ェチル層を減圧下で濃縮して析出する結晶を回収し、 HPLC処理す ることにより行うこと力 Sできる。

[0029] また、 Rが任意のアミノ酸であり、 Rが水素原子である化合物（I)を次式 (III)：

1 2

[化 5]

[式中、 R³、 R⁴及び nは前記と同義である。 ]

で表される化合物（ΠΙ)とともにリン酸緩衝液に溶解し、チロシナーゼで処理すること により、 R¹が任意のアミノ酸であり、 R²が式 (II)で表される基である化合物（I)を製造 することができる。反応液からの化合物（I)の精製は、 HPLC処理することにより行うこ とがでさる。

[0030] また、 Dopaを化合物（III)とともにリン酸緩衝液に溶解し、チロシナーゼで処理するこ とにより、 R¹が水素原子であり、 R²が式 (II)で表される基である化合物（I)を製造する ことができる。反応液からの化合物（I)の精製は、 HPLC処理することにより行うことが できる。

[0031] 化合物（III)は、次式 (IV)：

[化 6]

[式中、 nは前記と同義である。 ]

で表される化合物（IV) (例えば、システィン、ホモシスティン）のァミノ基及びカルボキ シル基に任意のアミノ酸をアミド結合させることにより製造することができる。

[0032] 5— S— GADは、センチニクバエの成虫に傷を与えて飼育した後に体液を採取す る力、ホモジネート化して原料とし、これをイオンカラムクロマトグラフィー及び逆相 HP LCにより分離 ·分画処理し、抗菌活性を有する画分を採取することにより得ることもで きる。

[0033] 化合物 (I)は、血管新生阻害作用及び血管退縮作用を有する。化合物 (I)は、血管 退縮作用に基づいて血管を退縮させ、血管新生を阻害することができる。但し、化合 物 (I)による血管新生阻害作用は、血管退縮作用に基づく作用に限定されるわけで はない。

[0034] 化合物 (I)は、血管内皮細胞増殖阻害作用、血管内皮細胞の管腔形成阻害作用、 血管内皮細胞の走化性阻害作用、マトリックスメタ口プロテアーゼ阻害作用、プラスミ ノーゲンァクチべ一ター阻害作用及びレセプター型チロシンキナーゼ阻害作用のい ずれの作用も有しないにも関わらず、血管退縮作用に基づき血管新生を阻害するこ とができる。したがって、化合物（I)は、血管内皮細胞の増殖を過度に抑制することに よって生じる創傷治癒の遅延等を惹起するおそれがなぐ長期投与可能である。

[0035] 本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤は、化合物（I)のみから構成されていて もよいが、通常は、医薬上許容される 1種以上の担体及び Z又は添加剤とともに常法 に従って製剤化される。製剤化する場合、化合物 (I)の配合量は適宜調節することが できる。

[0036] 医薬上許容される担体としては、例えば、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラ 一ゲン、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、カルボキシビ二ルポリマー、ァ ルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチ ン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレング リコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステア リン酸、ヒト血清ァノレブミン、マンニトール、ソルビトール、ラタトース等が挙げられる。

[0037] 製剤化に際して使用される添加剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、分 散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、 PH調節剤、溶解剤 、安定化剤等が挙げられ、これらの添加剤は製剤の投与単位形態等に応じて適宜 選択すること力 Sできる。

[0038] 投与経路及び投与剤形は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望まし い。投与経路の一般例としては、経口投与の他、脳内、腹腔内、 口腔内、気道内、直 腸内、皮下、筋肉内及び静脈内等の非経口投与が挙げられ、投与剤形の一般例と しては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、噴 霧剤、リボソーム剤、乳剤、座剤、注射剤、点眼剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。

[0039] 本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤が、血管新生阻害作用及び血管退縮 作用を発揮することができる組織は特に限定されるものではないが、眼、特に角膜に おいて優れた血管新生阻害作用及び血管退縮作用を発揮することができる。

[0040] 角膜を含む眼への投与は、例えば、本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤を 注射剤とし、角膜、硝子体等の患部組織又はその隣接組織中に細い注射針で直接 注入することにより行うこと力できる。また、ポンプ等を用いて眼内灌流液として投与 することができる。また、本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤をコンタクトレンズ の成分として予め含浸させておくことにより、角膜を含む眼への投与を行うことができ る。

[0041] 強膜は、脊椎動物の眼周囲の大部分を包囲している、高度に規則化したコラーゲ ン網目組織からなる薄い無血管性の層である。強膜は無血管性であるので、そこに 注射しても、本質的に出血の危険性はなぐ注射剤は眼からすぐに失われることがな レ、。したがって、強膜を天然の薬剤貯蔵場所として利用することができる。また、強膜 を天然の薬剤貯蔵場所として利用することにより、下層の組織への薬剤供給が可能 となる。

[0042] 本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤は、例えば、徐放性ポリマーのペレット 又はマイクロカプセルに取り込ませて徐放剤とし、当該徐放剤を治療すべき組織中 に外科的に移植することができる。徐放性ポリマーとしては、例えば、エチレンビニル アセテート、ポリヒドロメタタリレート、ポリアクリルアマイド、ポリビニルピロリドン、メチル セルロース、乳酸ポリマー、乳酸.グリコール酸コポリマー等が挙げられる力 これらの うち、生分解性ポリマーである乳酸ポリマー、乳酸'グリコール酸コポリマー等が好まし レ、。徐放剤の使用にあたり参照することができる事例としては、インサート剤やインプ ラント剤の使用（米国特許第 4,863,457号）がある。これらは眼上又は眼内へ長期に わたって薬剤を放出する。インサート剤とは、結膜層上といった眼上に差し込まれた 器材であり、これは一般に活性化合物を含有するポリマーマトリックスからなる。徐放 剤を強膜中に移植した場合、徐放剤から放出された本発明の血管新生阻害剤及び 血管退縮剤は強膜を通って眼内に拡散することができる。

[0043] 本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤は、ヒトを含む哺乳動物に投与すること ができる。本発明の血管新生阻害剤又は血管退縮剤の投与量は患者の年齢、性別 、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、一般 白勺に fま、成人一日あたり 0. 1〜： 1000mg/kgの範囲であり、好ましく ίま 10〜500mg Zkgの範囲であり、特に好ましくは 50〜： !OOmgZkgの範囲である。上記投与量の 薬剤は、毎日投与してもよいし、数日間隔で投与してもよぐ例えば:!〜 4日毎に投与 することができる。なお、本発明の血管新生阻害剤又は血管退縮剤を他の薬剤と併 用することもでき、その場合の投与量も上記と同様である。

[0044] 本発明の血管新生阻害剤及び血管退縮剤は、血管新生が関与する疾患、例えば 、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、血管新生緑内障、網膜静脈閉塞 症、網膜動脈閉塞症、翼状片、ルべォ一シス、角膜新生血管症等の眼疾患、固形腫 瘍、血管腫、腫瘍の増殖'転移等の癌疾患の予防又は治療剤として使用することが できる。

[0045] 本発明のスクリーニング方法において、試験物質が、血管退縮作用、血管内皮細 胞増殖阻害作用、血管内皮細胞の管腔形成阻害作用、血管内皮細胞の走化性阻 害作用、マトリックスメタ口プロテアーゼ阻害作用、プラスミノーゲンァクチべ一ター阻 害作用及びレセプター型チロシンキナーゼ阻害作用を有するか否かは、 in vitro系 又は in vivo系の公知の方法により判別することができる。 in vitro系の方法において は、例えば、ヒト、ゥシ、マウス、ラット等由来の血管内皮細胞（例えば、ヒト臍帯静脈 内皮細胞、ゥシ大動脈内皮細胞、マウス脳内皮細胞、ラット肝類洞内皮細胞）、所望 のレセプターを発現している細胞（例えば、所望のレセプター遺伝子を有する発現べ クタ一を導入した宿主細胞）の膜画分を使用することができる。また、 in vivo系の方法 においては、モデル動物として、ゥシ、ヒッジ、ャギ、ゥマ、ブタ、ゥサギ、ィヌ、ネコ、ラ ット、マウス等の哺乳動物を使用することができる。

[0046] 本発明のスクリーニング方法において、試験物質が例えば血管数、血管の太さ、血 管の長さ等を減少させることができるとき、試験物質が血管退縮作用を有すると判別 すること力 Sできる。

[0047] 本発明のスクリーニング方法において、試験物質の濃度が通常 10 μ M以下、好ま しくは 50 μ Μ以下、さらに好ましくは 100 a Μ以下であれば血管内皮細胞の増殖を 阻害しないとき、試験物質が血管内皮細胞増殖阻害作用を有しないと判別すること ができる。

[0048] 本発明のスクリーニング方法において、試験物質の濃度が通常 10 μ Μ以下、好ま しくは 50 μ Μ以下、さらに好ましくは 100 μ Μ以下であれば血管内皮細胞の管腔形 成を阻害しないとき、試験物質が血管内皮細胞の管腔形成阻害作用を有しないと判 另 IJすること力 Sできる。

[0049] 本発明のスクリーニング方法において、試験物質の濃度が通常 10 μ Μ以下、好ま しくは 50 μ Μ以下、さらに好ましくは 100 μ Μ以下であれば血管内皮細胞の走化性 を 50%以上阻害しないとき、試験物質が血管内皮細胞の走化性阻害作用を有しな レ、と判別することができる。

[0050] 本発明のスクリーニング方法において、試験物質の濃度が通常 10 μ M以下、好ま しくは 50 μ Μ以下、さらに好ましくは 100 μ Μ以下であればマトリックスメタ口プロテア ーゼ活性を阻害しないとき、試験物質がマトリックスメタ口プロテアーゼ阻害作用を有 しないと判別することができる。なお、「マトリックスメタ口プロテアーゼ」には、血管新 生に関係する限り、レ、かなる種類のマトリックスメタ口プロテアーゼも含まれ、例えば、 基底膜を分解するゼラチナーゼ群（ΜΜΡ— 2、 ΜΜΡ— 9)、これらを活性化する Μ MP— 3、 MMP— 14等が含まれる。

[0051] 本発明のスクリーニング方法において、試験物質の濃度が通常 10 μ M以下、好ま しくは 50 μ Μ以下、さらに好ましくは 100 μ Μ以下であればプラスミノーゲンァクチべ 一ター活性を阻害しないとき、試験物質がプラスミノーゲンァクチべ一ター阻害作用 を有しないと判別することができる。

[0052] 本発明のスクリーニング方法において、試験物質の濃度が通常 10 /i g/mL以下、 好ましくは 50 μ g/mL以下、さらに好ましくは 100 μ g/mL以下であればレセプタ 一型チロシンキナーゼ活性を 50%以上阻害しないとき、試験物質がレセプター型チ 口シンキナーゼ阻害作用を有しないと判別することができる。なお、「レセプター型チ 口シンキナーゼ」には、血管新生に関係する限り、レ、かなる種類のレセプター型チロ シンキナーゼも含まれ、例えば、 EGF受容体、 FGF受容体、 VEGF受容体（Flt _ l 、 Flk_ l)、 PDGF受容体等が含まれる。

[0053] 本発明のスクリーニング方法では、血管退縮作用を有し、かっ血管内皮細胞増殖 阻害作用、血管内皮細胞の管腔形成阻害作用、血管内皮細胞の走化性阻害作用、 マトリックスメタ口プロテアーゼ阻害作用、プラスミノーゲンァクチべ一ター阻害作用及 びレセプター型チロシンキナーゼ阻害作用を有しない物質を、 N— β—ァラニル— 5 _ S _ダルタチォニル—3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン様血管新生阻害物質と してスクリーニングすることができる。なお、「Ν _ β—ァラニル一 5 _ S _ダルタチォ ニル—3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン様血管新生阻害物質（5— S— GAD様血 管新生阻害物質)」とは、 5— S— GADと同様に、血管内皮細胞増殖阻害作用、血 管内皮細胞の管腔形成阻害作用、血管内皮細胞の走化性阻害作用、マトリックスメ タロプロテアーゼ阻害作用、プラスミノーゲンァクチべ一ター阻害作用及びレセプタ 一型チロシンキナーゼ阻害作用のいずれの作用も有しないにも関わらず、血管退縮 作用に基づき血管新生を阻害することができる物質である。 5-S- GAD様血管新 生阻害物質は、血管内皮細胞の増殖を過度に抑制することによって生じる創傷治癒 の遅延等を惹起するおそれがなレ、ので、長期投与可能である。

実施例

[0054] 〔実施例 1〕

実施例 1は、公知文献 (Nakamura M, Katsuki Y, Shibutani Y, Oikawa T. Dienogest , a synthetic steroid, suppresses both embryonic and tumor- cell-induced angiogenes is. Eur J Pharmacol.386， 33-40 (1999))を参考にして行った。

[0055] ゼラチンコートした 24穴プレートに HUVEC (human umbilical vein endothelial cells ：正常ヒト臍帯静脈内皮細胞）（10³細胞/ゥエル)を撒き、 37°C、 5%COで 4時間培

2 養した。 HUVECの培養には、 complete medium (MCDB131 (Sigma社製）， 10%ゥ シ胎児血清（fetal bovine serum) , 1%抗生物質（10,000 U/mlペニシリン及び 10, 000 β g/mlストレプトマイシンの混合液（GIBCO社製） ), 10μ gZmL内皮細胞成長サプ リメント (endothelial cell growth supplement) (Upstate Biotechnology千土 )， 10ng/ mL上皮細胞増殖因子 (epidermal growth factor) , 10 μ g/mLへパリン）を用いた。 その後、 5— S— GAD(0 xM， 0. ΟΙμΜ, 0. ΙμΜ, ΙμΜ, ΙΟμΜ, ΙΟΟμΜ) を添加し、さらに 37°C、 5%COで 72時間培養した。培養後、 HUVECをトリプシン

2

処理して剥がし、コールターカウンタ一法により細胞数を測定した。結果を図 1(a)に 示す。

[0056] ゥシ胎児血清の濃度を 1%にした complete mediumを用いて、上記と同様に HUVE Cを培養し、コールターカウンタ一法により細胞数を測定した。結果を図 2に示す。

[0057] ゼラチンコートした 96穴プレートに HUVEC (10⁴細胞/ゥエル）を撒き、 37°C、 5% COで 43寺 Γ培養した。その後、 5-S-GAD(0 M, 0.01/iM, 0. ΙμΜ, 1/i

2

M, ΙΟμΜ, 100 μΜ)を添カロし、さらに 37°C、 5% COで 72時間培養した。培養後

2

、 MTT法によりミトコンドリア代謝活性を測定した。結果を図 1 (b)に示す。 図 1及び図 2に示すように、 5— S— GADは、 ΙΟΟ μ Μ以下の濃度において、 HU VECの増殖に影響を与えな力 た。

[0058] 〔実施例 2〕

実施例 2は、公知文献（Oikawa T， Sasaki M, Inose M， Shimamura M, Kuboki H, Hi rano S, Kumagai H, Ishizuka M, Takeuchi T. Effects of cytogenin, a novel microbial product, on embryonic and tumor cell-induced angiogenic responses in vivo. Antica ncer Res. 17, 1881-1886 (1997))を参考にして行った。

[0059] 24穴プレートに、 4°C下、マトリゲル（Matrigel) (Becton Dickinson Labware社製）を 2mg/0. 2mL/ゥエルで加え、 37°Cで 30分間放置した。各ゥエルに HUVEC (7. 5 X 10⁴細胞/lmL/ゥェノレ）及び5— S— GAD (0 μ M, 1 /ι Μ, ΙΟ μ Μ, 100 μ Μ)を添加し、 37°Cで 18時間培養した後、位相差顕微鏡で観察した。

[0060] 通常、一定視野内の管腔の長さの合計を計算及び比較するが、ここでは、顕著な 阻害効果が見られなかったため、写真のみを図 3に示す。なお、図 3中、 A、 B、 C及 び Dは、それぞれ 5— S— GADの濃度が 0 μ M、 1 μ Μ、 10 μ M及び 100 μ Μであ る場合の結果を示す。

図 3に示すように、 5— S— GADは、 100 μ Μ以下の濃度において、 HUVECの管 腔形成を阻害しなかった。

[0061] 〔実施例 3〕

実施例 3は、公知文献（Nakamura M, Katsuki Y, Shibutani Y， Oikawa T. Dienogest , a synthetic steroid, suppresses both embryonic and tumor— cell—induced angiogenes is. Eur J Pharmacol. 386， 33-40 (1999))を参考にして行った。

[0062] ゼラチンコートした 35mmのディッシュ（IWAKI社製）に、 9 X 10⁵細胞/ディッシュと なるように、 complete mediumに懸濁した HUVECを 2mL添加し、 37°C、 5% COで 2

2

4時間培養した。次いで、 MCDB131 (Sigma社製）に 0. 1 %ゥシ血清アルブミン（bov ine serum albumin)、 10 μ gZ mL内皮糸田胞成 ¾サフリメント (endothelial cell growth supplement) (Upstate Biotechnology社製）、 10 μ g/mLへパリン及び 5— S— GAD (0 μ Μ, 0. ΟΙ μ Μ, 0. Ι μ Μ, Ι μ Μ, ΙΟ μ Μ, 100 μ Μ)を添カロした培地をカロ免 、 37°C、 5%COで 24時間培養した。 [0063] 培養上清を回収して、遠心し、その遠心上清のプラスミノーゲンァクチベーター活 性 (mU/10⁴細胞)を測定した。結果を図 4 (a)に示す。

また、ディッシュに接着した細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（phosphate-buffered sali ne)で 2回洗浄後、 0. 5mLの 0. 5% Triton X-100を含むリン酸緩衝生理食塩水で 細胞を溶解し、得られた抽出物のプラスミノーゲンァクチべ一ター活性 (mU/ μ gタ ンパク質)を測定した。結果を図 4 (b)に示す。

[0064] プラスミノーゲンァクチべ一ター活性は、ゥシプラスミノーゲン（bovine plasminogen) 及び H— D— Val— Leu— Lys— p—二トロアニリド（nitroanilide)を含む 0 · 1 M Tris /HCl (pH7. 4)に、サンプルを加えて、 37°Cでインキュベーションし、 405nmにお ける吸光度に基づいて遊離した P—二トロア二リドを測定することにより定量した。 図 4に示すように、 5— S— GADは、 100 μ Μ以下の濃度において、プラスミノーゲ ンァクチベータ一活性を阻害しなかった。

[0065] 〔実施例 4〕

実施例 4は、公知文献 (Nakamura M, Katsuki Y, Shibutani Y, Oikawa T. Dienogest , a synthetic steroid, suppresses both embryonic and tumor- cell-induced angiogenes is. Eur J Pharmacol. 386， 33-40 (1999))を参考にして行った。

[0066] ゼラチンコートした 35mmのディッシュに、 9 X 10⁵細胞/ディッシュとなるように、 co mplete mediumに懸濁した HUVECを 2mL添加し、 37°C、 5%COで 24時間培養し

2

た。その後、 MCDB131 (Sigma社製）に 0. 1 %ゥシ血清アルブミン、 10 μ g/mL内 皮糸田胞成長サフ メン卜 (endothelial cell growth supplement) (Upstate Biotechnology 社製）、 10 gZmL〜、 5— S— GAD (0 M， 0. 01 μ M, 0. 1 μ M， 1 μ M， ΙΟ μ Μ, 100 μ Μ)を添加した培地を加え、 18時間培養した。

[0067] 培養上清を回収して、遠心し、その上清の ΜΜΡ— 2活性及び ΜΜΡ— 9活性をゼ ラチンザィモグラフィー（gelatin-zymography)法により解析した。ゼラチンザィモグラ フィ一法は、コラーゲンの変性物であるゼラチンが多くの MMPの基質であることを利 用し、 MMPの活性を検出する方法である。 SDS—ポリアクリルアミド電気泳動ゲル にゼラチンを混ぜ、 MMPを含むサンプルをこのゲルで分離した後、酵素反応を行う と、 MMPは分子の大きさによってゲルの中を決まった距離だけ移動した後、その場 に留まってゼラチンを分解する。したがって、反応後、ゲルをタンパク質染色剤で染 色すると、 MMPが存在する部分だけ染まらずに透明なゲルとなり、 MMPの活性が 検出される。結果を図 5に示す。

[0068] 図 5に示すように、 5— S— GADの濃度が 0〜： ΙΟΟμΜのとき、 ΜΜΡ— 2前駆体を 示すバンドが観察された。すなわち、 5— S— GADは、 ΙΟΟμΜ以下の濃度におい て、 ΜΜΡ— 2活性を阻害しなかった。

なお、図 5に示すように、 5— S— GADの濃度に関わらず、 ΜΜΡ— 9前駆体を示 すバンドは観察されなかった。

[0069] 〔実施例 5〕

実施例 5は、公知文献（Oikawa T, Murakami K, Sano M， Shibata J, Wierzba K, Ya mada Y. A potential use of a synthetic retinoid TAC-101 as an orally active agent t hat blocks angiogenesis in liver metastases of human stomach cancer cells. Jpn J Ca ncer Res., 92, 1225-1234 (2001))を参考にして行った。

[0070] 35mmの培養ディッシュ（IWAKI社製）に HUVEC (4. 5 X 10⁵細胞/ mL, 2mUを 撒き、 24時間培養した。次いで、 MCDB131 (Sigma社製）に 0. 1%ゥシ血清アルブ ミン、 10 ig/mL内皮細胞成長サプリメント、 10 ig/mLへパリン及び 5— S— GA Ό(0μΜ, 0. ΟΙμΜ, 0. ΙμΜ, ΙμΜ)を添カロした培地をカロ免、 2時間培養した。 力ミソリの刃でディッシュの細胞の一部を搔き取り、 MCDB131 (Sigma社製）に 0. 1 %ゥシ血清アルブミン、 10 zg/mL内皮細胞成長サプリメント（endothelial cell growt h supplement) (Upstate Biotechnology社製）、 10 μ g/mLへパリン及び 5— S— GA Ό(0μΜ, 0. ΟΙμΜ, 0. 1 μΜ, 1 μ Μ)を添カロした培地で、さらに 16時間培養し た。細胞を固定し、ギムザ染色した後、搔き取った部分に遊走してきた細胞の数を力 ゥントし、対照（5— S— GAD濃度： ΟμΜ)に対する比率（％)を求めた。結果を図 6 に示す。

図 6に示すように、 5— S— GADは、 ΙμΜ以下の濃度において、 HUVECの走化 性 (遊走性）を阻害しなかった。

[0071] 〔実施例 6〕

実施例 6は、公知文献（Fukazawa H, Li PM, Mizuno S, Uehara Y. Method for simu Itaneous detection of protein kinase A, protein kinase C, protein tyrosine kinase, an d calmodulin-dependent protein kinase activities. Anal Biochem. , 212, 106-110 (199

3) )を参考にして行った。

[0072] v_ src癌遺伝子を発現させたマウス NIH3T3細胞を低張バッファー（ImM Hepe s - NaOH (pH7. 4)， 5mM MgCl， 25 μ g/mLアンチパイン（antipain) ,ロイぺ

2

プチン（leup印 tin) ,ぺプスタチン A (p印 statin A) )に懸濁し、氷上に 10分間放置した 。ボルテックスミキサーにより、 1分間撹拌し、細胞溶解液を調製した。細胞溶解液を 、 500 X gで 5分間、 4°Cで遠心し、遠心上清を脱核画分として回収した。脱核画分に 適当量の試薬を加え、タンパク質濃度 lmg/mL、 20mM Hepes— NaOH (pH7.

4)、 l OmM MgCl、 0. ImM Na VO、 ImM NaF、 20 μ M cAMP、 100 μ M C

2 3 4

aClとした。 DMSOに溶角早した 5— S— GAD (0. 1 μ g/mL, 1 μ g/mL, 10 μ g

2

/mL, 100 /i g/mL) (3 μ L)と脱核画分（22 μ L)とを混ぜて、氷上に 10分間放置 した。

_³²?]八丁？（10 / ¾ 75 μ Μ)を加えて反応を開始し、 25°Cで 20分 間放置した。 4 X SDS-PAGEサンプルバッファー（10 μ 1)を加えて、反応を止めた。

[0073] サンプルを 9% SDS— PAGE処理した後、オートラジオグラフィー解析を行った。

結果を図 7 (a)に示す。

また、チロシン特異的なリン酸化を検出するために、ゲルを IN Na〇Hで 55°C、 2 時間処理し、 10%酢酸— 5%イソプロパノールで中和した後、オートラジオグラフィー 解析を行った。結果を図 7 (b)に示す。

[0074] 図 7中、「PKA」はプロテインキナーゼ八、「PKC」はプロテインキナーゼ〇、「eEF _ 2KJは、 eEF— 2キナーゼ（真核生物延長因子 2キナーゼ；カルモジュリン依存性プ 口ティンキナーゼ ΠΙ)、「ΡΤΚ」はチロシンキナーゼの位置を示す。なお、図 7におい て、バンドの消失が活性阻害を表す。

[0075] 図 7に示すように、 5— S— GADの濃度が 0〜： Ι Ο μ Μのとき、 ΡΚΑ活性、 PKC活 性、 eEF _ 2K活性、 PTK活性を示すバンドが観察された。すなわち、 5— S— GAD は、 Ι Ο μ Μ以下の濃度において、 ΡΚΑ活性、 PKC活性、 eEF_ 2K活性、 PTK活 性を阻害しなかった。

[0076] 〔実施例 7〕 実施例 7は、公知文献（Hanai N， Nores G， Torres-Mendez C, Hakomori S. Modifie d ganglioside as a possiole modulator of transmembrane signaling mechanism through growth factor receptors: a preliminary note. Biochem Biophys Res Commun, 147, 1 27-134 (1987)； Bertics PJ, Gill GN. Self- phosphorylation enhances the protein-tyr osine kinase activity of the epidermal growth factor receptor. J Biol Chem, 260, 146 42-14647 (1985))を参考にして行った。

[0077] A431 (human epidermoid carcinoma)細胞より膜画分を調製した。 15 μ Lの反応液

(20mM Hepes (pH7.4) , 5mM MnCl ,タンパク質量 10 μ gの膜画分， 2 μ g/

2

mL EGF, lmg/mLアンジォテンシン（angiotensin) II)に、 5— S— GAD(1 μ g/ mL, 10/i g/mL, 100 μ g/mL)又は EGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤 AG1 478(0. 001, 0. l ig/mL)をカロえ、 25。Cで 30分間放置した。 5 μ L( [ γ -³²P]A TP(5 iCi/assay;l/iM)をカ卩えて反応を開始し、 0°Cで 15分間放置した。氷冷し た 20%トリクロ口酢酸で反応を止め、その上清を P81セルロースペーパー（Whatman n)にスポットした。洗浄後、放射活性をシンチレーシヨンカウンタ一にて測定した。結 果を図 8に示す。

図 8に示すように、 5— S— GADは、 ΙμΜ以下の濃度において、 EGF受容体チロ シンキナーゼ活性を阻害しなかった。

[0078] 〔実施例 8〕

実 例 8は、公矢口文献 (Sawano A, Takahashi T， Yamagucni S, Shibuya M. Tne pho sphorylated 1169-tyrosine containing region of flt-l kinase (VEGFR-l) is a major bi nding site for PLし gamma. Biochem Biophys Res Commun., 238, 487-491 (1997》を 参考にして行った。

[0079] VEGFレセプター（Flt_l)を過剰発現した Tn5細胞の膜画分（タンパク質量

)を、 5_S_GAD(10xgZmL, 100 μ gZmU又は VEGF受容体チロシンキナ ーゼ阻害剤 SU4984 (1 μ g/mL, 10 μ g/mL)を加えた kinase assay緩衝液中（5 OmM HEPES (pH7. 4)， 0. 1% Triton X-100, lOmM MnCl , 2mM MgCl ,

2 2

ImM DTT, ImM NaF, 0. ImM Na VO , ΙΟμΜ [ γ— ³²P]ATP(2. 5 μ Ci))、

3 4

25°Cで 10分間インキュベーションした。 SDS— PAGEサンプルバッファーを加えて 煮沸し、反応を止めた。

[0080] サンプルを 7. 5% SDS_ PAGE処理した後、オートラジオグラフィー解析した。結 果を図 9 (a)に示す。

また、チロシン特異的なリン酸化を検出するために、ゲルを 1M Na〇Hを用いて 55 °Cで 2時間処理し、 10%酢酸一 5%イソプロパノールで中和した後、オートラジオダラ フィー解析した。結果を図 9 (b)に示す。

なお、図 9において、バンドの消失が VEGF受容体チロシンキナーゼ活性の阻害を 表す。

[0081] 図 9に示すように、 5— S— GADの濃度が 10 μ Μのとき、 VEGF受容体チロシンキ ナーゼ活性を示すバンドが観察された。すなわち、 5— S— GADは、 ΙΟ μ Μ以下の 濃度において、 VEGF受容体チロシンキナーゼ活性を阻害しなかった。

[0082] 〔実施例 9〕

日本在来白色家兎 (体重 2〜2. 3kg：船橋農場)雌の大腿部筋肉に筋弛緩剤のセ ラクタール (Bayer社製）と塩酸ケタミン (三共社製）の混合液（1： 7)を約 1. 5mL注射 し、全身麻酔を行った。両角膜表面麻酔剤（ベノキシール:参天製薬社製）を滴眼後 、手術用顕微鏡下で 2%硝酸銀液に浸した直径 8mmの濾紙（アドバンテック東洋社 製)を角膜中央部に 1分間塗布し、ゴルフ刃を用いて硝酸銀塗布部の角膜上皮細胞 を剥離し、角膜実質面を露出させ、硝酸銀濾紙を 1分 30秒間角膜実質面上に塗布 した。塗布後直ちに 10mLの生理食塩水で洗浄した。次いで、直ちにエツペンドルフ 製マイクロピペットを用いて両角膜に 5 _S _GAD (5 _S _GAD投与群）又は生理 食塩水 (対照群）を各 50 z L点眼し、その後、感染予防のため結膜嚢内にタリビット 眼軟膏 (参天製薬社製)を投与した。翌日から 2週間、各群の両角膜にそれぞれ 5 _ S— GAD又は生理食塩水各 50 μ Lを 1日 4回点眼した。

[0083] 各群における 2週間後の状態を図 10に示す。図 10中、「5 _S _GAD (—）」は対 照群の結果を、「 5 _ S _ GAD (十）」は 5 _ S _ GAD投与群の結果を示す。

図 10に示すように、対照群においては、角膜の外縁から角膜上皮細胞剥離部分に 向力 血管が新生された力 5— S— GAD投与群においては、このような血管は新生 されなかった。 [0084] 新生血管モデル兎の作製 7日前に 5 _S _GAD又は生理食塩水を両角膜に 1日 4 回各 50 点眼した後、上記方法により新生血管モデル兎を作製し、コーヮ社製スリ ットランプを用いて血管新生を経時的に観察した。その際、各群の検体眼における新 生血管数をカウントし、次の要領でスコア化した。

[0085] 1個の検体眼のスコア = 2X + Y

X：角膜の外縁から角膜上皮細胞剥離部分に至る血管数

Υ:角膜の外縁から角膜上皮細胞剥離部分に至らない血管数 (但し、角膜の外縁か ら角膜の中心までの距離の 1/4以上の長さを有する血管を対象とした。 )

各群における 1週間後及び 3週間後のスコアを表 1に示す。

[0086] [表 1]

[0087] 表 1に示すように、硝酸銀刺激後 1週間目では両群のスコアに顕著な差は見られな レ、が、硝酸銀刺激後 3週間目では両群のスコアに顕著な差が見られた。このことから 、 5— S— GADの投与により、既存の血管の退縮が促進されることが示された。

[0088] なお、 5— S— GAD投与の有無と、 1週間から 3週間までのスコア変化との間に相 関があるかどうかを検定した。この検定での帰無仮説は、「5— S— GADの投与と、硝 酸銀刺激後 1週間から 3週間までのスコア変化とは独立な関係である」である。

[0089] イェーツの補正を行った場合の％ ²値は 57.0904311となる。これが自由度 1の χ ²分 布に従うことを用いて検定するとズ ²(1, 0.05) = 3·841となる。なお、 χ ²(1, 0.05)は、自 由度 1、有意水準 5%の ²値である。

イェーツの補正を行った場合の χ ²値は％²(1， 0.05)よりも大きレ、ので、帰無仮説は 棄却され、その結果、「5_ S _GADの投与と、硝酸銀刺激後 1週間から 3週間まで のスコア変化とには相関関係がある」が成立した。 [0090] 〔実施例 10〕

以下のようにしてマウス背部皮下（DAS : Dorsal Air Sac)法を行った。

ミリポア一リング（Millipore)の両面にミリポア一フィルター（pore size : 0. 45 x m, Mil lipore)を貼付したチャンバ一に腫瘍細胞（S180 ; Sarcoma 180 tumor cell line) 0. 1 5mL(2 X 10⁷細胞 Zチャンバ一）を注入した。麻酔したマウス（15週令の雌 ICRマウ ス）の尾根部より背部皮下に注射器で空気を注入した。皮膚を切開して空気注入部 の頭側にチャンバーを揷入、揷入部位を閉じた。チャンバ一移植 1， 2, 3, 4日目に、 サイトゲニン（_Cyt₀g_eni_n) (100mg/kg体重）又は 5— S— GAD (12. 5, 50, 200m g/kg体重）を i. p.投与した。チャンバ一移植 5日目に麻酔したマウスの背部を、チ ヤンバーを中心に切開し、皮膚を剥離した。皮膚側のチャンバ一接触部分にリングと 同型のゴムパッキンを置レ、た。 3mm以上の長さを示す新生血管数を実体顕微鏡で 測定した。結果を図 11に示す。

[0091] 図 11に示すように、 5— S— GADの投与により、新生血管数が減少した。

また、図 12に示すように、 5— S— GADの投与により、既存の血管が細くなつた。な お、図 12 (a)は PBS処理、 （b)はサイトゲニン処理、（c)は 5— S— GAD (200mg/ kg)処理、（d)は 5— S— GAD (50mg/kg)処理を表す。

[0092] 〔実施例 11〕

以下のようにして鶏胚漿尿膜 (CAM)法を行った。

Ethylene-vinyl acetate copolymer 40で処理した 5日目の鶏胚漿尿膜を、様々な用 量（0. 1， 1 , 10, 100 x g/egg)の 5— S— GADで処理し、 37°Cに加湿した孵卵器 でインキュベーションした。 2日目に適量の 20%脂肪乳濁液を漿尿膜に注入し、血 管網を観察した。血管がない領域が直径 3mm以上のとき、血管新生阻害効果があ ると評価した。 39個の検体について血管新生阻害効果の有無を評価し、血管新生 が阻害された検体の割合を算出した。結果を図 13に示す。

[0093] 図 13 (a)に示すように、 5— S— GADは、鶏胚における血管新生を阻害した。また 、図 13 (b)に示すように、 5— S— GADによる血管新生阻害は用量依存的であった。

Claims

請求の範囲

次式 (I)

[式中、 R¹は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R²は水素原子又は次式 (Π) [化 2]

[式中、 R³は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R⁴は水酸基又は任意のァミノ 酸残基を表し、 nは 1又は 2を表す。 ]

で表される基を表す。但し、 R¹及び R²のいずれか一方が水素原子である場合、他方 は水素原子ではない。 ]

で表される 3, 4—ジヒドロキシフヱ二ルァラニン誘導体又はその薬学的に許容される 塩を有効成分として含有する血管新生阻害剤。

[2] 前記 3， 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン誘導体力 N— β—ァラニル一 5— S—グ ルタチォニル _ 3， 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン、 β—ァラニル _ 3， 4—ジヒドロ キシフエ二ルァラニン又は 5— S—システィニル _ 3， 4—ジヒドロキシフエ二ルァラ二 ンである請求項 1記載の血管新生阻害剤。

[3] 眼用血管新生阻害剤である請求項 1又は 2記載の血管新生阻害剤。

[4] 角膜用血管新生阻害剤である請求項 3記載の血管新生阻害剤。

[5] 次式 (I) :

[化 3]

[式中、 R¹は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R²は水素原子又は次式 (Π)： [化 4]

[式中、 R³は水素原子又は任意のアミノ酸残基を表し、 R⁴は水酸基又は任意のァミノ 酸残基を表し、 nは 1又は 2を表す。 ]

で表される基を表す。但し、 R¹及び R²のいずれか一方が水素原子である場合、他方 は水素原子ではない。 ]

で表される 3, 4—ジヒドロキシフヱ二ルァラニン誘導体又はその薬学的に許容される 塩を有効成分として含有する血管退縮剤。

[6] 前記 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン誘導体力 N— β—ァラニル一 5— S グ ルタチォニルー 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラニン、 β ァラニルー 3, 4—ジヒドロ キシフエ二ルァラニン又は 5— S—システィ二ルー 3, 4—ジヒドロキシフエ二ルァラ二 ンである請求項 5記載の血管退縮剤。

[7] 眼用血管退縮剤である請求項 5又は 6記載の血管退縮剤。

[8] 角膜用血管退縮剤である請求項 7記載の血管退縮剤。

[9] 下記工程（a)及び（b)を含む、 N- β—ァラニル— 5_ S_ダルタチォニル _ 3， 4 —ジヒドロキシフエ二ルァラニン様血管新生阻害物質のスクリーニング方法。

(a)試験物質が、血管退縮作用、血管内皮細胞増殖阻害作用、血管内皮細胞の管 腔形成阻害作用、血管内皮細胞の走化性阻害作用、マトリックスメタ口プロテアーゼ 阻害作用、プラスミノーゲンァクチべ一ター阻害作用及びレセプター型チロシンキナ ーゼ阻害作用を有するか否力を判別する工程 (b)血管退縮作用を有し、かっ血管内皮細胞増殖阻害作用、血管内皮細胞の管腔 形成阻害作用、血管内皮細胞の走化性阻害作用、マトリックスメタ口プロテアーゼ阻 害作用、プラスミノーゲンァクチべ一ター阻害作用及びレセプター型チロシンキナー ゼ阻害作用を有しない物質をスクリーニングする工程