+

WO2007011265A1 - Procede de blocage d'activite des cibles specifiques a noggin2 - Google Patents

Procede de blocage d'activite des cibles specifiques a noggin2 Download PDF

Info

Publication number
WO2007011265A1
WO2007011265A1 PCT/RU2006/000382 RU2006000382W WO2007011265A1 WO 2007011265 A1 WO2007011265 A1 WO 2007011265A1 RU 2006000382 W RU2006000382 W RU 2006000382W WO 2007011265 A1 WO2007011265 A1 WO 2007011265A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nuggin2
protein
noggin2
activity
proteins
Prior art date
Application number
PCT/RU2006/000382
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2007011265A8 (fr
Inventor
Andrei Georgievich Zaraisky
Fedor Mikhailovich Eroshkin
Andrei Vyacheslavovich Bairamov
Original Assignee
Andrei Georgievich Zaraisky
Fedor Mikhailovich Eroshkin
Bairamov Andrei Vyacheslavovic
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Andrei Georgievich Zaraisky, Fedor Mikhailovich Eroshkin, Bairamov Andrei Vyacheslavovic filed Critical Andrei Georgievich Zaraisky
Publication of WO2007011265A1 publication Critical patent/WO2007011265A1/ru
Publication of WO2007011265A8 publication Critical patent/WO2007011265A8/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1875—Bone morphogenic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • This invention relates to proteins that regulate cell differentiation by inhibiting proteins of the superfamily, TGF- ⁇ and the EGF-CFC family. This invention was made using grant funds from the Howard Hughes Medical Institute (Howard Scientific Medical Institute). Under the terms of the grant, Howard Hughes Medical Institute is not entitled to this invention.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇
  • BMP bone morphogenesis proteins
  • BMP antagonists include, for example, chordin, ventroptin, noggin, cerberus, and follistatin proteins.
  • the proteins cerberus and vertebrate leggin induce the formation of head structures in the anterior ectoderm of vertebrate embryos.
  • the noggin protein is also able to change the differentiation of mesoderm primordia from ventral primordia, such as blood and mesenchyme, into dorsal primordia, such as muscle or chorda, or differentiation of epidermal primordia into neural primordia.
  • Chordin functions are similar to those of noggin, reflecting a similar mechanism of action of these proteins as antagonists of BMP.
  • TGF- ⁇ superfamily growth factor antagonists are important pharmaceutical, clinical, and laboratory tools for regulation of cell differentiation and therapeutic intervention.
  • Proteins secreted into the EGF-CFC family of epidermal growth factors are also characterized by common structural motifs. Proteins of this family were found only in vertebrate animals and to date, their involvement in a number of basic processes of ontogenesis has been shown (Salop et al., Bioresaus (1999) 21: 61-70; Salop et al., Endocr.Relat.Cancer (2000) 7 : 199-226; Shep and Sc Schier, Treps Gepet. (2000) 16: 303-309). In addition, it was found that violations and, in particular, an increase in the activity level of these proteins can lead to cell transformation and to the formation of cancer tumors ip vivo (M.
  • nuggin2 plays a role in the regulation of cell differentiation and is an antagonist of some members of the TGF- ⁇ superfamily and the EGF-CFC family. Moreover, the spectrum and nature of the action of nuggins2 are different from those of noggin (formerly “noggin”). In particular, unlike noggin, noggin2 does not induce the development of muscle tissue from embryonic ventral mesoderm. In addition, it may interfere with the well-known activity of noggin in relation to the induction of muscle development. At the same time, like noggin, noggin2 can induce the development of nervous tissue from the embryonic ectoderm. Thus, nuggin2 has a unique selective activity in relation to the induction of the development of nervous tissue.
  • nuggin2 has the ability to inhibit the activity of embryonic mesoderm inducers such as div / xpr (Xprs from Xeporis gave relat).
  • the mechanism of inhibition of half / Xprs activity by the nuggin factor 2 does not consist in direct binding of its molecules to half / Xprs molecules, but in their binding to the crypto factor, the presence of which is necessary for the interaction between half / Xprs and a specific receptor.
  • the present invention relates to methods and compositions that use nuggin2 or a nucleic acid encoding it.
  • the present invention relates to a method for altering the activity of a specific Nuggin2 target of the BMP family (e.g. BMP2, BMP4, BMP7), Sirto, or a combination thereof in the body, tissue, or cell, comprising administering an effective amount of Nuggin2, anti-Nuggin2 antibody, or a combination thereof the specified organism, tissue or cell, where these combinations alter the activity of nuggin2-specific targets (i.e., administration of nuggin2 inhibits the activity of these targets, while administration of an antibody leads to velicheniyu their activity).
  • the invention relates to a method for blocking the activity of specific Noggin2 targets, comprising introducing Nuggin2 into a specified organism, tissue or cell in an amount effective to inhibit or reduce the activity of specific Noggin2 targets by inhibiting the binding of these targets or their fragments to specific protein receptors.
  • the present invention relates to a method for increasing the activity of noggin2-specific targets, comprising administering antibodies to nuggin2 into the specified organism, tissue or cell in an amount effective for increasing the activity of nuggin2-specific targets by binding of nuggins2.
  • the present invention relates to a composition for altering the activity of noggin2-specific targets, comprising an effective amount of nuggin2, anti-nuggin2 antibodies, or a combination thereof.
  • the invention relates to a composition for blocking the activity of noggin2 specific targets, containing nuggin2 in an amount effective to inhibit or reduce the activity of noggin2 specific targets by inhibiting the binding of said targets or fragments thereof to specific protein receptors.
  • the present invention relates to a composition for increasing the activity of specific nuggins2 targets, comprising antibodies against nuggins2 in an amount effective to increase the activity of specifics of nuggins2 by binding of nuggins2.
  • these methods and compositions are used to modify cell differentiation, where the specified method involves bringing the cell or the medium surrounding the cell into contact with the nuggin2 protein under conditions where nuggin2 specifically interacts with its target components of the medium and / or cell surface, for modification cell differentiation.
  • the exogenous protein nuggin2 is used; in another preferred embodiment, an expression construct is used comprising the nuggin2 encoding nucleic acid under the control of a suitable promoter.
  • a method for altering cell differentiation involves the creation of an expression construct comprising a nuggin2 encoding nucleic acid under the control of a suitable promoter; introducing said expression construct into a cell for expression of nuggin2 or a functional chimeric protein containing nuggin2, where the expression of nuggin2 or said chimeric protein leads to a change in cell differentiation.
  • Figure 1 shows the difference between the effects of nuggins and nuggins2 on the differentiation of nervous and muscle tissues in Heporys lavis embryos and their tissue explants.
  • A, B. Ventral microinjections of 40 pg of synthetic noggin gene mRNA in the X. lavis embryos at the early stages of development lead to the formation of an additional axis of the body (the black arrow indicates the main axis of the body, the gray arrow indicates the additional axis of the body), while microinjections of such the same amounts of synthetic nuggin mRNA lead to the formation of a mushroom-like phenotype (A: 80%, 68 out of 85 embryos in total; B: 90%, 68 out of 75 embryos in total).
  • Figure 2 shows the scheme (A) and the results (B) of experiments to study the effects of nuggins and nuggins2 in the explants of embryonic tissues.
  • A Scheme of experiments with ectoderm explants of the animal region of the embryo (animal caps - AC) and explants of the ventral marginal zone of the embryo (VMZ).
  • B Scheme of experiments with ectoderm explants of the animal region of the embryo (animal caps - AC) and explants of the ventral marginal zone of the embryo (VMZ).
  • noggin and noggin2 activate the expression of neural markers (NCAM, Xapp-1) and inhibit the expression of epidermal (kerati), while only moggin mRNA detects the ability to activate the expression of the muscle molecular marker ⁇ -actin in explants of the ventral marginal zone.
  • Fig. 3 shows the difference between the effects of nuggins and nuggins2 on the expression of genes broxuir, BF-I and Pax-6.
  • a 5 B, C, D, D, E - results of hybridization of ip sit and total preparations of Heporus lakarvis embryos with probes to the corresponding genes (the hybridization signal ip sit is shown in black);
  • G ', D', E ') - the same embryos are shown under ultraviolet light, which allows visualization of microinjected cells containing, in addition to the mRNA label - fluorescein-lysine-dextran (FLD).
  • A, A '. Suppression of the expression of a mesoderm molecular marker (braxuyr) in embryos microinjected with ngingin mRNA2.
  • a - green fluorescent dye shows the distribution of microinjected material.
  • B, B '. Expression of the mesoderm molecular marker ⁇ braskhuyr) in the embryos microinjected with moggin mRNA does not show changes compared with the control embryo (arrow).
  • B, B ', D, D. Formation of the additional axis of the body in embryos microinjected with 2-5 ng ngingin2 mRNA into one of the ventral blastomeres.
  • Pax-6 indicates the presence in the additional axes of the forehead and eye structures.
  • Figure 4 shows the results of the analysis of the ability of the nuggin2 protein to bind to potential partner proteins.
  • the Nuggin2 protein exhibits the ability to bind bone morphogenetic protein (BMP) molecules and the Cirto protein molecule and does not show the ability to bind activin and Xpr molecules.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • ortholog refers to a polypeptide or protein derived from one species that is a functional copy of a polypeptide or protein of another species. Differences in ortholog sequences are the result of speciation.
  • the term “homologue” or “homology” represents is a term used in this field to describe the affinity of the nucleotide or protein sequence of another nucleotide or protein sequence, determined by the degree of identity and / or similarity between these compared sequences.
  • methods for changing the activity of certain members of the TGF- ⁇ superfamily and the EGF-CFC family are disclosed, as well as compositions containing the nuggin2 protein encoding its nucleic acid or anti-nuggin2 antibodies for use in them.
  • compositions for their practical use can be used in a number of research, diagnostic or therapeutic applications, including, but not limited to, inhibition or reduction of inflammation; regulation of bone reconstruction in the adult skeleton; the prevention and treatment of BMP-related disorders in animals, in particular humans; research and treatment of heart diseases and neurological disorders.
  • the present invention relates to the use of the specific function of nuggin2.
  • nuggin2 plays a role in the regulation of cell differentiation and differs from nuggins and other well-known growth factor antagonists belonging to superfamily TGF- ⁇ .
  • the authors also found that the nuggin2 proteins from Gallis gallis, having the sequences of SEQ ID NOs: 6 and 8, have the same biological properties as the nuggin2 from Heporys lavis.
  • noggin2 suppresses the general differentiation of the embryonic mesoderm, inhibiting the action of the mesoderm inducers by distance / hpg.
  • nuggin2 induces the development of nervous tissue from the embryonic ectoderm.
  • nuggin2 has a unique selective activity in relation to the induction of the development of nervous tissue.
  • the revealed ability of nuggins2 to inhibit dorsalizing activity of nuggins is the result of ⁇
  • an additional factor that binds to nuggin2 is the representative of the Epidemic Growth Factor Family (EGF-CFC) factor Sirto and related proteins, the activity of which is necessary for the induction of muscles from the embryonic mesoderm.
  • EGF-CFC Epidemic Growth Factor Family
  • the term “nuggin2” means a protein having a single and selective activity for inducing the development of neural tissue, binding to specific nuggin2 binding targets selected from the group consisting of BMP2, BMP4, BMP7, Sirto or a combination thereof, and being a homolog and an ortholog of the nuggin2 proteins selected from the group consisting of the nuggins2 of Xeporis lavis; nuggin2 Heporys trisalis; nuggin2 Figures and ribres; noggin2 gallis gallis (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8; corresponding Assessiop Nos in the Gepe Vapk database: AAX07470, AAX07471, AAX07474, AAX07476).
  • Noggin2-specific activity or function can be determined using known cell biology approaches in ip vitro or ip vivo systems, for example, ip vitro binding assays, analyzes in cell culture, in animals (e.g. immune response, gene therapy, transgenic animals, etc. .) etc.
  • Binding assays include any assay that evaluates the specific molecular interaction of nuggin2 with a binding target.
  • the target for binding may be a natural target for binding or non-natural target for binding, such as a specific immune protein, for example, an antibody.
  • binding specificity is assessed by biological analysis (for example, the ability to induce nerve tissue from an injected embryonic ectoderm) or by determining the binding constant of nuggin2 to its targets from the TGF- ⁇ superfamily, etc.
  • protein homologue a protein whose amino acid sequence is at least about 68%, typically at least about 75% and most often at least about 85% is identical to the known amino acid the nuggin2 sequences given in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, as determined using the MegAligp algorithm, DNAstar clustal algorithm, as described in DG Niggps app R.M. Sharr, "Fast apd Sepsitive multirle Sequepse Aligpmepts on a Misrosomruter", CABIOS 5 May pp. 151-3 (1989) (using the multiplicity 1 parameters, the penalty for skipping 3, windows 5 and saved diagonals 5).
  • the homologues of interest have a much greater sequence identity, e.g., 90% (e.g., 92%, 93%, 94%) or higher, e.g., 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99, 5%, especially for the amino acid sequence that forms the functional regions of the protein.
  • Tayuka are of interest to proteins that are substantially identical to nuggin2 proteins with the amino acid sequences of SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, where significant identity means that the amino acid sequence of the protein is at least about 68% identical to that of the protein, as typically at least about 75% and most often at least about 80%, where in some cases the identity may be more than, for example, 85%, 90%, 95% or more.
  • Proteins of interest include naturally occurring proteins and recombinant proteins containing the amino acid sequence of nuggin2 or its functional protein fragments having definable analysis of the specific activity of nuggin2.
  • proteins can be deletion mutants of the natural nuggin2 proteins, and they can be obtained in the form of hybrid products containing the nuggin2 polypeptides or its functional protein fragments.
  • polypeptides typically at least about 30 amino acids long, typically at least about 50 amino acids long, preferably at least about 75 to 100 amino acids long, and can be up to 300 amino acids or more in length , but, as a rule, do not exceed the length of 250 amino acids, where the fragment contains a portion of the amino acid sequence identical to the protein in question, at least about 25 amino acids in length, and usually, at least 45 amino acids, and in many embodiments, at least 50 amino acids.
  • the subject polypeptides are approximately 25 amino acids, approximately 50, approximately 75, approximately 100, approximately 125, approximately 150, approximately 200, or approximately 250 amino acids in length, up to a full length protein.
  • the fragments of interest retain all or substantially all of the specific functions of the wild-type protein.
  • proteins that are mutants or derivatives of naturally occurring proteins with specific nuggin2 activity. Mutants are understood to be proteins obtained either as a result of a limited substitution of amino acid residues in noggin2 proteins (as a rule, such a substitution can affect no more than 20% of all amino acid residues of the original protein), or as a result of deletions of certain fragments of noggin2 proteins. Derivatives of proteins are understood as recombinant proteins obtained on the basis of noggin2 proteins or their fragments, to which fragments of other proteins are added. Mutants and derivatives may retain the biological properties of wild-type proteins (eg, those found in nature) or may possess biological properties different from those of wild-type proteins.
  • biochemical property of the proteins of the present invention refers to biochemical properties, such as the stability of ip vivo and / or ip vitro (for example, half-life); ripening speed, ability to aggregate or to form oligomers and other such properties, but is not limited to them. Mutations include substitutions of individual amino acids, deletions or insertions of one or more amino acids, shortening or lengthening at the N-terminus, shortening or lengthening at the C-terminus, and the like.
  • nuggin2 nucleic acid containing a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 (corresponding Assessiop Nos in the Gepe Vapk base: AY779052, AY779053, AY779056, AY779058) nucleic acids, in substantially identical to these nucleic acids, and their mutants, derivatives and homologs.
  • nucleic acid homologue is meant a nucleic acid identical to the corresponding nucleotide sequence in at least about 30%, and preferably about 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% or higher, including 75%, 80%, 85%, 90% and 95% or higher.
  • the source of homologous nucleic acids and protein can be any species of plants or animals, or the sequence can be fully or partially synthesized, including nucleic acid analogs.
  • Mutants or derivatives of nuggin2 proteins and nucleic acids can be formed using standard molecular biology methods to the matrix nucleic acid encoding the nuggin2 protein by altering, deleting, or adding one or more nucleotides of the template sequence or a combination thereof to form a variant of the template nucleic acid. Substitutions, additions or deletions can be made by any method known in the art (see, for example, Gustip et al., Biotheshques (1993) 14: 22; Varapu, Gepe (1985) 37: 111-123 and Colicelli et al., MoI Gep. Hepet.
  • Substitutions, additions or deletions can also be introduced by a method involving recombination, recursive recombination of sequences, mutagenesis using modified phosphotioat DNA, mutagenesis using a uracil containing matrix, mutagenesis using a duplex rupture, mutagenesis using the repair of point inconsistencies, mutagenesis using a host strain with a deficiency in the recovery system, chemical mutagenesis, radiogenic mutagenesis, mutagenesis through deletions, mutagenesis using restriction-selection, mutagenesis using restriction-purification, synthetic synthesis genes, group mutagenesis, the creation of multimers of chimeric nucleic acids and their combination.
  • degenerate variants of the nuggin2 nucleic acid encoding proteins can be obtained.
  • Degenerate nucleic acid variants contain substitutions of nucleic acid codons for other codons encoding the same amino acids.
  • degenerate nucleic acid variants are prepared to enhance their expression in the host cell.
  • nucleic acid codons that are not preferred or less preferred in the host cell genes are replaced by the codons most represented in the host cell coding sequences, wherein said substituted codons encode the same amino acid.
  • Derivatives can also be obtained using standard methods, including RNA modification, chemical modifications, post-translational and post-transcriptional modifications, etc.
  • derivatives can be obtained using methods such as changing the profile of phosphorylation or glycosylation or acetylation or lipidization or using various types of cleavage of mature forms and the like.
  • Proteins and fragments of interest are isolated, i.e. exist outside the natural environment.
  • the considered proteins and protein domains can be synthesized or obtained by recombinant technologies or isolated from their natural environment.
  • the proteins of the present invention are recombinant proteins obtained using standard approaches using the Ngingin encoding nucleic acid, for example, a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7.
  • the nucleic acid molecule referred to here is a DNA molecule, such as genomic DNA molecules or cDNA molecules or RNA molecules, such as mRNA molecules.
  • said nucleic acid molecules are open reading frame cDNA molecules encoding the nuggin protein of the present invention or a functional fragment thereof and are capable of being expressed under the appropriate conditions as the active nuggin2 or functional domain of the nuggin of the present invention.
  • the genomic sequence of interest may contain a nucleic acid located between the initiating codon and the stop codon, as defined in the listed sequences, including all introns normally present in the original chromosome.
  • the genomic sequence of interest can include 5'- and 3'-untranslated regions located in mature mRNA, as well as specific transcriptional and translational regulatory sequences, such as promoters, enhancers, etc., including about 1 t. bp, but possibly more, flanking genomic DNA at either the 5 ′ or 3 ′ end of the transcribed region.
  • nucleic acids of interest can be isolated and obtained in substantially purified form.
  • substantially purified form means that the nucleic acids are at least about 50% pure, typically at least 90% pure and, as a rule, are "recombinant", i.e. flanked by one or more nucleotides with which they are normally not associated in the natural chromosome in their natural host organism.
  • Nucleic acids of the present invention, corresponding cDNAs, full-length genes and constructs can be artificially produced using various protocols known to those skilled in the art. Appropriate nucleic acid constructs are purified using standard recombinant DNA methods, for example, as described in SAMBROOK et al.
  • Fusion proteins may contain, for example, the nuggin2 protein and the second polypeptide ("fusion partner"), combined into a single reading frame at the N-terminus and / or C-terminus of the nuggin2 polypeptide.
  • Fusion partners include, but are not limited to, polypeptides capable of binding antibodies specific to the fusion partner (e.g., epitope tags), antibodies or their binding domains, polypeptides providing catalytic function or induction of a cellular response, ligands or receptors, or mimetics thereof etc.
  • the fusion partner is typically associated with a portion of the fusion protein, which is the nuggin2 protein, a non-natural method and, as a rule, is not the nuggin2 protein of the present invention or its derivative / fragment.
  • Nucleic acids encoding the fusion proteins described above are also of interest.
  • a vector and other nucleic acid constructs comprising a nuggin2 encoding nucleic acid.
  • Applicable vectors include viral and non-viral vectors, plasmids, cosmids, phages, etc., preferably plasmids, and are used for cloning, amplification, expression, transfer, etc. the nucleic acid sequences of the present invention in a suitable host.
  • the selection of a suitable vector is well known to the person skilled in the art, and many such vectors are commercially available.
  • a partial or full-length nucleic acid is inserted into a vector, usually by attaching a DNA ligase to a restriction enzyme digested site in a vector.
  • the desired nucleotide sequence can be inserted by homologous recombination of ip vivo, typically by attaching to the vector on the sides of the desired nucleotide sequence of homology regions.
  • homology regions are added by ligation of nucleotides or by polymerase chain reaction using primers containing a homology region and part of a desired nucleotide sequence.
  • the expression cassette can exist as an extrachromosomal element, or it can be integrated into the genome of a cell as a result of introducing said cassette into the cell.
  • the product of the gene encoded by the nucleic acid of the invention is expressed in any suitable expression system, including, for example, bacterial, yeast, insect, amphibian or mammalian systems.
  • the nucleic acid of the invention is operably linked to a regulatory sequence, which may contain promoters, enhancers, terminators, operators, repressors and inducers.
  • Cell lines stably expressing nuggin2 can be selected using methods well known in the art (for example, co-transfection with a selective marker such as dhfr, gpt, neomycin, hygromycin, which allows identification and isolation of transfected cells containing the gene integrated into the gene).
  • the expression systems described above can be used in prokaryotic or eukaryotic hosts.
  • host cells as E. coli, B. sibtilis, S. servisiae, insect cells in combination with baculovirus vectors, or cells of higher organisms such as vertebrates, for example, C0S7, HEK293, CHO cells, Xepopus ⁇ can be used ⁇ etc.
  • an expressed protein or polypeptide fall within the scope of the invention as a product of a host cell or host organism.
  • the product can be isolated by any suitable methods known in the art.
  • Antibodies specifically binding to the nuggin2 of the present invention are also disclosed. Applicable antibodies can be prepared using methods known in the art.
  • polyclonal antibodies can be obtained as described in Narrow Apd Lap Optibodies: A Labor Mapul, (1988) CoId Sprig Paror Lab, Parallel, as described below, it is possible ⁇ radrontise: ⁇ rodustiop apd Arlistiop THERf Monoclonal Certification ip CeIl Biologu, ⁇ i demanderhemistr apd Immopolisu; Zrd editiop, (1996) Academis Press.
  • Hybrid antibodies are also of interest, including humanized antibodies, as well as single chain antibodies and antibody fragments such as Fv, F (ab ') 2 and Fab.
  • Hoggin2 as well as the other components of the present invention described above, find application in many different applications, including the use as immunogens, targets in screening assays, biologically active substances for modulating cell growth, differentiation and / or functioning, etc.
  • the present invention relates to a method for changing the activity of noggin2-specific targets (for example, BMP2, BMP4, BMP7, Sirto, or a combination thereof), comprising administering a sufficient amount of noggin2, anti-noggin2 antibodies, or a combination thereof, to the specified organism, tissue or cell, where these combinations alter the activity of nuggin2-specific targets (i.e., the administration of nuggin2 inhibits the activity of these targets, while the administration of an antibody increases their activity).
  • noggin2-specific targets for example, BMP2, BMP4, BMP7, Sirto, or a combination thereof
  • the present invention relates to a method for blocking the activity of noggin2-specific targets, the method comprising administering nuggin2 into a specified organism, tissue or cell in an amount sufficient to inhibit or reduce the activity of specific noggin2 targets by preventing binding these targets or their fragments with specific protein receptors.
  • the present invention relates to a method for increasing the activity of noggin2 specific targets, comprising administering antibodies to nuggin2 into said organism, tissue or cell in an amount sufficient to increase the activity of specific noggin2 targets by binding to nuggin2.
  • the methods and compositions provided are used to modify cell differentiation.
  • a method for modifying cell differentiation involves bringing the cell or the environment surrounding the cell into contact with the nuggin protein under conditions where nuggin specifically interacts with its targets, the components of the medium and / or extracellular surface, to effect a change in cell differentiation.
  • the exogenous protein nuggin2 is used; in another preferred embodiment, an expression construct is used comprising the nuggin2 encoding nucleic acid under the control of a suitable promoter.
  • Nuggin2 protein can be added to the vitro culture medium and physiological fluids such as blood, synovial fluid, etc.
  • the protein can also be introduced or expressed in specific cell populations by any suitable method, such as microinjection, promoter-dependent expression of the recombinant enzyme, targeted delivery of lipid particles, etc. These methods can be used to reduce unwanted osteogenesis, inhibit cell growth requiring morphogenetic protein (e.g. BMP-dependent neuroblastomas and gliomas), regulate cartilage formation and growth, change morphogen-dependent cell development / differentiation directions in culture, such as cells for transplantation or infusion, etc.
  • morphogenetic protein e.g. BMP-dependent neuroblastomas and gliomas
  • nuggin2 Since nuggin2 causes activity in relation to the induction of nerve tissue, it can be used to treat peripheral neuropathies with the growth of the spinal cord and processes of sensitive neurons, for example, it can be included in therapeutic treatment for the regeneration of processes of neurons after strokes, brain damage caused by head injuries , and paralysis caused by spinal cord injuries.
  • the use may also be in the treatment of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease and multiple sclerosis, by stimulating the processes of neurons. Additional applications may include restoration of dissected axons, which often occurs in foci of damage in multiple sclerosis.
  • nuggin2 or a fragment thereof can be used as a suppressor of the activity of these factors, for example, morphogenetic bone protein (BMP), and epidermal growth factor Sirto or their homologues.
  • BMP morphogenetic bone protein
  • the invention relates to a method of counteracting the functioning of said specific target, comprising bringing said target into contact with the nuggin2 protein or fragment thereof.
  • the method according to the invention is carried out under conditions when nuggin2 or a fragment thereof binds to a specific target.
  • nuggin2 may be useful for the prophylaxis or treatment of BMP-related disorders in animals, in particular humans.
  • nuggin2 can be used to treat diseases or disorders that include, but are not limited to, progressive ossifying fibrodysplasia (FOP), and also to treat abnormal bone growth such as abnormal bone growth after hip replacement surgery, trauma, burns, or spinal cord injuries.
  • FOP progressive ossifying fibrodysplasia
  • nuggin2 can be used to treat or prevent the undesirable effects of BMP associated with abnormal bone growth observed in association with metastatic prostate cancer or osteosarcoma. Since it is known that the content of the ligand BMP2 and BMP4 significantly increases in asthma (Rosephal et Al, Am J Respir CeIl MoI Biol.
  • nuggin2 can also be used to bind BMP and, thus, to treat inflammatory syndromes.
  • nuggin2 can bind and thereby inhibit the activity of the protein, it also finds use in the prevention and treatment of cancer tumors, the formation of which in vertebrates is associated with an abnormal increase in the activity of this epidermal growth factor.
  • nuggin2 instead of the monoclonal antibodies and antisense RNA used to date for the treatment of a wide range of cancers, such as tumors of the breast, uterus, stomach, pancreas, lungs, ovaries and others.
  • nucleic acids, proteins, fragments and antibodies to nuggin2 of the invention can be used to alter the activity of specific nuggin2 targets in animals, in particular humans.
  • Compositions of interest may include a nuggin2 protein, for example a recombinant purified protein.
  • composition may also contain a suitable pharmaceutical carrier for systemic or local administration of ip vivo in any suitable manner, including, but not limited to, injection (e.g., intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, endoneural, perineural, intraspinal, intraventricular, intravitreal, and intrathecal etc.) by absorption through the epithelial or mucocutaneous lining (e.g., through the oral mucosa, rectal or intestinal mucosa, and .d.) or a sustained release implant, including a cellular or tissue implant.
  • injection e.g., intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, endoneural, perineural, intraspinal, intraventricular, intravitreal, and intrathecal etc.
  • absorption e.g., through the epithelial or mucocutaneous lining (e.g., through the oral mucosa, rectal or intestinal mucosa, and .d.) or a sustained release implant, including
  • the composition may contain a liquid carrier, such as saline, be enclosed in liposomes, microcapsules, polymer or paraffin-based controlled-release formulations, or be formulated in the form of a tablet, pill or capsule.
  • a liquid carrier such as saline
  • the concentration of the active ingredient used (s) depends on the type of disease or signs that are affected, the method of administration used, as well as the characteristics of the biological system. Effective doses can be obtained by extrapolating the dose-response curves obtained in ip vitro test systems or in animal models.
  • the term "effective amount” or "effective dose” refers to the amount of protein necessary to achieve a biological effect, i.e.
  • an effective dose is in the range of 0.1-100 mg / kg of the subject.
  • nuggin2 may result in the distribution of nuggin2 in the body or in a localized area.
  • intravenous or intrathecal administration of nuggin2 can be used.
  • local administration may be used.
  • an implant containing a nuggin2 can be placed in or near a specific area. Suitable implants include, but are not limited to, a gelatin sponge, wax, or microparticle based implants.
  • Example 1 Cloning of nuggin2 cDNA coding of nuggin2 cDNA was cloned during the search for the Xeporis lavis genes involved in the regulatory network of the homeobox-containing tepaXapf-1. 1999, v. 126, pp. 4513-4523).
  • nuggin2 The nucleotide and amino acid sequences of nuggin2 are shown in SEQ ID NO: 1 and 2.
  • Example 2 The effect of nuggin2 on the direction of cell development
  • the pSP64T vector containing the complete coding part of the nuggin2 cDNA (pSP64T-nuggin2 vector) was obtained as described in Example 1.
  • the complete coding sequence was obtained by PCR nogginl amshshfikatsii Heporis laevis cDNA sample using nogginl - specific primers 5'-T ATCC ATGGC AAGAAATSGGG AGC A-3 'and 5'ATTSTSGAGTSTS AGC ATGAGC ATTTGC A-3 1 and cloned into vector pSP64T ( vector pSP64T-nogginl).
  • Synthetic muggins noggin2 and noggin were obtained using the mMESSAGE MASHINE Kit reagent kit (Ambiop) from the pSP64T-nuggin vectors and the pSP64T-noggin vector, respectively, linearized with the restriction endonuclease EcoRI (Fermeptas).
  • the effects of microinjections of nuggin mRNA on the development of Xeporis laevgs were compared with the previously described effects of noggin mRNA injections (Smith, Ap. Narlapd, CeIl 1992, v. 70, pp. 829-840; Lamb et al., Sciepse 1993, v. 262, pp.
  • nuggin2 despite its alleged ability to bind BMP, did not induce the secondary axis of the body when its mRNA was injected into both ventral blastomeres of 8-cell embryos. Instead, abnormal mushroom-shaped embryos arose.
  • VMZ ventral marginal zone
  • OT-PCR reverse transcription-PCR
  • VMZ ventral marginal zone
  • AC explants were removed from the embryos subjected to injection using a micro-knife and a glass rod, as previously described in Zarisk et al. Developed Biolog 1992, v. 152, pp. 373-382. All explants were incubated overnight in a 0.5xMMR solution. Out of ten explants of each type, total RNA was isolated and RT-PCR was performed as described in Zarisk et al. Developed Biolog 1992, v. 152, pp. 373-382.
  • ⁇ -actin gene 5'-GCTGACAGAATGCAGAAG and 5'-TTGSTTGGAGGAGTGTGT; brashuiru: 5'-GCTGGAAGTATGTGAATGGAG AND 5'-TTAAGTGSTGTAATSTSTTS; Cerberus: 5'-
  • RT-PCR based on total RNA from AC and VMZ explants of embryos injected with leggin or nuggin2 mRNA was performed with primers for markers of neuroectoderma (NCAM, Xanf-1), epidermis (keratin), muscle ( ⁇ -actin), late mesoderm (brushuiru) and entomesoderm (cerberus) and Ef-1- ⁇ as a control (Fig. 2B).
  • Nuggin and noggin2 have been shown to activate the expression of neural markers (NCAM, Xanf-1) and inhibit the epidermal marker (keratin), while only noggin activates the expression of a muscle marker ( ⁇ -actin) in VMZ explants.
  • nuggin2 showed a strong neuralizing activity similar to that of noggin (Smith appd Härläpd, CeIl 1992, v. 70, pp. 829-840; Lamb et al., Sciepse 1993, v. 262, pp. 713-718) inducing the expression of markers of the anterior part of the nervous system, but inhibiting the epidermal marker.
  • the ability of nuggin2 to neutralize the ectoderm, together with its ability to suppress dorsalizing activity of nuggins looks very unusual and means that nuggin2, in addition to BMP, can bind some other factors necessary for differentiation of muscles.
  • noggin2 mRNA microinjections on the differentiation of embryonic mesoderm was assessed by analyzing the expression of the universal marker of the early stages of mesoderm development - the baxuiru gene - at the stage of the early gastrula Heporis laevis.
  • either noggin or noggin2 mRNA, obtained as described in example 2 was injected into the equatorial region of one of the ventral blastomeres at the stage of 8 blastomeres in an amount of 40 Ig using the Errepdorff microinjector.
  • FIG. 3 The experimental results are shown in FIG. 3.
  • the noggin2 mRNA microinjection causes inhibition of the expression of the bashui gene in the microinjection region, which indicates the suppression of differentiation of embryonic mesoderm at this site.
  • similar microinjections of Noggin mRNA do not cause inhibition of expression of briskuir and, accordingly, inhibition of the development of mesoderm (Fig. 3 B and B ').
  • nuggin2 has a unique ability to suppress the differentiation of embryonic mesoderm.
  • nuggin2 The ability of nuggin2 to inhibit the BMP signaling cascade was assessed by the ability of nuggin2 to suppress the expression of the main genetic target of this cascade - the Vent2 homeobox gene - in explants of embryonic embryonic ectoderm nuclei (AC explants) microinjected with a mixture of noggin2 mRNA and BMP7 BMP2, mRNA, mRNA.
  • nuggin mRNA was mixed for microinjections with mRNA of all of the above BMPs simultaneously. As a control, similar experiments were carried out with noggin mRNA.
  • Vent2 gene expression was analyzed by RT-PCR based on total RNA from AC explants as described in Example 2.
  • the following Vent2-specific primers were used: 5'-ASTGAACASAAGGASTAATASA and 5'-AGAGGCCAGAGACTGCCCAA.
  • nuggin2 is able to inhibit the activation of Vent2 expression induced by any of these BMPs, as well as their mixture.
  • nuggin2 protein To directly investigate the ability of the nuggin2 protein to bind BMP molecules in X.lavis embryos, the active forms of nuggin2 and BMP4 were expressed in the expression vectors pCS2- ⁇ Myc-noggin2 and pCS2- ⁇ Flag-BMP4, respectively.
  • the nucleotide sequence encoding the three amino acid sequences of the Myc protein epitope was inserted by PCR into the ngingin2 cDNA directly at the 3 'end of the sequence encoding the signal peptide n2.
  • 5 'and 3' respectively, overlapping parts of nuggin cDNA were obtained in PCR with 5'- primers
  • the nucleotide sequence encoding the three Flag amino acid sequences was inserted by PCR into BMP4 cDNA directly to the 3 'end of the sequence encoding the Heporis BMP4 protein region.
  • 5 'and 3' overlapping portions of BMP4 cDNA were obtained in PCR with primers 5'-AATTGGATCCGCCACCATGATTCCTGGTAACCGAATG-3 'and 5'- TTTGTCATCATCGTCTTTGTAGTCCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTGTTT TGGASTTSTTTTTGAS-W 1 5 1 -
  • the cDNA fragments were purified from not including primers, mixed together, denatured by heating, annealed and subjected to a second round of PCR with the primers 5'-end AATTGGATSSGSSASSATGATTSSTGGTAASSGAATG-W 1 and 5 1 - AATSTSGAGTSAASGGSASSSASASSSTTSSA-W 1.
  • the resulting full-length BMP4 cDNA containing the sequence encoding the three amino acid sequences of the Flag epitope was cloned into the pCS2 vector at the restriction sites Ncol (type) / Agel (type) and Xhol / Xhol.
  • 600 pg of synthetic 3Myc-noggin2 mRNA and 600 pg of synthetic 3Flag-BMP4 mRNA were microinjected into developing X. lavis nuclei at the stage of 2 blastomeres. Subsequently, these embryos were incubated in a solution of 0.1 MMR to the stage of early gastrula.
  • nuggin2 The ability of nuggin2 to inhibit the activin / delayed signaling cascade were evaluated by the ability of nuggin2 to suppress the expression of the main genetic target of this cascade, the broshuur gene, in explants of embryonic embryonic ectoderm of the embryos (AC explants) microinjected with a mixture of nuggin mRNA and mRNA Xrl, Xnr2, or Xnr4 (homologs of gene d). As a control, similar experiments were performed with mRNA and noggin.
  • the expression of the baskhuur gene was analyzed by RT-PCR for total RNA from AC explants as described in Example 2.
  • nuggin2 is able to suppress activation of expression of braskhuur induced by any of these Khpr.
  • nuggin2 protein In order to study the ability of the nuggin2 protein to bind the molecules of the antivip and Xpr proteins in X. lavis embryos, the active forms of nuggin2, activip and Xpr were expressed in the expression vectors pCS2- ⁇ Myc-noggin2, pCS2- ⁇ Flag-activin and pCS2- ⁇ Flag Xn-n.
  • the nucleotide sequence encoding the three Flag amino acid sequences (DYKDDDDKDYKDDDKKDYKDDDK) was inserted by PCR into the Antivip-B cDNA immediately behind the sequence encoding the protein region of activis-Xvisvis protein.
  • the nucleotide sequence encoding the three Flag amino acid sequences was inserted by PCR into the Xnr2 cDNA directly at the 3 'end of the sequence encoding the Xsritzpory protein region.
  • 5 'and 3' overlapping parts of BMP4 cDNA were obtained in PCR with primers 5'-AATTGGATSSGSSASSATGGCA ⁇ G ⁇ - ⁇ 1 and 5'-
  • AATSTSGAGTSTSGTTASATSSASASTSATSSATSA-Z 1, respectively.
  • these cDNA fragments were purified from unincorporated primers, mixed with each other, denatured by heating, annealed, and subjected to a second round of PCR with 5'- end primers
  • AATSTSGAGTSAASGGASSASSASASSTSTSSA-Z 1 The resulting full-length Xnr2 cDNA containing a sequence encoding the three amino acid sequences of the Flag epitope was cloned into the pCS2 vector at the restriction sites Ncol (type) / Agel (type) and Xhol / Xhol.
  • nuggin2 protein molecules to bind the protein molecules of the crypto cofactor from the epidermal family was investigated growth factors EGF-CFC.
  • EGF-CFC growth factors
  • the active forms of noggin2 and ⁇ rorto were expressed in the expression vectors pCS2- ⁇ Myc-noggin2, pCS2- ⁇ Flag-Cripto, respectively.
  • the mechanism of inhibition of the activin / delivered cascade by the factor of nuggin2 is different from that for the BMP cascade and is not carried out by direct binding of the activin molecules or by the binding of the nuggin2 molecules, but due to the ability of the nuggin2 to bind the crypto cofactor molecules, the presence of which is necessary for the normal functioning of this cascade (Fig. four).
  • the revealed ability of nuggins2 to bind the ⁇ r ⁇ 1958to factor can be of great biomedical significance.
  • Example 6 Simultaneous inhibition of BMP and activin / half signaling cascades and induction of head structures using nuggins2
  • BMP and activin / the differentiation of the structures of the main axis of the vertebral body is inhibited on the ventral side of the embryo as a result of the permanent activation of two main TGF- ⁇ -cascades: BMP and activin / by
  • the selective inhibition of the BMP cascade leads by default to the development of structures characteristic of the trunk and posterior part of the body axis.
  • the simultaneous inhibition of both BMP and activin / dip cascades causes the induction of anterior-headed structures, including eye and forebrain.
  • nuggin2 The ability of nuggin2 to inhibit both the BMP cascade and the activin / short cascade simultaneously indicates the potential ability of this factor to induce forehead structures.
  • a similar effect could be masked by the strong neuralizing effect of nuggin2, caused by relatively high concentrations of microinjectable mRNA.
  • nuggin2 the ability of low concentrations of nuggin2 to induce the development of additional anterior-headed structures in whole embryos was studied.
  • synthetic nuggin mRNA obtained in the same manner as described in Example 2 was microinjected into one of the ventral vegetative blastomeres of Xeporus lavis embryos at the stage of 8-16 blastomeres in the amount of 2-5 pg.
  • the development of an additional anterior-head section was observed.
  • the hybridization method of ip siti with specific probes for mRNA of the forehead markers BF-I and Pax-6 such additional brain structures included the end brain and eyes (Fig. 3 B and B 1 ; D and D 1 ).
  • Example 7 Obtaining the recombinant protein nuggin2 To obtain the active homginimer nuggin2, expression of nuggin2 was carried out in a culture of green monkey monkey epithelial cells CV-I as part of the pcDNAZ-6His-noggin2 expression vector. To obtain the pcDNAZ-bHis-noggin2 vector, a nucleotide sequence encoding 6 amino acid residues of histidine was inserted by PCR into the ngingin2 cDNA immediately behind the sequence encoding the ngingin2 signal peptide. In the first cloning step, 5 'and 3' overlapping parts of nuggin cDNA were obtained in PCR with primers 5'-ATTASSGGTGGGAGAASSTTGTTSTTSATT- 1 and 5'-
  • the resulting full-length noggin2 cDNA containing a sequence encoding 6 histidines was cloned into the pcDNAZ vector at the restriction sites Ncol (dull) and Hol. Green monkey epithelial cells (CV-I) were cultured in
  • DMEM medium (Sigma) with 10% serum (Biolot), 100 U / ml penicillin and 100 mg / ml streptomycin at 37 0 C and 1 atm.
  • these cells were transfected with pcDNA3-6His-noggin2 vector.
  • Subsequent selection was carried out in a medium containing 1 ⁇ g / ml geneticin (Gibso BRL).
  • Secreted recombinant 6His-Noggin2 was obtained from the culture medium by affinity chromatography on Ni-NTA agarose (Qiagep). Protein yield was estimated as 50 ⁇ g / million cells per day. The activity of the protein was confirmed by its ability activate neurogenesis in explants of embryonic ectoderm.
  • Example 8 Obtaining polyclonal. antibodies against nuggin2 cDNA containing the complete coding region of nuggin2 was reamplified as described in Example 1, subcloned into the pQECO vector and used to transform Escherichia coli. A recombinant protein containing six histidine residues was purified using affinity chromatography on Talop Resip (Clop Lab Laboratories, Ips.) Under denaturing conditions and was used to immunize rabbits using standard technology.
  • Polyclonal serum was tested against recombinant protein using ELISA and Western blot methods.
  • nuggin2 proteins from gallis gallis having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6 and 8 encoded by nucleic acids having the sequences of SEQ ID NO: 5 and 7, respectively. It has been found that these nuggin2 proteins from Gallis gallis exhibit the same biological properties as nuggin2 X.lavis.
  • nuggin2 Since the genomic sequence of nuggin2 is devoid of introns, the full-length coding region of chicken nuggin2 cDNA (Gallis gallis) was obtained from the genomic DNA of chicken using PCR with primers: 5'-
  • nuggin2 cDNA fragment was cloned into the plasmid pSP64T (Protega) at the restriction sites HindSh (type) / Age (type) and Xhol / Sall.
  • nuggin2 The nucleotide sequence of nuggin2 was confirmed by sequencing. To obtain the nuggin2 protein, nuggin2 was expressed in the culture of the CV-I green monkey epithelial cells as part of the pcDNAZ-6His-noggin2 expression vector. To obtain the pcDNAZ-bHis-noggin2 vector, the nucleotide sequence encoding 6 histidine amino acid residues were inserted by PCR into the nuggin2 cDNA immediately behind the sequence encoding the ngingin2 signal peptide. In the first cloning step, 5 'and 3' overlapping parts of nuggin cDNA were obtained in PCR with 5'-ATTACCGGTTGGATGCGTCCAGGGCCGGGAAG-3 'and 5'- primers
  • these cDNA fragments were purified from unincorporated primers, mixed with each other, denatured by heating, annealed, and subjected to a second round of PCR with primers 5'-ATTASSGGTTGGATG ⁇ G ⁇ GGGCCCCGG ⁇ G- ⁇ 1 , and 5'-
  • the resulting full-length chicken nuggin2 cDNA containing a sequence encoding 6 histidines was cloned into the pcDNAZ vector at the restriction sites Ncol (dull) and Xhol.
  • Green monkey epithelial cells were cultured in DMEM medium (Sigma) with 10% serum (Biolot), 100 U / ml penicillin and 100 mg / ml streptomycin at 37 ° C and 1 atm. To obtain a constant cell line producing 6His-noggin2, these cells were transfected with pcDNA3-6His-noggin2 vector. Subsequent selection was carried out in a medium containing 1 ⁇ g / ml geneticin (Gibso BRL). Secreted recombinant 6His-Noggin2 was obtained from the culture medium by affinity chromatography on Ni-NTA agarose (Qiagep). Protein yield was estimated as 70 ⁇ g / million cells per day. Protein activity was confirmed by its ability to activate neurogenesis in explants of the embryonic ectoderm Heporus lavis.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

СПОСОБ БЛОКИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ
ДЛЯ HOГГИH2 МИШЕНЕЙ
ОПИСАНИЕ
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Данное изобретение относится к белкам, регулирующим клеточную дифференцировку путем ингибирования белков надсемейства, ТGF-β и семейства EGF-CFC. Данное изобретение было сделано с использованием средств гранта от Медицинского Института Ховарда Хьюза (Ноwаrd Нughеs Меdiсаl Iпstitutе). В соответствии с условиями гранта, Медицинский Институт Ховарда Хьюза не имеет прав на это изобретение.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Надсемейство трансформирующего фактора роста β (ТGF-β) включает в себя множество факторов роста, обладающих общими структурными мотивами. Данные белки вовлечены в широкий спектр биологических процессов, таких как процессы клеточной и тканевой дифференцировки в ходе эмбрионального развития и заживления ран, восстановление и реконструкции костной ткани во взрослом организме. Идентифицирован ряд белков межклеточного матрикса, являющихся антагонистами различных представителей надсемейства ТGF-β (например, белков костного морфогенеза, BMP(Bone mоrрhоgепеtiс рrоtеiпs)) и играющих важную роль в процессах клеточной дифференцировки и развития (Ваlеmапs and Van HuI, Dеv Вiоl. (2002) 250(2):231-250; Аvsiап-Кrеtсhmеr апd Нsuеh, MoI Епdосriпоl. (2004) 18(1):1-12). К антагонистам BMP относятся например белки хордин, вентроптин, ноггин, церберус и фоллистатин.
Например, белки церберус и ноггин позвоночных индуцируют формирование структур головы в передней эктодерме эмбрионов позвоночных.
Белок ноггин способен так же изменять дифференцировку мезодермальных зачатков из вентральных зачатков, таких как кровь и мезенхима, в дорзальные зачатки, такие как мышца или хорда, или дифференцировку эпидермальные зачатков в нейральные зачатки. Функции хордина сходны с функциями ноггина, отражая сходный механизм действия этих белков как антагонистов BMP.
Антагонисты факторов роста из надсемейства ТGF-β являются важными фармацевтическими, клиническими и лабораторными инструментами для регуляции клеточной дифференцировки и терапевтического вмешательства.
Белки, выделяемые в семейство эпидермальных ростовых факторов EGF- CFC, подобно белкам надсемейства ТGF-β, также характеризуются общими структурными мотивами. Белки данного семейства обнаружены только у позвоночных животных и на сегодняшний день показана их вовлеченность в ряд базовых процессов онтогенеза (Sаlоmоп еt аl., Вiоеssауs (1999) 21:61-70; Sаlоmоп еt аl., Endocr.Relat.Cancer (2000) 7:199-226; Shеп апd Sсhiеr, Тrепds Gепеt. (2000) 16:303-309). Помимо этого, установлено, что нарушения и, в частности, повышение уровня активности этих белков может приводить к трансформации клеток и к формированию раковых опухолей iп vivо (M. Shеп, J.Сliп.Iпvеst. (2003) 112:500-502; С.Вiапсо еt аl., Grоwth Fасtоrs (2004) v.22(3):133-139). В связи с этим, исследование путей регуляции и возможных способов подавления активности белков этого семейства и, в первую очередь, человеческого гомолога - Сriрtо - является одной из наиболее актуальных биомедицинских задач. Недавно у позвоночных был описан новый гомолог белка ноггин, названный нoггин2 (Flеtсhеr еt аl., Gепе Ехрr Раttеrпs. 2004, v. 5, pp.225-230; Еrоshkiп еt аl., Gепе Ехрr Раttеrпs. 2006, v. 6, рр.180- 186). Было показано, что ген нoггин2 имеет дифференциальный характер экспрессии в ходе развития Хепориs. Однако функция нoггин2 не исследована. Настоящее изобретение относится к функции нoггин2.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения открыли, что нoггин2 играет роль в регуляции клеточной дифференцировки и является антагонистом некоторых представителей надсемейства ТGF-β и семейства EGF-CFC. При этом спектр и характер действия нoггин2 отличны от таковых ноггинl (ранее "ноггин"). В частности, в отличие от ноггинl, нoггин2 не индуцирует развитие мышечной ткани из эмбриональной вентральной мезодермы. Кроме того, он может препятствовать хорошо известной активности ноггинl в отношении индукции развития мышц. В то же время, подобно ноггинl, нoггин2 может индуцировать развитие нервной ткани из эмбриональной эктодермы. Таким образом, нoггин2 обладает уникальной избирательной активностью в отношении индукции развития нервной ткани. Выявленная способность нoггин2 препятствовать дифференцировке мышечной ткани объясняется его способностью ингибировать общую дифференцировку эмбриональной мезодермы благодаря взаимодействию с иным (более широким) спектром факторов. Наряду с ингибированием эпидермализующей активности BMP2, BMP4 или BMP7, которая, как известно, так же ингибируется ноггинl, нoггин2 обладает способностью ингибировать активность таких индукторов эмбриональной мезодермы, как поdаl/Хпrs (Хпrs от Хепориs поdаl rеlаtеd). Причем, в отличие от активности BMP, механизм ингибирования активности поdаl/Хпrs фактором нoггин2 состоит не в прямом связывании его молекул с молекулами поdаl/Хпrs, а в их связывании с кофактором Сriрtо, присутствие которого необходимо для взаимодействия поdаl/Хпrs со специфическим рецептором.
Настоящее изобретение относится к способам и композициям, в которых используется нoггин2 или кодирующая его нуклеиновая кислота. В предпочтительном осуществлении настоящее изобретение относится к способу изменения активности специфичных для нoггин2 мишеней семейства BMP (например, BMP2, BMP4, BMP7), Сriрtо или их сочетания в организме, ткани или клетке, предусматривающему введение эффективного количества нoггин2, антител против нoггин2 или их сочетания в указанный организм, ткань или клетку, где указанные сочетания изменяют активность специфичных для нoггин2 мишеней (т.е. введение нoггин2 приводит к ингибированию активности этих мишеней, тогда как введение антитела приводит к увеличению их активности).
В предпочтительном осуществлении изобретение относится к способу блокирования активности специфичных для нoггин2 мишеней, предусматривающий введение нoггин2 в указанный организм, ткань или клетку в количестве, эффективном для ингибирования или снижения активности специфичных для нoггин2 мишеней посредством препятствования связыванию указанных мишеней или их фрагментов со специфическими белковыми рецепторами.
В другом осуществлении настоящее изобретение относится к способу увеличения активности специфичных для нoггин2 мишеней, предусматривающий введение антител к нoггин2 в указанный организм, ткань или клетку в количестве, эффективном для увеличения активности специфичных для нoггин2 мишеней посредством связывания нoггин2.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции для изменения активности специфичных для нoггин2 мишеней, содержащей эффективное количество нoггин2, антител против нoггин2 или их сочетания.
В предпочтительном осуществлении изобретение относится к композиции для блокирования активности специфичных для нoггин2 мишеней, содержащей нoггин2 в количестве, эффективном для ингибирования или снижения активности специфичных для нoггин2 мишеней посредством препятствования связыванию указанных мишеней или их фрагментов со специфическими белковыми рецепторами.
В другом осуществлении настоящее изобретение относится к композиции для увеличения активности специфичных для нoггин2 мишеней, содержащей антитела против нoггин2 в количестве, эффективном для увеличения активности специфичных для нoггин2 мишеней посредством связывания нoггин2.
В предпочтительном осуществлении указанные способы и композиции используются для модификации клеточной дифференцировки, где указанный способ предусматривает приведение клетки или окружающей клетку среды в контакт с белком нoггин2 в таких условиях, когда нoггин2 специфически взаимодействует со своими мишенями - компонентами среды и/или клеточной поверхности, для модификации клеточной дифференцировки.
В одном предпочтительном осуществлении используется экзогенный белок нoггин2; в другом предпочтительном осуществлении используется экспрессирующая конструкция, содержащая кодирующую нoггин2 нуклеиновую кислоту под контролем подходящего промотора. В этом осуществлении способ изменения клеточной дифференцировки предусматривает создание экспрессирующей конструкции, содержащей кодирующую нoггин2 нуклеиновую кислоту под контролем подходящего промотора; введение указанной экспрессирующей конструкции в клетку для экспрессии нoггин2 или функционального химерного белка, содержащего нoггин2, где экспрессия нoггин2 или указанного химерного белка приводит к изменению клеточной дифференцировки. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На Фиг.l представлено различие между эффектами ноггинl и нoггин2 на дифференцировку нервной и мышечной тканей в эмбрионах Хепориs lаеvis и их тканевых эксплантатах. А, Б. Вентральные микроинъекции 40 пг синтетической мРНК гена ноггинl в зародыши X. lаеvis на ранних стадиях развития приводят к формированию дополнительной оси тела (черная стрелка указывает основную ось тела, серая стрелка указывает дополнительную ось тела), в то время, как микроинъекции такого же количества синтетической мРНК нoггин2 приводят к формированию грибообразного фенотипа (А: 80%, всего - 68 зародышей из 85; Б: 90%, всего - 68 зародышей из 75). В-Ж. In situ гибридизация контрольных зародышей (слева на каждой их фотографий) и зародышей, микроинъецированных мРНК нoггин2 с пробами мРНК приведенных генетических маркеров, показывает усиление нейральной (В, Г) и подавление эпидермальной (Д) и мезодермальной (E, Ж) дифференцировок. Сигнал гибридизации iп situ показан темно-фиолетовым. 3. Эксплантаты вентральной маргинальной зоны (VMZ) зародышей, микроинъецированных вентральном РНК ноггинl удлиняются к концу нейруляции благодаря дифференцировке скелетной мускулатуры. И. Эксплантаты вентральной маргинальной зоны (VMZ) зародышей, микроинъецированных вентральном РНК нoггин2 к концу нейруляции сохраняют округлую форму.
На Фиг.2 показана схема (А) и результаты (Б) опытов по изучению эффектов ноггинl и нoггин2 в эксплантатах эмбриональных тканей. А. Схема экспериментов с эксплантатами эктодермы анимальной области зародышей (анимальные шапочки - AC) и эксплантатов вентральной маргинальной зоны зародышей (VMZ). Б. Обратная транскрипция - ПЦР анализ проб тотальной РНК эксплантатов эктодермы, анимальной области зародышей и эксплантатов вентральной маргинальной зоны зародышей, микроинъецированных мРНК ноггинl и нoггин2 с праймерами к нейроэктодермальным (NCAM, Xaпf-1), эпидермальным (kеrаtiή), мышечным (а-асtiή), постериорному мезодермальному (Ъrасhуиrу) и эндомезодермальному (сеrЪеrиs) молекулярным маркерам и Ef-Ia в качестве контроля количества мРНК. И ноггинl и нoггин2 активируют экспрессию нейральных маркеров (NCAM, Xaпf-1) и подавляют экспрессию эпидермального (kеrаtiή), в то время только мРНК ноггинl обнаруживает способность активировать экспрессию мышечного молекулярного маркера α-actin в эксплантатах вентральной маргинальной зоны.
На Фиг.З представлено различие между эффектами ноггинl и нoггин2 на экспрессию генов brасhуиrу, BF-I и Pax-6. (A5 Б, В, Г, Д, E) - результаты гибридизации iп sitи тотальных препаратов эмбрионов Хепорus lаеvis с зондами к соответствующим генам (сигнал гибридизации iп sitи показан черным); (A', Б', В',
Г', Д', E') - те же эмбрионы показаны под ультрафиолетовым освещением, что позволяет визуализировать микроинъецированные клетки, содержащие помимо мРНК метку - флюоресцеин- лизин- декстран (FLD). А, А'. Подавление экспрессии мезодермального молекулярного маркера (brасhуиrу) у зародышей, микроинъекцированных мРНК нoггин2. А - зеленый флуоресцентный краситель показывает распределение микроинъецированного материала. Б, Б'. Экспрессия мезодермального молекулярного маркера {brасhуиrу) у зародышей, микроинъецированных мРНК ноггинl не обнаруживают изменений по сравнению с контрольным зародышем (стрелка). В, В', Д, Д. Формирование дополнительной оси тела у зародышей, микроинъецированных 2-5 нг мРНК нoггин2 в один из вентральных бластомеров. Наличие экспрессии молекулярных маркеров BF-I и
Pax-6 указывает на наличие в дополнительных осях переднеголовных и глазных структур. Г, Г', E, E'. Дополнительные оси тела, формирующиеся при микроинъекциях 40 нг мРНК ноггинl в один из вентральных бластомеров зародыша не содержат переднеголовных и глазных структур.
На Фиг.4 приведены результаты анализа способности белка нoггин2 связываться с потенциальными белками-партнерами.
Белок нoггин2 проявляет способность связывать молекулы костного морфогенетического белка (BMP) и молекулы белка Сriрtо и не обнаруживает способность связывать молекулы активина и Хпr. Подробное описание экспериментов приведено в тексте примеров 4 и 5.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Используемый здесь термин "ортолог" обозначает полипептид или белок, полученный из одного вида, являющийся функциональной копией полипептида или белка другого вида. Различия последовательностей ортологов являются результатом видообразования.
Используемый здесь термин "гомолог" или "гомология" представляет собой термин, применяющийся в данной области для описания родства нуклеотидной или белковой последовательности другой нуклеотидной или белковой последовательности, определяемого посредством степени идентичности и/или подобия между указанными сравниваемыми последовательностями. Как обобщено выше, раскрыты способы изменения активности определенных представителей надсемейства ТGF-β и семейства EGF-CFC, а также композиции, содержащие белок нoггин2, кодирующую его нуклеиновую кислоту или антитела против нoггин2 для применения в них. Указанные способы и композиции для их практического применения могут быть использованы в ряде исследовательских, диагностических или терапевтических приложений, включающих в себя в качестве неограничивающих примеров ингибирование или уменьшение воспаления; регуляцию реконструкции кости во взрослом скелете; профилактику и лечение связанных с BMP нарушений у животных, в частности, людей; исследование и лечение сердечных заболеваний и неврологических нарушений.
Настоящее изобретение относится к применению конкретной функции нoггин2. На примере белка нoггин2 из Хепориs lаеvis с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2, авторы открыли, что нoггин2 играет роль в регуляции дифференцировки клеток и по действию и особым мишеням для связывания отличен от ноггинl и других известных антагонистов факторов роста, принадлежащего к надсемейству ТGF-β. Также авторами было обнаружено, что белки нoггин2 из Gаllиs gаllиs, имеющие последовательности SEQ ID NO: 6 и 8, обладают теми же биологическими свойствами, что и нoггин2 из Хепориs lаеvis. В отличие от ноггинl, нoггин2 подавляет общую дифференцировку эмбриональной мезодермы, ингибируя действие индукторов мезодермы поdаl/Хпг.
В то же время, подобно ноггинl, нoггин2 индуцирует развитие нервной ткани из эмбриональной эктодермы. Таким образом, нoггин2 обладает уникальной избирательной активностью в отношении индукции развития нервной ткани. Выявленная способность нoггин2 препятствовать дорзализующей активности ноггинl является результатом его δ
способности связываться с некоторыми, отличными от достоверно связывающихся с ноггинl BMP2, BMP4 или BMP7, факторами. В частности, дополнительным фактором, связывающимся с нoггин2, является представитель семейства эпидемальных ростовых факторов (EGF-CFC) фактор Сriрtо и родственные ему белки, активность которых необходима для индукции мышц из эмбриональной мезодермы.
Используемый здесь термин "нoггин2" означает белок, обладающий единственной и избирательной активностью в отношении индукции развития нервной ткани, связывающийся со специфичными для нoггин2 мишенями для связывания выбранными из группы, состоящей из BMP2, BMP4, BMP7, Сriрtо или их сочетания, и являющийся гомологом и ортологом белков нoггин2, выбранных из группы, состоящей из нoггин2 Хепориs lаеvis; нoггин2 Хепориs trорiсаlis; нoггин2 Fиgи rиbriреs; нoггин2 Gаllиs gаllиs (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8; соответственные Ассеssiоп Nоs в базе Gепе Вапk: AAX07470, AAX07471, AAX07474, AAX07476).
Специфичную для нoггин2 активность или функцию можно определить посредством известных подходов клеточной биологии в системах iп vitrо или iп vivо, например, анализы связывания iп vitrо, анализы в клеточной культуре, у животных (например, иммунный ответ, генная терапия, трансгенные животные и т.д.) и т.п. Анализы связывания включают в себя любой анализ, где оценивают специфическое молекулярное взаимодействие нoггин2 с мишенью для связывания. Мишень для связывания может представлять собой природную мишень для связывания или неприродную мишень для связывания, такую как специфичный иммунный белок, например, антитело. Как правило, специфичность связывания оценивают посредством биологического анализа (например, способность к индукции нервной ткани из инъецированной эмбриональной эктодермы) или определения константы связывания нoггин2 с его мишенями из надсемейства ТGF-β и т.д.
Под гомологом белка подразумевают белок, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере приблизительно на 68%, как правило, по меньшей мере приблизительно на 75% и наиболее часто по меньшей мере приблизительно на 85% идентичен известным аминокислотным последовательностям нoггин2, приведенными в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, как определено с применением алгоритма МеgАligп, DNАstаr сlustаl аlgоrithm, как описано в D. G. Нiggiпs апd Р.М. Shаrр, "Fаst апd Sепsitivе multiрlе Sеquепсе Аligпmепts on а Мiсrосоmрutеr", CABIOS5 5 рр. 151-3 (1989) (с применением параметров кратности 1, штрафа за пропуск 3, окна 5 и сохраненными диагоналями 5). Во многих осуществлениях представляющие интерес гомологи обладают гораздо большей идентичностью последовательности, например, 90% (например, 92%, 93%, 94%) или выше, например, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, особенно для последовательности аминокислот, формирующей функциональные области белка.
Таюке представляют интерес белки, в значительной степени идентичные белкам нoггин2, с аминокислотными последовательностями SEQ ID ЖNо 2, 4, 6, 8, где под значительной идентичностью подразумевают то, что аминокислотная последовательность белка идентична последовательности указанного белка по меньшей мере приблизительно на 68%, как правило, по меньшей мере приблизительно на 75% и наиболее часто по меньшей мере приблизительно на 80%, где в некоторых случаях идентичность может составлять более чем, например, 85%, 90%, 95% или более.
Представляющие интерес белки включают в себя встречающиеся в природе белки и рекомбинантные белки, содержащие аминокислотную последовательность нoггин2 или его функциональные белковые фрагменты, обладающие определимой анализом специфической активностью нoггин2. Таким образом, белки могут представлять собой делеционные мутанты природных белков нoггин2, и их можно получать в виде гибридных продуктов, содержащих полипептиды нoггин2 или его функциональные белковые фрагменты.
Под вышеуказанными белковыми фрагментами подразумевают полипептиды, как правило, длиной по меньшей мере приблизительно 30 аминокислот, как правило, длиной по меньшей мере приблизительно 50 аминокислот, предпочтительно длиной по меньшей мере приблизительно от 75 до 100 аминокислот и могут составлять в длину до 300 аминокислот или более, но, как правило, не превосходят длины 250 аминокислот, где фрагмент содержит участок аминокислотной последовательности, идентичный рассматриваемому белку, длиной по меньшей мере приблизительно 25 аминокислот, а, как правило, по меньшей мере 45 аминокислот, а во многих осуществлениях по меньшей мере 50 аминокислот. В некоторых осуществлениях, рассматриваемые полипептиды составляют в длину приблизительно 25 аминокислот, приблизительно 50, приблизительно 75, приблизительно 100, приблизительно 125, приблизительно 150, приблизительно 200 или приблизительно 250 аминокислот, вплоть до полноразмерного белка. Представляющие интерес фрагменты сохраняют все или по существу все специфические функции белка дикого типа.
Также представляют интерес белки, являющиеся мутантами или производными встречающихся в природе белков со специфической активностью нoггин2. Под мутантами понимают белки, полученные либо в результате ограниченной замены аминокислотных остатков в белках noggin2 (как правило, такая замена может затрагивать не более 20% всех аминокислотных остатков исходного белка), либо в результате делеций определенных фрагментов белков noggin2. Под производными белков понимают рекомбинантные белки, полученные на основе белков noggin2 или их фрагментов, к которым добавлены фрагменты иных белков. Мутанты и производные могут сохранять биологические свойства белков дикого типа (например, встречающихся в природе) или могут обладать биологическими свойствами, отличными от таковых белков дикого типа. Термин "биологическое свойство" белков по настоящему изобретению относится к биохимическим свойствам, таким как стабильность iп vivо и/или iп vitrо (например, период полураспада); скорость созревания, способность к агрегации или к формированию олигомеров и другим таким свойствам, но не ограничен ими. Мутации включают в себя замены отдельных аминокислот, делеций или вставки одной или нескольких аминокислот, укорочения или удлинения на N- конце, укорочения или удлинения на С-конце и т.п.
Также интерес представляет кодирующая нoггин2 нуклеиновая кислота, содержащая нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 (соответственные Ассеssiоп Nоs в базе Gепе Вапk: AY779052, AY779053, AY779056, AY779058) нуклеиновых кислот, в значительной степени идентичных указанным нуклеиновым кислотам, и их мутантам, производным и гомологам.
Под гомологом нуклеиновой кислоты подразумевают нуклеиновую кислоту, идентичную соответствующей нуклеотидной последовательности по меньшей мере приблизительно на 30%, а предпочтительно - приблизительно на 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% или выше, в т.ч. на 75%, 80%, 85%, 90% и 95% или выше. Контрольная последовательность составляет в длину, как правило, по меньшей мере приблизительно 30 нуклеотидов, более часто - по меньшей мере приблизительно 60 нуклеотидов и может достигать длины полной последовательности, подлежащей сравнению. Сходство последовательностей рассчитывают, основываясь на контрольной последовательности. В данной области известны такие алгоритмы для анализа последовательности, как BLAST, описанный в Аltsсhul еt аl., J. MoI. Вiоl., 215, рр. 403-10 (1990) (например, с применением значений по умолчанию, т.е. параметров w=4 и T=I 7).
Источником гомологичных нуклеиновых кислот и белка может являться любой вид растений или животных, или последовательность можно целиком или частично синтезировать, включая в нее аналоги нуклеиновых кислот.
Мутанты или производные белков и нуклеиновых кислот нoггин2 можно образовывать с применением стандартных способов молекулярной биологии к матричной нуклеиновой кислоте, кодирующей белок нoггин2, посредством изменения, делеции или добавления одного или нескольких нуклеотидов матричной последовательности или их сочетания, для образования варианта матричной нуклеиновой кислоты. Замены, добавления или делеции можно вносить любым известным в данной области способом (см., например, Gustiп еt аl., Вiоtесhшquеs (1993) 14: 22; Ваrапу, Gепе (1985) 37: 111-123 и Соliсеlli еt аl., MoI. Gеп. Gепеt. (1985) 199:537-539, Sаmbrооk еt аl., Моlесulаr Сlопiпg: А Lаbоrаtоrу Мапuаl, (1989), CSH Рrеss, рр. 15.3-15.108), представляющим собой ПЦР с ошибками, перестановку, олигонуклеотид-направленный мутагенез, сборочный ПЦР, мутагенез посредством половой ПЦР, мутагенез iп vivо, кассетный мутагенез, рекурсивный групповой мутагенез, экспоненциальный групповой мутагенез, сайт-направленный мутагенез, случайный мутагенез, перестановку генов, насыщающий мутагенез генных участков (GSSM), перестановку искусственным лигированием (SLR) или их сочетание. Замены, добавления или делеции также можно вводить способом, предусматривающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, мутагенез с применением модифицированной фосфотиоатом ДНК, мутагенез с применением содержащей урацил матрицы, мутагенез с применением разрыва дуплекса, мутагенез с применением восстановления точечных несоответствий, мутагенез с применением штамма- хозяина с недостаточностью системы восстановления, химический мутагенез, радиогенный мутагенез, мутагенез посредством делеций, мутагенез с применением рестрикции-отбора, мутагенез с применением рестрикции-очистки, синтез искусственных генов, групповой мутагенез, создание мультимеров химерной нуклеиновой кислоты и их сочетание.
Кроме того, могут быть получены вырожденные варианты кодирующих белки нoггин2 нуклеиновых кислот. Вырожденные варианты нуклеиновых кислот содержат замены кодонов нуклеиновой кислоты на другие ко доны, кодирующие те же аминокислоты. Конкретно, вырожденные варианты нуклеиновых кислот получают для усиления их экспрессии в клетке-хозяине. В данном осуществлении кодоны нуклеиновой кислоты, не являющиеся предпочтительными или менее предпочтительные в генах клетки-хозяина замещают наиболее представленными в кодирующих последовательностях клетки-хозяина кодонами, где указанные замещенные кодоны кодируют ту же аминокислоту.
Производные также можно получать с применением стандартных способов, включающих в себя изменение РНК, химические модификации, посттрансляционные и посттранскрипционные модификации и т.п. Например, производные можно получать с применением такие способов как изменение профиля фосфорилирования или гликозилирования или ацетилирования или липидизации или с применением различных типов расщепления зрелых форм и т.п.
Представляющие интерес белки и фрагменты являются выделенными, т.е. существуют вне природной среды. Рассматриваемые белки и белковые домены можно синтезировать или получать посредством рекомбинантных технологий или выделять из их природной среды. Для биохимического синтеза, молекулярной экспрессии и очистки указанных композиций существует множество молекулярных и биохимических способов, см., например Моlесulаr Сlопiпg, А Lаbоrаtоrу Мапuаl (Sаmbrооk, еt аl., CoId Sрriпg Наrbоr Lаbоrаtоrу), Сurrепt Рrоtосоls iп Моlесulаr Вiоlоgу (Еds. Аusubеl, еt аl., Grеепе Рubl. Аssос, Wilеу- Iпtеrsсiепсе, NY).
В предпочтительных осуществлениях белки по настоящему изобретению представляют собой рекомбинантные белки, полученные с помощью стандартных подходов с применением кодирующей нoггин2 нуклеиновой кислоты, например, нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 3, 5 или 7. Упоминаемая здесь молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулы ДНК, такие как молекулы геномной ДНК или молекулы кДНК или молекулы РНК, такие как молекулы мРНК. Конкретно, указанные молекулы нуклеиновой кислоты представляют собой молекулы кДНК с открытой рамкой считывания, кодирующие белок нoггин2 по настоящему изобретению или его функциональный фрагмент и способны в подходящих условиях экспрессироваться в качестве активного нoггин2 или функционального домена нoггин2 по настоящему изобретению.
Представляющая интерес геномная последовательность может содержать нуклеиновую кислоту, находящуюся между инициирующим кодоном и стоп- кодоном, как определено в перечисленных последовательностях, включающую в себя все интроны, в норме присутствующие в исходной хромосоме. Представляющая интерес геномная последовательность может включать в себя 5'- и З'-нетранслируемые области, находящиеся в зрелой мРНК, а также специфические транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности, такие как промоторы, энхансеры и т.д., включая в себя приблизительно 1 т.п.н., но возможно больше, фланкирующей геномной ДНК или на 5'- или на З'-конце транскрибируемой области.
Рассматриваемые нуклеиновые кислоты можно выделять и получать в существенно очищенной форме. Термин "существенно очищенная форма" означает, что нуклеиновые кислоты являются по меньшей мере приблизительно на 50% чистыми, как правило - по меньшей мере на 90% чистыми и, как правило, являются "рекомбинантными", т.е. фланкированы одним или несколькими нуклеотидами, с которыми они в норме не ассоциированы в природной хромосоме в их природном организме-хозяине. Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, соответствующие кДНК, полноразмерные гены и конструкции можно получать искусственно посредством различных протоколов, известных специалистам в данной области. Соответствующие конструкции нуклеиновых кислот очищают с применением стандартных способов рекомбинантных ДНК, например, как описано в Sаmbrооk еt al.5 Моlесulаr Сlопiпg: А Lаbоrаtоrу Мапuаl, 2nd Ed., (1989) CoId Sрriпg Наrbоr Рrеss, CoId Sрriпg Наrbоr, NY, и по правилам, описанным, например, в Uпitеd Stаtеs Dерt. оf HHS, National Institute of Health (NIH) Guidеliпеs fоr Rесоmbiпапt DNA Rеsеаrсh.
Также интерес представляют химерные белки, содержащие нoггин2 или его фрагменты, слитые, например, с последовательностью деградации, сигнальным белком или любым белком или полипептидом представляющим интерес. Слитые белки могут содержать, например, белок нoггин2 и второй полипептид ("партнер по слиянию"), объединенные в одну рамку считывания на N-конце и/или С-конце полипептида нoггин2. Партнеры по слиянию включают в себя в качестве неограничивающих примеров полипептиды, способные связывать антитела, специфичные к партнеру по слиянию (например, эпитопные метки), антитела или их связывающие домены, полипептиды, обеспечивающие каталитическую функцию или индукцию клеточного ответа, лиганды или рецепторы или их миметики и т.п. В таких слитых белках партнер по слиянию, как правило, ассоциирован с частью гибридного белка, являющейся белком нoггин2, неприродным способом и, как правило, не является белком нoггин2 по настоящему изобретению или их производным/фрагментом. Также интерес представляют нуклеиновые кислоты, кодирующие описанные выше гибридные белки.
Также раскрыты вектор и другие конструкции нуклеиновых кислот, содержащие кодирующую нoггин2 нуклеиновую кислоту. Применимые векторы включают в себя вирусные и невирусные векторы, плазмиды, космиды, фаги и т.д., предпочтительно плазмиды, и их применяют для клонирования, амплификации, экспрессии, переноса и т.д. последовательности нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в подходящем хозяине. Выбор подходящего вектора хорошо известен специалисту в данной области, а многие такие векторы имеются в продаже. Для получения конструкций частичную или полноразмерную нуклеиновую кислоту встраивают в вектор, обычно посредством присоединения ДНК-лигазой к расщепленному ферментом рестрикции участку в векторе. Альтернативно, желательную нуклеотидную последовательность можно встраивать посредством гомологичной рекомбинации iп vivо, как правило, посредством присоединения к вектору по бокам желаемой нуклеотидной последовательности областей гомологии. Например, области гомологии добавляют посредством лигирования нуклеотидов или посредством полимеразной цепной реакции с применением праймеров, содержащих область гомологии и часть желаемой нуклеотидной последовательности.
Также раскрыты экспрессирующие кассеты или системы, в числе прочего применяемые для получения белка нoггин2 или его гибридного белка или для репликации молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Экспрессирующая кассета может существовать в качестве внехромосомного элемента или ее можно интегрировать в геном клетки как результат введения указанной кассеты в клетку. Для экспрессии продукт гена, кодируемого нуклеиновой кислотой по изобретению, экспрессируют в любой подходящей экспрессирующей системе, включая, например, бактериальные, дрожжевые системы, системы насекомых, амфибий или млекопитающих. В экспрессирующем векторе нуклеиновую кислоту по изобретению функционально связывают с регуляторной последовательностью, которая может содержать промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы. Способы получения экспрессирующих кассет или систем, способных экспрессировать желаемый продукт, хорошо известны специалистам в данной области. Клеточные линии, стабильно экспрессирующие нoггин2, можно отобрать посредством хорошо известных в данной области способов (например, совместной трансфекцией с селективным маркером, таким как dhfr, gрt, неомицин, гигромицин, обеспечивающим идентификацию и выделение трансфицированных клеток, содержащих интегрированный в геном ген). Описанные выше экспрессирующие системы можно применять у прокариотических или эукариотических хозяев. Для получения белка можно использовать такие клетки-хозяева как E. соli, В. sиbtilis, S. сеrеvisiае, клетки насекомых в сочетании с бакуловирусными векторами или клетки высших организмов, таких как позвоночные, например, клетки C0S7, HEK293, CHO, ооιщτы Xeпopus ~Α т.д.
Когда для репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот по изобретению применяют любые из указанных выше клеток-хозяев или другие применимые клетки-хозяева или организмы-хозяева, образующиеся в результате реплицированная нуклеиновая кислота, экспрессированный белок или полипептид подпадают под объем изобретения как продукт клетки-хозяина или организма-хозяина. Продукт можно выделить любыми известными в данной области подходящими способами. Также раскрыты антитела, специфично связывающиеся с нoггин2 по настоящему изобретению. Применимые антитела можно получать с применением известных в данной области способов. Например, поликлональные антитела можно получать, как описано в Наrlоw апd Lапе Апtibоdiеs: А Lаbоrаtоrу Мапuаl, (1988) CoId Sрriпg Наrbоr Lаbоrаtоrу Рrеss, CoId Sрriпg Наrbоr, Nеw Yоrk, а моноклональные антитела можно получать, как описано в Goding Monoclonal Апtibоdiеs: Рriпсiрlеs апd Рrасtiсе: Рrоduсtiоп апd Аррliсаtiоп оf Monoclonal Апtibоdiеs iп CeIl Вiоlоgу, Вiосhеmistrу апd Immuпоlоgу; Зrd еditiоп, (1996) Асаdеmiс Рrеss. Также представляют интерес гибридные антитела, включающие в себя гуманизированные антитела, а также одноцепочечные антитела и такие фрагменты антител как Fv, F(ab')2 и Fаb.
Hoггин2, а также другие описанные выше компоненты настоящего изобретения находят применение во множестве различных приложений, включающие в себя применение в качестве иммуногенов, мишеней в скринирующих анализах, биологически активных веществ для модуляции клеточного роста, дифференцировки и/или функционирования и т.д.
В предпочтительном осуществлении настоящее изобретение относится к способу изменения активности специфичных для нoггин2 мишеней (например, BMP2, BMP4, BMP7, Сriрtо или их сочетания), предусматривающему введение достаточного количества нoггин2, антител против нoггин2 или их сочетания в указанный организм, ткань или клетку, где указанные сочетания изменяют активность специфичных для нoггин2 мишеней (т.е. введение нoггин2 приводит к ингибированию активности этих мишеней, тогда как введение антитела приводит к увеличению их активности).
В одном осуществлении настоящее изобретение относится к способу блокирования активности специфичных для нoггин2 мишеней, предусматривающему введение нoггин2 в указанный организм, ткань или клетку в количестве достаточном для ингибировании или снижения активности специфичных для нoггин2 мишеней посредством препятствия связыванию указанных мишеней или их фрагментов со специфическими белковыми рецепторами.
В другом осуществлении настоящее изобретение относится к способу увеличения активности специфичных для нoггин2 мишеней, предусматривающему введение антител к нoггин2 в указанный организм, ткань или клетку в количестве достаточном для увеличения активности специфичных для нoггин2 мишеней посредством связывания нoггин2.
В предпочтительном осуществлении представленные способы и композиции используются для модификации клеточной дифференцировки. В частности, способ для модификации клеточной дифференцировки предусматривает приведение клетки или окружающей клетку среды в контакт с белком нoггин2 в таких в условиях, когда нoггин2 специфически взаимодействует со своими мишенями - компонентами среды и/или внеклеточной поверхности, для осуществления изменения клеточной дифференцировки. В одном предпочтительном осуществлении используется экзогенный белок нoггин2; в другом предпочтительном осуществлении используется экспрессирующая конструкция, содержащая кодирующую нoггин2 нуклеиновую кислоту под контролем подходящего промотора. Белок нoггин2 может быть добавлен в среду культивирования iп vitrо и физиологические жидкости, такие как кровь, синовиальная жидкость и т.д. Белок можно также вводить или экспрессировать в конкретных популяциях клеток любым подходящим способом, таким как микроинъекция, зависимая от промотора экспрессия рекомбинантного фермента, целенаправленная доставка липидных частиц и т.д. Данные способы можно применять для снижения нежелательного остеогенеза, ингибирования роста клеток, требующего морфогенетического белка (например, зависимые от BMP нейробластомы и глиомы), регулирования образования и роста хряща, изменения зависимых от морфогена направления развития/дифференцировки клеток в культуре, таких как клетки для трансплантации или инфузии и т.д. Так как нoггин2 обуславливает активность в отношении индукции нервной ткани, он может быть применим для лечения периферических нейропатий при росте спинного мозга и отростков чувствительных нейронов, например, его можно включать в терапевтическое лечение для регенерации отростков нейронов после инсультов, повреждения головного мозга, вызванного травмами головы, и паралича, вызванного травмами спинного мозга. Применение также может состоять в лечении нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и рассеянный склероз, посредством стимуляции отростков нейронов. Дополнительные применения могут включать в себя восстановление рассеченных аксонов, что часто происходит в очагах повреждения при рассеянном склерозе.
Как антагонист ряда факторов роста (например, BMP2, BMP4, BMP7, Сriрtо или их сочетания) нoггин2 или его фрагмент находит применение в качестве супрессора активности этих факторов, например, морфогенетического костного белка (BMP), и эпидермального фактора роста Сriрtо или их гомологов. Предпочтительно, изобретение относится к способу противодействия функционированию указанной специфической мишени, предусматривающему приведение указанной мишени в контакт с белком нoггин2 или его фрагментом. Способ по изобретению осуществляют в условиях, когда нoггин2 или его фрагмент связываются со специфической мишенью. В качестве антагониста BMP, нoггин2 может быть применим для профилактики или лечения связанных с BMP нарушений у животных, в частности, у людей. Например, нoггин2 может быть использован для лечения заболеваний или нарушений, которые включают в себя в качестве неограничивающих примеров прогрессирующую оссифицирующую фибродисплазию (FOP), а также для лечения аномального роста кости, такого как патологический рост кости после операции замещения тазобедренного сустава, травмы, ожогов или повреждения спинного мозга. Кроме того, нoггин2 может быть применим для лечения или профилактики нежелательных воздействий BMP, ассоциированных с аномальным ростом кости, наблюдаемым в связи с метастазирующим раком простаты или остеосаркомой. Так как известно, что содержание лиганды BMP2 и BMP4 значительно увеличивается при астме (Rоsепdаhl еt аl, Am J Rеsрir CeIl MoI Вiоl. 2002 Aug;27(2): 160-9) и при некоторых других воспалительных заболеваниях, в частности, при ревматоидном артрите (Lоriеs еt аl., Аrthritis Rhеum. 2003 Oct;48(10):2807-18.), то нoггин2 можно также применять для связывания BMP и, таким образом, для лечения воспалительных синдромов.
Так как нoггин2 может связывать и, тем самым, подавлять активость белка Сriрtо, он также находит применение для профилактики и лечения раковых опухолей, формирование которых у позвоночных связано с аномальным повышением активности данного эпидермального фактора роста. В частности, представляется возможным использование нoггин2 вместо применяемых на сегодняшний день моноклональных антител и антисмысловых РНК для лечения широкого спектра раковых опухолей, таких как опухоли груди, матки, желудка, поджелудочной железы, легких, яичников и других.
Кроме того, нуклеиновые кислоты, белки, фрагменты и антитела к нoггин2 по изобретению можно применять для изменения активности специфичных для нoггин2 мишеней у животных, в частности, у людей. Представляющие интерес композиции могут включать белок нoггин2, например рекомбинантный очищенный белок. Указанная композиция также может содержать пригодный фармацевтический носитель для системного или локального введения iп vivо любым пригодным способом, включающим в себя в качестве неограничивающих примеров инъекцию (например, внутривенную, интраперитонеальную, внутримышечную, подкожную, эндоневральную, периневральную, интраспинальную, внутрижелудочковую, интравитреально, интратекально и т.д.), всасыванием через эпителиальные или слизисто-кожные выстилки (например, через слизистую ротовой полости, ректальную или кишечную слизистую и т.д.) или имплантантов с замедленным высвобождением, включающих в себя клеточные или тканевые имплантанты. В зависимости от способов введения композиция может содержать жидкий носитель, такой как физиологический раствор, являться заключенной в липосомы, микрокапсулы, полимерные или основанные на парафине препараты с контролируемым высвобождением, или являться сформулированным в формы таблетки, пилюли или капсулы. Концентрация применяемого активного ингpeдиeнтa(oв) зависит от типа заболевания или признаков, которые подвергаются воздействию, от применяемого способа введения, а так же от особенностей биологической системы. Эффективные дозы можно получить экстраполяцией кривых "доза- ответ", полученных в тестовых системах iп vitrо или на животных моделях. Используемый здесь термин "эффективное количество" или "эффективная доза" обозначает количество белка необходимое для достижения биологического эффекта, т.е. подавления функции указанных выше представителей суперсемейства ТGF-бета. Биологический эффект может выражаться в уменьшении признаков, симптомов или устранении причин заболевания или любых иных изменениях биологической системы. Обычно, эффективная доза находится в пределах от 0,1-100 мг/кг субъекта.
Введение может приводить к распределению нoггин2 в организме или в локализованной области. Например, при многих состояниях, вовлекающих дистальные области нервной системы можно применять внутривенной или интратекальное введение нoггин2. Альтернативно, и не в качестве ограничения, когда вовлечены локализованные области нервной системы, можно применять локальное введение. В таких ситуациях в конкретную область или рядом с ней можно поместить содержащий нoггин2 имплантант. Пригодные имплантанты включают в себя в качестве неограничивающих примеров желатиновую губку, воск или имплантанты, основанные на микрочастицах.
Следующие ниже примеры предложены для иллюстрации, а не с целью ограничения. Пример 1. Клонирование кДНК нoггин2 кДНК нoггин2 клонировали во время поиска генов Хепориs lаеvis, вовлеченных в регуляторную сеть гомеобокс-содержащего тeпaXaпf-1 (Zаrаiskу еt аl. Dеvеlорmепtаl Вiоlоgу 1992, v. 152, рр. 373-382; Еrmаkоvа еt аl, Dеvеlорmепt 1999, v. 126, рр. 4513-4523). Для выявления генетических мишеней Xaпf-1, авторы провели вычитающую гибридизацию образцов кДНК, полученных из эксплантатов передней эктодермы двух групп эмбрионов Хепориs: в одной группе, трансляцию Xaпf-1 и его псевдоаллеля у Хепориs lаеvis, Xaпf-2, снизили с применением микроинъекций 1 мМ морфолиновых олигонуклеотидов против Xaпf-1 (5'-ATCCTTTCTGAAGAGCAGGAGACAT И 5'- АТССТТТСТGGАGАССАGТАGАСАТ, Gепе Тооls); в другой группе, в эмбрионы посредством микроинъекции вводили контрольные морфолиновые олигонуклеотиды (МО), предоставленные Gепе Тооls Со. В эмбрионы Хепориs lаеvis на стадии двух бластомеров в анимальные полюса обоих бластомеров проводили микроинъекции МО против Хапfшш контрольных МО, смешанных с витальным красителем флюоресцеинлизиндекстраном (FLD). Для каждого из двух типов эмбрионов на стадии средней нейрулы, как описано в Zаrаiskу еt аl. Dеvеlорmепtаl Вiоlоgу 1992, v. 152, рр. 373-382, вырезали приблизительно 30 эксплантатов передней нейроэктодермы, взятые вместе с подлежащей энтомезодермой. Для операции выбирали только те эмбрионы, которые обладали равномерным сигналом FLD в передней области, вычитающую гибридизацию и дифференциальный скрининг проводили с использованием набора реактивов PCR Sеlесt kit (BD Сlопtесh). Вставки кДНК всех дифференцированно распределенных клонов (всего приблизительно 50) секвенировали и анализировали в режиме онлайн с применением программ BLAST по базам данных GепеВапk и JGI. В результате идентифицировали клон, содержащий полную кодирующую область белка нoггин2. кДНК, содержащую полную кодирующую область нoггин2 реамплифицировали в ПЦР с использованием праймеров 5'- АТТАССGGТGGGАGААССТТGТТСТТСАТТ-З1 и 51-
ATTCTCGAGTTAGCATGAACACTTACACTCTG-3' и субклонировали в вектор pSP64T (Рrоmеgа) по рестрикционным сайтам HindШ(тyпoй)/Age(тyпoй) и Хhоl/Sаll. Нуклеотидная и аминокислотные последовательности нoггин2 показаны в SEQ ID NO: 1 и 2. Пример 2. Воздействие нoггин2 на направление развития клеток
Вектор pSP64T, содержащий полную кодирующую часть кДНК нoггин2 (вектор pSP64T-нoггин2), был получен, как описано в примере 1.
Полную кодирующую последовательность ноггинl получали путем ПЦР- амшшфикации с образца кДНК Хепориs lаеvis с использованием ноггинl - специфичных праймеров 5'-T ATCC ATGGC ААGАААТСGGG AGC A-3' и 5'- АТТСТСGАGТСТС AGC ATGAGC ATTTGC A-31 и клонировали в вектор pSP64T (вектор pSP64T-нoггинl).
Синтетические мРНК нoггин2 и ноггинl получали с применением набора реактивов mМЕSSАGЕ MASHINE Kit (Аmbiоп) из векторов pSP64T-нoггин2 и вектора pSP64T-нoггинl соответственно, линеаризованных рестрикционной эндонуклеазой ЕсоRI (Fеrmепtаs). Воздействия микроинъекций мРНК нoггин2 на развитие Хепориs lаеvгs сравнивали с ранее описанными воздействиями инъекций мРНК ноггинl (Smith апd Наrlапd, CeIl 1992, v. 70, рр. 829-840; Lаmb еt аl., Sсiепсе 1993, v. 262, рр. 713-718; Smith еt аl., Nаturе 1993, v. 361, рр. 547-549). В ходе данных экспериментов мРНК ноггинl и нoггин2 инъецировали в указанные ниже бластомеры с применением микроинъектора Еррепdоrf.
Вентральные инъекции 40 пг мРНК ноггинl в ранние эмбрионы индуцировали вторичную ось тела (Фиг. IA, черная стрелка - первичная ось; серая стрелка - вторичная ось, эффект наблюдали в 68 из 85 подвергнутых микроинъекции эмбрионах), тогда как подобные инъекции мРНК нoггин2 (40 пкг) приводили к развитию грибовидных эмбрионов (Фиг.lБ, эффект наблюдали в 68 из 75 эмбрионах). Таким образом, в отличие от ноггинl (DaIe апd Slасk, Dеvеlорmепt 1987, v. 100, рр. 279-295; CeIl 1992, v. 70, рр. 829-840; Smith еt аl., Nаturе 1993, v. 361, рр. 547-549), нoггин2, несмотря на его предполагаемую способность связывать BMP, не индуцировал вторичной оси тела при инъекции его мРНК в оба вентральных бластомера 8-клeтoчныx эмбрионов. Вместо этого возникали аномальные грибовидные эмбрионы. Гибридизация iп sitи на тотальном препарате эмбрионов с инъекцией мРНК нoггин2 с зондами к мРНК нейральных (NCAM, Xaпf-1), эпидермальных (ген кератина), мышечных (ген α-актина) генетических маркеров и генетических маркеров поздней мезодермы (brасhуиrу) выявили гигантскую нейрализацию эктодермы и уменьшение мышечной и эпидермальной дифференцировки (Фиг.l В-Ж). Все вместе данные результаты указывают на то, что нoггин2 может нейрализовать эмбриональную эктодерму, но ингибирует дифференцировку дорзальной мезодермы и, таким образом, может препятствовать дорзализующему действию эндогенного ноггинl.
Авторы также применяли эксплантаты, полученные из вентральной краевой зоны (VMZ) эмбрионов на стадии ранней гаструлы, для анализа эффектов нoггин2 на дифференцировку мезодермы. Микроинъекция мРНК ноггинl вызывает сильное удлинение данных эксплантантов, преобразуя характер их вентральной мезодермы в мышечную мезодерму (дорзализация) (DaIe апd Slасk, Dеvеlорmепt 1987, v. 100, рр. 279-295; CeIl 1992, v. 70, рр. 829-840; Smith еt аl., Nаturе 1993, v. 361, рр. 547-549; Фиг. 13). В отличие от этого, подобно эксплантатам VMZ без инъекции, экспрессирующие нoггин2 или и ноггинl, и нoггин2 эксплантаты остаются округлыми (Фиг. Ш).
Для независимого тестирования воздействий нoггин2 на дифференцировку эктодермальных клеток авторы использовали обратную транскрипцию-ПЦР (OT- ПЦР) и сравнили экспрессию различных генетических маркеров в эксплантатах "наивной" эктодермы (анимальные шапочки - AC), извлеченных из эмбрионов на стадии ранней гаструлы, в которые посредством микроинъекции предварительно ввели мРНК ноггинl или нoггин2 (Фиг. 2 А, Б). Авторы также использовали эксплантаты, извлеченные из вентральной краевой зоны (VMZ) эмбрионов на стадии ранней гаструлы, для анализа воздействий нoггин2 на дифференцировку мезодермы (Фиг. 2 А, Б).
Эксплантаты AC извлекали из эмбрионов, подвергнутых инъекции, с применением микроножа и стеклянной палочки, как ранее описано в Zаrаiskу еt аl. Dеvеlорmепtаl Вiоlоgу 1992, v. 152, рр. 373-382. Все эксплантаты инкубировали в течение ночи в растворе 0,5xMMR. Из десяти эксплантатов каждого типа выделяли общую РНК и проводили ОТ-ПЦР, как описано в Zаrаiskу еt аl. Dеvеlорmепtаl Вiоlоgу 1992, v. 152, рр. 373-382. Использовали следующие праймеры: ген α-актина: 5'-GCTGACAGAATGCAGAAG И 5'- ТТGСТТGGАGGАGТGТGТ; brасhуиrу: 5'-GCTGGAAGTATGTGAATGGAG И 5'- ТТААGТGСТGТААТСТСТТСА; церберус: 5'-
GСТТТGGТАААТGСАТСТСТСТСС И 5'-GGTGACCAGTAAATCATACCTGCT; ген кератина XK81: S'-СТGААТААСАТGАGАGСТG И 5'- ТGGТТСТАGТТGТGGАТGТ; NCAM: 5'-CCTGCTTATGTGTATCGC И 5'- ТТСАСАGТАСТGGGСТGТGСТТ; Xaпf-1: описаны в Grорре еt аl., 2002.
ОТ-ПЦР на основе тотальной РНК из эксплантатов AC и VMZ эмбрионов, подвергнутых инъекции мРНК ноггинl или нoггин2, осуществляли с праймерами к маркерам нейроэкто дермы (NCAM, Xanf-1), эпидермиса (кератин), мышц (α- актин), поздней мезодермы (brасhуиrу) и энтомезодермы (церберус) и Ef- 1-α в качестве контроля (Фиг. 2Б). Было показано, что ноггинl и нoггин2 активируют экспрессию нейральных маркеров (NCAM, Xanf-1) и ингибируют эпидермальный маркер (кератин), тогда как только ноггинl активирует экспрессию мышечного маркера (α-актин) в эксплантатах VMZ. Таким образом, в данном анализе нoггин2 показал сильную нейрализующую активность подобную активности ноггинl (Smith апd Наrlапd, CeIl 1992, v. 70, рр. 829-840; Lаmb еt аl., Sсiепсе 1993, v. 262, рр. 713-718), индуцируя экспрессию маркеров передней части нервной системы, но ингибируя эпидермальный маркер. Способность нoггин2 нейрализовать эктодерму вкупе с его способностью подавлять дорзализующую активность ноггинl выглядит очень необычно и означает то, что нoггин2, кроме BMP, может связывать некоторые другие факторы, необходимые для дифференцировки мышц. Пример 3. Подавление дифференцировки эмбриональной мезодермы с использованием ноггинl Влияние микроинъекций мРНК нoггин2 на дифференцировку эмбриональной мезодермы оценивали, анализируя экспрессию универсального маркера ранних стадий развития мезодермы - гена brасhуиrу - на стадии ранней гаструлы Хепориs lаеvis. В ходе данных экспериментов мРНК ноггинl либо нoггин2, полученные как описано в примере 2, инъецировали в экваториальную область одного из вентральных бластомеров на стадии 8 бластомеров в количестве 40 иг с применением микроинъектора Еррепdоrf.
Результаты эксперимента приведены на Фиг. 3. Как видно из Фиг. ЗА и А', микроинъекции мРНК нoггин2 вызывают ингибирование экспрессии гена brасhуиrу в области микроинъекции, что свидетельствует о подавлении в этом месте дифференцировки эмбриональной мезодермы. В то же время, аналогичные микроинъекции мРНК ноггинl не вызывают ингибирование экспрессии brасhуиrу и, соответственно, подавления развития мезодермы (Фиг. 3 Б и Б').
Результаты этих экспериментов ясно свидетельствуют о том, что в отличие от ноггинl, нoггин2 обладает уникальной способностью подавлять дифференцировку эмбриональной мезодермы.
Пример 4. Ингибирование сигнального каскада BMP с помощью нoггин2
Способность нoггин2 ингибировать сигнальный каскад BMP оценивали по способности нoггин2 подавлять экспрессию основной генетической мишени этого каскада - гомеобоксного гена Vent2 — в эксплантатах эмбриональной эктодермы зародышей (AC эксплантаты), микроинъецированных смесью мРНК нoггин2 и мРНК BMP2, BMP4 либо BMP7. Учитывая литературные данные о том, что разные BMP способны проявлять повышенную активность, образуя гетеродимеры, в специальной серии опытов мРНК нoггин2 смешивали для микроинъекций с мРНК всех вышеуказанных BMP одновременно. В качестве контроля, аналогичные опыты проводили и с мРНК ноггинl.
Экспрессию гена Vent2 анализировали с помощью ОТ-ПЦР на основе тотальной РНК из AC эксплантатов, как описано в Примере 2. Использовали следующие Vent2-cпeцифичecкиe праймеры: 5'- АСТGААСАСААGGАСТААТАСА И 5'-AGAGGCCAGAGACTGCCCAA.
Было установлено, что нoггин2 способен подавлять активацию экспрессии Vent2, индуцируемую любым из указанных BMP, а так же их смесью.
Эти данные показывают, что нoггин2 является эффективным ингибитором BMP каскада.
Для прямого исследования способности белка нoггин2 связывать молекулы BMP в зародышах Х.lаеvis были экспрессированы активные формы нoггин2 и BMP4 в составе экспрессионных векторов pCS2-ЗMyc-noggin2 и pCS2-ЗFlag- BMP4, соответственно.
Для получения pCS2-ЗMyc-noggin2 вектора, нуклеотидная последовательность, кодирующая три аминокислотных последовательности эпитопа белка Мус (ЕQКLISЕЕDLЕQКLISЕЕDLЕQКLISЕЕDL), была вставлена с помощью ПЦР в кДНК нoггин2 непосредственно на 3' конец последовательности, кодирующей сигнальный пептид нoггин2. Для этого на первой стадии клонирования были получены соответственно 5' и 3' перекрывающиеся части кДНК нoггин2 в ПЦР с праймерами 5'-
AATTGGATCCGCCACCATGAAGAGGATAAATCTGC-3' и 5'-
GАGGТСТТССТССGАТАТСАGСТТСТGТТССАGАТССТСТТСАGАGАТGАGТ ТТСТGСТСАТААGGСТGАСАGСАССССТGА-З1, 5'-
GААСАGААGСТGАТАТСGGАGGААGАССТСGАGСАGАААСТСАТСТСТGАА GAGGATCTGCTCAGGCTTAGACCCTCT-3' и 5'-
ATTCTCGAGTTAGCATGAACACTTACACTCTG-3' соответственно. На второй стадии эти фрагменты кДНК были очищены от не включившихся праймеров, смешаны друг с другом, денатурированы нагреванием, отожжены и подвергнуты второму раунду ПЦР с концевыми праймерами 5'-
ААТТGGАТССGССАССАТGААGАGGАТАААТСТGС-З1 и 5'-
АТТСТСGАGТТАGС ATGAAC ACTTAC ACTCTG-3 ' . Полученная полноразмерная кДНК noggin2, содержащая последовательность, кодирующую три аминкислотных последовательности Мус, была клонирована в вектор pCS2 по рестриктным сайтам Ncol(тyпoй)/Agel(тyпoй) и Хhоl/Хhоl.
Для получения pCS2-ЗFlag-BMP4 вектора, нуклеотидная последовательность, кодирующая три аминокислотных последовательности Flаg (DYКDDDDКDYКDDDDКDYКDDDDК), была вставлена с помощью ПЦР в кДНК BMP4 непосредственно на 3' конец последовательности, кодирующей прорегион белка BMP4 Хепориs lаеvis. На первой стадии клонирования были получены 5' и 3' перекрывающиеся части кДНК BMP4 в ПЦР с праймерами 5'- AATTGGATCCGCCACCATGATTCCTGGTAACCGAATG-3' и 5'- TTTGTCATCATCGTCTTTGTAGTCCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTGTTT ТGGАСТТСТТТТТGАС-З1, 51-
GАСТАСАААGАСGАТGАТGАСАААGАТТАСААGGАТGАСGАСGАТААGСА GАGАССССGТААААААААС-З1 и 5'- ААТСТСGАGТСААСGGСАСССАСАСССТТССА-З1 соответственно. На второй стадии эти фрагменты кДНК были очищены от не включившихся праймеров, смешаны друг с другом, денатурированы нагреванием, отожжены и подвергнуты второму раунду ПЦР с концевыми праймерами 5'- ААТТGGАТССGССАССАТGАТТССТGGТААССGААТG-З1 и 51- ААТСТСGАGТСААСGGСАСССАСАСССТТССА-З1. Полученная полноразмерная кДНК BMP4, содержащая последовательность, кодирующую три аминокислотных последовательности эпитопа Flаg, была клонирована в вектор pCS2 по рестриктным сайтам Ncol(тyпoй)/Agel(тyпoй) и Хhоl/Хhоl.
600 пг синтетической мРНК ЗMyc-noggin2 и 600 пг синтетической мРНК ЗFlag-BMP4 были микроинъецированы в развивающиеся зародыши X. lаеvis на стадии 2-х бластомеров. В дальнейшем эти зародыши были инкубированы в растворе 0,1 MMR до стадии ранней гаструлы.
Выделение экспрессированных белков проводилось путем лизирования зародышей на стадии ранней гаструлы по методике, описанной в Тапеgаshimа еt аl., IпtJ.Dеv.Вiоl (2004) 48:275-283.
После выделения проводилась абсорбция экспрессированного белка ЗFlаg-
BMP4 на смоле Flаg-Аgаrоsе (Sigmа) согласно протоколу производителя. После промывки смолы в соответствии с протоколом производителя, наличие на этой смоле связавшегося белка ЗMyc-noggin2 анализировалось методом белкового блоттинга с помощью Мус-специфических моноклональных антител (Sigmа).
Данный эксперимент выявил способность молекул белка нoггин2 связывать молекулы белка BMP4 (Фиг. 4).
Таким образом, наблюдаемое в экспериментах ингибирование активности BMP каскада белком нoггин2 может осуществляться благодаря способности молекул нoггин2 напрямую связывать молекулы BMP.
Пример 5. Ингибирование сигнального каскада активин/поdаl с помощью нoггин2
Способность нoггин2 ингибировать сигнальный каскад активин/поdаl оценивали по способности нoггин2 подавлять экспрессию основной генетической мишени этого каскада - гена brасhуurу - в эксплантатах эмбриональной эктодермы зародышей (AC эксплантаты), микроинъецированных смесью мРНК нoггин2 и мРНК Хпrl, Xnr2, либо Xnr4 (гомологи гена поdаl млекопитающих). В качестве контроля, аналогичные опыты проводили с мРНК и ноггинl .
Экспрессию гена brасhуurу анализировали с помощью ОТ-ПЦР по общей РНК из AC эксплантатов, как описано в Примере 2.
Было установлено, что нoггин2 способен подавлять активацию экспрессии brасhуurу, индуцируемую любым из указанных Хпr. Эти данные демонстрируют способность нoггин2 ингибировать не только сигнальный каскад BMP, но и каскад, активируемый другими членами большого надсемейства ТGF-β факторов - активин/поdаl.
Для исследования способности белка нoггин2 связывать молекулы белков асtiviп и Хпr в зародышах X. lаеvis были экспрессированы активные формы нoггин2, асtiviп и Хпr в составе экспрессионных векторов pCS2-ЗMyc-noggin2, pCS2-ЗFlag-activin и pCS2-ЗFlag-Xnr2, соответственно.
Получение pCS2-ЗMyc-noggin2 вектора было осуществлено, как описано в Примере 4.
Для получения pSP64T-ЗFlag-activin вектора, нуклеотидная последовательность, кодирующая три аминокислотных последовательности Flаg (DYКDDDDКDYКDDDDКDYКDDDDК), была вставлена с помощью ПЦР в кДНК асtiviп-В непосредственно позади последовательности, кодирующей прорегион белка асtiviп-В Хепориs lаеvis. На первой стадии клонирования были получены 5' и З1 перекрывающиеся части кДНК асtiviп-В в ПЦР с праймерами 5'- aattGGATCCGCCACCatggctctcctgttactgcctctg-3' и 5'-
ТТТGТСАТСАТСGТСТТТGТАGТССТТАТСGТСGТСАТССТТGТААТССТСGА GGССТСТСТТАСGGА-З1, 5'-
GАСТАСАААGАСGАТGАТGАСАААGАТТАСААGGАТGАСGАСGАТААGТG СGАТGGАСАСАСАААТТ-З1 и 5'- ААТGААТТСАТGСАСАGССGСАСТСGТССА-З1 соответственно. На второй стадии эти фрагменты кДНК были очищены от не включившихся праймеров, смешаны друг с другом, денатурированы нагреванием, отожжены и подвергнуты второму раунду ПЦР с концевыми праймерами 5'- aattGGATCCGCCACCatggctctcctgttactgcctctg-31 и 5'-
AATGAATTCATGCACAGCCGCACTCGTCCA-3'. Полученная полноразмерная кДНК асtiviп-В, содержащая последовательность, кодирующую три аминокислотных последовательности эпитопа Flаg, была клонирована в вектор pSP64T по рестриктным сайтам HindШ(тyпoй)/AgeI(тyпoй) и ЕсоRI/ЕсоRI.
Для получения pCS2-ЗFlag-Xnr2 вектора, нуклеотидная последовательность, кодирующая три аминокислотных последовательности Flаg (DYКDDDDКDYКDDDDКDYКDDDDК), была вставлена с помощью ПЦР в кДНК Xnr2 непосредственно на 3' конец последовательности, кодирующей прорегион белка Xnr2 Хепориs lаеvis. На первой стадии клонирования были получены 5' и 3' перекрывающиеся части кДНК BMP4 в ПЦР с праймерами 5'- ААТТGGАТССGССАССАТGGСААGССТАGGАGТСАТСТТG-З1 и 5'-
ТТТGТСАТСАТСGТСТТТGТАGТССТТАТСGТСGТСАТССТТGТААТСGGТАТ ТТТТСGТТТТТТGGТТ-З1, 5'-
GАСТАСАААGАСGАТGАТGАСАААGАТТАСААGGАТGАСGАСGАТААGАТ ТGТСАТGААСАССАТСССТ-З1 и 5'-
ААТСТСGАGТСАGТТАСАТССАСАСТСАТССА-З1 соответственно. На второй стадии эти фрагменты кДНК были очищены от не включившихся праймеров, смешаны друг с другом, денатурированы нагреванием, отожжены и подвергнуты второму раунду ПЦР с концевыми праймерами 5'-
ААТТGGАТССGССАССАТGАТТССТGGТААССGААТG-З1 и 5'-
ААТСТСGАGТСААСGGСАСССАСАСССТТССА-З1. Полученная полноразмерная кДНК Xnr2, содержащая последовательность, кодирующую три аминокислотных последовательности эпитопа Flаg, была клонирована в вектор pCS2 по рестриктным сайтам Ncol(тyпoй)/Agel(тyпoй) и Хhоl/Хhоl.
Анализ способности экспрессированного белка ЗMyc-noggin2 связывать молекулы белков ЗFlаg-асtiviп-В и ЗFlag-Xnr2 бьш проведен с помощью специфических антител по методике, описанной в Примере 4. Данный эксперимент не выявил способность молекул белка нoггин2 связывать молекулы белков асtiviп и Xnr2 (Фиг.4).
В связи с этим была исследована способность молекул белка нoггин2 связывать молекулы белка кофактора Сriрtо из семейства эпидермальных факторов роста EGF-CFC. Наличие данного кофактора необходимо для нормального функционирования активин/поdаl каскада.
Для исследования способности белка нoггин2 связывать молекулы белка Сriрtо в зародышах X. lаеvis были экспрессированы активные формы нoггин2 и Сriрtо в составе экспрессионных векторов pCS2-ЗMyc-noggin2, pCS2-ЗFlag-Cripto, соответственно.
Получение pCS2-ЗMyc-noggin2 вектора было осуществлено, как описано в Примере 4.
Вектор для синтеза мРНК ЗFlаg-Сriрtо был описан в Тапеgаshimа еt аl., Iпt. J. Dеv. Вiоl. 2004, v. 48, рр. 275-283
Анализ способности экспрессированного белка pCS2-ЗMyc-noggin2 связывать молекулы белка ЗFlаg-Сriрtо был проведен с помощью специфических антител по методике, описанной в Примере 4.
Данный эксперимент выявил способность молекул белка нoггин2 связывать молекулы белка Сriрtо (Фиг. 4).
Таким образом, механизм ингибирования активин/поdаl каскада фактором нoггин2 отличен от такового для BMP каскада и осуществляется не путем прямого связывания молекул активина или поdаl молекулами нoггин2, а благодаря способности нoггин2 связывать молекулы кофактора Сriрtо, присутствие которого необходимо для нормального функционирования данного каскада (Фиг. 4). Выявленная способность нoггин2 связывать фактор Сriрtо может иметь большое биомедицинское значение.
Пример 6. Одновременное ингибирование сигнальных каскадов BMP и активин/поdаl и индукция головных структур с использованием нoггин2 Как известно, дифференцировка структур главной оси тела позвоночных, ингибируется на брюшной стороне эмбриона в результате перманентной активации двух основных ТGF-β-каскадов: BMP и активин/поdаl. При этом селективное ингибирование BMP каскада приводит "по умолчанию" к развитию структур, характерных для туловищной и заднеголовной части оси тела. В частности, к развитию спинного мозга и мышц. В то же время, одновременное ингибирование как BMP, так и активин/поdаl каскадов, вызывает индукцию переднеголовных структур, в т.ч. глаз и переднего мозга. В нормальном развитии, подавление BMP каскада на спинной стороне эмбриона осуществляется специфическими белковыми факторами, секретируемыми клетками шпемановского организатора и способными связывать BMP. Наиболее известным из них является ноггинl. Микроинъекции мРНК ноггинl в вентральные вегетативные бластомеры эмбриона Хепорus способны вызывать развитие дополнительных туловищных структур на брюшной стороне тела эмбриона. При этом, вторые оси тела, индуцируемые экзогенным ноггинl, никогда не содержат переднеголовных структур, для развития которых необходимо одновременное ингибирование как BMP, так и активин/поdаl каскадов. В нормальном развитии, ингибирование активин/поdаl каскада, а так же тесно связанного с ним положительной обратной связью Wпt-сигнального каскада, осуществляется другими факторами, секретируемыми клетками головной части шпемановского организатора. Наиболее известными из них являются Dikkорf и церберус. Причем последний белок способен связывать сразу три фактора: BMP, поdаl и Wпt. В результате в ростральной части эмбриона снимается запрет на активацию программы переднеголовной дифференцировки и происходит развитие переднеголовных структур.
Способность нoггин2 ингибировать одновременно как каскад BMP, так и каскад активин/поdаl, указывает на потенциальную способность этого фактора индуцировать переднеголовные структуры. Однако, в опытах, описанных в Примере 2, подобный эффект мог быть маскирован сильным нейрализующим действием нoггин2, вызванным относительно высокими концентрациями микроинъецируемой мРНК.
В связи с этим, была изучена способность низких концентраций нoггин2 индуцировать развитие дополнительных переднеголовных структур в целых эмбрионах. В данной серии опытов синтетическую мРНК нoггин2, полученную так же, как описано в Примере 2, микроинъецировали в один из вентральных вегетативных бластомеров эмбрионов Хепорus lаеvis на стадии 8-16 бластомеров в количестве 2-5 пг. В результате, у 25% эмбрионов наблюдалось развитие дополнительного переднеголовного отдела. Как было показано с помощью метода гибридизации iп sitи со специфическими зондами к мРНК переднеголовных маркеров BF-I и Pax-6, такие дополнительные головные структуры включали конечный мозг и глаза (Фиг. 3 В и В1; Д и Д1). Аналогичные структуры отсутствовали в составе дополнительных осей тела, индуцированных микроинъекциями мРНК ноггинl (Фиг. 3, Г и Г1; E и E1). Эти данные демонстрируют качественное отличие эффектов нoггин2 от эффектов ноггинl, связанное со способностью нoггин2 ингибировать как BMP, так и активин/поdаl сигнальный каскад.
Пример 7. Получение рекомбинантного белка нoггин2 Для получения активного гомодимера нoггин2 осуществляли экспрессию нoггин2 в культуре эпителиальных клеток зеленой мартышки CV-I в составе экспрессионного вектора pcDNAЗ-6His-noggin2. Для получения рсDNАЗ-бНis- noggin2 вектора, нуклеотидная последовательность, кодирующая 6 аминокислотных остатков гистидина, была вставлена с помощью ПЦР в кДНК нoггин2 непосредственно позади последовательности, кодирующей сигнальный пептид нoггин2. На первой стадии клонирования были получены соответственно 5' и 3' перекрывающиеся части кДНК нoггин2 в ПЦР с праймерами 5'- АТТАССGGТGGGАGААССТТGТТСТТСАТТ-З1 и 5'-
GТGАТGGТGАТGGТGАТGСССGGGАТААGGСТGАСАGСАССССТ-З', и 5'- САТСАССАТСАССАТСАСGGGСССТАТСТСАGGСТТАGАСССТС-З' и 5'- ATTCTCGAGTTAGCATGAACACTTACACTCTG-3'. На второй стадии эти фрагменты кДНК были очищены от не включившихся праймеров, смешаны друг с другом, денатурированы нагреванием, отожжены и подвергнуты второму раунду ПЦР с праймерами З'-АТТАССGGТGGGАGААССТТGТТСТТСАТТ-З1 и 5'- ATTCTCGAGTTAGCATGAACACTTACACTCTG-3'. Полученная полноразмерная кДНК noggin2, содержащая последовательность, кодирующую 6 гистидинов, была клонирована в вектор рсDNАЗ по рестриктным сайтам Nсоl (тупой) и Хhоl. Эпителиальные клетки зеленой мартышки (CV-I) культивировали в
DMEM среде (Sigmа) с 10% сывороткой (Вiоlоt), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина при 370C и 1 атм. Для получения постоянной клеточной линии, продуцирующей 6His-noggin2, эти клетки были трансфицированы pcDNAЗ-6His-noggin2 вектором. Последующую селекцию проводили в среде, содержащей 1 мкг/мл генетицина (Gibсо BRL). Секретируемый рекомбинантный 6His-Noggin2 получали из культуральной среды при помощи аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе (Qiаgеп). Выход белка был оценен, как 50 мкг/миллион клеток в день. Активность белка подтверждали по его способности активировать нейрогенез в эксплантатах эмбриональной эктодермы.
Пример 8. Получение поликлональных. антител против нoггин2 кДНК, содержащую полную кодирующую область нoггин2, реамплифицировали как описано в примере 1, субклонировали в вектор рQЕЗО и использовали для трансформации Еsсhеriсhiа соli. Рекомбинантный белок, содержащий шесть гистидиновых остатков, очищали с использованием аффинной хроматографии на Таlоп Rеsiп (Сlопtесh Lаbоrаtоriеs, Iпс.) в денатурирующих условиях и использовали для иммунизации кроликов по стандартной технологии.
Поликлональную сыворотку тестировали против рекомбинантного белка с помощью методов ELISA и Вестерн-блота.
По аналогии с примерами 1-8, приведенными выше, авторами были исследованы белки нoггин2 из Gаllиs gаllиs, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 6 и 8, кодируемые нуклеиновыми кислотами, имеющими последовательности SEQ ID NO: 5 и 7 соответственно. Как было обнаружено, указанные белки нoггин2 из Gаllиs gаllиs проявляют те же биологические свойства, что нoггин2 Х.lаеvis.
Пример 9. Клонирование кДНК и получение рекомбинантного белка нoггин2 курицы (Gаllиs gаllиs)
Поскольку геномная последовательность нoггин2 лишена интронов, полноразмерная кодирующая область кДНК нoггин2 курицы (Gаllиs gаllиs) была получена из геномной ДНК курицы при помощи ПЦР с праймерами: 5'-
АТТАССGGТТGGАТGСGТССАGGGССGGGААG И 5'-
АТТСТСGАGGТGСТАGСАGGАGСАСТТGСАСТСGGА.
После очистки с помощью коммерческого набора PCR Рurifiсаtiоп Кit (Рrоmеgа) полученный фрагмент кДНК нoггин2 был клонирован в плазмиду pSP64T (Рrоmеgа) по рестрикционным сайтам HindШ(тyпoй)/Age(тyпoй) и Хhоl/Sаll.
Нуклеотидная последовательность нoггин2 была подтверждена секвенированием. Для получения белка нoггин2 осуществляли экспрессию нoггин2 в культуре эпителиальных клеток зеленой мартышки CV-I в составе экспрессионного вектора pcDNAЗ-6His-noggin2. Для получения рсDNАЗ-бНis- noggin2 вектора, нуклеотидная последовательность, кодирующая 6 аминокислотных остатков гистидина, была вставлена с помощью ПЦР в кДНК нoггин2 непосредственно позади последовательности, кодирующей сигнальный пептид нoггин2. На первой стадии клонирования были получены соответственно 5' и 3' перекрывающиеся части кДНК нoггин2 в ПЦР с праймерами 5'- ATTACCGGTTGGATGCGTCCAGGGCCGGGAAG-3' и 5'-
САТСАССАТСАССАТСАСТТССТGСGGСТGСGGСССТ-З1; 5'-
GТGАТGGТGАТGGТGАТGGGGСТGСССGGСGСССGGС-З1 и 5'-
АТТСТСGАGGТGСТАGСАGGАGСАСТТGСАСТСGGА -3'.
На второй стадии эти фрагменты кДНК были очищены от не включившихся праймеров, смешаны друг с другом, денатурированы нагреванием, отожжены и подвергнуты второму раунду ПЦР с праймерами 5'- АТТАССGGТТGGАТGСGТССАGGGССGGGААG-З1, и 5'-
ATTCTCGAGGTGCTAGCAGGAGCACTTGCACTCGGA-3'.
Полученная полноразмерная кДНК нoггин2 курицы, содержащая последовательность, кодирующую 6 гистидинов, была клонирована в вектор рсDNАЗ по рестриктным сайтам Nсоl (тупой) и Хhоl.
Эпителиальные клетки зеленой мартышки (CV-I) культивировали в DMEM среде (Sigmа) с 10% сывороткой (Вiоlоt), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина при 370C и 1 атм. Для получения постоянной клеточной линии, продуцирующей 6His-нoггин2, эти клетки были трансфицированы pcDNAЗ-6His-noggin2 вектором. Последующую селекцию проводили в среде, содержащей 1 мкг/мл генетицина (Gibсо BRL). Секретируемый рекомбинантный 6His-Noggin2 получали из культуральной среды при помощи аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе (Qiаgеп). Выход белка был оценен, как 70 мкг/миллион клеток в день. Активность белка подтверждали по его способности активировать нейрогенез в эксплантатах эмбриональной эктодермы Хепорus lаеvis.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ блокирования активности специфичных для нoггин2 мишеней в организме, ткани или клетке, предусматривающий введение нoггин2 или его гомолога, производного или фрагмента, обладающего той же активностью, что и нoггин2 в указанный организм, ткань или клетку в количестве, эффективном для ингибирования или снижения активности специфичных для нoггин2 мишеней.
2. Способ увеличения активности специфичных для нoггин2 мишеней в организме, ткани или клетке, предусматривающий введение антител против нoггин2 в указанный организм, ткань или клетку в количестве, эффективном для увеличения активности специфичных для нoггин2 мишеней.
3. Нуклеиновая кислота, имеющая последовательность SEQ ID NO: 5 и кодирующая белок, обладающий активностью нoггин2.
4. Нуклеиновая кислота, имеющая последовательность SEQ ID NO: 7 и кодирующая белок, обладающий активностью нoггин2.
5. Белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 и ингибирующий активность специфичных для нoггин2 мишеней.
6. Белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и ингибирующий активность специфичных для нoггин2 мишеней.
PCT/RU2006/000382 2005-07-21 2006-07-18 Procede de blocage d'activite des cibles specifiques a noggin2 WO2007011265A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2005123287 2005-07-21
RU2005123287/13A RU2354662C2 (ru) 2005-07-21 2005-07-21 Способ блокирования активности activin с помощью ноггин2

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2007011265A1 true WO2007011265A1 (fr) 2007-01-25
WO2007011265A8 WO2007011265A8 (fr) 2007-10-18

Family

ID=37669061

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2006/000382 WO2007011265A1 (fr) 2005-07-21 2006-07-18 Procede de blocage d'activite des cibles specifiques a noggin2

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2354662C2 (ru)
WO (1) WO2007011265A1 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2391352C1 (ru) * 2008-10-24 2010-06-10 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН СПОСОБ БЛОКИРОВАНИЯ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ, АКТИВИРУЕМОГО TGF-beta ФАКТОРОМ VgI В КЛЕТКАХ ЖИВОТНЫХ
RU2407799C1 (ru) * 2009-06-18 2010-12-27 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН СПОСОБ БЛОКИРОВАНИЯ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ, АКТИВИРУЕМОГО TGF-beta ФАКТОРОМ DERRIERE В КЛЕТКАХ ЖИВОТНЫХ

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL117175A (en) * 1995-02-20 2005-11-20 Sankyo Co Osteoclastogenesis inhibitory factor protein
WO2004064612A2 (en) * 2003-01-21 2004-08-05 The Rockefeller University Regulation of tgf-b signaling by tomoregulin

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE MEDLINE [online] FLETCHER R.B. ET AL.: "Expression of Xenopus tropicalis noggin1 and noggin2 in early development: two noggin genes in a tetrapod", XP003007557, Database accession no. (NLM15567718) *
DATABASE MEDLINE [online] FURTHAUER M. ET AL.: "Three different noggin genes antagonize the activity of bone morphogenetic proteins in the zebrafish embryo", XP003007556, Database accession no. (NLM10491267) *
DEV. BIOL., vol. 214, no. 1, 1 October 1999 (1999-10-01), pages 181 - 196 *
GENE EXPR. PATTERNS, vol. 5, no. 2, 2004, pages 225 - 230 *
LANGENFELD E.M. ET AL.: "The mature bone morphogenetic protein-2 is aberrantly expressed in non-small cell lung carcinomas and stimulates tumor growth of A549 cells", CARCINOGENESIS, vol. 24, no. 9, 2003, pages 1445 - 1454, XP003007558 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2354662C2 (ru) 2009-05-10
RU2005123287A (ru) 2007-01-27
WO2007011265A8 (fr) 2007-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Niclas et al. Cloning and localization of a conventional kinesin motor expressed exclusively in neurons
McCartney et al. Distinct cellular and subcellular patterns of expression imply distinct functions for the Drosophila homologues of moesin and the neurofibromatosis 2 tumor suppressor, merlin.
JP4222629B2 (ja) ニュールツリンおよび関連成長因子
JP7055637B2 (ja) ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体およびその使用
JPH10502527A (ja) ＴＧＦ−βファミリーの新規な成長／分化因子
JPH07250688A (ja) ＴＧＦ−βスーパーファミリー蛋白質をコードするヒト新規ｃＤＮＡ
JP2010187691A (ja) 哺乳類のトランスフォーミング増殖因子β−９
US5731167A (en) Autotaxin: motility stimulating protein useful in cancer diagnosis and therapy
WO1996026958A2 (en) Eph RECEPTOR LIGAND ELF-2
JP2000517179A (ja) Ｄｏｎ―１遺伝子およびポリペプチド、ならびにそれらの使用
WO2007011265A1 (fr) Procede de blocage d'activite des cibles specifiques a noggin2
AU2003288434B2 (en) Peptides, antibodies thereto, and their use in the treatment of central nervous system damage
EP4230652A1 (en) Anti-oscar antibody for preventing or treating osteoarthritis
WO2017032216A1 (zh) ACVR1-Fc融合蛋白及其制法和用途
AU710551B2 (en) Nucleic acid encoding a nervous tissue sodium channel
Eib et al. Expression of the follistatin/EGF-containing transmembrane protein M7365 (tomoregulin-1) during mouse development
KR20070059085A (ko) 세포 표면 당단백질
JP2002508666A (ja) 神経幹細胞遺伝子
US7939635B2 (en) Autotaxin: motility stimulating protein useful in cancer diagnosis and therapy
EP1132468B1 (en) MAST CELL-SPECIFIC SIGNAL TRANSDUCING MOLECULES AND cDNAS THEREOF
RU2407799C1 (ru) СПОСОБ БЛОКИРОВАНИЯ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ, АКТИВИРУЕМОГО TGF-beta ФАКТОРОМ DERRIERE В КЛЕТКАХ ЖИВОТНЫХ
CA2360530C (en) A human nuclear protein having a ww domain and a polynucleotide encoding the protein
RU2391352C1 (ru) СПОСОБ БЛОКИРОВАНИЯ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ, АКТИВИРУЕМОГО TGF-beta ФАКТОРОМ VgI В КЛЕТКАХ ЖИВОТНЫХ
JP2000300263A (ja) 血管新生に関連するタンパク質「４１０」および「ｎｅｗ」、ならびに該タンパク質をコードする遺伝子
US7285532B2 (en) Therapeutic method for treating bone formation diseases

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DPE2 Request for preliminary examination filed before expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 06784075

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

点击 这是indexloc提供的php浏览器服务，不要输入任何密码和下载