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WO2007003775A1 - Epitopes de la proteine hbsp et leurs applications biotechnologiques et medicales, notamment pour le traitement de l'hepatite b chronique - Google Patents

Epitopes de la proteine hbsp et leurs applications biotechnologiques et medicales, notamment pour le traitement de l'hepatite b chronique Download PDF

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WO2007003775A1
WO2007003775A1 PCT/FR2006/001532 FR2006001532W WO2007003775A1 WO 2007003775 A1 WO2007003775 A1 WO 2007003775A1 FR 2006001532 W FR2006001532 W FR 2006001532W WO 2007003775 A1 WO2007003775 A1 WO 2007003775A1
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WO
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hbsp
seq
amino acids
fragment
peptide
Prior art date
Application number
PCT/FR2006/001532
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Inventor
Marie-Louise Michel
Maryline Mancini-Bourgine
Florence Bayard
Patrick Soussan
Dina Kremsdorf
Original Assignee
Institut Pasteur
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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Filing date
Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P37/02—Immunomodulators
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present patent application relates to epitopes of the HBSP protein, and to their biotechnological and medical applications, in particular for the treatment of chronic hepatitis B.
  • the hepatitis B virus (HBV) of the Hepadnaviridae family is a 3.2 kb partially double-stranded DNA enveloped virus that has 4 ORFs from which mRNAs of different sizes are transcribed.
  • the 3.5 kb pregenomic mRNA codes for the capsid proteins (HBc, HBe), and for the polymerase (PoI), while the 2.4 kb, 2.1 kb mRNAs encode the three envelope proteins (HBs), and that of 0.7 kb protein X (HBx) (Seeger and Mason, 2000).
  • HBSP hepatitis B spliced protein
  • the HBSP protein is detected by immunohistochemistry in liver biopsies of chronic HBV carriers (Soussan et al., 2000), and 30-40% of them possess antibodies directed against the protein (Soussan et al., 2003). .
  • the present patent application relates to epitopes of the HBSP protein, and to their biotechnological and medical applications, in particular for the treatment of chronic hepatitis B. It proposes, in particular, peptides or polypeptides, mono- or poly-epitopic, which are capable of inducing an immune response directed against HBV, and in particular a cellular immune response, preferably a T (CD4 + T, TCD8 +) response, in particular a CD8 + T response.
  • Peptides or polypeptides according to the invention are capable of inducing or stimulating activation of CD4 + T cells, more particularly of inducing or stimulating the production of cytokines, for example type 1 cytokines such as NFN gamma, and / or type 2 cytokines.
  • Peptides or polypeptides according to the invention are especially capable of inducing activation of CD8 + T cells and / or an induction and / or stimulation of the differentiation of CD8 + T cells in CTL, and more particularly in CTL capable of specific lysis.
  • the peptides and polypeptides according to the invention comprise at least one fragment of HBSP, or at least one analog of such a fragment, or consist of such a fragment or the like.
  • the present invention also relates to the epitopes of this protein, to the oligonucleotides or polynucleotides encoding the peptides, polypeptides and epitopes according to the invention, to the vectors bearing such an oligonucleotide or polynucleotide, to the transfected host cells, infected and / or transformed by such oligonucleotide or polynucleotide, or by such a vector.
  • the present invention also relates to the therapeutic and / or preventive and / or palliative applications of the products according to the invention.
  • the peptides, polypeptides, epitopes, oligonucleotides, polynucleotides, vectors and host cells according to the invention indeed find applications of particular interest for therapeutic and / or preventive and / or palliative immunization against a disease or condition linked to a punctual or chronic infection with hepatitis B virus (HBV).
  • HBV hepatitis B virus
  • Figure 2 ELISPOT test performed on 9 HHD mice immunized with the pcDNA3-HBSP vector. The number of spots per million splenocytes is calculated by subtracting the median control wells (medium) from the median of the wells tested (with peptide). A minimum of 20 spots per million splenocytes is considered positive.
  • FIG. 3 Cytotoxic test performed on 6 HHD mice immunized with the pcDNA3-HBSP vector. After stimulation of splenocytes for seven days with peptides HBSP A2-1, HBSP A2-2 and PoI A2-2, these effector cells were put in the presence of autologous targets loaded with the specific peptide or control.
  • the graphs show the percentage of specific lysis at different effector / target ratios, i.e. the percentage obtained by subtracting the lysis of the control target from the lysis of the specific target. The result is positive when the percentage of specific lysis is greater than 10% for two consecutive reports.
  • FIG. 4 ELISPOT test performed on two sets of 6 HLA-B * 0702 mice (A to F and G to L) immunized with the vector pcDNA3-HBSP and sacrificed in independent experiments. As in the other ELISPOT assays, the number of spots is calculated by subtracting the median of the control wells from that of the stimulated wells and considered positive when it is greater than 20 per million splenocytes.
  • Figure 5 Cytotoxicity assay performed on HLA-B * 0702 mice demonstrating the high specific lysis (percentage of the lysis of the specific target minus the percentage of the lysis of the control target) in response to stimulation by HBSP B7 -1. For HBSS B7-1 stimulation, the graph represents only 5 of 11 mice tested, and for PoI B7-1 stimulation only 6 of 12 mice tested.
  • FIG. 6 IFN- ⁇ secretion observed by ex-vivo ELISPOT test in splenocytes of HHD mice immunized with the pCMV.B10-HBSP vector.
  • the specific response of the HBs protein is important (pep 5 and pep 10).
  • the specific response of HBSP is essentially directed against 15Mers 64-78, and for mouse I, against 15Mers 59-73.
  • Figure 7 Demonstration of cytotoxic T lymphocytes specific for HBs-5 and HBs-10 in HHD mice immunized with the vector pCMV.B10-HBSP, but not for HBSP A2-1 and HBSP A2-2.
  • FIG. 8 Intracytoplasmic labeling performed for stimulation with the peptide HBSP 79-93.
  • the graph on the left shows the secretion of IFN- ⁇ by the CD8 + cells present in the medium.
  • the graph on the right represents the secretion of IFN- ⁇ by the CD8 + cells present in the well stimulated by the peptide 79-93.
  • FIG. 9 the top graph shows the secretion of IFN- ⁇ ex vivo in an ELISPOT test in response to peptides derived from the HBSP protein, and of 4 peptides derived from HBs in HLA-B * 0702 mice immunized by the vector pCMV.B10-HBSP.
  • the bottom graph represents the results after secondary stimulation with the peptides at 39-53, 59-73, 64-78, and 79-93.
  • Figure 10 Demonstration of specific cytotoxic T lymphocytes of HBSP B7-1, and of 15mers 79-93. No mice responded to stimulation with HBs 62 and HBSP 39-53.
  • Figure 11 Nucleotide sequences encoding fragment 39 to 111 of HBSP (SEQ ID NO: 1), and encoding the complete HBSP protein (SEQ ID NO: 2), and complete protein sequence of HBSP (SEQ ID NO: 3).
  • Figure 12 Sequences of peptides, polypeptides and epitopes according to the invention (Table 2, having the SEQ ID NO: 4 to 16).
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • IFN gamma interferon-gamma producing cells
  • the IFN gamma ELIspot were made with the indicated peptides.
  • the PBMCs of nine HLA-A2 + patients with chronic HBV infection (P1 to P9 patients) ( Figures 13A, 13B) and seven HLA-B7 + patients with chronic HBV infection (P10 to P16 patients) were analyzed ( 13C, 13D) and, as controls, six subjects C1 to C3 (FIGS. 13A, 13B) and C4 to C6 (FIGS. 13C, 13D) corresponding to HBV-, HCV- and HIV-negative individuals.
  • the results are expressed as the number of IFN gamma / 10 6 PBMC secreting T cells.
  • the responses were considered positive when the IFN gamma was> 50 spots / 10 6 PBMC and was greater than at least twice the background (measured on media).
  • the PBMCs of four HLA-B7 + patients with chronic HBV infection were stimulated in vitro using a pool of natural variants of the HBSP B7-1 peptide (see Table 4 below), and cells that secrete interferon gamma after stimulation with the indicated peptide are quantified.
  • Figure 14 Detection among PBMCs of HBV-infected patients of IFN-gamma-secreting cells in response to stimulation with a 15mer peptide.
  • the PBMCs of twelve individuals chronically infected with HBV and six healthy controls were stimulated in vitro with four pools of 15-mer peptides and cells that secrete interferon gamma are quantified by ELIspot assay.
  • the positive responses observed after stimulation with the peptide pool 54-78 were further characterized using the three peptides of the pool in individual form. The results are expressed as in FIGS. 13A-13D.
  • PBMCs of patients with chronic HBV infection were stimulated with HBSP-reactive 15-mer peptides, and phenotypic characterization of T cells producing cytokines was performed. Intracellular staining for IFN gamma and IL-2 production was examined for patient P1 (top panels) and interferon gamma production only for patient P2 (bottom panel). Percentages of interferon-gamma or IL-2 producing CD4 + T cells are shown in the upper right corner of each panel. Negative control results were ⁇ 0.02% in all cases.
  • Phenotyping of PBMCs was performed using PE-conjugated anti-HLA-A2 (BB7-2) and FITC-conjugated anti-HLA-B7 (BB7-1) antibodies (Serotec, Oxford). , UK).
  • BB7-2 PE-conjugated anti-HLA-A2
  • BB7-1 FITC-conjugated anti-HLA-B7
  • In vitro multiplied PBMCs were placed overnight in the presence or absence of peptide (1 microgram / mL) and Brefeldin A (2 micrograms / mL, Sigma). The cells were washed and incubated with human anti-CD6 conjugated to PE conjugated with PerCP and anti-CD4. Cells with staining on their surface were fixed with 2% paraformaldehyde in PBS.
  • the fixed cells were resuspended in permeabilization buffer (saline phosphate buffer 0.5% bovine serum albumin, 0.5% saponin and 0.05% sodium azide), and incubated with anti-IFN monoclonal antibodies.
  • permeabilization buffer saline phosphate buffer 0.5% bovine serum albumin, 0.5% saponin and 0.05% sodium azide
  • anti-IFN monoclonal antibodies gamma or anti-IL-2 conjugated to FITC (BD Biosciences, Le Pont de Claix, France) to allow flow cytometric analysis of peptide-specific T cells.
  • the present invention relates to mono- or poly-epitopic peptides or polypeptides which are capable of inducing an immune response directed against
  • the peptides or polypeptides according to the invention may be natural peptides or polypeptides, or fragments of a natural protein or polypeptide, or they may be recombinant peptides or polypeptides, or they may be synthetic peptides or polypeptides.
  • the mono- or poly-epitopic peptides or polypeptides according to the invention comprise at least one fragment of HBSP, or at least one fragment analog, or consist of such a fragment or the like.
  • the complete protein sequence of HBSP consists of 111 amino acids, shown in Figure 11 (SEQ ID NO: 3).
  • SEQ ID NO: 3 A nucleotide sequence encoding the complete protein is presented as SEQ ID NO: 2 in Figure 11.
  • the present patent application relates to mono- or poly-epitopic peptides or polypeptides, capable of inducing an immune response directed against HBV, which:
  • HBSP protein Hepatitis B spliced protein
  • analogue of such a fragment said analogue being a peptide or polypeptide consisting of at least 6 and at most 80 amino acids, which derived from said fragment by substitution and / or deletion and / or addition of one or more amino acids, and which has retained an ability to induce an immune response directed against HBV, or which consist of such a fragment or the like.
  • said HBSP fragment and said conservative analogue are each, independently of one another, consisting of from 6 to 72 amino acids, preferably from 6 to 65 amino acids, for example from 6 to 46 amino acids, preferably from 6 to 35 amino acids, more preferably from 6 to 20 amino acids, for example from 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 amino acids , in particular from 6 to 16 amino acids, for example 6, 7, 8, 9,
  • said fragment of the HBSP protein is constituted by at least 6 amino acids, preferably at least 9 amino acids, and consists of at most 20 amino acids, preferably at most 15 amino acids, in particular from 6 to 15 amino acids. amino acids, 9 to 15 amino acids, for example 9 or 10 amino acids, or 12 to 15 amino acids.
  • said conservative analogue is a peptide or polypeptide consisting of at least 6, preferably at least 9 amino acids, and at most 25 amino acids, preferably at most 20 amino acids, in particular from 6 to 20 amino acids, for example 9 to 20 or 9 to 15 amino acids.
  • the present application aims as such said fragments and the like.
  • a peptide or polypeptide according to the invention may consist of a single fragment or the like.
  • a polypeptide or polypeptide according to the invention may contain these fragments contiguously or non-contiguously: they may be in a state of "contiguity / non-contiguity" different from that in which they are found in the native HBSP protein, or on the contrary be find in the same state of "contiguity / non-contiguity” as in the complete native HBSP protein.
  • These Fragments can be placed in the same order, or on the contrary in a different order, from that in which they are found in the complete native HBSP protein.
  • a peptide or polypeptide according to the invention may thus consist of from 6 to 72 amino acids, preferably from 6 to 65 amino acids, for example from 6 to 46 amino acids, preferably from 6 to 35 amino acids, more preferably from 6 to 20 amino acids, for example 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 amino acids, in particular from 6 to 16 amino acids, for example from 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 amino acids, more particularly 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 amino acids.
  • said peptide or polypeptide according to the invention consists of at least 6 amino acids, preferably at least 9 amino acids, and consists of at most 20 amino acids, preferably at most 15 amino acids, in particular 6 at 20 amino acids, from 6 to 15 amino acids, in particular from 9 to 15 amino acids, for example from 9 or 10 amino acids, or from 12 to 15 amino acids.
  • a peptide or polypeptide according to the invention may, in addition, be associated, coupled or fused with one or more amino acid sequences which do not derive from HBSP.
  • it may be associated, coupled or fused with one or more amino acid sequences that are not derived from HBSP, and that have the ability to increase the immunogenicity of the peptide or polypeptide, and / or have the ability to direct the peptide or polypeptide to particular biological targets, for example advantageous cell targets for the treatment, palliation and / or prevention of a disease or condition related to infection, HBV punctual or chronic.
  • a peptide or polypeptide according to the invention may for example be associated, coupled or fused with one or more amino acid sequences which derive from HBV, but which do not derive from HBSP.
  • said peptide or polypeptide may be associated, coupled or fused to a sequence or portion of an HBV envelope protein sequence, for example a sequence or portion of an S protein sequence.
  • Said HBSP fragment may have as its sequence the sequence extending from positions 39 to 111 of HBSP (junction between the common sequence with the polymerase, and the "original" part of the HBSP sequence), or is a subfragment preservative of at least 6 amino acids of this sequence, preferably at least 9 amino acids (sub-fragment which consists of at least 6 consecutive amino acids of this sequence, preferably at least 9 consecutive amino acids of this sequence, and which has retained an ability to induce an immune response against HBV).
  • a conservative sub-fragment may advantageously consist of at most 20 amino acids, preferably at most 15 amino acids, in particular from 9 to 15 amino acids, for example from 9 or 10 amino acids, or from 12 to 15 amino acids .
  • Said HBSP fragment may thus have the sequence which extends from positions 39 to 63 of HBSP as a sequence, or is a conservative sub-fragment of at least 6 amino acids of this sequence, preferably at least 9 amino acids ( sub-fragment which consists of at least 6 consecutive amino acids of this sequence, preferably at least 9 consecutive amino acids of this sequence, and which has retained an ability to induce an immune response directed against HBV).
  • a conservative sub-fragment may advantageously consist of at most 20 amino acids, preferably at most 15 amino acids, in particular from 9 to 15 amino acids, for example from 9 or 10 amino acids, or from 12 to 15 amino acids .
  • Said HBSP fragment may thus have as its sequence the sequence which extends from positions 39 to 53 of HBSP (EDLHLQLPNDPRPPV, SEQ ID NO: 15), or is a conservative sub-fragment of at least 6 amino acids of this sequence, preferably at least 9 amino acids (sub-fragment which consists of at least 6 consecutive amino acids of this sequence, preferably at least 9 consecutive amino acids of this sequence, and which has retained an ability to induce a response immune against HBV).
  • a conservative sub-fragment may advantageously consist of at most 20 amino acids, preferably at most 15 amino acids, in particular from 9 to 15 amino acids, for example from 9 or 10 amino acids, or from 12 to 15 amino acids .
  • the sequence of SEQ ID NO: 16 (LPNDPRPPV), which is identical to the sequence which extends from positions 45 to 53 of the complete HBSP protein, is an example of a conservative sub-fragment of the sequence of SEQ ID NO: 15.
  • Said HBSP fragment may have as its sequence the sequence which extends from positions 47 to 111 of HBSP ("original" part of the HBSP sequence), or is a conservative sub-fragment of at least 6 amino acids of this sequence , preferably at least 9 amino acids (sub-fragment which consists of at least 6 consecutive amino acids of this sequence, preferably at least 9 consecutive amino acids of this sequence, and which has retained an ability to induce immune response to HBV).
  • a conservative sub-fragment may advantageously consist of at most 20 amino acids, preferably at most 15 amino acids, in particular from 9 to 15 amino acids, for example from 9 or 10 amino acids, or from 12 to 15 amino acids .
  • Said HBSP fragment may thus consist of a sequence chosen from the sequences which extend from the following positions of HBSP: a) 79 to 93 (RTEIAPVFPSHHLGL, SEQ ID NO: 4), b) 83 to 91 (HBSP B7- 1, APVFPSHHL, SEQ ID NO: 5), c) 85 to 93 (VFPSHHLGL, SEQ ID NO: 6), d) 54 to 68 (FM 5-L, RDPAKPARLLLKATL, SEQ ID NO: 7), e) 55 to 63; (DPAKPARLL, SEQ ID NO: 8), f) 58-66 (KPARLLLKA, SEQ ID NO: 9), g) 59-73 (P-15-V, PARLLLKATLCIPHV, SEQ ID NO: 10), h) 62 to 70 (HBSP A2-1, LLLKATLCI, SEQ ID NO: 11), i) 64 to 78 (LKATLCIPHVAVQNL, SEQ ID NO:
  • a conservative sub-fragment may advantageously consist of at most 20 amino acids, preferably at most 15 amino acids, in particular from 9 to 15 amino acids, for example 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 amino acids, for example 9 or 10 amino acids, or 12 to 15 amino acids.
  • the sequences of SEQ ID NO: 5 and NO: 6 are examples of conservative subfragments of the fragment of SEQ ID NO: 4.
  • the sequences of SEQ ID NO: 8 and NO: 9 are examples of conservative subfragments of the fragment of SEQ ID NO: 7.
  • the present application aims as such said fragments and the like. Some of the said fragments are mono-epitopic, others are polyepitopic, and still others correspond to epitopes.
  • the fragment whose sequence is that extending from positions 79 to 93 of HBSP (RTEIAPVFPSHHLGL; SEQ ID NO: 4) contains two epitopes, namely:
  • VFPSHHLGL positions 85 to 93, SEQ ID NO: 6
  • the fragment whose sequence is that extending from positions 54 to 68 of HBSP contains at least two CD8 + epitopes, namely:
  • KPARLLLKA SEQ ID NO: 9
  • the fragment whose sequence is that extending from positions 54 to 68 of HBSP also contains at least one epitope recognized by the CD4 + T lymphocytes of HBV + patients; this fragment therefore also contains at least one epitope restricted by a class II HLA molecule (such as HLA-DR, HLA-DP, etc.).
  • Said HBSP fragment may have as its sequence the sequence that extends from positions 1 to 46 of HBSP (part of the HBSP sequence that is common to that of the polymerase), or is a conservative sub-fragment of at least 6 amino acids of this sequence, preferably at least 9 amino acids (sub-fragment which consists of at least 6 consecutive amino acids of this sequence, preferably at least 9 consecutive amino acids of this sequence, and which has retained an ability to induce an immune response against HBV).
  • a conservative sub-fragment may advantageously consist of at most 20 amino acids, preferably at most 15 amino acids, in particular from 9 to 15 amino acids, for example from 9 or 10 amino acids, or from 12 to 15 amino acids .
  • Said HBSP fragment may thus have the sequence which extends from positions 1 to 38 of HBSP as a sequence, or is a conservative sub-fragment of at least 6 amino acids of this sequence, preferably at least 9 amino acids ( sub-fragment which consists of at least 6 consecutive amino acids of this sequence, preferably at least 9 consecutive amino acids of this sequence, and which has retained an ability to induce an immune response directed against HBV).
  • a conservative sub-fragment may advantageously consist of at most 20 amino acids, preferably at most 15 amino acids, in particular from 9 to 15 amino acids, for example from 9 or 10 amino acids, or from 12 to 15 amino acids .
  • Said HBSP fragment may thus have the sequence which extends from positions 25 to 33 of HBSP (Poi B7-1, LPRLADEDL, SEQ ID NO: 18), or is a conservative sub-fragment of at least 6 acids.
  • amines of this sequence preferably at least 9 amino acids, preferably at least 9 amino acids (sub-fragment which consists of at least 6 consecutive amino acids of this sequence, preferably at least 9 consecutive amino acids) of this sequence, and which has retained an ability to induce an immune response against HBV).
  • a conservative sub-fragment may advantageously consist of at most 20 amino acids, preferably at most 15 amino acids, in particular from 9 to 15 amino acids, for example from 9 or 10 amino acids, or from 12 to 15 amino acids .
  • Said HBSP fragment may thus have as its sequence the sequence which extends from positions 15 to 29 of HBSP, or is a conservative sub-fragment of at least 6 amino acids of this sequence, preferably of at least 9 amino acids ( sub-fragment which consists of at least 6 consecutive amino acids of this sequence, preferably at least 9 consecutive amino acids of this sequence, and which has retained an ability to induce an immune response directed against HBV).
  • a conservative sub-fragment may advantageously consist of at most 20 amino acids, preferably at most 15 amino acids, in particular from 9 to 15 amino acids, for example from 9 or 10 amino acids, or from 12 to 15 amino acids .
  • Said HBSP fragment may thus have as its sequence the sequence which extends from positions 13 to 21 (PoI A2-2, LLDEEAGPL, SEQ ID NO: 14) of HBSP, or is a conservative sub-fragment of at least 6 acids.
  • amines of this sequence preferably at least 9 amino acids (sub-fragment which consists of at least 6 consecutive amino acids of this sequence, preferably at least 9 consecutive amino acids of this sequence, and which has retained an ability to induce a response immune against HBV).
  • a conservative sub-fragment may advantageously consist of at most 20 amino acids, preferably at most 15 amino acids, in particular from 9 to 15 amino acids, for example from 9 or 10 amino acids, or from 12 to 15 amino acids .
  • Said immune response is advantageously a cell-mediated response (T and / or NK response).
  • Said peptide or polypeptide according to the invention is preferably capable of inducing a T (CD8 + and / or TCD4 +) response. Said peptide or polypeptide is then capable of inducing the activation and / or differentiation of T cells (CD8 + T and / or CD4 + T).
  • said peptide or polypeptide is capable of inducing a CD8 + and / or CD4 + T response, in particular to induce the activation of CD8 + T and / or CD4 + T cells, and / or the differentiation of CD8 + T cells in CTL.
  • Said activation of T cells then results, for example, in the induction and / or stimulation of cytokine production (such as IFN-gamma).
  • Said differentiation of CD8 + T then results, for example, in a differentiation of CD8 + T in CTL, and more particularly in CTL capable of specific lysis.
  • Said fragment or, if appropriate, said conservative analogue is preferably restricted by MHC, advantageously by HLA (HLA class I, such as HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-F, HLA-G , HLA-H, and / or HLA class II, such as HLA-D 1 eg HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DS, HLA-DZ).
  • HLA HLA class I
  • HLA-A HLA-A
  • HLA-B HLA-C
  • HLA-F HLA-G
  • HLA-H and / or HLA class II, such as HLA-D 1 eg HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DS, HLA-DZ.
  • HLA class I such as HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-F, HLA-G
  • Said fragment or, if appropriate, said conservative analogue may for example be restricted by a class I HLA molecule, such as an HLA-A, HLA-B, or HLA-C molecule, HLA-F, HLA-G, HLA-H, more particularly HLA-A (HLA-A1, HLA-A2, for example HLA-A2), HLA-B (HLA-B1, HLA-B2, HLA-B3, HLA-B4, HLA-B5, HLA -B6, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B9, for example HLA-B7, and more particularly HLA-B0702, HLA-B0703, HLA-B0704, HLA-B0705, HLA-B1508, HLA-B3501, HLA-B3502, HLA-B3503, HLA-B51, HLA-B5301, HLA-B5401, HLA-B5501, HLA -B5502, HLA-B 5601, HLA-B5602, HLA-
  • the invention thus aims more particularly at a peptide or polypeptide, mono- or poly-epitopic, capable of inducing a CD8 + immune response and / or CD4 + T directed against HBV, characterized in that:
  • HBSP protein Hepatitis B spliced protein
  • analogue of such a fragment, said analogue being a peptide or polypeptide consisting of at least 6 and at most 80 amino acids, which is derived from said fragment by substitution and / or deletion and / or addition of one or several amino acids, and which has retained an ability to induce a CD8 + and / or CD4 + T immune response directed against HBV, and in that
  • said HBSP fragment consists of a sequence chosen from sequences which extend from the following positions of HBSP: a) from 79 to 93 (RTEIAPVFPSHHLGL, SEQ ID NO: 4), b) from 83 to 91 (HBSP B7 (SEQ ID NO: 5), (c) from 85 to 93 (VFPSHHLGL, SEQ ID NO: 6), (d) from 54 to 68 (R-15-L, RDPAKPARLLLKATL, SEQ ID NO: 7), e) from 55 to 63 (DPAKPARLL, SEQ ID NO: 8), f) from 58 to 66 (KPARLLLKA, SEQ ID NO: 9), g) from 59 to 73 (P-15-V, PARLLLKATLCIPHV, SEQ ID NO : 10), h) from 62 to 70 (HBSP A2-1, LLLKATLCI, SEQ ID NO: 11), i) from 64 to 78 (LKATLCIPHVAVQNL, SEQ ID NO
  • said HBSP fragment and said conservative analogue are each, independently of one another, consisting of from 6 to 72 amino acids, preferably from 6 to 65 amino acids, for example from 6 to 46 amino acids, preferably from 6 to 35 amino acids, more preferably from 6 to 20 amino acids, for example from 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 amino acids , in particular from 6 to 15 amino acids, for example from 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15, 16 amino acids, more particularly from 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 amino acids.
  • said fragment of the HBSP protein is constituted by at least 6 amino acids, preferably at least 9 amino acids, and consists of at most 20 amino acids, preferably at most 15 amino acids, in particular from 6 to 15 amino acids.
  • said conservative analogue is a peptide or polypeptide consisting of at least 6, preferably at least 9 amino acids, and at most 25 amino acids, preferably at most 20 amino acids, in particular from 6 to 20 amino acids, for example 9 to 20 or 9 to 15 amino acids.
  • conservative analogs include those which result from the deletion and / or conservative substitution of one or more amino acids of a fragment according to the invention.
  • the first four N-terminal amino acids and the last two C-terminal amino acids of the sequence of SEQ ID NO: 4 can be deleted (resulting in the sequence of SEQ ID NO: 5 ).
  • the first six N-terminal amino acids of the sequence of SEQ ID NO: 5 can be deleted (resulting in the sequence of SEQ ID NO: 5 ).
  • amino acid L at position 9 can be substituted with A, I, M, V, F, W or Y, without changing the binding of the peptide to the class I molecule (HLA-B7).
  • SEQ ID NO: 5 which derive from natural variants of HBSP (variant HBSP sequences that may have been observed in some HBV-positive patients) are derived from SEQ ID NO: 5 substituting amino acid L at position 9 by P (SEQ ID NO: 33; APVFPSHHP), or substituting amino acid L at position 9 with P and amino acid P at position 2 with L (SEQ ID NO: 34 ALVFPSHHP), or substituting amino acid L at position 9 with H and amino acid P at position 2 with L (SEQ ID NO: 35; ALVFPSHHH).
  • amino acid L at position 2 can be substituted with V, M, I 1 T or A, without changing the binding of the peptide. to the class I molecule (HLA-A2).
  • amino acid I at position 9 can be substituted with V, M, L, T or A, without changing the binding of the peptide. to the class I molecule (HLA-A2).
  • this peptide or polypeptide is restricted by an HLA class I and / or class II molecule.
  • This peptide or polypeptide may be characterized in that it is capable of inducing activation of CD8 + T and / or CD4 + T cells, and / or differentiation of CD8 + T cells into CTL.
  • this peptide or polypeptide may comprise one of said fragments or analogs, or at least two of said fragments or analogs.
  • HBSP fragment of at least 6 amino acids
  • a protein or HBV protein fragment other than HBSP fragment of at least 6 amino acids
  • a protein or HBV envelope protein fragment for example a protein or HBV envelope protein fragment, e.g., an S protein or an S protein fragment.
  • the invention is of course directed to the sequences a) to n) above mentioned as such, as well as their conservative fragments as such, as defined above.
  • sequences b), c), e), f), h), j), k), m), n) above others are polyepitopic (e.g., sequence a), d) above).
  • Sequences a), b), c), e), g), I) and m) and n) are restricted by HLA-B (SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 15, 16, 18) and sequences f), h), i), j) and k) are restricted by HLA-A (SEQ ID NO: 9, 11, 12, 13, 14).
  • sequences may also be restricted by a class II HLA molecule. This is particularly the case for those sequences which consist of at least 9 amino acids, such as SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 7.
  • SEQ ID NO: 7 The sequence mentioned under d) above (SEQ ID NO: 7) is both restricted by HLA-A and HLA-B, and is further restricted by a class 11 HLA molecule.
  • the invention thus more particularly targets those peptides or polypeptides according to the invention, which comprise at least one, or consist of a HLA-A-restricted fragment or analog of HBSP.
  • They are characterized in particular by the fact that said at least one HBSP fragment consists of a sequence chosen from among the sequences which extend from the following positions of HBSP: i. from 54 to 68 (RDPAKPARLLLKAT; SEQ ID NO: 7), ii. from 58 to 66 (KPARLLLKA, SEQ ID NO: 9), iii. from 62 to 70 (HBSP A2-1, LLLKATLCI, SEQ ID NO: 11), iv.
  • a conservative sub-fragment may advantageously consist of at most 20 amino acids, preferably at most 15 amino acids, in particular from 9 to 15 amino acids, for example from 9 or 10 amino acids, or from 12 to 15 amino acids .
  • Some of these peptides or polypeptides may also be restricted by at least one HLA class II molecule. This is particularly the case of those of said peptides or polypeptides which consist of a fragment of HBSP selected from SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, or an analogue of such a fragment. This is also particularly the case with those of said peptides or polypeptides:
  • the invention thus relates more particularly to those peptides or polypeptides according to the invention, which comprise at least one, or consist of a fragment or analog of HLA-B restricted HBSP. They are characterized in particular by the fact that said at least one HBSP fragment consists of a sequence chosen from among the sequences which extend from the following positions of HBSP: i. from 79 to 93 (RTEIAPVFPSHHLGL, SEQ ID NO: 4), ii. from 83 to 91 (HBSP B7-1, APVFPSHHL, SEQ ID NO: 5), iii. from 85 to 93 (VFPSHHLGL, SEQ ID NO: 6), iv.
  • At viii preferably at least 9 amino acids, for example 6, 7, or 8 consecutive amino acids (sub-fragment which consists of at least 6 consecutive amino acids of this sequence, preferably at least 9 acids consecutive amines of this sequence, and which has retained an ability to induce an immune response directed against HBV, and more particularly to induce a CD8 + immune response directed against HBV, and more particularly to be restricted by HLA-B).
  • a conservative sub-fragment may advantageously consist of at most 20 amino acids, preferably at most 15 amino acids, in particular from 9 to 15 amino acids, for example from 9 or 10 amino acids, or from 12 to 15 amino acids .
  • Some of these peptides or polypeptides may also be restricted by at least one HLA class II molecule.
  • the invention thus relates more particularly to those peptides or polypeptides according to the invention, which comprise at least one, or consist of a fragment or analog of HBSP restricted by at least one HLA class II molecule.
  • the at least one HBSP fragment consists of a RDPAKPARLLLKAT sequence (positions 54 to 68 of HBSP, SEQ ID NO: 7), or of the conservative subfragments thereof. sequence, said conservative subfragments consisting of at least 6 consecutive amino acids of this sequence, and having retained an ability to induce a CD4 + T immune response directed against HBV.
  • the invention also relates to epitopes capable of inducing an immune response directed against HBV, which consist of a 6 to 15 amino acid fragment of the HBSP (Hepatitis B spliced protein) protein, preferably from 9 to 15 amino acids , especially 9 or 10 amino acids, or 12 to 15 amino acids. More particularly, HBSP (Hepatitis B spliced protein) epitopes, which are chosen from: A.
  • HBSP Hepatitis B spliced protein
  • Peptides which consist of 6 to 15 consecutive amino acids (for example, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 amino acids), preferably from 9 to 15 consecutive amino acids of one of the following sequences a) to n): a) from 79 to 93 (RTEIAPVFPSHHLGL; SEQ ID NO: 4), b ) from 83 to 91 (HBSP B7-1, APVFPSHHL, SEQ ID NO: 5), c) from 85 to 93 (VFPSHHLGL, SEQ ID NO: 6), d) from 54 to 68 (R-15-L; RDPAKPARLLLKATL SEQ ID NO: 7), e) from 55 to 63 (DPAKPARLL, SEQ ID NO: 8), f) from 58 to 66 (KPARLLLKA, SEQ ID NO: 9), g) from 59 to 73 (P-15 SEQ ID NO: 10), h) from 62 to 70 (HBSP A2-1, LLLKATLCI, SEQ ID NO: 11),
  • CD4 + against VHB or B.
  • the peptides which consist of a conservative analogue of 6 to 15 amino acids, preferably 9 to 15 amino acids, which are derived from a group A peptide above, by substitution and / or deletion and / or or adding one or more amino acids, said analog having retained an ability to induce a CD8 + and / or CD4 + immune response against HBV.
  • epitopes of HBSP according to the invention are restricted by HLA-B.
  • HLA-B Hepatitis B splice protein
  • epitopes of HBSP Hepatitis B splice protein
  • A peptides which consist of 6 to 15 consecutive amino acids (for example, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 amino acids), preferably from 9 to 15 consecutive amino acids, in particular from 9 or 10 amino acids, or from 12 to 15 amino acids, of one of the following sequences:
  • the peptides which consist of a conservative analogue of 6 to 15 amino acids, preferably 9 to 15 amino acids, which are derived from a group A peptide above, by substitution and / or deletion and / or or adding one or more amino acids, said analog retains an ability to induce a CD8 + immune response against HBV.
  • the invention is also directed to epitopes of the HBSP protein, which are restricted by an HLA class I molecule (e.g., HLA-B), which consist of one of the following sequences:
  • VFPSHHLGL positions 85 to 93 of HBSP, SEQ ID NO: 6
  • APVFPSHHL positions 83 to 91 of HBSP, SEQ ID NO: 5
  • DPAKPARLL positions 55 to 63 of HBSP, SEQ ID NO: 8
  • - LPNDPRPPV positions 45 to 53 of HBSP, SEQ ID NO: 16
  • a conservative fragment of 6 to 8 amino acids which comprises at least 6 consecutive amino acids, and at most 8 consecutive amino acids of one of these four sequences, said fragment having retained an ability to induce a CD8 + immune response directed against HBV, and more particularly to be restricted by HLA-B, or a conservative analogue of 6 to 10 amino acids, which derives from one of these three sequences, or one of their conservative fragments, by substitution and / or deletion and / or addition of one or more amino acids, said analog retained an ability to induce an immune response T CD8 + directed against HBV, and more particularly to be restricted by HLA-B.
  • HBSP Hepatitis B spliced protein
  • the peptides which consist of a conservative analogue of 6 to 15 amino acids, preferably 9 to 15 amino acids, which are derived from a group A peptide above, by substitution and / or deletion and / or or adding one or more amino acids, said analog retains an ability to induce a CD8 + immune response against HBV.
  • the invention also encompasses epitopes of the HBSP protein, which are restricted by a class I HLA molecule (for example, HLA-A), which consist of one of the following sequences:
  • KPARLLLKA SEQ ID NO: 9, positions 58 to 66 of HBSP
  • LLLKATLCI SEQ ID NO: 11, positions 62 to 70 of HBSP
  • TLCIPHVAV (SEQ ID NO: 13, positions 67 to 75 of HBSP),
  • - LLDEEAGPL (SEQ ID NO: 14; positions 13 to 21 of HBSP), or a conservative fragment of 6 to 8 amino acids, which comprises at least 6 consecutive amino acids, and at most 8 consecutive amino acids of one of these four sequences, said fragment having retained an ability to induce a CD8 + immune response directed against HBV, and more particularly to be restricted by HLA-A, or a conservative analog of 6 to 10 amino acids, which derives from one of these three sequences, or one of their conservative fragments, by substitution and / or deletion and / or addition of one or more amino acids, said analogue retained an ability to induce an immune response T CD8 + directed against
  • HBV and more particularly to be restricted by HLA-A.
  • the invention also proposes a method for producing an epitope of HBSP capable of inducing a CD8 + and / or CD4 + T immune response directed against HBV, and more particularly an epitope restricted by a MHC molecule, advantageously an HLA molecule, and especially by a class I HLA molecule and / or a class II molecule, comprising: selecting from: A.
  • peptides which consist of 6 to 15 consecutive amino acids (e.g., 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 or 15 amino acids), preferably from 9 to 15 consecutive amino acids of one of the following sequences a) to n): a) from 79 to 93 (RTEIAPVFPSHHLGL; SEQ ID NO: 4), b) 83-91 (HBSP B7-1, APVFPSHHL, SEQ ID NO: 5), c) 85-93 (VFPSHHLGL, SEQ ID NO: 6), d) 54-68 (R-15-L; RDPAKPARLLLKATL, SEQ ID NO: 7), e) 55-63 (DPAKPARLL, SEQ ID NO: 8), f) 58-66 (KPARLLLKA, SEQ ID NO: 9), g) 59-73 (P- 15-V; PARLLLKATLCIPHV; SEQ ID NO: 10), h) from 62 to 70 (HBSP A2-1, LLLKATLCI, S
  • peptides which consist of a conservative analogue of 6 to 15 amino acids, preferably from 9 to 15 amino acids, which is derived from a group A peptide above, by substitution and / or deletion and / or addition of one or more amino acids, of a peptide which is capable of inducing a CD8 + and / or CD4 + T response directed against HBV 1, for example to induce T-cell activation (production of cytokines, such as IFN-gamma), and / or to induce the differentiation of CD8 + T in CTL (lysis-specific ).
  • the selection may for example take place among the peptides which consist of 6 to 15 consecutive amino acids, in particular 9 to 15 amino acids (for example, 6, 7, 8, 9 or 10) of the sequence RTEIAPVFPSHHLGL (positions 79 to 93 of HBSP; SEQ ID NO: 00
  • HBSP B7-1 positions 83 to 91 of HBSP, SEQ ID NO: 5
  • VFPSHHLGL epitope positions 85 to 93 of HBSP, SEQ ID NO: 6
  • the present application also relates to the mimotopes of epitopes of HBSP.
  • mimotopes of a given epitope are known in the prior art.
  • An example of such methods is for example described in WO 86 06487 in the name of Commonwealth Serum Laboratories Commission (US 4,833,092, the contents of which are incorporated by reference, EP 220 245 B1).
  • Such mimotopes can advantageously be large less than that of the epitope they mimic. They may comprise in their sequence alpha amino acid acids and / or beta amino acids.
  • the present application also relates to antibodies directed against an epitope of HBSP, in preference to antibodies specific for one or more of said epitopes, which do not bind to a sequence of the HBSB protein that is not epitopic (ie ie HBSP sequence that would not be able to induce an immune response against HBV).
  • Such antibodies may in particular be produced by immunization of a mammal against a peptide or polypeptide according to the invention, and isolation of a specific antibody produced.
  • Monoclonal antibodies can be produced (Kohler and Milstein 1975, Nature 256: 495-497).
  • the present invention also relates to the oligonucleotides and polynucleotides that encode a peptide or polypeptide according to the invention, or an epitope according to the invention.
  • This coding is preferably performed according to the universal genetic code, taking into account the degeneracy of this code.
  • oligonucleotides or polynucleotides according to the invention include, in particular, those of SEQ ID NO: 19 to 32 (see FIG. 11), in which the nucleotide sequence coding for the complete protein of HBSP is present in SEQ ID NO: 2 and on which it can be read the nucleotide positions corresponding to the peptides according to the invention, see also Table 3 below).
  • Table 3 :
  • the present invention also relates to the vectors which comprise at least one oligonucleotide or polynucleotide according to the invention, and to the transfected host cells, infected or transformed with at least one oligonucleotide or polynucleotide according to the invention, or with at least one vector according to the invention.
  • Suitable vectors include, in particular, integrative viral vectors (retrovirus, adeno-associated virus, lentivirus, etc.) or non-integrative viral vectors (adenovirus, alphavirus, herpes simplex virus, etc.), plasmids, phages, YACs (Yeast Artificial Chromosome). ), and in general any expression vector.
  • An advantageous expression vector allows the production of an epitope, peptide or polypeptide according to the invention in vitro and / or in vivo.
  • a vector carrying a nucleotide sequence encoding the complete HBSP protein, and a vector carrying a nucleotide sequence encoding the 39-111 fragment of the HBSP protein were deposited with C.N.C.M. June 27, 2005 (National Collection of Cultures of Microorganisms, Institut Pasteur, 25, rue du Dondel Roux, F-75724 Paris Cedex 15, France): their respective deposit numbers are CNCM I-3467 and CNCM I-3468.
  • a vector according to the invention may therefore further comprise one or more of: transcription regulatory region (such as promoter, enhancer, ribosome binding site (RBS), signal polyA), termination signal, prokaryotic or eukaryotic origin of replication, resistance gene (for selection), gene encoding Myc, His, Tag or Flag tag.
  • transcription regulatory region such as promoter, enhancer, ribosome binding site (RBS), signal polyA
  • termination signal such as prokaryotic or eukaryotic origin of replication
  • resistance gene for selection
  • gene encoding Myc, His, Tag or Flag tag for selection
  • transcription regulatory region such as promoter, enhancer, ribosome binding site (RBS), signal polyA
  • termination signal such as promoter, enhancer, ribosome binding site (RBS), signal polyA
  • termination signal such as prokaryotic or eukaryotic origin of replication
  • resistance gene for selection
  • gene encoding Myc, His, Tag or Flag tag for selection
  • the choice of a suitable promoter may be in fact
  • a tissue-specific promoter may be selected depending on the organ to receive the product.
  • the promoter of a vector according to the invention is the promoter of CMV (cytomegalovirus).
  • the vector may further include one or more sequences that allow conditional expression, such as sequences of the Cre / Lox system or the like.
  • an expression vector adapted to in vivo expression will be chosen.
  • a retrovirus such as for example a retrovirus, and more particularly a lentivirus.
  • a lentiviral vector derived from HIV-1 that expresses HBSP has been constructed.
  • naked DNA DNA not carried by a vector
  • plasmid DNA may also be performed (injection into muscle cells for example ); cf. Loirat et al., 2000; Malmassari et al., 2005, whose contents are incorporated by reference).
  • This naked or plasmid DNA can moreover be associated, coupled or fused to a cell targeting molecule and / or to a molecule stimulating the immune response. It can also be associated with one or more elements facilitating transfection, such as liposome, polymer, conjugate.
  • the present invention also relates to genetically modified cells comprising an oligonucleotide or polynucleotide according to the invention.
  • a cell may be infected, transformed or transfected with an oligonucleotide or polynucleotide according to the invention, or with a vector according to the invention according to methods known to those skilled in the art, for example by chemical transfection (clacium phosphate, lipofectamine), lipid techniques (liposome), electroporation, photoporation, use of viral vectors, etc.
  • Infection, transformation or transfection can be performed on a unicellular or multicellular organism. In the case of multicellular organisms, such as a mammal, and more particularly a human being, it can be carried out in vivo or ex vivo.
  • any type of cell that the person considers appropriate can be used. It can be prokaryotic or eukaryotic cells, such as mammalian cells, by example of human cells or non-human mammalian cells, preferably somatic cells.
  • APCs antigen-presenting cells
  • MHC class I and more particularly HLA class I 1 such as dendritic cells (DC)
  • DC dendritic cells
  • HLA class II such as macrophages and B cells.
  • the invention thus more particularly targets APC cells, and more preferably dendritic cells (DC), such as a Langerhans cell, which have been transfected, infected or transformed with an oligonucleotide, polynucleotide or vector according to the invention.
  • DC dendritic cells
  • the present invention also relates to the therapeutic and / or preventive and / or palliative applications of the products according to the invention.
  • the peptides, polypeptides, epitopes, oligonucleotides, polynucleotides, vectors and host cells according to the invention indeed find applications of particular interest for therapeutic and / or preventive and / or palliative immunization against a disease or condition linked to a punctual or chronic infection with hepatitis B virus (HBV).
  • HBV hepatitis B virus
  • the products according to the invention can in fact prevent and / or treat and / or palliate hepatitis B, that is to say the infection with HBV itself, but also prevent and / or treat and / or compensate diseases and conditions induced by such infection, such as hepatocellular carcinoma, or, in the case of chronic HBV infection, fibrosis.
  • the products according to the invention may be used in free form, or in complexed or polymerized or conjugated or otherwise physically associated form.
  • the peptides or polypeptides according to the invention may for example be used in the form of lipopeptides, the oligonucleotides or olynucleotides according to the invention may for example be used in the form of liposomes.
  • Such compounds which comprise, in addition to a product according to the invention (peptides, polypeptides, epitopes, oligonucleotides, polynucleotides, vectors and host cells according to the invention), a non-protein or nucleotide component, such as for example a lipid component, are the subject of the present application.
  • a product according to the invention peptides, polypeptides, epitopes, oligonucleotides, polynucleotides, vectors and host cells according to the invention
  • a non-protein or nucleotide component such as for example a lipid component
  • the products according to the invention may be used in combination, for simultaneous or delayed administration, with one or more other active ingredients, such as another anti-HBV active principle. and / or another active ingredient anti-hepatitis virus (anti-HIV), for example anti-HCV.
  • anti-HIV anti-hepatitis virus
  • the present application therefore relates to a pharmaceutical composition, and in particular to a pharmaceutical composition adapted for administration in vivo (in particular by injection), or to an in vitro or ex vivo application, which comprises at least one:
  • peptide or polypeptide according to the invention optionally in the form of lipopeptide or lipopolypeptide,
  • epitope according to the invention optionally in the form of a lipopeptide, a mimotope according to the invention,
  • oligonucleotide or polynucleotide according to the invention optionally in liposome form, vector according to the invention,
  • each of these products can be in free form, or form complexed or polymerized or conjugated or otherwise physically associated.
  • composition according to the invention may comprise at least one of:
  • a peptide or polypeptide according to the invention optionally in the lipopeptide or polypeptide form, which consists of 6 to 80 amino acids (preferably 6 to 72, preferably 6 to 65, for example from 6 to 46 acids, as above indicated), and which comprises at least one copy (or consists of) of the HBSP A2-1 fragment (SEQ ID NO: 11), of a conservative sub-fragment of this fragment, or of a conservative analogue of this fragment or subfragment;
  • an oligonucleotide or polynucleotide which codes for such a peptide or polypeptide, according to the universal genetic code, and taking into account the degeneracy of this code,
  • a vector comprising such an oligonucleotide or polynucleotide
  • a host cell and more particularly an antigen presenting cell, transfected, infected or transformed with such an oligonucleotide or polynucleotide or by such a vector.
  • composition according to the invention may comprise several of said products according to the invention, for example, at least two, at least three or at least four products according to the invention. More particularly, a composition according to the invention can comprise:
  • a peptide or polypeptide according to the invention optionally in the lipopeptide or lipopolypeptide form, which consists of 6 to 80 amino acids (preferably 6 to 72, preferably 6 to 65, for example from 6 to 46 acids, as above indicated), and which comprises at least one copy (or consists of) of the HBSP A2-1 fragment (SEQ ID NO: 11), of a conservative sub-fragment of this fragment , or a conservative analogue of this fragment or subfragment; a mimotope of such a peptide or polypeptide,
  • an oligonucleotide or polynucleotide which codes for such a peptide or polypeptide, according to the universal genetic code, and taking into account the degeneracy of this code (for example, SEQ ID NO: 26),
  • a vector comprising such an oligonucleotide or polynucleotide, a host cell, and more particularly an antigen presenting cell, transfected, infected or transformed with such an oligonucleotide or polynucleotide or by such a vector;
  • a peptide or polypeptide according to the invention optionally in the lipopeptide or lipopolypeptide form, which consists of 6 to 80 amino acids (preferably 6 to 72, preferably 6 to 65, for example from 6 to 46 acids, as above indicated), and which comprises at least one copy (or consists of) of the HBSP fragment B7-1 (SEQ ID NO: 5), of a conservative sub-fragment of this fragment , or a conservative analogue of this fragment or subfragment (e.g., a variant of SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35); a mimotope of such a peptide or polypeptide, an oligonucleotide or polynucleotide which encodes such a peptide or polypeptide, according to the universal genetic code, and taking into account the degeneracy of this code (for example, SEQ ID NO: 20 a vector comprising such an oligonucleotide
  • a peptide or polypeptide according to the invention optionally in the form of lipopeptide or lipopolypeptide, which consists of from 6 to 80 amino acids (preferably from 6 to 72, preferably from 6 to 65, e.g.
  • HBSP A2-2 fragment SEQ ID NO: 13
  • SEQ ID NO: 13 a conservative sub-fragment of this fragment, or a conservative analogue of this fragment or subfragment
  • a mimotope of such a peptide or polypeptide, an oligonucleotide or polynucleotide which encodes such a peptide or polypeptide, according to the universal genetic code, and taking into account the degeneracy of this code for example, SEQ ID NO: 28 a vector comprising such an oligonucleotide or polyolucleotide, a host cell, and more particularly an antigen presenting cell, transfected, infected or transformed with such an oligonucleotide or polynucleotide or by such a vector.
  • Such a composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier. It may be a vehicle in the form of a solution or a physiologically acceptable emulsion, or a pharmaceutically acceptable excipient (including water, salts, dextrose, glycerol, ethanol, and combinations of these excipients).
  • a pharmaceutical composition according to the invention may be intended for systemic or topical administration. It may be intended for subcutaneous (s.c), intradermal (i.d.), intramuscular (i.m.) or intravenous (i.v.) administration by injection, orally, intranasally, or by inhalation.
  • the amount of active ingredient according to the invention to be administered depends on the subject to be treated, including its physiological state, the state of its immune system, the intended route of administration, and the size and / or weight of the patient.
  • suitable doses include, in particular, from 1 microgram to 2.5 milligrams for DNA vector injections intended for humans, but may be modified and adapted by the skilled person depending on the circumstances.
  • It may be a vaccinating composition, or a composition of therapy or palliation by immunization.
  • a vaccination adjuvant When intended for administration to humans for vaccination, it may further comprise a vaccination adjuvant, and more particularly an alum, or a CpG ODN adjuvant.
  • HBV HBV fragment other than those of the present invention
  • an HBV fragment other than an HBSP fragment for example an envelope protein, such as protein S, or a fragment of such a protein, or an oligonucleotide, or polynucleotide encoding such a protein or protein fragment, or a vector comprising such an oligonucleotide or polynucleotide, or a transfected host cell infected or transformed with such an oligonucleotide or polynucleotide.
  • such a composition may, in addition to a product according to the invention, comprise one or more HBs antigens, preferably in the form of particles carrying one or more HBs antigens, such as the chimeric particles described in US Pat. 513 (the content of which is hereby incorporated by reference), and in patent EP 156 712.
  • the chimeric particles described in these patents, and in particular as defined in claim 1 of patent EP 156 712 B1 or US Pat. No. 5,324,513 include polypeptides which carry the immunogenic sites of the HBs antigen and the polymerized human albumin receptor of hepatitis B virus.
  • the peptides or polypeptides according to the invention have the property of fusing with these chimeric particles.
  • a pharmaceutical composition according to the invention may therefore advantageously comprise particles carrying the immunogenic sites of the HBs antigen, and peptides or polypeptides according to the invention, optionally fused to these particles.
  • composition may further comprise one or more other active ingredients, for example another anti-HBV active ingredient and / or another active anti-hepatitis (anti-HIV) agent, for example anti-HCV.
  • active ingredients for example another anti-HBV active ingredient and / or another active anti-hepatitis (anti-HIV) agent, for example anti-HCV.
  • anti-HIV active anti-hepatitis
  • the products according to the invention may also be used to activate and / or differentiate T lymphocytes (CD8 + T and / or CD4 + T), and more particularly CD8 + T lymphocytes, and / or to induce or facilitate the maturation of APC cells. , and more particularly dendritic cells (DC).
  • the present invention thus also relates to a method for activating and / or differentiating a T lymphocyte (CD8 + T and / or CD4 + T), and more particularly a CD8 + T lymphocyte, which comprises contacting (in vitro, in vivo or ex vivo) of said T lymphocyte with at least one of:
  • the T cells used may be derived from cell lines, or else be the T cells of a donor (for example a patient suffering from HBV infection or a pathological condition related to such an infection, or donor HLA- compatible). This contacting is preferably carried out under conditions of nutrition, atmosphere, temperature, and contact time, which allow the activation and / or differentiation of the T cells contacted.
  • T lymphocytes thus activated and / or differentiated constitute effective effector cells to fight against the installation and / or the development and / or the resurgence of a HBV infection, and / or a disease or pathological condition related to a such infection as hepatocellular carcinoma and / or fibrosis.
  • the present invention also relates to a method for inducing and / or stimulating the maturation of APC cells, and more particularly of dendritic cells (DC), which comprises bringing into contact (in vitro, in vivo or ex vivo) said APC cell with at least one of:
  • mimotope according to the invention, oligonucleotide or polynucleotide according to the invention,
  • the host cell according to the invention, and more particularly the antigen presenting cells (APC) according to the invention.
  • APC antigen presenting cells
  • the APC cells used may be derived from cell lines, or else be the APC cells of a donor (for example a patient suffering from a HBV infection or a pathological state related to such an infection, or a donor HLA compatible).
  • This contacting is preferably carried out under conditions of nutrition, atmosphere, temperature, and contact time, which allow the maturation of the APC cells.
  • the APC cells thus obtained have a peptide, polypeptide, epitope or mimotope according to the invention on their surface. They constitute cells that have the capacity to activate and / or differentiate T cells (CD4 +, CD8 +), and particularly CD8 + T cells, thus making it possible to produce T cells. effective against the establishment and / or development and / or resurgence of HBV infection, and / or disease or condition related to such infection, such as hepatocellular carcinoma and / or fibrosis.
  • T cells and / or APC cells obtained by a method according to the invention may advantageously be administered to an organism in need of such treatment, and more particularly to a human or non-human mammal, to whom it would be desirable to administering a therapeutic and / or preventive and / or palliative treatment against hepatitis B, chronic hepatitis B, hepatocellular carcinoma, and / or fibrosis.
  • HHD Class I Major Human Histocompatibility Complex
  • HLA-A * 0201 mice and HLA-B mice HLA-A * 0201 mice and HLA-B mice. * 0702).
  • HLA-A * 0201 is expressed by 50% of Caucasians (Gulukota and DeLisi, 1996) and the HLA-allele B * 0702 is carried by 15-20% of humans (Rohrlich et al., 2003), and secondly because these models have been validated by numerous studies in humans.
  • Two constructs were made to be able to be injected in DNA form to these mice.
  • mice We immunized these mice by intramuscular injection of plasmid DNA encoding the HBSP protein in its entirety (pcDNA3.1 HBSP) or in its original part ie devoid of the polymerase part (pCMV.BIO-HBSP).
  • plasmid DNA encoding the HBSP protein in its entirety (pcDNA3.1 HBSP) or in its original part ie devoid of the polymerase part (pCMV.BIO-HBSP).
  • professional antigen presenting cells or APCs such as dendritic cells or macrophages recruited by inflammation and cell regeneration caused by intramuscular injection of cardiotoxin five days before vaccination, are present at the of the plasmid injection site.
  • the DNA can enter these cells, be transcribed and then translated, thus allowing the expression of the HBSP protein.
  • HBSP protein-specific T cells we then looked for the presence of HBSP protein-specific T cells, using qualitative functional assays such as the chromium release assay, which aims to characterize cytotoxic lymphocytes specific for an antigenic domain of the protein and quantitative as well.
  • ELISPOT which makes it possible to determine the number of IFN- ⁇ secreting cells in response to stimulation with a peptide.
  • the amino acid sequence of the HBSP protein consists of a fusion of the first 46 amino acids of the polymerase, and 65 amino acids corresponding to a totally original sequence.
  • pcDNA3.1 HBSP The complete genotype A HBSP sequence of the hepatitis B virus genome was inserted between the Hind III and Xho I restriction sites of pcDNA3.1 / myc-His (Invitrogen). This plasmid will be called pcDNA3-HBSP. This plasmid was deposited with the CN. CM. June 27, 2005 (National Collection of Cultures of Microorganisms, Institut Pasteur, 25, rue du Dondel Roux, F-75724 Paris Cedex 15, France). Its CNCM deposit number is: I- 3467.
  • pCMV.S2S This plasmid encodes the medium (M) and small (S) proteins of the viral envelope of hepatitis B virus 1 and allows the secretion of HBs antigen-bearing particles (Michel et al., 1995)
  • pCMV.B10-HBSP We subcloned the HBSP sequence from amino acids 39 to 111 and inserted it in phase instead of the preS2 sequence in plasmid pCMV.S2S (Firat et al., 1999).
  • the plasmids were prepared with the Quiagen purification columns (endofree plasmid kit, Quiagen, Hilden, Germany) and aliquoted at 1 mg / ml in PBS endotoxin free (Sigma).
  • RMA-B7 murine TAP + lymphocyte line expressing the HLA-B * 0702 molecule after transfection, cultured in RPMI 1640 (Invitrogen), 2mM L-glutamine (Invitrogen), penicillin 100 U / mL (Invitrogen), streptomycin 100 ⁇ g / mL ( Invitrogen), G418 500 ⁇ g / mL (PAA laboratories), 10% FCS (fetal calf serum, PAA laboratories).
  • RMA-S HHD TAP-murine lymphocyte line expressing the HLA-A * 0201 molecule after transfection grown in RPMI 1640, 2 mM L-glutamine, penicillin 100 U / mL, streptomycin 100 ⁇ g / mL, 10% FCS (PAA laboratories) .
  • HHD or HLA-A * 0201 mice express a transgenic class I MHC molecule composed of human ⁇ 2-microglobulin covalently linked at its C-terminal portion to the N-terminal portion of 'chain chimeric heavy at ⁇ 1- ⁇ 2 HLA-A * 0201 domains, and intracytoplasmic and transmembrane domains ⁇ 3 H-2D b .
  • Murine genes H-2D b and ⁇ 2-microglobulin have been invalidated by homologous recombination.
  • HLA-B7 or HLA-B * 0702 mice are genetically disabled for murine class I molecules and are transgenic for the HLA-B * 0702 molecule (Rohrlich et al., 2003).
  • mice Female mice 8-12 weeks old were immunized by two intramuscular injections at 3-week intervals with plasmids pCDNA3.1 HBSP, pCMV.B10-HBSP or pCMV.S2S, in independent experiments. All mice were anesthetized by intraperitoneal administration of pentobarbital sodium solution at 75 mg / kg (Sanofi, France). Five days before immunization, 50 ⁇ L of cardiotoxin (Latoxan, France) are injected into the tibialis ante ⁇ or muscle of each of the posterior legs of the mouse to allow degeneration followed by muscle regeneration and inflammation at the injection site of the mouse. DNA. The mice are sacrificed between seven and ten days after the second injection.
  • cardiotoxin Latoxan, France
  • mice are sacrificed by CO 2 asphyxiation.
  • Splenocytes are obtained by crushing spleens through a 70 ⁇ m diameter nylon filter (Becton Dickinson, France). After washing with 15 ml of HBSS medium (Invitrogen), 2mM L-glutamine, penicillin 100 U / ml, streptomycin 100 ⁇ g / ml, 5% FCS (PAA laboratories), the red blood cells are lysed at + 4 ° C. thanks to a solution of NH 4 Cl (8.3 g / L, buffered tris pH 7.2). The cells are then washed twice with the same medium, counted and resuspended to the desired concentration and in the appropriate medium of the experiment performed.
  • the ELISPOT test makes it possible to quantify, among the splenocytes, the antigen-specific IFN-gamma secreting cells.
  • a multi-well plate with a nitrocellulose membrane bottom (Millipore, Molsheim, France) is covered by 50 ⁇ l per well of a solution at 5 ⁇ g / ml of anti-IFN- ⁇ monoclonal antibody (anti-mouse IFN- ⁇ rat, Pharmingen) in carbonate buffer (pH 9.6) and overnight at 40 ° C. C.
  • the plates are saturated in 10% FCS medium for 2 hours at 37 ° C., 5% CO 2 and then washed three times in serum-free medium before distributing the peptides at 4 ⁇ g / ml under 100 ⁇ l of alpha MEM medium (Invitrogen).
  • 10% FCS (Myoclone) 2mM L-glutamine, 100 U / mL penicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin, 1% essential amino acid, 50 nM ercaptoethanol, 1mM sodium pyruvate, 10mM hepes.
  • Splenocytes obtained as described above, resuspended in complete alpha MEM and one million cells are distributed in 100 uL in the wells of the ELISPOT plate and incubated 24 hours at 37 0 C, 5% CO 2. Each peptide is tested in triplicate. Five washes in PBST (1X PBS, 0.05% Tween) are carried out in order to eliminate the cells and 50 ⁇ l of biotinylated antibody (anti-mouse IFN- ⁇ rat, Becton Dickinson) diluted 1/500 ⁇ in PBST are added to the wells for 1 hour 30 minutes at room temperature.
  • biotinylated antibody anti-mouse IFN- ⁇ rat, Becton Dickinson
  • the plates are again washed five times in PBST and incubated for 1 hour with streptavidin conjugated to alkaline phosphatase diluted to 1/1000 in PBST. Plates are revealed by addition of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) and nitroblue tetrazolium (NBT) substrates (Promega, Madison, WI). The number of spots is determined by a Zeiss ELISPOT automatic counter and reported as the number of cells forming one spot per million splenocytes (SFC / million splenocytes).
  • BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate
  • NBT nitroblue tetrazolium
  • the number of specific IFN- ⁇ secreting specific T cells after specific stimulation is obtained from the median value for each triplicate by subtracting the median from the number of spots obtained for the control wells where there is only the medium.
  • the measured response is considered positive if the median of the spots is greater than 20 and if the number of spots for the specific stimulation is greater than twice the background noise obtained for the control wells.
  • splenocytes The splenocytes of HHD mice are cultured in the presence of autologous stimulating cells (see following paragraph). So 5 10 6 cells are distributed in each well under 1 ml. On the other hand, for the HLA-B * 0702 mice, 10 million cells are cultured directly with 10 ⁇ g per mL of peptide in the well. This culture is intended to amplify the number of specific cells of the peptide placed in their presence, to achieve seven days after a so-called cytotoxicity functional test.
  • non-immunized mouse autoimmune B lymphocytes were prepared which were activated with LPS on the three days prior to culturing.
  • the non-immunized HHD mouse cells obtained as indicated above are incubated for 3 days at 37 ° C., 5% CO 2 in flasks of 50 ml of RPMI, 10% FCS (PAA laboratories), L-glutamine 2 mM, penicillin 100 U / mL, streptomycin 100 ⁇ g / mL, 25 ⁇ g / mL LPS (Sigma, 5 mg / mL), 7 ⁇ g / mL dextran sulfate (Pharmacia, 7 mg / mL).
  • the autologous stimulating cells are washed in HBSS medium, 5% FCS, 2mM L-glutamine, 100 U / mL penicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin counted and centrifuged for 10 minutes at 1600 rpm. The cell pellet is irradiated at 10,000 rads for 30 minutes. The cells are then washed, resuspended at a concentration of 5 10 6 cells per ml of alpha MEM complete with the peptide at 10 ⁇ g / ml and incubated with the splenocytes of immunized mice in a 1/1 ratio.
  • Cytotoxicity test In order to demonstrate the cytotoxic function of the CD8 + T cells, activated by a defined peptide, the stimulated splenocytes 7 days are put in contact with the peptide, so-called effector cells, with target cells prepared as follows.
  • Cells expressing the same MHC as the splenocytes of the immunized mice cultured in the laboratory are incubated with peptide at 10 ⁇ g / ml at a concentration of 10 million cells per ml for 2 hours at room temperature.
  • peptide for RMA cells S HHD, the day before, it is necessary to put them in boxes previously conditioned with CO 2 at a concentration of 10 6 cells per ml in RPMI medium, L-glutamine 2mM, penicillin 100U / mL, streptomycin 100 ⁇ g / mL, betamercaptoethanol 5nM, 1mM sodium pyruvate, 1X non-essential amino acids, 10mM hepes, serum-free, at room temperature overnight.
  • the target cells are then labeled with 10 ⁇ Cu of chromium 51 per million cells (Perkin Elmer, 5mCu / mL) and incubated for 1 hour in a water bath at 37 ° C. Then, they are washed three times, counted, suspended at 200,000 cells per mL in CRT medium (RPMI 1640, 2 mM L-glutamine, penicillin 100 LVmL, streptomycin 100 ⁇ g / mL, 10% FCS (PAA laboratories), 10 mM hepes, diluted 1/4 and distributed under 100 ⁇ L, or 5000 cells in the end, in all the wells of the corresponding plate 96 wells with round bottom (Falcon), after having deposited the effector cells.
  • CRT medium RPMI 1640, 2 mM L-glutamine, penicillin 100 LVmL, streptomycin 100 ⁇ g / mL, 10% FCS (PAA laboratories)
  • 10 mM hepes diluted 1/4 and distributed
  • the splenocytes in culture are counted, washed, and resuspended in a CRT medium at 5 million per ml to obtain a first effect / target ratio of 100/1.
  • 150 ⁇ l of effectors are dispensed into the first three wells of the second line of the plate from which three successive 1/3 dilutions are made directly in the plate.
  • the plates are centrifuged for 1 minute at 1000 rpm in order to bring the cells into contact and then incubated for 4 hours at 37 ° C., 5% CO 2. 50 .mu.l of the supernatant from each well are then collected after centrifugation of the plates for 5 minutes at 1000 rpm, which is placed with 100 .mu.l of scintillant in plates of counting (Perkin Elmer, France) to microbeta. The radioactivity is then measured in a microbeta counter (ref).
  • the percentage of lysis is obtained by the following formula: Average number of cpm of the 3 wells - average of the cpm in the 6 wells 0% / average cpm 100% - average cpm 0%
  • Specific lysis is calculated by subtracting the percentage of lysis obtained for the non-specific target from that obtained for the specific target. The result is positive when the percentage of specific lysis is greater than 10% for two consecutive Effector / Target reports.
  • the splenocytes are incubated with the peptide at 2 ⁇ g / ml in complete MEM alpha medium supplemented with TCGF (T CeII Growth Factor) at 1/20 for 3 to 4 days. The day before the marking, the medium is replaced by the complete alpha MEM. At least 200,000 of these splenocytes previously re-stimulated in vitro are distributed in 4 wells of a 96-well round bottom plate.
  • the cells of two out of four wells are incubated for one hour at 37 ° C., 5% CO2 with the peptide at 4 ⁇ g / ml under 100 ⁇ l of complete MEM alpha, while the other two wells do not receive peptide (wells). middle). Then, the secretion of IFN- ⁇ is blocked with brefeldin A at 4 ⁇ g / ml (1 mg / ml, Sigma) under 100 ⁇ l in all the wells, for 4 hours at 37 ° C., 5% CO2. The cells are then washed twice in FACS solution (1X PBS, 0.1% azide, 1% BSA).
  • the surface labeling is performed on the cells of a well which has received peptide and a medium well by the addition of 50 ⁇ l of surface antibodies, namely anti-CD4 FITC (IgG2b, k, BD Biosciences) and anti -CD8 APC (IgG2a, k, BD Biosciences) diluted 1/50 in FACS solution.
  • the other two wells are incubated with 50 ⁇ L of control isotypes (BD Biosciences) also diluted 1/50 in FACS solution. Two washes are again performed after incubation for 30 minutes at + 4 ° C., and then the cells are fixed in FACS solution formaldehyde 2% for a minimum of 30 minutes.
  • the cells are washed twice in FACS solution and then once in 0.05% FACS saponin solution in order to permeabilize the membrane to perform the intracellular labeling. This is carried out by adding 50 ⁇ L of anti-IFN- ⁇ PE antibody or its isotypic control (BD Biosciences) diluted 1/100 in FACS saponin solution 0.05% for 30 minutes at +4 ° C. .
  • the cells are washed twice in 0.05% FACS saponin solution, once in FACS solution and fixed in FACS 1% formaldehyde solution. Cells can be stored at + 4 ° C before data acquisition at FACS Calibur (BD Biosciences) is performed.
  • HHD mice HLA-A * 0201
  • pcDNA3.1-HBSP vector DNA vaccination protocols were developed for other HBV viral proteins (HBs, HBx) in transgenic mice for human HLA molecules (Loirat et al., 2000, Malmassari et al., 2005). This approach was therefore used to characterize the HBSP-specific immune response.
  • the HLA-B * 0702 mice were immunized with two injections of 100 ⁇ g of DNA into the anterior tibialis muscle of the mouse, and the mice were sacrificed between seven and ten days after the booster to identify T cells. specific to HBSP.
  • the H mouse has 90 interferon gamma producer cells per million splenocytes in response to the 69-93 peptide mixture containing the HBSP B7-1 9mer peptide sequence and 75 cells per million in response to HBSP B7-1.
  • cytotoxicity tests were carried out on the same 12 mice as those of the ELISPOT test, the results of which are reported in FIG. 4, in two independent experiments. They revealed the presence of T lymphocytes specific for the HBSP B7-1 peptide. Stimulation by this peptide leads to enrichment of the splenocytes in culture in T lymphocytes capable of significantly lysing autologous targets loaded with this peptide but not with a control peptide (derived from the core protein of the hepatitis B virus) and this in all the mice tested (Figure 5). This is observed for 11 out of 11 mice tested.
  • a second DNA vector In order to increase the immunogenicity of the HBSP protein, we fused the original HBSP sequence, to the sequence of the small HBV S protein, into a pCMV.BIO vector.
  • This vector is derived from the vector pCMV-S2S encoding medium (S2S or M) and small (S) HBV envelope proteins and allows the formation of HBsAg-bearing particles capable of secretion.
  • the pCMV.BIO vector contains in the preS2 part a polylinker in phase with the coding sequence for the S protein.
  • the insertion into this vector of the original sequence of HBSP makes it possible to create a chimeric protein that can optionally be secreted. Since the HBSP protein has a low half-life, the fusion with the small envelope protein could thus contribute to the stability of the HBSP protein.
  • mice IFN-gamma-secreting T cells in response to stimulation of the GLSPTVWLS sequence peptide (amino acids 348-357) of the S protein, and in four mice. of 5 in response to stimulation with FLLTRILTI sequence peptide (amino acids 183-191). This response is strong since there are 40 to 180 IFN- ⁇ producing cells in response to peptide 5, and 55 to 250 cells in response to peptide 10. It should be noted that the results are not reported in relation to to the number of CD8 + T cells. However, an HLA-A * 0201 mouse has on average 2 to 3% of CD8 + T lymphocytes, ie 30,000 for 10 6 splenocytes. For example, mouse J which possesses 120 interferon-gamma-producing cells in response to stimulation by peptide 10 thus has 4 interferon-gamma-producing HBs peptide-specific T cells per 1000 CD8 + T cells.
  • mice had a 35-50% positive response of specific lysis directed against the HBs-5 peptide and 3 out of 4 mice tested responded to stimulation with the HBs-10 peptide.
  • the low levels of lysis observed in response to stimulation by HBSP A2-1, detectable during immunization by the vector pcDNA3-HBSP are no longer, while those observed for peptide HBSP A2-2 remain very low, only for the ratio 100/1 in mouse A.
  • this result can not be considered positive since a specific percentage of lysis is required for two consecutive ratios (FIG. 7).
  • Interferon gamma interferon-specific T cells specific for HBSP B7-1 could be demonstrated in two out of six mice tested, at a frequency of 25 and 28 interferon producing cells per million splenocytes (FIG. 8).
  • HLA-A * 0201 mice the results are not reported in relation to the number of CD8 + T cells.
  • an HLA-B * 0702 mouse has on average 12% of CD8 + T lymphocytes, ie 120000 for 10 6 splenocytes, or about 1 HBSP B7-1 specific T lymphocyte and producer of interferon gamma for 4000 CD8 T lymphocytes.
  • the response obtained with peptide 64-78 is obviously a murine response, since we also detected it in transgenic mice for the HLA-A * 0201 molecule.
  • During secondary stimulation performed on the splenocytes in culture of three mice we were able to confirm the presence of interferon gamma-secreting T cells specific for the peptide 79-93 in the mice # 7 and # 10 tested for this peptide. , but not for 15-mer 39-53, nor for 64-78.
  • the mouse 9 tested secondarily had weakly positive responses during the first ELISPOT (see Figure 9).
  • peptide SB7-1 of sequence CPGYRWMCL is recognized in the context of the class I molecules of the chimpanzee (Bertoni et al., 1998) and the SB7-2 peptide (Bertoni et al., 1998) is also recognized in this context and has been demonstrated in patients with acute hepatitis (Bertoni et al., 1997). ).
  • the lymphocytes have a strong specific response of the HBSP B7-1 peptide with a significant percentage of specific lysis of the order of 60% in all the mice tested (6/6). As a reminder, the percentage of specific lysis is obtained by subtracting the percentage of lysis from the autologous targets loaded with a control peptide at the percentage of lysis of the targets loaded with the HBSP B7-1 peptide.
  • This peptide thus contains a CD8 + T epitope capable of activating interferon gamma-producing T lymphocytes (FIG. 9) and cytotoxic T cells (FIG. 10). This is probably HBSP B7-1 whose sequence is included in this peptide.
  • the short ex vivo stimulation of splenocytes by the 79-93 peptide which contains the HBSP B7-1 9mer sequence allows the activation of CD8 + T cells secreting interferon gamma.
  • this 15-mer does not make it possible to activate T lymphocytes of an in vitro culture of splenocytes as strongly.
  • the specific lysis of autologous target cells loaded with the mouse with respect to the targets loaded with a control peptide is 30 to 40% at a ratio of 100 effector cells against a target cell.
  • the results obtained with the 9mer HBSP B7-1 peptide and the 15mers 79-93 suggest that 9mer is not optimal for stimulating T cells.
  • lymphocytes are activated by a peptide slightly different from HBSP B7-1, but contained in the 15-mer 79-93.
  • the in vitro stimulation by the 9mer makes it possible to activate cytotoxic T lymphocytes while the 15-mer is less optimal, since the percentage of specific lysis is lower.
  • This response may be related to the lower in vitro affinity of a 15 amino acid peptide for a class I HLA molecule such as HLA-B * 0702.
  • mice show that the HBSP protein is produced from our vectors, and that the in vivo cutting of this protein activates in vivo peptides-specific T lymphocytes derived from HBSP that they are able to recognize. . Indeed, ex vivo stimulation allows them to secrete interferon gamma and long-lasting stimulation in vitro to acquire a cytotoxic function.
  • HLA-A * 0201 context we have identified peptides that activate cytotoxic CD8 + T cells. These peptides had all been predicted by Bimass and SYFPEITHI computer programs. Stimulation with HBSP A2-1, HBSP A2-2 and PoI A2-2 peptides induces a response cytotoxic activity of specifically activated CD8 + T cells but remains weak.
  • mice for human class I and class II molecules can be produced (Pajot et al., 2004a, Pajot et al., 2004b, the contents of which are incorporated by reference). These mice are genetically disabled for mouse molecules.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • PBMCs were collected by Ficoll purification from HBV-infected patients with biopsy-proven chronic hepatitis, and HBV replication (nine HLA-A2 + patients, referenced P1 to P9, and seven HLA-B7 + patients). referenced under P10 to P16). None of these patients were on immunosuppressive therapy, or had HIV, hepatitis C, or hepatitis C related infections.
  • HBV-negative individuals The PBMCs of six HBV-negative individuals were also included in the study as controls (three HLA-A2 + individuals, referenced C1 to C3, and three HLA-B7 + individuals, referenced under C4 to C6).
  • PBMCs are preserved by nitrogen freezing until use.
  • the PBMCs were then thawed, washed and incubated in complete medium (RPMI 1640 medium, supplemented with 2mM L-glutamine, 1mM sodium pyruvate, non-essential amino acids, penicillin 100 U / mL, streptomycin 100 micrograms / mL and human serum AB 10% (Jacques Boy Institute, Reims, France)) overnight at 37 0 C under CO 2 at 5%.
  • complete medium RPMI 1640 medium, supplemented with 2mM L-glutamine, 1mM sodium pyruvate, non-essential amino acids, penicillin 100 U / mL, streptomycin 100 micrograms / mL and human serum AB 10% (Jacques Boy Institute, Reims, France)
  • the cells were stimulated by incubation for three days with 10 micrograms / mL of HLA-A2 or HLA-B7 restricted peptides, or with 15-mer peptide pools from HBSP region 39-111 (1 microgram). / mL of each peptide), each pool containing three to four peptides.
  • Half of the medium was replaced every 3-4 days by complete medium supplemented with recombinant IL-2 (50 IU / mL) (Roche, Meylan, France). After 10 days of culture, the producer cells were specifically quantified by ELIspot.
  • nitrocellulose membrane-bottomed multiwell plates (Millipore, Bedford, MA) were coated with an anti-interferon gamma monoclonal antibody (1-DIK, 15 micrograms / mL, Mabtech, Sweden), and wells were blocked with 200 microL of serum human AB at 5% in PBS at room temperature for 2 hours. The wells thus saturated were filled in triplicate by cells stimulated in vitro (10 5 / well) in complete medium and with the appropriate peptides (1 microgram / ml). A Zeiss ELISPOT automatic counter was used to determine the number of spots.
  • the response was considered positive when the median number of each spot cell triplicate (SFC), stimulated with the appropriate peptides, was at least twice that of the control wells containing the medium alone, and at least 5 cells forming spot by 10 5 PBMCs were detected after subtraction of background noise.
  • SFC spot cell triplicate
  • the T responses were first analyzed by an interferon gamma assay by ELIspot, using two peptides that were immunogenic in HLA-A2 transgenic mice (HBSP A2-1 and HBSP A2-2).
  • HBSP A2-1 and HBSP A2-2 two peptides that were immunogenic in HLA-A2 transgenic mice
  • four of the nine HLA-A2 + patients (patients 1, 2, 4, 5) exhibited significant T-cell activation with the HBSP A2-1 peptide (see Figure 13A).
  • incubation with the HBSP A2-2 peptide did not induce significant release of IFN-gamma for the eight patients tested (see Figure 13B).
  • PBMCs from four HLA-B7 + patients were stimulated in vitro with a mixture of the wild-type peptide and the three variant peptides, and then tested by ELIspot using the individual peptides.
  • T cells cross-reacting with variant peptides derived from genotypes D and E were observed. This contrasts with the weak response T obtained by stimulation with the peptides derived from genotypes C or F (see FIG. 13D).
  • the cells of this particular patient were not found to be sensitive to stimulation with the HBSP-B7-1 peptide derived from genotype A (see Figure 13C).
  • HBV-negative controls showed T cells responding to HBSP A2-1 or HBSP B7-1 peptide after stimulation (see FIGS. 13A, 13B, 13C, individuals C1 to C3 and C4 to C6). It thus appears that the HBSP B7-1 epitope can be generated during the natural process of HBV infection, but that it would not be a dominant epitope in this context.
  • HBSP-specific T cells were detected using peptide pool 54-78 (peptide 54-68 referenced under SEQ ID NO: 7 + peptide 59-73 referenced as SEQ ID NO: 10 + peptide 64-78 referenced under SEQ ID NO: 12).
  • peptides from this pool were used individually to activate T cells in ELIspot assays, each peptide in this pool was shown to be able to activate interferon gamma production by T cells (see Figure 14B).
  • the PBMCs of six HBV-negative individuals did not produce significant levels of interferon gamma after exposure to these peptides (see Figure 14A).
  • the 15-mer peptides used in ELIspot assays can react with MHC class I molecules and class II MHC molecules, we have analyzed the phenotype of IFN-gamma-producing T cells in some patients.
  • the HBSP-specific T cells activated by the peptides included in the 54-78 pool have been shown to be CD4 + cells, and several different peptides are recognized (see Figure 14B).
  • Using intracellular cytokine staining we found that these CD4 + T cells are able to produce both IFN-gamma and IL-2 cytokines in response to peptide stimulation (see Figure 15).
  • H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic mice a versatile animal model for preclinical evaluation of antitumor immunotherapeutic strategies.
  • HLA-B * 0702 transgenic, H-2KbDb double-knockout mice phenotypical and functional characterization in response to influenza virus.
  • hepatitis B spliced protein HBSP
  • HBSP hepatitis B spliced protein
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate
  • BSA bovine serum albumin (bovine serum albumin)
  • CMV cytomegalovirus MHC: major histocompatibility complex
  • CTL cytotoxic T lymphocyte (cytotoxic T lymphocyte)
  • Elispot enzyme linked immunospot (immuno-spot by enzymatic binding)
  • FACS fluorescence activated cell sorter (fluorescence activated cell sorter)
  • FITC fluorescein isothiocyanate (fluorescein isothiocyanate)
  • HBSP hepatitis B spliced protein (spliced protein of hepatitis B)
  • HHD human human D b (Human human b )
  • HLA human leucocyte antigen (major human histocompatibility complex)
  • IFN interferon
  • Ig immunoglobulin
  • LPS lipopolysaccharide
  • Pb PBS base pair: phosphate buffer saline (phosphate buffer)
  • PBST phosphate buffer salt tween 0.05%
  • PE phycoerythrin
  • NBT nitroblue tetrazolium (nitrobleu tetrazolium)
  • TAP transporter associated protein
  • TCGF T cell growth factor
  • TGF ⁇ i transforming growth factor
  • HBV hepatitis B virus

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Abstract

La présente demande de brevet est relative à des épitopes de la protéine HBSP, et à leurs applications biotechnologiques et médicales, notamment pour le traitement de l'hépatite B chronique.

Description

TITRE DE L'INVENTION :
Épitopes de la protéine HBSP et leurs applications biotechnologiques et médicales, notamment pour le traitement de l'hépatite B chronique.
DOMAINE TECHNIQUE :
La présente demande de brevet est relative à des épitopes de la protéine HBSP, et à leurs applications biotechnologiques et médicales, notamment pour le traitement de l'hépatite B chronique.
ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIQUE :
Le virus de l'hépatite B (VHB) de la famille des Hepadnaviridae est un virus enveloppé à ADN partiellement double brin de 3,2 kb qui possède 4 ORF à partir desquels sont transcrits des ARNm de différentes tailles. L'ARNm prégénomique de 3,5 kb code pour les protéines de capside (HBc, HBe), et pour la polymérase (PoI), tandis que les ARNm de 2,4 kb, 2,1 kb codent les trois protéines d'enveloppe (HBs), et celui de 0,7 kb la protéine X (HBx) (Seeger and Mason, 2000). De plus, d'autres ARNm issus de l'épissage alternatif de l'ARNm prégénomique ont été mis en évidence et seraient encapsidés dans des particules virales défectives (Rosmorduc et al., 1995). Récemment, une nouvelle protéine virale, HBSP (hepatitis B spliced protein), traduite à partir de l'ARN épissé de 2,2 kb, majoritairement présent au sein de ces particules défectives, a pu être identifiée (Soussan et al., 2000). Suite à cet épissage, la protéine HBSP est constituée en sa partie N-terminale des 46 premiers acides aminés de la polymérase du VHB, et de 65 acides aminés codés dans une autre phase de lecture, appartenant de manière propre à HBSP en sa partie C-terminale.
La protéine HBSP est détectée par immunohistochimie dans des biopsies de foie de porteurs chroniques du VHB (Soussan et al., 2000), et 30 à 40 % d'entre eux possèdent des anticorps dirigés contre la protéine (Soussan et al., 2003).
RÉSUMÉ DE L'INVENTION :
La présente demande de brevet est relative à des épitopes de la protéine HBSP, et à leurs applications biotechnologiques et médicales, notamment pour le traitement de l'hépatite B chronique. Elle propose notamment des peptides ou polypeptides, mono- ou poly- épitopiques, qui sont capables d'induire une réponse immunitaire dirigée contre le VHB, et notamment une réponse immunitaire cellulaire, de préférence une réponse T (T CD4+, TCD8+), notamment une réponse T CD8+. Des peptides ou polypeptides selon l'invention sont capables d'induire ou stimuler une activation de cellules T CD4+, plus particulièrement d'induire ou stimuler la production de cytokines, par exemple des cytokines de type 1 telles que NFN gamma, et/ou des cytokines de type 2. Des peptides ou polypeptides selon l'invention sont notamment capables d'induire une activation de cellules T CD8+ et/ou une induction et/ou stimulation de la différentiation de cellules T CD8+ en CTL, et plus particulièrement en CTL capables de lyse spécifique.
Les peptides et polypeptides selon l'invention comprennent au moins un fragment de HBSP, ou au moins un analogue d'un tel fragment, ou sont constitués d'un tel fragment ou analogue.
La présente invention est également relative aux épitopes de cette protéine, aux oligonucléotides ou polynucléotides codant les peptides, polypeptides et épitopes selon l'invention, aux vecteurs portant un tel oligonucléotide ou polynucléotide, aux cellules hôtes transfectées, infectées et/ou transformées par un tel oligonucléotide ou polynuciéotide, ou par un tel vecteur.
La présente invention est également relative aux applications thérapeutiques et/ou préventives et/ou palliatives des produits selon l'invention. Les peptides, polypeptides, épitopes, oligonucléotides, polynucléotides, vecteurs et cellules hôtes selon l'invention trouvent en effet des applications d'intérêt tout particulier pour une immunisation thérapeutique et/ou préventive et/ou palliative contre une maladie ou un état lié à une infection ponctuelle ou chronique par le virus de l'hépatite B (VHB).
La présente invention est particulièrement relative aux objets visés par les revendications de la demande telle que déposée. PRESENTATION DES FIGURES :
Figures 1A, 1B et 1C :
(A) Schéma du génome du VHB et des différents transcrits. (B) En (B), est représenté l'épissage de I1ARNm prégénomique de 3,5 kb du VHB qui permet la synthèse de la protéine HBSP.
(C) En (C), sont présentées les constructions des plasmides pcDNA3.1 HBSP (insertion de séquence codant les 111 acides aminés de HBSP); pCMV.S2S et pCMV.B10-HBSP (insertion de séquence codant les acides aminés 39 à 111 de HBSP).
Figure 2 : Test ELISPOT réalisé sur 9 souris HHD immunisées par le vecteur pcDNA3-HBSP. Le nombre de spots par million de splénocytes est calculé en soustrayant la médiane des puits contrôle (milieu) à la médiane des puits testés (avec peptide). Un nombre minimum de 20 spots par million de splénocytes est considéré positif.
Figure 3 : Test de cytotoxycité réalisé sur 6 souris HHD immunisées par le vecteur pcDNA3-HBSP. Après stimulation des splénocytes pendant sept jours avec les peptides HBSP A2-1 , HBSP A2-2 et PoI A2-2, ces cellules effectrices ont été mises en présence de cibles autologues chargées avec le peptide spécifique ou contrôle. Les graphes montrent le pourcentage de lyse spécifique à différents rapports effecteurs/cibles, c'est-à-dire le pourcentage obtenu en soustrayant la lyse de la cible contrôle à la lyse de la cible spécifique. Le résultat est positif lorsque le pourcentage de lyse spécifique est supérieur à 10 % pour deux rapports consécutifs.
Figure 4 : Test ELISPOT réalisé sur deux séries de 6 souris HLA-B*0702 (A à F et G à L) immunisées par le vecteur pcDNA3-HBSP et sacrifiées lors d'expériences indépendantes. Comme dans les autres essais ELISPOT, le nombre de spots est calculé en soustrayant la médiane des puits contrôle à celle des puits stimulés et considéré comme positif lorsqu'il est supérieur à 20 par million de splénocytes. Figure 5 : Test de cytotoxicité réalisé sur les souris HLA-B*0702 mettant en évidence la forte lyse spécifique (pourcentage de la lyse de la cible spécifique moins le pourcentage de la lyse de la cible contrôle) en réponse à la stimulation par HBSP B7-1. Le graphe ne représente pour la stimulation par HBSP B7-1 que 5 souris sur 11 testées, et pour la stimulation par PoI B7-1 , que 6 souris sur 12 testées.
Figure 6 : Sécrétion d'IFN-γ observée par test ELISPOT ex vivo chez des splénocytes de souris HHD immunisées par le vecteur pCMV.B10-HBSP. La réponse spécifique de la protéine HBs est importante (pep 5 et pep 10). La réponse spécifique de HBSP est essentiellement dirigée contre le 15mers 64-78, et pour la souris I, contre le 15mers 59-73.
Figure 7 : Mise en évidence de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de HBs-5 et HBs-10 chez les souris HHD immunisées par le vecteur pCMV.B10-HBSP, mais pas de HBSP A2-1 et de HBSP A2-2.
Figure 8 : Marquage intracytoplasmique réalisé pour la stimulation par le peptide HBSP 79-93. Le graphe de gauche montre la sécrétion d'IFN-γ par les cellules CD8+ présentes dans le milieu. Le graphe de droite représente la sécrétion d'IFN- γ par les cellules CD8+ présentes dans le puits stimulé par le peptide 79-93.
Figure 9 : le graphe du haut montre la sécrétion d'IFN-γ ex vivo dans un test ELISPOT en réponse aux peptides dérivés de la protéine HBSP, et de 4 peptides dérivés de HBs chez des souris HLA-B*0702 immunisées par le vecteur pCMV.B10-HBSP. Le graphe du bas représente les résultats après stimulation secondaire avec les peptides 15mers 39-53, 59-73, 64-78, et 79-93. Figure 10 : Mise en évidence de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de HBSP B7-1 , et du 15mers 79-93. Aucune souris ne répond à la stimulation par HBs 62 et HBSP 39-53.
Figure 11 : séquences nucléotidiques codant le fragment 39 à 111 de HBSP (SEQ ID NO :1 ), et codant la protéine HBSP complète (SEQ ID NO :2), et séquence protéique complète de HBSP (SEQ ID NO :3).
Figure 12 : séquences de peptides, polypeptides et épitopes selon l'invention (tableau 2, présentant les SEQ ID NO :4 à 16).
Figures 13A, 13B, 13C, 13D :
Détection parmi les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) de patients infectés par VHB de cellules produisant de l'interféron gamma (IFN gamma, ou IFN-γ) en réponse à une stimulation exercée par des peptides prédits par ordinateur.
Les ELIspot à IFN gamma ont été réalisés avec les peptides indiqués. Ont été analysées les PBMC de neuf patients HLA-A2+ présentant une infection chronique à VHB (patients P1 à P9) (Figures 13A, 13B), et de sept patients HLA- B7+ présentant une infection chronique à VHB (patients P10 à P16) (Figures 13C, 13D) et, à titre de témoins, de six sujets C1 à C3 (Figures 13A, 13B) et C4 à C6 (Figures 13C, 13D) correspondant à des individus VHB-, VHC et VIH-négatifs. Les résultats sont exprimés en nombre de cellules T sécrétrices d'IFN gamma / 106 PBMC. Les réponses ont été considérées comme étant positives lorsque l'IFN gamma était >50 spots/106 PBMC et était supérieur à au moins deux fois le bruit de fond (mesuré sur milieu). En Figure 13D, les PBMC de quatre patients HLA- B7+ présentant une infection chronique à VHB ont été stimulées in vitro à l'aide d'un pool de variants naturels du peptide HBSP B7-1 (cf. tableau 4 ci-dessous), et sont quantifiées les cellules qui sécrètent de l'interféron gamma après stimulation avec le peptide indiqué.
Figure 14 : Détection parmi les PBMC de patients infectés par VHB de cellules sécrétant de l'IFN gamma en réponse à une stimulation par un peptide 15mer. Les PBMC de douze individus chroniquement infectés par VHB et de six témoins sains ont été stimulées in vitro avec quatre pools de peptides 15-mers et les cellules qui sécrètent de l'interféron gamma sont quantifiées par test ELIspot. Les réponses positives observées après stimulation avec le pool peptidique 54-78 ont été plus avant caractérisées en utilisant les trois peptides du pool sous forme individuelle. Les résultats sont exprimés comme en Figures 13A-13D.
Figure 15 :
Coloration intracellulaire de cellules T HBSP-spécifiques.
Les PBMC de patients présentant une infection chronique à VHB ont été stimulées avec des peptides 15-mers HBSP-réactifs, et la caractérisation phénotypique des cellules T produisant des cytokines a été réalisée. La coloration intracellulaire pour la production d'IFN gamma et IL-2 a été examinée pour le patient P1 (panneaux du haut) et pour la production d'interféron gamma seulement pour le patient P2 (panneau du bas). Les pourcentages de cellules T CD4+ productrices d'interféron gamma ou d'IL-2 sont indiqués dans le coin en haut à droite de chaque panneau. Les résultats de témoins négatifs étaient <0,02% dans tous les cas.
Le phénotypage des PBMC a été réalisé à l'aide d'anticorps anti-HLA-A2 conjugués à la PE (BB7-2) et d'anticorps anti-HLA-B7 conjugués à la FITC (BB7- 1) (Serotec, Oxford, UK). Pour les expériences de coloration de cytokines intracellulaires, des PBMC multipliés in vitro ont été placés une nuit durant en présence ou absence de peptide (1 microgramme/mL) et de Bréfeldine A (2 microgrammes/mL ; Sigma). Les cellules ont été lavées et incubées avec des anticorps anti-CD6 humains conjugués à PerCP et anti-CD4 humains conjugués à la PE. Les cellules présentant une coloration sur leur surface ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 2% dans du PBS. Les cellules fixées ont été replacées en suspension dans un tampon de perméabilisation (tampon phosphate salin 0,5% albumine de sérum bovin ; 0,5% saponine et azide de sodium 0,05%), et incubées avec des anticorps monoclonaux anti-IFN gamma ou anti-IL-2 conjugués à la FITC (BD Biosciences, Le Pont de Claix, France) pour permettre une analyse en cytométrie de flux des cellules T peptide-spécifiques.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE :
La présente invention est relative à des peptides ou polypeptides mono- ou poly- épitopiques qui sont capables d'induire une réponse immunitaire dirigée contre
VHB.
Les peptides ou polypeptides selon l'invention peuvent être des peptides ou polypeptides naturels, ou des fragments de protéine ou polypeptide naturel, ou bien être des peptides ou polypeptides recombinants, ou bien être des peptides ou polypeptides synthétiques.
Toute technique de synthèse connue de la personne du métier peut être utilisée.
Des exemples de techniques de synthèse, telles que la synthèse en phase solide de type Merrifield, peuvent être par exemple trouvées dans l'ouvrage « Solid
Phase Peptide Synthesis » (J. M. Steward & J. D. Young, 1969, Ed. W.H. Freeman
Co., San Francisco), ou « Peptide synthesis » (M. Bodansky et al. 1976, John
Wiley & Sons, 2πd Edition).
Les peptides ou polypeptides mono- ou poly-épitopiques selon l'invention comprennent au moins un fragment de HBSP, ou au moins un analogue d'un fragment, ou sont constitués d'un tel fragment ou analogue.
La séquence protéique complète de HBSP est constituée de 111 acides aminés, présentés en figure 11 (SEQ ID NO :3). Une séquence nucléotidique codant la protéine complète est présentée sous SEQ ID NO :2 en Figure 11.
La présente demande de brevet est relative à des peptides ou polypeptides mono- ou poly-épitopiques, capables d'induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB, qui :
- sont constitués de 6 à 80 acides aminés, et - comprennent au moins un fragment ou analogue parmi :
- un fragment de la protéine HBSP (Hepatitis B spliced protein) d'au moins 6 acides aminés, et d'au plus 80 acides aminés,
- un analogue conservateur d'un tel fragment, ledit analogue étant un peptide ou polypeptide constitué d'au moins 6 et d'au plus 80 acides aminés, qui dérive dudit fragment par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB, ou bien qui sont constitués d'un tel fragment ou analogue.
De préférence, ledit fragment de HBSP et ledit analogue conservateurs sont chacun, indépendamment l'un de l'autre, constitués de 6 à 72 acides aminés, de préférence de 6 à 65 acides aminés, par exemple de 6 à 46 acides aminés, préférablement de 6 à 35 acides aminés, plus préférablement de 6 à 20 acides aminés, par exemple de 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 acides aminés, notamment de 6 à 16 acides aminés, par exemple de 6, 7, 8, 9,
10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16 acides aminés, plus particulièrement de 6, 7, 8, 9, 10,
11 , 12, 13, 14 ou 15 acides aminés.
Avantageusement, ledit fragment de la protéine HBSP est constitué d'au moins 6 acides aminés, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés, et est constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement au plus 15 acides aminés, notamment de 6 à 15 acides aminés, de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés.
Avantageusement, ledit analogue conservateur est un peptide ou polypeptide constitué d'au moins 6, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés, et d'au plus 25 acides aminés, préférentiellement au plus 20 acides aminés, notamment de 6 à 20 acides aminés, par exemple de 9 à 20 ou de 9 à 15 acides aminés.
La présente demande vise en tant que tels lesdits fragments et analogues.
Un peptide ou polypeptide selon l'invention peut être constitué d'un seul fragment ou analogue.
Il peut également être constitué de plusieurs fragments ou analogues, par exemple au moins deux, ou au moins trois fragments et/ou analogues. Un polypeptide ou polypeptide selon l'invention peut contenir ces fragments de manière contiguë ou non contiguë : ils peuvent être dans un état de « contiguïté/non contiguïté » différent de celui dans lequel ils se trouvent dans la protéine native HBSP, ou au contraire se trouver dans le même état de « contiguïté/non contiguïté » que dans la protéine HBSP native complète. Ces fragments peuvent être placés dans le même ordre, ou au contraire dans un ordre différent, de celui dans lequel ils se trouvent dans la protéine HBSP native complète.
Un peptide ou polypeptide selon l'invention peut ainsi être constitué de 6 à 72 acides aminés, de préférence de 6 à 65 acides aminés, par exemple de 6 à 46 acides aminés, préférablement de 6 à 35 acides aminés, plus préférablement de 6 à 20 acides aminés, par exemple de 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 acides aminés, notamment de 6 à 16 acides aminés, par exemple de 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16 acides aminés, plus particulièrement de 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 ou 15 acides aminés.
Avantageusement, ledit peptide ou polypeptide selon l'invention est constitué d'au moins 6 acides aminés, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés, et est constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentieilement au plus 15 acides aminés, notamment de 6 à 20 acides aminés, de 6 à 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés.
Un peptide ou polypeptide selon l'invention peut en outre être associé, couplé ou fusionné à une ou des séquences aminoacides qui ne dérivent pas de HBSP. Par exemple, il peut être associé, couplé ou fusionné à une ou des séquences aminoacides qui ne dérivent pas de HBSP, et qui ont la capacité à augmenter l'immunogénicité du peptide ou polypeptide, et/ou bien qui ont la capacité de diriger le peptide ou polypeptide vers des cibles biologiques particulières, par exemple des cibles cellulaires avantageuses pour le traitement, la palliation et/ou la prévention d'une maladie ou d'un état lié à une infection, à VHB ponctuelle ou chronique.
Un peptide ou polypeptide selon l'invention peut par exemple être associé, couplé ou fusionné à une ou des autres séquences aminoacides qui dérivent de VHB, mais qui ne dérivent pas de HBSP. Par exemple, ledit peptide ou polypeptide peut être associé, couplé ou fusionné à une séquence ou partie de séquence de protéine d'enveloppe de VHB, par exemple une séquence ou partie de séquence de protéine S. Ledit fragment de HBSP peut avoir pour séquence la séquence qui s'étend des positions 39 à 111 de HBSP (jonction entre la séquence commune avec la polymérase, et la partie « originale » de la séquence de HBSP), ou est un sous- fragment conservateur d'au moins 6 acides aminés de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous- fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés.
Ledit fragment de HBSP peut ainsi avoir pour séquence la séquence qui s'étend des positions 39 à 63 de HBSP, ou est un sous-fragment conservateur d'au moins 6 acides aminés de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous-fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés.
Ledit fragment de HBSP peut ainsi avoir pour séquence la séquence qui s'étend des positions 39 à 53 de HBSP (EDLHLQLPNDPRPPV ; SEQ ID NO :15), ou est un sous-fragment conservateur d'au moins 6 acides aminés de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous- fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. La séquence de SEQ ID NO :16 (LPNDPRPPV), qui est identique à la séquence qui s'étend des positions 45 à 53 de la protéine HBSP complète, est un exemple de sous-fragment conservateur de la séquence de SEQ ID NO :15.
Ledit fragment de HBSP peut avoir pour séquence la séquence qui s'étend des positions 47 à 111 de HBSP (partie « originale » de la séquence de HBSP), ou est un sous-fragment conservateur d'au moins 6 acides aminés de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous-fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Ledit fragment de HBSP peut ainsi être constitué d'une séquence choisie parmi les séquences qui s'étendent des positions suivantes de HBSP : a) 79 à 93 (RTEIAPVFPSHHLGL ; SEQ ID NO :4), b) 83 à 91 (HBSP B7-1 ; APVFPSHHL ; SEQ ID NO :5), c) 85 à 93 (VFPSHHLGL ; SEQ ID NO :6) d) 54 à 68 (FM 5-L ; RDPAKPARLLLKATL ; SEQ ID NO :7), e) 55 à 63 (DPAKPARLL ; SEQ ID NO:8), f) 58 à 66 (KPARLLLKA ; SEQ ID NO:9), g) 59 à 73 (P-15-V ; PARLLLKATLCIPHV ; SEQ ID NO :10), h) 62 à 70 (HBSP A2-1 ; LLLKATLCI ; SEQ ID NO :11), i) 64 à 78 (LKATLCIPHVAVQNL ; SEQ ID NO :12), j) 67 à 75 (HBSP A2-2 ; TLCIPHVAV ; SEQ ID NO :13), ou parmi les sous-fragments conservateurs d'au moins 6 acides aminés de l'une de ces séquences a) à j), préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sous- fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous-fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9, 10, 11 , 12, 13, 14 ou 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Les séquences de SEQ ID NO :5 et NO :6 sont des exemples de sous-fragments conservateurs du fragment de SEQ ID NO :4. Les séquences de SEQ ID NO :8 et NO :9 sont des exemples de sous-fragments conservateurs du fragment de SEQ ID NO :7.
La présente demande vise en tant que tels lesdits fragments et analogues. Certains desdits fragments sont mono-épitopiques, d'autres sont poly- épitopiques, d'autres encore correspondent à des épitopes. Ainsi, le fragment dont la séquence est celle qui s'étend des positions 79 à 93 de HBSP (RTEIAPVFPSHHLGL ; SEQ ID NO :4) contient deux épitopes, à savoir :
- APVFPSHHL (HBSP B7-1 ; positions 83 à 91 ; SEQ ID NO :5), et
- VFPSHHLGL (positions 85 à 93 ; SEQ ID NO :6).
Le fragment dont la séquence est celle qui s'étend des positions 54 à 68 de HBSP (RDPAKPARLLLKATL ; SEQ ID NO :7) contient au moins deux épitopes CD8+, à savoir :
- KPARLLLKA (SEQ ID NO :9), qui est reconnu dans le contexte A2 et B7,
- DPAKPARLL (SEQ ID NO :8), qui est reconnu dans le contexte B7. Avantageusement, le fragment dont la séquence est celle qui s'étend des positions 54 à 68 de HBSP (RDPAKPARLLLKATL ; SEQ ID NO :7) contient également au moins un épitope reconnu par les lymphocytes T CD4+ de patients VHB+ ; ce fragment contient donc également au moins un épitope restreint par une molécule HLA de classe II (telle que HLA-DR, HLA-DP, etc.).
Ledit fragment de HBSP peut avoir pour séquence la séquence qui s'étend des positions 1 à 46 de HBSP (partie de la séquence de HBSP qui est commune à celle de la polymérase), ou est un sous-fragment conservateur d'au moins 6 acides aminés de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous-fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Ledit fragment de HBSP peut ainsi avoir pour séquence la séquence qui s'étend des positions 1 à 38 de HBSP, ou est un sous-fragment conservateur d'au moins 6 acides aminés de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous-fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés.
Ledit fragment de HBSP peut ainsi avoir pour séquence la séquence qui s'étend des positions 25 à 33 de HBSP (Poi B7-1 ; LPRLADEDL ; SEQ ID NO : 18), ou est un sous-fragment conservateur d'au moins 6 acides aminés de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentieilement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous-fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Ledit fragment de HBSP peut ainsi avoir pour séquence la séquence qui s'étend des positions 15 à 29 de HBSP, ou est un sous-fragment conservateur d'au moins 6 acides aminés de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous-fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés.
Ledit fragment de HBSP peut ainsi avoir pour séquence la séquence qui s'étend des positions 13 à 21 (PoI A2-2 ; LLDEEAGPL ; SEQ ID NO :14) de HBSP, ou est un sous-fragment conservateur d'au moins 6 acides aminés de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentieilement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB). Un sous- fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés.
Ladite réponse immunitaire est avantageusement une réponse à médiation cellulaire (réponse T et/ou NK).
Ledit peptide ou polypeptide selon l'invention est de préférence capable d'induire une réponse T (T CD8+ et/ou TCD4+). Ledit peptide ou polypeptide est alors capable d'induire l'activation et/ou la différentiation de cellules T (T CD8+ et/ou T CD4+).
De préférence, ledit peptide ou polypeptide est capable d'induire une réponse T CD8+ et/ou CD4+, notamment d'induire l'activation de cellules T CD8+ et/ou T CD4+, et/ou la différentiation de cellules T CD8+ en CTL. Ladite activation de cellules T se traduit alors par exemple par l'induction et/ou la stimulation d'une production de cytokines (telles que de l'IFN-gamma). Ladite différentiation de T CD8+ se traduit alors par exemple par une différentiation de T CD8+ en CTL, et plus particulièrement en CTL capables de lyse spécifique.
Ledit fragment ou, le cas échéant, ledit analogue conservateur, est de préférence restreint par le CMH, avantageusement par HLA (HLA de classe I, telle que HLA- A, HLA-B, HLA-C, HLA-F, HLA-G, HLA-H, et/ou HLA de classe II, telle que HLA- D1 par exemple HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DS, HLA- DZ).
Ledit fragment ou, le cas échéant, ledit analogue conservateur, peut par exemple être restreint par une molécule HLA de classe I, telle que une molécule HLA-A, HLA-B, ou HLA-C, HLA-F, HLA-G, HLA-H, plus particulièrement HLA-A (HLA-A1 , HLA-A2, par exemple HLA-A2), HLA-B (HLA-B1 , HLA-B2, HLA-B3, HLA-B4, HLA- B5, HLA-B6, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B9, par exemple HLA-B7, et plus particulièrement HLA-B0702, HLA-B0703, HLA-B0704, HLA-B0705, HLA-B1508, HLA-B3501 , HLA-B3502, HLA-B3503, HLA-B51 , HLA-B5301 , HLA-B5401 , HLA- B5501 , HLA-B5502, HLA-B 5601 , HLA-B5602, HLA-B6701 et HLA-B7801).
L'invention vise ainsi plus particulièrement un peptide ou polypeptide, mono- ou poly-épitopique, capable d'induire une réponse immunitaire T CD8+ et/ou T CD4+ dirigée contre VHB, caractérisé en ce que :
- il est constitué de 6 à 80 acides aminés, et en ce que
- il comprend au moins un, ou est constitué d'un fragment ou analogue parmi : - un fragment de la protéine HBSP {Hepatitis B spliced protein) d'au moins
6 acides aminés, et d'au plus 80 acides aminés,
- un analogue conservateur d'un tel fragment, ledit analogue étant un peptide ou polypeptide constitué d'au moins 6 et d'au plus 80 acides aminés, qui dérive dudit fragment par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ et /ou CD4+ dirigée contre VHB, et en ce que
- ledit fragment de HBSP est constitué d'une séquence choisie parmi les séquences qui s'étendent des positions suivantes de HBSP : a) de 79 à 93 (RTEIAPVFPSHHLGL ; SEQ ID NO :4), b) de 83 à 91 (HBSP B7-1 ; APVFPSHHL ; SEQ ID NO :5), c) de 85 à 93 (VFPSHHLGL ; SEQ ID NO :6), d) de 54 à 68 (R-15-L ; RDPAKPARLLLKATL ; SEQ ID NO :7), e) de 55 à 63 (DPAKPARLL ; SEQ ID NO :8), f) de 58 à 66 (KPARLLLKA ; SEQ ID NO :9), g) de 59 à 73 (P-15-V ; PARLLLKATLCIPHV ; SEQ ID NO :10), h) de 62 à 70 (HBSP A2-1 ; LLLKATLCI ; SEQ ID NO :11 ), i) de 64 à 78 (LKATLCIPHVAVQNL ; SEQ ID NO :12), j) de 67 à 75 (HBSP A2-2 ; TLCIPHVAV ; SEQ ID NO :13), k) de 13 à 21 (PoI A2-2 ; LLDEEAGPL ; SEQ ID NO :14),
I) de 39 à 53 (EDLHLQLPNDPRPPV ; SEQ ID NO :15), m) de 45 à 53 (LPNDPRPPV ; SEQ ID NO :16), n) de 25 à 33 (PoI B7-1 ; LPRLADEDL ; SEQ ID NO : 18), ou est un sous-fragment conservateur de l'une de ces séquences a) à n), ledit sous-fragment conservateur étant constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de l'une de ces séquences a) à n) (par exemple, 6, 7 ou 8 acides aminés), et ayant conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ et/ou CD4+ dirigée contre VHB.
De préférence, ledit fragment de HBSP et ledit analogue conservateurs sont chacun, indépendamment l'un de l'autre, constitués de 6 à 72 acides aminés, de préférence de 6 à 65 acides aminés, par exemple de 6 à 46 acides aminés, préférablement de 6 à 35 acides aminés, plus préférablement de 6 à 20 acides aminés, par exemple de 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 acides aminés, notamment de 6 à 15 acides aminés, par exemple de 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, ou 15, 16 acides aminés, plus particulièrement de 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 ou 15 acides aminés. Avantageusement, ledit fragment de la protéine HBSP est constitué d'au moins 6 acides aminés, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés, et est constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement au plus 15 acides aminés, notamment de 6 à 15 acides aminés, de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Avantageusement, ledit analogue conservateur est un peptide ou polypeptide constitué d'au moins 6, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés, et d'au plus 25 acides aminés, préférentiellement au plus 20 acides aminés, notamment de 6 à 20 acides aminés, par exemple de 9 à 20 ou de 9 à 15 acides aminés.
Des exemples d'analogues conservateurs comprennent notamment ceux qui résultent de la délétion et/ou de la substitution conservative d'un ou plusieurs acides aminés d'un fragment selon l'invention.
Par exemple, les quatre premiers acides aminés N-terminaux et les deux derniers acides aminés C-terminaux de la séquence de SEQ ID NO :4 (positions 79 à 93) peuvent être délétés (il en résulte la séquence de SEQ ID NO :5). Par exemple, les six premiers acides aminés N-terminaux de la séquence de SEQ
ID NO :4 (positions 79 à 93) peuvent être délétés (il en résuite la séquence de
SEQ ID NO :6). Par exemple, dans la séquence épitopique SEQ ID NO :5 (qui est restreinte par HLA-B7), on peut substituer l'acide aminé L en position 9 par A, I, M, V, F, W ou Y, sans changer la fixation du peptide à la molécule de classe I (HLA-B7). Des variants de la séquence épitopique SEQ ID NO :5 (HBSP B7-1 ) qui dérivent de variants naturels de HBSP (séquences variantes de HBSP qui ont pu observées chez certains patients VHB-positifs) dérivent de la SEQ ID NO :5 en substituant l'acide aminé L en position 9 par P (SEQ ID NO :33 ; APVFPSHHP), ou en substituant l'acide aminé L en position 9 par P et l'acide aminé P en position 2 par L (SEQ ID NO :34 ; ALVFPSHHP), ou en substituant l'acide aminé L en position 9 par H et l'acide aminé P en position 2 par L (SEQ ID NO :35 ; ALVFPSHHH).
De tels variants constituent des exemples d'analogues conservateurs du fragment de SEQ ID NO :5, et entrent dans la portée de la présente invention. Par exemple, dans la séquence épitopique SEQ ID NO :9 (qui est restreinte par HLA-A2), on peut substituer l'acide aminé L en position 2 par V, M, I1 T ou A, sans changer la fixation du peptide à la molécule de classe I (HLA-A2). Par exemple, dans la séquence épitopique SEQ ID NO :9 (qui est restreinte par HLA-A2), on peut substituer l'acide aminé I en position 9 par V, M, L, T ou A, sans changer la fixation du peptide à la molécule de classe I (HLA-A2).
Avantageusement, ce peptide ou polypeptide est restreint par une molécule HLA de classe I et/ou de classe II.
Ce peptide ou polypeptide peut être caractérisé par le fait qu'il est capable d'induire une activation de cellules T CD8+ et/ou T CD4+, et/ou une différentiation de cellules T CD8+ en CTL.
Comme précédemment indiqué, ce peptide ou polypeptide peut comprendre un desdits fragments ou analogues, ou bien au moins deux desdits fragments ou analogues.
Il peut par ailleurs être associé, couplé ou fusionné à une protéine ou fragment de protéine autre que HBSP (fragment d'au moins 6 acides aminés), par exemple une protéine ou fragment de protéine de VHB autre que HBSP, par exemple une protéine ou fragment de protéine d'enveloppe de VHB, par exemple une protéine S ou un fragment de protéine S. L'invention vise bien entendu les séquences a) à n) ci-dessus mentionnées en tant que telles, ainsi que leurs fragments conservateurs en tant que tels, tels que ci-dessus définis.
Certaines de ces séquences sont mono-épitopiques (par exemple, les séquences b), c), e), f), h), j), k), m), n) ci-dessus mentionnées), d'autres sont poly- épitopiques (par exemple, séquence a), d) ci-dessus mentionnées). Les séquences a), b), c), e), g), I) et m) et n) sont restreintes par HLA-B (SEQ ID NO :4, 5, 6, 8, 15, 16, 18), et les séquences f), h), i), j) et k) sont restreintes par HLA-A (SEQ ID NO :9, 11 , 12, 13, 14).
Certaines de ces séquences peuvent également être restreintes par une molécule HLA de classe II. C'est notamment le cas de celles de ces séquences qui sont constituées d'au moins 9 acides aminés, telles que SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :7. La séquence mentionnée sous d) ci- dessus (SEQ ID NO :7) est à la fois restreinte par HLA-A et par HLA-B, et est en outre restreinte par une molécule HLA de classe 11.
L'invention vise ainsi plus particulièrement ceux des peptides ou polypeptides selon l'invention, qui comprennent au moins un, ou sont constitués d'un fragment ou analogue de HBSP restreint par HLA-A. Ils sont notamment caractérisés par le fait que ledit au moins un fragment de HBSP est constitué d'une séquence choisie parmi les séquences qui s'étendent des positions suivantes de HBSP : i. de 54 à 68 (RDPAKPARLLLKAT ; SEQ ID NO :7), ii. de 58 à 66 (KPARLLLKA ; SEQ ID NO :9), iii. de 62 à 70 (HBSP A2-1 ; LLLKATLCI ; SEQ ID NO :11 ), iv. de 64 à 78 (LKATLCIPHVAVQNL ; SEQ ID NO :12), v. de 67 à 75 (HBSP A2-2 ; TLCIPHVAV ; SEQ ID NO :13), vi. de 13 à 21 (PoI A2-2 ; LLDEEAGPL ; SEQ ID NO :14), ou parmi les sous-fragments conservateurs de ces séquences i. à vi., lesdits sous-fragments conservateurs étant constitués d'au moins 6 acides aminés consécutifs d'une de ces séquences i. à vi., préférentiellement d'au moins 9 acides aminés, par exemple 6, 7, ou 8 acides aminés consécutifs (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB, et plus particulièrement à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB, et plus particulièrement à être restreint par HLA-A). Un sous- fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés.
Certains de ces peptides ou polypeptides peuvent également être restreints par au moins une molécule HLA de classe II. C'est notamment le cas de ceux desdits peptides ou polypeptides qui sont constitués d'un fragment de HBSP choisis parmi SEQ ID NO :7, SEQ ID NO :12, ou d'un analogue d'un tel fragment. C'est également notamment le cas de ceux desdits peptides ou polypeptides :
- qui comprennent au moins 9 acides aminés, avantageusement au moins 9 acides aminés consécutifs d'une desdites séquences i. à vi., - préférentiellement, qui comprennent au moins 11 acides aminés, avantageusement au moins 11 acides aminés consécutifs d'une desdites séquences, à savoir en l'occurrence au moins 11 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO :7 ou SEQ ID NO :12,
- très préférentiellement, qui sont constitués de 12 acides aminés, avantageusement 12 acides aminés consécutifs d'une desdites séquences, à savoir en l'occurrence 12 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO :7 ou SEQ ID NO :12.
L'invention vise ainsi plus particulièrement ceux des peptides ou polypeptides selon l'invention, qui comprennent au moins un, ou sont constitués d'un fragment ou analogue de HBSP restreint par HLA-B. Ils sont notamment caractérisés par le fait que ledit au moins un fragment de HBSP est constitué d'une séquence choisie parmi les séquences qui s'étendent des positions suivantes de HBSP : i. de 79 à 93 (RTEIAPVFPSHHLGL ; SEQ ID NO :4), ii. de 83 à 91 (HBSP B7-1 ; APVFPSHHL ; SEQ ID NO :5), iii. de 85 à 93 (VFPSHHLGL ; SEQ ID NO :6), iv. de 54 à 68 (RDPAKPARLLLKAT ; SEQ ID NO :7), v. de 55 à 63 (DPAKPARLL ; SEQ ID NO :8), vi. de 59 à 73 (PARLLLKATLCIPHV ; SEQ ID NO :10), vii. de 39 à 53 (EDLHLQLPNDPRPPV ; SEQ ID NO :15), viii. de 45 à 53 (LPNDPRPPV ; SEQ ID NO :16), ou parmi les sous-fragments conservateurs de ces séquences i. à viii., lesdits sous-fragments conservateurs étant constitués d'au moins 6 acides aminés consécutifs d'une de ces séquences i. à viii., préférentiellement d'au moins 9 acides aminés, par exemple 6, 7, ou 8 acides aminés consécutifs (sous-fragment qui est constitué d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, préférentiellement d'au moins 9 acides aminés consécutifs de cette séquence, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB, et plus particulièrement à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB, et plus particulièrement à être restreint par HLA-B). Un sous- fragment conservateur peut avantageusement être constitué d'au plus 20 acides aminés, préférentiellement d'au plus 15 acides aminés, notamment de 9 à 15 acides aminés, par exemple de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Certains de ces peptides ou polypeptides peuvent également être restreints par au moins une molécule HLA de classe II. C'est notamment le cas de ceux desdits peptides ou polypeptides qui sont constitués d'un fragment de HBSP choisis parmi SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :7, SEQ ID NO :15, ou d'un analogue d'un tel fragment. C'est également notamment le cas de ceux desdits peptides ou polypeptides :
- qui comprennent au moins 9 acides aminés, avantageusement au moins 9 acides aminés consécutifs d'une desdites séquences i. à viii.,
- préférentiellement, qui comprennent au moins 11 acides aminés, avantageusement au moins 11 acides aminés consécutifs d'une desdites séquences, à savoir en l'occurrence au moins 11 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :7 ou SEQ ID NO :15,
- très préférentiellement, qui sont constitués de 12 acides aminés, avantageusement 12 acides aminés consécutifs d'une desdites séquences, à savoir en l'occurrence 12 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :7 ou SEQ ID NO :15.
L'invention vise ainsi plus particulièrement ceux des peptides ou polypeptides selon l'invention, qui comprennent au moins un, ou sont constitués d'un fragment ou analogue de HBSP restreint par au moins une molécule HLA de classe II. Des exemples de tels peptides ou polypeptides sont notamment caractérisés par le fait que ledit au moins fragment de HBSP est constitué d'une séquence RDPAKPARLLLKAT (positions 54 à 68 de HBSP ; SEQ ID NO :7), ou parmi les sous-fragments conservateurs de cette séquence, lesdits sous-fragments conservateurs étant constitués d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, et ayant conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD4+ dirigée contre VHB.
L'invention vise également les épitopes capables d'induire une réponse immunitaire dirigée contre VHB, qui sont constitués d'un fragment de 6 à 15 acides aminés de la protéine HBSP (Hepatitis B spliced protein), de préférence de 9 à 15 acides aminés, notamment de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés. Sont plus particulièrement visés les épitopes de HBSP (Hepatitis B spliced protein), qui sont choisis parmi : A. les peptides qui sont constitués de 6 à 15 acides aminés consécutifs (par exemple, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 ou 15 acides aminés), de préférence de 9 à 15 acides aminés consécutifs de l'une des séquences a) à n) suivantes : a) de 79 à 93 (RTEIAPVFPSHHLGL ; SEQ ID NO :4), b) de 83 à 91 (HBSP B7-1 ; APVFPSHHL ; SEQ ID NO :5), c) de 85 à 93 (VFPSHHLGL ; SEQ ID NO :6), d) de 54 à 68 (R-15-L ; RDPAKPARLLLKATL ; SEQ ID NO :7), e) de 55 à 63 (DPAKPARLL ; SEQ ID NO :8), f) de 58 à 66 (KPARLLLKA ; SEQ ID NO :9), g) de 59 à 73 (P-15-V ; PARLLLKATLCIPHV ; SEQ ID NO :10), h) de 62 à 70 (HBSP A2-1 ; LLLKATLCI ; SEQ ID NO :11 ), i) de 64 à 78 (LKATLCI PHVAVQNL ; SEQ ID NO :12), j) de 67 à 75 (HBSP A2-2 ; TLCIPHVAV ; SEQ ID NO :13), k) de 13 à 21 (PoI A2-2 ; LLDEEAGPL ; SEQ ID NO :14), I) de 39 à 53 (EDLHLQLPNDPRPPV ; SEQ ID NO :15), m) de 45 à 53 (LPNDPRPPV ; SEQ ID NO :16), n) de 25 à 33 (PoI B7-1 ; LPRLADEDL : SEQ ID NO : 18), et qui ont conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ et/ou
CD4+ dirigée contre VHB, ou B. les peptides qui sont constitués d'un analogue conservateur de 6 à 15 acides aminés, de préférence de 9 à 15 acides aminés, qui dérivent d'un peptide du groupe A. ci-dessus, par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ledit analogue ayant conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ et/ou CD4+ dirigée contre VHB.
Certains des épitopes de HBSP selon l'invention sont restreints par HLA-B. C'est notamment le cas des épitopes de HBSP {Hepatitis B spliœd protein), qui sont choisis parmi : A. les peptides qui sont constitués de 6 à 15 acides aminés consécutifs (par exemple, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 ou 15 acides aminés), de préférence de 9 à 15 acides aminés consécutifs, notamment de 9 ou 10 acides aminés, ou de 12 à 15 acides aminés, de l'une des séquences suivantes :
- de 79 à 93 (RTEIAPVFPSHHLGL ; SEQ ID NO :4), - de 85 à 93 (VFPSHHLGL ; SEQ ID NO :6),
- de 83 à 91 (APVFPSHHL ; SEQ ID NO :5),
- de 54 à 68 (RDPAKPARLLLKATL ; SEQ ID NO :7),
- de 55 à 63 (DPAKPARLL ; SEQ ID NO :8),
- de 59 à 73 (PARLLLKATLCIPHV ; SEQ ID NO :10), - de 39 à 53 (EDLHLQLPNDPRPPV ; SEQ ID NO :15), et qui ont conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB, ou
B. les peptides qui sont constitués d'un analogue conservateur de 6 à 15 acides aminés, de préférence de 9 à 15 acides aminés, qui dérivent d'un peptide du groupe A. ci-dessus, par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ledit analogue conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB.
L'invention vise également les épitopes de la protéine HBSP, qui sont restreints par une molécule HLA de classe I (par exemple, HLA-B), qui sont constitués d'une des séquences suivantes :
- VFPSHHLGL (positions 85 à 93 de HBSP ; SEQ ID NO :6),
- APVFPSHHL (positions 83 à 91 de HBSP ; SEQ ID NO :5), - DPAKPARLL (positions 55 à 63 de HBSP ; SEQ ID NO :8),
- LPNDPRPPV (positions 45 à 53 de HBSP ; SEQ ID NO :16), ou d'un fragment conservateur de 6 à 8 acides aminés, qui comprend au moins 6 acides aminés consécutifs, et au plus 8 acides aminés consécutifs d'une de ces quatre séquences, ledit fragment ayant conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB, et plus particulièrement à être restreint par HLA-B, ou d'un analogue conservateur de 6 à 10 acides aminés, qui dérive de l'une de ces trois séquences, ou de l'un de leurs fragments conservateurs, par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ledit analogue conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB, et plus particulièrement à être restreint par HLA-B.
D'autres épitopes de HBSP selon l'invention sont restreints par HLA-A. C'est notamment le cas des épitopes de HBSP (Hepatitis B spliced protein), qui sont choisis parmi :
A. les qui sont constitués de 6 à 15 acides aminés consécutifs (par exemple, 6, 7,
8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 ou 15 acides aminés), de préférence de 9 à 15 acides aminés consécutifs de l'une des séquences suivantes : - de 54 à 68 (RDPAKPARLLLKATL ; SEQ ID NO :7),
- de 58 à 66 (KPARLLLKA ; SEQ ID NO :9),
- de 62 à 70 (HBSP A2-1 ; LLLKATLCI ; SEQ ID NO :11),
- de 64 à 78 (LKATLCIPHVAVQNL ; SEQ ID NO :12),
- de 67 à 75 (HBSP A2-2 ; TLCIPHVAV ; SEQ ID NO :13), - de 13 à 21 (PoI A2-2 ; LLDEEAGPL ; SEQ ID NO :14),et qui ont conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB, ou
B. les peptides qui sont constitués d'un analogue conservateur de 6 à 15 acides aminés, de préférence de 9 à 15 acides aminés, qui dérivent d'un peptide du groupe A. ci-dessus, par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ledit analogue conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB. L'invention vise également les épitopes de la protéine HBSP, qui sont restreints par une molécule HLA de classe I (par exemple, HLA-A), qui sont constitués d'une des séquences suivantes :
- KPARLLLKA (SEQ ID NO :9 ; positions 58 à 66 de HBSP), - LLLKATLCI (SEQ ID NO :11 ; positions 62 à 70 de HBSP),
- TLCIPHVAV (SEQ ID NO :13 ; positions 67 à 75 de HBSP),
- LLDEEAGPL (SEQ ID NO :14 ; positions 13 à 21 de HBSP), ou d'un fragment conservateur de 6 à 8 acides aminés, qui comprend au moins 6 acides aminés consécutifs, et au plus 8 acides aminés consécutifs d'une de ces quatre séquences, ledit fragment ayant conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB, et plus particulièrement à être restreint par HLA-A, ou d'un analogue conservateur de 6 à 10 acides aminés, qui dérive de l'une de ces trois séquences, ou de l'un de leurs fragments conservateurs, par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ledit analogue conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre
VHB, et plus particulièrement à être restreint par HLA-A.
L'invention propose également une méthode pour produire un épitope de HBSP capable d'induire une réponse immunitaire T CD8+ et/ou CD4+ dirigée contre VHB, et plus particulièrement un épitope restreint par une molécule du CMH, avantageusement une molécule HLA, et notamment par une molécule HLA de classe I et/ou une molécule de classe II, comprenant : la sélection parmi : A. les peptides qui sont constitués de 6 à 15 acides aminés consécutifs (par exemple, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 ou 15 acides aminés), de préférence de 9 à 15 acides aminés consécutifs de l'une des séquences a) à n) suivantes : a) de 79 à 93 (RTEIAPVFPSHHLGL ; SEQ ID NO :4), b) de 83 à 91 (HBSP B7-1 ; APVFPSHHL ; SEQ ID NO :5), c) de 85 à 93 (VFPSHHLGL ; SEQ ID NO :6), d) de 54 à 68 (R-15-L ; RDPAKPARLLLKATL ; SEQ ID NO :7), e) de 55 à 63 (DPAKPARLL ; SEQ ID NO :8), f) de 58 à 66 (KPARLLLKA ; SEQ ID NO :9), g) de 59 à 73 (P-15-V ; PARLLLKATLCIPHV ; SEQ ID NO :10), h) de 62 à 70 (HBSP A2-1 ; LLLKATLCI ; SEQ ID NO :11 ), i) de 64 à 78 (LKATLCIPHVAVQNL ; SEQ ID NO :12), j) de 67 à 75 (HBSP A2-2 ; TLCIPHVAV ; SEQ ID NO :13), k) de 13 à 21 (PoI A2-2 ; LLDEEAGPL ; SEQ ID NO :14), I) de 39 à 53 (EDLHLQLPNDPRPPV ; SEQ ID NO :15), m) de 45 à 53 (LPNDPRPPV ; SEQ ID NO :16), n) de 25 à 33 (LPRLADEDL ; SEQ ID NO : 18), ou parmi B. les peptides qui sont constitués d'un analogue conservateur de 6 à 15 acides aminés, de préférence de 9 à 15 acides aminés, qui dérive d'un peptide du groupe A. ci-dessus, par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, d'un peptide qui est capable d'induire une réponse T CD8+ et/ou CD4+ dirigée contre VHB1 par exemple d'induire une activation de cellules T (production de cytokines, telles que IFN-gamma), et/ou d'induire la différentiation de T CD8+ en CTL (lyse-spécifique).
Des exemples de telles méthodes sont notamment décrites dans les exemples qui suivent.
Pour produire des épitopes restreints par HLA-B, la sélection peut par exemple s'opérer parmi les peptides qui sont constitués de 6 à 15 acides aminés consécutifs, notamment de 9 à 15 acides aminés (par exemple, 6, 7, 8, 9 ou 10) de la séquence RTEIAPVFPSHHLGL (positions 79 à 93 de HBSP ; SEQ ID
NO :4). Une telle sélection permet notamment d'identifier l'épitope APVFPSHHL
(HBSP B7-1 ; positions 83 à 91 de HBSP ; SEQ ID NO :5), et l'épitope VFPSHHLGL (positions 85 à 93 de HBSP ; SEQ ID NO :6).
La présente demande est également relative aux mimotopes des épitopes de HBSP.
Des méthodes pour construire des mimotopes d'un épitope donné sont connues dans l'art antérieur. Un exemple de telles méthodes est par exemple décrit dans la demande WO 86 06487 au nom de Commonwealth Sérum Laboratories Commission (US 4 833 092 dont le contenu est incorporé par référence ; EP 220 245 B1 ). De tels mimotopes peuvent avantageusement être de taille inférieure à celle de l'épitope qu'ils miment. Ils peuvent comprendre dans leur séquence des acides acides aminés alpha et/ou des acides aminés beta.
La présente demande est également relative aux anticorps dirigés contre un épitope de HBSP, de préférence aux anticorps spécifiques d'un ou plusieurs desdits épitopes, qui ne se lient pas à une séquence de la protéine HBSB qui ne serait pas épitopique (c'est-à-dire séquence de HBSP qui ne serait pas capable d'induire une réponse immunitaire contre VHB). De tels anticorps peuvent être notamment produits par immunisation d'un mammifère contre un peptide ou polypeptide selon l'invention, et isolement d'un anticorps spécifique produit. Des anticorps monoclonaux peuvent être produits (Kôhler et Milstein 1975, Nature 256 :495-497).
La présente invention est également relative aux oligonucléotides et aux polynucléotides qui codent un peptide ou polypeptide selon l'invention, ou un épitope selon l'invention. Ce codage s'effectue de préférence selon le code génétique universel, en tenant compte de la dégénérescence de ce code. Des exemples d'oligonucléotides ou polynucléotides selon l'invention comprennent notamment ceux de SEQ ID NO :19 à 32 (cf. Figure 11 présentant en SEQ ID NO :2 la séquence nucléotidique codant la protéine complète de HBSP, et sur laquelle on peut relever les positions nucléotidiques correspondant aux peptides selon l'invention ; cf. également Tableau 3 ci-dessous). Tableau 3 :
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
La présente invention est également relative aux vecteurs qui comprennent au moins un oligonucléotide ou polynucléotide selon l'invention, et aux cellules hôtes transfectées, infectées ou transformées par au moins un oligonucléotide ou polynucléotide selon l'invention, ou par au moins un vecteur selon l'invention. Des vecteurs appropriés comprennent notamment les vecteurs viraux intégratifs (rétrovirus, virus adéno-associé, lentivirus, etc.) ou non intégratifs (adénovirus, alphavirus, virus Herpès simplex, etc.), les plasmides, les phages, les YAC (Yeast Artificial Chromosome), et de manière générale tout vecteur d'expression. Un vecteur d'expression avantageux permet la production d'un épitope, peptide ou polypeptide selon l'invention in vitro et/ou in vivo.
Un vecteur portant une séquence nucléotidique codant la protéine HBSP complète, et un vecteur portant une séquence nucléotidique codant le fragment 39-111 de la protéine HBSP ont été déposés auprès de la C.N.C.M. le 27 juin 2005 (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ; Institut Pasteur ; 25, rue du Docteur Roux ; F-75724 Paris Cedex 15, France) : leurs numéros respectifs de dépôt sont CNCM I-3467 et CNCM I-3468.
En sus dudit au moins un oligonucléotide ou polynucléotide, un vecteur selon l'invention peut donc en outre comprendre un ou plusieurs éléments parmi : région de régulation de la transcription (telles que promoteur, amplificateur, site de liaison du ribosome (RBS), signal polyA), signal de terminaison, origine de réplication procaryote ou eucaryote, gène de résistance (pour la sélection), gène codant pour une étiquette de type Myc, His,Tag ou Flag. La construction d'un vecteur approprié est réalisable par la personne du métier, en fonction des objectifs poursuivis. Par exemple, le choix d'un promoteur approprié peut être en fait en fonction du type d'expression souhaité, par exemple une expression constitutive ou une expression transitoire ou une expression inductible, ou une expression forte ou faible, ou un promoteur à spécificité cellulaire ou à spécificité liée au stade de développement. Plus particulièrement, un promoteur tissu-spécifique peut être choisi en fonction de l'organe qui doit recevoir le produit. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le promoteur d'un vecteur selon l'invention est le promoteur du CMV (cytomegalovirus). Ledit vecteur peut par ailleurs également comprendre une ou des séquences qui permettent une expression conditionnelle, telles que des séquences du système Cre/Lox ou analogue.
Pour des applications qui visent l'expression in vivo du peptide ou polypeptide codé, et plus particulièrement pour des applications thérapeutiques, et/ou palliatives, et/ou préventives, notamment vaccinales, on choisira un vecteur d'expression adapté à une expression in vivo dans la cellule ou l'organisme hôte concerné, tel que par exemple un rétrovirus, et plus particulièrement un lentivirus.
Il a par exemple été construit un vecteur lentiviral dérivé de VIH-1 (pTRIP-CMV- HBSP) qui exprime HBSP.
Pour les applications thérapeutiques, et/ou palliatives, et/ou préventives, notamment vaccinales, une administration d'ADN nu (ADN non porté par un vecteur) ou d'ADN plasmidique peut par ailleurs être réalisée (injection dans les cellules musculaires par exemple) ; cf. Loirat et al., 2000; Malmassari et al., 2005, dont les contenus sont incorporés par référence). Cet ADN nu ou plasmidique peut par ailleurs être associé, couplé ou fusionné à une molécule de ciblage cellulaire et/ou à une molécule stimulant la réponse immunitaire. Il peut par ailleurs être associé à un ou plusieurs éléments facilitant la transfection, tels que liposome, polymère, conjugué.
La présente invention est également relative aux cellules génétiquement modifiées comprenant un oligonucléotide ou polynucléotide selon l'invention. Une cellule peut être infectée, transformée ou transfectée par un oligonucléotide ou polynucléotide selon l'invention, ou par un vecteur selon l'invention selon des méthodes connues de la personne du métier, par exemple par transfection chimique (phosphate de clacium, lipofectamine), les techniques lipidiques (liposome), l'électroporation, la photoporation, l'utilisation de vecteurs viraux, etc. L'infection, transformation ou transfection peut être réalisée sur un organisme unicellulaire ou pluricellulaire. Dans le cas d'organismes pluricellulaires, tels qu'un mammifère, et plus particulièrement un être humain, elle peut être réalisée in vivo ou ex vivo.
Tout type de cellule que la personne juge appropriée peut être utilisé. Il peut s'agir de cellules procaryotes ou eucaryotes, telles que des cellules de mammifères, par exemple des cellules humaines ou des cellules de mammifère non-humain, de préférence des cellules somatiques.
Parmi les cellules particulièrement intéressantes dans le cadre d'une immunisation thérapeutique, préventive ou palliative, on peut notamment citer les cellules du système immunitaire, et plus particulièrement les cellules présentatrices d'antigène (APC). Ces cellules peuvent par exemple être des cellules APC impliquées dans la reconnaissance du CMH de classe I, et plus particulièrement du HLA de classe I1 telles que des cellules dendritiques (DC), or dans la reconnaissance du CMH de classe II, et plus particulièrement du HLA de classe II, telles que les macrophages et les lymphocytes B.
L'invention vise ainsi plus particulièrement les cellules APC, et plus préférentiellement les cellules dendritiques (DC), telles qu'une cellule de Langerhans, qui ont été transfectées, infectées ou transformées par un oligonucléotide, polynucléotide ou vecteur selon l'invention.
La présente invention est également relative aux applications thérapeutiques et/ou préventives et/ou palliatives des produits selon l'invention. Les peptides, polypeptides, épitopes, oligonucléotides, polynucléotides, vecteurs et cellules hôtes selon l'invention trouvent en effet des applications d'intérêt tout particulier pour une immunisation thérapeutique et/ou préventive et/ou palliative contre une maladie ou un état lié à une infection ponctuelle ou chronique par le virus de l'hépatite B (VHB).
Les produits selon l'invention peuvent en effet prévenir et/ou traiter et/ou pallier une hépatite B, c'est-à-dire l'infection au VHB en elle-même, mais aussi prévenir et/ou traiter et/ou pallier les maladies et états pathologiques induits par une telle infection, tels que carcinome hépatocellulaire, ou, dans le cas d'une infection chronique à VHB, fibrose.
Pour les applications thérapeutiques et/ou préventives et/ou palliatives, les produits selon l'invention peuvent être utilisés sous forme libre, ou bien forme complexée ou polymérisée ou conjuguée ou autrement physiquement associée. Les peptides ou polypeptides selon l'invention peuvent par exemple être utilisés sous forme de lipopeptides, les oligonucléotides ou olynucléotides selon l'invention peuvent par exemple être utilisés sous forme de liposomes. De tels composés qui comprennent, en sus d'un produit selon l'invention (peptides, polypeptides, épitopes, oligonucléotides, polynucléotides, vecteurs et cellules hôtes selon l'invention), une composante non protéique ou nucléotidique, telle que par exemple une composante lipidique, sont visés par la présente demande. Pour les applications thérapeutiques et/ou préventives et/ou palliatives, les produits selon l'invention peuvent être utilisés en association, pour une administration simultanée ou différée, avec un ou plusieurs autres principes actifs, tel qu'un autre principe actif anti-VHB et/ou un autre principe actif anti-Virus de l'hépatite (anti-VH), par exemple anti-VHC.
La présente demande est donc relative à une composition pharmaceutique, et notamment à une composition pharmaceutique adaptée à une administration in vivo (notamment par injection), ou à une application in vitro ou ex vivo, qui comprend au moins un :
- peptide ou polypeptide selon l'invention, éventuellement sous forme de lipopeptide ou iipopolypeptide,
- épitope selon l'invention, éventuellement sous forme de lipopeptide, mimotope selon l'invention,
- oligonucléotide ou polynucléotide selon l'invention, éventuellement sous forme de liposome, - vecteur selon l'invention,
- cellule hôte selon l'invention, et plus particulièrement les cellules présentatrices d'antigène selon l'invention, chacun de ces produits pouvant se trouver sous forme sous forme libre, ou bien forme complexée ou polymérisée ou conjuguée ou autrement physiquement associée.
Avantageusement, une composition selon l'invention peut comprendre au moins un produit parmi :
- un peptide ou polypeptide selon l'invention, tel que ci-dessus défini, éventuellement sous forme de lipopeptide ou Iipopolypeptide, qui est constitué de 6 à 80 acides aminés (préférentiellement de 6 à 72, de préférence de 6 à 65, par exemple de 6 à 46 acides, tel que ci-dessus indiqué), et qui comprend au moins un exemplaire (ou est constitué) du fragment HBSP A2-1 (SEQ ID NO: 11), d'un sous-fragment conservateur de ce fragment, ou d'un analogue conservateur de ce fragment ou sous- fragment ;
- un mimotope d'un tel peptide ou polypeptide,
- un oligonucléotide ou polynucléotide qui code pour un tel peptide ou polypeptide, selon le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence de ce code,
- un vecteur comprenant un tel oligonucléotide ou polynucléotide,
- une cellule hôte, et plus particulièrement une cellule présentatrice d'antigène, transfectée, infectée ou transformée par un tel oligonuciéotide ou polynucléotide ou par un tel vecteur.
Avantageusement, une composition selon l'invention peut comprendre plusieurs desdits produits selon l'invention, par exemple, au moins deux, au moins trois ou au moins quatre produits selon l'invention. Plus particulièrement, une composition selon l'invention peut comprendre :
- au moins un produit parmi :
- un peptide ou polypeptide selon l'invention, tel que ci-dessus défini, éventuellement sous forme de lipopeptide ou lipopolypeptide, qui est constitué de 6 à 80 acides aminés (préférentiellement de 6 à 72, de préférence de 6 à 65, par exemple de 6 à 46 acides, tel que ci-dessus indiqué), et qui comprend au moins un exemplaire (ou est constitué) du fragment HBSP A2-1 (SEQ ID NO: 11 ), d'un sous-fragment conservateur de ce fragment, ou d'un analogue conservateur de ce fragment ou sous- fragment ; - un mimotope d'un tel peptide ou polypeptide,
- un oiigonucléotide ou polynucléotide qui code pour un tel peptide ou polypeptide, selon le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence de ce code (par exemple, SEQ ID NO: 26),
- un vecteur comprenant un tel oligonucléotide ou polynucléotide, - une cellule hôte, et plus particulièrement une cellule présentatrice d'antigène, transfectée, infectée ou transformée par un tel oligonucléotide ou polynucléotide ou par un tel vecteur ;
- ainsi que :
- au moins un produit parmi : o un peptide ou polypeptide selon l'invention, tel que ci-dessus défini, éventuellement sous forme de lipopeptide ou lipopolypeptide, qui est constitué de 6 à 80 acides aminés (préférentiellement de 6 à 72, de préférence de 6 à 65, par exemple de 6 à 46 acides, tel que ci-dessus indiqué), et qui comprend au moins un exemplaire (ou est constitué) du fragment HBSP B7-1 (SEQ ID NO: 5), d'un sous-fragment conservateur de ce fragment, ou d'un analogue conservateur de ce fragment ou sous- fragment (par exemple, un variant de SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :34, SEQ ID NO :35); o un mimotope d'un tel peptide ou polypeptide, o un oligonucléotide ou polynucléotide qui code pour un tel peptide ou polypeptide, selon le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence de ce code (par exemple, SEQ ID NO: 20), o un vecteur comprenant un tel oligonucléotide ou polynucléotide, o une cellule hôte, et plus particulièrement une cellule présentatrice d'antigène, transfectée, infectée ou transformée par un tel oligonucléotide ou polynucléotide ou par un tel vecteur ; et/ou
- au moins un produit parmi : o un peptide ou polypeptide selon l'invention, tel que ci-dessus défini, éventuellement sous forme de lipopeptide ou lipopolypeptide, qui est constitué de 6 à 80 acides aminés (préférentiellement de 6 à 72, de préférence de 6 à 65, par exemple de 6 à 46 acides, tel que ci-dessus indiqué), et qui comprend au moins un exemplaire (ou est constitué) du fragment HBSP A2-2 (SEQ ID NO: 13), d'un sous-fragment conservateur de ce fragment, ou d'un analogue conservateur de ce fragment ou sous- fragment ; o un mimotope d'un tel peptide ou polypeptide, o un oligonucléotide ou polynucléotide qui code pour un tel peptide ou polypeptide, selon le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence de ce code (par exemple, SEQ ID NO: 28), o un vecteur comprenant un tel oligonucléotide ou poiynucléotide, o une cellule hôte, et plus particulièrement une cellule présentatrice d'antigène, transfectée, infectée ou transformée par un tel oligonucléotide ou polynucléotide ou par un tel vecteur.
Une telle composition peut en outre comprendre un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Il peut s'agir d'un véhicule sous forme de solution ou d'émulsion physiologiquement acceptable, ou d'un excipient pharmaceutiquement acceptable (y compris de l'eau, des sels, du dextrose, du glycérol, de l'éthanol, et des combinaisons de ces excipients). Une composition pharmaceutique selon l'invention peuvent être destinée à une administration systémique ou topique. Elle peut être destinée à une administration sous-cutanée (s.c), intradermique (i.d.), intramusculaire (i.m.) or intravéneuse (i.v.) par injection, par voie orale, par voie intranasale, par inhalation. La quantité de principe actif selon l'invention à administrer (dosage de la composition) dépend du sujet à traiter, y compris de son état physiologique, de l'état de son système immunitaire, de la voie d'administration prévue, et de la taille et/ou du poids du patient. Des exemples de doses appropriées comprennent notamment de 1 microgramme à 2,5 milligrammes, pour des injections de vecteur ADN destinées à un être humain, mais peuvent être modifiées et adaptées par la personne du métier en fonction des circonstances.
Il peut s'agir d'une composition vaccinante, ou d'une composition de thérapie ou palliation par immunisation.
Lorsqu'elle destinée à une administration à l'homme pour vaccination, elle peut en outre comprendre un adjuvant de vaccination, et plus particulièrement un alun, ou un adjuvant CpG ODN.
Elle peut en outre comprendre un fragment protéique ou polynucléotide de VHB autre que ceux de la présente invention, par exemple un fragment de VHB autre qu'un fragment de HBSP, par exemple une protéine d'enveloppe, telle que la protéine S, ou un fragment d'une telle protéine, ou un oligonucléotide, ou polynucléotide codant une telle protéine ou un tel fragment de protéine, ou un vecteur comprenant un tel oligonucléotide ou polynucléotide, ou une cellule hôte transfectée, infectée ou transformée par un tel oligonucléotide ou polynucléotide. Par exemple, une telle composition peut, en sus d'un produit selon l'invention, comprendre un ou plusieurs antigènes HBs, préférentiellement sous forme de particules portant un ou plusieurs antigènes HBs, telles que les particules chimères décrites dans les brevets US 5 324 513 (dont le contenu est ici incorporé par référence), et dans le brevet EP 156 712. Les particules chimères décrites dans ces brevets, et notamment telles que définies en revendication 1 du brevet EP 156 712 B1 ou du brevet US 5 324 513, comprennent des polypeptides qui portent les sites immunogènes de l'antigène HBs et du récepteur de l'albumine humaine polymérisée du virus de l'hépatite B. Les peptides ou polypeptides selon l'invention ont la propriété de fusionner avec ces particules chimères. Une composition pharmaceutique selon l'invention peut donc avantageusement comprendre des particules portant les sites immunogènes de l'antigène HBs, et des peptides ou polypeptides selon l'invention, éventuellement fusionnés à ces particules.
Une telle composition peut en outre comprendre un ou plusieurs autres principes actifs, par exemple un autre principe actif anti-VHB et/ou un autre principe actif anti-Virus de l'hépatite (anti-VH), par exemple anti-VHC.
Les produits selon l'invention peuvent en outre être utilisés pour activer et/ou différencier des lymphocytes T (T CD8+ et/ou T CD4+), et plus particulièrement des lymphocytes T CD8+, et/ou pour induire ou faciliter la maturation de cellules APC, et plus particulièrement de cellules dendritiques (DC). La présente invention est ainsi également relative à une méthode pour activer et/ou différencier un lymphocyte T (T CD8+ et/ou T CD4+), et plus particulièrement un lymphocyte T CD8+, qui comprend la mise en contact (in vitro, in vivo ou ex vivo) dudit lymphocyte T avec au moins un élément parmi :
- peptide ou polypeptide selon l'invention,
- épitope selon l'invention, - mimotope selon l'invention,
- oligonucléotide ou polynucléotide selon l'invention,
- vecteur selon l'invention,
- cellule hôte selon l'invention, et plus particulièrement les cellules présentatrices d'antigène (APC) selon l'invention. Les cellules T mis en œuvre peuvent être issues de lignées cellulaires, ou bien être les cellules T d'un donneur (par exemple un patient souffrant d'une infection au VHB ou d'un état pathologique lié à une telle infection, ou bien donneur HLA- compatible). Cette mise en contact est de préférence réalisée dans des conditions de nutrition, d'atmosphère, de température, et de temps de contact, qui permettent l'activation et/ou la différentiation des lymphocytes T mis en contact.
Les lymphocytes T ainsi activés et/ou différenciés constituent des cellules effectrices efficaces pour lutter contre l'installation et/ou le développement et/ou la résurgence d'une infection par VHB, et/ou d'une maladie ou état pathologique lié à une telle infection, tel que carcinome hépatocellulaire et/ou fibrose.
La présente invention est également relative à une méthode pour induire et/ou stimuler la maturation de cellules APC, et plus particulièrement de cellules dendritiques (DC), qui comprend la mise, en contact (in vitro, in vivo ou ex vivo) de ladite cellule APC avec au moins un élément parmi :
- peptide ou polypeptide selon l'invention,
- épitope selon l'invention,
- mimotope selon l'invention, - oligonucléotide ou polynucléotide selon l'invention,
- vecteur selon l'invention,
- cellule hôte selon l'invention, et plus particulièrement les cellules présentatrices d'antigène (APC) selon l'invention.
Les cellules APC mises en oeuvre peuvent être issues de lignées cellulaires, ou bien être les cellules APC d'un donneur (par exemple un patient souffrant d'une infection au VHB ou d'un état pathologique lié à une telle infection, ou bien donneur HLA-compatible).
Cette mise en contact est de préférence réalisée dans des conditions de nutrition, d'atmosphère, de température, et de temps de contact, qui permettent la maturation des cellules APC.
Les cellules APC ainsi obtenues présentent un peptide, polypeptide, épitope ou mimotope selon l'invention à leur surface. Elles constituent des cellules qui ont la capacité d'activer et/ou différencier les cellules T (CD4+, CD8+), et particulièrement les cellules T CD8+, permettant ainsi de produire des cellules T efficaces contre l'installation et/ou le développement et/ou la résurgence d'une infection par VHB, et/ou d'une maladie ou état pathologique lié à une telle infection, tel que carcinome hépatocellulaire et/ou fibrose.
Les cellules T et/ou les cellules APC obtenues par une méthode selon l'invention peuvent être avantageusement administrées à un organisme en besoin d'un tel traitement, et plus particulièrement à un mammifère humain ou non-humain, à qui l'on souhaiterait administrer un traitement thérapeutique et/ou préventif et/ou palliatif contre l'hépatite B, l'hépatite B chronique, un carcinome hépatocellulaire, et/ou une fibrose.
La présente invention est illustrée par les exemples qui suivent. Ces exemples sont donnés à titre illustratifs seulement, et ne limitent l'invention en aucune façon.
EXEMPLES :
Nous avons étudié la réponse immunitaire lymphocytaire T induite par la protéine HBSP en utilisant un modèle de souris transgéniques pour les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) humain de classe I (souris HHD ou HLA-A*0201 et souris HLA-B*0702). Nous avons choisi ces deux modèles de souris transgéniques pour les molécules de classe I humaine, d'une part car la molécule HLA-A*0201 est exprimée par 50% des Caucasiens (Gulukota and DeLisi, 1996) et que l'allèle HLA-B*0702 est porté par 15-20 % des humains (Rohrlich et al., 2003), et d'autre part car ces modèles ont été validés par de nombreuses études chez l'homme. Deux constructions ont été réalisées afin de pouvoir être injectées sous forme d'ADN à ces souris. A partir du plasmide pcDNA3.1-HBSP codant pour la protéine dans son intégralité, nous avons sous- cloné la séquence de HBSP allant des acides aminés 39 à 111 à l'intérieur d'un plasmide codant pour les protéines moyenne (M) et petite (S) de l'enveloppe du virus de l'hépatite B. A la place de la séquence préS2 de la protéine M, nous avons inséré la séquence de HBSP dans la même phase de lecture. La protéine est alors fusionnée à la protéine S de l'enveloppe créant une protéine chimère et peut être sécrétée sous forme de particules portant l'antigène HBs. Nous avons immunisé ces souris par injection intramusculaire d'ADN plasmidique codant pour la protéine HBSP dans son intégralité (pcDNA3.1 HBSP) ou dans sa partie originale c'est à dire dépourvue de la partie polymérase (pCMV.BIO- HBSP). Outre les cellules musculaires, des cellules présentatrices de l'antigène ou CPA professionnelles telles que les cellules dendritiques ou les macrophages recrutées par l'inflammation et la régénération cellulaire provoquées par l'injection intramusculaire de cardiotoxine cinq jours avant la vaccination, sont présentes au niveau du site d'injection du plasmide. Ainsi, lors de l'immunisation des souris, l'ADN peut entrer dans ces cellules, être transcrit, puis traduit, permettant ainsi l'expression de la protéine HBSP. Le découpage de la protéine in vivo va permettre la présentation de peptides issus de la protéine par les molécules de classe I du CMH des souris à des lymphocytes T CD8+, et donc dans cette étude par les molécules humaines HLA-A*0201 ou HLA-B*0702. Il y aura également présentation de peptides aux lymphocytes T CD4+ dans le contexte des molécules de classe II murines. Il a été montré récemment que les cellules dendritiques permettraient une présentation croisée, phénomène appelé « cross- presentation » de la protéine directement sous sa forme native. Des peptides de 15 acides aminés chevauchant de 10 acides aminés qui couvrent Ia séquence peptidique correspondant à l'insert du plasmide pCMV.BIO- HBSP ont été synthétisés. Nous avons alors cherché la présence de lymphocytes T spécifiques de la protéine HBSP, à l'aide de tests fonctionnels qualitatifs comme le test de relargage de chrome qui vise à caractériser des lymphocytes cytotoxiques spécifiques d'un domaine antigénique de la protéine et quantitatifs comme l'ELISPOT qui permet de déterminer le nombre de cellules sécrétrices d'IFN-γ en réponse à la stimulation par un peptide.
Dans cette étude, nous avons pu identifier au sein de la protéine HBSP des peptides restreints par la molécule HLA-A*0201 possiblement épitopiques, ainsi qu'un épitope inducteur de fortes réponses T restreint par la molécule HLA- B*0702. Bien qu'il existe un vaccin efficace contre le virus de l'hépatite B, le réservoir de porteurs chroniques de ce virus reste important puisqu'il inclut 400 millions de personnes dans le monde (Ganem and Prince, 2004). De plus, l'infection par le virus de l'hépatite B est l'une des causes majeures du carcinome hépatocellulaire et demeure donc un problème de santé publique. Les traitements disponibles à l'heure actuelle reposent sur des antiviraux (la lamivudine ou l'alpha-interféron et depuis peu l'adéfovir), mais, bien qu'ils diminuent la charge virale de manière importante, ils induisent fréquemment des résistances surtout en ce qui concerne la lamivudine (Ganem and Prince, 2004). La découverte de nouveaux antiviraux et de nouvelles stratégies thérapeutiques sera donc particulièrement importante pour l'avenir des porteurs chroniques du VHB.
Quatre-vingt quinze pour cent des adultes infectés par le VHB guérissent spontanément grâce à une réponse immunitaire forte et efficace qui contrôle totalement le virus dans l'organisme. Malheureusement, cinq à dix pour cent d'entre eux vont développer une hépatite chronique. Chez ces patients, la fréquence de lymphocytes T CD4+ et CD8+ spécifiques d'antigènes viraux est basse, et insuffisante à induire la guérison. De plus, les anticorps anti-HBs (protéine de surface du virus) sont complexés aux antigènes présents dans le sérum, et sont inefficaces.
L'étude de la réponse immune dirigée contre la protéine HBSP et la mise en évidence de réponses T spécifiques nous semblent particulièrement importantes dans la mesure où cette protéine est impliquée dans la fibrogenèse chez les porteurs chroniques du VHB. Ainsi, la caractérisation immunologique de cette nouvelle protéine virale nous permettra de mieux comprendre comment cette protéine est reconnue par l'hôte et contribue à la pathogenèse du virus de l'hépatite B.
I. Matériel et méthodes
1. Plasmides
La séquence en acides aminés de la protéine HBSP consiste en une fusion des 46 premiers acides aminés de la polymérase, et de 65 acides aminés correspondant à une séquence totalement originale.
pcDNA3.1 HBSP : la séquence complète de HBSP du génotype A du génome du virus de l'hépatite B a été insérée entre les sites de restriction Hind III et Xho I du pcDNA3.1/myc-His (Invitrogen). Ce plasmide sera appelé pcDNA3-HBSP. Ce plasmide a été déposé auprès de la CN. CM. le 27 juin 2005 (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ; Institut Pasteur ; 25, rue du Docteur Roux ; F-75724 Paris Cedex 15, France). Son numéro de dépôt CNCM est : I- 3467.
pCMV.S2S : Ce plasmide code les protéines moyenne (M) et petite (S) de l'enveloppe virale du virus de l'hépatite B1 et permet la sécrétion de particules portant l'antigène HBs (Michel et al., 1995)
pCMV.B10-HBSP : nous avons sous clone la séquence de HBSP des acides aminés 39 à 111 et l'avons insérée en phase à la place de la séquence préS2 dans le plasmide pCMV.S2S (Firat et al., 1999).
Ce plasmide a été déposé auprès de la CN. CM. le 27 juin 2005 (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ; Institut Pasteur ; 25, rue du Docteur Roux ; F-75724 Paris Cedex 15, France). Son numéro de dépôt CNCM est : I- 3468. Ces constructions plasmidiques sont présentées en Figure 1 C
Afin de pouvoir être injectés aux souris, les plasmides ont été préparés avec les colonnes de purification Quiagen (endofree plasmid kit ; Quiagen, Hilden, Allemagne) et aliquotés à 1 mg/mL en PBS endotoxin free (Sigma).
2. Peptides Treize peptides 15-mers chevauchant de 10 acides aminés qui couvrent la séquence de la protéine HBSP ainsi que la jonction avec la séquence de la polymérase insérée dans la plasmide pCMV.B10-HBSP, soit des acides aminés 39 à 111 , ont été synthétisés en qualité immunograde. Des peptides épitopiques de 9 acides aminés ont été prédits à l'aide des programmes informatiques Bimass (http://thr.cit.nih.gov/) et SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/), et synthétisés par Neosystem (tableau 1 ). Ils ont tous été solubilisés dans de l'eau stérile pH 4,5 ou 50% Acétonitrile, à 1 mg/mL. Tableau 1 : Position et affinité des peptides épitopiques prédits pour se fixer à HLA-A*0201 ou HLA-B*0702. Pour les deux programmes de prédiction, les plus hauts scores correspondent à la plus haute affinité prédite.
Figure imgf000043_0001
3. Lignées cellulaires
RMA-B7 : lignée lymphocytaire murine TAP+ exprimant la molécule HLA-B*0702 après transfection, cultivée en RPMI 1640 (Invitrogen), L-glutamine 2mM (Invitrogen), pénicilline 100 U/mL (Invitrogen), streptomycine 100 μg/mL (Invitrogen), G418 500 μg/mL (PAA laboratories), 10 % SVF (sérum de veau fœtal, PAA laboratories).
RMA-S HHD : lignée lymphocytaire murine TAP- exprimant la molécule HLA- A*0201 après transfection cultivée en RPMI 1640, L-glutamine 2 mM, pénicilline 100 U/mL, streptomycine 100 μg/mL, 10 % SVF (PAA laboratories).
4. Souris
Les souris HHD ou HLA-A*0201 (Pascolo et al., 1997) expriment une molécule du CMH de classe I transgénique composée de la β2-microglobuline humaine liée de manière covalente en sa partie C-terminale à la partie N-terminale d'une chaîne lourde chimérique aux domaines α1-α2 HLA-A*0201 , et aux domaines intracytoplasmiques et transmembranaires α3 H-2Db. Les gènes murins H-2Db et de la β2-microglobuline ont été invalidés par recombinaison homologue. Les souris HLA-B7 ou HLA-B*0702 sont invalidées génétiquement pour les molécules de classe I murines et sont transgéniques pour la molécule HLA- B*0702 (Rohrlich et al., 2003).
5. Immunisation Des souris femelles âgées de 8 à 12 semaines ont été immunisées par deux injections intramusculaires à 3 semaines d'intervalle avec les plasmides pCDNA3.1 HBSP, pCMV.B10-HBSP ou pCMV.S2S, dans des expériences indépendantes. Toutes les souris ont été anesthésiées par administration intrapéritonéale d'une solution de pentobarbital sodique à 75 mg/kg (Sanofi, France). Cinq jours avant immunisation, 50μL de cardiotoxine (Latoxan, France) sont injectés dans le muscle tibialis anteήor de chacune des pattes postérieures de la souris afin de permettre une dégénération suivie d'une régénération musculaire et une inflammation au site d'injection de l'ADN. Les souris sont sacrifiées entre sept et dix jours après la deuxième injection.
6. Obtention des splénocytes
Les souris sont sacrifiées par asphyxie au CO2. Les splénocytes sont obtenus en écrasant les rates au travers d'un filtre en nylon aux pores de 70 μm de diamètre (Becton Dickinson, France). Après un lavage avec 15 mL de milieu HBSS (Invitrogen), L-glutamine 2mM, pénicilline 100 U/mL, streptomycine 100 μg/mL, 5% SVF (PAA laboratories), les globules rouges sont lysés à +4°C grâce à une solution de NH4CI (8,3 g/L, tamponné tris pH 7,2). Les cellules sont alors lavées deux fois avec le même milieu, comptées et resuspendues à la concentration désirée et dans le milieu adéquat de l'expérience réalisée.
7. Test enzyme-linked immunospot ELISPOT
Le test ELISPOT permet de quantifier, parmi les splénocytes, les cellules sécrétrices d'IFN-gamma spécifiques de l'antigène. Une plaque multi puits à fond en membrane de nitrocellulose (Millipore, Molsheim, France) est recouverte par 50 μl par puits d'une solution à 5 μg/ml d'anticorps monoclonal anti- IFN-γ (Rat anti-mouse IFN-γ, Pharmingen) dans du tampon carbonate (pH 9,6) et mise une nuit à 40C. Les plaques sont saturées en milieu 10% SVF pendant 2 heures à 37°C, 5% CO2 puis lavées trois fois en milieu sans sérum avant de distribuer les peptides à 4 μg/mL sous 100μl_ de milieu alpha MEM (Invitrogen) complet soit 10 % SVF (Myoclone), L-glutamine 2mM, pénicilline 100 U/mL, streptomycine 100 μg/mL, acides aminés non essentiels (1X), βmercaptoéthanol 50 nM, pyruvate sodium 1mM, hepes 1OmM. Les splénocytes, obtenus comme indiqué précédemment, resuspendus dans du milieu alpha MEM complet et un million de cellules sont distribuées sous 100 μL dans les puits de la plaque Elispot et mis à incuber 24 heures à 370C, 5% CO2. Chaque peptide est testé en triplicate. Cinq lavages en PBST (PBS 1X, Tween 0,05%) sont effectués de manière à éliminer les cellules et 50 μL d'anticorps biotinylé (Rat anti-mouse IFN-γ, Becton Dickinson) dilué au 1/500emΘ en PBST sont ajoutés dans les puits pendant 1 H30 à température ambiante. Les plaques sont à nouveau lavées cinq fois en PBST et incubées pendant 1 heure avec de la streptavidine conjuguée à de la phosphatase alcaline diluée au 1/1000eme en PBST. Les plaques sont révélées par ajout des substrats 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) et nitroblue tetrazolium (NBT) (Promega, Madison, Wl). Le nombre de spots est déterminé par un compteur automatique Zeiss ELISPOT et rapporté en nombre de cellules formant un spot par million de splénocytes (SFC/million splénocytes). Le nombre de cellules T spécifiques sécrétant de I' IFN-γ après stimulation spécifique est obtenu à partir de la valeur médiane pour chaque triplicate en soustrayant la médiane du nombre de spots obtenus pour les puits contrôles où il y a seulement le milieu. La réponse mesurée est considérée positive si la médiane des spots est supérieure à 20 et si le nombre de spots pour la stimulation spécifique est supérieur à deux fois le bruit de fond obtenu pour les puits contrôle.
8. Mise en culture des splénocytes La mise en culture des splénocytes des souris HHD s'effectue en présence de cellules stimulatrices autologues (voir paragraphe suivant). On distribue donc 5 106 cellules dans chaque puits sous 1mL. Par contre, pour les souris HLA- B*0702, 10 millions de cellules sont mises en culture directement avec 10 μg par mL de peptide dans le puits. Cette mise en culture a pour but d'amplifier le nombre de cellules spécifiques du peptide mis en leur présence, afin de réaliser sept jours après, un test fonctionnel dit de cytotoxicité.
9. Préparation de cellules stimulatrices autolopues pour mise en culture des splénocytes
Afin d'améliorer la stimulation de splénocytes des souris HHD immunisées mis en culture pendant sept jours, on prépare des lymphocytes B autoiogues de souris non immunisées, que l'on active avec du LPS les trois jours précédents la mise en culture. Ainsi, les cellules de souris HHD non immunisées obtenues comme indiqué précédemment, sont mises à incuber 3 jours à 37°C, 5% CO2 dans des flasques de 50 mL de RPMI, 10% SVF (PAA laboratories), L-glutamine 2 mM, pénicilline 100 U/mL, streptomycine 100 μg/mL, 25 μg/mL de LPS (Sigma, 5 mg/mL), 7 μg/mL de sulfate de dextran (Pharmacia, 7 mg/mL). Le jour de la mise en culture des splénocytes des souris immunisées (voir paragraphe précédent), les cellules stimulatrices autoiogues sont lavées en milieu HBSS, 5 % SVF, L-glutamine 2mM, pénicilline 100 U/mL, streptomycine 100 μg/mL comptées et centrifugées pendant 10 minutes à 1600 rpm. Le culot cellulaire est irradié à 10000 rads pendant 30 minutes. Les cellules sont ensuite lavées, resuspendues à une concentration de 5 106 cellules par mL en alpha MEM complet avec le peptide à 10 μg/mL et mises à incuber avec les splénocytes de souris immunisées dans un rapport 1/1.
10. Test de cytotoxicité Afin de mettre en évidence la fonction cytotoxique des lymphocytes T CD8+, activés par un peptide défini, on met en présence les splénocytes stimulés 7 jours avec le peptide, cellules dites effectrices, avec des cellules cibles préparées comme suit.
Préparation des cibles
Des cellules exprimant le même CMH que les splénocytes des souris immunisées, cultivées au laboratoire (voir paragraphe lignées cellulaires) sont incubées avec du peptide à 10 μg/mL à une concentration de 10 millions de cellules par mL pendant 2 heures à température ambiante. Pour les cellules RMA- S HHD, la veille, il est nécessaire de les mettre dans des boîtes préalablement conditionnées en CO2 à une concentration de 106 cellules par mL dans du milieu RPMI, L-glutamine 2mM, pénicilline 100U/mL, streptomycine 100μg/mL, betamercaptoéthanol 5OnM, pyruvate sodium 1 mM, acides aminés non essentiels 1X, hepes 10 mM, sans sérum, à température ambiante toute la nuit. Les cellules cibles sont ensuite marquées avec 10 μCu de chrome 51 par million de cellules (Perkin Elmer, 5mCu/mL) et incubées pendant 1 heure dans un bain marie à 370C. Puis, elles sont lavées trois fois, comptées, suspendues à 200000 cellules par mL en milieu CRT (RPMI 1640, L-glutamine 2 mM, pénicilline 100 LVmL, streptomycine 100 μg/mL, 10 % SVF (PAA laboratoires), hepes 10 mM, diluées au 1/4 et distribuées sous 100μL, soit 5000 cellules au final, dans tous les puits de la plaque correspondante 96 puits à fond rond (Falcon), après avoir déposé les cellules effectrices.
Préparation des splénocytes effecteurs
Les splénocytes en culture sont comptés, lavés, et re-suspendus en milieu CRT à 5 millions par mL pour avoir un premier rapport effecteurs/cibles de 100/1.
Plan de plaque (tableau 51
0 % de lyse 100 % de lyse
100/1 33/1 10/1 3/1
100 μL de milieu CRT sont distribués dans les puits 0% de lyse et les 9 derniers des lignes suivantes (voir plan au dessus).
On distribue 150 μl d'effecteurs dans les trois premiers puits de la 2ème ligne de la plaque à partir desquels trois dilutions successives au 1/3 sont effectuées directement dans la plaque.
Six puits témoins négatifs ne reçoivent que 100 μL de cibles et 100 μL de milieu tandis que dans six autres puits, on met dans 100 μL de cibles et 100 μL de solution de lyse (triton 5%, SDS 1%) afin d'avoir le niveau de lyse maximale.
Les plaques sont centrifugées 1 minute à 1000 rpm afin de mettre en contact les cellules, puis incubées pendant 4 heures à 37°C, 5% CO2. On récolte ensuite 50 μL du surnageant de chaque puits après centrifugation des plaques 5 minutes à 1000 rpm que l'on met avec 100 μL de scintillant dans des plaques de comptage (Perkin Elmer, France) à microbeta. La radioactivité est alors mesurée dans un compteur microbeta (ref).
Le pourcentage de lyse est obtenu par la formule suivante : Moyenne nombre de cpm des 3 puits - moyenne des cpm dans les 6 puits 0 % / moyenne cpm 100 % - moyenne cpm 0 %
On calcule la lyse spécifique en soustrayant le pourcentage de lyse obtenu pour la cible non spécifique à celui obtenu pour la cible spécifique. Le résultat est positif lorsque le pourcentage de lyse spécifique est supérieur à 10 % pour deux rapports Effecteurs/cibles consécutifs.
11. Marquage intracellulaire
II est réalisé pour caractériser les cellules sécrétrices d'IFN-gamma en réponse à la stimulation par les peptides. Les splénocytes sont incubés avec le peptide à 2 μg/mL en milieu alpha MEM complet additionné de TCGF (T CeII Growth Factor) au 1/20 pendant 3 à 4 jours. La veille du marquage, le milieu est remplacé par de l'alpha MEM complet. Au minimum 200000 de ces splénocytes préalablement re-stimulés in vitro sont distribués dans 4 puits d'une plaque 96 puits à fond rond. Les cellules de deux puits sur 4 sont incubées pendant une heure à 37°C, 5% CO2 avec le peptide à 4 μg/mL sous 100 μL d'alpha MEM complet, tandis que les deux autres puits ne reçoivent pas de peptide (puits milieu). Puis, on bloque la sécrétion d'IFN-γ avec de la brefeldine A à 4 μg/mL (1mg/mL, Sigma) sous 100 μL dans tous les puits, pendant 4 heures à 37°C, 5% CO2. Les cellules sont ensuite lavées 2 fois en solution FACS (PBS 1X, azide 0.1%, BSA 1 %). Le marquage de surface est réalisé sur les cellules d'un puits ayant reçu du peptide et un puits milieu par l'addition de 50 μL d'anticorps de surface, à savoir anti-CD4 FITC (lgG2b, k, BD Biosciences) et anti-CD8 APC (lgG2a, k, BD Biosciences) dilués au 1/50 en solution FACS. Les deux autres puits sont incubés avec 50 μL des isotypes contrôles (BD Biosciences) également dilués au 1/50 en solution FACS. Deux lavages sont à nouveau effectués après une incubation de 30 minutes à +4°C, puis les cellules sont fixées en solution FACS formaldéhyde 2% 30 minutes minimum. Après fixation, les cellules sont lavées deux fois en solution FACS, puis une fois en solution FACS saponine 0,05% afin de perméabiliser la membrane pour effectuer le marquage intracellulaire. Celui-ci s'effectue par l'ajout pendant 30 minutes à +40C de 50 μL d'anticorps anti-IFN-γPE ou son contrôle isotypique (BD Biosciences) dilués au 1/100 en solution FACS saponine 0,05%.
Enfin, les cellules sont lavées deux fois en solution FACS saponine 0,05%, une fois en solution FACS et fixées en solution FACS formaldéhyde 1%. Les cellules peuvent être conservées à +4°C avant que l'acquisition des données au FACS Calibur (BD Biosciences) ne soit réalisée.
II. Résultats
1. Immunisation des souris HHD (HLA-A*0201) par le vecteur pcDNA3.1- HBSP Des protocoles de vaccination ADN ont été mis au point pour d'autres protéines virales (HBs, HBx) du VHB dans des souris transgéniques pour les molécules HLA humaines (Loirat et al., 2000; Malmassari et al., 2005). Cette approche a donc été utilisée pour caractériser la réponse immunitaire T spécifique de HBSP. Nous avons procédé à deux injections intramusculaires d'ADN distantes de trois semaines d'intervalle afin d'induire une réponse immune chez la souris. Celles-ci ont été sacrifiées sept à dix jours après la seconde injection et des tests fonctionnels différents ont été effectués, soit directement ex vivo sur les splénocytes frais, soit après mise en culture in vitro.
a. Mise en évidence des lymphocytes T sécrétant de l'interféron gamma (test
ELISPOT et marquage intracellulaire)
Nous n'avons pas pu mettre en évidence des lymphocytes T sécrétant de l'IFN-γ en réponse à la stimulation courte ex vivo de 24 heures par les peptides HBSP A2-1 , HBSP A2-2, et PoI A2-2. Cependant, nous avons obtenu une sécrétion d'interféron gamma en réponse à un groupe constitué des peptides 15mers couvrant les acides aminés 39 à 78 de la protéine HBSP chez la souris n°1 (figure 2). Lors du test individuel de chacun de ces peptides chez trois souris, il s'est avéré que la souris 8 répondait fortement au peptide 64-78 (figure 2). Nous avons alors procédé à une stimulation secondaire avec ce peptide en présence de TCGF pendant 4 jours, puis effectué un marquage de surface et intracellulaire pour les molécules CD4, CD8 et IFN-γ. Cependant, nous n'avons pas pu phénotyper par cette technique les lymphocytes T sécrétant de l'interféron gamma, quel que soit le peptide testé ; cf. Figure 2.
b. Mise en évidence de lymphocytes T à fonction cytotoxigue
Pour augmenter la fréquence de lymphocytes CD8+ spécifiques d'un peptide donné de HBSP, nous avons mis en culture les splénocytes pendant sept jours après prélèvement de la rate en présence de cellules présentatrices chargées avec le peptide à une concentration de 10 μg/mL. Nous avons testé la réponse obtenue pour les peptides épitopiques prédits par le programme informatique (voir matériel et méthodes). Ainsi, nous avons pu détecter la présence de lymphocytes T cytotoxiques capables de lyser spécifiquement des cellules cibles autologues chargées avec les peptides suivants : HBSP A2-1 dans une proportion de 3/6, HBSP A2-2 dans une proportion de 1/6 et PoI A2-2 dans une proportion de 1/6 souris testées (voir figure 3). Cependant ces réponses restent faibles. Cf. Figure 3.
2. immunisation des souris HLA-B*0702 par le vecteur pcDNA3.1-HBSP Dans un modèle de souris transgénique pour la molécule HLA de classe I humaine HLA-B*0702, nous avons cherché la présence de lymphocytes T spécifiques des peptides épitopiques restreints par ce CMH et prédits par les programmes Bimass et SYFPEITHI que nous avons fait synthétiser au préalable.
a. Mise en évidence de lymphocytes T sécrétant de lïnterféron gamma (test
ELISPOT et marquage intracellulaire)
Les souris HLA-B*0702 ont été immunisées par deux injections de 100 μg d'ADN dans le muscle tibialis anterior de la souris, puis les souris ont été sacrifiées entre sept et dix jours après le rappel afin de mettre en évidence des lymphocytes T spécifiques de HBSP. Nous avons pu établir la présence de lymphocytes sécrétant de l'interféron gamma en réponse à la stimulation par différents groupes de peptides 15mers (figure 4). La souris H possède 90 cellules productrices d'interféron gamma par million de splénocytes en réponse au mélange de peptides 15mers 69-93, contenant la séquence du peptide 9mers HBSP B7-1 et 75 cellules par million en réponse à HBSP B7-1. Nous avons également pu établir une réponse de l'ordre de 40 cellules productrices d'IFN-γ pour un million de splénocytes en réponse à la stimulation par le groupe de peptides 39-63 chez une souris sur douze testées, la souris L. Les splénocytes sont mis en culture en stimulation peptidique en plus du test ELISPOT, afin de procéder à un test plus qualitatif, visant à mettre en évidence la fonction cytotoxique des lymphocytes T spécifiques de HBSP. Cette mise en culture s'effectue sans cellules stimulatrices autologues mais nécessite un nombre important de cellules, c'est pourquoi, tous les peptides 15 mers n'ont pas pu être testés individuellement dans ces tests ELISPOTS ; cf. Figure 4.
b. Mise en évidence de lymphocytes T à fonction cytotoxique Les tests de cytotoxicité ont été effectués sur les mêmes 12 souris que celles du test ELISPOT, dont les résultats sont rapportés dans la figure 4, dans deux expériences indépendantes. Ils ont révélé la présence de lymphocytes T spécifiques du peptide HBSP B7-1. La stimulation par ce peptide conduit à un enrichissement des splénocytes en culture en lymphocytes T capables de lyser de manière importante des cibles autologues chargées avec ce peptide mais pas avec un peptide contrôle (issu de la protéine core du virus de l'hépatite B) et ce chez toutes les souris testées (figure 5). Ceci est observé pour 11 souris sur 11 testées.
Au contraire, aucune réponse cytotoxique n'a pu être détectée contre le peptide prédit dans la partie polymérase du virus, PoI B7-1 chez toutes les souris testées.
3. Immunisation des souris HLA-A*0201 par le vecteur pCMV.1 Q-HBSP
a. Construction d'un second vecteur ADN Afin d'augmenter Pimmunogénicité de la protéine HBSP, nous avons fusionné la séquence originale HBSP, à la séquence de la petite protéine S du VHB, dans un vecteur pCMV.BIO. Ce vecteur dérive du vecteur pCMV-S2S codant pour les protéines d'enveloppe du VHB moyennes (S2S ou M) et petites (S) et permet la formation de particules portant l'antigène HBs pouvant être sécrétées. Le vecteur pCMV.BIO contient dans la partie préS2 un polylinker en phase avec la séquence codant pour la protéine S. Ainsi, l'insertion dans ce vecteur de la séquence originale de HBSP permet de créer une protéine chimérique, pouvant être éventuellement sécrétée. La protéine HBSP possédant une demi-vie faible, la fusion avec la petite protéine d'enveloppe pourrait ainsi contribuer à la stabilité de la protéine HBSP.
Après avoir construit le vecteur pCMV.B10-HBSP, nous avons immunisé des souris HLA-A*0201 comme pour le pcDNA3-HBSP. Nous avons alors procédé à la recherche de lymphocytes T spécifiques de HBSP, ainsi que de la petite protéine S d'enveloppe du VHB, également codée par ce vecteur. Dans ce but, nous avons utilisé trois tests différents, c'est-à-dire l'ELISPOT pour quantifier des lymphocytes sécréteurs d'interféron gamma, le marquage intracellulaire pour phénotyper ces derniers, et le test de cytotoxicité.
b. Mise en évidence de lymphocytes T sécrétant de l'interféron gamma (test
ELlSPOT)
La réponse aux peptides prédits situés dans la région de la polymérase ne peut pas être étudiée, puisque le vecteur ne code pas pour la partie N terminale de la protéine HBSP. Nous avons testé tous les peptides 15 mers couvrant l'insert HBSP, et nous avons trouvé des lymphocytes T sécrétant de l'interféron gamma spécifiques du peptide 64-78 chez 4 souris sur 5. Le peptide 59-73 est quant à lui réactif pour la souris I soit une souris sur 5 (voir figure 6). Le marquage intracellulaire réalisé sur les splénocytes activés ne nous a pas permis de phénotyper les cellules sécrétant de l'IFN-γ en réponse aux peptides 64-78 et 59-73.
Nous avons pu mettre en évidence chez toutes les souris des lymphocytes T sécrétant de l'IFN-γ en réponse à la stimulation par le peptide 5 de séquence GLSPTVWLS (acides aminés 348-357) de la protéine S, et chez quatre souris sur 5 en réponse à la stimulation par le peptide 10 de séquence FLLTRILTI (acides aminés 183-191). Cette réponse est forte puisque l'on a de 40 à 180 cellules productrices d' IFN-γ en réponse au peptide 5, et 55 à 250 cellules en réponse au peptide 10. Il est à noter que les résultats ne sont pas rapportés par rapport au nombre de lymphocytes T CD8+. Mais, une souris HLA-A*0201 possède en moyenne 2 à 3 % de lymphocytes T CD8+, soit 30000 pour 106 splénocytes. Par exemple, la souris J qui possède 120 cellules productrices d'interféron gamma en réponse à la stimulation par le peptide 10 a donc 4 lymphocytes T spécifiques du peptide 10 de l'HBs producteurs d'interféron gamma pour 1000 lymphocytes T CD8+.
c. Mise en évidence de lymphocytes T à fonction cytotoxique L'immunisation par le vecteur pCMV.B10-HBSP permet d'induire une réponse contre des peptides de la protéine S, fortement immmunogénique. En effet, deux peptides dérivés de la protéine S sont reconnus dans le contexte HLA-A*0201 : le peptide 5 et le peptide 10 qui seront appelés HBs-5 et HBs-10 respectivement. Ces peptides ont été testés afin d'avoir un contrôle positif, et ainsi, de vérifier si les souris ont bien été immunisées. Sur la figure 7, nous pouvons observer le pourcentage de lyse spécifique obtenu pour chaque stimulation des expériences réalisées. À chaque fois, toutes les souris ont eu une réponse positive de 35 à 50 % de lyse spécifique dirigée contre le peptide HBs-5 et 3 souris sur 4 testées ont répondu à la stimulation par le peptide HBs-10. Par contre, les faibles taux de lyse observés en réponse à la stimulation par HBSP A2-1 , détectables lors de l'immunisation par le vecteur pcDNA3-HBSP ne le sont plus, tandis que ceux qui sont observés pour le peptide HBSP A2-2 restent très bas, uniquement pour le rapport 100/1 chez la souris A. Cependant ce résultat ne peut pas être considéré positif puisqu'il faut un pourcentage de lyse spécifique pour deux rapports consécutifs (figure 7).
4. Immunisation des souris HLA-B7 par le vecteur pCMV.BI Q-HBSP
a. Sécrétion d'interféron gamma (test ELISPOT et mamuape intracellulaire) Des lymphocytes T sécrétant de l'interféron gamma spécifiques de HBSP B7-1 ont pu être mis en évidence dans deux souris sur six testées, à une fréquence de 25 et 28 cellules productrices d'interféron pour un million de splénocytes (figure 8). Comme pour les souris HLA-A*0201 , les résultats ne sont pas rapportés par rapport au nombre de lymphocytes T CD8+. Cependant, une souris HLA-B*0702 possède en moyenne 12 % de lymphocytes T CD8+, soit 120000 pour 106 splénocytes, soit environ 1 lymphocyte T spécifique de HBSP B7-1 et producteur d'interféron gamma pour 4000 lymphocytes T CD8. De plus, nous pouvons observer sur la figure une sécrétion d'interféron gamma en réponse au peptide 15 mer 79-93, qui contient HBSP B7-1 (position 83) chez quatre souris sur six testées (souris n°7, n°8, n°10 et n°11). La souris n°9 est à la limite de la positivité, on observe 20 cellules productrices d'IFN-γ pour un million de splénocytes, ce qui correspond au seuil que nous avons défini. Des lymphocytes spécifiques des peptides 1 δmers 39-53 et 64-78 ont également été mis en évidence chez respectivement deux souris (souris n°7 et n°10) et une souris (souris n°8) sur six testées. La réponse obtenue avec le peptide 64-78 est de toute évidence une réponse murine, puisque nous l'avons également détectée chez les souris transgéniques pour la molécule HLA-A*0201. Lors d'une stimulation secondaire effectuée sur les splénocytes en culture de trois souris, nous avons pu confirmer la présence de lymphocytes T sécréteurs d'interféron gamma spécifiques du peptide 79-93 chez les souris n°7 et n°10 testées pour ce peptide, mais pas pour le 15-mer 39-53, ni pour le 64-78. Cependant, il est à noter, pour ce dernier, que la souris 9 testée secondairement avait eu des réponses faiblement positives lors du premier ELISPOT (voir figure 9). Parallèlement à cet ELISPOT secondaire, nous avons réalisé un marquage intracellulaire qui a révélé que les cellules sécrétant de l' IFN-γ en réponse à la stimulation par le peptide 79-93 sont de phénotype T CD8+. Pour tester la réponse immunitaire spécifique de la protéine S, également codée par le vecteur pCMV.B10-HBSP, nous disposions de trois peptides 9mers nommés SB7-1 , SB7-2 et SB7-3, ainsi que d'un 1 δmers, HBs 62, contenant la séquence d'un peptide prédit. Tous ces peptides ont été prédits par les programmes Bimass et SYFPEITHI. De plus, le peptide SB7-1 de séquence CPGYRWMCL est reconnu dans le contexte des molécules de classe I du chimpanzé (Bertoni et al., 1998) et le peptide SB7-2 (Bertoni et al., 1998) est également reconnu dans ce contexte et a été mis en évidence chez des patients atteints d'hépatite aiguë (Bertoni et al., 1997).
Aucune réponse positive n'a pu être mise en évidence, cependant, on peut noter que la réponse au peptide SB7-1 est plus élevée que pour les autres peptides.
b. Mise en évidence de lymphocytes T à fonction cytotoxique Les lymphocytes ont une forte réponse spécifique du peptide HBSP B7-1 avec un pourcentage de lyse spécifique important de l'ordre de 60 % chez toutes les souris testées (6/6). Pour rappel, le pourcentage de lyse spécifique s'obtient en soustrayant le pourcentage de lyse des cibles autologues chargées avec un peptide contrôle au pourcentage de lyse des cibles chargées avec le peptide HBSP B7-1. Nous avons également pu mettre en évidence la présence de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques du 15mer 79-93 chez deux souris sur trois testées avec une lyse spécifique variant de 30 à 40 % à un rapport de 100 cellules effectrices contre une cellule cible. Ce peptide contient donc un épitope T CD8+ capable d'activer des lymphocytes T produisant de l'interféron gamma (figure 9) et cytotoxiques (figure 10). Il s'agit vraisemblablement de HBSP B7-1 dont la séquence est inclue dans ce peptide. Nous avons stimulé avec le 15mers 39-53, qui avait induit une sécrétion d'IFN-γ, les splénocytes de deux souris, mais nous n'avons pas pu induire de lyse spécifique, comme l'atteste la figure 10.
III. Discussion
Dans ce travail, nous avons pu mettre en évidence une réponse immunitaire dirigée spécifiquement contre des peptides issus de la protéine HBSP. Ainsi, dans le contexte des molécules HLA-A*0201 , la réponse observée n'a pas été très forte, mais elle révèle toutefois la présence d'épitopes T reconnus spécifiquement par les lymphocytes T CD8+ de la souris transgénique pour la molécule humaine HLA-A*0201. Les épitopes décrits dans cette étude se localisent à la fois dans la partie de la polymérase du virus en ce qui concerne le peptide nommé POL A2- 2, et dans la partie originale de HBSP, pour les peptides HBSP A2-1 et HBSP A2- 2. Il est remarquable que selon le plasmide d'immunisation, nous n'ayons pas obtenu la même réponse. En effet, à l'aide du vecteur exprimant la protéine HBSP fusionnée à la petite protéine HBs du VHB, nous ne détectons pas la réponse contre HBSP A2-1 , mais conservons la réponse contre HBSP A2-2, ceci alors que l'épitope HBSP A2-1 semblait susciter une réponse plus forte de la part des souris immunisées par le vecteur pcDNA3-HBSP. Ainsi, la réponse contre la protéine HBs semble prendre le pas sur celle spécifique de HBSP. Ce résultat n'est pas étonnant car de nombreux travaux ont suggéré la compétition épitopique entre les protéines virales, et notamment exprimées à partir d'un même vecteur, sous le contrôle du même promoteur (Fissolo et al., 2005). Dans le contexte des souris exprimant la molécule HLA-B*0702, les résultats obtenus sont très encourageants. En effet, la présence de lymphocytes T CD8+ capables de lyser jusqu'à 60% des cibles chargées spécifiquement avec le peptide HBSP B7-1 a pu être mise en évidence chez toute les souris testées, que la protéine soit fusionnée ou pas avec HBs. Dans le contexte HLA-B*0702, il ne semble pas y avoir de compétition pour l'activation des lymphocytes T par des peptides issus de HBs ou de HBSP. Ainsi, la forte réponse contre le peptide prédit HBSP B7-1 suggère l'identification d'un épitope capable d'activer fortement in vitro des lymphocytes T de HBSP. Nous avons également pu montrer que les lymphocytes T de la rate des souris immunisées par l'une ou l'autre des deux constructions codant pour HBSP utilisées dans cette étude, produisaient de l'interféron gamma en réponse à une stimulation courte par ce peptide. Toutefois cette sécrétion reste faible et ne se retrouve pas chez toutes les souris. Ceci nous amène à penser que la fréquence de lymphocytes T effecteurs circulants spécifiques du peptide 9mers HBSP B7-1 est faible, et difficile à détecter sans stimulation.
La stimulation courte ex vivo des splénocytes par le peptide 15mers 79-93 qui contient la séquence du 9mers HBSP B7-1 , permet l'activation de cellules T CD8+ sécrétant de l'interféron gamma. Par contre, ce 15mers ne permet pas d'activer aussi fortement des lymphocytes T d'une culture in vitro de splénocytes. En effet, la lyse spécifique de cellules cibles autologues chargées avec le 15mers par rapport aux cibles chargées avec un peptide contrôle est de 30 à 40 % à un rapport de 100 cellules effectrices contre une cellule cible. Les résultats obtenus avec le peptide 9mers HBSP B7-1 et le 15mers 79-93 suggèrent que le 9mer n'est pas optimal pour stimuler des lymphocytes T effecteurs circulants qui ont été activés in vivo, alors que le 15mers permet la sécrétion d'IFN-γ par ces lymphocytes. Ceci suggère que les lymphocytes sont activés par un peptide légèrement différent de HBSP B7-1 , mais contenu dans le 15-mers 79-93. La stimulation in vitro par le 9mers permet, quant à elle d'activer des lymphocytes T cytotoxiques alors que le 15mers est moins optimal, puisque le pourcentage de lyse spécifique est plus faible. Cette réponse est peut-être liée à l'affinité moindre in vitro d'un peptide de 15 acides aminés pour une molécule HLA de classe I telle que HLA-B*0702. Pour vérifier cette hypothèse, il sera nécessaire de procéder à des expériences complémentaires en testant notamment des cibles et des effecteurs respectivement chargés et stimulés par le 9mers et le 15mers, et inversement. De plus, il faudra tester des peptides de 9-10 acides aminés décalés de 1 acide aminé afin de déterminer le peptide qui nous donnera une réponse optimale chez les souris transgéniques pour la molécule HLA-B*0702 humaine, à la fois pour les fonctions de sécrétion d'interféron gamma en réponse à une courte stimulation peptidique ex vivo, et de cytotoxicité. En plus des réponses à ces peptides, nous avons identifié dans un test ELISPOT la capacité stimulatrice de la sécrétion d'interféron gamma du 15mer 39-53. Après un marquage intracytoplasmique de cytokines, il s'est avéré que les cellules sécrétrices d'interféron gamma en réponse à ce 15mers étaient de phénotype T CD8+. Or ce 15mer contient un épitope T CD8+ prédit pour la fixation à la molécule HLA B*0701 , mais que nous n'avons pas encore fait synthétiser. Afin de voir si ce peptide pouvait stimuler in vitro des lymphocytes T, un test de cytotoxicité a été réalisé dans lequel nous n'avons pas pu observer de lyse spécifique. Néanmoins, cette expérience ayant été réalisée sur deux souris seulement, il s'agit peut-être d'un épitope reconnu plus faiblement que HBSP B7- 1 ce qui expliquerait la réponse négative chez ces souris. De plus, un peptide 15mers n'est certainement pas le meilleur outil à la stimulation in vitro des lymphocytes T spécifiques d'un peptide 9mers. Cette explication nous est suggérée par les résultats obtenus lors de la stimulation par l'épitope défini de neuf acides aminés HBSP B7-1 et le 15mer 79-93 qui contient cette séquence, comme nous l'avons discuté plus haut.
Ces résultats constituent la première approche de la recherche d'épitopes reconnus par les lymphocytes T au sein de la protéine HBSP du VHB. Ils contribuent ainsi à la connaissance de cette protéine en apportant un éclairage immunologique aux travaux, davantage orientés sur l'étude moléculaire, déjà effectués sur cette protéine. La réponse immunitaire spécifique du VHB permet d'éliminer des hépatocytes infectés et de maintenir un équilibre entre la réplication virale et l'atteinte hépatique de l'hôte. La présence d'anticorps spécifiques de la protéine HBSP a été corrélée avec la fibrose chez les porteurs chroniques du virus de l'hépatite B. Cette protéine virale est probablement impliquée dans le processus de fibrogenèse, et notamment dans une cascade d'activation mettant en cause le TGFβi . La meilleure connaissance de l'implication de cette protéine dans ce processus de pathogenèse virale, couplée à une étude clinique chez les porteurs chroniques du virus visant à définir la réponse immunitaire spécifique de la protéine HBSP dans le cadre d'une infection réelle, seront essentielles. Notamment, il faudrait définir la cinétique d'apparition des anticorps spécifiques de cette protéine par rapport à la survenue de la fibrose ou si celle-ci apparaît avant la protéine. Cependant, il est probable que la protéine soit synthétisée dès le début de l'infection. En théorie, une immunothérapie basée sur un vecteur vaccinal portant des séquences de la protéine HBSP pourrait contribuer à l'atténuation des atteintes du foie chez des porteurs chroniques du VHB possédant des anticorps spécifiques de HBSP et présentant une fibrose hépatique.
IV. Conclusion et perspectives
Les résultats obtenus chez les deux types de souris montrent que la protéine HBSP est produite à partir de nos vecteurs, et que le découpage in vivo de cette protéine active in vivo des lymphocytes T spécifiques de peptides dérivés de HBSP qu'ils sont capables de reconnaître. En effet, la stimulation ex vivo leur permet de sécréter de l'interféron gamma et la stimulation longue in vitro d'acquérir une fonction cytotoxique. Dans le contexte HLA-A*0201 , nous avons identifié des peptides activant des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Ces peptides avaient tous été prédits par les programmes informatiques Bimass et SYFPEITHI. La stimulation à l'aide des peptides HBSP A2-1 , HBSP A2-2 et PoI A2-2 permet d'induire une réponse cytotoxique des lymphocytes T CD8+ spécifiquement activés mais qui reste faible.
Parmi les autres peptides prédits pour la fixation à HLA-A*0201 qui n'ont pas été synthétisés ni testés, il en existe peut-être un ou plusieurs capables d'induire de meilleures réponses cytotoxiques. Nous avons d'ores et déjà comme candidat, le 15mers 59-73 qui active des lymphocytes T produisant de l'IFN-γ. Dans le contexte HLA-B*0702, nous avons détecté une réponse immune cytotoxique particulièrement forte, lors de la stimulation in vitro avec le peptide HBSP B7-1 prédit pour la fixation à HLA-B*0702. Cependant, ce peptide ne paraît pas optimal dans la mesure où il ne permet pas d'activer fortement la sécrétion d'IFN-γ ex vivo. Nous allons donc définir le peptide optimal et continuer à effectuer la recherche des peptides de HBSP se fixant à HLA-B*0702, en testant dans un premier temps le peptide prédit contenu dans le 15mers réactif 39-53. Des souris transgéniques pour les molécules de classe I et de classe II humaines peuvent être produites (Pajot et al., 2004a; Pajot et al., 2004b, dont les contenus sont incorporés par référence). Ces souris sont invalidées génétiquement pour les molécules de souris. Nous envisageons d'étendre notre étude à la réponse des lymphocytes T CD4 + contre la protéine HBSP. Ce modèle nous permettra de travailler dans les deux contextes du CMH humain, et d'éliminer les réponses des lymphocytes T CD4+ activés par des peptides présentés par une molécule du CMH de classe II murin.
A ce travail chez la souris, fera suite une étude chez des porteurs chroniques du virus de l'hépatite B, et notamment chez des patients HLA-B*0702, au vu des résultats obtenus avec le peptide HBSP B7-1. Ce travail permettra de mieux comprendre la réponse immune spécifique de la protéine HBSP lors de l'infection par le VHB, et le rôle qu'elle joue dans la pathogenèse. Il nous permettra également de mettre au point de nouvelles approches thérapeutiques basées sur la protéine HBSP. Analyse de cellules de patients porteurs chroniques de VHB : Les peptides 59-73 (PARLLLKATLCIPHV ; P-15-V ; SEQ ID NO : :10) et 54-68 (RDPAKPARLLLKATL ; R-15-L ; SEQ ID NO : 7) ont été identifiés chez les patients humains infectés par le VHB. Les patients infectés par VHB développent une réponse T HBSP-spécifique : Nous avons alors cherché à déterminer si HBSP est apprêtée et présentée sous forme de peptides au cours de l'infection à VHB chez les humains. Pour répondre à cette question, nous avons utilisé des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) congelées de patients présentant une infection chronique au VHB.
Les PBMC ont été collectées par purification sur Ficoll du sang de patients infectés par VHB qui présentent une hépatite chronique démontrée par biopsie, et une réplication du VHB (neuf patients HLA-A2+, référencés sous P1 à P9 ; et sept patients HLA-B7+, référencés sous P10 à P16). Aucun de ces patients n'était en traitement immunosuppressif, ni n'avait d'infection liée à un VIH, ou à un virus de l'hépatite C ou D.
Les PBMC de six individus VHB-négatifs ont également été incluses dans l'étude à titre de témoins (trois individus HLA-A2+, référencés sous C1 à C3 ; et trois individus HLA-B7+, référencés sous C4 à C6).
Les PBMC sont conservées par congélation à l'azote jusqu'à utilisation. Les PBMC ont alors été décongelées, lavées et incubées dans un milieu complet (milieu RPMI 1640, additionné de L-glutamine 2mM, pyruvate de sodium 1mM, acides aminés non essentiels, pénicilline 100 U/mL, streptomycine 100 microgrammes/mL et sérum humain AB 10% (Institut Jacques Boy, Reims, France)) une nuit durant à 370C sous CO2 à 5%. Après lavage, les PBMC (3x106 cellules/mL) ont été placées en suspension dans du milieu complet avec de l'IL-7 20 ng/mL (Roche, Meylan, France) dans des plaques à 48 puits. Ensuite, ies cellules ont été stimulées par incubation pendant trois jours avec 10 microgrammes/mL de peptides restreints par HLA-A2 ou HLA-B7, ou avec des pools de peptides 15-mers issus de la région 39-111 de HBSP (1 microgramme/mL de chaque peptide), chaque pool contenant trois à quatre peptides. La moitié du milieu a été remplacée tous les 3-4 jours par du milieu complet additionné d'IL-2 recombinante (50 UI/mL) (Roche, Meylan, France). Après 10 jours de culture, les cellules productrices ont été spécifiquement quantifiées par ELIspot. Brièvement, des plaques multi puits à fond en membrane de nitrocellulose (Millipore, Bedford, MA) ont été recouvertes par un anticorps monoclonal anti-interféron gamma (1-DIK ; 15 microgrammes/mL ; Mabtech, Stockholm, Suède), et les puits ont été bloqués avec 200 microL de sérum humain AB à 5% dans du PBS à température ambiante pendant 2 heures. Les puits ainsi saturés ont été remplis en triple exemplaire par des cellules stimulées in vitro (105/puit) dans du milieu complet et avec les peptides appropriés (1 microgramme/mL). Un compteur automatique Zeiss ELISPOT a été utilisé pour déterminer le nombre de spots. La réponse a été considérée comme positive lorsque le nombre médian de chaque triplica de cellules formant spots (SFC), stimulé avec les peptides appropriés, était égal à au moins deux fois celui des puits témoins contenant le milieu seul, et au moins 5 cellules formant spot par 105 PBMC ont été détectées après soustraction du bruit de fond.
Les réponses T ont d'abord été analysées par un test de mesure d'interféron gamma par ELIspot, en utilisant deux peptides qui se sont montrés immunogènes dans les souris transgéniques HLA-A2 (HBSP A2-1 et HBSP A2-2). De manière intéressante, quatre parmi les neuf patients HLA-A2+ (patients 1 , 2, 4, 5) ont présenté une activation significative des cellules T avec le peptide HBSP A2-1 (cf. Figure 13A). Par contre, l'incubation avec le peptide HBSP A2-2 n'a pas induit de libération significative d'IFN-gamma pour les huits patients testés (cf. figure 13B). Nous avons réalisé les mêmes expériences avec les peptides que les logiciels prédisent comme étant restreints par la molécule du CMH de classe I HLA- B*0702. Aucune réponse n'a été observée après stimulation in vitro des PBMC à l'aide des peptides HBSP B7-2 et HBSP B7-3. Concernant le peptide correspondant au peptide immunodominant restreint par HLA-B7 (HBSP B7-1) qui a été identifié chez les souris transgéniques, une libération significative d'interféron gamma a été détectée chez seulement un des sept patients HLA-B7+ (cf. Figure 13C). Pour s'assurer que la faible reconnaissance de l'épitope HLA-B7 chez les humains n'était pas due à des variations de séquence des souches virales infectieuses, nous avons réalisé des tests ELIspot en utilisant des peptides HBSP B7-1 dérivant d'isolats HBV naturels (cf. tableau 4 ci-dessous). Tableau 4 : Variants naturels de l'épitope HBSP B7-1. Des mutations sont observées aux positions 2 et 9. Les scores prédits par ordinateur obtenus à l'aide des programmes Bimas et SYFPEITHI sont indiqués. Les variants des génotypes D, C, F et E n'ont pas été prédits (NP) par le programme Bimas.
Figure imgf000062_0001
Les PBMC de quatre patients HLA-B7+ ont été stimulées in vitro avec un mélange du peptide sauvage et des trois peptides variants, et ensuite testées par ELIspot en utilisant les peptides individuels. Pour un patient (patient P16), des cellules T réagissant de manière croisée avec les peptides variants dérivants des génotypes D et E ont été observées. Ceci contraste avec la faible réponse T obtenue par stimulation avec les peptides dérivant des génotypes C ou F (cf. Figure 13D). Les cellules de ce patient particulier ne se sont pas révélées être sensibles à une stimulation avec le peptide HBSP-B7-1 dérivant du génotype A (cf. Figure 13C).
Aucun des témoins VHB-négatifs n'a présenté de cellules T répondant au peptide HBSP A2-1 ou HBSP B7-1 après stimulation (cf. figures 13A, 13B, 13C, individus C1 à C3 et C4 à C6). Il apparaît ainsi que l'épitope HBSP B7-1 peut être généré au cours du processus naturel de l'infection par VHB, mais qu'il ne serait pas un épitope dominant dans ce contexte.
Par contre, environ la moitié des patients HLA-A2+ infectés par VHB qui ont été testés présentent une réponse contre l'épitope HBSP A2-1. Nous avons en outre documenté les réponses HBSP-spécifiques en utilisant des pools de peptides HBSP 15-mers couvrant la séquence aa39-111 de HBSP. Des cellules HBSP-spécifiques ont été observées chez des patients en utilisant des pools de peptides 15-mers en stimulation in vitro (cf. Figures 14). Exception faite de la partie N-terminale de HBSP (aa 39-63), l'incubation avec les différents pools peptides a induit une libération significative d'interféron gamma par les cellules T.
Pour la plupart des patients, des cellules T HBSP-spécifiques ont été détectées en utilisant le pool peptidique 54-78 (peptide 54-68 référencé sous SEQ ID NO: 7 + peptide 59-73 référencé sous SEQ ID NO: 10 + peptide 64-78 référencé sous SEQ ID NO: 12). Lorsque les peptides de ce pool ont été utilisés individuellement pour activer des cellules T dans des tests ELIspot, chaque peptide de ce pool s'est montré capable d'activer la production d'interféron gamma par les cellules T (cf. Figure 14B). En utilisant le même pool de peptides, les PBMC de six individus VHB-négatifs n'ont pas produit des niveaux significatifs d'interféron gamma après exposition à ces peptides (cf. Figure 14A).
Comme les peptides 15-mers utilisés dans les tests ELIspot peuvent réagir avec les molécules du CMH de classe I et avec les molécules du CMH de classe II, nous avons analysé le phénotype des cellules T productrices d'IFN-gamma de quelques patients. Les cellules T HBSP-spécifiques activées par les peptides inclus dans le pool 54-78 se sont révélées être des cellules CD4+, et plusieurs peptides différents sont reconnus (cf. Figure 14B). En utilisant une coloration intracellulaire des cytokines, nous avons trouvé que ces cellules T CD4+ sont capables de produire à la fois des cytokines IFN-gamma et IL-2 en réponse à la stimulation peptidique (cf. Figure 15).
Pris ensemble, ces résultats démontrent qu'il existe une réponse immunitaire cellulaire spécifique des épitopes de HBSP chez les patients infectés par VHB. Cette réponse est multi-spécifique, étant donné que plusieurs épitopes ont été reconnus, et fait intervenir les cellules T CD8+ et les cellules T CD4+.
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AA : acides aminés
ADN : acide désoxyribonucléique ARNm : acide ribonucléique messager
APC : allophycocyanine
BCIP : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate
BSA : bovine sérum albumine (sérum albumine bovine)
CMV : cytomégalovirus CMH : complexe majeur d'histocompatibilité
CTL : cytotoxic T lymphocyte (lymphocyte T cytotoxique)
Elispot : enzyme linked immunospot (immuno-spot par liaison enzymatique)
FACS : fluorescence activated cell sorter (trieur de cellule activée par fluorescence) FITC : fluoresceine isothiocyanate (isothiocyanate de fluorescéine)
HBSP : hepatitis B spliced protein (protéine épissée de l'hépatite B)
HHD : human human Db (Db humain humain)
HLA : human leucocyte antigen (complexe majeur d'histocompatibilité humain) IFN : interféron
Ig : immunoglobuline
LPS : lipopolysaccharide
ORF : open reading frame (phase ouverte de lecture)
Pb : paire de bases PBS : phosphate buffer saline (tampon phosphate)
PBST : phosphate buffer saline tween 0,05%
PE : phycoérythrine
NBT : nitroblue tetrazolium (tétrazolium de nitrobleu)
TAP : transporter associated protein (protéine associée à transporteur) TCGF : T cell growth factor (facteur de croissance des cellules T)
TGFβi : transforming growth factor (facture de croissance transformant)
VHB : virus de l'hépatite B

Claims

REVENDICATIONS
1. Peptide ou polypeptide, mono- ou poly-épitopique, capable d'induire une réponse immunitaire T CD8+ et/ou CD4+ dirigée contre VHB, caractérisé en ce que :
- il est constitué de 6 à 46 acides aminés, et en ce que
- il comprend au moins un, ou est constitué d'un fragment de HBSP ou analogue parmi :
- un fragment de la protéine HBSP (Hepatitis B spliced protein) d'au moins 6 acides aminés, et d'au plus 15 acides aminés,
- un analogue conservateur d'un tel fragment, ledit analogue étant un peptide ou polypeptide constitué d'au moins 6 et d'au plus 20 acides aminés, qui dérive dudit fragment par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, et qui a conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ et/ou CD4+ dirigée contre VHB, et en ce que
- ledit fragment de HBSP est constitué d'une séquence choisie parmi les séquences qui s'étendent des positions suivantes de HBSP : a) de 79 à 93 (RTEIAPVFPSHHLGL ; SEQ ID NO :4), b) de 83 à 91 (HBSP B7-1 ; APVFPSHHL ; SEQ ID NO :5), c) de 85 à 93 (VFPSHHLGL ; SEQ ID NO :6), d) de 54 à 68 (R-15-L ; RDPAKPARLLLKATL ; SEQ ID NO :7), e) de 55 à 63 (DPAKPARLL ; SEQ ID NO :8), f) de 58 à 66 (KPARLLLKA ; SEQ ID NO :9), g) de 59 à 73 (P-15-V ; PARLLLKATLCIPHV ; SEQ ID NO :10), h) de 62 à 70 (HBSP A2-1 ; LLLKATLCI ; SEQ ID NO :11 ), i) de 64 à 78 (LKATLCIPHVAVQNL ; SEQ ID NO :12), j) de 67 à 75 (HBSP A2-2 ; TLCIPHVAV ; SEQ ID NO :13), k) de 13 à 21 (PoI A2-2 ; LLDEEAGPL ; SEQ ID NO :14), I) de 39 à 53 (EDLHLQLPNDPRPPV ; SEQ ID NO :15), m) de 45 à 53 (LPNDPRPPV ; SEQ ID NO :16), n) de 25 à 33 (LPRLADEDL ; SEQ ID NO : 18), ou est un sous-fragment conservateur de l'une de ces séquences a) à n), ledit sous-fragment conservateur étant constitué d'au moins 6 acides aminés 61
consécutifs de l'une de ces séquences a) à n), et ayant conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ et/ou CD4+ dirigée contre VHB.
2. Peptide selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il est restreint par une molécule HLA de classe I.
3. Peptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'il est capable d'induire une activation de cellules T CD8+ et/ou une différentiation de cellules T CD8+ en CTL.
4. Peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend un desdits fragments ou analogues.
5. Peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux desdits fragments ou analogues.
6. Peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est en outre fusionné à une protéine d'enveloppe de VHB, ou à un fragment d'au moins 6 acides aminés d'une telle protéine.
7. Peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est constitué de 6 à 46 acides aminés, et en ce qu'il comprend au moins un, ou est constitué d'un analogue du fragment de HBSP de SEQ ID NO : 5 (APVFPSHHL ; HBSP B7-1), ledit analogue étant choisi parmi :
- APVFPSHHP (SEQ ID NO : 33),
- ALVFPSHHP (SEQ ID NO : 34),
- ALVFPSHHH (SEQ ID NO : 35).
8. Peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, qui comprend un fragment ou analogue de HBSP restreint par HLA-B, caractérisé en ce que ledit fragment de HBSP est constitué d'une séquence choisie parmi les séquences qui s'étendent des positions suivantes de HBSP : i. de 79 à 93 (RTEIAPVFPSHHLGL ; SEQ ID NO :4), ii. de 83 à 91 (HBSP B7-1 ; APVFPSHHL ; SEQ ID NO :5), iϋ. de 85 à 93 (VFPSHHLGL ; SEQ ID NO :6), iv. de 54 à 68 (RDPAKPARLLLKAT ; SEQ ID NO :7), v. de 55 à 63 (DPAKPARLL ; SEQ ID NO :8), vi. de 59 à 73 (PARLLLKATLCIPHV ; SEQ ID NO :10), vii. de 39 à 53 (EDLHLQLPNDPRPPV ; SEQ ID NO :15), viii. de 45 à 53 (LPNDPRPPV ; SEQ ID NO :16), ou parmi les sous-fragments conservateurs de ces séquences i. à viii., lesdits sous-fragments conservateurs étant constitués d'au moins 6 acides aminés consécutifs d'une de ces séquences i. à viii., et ayant conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB.
9. Peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, qui comprend un fragment ou analogue de HBSP restreint par HLA-A, caractérisé en ce que ledit fragment de HBSP est constitué d'une séquence choisie parmi les séquences qui s'étendent des positions suivantes de HBSP : i. de 54 à 68 (RDPAKPARLLLKAT ; SEQ ID NO :7), ii. de 58 à 66 (KPARLLLKA ; SEQ ID NO :9), iii. de 62 à 70 (HBSP A2-1 ; LLLKATLCI ; SEQ ID NO :11 ), iv. de 64 à 78 (LKATLCIPHVAVQNL ; SEQ ID NO :12), v. de 67 à 75 (HBSP A2-2 ; TLCIPHVAV ; SEQ ID NO :13), vi. de 13 à 21 (PoI A2-2 ; LLDEEAGPL ; SEQ ID NO :14), ou parmi les sous-fragments conservateurs de ces séquences i. à vi., lesdits sous-fragments conservateurs étant constitués d'au moins 6 acides aminés consécutifs d'une de ces séquences i. à vi., et ayant conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre VHB.
10. Peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, qui comprend un fragment ou analogue de HBSP restreint par une molécule HLA de classe II, caractérisé en ce que ledit fragment de HBSP est constitué d'une séquence choisie parmi les séquences suivantes :
- séquence RDPAKPARLLLKAT (positions 54 à 68 de HBSP ; SEQ ID NO :7),
- séquence RTEIAPVFPSHHLGL (positions 79 à 93 de HBSP ; SEQ ID NO :4), - séquence EDLHLQLPNDPRPPV (positions de 39 à 53 de HBSP ; SEQ ID NO :15),
- séquence LKATLCIPHVAVQNL (positions 64 à 78 de HBSP ; SEQ ID NO :12), ou parmi les sous-fragments conservateurs de ces séquences, lesdits sous- fragments conservateurs étant constitués d'au moins 6 acides aminés consécutifs de cette séquence, et ayant conservé une capacité à induire une réponse immunitaire T CD4+ dirigée contre VHB.
11. Épitope de la protéine HBSP, ledit épitope étant restreint par HLA-B, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une des séquences suivantes :
- VFPSHHLGL (positions 85 à 93 de HBSP ; SEQ ID NO :6),
- APVFPSHHL (positions 83 à 91 de HBSP ; SEQ ID NO :5),
- DPAKPARLL (positions 55 à 63 de HBSP ; SEQ ID NO :8),
- LPNDPRPPV (positions 45 à 53 de HBSP ; SEQ ID NO :1β), ou d'un fragment conservateur de 6 à 8 acides aminés, qui comprend au moins 6 acides aminés consécutifs, et au plus 8 acides aminés consécutifs d'une de ces quatre séquences, ledit fragment ayant conservé une capacité à être restreint par HLA-B, ou d'un analogue conservateur de 6 à 10 acides aminés, qui dérive de l'une de ces trois séquences, ou de l'un de leurs fragments conservateurs, par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ledit analogue conservé une capacité à être restreint par HLA-B.
12. Épitope de la protéine HBSP, ledit épitope étant restreint par HLA-A, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une des séquences suivantes :
- KPARLLLKA (SEQ ID NO :9 ; positions 58 à 66 de HBSP),
- LLLKATLCI (SEQ ID NO :11 ; positions 62 à 70 de HBSP),
- TLCIPHVAV (SEQ ID NO :13 ; positions 67 à 75 de HBSP),
- LLDEEAGPL (SEQ ID NO :14 ; positions 13 à 21 de HBSP), ou d'un fragment conservateur de 6 à 8 acides aminés, qui comprend au moins 6 acides aminés consécutifs, et au plus 8 acides aminés consécutifs d'une de ces quatre séquences, ledit fragment ayant conservé une capacité à être restreint par HLA-A, ou d'un analogue conservateur de 6 à 10 acides aminés, qui dérive de l'une de ces trois séquences, ou de l'un de leurs fragments conservateurs, par substitution et/ou délétion et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ledit analogue conservé une capacité à être restreint par HLA-A.
13. Oligonucléotide ou polynucléotide qui code un peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, ou un épitope selon la revendication 11 ou 12, selon le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence de ce code.
14. Oligonucléotide ou polynucléotide selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il a pour séquence une séquence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO :19 à SEQ ID NO : 32.
15. Vecteur comprenant un oligonucléotide ou polynucléotide selon la revendication 13 ou 14.
16. Cellule présentatrice d'antigène (CPA) transfectée, infectée ou transformée par un oligonucléotide ou polynucléotide selon la revendication 13 ou 14, ou par un vecteur selon la revendication 15.
17. Composition pharmaceutique à effet immunisant destinée à la thérapie et/ou la prévention et/ou la palliation d'une maladie et/ou d'un état lié à une infection par VHB, et plus particulièrement à une infection chronique de VHB, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un élément parmi :
- les peptides et polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 10,
- les épitopes selon la revendication 11 ou 12,
- les oligonucléotides ou polynucléotides selon la revendication 13 ou 14,
- les vecteurs selon la revendication 15,
- les cellules présentatrices d'antigène selon la revendication 16.
18. Composition selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle comprend : - au moins un peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, qui est constitué de 6 à 46 acides aminés, et qui comprend au moins un fragment de HBSP ou analogue conservateur de ce fragment de HBSP, ledit fragment de HBSP étant constitué du fragment HBSP A2-1 (SEQ ID NO :11 ) ou d'un sous-fragment conservateur de HBSP A2-1 , ou
- au moins un oligonucléotide ou polynucléotide qui code pour un tel peptide ou polypeptide selon le code génétique universel, en tenant compte de la dégénérescence de ce code, ou
- au moins un vecteur qui comprend au moins un tel oligonucléotide ou polynucléotide, ou
- au moins une CPA transfectée, infectée ou transformée par un tel oligonucléotide ou polynucléotide, ou par un tel vecteur.
19. Composition selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre :
- au moins un peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, qui est constitué de 6 à 46 acides aminés, et qui comprend au moins un fragment de HBSP ou analogue conservateur de ce fragment de HBSP, ledit fragment de HBSP étant constitué du fragment HBSP B7-1 (SEQ ID NO :5) ou d'un sous-fragment conservateur de HBSP B7-1 , ou
- au moins un oligonucléotide ou polynucléotide qui code pour un tel peptide ou polypeptide selon le code génétique universel, en tenant compte de la dégénérescence de ce code, ou
- au moins un vecteur qui comprend au moins un tel oligonucléotide ou polynucléotide, ou
- au moins une CPA transfectée, infectée ou transformée par un tel oligonucléotide ou polynucléotide, ou par un tel vecteur.
20. Composition selon la revendication 18 ou 19, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre :
- au moins un peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, qui est constitué de 6 à 46 acides aminés, et qui comprend au moins un fragment de HBSP ou analogue conservateur de ce fragment de HBSP, ledit fragment de HBSP étant constitué du fragment HBSP A2-2 (SEQ ID NO :13) ou d'un sous-fragment conservateur de HBSP A2-2, ou
- au moins un oligonucléotide ou polynucléotide qui code pour un tel peptide ou polypeptide selon le code génétique universel, en tenant compte de la dégénérescence de ce code, ou
- au moins un vecteur qui comprend au moins un tel oligonucléotide ou polynucléotide, ou
- au moins une CPA transfectée, infectée ou transformée par un tel oligonucléotide ou polynucléotide, ou par un tel vecteur.
21. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre des particules portant les sites immunogènes de l'antigène HBs.
22. Composition selon l'une quelconque des revendications 17 à 21 caractérisée en ce qu'elle est destinée à la thérapie et/ou la prévention et/ou la palliation d'une hépatite B.
23. Composition selon l'une quelconque des revendications 17 à 22, caractérisée en ce qu'elle est destinée à la thérapie et/ou la prévention et/ou la palliation d'une hépatite B chronique.
24. Composition selon l'une quelconque des revendications 17 à 22, caractérisée en ce qu'elle est destinée à la thérapie et/ou la prévention et/ou la palliation d'une fibrose.
25. Méthode pour activer et/ou différencier un lymphocyte T CD8+ et/ou CD4+, qui comprend la mise en contact in vitro dudit lymphocyte T avec au moins un élément parmi : - un peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 10,
- un épitope selon la revendication 11 ou 12,
- un oligonucléotide ou polynucléotide selon la revendication 13 ou 14, - un vecteur selon la revendication 15,
- une cellule présentatrice d'antigène selon la revendication 16.
26. Méthode pour induire et/ou stimuler la maturation d'une cellule dendritique, qui comprend la mise en contact in vitro de ladite cellule dendritique avec au moins un élément parmi :
- un peptide ou polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 10,
- un épitope selon la revendication 11 ou 12, - un oligonucléotide ou polynucléotide selon la revendication 13 ou
14,
- un vecteur selon la revendication 15,
- une cellule présentatrice d'antigène selon la revendication16.
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